Предисловие

За последние десятилетия молекулярная иммунология стала одной из ведущих областей современной биологии. Как составная часть иммунологии эта дисциплина сегодня привлекает внимание очень боль.шого числа исследователей. Достаточно сказать, что работы по вопросам иммунологии печатаются более чем в 900 изданиях. Впечатляющие результаты исследований, их влияние на самые различные области биологии и медицины, возможность эффективного приложения результатов многих исследований для нужд здравоохранения, ветеринарии, биотехнологии привлекают в иммунологию все новых и новых специалистов. В этих условиях обобщение накопленных знаний в форме руководства, учебных пособий ——задача актуальная.

По вопросам общей иммунологии в нашей стране и за рубежом опубликован в последние годы ряд отличных руководств. Молекулярной иммунологии «не ловезло». Несмотря на публикацию обзорных статей по частным вопросам, руководств, обобщающих обширный фактический материал в этой области, по существу еще не издавалось. Достаточно сказать, что одна из наиболее значительных книг по иммунохимии вышла в свет в 50-х годах 1.

В предлагаемой интателю книге обобщены основные сведения о молекулярных основах реакций иммунитета. Содержание руководства находится в соответствии с учебными программами курсов иммунологии и иммунохимии, преподаваемых на медико-биологическом факультете 2-го Московского медицинского института им. Н. И. Пирогова и в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова (биологический факультет) .Пособие рассчитано на студентов, знакомых с осно-

См. Кэбот Э., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.» 1968.

вами органической химии, биохимии, молекулярной биологии.

В книге обсуждаются основные вопросы клеточной иммунологии и многие иммунологические феномены, однако она не подменяет собой руководств по общей иммунологии. Именно молекулярные аспекты иммунологии являются ее основным содержанием. В пособии представлены прежде всего те разделы современной иммунологии (строение антигенов и антител, биосинтез антител, эффекторные функции иммуноглобулинов, система комплемента), где уже осуществлен глубокий анализ явлений на молекулярном уровне. Рассматриваются также молекулярные аспекты регуляции иммунного ответа и некоторые проблемы иммунопатологии. В книгу вошел также раздел, знакомящий читателя с методологией им- мунохимического эксперимента, возможностями молекулярной иммунологии для решения ряда задач современной молекулярной биологии и биохимии. Последнее представляется необходимым, чтобы показать, сколь велики возможности молекулярной иммунологии в областях, во многом определяющих прогресс биологии.

Автор

Введение

Молекулярная иммунология——научная дисциплина, изучающая химические, биохимические и молекулярно-биологические основы реакций иммунитета. Как способ научного мышления молекулярная иммунология и прежде всего иммунохимия возникла одновременно со становлением иммунологии как отрасли биологии. Первые попытки создания искусственных антигенов； на основе :<и ми чески модифицированных белков были предприняты еще в 1906 г. Э. Пиком (Е. Pick). Первая, во многом предвосхитившая наши современные представления теория образования антител была сформулирована выдающимся хнмнком XX столетия Паулем Эрлихом (Р. Ehrlich, 1903). Несколько позже большой интерес к иммунологии проявил выдающийся физико-химик Сванте Аррениус, который ввел в научную литературу термин иммунохимия (S. Arrhenius, 1904). В 10—30-х годах исследованиями К- Ландштейнера, М. Гейдельбер- гера, В. Бойда, Э. Кэбота (K.Landsteiner, М. Heidelber- ger, W. Boyd, E. Kabat) и другими был создан фундамент современной молекулярной иммунологии.

Успехи молекулярной иммунологии в решающей степени связаны с успехами в изучении химии белка и других биополимеров, общей биохимии и молекулярной биологии. Молекулярная иммунология не только базируется на этих дисциплинах, но н активно влияет своими методическими подходами на успех наиболее быстро развивающихся областей биологической науки: изучение структуры и функции белков, молекулярной генетики эукариот, дифференцировки клеток и тканей.

Оценка реакций иммунитета с химических позиций позволяет выявить принципиальные особенности этой системы регуляции постоянства внутренней среды организма. В основе реакций иммунитета, как и других реакций организма, необходимых для обеспечения его жизнедеятельности, лежит специфическое (избирательное) взаимодействие одних макромолекул с другими макромоле-

кулами или низкомолекулярными соединениями. Не обсуждая здесь химических основ специфического взаимодействия, отметим ли.шь, что мерой специфичности служит скорость реакции, например, скорость реакции фермент-субстрат, антиген (гаптен) -антитело, лиганд-кле- точный рецептор и др.

Константа скорости гакой важнейшей в биологическом отношении реакции, как фермент-субстрат, достигает значений порядка 106—108 м-1 с-1. Аналогичные значения константы скорости характерны для реакции антител с антигенами или гаптенами. Но между сравниваемыми реакциями существуют очень важные различия. В случае ферментативного катализа за счет изменения химического строения субстрата сродство образующегося продукта к активному центру фермента крайне мало по сравнению с субстратом. В силу этого активный центр становится доступным для реакции с новой молекулой субстрата. Напротив, комплекс антиген (гаптен)-антите- ло не подвергается внутренним превращениям, которые могли бы привести к освобождению активного центра антитела. Аналогично протекает реакция антигена с поверхностными рецепторами клеток иммунной системы. Вследствие этого судьба антител (рецепторов) — это их распад в процессе катаболизма комплекса. Следовательно, протекающие в иммунной системе химические реакции, определяющие ее роль в гомеостазе, по существу необратимы. Это отличает их как от реакции фермент- субстрат, так, видимо, и от других менее изученных в кинетическом плане реакций, регулирующих гомеостаз: специфической рецепции клетками субстратов, разнообразных медиаторов и другими реакциями.

Сказанное выше служит иллюстрацией роли химического анализа для глубокого понимания биологической сущности реакций иммунитета. Тем самым молекулярная иммунология, изучая на основе всех достижений физико-химической биологии систему иммунитета, вносит значительный вклад в биологическую теорию. В свою очередь, разнообразные методы иммунохимического анализа, сочетающие в себе высокую специфичность с точностью химического и физического экспериментов, уже нашли и продолжают находить все более широкие сферы приложения в самых различных областях биологии и медицины.

Система иммунитета

В настоящей главе кратко рассмотрены некоторые наиболее важные сведения о системе иммунитета и феноменологии иммунологических реакций. Изложенные ниже материалы необходимы для .последующего детального обсуждения основных проблем молекулярной иммунологии.

Клетки и органы иммунной системы

Реализацию специфических реакций иммунитета обеспечивают два основных типа клеток — лимфоциты и макрофаги, или А-клетки. Их созревание под влиянием различных индукторов, включая антигены, происходит в органах иммунной системы. Органы иммунной системы по морфологическим признакам не без основания отождествляют с лимфоидными органами, так как основным типом клеток в них являются v^имфoциты, их предшественники и потомки. Лимфоидные органы подразделяют на центральные и периферические. Центральные органы — это костный мозг, фабрициева сумка у птиц и ее аналог у млекопитающих (см. ниже), а также тимус (вилочковая железа). Периферические органы включают селезенку, лимфатические узлы и многочисленные рассеянные по всему организму скопления лимфоцитов, находящихся на различных стадиях дифференцировки (рис. 1).

Лимфоциты—основные клетки, ответственные за специфическую иммунореактивность. Они возникают из стволовых клеток (stem cells) кроветворной ткани. У млекопитающих до рождения (ad utero, или в антенатальный период) основным органом кроветворения

Тимус

Г р\」ноГ[ проток

Селезенка

Косгный мозг

Ли^!флические сосуды TKdHefi

Тонкая кишка

Пейерова бляшка

Лимфатические \ Г1Ы

Аденоиды

Миндалина

Рис. 1. Лимфатическая система человека

Леваяподключичнаявена

Толе гая кишка Аппендикс

(гемопоэза) служит печень. Здесь как и в костном мозге, находятся полипотентные стволовые клетки и протекают первые этапы лимфопоэза. После рождения (постнатальный период) печень полностью утрачивает функции органа гемопоэза и в том числе лимфопоэза. В этот период стволовые клетки кроветворной ткани, включая предшественники лимфоцитов, находят только в костном мозге. Именно за счет этих клеток происходит пополнение числа лимфоцитов как в норме, так и после гибели значительного числа лимфоцитов в результате действия радиационного облучения или различных агентов.

Зрелые лимфоциты подразделяют на две популяннн: В- и Т-лимфоциты. B-лимфоциты возникают в ходе анти- геннезависимой дифференцировки стволовых клеток в фабрициевой сумке у птиц или ее эквиваленте у млекопитающих. Они обязаны своим названием первой букве латинского слова bursa ——сумка. У птиц фабрициева сумка представляет собой лимфоэпителиальный орган, расположенный в задней стенке клоаки. Точная локализация аналога фабрициевой сумки у млекопитающих не известна. Допускают, что это образование находится в стенке толстой кишки.

Т-лимфоциты появляются в процессе антигеннезави- симой дифференцировки стволовых клеток в тимусе (по первой букве которого они и названы). Тимус ——лимфоэпителиальный орган, находящийся в передней верхней части средостения. Убедительно доказано, что, будучи одним из центральных органов лимфоидной системы, тимус является также органом эндокринной системы. Продуцируемые им гормоны — тимозин, тимопоэтин, ти- мости мул ин и ряд других участвуют в дифференцировке лимфоцитов Т-ряда на всех трех «территориях», содержащих клетки лимфоидного ряда,——костном мозге, тимусе и периферических лимфоидных органах. Имеется ряд доказательств в пользу того, что тимические гормоны продуцируются эпителиальными клетками тимуса. На тесную взаимосвязь между лимфоцитами, «заселяющими» тимус,——тимоцитами и окружающими их эпителиальными клетками указал впервые А. Максимов (1923). Позднее значительный вклад в изучение эндокринной функции тимуса, структуры и функции его гормонов внесли А. и Дж. Гольдштейны и Н. Трайнин (A. Goldstein, G. Goldstein a N. Trainin) (1974—1983).

Предполагают, что фабрициева сумка и ее аналог у млекопитающих также продуцируют вещества со свойст-

вами гормонов, регулирующие созревание В-лимфоци- тив.

Лимфоидные органы, в гом числе и центральные, находятся под контролем всей эндокринной системы, а также управляющими ею органами центральной нервной системы. Нейроэндокринные влияния на дифференцировку стволовых клеток (за исключением гормонов тимуса и гипотетических гормонов фабрициевой сумки) носят неспецифический характер и аналогичны их эффекту на клетки других систем организма. Специфическую направленность дифференцировке стволовых клеток кроветворной системы придают, no-вн工нмому, корогкодистант- ные по механизму действия факторы, продуцируемые стромальными элементами органов лимфоидной системы (А. Фриденштейн, Е. Лурия, 1980). Эти проблемы еще только начинают разрабатывать и их значение для биологической теории трудно переоценить.

В- и Т-лимфоциты, не отличаясь заметно по морфологии, имеют сущесгн£щные отлин.ия в метаболизме, что находит свое отражение в их физических свойствах, строении ассоциированных с цитоплазматической мембраной рецепторов, включая рет^пторы-для. антигена.

工^胆史把竺и несут Оольтнй отршхательннй заря1n по ср ? внениюс В-л имф оцитам и, благодаря наличию на их поверхности значительно большего числа остатков сиаловой кнелоты. На этих различиях основан один н5~йё^ ^годов разделения Т- и В-лимфоцитов с помощью электрофореза.

Т-лимфоциты при центрифугировании смеси клеток в градиенте плотности располагаются в более плотных слоях градиента.

Т-лимфоциты (мыши) несут на своей поверхности характерные антигены (антигенные маркеры). В их числе так называемый Thy-1-антиген, антигены семейства Lyt и др. Образование маркера Thy-1 находится под контролем тимозина, тимопоэтина и тимостимулина, а маркеров семейства Lyt — преимущественно тимозина.

В-лимфоциты синтезируют рецепторы для антигена, которые лишь в небольшой степени отличаются от сывороточных иммуноглобулинов по своему строению (рис. 2). Антигенсвязывающие рецепторы Т-лимфоцитов представлены белками, не относящимися к семейству иммуноглобулинов.

В-лимфоциты могут содержать на своей поверхности рецепторы для Fc-участков иммуноглобулинов всех клас-

сов. Эти рецепторы, называемые Fc-рецепторами, экспрессированы не на одной клетке, а на различных субпопуляциях В-лнмфоцитов, но все они принадлежат к лимфоцитам В-ряда. На Т-лимфоцитах на員денн рецепторы для иммуноглобулинов классов G, М, А и Е.

1а

^С^^Антнген

Рис. 2. Рецепторы и антигенные маркеры В-лимфо- цита:

IgD н IgM ——иммуноглобулиновые рецепторы соответствующего класса, 1а — антиген, Fc и Fc — рецепторы для Fc-участков иммуноглобулинов G и М, CR — рецептор для активированного третьего компонента комплемента. MBLA — дифференцировочный антиген В-лимфоцитов мыши

Только В-лимфоциты имеют на своей поверхности рецепторы для продуктов частичного протеолиза третьего компонента системы комплемента — СЗЬ и C3d.

В-лимфоциты экспрессируют мембранный дифференцировочный антиген, который в случае В-лимфоцитов мыши получил название MBLA. На поверхности Т-лимфоцитов (человека) существует особый антиген — HTLA, синтез которого контролируется одним из факторов, продуцируемых тимусом — FTS (от франц. — facteur thymique serique).

На цитоплазматической мембране В-лимфоцитов (мыши) содержится в большом количестве 1а-антиген — продукт одного из локусов 1-района генов основного комплекса гистосовместимости.

Совокупность указанных и некоторых других признаков позволяет с большой достоверностью дифференцировать m vitro лимфоциты Т- н В-рядов. Но между этими клетками существует также принципиальное функциональное отличие, выявить которое удается лишь в ходе их антигензависимой дифференцировки. Только ■BwipguHTbi способны превращаться в клет&£п одуци- рующие .ммуноглобумннн '(антитела). Что касается 'Т-л^мфоцитов, то они под действием антигена превращаются в клетки, ответственные за реакции клеточного, вернее клеточно-опосредованного (cell-mediated) иммунитета, и клетки, регулирующие силу реакций в эффекторных звеньях гуморального и клеточного иммунитета.

Сказанное выше указывает на принципиальные различия в организации и экспрессии структурных генов для белков, определяющих функции Т- и В-лимфоцитов в иммунных реакциях. Причем эти различия возникают в процессе антигеннезависимой диференцировки стволовой клетки в центральных лимфоидных органах. Лишь за- вер.шающие стадии дифференцировки клеток лимфоидного ряда, происходящие при участии антигена, осуществляются в периферических, или вторичных, лимфоидных органах. Лимфоциты поступают сюда из центральных органов с кровью или лимфой. В-лимфоциты оседают в селезенке и димфоуздах, в то время как значительная ' часть Т-лимфоцитов продолжает циркулировать, находясь как в крови (лимфе), так и в лимфоидных органах. В результате свыше 2/3 лимфоцитов, циркулирующих в крови, представлены Т-лимфоцитами.

В периферических лимфоидных органах Т- и В-лимфоциты находятся в различных зонах, расположение которых видно на схеме лимфатического узла (рис. 3). Т-лимфоциты располагаются в так называемой тимуеза- висимой зоне коры; последняя прилегает к той части органа, где его ткань пронизана питающими лимфатический узел кровеносными сосудами. Ближе к капсуле находится тимуснезависимая зона, содержащая плотные скопления лимфоцитов (преимущественно В-лимфоци- тов). Эти скопления называются фолликулами или пер- еичными фолликулами. В ходе иммунного ответа первичные фолликулы значительно увеличиваются в размере (вторичные фолликулы) за счет пролиферации клеток. При этом образуется так называемый зародышевый центр (germinal center).

Около 95% лимфоцитов, содержащихся в лимфатическом узле или других периферических лимфоидных органах в отсутствие иммунного стимула, представлены клетками, происходящими из крови и лимфы. Иными словами, все эти клетки возникают в центральных лимфоидных органах, где идет интенсивный лимфопоэз. Проник-

Корковый слойКорковый слойМозговой слойМозговой слойАфферентный лимфатический проюкАфферентный лимфатический проюкЭфферентный лимфатический протокЭфферентный лимфатический протокВФВФРис. 3. Общая структура лимфатического узла:Рис. 3. Общая структура лимфатического узла:

Корковый слой

Корковый слой

Мозговой слой

Мозговой слой

Афферентный лимфатический проюк

Афферентный лимфатический проюк

Эфферентный лимфатический проток

Эфферентный лимфатический проток

ВФ

ВФ

Рис. 3. Общая структура лимфатического узла:

Рис. 3. Общая структура лимфатического узла:

СКС — синус коркового слоя, ДКС — диффузный корковый слой,СМС——синус мозгового слоя, ПФ——первичный фолликул, ВФ —вторичный фолликул, М ——мантия, ЗЦ ——зародышевый центр,ПКВ — посткапиллярные венулы, МШ — мякотные шнуры

новение лимфоцитов в кровеносное русло связано с прохождением через стенки посткапиллярных венул. Это происходит путем прикрепления клеток к определенным структурам сосудистой стенки, чувствительным к действию трипсина и гликозидаз, и последующей миграции через щели между клетками эндотелия. Аналогичным путем осуществляется перемещение лимфоцитов из циркуляции в периферические лимфоидные органы (селезенку). В лимфатические узлы лимфоциты поступают через афферентные лимфатические протоки, пронизывающие ткани в непосредственной близости от лимфоузла.

Иммунный ответ

При введении антигена местно (например, в кожу) он попадает первоначально в близлежащий (регионарный) лимфатический узел, где происходит его

первый контакт с лимфоцитами В-ряда. Но еще прежде в афферентных лимфатических протоках произойдет контакт антигена с Т-лимфоцитами, большая часть которых, как указывалось, рецнркулнрует, находясь в крови и лимфе. Поэтому при попадании в кровь антиген вступит в контакт также с Т-лимфоцитами.

Вне лимфоидных органов антиген контактирует также с фагоцитами и прежде всего макрофагами. Эти клетки, возникающие в ходе дифференцировки из особых клеток-предшественников, которые находятся в костном мозге, заселяют все без исключения органы и ткани. На промежуточной стадии своей дифференцировки они сохраняют способность циркулировать (моноциты). Затем эти клетки становятся малоподвижными и в большом числе прикрепляются к поверхности клеток, выстилающих стенки мелких сосудов.

Антигены, находящиеся в крови, фиксируются на поверхности макрофагов вне зависимости от того, где расположены эти клетки. Так как вся кровь проходит через печень, где находится большое число макрофагов (названных купферовыми клеткамн), значительная часть антигена оказывается в печени. Остальной антиген находят в почках, селезенке, легких. Однако только та часть антигена, которая окажется в селезенке, будет в качестве специфического индуктора стимулировать иммунный ответ. Ниже показано распределение меченных 51Сг эритроцитов барана в организме неиммунизированного кролика (эритроциты вводили внутривенно в дозе 5Х 108, определение радиактивности проводили через 2 ч):

Объект исследования Радиоактивность, %

О7910,36,54,2О7910,36,54,2Кровь

О7910,36,54,2

О7910,36,54,2

Печень

Селезенка

Почки

Легкие

При внутривенном введении в периферические лимфоидные органы попадает лишь ограниченная часть антигена; однако в случае местного введения антиген практически целиком пройдет через регионарный лимфатический узел. Поэтому располагая небольшим количеством антигена, целесообразно вводить его местно (в кожу, в окружающую лимфатические узлы жировую клетчатку или, когда это возможно, непосредственно в лимфатический узел). При иммунизации кроликов часто прибегают

к введению антигена в подколенные лимфатические узлы. Для того чтобы обеспечить депонирование растворимого антигена (например, белка) в лимфатическом узле, желательно сорбировать его на инертном носителе (часто А1 (ОН)з) или приготовить в виде водно-масляной эмульсии. В такой форме антиген наиболее эффективно захватывается макрофагами, которые перенесут его затем в лимфатический узел.

、Тсиько_тот 呼тмген, которий бупет захваген макио- .@ага、ш, способен вызвать иммипнь@ ответ.. В случае ^растворимых белковых антигенов макрофагами захватывается лишь несколько процентов от всего количества белка, причем та его часть, которая представлена спонтанно возникающими агрегатами. Неагрегнрованнн員 белок продолжает оставаться в циркуляции до того момента, пока в кровь не начнут поступать синтезированные против этого белка антитела. В комплексе с антителами чужеродный белок будет быстро поглощаться макрофагами.

Белок в мономерной форме, остающийся в циркуляции после «отсеивания» макрофагами агрегатов того же белка, вызывает противоположное иммунному ответу состояние, называемое иммунологической толерантностью (см. гл. 11). Это было установлено путем переноса сыворотки животных, получивших за несколько часов до этого растворимый белковый антиген непосредственно в кровоток, сингенным реципиентам, т. е. животным, тождественным донору в генетическом отношении (Р. Frei, 1965). Способность белка в мономерной форме индуцировать иммунологическую толерантность обусловлена в частности тем, что он без участия макрофагов вступает в контакт с лимфоцитами. Таким образом, в наиболее общей форме картина выглядит следующим образом. Если ^ДШШ1.6ylдет захваиен макрофагами н через их посредство станет взанмо工ействовать с лнм巾оннтамн. 一 всзннк- нет I粤мунннй ответ. Если антиген не может быть захвачен макрофагами, но способен непосредственно контактировать с лимфоцитами, возникнет состояние иммуноло- .гниеской толерантности」т. е. специф|Ической иммунологической ареактивности.

JVLaкpoфaги взаимодействуют с антигенами неспеин： г_фически£ один и тот же макрофаг связывает самые различные антигены. Связанный макрофагами антиген определенным образом перерабатывается (процессируется). В результате переработки антигена (см. раздел 10.1) на

поверхности макрофага появляется продукт, состоящий из фрагментов молекулы антигена и белков, контролируемых генами основного комплекса гистосовместимости (см. раздел 10.1). Такой макрофаг вступает в контакт с Т-лимфоцитами, что служит необходимым условием для реализации процесса антигензависимой дифференцировки лимфоцитов как Т-, так и В-ряда.

Одно из первых проявлений реакции на антиген состоит в значительном уменьшении числа лимфоцитов, покидающих лимфатический узел по эфферентному лимфатическому сосуду и значительному увеличению числа делящихся клеток. Спустя 24——48 ч в органе появляются лимфобласты — потомки лимфоцитов, отличающиеся от них высокой метаболической активностью. Эти клеткн имеют по сравнению с лимфоцитами значительно больший объем цитоплазмы, содержащей большое число полирибосом. Если лимфобласты являются потомками В-лимфоцитов, на полирибосомах происходит синтез по- липептидных цепей иммуноглобулинов, которые скапливаются в цитоплазматических вакуолях. После сборки из изолированных цепей молекул иммуноглобулинов (антител) они экскретируются клетками. Следовательно, с этого периода в периферических лимфоидных органах появляются клетки, продуцирующие антитела.

Нетрудно представить, что интенсивность продукции антител будет возрастать как по мере увеличения в результате деления клеток, участвующих в их синтезе, так и совершенствования в ходе дифференцировки аппарата синтеза и секреции антител. Такими клетками являются псазматацеские клетк1tL— конечная стадия дифференци- ^овки В-лимфоцитов. Эти клетки имеют чрезвычайно развитую сеть так называемого шероховатого эндоплазматического ретикулума ——заполненных иммуноглобулинами «цистерн», на наружной поверхности которых в большом количестве фиксированы полирибосомы. Плазматические клетки в полном смысле слова — «фабрика» для продукции иммуноглобулинов (антител). Плазматические клетки утрачивают такие важнейшие функции лимфоцитов, как рецепцию антигенов, связывание через Fc-рецепторы иммуноглобулинов взамен единственной функции — продукции антител. Значительное число этих клеток гибнет в процессе секреции антител, так что продолжительность жизни многих из них едва ли превышает несколько суток.

Одшш из важнейших признаков внсоко員 степени дифференцировки плазматических клеток является то, что они продуцируют антитела только против о工но》 детер- мнн日нтйБ11 грушш анттгена. Эти антитела относятся только к одному классу (подклассу) иммуноглобулинов со строго определенным аллотипом полипептидных цепей и характерным идиотипом (см. гл. 3).

Антиген обеспечивает рост клона клеток В-ряда, пре- коммитированных в ходе их антигеннезависимой дифференцировки к синтезу антител против этого антигена. Только часть дочерних лимфоцитов, принадлежащих к данному клону, превращается в антителопродуцирующие клетки. Остальные сохраняют морфологические признаки лимфоцитов. К их числу принадлежат клетки иммунологической памяти, способные при контакте с тем же антигеном быстро превратиться в клетки, продуциру* ющие антитела.

Целесообразно охарактеризовать количественно некоторые параметры иммунного ответа, например, при иммунизации мышей оптимальной для продукции антител дозой чужеродных эритроцитов. Если антиген введен впервые (первичный иммунный ответ), максимальное число антителопрод)щирующих клеток в ответ на вн工т- _рив£нную инъекцию антигена накапливается в селезенке 一 к 4—5-му дрю. На 106 ядросодержащих клеток селезен7 к и оно составляет порядка 100—400. В этот же период число лимфоцитов, связывающих использованный для иммунизации антиген, составляет порядка 2 X 104/106 клеток селезенки. К 8—9-му дням после иммунизации число антителопродуцирующих и связывающих антиген клеток резко уменьшается (рис. 4). Уменьшение числа антителопродуцирующих клеток объясняется в том числе малым сроком жизни плазматических клеток. Уменцше- ние числа лимфоцитов, связывающих антиген, объяснить той же причиной нельзя, поскольку у лимфоцитов в среднем более продолжительное время жизни. Этот феномен в последнее время получил объяснение на основе представлений о способности фиксированных на поверхности v^имфoцитoв комплексов антиген-антитело как бы выполнять функцию антигенсвязывающих рецепторов (см. гл. 9). Необратимо теряя фиксированные на их поверхности комплексы, лимфоциты теряют вместе с тем способность связывать антиген.

Дифференцировка В-л,имфоцитов в антиталопродуци- рующие клетки требуир и G.邑1кр/1丄剪 1%匕5戸匕/в участия

помимо макрофагов (А-клетки) также определенного типа Т-лимфоцитов — помощников (Т-хелперы, или Тх). Вза21Mрд^ствне различных типов клеток в ходе иммунного ответ^получило название клеточнайпшбйёрацииГ

Кооперации В-лимфоцитов гГКхелперов строго специфична. Каждая из этих клеток имеет рецепторы для антигена, хотя распознаваемые ими структуры в молекуле антигена различны (см. гл. 2). Макрофаги, как уже указывалось выше, связывают антиген неспецифически. Антигены, требующие участия Т-хелгтеро_в для индукции "антитёлообразования, получили название мых,^Соответственно ответ на эти антигены также называют тимусзависимым. К тнмусзавнсимым антигенам относятся большинство глобулярных белков, синтетические полипептиды, ксеногеьпШё и~~аллогеннь1е клетки. Те биополимеры и их синтетические аналоги,~которые содержат регулярно повторяющиеся идентичные структуры, способны индуцировать ангителообразование без участия Т-хелперов. Такие антигены называют тимусне- sg^uiuiMiiiMU, а ответ на них — тимуснезависимым L В число тимуснезависимых антигенов входят полиса^а- рг1дыт агрегаты_Делков регулярного строения и др.

Под действием антигена в периферических лимфоидных органах протекают сложные процессы дифференцировки Т-лимфоцитов. Они идут в двух направлениях. Одно из них связано с активацией предшественников высокоспециализированных Т-лимфоцитов-эффекторов, участвующих в различных реакциях клеточного, а точнее, клеточно-опосредованного иммунитета. Другое — сопряжено с накоплением и активацией ряда субпопуляций лимфоцитов, регулирующих активность как В-лимфоцитов, так и предшественников Т-клеток-эффекторов. Одновременно накапливаются клетки иммунологической памяти, относящиеся к Т-лимфоцитам. При этом клетки памяти существуют как для регуляторных, так и эффекторных лимфоцитов.

К реакциям клеточно-опосредованного иммунитета, возникающим под действием различных категорий Т-эффекторов, относятся: реакция гиперчувствительности замедленного типа (delayed hypersensitivity); реакция от-

Этот термин нельзя признать удачным, так как в настоящее время нет сомнений в том, что ответ на все без исключения антигены регулируется теми или иными субпопуляциями Т-лимфоцитов.

торжения аллогенного трансплантата (allograft rejection); реакция трансплантат против хозяина (graft-versus- host reaction); цитотоксическая реакция против трансформированных онкогенными вирусами клеток или клеток, на поверхности которых представлены антигены

2622乃心仞 6 2t^~qHs-Gs/ goEnholb.1 .与毒/费復冬E否o'Jnh2622乃心仞 6 2t^~qHs-Gs/ goEnholb.1 .与毒/费復冬E否o'Jnh335555/3/3<1§YnnhwoduwaEWD oygh---例<1§YnnhwoduwaEWD oygh---例

2622乃心仞 6 2t^~qHs-Gs/ goEnholb.1 .与毒/费復冬E否o'Jnh

2622乃心仞 6 2t^~qHs-Gs/ goEnholb.1 .与毒/费復冬E否o'Jnh

3

3

5

5

5

5

/3

/3

<1§YnnhwoduwaEWD oygh---例

<1§YnnhwoduwaEWD oygh---例

詞？ сутки с момента иммунизации

Рис. 4. Динамика антителопродуцируЮ'щих клеток (/) и лимфоцитов, связыва-ющих антиген (2), в селезенке мыши,иммунизированной эритроцитами бара-на (5X107 клеток)

внутриклеточных паразитов — некоторых видов бактерий (микобактерии туберкулеза, листерии, бруцеллы), простейших, некоторых патогенных грибов.

К числу Т-лимфоцитов, регулирующих и модулирующих иммунный ответ, принадлежат различные виды Т-хелперов, Т-лимфоцитов, специфически подавляющих реакции гуморального и (или) клеточного иммунитета (Т-супрессоры, нлн Тс), Т-лимфоцитов, отменяющих или модулирующих функцию Т-супрессоров.

Индуцированная антигеном активация и дифференцировка Т-лимфоцитов столь же сложный процесс, как и процесс антигензависимой дифференцировки В-лимфоци- тов. Многие его аспекты еще требуют детального изучения как специалистами в области клеточной иммунологии, так и иммунохимии. В последующих главах мы рассмотрим ряд иммунохимических аспектов кооперативного взаимодействия клеток иммунной системы.

АнтигеныАнтигены

Антигены

Антигены

Антигенами называют биополимеры или их синтетические аналоги, способные при введении в организм или в культуре лимфоидных клеток вызвать иммунный ответ: продукцию антител, появление клеток-эффекторов тимического происхождения, формирование иммунологической памяти. Антитела или клетки, появляющиеся в ходе иммунного ответа, специфически взаимодействуют с антигеном или химическими веществами сходного строения. Последние могут не_обладать свойством рнзмвать нммуннмй ответ. Такие вещества называют^гаптенами. При определенных условиях антигены способны вызвать состояние специфической безответственности ——иммунологической толерантности (см. гл. 11).

Антигенам.и являются, как правило, чужеродные для реципиента вещества, к которым принадлежат белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты и их комплексы. Изменяя путем химической модификации природные биополимеры, можно получить так называемые конъюгированные антигены. Конъюгированные антигены могут быть получены на основе белков, принадлежащих самому реципиенту. Аутологичные белки, денатурированные физическими или химическими методами, также приобретают антигенные свойства.

Синтетические полипептиды как аналоги белковых антигенов способны индуцировать иммунный ответ, но при этом совсем не обязательно они должны быть подобны по первичной и пространственной структуре какому- то определенному белку. Существенном дня еоквлення у ннх антнгенннх свойств является (Ьормнрованне устой-. 4нвой npiU^rpbHCTBeHHoft структура. По этой причине гомополимеры, т. е. полимеры, образованные только из одной аминокислоты, антигенными свойствами не обладают. Эти свойства появляются у полипептидов, в образо-

вании которых участвуют две аминокислоты и более различного строения.

В классической иммунологии словом антиген обозначают в том числе целые клетки бактериального или животного происхождения. С химической точки зрения это неверно, так как клетка состоит из большого числа белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов. Каждый из этих полимеров, полученный в очищенном виде, может быть использован для индукции иммунного ответа, специфичного в отношении этого полимера. Рассматривая очищенный биополимер как индивидуальный антиген, любое сочетание пocv^eдниx в какой-либо надмолекулярной структуре, например клеточной мембране, следует характеризовать как семейство индивидуальных антигенов. Этот термин может быть использован и для обозначения спонтанно агрегирующего (полимеризующегося) индивидуального антигена. Так флагеллин — сократительный белок из жгутиков грамотрицательных бактерий рода Salmonella может находиться в мономерной форме (молекулярная масса 40 000 дальтон 9 и в полимеризованном виде. В обоих случаях этот индивидуальный антиген способен индуцировать образование антител, хотя условия для этого различны: мономер флагеллина является тимусзависимым. а полимер ——тимуснезависимым антигеном.

Несомненно существует связь между молекулярной массой биополимера и его антигенной активностью, но такую связь можно установить, только сравнивая вещества одного класса, например, различные белки с однотипной вторичной и третичной структурами: глобулярные или фибриллярные. При соблюдении этих условий удается установить прямую зависимость между молекулярной массой и способностью биополимера индуцировать образование антител. Эта закономерность не абсолютна и зависит от ряда других свойств антигена, как биологических, так и химических.

Выраженность антигенных свойств белков как наиболее обширного и значимого класса антигенов зависит от того, насколько удалены в эволюционном отношении донор, от которого получен белок, и реципиент, которому

1 Согласно Международной системе СИ молекулярная масса измеряется в атомных единицах массы (а. е. м.)； 1 а. е. м.« 1,66057X X 10~эт кг. В биохимии молекулярную массу макромолекул принято выражать в дальтонах; 1 дальтон = 1 а. е. м. В дальнейшем изложении размерность молекулярной массы не указывается.

этот белок вводят в качестве антигена. Сравнительный анализ будет корректен ли,шь в том случае, когда для сравнения используют однотипные белки. Так, если иммунизировать мышей альбумином из сыворотки человека и крысы, то на альбумин человека будет более выраженный ответ (большая продукция антител), чем на альбумин кры?ы.

В том случае когда биополимер (или его синтетический аналог) обладает высокой чувствительностью к расщеплению, его антигенные свойства выражены в меньшей степени, чем у более устойчивого к ферментативному гидролизу вещества. Так, при использовании в качестве антигенов синтетических полипептидов или конъюгатов белков с олигопептидами более выраженный ответ получают на полипептид, в состав которого входят неприродные D-аминокислоты.

Иммунный ответ в решающей степени завнснт от генотипа реципиента. Эта проблема будет рассмотрена ниже.

Участки молекулы биополимера,' его синтетического аналога или конъюгированного антигена, распознаваемые антигенсвязывающими рецепторами В-лимфоцитов и антителами, обозначают как детерминантные группы. В молекуле антигена, как правило, содержится несколько различных по строению детерминантных групп, каждая из которых может повторяться по нескольку раз. Если в молекуле какого-либо вещества существует только одна детерминантная группа определенного строения, образования антител против этой детерминанты не произойдет. По мере увеличения в молекуле антигена числа идентичных детерминантных групп (эпитопная плотность) иммунный ответ на эту детерминанту^астет, но до определенного предела, вслед за чем снижается и может вовсе не наблюдаться. Это явление было изучено при использовании конъюгированных антигенов с различным числом заместителей, выполняющих функцию де- терминантной группы. Исчезновение иммунного ответа на антигены с очень высокой эпитопной плотностью связано с механизмом активации В-лимфоцитов и будет рассматриваться в гл. 10.

Конъюгированные антигены

Исследование этого класса антигенов сыграло важную роль для понимания организации детер-

минантных групп природных антигенов, реальной оценки информационной «емкости» иммунной системы в филогенезе и онтогенезе.

Ниже приведен пример синтеза конъюгированного антигена на основе реакции азосочетания диазобензолсульфоновой кислоты с остатками тирозина в молекуле белка, например, бычьего сывороточного альбумина:

Д иаюбен юл сульфо новая кислотаД иаюбен юл сульфо новая кислотаСу1ьфанилозаяКИСЛО 1.1Су1ьфанилозаяКИСЛО 1.1Диаюбен юл- сульфоновая кислотаДиаюбен юл- сульфоновая кислота

Д иаюбен юл сульфо новая кислота

Д иаюбен юл сульфо новая кислота

Су1ьфанилозая

КИСЛО 1.1

Су1ьфанилозая

КИСЛО 1.1

Диаюбен юл- сульфоновая кислота

Диаюбен юл- сульфоновая кислота

При иммунизации кроликов таким конъюгатом образуется несколько видов антител, реагирующих как с белком, так и с остатком сульфаниловой кислоты. Наличие антител к сульф ан ил а ту можно установить, синтезировав тест-антиген и аналог детерминантной группы ——гаптен.

Тест-антиген получают, конъюгировав с диазобензолсульфоновой кислотой другой тирозинсодержащий белок; последний не должен иметь сходства антигенной структуры с белком — носителем детерминантной группы, использованным для иммунизации. В избранном нами случае таким белком может быть яичный альбумин. Если при добавлении тест-антигена к исследуемой антисыворотке образуется преципитат, существование антител против сульфаниловой кислоты можно считать доказанным 1.

* Помимо реакции преципитации может быть использована любая другая реакция антиген-антитело: пассивная гемагглютинация, связывание комплемента и др. (см. гл. 12).

Для точной оценки структуры детерминантной группы синтезируют гаптены. В рассматриваемом примере гаптеном послужит конъюгат тирозина с сульфаниловой кислотой. Такой гаптен не преципитирует антител, но, соединяясь с ними, блокирует активные центры. В результате антитела утратят способность взаимодействовать с тсст-антигеном. Реакция ингибирования — эффективный метод тестирования антител против простых по химическому строению гаптенов.

Реакцию низкомолекулярного гаптена с антителами можно оценить с помощью прямых реакций, среди которых наибольшее применение получил метод равновесного диализа (см. гл. 12). Полученные в эксперименте данные позволяют рассчитать константу равновесия (К) в системе гаптен-антитело (см. гл. 4 и 12). Если определять величины константы равновесия при реакции антител к определенному конъюгированному антигену с рядом сходных по строению гаптенов, можно оценить вклад каждого радикала в структуру детерминантной группы. При этом удобно сопоставлять сродство к антителу какого-то аналога детерминантной группы со сродством наиболее близкого к ней по строению гаптена (референс-гаптен). Таким способом получают относительную величину константы связывания (Котн) ： Котн= = К*/Кр.г, где Кх — константа связывания исследуемого аналога, Кр.г — константа связывания референс-гаптена.

Ниже приведены величины Котн для ряда нитрофе- нильных производных, реагирующих с антителами кролика против динитрофенилированного гемоцианина, т. е. степень сродства антидинитрофенильных антител кролика к различным гаптенам. Антиген получали, модифицируя белок по е-аминогруппам лизина динитрофенилсульфоновой кислотой. Поскольку е-динитрофениллизин наиболее близок по строению детерминантной группе использованного конъюгированного антигена, его использовали в качестве референс-гаптена.

Из анализа приведенных ниже данных следует, что антитела распознают как ДНФ-группу, так и аминокислотный остаток, к которому эта группа присоединена. При замене лизина на любую другую аминокислоту сродство антител к гаптену резко снижается. Даже в случае 抵- пользования в качестве гаптена g-динитрофениллизина, в котором взят неприродный оптический изомер (D-лизин), отчетливо заметно снижение константы связывания. Особенно низкая константа связывания найдена ® случае

отсутствия в молекуле гаптена аминокислотного остатка (динитрофенол). Практически не связываются с изучаемыми антителами мононитрофенильные производные аминокислот. Данные, аналогичные описанным вы,ше, были получены и для других антител к конъюгированным антигенам.

н тк о52391 32О2°* 1 о о о 11 11 о он тк о52391 32О2°* 1 о о о 11 11 о оГаптен

н т

к о52391 32О2°* 1 о о о 11 11 о о

н т

к о52391 32О2°* 1 о о о 11 11 о о

е-ДНФ-Ь-лизин....

е-ДНФ-В-лизин

а-ДН ①-L-аланнн а-ДНФ-Ь-фенилаланин ...

а-ДНФ-аминокапроновая кислота 丫-ДН①-амнномасляная кислота ДНФ-глицин 2,4-динитрофенол

\н、\н、СООНСООНхнхнsc лsc л/~ А минобенюйнаякислота/~ А минобенюйнаякислота力-Аминосульфоноваякислота力-Аминосульфоноваякислота

\н、

\н、

СООН

СООН

хн

хн

sc л

sc л

/~ А минобенюйнаякислота

/~ А минобенюйнаякислота

力-Аминосульфоноваякислота

力-Аминосульфоноваякислота

Оба ароматических соединения имеют в пара-положении отрицательно заряженный заместитель. Заместители отличаются степенью своей нуклеофильности, которая у сульфогруппы ощутимо выше, чем у карбоксильной группы, что приводит к более выраженному смещению облака л-электронов ароматического кольца в направлении заместителя, представленного сульфогруппой в сравнении с карбоксильной группой. Это обстоятельство и различия в размере замещающей группы достаточны, очевидно, для того, чтобы каждое соединение реагировало только с направленным к нему антителом.

Вопрос о размере детерминантной группы конъюгированного антигена, вкладе в ее специфичность различных радикалов был изящно проанализирован И. Шехте- ром (I. Schechter, 1970). В качестве антигена использовали конъюгаты белка с олиго-О-аланином (пептиды присоединяли к белку через свободную карбоксильную группу). Реакцию между антителами к поли-В-аланину и тест-антигеном ингибировали с помощью различных по размеру олигопептидов из D- и L-аланина. Как оказалось, ингибирующий эффект гаптенов нарастал от ди- к тетра-Б-аланину. Дальнейшее увеличение длины пептида не усиливало его ингибирующих свойств. Тетра-Ь-ала- нин был совер.шенно не активен как ингибитор. Эти данные означают, во-первых, что антитела четко различают олигопептиды из право- и левовращающих аминокислот, не имеющие регулярной вторичной структуры. Во-вторых, очевидно, что активный центр антитела соответствует по размеру тетрапептиду.

Дальнейшие опыты показали, что вклад каждого остатка аланина в связывание тетрапептида антителом далеко не одинаков. Были синтезированы аналоги гаптена, в которых один из остатков аланина заменяли на глицин (табл. 1). В случае замены N-концевого аланина на глицин константа связывания такого гаптена по сравнению с тетрааланином уменьшалась в 100 раз. Напротив, за-

Таблица 1. Исследование специфичности антител к поли-Ь-алани- ну с помощью тетрапептидов различного строения

Пептиды

Концентрация для 50% ингибирования, ммоль

△2F) кДжХмоль—1

Ala Ala Ala Ala

0,09

-—

Ala Ala Ala Gly

0,09

0

Ala Ala Gly Ala

0,18

1,76

Ala Gly Ala Ala

0,70

5,25

Gly Ala Ala Ala

2,9

8,82

丨 AF — см. раздел 4.3.

мена С-концевого аналина на глицин почти не сказывалась на величине константы связывания. Поскольку пептиды присоединяли к белку-носителю через С-концевую группу, можно заключить, что решающий вклад в связывание гаптена антителом вносит наиболее удаленный от молекулы белка-носителя участок присоединенного к ней пептида: в рассматриваемом случае метильная группа N-концевого аланина. Такая группа в молекуле гаптена получила название иммунодоминантной.

Конъюгированные антигены оказались весьма полезными для изучения многих ключевых проблем клеточной иммунологии, вопросов регуляции иммунного ответа. Применение конъюгированных антигенов для решения указанных задач мы рассмотрим в соответствующих разделах.

Белки и синтетические полипептиды

Изучение антигенной структуры белков осуществляют с помощью нескольких методов: 1) исследованием продуктов ограниченного протеолиза, 2) химической модификацией различных боковых аминокислотных остатков с последующим анализом антигенного строения образующегося продукта, 3) разрушением присущей данному белку вторичной и третичной структуры. Каждый из перечисленных методов имеет свои ограничения, в силу чего достаточно полная информация о строении детерминантных групп белков может быть получена лкшь при сочетании ряда методов.

При расщеплении мономера флагеллина (молекулярная масса 40 000) по остаткам метионина с помощью бромциана образуются 4 фрагмента, размер которых

приведен на рис. 5. Фрагмент А, составляющий менее половины молекулы, имеет в своем составе все антигенные детерминанты этого белка (вероятно, три), так как полностью ингибирует реакцию антител против нативного флагеллина с нерасщепленным флагеллином. Существенно, что указанный фрагмент в отличие от остальной части молекулы содержит относительно резистентные к дей-

8ADC

н2 N I11—i1 соон

Рис. 5. Фрагменты, образующиеся при расщеплении флагеллинабромцианом

ствию пепсина и трипсина участки полипептидной цепи. Это согласуется с заключением, согласно которому резистентность к ферментативному гидролизу служит фактором, благоприятствующим проявлению антигенных свойств биополимера.

У глобулярных белков с большим содержанием а-спиральных участков антигенные детерминанты располагаются в местах изгиба скрученной в спираль цепи. Так, в миоглобине кашалота (sperm whale myoglobin) детерминанты располагаются между остатками 15—29, 56—69, 70—76, 77—89, а также в С-концевой части молекулы (рис. 6). Эти данные были получены при анализе продуктов гидролиза миоглобина трипсином и химотрипсином.

Как и в молекуле миоглобине, у стафилококковой нуклеазы антигенные детерминанты расположены на поверхности молекулы преимущественно в тех участках, где между спирализованными отрезками пептидной цепи находятся неспиралпзованные участки.

При антигенном анализе продуктов протеолиза белков желательно использовать антисыворотки от нескольких животных, полученные в различные сроки после иммунизации. Так, в случае изучения антигенной структуры белка вируса табачной мозаики было установлено, что индивидуальные антисыворотки кроликов реагируют, как правило, с С-концевым декапептидом, но часть антисывороток содержит антитела против N-концевого декапептида. Антитела к С-концевому декапептиду от некоторых кроликов взаимодействуют с пептидом, от которого отщеплен С-концевой аргинин, в то время как антитела от других кроликов распознают детерминанту только

наглядностинаглядностипри наличии С-концевого аргинина. Для приводим структуру указанного пептида:

наглядности

наглядности

Н2M—Thr—Thr—Ala—Al a —Giu—Leu—Asp—Ala—Thr— Arg—СООН

Полученные в ранние сроки после иммунизации антитела кролика против растворимого коллагена из кожи

Рис. 6. Строение молекулы миоглобина кашалотаРис. 6. Строение молекулы миоглобина кашалота

Рис. 6. Строение молекулы миоглобина кашалота

Рис. 6. Строение молекулы миоглобина кашалота

крыс реагируют с детерминантами в С-концевой части молекулы, а «поздние» антитела взаимодействуют также с N-концевым участком. ,

При иммунизации кроликов лизоцимом из яиц кур антитела появляются впервые через 10 дней. Но только через 2—3 месяца накапливаются определимые их количества, реагирующие с пептидами, которые включают остатки с 1 по 20 и с 60 по 83, поперечно связанные дисульфидной связью с остатками 123—129.

Закономерен вопрос, нельзя ли избежать отмеченных выше трудностей антигенного анализа, отказавшись от традиционной техники получения антител в результате иммунизации и оперируя вместо этого моноклональными антителами, полученными с помощью гибридомной техники (см. гл. 12). Очевидно, что для детального анализа антигенной структуры, например белков, необходимо использование большого числа индивидуальных клонов. Чтобы учесть генетические особенности иммунного ответа индивидуальных реципиентов, придется производить слияние с клетками плазмацитомы лимфоидных клеток от генетически неидентичных особей, отбор которых может быть ли,шь случайным. Тем самым степень неопределенности задачи не уменьшится.

Продолжив рассмотрение вопроса о строении детер- минантных групп белков, проанализируем один из широко применявшихся для этих целей методов, связанных с химической модификацией боковых аминокислотных остатков в глобулярных белках. Такое воздействие оказывает влияние на их антигенные свойства. В результате модификации изменяется, как правило, конформация молекулы. Так, модификация с помощью ангидрида янтарной кислоты (сукцинилирование) 32 и 57 аминогрупп в молекуле бычьего сывороточного альбумина уменьшает способность белка взаимодействовать с антителами на 8 и 65% соответственно. Измерение при этом объема молекулы модифицированного альбумина, оцененное по величине стоксовского радиуса, показало, что в первом случае он возрастает на 27%, а во втором—уже на 78%. Следовательно, увеличение степени гидратации модифицированного белка за счет роста его отрицательного заряда при определенной степени модификации несомненно связано со значительным изменением нативной кон- (Ьормации. Последнее выражается и в разрушении детер- м.инантных групп. То, что это заключение справедливо и инактивация белка как антигена в описанном выше примере не обусловлена лишь замещением аминогрупп, подтверждается данными, полученными прн антигенном анализе бычьего сывороточного альбумина, в молекуле которого было амидинировано 58 аминогрупп. При таком способе модификации заряд белковой молекулы не изменяется. Не изменяется при этом и стоксовский радиус. Антигенная структура модифицированного таким способом белка также практически полностью сохраняется.

Убедительные свидетельства существования как в глобулярных, так и в фибриллярных белках антигенных детерминант, структура которых зависит от пространственной конформации молекулы (эти детерминанты называются конформационными или конформационнозависимыми), были получены при сравнении антигенных свойств нативных и денатурированных белков.

В случае восстановления внутрицепьевых дисульфидных связей в молекуле рибонуклеазы в присутствии концентрированной мочевины такой белок утрачивает, по данным физических методов исследования, нативную конформацию. Одновременно происходит разрушение его антигенных детерминант, поскольку денатурированный белок не реагирует с антителами против нативного белка. Однако восстановление двух из четырех дисульфидных связей в молекуле рибонуклеазы, выполненное в отсутствие денатурирующих агентов, не сказывается на антигенных свойствах фермента. Аналогичные данные были получены при изучении пепсина, папаина, иммуноглобулина G. Следовательно, сама по себе дисульфидная связь не определяет структуры антигенных детерминант, если при ее разрыве не разрушают стабилизирующих вторичную и третичную структуру нековалентных связей.

Не только третичная, но и четвертичная структура белков определяет их антигенное строение (по крайней мере структуру некоторых антигенных детерминант). Детерминанты, в образовании которых участвуют две или три полипептидные цепи, в том числе цепи различного строения, найдены, в частности, в молекуле гемоглобина, коллагена, иммуноглобулина G. При диссоциации молекулы белка на изолированные цепи такие детермн- нан^тн разрушаются. В случае спонтанной рекомбинации пептидных цепей с восстановлением активной конформации восстанавливается также структура антигенных детерминант, в образовании которых участвуют две или более цепей.

Даже незначительные изменения конформации белка способны повлечь за собой ощутимые изменения его антигенной структуры. Так, удаление гема из молекулы метмиоглобина (обработкой на холоду подкисленным ацетоном) приводит к появлению свободного от гема белка — апомиоглобина. Последний отличается от нативного белка уменьшением содержания а-спиральных участков с 56—64 до 42—49%. Одновременно происхо-

дит небольшое набухание молекулы, увеличение ее асимметрии. Увеличивается чувствительность белка к протеолизу, доступность для модификации остатков тирозина и гистидина. Эти и другие данные указывают на меньшую конформационную устойчивость апомиоглобина по сравнению с метмиоглобином. Антитела к метмиоглобину имеют низкую степень сродства к апомиоглобину. Если путем добавления гема к апомиоглобину реконструировать молекулу метмиоглобина, восстанавливается также и его антигенная структура.

Вообще спонтанное восстановление конформации денатурированного белка ведет к восстановлению его антигенной структуры. Это продемонстрировано на совершенно различных по степени сложности структурной организации белках, в том числе на таких, как рибонуклеаза и иммуноглобулин G. Тем самым антигенный анализ может служить одним из надежных методов оценки степени ренатурации белка.

Особо следует рассмотреть вопрос о специфичности антител, образующихся при иммунизации денатурированными белками. Они взаимодействуют только с денатурированным белком, причем антитела к одному из денатурированных белков взаимодействуют с другим денатурированным белком. Это наблюдается и в том случае, когда изучаемые белки в нативном виде не имеют антигенного родства. Здесь надо иметь в виду, что, утратив определенную конформацию вследствие денатурации, белок приобретает некоторую другую конформацию, чаще всего хаотического клубка (random coil), которая допускает возникновение у разных белков статистически вероятных пространственных структур, мало зависящих от их первичной структуры. Скорее всего именно благодаря этим структурам возникает антигенное родство различных денатурированных белков.

Как отмечалось в предыдущем разделе, конъюгированные антигены, имеющие в качестве детерминантных групп пептиды, например пептиды из D-аланийа, индуцируют образование антител, реагирующих с тетра- и даже триаланином. Подобные пептиды не имеют устойчивой конформации. Следовательно, антитела в этом случае распознают лишь определенную аминокислотную последовательность. Такого типа детерминанты, получившие название секвенциальных, по-видимому, крайне редко встречаются в глобулярных белках. Даже короткие отрезки пептидных цепей глобулярных белков, с которыми

реагируют антитела, например, С-концевой гептапептид миоглобина, имеют определенную пространственную конформацию. Однако в фибриллярных белках есть участки пептидных цепей, лишенные вторичной структуры. Так, большая часть кроличьих антител против гетерологичного коллагена направлена против коротких неспиральных N-концевых участков цепей. Эти антитела реагируют также с Х-концевыми участками полипептидных цепей денатурированного растворимого коллагена.

Одним из основных доказательств принадлежности антигенной детерминанты белка к секвенциальному типу служит наличие иммунодоминантной группы в виде концевого аминокислотного остатка. Иммунизируя кролика Fab-фрагментом аутологичного иммуноглобулина G (см. гл. 3), можно получить антитела, реагирующие только с этим фрагментом, но не с целой молекулой иммуноглобулина. Антитела практически полностью утрачивают способность реагировать с фрагментом после обработки последнего карбоксипептидазой (Л. Бартова, Г. Маргумнс, 1985). В использованных для протеолиза условиях от одной из пептидных цепей Fab-фрагмента отщепляется только С-концевой лейцин. Последний служит нммунодомннантной группой детерминанты секвенциального типа, находящейся в С-концевой части фрагмента. 一

Важным подтверждением существования антител против конформационных и секвенциальных детерминант послужили эксперименты с синтетическими полипептидами, выполненные в лаборатории М. Села (М. Sela, 1968). Были использованы два типа пептидов, каждый нз которых имел в своем составе трипептид: Туг — Ala — Glu (TAG). Один пептид обладал разветвленной структурой, будучи образован сополимером аланина и лизина (—A—L—), к £-амнногруп1и“ которого апериодически были присоединены указанные трипептиды —TAG. Второй пептид представлял собой периодический полимер в форме а-спирали с форм\\пой (TAG),. Как видно из рис. 7, при различной структуре оба полипептида имели в своем составе блоки TAG; они характеризовались сходными молекулярными массами.'

Каждый из полипептидов был использован в качестве антигена для иммунизации кроликов. Полученные антитела не реагировали перекрестно со сравниваемыми полимерами. Трипептид—TAG блокировал реакцию меж-

-^—■ D L— A la ^* Lys-^—■ D L— A la ^* LysТугTvrAlaAlaТугTvrAlaAlaТ\г ТугТ\г ТугРис. 7. Разветвленный полипептид аланина и лизина и периодический Glu)nРис. 7. Разветвленный полипептид аланина и лизина и периодический Glu)nду разветвленным полимером (TAG)—А—L— и антителами к нему, но не влиял на реакцию (TAG)n с направленными к нему антителами. В качестве гаптенов — аналогов (TAG)„ — синтезировали олигопептиды с различным числом регулярно повторяющихся блоков TAG. Выраженной способностью связываться с антителами против (TAG) „ обладал пептид из 9 блоков, т. е. (TAG)9.

-^—■ D L— A la ^* Lys

-^—■ D L— A la ^* Lys

ТугTvr

AlaAla

ТугTvr

AlaAla

Т\г Туг

Т\г Туг

Рис. 7. Разветвленный полипептид аланина и лизина и периодический Glu)n

Рис. 7. Разветвленный полипептид аланина и лизина и периодический Glu)n

(Tyr—Ala—Glu),“

на основе поли-D, L-полнмер (Туг — Ala —

Такой петид еще не формирует устойчивой а-спирали. Но согласно данным, полученным методом циркулярного дихроизма, взаимодействие (TAG)g с антителами ведет к его спирализации. Следовательно, антитела способны оказать конформирующее влияние на гаптен (оно было особенно выражено в случае пептида (TAG) 13).

Совокупность данных о строении ряда белков, локализации в их молекулах детерминантных групп, общих представлений об организации антигенных детерминант белков позволили синтезировать пептиды, соответствующие детерминантным группам природных белков. Эти пептиды либо индуцировали образование антител, реагирующих с нативным белком, либо реагировали с антителами к нативному белку. Так, периодический полимер из трипептидов: Pro — Gly — Pro, формировавший характерную для коллагена тройную спираль, индуцировал образование антител, реагировавших с коллагеном, выделенным от рыб, крысы и морской свинки. На твердо-

фазном носителе был синтезирован пептид, воспроизводящий последовательность с 64-го по 82-й остатки лизоцима из куриного яйца (рис. 8). Полуцистиновые остатки в позициях 64 н 80 были замкнуты в дисульфидную

707075751001006060454520 1120 1185851515252510103030125125^w^i— Дисульфидная связь^w^i— Дисульфидная связь115115120120Рис. 8. Структура молекулы лизоцима куриного яйца. Окружностью отмечена петля полипептидной цепи, стабилизированная внутрицепьевой дисульфидной связью (loop peptide)Рис. 8. Структура молекулы лизоцима куриного яйца. Окружностью отмечена петля полипептидной цепи, стабилизированная внутрицепьевой дисульфидной связью (loop peptide)80804040105105

70

70

75

75

100

100

60

60

45

45

20 11

20 11

85

85

15

15

25

25

10

10

30

30

125

125

^w^i— Дисульфидная связь

^w^i— Дисульфидная связь

115

115

120

120

Рис. 8. Структура молекулы лизоцима куриного яйца. Окружностью отмечена петля полипептидной цепи, стабилизированная внутрицепьевой дисульфидной связью (loop peptide)

Рис. 8. Структура молекулы лизоцима куриного яйца. Окружностью отмечена петля полипептидной цепи, стабилизированная внутрицепьевой дисульфидной связью (loop peptide)

80

80

40

40

105

105

связь, после чего образовавшуюся петлю (loop peptide) присоединяли к носителю в виде линейного полимера: поли-ВЕ-Ак-поли-Ь-Ьуз. В ♦ результате иммунизации таким антигеном были получены антитела, реагировавшие с нативным лизоцимом, а в пределах его молекулы именно с тем участком, который соответствовал синтезированной петле. В свою очередь антитела к нативному лизоциму реагировали с синтезированным пептидом (рис. 9). Восстановление внутрицепьевой дисульфидной

связи, превращавшей синтезированный пептид в петлю, так изменяло его конформацию, что он утрачивал способность реагировать не только с антителами против нативного лизоцима, но и с антителами, полученными против того же пептида, но в виде петли. Следовательно,

Рис. 9. Структура петли (loop peptide) молекулы лизоцима

пептид в форме петли представляет собой типичную конформационную детерминанту.

Оцепить размер конформационной детерминанты достаточно сложно. Ее могут образовывать аминокислотные остатки, удаленные друг от друга в первичной структуре. но сближенные в пространстве после образования третичной структуры. Так, замена двух аминокислотных остатков (позиции 153 и 191) в молекуле легкой (х) цепи иммуноглобулина G человека сопровождается изменением структуры только одной антигенной детерминанты. Указанные остатки находятся в двух различных петлях пептидной цепи, однако они сближены в пространстве таким способом, что контактируют между собой. Из рассматриваемого примера следует, что у конформационной детерминанты есть остов, или каркас, который стабилизирует в пространстве расположенные на поверхности молекулы боковые аминокислотные остатки, определяющие специфичность детерминанты.

Определить размер детерминант секвенциального типа значительно проще, используя, например, технику ингибирования реакции между исследуемым антигеном и антителами к нему с помощью различных по размеру

Таблица 2. Размер секвенциальных детерминант

Антиген

Детерминанта

Размер активного центра, нм3

Полиаланин-БСА 1

Тетрааланин

2.5X1,1X0,65

Полилизин-БСА1

Пеитализин

2,7X1,7X0,65

Полиглутаминовая кислота БСА 1

Гексаглутаминовая кислота

3,6X1,ОХ 0,6

Сополимер: GlU5$LyS48Tyr6

Пентадиамин

—

Декстран

11зомальтогексаоза

3,4Х1,2ХО,7

Денатурированная ДНК

Пентануклеотид

2,8X1,ОХ 1,0

альбумин быка, использованный в качестве белка-

1 БСА — сывороточный носителя.

пепт11дов. O6paniaeT на себя внимание тот факт, что у самых различных соединений размер секвенциальных детерминант незначительно отличается друг от друга (табл. 2). В таблице указаны приближенные размеры активных центров антител, рассчитанные на основе молекулярных параметров детерминанты.

Нуклеиновые кислоты и синтетические полинуклеотиды

С целью получения антител к нуклеиновым кислотам для иммунизации используют нуклеопротеины пли очищенные нуклеиновые кислоты, ковалентно связанные с белком-носителем или адсорбированные на метилированном сывороточном альбумине. Таким путем можно получить антитела, реагирующие с двуспиральной РНК, денатурированной или одноцепочечной ДНК, но не двуспиральной ДНК. Несмотря на это можно получить антитела, реагирующие с синтетическими двуспиральными дезоксирибонуклеотидами. Так, полндезо- ксигуанил-дезоксицитидиловая кислота (поли-dGdC), комплексированная с белком, индуцирует образование антител, реагирующих с полп-dGdC. В то же время невозможно получить антитела против поли-dAdT (поли- дезоксиаденил-дезокситимидиловая кислота), используя этот дезоксирибонуклеотид в качестве детерминантной группы конъюгированного антигена.

Ранее считали, что нуклеиновые кислоты способны быть только гаптенами и антитела к ним можно получить

лишь после комппскснровання с белком. Однако позднее было показано, что некоторые синтетические полинуклеотиды способны индуцировать образование антител сами по себе. Так, морские свинки отвечают образованием антител в ответ на введение полиинозиловой и полицитидиловой кислоты (поли-1-поли-С) и полиадениловой и полиуридиловой кислот (поли-Л-поли-U). У мышей различных пибредных линий можно индуцировать продукцию антител IgG-K.】acca против поли-1-поли-С. Если вводить указанный двуспиральный полинуклеотид с адъювантом (см. гл. 11), происходит также образование антител. Более вероятно получить IgG-аититсла против синтетических полинуклеотидов, используя для иммунизации их конъюгаты с белком.

Иммунный ответ на полп-1-поли-С тнмуснезависим: неон&тальпая (в момент рождения) тимэктомия не подавляет ответ на этот полинуклеотид. Более того, при любом способе элиминации у мышей клеток тимуса их иммунный ответ на полп-1-поли-С даже усиливается.

Здесь мы сталкиваемся с важным иммунологическим явлением: обусловленным Т-супрессорами подавлением иммунного ответа. 11зучение причин низкой иммунореак- тпвностп в отношении нуклешюсых кислот н их синтетических аналогов и практически полного отсутствия в норме спвета против нативной ДНК выявило большое число присутствующих в норме Т-супрессоров, специфически подавляющих ответ против нуклеиновых кислот. Объяснить этот феномен удалось, изучая имм^^нологиче- скпй статус мышей со спонтанно возникающим аутоиммунным процессом: новозеландских черных мышей (XZB), гибридов первого поколения (Fi) этих мышей с новозеландскими белыми мышами (NZW) и мышей линии MRL и BxSB.

Новозеландские мыши клинически нормальны в течение первых трех месяцев жизни. Позднее у них возникают нарушения в процессе созревания Т-лимфоцптов — в отличие от более молодых особей той же линии у них крайне ослаблены реакции трансплантационного иммунитета, практически полностью подавлена продукция гормонов тнмуса. В этот период спонтанно появляются антитела против клеток тимуса, убивающие их в присутствии комплемента. Следствием всех этих процессов является дефицит рецнркх пирующих Т-лимфоцитов.

На фоне дефицита Т-клеток у мышей NZB, NZW, MRL и BxSB появляются антитела против ДНК и РНК.

Появление антител против двусппральной ДНК может быть связано с вирусной инфекцией. Опи имеют наибольшее сродство к PIIK вирусного происхождения, меньшее—к П0ЛИ-1-1ЮЛИ-С и еще меньшее — к рибосомальным и транспортным РНК. Появление антител к нативной ДН1\ может быть результатом неспецифической активации всех без исключения клонов В-лпмфоцитов (так называемая поликлональная активация). Этот процесс обусловлен действием на В-лимфоциты неспецифическпх стимуляторов их митогенеза, но реализуется он лишь потому, что происходит резкое уменьшение числа Т-супрес- соров.

Процесс, сходный с таковым у мышей, наблюдается при одном из тяжелых аутоиммунных заболеваний человека——системной красной волчанке (systemic lupus erythematosis) (см. гл. 11). У этих больных в сыворотке присутствуют антитела против РНК и нативной ДНК, причем содержание антител коррелирует с тяжестью заболевания.

Экспансия каона клеток, прекоммитированных к синтезу антител против ДНК, может возникать при опухолевом процессе у человека — так называемой множественной миеломе. Клетки аналогичной опухоли мышей (плазмацитома) продуцируют иммуноглобулины, специфически взаимодействующие как антитела с рядом пуриновых и пиримидиновых оснований.

Полисахариды

Полисахариды составляют большую п важную в биологическом отношении группу антигенов. Они входят в состав капсулы н клеточной стенки микробов, определяя их антигенную специфичность. Выраженными антигенными свойствами обладают полисахариды растительного происхождения. Будучи составной частью цитоплазматической мембраны клеток животного происхождения, полисахариды играют важную роль в формировании их антигенной структуры. В меньшей степени изучены антигенные свойства углеводных компонентов растворимых глобулярных белков.

Большинство полисахаридов микробного происхожде- ння устойчиво к гидролизу ферментами млекопитающих, что, как уже упоминалось, служит важным фактором реализации антигенных свойств биополимеров.

Иммунохимия полисахаридов может быть детально рассмотрена на примере полисахаридов, входящих в состав стенкп грамотрицательных бактерий. Они являются составной частью липополисахаридного комплекса (ЛПС), который, в свою очередь, образует комплекс с белками и фосфолипидами ке(ралинового типа. ЛПС представляет собой соматический антиген, в силу чего на основе особенностей его строения осуществляется

EthN

Gic — глюкоза. Gal — галактоза. Hep ——гептозы, KDO — 2-кетодидезоксиоктанат, GlcNAc — N-ацетилглюкозамин, EthN — этаполамин

иммунологическая (или серологическая) классификация грамотрицательных бактерий. Значительный вклад в пммунохимичсское изучение ЛПС внес в 60—70-е годы О. Вестфаль с сотрудниками (О. Westphal).

ЛПС подразделяют на три района. Район I — так называемый О-специфический полисахарид, образован многократно повторяющимися единицами, образованными трнсахарпдами. Он отличается большой вариабельностью—-разнообразные сахара могут находиться в различных комбинациях и соединяться разными типами гликозидных связей. Район II образован олигосахаридом, общим для ЛПС всех бактерии рода Salmonella, что определило его название: основной кор (basal core). Район III — липид А, гликолипид, содержащий глюкозамнн, жирные кислоты н фосфаты. Общая схема строения ЛПС представ юна на рис. 10.

Несколько описанных выше единиц ЛПС, как правило три, образуют одну большую структурную единицу в

стенке бактерий. Молекулы ЛПС объединены фосфо- эфирными связями посредством липида А.

ЛПС получают фенольной экстракцией бактериальной массы. В результате обработки ЛПС горячей укосной кислотой удаляют липид А, хотя при этом происходит частичная деградация полисахарида. Последний получил название полисахарида Фримана.

Качественные особенности углеводного компонепта ЛПС называют хелютшюм. 11зучение свыше 150 штаммов Salmonella н Escherichia coll позволило охарактеризовать несколько десятков хемотипов. Опи образуются за счет различных комбинаций 3,6-дпдезоксигексоз (тивелоза, паратоза, абеквоза, колитоза), 6-дезоксигексоз (рамноза, фукоза), гексоз (глюкоза, галактоза, манноза в форме а- пли р-ппранозида), дезоксипентозы (2-дезок- си D-рибоза в фуранозной форме), гексозампнов (глю- козамип п галактозамин).

На рис. 11 представлены повторяющиеся единицы некоторых полисахаридов сальмонелл. На основную цепь «навешены» боковые цепн. Структура цепей установлена путем сравнительного химического изучения различных мутантов. При сочетании такого исследования с антигенным анализом удается охарактеризовать иммунодомина нт и ые группы, или О-факторы. Их роль выполняют концевые сахара боковых цепей. Что касается структуры всей детерминантной группы, то в ее образовании помимо боковой цепи участвует сахар из основной цепи, к которому присоединена боковая цепь. Таким образом, имеется известное сходство в строении детерминант разветвленных полисахаридов и конъюгированных антигенов па основе модифицированных белков (см. разд. 2.1). Природа нммунодоминантных групп у некоторых подгрупп сальмонелл представлена на рис. 12.

Большое значение в иммунологических исследованиях приобрели капсульные полисахариды пневмококков. Как и другие капсульные полисахариды, они содержат большое количество уроновых кислот. На осповапии особенностей аптпгепных свойств капсульных полисахаридов идентифицировано свыше 70-типов пневмококков.

В полисахаридах пневмококков весьма велико разнообразие ампносахаров, находящихся в форме N-ацетпль- пых производных. Из нейтральных сахаров встречаются только три, причем наиболее часто L-рамноза. Очень широко используемый в иммунологических исследованиях

пневмококковый полисахарид SIII имеет следующую регулярно повторяющуюся единицу:

3 Глюкуроновая 1,4 Глюкоза 1

尸 кислотаaf

₽

Многократно повторяясь, такие структуры образуют цел-лобиуроиовую кислоту, минимальная молекулярная мае-

Подгруппа

Пов юряющаяся с [рук гура О-антигена

Abe

В

Glc

а-13

x-J,6

1.3

a-l 1 — Gal―—

7夕一1,4

M ап"^- R ha

GIcGIc2—Ac—Abe

GIc

GIc

”13”13”1,6

”13

”13

^Man —'-4 - Rha—^^Man —'-4 - Rha—^

^Man —'-4 - Rha—^

^Man —'-4 - Rha—^

DiDi2—Ac—Glc2—Ac—Glc”1.3”1.3”1、4”1、4

Di

Di

2—Ac—Glc

2—Ac—Glc

”1.3

”1.3

”1、4

”1、4

-*^ Man-*^ Mana—1 ?Rha——二a—1 ?Rha——二Gal-2^Gal-2^ElElAcAc*- Man*- Manx-L4>-Rhax-L4>-RhaE2E2—Man :屮 a rha—口—a Gal—Man :屮 a rha—口—a Gal

-*^ Man

-*^ Man

a—1 ?

Rha——二

a—1 ?

Rha——二

Gal-2^

Gal-2^

El

El

Ac

Ac

*- Man

*- Man

x-L4

>-Rha

x-L4

>-Rha

E2

E2

—Man :屮 a rha—口—a Gal

—Man :屮 a rha—口—a Gal

Рис. 11. Основные структурные элементы 0-антигенов саль-монелл различных подгрупп:

Abe — абекЕоза, Мап — манноза, Glc — глюкоза. Gal — галактоза,Tyv — тивелоза, Rha — рафиноза

са которой приблизительно равна 60 000. Антитела против SIII распознают указанную выше структурную единицу полисахарида, о чем св идете льствует, в частности, тот факт, что частично окисленный хлопок, содержащий цел- лобиуроновую кислоту, реагирует с антителами против SIII.

Большое значение для выяснения структуры детерми- наптных групп полисахаридов имело изучение декстра-

нов. Это экзополпсахарнды, продуцируемые некоторыми грамположптельными бактериями {Leuconostoc meseti- iroides, Leuconosioc dexlrantcum, Streptococcus viridans) л представля1дщие собой полимеры глюкозы с молеку-

ГлюкозаГлюкозаS. paratyphi AS. paratyphi AПодгруппа AПодгруппа AПара, о за ГлюкозаПара, о за ГлюкозаРамнозаРамнозаПодгруппа ВПодгруппа ВГалактоза МаннозаГалактоза МаннозаРамнозаГлюкозаРамнозаГлюкоза9 q9 qАбеквозаАбеквозаS. paratyphi ВS. paratyphi В

Глюкоза

Глюкоза

S. paratyphi A

S. paratyphi A

Подгруппа A

Подгруппа A

Пара, о за Глюкоза

Пара, о за Глюкоза

Рамноза

Рамноза

Подгруппа В

Подгруппа В

Галактоза Манноза

Галактоза Манноза

Рамноза

Глюкоза

Рамноза

Глюкоза

9 q

9 q

Абеквоза

Абеквоза

S. paratyphi В

S. paratyphi В

Рис. 12. Концевые моносахариды, выполняющие функцию иммунодо-минантных групп О-антигенов у некоторых видов грамотрицательныхбактерий

л яр ной массой, превышающей 106. В основном скелете связь преимущественно а=1,6, а в боковых цепях —— (/=1,2, а — 1,3 и а=1,4. Весьма значимые для иммунохимии работы по изучению декстрана были выполнены Э. Кэботом (Е. Kabat, 1959), использовавшим, в частности, в качестве источника антител против декстрана собственную сыворотку. Оценивая реакцию с антидекстра- новыми антителами различных по длине цепи олигосахаридов, удалось установить размер детерминантной

группы декстрана. Максимальной связывающей способностью обладали гекса- и гептасахарпды. Опыты выполняли с олигосахаридами, имеющими а= 1,6 или а= 1,4 связи (как и в боковых цепях декстрана). 11оследние оказались менее активными, исходя из чеГо можно заключить, что у декстрана иммуподомппантным служит концевой «-связанный глюкозидный остаток.

В других опытах декстран фиксировали на нерастворимой основе и на полученном сорбенте специфически связывали антитела. Для их элюции нсно.хьзовалн различные по длине цепи олигосахариды. Были элюированы две фракции антител: первая ——комплементарная изомальтотриозе, и вторая — изомальтогексаозе. 11зомаль- тогексаоза эффективно ингибировала реакцию обеих фракций антител с декстраном. Следовательно, антитела неоднородны по размеру активных центров.

Олигосахариды различного размера конъюгировали с белком 1 н иммунизировали полученными конъюгатами кроликов. Антитела против производных а-мальтозы реагировали с а-1,6 декстраном, а антитела против производных а-глюкозы — нет. Это означает, что антитела к «декстрану направлены к детерминантам, образованным несколькими глюкозидными остатками.

Один нз эффективных методов изучения детерминант- иых групп полисахаридов состоит в анализе перекрестно реагирующих полисахаридов. В случае реакции с антителами пневмококковых полисахаридов — SIII и SVIII эффективными ингибиторами служат гекса- и октасахариды соответственно. При перекрестном анализе реакцию удавалось заблокировать тетра- и даже дисахаридом целло- бнуроновой кислоты. Поэтому дисахарид можно рассматривать как общую для обоих полисахаридов иммунодо- минаптную группу. Другим примером может служить перекрестная реакция стрептококка группы Л с антителами против стрептококка группы L и наоборот. Иммунодоми-

1 Это можно осуществить, в частности, путем реакции азосочетания диазотированного производного — аминофенилфлавазола с любым олигосахаридом (R):

т-Ами нофенилфлавазол

нантной Ppynnoii, общей для обоих полисахаридов детерминанты, с>1А'жит N-ацетилглюкозамин.

Бактериальные полисахариды с регулярно повторяющимися структурным и единицами принадлежат к числу тимуснезависим\1х антигенов. Их способность индуцировать образованыДантител прямо зависит от степени полимеризации. Так, чистый О-полисахарид грамотрниате.чь- ных бактерий имеет ^онекулярную массу, приблизительно равную 10 000—20 00(1 и не способен индуцировать синтез антител. В то же вр兩只 высокополимерныи ЛПС или тот же полисахарид, входящий в состав полного О-анти- гена (О-антиген помнмо'полнсахарнда содержит липид А и белок), обладает выраженными антигенными свойствами. Как ЛПС, так и полный О-антиген склонны к агрегации и образуют мицеллы с молекулярной массой в несколько миллионов (в присутствии бивалентных катионов) .11ммунный ответ на ЛПС прямо зависит от степени агрегации.

Крайне важным при нндукинн биосинтеза антител на полисахариды является правильный выбор дозы антигена. Классические опыты, иллюстрирующие зависимость реакции организма от дозы полисахарида, выполнены на мышах, которым вводили пневмококковый полисахарид Sill (L. Felton et al., 1942).

Очень низкая доза SIII (0,5—1,0 мкг) защищает мышей от последующего инфицирования пневмококком. Большая доза (500 мкг) вызывает специфический иммунологический паралич и полностью исключает возможность защиты мышей от инфекции данным типом пневмококка. Такой типоспецифический паралич наблюдается у мышеи на протяжении 15 месяцев. В течение всего этого периода полисахарид сохраняется в организме, поскольку полисахарид очень устойчив к ферментативному гидролизу. Во время указанного срока полисахарид удается выделить как из печени, так и из селезенки мышей. Не обсуждая здесь причины возникновения иммунологического паралича на SIII (см. гл. II), отметим лишь, что именно персистенипя полисахарида — основная причина продолжительности иммунологического паралича. Это продемонстрировали опыты с ферментами Вас. pa lust г is, расщепляющими SIII до гексосахарпдов. Если SIII вводили в большой дозе, а затем тем же животным инъецировали ферменты Вас. palustris, у мышей развивался иммунный ответ. Помимо прочего этот результат означает, что для индукции иммунного ответа достаточен кратко-

срочный контакт антигена с пммупокомпетеитиыми клетками. В противном случае ответ не возник 0。из-за расщепления всего введенного антигена.

Полисахариды как антигены действуют на прекомми- тпроваиные к ним В-лимфоцпты и способны трансформировать их в аитптелопродуцпрующие вбеткн без участия Т-хслпсров. Отвечающая на полиса/аридные антигены суб популяция (В]) способна превращаться преимущественно в клетки, продуцирующие IgM-антитела. Ответ на полисахариды не коптролпруетсУ генами иммунного ответа (см. раздел 2.5).

Бактериальные лшополисахариды являются митогенами для В-лимфоцитов. Так, ЛПС из Salmonella typhi, штамм 0901, способен вызвать поликлональную активацию В-лимфоцлгов, т. е. пролиферацию и дифферепциров- ку в аитптелопродуцпрующие клетки В-лимфоцитов, прекоммитированных к синтезу самых разнообразных антигенов. На поверхности В-лимфоцитов находятся специальные рецепторы для ЛПС. Эти рецепторы не имеют иммуноглобулиновой природы и существуют независимо от антигеираспознающих рецепторов н м муноглобул и новой природы (см. гл. 9).

В составе субпопуляцип В-лимфоцитов (Вг), отвечающих на тимусзависпмые антигены, присутствуют клетки, распознающие олигосахариды. Об этом свидетельствует возможность получения антител против конъюгатов белков с сахарами. Ответ на подобные антигены, как указывалось в разделе 2.1, тимусзависим. Во многих случаях конъюгаты белка с сахарами, являющимися иммунодо- минантными в природных полисахаридах, индуцируют антитела, не реагирующие с соответствующими полисахаридами. Это, очевидно, связано с тем, что в образовании детерминанты конъюгированного антигена велик вклад бокового аминокислотного остатка белка-носителя, к которому присоединен заместитель (см. раздел 2.1). Так, в частности, антитела кролика против конъюгата белка с р-азофенил-а-3,6-дидезоксигексапиранози- дом не реагируют с ЛПС энтеробактерий, имеющих в качестве нммуно二омннантннх групп сахара в форме а-пнранознда.

Групповые антигены крови

Олигосахариды, ассоциированные с поверхностью эритроцитов человека, участвуют в фор- мнрованнн антигенов, которые обозначают как группо-

вые вещест&а крови. Сюда относят системы ABO, Rh, Lewis, MN,队Kell, Duffy, Kidd. Наиболее важными из них в практиче^ьюм отношении являются АВО(Н) и Rh, так как птн системы в первую очередь ответственны за совместимость эритроцитов различных индивидуумов, а следовательно, за \озможность переливания крови.

Групповые вещества системы АВО(Н) и фактор Lewis (Le) очень бл^ки по химическому составу: большое число олигосахаридных пспеп, присоединенных к полипептиду, Быгюлнякжлему функцию скелета. Вес цепочки олигосахаридов построены из пяти сахаров: D-галактозы, L-фукозы, Ы-ацетил-О-глюкозамина, N-aue- тилгалактозамина и сиаловой кислоты. Как и в других полисахаридах, антигенная специфичность определяется концевым моносахаридом и характером его связи. Если концевым сахаром служит D-фукоза, образующаяся структура не аптигенна для нормальных индивидуумов, поскольку все они содержат на поверхности эритроцитов подобную детерминанту. Такой антиген получил название Н-субстанции (рис. 13). Фермент фукозилтрансфераза, ответственный за присоединение концевой фукозы, находится под контролем Н-гена, отличного от системы ЛВО- генов. Однако Н-субстанция — обязательный предшественник для формирования детерминант, соответствующих А- н В г рупповым веществам. Соответствующие гены контролируют синтез ферментов, обеспечивающих присоединение к концевой галактозе Н-субстанции N-а цетил галактозамина (А-субстйнция) или D-галактозы (В-субстан- ция). Фактору Le соответствует концевая фукоза (рис. 13). Различные индивидуумы экспрессируют различные структурные гены для ферментов, обеспечивающих присоединение соответствующего той или иной субстангшн концевого моносахарида.

У некоторых индивидуумов не происходит синтез фу- козплтрансферазы, необходимой для образования Н-субстанции. По этой причине у них невозможно также формирование детерминант, соответствующих суб- станцням А и В. Индивидуумы с подобной мутацией (обозначается как фенотип «Bombay») способны образовывать антитела против Н-субстанции, в связи с чем им невозможно перелить кровь ни одной группы. У нормальных индивидуумов, имеющих группу крови А (экспрессирующих А-субстанцию), в крови присутствуют антитела M-класса против группового вещества В, и наоборот. Индивидуумы, не экспрессирующие групповых веществ

A ii В (но экспрессирующих Н-субстанцпю), составляют группу крови 0. В их сыворотке содержатся антнтела против групповых веществ А и В. Исходя из описанной

О-а-、-аиегн 1-и-га лактозами ни п-(1-*3)-[О-а-Ь-ф\ко пп- (1—^2)]-О-/?- 1)-га.1；1к го jh“-(1—»-4)-N-aueTn.n-D-rnK)Ko jumiih

О-а-О-галактоп1.1-(1-*-3)-(О-а-Е-фукои1 i(l-*2)]-O- Д-В-галакго hi 1-(1—►4)-\-аце1ИЛ-П-глюкозамин

Рис. 13. Строение олигосахаридов, определяющих антигенную специфичность групповых веществ крови А(/) и В(〃)(эритроцитов человека); стрелками указаны остатки, которыми две детерминанты различаются между собой

закономерности, при переливании крови, как правило, используют гомологичную кровь или кровь «универсальных доноров» —- ннднвндуумов, имеющих группу 0.

Гликопротеины с детерминантами системы АВО(Н) обнаружены в различных биологических жидкостях —— слюпе, моче, сперме. На поверхности эритроцитов оли-

госахариды, определяющие антигенную специфичность групповых в押еств, присоединены не к полипептиду, а к липиду. В пмЛунохимическом изучении системы АВО(Н) большая роль \ц)пнадлсл<ит Э. Кэботу, В. Моргану и В. Уоткинсу (Е. Kabat, W. Morgan, W. Watkins, 1953— 1966). \

Резус-фактор (Rli^ciicTeMa) эритроцитов не имеет антигенного родства с\、АВ0(Н) системой. Он получил название в свете даннцх К. Ландштейнера, показавшего, что кроличьи антитела против эритроцитов обезьян макак резусов агглютинируют эритроциты у 80% здоровых людей. Иммунохимиче^ки Rh-система изучена пока недостаточно. Ясно только, что она представляет собой большую группу антигенов сходного строения. Наиболее сильным антигеном системы является антиген D (RhD или Rh。). При выявлении этого антигена на поверхности эритроцитов человек считается резус-положительным. Концентрация RhD-антигена на поверхности эритроцитов значительно ниже, чем антигенов системы АВО. В силу стерических причин бивалентные антитела против RhD-антигена не способны эффективно «сшить» между собой резус-положительные эритроциты, что является необходимым условием возникновения реакции гемагглютинации (см. гл. 12). Из-за этого антирезусные антитела ошибочно называют «неполными».

Детерминанты антигена, распознаваемые В- и Т-лимфоцитами

Лимфоциты В-ряда, взаимодействующие с антигеном с помощью рецепторов иммуноглобулиновой природы (см. гл. 9), распознают те же детерминанты, что и антитела, продуцируемые дифференцированными потомками этих клеток—-плазмобластамп и плазматическими клетками.

Рецепторы для антигена на поверхности Т-супрессо- ров сходны, если не идентичны, по специфичности с рецептора ?vi и В-лимфоцитов и антителами, что было убедительно продемонстрировано в опытах с конъюгированными антигенами. Достоверные сравнительные данные о сродстве (аффинность) антигенсвязывающих рецепторов В-лимфоцитов и Т-супрессоров к простым гаптенам еще не получены.

Рецепторы для антигена на Т-хелперах распознают участки молекулы антигена, не совпадающие по прост-

ранственпой локализации и химическом)* строению с антигенными детерминантами, реагирующими с антителами, В-лимфоцитами и Т-супрессорами. Очевидные непрямые свидетельства этого были получены при изучении иммунного ответа на тимусзависимые7 антигены, принадлежащие к группе конъюгированных.

Мышей сенсибилизировали дп^итрофенилпровапным бычьим сывороточным альбумином (ДН①-ВСА). Если повторно вводили тот же антиген, наблюдали продукцию антител как против дшштрофепилыюй группы, так и против белка-носителя. В том случае, когда для второй инъекции использовали дииитрофенилированный яичный альбумин, синтеза антител против ди нитрофенильной группы не происходило только потому, что белок-носитель для второго антигена не имел структурного сходства с белком-носителем первого антигена. Третьей группе мышей, получивших ранее инъекцию ДНФ-БСА, дополнительно вводили чистый яичный альбумин, а спустя некоторое время динитрофенилированный яичный альбумин. Мыши этой группы продуцировали антитела как против динитрофенильной группы, так и против нового белка-, носителя — яичного альбумина (N. Mitchison, 1968). Полученные данные означают, что Т-хелперы распознают детерминанты белка-носителя, но не реагируют с динит- рофенильной группой. После достаточной для иммунного ответа пролиферации и активации Т-хелперов, специфически распознающих новый белок-носитель (яичный альбумин), животные третьей группы оказались способными продуцировать антитела против диннтрофенильной группы, присоединенной к яичпо лу альбумину.

При изучении пммуппого ответа на различные белки продемонстрировано, что структуры, распознавгемыс Т-хелперами, и антигенные детерминанты, распознаваемые В-лимфоцитамн и антителами, пространственно изолированы. Так, в молекуле ферредоксина (молекулярная масса 5800) N-концевая половина молекулы содержит детерминанты, распознаваемые В-клетками, а С-концевая половина — Т-хелперами. Аналогично расположены структуры, распознаваемые В-лпмфоцптами и Т-хелперами, в молекуле глюкагона (молекулярная масса около 3500). Если указанные белки расщепить на N- и С-кон- цевые половины, продукция антител на изолированные половины молекул не происходит. Для получения полноценного антигена обе половины молекулы необходимо

соединить даже с использованием в качестве мостика между ними другого белка.

Убедительн'ым примером структурных отличий между детерминантами, распознаваемыми В-лимфоцитамп и 1 -хелперами, служат результаты изучения проколлагена (Н. Rohde et ai., 19.78). Первый тип этого белка имеет два вида структур: коллагеноподобную и глобулярную, причем каждый участок образует самостоятельный домен. Глобулярный участок образует р-складчатую структуру, стабилизированную пятью дисульфидными связями. Антитела против проколлагена реагируют именно с этим участком. Распознаваемые ими детерминанты принадле- 】кат к конформационному типу — после восстановления дисульфидных связей в присутствии денатурирующих агентов они разрушаются. Коллагеноподобный участок распознается Т-хслперами, причем нативная конформация этого участка для этих клеток не существенна. После необратимого раскручивания спирализованного по типу коллагена домена в 8М мочевине пли в результате прогревания при 55иС детерминанты для Т-хелперов не разрушаются.

Отсутствие связи между пространственной конформацией белков и способностью Т-хелперов специфически распознать их доказано в опытах с денатурированными различными способами лизоцимом, мономерной формой флагеллина, коллагеном, p-цепью инсулина. Эти данные, а также некоторые факты, указывающие на возможность распознавания Т-хелперамп коротких пептидов, изолированных из глобулярных белков, позволяют предположить, что детерминанты для Т-хелперов подобны секвенциальным. Проблему нельзя считать решенной.

Антигены, индуцир^'ющие биосинтез антител, способны индуцировать также реакции клеточного (клеточно- опосредованно!о) иммунитета. Следовательно, определенные структуры этих антигенов должны распознаваться специфически предшественниками эффекторных Т-лимфоцитов и собственно Т-эффекторами. Детерминанты антигена для этих клеток, очевидно, не совпадают по структуре с детерминантами, распознаваемыми антителами (рецепторами В-лимфоцитов).

Существуют данные о том, что специфичность детерминант для эффекторов реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) не зависит от конформации белкового антигена. Так, если нативную и денатурированную формы глобулярного белка, например лизоцима,

использовать для индукции биосинтеза антител, образующиеся антитела не реагируют перекрестно. В то же время нативный и денатурированный белки реагируют перекрестно в реакции ГЗТ. Аналогично, восстановленные и карбоксиметилированные fi-цепи инсулина не реагируют с антителами против нативного инсулина, но вызывают кожные реакции замедленного типа у морских свинок, сенсибилизированных нативным инсулином.

Антигенная специфичность и генотип реципиента

Вся информация об антигенной структуре биополимера пли его синтетического аналога может быть получена на основе корреляции данных о его строении и специфичности антител — антнгенраспознающнх рецепторов лимфоцитов. Однако даже в пределах одного биологического вида отдельные особи распознают, а затем отвечают продукцией антител на различные антигенные детерминанты. На практике сравнивают специфичность антител не отдельных особей, а животных различных инбредных линий одного биологического вида.

При иммунизации морских свинок линий 2 и 13 инсулином было установлено, что животные липин 2 образуют антитела против антигенных детерминант N-концевых половин его полипептпдных цепей, а линии 13 — против С-концевых.

У мышей линии C57BL/6 образуется в 10 раз больше антител против разветвленного полипептида (TG)—А—— L—, чем у мышей линии СВА. Если заменить в полипептиде тирозин на гистидин, то иа пептид со структурой (HG)—А—L— мыши линии СВА отвечают значительно сильнее, чем мыши C57BL/6. В том случае, когда гистидин заменяли на фенилаланин, образующийся полипептид со структурой (PG)—А—L — индуцировал примерно равные количества антител у мышей сравниваемых линий.

Иммунный ответ Fi гибридов СВА на C57BL/6 и гибридов, полученных при возвратном скрещивании, показал, что способность к биосинтезу антител на (TG)—А—L— наследуется. Ген, ответственный за иммунный ответ на этот антиген, равно как п аналогичные гены, контролирующие иммунный ответ на различные белки, полипептиды, конъюгированные антигены, получили название гена иммунного ответа (immune response gene, Ir) (В. Benacerraf, 1976). У мышей эти гены найдены в

17-й хромосоме. Они сцеплены с「енамн основного комплекса гистосовместимости (Н-2), располагаясь в 1-районе Н-2-комп』екса (см. гл. 10).

Как каждый из 1г-генов, Ir-ген, контролирующий ответ на разветвленный полипептид, является аутосомным доминантным геном, аллели которого контролируют ответ на детерминанты, образованные Туг—Glu, His—Glu и Phe—Glu. Наибольшие генетически контролируемые различия наблюдаются при вторичном ответе на сравниваемые разветвленные полипептиды. Эти различия полностью исчезают при использовании для иммунизации комплекса полипептида с белком ——метилированным бычьим сывороточным альбумином. Следовательно, генетически детерминированные различия иммунного ответа определяются природой носителя детермипантной группы. Как показано в разделе 2.4, структуру носителя распознают Т-хелперы. Из этих и других экспериментов со всей очевидностью вытекает, что 1г-гены контролируют ответ на тпмусзависимые антигены и что этот контроль осуществляется на уровне Т-клеток, регулирующих иммунный ответ (см. также гл. 10).

К настоящему времени описано свыше двадцати 1г-ге- иов у мышей. Подобные гены найдены у морских свинок, крыс, обезьян (макак резусов) и человека. Идентификацию Ir-генов осуществляли с использоваппем синтетических полипептидов сходного строения, белковых антигенов (которые вводили в низких дозах с целью обнаружения ответа только на наиболее иммуногенные детерминанты) ,а также аллоантпгенов, лишь в незначительной степени отличающихся по своему строению от аналогичных собственных биополимеров. Не обнаружено ни одного тнмуснезавнснмого антигена, п?у1мунпый ответ на который находился бы под контролем 1г-генов.

Один и тот же Ir-ген может контролировать иммунный ответ на несколько антигенов, различающихся с точки зрения классической иммунологии по антигенной специфичности. Это значит, что к сравниваемым антигенам образуются антитела, не реагирующие между собой перекрестно. Однако, как уже обсуждалось выше (см. раздел 2.4), антнтела распознают в антигене иные структуры, чем Т-хелперы. Л именно участие Т-хелперов в иммунном ответе контролируют Ir-гены. Следовательно, если один и тот же 1г ген контролирует ответ на два антигена, значит у этих двух антигенов сходны те участки молекул, которые распознают Т-хелперы.

Ir-гены контролируют также реакции клеточного иммунитета. В частности, показано, что вызванная антигеном пролиферация Т-лимфоцитов у мышеи, ранее иммунизированных нативным миоглобином, детерминирована двумя Ir-гснамп: один контролирует ответ на N-koh- ueBoii участок молекулы, другой ——на С-концевой (фрагменты молекулы миоглобина получали с помощью пепти- долиза бромцпаном по остаткам метионина). Интересно, что указанные 1г-гены локализованы в разных субрайонах 1-райоиа H-2-комплскса.

Все накопленные к настоящему времени факты свидетельствуют о том, что у одной особи данного вида невозможно индуцировать синтез антител ко всем антигенным детерминантам определенного антигена, равно как и получить сильный ответ на серию различных антигенов. Путем направленной селекции можно резко усилить ответ на некоторые антигены (антигенные детерминанты). Так, например, путем селекции двадцати поколений мышей удалось, в частности, получить линии, отличающиеся по силе иммунного ответа на эритроциты барана в 200 раз. Подобный эффект не достигается посредством многократной иммунизации, в результате которой можно вооб-' ще подавить ответ из-за возникновения так называемого иммунологического паралича (см. гл. 11).

ИммуноглобулиныИммуноглобулины

Иммуноглобулины

Иммуноглобулины

Иммуноглобулины представляют собой семейство сывороточных белков со сходной структурной организацией молекул, способных в качестве антител специфически взаимодействовать с антигеном. Исходя из определения, к белкам иммуноглобулиновой природы следус г отнести также аптигенсвязывающие рецепторы В-лпмфоцитов.

Иммупоглобулины подразделяют на классы, а в пределах каждого класса на подклассы. Известно пять классов иммуноглобулинов, обозначаемых как IgG, IgM, IgA, IgE и IgD. У человека, мыши и некоторых других животных в пределах IgG, IgM и IgA описано несколько подклассов.

Структурная организация иммуноглобулинов

На рис. 14 представлены принципиальные схемы строения различных классов п подклассов иммуноглобулинов человека. Иммуноглобулины других

Рис. 14. Субмолекулярная структура различных нммуноглобулинов человека:IgGl, IgG2. IgG3 и IgG4—подклассы IgG; J—Z-цепь, входящая в состав IgM и IgA; СК — секреторный компонент IgA; пунктиром показаны дисульфидные связиРис. 14. Субмолекулярная структура различных нммуноглобулинов человека:IgGl, IgG2. IgG3 и IgG4—подклассы IgG; J—Z-цепь, входящая в состав IgM и IgA; СК — секреторный компонент IgA; пунктиром показаны дисульфидные связи-Q-Q,, -О—Q„ лоь— |с|?рр Adl5^^x<dJ4 ^ |ро\а|я ^.ръ>^йс^^ ~т> -ц-\>к(.・ A4d—с-Q-Q,, -О—Q„ лоь— |с|?рр Adl5^^x<dJ4 ^ |ро\а|я ^.ръ>^йс^^ ~т> -ц-\>к(.・ A4d—с

Рис. 14. Субмолекулярная структура различных нммуноглобулинов человека:

IgGl, IgG2. IgG3 и IgG4—подклассы IgG; J—Z-цепь, входящая в состав IgM и IgA; СК — секреторный компонент IgA; пунктиром показаны дисульфидные связи

Рис. 14. Субмолекулярная структура различных нммуноглобулинов человека:

IgGl, IgG2. IgG3 и IgG4—подклассы IgG; J—Z-цепь, входящая в состав IgM и IgA; СК — секреторный компонент IgA; пунктиром показаны дисульфидные связи

-Q-Q,, -О—Q„ лоь— |с|?рр Adl5^^x<dJ4 ^ |ро\а|я ^.ръ>^йс^^ ~т> -ц-\>к(.・ A4d—

с

-Q-Q,, -О—Q„ лоь— |с|?рр Adl5^^x<dJ4 ^ |ро\а|я ^.ръ>^йс^^ ~т> -ц-\>к(.・ A4d—

с

биологических видов построены аналогично. Из схемы видно, что иммуног.чобулнны — это белки с четвертичной структурой, т. е. их молекулы построены из нескольких полипептидных цепей. В состав молекулы hmmvho-

глобулинов каждого класса входит кратное двум число разноименных полипептидных цепей—легких (L) и тяжелых (Н). Легкие цепи с молекулярной массой 22 000 идентичны по своему строению у иммуноглобулинов всех классов и подклассов. Тяжелые цепи имеют характерные особенности строения у каждого класса (подкласса). Молекулярная масса тяжелых цепей варьирует от 51 000—52 000 до 72 ОСО—76 000 (табл. 3).

Таблица 3. Свойства иммуноглобулинов человека

Изучаемый параметр

IgG

IgA

IgM

IgD

IgE

Молекулярная масса, тыс. дальтон

150

150—350

900

180

190

Константа седиментации, S20 .

7

7(9—15)

19

7

8

Легкие цепи (молекулярная масса, тыс. дальтон) ...

22

22

22

22

22

Тяжелые цепи (молекулярная масса, тыс. дальтон) ...

52—60

56

70

70

70

Углеводы, %

3

7

12

12

12

Время циркуляции (1/2), сутки

21

6

5

3

2

Концентрация в сыворотке, мг/100 мл

1100

250

100

3

0,01

Все иммуноглобулины, за исключением IgM и IgA, представлены в сыворотке крови в виде мономеров, состоящих из двух симметричных половин, каждая из которых, в свою очередь, образована одной легкой и одной тяжелой цепью. Константа седиментации мономера 7—— 8,5S. Молекула IgM образована пятью 7S мономерами, объединенными между собой дисульфидными связями. IgA встречается в сыворотке как в виде мономера, так и полимера из двух—пяти 7S субъединиц. Тяжелые цепи иммуноглобулинов обозначают греческими буквамн: у, ц, а, е, 6. Легкие цепи на основании определенных различий первичной структуры и антигенных свойств подразделяют на два типа: х л 九.Важно, что в одной молекуле иммуноглобулина имеются легкие цепи только одного типа, а тяжелые цепи, характерны только для одного класса (подкласса). Ниже представлены молекулярные формулы сывороточных иммуноглобулинов человека (в молекулу полимерных срорм и м муноглобул и нов М и А входит по одной /-лепи):

К пассК пассФормула

К пасс

К пасс

IgG...俨2 ИЛИ Y2大2

IgM..-(卩2勾)5 или (|12?"2)5

IgA...U2X2 ИЛН "2入2

IgE...(£2X2)2 ИЛИ(e2X2)2

IgD...62X2 или 62^2

Полипептидные цепи объединены в молекуле 7S мономера ковалентными дисульфидными связями и нековалентными связями, прежде всего гидрофобными. В молекуле иммуноглобулина различают два вида межцепьевых дисульфидных связей: между одноименными тяжелыми цепями и между легкими и тяжелыми цепями. Дисульфидные связи между тяжелыми цепями IgG расположены в районе, получившем название сталии» молекулы (hinge region) Как видно из рис. 14, число дисульфидных связей между тяжелыми цепями неодинаково у иммуноглобулинов различных классов, равно как у иммуноглобулинов различных подклассов одного класса. Это один из отличительных признаков соответствующего подкласса. Разорвав дисульфидные связи в районе талии, молекулу IgG мономера можно разделить на две половины. Диссоциация происходит в слабокпслой среде (pH 3,0——3,5). Если вслед за этим нейтрализовать раствор, обе половины молекулы вновь соединятся за счет нековалептпых связей между С-концевыми половинами тяжелых цепей (A. Nisonoff, 1963).

Для получения в изолированном виде полипептидных цепей иммуноглобулинов первоначально разрывают все межцепьевые дисульфидные связи. Это можно осуществить с помощью различных восстановителей: 2-меркапто- этанола, цистеина. Существенно, что в отсутствие денатурирующих агентов внутрицепьевые дисульфидные связи, играющие важную роль в стабилизации третичной структуры легкой и тяжелой цепей, не разрываются.

Разрыв нековалентных связей между полипептидны- ми цепями происходит либо в концентрированной (ЮМ) мочевине, либо в 1М растворе уксусной, пропионовой или масляной кнелоты. Третичная структура цепей в этих условиях не претерпевает необратимых изменений благодаря сохранению каркаса внутрнп.епьевых дисульфидных связей.

С помощью гель-хроматографии в буфере с тем или иным диссоциирующим агентом легкие н тяжелые цепи могут быть разделены с достаточной степенью полноты. Если до удаления диссоциирующего реагента смешать

эквимолярные количества легких п тяжелых цепей, а затем уд,агшть диссоциирующий реагент диализом, произойдет спонтанная рекомбинация цепей и реконструкция мономера. После замыкания сульфгидрильных групп полуцистиновых остатков в межцепьевые дисульфидные связи (для чего достаточно насытить воздухом раствор белка при pH 7,8—8,0) образуется молекула, совпадающая по всем основным элементам структуры с первоначальной. Обнаружение в иммуноглобулинах нескольких типов пскишептидцых цепей, разработка методов их диссоциации и открытие спонтанной рекомбинации осуществлены прежде всего Дж. Эдельманом, Р. Портером и Ф.①ранеком (J. Edelman, R. Porter, F. Franek, 1959— 1961).

Принцип самосборки молекулы иммуноглобулина из изолированных цепей закодирован в третичной структуре полипептидных цепей. На его основе происходит сборка молекул иммуноглобулинов в клетках, участвующих в их синтезе (см. гл. 5).

Важную роль в изучении структуры и функции иммуноглобулинов сыграли методы фрагментации молекулы с помощью различных протеназ. Рассмотрим строение и свойства фрагментов на примере продуктов протеолиза IgG кролика.

Молекула этого белка имеет единственную дисульфидную связь между тяжелыми цепями. При протеолизе папаином в нейтральной среде в присутствии низких концентрации восстановителей молекула IgG кролика распадается на три фрагмента в связи с расщеплением тяжелых цепей в районе тал】ш и разрывом дисульфидной связи между ними (рис. 15). Все фрагменты имеют одинаковые величины константы седиментации — 3,5S. Они могут быть разделены с помощью ионообменной хроматографии на карбокепметпл-целлюлозе. Если для расшепления использовали IgG-антитела, например против яичного альбумина, то два из трех полученных фрагментов способны специфически соединяться с антигеном, третий нет. Первые два фрагмента получили название Fab (fragiuent antigen binding). Третий фрагмент, благодаря своему свойству легко кристаллизоваться из дистиллированной воды пли нейтральных буферных растворов низкой ионной силы, получил название Fc (fragment crystaliiziable).

Fab-фрагмент образован легкой цепью и ампноконце- вой половиной тяжелой цепи. В образовании Fc-фрагмен-

та участвуют С-концевые половины тяжелых цепей, объединенных только нековалентнымп связями. Изучение Fab- и Fc-фрагментов было осуществлено Р. Портером (1959).

Протеолиз IgG кролика пепсином при pH выше оптимума активности этого фермента (pH 4,0) приводит к

ПротеолизПротеолизFvFvРис. 15. Фрагменты молекулы IgG, полученные в результате ограниченного протеолиза. Жирным обозначены домены, входящие в состав соответствующего фрагмента образованию одного крупного фрагмента с константой седиментации 5S п молекулярной массой 105 000, еще одного фрагмента с молекулярной массой около 25 000 и серии низкомолекулярных пептидов. Фрагмент типа F(ab')2 представляет собой димер фрагментов, очень близких по строению Fab, которые объединены дисульфидным мостиком. Его разрыв приводит к образованию двух 3,5S фрагментов. Последние обозначают как Fab', а димер ——как F(ab')£. Фрагмент Fc' с молекулярной массой 25 000 (константа седиментации 2,4S) образован двумя отрезками тяжелых цепей, каждый из которых равен примерно четвертой части ее длины (рис. 15).Рис. 15. Фрагменты молекулы IgG, полученные в результате ограниченного протеолиза. Жирным обозначены домены, входящие в состав соответствующего фрагмента образованию одного крупного фрагмента с константой седиментации 5S п молекулярной массой 105 000, еще одного фрагмента с молекулярной массой около 25 000 и серии низкомолекулярных пептидов. Фрагмент типа F(ab')2 представляет собой димер фрагментов, очень близких по строению Fab, которые объединены дисульфидным мостиком. Его разрыв приводит к образованию двух 3,5S фрагментов. Последние обозначают как Fab', а димер ——как F(ab')£. Фрагмент Fc' с молекулярной массой 25 000 (константа седиментации 2,4S) образован двумя отрезками тяжелых цепей, каждый из которых равен примерно четвертой части ее длины (рис. 15).

Протеолиз

Протеолиз

Fv

Fv

Рис. 15. Фрагменты молекулы IgG, полученные в результате ограниченного протеолиза. Жирным обозначены домены, входящие в состав соответствующего фрагмента образованию одного крупного фрагмента с константой седиментации 5S п молекулярной массой 105 000, еще одного фрагмента с молекулярной массой около 25 000 и серии низкомолекулярных пептидов. Фрагмент типа F(ab')2 представляет собой димер фрагментов, очень близких по строению Fab, которые объединены дисульфидным мостиком. Его разрыв приводит к образованию двух 3,5S фрагментов. Последние обозначают как Fab', а димер ——как F(ab')£. Фрагмент Fc' с молекулярной массой 25 000 (константа седиментации 2,4S) образован двумя отрезками тяжелых цепей, каждый из которых равен примерно четвертой части ее длины (рис. 15).

Рис. 15. Фрагменты молекулы IgG, полученные в результате ограниченного протеолиза. Жирным обозначены домены, входящие в состав соответствующего фрагмента образованию одного крупного фрагмента с константой седиментации 5S п молекулярной массой 105 000, еще одного фрагмента с молекулярной массой около 25 000 и серии низкомолекулярных пептидов. Фрагмент типа F(ab')2 представляет собой димер фрагментов, очень близких по строению Fab, которые объединены дисульфидным мостиком. Его разрыв приводит к образованию двух 3,5S фрагментов. Последние обозначают как Fab', а димер ——как F(ab')£. Фрагмент Fc' с молекулярной массой 25 000 (константа седиментации 2,4S) образован двумя отрезками тяжелых цепей, каждый из которых равен примерно четвертой части ее длины (рис. 15).

Изучение продуктов протеолиза IgG пепсином осуществил А. Нисонов с сотрудниками (A. Nisonoff et al・, 1960—1963).

Рис. 16. Субмолекулярная структура IgM.

В одной из 7S субъединиц обозначены домены легкой » тяжелой (и) цепей, внутрицепьевые и межцепьевые дисульфидные связи; J—/ цепь; пунктиром обозначены Fab- Fjab) и (Ёс)5^фрагменты

Таким образом, два симметричных участка молекулы IgG—Fab-участки принимают участие в формировании активных центров антитела; Fc-участок отвечает за основные эффекторные функции антител (см. гл. 6).

11ммуноглобулины других классов, хотя и отличаются значительно в чувствительности к протеолизу, также могут быть расщеплены на Fab- и Fc-фрагменты. Различные фрагменты IgM, в частности, представлены на

рис. 16. Схематическое изображение IgM с центральным ядром, образованным Рсм-участками, и расположенными на периферии РаЬц-участкамп в большой степени соответствует данным электронно-микроскопического изучения этого очень крупного по размеру белка с молекулярной массой около 900 000.

Рис. 17. Субмолекулярная структура IgA:

I, II ——возможные вариации замыкання межцепьевых дисульфидных связей; а ——тяжелая цепь IgA, СК——секреторный компонент, /—/-цепь; точками обозначены вариабельные районы легкой и тяжелой цепей

IgM и полимерные формы IgA (рис. 17) имеют дополнительную полипептидную цепь с молекулярной массой 12 000, получившую название /-цепи (соединяющая, от англ, joining). В ее состав входит большое число полу- цистпновых остатков, остатков пролииа, глутаминовой и аспарагиновой кислот. Указанная цепь принимает, очевидно, участие в формировании полимерных форм иммуноглобулинов.

Отличительной особенностью иммуноглобулинов класса А является их присутствие в различных секретах: молозиве, секретах верхних дыхательных путей, желчи, отделяемом толстого кнтечннна. IgA, поступающий в секреты, синтезируется лимфоидными клетками, рассеянными в форме скоплений под цил ин др и ческим эпителием. Он приобретает способность проникать в секреты после присоединения так называемого секреторного компонента, который синтезируется клетками серозного эпителия. Этот белок (секреторный компонент) с молекулярной

массой охоло 70 000 встречается в составе только секреторного IgA. Секреторный IgA представляет собой димер, в котором IgA-моиомсры (7S) «состыкованы» конец в конец своими Fc-участками. Последние обвиты секреторным компонентом (рис. 17). Между Fc-участками располагается также /-цепь. Копстанта седиментации всего комплекса 11S, а молекулярная масса 380 000—390 000. I [еобходпмо особо подчеркнуть, что сывороточный IgA никогда не превращается в секреторный.

Еще одна отличительная особенность IgA, а именно его второго подкласса — IgA2 (Am+) (см. раздел 3.4) состоит в отсутствии дисульфидных связей между легкими и тяжелыми цепями и существовании дисульфидной связи, объединяющей легкие цепи (см. рис. 14).

Говоря об особенностях строения отдельных классов иммуноглобулинов, следует отметить очень высокую чувствительность иммуноглобулина D к расщеплению папаином и другими нейтральными протеиназами. При хранении на холоду даже в течение нескольких дней сыворотки, содержащей IgD, последний расщепляется до Fabs- и п FQ-фрагментов. При сравнении скоростей расщепления папаином, трипсином или плазмином моноклональных иммуноглобулинов человека оказалось, что наиболее быстро распадается IgD. Остальные белки по чувствительности к протеолизу располагаются в следующий ряд: Ig'G 1 > IgG2> IgM> IgA. Расщепление IgG в сыворотке происходит, очевидно, за счет следов плазмина, так как процесс гидролиза тормозится в присутствии ингибитора плазмина е-аминокапроновой кислоты. IgG человека также может расщепляться при хранении и а холоду примесью плазмина, содержащегося в сыворотке или коммерческих препаратах гамма-глобулина. Прежде, когда не было известно строение иммуноглобулинов, считали, что в этих условиях происходит разрушение гамма-глобулина (антител). Сегодня очевидно, что под влиянием плазмина идет лишь ограниченный протеолиз с образованием Fab-фрагментов.

Все иммуноглобулины являются гликопротеинами. Содержание углеводного компонента неодинаково у различных классов, достигая 10% и выше в нммуноглобулннах классов М и Л. Олигосахарид присоединен через остаток аспарагипа к тяжелым цепям в области Fc-фрагмента. Более детальная локализация углеводного компонента будет представлена в следующих разделах этой павы.

Первичная структура полипептидных цепей иммуноглобулинов

Иммуноглобулины одного класса п даже подкласса продуцируют многие плазматические клетки, а точнее, клоны плазматических клеток. Каждый из этих клонов синтезирует молекулы, отличающиеся друг от друга по аминокислотной последовательности. Это было доказано при сравнительном изучении миеломных иммуноглобулинов, т. е. иммуноглобулинов, синтезируемых клетками больных множественной миеломой или клетками перевиваемой плазмацитомы мыте访.И те и другие опухоли образованы клетками одного определенного клона плазматических клеток. В том случае, когда индивидуальные миеломы (плазмацитомы) продуцируют пммуно- глобулины одного и того же класса и подкласса, представляется возможным сравнить первичные структуры легких и тяжелых цепей моноклональных белков.

Анализ большого числа легких цепей моноклональных иммуноглобулинов показал, что молекулу цепи, с точки зрения особенностей первичной структуры, можно разделить на две равные части. Если С-концевые половины легких цепей одного типа (х или л), синтезируемых различными клопами к」еток, практически полностью совпадают по аминокислотной последовательности, то N-концевые половины имеют существенные различия. Наибольшей степенью вариабельности отличаются три участка последовательности: 24—34, 50—56 и 89—97. Практически не существует двух моноклональных иммуноглобулинов, легкие цепи которых совпали бы по аминокислотной последовательности в указанных участках. На основании этих данных N-концевые половины легких цепей получили название вариабельных (variable) в отличие от С-концевых половин, названных константными (constant). Сокращенно их обозначают как V- и С-районы соответственно. Участки последовательности с наибольшей степенью вариабельности первичной структуры получили наименование гипервариабельных. Напротив, участки V-района,в которых первичная структура' достаточно устойчива, называют консервативными, а аминокислотные остатки в них инвариантными.

При сопоставлении аминокислотных последовательностей V-районов индивидуальных х- илп л-цепей можно обнаружить, что у ряда цепей сходство последовательно-

степ больше, чем у других. Осуществляя подобную группировку, установили наличие трех подгрупп Vx и пяти У< у человека. У мышей пока трудно оценить верхнюю границу числа Vz-подгрупп. Минимальное их число составляет 9. Что касается Z-цепей мышиного иммуноглобулина, то их содержание в норме не превышает 5% от общего количества легких цепей. Это выражается и в крайне низком содержании миеломных иммуноглобулинов мыши с легкими цепями /.-типа.

В пределах каждой подгруппы у всех цепей в одних и тех же позициях существуют вставки и делеции. Они соответствуют позициям 27—30 и 90—100. Поэтому общее число остатков в цепях колеблется от 210 до 223.

Степень гомологии между вариабельными и константными районами одного типа легких цепей крайне невелика и составляет, например, для 入-цепе百 человека всего 15%. Напротив, гомология константных районов и- и 入-цепей высокозначима н достигает 40%. Она в два раза выше, чем для VH- и V入-районов, н соответствует приблизительно гомологии а- и р-цепей гемоглобина.

С эволюционной точки зрения подгруппы являются, очевидно, устойчивым образованием. Об этом свидетельствует следующий факт: высокую степень гомологии обнаруживают между подгруппой I Н-цепей человека н подгруппой II Н-цепей мыши. Гомология между ними существенно выше, чем между подгруппами I и II Н-цепей человека (G. Rechavi el al., 1983).

Что показали данные, полученные при изучении первичной структуры легких цепей? Прежде всего, что синтез цепи каждого типа контролируют не менее двух структурных генов: один — для вариабельного, другой — для константного районов. Следовательно, генетический закон, открытый при изучении прокариот и сводящийся к правилу: один ген — одна полипептпдная цепь, не обязательно выполняется у эукариот, в частности, при синтезе иммуноглобулинов. Во-вторых, стало ясно, что должно существовать большое число генов для V-района (V-re- нов), каждый из которых контролирует структуру вариабельного района легкой цепи, синтезируемой индивидуальной плазматической клеткой. С учетом данных, свидетельствующих о локализации в разных хромосомах Сн- и С?.-генов, это указывало на существование в геноме двух больших наборов V-генов. Эти выводы, сделанные только на основе данных по первичной структуре легких цепей, нашли полное подтверждение при изучении структурных

генов иммуноглобулинов методами молекулярной генетики (см. гл. 5).

Тяжелые цепи каждого класса (подкласса) иммуноглобулинов также состоят из вариабельного (Vh) и константного (Сн) районов. V-район включает в среднем 114—124 остатков с N-конца (а-аминогруппа, как правило, заблокирована остатком пироллидонкарбоновой кислоты). В случае у-цепи в ее состав входит 450 аминокислотных остатков. Следовательно, константный район приблизительно в три раза больше вариабельного.

V-pa юи включает три гипервариабельных участка, в целом симметричных аналогичным участкам легких цепей (остатки 31—37, 51—68 и 101—110). Делеции и вставки особенно характерны для последнего гипервариабельного района.

Подобно VL-районам Ун-районы можно разделить на подгруппы, число которых д』只 миеломных иммуноглобулинов человека составляет четыре. Необходимо подчеркнуть еще раз основное правило структурной организации тяжелых цепей: все без исключения подгруппы вариабельного района присущи не какому-либо определенному классу (подклассу), а могут встречаться в ассоциации с Сн-районами любого класса тяжелых цепей (у,卩，а, £, б)-

Константные районы тяжелых цепей различных классов иммуноглобулинов наряду с определенным сходством первичной структуры имеют п характерные особенности. Прежде всего, константный район тяжелой цепи каждого класса образован из нескольких равных по протяженности участков (за исключением района талии). Число таких участков в константном районе ^--цепи равно трем. Каждый из них содержит 110—120 остатков, т. е. столько же, сколько Ун-район. Каждый район ограничен внутрицепьевой дисульфидной связью и при формировании пространственной структуры образует компактную глобулу, названную, по предложению Дж. Эдельмана, доменом. Ун-район также сворачивается в пространственно автономный домен, стабилизированный внутрицепьевой дисульфидной связью. Домены константного участка тяжелой цепи IgG обозначают в направлении С-конца как СнМС#, Сн2(С】2), СнЗ(СуЗ).

Тяжелая 国-иепь IgM длиннее -у-цепи на 130 остатков, находящихся в константном районе и образующих дополнительный домен. Следовательно, в С^-районе четыре домена: Сц1, Си2, С/, С/.

Также по четыре домена в константных районах е- и б-цепей IgE и IgD. В сывороточном и секреторном IgA константный район у-цепи состоит из трех доменов.

Сравнение аминокислотных последовательностей доменов константного района у-цепи свидетельствует о высокозначимой гомологии в сравнении с гомологией между Vh- и Су-районами (40- 60% против 15%). Гомология между доменами константного района тяжелой цепи подобна таковой между константными районами х- н /.-цепей. Статистически значима также гомология между константным доменом легкой цепи и константными доменами тяжелой цепи. Эти данные дают основание для предположения о том, что константный район тяжелой цепи контролируют гены, которые произошли от предкового гена, общего для константных районов легкой и тяжелой цепей.

Сопоставление первичных структур константных районов тяжелых цепей различных подклассов IgG человека без учета структуры талии указывает на чрезвычайно высокую степень гомологии, достигающей 85—90%. Однако даже небольших различий первичной структуры достаточно для проявления у различных подклассов разных эффекторных функций, зависящих от строения Сн2- и СнЗ- доменов Fc-участка молекулы (см. гл. 6).

Важная роль для проявления биологических свойств иммуноглобулинов принадлежит району талии — отрезкам тяжелых цепей, объединяющих V- и С-участки молекулы. Этот район обладает уникальными особенностями строения, отличающими его от других участков тяжелых и легких цепей.

Район талии включает отрезки тяжелых цепей длиной от 15 до 60 остатков. В пределах этого отрезка тяжелой цепи участок из 15—16 аминокислотных остатков может быть неоднократно дуплицирован. Так, в IgG3 человека он повторен четыре раза.

В пределах района талии, как уже говорилось в разделе 3.1, находятся полуцистиновые остатки, участвующие в образовании дисульфидных связей между тяжелыми цепями. Число таких связей зависит от числа повторяющихся блоков сходной аминокислотной последовательности. Так, в уже упомянутом IgG3 число полуцистиновых остатков достаточно для образования между тяжелыми цепями 11 дисульфидных связей.

Удивительной особенностью района талии является очень высокое содержание остатков пролина. В IgGl че-

ловека здесь расположено пять остатков пролина, а в I&G кролика — даже восемь (рис. 18). Как видно из рисунка, существует участок цепи, где подряд расположено три остатка пролина. Остаток пролина препятствует формированию регулярной вторичной структуры и взаимодействию гомологичных участков соседних тяжелых цепей. Ниже мы вернемся к особенностям конформации района талии. Здесь же следует подчеркнуть, что особенности состава и пространственной структура района талии определяют высокую чувствительность образующих его участков тяжелых цепей к действию протеолитических ферментов. Без участия каких-либо денатурирующих агентов IgG расщепляют в этом районе папаин, трипсин, пепсин (рис. 18), плаз?иин, бромелин, катепсин С и даже такой высокоспецифичный в отношении субстрата фермент, как коллагеназа.

Район талии у-цепей не обнаруживает статистически значимой гомологии с доменами константного и вариабельного районов. Этот факт следует иметь в виду в связи с проблемой организации структурных генов для тяжелых цепей иммуноглобулинов (см. гл. 5). Уже на основании сведений, полученных при изучении первичной структуры, закономерно заключить, что район талии кодирует ген, имеющий иное филогенетическое происхождение, нежели гены, кодирующие Vh- и Сн-домены. Ген для района талии эволюционировал независимо от С-генов, и в ходе его эволюции сформировалось семейство сходных в структурном отношении генов, кодирующих соответствующие районы иммуноглобулинов различных классов (подклассов). Несомненное близкое структурное родство по крайней мере группы генов, кодирующих районы талии IgG человека различных подклассов, следует из того факта, что гомология по этому району достигает 70%. Подобие первичной структуры районов талии у IgG и IgA человека очевидно. Оба подкласса IgA содержат три по- луцпетиновых остатка и богаты пролином. Заметна дупликация небольших сегментов последовательности в IgA 1: Pro—Ser—Thr—Pro—Pro—Thr—Pro.

Константные домены тяжелых цепей различных классов заметно отличаются по первичной структуре, однако степень гомологии между ними статистически значима, достигая, наприглер, 30% для у- и ц-цепей. Это указывает на происхождение всех генов для константных районов тяжелых цепей иммуноглобулинов от одного предкового гена. Возникшие в ходе эволюции изменения в структуре

Рис. 18. Места расщепления молекулы IgG кролика в районе талии с помощью папаина (Пап), пепсина (П), трипсина (Т) и бромциана (CNBr)

Сн-генов и, как следствие этого, возникновение различий в структуре константных районов иммуноглобулинов определили характерные для них особенности биологических свойств (см. гл. 6).

Пространственная структура легкой и тяжелой цепей и организация четвертичной структуры иммуноглобулинов

Как было показано в предыдущем разделе, вариабельные и константные районы легкой и тяжелой цепей формируют автономные, компактно сформированные домены, стабилизированные внутрицепьевьр ми дисульфидными связями. Основной тип вторичной структуры ——ан-jипараллельная ^-складчатая. Одно из первых доказательств такого типа вторичной структуры в иммуноглобулинах было получено Г. Троицким и В. Завьяловым (1972).

Реитгеноструктурный анализ свидетельствует о том, что каждый домен имеет примерно цилиндрическую форму. Определенная пространственная асимметрия обусловлена тем, что одна из сторон цилиндра образована тремя антипараллельпыми р-складками, а другая — четырьмя. Несмотря на большое сходство, в упаковке V- и С-домепов имеются существенные различия: в Vl- и У'и-доменах расположена дополнительная петля поли- пептидпой цепи (рис. 19). Упаковка Vh- и Уь-доменов мало чем отличается друг от друга. Очень сходна пространственная упаковка Cl-, Сн1- и СцЗ-доменов. Что касается Сн2-〃омена, то определенное своеобразие ему придает присоединенная разветвленная цепь олигосахарида.

Между доменами находятся короткие, по достаточно гибкие отрезки цепей, допускающие расположение доменов в молекуле иммуноглобулина под некоторым углом друг к Аругу (рис. 20). В отличие от собственно доменов, характеризующихся значительной устойчивостью к протеолизу, соединяющие их отрезки цепей более доступны для протеиназ. Степень доступности отдельных междо- мецных пространств для протеиназ возрастает после кратковременной инкубации белка в кислой среде. Последующий протеолиз плазмином, в частности, приводит к отщеп,；1ению от молекулы IgG СнЗ-доменов. Лишенный их фрагмент, получивший назвапие Facb (см. рис. 15),

ектами для изучения локализации и структуры центров.ектами для изучения локализации и структуры центров.ответственных за эффекторные функции иммуноглоб\\чи-ответственных за эффекторные функции иммуноглоб\\чи-NH?NH?Рис. 19. Третичная структура доменов полипептидных цепей IgG человека:Kern н Oz — положения антигенных марке-Рис. 19. Третичная структура доменов полипептидных цепей IgG человека:Kern н Oz — положения антигенных марке-ров, находящихся в константном домене легкой цепи; S——S ——внутридоменная дисульфидная связь; точками обозначена дополнительная петля пептидной цепи, имеющаяся в вариабельных доменах; цифрами обозначены номера аминокислотных остатковров, находящихся в константном домене легкой цепи; S——S ——внутридоменная дисульфидная связь; точками обозначена дополнительная петля пептидной цепи, имеющаяся в вариабельных доменах; цифрами обозначены номера аминокислотных остатков

ектами для изучения локализации и структуры центров.

ектами для изучения локализации и структуры центров.

ответственных за эффекторные функции иммуноглоб\\чи-

ответственных за эффекторные функции иммуноглоб\\чи-

NH?

NH?

Рис. 19. Третичная структура доменов полипептидных цепей IgG человека:

Kern н Oz — положения антигенных марке-

Рис. 19. Третичная структура доменов полипептидных цепей IgG человека:

Kern н Oz — положения антигенных марке-

ров, находящихся в константном домене легкой цепи; S——S ——внутридоменная дисульфидная связь; точками обозначена дополнительная петля пептидной цепи, имеющаяся в вариабельных доменах; цифрами обозначены номера аминокислотных остатков

ров, находящихся в константном домене легкой цепи; S——S ——внутридоменная дисульфидная связь; точками обозначена дополнительная петля пептидной цепи, имеющаяся в вариабельных доменах; цифрами обозначены номера аминокислотных остатков

равно как и тандем СнЗ-домснов, служат важными объ

нов (см. гл. 6).

Гидролиз пепсином Fab-фрагментов мышиного IgA, продуцируемого плазмацитомой МОРС 315, приводит к отщеплению Cl- и Сн-доме- нов и сохранению нерасщепленн ы м н Vl- и Ун-Доменов, находящихся между собой в контакте. Этот фрагмент получил название вариабельного -Fv (см. рис. 15). Белок, продуцируемый плазмацитомой 315, обладает активностью антидинитрофенил ь- ного антитела. Его Fv-фрагмент полностью сохраняет всю гаптенсвязывающу ю активность, присущую нерасщеплен-

ному иммуноглобулину. Эти данные, полученные Д. Гиво-

лом с сотрудниками (D. Givol et al., 1972), послужили бесспорным доказа

тельством того, что в формировании активного центра антитела участвуют только Vu- и Уь-домены.

Еще меньшие по размеру осколки молекулы антитела, соответствующие по молекулярной массе только одно

му домену (13 000± 1200), также способны, хотя и с мень

шим сродством, связывать антиген. Такие фрагменты были получены в результате протеолиза папаином дена-

Рис. 20. Взаимное расположение доменов легкой и тяжелой цепей IgG. Заштрихован углеводный компонент, присоединенный к Сн2-доменам тяжелых цепей

турированных в мочевине Fab-фрагментов IgG кролика еще до открытия доменной организации иммуноглобулинов (А. Кульберг, И. Тарханова, 1962). Эти данные, а также факт обнаружения в моче осколков молекулы антитела с константой седиментации 1,2S, способных связывать антиген (J. Remington, 1962), явились первым важным для химии белка доказательством значительной структурной автономии лиганд связывающих, участков молекулы антитела.

Между доменами в пределах одной цепи существуют продольные (пли цис), а между доменами прилегающих цепей — поперечные (латеральные, или транс-) взаимодействия. Поперечные взаимодействия сопровождаются формированием модулей: Vl—Vh, Cl—Сн1, СцЗ—СнЗ. Модуль СнЗ—СнЗ соответствует фрагменту Fc'. Фрагмент Fv представляет собой модуль Vl—Vh. О существовании модуля Cl—Сн1 помимо данных рентгеноструктурного анализа свидетельствуют весьма важные для понимания механизмов самосборки молекулы иммуноглобулина эксперименты К. Доррингтона с соавторами (К. Dorrington et al., 1982).

Изолированный Vn-домеи моноклонального IgM человека был получен путем расщепления изолированной 卩-吟 пи по 127-му остатку (полуцистин, участвующий в образовании связи между у-цепью и L-цепью) в результате S-цианилирования 2-иитро-5-тиоцианбензойной кислотой. Изолированный Vn-домен образовывал бимолекулярный комплекс с L-цепью из аутологичного моноклонального иммуноглобулина. Величина константы связывания достаточно велика: 107 М-1. Но она существенно ниже, чем в случае взаимодействия изолированных аутологичных L- и р-цепей: 1010 М-1. Такое увеличение константы связывания служит несомненным доказательством формирования модуля Cl―Сн1 и важной роли взаимодействия этих доменов при самосборке молекулы иммуноглобулина.

Весьма существенно, что домены Cl и Сц1 обеспечивают взаимодейстгне легких и тяжелых цепей, продуцируемых разными клонами плазматических клеток и даже легких и тяжелых цепей разного видового происхождения. В то же время вариабельные домеиы легкой и тяжелой цепей взаимодействуют с образованием тандема, только если они получены из одной и той же молекулы иммуноглобулина. Такая высокая специфичность взаимодействия вариабельных доменов предполагает заметный

вклад в этот процесс по крайней мере одного из гипервариабельных участков от каждого домена. Латеральное взаимодействие доменов происходит главным образом за счет гидрофобных связей, причем в контактные участки входят остатки триптофана и тирозина.

Для понимания принципов функционирования молекулы иммуноглобулина как единого целого существенно, что при латеральном взаимодействии доменов контактные участки меньше по своей протяженности, чем собственно домен (его длинная ось). Взаимодействующие домены разноименных цепей повернуты друг к другу под углом. В свою очередь, расположенные вдоль одной цепи домены также находятся под углом друг к другу (рис. 20). Очевидно, они также повернуты вдоль соединяющих их отрезков цепи приблизительно на 180°. Последнее вытекает, в частности, из того факта, что Vl- и Vn-домены взаимодействуют теми сторонами, которые образованы тремя антипараллельными р-складками, а Сн1 и Cl—■ четырехскладчатыми. Все вместе эти особенности четвертичной структуры Fab-участка указывают на существование тесного продольного и поперечного взаимодействия образующих его доменов (R. Polyak, М. Huber, J. Diesenhorer, 1975—1981).

Рентгеиоструктурный анализ со всей очевидностью свидетельствует о том, что Сн2-домены соседних у-цепей не контактируют между собой, поскольку в пространстве между ними расположены две цепочки разветвленных олигосахаридов, обеспечивающих гидратацию междоменного пространства. Вместе с тем существует латеральное взаимодействие между СнЗ-доменами. В свою очередь, за счет ковалентной сшивки тяжелых цепей дисульфидными связями в районе талии они здесь тесно сближены между собой. Тем самим в Fc-участке молекулы IgG формируется кольцо, замкнутое с N- и С-конца Сн2-доменов. Структура имеет напряженный характер, о чем свидетельствует ряд факторов, обсуждаемых в гл. 6.

Напряженный характер четвертичной структуры IgG, как и, по-видимому,' других иммуноглобулинов, имеет большое значение для возможности передачи сигнала из N-концевой части молекуль/, где расположен активный центр, в С-концевую половину (Fc-участок), в пределах которой находятся центры, ответственные за эффекторные функции иммуноглобулинов (см. гл. 6). Это особенно существенно, если учесть, что общая длина молекулы IgG достигает 24 нм.

Когда речь идет о длине молекулы и мм у но г л обул ина любого класса, включая IgG, необходимо иметь в виду возможность перемещения в пространстве Fab-участков относительно друг друга и относительно Fc-участка. Гибкость молекуле придает район талии. Полипролиновые сегменты, будучи относительно ригидными структу-

Рис. 21. «Сшивание» корпускулярного антигена (эритроцитов) бивалентными IgG- антителами:Э — эритроцит, на поверхности которого условно обозначены детермина нтные группы; молекулы IgG в составе комплекса имеют Т-образную форму; Fc-yqac- гок молекулы зачернен, rab-участки — заштрихованыРис. 21. «Сшивание» корпускулярного антигена (эритроцитов) бивалентными IgG- антителами:Э — эритроцит, на поверхности которого условно обозначены детермина нтные группы; молекулы IgG в составе комплекса имеют Т-образную форму; Fc-yqac- гок молекулы зачернен, rab-участки — заштрихованы

Рис. 21. «Сшивание» корпускулярного антигена (эритроцитов) бивалентными IgG- антителами:

Э — эритроцит, на поверхности которого условно обозначены детермина нтные группы; молекулы IgG в составе комплекса имеют Т-образную форму; Fc-yqac- гок молекулы зачернен, rab-участки — заштрихованы

Рис. 21. «Сшивание» корпускулярного антигена (эритроцитов) бивалентными IgG- антителами:

Э — эритроцит, на поверхности которого условно обозначены детермина нтные группы; молекулы IgG в составе комплекса имеют Т-образную форму; Fc-yqac- гок молекулы зачернен, rab-участки — заштрихованы

рамп, имеют на флангах гибкие сегменты, о чем убедительно свидетельствуют данные рентгеноструктурного анализа. Поскольку ось вращения Fab- п Fc-участков проходит через район талии, его иногда называют шарнирным участком.

В волном растворе молекула IgG имеет У-образную форму. Угловое расстояние между Fab-участками может колебаться от 5—10 до 180°. Крайние значения эта величина принимает, согласно данным электронной микроскопии, когда антнтела находятся в комплексе с антигеном или бивалентным гаптеном. Расстояние между Fab-участками молекулн антитела зависит от молекулярного состава комплекса. В точке эквивалентности системы (см.

гл. 12) угловое расстояние между Fab-участками наибольшее, что обеспечивает бивалентным антителам возможность «сшивания» наибольшего числа молекул антигена (рис. 21).

У иммуноглобулинов различных классов, а в пределах одного класса - - у молекул различных подклассов гибкость далеко не одинакова и зависит от протяженности района талии и числа межцепьевых дисульфидных связей (зависимость носит обратный характер). Не удивительно, что значительной ригидностью характеризуется IgG3, у которого полипролиновый сегмент может достигать в длину 10 нм. Поскольку реализация антиген- зависимых эффекторных функций иммуноглобулинов связана в том числе и с гибкостью молекулы, эти свойства у различных иммуноглобулинов неодинаковы (см. гл. 6).

Антигенное строение иммуноглобулинов

Особенности строения различных участков молекулы иммуноглобулина, равно как н иммуноглобулинов различных классов (подклассов), находят отражение в их антигенной структуре. Помимо важной роли антигенного анализа иммуноглобулинов для сравнительного изучения их строения и понимания структурных основ генетически детерминированной неоднородности, антигенный анализ иммуноглобулинов позволил раскрыть важные принципы дифференцировки клеток В-ряда и регуляции иммунного ответа. Наконец, на основе данных об антигенном строении иммуноглобулинов созданы методы их качественного и количественного определения, а также многие так называемые непрямые иммунологические (серологические) методы (см. гл. 12).

Все антигенные детерминанты иммуноглобулинов подразделяют на четыре типа. Одни из них характерны для изотипа иммуноглобулина. Они отражают в своем строении классоспецпфические особенности иммуноглобулина данного биологического вида. Другие зависят от особенностей строения тех участков молекулы иммуноглобулина данного класса (подкласса), которыми этот белок от одного индивидуума данного биологического вида отличается от белка, синтезируемого другим индивидуумом того ;ке вида. Тем самым эти антигенные детерминанты характеризуют аллотип иммуноглобулина.

Третьи аптигенние 刀етермннанти отражают те особенности строения иммуноглобулина, которыми белок, продуцируем ыи одним клоном клеток, отличается от белка того же класса (подкласса), продуцируемого другим клоном клеток того же индпвидхума. Эти детерминанты определяют идиотип иммуноглобулина. Наконец, четвертый тип антигенных детерминант характеризует наиболее общие, независимые от пидивпдуальной или кленовой принадлежности свойства иммуноглобулинов данного вида, иргнадлокашие к любому классу (подклассу). Эти детерминанты характеризуют вариотип иммуноглобулинов. Ниже рассматриваются способы выявления, локалн- зацнн и строение перечисленных антигенных детерминант.

Изотипические детерминанты. Для выявления этих детерминант получают антитела, иммунизируя соответствующими иммуноглобулинами данного вида особей другого биологического вида. Тем самым выявляются различия в строении соответствующих иммуноглобулинов донора и реципиента. 11з этого вытекает, что чем более удалены друг от друга на эволюционной лестнице донор и реципиент, тем большее число изотипических детерминант удастся выявить в иммуноглобулине донора. Так, для наиболее полного анализа изотипа иммуноглобулинов млекопитающих следует получать антитела против них, иммунизируя птиц. На практике однако чаще используют анти- изотипические сыворотки млекопитающих. При этом для анализа того или иного иммуноглобулина целесообразно использовать антисыворотки от различных в видовом отношении реципиентов. Видовые различия в ответе на изотипические детерминанты отчетливо видны из следующего примера: при иммунизации козы IgG кролика образуются почти исключительно антитела против детерминант Fc-участка молекулы; при иммунизации тем же белком осла образуется примерно равное количество антител против Fab- и Fc-участков молекулы.

Если иммунизировать кролика высокоочищенным IgG человека, то полученная антисыворотка будет содержать антитела двух основных типов. Одни из пих направлены к детерминантам, имеющимся только в IgG человека, в то время как другие распознают детерминанты, общие для иммуноглобулинов человека различных классов. Структурное сходство иммуноглобулинов, оказывающее наибольшее влияние на их антигенное родство, определяется легкими цепями, общими, как известно, у всех иммуноглобулинов. После специфической адсорбции антисыво-

ротки изолированными легкнмн цепями в ней остаются почти исключительно антитела против детерминант, характерных для IgG. Эти детерминанты расположены в пределах константного района тяжелой цепи. В адсорбированной легкими цепями антисыворотке могут содержаться в небольшом количестве антитела против детерминант Ун-райопа, определяемых строением как гипервариабель- иых, так и консервативных участков. Ниже мы остановимся на пх точной локализации и строении. Наконец, в антисыворотке гетерологичного животного содержатся антитела против детерминант IgG, в формировании которых участвуют как легкая, так и тяжелая цепи. Естественно, такие детерминанты разрушаются при разделении разноименных цепей, в силу чего антитела против них нельзя удалить путем адсорбции антисыворотки только изолированными легкими цепями. В связи со сказанным, наиболее специфичный для IgG набор антител может бить получен после адсорбции антисыворотки против IgG с помощью Fab-фрагментов. Остающиеся антитела будут направлены только против детерминант, локализованных в пределах Fc-фрагмента.

Из сказанного логично заключить, что высокоспеци- 4)ичную для IgG, равно как и для иммуноглобулинов других классов, антисыворотку целесообразно получать, используя в качестве антигена изолированные Fc-фрагменты. Однако практически это нецелесообразно ввиду того, что Fc-фрагмент, полученный, например, с помощью папаина, очень трудно отделить от примеси Fab-фрагментов. Напротив, получение Fab-фрагментов, свободных от примеси Fc-фрагментов, нс встречает больших трудностей.

Таким образом, антисыворотка против детерминант, строго характеризующих данный изотип иммуноглобулина, т. е. униьсальные для иммуноглобулина данного класса (подкласса) видовые особенности, содержит антитела, реагирующие с детерминантами С-концевой половины тя- желоЛ цепи . Такую антисыворотку называют моноспеци- фической.

При получении моноспецифических антисывороток против иммуноглобулинов человека в качестве антигенов используют белки от больных множественной миеломой. В сыворотке таких больных в большом количестве содер-

жатся иммуноглобулины определенного класса (подкласса), не отличающиеся по своему строению (в том числе антигенному) ог соответствующих нормальных иммуноглобулинов. Использование сывороток больных множественной миеломой значительно облегчает получение в чистом виде иммуноглобулинов п практически решает задачу получения иммуноглобулинов, содержащихся в норме в следовых количествах (IgD, IgE). При получении антисывороток против иммуноглобулинов мыши, как правило, используют в качестве антигенов моноклональные иммуноглобулины, продуцируемые клетками перевиваемых мышиных плазмацитом. Аналогично получению антисывороток против иммуноглобулинов человека для получения моноспецифпческнх сывороток против мышиных иммуноглобулинов их адсорбируют легкими цепями или Fab- фрагментамп.

Мопоспецпфические гетерологичные антисыворотки против иммуноглобулинов человека нашли самое широкое применение для количественного определения этих белков в норме и патологии. При определении трех основных классов: IgG, IgM и IgA — применяют метод радиальной иммунодиффузии; IgD и IgE определяют с помощью радиоиммунного или иммукоферментного метода (см. гл. 12).

Большая степень гомологии первичной структуры у одноименных иммуноглобулинов близких в эволюционном отношении биологических видов находит свое отражение в сходстве части их антигенных детерминант. Так, кроличьи антитела против IgG человека эффективно перекрестно реагируют с IgG обезьяны и менее эффективно с IgG лотами и крысы. Подобные перекрестные реакции используют для выявления иммуноглобулинов, содержащихся в сыворотке в следовых количествах, например IgE. Для выявления этого белка у лабораторных животных используют антисыворотку против миеломного IgE человека.

Моноспецифические антисыворотки против изотипических детерминант иммуноглобулинов человека нашли важную область применения при сравнительном антигенном анализе иммуноглобулинов сыворотки крови и антигенсвязывающих рецепторов лимфоцитов (см. гл. 9).

Ниже рассматривается вопрос об антигенном строении легких цепей и его связи с первичной структурой.

Антитела против легких цепей человека могут быть получены как при иммунизации изолированными из мо-

лекулы им муноглобул ин а цепями, так и при использовании в качестве антигена белков Бенс-Джонса. Последние представляют собой мономеры или димеры легких цепей, содержащиеся в моче некоторых больных множественной миеломой; такие опухолевые клетки способны синтезировать в большом избытке легкие цепи и секретировать их.

112、114152163190216

Рис. 22. Аминокислотные замены, соответствующие изотипическим маркерам Л-цепей иммуноглобулинов человека

В иммуноглобулинах человека имеются четыре варианта 7,-цепей, отличающихся определенными антигенными детерминантами. Эти детерминанты можно выявить с помощью гетерологичных антисывороток, которые не дают перекрестных реакций. Указанные детерминанты не имеют ничего общего с аллотипическими (см. ниже), так как все четыре варианта найдены у всех людей.

На рис. 22 представлены данные о различиях в аминокислотной последовательности константных районов Z-цепей каждого из различающихся в антигенном отношении вариантов. Различия найдены только в пяти позициях. Специфичность двух антигенных маркеров — детерминант Kern и Oz — определяется заменами в позициях 152 и 190 соответственно. Если в позиции 152 находится глицин, цепь имеет детерминанту Kern ( + ). Если в той же позиции находится серин, то Kern (—). Аналогично лизину в позиции 190 соответствует детерминанта Oz (+), а аргинину — Oz (—). Поскольку, как указывалось, все варианты Z-цепей присутствуют у каждого индивидуума, нм должны соответствовать четыре одновременно функционирующих структурных &-гена.

Аллотипические детерминанты. Антигенные детерми- мпнанты, структура которых определяется аллельными

различиями в строении иммуноглобулинов, получили название аллотипических. Аллотипы отражают генетически контролируемый полиморфизм иммуноглобулинов^ в силу которого идентичные иммуноглобулины одного видового происхождения, но принадлежащие различным индивидуумам, различаются по своему строению.

Для выявления аллотипических детерминант можно получить антисыворотку, иммунизируя определенным иммуноглобулином одного животного другое животное того же вида, отличающееся от донора по генотипу. Так как каждая молекула иммуноглобулина имеет несколько различных аллотипических детерминант (или аллотипических маркеров), для получения антисыворотки только против одного маркера реципиент должен содержать все аллотипические маркеры донорского иммуноглобулина, за исключением этого маркера. При изучении аллотипов генетически однородных животных (например, линейных мы,шей) мышей одной линии иммунизируют иммуноглобулином мышей другой линии.

Антитела против аллотипических детерминант могут содержаться также в гетерологичных антисыворотках. Чтобы такая антисыворотка приобрела свойства анти- аллотипической, из нее методом специфической сорбции должны быть удалены антитела против изотипических антигенных детерминант, характерных для иммуноглобулина данного класса. Для адсорбции в качестве антигена может быть использован иммуноглобулин того же класса и видового происхождения, но от индивидуума> отличающегося по аллотипу от тестируемого иммуноглобулина. В качестве антигенов для получения антиал- лотипических сывороток часто служат моноклональные миеломные иммуноглобулины определенного класса, изолированные полипептидные цепи или фрагменты, полученные путем протеолиза.

Изучение аллотипов ii м м уноглобул и нов в сочетании с данными о первичной структуре составляющих их полипептидных цепей сыграло большую роль в понимании организации структурных генов для иммуноглобулинов^ В свою очередь, знание аллотипических маркеров иммуноглобулинов весьма существенно для ряда областей прикладной иммунологии. Ниже кратко излагаются сведения об аллотипических маркерах иммуноглобулинов человека, кролика и мыши.

Иммуноглобулины человека. Маркеры обнаружены в Сь-районе х-цепи, Си-районах тяжелых цепей IgG, IgM>

IgA и их подклассах. Маркеры легих цепей получили название Inv.

Ниже приведены обозначения аллотипических маркеров тяжелых цепей иммуноглобулинов человека:

Тип цепиТип цепиYi—Y4Yi—Y4Сн】Сн】СнЗСнЗGm(4)Gm(17)Gm(4)Gm(17)МаркерМаркерAm MmlAm MmlМаркер InvМаркер InvGm(l) GM—l)Gm(2)Gm(l) GM—l)Gm(2)..He установлен・・ Gm.・ He установлен..He установлен・・ Gm.・ He установленТип цепи x ・•・Тип цепи x ・•・.・ He установлен A ».・ He установлен A »

Тип цепи

Тип цепи

Yi—Y4

Yi—Y4

Сн】

Сн】

СнЗ

СнЗ

Gm(4)

Gm(17)

Gm(4)

Gm(17)

Маркер

Маркер

Am Mml

Am Mml

Маркер Inv

Маркер Inv

Gm(l) GM—l)

Gm(2)

Gm(l) GM—l)

Gm(2)

..He установлен

・・ Gm

.・ He установлен

..He установлен

・・ Gm

.・ He установлен

Тип цепи x ・•・

Тип цепи x ・•・

.・ He установлен A »

.・ He установлен A »

Gm (23)

Gm (—23)

Gm(5) Gm(—5)Gm(15)Gm(21)Gm(-21)Gm(5) Gm(—5)Gm(15)Gm(21)Gm(-21)Gm(6) Gm(13)Gm(ll) Gm(—11)Gm (14)Gm(6) Gm(13)Gm(ll) Gm(—11)Gm (14)

Gm(5) Gm(—5)

Gm(15)

Gm(21)Gm(-21)

Gm(5) Gm(—5)

Gm(15)

Gm(21)Gm(-21)

Gm(6) Gm(13)

Gm(ll) Gm(—11)

Gm (14)

Gm(6) Gm(13)

Gm(ll) Gm(—11)

Gm (14)

Gm(4a) Gm(4b)

Рис. 23. Локализация Gm-маркеров в константных доменах тяжелых цепей IgG человека различных подклассов

Рисунок 23 дает представление о локализации аллотипических маркеров в доменах константного района тяжелых цепей у различных подклассов IgG. Каждому подклассу присущ характерный набор Gm-факторов (маркеров). Некоторые маркеры идентичны в различных подклассах. Каждому маркеру Gm-системы, как и мар-

керам системы Inv, соответствуют определенные особенности первичной структуры. Их удается выявить в каждом из трех доменов у-цепи. Различия аминокислотной последовательности, связанные с определенными Gm-маркерами, выражаются в заменах единичных аминокислотных остатков. Так, например, детерминанте Gm(4) соответствует в позиции 214 (Сн1-домен) остаток аргинина, а детерминанте Gm(17)—остаток лизина. В позиции 358 (СнЗ-домен) IgGl с детерминантой Gm(l) имеет остаток лейцина, а аллельный вариант того же иммуноглобулина с детерминантой Gm(——1) —остаток метионина. Структура части Gm-маркеров, расположенных в Сн 1-домене ——Gm (4) и Gm (17), зависит от конформирующего влияния прилегающего константного домена легкой цепи. Напротив, структура детерминант, расположенных в С-концевых половинах тяжелых цепей (образующих Fc-фрагмент), не зависит от влияния одноименной цепи. Это не удивительно для детерминант, локализованных в Сц2-домене, поскольку одноименные домены двух цепей не контактируют друг с другом (см. раздел 2.3). Однако СнЗ-домены образуют устойчивый домен подобно тандему Сн1—Cl- При этом следует иметь в виду, что, судя по данным рентгеноструктурного анализа, сама компактность упаковки отдельных константных доменов неодинакова. Это, по-видимому, и определяет вклад прилегающего домена (иными словами, латерального взаимодействия) в структуру аллотипичес- кой детерминанты. Обсуждаемые данные, равно как и приводившиеся выше о зависимости первичной структуры цепей и их аллотипической специфичности, не оставляют сомнений в том, что детерминанты, определяющие аллотип, принадлежат к числу конформационнозависимых.

Изучение аллотипической специфичности IgM показало, что его маркер Mml представляет собой детерминанту, структура которой зависит от взаимодействия двух прилегающих друг к другу ц-цепен. Изолированные (.1-цепи не реагируют с анти-Mml антителами. IgA2, в молекуле которого обнаружена аллотипическая детерминанта Am(1) и ее аллельный вариант Аш(——1), имеет необычную для иммуноглобулинов структуру: дисульфидные связи между легкими и тяжелыми цепями отсутствуют, но сами легкие цепи связаны дисульфидным мостиком (см. раздел 2.1). Существует ли связь между этими особенностями четвертичной структура IgA2 и его

аллотипической специфичностью, не известно; она не исключена, если учесть, что один из аллотипических маркеров этого белка — A2m (2) находится в пределах N-концевой половины a-цепи и, следовательно, может испытывать на себе влияние легкой цепи.

В легких цепях иммуноглобулинов человека аллоти- пические маркеры обнаружены только в х-цепях. Их называют, как уже упоминалось, Inv-факторами. Описаны три Inv-фактора, причем у большинства индивидуумов маркер Inv(l) сцеплен с маркером Inv(2). Напротив, маркеры Inv(l) и Inv(3) не удается обнаружить в одной и той же х-цепи.

Установлена взаимосвязь между особенностями первичной структуры х-цепи (ее константного района) и типом Inv-фактора. В случае маркеров Inv(l, 2) в позиции 191 находится лейцин, а в случае Inv(3) — валин. Несмотря на гомологичность замены (в обоих случаях аминокислоты с алифатическим радикалом), конформация участка цепи, несущего детерминанту, или соседних участков, по-видимому, не одинакова. В результате этого, возможно, происходят определенные нзменення участка цепи, посредством которого она 'взаимодействует с тяжел oil цепью. Влияние последней на структуру Inv-детерминант весьма велико, так как для выявления этих детерминант в изолированных легких цепях требуется в пять раз большая их молярная концентрация по сравнению с интактным IgG.

Хотя легкие цепи у иммуноглобулинов одного класса и подкласса в пределах одного вида одинаковы, их способность в составе молекулы иммуноглобулина индуцировать образование антител различна. Так, среди подклассов IgG она наименее выражена у IgG2 и IgG4. На этом основании можно заключить, что в различных подклассах IgG константный домен легкой цепи в разной степени испытывает на себе влияние Сн1-Домена, что зависит от тонких особенностей их конформации. Так антигенный анализ позволяет более глубоко проникнуть в тайну структурной организации иммуноглобулинов.

Иммуноглобулины кролика. Для “- и 厶-цепей иммуноглобулинов кролика характерно наличие двух разных групп маркеров: b и с, которые не имеют между собой антигенного родства. Около 70—90% всех иммуноглобулинов у кролика содержат легкие цепи х-типа; в их составе выявлено четыре аллотипических маркера: Ь4, Ь5, Ь6, Ь9. Структура двух последних сходна. Фактически

каждому из указанных маркеров соответствует несколько антигенных детерминант в пределах одной цепи. Экспрессия аллотипов группы b .подчиняется у здоровых кроликов следующей количественной закономерности: Ь4>Ь5>Ь6>Ь9. Аллельным вариантам х-цепей кролика соответствуют многочисленные аминокислотные замены в пределах константного района.

Маркеры л-цепи кролика — С7 и С21 контролируются генами, которые, видимо, тесно сцеплены. Однако оба маркера никогда не выявляются в пределах одной и той тке цепи, что несомненно указывает на существование двух аллепьннх форм С^-гена.

Определение аллотипических маркеров очищенных ■антител гетерозиготного кролика имеет существенное значение для оценки степени их однородности. Если антитела содержат легкие цепи одного типа и с единственным аллотипическим маркером, это служит важным свидетельством участия в синтезе антител одного или всего нескольких клонов клеток.

Для тяжелых цепей иммуноглобулинов кролика характерны две группы аллотипических маркеров. Одна из них локализована в Vn-районе и контролируется тремя аллельными генами: al, а2 и аЗ. Соответствующие им детерминанты можно обнаружить практически в 90% тяжелых цепей иммуноглобулинов различных классов. Наиболее характерные для указанных маркеров аминокислотные замены приходятся на участок цепи, включающий 29 остатков с амипоконца. Как известно (см. раздел 2.2), в пределах этого сегмента находится один гипервариабельный участок. Однако аллотипические детерминанты находятся, естественно, вне этого участка, ибо в противном случае их структура отражала бы не индивидуальный полиморфизм генов особей данного вида, а клоноспецифическую гетерогенность иммуноглобулинов, т. е. их идиотип (см. ниже).

Сведения об аллотипических маркерах иммуноглобулинов кролика и их локализации (табл. 4) служат независимым подтверждением полигенного контроля за их синтезом (см. гл. 5). Ведь только для С】-района существуют две независимые группы маркеров, ассоциированных с участками молекулы, значительно отличающимися и по первичной, н по пространственной структуре. Антигенная специфичность маркеров группы d определяется как аминокислотными заменами в позиции 225, так и расположенной в районе талин дисульфидной связью

Т а б al и ц a 4. Аллотипы иммуноглобулинов кролика

Локус

Детерминанты

Класс иммуноглобулина

Локализация

а

al, а2, аЗ

Все классы

Вариабельный район

Н-цепи

X, У b

х32, v33

》

》

То же

Ь4, Ь5, Ь6, Ь9

》

»

Константный район х-цепп

С

с7, с21

»»

Константный район

Z-цепи

d

dll, dl2

IgG

Константный район 『непн(участок

«талии» молекулы IgG)

е

е14, е15

》

Константный район у-цепи (Fc-участок молекулы IgG)

f

Г69, Г70, f/l, f72, f73

IgA

Константный район а-цепи

g

g74, g75, g76, g77

》

То же

?1

Msl, Ms2, Ms4, Ms5, Ms6

IgM

Константный район

卩-цепи

? 1

n81, n82

》

То же

Локус неизвестен.

между тяжелыми цепями. Зависимость структуры антигенных детерминант, соответствующих d маркеру, от межцепьевой дисульфидной связи указывает на несомненное кооперативное взаимодействие тяжелых цепей в районе талии независимо от своеобразия их первичной структуры (см. раздел 2.3). Существование такого взаимодействия подтверждает также рентгеноструктурный анализ.

Гены, контролирующие аллотнпические маркеры вариабельного и константного районов тяжелой цепи, тесно сцеплены между собой, что согласуется с данными о нахождении структурных генов для обоих районов в одной и той же хромосоме (см. гл. 5).

Аллотнпические детерминанты С”- и Са-районов контролируются аллельными генами двух независимых локусов каждый. В свете современных представлений об организации структурных генов для тяжелых цепей (см. гл. 5) это означает, что М- и n-маркеры 卜i-цепн и f- и g-маркеры a-цепи расположены в различных константных доменах соответствующих цепей, а их синтез контролируется различными сегментами Сц- и Са-генов. Как и для

у-цепеи, для 卩-и а-цепеи характерно тесное сцепление маркеров вариабельных и константных районов.

И ммуноглобул ины мыши. Данные об аллотиппческпх маркерах иммуноглобулинов мыши приведены ниже.

Тип цепиМаркеры

N

А ....

Y1

4а,

ь, с, d, е, f, g, h

Y2a ..-.

....1а-

b* c，e, f, g, h

Y2b ・•・•

....за>

b・ r, d, f, g, h

Тз

Не

установлены

а

....2“，

b, c, d, e, f, g, h

6 .

・ 5а

b

从

,...ба，

b

Почти все идентифицированные маркеры находятся в С-концевых половинах молекул. Стр ктура маркеров каждого из подклассов IgG контролируется генами различных локусов. Гены каждого локуса определяют структуру большого числа детерминант (например, Ig-1 локус—более десяти). Мыши различных линий могут иметь несколько идентичных детерминант. Если мыши дв х разных линий содержат одинаковый маркер в подклассе IgGl, у них будут также одинаковые маркеры в подклассах lgG2a, IgG2b, IgA. На этой основе построена номенклатура аллелей локусов Ig-1, Ig-2, Ig-3, Ig-4, с которой можно часто встретиться в литературе. Так, например, если все линии мышей с аллелями Ib-la, Ig-lc, Ig-lh локуса Ig-1 идентичны по специфичности с детерминантами локуса Ig-З, аллель этого локуса обозначается как Ig-3a，c,匹 о чем свидетельствует указанная закономерность? Прежде всего о том, что все семейство С-генов эволюцинирует как единое целое, причем важным групповым признаком семейства служат аллотипиче- ские маркеры. Осуществляя селекцию как лабораторных, так и сельскохозяйственных животных, даже по одному аллотипическому маркеру константного района иммуноглобулинов можно судить о степени близости новой линии (породы) прототипу. Это один из примеров того, сколь существен может быть вклад молекулярной иммунологии в современную биологию и сельское хозяйство.

Идиотипические детерминанты. Термин идиотип, впервые введенный Ж. Уденом (J. Oudin, 1966), обозначает индивидуальную антигенную специфичность антител, миеломных белков и белков Бенс-Джонса. Антигенные детерминанты этого типа (идиотипические детерминанты) могут быть выявлены с помощью гетерологичных, гомологичных и изологичных (аутологичных) антител. Приведем в качестве примера способ получения гетерологичных антител.

Если иммунизировать кролика индивидуальными миеломными иммуноглобулинами человека, образуются антитела, реагирующие как с иммуноглобулином, исполь- вованным для иммунизации, так и с другими миеломными белками и нормальными иммуноглобулинами человека. После адсорбции этой антисыворотки использованным для иммунизации антигеном она полностью утрачивает способность реагировать с любым иммуноглобулином человека. Однако в случае адсорбции антисыворотки смесью нормальных иммуноглобулинов или смесью разнообразных индивидуальных миеломных белков, в числе которых нет иммуноглобулина, использованного в качестве антигена, полного извлечения из антисыворотки всех антител не произойдет. В ней останутся антитела, реагирующие только с тем иммуноглобулином, который использовали в качестве антигена. Антигенные детерминанты, к которым направлены эти антитела, расположены в Fab-участках молекулы иммуноглобулина, а точнее ——в пределах вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей.

Уникальность строения идиотипической детерминанты определенного миеломного белка иммуноглобулиновой природы была установлена при использовании анти- идиотипической сыворотки для сравнительного анализа большого числа индивидуальных миеломных иммуноглобулинов. Так, в частности, исследовали 160 иммуноглобулинов, продуцируемых перевиваемыми плазмацитомами мышей линии BALB/c. Кроличья антиидпотппичес- кая сыворотка была получена к одному из белков, входящему в число изучаемых. Ни один из иммуноглобулинов, кроме того, который использовали для иммунизации, и еще одного, не реагировал с данной антисывороткой. Как оказалось, перекрестно реагирующие два из 160 белков имели как антитела идентичные лигандсвязывающие свойства — оба реагировали с пневмококковым полисахаридом одинакового строения.

Для оценки идиотипической специфичности антител кролика использовали гетерологичные и гомологичные антисыворотки. Последние получали, вводя повторно кроликам-реципиентам очищенные антитела определенной специфичности от индивидуальных доноров. Подбирали доноров и реципиентов таким образом, чтобы они совпадали по основным аллотипам иммуноглобулинов (последнее желательно, чтобы избежать процедуры адсорбции антисыворотки нормальными иммуноглобулинами донора). Показано, что антитела одной и той же специфичности, но от разных доноров различаются строением идиотипических детерминант.

Вместе с тем миеломные белки от различных индивидуумов, специфически реагирующие с одним и тем же антигеном, могут иметь в ряде случаев сходные идиотипы. Так, кроличья антисыворотка против антител к параазофенил арсонату, полученных от одной из мышей линии A/J, реагировала с антителами той же специфичности многих мы.шей этой стинии.

Значительный интерес представляет возможность получения антител к идиотипическим детерминантам аутологичных иммуноглобулинов. В одном из подобных экспериментов в качестве антигена служили F(abz)2-фрагменты кроличьих антител против пара-ами- нофеннл-N-триметиламмония. Фрагменты антител от индивидуальных доноров полимеризовали глутаральдегидом и вводили тем же кроликам спустя 6 месяцев после получения антисывороток. В этот период у животных уже не удавалось обнаружить антител указанной специфичности. Методом непрямой преципитации с радиоме- ченым антигеном (см. гл. 12) у каждого из подопытных кроликов были обнаружены антитела против F(ab')2- фрагментов собственных антител. Поскольку эти анти-антитела не реагировали с F(ab')2-巾рагментамн антитела ■в присутствии специфического гаптена, можно было заключить, что они направлены к детерминантам непосредственно в районе активного центра антитела. Именно в этом районе находятся детерминанты, определяющие идиотип иммуноглобулина (L. Rodkey, 1974).

Важный факт установили Л. Клюскенс и Г. Кёлер (L. Kluskens, Н. Kohler, 1974) при исследовании сывороток мышей BALB/c, многократно иммунизированных пневмококком R3GA (так называемый фосфорилхолино- вый антиген). В сыворотке одновременно выявлялись как антифосфорилхолиновые антитела, так и анти-антитела

со свойствами антиидиотипических, т. е. направленных к детерминантам в Fab-фрагменте.

Как в гетерологичной, так и в изологичной антиидио- типической сыворотках содержатся антитела к детерминантам, находящимся непосредственно в активном центре антитела, а также детерминантам, удаленным от него. Первые из указанных анти-антител не взаимодействуют с антителом после блокирования его активного центра гаптеном. Используя этот методический прием, удалось показать, что в гетерологичной антисыворотке свыше 90% антител направлено к детерминантам, удаленным от активного центра, в то время как в изологичной антисыворотке содержатся преимущественно анти-антитела к детерминантам, непосредственно примыкающим к активному центру. Следовательно, гетерологичные и изологичные антиидиотипические антитела направлены к различным, хотя и близко расположенным детерминантам.

Исследование изолированных полипептидных цепей иммуноглобулинов и реконструированных из них молекул указывает на то, что большинство идиотипических детерминант образовано при участии как легкой, так и тяжелой цепи. В частности, установлено, что изолированные легкие цепи миеломного иммуноглобулина не реагируют с антителами, полученными против идиотипических детерминант целой молекулы белка. При реконструкции молекулы из изолированных цепей структура идиотипических детерминант восстанавливалась только в том случае, если легкие и тяжелые цепи принадлежали иммуноглобулину, который служил антигеном при получении антиидиотипической сыворотки. Последнее не удивительно в свете уже обсуждавшейся в разделе 3.3 работы К. Доррингтона, в которой было показано, что при реконструкции молекулн иммуноглобулина из легких и тяжелых цепей, взятых из разных молекул (разных моноклональных иммуноглобулинов), связывание легкой цепи идет за счет ее константного домена, а вариабельные домены легкой и тяжелой цепей не взанмо工е^ствуют между собой.

Идиотип иммуноглобулина подобно другим особенностям его строения определяется в конечном счете аминокислотной последовательностью образующих идиотипическую детерминанту участков полипептидных цепей. Эти участки, несомненно, расположены в вариабельных районах тяжелой и легкой цепей и у имм\ ноглобулинов

со сходной идиотипической специфичностью имеют сходную или тождественную первичную структуру. Это находит подтверждение в многочисленных данных, в том числе полученных Дж. Капра и Дж. Кейе (J. Capra, J. Kehoe, 1975). Исследовали два моноклональных иммуноглобулина М н G класса, . продуцируемых одним клоном плазматических клеток. Белки совпадали по идиотипической специфичности и не имели никаких различий в аминокислотной последовательности гипервариабельных районов тяжелых цепей. У этих белков совпадала также последовательность 38 аминокислотных остатков аминоконцевых участков легких цепей. То, что иммуноглобулины двух различных классов, продуцируемые одной клеткой, должны обязательно иметь идентичные вариабельные районы, представляется сегодня единственно возможным в свете наших знаний об организации структурных генов иммуноглобулинов и их перегруппировках (см. гл. 5).

Мы не заканчиваем здесь обсуждение проблем идиотипы и и продолжим его в гл. 10.

Вариотипические детерминанты (framework determinants). Термин был предложен Ю. Бен-Нейрахом, П. Ло- наи с соавторами (Y. Ben-Neriah, Р. Lonai et al., 1978) для обозначения описанных ими детерминант вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей иммуноглобулинов мы,ши, структура которых в отличие от идиотипических определяется не гипервариабельными, а инвариантными (консервативными) участками последовательности. Антитела можно получить в результате иммунизации кроликов изолированными вариабельными доменами обеих цепей. Последние получают из Fv-фрагмента. Чем замечательны вариотипические детерминанты? Тем, что они идентичны в антителах самой различной специфичности, полученных у животных одного вида. Тем, что локализуются в контактных участках доменов и поэтому антитела к ним не реагируют ни с одним из иммуноглобулинов. Они не реагируют также с изолированными Fab-фрагментами, взаимодействуя только с изолированными вариабельными доменами. Вариотипические детерминанты образованы, видимо, короткими (из пяти — семи остатков )отрезками пептидных цепей. Вопрос о биологической значимости таких детерминант и антител к ним только предстоит установить.

MABAMABA44ктивный центр антителактивный центр антитела

MABA

MABA

4

4

ктивный центр антитела

ктивный центр антитела

Активным центром антитела называют участок молекулы, пространственно комплементарный детерминантной группе антигена (гаптена). Комплемен- тарность (пространственное соответствие) активного центра антигенной детерминанте обеспечивает большое число нековалентных связей, возникающих между лигандом и образующими активный центр отрезками пептидных цепей антитела. Эти нековалентные связи стабилизируют комплекс. Хотя между детерминантной группой (гаптеном) и аминокислотными остатками в активном центре не возникают ковалентные связи, однако за счет большого числа слабых связей образуется относительно мало диссоциирующий комплекс. В силу этого равновесие в системе антиген-антитело сильно смещено вправо:

Аг + Ат^АгАт, (1)

где Аг — антиген, Ат — антитело.

Если принять во внимание, что антигены поливалентны, т. е. содержат в молекуле несколько идентичных де- терминантных групп, а антитела как минимум бивалентны, становится очевидным второй важный фактор стабильности формирующихся комплексов антиген-антитело. Согласно второму закону термодинамики

AF = AH-TAS, (2) где AF •— изменение свободной энергии системы в ходе реакции, АН — изменение энтальпии, илги общей энергии, AS—изменение энтропии (мера неупорядоченности системы). В ходе реакции антиген-антитело в силу взаимодействия по нескольким точкам возрастает роль энтропийного члена, поскольку в момент диссоциации по одной точке комплекс остается стабильным за счет связи по другим точкам. Подробнее термодинамические особенности реакции антиген-антитело рассматриваются ниже.

Организация активного центра

Активный центр, или антидетерминанта, представляет собой щель, расположенную между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей. Оба домена участвуют в формировании антидетерминанты. Вклад •каждого из них не одинаков, о чем можно судить по сравнительному изучению антиген (гаптен) -связывающих свойств изолированной легкой цепи и аминоконцевой половины тяжелой цепи (Fab-фрагмент), выделенных из какого-либо антитела. Изолированные легкие цепи практически не связывают антиген (гаптен). Fd-фрагменты 1 антител, растворимость которых повышена за счет карбоксиметилирования части аминогрупп монойодацетатом (А. Кульберг, И. Тарханова, 1968) или присоединения коротких цепочек полиаланина ——полиаланил'ирования (J. С. Jaton et al., 1968), специфически связывают антиген или гаптен. Однако связывающая способность Fd- фрагмента намного уступает таковой Fab-фрагмента и даже Fv-фрагмента.

История изучения строения антидетерминанты включает несколько этапов. Первый этап, начавшийся открытием Р. Портером (R. Porter) в 1958—1959 гг. Fab-фрагментов, увенчался доказательством выраженной структурной автономии участка молекулы, образующего активный центр: получен в изолированном виде низкомолекулярный фрагмент антитела, сохраняющий по крайней мере частично антигенсвязывающие свойства (А. Кульберг, И. Тарханова, 1962). Размеры этого фрагмента (13 000+1000) полностью совпадают с размерами изолированного домена, установленными Д. Инбаром (D. Inbar) с соавторами только в 1972 г. Важно подчеркнуть, что получить меньшие по размеру лигандсвязы- вающие фрагменты молекулы антитела невозможно. Но это стало понятно лпд!ь теперь, когда выяснилось, во- первых, что домен — очень компактное структурное образование, во-вторых, что в образовании антидетерминанты участвуют гипервариабельные участки, разбросанные по всей длине отрезка цепи, сформированного в вариабельный домен.

Второй этап изучения антидетерминанты — доказательство самосборки активного центра при реконструкции молекулы антитела из изолированных цепей

Fd-фрагмент — аминоконцевая половина тяжелой цепи.

(Ф. Франек, Р. Незлин, 1964; J. Edelman, 1963). Тогда же была продемонстрирована возможность спонтанной реконструкции антидетерминанты из полипептидных цепей, развернутых предварительно под влиянием денатурирующих агентов в присутствии восстановителей (М. Fridman, М. Sela, 1966). Именно с этого момента можно считать окончательно утратившими значение идеи о прямом участии антигена (гаптена) в формировании полости антидетерминанты.

Третий этап—создание метода «метки по сродству» с целью идентификации аминокислотных остатков непосредственно в активном центре (L. Wofsy, Н. Metzger, S. Singer, 1962—1964). Сущность метода состоит в том, что гаптен в форме реакционноспособного производного, связываясь с высокой скоростью в активном центре специфичного к нему антитела, обеспечивает взаимодействие реакционноспособной группы с радикалами непосредственно в активном центре.

Рис. 24 схематически иллюстрирует механизм метки по сродству на примере азопроизводного динитрофениль- ной группы. К настоящему времени синтезировано большое число различных реакционноспособных производных гаптенов, избирательно реагирующих с разными аминокислотными остатками. В ходе реакции образуются устойчивые ковалентные связи, поэтому, разделив поли- пептидные цепи и фрагментировав их, можно точно локализовать меченый аминокислотный остаток. Таким способом удалось установить, что оба вариабельных домена (от легкой и тяжелой цепей) участвуют своими аминокислотными остатками в формировании полости активного центра и что полость центра «выстилают» отрезки цепей, соответствующие гипервариабельным участкам. Данные, накопленные с помощью метода «метки по сродству», были дополнены результатами, полученными методами дифференциальной спектрофотометрии и электроннопарамагнитного резонанса (см. гл. 12), а также химической модификации определенных аминокислотных остатков в молекуле антитела. Для ряда гаптенов гидрофобного характера . (например, нитрофениль- ные производные) было доказано присутствие в активном центре антитела остатка триптофана, продемонстрирован гидрофобный характер полости антидетерминанты. Для других гаптенов установлена локализация остатков гистидина, лизина, тирозина и точно определено их местоположение в каждой цепи.

ББАш иге.ia направлены кАш иге.ia направлены кРис. 24. Метод «метки по сродству». Л — изображение активного центра (аьпнде- терминанты) антитела к ди- нитрофенильной группе и места фиксации азопроизводного динитрофенильной группы на остатке тирозина в активном центре; Б — локализация некоторых гаптенов в легкой и тяжелой цепях соответствующих антител при использовании д.1я мечения азопроизводных гаптенов

Б

Б

Аш иге.ia направлены к

Аш иге.ia направлены к

Ме1яший реагенiМе1яший реагенi/?- а юбен JCHapcofiai \/?- а юбен JCHapcofiai \Tyr-R< His-R Lys-RTyr-R< His-R Lys-R2.4 工“H“ipc巾сн“」」“ mih\2.4 工“H“ipc巾сн“」」“ mih\1,31,81,31,8аюфени-! I piiMCiH.iaMMoiiifK?аюфени-! I piiMCiH.iaMMoiiifK?С ня мнныйI ап Iен в1яжелой легкойцепях, моль

Ме1яший реагенi

Ме1яший реагенi

/?- а юбен JCHapcofiai \

/?- а юбен JCHapcofiai \

Tyr-R

< His-R Lys-R

Tyr-R

< His-R Lys-R

2.4 工“H“ipc巾сн“」」“ mih\

2.4 工“H“ipc巾сн“」」“ mih\

1,3

1,8

1,3

1,8

аюфени-! I piiMCiH.iaMMoiiifK?

аюфени-! I piiMCiH.iaMMoiiifK?

Заключительный этап изучения антидетермпнанты — получение в кристаллической форме Fab-фрагментов моноклональных иммуноглобулинов, специфически связывающих определенные гаптены, и рентгеноструктурный анализ кристаллов, образованных комплексами фрагмента антитела с соответствующим гаптеном. В этих исследованиях, выполненных в последние годы, были под-

тверждены п развиты представления, сформулированные на основании многих работ по структуре антител.

Рентгеноструктурный анализ подтвердил участие гипервариабельных сегментов в формировании полости антидетерминанты. Примером может служить изучение Fab-фрагмента моноклонального миеломного иммуноглобулина человека New, который в числе ряда лигандов связывает также гидроксильное производное витамина Ki, имея к этому лиганду сравнительно высокое сродство (Ка= Ю5М-1). Как следует из рис. 25, гипервариабельные участки образуют неглубокие выемки, так что центр имеет размеры 1,6X0,7 нм2 при глубине 0,6 нм. Ароматическая менадионовая группа гаптена находится в непосредственном контакте с остатками ароматических аминокислот: тирозином и триптофаном. Этим остаткам принадлежит, очевидно, основная роль в «удержании» менадионовой группировки (2-метил-1,4-нафтохинон) в полости активного центра.

Кристаллографический анализ Fab-фрагмента мышиного моноклонального IgA, продуцируемого плазмацитомой МсРсбОЗ 'И связывающего фосфорилхолин, показал, что активный центр имеет клиновидную форму с размерами 1,5x20 нм2 и глубиной 2,0 нм (рис. 26). Из шести гипервариабельных участков (имеющихся в двух вариабельных доменах) в образовании центра участвуют пять: первый и третий легкой цепи и все три тяжелой. Второй гипервариабельный участок легкой цепи «вытеснен» из полости центра петлей легкой цепи, образованной первым гипервариабельным участком и петлей третьего гипервариабельного участка тяжелой цепи. Большая глубина полости центра, связывающего фосфорилхолин, в сравнении с центром для витамина Ki (см. выше) обусловлена большей длиной петель гипервариабельных сегментов: первого легкой цепи и третьего тяжелой цепи — на три остатка каждого. Замечательно, что фосфорилхолин занимает только часть полости активного центра; это (как будет обсуждаться ниже) вообще типичное явление, служащее структурной основой полиспец'ифичности антител, т. е. способности антитела к определенному лиганду связывать еще и другие не родственные первому лиганду соединения.

Различия не только состава гипервариабельных участков, но и их длины обеспечивают структурное многообразие активных центров. Наиболее вариабельны по длине первый гипервариабельный участок легкой цепи

(может варьировать на 6 остатков) и третий гнперварна- бельный участок тяжелой цепи (см. ниже). При этом, как правило, указанные гипервариабельные участки структурно связаны между собой. Не менее значимо, по-

Рис. 25. Гаптен (витамин KQH) в полости антидетерминанты моноклонального IgG человека (New):

Lu L3, Hi, Н2 и H4 — петли гипервариабельных районов легкой и тяжелой цепей. Два конденсированных шестичленных кольца (менадион) связаны вверху в неглубокой полости (1,6ХО.7Х Х0,6 нм3); фитиновый хвост гаптена расположен под остатком менадиона и продолжается дальше почти на всю длину полости антидетерм ин анты

видимому, взаимодействие первого гипервариабельного участка тяжелой цепи с третьим гипервариабельным участком легкой цепи. Иллюстрацией этому служит иммуноглобулин плазмацитомы S107, связывающий фос- форилхолин. В активном центре этого белка взаимодействуют остаток глутаминовой кислоты, находящийся в

24

Рис. 26. Полость активного центра моноклонального IgA мыши МсРс 603 с расположенным в нем гаптеном — фосфорилхолином (выделен жирной линией); обозначения те же, что и на рис. 25.

позиции 35 тяжелой цепи (первый гипервариабельный участок), и остаток тирозина в позиции 94 третьего гипервариабельного района легкой цепи. Благодаря этому стабилизируется конфигурация полости, в которой располагается лиганд——фосфорилхолин. То, что это действительно так, показывает изучение иммуноглобулина, продуцируемого мутантом U4 плазмацитомы S107. Он отличается от иммуноглобулина, о котором шла речь выше, только одной аминокислотной заменой: остаток глутаминовой кислоты в позиции 35 тяжелой цепи заменен аланином. И этого достаточно, чтобы мутантный белок не связывал фосфорилхолин (S. Rudikoff et al., 1981).

Возможно, что конфигурационная асимметрия вариабельных участков легкой и тяжелой цепей (обусловленная неодинаковой протяженностью и различиями строения) служит причиной полиспецифичности антител — неполного структурного соответствия центра единственному лиганду. В качестве примера можно привести уникальный белок, продуцируемый клетками миеломы Rei и состоящий нз димера двух вариабельных доменов легкой (х) цепи. Димер удается получить в кристаллическом виде вместе с лигандом — тринитрофенильной группой. Симметрично расположенные петли гипервариабельных участков образуют глубокий щелеподобный карман. Тринитрофенильная группа заполняет этот карман целиком, оказываясь в непосредственном контакте с остатками тирозина в позициях 49, 91 и 96 (на каждой из «стенок») и 36 (на «дне»). Не удивительно, если бы с помощью дифференциальной спектрофотометрии в полосе поглощения гаптена был бы обнаружен длинноволновый сдвиг, характерный для комплекса с переносом заряда между остатками тирозина в активном центре н триннт- рофенильной группой как акцептором электронов (см. гл. 12).

Далеко не всегда активный центр представляет собой отчетливо выраженную впадину или щель. Примером служит моноклональный белок Koi, для которого не известен специфический лиганд. Это представляется закономерным, поскольку со стороны тяжелой цепи в область молекулы, обычно занимаемой активным центром, вдается весьма длинная петля третьего гипервариабельного участка. Она длиннее на шесть остатков соответствующей петли иммуноглобулина, продуцируемого клетками миеломы М603, и на восемь остатков того же участка белка New (табл. 5).

Таблица 5. Аминокислотная последовательность гипервариабельных районов Vn-домена некоторых моноклональных иммуноглобулинов человека, кодируемых D-сегментом структурного гена для тяжелых цепей иммуноглобулинов

Номера остатков

Белок

96£7999 9100101al6cdefg论<左102

(102) (103) (104) (10 5) (106) (107) (Ю8) (109) (110) (111)(112)

М603

Cys —— Ala — Arg—-Asn — Туг — Туг— Gly—Ser — Thr ■**•"*" Tyr—"*

New

一 Cys 一 Ala 一 Arg—Asn—Leu — Пе — Ala — Gly — Cys — He —— Vai—

е

Ей

—Cys'— Ala — Gly—Gly — Туг—Gly — He —— Tyr—

М21

«—Туг — Pro —Тгр—Туг — Ala—Met ——Tyr—

Ко!

—Cys — Ala — Arg—Asp—Gly — Gly — His — Gly — Phe — Cys — Ser — Ser — Ala—Ser—Cys—Phe—Gly

а—Л — дополнительная аминокислотная последовательность в белке KoL

Дополнительный отрезок цепи скручен такнм образом, что заполняет целиком пространство между петлями других гипервариабельных участков легкой и тяжелой цепи, т. е. гипотетическую полость активного центра. Активный центр в форме глубокой впадины появился бы в этом участке, если «вырезать» из третьего гипервариабельного участка «лишний» пептид, формирующий анти- параллельную ^-шпильку. Другие иммуноглобулины, подобные Koi, не изучали методами рентгеноструктурного анализа, однако они, несомненно, существуют. Например, иммуноглобулин мыши М141. Он не связывает каких-либо известных лигандов 也 характеризуется более длинным, чем у известных моноклональных антител, третьим гипервариабельным участком тяжелой цепи. Логично, что и в этом случае полость активного центра заполнена петлей этого длинного гипервариабельного участка.

Интересно допустить, что заполнение пространства между петлями гипервариабельных участков удлиненной петлей одного из них, как бы выполняющей функцию лиганда, — более частое явление, чем наличие иммуноглобулинов (антител), содержащих полость, соответствующую активному центру. С энергетических позиций наличие полости невыгодно, так как в отсутствие лиганда структура недостаточно устойчива. Заполнение полости вклинившейся в нее петлей цепи существенно повышает устойчивость всей этой области, а следовательно, энергетически выгодно.

Предлагаемая мною гипотеза, конечно, нуждается в дополнительных подтверждениях. Но она служит основой для далеко идущих предположений общебиологического плана. Напр’нмер, проблемы так называемых неспецифических или нормальных иммуноглобулинов. Иммунологам хорошо известно, что одновременно с синтезом антител образуется большое количество иммуноглобулинов, которые никакие известные лиганды, в том числе и использованный антиген, не связывают. Число продуцирующих их клеток может намного превышать число ан- тителдпродуцирующих клеток (Е. Сидорова и др., 1981). По всем признакам (общий план строения, антигенный анализ) нормальный имм)шоглоб)^лин отличается от антител только одним: он не связывает известных лигандов. На основании обсуждавшихся данных рентгеноструктурного анализа мы ставим на обсуждение предположение о том, что нормальные иммуноглобулины — это энергетически устойчивая конформация молекулы имму-

ноглобулина, в которой полость центра заполнена длинной петлей одного (скорее всего третьего тяжелой цепи) из гипервариабельных районов. Данные генетики иммуноглобулинов хорошо согласуются с этим предположением. Не повторяя здесь материалов гл. 5, скажем лишь, что появление более длинных петель гипервариабельных участков и прежде всего третьего тяжелой цепи совсем не требует участия особого структурного гена. Этот участок кодируют три стыкующихся сегмента — Vn, D и J, разделенные интронами в эмбриональном геноме. Ре- арранжировка генов в процессе дифференцировки может сопровождаться «сдвигом рамкн» ——сочленением сегментов с некоторым сдвигом относительно друг друга. Это тем более вероятно в свете данных И. Куросава и С. То- негава (У. Kurosawa, S. Tonegawa, 1982) о существовании трех различных семейств D-сегментов, кодирующих три, пять и семь аминокислот.

Данные рентгеноструктурного анализа, согласно которым гаптен (фосфорилхолин) заполняет в белке МсРсбОЗ голько часть полости активного центра, в пределах которой может разместиться в принципе еще один лиганд, хорошо согласуется с данными о полиспецифичности моноклональных иммуноглобулинов. Ценность обсуждаемых результатов особенно велика в силу именно моноклонального происхождения белков и, следовательно, высокой степени их однородности. По данным Г. Айзена с соавторами (Н. Eisen et al., 1968), моноклональный иммуноглобулин класса А мышиной плазмацитомы МОРС315, имеющий высокое сродство к динитрофениль- ной группе, связывает также менадион и динитронафтол. Сравнение структуры этих трех сильно связуемых лигандов позволяет предположить существование в полости активного центра белка МОРС315 двух, а возможно и трех частично перекрывающихся участков для указанных лигандов, имеющих, как видно из их структурных формул, лп.шь незначительную степень сходства:

о

еII 3

О

2_Мс I пл —

1.4-1К|ф гохи нон (менадион)

В другом случае для моноклонального белка, связывающего два лиганда, достоверно показано, что соответствующие участки активного центра перекрываются лишь ■в малой мере. Мышиный моноклональный иммуноглобулин, продуцируемый плазмацитомой МОРС460, связывает динитрофенильную группу и менадион. Если обработать иммуноглобулин 4,3 М раствором солянокислого гуанидина, способность связывать динитрофенильную группу утрачивается, хотя полностью сохраняется свойство связывать менадион. Обратный эффект наблюдается при воздействии на белок 2%-ного раствора диметилсульфоксида. В свою очередь, химическая модификация с)^льфигидрильной группы внутри центра (или в непосредственной близости от него) приводит к потере сродства к .менадиону, но не динитрофенильной группе.

Существует также наблюдение о наличии в пределах одного активного центра IgG человека участков для связывания Fc-фрагмента гомологичного IgG и ДНК. Полное отсутствие структурного сходства между перечисленными лигандами очевидно.

Полиспецифичность моноклональных н\{муногло6у〃н- нов предполагает существование полиспецифичности и у антител, синтезируемых под влиянием определенного антигена. При этом имеется в виду, что антиген-индуктор имеет только одну детерм ин антн)7ю группу, с которой может взаимодействовать полиспецифичное антитело. Из этого вытекает, что иммунный ответ практически никогда не бывает строго специфичен, т. е. направлен только против антигенных детерминант антигена-индуктора.

Обсуждаемая проблема имеет по крайней .мере еще два важных аспекта. Теоретический аспект состоит в том, что разнообразие антител в отношении их специфичности (равно как и разнообразие специфичности ан- тпгенсвязывающих рецепторов лимфоцитов), очевидно, существенно больше числа структурных генов для вариабельных районов легкой и тяжелой цепей, так как в структуре каждого из них закодирована, по-видимому, структура участков, комплементарных нескольким неродственным по строению детерминантным группам.

Практически значимая сторона проблемы полиспецифичности антител состоит в том, что никакими способами (в том числе и гибридомной техникой (см. гл. 12) не представляется в принципе возможным гарантировать узкую специфичность антител, поскольку она вряд ли запрограммирована на генетическом уровне.

Организация структуры антидетерминанты

Детерминанта включает в себя не только гипервариабельные участки цепей, но и опорные структура, стабилизирующие ее конфигурацию. Эти опорные структуры образуются инвариантными участка- М'И аминокислотной последовательности V-районов. Степень участия каждого из них в стабилизации антидетерминанты не известна. Не вызывает сомнения, что большой вклад в формирование антидетерминанты вносят короткодействующие неполярные связи. Значительная роль принадлежит ароматическим остаткам и в первую очередь остаткам триптофана. Так, показано, что избирательное окисление остатков триптофана N-бромсук- цинимидом в мочевине приводит к разрушению антидетерминанты вне зависимости от специфичности антител.

Выше упоминалось, что находящийся в активном центре лиганд оказывает стабилизирующее влияние на структуру центра. Изящное подтверждение этому было получено, в частности, А. Гроссбергом с соавторами (A. Grossberg et al., 1965), изучавшими чувствительность к протеолизу химотрипсином очищенных антител против р-азофениларсоната и р-азофенилтриметиламмония до и после добавления гаптена. Антитела метили радиоактивным иодом и об интенсивности протеолиза судили по появлению низкомолекулярных меченых пептидов. При этом свободное антитело метили одним радиоизотопом иода (1311), а связанное с гаптеном — другим (1251). После 5 ч переваривания 10% радиоактивности находилось в составе ннзкомолекулярннх пептидов, содержащихся в гидролизате свободных антител, и 7% — в гидролизате при проведении реакции в присутствии гаптена.

Увеличение резистентности антитела к протеолизу в присутствии гаптена продемонстрировано также на других моделях с использованием как химотрипсина, так и субтилизина. Показано, что гаптен влияет на чувствительность к протеолизу именно Fab-фрагмента, более точно участки расщепления не были локализованы. 1 Io- лученные результаты интерпретируют как доказательство изменения конформации активного центра под влиянием гаптена и стабилизации конформации участка молекулы антитела, содержащего антидетерминаиту.

Кинетика и термодинамика реакции гаптен-антитело

Получение экспериментальных данных, необходимых для вычисления основных параметров реакции антитела со специфическим лигандом, возможно с достаточной точностью лишь в том случае, когда лиганд одновалентен и как всякий одновалентный гаптен не ведет к образованию больших по размеру и сложных по составу агрегатов. В случае образования комплексов, состоящих из нескольких молекул антигена и антитела, снстема настолько усложняется, что реакция не может быть описана простыми уравнениями.

Источником антител для оценки кинетических параметров реакцИ'И служили до последнего времени очищенные антитела против простых гаптенов и моноклональные миеломные иммуноглобулины с гаптенсвязывающей активностью. Первые из них неоднородны в том числе и по степени сродства (скорость реакции) с лигандом. Поэтому в подобных случаях получают лишь усредненные значения тех или иных параметров.

В ходе реакции гаптен-антитело (когда гаптен имеет небольшую молекулярную массу и одновалентен) не происходит никаких взаимных превращений гаптена и антитела. Поэтому о их взаимодействии судят с помощью различных физических и физико-химических методов. Эти методы основаны на оценке количества связанного гаптена по изменению диффузионного равновесия последнего в присутствии антитела (метод равновесного диализа ) или по изменению оптических свойств гаптена после его связывания антителом.

Из-за очень большой скорости прямой реакции н значительных технических трудностей одновременной оценки скоростей прямой и обратной реакций (уравнение 1) на практике измеряют не величины 々i и 々2 ——константы скоростей прямой и обратной реакций, а константу равновесия, или константу сродства Ка, т. е. отношение констант скоростей прямой и обратной реакций:

Кд= ^1/^2- (3)

Наиболее эффективный способ оценки скорости реакции, потребовавший использования уникального оборудования, был предложен и апробирован в Институте им.

Макса Планка (ФРГ). Этот метод основан на оценке скорости изменения равновесия в системе гаптен-антитело npin дискретном увеличении температуры за крайне короткие промежутки времени. Сконструированная аппаратура на основе гигантского конденсатора (10 000 эрстед) при его разряде за 0,1 мкс позволяла повысить температуру смеси гаптен-антитело на 10℃. За это время успевало установиться равновесие, что свидетельствует об очень высокой скорости реакции, реальное измерение которой сложно с технической точки зрения.

Одна из наиболее изученных в кинетическом отношении систем ——это система с антителами против динитро- фенильной группы. Многочисленные измерения с использованием очищенных антител или миеломного мышиного •иммуно гл обул ина 315 с динитрофенильной активностью дали величину прямой реакции порядка 107——108 М-1 с-1, а обратной — от 1 до 50 с-1. Рассчитанная на основе этих данных К“ оказалась порядка 105—106 М.-1.

Величина 历 отражает время нахождения гаптена в полости активного центра (обычно оценивают период по- лужнзнн гаптена в активном центре). Если принять величину 后 равной 1 с-1 (что соответствует реальным значениям), то период полужизни составит 0,69 с. Для прямой реакции при величине /?! = 2Х 109 AV1 с-1 время полужизни гаптена в активном центре составит около 30 с. Столь большие различия периодов полужизни гаптена в активном центре при прямой н обратной реакциях хо- ро.шо согласуются с фактами, указывающими на значительную трудность удаления гаптена из активного центра, например, с помощью диализа.

На основе сведений, полученных при оценке константы равновесия при нескольких значениях температуры, можно вычислить основные термодинамические параметры реакции гаптен-антитело.

Константа равновесия связана со стандартной свободной энергией уравнением AF° =——RTlnK, где R ——газовая постоянная, Т — абсолютная температура. На основании этого уравнения были найдены значения AF° для единичной связи гаптен-антитело в самых различных системах. Как показано ниже, величины z\F° для различающихся по своему строению гаптенов и соответствующих антител незначительно отличаются друг от друга (были использованы антитела кролика против ди- нитрофенпльной группы). Они не превышают —37,8 Дж/моль и весьма невелики по сравнению с величинами

ГаптенГаптен△F° при образовании, например, двух кислород-водородных связей в молекуле воды (—229,53 кДж/моль).

Гаптен

Гаптен

—А『кДж/моль-1

е-ДНФ-Ь-лизин 43,26

е-ДНФ-В-лизин 41,16

а-ДНФ-Ь-аланин 40,32

а-ДНФ-Ь-фенилаланин.・・・37,76

а-ДНФ-аминокапроноваякислота43,26

Динитрофенол 31,50

Изменения энтальпии (ДН°) можно рассчитать из уравнения Вант-Гоффа:

In K2/«i=(AH°/R)(1“i- 1/Т2),

где К】и ^2 ——константы равновесия при двух темпера-турах: Ti и Т2. Следовательно, для расчета ДН° необхо-димо измерить константу равновесия минимум при двухтемпературах. Из уравнения 2-го закона термодинамики:AF°=AH°—TAS°

можно вычислить изменение стандартной энтропии после определения значений AF° и ДН°. Поскольку антитела неоднородны и варьируют в определенных пределах по величине сродства к гаптену, все определяемые термодинамические параметры представляют собой усредненные величины. Исключение составляют миеломные моноклональные иммуноглобулины.

С учетом сказанного оценим основные термодинамические параметры реакции гаптен-антитело. При относительно небольших значениях AF° (см. выше) изменения энтальпии весьма велики. Например, для реакции анти- динитрофенильных антител с динитрофенильным гаптеном они составляют ——73,5 кДж/моль и мало объяснимы. Следует еще учесть, что величина АН°, рассчитанная на основании уравнения Вант-Гоффа, в два раза ниже (менее отрицательна), чем при оценке теплоты реакции методами прямой калориметрии, т. е. определением количества выделенного при реакции тепла. Вероятная причина этого — неоднородность антител, эффект которой может быть неодинаков при разных температурах. В самом деле, величины ДЫ°, полученные расчетным путем и на основании прямой калориметрии, практически совпадают в случае изучения реакции между гаптеном и моноклональным иммуноглобулином. Для иммуноглобулинов, продуцируемых мышиными плазмацитомами МОРС 315 и 460, связывающих ди- и тринитрофенильную

группы, значения ДН° составляют от —84 до —50,4 кДж/моль. Отрицательное значение АН° означает, что реакция протекает с выделением тепла.

Поскольку при взаимодействии антитела с гаптеном подвижность реагирующих соединений (обусловленная броуновским движением в растворе) уменьшается, а вместе с этим уменьшается степень неупорядоченности системы, следует ожидать изменения конфигурационной энтропии. При этом величины AS° должны были бы принимать отрицательные значения. Однако в силу того, что некоторые гаптены имеют заряд, величина которого уменьшается при взаимодействии с антителом, в ходе реакции высвобождается часть связанной гаптеном и антителом воды. Кроме того, при реакции гаптен-антитело изменяется общая конфигурация молекулы антитела, обусловленная изменением подвижности Fab-участков относительно Fc-участка (см. гл. 3). Этот факт также способен повлиять на степень гидратации молекулы антитела вне зависимости от заряда гаптена. Обусловленное высвобождением воды положительное изменение энтропии способно в отдельных случаях полностью компенсировать уменьшение энтропии системы за счет самой реакции гаптен-антитело. В свете сказанного сравнительные оценки величин AS° для реакции различных по специфичности антител со своими гаптенами вряд ли правомерны.

Вопросы, касающиеся реакции антител с поливалентными антигенами, будут рассмотрены в гл. 12.

Биосинтез иммуноглобулинов

Организация структурных генов

Анализ строения полипепгидных цепей иммуноглобулинов со всей очевидностью свидетельствует в пользу множественности генов, кодирующих структуру этих белков, и существовании сложной системы их

организации. Разработка методов изучения структуры генов высших организмов, анализ их строения и перегруппировки в онтогенезе осуществляются в настоящее время в значительной мере на основе знаний, полученных при изучении структурных генов иммуноглобулинов.

Начальный этап изучения генетики иммуноглобулинов был связан с разработкой общей теории, которая наиболее рационально объясняла бы на генетическом уровне высокую степень вариабельности аминоконцевых районов легких и тяжелых цепей. В 1965 г. В. Дрейер и Дж. Беннет (W. Dreyer, J. Bennet) сформулировали гипотезу, согласно которой вариабельные и константные районы легких и тяжелых цепей кодируются раздельно и что существует большое число генов для вариабельных районов (V-генов), но только одна копия гена для константного района легкой цепи каждого типа и константного района тяжелой цепи каждого класса (подкласса). Очевидным следствием из этого предположения был вывод, согласно которому определенный ген для константного района способен за счет реарранжировок генетического материала объединяться с одним из многих генов для вариабельного района. Один из первых гипотетических механизмов реарранжировки V-C-генов был предложен Дж. Эдельманом (G. Edelman) в 1969 г.

Значительный прогресс в изучении генетических основ биосинтеза иммуноглобулинов достигнут в результате решения трех основных методических проблем:

получение и поддержание в культуре большого числа клонов трансформированных (опухолевых) плазматических клеток, продуцирующих однородные иммуноглобулины;

разработка методов получения моноклональных антител на основе гибридомной техники;

отработка техники молекулярного клонирования ДНК из иммуноглобулинпродуцирующих клеток в бактериальных векторах и последующий анализ ее структуры с использованием бактериальных рестриктаз, разделения сегментов в гель-электрофорезе, гибридизации рестриктированных сегментов с высокоочищенными мРНК для пептидных цепей иммуноглобулинов и, нако- нец, секвенировании сегментов ДНК с определением нуклеотидной последовательности сегментов, содержащих структурные гены для иммуноглобулинов.

Нетрудно заметить, что первые два методических принципа привнесены из клеточной биологии, а третий

лежит в основе всех современных исследований по молекулярной генетике.

Наши современные сведения об организации иммуноглобулиновых генов основаны по существу только на данных, полученных в опытах на клетках мышей. Однако есть достаточно оснований считать, что полученные в этих опытах результаты отражают закономерности, характерные и для других млекопитающих, включая человека, а возможно, и для всех позвоночных.

VA2 J/ J2 "4 С"VA2 J/ J2 "4 С"17 133 kb17 133 kb3'3'V# J/ С； 3 цз С"

VA2 J/ J2 "4 С"

VA2 J/ J2 "4 С"

17 133 kb

17 133 kb

3'

3'

Л—L—цельЛ—L—цель5、ENBty鹵Зв ・з

Л—L—цель

Л—L—цель

?126195 L3

'к】 W" Jn ck

K-L-цепь 5^ DvOwOv^vf (If |<в-У

?2*5 kb

Рис. 27. Структурные гены для х> и /i-цепей иммуноглобулинов че-ловека:

С入 1—С入4 ——неаллельные варианты генов для константных районов Х-цепей, размеры интронов указаны в килобазах (kb)

При обобщении nojiyqeHHoii к настоящему времени информации об организации структурных генов для иммуноглобулинов складывается следующая картина.

Гены для х-цепи мышиного иммуноглобулина находятся в шестой хромосоме. Около 400 генов (сегментов ДНК) формируют пул Vx-генов. Они объединены в 50 семейств, каждое из которых содержит не более восьми генов со сходной, но не идентичной нуклеотидной последовательностью. В той же хромосоме в направлении З'-кон- ца обособленно (на расстоянии 1,3—1,4 kb ) от Vx-генов находится группа из коротких /- (joining) сегментов, имеющих высокую степень гомологии. Далее в направлении З'-кониа на довольно значительном расстоянии (2,5——4,5 kb) расположен г&н, кодирующий константный участок х-цепи (以-ген).

Таким образом, гены, кодирующие соответствующие участки х-цепи: Vx-ген (1—95), J-сегмент (96—108) и Сх-ген (109——214)—разделены между собой нетрансли-

руемыми последовательностями. Последние называются интронами, а кодирующие сегменты генома——экзонами. Расположение структурных генов для легкой цепи в хромосоме изображено на рис. 27.

В ходе дифференцировки эмбриональных клеток в зрелые лимфоидные клетки происходит перегруппировка генетического материала, приводящая к объединению одного из Vx-генов с J-сегментом в той же хромосоме и сближению объединенного VJ-сегмента с С-геном. Однако и в дифференцированной лимфоидной клетке VJ- и С-гены разделены интроном (рис. 27). Экспериментальные доказательства в пользу интронирования структурных генов для легких цепей и их перегруппировки были получены в 1978——1979 гг. в разных лабораториях С. Тонегавой, П. Лидером и Л. Худом (S. Tonegawa; F. Leder; L. Hood).

Гены для A-цепи мышиного иммуноглобулина находятся в шестнадцатой хромосоме. Число наследуемых (germline) Vx-генов равно двум. Значительная разница в числе наследуемых Vx- и Vx-генов выглядит не так впечатляюще, если принять во внимание, что в пуле мышиных иммуноглобулинов число молекул с легкими цепями Z-типа составляет едва ли 5%. Число Сл-генов равно четырем, причем каждому из них соответствуют J-сегменты. Интрон между J-сегментом и 5'-концом С\-гена равен 1,3—1,4 kb. Из четырех Сх-генов, по-видимому, экспрессируются только три.

В эмбриональной клетке V-ген включает в себя один интрон, разделяющий нуклеотидные последовательности, кодирующие лидерный пептид (см. ниже) и собственно V-район. Величина этого интрона в Va-гене равна 93 нуклеотидам.

Гены для тяжелых цепей мышиных иммуноглобулинов локализуются в двенадцатой хромосоме (у человека——в четырнадцатой). Число наследуемых Ун-генов достигает 100—250. За ними в направлении 3,-конца располагаются первоначально Dh-(diversity), а затем Лн-сегменты. Наконец вслед за Лн-сегментами находятся гены для константных районов всех без исключения классов и подклассов иммуноглобулинов (рис. 28).

Гены для константных районов (мыши) располагаются в такой последовательности: 5'—С^—С6—Ст3— СТ1—Су2b—Cv2a—Ce—Ca—3'. Как и в хромосомах, кодирующих легкие цепи, в двенадцатой хромосоме Ун-гены, Dh- и Лн-сегменты, а также все семейство С-генов интро-

Рис. 28. Гены для тя?келых цепей иммуноглобулинов в клетках эмбрионаРис. 28. Гены для тя?келых цепей иммуноглобулинов в клетках эмбрионанировано. Для того чтобы представить себе масштаб расчлененности генов того локуса хромосомы, где он расположен, приводим размеры интронов, обратив внимание на то, что расстояние между двумя прилегающими константными генами становится короче в направлении Законна: 5'—JH—(6,5 kb)—C”—(4,5 kb)—C&—(5,5 kb)— CY3— (34 kb) —CV1 — (21 kb) —&,2b — (15 kb)—CT2a— (14,5 kb)—Ce—(12,5 kb)—Ca—3'.

Рис. 28. Гены для тя?келых цепей иммуноглобулинов в клетках эмбриона

Рис. 28. Гены для тя?келых цепей иммуноглобулинов в клетках эмбриона

、М \"2 '“I】D J“ C〃 (方

夕• 口？匸но]И ill №^^，騒

If)-14 °?0」92：5

Каждый ген для соответствующего константного района тяжелой цепи, в свою очередь, интронирован по числу доменов. Таким образом, в составе С^-гена насчитывается четыре изолированных сегмента. То же число сегментов находится в составе Сб-гена. В составе Ст и Са-генов содержится по три изолированных сегмента. Существует также изолированный сегмент ДНК, кодирующий структуру района талии (Ш). Вслед за сегментом для четвертого домена 卩-цепн расположены короткие нуклеотидные последовательности для С-концевых участков д-цепи, содержащихся в секретируемом клетками или мембранассоциированном (рецепторном) IgM (см. гл. 9). На рис. 28 представлена схематически структура генов для константных участков тяжелых цепей.

Для того чтобы оценить размер участка хромосомы, включающего все Ун-гены, йн-сегменты, число которых достигает 10, Лн-сегменты (четыре) и Сц-гены, следует учесть, в частности, что расстояние между 工вумя прилегающими Vn-генами может достигать 10—14 kb. В результате только район, занимаемый Ун-генами (с учетом всех интронов), составляет примерно 1500—3000 kb, а D-J-C-район — около 150 kb. Эти величины интересно сопоставить с размером транскрипционных единиц для у- и р (6) -цепей, составляющих соответственно приблизительно 6,5 и 14 kb. Из сравнения очевидно, сколь значительные реарранжировки генетического материала предшествуют процессу считывания структурных генов для тяжелых цепей иммуноглобулинов.

Открытие Dh-> Jl- и Лн-сегментов значительно продвинуло вперед вопрос о происхождении многообразия антител (под многообразием понимают число лигандов, распознаваемых антителами).

В случае легкой цепи х-типа J-сегменты кодируют 13 С-концевых остатков вариабельного района. Один или два остатка, кодируемые JL-сегментом, входят в состав третьего гипервариабельного района легкой цепи. В зависимости от того, с каким из J-сегментов произойдет интеграция определенного Vx-гена, будет зависеть структура одного из районов легкой цепи, участвующего в образовании активного центра. Отсюда следует, что если число V-генов для х-цепей равно 400, а число экспрессируемых JL-сегментов равно четырем (из пяти закодированных) ,то число возможных вариантов аминокислотной последовательности вариабельного района х-цепи, наследуемых эмбрионом мыши, достигает 1600.

В тяжелых цепях D-сегменты кодируют остатки с 100 по 107, J-сегменты — остатки 108—123 Ун-участка. Фактически это только средние величины, поскольку, как уже упоминалось в разделе 4.2, Он-сегменты имеют разную длину (10, 17 и 23 пары оснований), что обеспечивает кодирование 3, 5 и 7 аминокислот. Однако и это чисто теоретический расчет, поскольку реально соответствующие им участки вариабельного района тяжелой цепи в ряде случаев короче геномных, а в ряде — значительно длиннее. Сказанное выше показывает, сколь велико разнообразие аминокислотных последовательностей, возникающих в результате интеграции Ун-генов только с Он-сегментами. Но D-сегменты интегрируют и с J-сегментами. Их тоже четыре и участок, которым они состыковываются с D-сегментом, строго не зафиксирован (см. ниже). Вся область, кодируемая Dn-сегментом, а также J-сегментом, соответствует третьему гипервариабельному району тяжелой цепи, обеспечивая исключительно большую степень его разнообразия как по составу, так и но протяженности.

Процесс рекомбинации сегментов (экзонов) связан с взаимодействием З'-.концевого участка одного экзона с 5'-концевь1м участком следующего экзона. На З'-конне V-гена находятся два блока из 9 и 7 нуклеотидов с комплементарной последовательностью. Указанные блоки удалены друг от друга на строго определенные расстояния (11 или 22 пары нуклеотидов). Вся структура, например, для Вн-сегмента выглядит следующим образом:

N—S—H—D—H—S—N, где N-нонамер, S-спейсер (нз 11—12 или 22—23 нуклеотидов), Н-гептамер, D—15н-сег- мент.

Соединение Ун-гена с Dr и Jn-сегментами протекает в два этапа:

5，-Vh — H-S23 — N-3' + 5'-N-Si2-H-D-H —

—S[2 — N - 3,--> 5, - Vh ~■ D - H — S[2 - N - 3,+ 5, — N -

—S?3 — H — Jh — 3'―»5' — VhDJh — 3'

Можно предположить три причины вариаций последовательности в местах соединения Vh-, Dh- и Лн-сег- ментов.

Образование альтернативных триплетов (кодонов) в участках двух соседних собирающихся экзонов.

Добавление или делеция триплетов в участках объединения.

Участие различных Vh- и DH-сегментов в образовании единого сегмента с одним」н-геном.

Если внутрихромосомные перестройки, протекающие в процессе клеточной дифференцировки, обеспечивают слияние всех сегментов гена для вариабельного района легкой или тяжелой цепи, то по мало понятным пока причинам слияние полного гена для Ун-района с С-ге- ном не происходит. Наблюдается „лишь значительное уменьшение интронируемой последовательности. В результате образуется транскрипционная единица (transcription unit), которая в случае гена для легкой цепи включает VJ-сегмент, интронируемый сегмент ДНК и С-ген (рис. 29).

По тому же принципу протекает реарранжировка генетического материала, приводящая к появлению транскрипционной единицы для тяжелой цепи. В отличие от генов для легкой цепи в этом случае на стадии полного гена для вариабельного района происходит, как говорилось, двойная реарранжировка, приводящая к «состыковке» Ун-гена с Ё)ц- и Лн-сегментами, а затем уже сближение полного Ун-гена с одним из Сц-генов за счет делеции части интронирующего сегмента хромосомы. Эта последняя стадия протекает значительно сложнее, чем в случае генов для легких цепей, уже по той причине, что один и тот же Ун-ген способен в принципе сформировать транскрипционную единицу с любым представителем семейства Сц-генов, а число этих генов доста-

точно велико. Кроме того, хорошо известно, что экспрессия различных классов иммуноглобулинов как в период антигеннезависимо I дифференцировки лимфоидных клеток В-ряда, так и на стадии дифференцировки последних под действием антигена подчиняется строгим закономерностям. Напомним, что у млекопитающих в антенаталь-

лнк

I Грапскрипния

Рис. 29. Процесс сплайсинга первичного транскрипта генов для легкой цепи иммуноглобулинов (пре-мРНК)：

L — лидерный полинуклеотид, (Л) п — полиадениловый З'-конец (нетранслиру- емый); цифрами обозначены размеры копий интронов (пре-мРНК) и транслируемых копий сегментов ДНК (мРНК)

ный (внутриутробный) период предшественники В-лим- фоцитов способны синтезировать только IgM, который можно обнаружить лишь внутри клеток.

Появляющиеся во внутриутробный период В-лимфоциты способны первоначально синтезировать только мембранассоциированный (рецепторный) 8S IgM, а позднее, к моменту рождения, также мембранассоциированный IgD. При индукции иммунного ответа тимус- зависимым антигеном бласты и плазматические клетки первоначально синтезируют и секретируют только IgM, а позднее, в зависимости от природы антигена и частоты его введения, IgG-антитела или антитела других классов. Поскольку антитела разных классов и иммуноглобулиновые рецепторы могут нс отличаться по специфичности (т. е. иметь в составе транскрипционных единиц од-

ни и те же Vn-гены), механизм переключения с синтеза одного иммуноглобулина на другой должен включать в себя механизм реарранжировки С-генов.

По аналогии с рекомбинационными участками на концах Vh-, Dh- и Jn-сегментов было установлено существование у каждого С-гена «района переключения»: S-района (от англ, swith region). Каждый S-район состоит из тандема повторяющихся нуклеотидных последовательностей, расположенных в 5'-концевом участке соответствующего С-гена. Так, нуклеотидная последовательность Su-района может быть представлена как

(САССТ)я(ОСССТ)те,

где п варьирует от одного до семи (наиболее часто три), а т имеет значение порядка 150. Все другие S-районы (Sy, Se и т. д.) также содержат тандемы повторяющихся последовательностей, которые отличаются друг от друга, но имеют сходные с Su-районом короткие последовательности GAGGT и GGGGT.

Различия между S-районами необходимы, очевидно, для функционирования специфических ферментов, требующихся для узнавания соответствующего С-гена и рекомбинации запрограммированной для данной стадии дифференцировки S——S-районов. Такая S——S-рекомбинация приводит к выключению участка хромосомы между уже собранным геном для вариабельного района и С-геном, участвующим в образовании транскрипционной единицы на данной стадии дифференцировки. Существуют две точки зрения по этому вопросу. Одна состоит в том, что S—S-рекомбинация происходит между сестринскими хромосомами по типу кроссинговера. Согласно другому предположению в результате S—S-рекомбинации исключаемый сегмент ДНК формирует петлю, которая вырезается (рис. 30). Известны аргументы в пользу той и другой модели. То, что делеция, несомненно, имеет место, следует из данных табл. 6.

Изучали сегменты ДНК, содержащие Сн-генн из клеток плазмацитом мышей. Использовали обратные транскрипты очищенных мРНК, которые гибридизовали с фрагментами ДНК, содержащими Сн-гены. Оказалось (S. Cory, J. Adams, 1980), что в клетках, продуцирующих IgM, содержатся гены для константных районов других классов (подклассов) иммуноглобулинов. Напротив, в клетке, продуцирующей IgA, имеется только Са- ген. Если обратиться к схеме, иллюстрирующей порядок

гАн-ри(н1；1.!Ы1ая

К 1CIKJ

&〉С‘зС м 戶са<£

\X-D-J「 сосдпнение

田^中Н巾则“婀臓胡風^1胸隊緩=

\L / ，、、、 \///

Г) J((l J]】J.3 J[[4 Sg C g

Н、4УНОКО7ПС\С\МММ；1В-лимфоцит

о=七触側喇恤■

\'и\“ D J,, s〃

1ШшШПШ^Ш=

С〃S)С а

Переклю-чениеС〃・【мМоиовПереклю-чениеС〃・【мМоиовПлаиглтческая к.чегкаПлаиглтческая к.чегкафункциональная единица гранскрштии для а-цинейфункциональная единица гранскрштии для а-циней

Переклю-чение

С〃・【мМоиов

Переклю-чение

С〃・【мМоиов

Плаиглтческая к.чегка

Плаиглтческая к.чегка

функциональная единица гранскрштии для а-циней

функциональная единица гранскрштии для а-циней

Функциональная единица iраискрипции для д-исисй

Деления ссг мсига хромоиочн»! (12Okh)

Рис. 30. Перегруппировка генов для тяжелых цепей иммуноглобулинов, происходящая в онтогенезе. Схематически изображен гипотетический механизм формирования единицы транскрипции для a-цепей IgA

Таблица 6. Структурные гены для тяжелых цепей иммуноглобулинов в клетках мышиной плазмацитомы

Плазмацитома

Синтез 1g

Наличие структурных генов для：

卩

ТЗ

Т1

T2b

T2a

а

НРС 76

IgM

+

+

+

+

ЛЮРС 21

IgGl

——

—

+

+

-г

МРС 11

lgG2B

——

——

-—

+

+

МОРС 173

lgG2a

—

—

—

—

МОРС 315

IgA

—

—

—

—

—

расположения константных генов для тяжелых цепей (см. рис. 28), становится ясно, что для того, чтобы возникла транскрипционная единица для 卩-цепей, нет необходимости в делеции части Сц-генов, так как С—ген расположен ближе всего к З'-концевому участку VhDjjJh- гена. В то же время Са-ген наиболее удален от Ун-гена и возникновение транскрипционной единицы для а-цепей потребует делеции участка хромосомы от С^ до Се-генов.

Остается неясным, каков механизм рекомбинации строго определенных S-районов на каждой стадии дифференцировки клеток В-ряда. Возможно, существуют особые ферменты — рекомбиназы (class switch recombinase), распознающие негомологичные последовательности соответствующих S-районов.

Особого внимания заслуживает вопрос о механизме одновременной экспрессии иммуноглобулинов двух классов или одновременной экспрессии мембранассоцииро- ванного и секретируемого иммуноглобулинов одного класса. Первое, как правило, имеет место в зрелых В-лимфоцитах, синтезирующих мембранассоц'иированные иммуноглобулины двух классов — М и D (см. гл. 9). Второе наблюдается на промежуточных стадиях дифференцировки В-лимфоцита в плазматическую клетку. В обоих случаях иммуноглобулины двух разных классов не различимы по антигенной специфичности ——способности распознавать одну и ту же антигенную детерминанту. Следовательно, при их синтезе экспрессируются один и тот же Ун-ген, D- и J-сегменты. Если бы формирование двух единиц транскрипции происходило с участием разных Сн-генов, в геноме потребовались бы две идентичные копии Ун-генов, D- и J-сегментов. Этого никто не наблюдал. В то же время ряд фактов свидетельствует о том, что мРНК, необходимые для одновременной

экспрессии двух иммуноглобулинов с идентичными вариабельными и разными константными районами, возникают в ходе «созревания» (процессинга) пре-мРНК в результате так называемого альтернативного сплайсинга (см. раздел 5.2).

Процессинг пре*мРНК

Наличие интронирующих сегментов в единицах транскрипции для легкой и тяжелой цепей указывает на то, что существует механизм, обеспечивающий вырезание из первичного транскрипта участков, являющихся копиями интронов. В первичном транскрипте легких цепей (РНК-овая копия единицы транскрипции) таких участков два или даже три. Один является копией интрона между Vl- и Сь-генами и эквивалентен 2,5—4 kb. Второй соответствует интрону между последовательностями, кодирующими лидерный пептид и Vl- район (эквивалентен примерно 130 парам оснований). Что касается третьего участка, то он, по-видимому, служит копией интрона, разделяющего последовательность, кодирующую лидерный пептид (см. рис. 29). Размер последнего участка равен 4—6 kb.

В ходе считывания единицы транскрипции, как и в ряде других известных случаев для пре-мРНК, эукариот, происходит модификация 5'-конца и присоединение «липкого» поли-А нуклеотида к 3'-концу. В результате появляется пре-мРНК, которая для легких цепей х-типа имеет константу седиментации 40S н состоит приблизительно из 10 000 нуклеотидов. За счет «вырезания» (сплайсинг) удаляются участки, соответствующие интро- нируемым сегментам. Этот процесс протекает, по крайней мере, в два этапа: вначале появляется промежуточный транскрипт с константой седиментации 24S (около 4800 оснований), а затем «зрелая» единица трансляции, состоящая из 1300 оснований и имеющая константу седиментации 13S. Только в этот момент мРНК покидает ядро и переходит в цитоплазму, принимая участие в формировании полирибосомального комплекса, необходимого для синтеза х-цепей. Интересно соотношение различных форм мРНК в ходе ее процессинга. В плазматической клетке содержится (в ядре) 540 молекул 40S пре- мРНК (время полужизни около 10 мин), 900 молекул 24S пре-мРНК (время полужизни порядка 18 мин) и

4200 молекул ядерной 13S мРНК (время полужизни 20 ч).

Появлению «зрелых» мРНК для тяжелых цепей также предшествует поэтапный сплайсинг. Число интрони- рующих последовательностей в единице транскрипции для любой из тяжелых цепей значительно больше, чем для легкой хотя бы за счет интронов между сегментами С-гена для отдельных доменов. Поэтому процессинг мРНК для тяжелых цепей протекает, по-видимому, с большим числом этапов. Особенности транскрипции генов для тяжелых цепей можно проследить на примере альтернативного сплайсинга, позволяющего, как упоминалось в разделе 5.1, обеспечить при наличии в клетке только одной копии Vn-гена синтез иммуноглобулинов одной специфичности, но разных классов.

В обсуждаемом случае после перегруппировки эмбриональной ДНК, приводящей в ходе дифференцировки лимфоидных клеток В-ряда к рекомбинации определенного Vh-гснэ с D- и J-сегментами и делеции части интрона между Ун-геном и С—геном, появляется единица транскрипции. Она включает (см. рис. 29) помимо Vn- гена все сегменты интронированных генов для константных участков 卩-и 6-цепей (С;1- и Сс-гены расположены последовательно).

Надо специально отметить, что в единицу транскрипции входят сегменты обоих константных генов, кодирующих С-концевые последовательности как секретируемых форм 1gM и IgD, так и мембранассоциированных форм этих белков (см. раздел 5.1, а также гл. 9). При считывании всей этой единицы транскрипции вначале образуется гигантская пре-мРНК. Сплайсинг ее различных копий может идти двумя путями. В одном случае сегмент, кодирующий Ун-район, соединяется с сегментом, кодирующим константный район IgM, встраивающегося в мембрану лимфоцита. В другом случае с тем же сегментом мРН1\ для Ун-ранона соединяется сегмент, кодирующий участок мРНК для мембранассоциированной формы IgM. Аналогично происходит сплайсинг для секретируемых иммуноглобулинов различных классов, но одинаковой специфичности. В ходе сплайсинга вырезаются копии многочисленных интронирующих последовательностей, а также последовательностей, соответствующих исключаемому константному гену.

«Зрелые» мРНК для секретируемого и мембранассо- циируемого IgM образованы соответственно 2400 и 2700

основаниями. Отличия упомянутых мРНК заключаются в З'-концевнх участках, кодирующих С-концы соответствующих ц-цепей. Так, у секретируемой формы С-конец р-цепи образован 20 аминокислотными остатками, расположенными сразу вслед за Сц4-доменом. Также расположен С-концсвой участок мсмбранассоциированного IgM, но структура его совершенно иная. Особенности структуры встроенного в мембрану IgM обсуждаются в гл. 9.

На поверхности клеток иммунологической памяти, относящихся к лимфоцитам В-ряда, способны экспрессироваться одновременно идентичные по специфичности рецепторы двух классов, но в различных сочетаниях —— igM, IgG, IgM, IgE и др. Закономерен вопрос, как возникает единица транскрипции, включающая общий Унген, Сц- и Са-гены, если два последних отделены друг от друга всеми остальными константными генами? Представляется, что возникновению такой единицы предшествуют две серии реарранжировок ДНК： рекомбинация Vh-> D- и J-сегментов и делеция части интрона между V- и Сц-генами, а после этого (или одновременно) S—S- рекомбинация между С6- и СЕ-генами с последующей де- лецией этого участка генома. Вероятно, два процесса разобщены во времени, так что второй протекает в процессе антигензависимой дифференцировки В-лимфоцитов в клетки иммунологической памяти.

Трансляция легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов

В зрелой плазматической клетке, синтезирующей иммуноглобулины определенного класса (изотипа), существует два вида полирибосом: одни ——с мРНК для легких цепей, а другие ——для тяжелых. Их скорость седиментации составляет 200S и 300S соответственно и позволяет разделить их с помощью градиентного центрифугирования. Полирибосомы для легких цепей состоят из 4——5, а для тяжелых цепей ——из 11——18 рибосом. Время трансляции составляет для легкой цепи 1 мин, а для тяжелой — 2 мин.

В мРНК для легкой цепи находятся два участка, которые не транслируются. Это участок из 150 нуклеотидов на 5'-конце, который предшествует сегменту, кодирующему VL-район, и участок из 200 нуклеотидов в З'-кслщсвой области между сегментом, кодирующим Cl-

район, и «липким» З'-конневым полнаденилатом (см. рис. 29). Появляющаяся после трансляции 'полнпептидная цепь отличается от легкой цепи, входящей в состав молекулы иммуноглобулина, большей молекулярной массой за счет дополнительной аминокислотной последовательности из 15—20 остатков в аминоконцевой части молекулы. Этот гидрофобный отрезок цепи необходим, по- видимому, для ассоциации полирибосомного комплекса, на котором синтезируется цепь, с мембраной эндоплазматического ретикулума, на наружной поверхности которого фиксирована полирибосома. Указанный отрезок предшественника легкой цепи отщепляется в результате его процессинга в просвете цистерн эндоплазматического ретикулума, куда поступает новообразованный предшественник. Помимо протеолитического отщепления N-концевого экстрапептида именно в цистернах окончательно формируется третичная структура легкой цепи и замыкаются внутрицепьевые дисульфидные связи.

Процесс трансляции тяжелых цепей и посттрансляционного процессинга их предшественника в целом подобен процессу, описанному для легких цепей.

Находящиеся в цистернах эндоплазматического ретикулума легкие и тяжелые цепи начинают взаимодействовать между собой сначала за счет нековалентных связей. Сборка четырехцепочной молекулы с формулой L2H2 протекает за 5—15 мин. Завершению сборки предшествует формирование ряда промежуточных продуктов, состав которых зависит как от класса синтезируемых иммуноглобулинов, так и от принадлежности белка к соответствующему биологическому виду. У мышей большая часть молекул IgG имеет промежуточную форму Н2, а молекул 1gM——HL. В первом случае достройка идет за счет присоединения легких цепей, во втором —— путем димеризации двух половин 7S субъединицы. По мере сборки молекулы замыкается каркас межцепьевых дисульфидных связей.

Как уже говорилось в гл. 3, иммуноглобулины принадлежат к числу гликопротеинов. Гликозилирование полипептидных цепей начинается уже на стадии трансляции, когда к растущей цепи присоединяются префор- мированные блоки будущей олигосахаридной цепи. При этом фосфорилированный олигосахарид (манноза-№аие- тилглюкозамин-долихолфосфат) функционирует как ко- су£страт. К у-непям растущая углеводная цепь присоединяется через остаток аспарагина в позиции 297.

Окончательное формирование углеводного компонента происходит уже в цистернах эндоплазматического ретикулума на стадии, предшествующей секреции иммуноглобулина клеткой. Он представляет собой разветвленный олигосахарид, содержащий до 12 моносахаров, включая N-ацетилглюкозамин и N-гликолилнейрамино- вую кислоту.

Секреция новообразованных иммуноглобулинов

После завершения синтеза изолированные полипептидные цепи остаются еще около 5 мин на месте синтеза, т. е. в месте прикрепления полисом к поверхности мембран эндоплазматического ретикулума. Вслед за этим цепи попадают в просвет цистерн, где происходит, как указывалось, сборка молекулы иммуноглобулина. По мере достройки углеводного компонента уже собранная молекула переходит из шероховатого эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи. Выход иммуноглобулинов из клетки имеет, очевидно, ряд особенностей, отличающих этот процесс от секреции, например, гормонов. Последние по мере их синтеза в соответствующих клетках обосабливаются в секреторных вакуолях, содержимое которых выбрасывается из клетки после слияния вакуоли с внутренней поверхностью цитоплазматической мембраны. Акт дегрануляции требует участия мнкротубулярного аппарата, блокада которого, например, цитохалазином В исключает секрецию белка. В случае секреции иммуноглобулинов плазматическими клетками цитохалазин не оказывает влияния на выброс белка клеткой. Создается впечатление, что иммуноглобулины просто выдавливаются из цистерн через поры в местах присоединения вакуолей аппарата Гольджи к цитоплазматической мембране и что сигналом для этого служит переполнение цистерн.

Коротко следует сказать о сборке полимерных форм иммуноглобулинов: IgM и IgA. Их сборка из 7S субъединиц осуществляется непосредственно перед секрецией при обязательном участии J-цепей, синтез которых также происходит в плазматических клетках, причем вне зависимости от того, какой класс иммуноглобулинов продуцируют эти клетки.

Эффекторные функции иммуноглобулинов

Иммуноглобулинам (антителам) присущи многие биологические функции. Некоторые из этих функций зависят прежде всего от принадлежности иммуноглобулина к определенному классу (подклассу) вне зависимости от его свойства взаимодействовать с антигеном в качестве антитела. Другие реализуются только после специфического взаимодействия с антигеном. Наконец, третьи удается выявить только у продуктов ограниченного протеолиза иммуноглобулинов (см. гл. 7).

Реализация иммуноглобулинами, продуктами их протеолиза или комплексами антиген-антитело биологических функций выражается в том н」н нном эффекте, феномене, реакции. Вот почему биологические функции иммуноглобулинов, складывающиеся часто из нескольких более простых реакций, целесообразно обозначать как эффекторные, подразумевая под ними наиболее простые реакции. Что касается взаимодействия антител с антигеном (гаптеном), то если исключить биологические последствия этого взаимодействия, эту функцию нмму- ноглоб)линов можно назвать афферентной.

Каждая эффекторная функция иммуноглобулинов зависит от особенностей строения определенного участка молекулы. Этот участок по аналогии с активным центром (антидетерминантой) называют эффекторным центром. В одних случаях этот центр подобно антидетерминанте связывает определенный лиганд и (или) сам служит лигандспецифичсской структурой, распознаваемой другим, неродственным иммуноглобулину белком. В других случаях под эффекторным центром подразумевают ту область молекулы, от которой зависит инициация каскада реакций, приводящих к сложному биологическому эффекту.

Изучение химических основ эффекторных функций иммуноглобулинов весьма значимая для теории и практики область молекулярной иммунологии.

Антигеннезависимые эффекторные функции

Преодоление плацентарного барьера. IgG человека (все его подклассы) обладает этим свойством. Иммуноглобулины других классов не проходят в норме через плаценту.

Преодоление плацентарного барьера — активный процесс, начальная стадия которого связана с фиксацией IgG на выстилающих плаценту клетках — трофобластах. На трофобластах не фиксируются Fab- или F(at/)2- фрагменты и даже Facb-фрагмент (см. рис. 15), представляющий собой, как говорилось, молекулу IgG, лишенную С-концевых Су3-доменов. В то же время димер (тандем) СуЗ-доменов в изолированном виде способен конкурировать с нерасщепленным IgG за фиксацию на трофобластах. Из этого следует, что эффекторный центр, обеспечивающий фиксацию IgG на трофобластах, находится в пределах СуЗ-доменов. Подобная структура отсутствует в иммуноглобулинах других классов.

Скорость прохождения плацентарного барьера у различных подклассов IgG неодинакова. Она минимальна у IgG4. Различия связаны со способностью фиксироваться на трофобластах. Однако они нивелируются, если сравнивают связывающие свойства Су3-тандемов, выделенных из IgG различных подклассов. Это позволяет предположить, что эффекторный центр, обеспечивающий фиксацию IgG человека на трофобластах, расположен в той части СуЗ-доменов, которая прилегает к Су2-доме- нам. Последние, в зависимости от особенностей своей структуры, равно как и конформации всей молекулы, могут в разной степени экранировать эффекторный центр на СуЗ-доменах. Справедливость этого вывода подтверждает тот факт, что расщепление дисульфидных связей между тяжелыми цепями в районе талии молекулы IgG резко снижает сродство этого белка к трофобластам. Как известно (см. гл. 3), различные подклассы IgG человека сильно отличаются по структуре района талии.

Реабсорбция в извитых канальцах почек. Все сывороточные белки в процессе фильтрации крови через почки (почечные клубочки) реабсорбируются затем из первичной мочи в извитых канальцах. Не представляют собой исключения и иммуноглобулины. Благодаря глубокому изучению субмолекулярной структуры иммуноглобули-

нов получены достоверные данные о структурных основах столь важной биологической функции этих белков, как способность продолжительное время находиться в. кровеносном русле.

Г. Шпигельбергер и В. Вейгл (G. Spigelberger” W. Weigle, 1966) сделали важное наблюдение: моновалентные и бивалентные Fab-фрагменты гомологичного IgG, введенные в кровоток, очень быстро исчезают из него. Так, показано, что изолированные Fab- и F(ab)2‘- фрагменты практически полностью исчезали из кровотока за 4 ч (Н. Шмелева, 1972); при введении радиомече- ного фрагмента, радиоактивность оказывалась в моче- (напомним, что период полувыведення IgG составляет для мыши несколько суток, а для человека ——до трех недель).

Причина быстрого выведения Fab-фрагментов — неспособность к реабсорбции в извитых канальцах. В опытах на крысах блокировали канальцы некоторыми жирными кислотами и вводили в кровоток гомологичный Fab-фрагмент; последний при этом продолжительное время оставался в кровотоке. Аналогичный эффект оказывает перевязка обоих почечных артерий, т. е. полное прекращение почечной фильтрации.

Подобно Fab-фрагментам Facb-фрагменты, лишенные только С-концевых С、,3-工оменов, также не реабсорбируются в извитых канальцах. Тандем Су3-доменов, как и Fc-фрагменты, находится в кровотоке примерно столько же, сколько нерасщепленный IgG. Следовательно, эффекторный центр, ответственный за продолжительную циркуляцию IgG, бесспорно находится в Fc-участке молекулы, точнее — в СуЗ-домене, Очевидно, на клетках эпителия, выстилающего извитые канальцы почек, расположены рецепторы, распознающие определенные структуры СуЗ-домена.

Доказательства существования эффекторного центра, отвечающего за продолжительную цирк}\пяцию иммуноглобулинов, получены на модели IgG, но нет сомнения в том, что аналогичные центры есть в пределах Fc-участков молекул других иммуноглобулинов. По-в,идимомуг структура этих центров, равно как и структура распознающих их клеточных рецепторов, неодинакова. Это обеспечивает селективность контроля за уровнем иммуноглобулинов каждого класса в кровотоке. Конечно, обсуждаемый механизм гомеостатической регуляции уровня иммуноглобулинов один из нескольких (о других пой-

дет речь ниже). Но все эти механизмы, безусловно, селективны, а следовательно, связаны со специфическим распознаванием иммуноглобулина (его эффекторного центра) рецепторами клеток, контролирующими гомеостатическое равновесие этого показателя на уровне целого организма. Исследования в этой весьма важной в общебиологическом плане области только начинаются.

В заключение этого раздела следует особо отметить, что продолжительность времени циркуляции моновалентных фрагментов антител может резко возрастать, если фрагменты находятся в циркуляции в комплексе с антигеном (Spigelberger, Weigle, 1966). Это имеет прямое отношение к проблеме клиренса антигенов в иммунном организме, и мы вернемся 眼 ней ниже в этой главе.

Фиксация на тучных клетках и базофилах. Иммуноглобулины двух классов: Е и G обладают сродством к указанным клеткам. На этом основании, а также из-за способности фиксированных на клетках имм)^ноглобули- нов этих классов вызывать после контакта с антигеном высвобождение из тканей субстанций анафилаксии, подобные иммуноглобулины названы цитотропинами. Соответственно антитела названы цитотропными. Иммуноглобулины, фиксирующиеся на гомологичных (или аутологичных) клетках, получили название гомоцитотропи- нов.

Основным классом цитотропных антител, ответственных за возникновение и развитие ряда заболеваний человека (аллергических), являются IgE-антитела. Еще одно часто употребляемое название их ——реагины. IgE обнаружены у человека и многих животных (обезьяны, кролики, собаки, крысы, мыши). IgE присутствуют в сыворотке в следовых количествах (см. табл. 3). Их удается выявить с помощью высокочувствительных методов также на поверхности тучных клеток и базофилов.

Связывание IgE тучными клетками — основное условие возникновения каскада биологических реакций, обозначаемых термином ——реакции гиперчувствительности немедленного типа. Эти реакции возникают после взаимодействия поливалентного антигена (аллергена) с фиксированными на клетках IgE-антителами. В этом разделе мы рассмотрим лишь проблему связывания ци- готропинов клетками. Процесс высвобождения субстанций анафилаксии под влиянием комплекса антиген-цито- тропины мы обсудим ниже.

Важной особенностью IgE, отличающей их от цито-

гропинов IgG-класса, является высокая степень сродства к клеткам-мишеням. Они остаются связанными с поверхностью клетки на протяжении многих дней (возможно, недель). IgG в любом избытке не вытесняет IgE с поверхности тучных клеток. Последнее не удивительно, поскольку фиксация IgE происходит через специальный для этого иммуноглобулина рецептор. Этот рецептор получил наименование FcfR. Уже из названия следует, что IgE связывается своим Fc-участком и, следовательно, в его пределах находится структура, ответственная за цитотроппые функции этого иммуноглобулина. Ни изолированные е-цепи, ни Fab-фрагменты IgE с тучными клетками не связываются. Не связывается с ними pFc- фрагмент ——С-концевой осколок Fcg-фрагмента, образующийся при гидролизе IgE пепсином. В то же время сам Рсе-фрагмент прочно фиксируется на клеточной поверхности, конкурируя за FcER тучных клеток с нерасщеп- ленным IgE. Это означает, что центр, ответственный за связывание IgE клетками, находится не в концевых доменах е-цепи (напомним, что в константной части е-цепи имеется четыре домена). Как показал Р. Хамбургер (R. Hamburger, 1975), за связывание IgE тучными клетками отвечает СЕ3-домен, а в его пределах участок последовательности с 320 по 324 остатки. Изолированый пептид Asp — Ser — Asp ■— Pro — Arg способен конкурентно блокировать связывание IgE тучными клетками.

Выяснение строения участка молекулы IgE, определяющего его цитотропные свойства, вселило надежду на возможность успешной борьбы с аллергическими заболеваниями, которые обусловлены IgE-реагинами. Представлялось, что с помощью пептида окажется возможным вытеснять реагины с поверхности тучных клеток. Однако, хотя не существует технических трудностей для синтеза подобного пептида, его испытание в клинике не проводили. Вероятно, дело в том, что сродство IgE к рецепторам на тучных клетках столь велико, что вытеснение их пептидом практически недостижимо, особенно в организме.

Структура, определяющая цитотропные свойства IgE, весьма чувствительна к термической денатурации. Уже после прогревания при 56°С цитотропины класса Е инак- вируются, в то время как IgG-цитотропины сохраняют способность связываться с клетками-мишенями. Следует иметь в виду этот простой тест для дифференцирования гомоцитотропинов различных классов.

Г омоцитотропины обоих классов после внутрикожного введения гомологичным или близкородственным реципиентам фиксируются на клетках и после взаимодействия с антигеном (который вводят, как правило, внутривенно) обеспечивают возникновение реакции пассивной кожной анафилаксии (см. раздел 6.2). Однако латентный период, необходимый для оптимальной сенсибилизации клеток-мишеней, неодинаков в случае IgE- и IgG-ro- моцитотропинов. Если для IgG этот срок равен 1—4 ч, то для IgE — 48—72 ч. В чем причина этих различий? Скорее всего не в скорости реакции гомоцитотропинов с клеточными рецепторами. По-видимому, для проявления у IgE-цитогрошшов свойства обеспечивать при реакции с антигеном высвобождение из клетки субстанций анафилаксии необходима конформационная перестройка молекулы. В результате проявляется так называемый «.активирующий ткани центр». Эта конформационная перестройка, очевидно, протекает достаточно медленно.

Не только структура, но и биосинтез IgE-антител существенно отличается от биосинтеза IgG-антител. Прежде всего необходимо подчеркнуть, что тимуснезависимые антигены не способны вызвать продукцию антител IgE- класса и, следовательно, вызвать аллергические реакции. Существуют факты, указывающие на существование особой субпопуляции Т-хелперов и Т-супрессоров, регулирующих синтез именно IgE-антител. Антиген, стимулирующий синтез IgE-антител, должен иметь некоторые особенности структурной организации именно тех участков, которые распознают Т-хелперы. Так, если ввести реципиентам одного и того же вида конъюгаты ди- -нитрофенильной группы с бычьим сывороточным альбумином или белками круглых глистов (As car is suis, на- .■пример), то в первом случае произойдет синтез IgG-ан- тнтел, а во втором — IgE. II те и другие антитела направлены против динитрофенильной группы. В свою очередь, синтез IgE-антител подавляют клетки селезенки сингенных доноров, иммунизированных гомологичным антигеном (динитрофенилированными белками аскариды), но не клетки селезенки доноров, .иммунизированных динитрофенилированным альбумином (Т. Tada et al., 1971).

Независимая от антигена дифференцировка пре-В- лимфоцитов сопровождается появлением В-клеток — предшественников плазматических клеток, синтезирующих IgE. Процесс протекает по тем же законам, что и

процесс, связанный с появлением клеток-предшественников для синтеза антител других классов. Клетка-предшественник для IgE-антител несет рецепторы для антигена, имеющие свойства 1gM (|i4-лимфоцит). В дальнейшем эта клетка превращается в В-лимфоцит с рецепторами двух классов: IgM и IgE (р，+ е+лимфоцит). Такой лимфоцит уже в процессе антигензависимой дифференцировки превращается в плазматическую клетку, продуци-

Рис. 31. Механизм дифференцировки В-лимфоцитов, экспрессирующих рецепторный IgM (ц+ лимфоциты) в плазматические клетки, секретирующие IgE

рующую и секретирующую IgE (рис. 31). В-лимфоциты, несущие одновременно иммуноглобулиновые рецепторы |л- и е-типов, были найдены И. Кумагаи и др. (Y. Kumagai et al., 1982) в селезенке мышей, иммунизированных круглыми глистами Nippostrongylus brasiliensis. Существование единого предшественника, несущего рецепторы 卩-типа, для плазматических клеток, которые продуцируют иммуноглобулины всех классов, включая IgE, подтверждают также опыты по супрессии изотипа (см. гл. 10).

Г омоцитотропины со свойствами IgG имеют наибольшую электрофоретическую подвижность по сравнению с IgG других подклассов. К ним относятся IgGl морской свинки, IgGl мыши, IgGa крысы. Молекулярная масса этих белков, как и других IgG, 160 000 (IgE—185 000). Их содержание в сыворотке примерно в 1000 раз превышает содержание IgE (1—3 мг/мл против 2 мкг/мл). IgG-гомоцитотропины образуются при иммунизации самыми различными антигенами -и способны сенсибилизировать in vitro ткани животного того же вида (обычно фрагменты легких), лейкоциты, тучные клетки. В результате контакта сенсибилизированных этими антителами тканей с антигеном из клеток высвобождаются биогенные амины и другие субстанции анафилаксии. 5—1258 129

В опытах in vivo IgG-гомоцитотропные антитела вызывают реакцию пассивной кожной анафилаксии.

Характерной особенностью IgG-гомоцитотропинов является образование относительно легко диссоциируемого комплекса с рецепторами клеток-мишеней. Эти рецепторы распознают структуры, расположенные в Fc-участке молекулы, и, следовательно, относятся к Рсу-рецепто- рам. Прочность фиксации I gG-гомоцитотропинов на клетках существенно возрастает в присутствии антигена. Аналогичное явление наблюдается при связывании гетерологичных и гомологичных антител IgG-класса с Fcv- рецепторами лимфоцитов. Причины этого явления обсуждаются ниже.

Центр, ответственный за взаимодействие IgG-антител с тучными клетками, находится в Fc-участке молекулы; в его организации участвует не только Cv3-, но и С?2-до- мен. Так, после гидролиза IgG пепсином (что приводит к разрушению С”2-доменов) в составе продуктов гидролиза не удается обнаружить фрагментов, способных конкурентно ингибировать связывание нерасщепленных IgGl-гомоцитотропинов клетками. На основании всех имеющихся данных можно заключить, что центр формируется при участии Cv2- и СуЗ-доменов.

IgG кролика, собаки и человека способны фиксироваться в коже и тканях морской свинки. После взаимодействия с антигеном или анти- IgG-антителами фиксированные на тучных клетках морской свинки чужеродные для этого животного IgG вызывают высвобождение субстанций анафилаксии. Такие гетероцитотропные антитела в отличие от IgG-гомоцитотропинов имеют меньшую электрофоретическую подвижность, способны активировать систему комплемента по классическому пути (см. гл. 8). Их содержание в сыворотке достаточно велико: 3—5 мг/мл. Среди подклассов IgG человека способностью фиксироваться клетками морской свинки обладают все подклассы, за исключением второго.

При изучении IgG кролика была продемонстрирована зависимость цитотропных свойств от общей конформации молекулы. Как показали И. Тарханова с соавторами (1975), расщепление в молекуле IgG кролика только одной дисульфидной связи в районе талии модифицирует белок таким способом, что он менее эффективно фиксируется в коже морской свинки in vivo (рис. 32) и полностью теряет способность связываться изолированными тучными клетками. Это происходит несмотря

на то, что центр для связывания IgG тканями морской свинки находится не в районе талии молекулы IgG, а в пределах Fc-участка. Действительно, полученный с помощью папаина Fc-фрагмент молекулы IgG эффективно конкурирует с нерасщепленным IgG за рецепторы на клетках-мишенях. Следовательно, инактивация гетеро- цитотропного IgG после разрыва дисульфидной связи в

SagOH侣sn n旨工 ，gnExn § 3 hDqnBDHD & .83意營0 n营DadgqE20Hg自уSagOH侣sn n旨工 ，gnExn § 3 hDqnBDHD & .83意營0 n营DadgqE20Hg自у

SagOH侣sn n旨工 ，gnExn § 3 hDqnBDHD & .83意營0 n营DadgqE20Hg自у

SagOH侣sn n旨工 ，gnExn § 3 hDqnBDHD & .83意營0 n营DadgqE20Hg自у

246

Число SH- групп} высёободившикся при бос-становлении

Рис. 32. Влияние восстановления дисуль-фидной связи между тяжелыми цепямиIgG кролика (IgG-антитела против яич-ного альбумина) на способность этогобелка вызывать реакцию пассивной кож-ной анафилаксии у морских свинок

районе талии (эта связь в молекуле IgG кролика единственная) —результат изменения общей конформации молекулы. Такие изменения, как об этом свидетельствуют данные о строении IgG, могут быть обусловлены увеличением свободы движений Су2-доменов относительно друг друга и С73-доменов (см. рис. 20). Как будет продемонстрировано ниже, расщепление дисульфидной связи в районе талии оказывает большое влияние на реализацию многих эффекторных функций IgG.

Фиксация на макрофагах (моноцитах) и лимфоцитах.

Указанная функция присуща прежде всего IgG и IgE. IgM способен фиксироваться только на одной из субпопуляций Т-лимфоцитов.

На макрофагах (моноцитах) обнаружено несколько видов рецепторов для IgE и IgC, причем последние специализированы в отношении связывания белка в мономерной и агрегированной формах. В свою очередь, рецепторы для нативного IgG подразделяются по специфичности на рецепторы для разных подклассов IgG. В агрегированной форме (например, в виде комплекса антиген-антитело) IgG с равной эффективностью связывается как гомологичными, так и гетерологичными макрофагами. Связывание нативного IgG видоспецифично.

Важные данные получены при определении константы связывания мономерной формы IgG гомологичными макрофагами (R. Leslie, М. Alexander, 1982). Проанализировано взаимодействие в гомологичных системах IgG человека, кролика, морской свинки, мыши. Как видно из табл. 7, константа связывания /Са в различных системах колеблется на два порядка (от 6Х Ю5 -М_, до 1,ЗХ X Ю8 М-1). Число связывающих центров, т. е. Fcy-peuen- торов, на поверхности макрофагов варьирует от 2Х Ю4 до 4,5X Ю6. При этом величина Ка тем больше, чем меньше число связывающих центров. Реакция IgG с макрофагами —это экзотермическая реакция, в силу чего с повышением температуры (от 20 до 37℃) величина Ка снижается приблизительно на 30%. Тем не менее при величине Ка порядка 105—107 Мт (при 37℃), свыше 95% Fcy-рецепторов макрофагов для IgG заняты фиксированным на них IgG в мономерной форме.

Таблица 7. Константа связывания и число рецепторов для IgG на перитонеальных макрофагах

Вид

Подкласс IgG

Температура инкубации, °C

(X10-5M-1)

Число рецеп* торов иа клетку (Х10-5)

Морская свинка

IgGl

20

6,1±1,5

13,3 土 1,8

IgG2

20

14,6 土 4,5

25,0 土 4,0

Кролик

IgG

20

5,9 土 1,6

46±21

Мышь

IgG2a

4

1300

4,4

IgG2B

4

90

2,9

Остается открытым вопрос, необходимо ли in vivo вытеснение мономерного IgG с поверхности макрофагов ■для связывания этими клетками иммунных комплексов? Проблема существенна, так как без ее решения невоз-

можно объяснить с современных позиций важнейший механизм иммунитета — освобождение организма от комплексов антител с самыми разнообразными антигенами, включая патогенные бактерии, вирусы, простейшие.

Среди подклассов IgG человека с моноцитами из крови человека связываются в мономерной форме только IgGl и IgG3 (с нейтрофилами связываются все четыре подкласса IgG человека). На макрофагах мыши существуют специальные рецепторы для двух подклассов IgG: IgG2a и IgG2b. Центр для связывания IgG человека моноцитами находится в СуЗ-домене. После расщепления из этого домена выделили пептид из 10 аминокислот, который конкурирует с IgGl и IgG3 за связывание на моноцитах.

В IgG2a мыши центр для связывания макрофагами •находится между Сн2- и СнЗ-доменами, а в IgG2b — в Сн2-домене.

В-лимфоциты способны образовывать легко диссоциирующие комплексы с IgG в форме мономера, однако они прочно связывают IgG только в комплексе с антигеном (J. Miller et al., 1972). В'идовая принадлежность антител при этом не имеет значения. Помимо В-лимфоци- тов Fcy-рецептор обнаружен на некоторых Т-лимфоцитах. У 'человека Т-лимфоцитам с Рст-рецепторами (FcyR) приписывают свойства Т-супрессоров, а Т-лимфоцитам с рецепторами для IgM(FcnR)——свойства Т-хелперов.

На некоторых субпопуляциях В- и Т-лимфоцитов найдены рецепторы для IgE. Число В-лимфоцитов, связывающих IgE, возрастает у людей, страдающих аллергическими заболеваниями, а также у инфицированных патогенными глистами животных, имеющих повышенный уровень IgE.

То обстоятельство, что IgG-антитела в комплексе с антигеном обладают значительно большим сродством к Fc-рецепторам В-лимфоцитов, чем IgG в мономерной форме, вряд ли можно приписать кооперативности взаимодействия нескольких Fc-участков с соответствующим числом Рс5)ецепторов. Так, комплексы антигена (яичный альбумин) с кроличьими IgG-антителами практически утрачивают сродство к Fc-рецепторам лимфоцитов после расщепления единственной дисульфидной связи в районе талии (И. Тарханова и др., 1973). Модифицированные таким способом антитела полностью сохраняют антигенсвязывающие свойства. Поэтому представляется,

что усиление сродства IgG-антител к Fc-рецептору после образования ими комплекса с антигеном обусловлено конформационными изменениями в Fc-участке молекулы. После расщепления дисульфидной связи в районе талии антигензав'исимые изменения в Fc-участке молекулы не происходят. Справедливость этого предположения подтверждают данные сравнительного изучения комплексов бивалентного гаптена с нативными IgG-антителами и темя же антител а м(и с восстановленной дисульфидной связью в районе талии. По данным спектрофлу- ориметрии, образование иммунного комплекса нативными антителами приводит к конформационной перестройке в Fc-участке молекулы. Эти изменения не происходят, если в молекуле антитела расщеплена дисульфидная связь в районе талии (J. Schlessinger et al., 1975).

Обобщая существующие к настоящему времени данные о взаимодействии иммуноглобулинов с клетками, необходимо подчеркнуть следующие основные положения.

Взаимодейств1ие иммуноглобулинов с клетками обусловлено наличием на поверхности клеток специальных рецепторов, распознающих характерные для иммуноглобулинов данного видового происхождения, класса и подкласса структуры в F—участках их молекул.

В одной и той же молекуле иммуноглобулина может находиться два ,и более не перекрывающихся пространственно (или только частично перекрывающихся) центров для связывания с различными типами клеток.

Центр, ответственный за связывание иммуноглобулина клетками, образован (в нескольких изученных случаях) коротким отрезком пептидной цепи из 5——10 аминокислот. Выделенные из состава молекулы иммуноглобулина, эти пептиды способны функционировать автономно.

Несмотря на очевидную простоту структурной организации центров, отвечающих за связывание иммуноглобулинов клетками, они испытывают на себе влияния со стороны других участков молекулы. Связь с общей конформацией молекулы может выражаться либо экранированием, либо, наоборот, большим экспонированием центра на поверхности молекулы.

Связывание Clq субкомпонента первого компонента комплемента. Этой важной в биологическом отношении функцией обладают IgG и IgM. Прочное связывание

Clq служит необходимым условием активации системы комплемента по классическому пути (см. гл. 8).

Clq ——белок с молекулярной массой около 400 000, состоит из шести идентичных субъединиц (рис. 33), каждая из которых содержит структуру, обеспечивающую взаимодействие с IgG или IgM (см. гл. 8).

Рис. 33. Структура Clq субкомпонента первого 'компо нента системы комплемента

Будучи в растворе, IgG в мономерной форме образует легко диссоциирующий комплекс с Clq. При большом избытке IgG, сдвигающем равновесие реакции в сторону образования комплекса, наблюдали формирование 15S компонента, состоящего приблизительно из четырех молекул IgG, ассоциированных с одной молекулой Clq. Высокодиссоциируемый комплекс с эквимолярным соотношением реагентов в нем образуется в растворе между IgM и Clq.

Сродство IgG к Clq резко возрастает >при проведении реакции в гетерофазной системе, когда IgG фиксируют предварительно на инертном носителе (присоединяя, например, ковалентно к бромциансефарозе). Прочность связи между иммобилизованным IgG и Clq столь велика, что позволяет выделить Clq из плазмы количествен-

но. Для элюции Clq приходится применять растворы алифатических диаминов (этилендиамин, гексаметилендиамин) или водные растворы аммиака.

Предполагают, что для прочного связывания Clq необходима определенная конформационная перестройка IgG. Это предположение базируется на том, что IgG в форме комплекса с антигеном, а также IgG, агрегированный иными способами (прогреванием при 63°С, сшивкой бифункциональными реагентами), прочно связывает Clq. IgM прочно связывает Clq также после его агрегации. Но это условие не является обязательным. Как убедительно показали Х.-Ч. Чианг и М. Кошланд (Н.—Ch. Chiang, М. Koshland, 1979), даже комплекс IgM- антител с одновалентным гаптеном имеет высокое сродство к Clq. Хотя агрегации IgM не (происходит, наблюдаются вызванные гаптеном изменения конформации иммуноглобулина, в том числе Fc-участка молекулы/ Все эти данные позволяют предполагать лишь, что связывание Clq ——кооперативный процесс, и прочная фиксация достигается скорее всего в случае соединения Clq с иммуноглобулинами по нескольким точкам. Так как в молекуле IgG два центра для связывания Clq, но стерически доступен, по-видимому, только один, для связывания Clq по нескольким точкам необходимо сближение в пространстве нескольких эффекторных центров. Это достигается при агрегации IgG или его фиксации на нерастворимом носителе. В молекуле IgM пять доступных для Clq центров. Поэтому кооперативный эффект при взаимодействии может быть достигнут даже при формировании эквимолекулярного комплекса, но при условии, что все центры для связывания Clq в молекуле IgM будут располагаться в пространстве наиболее благоприятным образом для фиксации лиганда. Этому, очевидно, способствует гаптен, связывающийся с IgM-антителами.

Прочное связывание Clq иммуноглобулинами — необходимое условие для фиксации на молекуле Clq и последующей активации двух субкомпонентов первого компонента системы комплемента: С1г и Cis. Молекула Clq при прочной фиксации иммуноглобулинами классов G и М претерпевает конформационные изменения, которые служат необходимым предварительным условием для связывания С1г и Cis (см. гл. 8).

Изолированный Fc-фрагмент молекулы IgG в агрегированной форме фиксирует Clq. Этим свойством не обладает полученный с помощью пепсина Рс^фрагмент —

димер СуЗ-доменов. Уже это позволило заключить, что центр для связывания Clq расположен в пределах Сн2- доменов.

Следующим этапом в изучении центра для связывания Clq было выделение пептида из 60 аминокислот, входящего в состав Сн2-домена IgG мыши, который обладал способностью связывать Clq после адсорбции на латексе полистирола. Затем был синтезирован ряд олигопептидов, воспроизводивших отдельные участки Сн2-домена в районе, где расположен центр для Clq. Оказалось, что пептид состава: Lys — Ala — Asp — Trp — Туг — Vai — Asp—Gly не только связывает Clq, но и обеспечивает реализацию последующих этапов активации комплемента (R.'Boakle et al., 1979). По данным Т. Люкакс и соавторов (Т. Lukacs et al., 1979), центр для связывания Clq расположен в пределах декапептида между 282 и 292 остатками Сн2-домена IgGl человека. Рентгеноструктурный анализ указывает на то, что центр для Clq расположен, очевидно, на наружной поверхности Сн2-домена, не экранированной углеводным компонентом (см. рис. 20). Предполагаемый участок Сн2, где находится центр, достаточно гибок, что, вероятно необходимо для связывания Clq.

Подробно останавливаясь на проблеме взаимодействия IgG (молекулярная масса 150 000) с Clq (молекулярная масса около 400 000), мы стремимся обратить внимание читателей на два существенных в биологическом плане аспекта проблемы. Первый заключается в том, что при малой площади собственно участков контакта (для IgG, как было показано, этот участок ограничен отрезком цепи из 10 остатков) удержание рядом друг с другом таких крупных молекул только за счет слабых нековалентных взаимодействий при условии их интенсивного броуновского движения в растворе требует именно кооперативности взаимодействия. Последнее облегчается поливалентностью реагирующих молекул: собственно Clq с шестью центрами, IgM, имеющим до пяти функционирующих (активных) центров, в различной мере агрегированного IgG. *

Второй аспект проблемы связан с первым и состоит в том, что происходящий вслед за фиксацией Clq каскад реакций, протекающих при активации комплемента, требует предварительных конформационных изменений в молекуле Clq, причем в участке, удаленном примерно на 100—150 нм от участка молекулы, с которым

связывается антитело. Индуцируемый антителом конформационный переход в молекуле Clq допустим с энергетической точки зрения только при большом выигрыше в энергии на этапе формирования комплекса Clq-антитело. А это, в свою очередь, возможно прежде всего за- счет кооперативности процесса взаимодействия, предъявляющего большие требования к пространственному соответствию реагирующих молекул. Так, пространственная организация макромолекул (которую на языке классической биологии можно было бы назвать морфологией молекулы), предетерминированная генетически, обеспечивает течение крайне важных в биологическом отношении реакций без участия катализаторов.

Центр для связывания Clq, имеющийся в молекуле IgM, расположен в третьем константном домене. Увеличение сродства IgM-антитела к Clq после связывания антителом антигена (гаптена) можно объяснить происходящими при этом изменениями конформации молекулы антитела, наблюдаемыми даже при связывании одновалентного гаптена. Если обратиться к схеме, изображающей структуру IgM (см. рис. 16), становится очевидным, что, несмотря на существование нескольких центров для связывания Clq в молекуле IgM, они не способны одновременно взаимодействовать с несколькими центрами одной молекулы Clq. Причина этого лежит в большом диаметре молекулы IgM и (или ) пространственной недоступности Fcg-участков для Clq (см. рис. 33). Именно в этих условиях важна роль антигена, изменяющего конформацию молекулы IgM-антитела таким образом, что число пространственно доступных для Clq центров возрастает.

Связывание СЗ. Иммуноглобулины тех классов, которые не связывают Clq и, следовательно, не способны обеспечить активацию комплемента по классическому пути (см. гл. 9), способны активировать комплемент по альтернативному пути, благодаря их свойству связывать ключевой компонент альтернативного пути — СЗ, вернее модифицированный СЗ ——СЗЬ. Этими свойствами обладают агрегаты сывороточных IgA, IgE, а также агрегированный IgG человека. Центр для связывания СЗЬ расположен в С-концевой части Fab-участка, граничащего с районом талии. За это свидетельствуют данные о способности пепсиновых Fab'~ и F(ab') 2-фрагментов, но не папаинового Fab-фрагмента активировать систему комплемента без участия совершенно необходимых для

классического пути активации С4 и С2 (А. Кульберг и др., 1971; A. Sandberg et al., 1971). Получены также прямые доказательства связывания СЗЬ с помощью Fab。и F(аЬЭг-фрагментов.

Связывание белка A Staphylococcus aureus. Белок Д клеточной стенки Staphylococcus aureus (штам'м Cowan содержит его в наибольшем количестве) образован одной полипептидной цепью с молекулярной массой 42 000. У большинства штаммов стафилококка белок ковалентно связан с клеточной стенкой через пентаглициновый мостик пептидогликана. Он может быть отщеплен и получен без углеводного компонента путем переваривания лизостафином. Отдельные варианты S. aureus при купь- тивировании на жидкой среде высвобождают белок А в культуральную жидкость. Последняя служит источником для получения белка А в очищенном виде

В молекуле белка Л содержится четыре идентичных центра для связывания IgG различных биологических видов. Каждый центр входит в состав отдельного домена белка Л, причем домены характеризуются структурной автономией. Все подклассы IgG человека, за исключением IgG3, взаимодействуют с белком А. Некоторые моноклональные иммуноглобулины классов М и А также связывают белок Л, но это скорее исключение.

Центр для связывания белка образован при участии Сн2- 'и СнЗ-доменов IgG, что было независимо установлено D. Stanworth и И. Тархановой с А. Руденским в 1979—1980 гг. Этот вывод вытекает из того факта, что из фрагментов IgG: Fab, Fc, Fc', Facb только Fc-фрагмент связывает белок А Обсуждая локализацию центра для связывания белка Л, существенно упомянуть, что белок Л и Clq не конкурируют между собой за центры связывания (центр для связывания последнего находится на наружной поверхности Сн2-домена).

Определение точной локализации центра для белка Л достигнуто после получения в кристаллическом виде мо- номолекулярного комплекса Fc-фрагмента и одного из четырех доменов белка Л — FB. Центр действительно располагается в месте контакта Сн2- и СнЗ-доменов (J. Diesenhofer, 1982).

Связывание IgG белками клеточной стенки кокков представляет далеко не академический интерес. Во-пер-

вых, эта реакция оказалась очень удобной для выявления IgG (в том числе IgG антител) в таких условиях (в частности, в клеточных культурах), где для той же цели потребовались бы значительно более трудоемкие и дорогостоящие методы. Во-вторых, реакция между патогенными кокками и IgG происходит, очевидно, в инфицированном ими организме. Если формирование комплекса происходит в масштабах, достаточных для индукции иммунного ответа, могут появиться антитела против аутологичного IgG (антиантитела) за счет срыва иммунологической толерантности перекрестно-реагирующим антигеном (см. гл. 11). Появление антител против IgG, в том числе и гетерологичного, отмечается, в частности, при иммунизации стрептококком.

Антигензависимые эффекторные функции

Биологические реакции, возникающие в результате взаимодействия антител с антигеном как в биологических жидкостях, так и на поверхности клеток, лежат в основе многих явлений, которые наблюдаются при инфекционных и аллергических заболеваниях, осложнениях, возникающих при вакцинации, а также при аутоиммунном процессе. Их возникновение обусловлено реализацией антигенсвязывающих и эффекторных функций иммуноглобулинов. Рассмотрим основные эффекторные функции, характерные для комплекса антиген-антитело.

Активация системы комплемента. Каскад ферментативных реакций, инициация которого осуществляется комплексами антиген-антитело, служит одним из важнейших механизмов регуляции гомеостаза. Значение процесса активации комплемента тем более велико, поскольку он сопряжен с активацией фибринолитической системы и системы свертывания крови, высвобождением из клеток биогенных аминов и других биологически активных соединений. Механизм активации комплемента и роль этого процесса в иммунном гомеостазе рассматриваются в гл. 8.

Нейтрализация бактериальных токсинов. Многие микроорганизмы в процессе жизнедеятельности выделяют в среду белки, имеющие сильное токсическое действие на организм млекопитающих. Подобные вещества — экзотоксины —образуют, как правило, патогенные для чело-

века анаэробные -бактерии: Вас. tetanus, Вас. diphteria. Вас. botulinic, а также несколько видов бактерий, вызывающих у человека газовую гангрену (Вас. perfringens, Вас. oedematiens). Не обсуждая здесь вопрос о механизме действия токсинов, отметим, что каждый токсин имеет так называемую токсофорную группу, от блокирования которой зависит нейтрализация токсина. Блокировка достигается химическим путем, например обработкой формальдегидом, в результате чего образуется так называемый анатоксин. Последний не отличается по антигенному строению от токсина, но лишен токсических свойств. При иммунизации анатоксином образуются антитела —антитоксины, специфически нейтрализующие токсины в организме и животного, и человека.

В настоящее время достоверно установлено, что са- ыа токсофорная группа не содержит антигенной детерминанты 1.

Значит, нейтрализация токсина может произойти только в результате пространственного экранирования токсофорной группы антителами, присоединяющимися к участкам молекулы токсина, который находится вне тoк^ софорной группы. Уже на основании этого можно предположить, что блокирование токсофорной группы будет более эффективным, если в этом процессе участвует не только содержащий активный центр Fab-участок молекулы, но и Fc-ухасток.

Это предположение экспериментально проверили И. Тарханова с соавторами (1972), сравнивая на молекулярной основе нейтрализацию столбнячного токсина ъерасщепленным IgG-антитоксином кролика, а также его F(ab')2- и Fab'-фрагментамн. Не отличаясь по сродству к токсину, фрагменты были соответственно в 3 и 6 раз менее активны по сравнению с нерасщепленным антитоксином. Полученные результаты подтверждают важную роль всех участков молекулы антитоксина в реализации его токсиннейтрализующего действия, равно как и важное значение в этом процессе бивалентного харак-

Приводим убедительный эксперимент, подтверждающий это. Л. Бартова с соавторами (1972) иммунизировали кур высокоочи- тенными столбнячным токсином и анатоксином. Иммунизация токсином оказалась возможной, так как куры не чувствительны к столбняку. Сравнение антисывороток к токсину и анатоксину путем их перекрестной сорбции на иммуносорбентах показало полное совпадение сравниваемых антител по специфичности.

тера антител. Но полученные результаты трактуются неоднозначно, и вот почему.

Оценку нейтрализующего действия антител и их фрагментов проводят, вводя приготовленные в пробирке комплексы высокочувствительным к столбнячному токсину животным — белым мышам. Как уже говорилось в разделе 6.1, комплексы антигена с Fab-фрагментами антител циркулируют продолжительное время и не захватываются фагоцитами. Из материалов гл. 4 ясно, что даже при высоком сродстве антител к антигену (гаптену) комплекс в ограниченной степени диссоциирует. Следовательно, в случае комплекса токснн-ЕаЬ'-(|)рагмент антитоксина за период циркуляции комплекса все время высвобождается токсин, который быстро фиксируется высокочувствительными к нему клетками нервной системы. Со временем, там накопится достаточно токсина, чтобы вызвать заболевание у животного. Разумеется, комплекс токсина с нерасщепленным антитоксином также диссоциирует. Но время его циркуляции крайне невелико вследствие захвата фагоцитами. Здесь мы подходим к рассмотрению вопроса об определяющей роли фагоцитирующих клеток в обеспечении защитного действия антитоксических, антибактериальных и противовирусных антител. Молекулярные аспекты этой проблемы рассматриваются в следующем разделе.

Роль антител в усилении фагоцитоза. Вирусы, риккетсии, бактерии, простейшие способны фиксироваться на поверхности фагоцитов (макрофагов и сегментоядерных лейкоцитов), а затем поглощаться клетками. Связывание носит неспецифический характер, т. е. на поверхности фагоцитов нет специализированных рецепторов только для какого-нибудь определенного вида микроорганизмов. Один и тот же фагоцит способен в принципе связывать самые разнообразные микроорганизмы..

Число фагоцитированных микроорганизмов и скорость фагоцитоза значительно возрастают в том случае, когда микроорганизмы предварительно инкубируют с направленными против них IgG-антителами. Такие антитела получили название опсонинов, а обусловливаемый ими эффект — опсонизирующим. Только IgG-антитела, как гомологичные, так и гетерологичные, усиливают фагоцитоз и, следовательно, обладают опсонизирующими свойствами. Ни F(ab')2-, ни Fab'-фрагменты опсонинов фагоцитоз не усиливают. Это позволило предположить, что опсонины усиливают фагоцитоз за счет того, что

обеспечивают фиксацию корпускулярного антигена на поверхности фагоцитов, в том числе и через Fc-рецепто- ры (см. раздел 6.1).

В последнее время убедительно доказана роль Fcv- рецептора макрофагов в реализации действия IgG-onco- нинов (И. Сычева и др., 1983). Были получены антитела против Fcv-рецепторов макрофагов мыши. Эти антитела и их .Fab'-巾рагментн обладали свойством экранировать Fcv-рецепторы, препятствуя взаимодействию последних с IgG в агрегированной форме. Обработка перитонеальных макрофагов Fab'-山 рагментамн антител против Fcy-рецепторов 'полностью отменяла опсонизирующее действие IgG-антител против бактериальных клеток Salmonella typhimurium (табл. 8). Те же фрагменты совершенно не влияли на фагоцитоз не обработанных опсонинами бактерий. Следовательно, экранирование Fcv- рецептора ——основной фактор, препятствующий действию опсонинов. А это, в свою очередь, означает, что, именно благодаря наличию в молекуле IgG-антитела эффекторного центра для Fcv-рецептора реализуется важнейший механизм иммунологической защиты ——ускоренное очищение макроорганизма от инфекционных агентов.

Таблица 8. Влияние Fab'-巾рагментов из анти-Ес^К-антител на фагоцитоз Salmonella typhimHriHin перитонеальными макрофагами

Фагоцитируемый объект

Необработанные макрофаги

Макрофаги, обработанные фрагментами из ан- th-Fct R"

Клетки, содержащие бактерии, % М±гп

Фагоцитарный индекс 1

Клетки, содермсащие бактерии, % М±т

Фагоци* тарный индекс 1

S. typhimurium

S. typhimurium

сенсибилизированные IgG-антителами

38,0± 1,40 63,0 士 2,52

1,43

1,91

42,0 土 1,12

27,0 士 1,26

1,24 0,72

1 Фагоцитарный иидекс — число бактерий, поглощенных единичным макрофагом.•

2 В контрольных опытах макрофаги обрабатывали Fab'-фрагментами из яеродственных антител. Это не оказывало никакого влияния на фагоцитоз.

Нейтрализация вирусов антителами. Хотя фагоцитоз опсонизированных антителами вирусов служит, по-види- мому, важнейшим механизмом клиренса находящегося

вне клеток вируса и купирования тем самым вирусной инфекции, понимание этого процесса требует установления взаимосвязи между строением комплекса вирус-антитело и способностью вируса к заражению клеток. Дело 鼻 том, что комплексы вирусов с антителами, сохраняющие еще инфекционную активность (т. е. способность проникать в чувствительные клетки и размножаться в них),-были обнаружены в кровотоке при ряде вирусных инфекций, например, у мышей, зараженных лактатдегидрогеназным вирусом или вирусом лимфоцитарного хориоменингита при так называемой алеутской болезни норок. Имеются сведения о возможности циркулировать вируссо- держащих иммунных комплексов при гепатите В у человека. Персистенция комплексов вирус-антитело, обладающих инфекционной активностью, служит одним из существенных факторов, обусловливающих хроническое течение ряда вирусных заболеваний.

Следует особо подчеркнуть, что защитное действие противовирусных антител будет зависеть в конечном счете от двух их качеств: способности экранировать те участки вирусной частицы, которыми последняя фиксируется на чувствительных к данному вирусу клетках, и опсонизирующих свойств противовирусных антител. Поскольку нейтрализацию вируса антителами можно проверить m vitro, оценивая действие комплекса вирус-антитело на клеточные культуры, две отмеченные выше стороны действия антител можно разграничить L

Опыт показывает, что моновалентные Fab- или Fab'- фрагменты противовирусных антител значительно уступают нерасщепленным антителам в нейтрализации вируса в культуре клеток. Такие данные в опытах с полиовирусом получены, в частности, Ю. Первиковым с соавторами (1975, 1976). Добавление к комплексу вирус- Fab-фрагмент нерасщепленных противовирусных антител не обеспечивало полной нейтрализации вируса. Последнее связано, очевидно, с блокированием антигенных детерминант вируса Fab-фрагментами, которые сами по себе не обеспечивают эффективного экранирования вириона. Но почему? Из-за того ли только, что молекула фрагмента меньше по размеру молекулы антитела»

1 Другой традиционный способ оценки защитного действия противовирусных антител, связанный с введением комплекса вирус-антитело куриным эмбрионам, по сути аналогичен методу оценки защитного действия антител в культуре клеток.

или потому, что моновалентный фрагмент не способен «сшить» вирусные частицы, агрегировав их?

Последнее, несомненно, существенно, что было показано Н. Гутман и А. Кульбергом (1973). К вирусу гриппа А прибавляли специфические противовирусные антитела в количестве, недостаточном для полной нейтрализации вируса. Если затем к комплексу добавляли антитела против иммуноглобулинов, эффективность блокирования вируса возрастала в 8—16 раз. Можно было предположить, что обнаруженный эффект связан с более плотным «укутыванием» поверхности индивидуальных вирусных частиц. Однако это неверно по следующим причинам. Так, оказалось, что при одной и той же дозе вирусспецифических и антиглобулиновых антител усиливающее действие последних в реакции нейтрализации не изменялось при увеличении заражающей дозы вируса в 100 и даже 1000 раз. Если бы результат действия антиглобулиновых антител был связан с более эффективным экранированием каждой инди идуальной вирусной частицы при отсутствии между ними мостиков из антител, для нейтрализации большего числа вирусных частиц потребовалось бы больше как противовирусных, так и антииммуноглобулиновых антител. И, наконец, Fab-фрагменты антииммуноглобулиновых антител значительно менее эффективно усиливают нейтрализующее действие противовирусных антител по сравнению с нерасщепленными антителами. И это несмотря на то, что на каждую молекулу противовирусного антитела как поливалентного антигена присоединяется несколько (не менее 3—5) молекул Fab-фрагментов антииммуноглобулиновых антител.

Таким образом, не за счет «покрывания» антителами индивидуальных вирионов, а благодаря образованию достаточно жесткой «решетчатой» структуры посредством «сшивания» антителами вирусных частиц (по типу решетчатой структуры преципитата, см. гл. 12) обеспечивается эффективная нейтрализация вируса; разумеется, это происходит при наличии у антитела опсонизирующих свойств, т. е. принадлежности к иммуноглобулинам класса G и сохранения Fc-участка молекулы.

Участие антител в высвобождении биогенных аминов из тучных клеток. Процесс высвобождения биогенных аминов, как упоминалось в разделе 6.1, лежит в основе патофизиологических реакций, возникающих у человека при аллергии, а в эксперименте — при анафилаксии.

Высвобождению аминов (гистамин, серотонин, так называемая медленно реагирующая субстанция анафилаксии——SRS-A), предшествует взаимодействие фиксированных на поверхности тучных клеток цитотропных IgE- или IgG-антител с антигеном (аллергеном). Те же процессы возникают при реакции фиксированных на клетках цитотропных иммуноглобулинов указанных классов с антителами против IgE и IgG. Активация метаболических процессов в тучных клетках, предшествующая высвобождению вазоактивных аминов, происходит .лишь в том случае, когда антиген поливалентен, а анти- иммуноглобулиновые антитела — бивалентны. Так, фрагмент aHTH-IgE-антител не вызывает высвобождения аминов (дегрануляция) тучных клеток, сенсибилизированных IgE. Причины того, что «сшивание» нескольких молекул IgE или IgG цитотропных антител необходимо .для активации клетки, связаны как с влиянием этого процесса на цитоплазматическую мембрану, так и с конформационной перестройкой молекулы фиксированного антитела и появлением эффекторного центра. Этот центр обозначен Д. Стенвортом (D. Stanworth, 1971) как активирующий ткани центр. Центр возникает под влиянием антигена в молекуле IgE-антитела, отличаясь по структуре и локализации от центра, отвечающего за фиксацию IgE на клетке-мишени.

Высвобождение вазоактивных аминов из тучных клеток под действием комплекса цитотропных антител с антигеном протекает в диапазоне pH 7,5—7,9 при 37—38℃ и требует присутствия в среде Са2+. Необратимое подавление процесса происходит при 45℃. В активации клеток участвует сериновая протеиназа (процесс блокирует диизопропилфторфосфат). Дегрануляцию подавляют также ингибиторы гликолиза. Накопление в тучных клетках циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) препятствует процессу дегрануляции. Это наблюдается, например, в присутствии простагландинов. В свою очередь, метилксантин, подавляющий активность фосфодиэстеразы цАМФ, тормозя распад этого метаболита, блокирует одновременно высвобождение вазоактивных аминов из тучных клеток, несущих на своей поверхности комплекс цитотропнь1Х антител с антигеном.

Зависимая от антител клеточная цитотоксичность. Если инкубировать с лимфоцитами неиммунизированных животных какие-либо клетки, обработанные IgG-антителами против антигенов этих клеток, происходит гибель

сенсибилизированных антителами клеток-мишеней. Эффект наблюдается при 37° С в отсутствие комплемента. Антитела могут быть как гетерологичными, так и гомо- (изо) логичными. Однако во всех случаях это должны быть нерасщепленные антитела, а не их Fab- или F(abz)2-фрагменты. Участвующие в реакции лимфоциты несут на своей поверхности Fcy-рецепторы, но не имеют маркеров, характерных для В- и Т-лимфоцитов (см. гл. 1). Эта малочисленная субпопуляция (не превышающая нескольких процентов от общего числа лимфоцитов) получила название нулевых (т. е. не содержащих маркеров) или К-клеток (от англ. Killer).

В описываемом феномене антитела выполняют роль посредников между клеткой-мишенью и К-клеткой. Последняя не имеет рецепторов для клетки-мишени и распознает ее через Fc-участки антител, присоединенных к клетке-мишени.

Убедительно продемонстрированный в модели in vitro феномен, очевидно, имеет определенное значение и in vivo- для элиминации, например, клеток с персистирующими в них микроорганизмами или вирусами, если на поверхности зараженных клеток появятся новые антигены, синтез которых контролирует геном паразита. Можно допустить также участие антител и К-клеток в аутоиммунном процессе.

Связывание лимфоцитами иммунных комплексов in vivo. Содержащиеся в крови здорового человека лимфоциты фиксируют на своей поверхности иммуноглобулины (Н. Dikcler и др., 1975). Адсорбированные иммуноглобулины отличают от иммуноглобулинов, синтезируемых В-лимфоцитами и выполняющих функцию антигенсвязывающих рецепторов, с помощью простого теста_ После кратковременной инкубации (0,5—2 ч) лимфоцитов при 37° С иммуноглобулины, сорбированные клетками, исчезают с их поверхности, а иммуноглобулины, продуцируемые клеткой и выполняющие функцию рецепторов, сохраняются.

Иммунные комплексы, возникающие во всех случаях антигензависимой индукции биосинтеза антител, также способны фиксироваться на лимфоцитах. Появляясь в； циркуляции, комплексы могут попадать в селезенку. Этот процесс требует участия комплемента и лимфоцитов (N. Rooijen van, 1976) и протекает, очевидно, в две стадии. Первоначально комплексы антиген-антитело, находясь в циркуляции, связывают комплемент: Clq и СЗ.

Связывание СЗ повышает степень дисперсности комплекса (G. Miller, V. Nussenzweig, 1975). Высокодисперсные иммунные комплексы накапливаются в красной пульпе селезенки. Здесь происходит их фиксация на поверхности лимфоцитов, которые переносят комплексы в зародышевые центры. «Лимфоциты, переносящие иммунные комплексы в белую пульпу, принадлежат, очевидно, к В-лим- фоцитам, имеющим Fc-рецепторы и рецепторы для СЗ (N. Rooijen van, 1976).

Принципиальное значение имеет вопрос о функции лимфоцитов, содержащих на своей поверхности адсорбированные иммуноглобулины (антитела) или комплексы антиген-антитело. Как показано в гл.1, при иммунизации в селезенке быстро накапливается большое число клеток, способных связывать антиген, использованный для иммунизации. Их число в селезенке мыши, иммунизированной гетерологичными эритроцитами, достигает 2— 2,5% от общего числа ядерных клеток селезенки. Затем в течение 3——4 дней число этих клеток снижается в 10 раз. Такая кинетика антигенсвязывающих лимфоцитов дала основание предположить (А. Кульберг и др., 1974), что большая их часть принадлежит к клеткам, сорбировавшим на своей поверхности комплексы антиген-антитело. В составе сорбированных комплексов часть активных центров антител свободна и сорбированные комплексы за их счет связывают антиген. Проверка этого предположения была осуществлена Б. Юриным с соавторами (1976, 1977). Очищенные лимфоциты селезенки мышей культивировали ш vitro в течение 20 ч. Клетки получали на 5-й и 9-й дни после иммунизации эритроцитами барана. Пятый день соответствует максимальному содержанию в селезенке лимфоцитов, связывающих антиген, а 9-й ——времени резкого снижения их содержания. Через различные сроки после начала культивирования определяли число лимфоцитов, связывающих эритроциты барана (антиген) и общее содержание иммуноглобулинов на поверхности клеток, с помощью радиоиммунного анализа (см. гл. 12). Часть проб культивировали в присутствии циклогексимида — ингибитора биосинтеза белка.

Из рис. 34 следует, что за 20 ч культивирования лимфоцитов, полученных на 9-й день после иммунизации, содержание клеток, связывающих антиген, не изменялось. Не изменялось и содержание иммуноглобулинов на клеточной поверхности за 4 ч культивирования (срок на-

0 / 4 "勿 Время культивирования ^ ч0 / 4 "勿 Время культивирования ^ чРис. 34. Число лимфоцитов, связывающих антиген в культуре лимфоцитов из селезенки мыши на 5-й день (А) и 9-й день (5) после иммунизации эритроцитами бараРис. 34. Число лимфоцитов, связывающих антиген в культуре лимфоцитов из селезенки мыши на 5-й день (А) и 9-й день (5) после иммунизации эритроцитами барана:7, 3 ——культивирование без циклогек-симида, 2, 4 — в присутствии цикло-гексимидана:7, 3 ——культивирование без циклогек-симида, 2, 4 — в присутствии цикло-гексимидаТаким образом, все лим-Таким образом, все лим-

0 / 4 "勿 Время культивирования ^ ч

0 / 4 "勿 Время культивирования ^ ч

Рис. 34. Число лимфоцитов, связывающих антиген в культуре лимфоцитов из селезенки мыши на 5-й день (А) и 9-й день (5) после иммунизации эритроцитами бара

Рис. 34. Число лимфоцитов, связывающих антиген в культуре лимфоцитов из селезенки мыши на 5-й день (А) и 9-й день (5) после иммунизации эритроцитами бара

на:

7, 3 ——культивирование без циклогек-симида, 2, 4 — в присутствии цикло-гексимида

на:

7, 3 ——культивирование без циклогек-симида, 2, 4 — в присутствии цикло-гексимида

Таким образом, все лим-

Таким образом, все лим-

блюдения). При культивировании в присутствии циклогексимида число связывающих антиген лимфоцитов за 4 ч уменьшилось наполовину. Этот срок соответствует времени полуобмена иммуноглобулиновых рецепторов лимфоцитов, установленному Е. Витетта и Дж. У ром (Е. Vitetta, J. Uhr, 1972). Все это означает, что на 9-й день

после иммунизации в се-.

лезенке содержатся только такие лимфоциты, которые связывают антиген за.счет иммуноглобулиновых рецепторов, синтезируемых этими клетками.

Совершенно иная картина наблюдалась при культивировании лимфоцитов, полученных на 5-й день после иммунизации (рис. 34). Уже через 1 ч от момента начала культивирования число клеток, связывающих эритроциты барана (антиген), уменьшалось в два раза. За этот же срок почти вдвое уменьшалось содержание иммуноглобулинов на поверхности лимфоцитов. В то же время за последующие 16 ч дальнейшего уменьшения числа клеток, связывающих антиген, не происходило, за исключением проб, в которые был внесен ингибитор белко-

вого синтеза ——циклогексимид.

•фоциты на 5-й день после иммунизации можно разделить на две группы: необратимо теряющие свои антигенсвя- зывающие рецепторы (и одновременно часть поверхностных иммуноглобулинов) и способные поддерживать на постоянном уровне содержание антигенсвязывающих рецепторов. Вывод из этих опытов очевиден! в селезенке иммунизированного животного есть много лимфоцитов, связывающих антиген за счет сорбированных антител (комплексов антиген-антитело).

Позднее аналогичные данные были получены Т. Ка- киучи с сотрудниками (Т. Kakiuchi et al., 1981). Они обнаружили комплексы антиген-антитело на Fc-рецепторах лимфобластов из селезенки мышей на 7-й день после иммунизации эритроцитами лошади. Десорбция иммунных комплексов с поверхности клеток происходила, как и в описанных выше опытах, при краткосрочной (30 мин — 1 ч) инкубации клеток при 37° С в среде с низким содержанием сыворотки.

Таким образом, можно считать установленным факт сорбции in vivo на поверхности лимфоцитов комплексов антиген-антитело. В свете этого факта закономерно возникают два вопроса: насколько долго могут находиться на клеточной поверхности иммунные комплексы в организме и какова функция лимфоцитов, сорбировавших иммунные комплексы?

Большая скорость десорбции антител (иммунных комплексов) ,установленная в опытах ш vitro, возможно, связана с их расщеплением протеиназами, находящимися в лимфоидных клетках. Этому благоприятствуют условия культивирования клеток, а именно, низкая концентрация сыворотки в среде, поскольку при этом низка концентрация содержащихся в сыворотке ингибиторов протеиназ. Действительно, инкубация при 37° С клеток селезенки иммунизированных мышей в цельной изологичной плазме крови резко замедляет процесс десорбции с поверхности клеток антител (иммунных комплексов). Значит, в организме антитела или их комплексы с антигеном могут продолжительное время оставаться сорбированными на поверхности лимфоцитов. Такие клетки способны взаимодействовать с антигеном, не будучи прекоммити- рованными к синтезу антител и рецепторов к этому антигену.

В настоящее время далеко не все известно о функции лимфоцитов, чьи антигенсвязывающие свойства обусловлены сорбированными на их поверхности антителами (иммунными комплексами). Судя по некоторым фактам, эти клетки у мышей, иммунизированных оптимальной для продукции антител дозой антигена, могут выполнять функцию супрессоров реакции гиперчувствительности замедленного типа (Л. Черноусова и др., 1981, 1982), т. е. реакцию клеточного иммунитета. Тем самым вскрывается один из механизмов, регулирующих соотношение реакций гуморального и клеточного иммунитета на один и тот же антиген.

Исследования в описанной области не завершены и полученные данные не окончательны, однако мы считаем необходимым обратить на них внимание также и с методологических позиций. Дело в том, что эти работы показывают, в частности, как не прост путь от закономерностей, установленных в модельных опытах в пробирке, к выяснению вероятности реализации этих закономерностей в целом организме. Путь этот труден, но безусловно плодотворен, так как на нем лежит разгадка крайне многообразных связей отдельных биологических явлений. В следующем разделе мы приведем еще один пример того, как, только сочетая сведения, полученные хотя и в смежных, но различных разделах иммунохимии, удается наметить подходы для понимания закономерностей течения иммунного процесса в организме.

Интерференция эффекторных функций иммуноглобулинов. При изучении каждой в отдельности эффекторной функции иммуноглобулинов (антител) исследователь не всегда принимает во внимание, что реализация этих функций в организме будет происходить при одновременном присутствии в среде нескольких различных лигандов, причем в условиях, благоприятных для реакции одной и той же молекулы антитела с разными лигандами. Например, комплекс антигена с IgG-антителами способен связывать содержащийся в крови Clq, а также фиксироваться на Рст-рецепторах макрофагов, нейтрофилов или лимфоцитов. Центры для Clq и Fc-рецептора находятся, как известно, в Fc-участке молекулы IgG и пространственно разобщены. Но достаточно ли удалены эти центры друг от друга, чтобы исключить их взаимное стерическое экранирование? Вопрос существен для оценки возможностей реализации эффекторных функций в условиях целого организма и, в частности, для оценки иммунопатологических свойств комплексов антиген-антитело.

В самом деле, если концентрация Clq в циркуляции будет достаточной для замещения большинства центров в молекулах IgG-антител, входящих в иммунный комплекс, то из-за больших размеров молекулы Clq (см. рис. 33 и табл. 9) может пройзойти экранирование центра для Fc-рецептора. Это сделает невозможным фиксацию комплексов на фагоцитах, их захват этими клетками и, следовательно, выведение из циркуляции. Насколько опасна такая ситуация в случае продолжительного но времени образования иммунных комплексов, например при аутоиммунных заболеваниях, мы обсудим ниже.

Здесь мы хотим продемонстрировать, что интерференция, эффекторных функций (термин предложен нами) действительно имеет место и ее можно продемонстрировать, например, оценивая влияние Clq на связывание иммунного комплекса клетками селезенки и перитонеальными макрофагами (А. Кульберг и др., 1985).

В описываемых опытах в качестве иммунного комплекса использовали эритроциты барана, обработанные субагглютинирующей дозой IgG-антител кролика против эритроцитов барана. Полученные комплексы дополнительно инкубировали с высокоочищенным Clq человека, после чего избыток этого компонента комплемента удаляли. Обработанные с помощью Clq иммунные комплексы в отличие от необработанных не фиксировались на перетонеальных макрофагах мыши и на клетках из селезенки мыши. Степень торможения связывания иммунного комплекса клетками прямо зависела от дозы Clq. Более того, уже фиксированные на поверхности клеток сенсибилизированные антителами эритроциты отделялись от клеточной поверхности в присутствии Clq. Все это может означать, что Clq, присоединяясь к антителам в составе иммунного комплекса, не только препятствует связыванию комплекса с Гс7-рецепторами клеток (независимо от их происхождения), но и вытесняет присоединенный комплекс. Последнее возможно, конечно, потому, что фиксация на Fc-рецепторах иммунных комплексов носит обратимый характер.

Описанное явление может, как представляется, реализоваться в организме прежде всего при увеличении уровня Clq в крови за счет ускорения его синтеза. Это, в частности, характерно для аутоиммунного процесса (см. гл. 8). Если в результате нарушения процесса фиксации иммунных комплексов на фагоцитах их выведение из организма будет замедленно, такие комплексы начнут откладываться вокруг мелких сосудов почек и других органов, что приведет к тяжелой патологии, характерной для ряда хронических заболеваний с синдромом болезни иммунных комплексов (системная красная волчанка И др.).

Катаболизм иммуноглобулинов. Биологические свойства продуктов расщепления

г Как и другие белки, иммуноглобулины подвергаются катаболитическому распаду. Его скорость зависит от химического строения иммуноглобулина — принадлежности к определенному классу и подклассу (см. табл. 3). У различных биологических видов скорость катаболизма неодинакова и находится в обратной зависимости от собственной массы особи. Так, у мышей период полувыведения IgG около трех дней, у кролика — 7, у человека — 21—23 дня. На скорость распада оказывает прямое влияние концентрация иммуноглобулина, причем даже чужеродный иммуноглобулин может усилить скорость распада собственного иммуноглобулина. Однако и в этом случае сохраняется эффект классоспеци- фичности процесса катаболизма иммуноглобулинов (J. Fahey, A. Robinson, 1963).

Основную роль в катаболизме иммуноглобулинов, как, впрочем, и других сывороточных белков, играет печень. В захвате и распаде иммуноглобулинов принимают участие также макрофаги различной органной локализации (в том числе селезенки). Расщепление иммуноглобулинов происходит в воспалительных очагах за счет действия главным образом тканевых протеиназ, действующих на содержащиеся в тканевом воспалительном эксудате иммуноглобулины.

Изучение состава белков мочи, содержимого лизосом клеток печени и фагоцитов, а также продуктов, содержащихся в воспалительных очагах, позволило составить представление о природе промежуточных продуктов распада иммуноглобулинов и их биологических свойствах. Многие из изученных продуктов обладали той или иной биологической активностью, не свойственной нерасщеп- ленному иммуноглобулину. Тем самым удалось заметно расширить представления о биологических свойствах иммуноглобулинов, описав группу «скрытых» эффекторных

центров, т. е. центров, появляющихся только после расщепления молекулы иммуноглобулина в определенных участках.

Фрагменты типа Fab'—F(ab')2. Белки, подобные РаЬх-фрагменту по молекулярной массе, антигенному строению, пептидным картам, были обнаружены многими исследователями у человека и кролика в моче и сыворотке крови (Л. Бартова и др., 1962, 1963; J. Remington, 1962; Е. Merler, 1963). А. Кульберг с соавторами (1968, 1970) получили убедительные доказательства катаболи- тического происхождения этих фрагментов. Кроликам вводной внутривенно гомологичный столбнячный IgG- антитоксин, после чего в их моче появлялись Fab-фрагменты антитоксина, специфически нейтрализовавшие столбнячный токсин. В других опытах нормальным кроликам вводили IgG-антитела кролика против яичного альбумина. Во фракции лизосом клеток печени этих кроликов содержались Fab-фрагменты антител к яичному альбумину. Fab-фрагменты были обнаружены в экстрактах клеток селезенки и субклеточных фракциях клеток печени крысы, содержащих катепсины (F. Tsuji et al., 1969).

Приведенные данные, а также факт отсутствия среди продуктов биосинтеза и неполной сборки иммуноглобулинов в плазматических клетках фрагментов типа Fab (см. гл. 5) служат несомненными доказательствами образования Fab-фрагментов при внутриклеточном распаде гомологичного (аутологичного) IgG и других иммуноглобулинов. Обнаружение этого фрагмента в лизосомах, имеющих высокое содержание катепсинов, согласуется с многочисленными наблюдениями, свидетельствующими об относительно высокой устойчивости Fab-фрагмента к более глубокому расщеплению, в том числе и катепсинами.

Несмотря на то, что у здоровых особей в крови присутствуют лишь следовые количества Fab- или F(ab')2- фрагментов, они при определенных условиях могут накапливаться. Так их содержание возрастает при экспериментальном повреждении печени — частичной ге- патэктомии (Д. Евнин и др., 1971—1976). Своим появлением в этих условиях они обязаны тканевым протеиназам. Fab-фрагменты были найдены в гнойном содержимом абсцессов у человека (М. Waller, 1973).

К настоящему времени установлены две, возможно взаимосвязанные, эффекторные функции Fab-фрагмен- 154

тов. Как показали Г. Маргулис с соавторами (1977— 1980), Fab7- и F (abz) 2-фрагменты IgG кролика и человека, а также полученный с помощью папаина Fab-фрагмент IgG кролика подавляют m vitro бласттрансформа- цию лимфоцитов крови человека, индуцированную фитомитогенами —фитогемагглютинином и конканавалином А. Как известно, под влиянием фитомитогенов резко ускоряется синтез ДНК в лимфоцитах; этот процесс можно зарегистрировать по включению радиомеченого предшественника —3Н-тимидина в ДНК через 48—96 ч после добавления индуктора. Fab-фрагменты в 2—3 раза подавляют включение тимидина в активированные лимфоциты, причем эффект не связан с влиянием фрагмента на проникновение радиомеченого тимидина в клетки. Фрагменты не токсичны для клеток, не оказывают влияния на пролиферацию фибробластов кожи человека. Они не влияют на так называемую спонтанную трансформацию лимфоцитов, т. е. процесс биосинтеза ДНК в покоящихся клетках в отсутствие внешних индукторов. Все это означает, что влияние Fab-фрагментов испытывают на себе только те лимфоциты, которые активированы митогеном. Позже Ю. Первиков и др. (1981) установили, что Fab- фрагменты подавляют также индуцированную антигеном бласттрансформацию лимфоцитов человека, происходящую в том случае, когда клетки получают из крови людей, ранее иммунизированных этим антигеном.

Существенно, что предварительная инкубация лимфоцитов с Fab-фрагментом (с последующим промыванием клеток) не оказывает никакого влияния на процесс активации лимфоцитов митогенами. Вместе с тем тот же фрагмент способен подавить активацию клеток митогеном даже после добавления его спустя 24 и 48 ч после митогена (уровень включения радиометки оценивали спустя 72 ч после добавления митогена). Установлено также, что Fab-фрагменты высокоочищенных антител кролика против -динитрофенильной группы не отличаются по способности подавлять бласттрансформацию от аналогичных фрагментов нормального IgG. Это указывает на отсутствие каких-либо цеиммуноглобулиновых примесей в составе препарата фрагмента.

Fab-фрагменты подавляют биосинтез ДНК в активированных лимфоцитах на протяжении всего периода, в течение которого фрагмент находится е среде (рис. 35). Тормозящее действие проявляется в ранней фазе S-периода клеточного цикла и выражается в том, что фраг-

Рис. 35. Влияние РаУ-фрагмента на включение 3Н-тимидина в ДНК лимфоцитов крови человека, стимулированныхф итогем а гглюти-нином:/ — культивирование без РаЬ^фрагмен- та, 2—то же, в присутствии Fab'・ фрагмента, 3—влияние Fab'-фрагмен- та на спонтанную активацию лимфоцитовРис. 35. Влияние РаУ-фрагмента на включение 3Н-тимидина в ДНК лимфоцитов крови человека, стимулированныхф итогем а гглюти-нином:/ — культивирование без РаЬ^фрагмен- та, 2—то же, в присутствии Fab'・ фрагмента, 3—влияние Fab'-фрагмен- та на спонтанную активацию лимфоцитов

Рис. 35. Влияние РаУ-фрагмента на включение 3Н-тимидина в ДНК лимфоцитов крови человека, стимулированныхф итогем а гглюти-

нином:

/ — культивирование без РаЬ^фрагмен- та, 2—то же, в присутствии Fab'・ фрагмента, 3—влияние Fab'-фрагмен- та на спонтанную активацию лимфоцитов

Рис. 35. Влияние РаУ-фрагмента на включение 3Н-тимидина в ДНК лимфоцитов крови человека, стимулированныхф итогем а гглюти-

нином:

/ — культивирование без РаЬ^фрагмен- та, 2—то же, в присутствии Fab'・ фрагмента, 3—влияние Fab'-фрагмен- та на спонтанную активацию лимфоцитов

мент препятствует вхождению части стимулированных лимфоцитов в S-период.

Наблюдаемые эффекты проявляются несмотря на то, что сколько-нибудь заметное связывание лимфоцитами меченного по тирозину 1251 Fab-фрагмента обнаружить не удается. Да это и неудивительно, так как рецепторов для Fab-участка иммуноглобулинов, очевидно, не существует- Возможный механизм

действия Fab-фрагментов на лимфоциты обсуждается ниже в этой главе.

Вторая функция фрагментов из Fab-участка молекулы IgG связана с неспецифической регуляцией ими биосинтеза антител. Образующиеся в организме фрагменты типа Fab' и полученные с помощью пепсина F(ab')2- фрагменты гомологичного IgG усиливают in vivo и в культуре клеток селезенки кролика антигензависи- мую пролиферацию антителопродуцирующих клеток (Л. Бартова, Д. Ев- нин, А. Кульберг, Г. Маргулис, 1976—1983). Указанные фрагменты усили

вают иммунный ответ на тимусзависимые антигены (гетерологичные эритроциты, гетерологичный гамма-глобулин), но не влияют на ответ в отношении такого тимус-

независимого антигена, как липополисахарид из грамот- рицательных бактерий кишечной группы. Свойство Fab'- фрагментов усиливать иммунный ответ не связано с их антигенсвязывающими свойствами. С наибольшей очевидностью это следует из того факта, что полученный с помощью папаина Fab-фрагмент из нормального IgG лишен свойства усиливать иммунный ответ, хотя этим свойством обладает ЕаЬ^-фрагмент, полученный из того же препарата IgG. Последнее имеет принципиальное значение для выяснения строения участка молекулы фрагмента, определяющего его свойство усиливать иммунный

ответ.

В самом деле, как видно из рис. 18, фрагменты, полученные с помощью пепсина и папаина, отличаются друг от друга только отрезком тяжелой цепи в районе талии, который образован шестью аминокислотными остатками (три из них — остатки пролина). Роль этого участка подтверждена следующими опытами. Были получены гомологичные антитела против детерминанты IgG кролика, образованной с участием последовательности, отличающей пепсиновый РаЬ^фрагмент от папаинового. Было продемонстрировано, что иммунодоминантной группой этой детерминанты секвенциального типа служит С-кон- цевой лейцин (Л. Бартова, Г. Маргулис, 1985). Антитела против указанной детерминанты, добавленные в культуру клеток селезенки, полностью отменяют эффект F(ab')2- фрагмента на иммунный ответ.

Для понимания механизма действия F(abz) 2-фрагмента на иммунный ответ существенно, что он практически полностью отменяет неспецифическое конкурентное подавление иммунного ответа неродственным антигеном. Этот хорошо известный иммунологический феномен обусловлен накоплением под действием первого из двух последовательно введенных антигенов неспецифических. Т-супрессоров (М. Taussig, 1974; R. Gershon et al., 1978). He обсуждая здесь функциональной роли Т-супрессоров и их классификации (см. гл. 10), отметим лишь, что усиление иммунного ответа F (abz) 2-фрагментом (а точнее, олигопептидом из его С-концевой части) может быть следствием подавления фрагментом (пептидом) активации Т-супрессоров.

Изучение эффекторных функций Fab-фрагментов убедительно иллюстрирует возможности молекулярной иммунологии в расширении существующих представлений о гомеостатических механизмах регуляции биосинтеза белка у высших организмов. В самом деле, до выяснения функции промежуточных продуктов катаболизма иммуноглобулинов з биосинтезе иммуноглобулинов был экспериментально доказан только один механизм регуляции биосинтеза иммуноглобулинов по типу обратной связи: подавления биосинтеза антител IgG-антителами той же специфичности (см. гл. 10). Описанный в этом разделе механизм усиления биосинтеза антител фрагментом (пептидом) из Fab-участка молекулы IgG также относится к механизмам регуляции биосинтеза белка по типу обратной связи. Ведь фрагменты типа Fab ——промежуточные продукты катаболизма иммуноглобулинов, а по-

этому их содержание отражает интенсивность распада иммуноглобулинов в организме, их убыль. Усиливая синтез иммуноглобулинов (антител) при участии специфиче- •ского индуктора — антигена, они (ЕаЬ^фрагменты) обеспечивают восстановление уровня иммуноглобулинов. Ес- .ли учесть, что скорость распада иммуноглобулинов прямо зависит от их концентрации (J. Fahey, A. Robinson, 1963), а самые разнообразные антигены постоянно поступают в •организм через пищеварительный тракт, дыхательные пути it даже кожу, этот механизм регуляции биосинтеза иммуноглобулинов имеет, очевидно, большое значение.

Другая сторона обсуждаемой проблемы — ее методологический аспект, к которому хотелось бы привлечь внимание будущих исследователей. Для решения этой задачи, как и, впрочем, большинства других интересных задач современной молекулярной иммунологии, потребовалось использование самых различных методов, а для построения рабочих гипотез — знания в области химии •белка, энзимологии, клеточной иммунологии.

Изучение механизма усиления биосинтеза антител Fab'-фрагментамн не завершено. Сегодня все более очевидно, что этот процесс многоэтапен. Опыты in vivo показывают, что под действием фрагмента происходит образование фактора неиммуноглобулиновой природы, накапливающегося в сыворотке и способного при переносе интактному реципиенту вместе с антигеном усилить у него иммунный ответ на этот антиген (И. Елистратова и др., 1982). Все имеющиеся данные можно обобщить в виде следующей схемы:

Иммуноглобулины f Расщепление в фагоцитах — F (ab') 2 f -♦-Переработка — Индукция продуктами расщепления F(ab')2 А-клетками синтеза регулятора активности Т-супрессорои

Fc-фрагмент IgG. Fc-фрагменты были найдены в моче •здоровых людей. После введения добровольцам меченного 1311 гомологичного IgG в их моче появлялся меченый белок, имеющий антигенное родство с Fc-фрагментом (J. Vaughan et al., 1967). Результаты опытов in vitro свидетельствуют об относительно высокой чув- -ствительности Fc-участка молекулы IgG к расщеплению в кислой среде (см. гл. 3). Поэтому можно было предположить, что при расщеплении иммуноглобулинов в лизосомах с помощью катепсинов Сн2-домены разрушаются. В силу этого основным промежуточным продуктом ката-

болизма IgG служат фрагменты типа Fc', т. е. тандем С-концевых СнЗ-доменов.

Интенсивное расщепление Fc-участка IgG с помощью катепсинов было продемонстрировано К. Фером и др. (К. Fehr et al., 1970). Fc'-фрагменты были найдены в моче и сыворотке (следы) новорожденных телят после получения ими молозива (В. Kickhofen et al., 4971). Ката- болитическое происхождение этих фрагментов не вызывает сомнений, так как у жвачных животных иммуноглобулины не передаются от матери к плоду через плаценту;, поэтому до получения молозива новорожденные животные не имеют в крови иммуноглобулинов. Все сказанное выше свидетельствует о том, что не Fc-фрагмент, а только его С-концевая половина (т. е. Рс^фрагмент) с молекулярной массой около 20 000 служит промежуточным продуктом катаболизма IgG.

Фрагменты типа Fc' продолжительное время находятся в циркуляции благодаря наличию в их составе центра, ответственного за реабсорбцию IgG в извитых канальцах почек (см. гл. 6). Мало вероятно, что у этого фрагмента отчетливо выражены другие эффекторные функции. Что же касается всего Fc-фрагмента, то надежных оснований считать его промежуточным продуктом катаболизма иммуноглобулинов нет. Нельзя однако исключить, что такие фрагменты все же появляются в циркуляции в следовых количествах и даже в этих условиях проявляют свою биологическую активность. То, что Fc-фрагменты, полученные при протеолизе, имеют характерные эффекторные свойства, убедительно доказано.

Как показали М. Берман и У. Вейгл (М. Bermanr W. Weigle, 1976), полученные с помощью папаина Fc- фрагменты IgG мыши и некоторых других млекопитающих вызывают усиление синтеза ДНК и бласттранс- формацию В-лимфоцитов мыши в культуре. Fc-фрагменты, выделенные из иммуноглобулинов других классо» (IgA>IgM>IgD), но не IgE, также активируют В-лим- фоциты. Одно из проявлений активации этих клеток состоит в появлении бластов, продуцирующих различные- по специфичности антитела; антигены в этом участия не принимают. Поэтому можно заключить, что Fc-фрагмент вызывает антигеннезависимую поликлональную активацию В-лимфоцитов. Существенно, что нерасщепленный IgG такими свойствами не обладает. Поэтому описанное свойство Fc-фрагментов принадлежит к числу скрытых эффекторных функций иммуноглобулинов.

В серии работ Е. Морган и У. Вейгл (Е. Morgan, W. Weigle, 1979—1984) показали, что Fc-фрагмент активирует В-лимфоциты только в присутствии макрофагов (А-клеток). Эти клетки расщепляют фрагмент, после чего в культуральной жидкости появляются его осколки., активирующие В-лимфоциты мыши. Осколок молекулы Fc-фрагмента, обладающий активностью, имеет довольно большие размеры (молекулярная масса около 14 000). Он происходит из С-концевой части Fc-фрагмента. Это весьма существенно, поскольку, как говорилось в этом разделе выше, фрагменты из С-концевой половины Fc- участка молекулы IgG служат промежуточными продуктами катаболизма этого белка. В последнее время теми же авторами был синтезирован пептид из 23 аминокислотных остатков, воспроизводящий аминокислотную последовательность \-цепн IgG человека, начиная с остатка 335. Этот пептид способен активировать В-лимфоциты, заменяя собой Т-хелперы.

Помимо А-клеток в процессе поликлональной активации В-лимфоцитов Fc-фрагментом участвуют также Т-лимфоциты. Их функция состоит лишь в определенном усилении эффекта Fc-фрагмента, который и без их помощи способен индуцировать процесс поликлональной активации В-лимфоцитов.

Из изложенного с очевидностью следуют принципиальные различия в эффекте Fab'- и Fc-фрагментов на иммунный ответ. Первый из фрагментов несомненно служит промежуточным продуктом катаболизма иммуноглобулинов, а второй ——нет. Хотя для проявления свойства сравниваемых фрагментов влиять на активность В-лимфоцитов необходима помощь А-клеток, образующиеся продукты совершенно различны по строению и свойствам. Активный олигопептид из РаЬ^-фрагмента имеет характерные для талии молекулы особенности строения (богат пролином). А как явствует из данных по первичной структуре IgG (см. гл. 3), район талии уникален по аминокислотному составу и не гомологичен другим участкам молекулы, в том числе и Fc-участку. Что касается активного осколка Fc-фрагмента, то он при относительно большой молекулярной массе тяготеет к С-концевой части фрагмента. Наконец, действие активных пептидов в обоих случаях совершенно различно. Олигопептид из Fab'-фрагмента, как и сам фрагмент, влияет на активность Т-супрессоров. А пептид из Fc-фрагмента практически без участия Т-клеток действует на В-лимфоциты.

Процесс поликлональной активации В-лимфоцитов под действием Fc-фрагмента может иметь, по-видимому, значение в патологии при продолжительной персистенции в организме иммунных комплексов. Действительно, модельные опыты показали, что аналог иммунного комплекса—прогретый при 63° С гамма-глобулин человека активирует мышиные лимфоциты подобно изолированному Fc-фрагменту (W. Weigle et al., 1976—1978). Как установили те же исследователи, активный осколок Fc-участка агрегированного IgG образуется после захвата агрегированного белка макрофагами и его частичного переваривания в этих клетках.

Фрагменты молекулы IgG, усиливающие фагоцитоз. При протеолизе IgG трипсином среди продуктов гидролиза появляется фрагмент, способный усиливать фагоцитоз бактерий сегментоядерными лейкоцитами. Под его влиянием увеличивается и число захваченных фагоцитами микробных тел и эффективность их разрушения в фаго- лизосомах. Путем многократной очистки удалось выделить активный фактор и проанализировать его структуру <W. Najiar et al., 1969—1974). Это оказался тетрапептид: Thr—Lys—Pro—Arg. Позже было показано, что эта последовательность соответствует остаткам 289—292 в Сн2-домене IgG. Пептид, получивший название «тафт- с〃н» (открывшие его исследователи работали в университете им. Тафта, США), является продуктом катаболизма IgG, так как он может высвобождаться также при действии на IgG протеолитического фермента, содержащегося в мембране сегментоядерных лейкоцитов — лейкокина- зы, а также эндокарбоксипептидазы. Активность тафтсина определяется всеми входящими в его состав аминокислотными остатками. Отщепление одного из концевых остатков лишает пептид активности.

После того как тафтсин был синтезирован искусственно, были также синтезированы его многочисленные аналоги. Почти все замены в структуре тетрапептида вели к снижению его активности. В свете этих данных эволюционно-приспособительный характер взаимосвязи между структурой и катаболизмом иммуноглобулинов, с одной стороны, и активацией одной из важнейших защитных систем организма ——фагоцитоза, с другой, здесь проявляется особенно ярко.

Тафтсин был испытан как терапевтический агент при гнойно-септическом процессе (есть сообщения о положительном эффекте лечения). В настоящее время этот пре-

парат доступен для лабораторных исследований. Сам факт производства тафтспна вне зависимости от того, какой в конечном итоге будет результат его применения в клинике, является своего рода революцией в иммунологии, Спустя десятки лет после появления коммерческих препаратов гамма-глобулина для целей профилактики и лечения инфекционных заболеваний выпускается в продажу синтезированный в заводских условиях осколок молекулы гамма-глобулина, предлагаемый для защиты от инфекции, но как неспецифический стимулятор.

Тафтсин не уникален по своей функции усиливать фагоцитоз. Существуют наблюдения о способности этого пептида и некоторых его аналогов усиливать также иммунный ответ.

Сравнительно недавно в составе СнЗ-домена был обнаружен участок (с 345 по 348 остатки), синтетический гомолог которого подобен по свойствам тафтсину (Г. Чи- пенс с соавторами, 1980—1982). Поскольку исследователи работают в г. Риге, они назвали этот пептид «ри- гином».

Фрагменты иммуноглобул инов с хемотактическими свойствами. К хемотактическим факторам относят вещества, вызывающие перемещение различных клеток крови (моноциты, сегментоядерные лейкоциты, лимфоциты) по направлению градиента концентрации фактора. Хемо- тактические факторы служат одним из важнейших инструментов процесса воспаления, без преувеличения, главной защитной неспецифической реакцией организма на повреждающие воздействия.

К настоящему времени описаны многие хемотактиче- ские факторы, причем их появление во многих случаях связано с протеолитическим расщеплением белков, некоторые из фрагментов которых обладают хемотактпческой активностью (см. также г」.8).

Иммуноглобулины также служат источником ряда хемотактических факторов. Первый из описанных хемо- тактических факторов получил название лейкоэгрессин (leukoegressin). Он был обнаружен И. Йошинага с соавторами (I. Yoshinaga et al., 1972) в очагах воспаления, а также в сыворотках животных, которым вводили комплексы антиген-антитело. Источником лейкоэгрессина служат те подклассы IgG, которые относительно более устойчивы к расщеплению SH-зависимыми протеиназами. Это IgG2 и IgG4 человека, а также IgG кролика

с высокой электрофоретической подвижностью. Образующийся в организме лейкоэгрессин, как и аналогичный ему продукт, полученный при протеолизе i〃 vitro с помощью папаина или тканевых катепсинов, имеет молекулярную массу около 140 000, заметно не отличается от IgG по антигенному строению, но в отличие от нерасщеп- ленного IgG обладает выраженной хемотактической активностью в отношении сегментоядерных лейкоцитов. Обнаружение лейкоэгрессина в очагах воспаления, где в эксудате содержатся IgG и тканевые протеиназы, отсутствие хемотактической активности у нерасщепленного IgG несомненно свидетельствуют о том, что хсмотактическая активность этого продукта протеолиза IgG определяется существованием в молекуле последнего скрытого эффекторного центра; его демаскирование происходит при катаболитическом расщеплении IgG в патологических условиях (например, в воспалительном очаге).

Если в качестве субстрата для SH-зависимых тканевых протеиназ выступает IgM, образуются в том числе фрагменты с молекулярной массой около 14 000, которые обладают хемотактической активностью для лимфоцитов. Фрагменты чувствительны к дальнейшему протеолнзу, в результате которого они теряют активность. Сам IgM. какой-либо хемотактической активностью не обладает. Протеолиз IgG SH-независпмой протеиназой, выделенной из лейкоцитов, сопровождается появлением недостаточно полно охарактеризованных фрагментов, которые служат хемотактпческими факторами для моноцитов.

Таким образом иммуноглуболины классов G и М служат источником трех различных хемотактических факторов, способных привлечь к месту их образования сегментоядерные лейкоциты, моноциты и лимфоциты. Разумеется иммуноглобулины ——не единственный источник хемотактических факторов восп а лите л ьного очага, но, по- видимому, весьма существенный.

Продукты распада иммуноглобулинов и воспаление. В предыдущем разделе мы уже отметили роль продуктов распада иммунопобулинов в возникновении процесса воспаления — образование хемотактических факторов. Однако, как оказалось, продукты расщепления иммуноглобулинов способны быть не только медиаторами, но и индукторами реакции воспаления. Такие свойства присуши в организме Fab' и F(ab') 2-фрагментам гомологичного и даже аутологичного IgG. Фрагменты могут быть

工 j 八 EHawal/uwoy

^1 ^^「qajrfno音аи зо^1 ^^「qajrfno音аи зо

^1 ^^「qajrfno音аи зо

^1 ^^「qajrfno音аи зо

Рис. 36. Патофизиологические изме

нения, возникающие у кролика после внутривенного введения ему 0,5 мг Fab'-фраг- мента гомологич

ного IgG:

/ — изменения гемолитической активности комплемента сыворотки крови. 2 — изменение содержания фибриногена в плазме крови, 3 — содержание л ей ко- цитов крови в норме (суточные колебания),, 4— то же, после введения Fab'- фрагмента, 5 — изменения температуры тела в норме (су той- ные колебания). 6 — то же, после введения ЕаЬ'-фрагмента

получены с помощью пепсина in vitro. Аналогичными свойствами обладают подобные им фрагменты, выделенные из печени кролика.

При внутривенном введении кролику 0,5 мг Fab-фрагментов аутологичного IgG у него в течение последующих 2—6 ч регистрируются следующие реакции: кратковременная лейкопения, сменяющаяся лейкоцитозом, совпадающее с периодом лейкопении повышение температуры тела, снижение уровня комплемента и повышение фибринолитической активности крови (Н. Шмелева и др., 1971). Эти явления вызывают именно Fab'- и F(ab')2-山рагмен- ты, в то время как нерасщепленный IgG и полученный с помощью папаина Fab-фрагмент такими свойствами не обладают. Характер патофизиологических реакций в ответ на введение аутологичного Fab'-фрагмента иллюстрирует рис. 36.

В свете сказанного закономерно заключить, что определяющая роль в возникновении указанных реакций принадлежит С-концевому участку Fab'-фрагмента, которым этот фрагмент отличается от аналогичного фрагмента, полученного с помощью папаина (см. рис. 18).

Все описанные выше реакции, характерные для процесса воспаления, возникают только при дискретном увеличении концентрации Fab' в циркуляции. Введение той же дозы фрагмента по частям в течение часа не приводит к каким-либо реакциям. Это объясняет тот факт, что, будучи естественными промежуточными продуктами катаболизма IgG, фрагменты типа Fab' не вызывают в норме нарушений гомеостаза, так как они поступают в циркуляцию постоянно в небольших количествах. Однако, если возникают условия для одномоментного расщепления ощутимых количеств IgG (например, высвобождение тканевых протеиназ при ранениях и других повреждениях тканей) и появления больших количеств Fab'-фрагмен- тов, они способны стать важным фактором в развитии воспалительной реакции. При этом важно иметь в виду, что IgG крайне чувствителен к протеолизу именно по району талии молекулы.

А. Роусон с сотрудниками (A. Rawson ct al., 1969) обнаружили воспалительный процесс, напоминающий артрит у человека после введения в суставную сумку здорового кролика Fab'-фрагмента гомологичного IgG. Аналогичный процесс наблюдали К. Фер с соавторами (К. Fehr et al., 1976), вводя в сустав кролика F(ab')2- фрагмент, полученный с помощью тканевой протеина-

зы — катепсина D. Следовательно, Fab'-фрагментн способны вызвать н локальный воспалительный процесс.

Разумеется, Fab'- п F(аЬ,)2-фрагменты — далеко не единственные эндогенные факторы, участвующие в развитии воспалительного процесса. Но тот факт, что такие свойства присущи продукту катаболизма IgG, выявляет новые взаимосвязи между естественной резистентностью (реакция воспаления — один из важнейших ее механизмов) и специфической иммунореактивностью, в обеспечении которой иммуноглобулины (антитела)——один из основных факторов.

КомплементКомплемент

Комплемент

Комплемент

Комплементом называют многокомпонентную самособирающуюся систему белков крови, которая играет одну из ключевых ролей в поддержании иммунного гомеостаза. Инициация процесса активации (самосборки) системы комплемента может осуществляться двумя путями: классическим и альтернативным, причем в первом случае инициирующим фактором является комплекс антиген-антитело. Инициация процесса активации комплемента комплексом антиген-антитело не единственный, но важнейший в биологическом отношении путь активации, так как в значительной степени именно посредством системы комплемента антитела при участии антигена способны очень глубоко влиять на самые различные системы поддержания гомеостаза многоклеточных организмов: фибринолитическую систему и систему свертывания крови, регуляцию проницаемости сосудистого русла, хемотаксис, образование и высвобождение пептидов, управляющих сократимостью гладкой мускулатуры, и ряд других систем.

Химия комплемента

Компоненты классического пути активации комплемента (их число равно 11) обозначают цифрами от С1 до С9. Три субкомпонента С1 получили наименование Clq, Clr, Cis.

Так называемые концевые (терминальные) компоненты классического пути (СЗ, С5, С6—С9) участвуют также в активации комплемента альтернативным путем. Кроме них реализацию альтернативного пути обеспечивают еще ряд компонентов, основные из которых указаны в табл. 9. Компоненты альтернативного пути имеют буквенные обозначения: Р (пропердин), В и D. Исключение составляет СЗ. Необходимо знать, что если над литерой, обозначающей тот или иной компонент, стоит черточка (СЗ, Р), это означает, что соответствующий компонент активирован.

Таблица 9. Основные характеристики белков системыкомплемента

Наименование белка

Молекулярная масса, дальтон

Концентрация, мкг-мл

Классический путь активации Clq

390 000

190

Clr

83 000

□

Cis

83 000

120

С4

209 000

430

С2

117 000

30

Альтернативный путь активации Р

220 000

25

D

23 500

В

100 000

240

СЗ

190 000

1300

Терминальные компоненты СЗ

190 000

С5

206 000

75

С6

95 000

60

С7

120 000

55

С8

163 000

60

С9

79 000

160

Связь между компонентами классического и альтернативного пути демонстрирует схема на рис. 37. Очевидно, что ключевым компонентом является СЗ. Его активация, связанная с частичным расщеплением и, как следствие этого, появлением фрагмента СЗЬ, достигается двумя различными путями. С появлением СЗЬ начинается ак-

тивация терминальных компонентов — эффекторного звена всего каскада.

Прежде чем перейти к детальному рассмотрению всех звеньев активации системы комплемента, отметим общее основное положение: важнейшие этапы активации связаны с процессом ферментативного катализа, причем многие компоненты комплемента, будучи активированными,

КлассическийКлассическийРис. 37. Компоненты классического и альтернативного путей связывания комплемента и их взаимосвязьРис. 37. Компоненты классического и альтернативного путей связывания комплемента и их взаимосвязьобладают активностью протеиназ или эстераз. Для осуществления всего каскада реакций не требуется внешних (вне системы комплемента) источников ферментов. В силу крайне малой продолжительности жизни компонентов в активированной форме образующиеся при активации комплемента протеиназы или эстеразы не оказывают определяемого влияния на другие субстра

Классический

Классический

Рис. 37. Компоненты классического и альтернативного путей связывания комплемента и их взаимосвязь

Рис. 37. Компоненты классического и альтернативного путей связывания комплемента и их взаимосвязь

ты, присутствующие в крови (например, другие сывороточные белки). Следовательно, ферменты системы комплемента «настроены» для работы только на компоненты системы.

Другое важное положение состоит в том, что процесс активации носит характер гетерофазного катализа, т. е. каждый новый фермент каскада функционирует после спонтанного связывания с клеточной поверхностью. Последняя защищает фермент от инактивации либо особыми, регулирующими активность системы ферментами, либо ферментами, образующимися на предшествующей стадии активации системы.

Классический путь активации

Инициация процесса связана с образованием комплекса антиген-антитело. Только два класса антител: IgG и IgM—обеспечивают активацию благодаря наличию в их молекулах эффекторных центров для

Clq — первого субкомпонента первого компонента системы (см. гл. 6).

Прежде чем перейти к детальному рассмотрению вопроса о механизме активации комплемента с участием

aClq.r.s: Ca2+

SACl,4bSACl,4bC2;Mg"C2;Mg"(C2a)i+C2b(C2a)i+C2bSACl,4b.2aSACl,4b.2aS^^-SA——-

SACl,4b

SACl,4b

C2;Mg"

C2;Mg"

(C2a)i+C2b

(C2a)i+C2b

SACl,4b.2a

SACl,4b.2a

C

C3

C3a+(C3b)i

S A Cl 4b,2a, 3b

C

C5,6,7

C5a+(C5b,6,7)i

SAC 1, 4b, 2a, 3b, 5b, 6,7

Iе8

SA C工 4b, 2a, 3b, 5b, 6,7,8

1C9

Лизис'

эритроцита —SAC1,4b, 2a, ЗЬ, 5b, 6,7,8,9

Рис. 38. Классический путь активации компле-мента:

S — антиген (эритроциты), А— антитела против эритро-цитов (IgG или IgM)

комплекса антиген-антитело, представляется целесообразным изложить в схематической форме современные взгляды на процесс активации комплемента по классическому пути в хорошо изученной системе: эритроцит — IgG-антитело кролика.

Согласно схеме (рис. 38) первоначально к комплексу антиген (S)-антитело (А) присоединяется комплекс С1,

состоящий из трех компонентов: Clq, Clr, Cis. В результате образуется фермент — Cl-эстераза (Cis). Под действием С1-эстеразы возникает энзиматически активный комплекс четвертого и второго компонентов комплемента (С4, 2), обозначаемый также как СЗ-конвертаза. Этот фермент расщепляет третий компонент комплемента——СЗ на два фрагмента: СЗа, обладающий свойствами анафилатоксина (см. ниже) и хемотактической ак- тпвностью, и СЗЬ, способный взаимодействовать с С4,2.

Неколагенопо-Колагеноподо5ный участокГлобулярный

добный уиас-(78 аминокислотныеучасток (f03-

ток (2-в ами-остатков)'108 амино-

налислотнылл ислстнь /л

I ^таткоВ)иигпеткоб；

Рис. а。. Особенности первичной структуры полипептидныхцепей Clq субкомпонента системы комплемента

В результате образуется фермент с активностью пептидазы, действующий на С5. Комплекс С4,2,3, находящийся на поверхности клетки, обеспечивает фиксацию на клеточной мембране активированного пятого компонента комплемента, а затем С6 и С7. Эти три компонента, действующие как одна функциональная единица, способствуют фиксации С8 и С9. После присоединения первого из них эритроцит становится высокочувствительным к осмотическому лизису. Действие С8 усиливает С9, вызывающий необратимые повреждения структуры мембраны.

Головной компонент классического пути активации —— Clq представляет собой один из интереснейших по строению белков. Он имеет молекулярную массу 400 000 и образован 18 полипептидными цепями (см. рис. 33). В каждой цепи около 200 аминокислотных остатков, но первичная структура их хотя и сходна, но не идентична. Их можно разделить на три типа: А, В и С. Аминоконцевые половины каждой из цепей подобны по структуре коллагену, так как образованы повторяющимися аминокислотными триплетами X——У——Gly. Лишь короткий отрезок цепи непосредственно в районе аминоконцевого остатка не имеет подобной структуры (рис. 39). С-концевая часть

каждой цепи (103—108 остатков) имеет третичную структуру, характерную для глобулярного белка. По данным электронной микроскопии, все полипептидные цепи сформированы в шесть субъединиц, причем вся молекула напоминает по внешнему виду тюльпан (см. рпс. 33). Шесть лепестков (или головок) образованы С-концевы- ми глобулярными областями цепей, а коллагеноподобные участки скручены в каждой субъединице в трехспиральную структуру. Все вместе они образуют структуру, подобно стеблю (stulk), будучи объединены непосредственно в районе аминоконцевого участка межцепьевымп дисульфидными связями. Глобулярные участки отвечают за взаимодействие с антителами IgG- и IgM-классов, а коллагеноподобный участок ——за связывание С1г и Cis.

Как показано в гл. 6, Clq образует с IgG в мономерной форме сильно диссоциирующий комплекс. В составе такого комплекса Clq не способен связать комплекс из двух молекул С1г и Cis. Только при прочной фиксации этого комплекса на Clq происходит расщепление п, как следствие этого, активация С 1г, что, в свою очередь, необходимо для расщепления Cis и превращения его в активный фермент (эстеразу). Лишь после связывания Clq двумя или большим числом головок с антителами (что достигается агрегацией последних антигеном) возникают условия для формирования энзиматически активного комплекса С1. Почему это происходит? Существуют данные, что после связывания с агрегированным IgG в молекуле Clq происходят определенные конформационные изменения, затрагивающие коллагеноподобный стебель молекулы. Возможно, эти изменения касаются области, с которой взаимодействует Clr2-Cls2 комплекс, и благодаря им сродство к этим лигандам возрастает.

Как С1г, так и Cis образованы каждый одной полипеп- тидной цепью с молекулярной массой около 83 000. Оба белка в отсутствие Clq образуют стабильный тетрамолекул я рный комплекс с молекулярной массой 340 000. Для формирования комплекса требуются ионы кальция. После фиксации этого комплекса на Clq образуется структура с молекулярной массой 740 000 и константой седиментации 16S (рассчитано при образовании комплекса из чистых компонентов в растворе).

В составе комплекса С1 каждый из субкомпонентов — Clr и Cis расщепляются на два связанных дисульфидной связью фрагмента с молекулярными массами, приблизительно равными 60 000 и 30 000. Отличаясь по антпгенно-

му строению, Clr н Cis сходны по физико-химическим н химическим свойствам. После активации каждый из них превращается в так называемую сернновую протеиназу (эстеразу), т. е. фермент, в активном центре которого находится остаток серина. Как все ферменты этого типа, он инактивируется диизопропнлфторфосфатом, причем каждый из меньших по размеру фрагментов активированного Clr или Cis связывает по 1 молю ингибитора. Это указывает на наличие одного активного центра на полипептидную цепь.

Как говорилось, С1 действует па С4. Последний представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 209 0G0. Он образован тремя цепями: а —с молекулярной массой 93 000, р — 78 000 н 丫一 33 000. Четвертичная структура стабилизирована дисульфидными связями и нековалентными связями.

Активация С4 с помощью С1 связана с отщеплением от аминоконцевой части a-цепи пептида с молекулярной массой 7000—11 000. Его обозначают как С4а, а всю остальную часть молекулы — как С4Ь (рис. 40). Фрагмент С4Ь имеет пять функций: 1) необратимо связывается с иммунным комплексом и мембраной клетки через появляющийся в ходе активации новый N-концевой участок а-цепп; 2) связывается с клеточными рецепторами, ответственными за так называемое иммунное прикрепление (см. ниже); 3) взаимодействует с С1, что обеспечивает более эффективное расщепление С2; 4) связывается с активированным С2; 5) взаимодействует с СЗЬ, что приводит к формированию тройного комплекса — С4b2a3b, являющегося С5-конвертазой классического пути активации.

Содержащаяся в сыворотке крови протеиназа С4Ь-ин- активатор способна отщепить от a-цепи С4Ь (когда он находится в жидкой фазе) пептид ——C4d, превращая С4 в продукт, обозначаемый как С4с. Последний сохраняет все свойства С4Ь, за исключением одного ——способности связываться со специальным участком цитоплазматической мембраны. Тем самым С4 выводится из основной реакции, ведущей к комплементзавненмому повреждению мембран клеток-мишеней. По сути С4-ннактнватор выполняет роль гомеостатического регулятора. Ниже будут представлены данные об аналогичных по функции инактиваторах СЗЬ и С5Ь.

Как уже указывалось, активация С2, одноцепочечного белка с молекулярной массой 120 000, связана с его

расщеплением с помощью Cis на два фрагмента — С2Ь (молекулярная масса 5000) и С2а (молекулярная масса 35 000). Последний нз фрагментов, являющийся аминоконцевой частью молекулы С2, обладает протеиназной активностью после присоединения к С4Ь в присутствии

СЗаСЗЬ

I 丨 「一丨一la

§s5S§s5Sd-Конёертаза - С5Ь- Инантиёогпорd-Конёертаза - С5Ь- ИнантиёогпорOS С^Ь-ИнактиВатор гOS С^Ь-ИнактиВатор г

§s

5S

§s

5S

d-Конёертаза - С5Ь- Инантиёогпор

d-Конёертаза - С5Ь- Инантиёогпор

OS С^Ь-ИнактиВатор г

OS С^Ь-ИнактиВатор г

С5аС5Ь

C5dС5с

-"u.

5SS

SS5

I ■-_- 一 -Jf

С5- Конёертаза

Рис. 40. Структура третьего (СЗ), четвертого (С4)и пятого (С5) компонентов комплемента и фраг-менты, образующиеся при их активации и после-дующей инактивации

Mg2+ (СЗ-конвертаза). Комплекс разрушается в результате прогревания при 56° С с образованием инактивированного С2а. Однако после этого С4Ь сохраняет свойство присоединять новую молекулу С2а, вновь превращаясь в СЗ-конвертазу.

Расщепление СЗ-конвертазой классического пути третьего компонента комплемента сопровождается отделением от аминоконцевой части молекулы этого компонента (его a-цепи) небольшого фрагмента СЗа, с молекулярной массой около 9000 (рис. 40). В результате появ-

ляется ключевой компонент как классического, так и альтернативного путей активации — СЗЬ с молекулярной массой 171 000 (см. рис. 40). СЗЬ, связываясь с комплексом С4Ь2а, становится устойчивым к действию протеиназы СЗ-инактиватора, содержащейся в сыворотке. Если СЗЬ остается в жидкой фазе (например, избыток этого компонента), инактиватор отщепляет от его а-цепи один или два пептида (C3d и СЗс). Остающийся фрагмент уже

Рис. 41 Функционально-активные комплексы, образующиеся при активации классического пути связывания комплемента IgG антителами против антигенов клетки:

/, //, /// — центры связывания на клеточной поверхности

не способен участвовать в образовании С5-конвертазы. Этот фермент каскада в виде комплекса С4Ь2аЗЬ фиксируется на особом участке клеточной мембраны, не совпадающем по своей локализации с местом фиксации первого компонента, включая Cis (рис. 41). Тем самым на мембране клетки-мишени при классическом пути активации комплемента формируются два каталитических центра с различными по специфичности протеиназами.

С появлением С5-конвертазы на поверхности клет- кп-мишенп начинает собираться так называемы i мемб- ранатакующпн комплекс, состоящий из пятого ——девятого компонентов комплемента. Место фиксации этого комплекса на клетке-мишени не совпадает в пространстве с упомянутыми выше каталитическими центрами (рис. 41).

Активация С5 (молекулярная масса 206 000)—процесс, подобный процессу активации С4 и СЗ (см. рис. 40). От одной из полипептидных цепей С5, a-цепи, отщепля-

ется пептид (G5a) с молекулярной массой 11 000. Остальная часть молекулы, С5Ь-фрагмент, способна связываться соответствук^цими структурами цитоплазматической мембраны. Пос\е фиксации С5Ь на мембране к нему присоединяются С6 и С7. Оба они связываются с фиксированным на мембране С5Ь без каких-либо каталитических превращений. Сформировавшийся тримолекуляр- ный комплекс С5Ь—С7 фиксирует С8, а затем шесть молекул С9. Общая молекулярная масса декамолекуляр- ного комплекса достигает 106. Все его компоненты, за исключением С5, в ходе активации не подвергаются каталитическим превращениям. Но появление у них способности в составе комплекса атаковать мембрану несомненно связано с внутримолекулярными конформационными превращениями, происходящими, очевидно, уже после их фиксации на мембране.

Если последовательно формировать из очищенных компонентов мембранатакующнй комплекс, три молекулярный комплекс ——С5Ь——С7 не повреждает мембраны. Но после присоединения С8 начинается медленно протекающий процесс цитолиза, который значительно усиливается в присутствии о-фенантро」нлнна или 2,2-дппири- дина. В модельных опытах показано, что липидный бислой холестерина и сфингомиелина дезорганизуется после того, как к комплексу С5Ь—С7 добавляют С8. С9 только усиливает действие С8. На основе всех данных, включая электронно-микроскопические, представляется, что вклинившийся в мембрану комплекс С5Ь—С7 позволяет С8 войти в непосредственный контакт с мембраной, вызвать дезорганизацию ее регулярных структур и, наконец, привести к образованию спиралевидных трансмембранных каналов, которые подобны каналам, образуемым в клеточной стенке антибиотиком грамицидином А.

Альтернативный путь активации

Из сказанного выше следует, что эффекторная дуга каскада реакций, именуемых активацией комплемента, реализуется после появления' продукта распада третьего компонента системы, а именно СЗЬ. Благодаря ферментативным свойствам этого компонента (С5-конвертаза) возможно формирование мембранатакующего комплекса С5b—С9. Кинетические исследования показывают, что лнмнтнрующнм фактором при реализации основного эф-

фекторного механизма системы комплемента, его цитолитического действия, является СЗЬ. Поскольку собственно СЗ содержится в плазме кровн в концентрациях, намного превышающих содержание других компонентов комплемента (см. табл. 9), субстратных ограничений для образования СЗЬ в значительных количествах не существует. Существует также возможность активации СЗ с образованием СЗЬ не только с помощью СЗ-конвертазы классического пути (см. раздел 8.2), но и СЗ-конвертазы так называемого альтернативного пути.

Альтернативным рассматриваемый путь активации комплемента называют в силу того, что для появления фермента, активирующего СЗ, не требуются первые три компонента классического пути: Cl, С4 и С2. Кроме того, инициация реакций альтернативного пути, ведущая к активации СЗ, может происходить без участия комплекса антиген-антитело. Впервые концепция активации комплемента без участия иммунного комплекса была сформулирована Л. Пиллемером (L. Pillemer) в 1954 г. В основу ее было положено наблюдение, что какой-то из белков сыворотки, взятой от нормальных индивидуумов, способен взаимодействовать с разнообразными полисахаридами и липополисахаридами, что обеспечивает актнваинк> комплемента. Этот белок, названный пропердином (Р)> обладает активностью только в присутствии Mg2+ п требует для участия в активации комплемента помощи двух других белков — фактора D, чувствительного к обработке гидразином, и фактора В. Ниже мы рассмотрим свойства каждого из белков, участвующих в реализации альтернативного пути.

Пропердин (Р)—сывороточный белок с молекулярной массой 220 000 и электрофоретической подвижностью, близкой к гамма-глобулину. Нативный пропердин образует высокодиссотшрующле комплексы с СЗЬ. После активации (см. ниже) сродство пропердина к СЗЬ возрастает. Нативный и активированный пропердин состоят из идентичных субъединиц (четырех) и не отличаются друг от друга по электрофоретической подвижности, N- н С-концевым аминокислотам. Следовательно, активация связана с конформационными превращениями этого белка, не обусловленными отщеплением фрагментов, как это происходит при активации СЗ п ряда других компонентов. Субъединицы пропердина связаны только нековалентно, в силу чего их диссоциация достигается в солянокислом гуанидине. Удаление последнего сопровождает-

Рис. 42. Петля усиления альтернативного пути связывания комплемента (зачернена)Рис. 42. Петля усиления альтернативного пути связывания комплемента (зачернена)

Рис. 42. Петля усиления альтернативного пути связывания комплемента (зачернена)

Рис. 42. Петля усиления альтернативного пути связывания комплемента (зачернена)

ся образованием димеров, обладающих примерно 50% активности нативного белка.

Фактор В ——сывороточный белок с молекулярной массой 100 000 и электрофоретической подвижностью р-гло- булина. Молекула об )азована одной полипептидной цепью. Его содержание в сыворотке довольно велико —— 200 мкг/мл. В прнсутств»! СЗЬ и Mg2+ фактор В способен с небольшой скоростью расщеплять СЗ до СЗЬ. Его

активность резко возрастает после расщепления с помощью активированного фактора。(力).Образующийся фрагмент ВЬ имеет молекулярную массу 80 000 и электрофоретическую подвижность у* глобулина. Он активен только в комплексе с СЗЬ, и именно этот комплекс: СЗЬВЬ характеризуется свойствами СЗ-конверта- зы альтернативного пути. Следует подчеркнуть, что фактор В является структурным и функциональным аналогом С2. По пер-

вичной структуре фактор В гомологичен аминоконцевой части a-цепи С2а, т. е. активированного С2 со свойствами СЗ-конвертазы. В состав входит 550 аминокислотных остатков, причем по ряду особенностей первичной струк

туры это типичная сериновая протеиназа.

Фактор D — в активной форме (D) является конвер- тазой СЗ проактнватора. Это одноцепьевая сериновая протеиназа с молекулярной массой около 24 000. Под влиянием D происходит образование ВЬ, а вслед за этим бимолекулярного комплекса СЗЬВЬ. В норме в плазме крови содержится активированный фактор D, что обеспечивает в присутствии следовых количеств СЗЬ возможность генерировать с помощью комплекса СЗЬВЬ новые количества СЗЬ за счет расщепления СЗ (рис. 42). Тем самым 方 принимает участие в образовании петли усиления (amplification loop), обеспечивающей высокую эффективность превращения СЗ — ключевого компонента альтернативного пути. Что касается пропердина, открытие которого положило начало изучению альтернативного

пути, то его функция заключается в стабилизации комплекса СЗЬВЬ. Связываясь с СЗЬ, пропердин повышает устойчивость его комплекса с ВЬ, очевидно, за счет конфор- мирующего влияния на белок.

Каков механизм инициации альтернативного пути активации комплемента? Прежде всего необходимо перечислить вещества, способные активировать комплемент альтернативным путем. Это полисахариды бактериального и растительного происхождения, ЛПС из грамотрицательных бактерий, инулин, агароза, сефадекс (поперечно сшитый декстран). Другая группа активирующих субстанций (практически не изученных в химическом отношении) находится на поверхности вирусных частиц, инфицированных вирусами клеток, опухолевых клеток, паразитов. Активацию альтернативного пути обеспечивают комплексы антигена с антителами классов IgA и IgE, не имеющих, как известно, эффекторных центров для Clq, неспецифически агрегированный IgG и комплексы F (abz)2-фрагментов антител с антигеном (Н. Miiller — Eberhard, R. Schreiber, 1980; К. Reid, R. Porter, 1981). Наконец, активация комплемента по альтернативному пути происходит под влиянием эритроцитов кролика (но не других эритроцитов). Некоторые белки, появляющиеся в сыворотке человека при патологии, также активируют комплемент по альтернативному пути. В их числе так называемый нефритический фактор, присутствующий в крови больных хроническим гломерулонефритом.

Как увязать многообразие факторов, активирующих систему комплемента по альтернативному пути, с очевидным фактом ключевой роли СЗЬ в инициации всего каскада реакций? В настоящее время представляется, что -СЗЬ непрерывно образуется спонтанно, поскольку тпо- эфнрные связи в нативном СЗ чувствительны к спонтанному гидролизу (рис. 43). Экспериментально доказано (М. Pangburn et al., 1980, 1981), что скорость гидролиза этих связей составляет в физиологических условиях 0,2—— Q4%/q. Образующийся продукт, обозначенный СЗ(НгО), подвергается медленной поэтапной тргшсс^ориатл вплоть до конформации, характерной для СЗЬ. В какой- то момент появляется короткоживущий комплекс СЗ(Н2。)с фактором В, обладающий свойствами СЗ-коп- вертазы. Последний уже обеспечивает появление СЗЬ ферментативным путем. Роль активаторов заключается в таком случае в фиксации СЗЬ. Следствием этого является предохранение СЗЬ от инактивации в жидкой фазе

КомпонентКомпонентМолекулярная масса, да.чьтоиМолекулярная масса, да.чьтоиС1гС1гCisCis83000830008300083000\н、\н、*сосн*сосн5600056000сТгсТг5600056000С1гС1г\Нэ\Нэ—, СООгГ—, СООгГ

Компонент

Компонент

Молекулярная масса, да.чьтои

Молекулярная масса, да.чьтои

С1г

С1г

Cis

Cis

83000

83000

83000

83000

\н、

\н、

*сосн

*сосн

56000

56000

сТг

сТг

56000

56000

С1г

С1г

\Нэ

\Нэ

—, СООгГ

—, СООгГ

и создание тем са^нм условий для генерации все новых количеств СЗЬ согласно описанному выше механизму (см. рис. 42).

Образование активного фрагмен^^(помечен ч?сзлочкой)

S-S

10800010800034000 Л、м-т^34000 Л、м-т^£4000С2а~£4000С2а~■СООН■СООНфактор Вфактор ВФакюр D1Факюр D1Фактор 11Фактор 11920009200025000250008800088000NH.NH.32000 , Ва32000 , Ва、皿 50000、Н Г、皿 50000、Н Г60000вь60000вь*соон*соон、h、一-♦ cоон、h、一-♦ cоон^^—*соон^^—*соон

108000

108000

34000 Л、м-т^

34000 Л、м-т^

£4000С2а~

£4000С2а~

■СООН

■СООН

фактор В

фактор В

Факюр D1

Факюр D1

Фактор 11

Фактор 11

92000

92000

25000

25000

88000

88000

NH.

NH.

32000 , Ва

32000 , Ва

、皿 50000

、Н Г

、皿 50000

、Н Г

60000вь

60000вь

*соон

*соон

、h、一-♦ cоон

、h、一-♦ cоон

^^—*соон

^^—*соон

--S

Сериновые протеннлы. учас1вуютис в активации и контроле сиоемы комплемента.

Рис. 43. Структурное подобие ряда компонентов классического “альтернативного путей связывания комплемента и фрагментов, обра-зующихся при их активации

Регуляторные белки системы комплемента

Несколько белков, содержащихся в сыворотке крови, способны с большой избирательностью инактивировать протеиназы, появляющиеся в процессе активации комплемента.

Ингибитор Cl (Cl INH)—одноцепьевой белок с молекулярной массой 105000; до 35% его массы составляют углеводы. 11нгпбитор связывается быстро, прочно и необратимо с легкой цепью Cis, входящего в состав три- молекулярного комплекса Clqrs. В результате С1 утрачивает ферментативную активность, что исключает протекание последующих стадий активации комплемента по классическому путн. Связываясь с С1, ингибитор, кроме того, диссоциирует тримолекулярнын комплекс. В результате высвобождается Clq, фиксированный иммунным комплексом.

Инактиватор СЗЬ (СЗЬ IN А, или фактор /) — белок с молекулярной массой 93 000, состоящий из двух цепей, объединенных дисульфидной связью. СЗЬ INA расщепляет a-цепь СЗЬ, находящегося в свободном виде, но не способен гидролизовать его в составе бимолекулярного комплекса СЗЬВЬ, являющегося СЗ-конвсртазой альтернативного пути активации. Следует отметить, что под действием СЗЬ INA не происходит отщепления от СЗЬ никаких пептидов, кроме СЗс (см. рис. 40). Отщепление еще одного фрагмента от a-цепи СЗ, а именно C3d, происходит под действием протеиназ, не входящих в систему комплемента, например плазмина.

Инактивация С4Ь н С5Ь, связанная с дальнейшим гидролизом a-цепей этих компонентов, осуществляется с помощью особых протеиназ. Одна из них — фактор / способна быстро расщеплять в двух местах a-цепь С4, но только после того, как этот компонент свяжется с особым кофактором: С4-связывающим белком. Это самый большой по молекулярной массе белок системы комплемента (около 600 000), образованный десятью идентичными полппептиднымп цепями.

Бета-1-H (p-1-H)1 ——белок с молекулярной массой 150 000, обладает свойством вытеснять ВЬ из комплекса—СЗЬВЬ. Это благоприятствует расщеплению свободного СЗЬ с помощью фактора /. Существенно, что фактор / эффективно расщепляет СЗЬ как в жидкой фазе, так в связанной форме только в присутствии фактора Н. Фактор Н регу/шрует также связывание активированного С5 на клеточной мембране, препятствуя тем самым формированию мембранатакующего комплекса.

В последнее время обозначают как фактор ".

Помимо фактора Н в процесс фиксации мембраната- кующего комплекса вмешивается так называемый белок S. Этот гликопротеин с молекулярной массой 88 000 способен подобно сывороточному липопротеину низкой плотности связываться комплексом С5Ь67, конкурируя за центр, посредством которого этот тримолекулярпый комплекс связывается с клеточной мембраной (см. рис. 41).

Биологически активные пептиды

Классический путь активации комплемента связан с появлением продуктов протеолиза С4, С2, СЗ и С5. Фрагменты С4Ь, С2а, СЗЬ п С5Ь вовлечены в каскад реакций собственно системы комплемента. В то же время низкомолекулярные фрагменты — СЗа н С5а обладают независимой биологической активностью. Совокупность присущих им свойств дала основание назвать их анафилатоксинами. Указанные фрагменты способны вызвать высвобождение гистамина из тучных клеток, обеспечить направленную миграцию (хемотаксис) полиморфноядерных лейкоцитов, вызвать сокращение гладкой мускулатуры. При внутрикожном введении СЗа и С5a быстро вызывают отек и покраснение (эритема) в связи с нарушением проницаемости сосудов, их расширением и, как следствие, нарушением гемодинамики. Активность пептидов очень велика: эффективная доза СЗа составляет 2Х 10-12 моль, а С5а ——10-15 моль.

СЗа обладает молекулярной массой приблизительно 9000 и является, как указывалось, N-концевой частью «-цепи СЗ. Пептид образован 77 аминокислотными остатками, в число которых не входят триптофан и свободные сульфгидрильные группы. Согласно данным циркулярного дихроизма 40—45% цепи закручено в а-спнраль. Для сравнения отметим, что в СЗ содержится не более 10% а-спиральных структур, а в СЗЬ их вовсе нет. Это может означать, что расщепление а-цеп и СЗ сопровождается конформационным переходом отделившегося пептида, что приводит к увеличению в его молекуле доли регулярной а-спиральной структуры.

Активность СЗа в значительной степени связана с С-кониевым аргинином. Его отщепление карбоксипептидазой В приводит к полной потере биологической активности, хотя каких-либо изменений вторичной структуры при этом не возникает. Следовательно, С-конце вой аргинин входит в состав активного центра СЗа.

Интересно, что в молекуле С5а, пептиде, сходном по функции с СЗа, С-концевой аминокислотой также является аргинин. И в этом случае его отщепление карбоксипептидазой лишает С5а биологической активности. Молекула С5a подобно СЗа имеет около 40% а-спиральных структур. Третичная структура С5а стабилизирована дисульфидной связью. В присутствии 2-меркаптоэтанола активность пептида резко снижается наряду с уменьшением степени его спирализации. После удаления восстановителя структура и функция С5а спонтанно восстанавливаются.

Карбоксппептпдаза В является естественным инактиватором анафилатоксннов СЗа и С5а. Так как этот сывороточный фермент инактивирует также брадикинин, его обозначают как кининазу 1.

Эффекторные функции системы комплемента

Выше мы уже познакомились с двумя эффекторными функциями системы комплемента: цитотоксическим действием и общим патофизиологическим эффектом анаф1ыатокспнов: СЗа и С5а. Эти эффекторные функции системы комплемента реализуются при участии антител любого класса в комплексе с любым поливалентным антигеном. Действительно, формирование мембран- атакующего комплекса С5а6789 и появление анафилаток- синов СЗа II С5а происходит при активации комплемента п классическим, п альтернативным путем.

Протеиназы, появляющиеся при активации комплемента, несмотря на их субстратную специфичность, способны активировать другие ферментные системы крови: систему свертывания и систему кннннообразования. Основная роль здесь принадлежит, по-вндимому, СЗЬ. Связь СЗЬ с системой свертывания крови заключается в том, что под действием СЗЬ изменяется поверхность тромбоцитов, которые участвуют в активации факторов свертывания крови.

Взаимодействуя с комплексом антиген-антитело, компоненты системы комплемента способны изменять физикохимические свойства этого комплекса и, таким образом, влиять на его судьбу в организме. Способность комплемента увеличивать степень дисперсности (уменьшать степень агрегации) иммунных комплексов была впервые продемонстрирована Г. Миллером и В. Нюссенцвейгом

(G. Miller, V. Nussenzweig, 1975). Среди компонентов комплемента этими свойствами обладают, очевидно, СЗЬ II Clq. Первый из упомянутых компонентов реагирует с Fab-участком молекулы. В этом случае при оптимальных условиях приблизительно 200 молекул СЗЬ присоединяются на 1000 молекул IgG пли F(ab')2 в составе иммунного комплекса (К. Gadd н К- Reid, 1981). Увеличение степени дисперсности иммунного комплекса после присоединения СЗЬ обусловлено скорее всего увеличением степени его гидратации. Менее очевидны причины увеличения степени дисперсности иммунных комплексов после присоединения Clq. По-видимому, из-за больших размеров молекулы Clq создаются стерические препятствия для наиболее эффективного «сшивания» антителами молекул антигена.

Присоединение Clq к иммунному комплексу, образованному с участием IgG-антител, препятствует его связыванию Fc-рецепторами клеток селезенки и перитонеальных такрофагов (А. Кульберг и др., 1985). Причины этого феномена обсуждаются в гл. 6. Очевидным следствием уменьшения сродства иммунных комплексов к Fc-pe- цепторам фагоцитов будет уменьшение эффективности их фагоцитоза.

Благодаря наличию на различных клетках рецепторов для модифицированного третьего компонента комплемента (СЗЬ II C3d) иммунные комплексы, связавшие модифицированный СЗ, способны через него фиксироваться на клеточной поверхности. Феномен получил название иммунного прикрепления (immune adherence) (D. Nelson, 1963). К числу клеток, несущих рецепторы для СЗ (C3R), у человека относятся эритроциты, полиморфону клеары (нейтрофилы и эозинофилы), макрофаги и В-лимфоциты. Фиксация иммунного комплекса на C3R требует связывания комплексом только СЗ и протекает без участия двухвалентных катионов. Строение C3R обсуждается в гл. 9.

Связывание иммунных комплексов фагоцитами через C3R служит фактором, благоприятствующим их захвату клетками. Если иммунный комплекс фиксирован на поверхности фагоцита, но не может быть поглощен клеткой, последние высвобождают наружу содержащиеся в лизосомах ферменты (этот процесс обозначают как эк- зоцитоз). Свойством секретировать содержащиеся в клетке вещества (прежде всего биогенные амины: гистамин и серотонин) под влиянием иммунного комплекса, при-

крепившегося к клетке через C3R, обладают также тромбоциты. Однако C3R выявлен пока что только на тромбоцитах грызунов. Иммунные комплексы можно заменить в экспериментах с тромбоцитами какими-либо частицами, покрытыми СЗ, например клеточными стенками дрожжей (последние эффективно связывают СЗЬ).

Хотя факт фиксации на поверхности В-лимфоцитов комплексов антиген-антитело, связавших СЗЬ, безусловно доказан, значение этого феномена в иммунологических реакциях не очевидно: модельные опыты показали, что иммунные комплексы, фиксированные через C3R на лимфоцитах, быстро высвобождаются с клеточной поверхности при 37° С в присутствии избытка СЗ. Этот феномен связан, очевидно, с появлением большого избытка СЗЬ в результате активации СЗ альтернативным путем. Не удивительно поэтому, что введенные в кровоток комплексы антиген-антитело, хотя и фиксируются первоначально на циркулирующих в крови лимфоидных клетках, исчезают с их поверхности в течение первых пяти минут (G. Miller, V. Nussenzweig, 1975). Эти данные служат одним из примеров того, как ошибочно переносить результаты опытов in vitro на целостный организм без специальных экспериментов in vivo.

Хемотактические свойства активированных компонентов комплемента проявляются у С5а, гемолнтическп неактивного комплекса С5Ь67, содержащегося в жидкой фазе, и у ВЬ в составе комплекса СЗЬВЬ (СЗ-конверта- за). С5а вызывает миграцию нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов, а комплекс С5Ь67 только нейтрофилов. Эти свойства активированных компонентов комплемента в сочетании со свойством анафилатоксина (СЗа или С5а) увеличивать проницаемость сосудов и вызывать их расширение определяют их роль в развитии воспаления — важнейшей приспособительной реакции естественного иммунитета, направленной на ограничение действия повреждающих факторов, будь то физические (тепловое или ультрафиолетовое облучение), химические или биологические (токсины микробного и растительного происхождения) и др. Роль отдельных компонентов системы комплемента в реализации различных эффекторных функций проиллюстрирована на рис. 44.

Из предыдущего изложения ясно, что система комплемента играет значительную роль в регуляции гомеостаза и в том числе в естественной резистентности организма к различным воздействиям. Исследована также роль

системы комплемента и ее отдельных компонентов в специфической реакции на антиген. Так, М. Пепис (М. Pepys, 1976) обнаружил, что введение мышам так называемого фактора из яда кобры (CoF) подавляет продукцию антител на тимусзависимые антигены. CoF имеет непосредственное отношение к системе комплемента, так

Рис. 44. Биологические реакции, возникающие при активации системы комплемента:

Аг — антиген, Ат — антитело

как, влияя на активность ферментов альтернативного пути, он способен резко снижать в организме содержание СЗ. Вслед за этим наблюдением были предприняты усилия оценить в культуре клеток селезенки влияние СЗ и продуктов его активации на первичный иммунный ответ. Оказалось, что собственно СЗ и антисыворотка против него влияют на антигензависимый синтез антител, усиливая и подавляя его соответственно.

Недавно Л. Черноусова с соавторами (1982—1984) получили свидетельства в пользу того, что Clq участвует в регуляции процесса перекгтючения иммунологических реакций с клеточных на гуморальные и наоборот. Как указывалось в гл. 1, при иммунизации таким тимусзави- симым антигеном, как эритроциты барана, на пике первичного иммунного ответа около 2% клеток селезенки способны специфически связывать антиген. Примерно 70% этих клеток (морфологически относящихся к」нм-

фоцитам) связывают антиген за счет сорбированных ими комплексов антиген-антитело (см. гл. 6). После инкубации с Clq эти клетки утрачивают антигенсвяэывающие свойства. В свою очередь, показано, что Clq инактивирует супрессоры реакции гнперчувствительностп замедленного типа (ГЗТ). Чувствительные к Clq клетки находились в селезенке мышеи, иммунизированных эритроцитами барана, в дозе, оптимальной для продукции антител (5Х Ю7—5х 108 клеток).

Клетки-супрессоры ГЗТ принадлежат к числу лимфоцитов, сорбировавших иммунные комплексы (<Л. Черноусова и др., 1980—1984). Отсюда можно заключить, что Clq инактивирует супрессоры ГЗТ, поскольку взаимоде!!- ствует с иммунными комплексами на их поверхности. А все вместе это означает, что Clq способен влиять на течение такой реакции клеточного иммунитета, как ГЗТ.

Биосинтез компонентов комплемента

Трудности высокочувствительной индикации отдельных компонентов комплемента создали проблемы для точной оценки места их синтеза. Лишь в последнее время с получением моноспецифических, а также моноклональных антител против компонентов комплемента стало возможным приступить к решению проблемы.

В настоящее время не вызывает сомнения, что важная роль в синтезе ключевых компонентов как классического, так и альтернативного путей активации комплемента прпнад/ежнт клеткам моноцитарно-фагоцитарной системы: собственно макрофагам н полиморфноядерным лейкоцитам. Так, макрофаги синтезируют Clq, С4, С2, СЗ, С5, пропердин, факторы В и D. Клетки паренхимы печени, вероятно, синтезируют СЗ, С5 и С9. Способы изучения синтеза компонентов комплемента можно проследить на примере Clq.

Перитонеальные макрофаги мыши культивируют в среде, содержащей все аминокислоты, кроме глицина (элективная среда). В среду добавляют меченный 14С глицин и через различные промежутки времени определяют содержание в культуральной среде радиомеченого Clq. Последний извлекают из среды с помощью иммобилизованных на сефарозе антител кролика против Clq мыши. Как видно из рис. 45 (Н. Н. Кулагина и др., 1985),

скорость синтеза Clq макрофагами возрастает во времени, что предполагает цндуцибельный характер его синтеза. Одним из индукторов синтеза Clq в организме служит агрегированный IgG, о чем убедительно свидетельствуют, в частности, опыты, выполненные 11. Тархановой с соавторами (1984).

Hns—--工n 域卷odG三巨言\ i •Hne-B-n QZOHH^m --J qEJOHgnE'XDOnpDdHns—--工n 域卷odG三巨言\ i •Hne-B-n QZOHH^m --J qEJOHgnE'XDOnpDd4勿4勿Hns- UEn 〕n8ndn三2CLU一x£=~lbe-cOM三Hamnho- 0"7 ^EJ^SCSSHns- UEn 〕n8ndn三2CLU一x£=~lbe-cOM三Hamnho- 0"7 ^EJ^SCSS00咎咎4 /4 %4 /4 %Время после инъекции, уВремя после инъекции, у

Hns—--工n 域卷odG三巨言\ i •Hne-B-n QZOHH^m --J qEJOHgnE'XDOnpDd

Hns—--工n 域卷odG三巨言\ i •Hne-B-n QZOHH^m --J qEJOHgnE'XDOnpDd

4勿

4勿

Hns- UEn 〕n8ndn三2CLU一x£=~lbe-cOM三Hamnho- 0"7 ^EJ^SCSS

Hns- UEn 〕n8ndn三2CLU一x£=~lbe-cOM三Hamnho- 0"7 ^EJ^SCSS

0

0

咎

咎

4 /4 %

4 /4 %

Время после инъекции, у

Время после инъекции, у

Рис. 45. Синтез Clq пе-ритонеальными макро-фагами мыши, культиви-руемыми in vitroРис. 45. Синтез Clq пе-ритонеальными макро-фагами мыши, культиви-руемыми in vitroРис. 46. Изменение биосинтеза Clq у мыши, получившей однократную инъекцию аналога иммунного комплекса —— агрегированного при 63℃ IgG

Рис. 45. Синтез Clq пе-ритонеальными макро-фагами мыши, культиви-руемыми in vitro

Рис. 45. Синтез Clq пе-ритонеальными макро-фагами мыши, культиви-руемыми in vitro

Мышам вводили однократно внутривенно агрегированные при 63° С изологичные иммуноглобулины (аналоги комплекса антиген-антитело). Спустя различные промежутки времени оценивали содержание в плазме радиомеченого Clq (за 4 ч до каждого взятия крови внутривенно вводили радиомеченый глицин; указанный срок соответствует максимальному включению радиоактивной аминокислоты во вновь синтезированный Clq). После введения агрегированных иммуноглобулинов синтез Clq быстро возрастает и только спустя 48 ч возвра-

щается к норме (рис. 46). Параллельно оценивали общее содержание в плазме Clq с помощью метода радиальной иммунодиффузии (см. гл. 12), используя антитела против Clq мыши.

Как следует из рис. 47, сразу после введения агрегированных иммуноглобулинов содержание Clq в крови резко снижается, что можно объяснить его связыванием

Рис. 47. Содержание Clq (по методу Манчини) в плазме крови мыши после инъекции аналога иммунного комплекса — агрегированного при 63℃ IgG

иммуноглобулинами в форме агрегата. Затем содержание Clq увеличивается и превышает в течение нескольких суток нормальные значения. Из этих опытов несомненно следует, что агрегаты иммуноглобулинов, имеющих эффекторные центры для Clq, способны усилить синтез этого компонента комплемента. В этой связи значительный интерес представляют данные тех же авторов, согласно которым после иммунизации мышей оптимальной дозой эритроцитов барана синтез Clq на короткий срок усиливается (рис. 48). Очевидно, ускорение синтеза Clq у иммунизированных животных совпадает с появлением у них в циркуляции иммунных комплексов, связывающих Clq.

мунизации^ суткимунизации^ суткиРис. 48. Изменение содержания Clq в плазме крови мыши по- гле иммунизации эритроцитами барана (5Х Ю8 клеток)Рис. 48. Изменение содержания Clq в плазме крови мыши по- гле иммунизации эритроцитами барана (5Х Ю8 клеток)

мунизации^ сутки

мунизации^ сутки

Рис. 48. Изменение содержания Clq в плазме крови мыши по- гле иммунизации эритроцитами барана (5Х Ю8 клеток)

Рис. 48. Изменение содержания Clq в плазме крови мыши по- гле иммунизации эритроцитами барана (5Х Ю8 клеток)

Иммунные комплексы, вероятно, регулируют синтез не только Clq, но и С2, а возможно, и других компонентов комплемента (Me. Phadden et al., 1981, 1982).

Основным органом, участвующим в синтезе СЗ, С6, С8 и фактора В, служит печень. По крайней мере 90% всего количества этих компонентов, содержащихся в крови, синтезировано клетками печени. В синтезе участвуют собственно гепатоциты. Опухолевые клетки печени человека Нер2 синтезируют в культуре и секретируют функционально активные Clr, Cis, С2, СЗ, С4, С5, фактор В, С1-ингибитор, фактор /, небольшие количества С6 и С8. Вместе с тем не установлена продукция клетками печени Clq, С7 и С9 (С. Alper, F. Rosen, 1981). Кроме упомянутых типов клеток в синтезе компонентов комплемента участвуют фибробласты (С1 и СЗ) и эпителиальные клетки (С1).

Многоцепьевые компоненты комплемента синтезируются в виде одноцепьевого предшественника. Это было установлено для С4, СЗ и С5. Одноцепьевые предшественники найдены в лизатах клеток гепатомы, а также при изучении синтеза С4 в бесклеточной системе гомогенатов клеток печени. Про-С4 обладает молекулярной массой, равной 200 000. После ограниченного протеолиза про-С4, как и про-СЗ и про-С5, превращался в мно- гоцепьевой белок. Процесс «созревания» предшествует секреции белка клеткой. И тем не менее до 3% от общего количества белков системы комплемента присутствует в крови в виде одноцепьевых предшественников.

При патологических состояниях, связанных с продолжительным периодом персистенции в организме иммунных комплексов, синтез компонентов комплемента, взаимодействующих с иммунным комплексом, как, по-види- мому, и других компонентов комплемента, существенно изменяется. Это было продемонстрировано при оценке 189

скорости синтеза и общего содержания Clq у мышей (NZB/\ZW)Fi разного возраста (А. Кульберг и др., 1985). У этих мышей в возрасте 6——8 месяцев наблюдается выраженная аутоиммунная патология и, в частности, продукция антител против нативной ДНК, собственных эритроцитов и тимоцитов (см. также гл. 2 и 11). При сравнительном определении общего содержания Clq в плазме мышей (NZB/\ZW)Fi в возрасте 8 месяцев и 1 месяц оказалось, что у первых его количество крайне невелико: по крайней мере в 4 раза ниже, чем у молодых мышей той же липин. Напротив, скорость биосинтеза Clq у взрослых новозеландских мышей была значительно большей, чем у молодых. Новообразованный Clq, как было показано, находится преимущественно в связанной форме в составе иммунных комплексов.

Приведенные сведения представляют интерес в двух аспектах. Во-первых, они служат подтверждением предположения, что Clq и, очевидно, другие компоненты комплемента синтезируются под контролем индукторов, важнейшим из которых, вероятно, является комплекс антиген-антитело. Во-вторых, представляется обоснованным следующее заключение. При заболеваниях, связанных с персистенцией иммунных комплексов, из-за большой продукции Clq последний насыщает эти комплексы. Поэтому их элиминация фагоцитами затруднена вследствие экранирования Clq компонентом эффекторных центров IgG для Fc-рецепторов (см. раздел 6.2).

Интенсивное потребление комплемента происходит даже в норме, поскольку в норме непрерывно идет образование антител (например, к антигенам бактерий-симбионтов кишечного тракта), а следовательно, образуются иммунные комплексы. В силу этого компонентам комплемента присуща необычно высокая для сывороточных белков скорость катаболизма. При внутривенном введении высокоочищенных радиомеченых С4, СЗ, С5 и фактора В человека скорость их катаболизма составляет 2%/ч или 50 %/сутки. Для сравнения напомним, что IgG человека распадается на 50% за 21 день. Эти и другие приведенные в этом разделе данные свидетельствуют в пользу большой динамичности системы комплемента, что в еще большей степени повышает ее роль в регуляции гомеостаза.

Рецепторылимфоцитов

Лимфоциты содержат на своей поверхности рецепторные белки, способные в качестве лигандов связывать антигены, иммуноглобулины, компоненты системы комплемента, медиаторы иммунного ответа, различные гормоны. Некоторые виды рецепторов лимфоцитов- те же, что и у других клеток. Это относится не только к рецепторам для гормонов, имеющимся на клетках самых различных органов и тканей, но и Fc-рецепторам и рецепторам для комплемента. Так, Fc-рецепторы характерны для фагоцитов (макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты), клеток паренхимы печени, трофобластов плаценты. На многих типах клеток имеются рецепторы для комплемента (см. гл. 8). Однако только лимфоциты В- и Т-ряда синтезируют рецепторные белки, обеспечивающие специфическое связывание этими клетками антигенов. Поэтому основное внимание в этой главе будет уделено именно этому виду рецепторов.

Рецепторы для антигена

В-клетки. Наличие антигснсвязываю- щпх рецепторов иммуноглобулинового типа — характерный признак клеток В-ряда. У взрослых индивидуумов В-лимфоциты могут иметь антигенсвязывающие рецепторы, подобные по изотипу любому из известных сывороточных иммуно г л о б у л ино в: IgM, IgG, IgA, IgD, IgE. Каких-либо иммуноглобулинов, отличающихся по пзотппу от сывороточных иммуноглобулинов, лимфоидные клетки В-ряда не продуцируют. -

На поверхности индивидх^альной клетки (малого лимфоцита) могут быть представлены иммуноглобулиновые рецепторы не более двух пзотипов. В-лимфоциты, не являющиеся потомками клеток, контактировавших ранее с антигеном, обладают рецепторами двух пзотипов: Ig'l н IgD. В-лимфоциты, принадлежащие к дочерним клеткам

лимфоцитов, уже стимулированных антигеном, могут иметь рецепторы, соответствующие по пзотипу одному из подклассов IgG в сочетании с IgM или IgA, только IgA, IgG или IgE. Функционально эти лимфоциты относятся к клеткам иммунологической памяти. Принципиально важным является то, что предшественники лимфоцитов, несущих рецепторы изотипов IgG, IgA и IgE, имеют рецепторы изотипа IgM.

У мышей лимфоциты с рецепторами IgM-изотипа появляются на стадии эмбриона и локализуются в печени. К моменту рождения у мыши содержатся В-лимфоциты, экспрессирующие только этот изотип. Абсолютное число лимфоцитов, несущих иммуноглобулиновые рецепторы, у новорожденной мыши значительно меньше, чем у взрослой особи. Однако число антигенов, специфически распознаваемых лимфоцитами новорожденной мыши, приблизительно то же, что и у взрослой особи того же генотипа (N. Klinman et al., 1976—1980).

Ко второй-третьей неделе жизни плотность иммуноглобулиновых рецепторов на В-лимфоцитах мыши возрастает до 104—105 на одну клетку. Увеличение абсолютного числа иммуноглобулиновых рецепторов происходит в том числе за счет того, что клетки приобретают способность продуцировать помимо рецепторов изотипа IgM также рецепторы изотипа IgD. У человека В-лимфоциты, несущие рецепторы IgD-изотппа, появляются, очевидно, уже у плода. При этом находящиеся на поверхности одной клетки рецепторы изотипов IgM и IgD имеют один и тот же тип легкой цепи (х или 入)и одну и ту же антигенную специфичность (N. Warner, 1974; S. Fu, Н. Kun- ке1, 1974).

Период экспрессии рецепторов IgD-изотипа совпадает по времени с функциональным созреванием В-лимфо- цитов, а именно с их способностью превращаться под влиянием антигена и клеток-помощников: Т-хелперов и А-клеток в антителопродуцирующие клетки.

На стадии лимфобласта на поверхности клетки сохраняются иммуноглобулиновые рецепторы, хотя такая клетка уже способна секретировать иммуноглобулины (антитела) (F. Moddaber, A. Coons, 1971). Зрелые плазматические клетки, интенсивно продуцирующие и секретирующие иммуноглобулпны, лишены иммуноглобулиновых рецепторов.

Сам факт существования клеток, способных одновременно продуцировать иммуноглобулины как в секрети-

руемой форме, так и в форме ассоциированных с мембраной рецепторов, говорит о независимости путей синтеза секретируемых и ассоциированных с мембраной иммуноглобулинов. Этот вывод подтверждают два факта: структурные различия тяжелых цепей двух сравниваемых форм иммуноглобулинов в случае принадлежности их одному пзотипу, а также существование для мембранассоциированных им муноглобул инов собственной информационной РНК для тяжелых цепей (J. Rogers et al., 1980) и особых полисомальных комплексов (F. Melchers, 1980).

Тяжелые ц-цепи мембранассоцнпрованного IgM имеют ту же структуру, что и сывороточного IgM, за исключением С-концевого участка, расположенного за С4-доме- ном. В направлении С-конца этот отрезок цепи образован коротким связывающим участком из 12 гидрофильных аминокислотных остатков, за которым идет отрезок из 26 остатков (локализующихся внутри мембраны) и, наконец, С-концевой трипептид Lys — Vai — Lys — COOH, погруженный в цитоплазму (рис. 49). С-концевой участок 6-цепи и, по-видимому, тяжелых цепей других мембранассоциированных форм иммуноглобулинов построены однотипно. Во всех случаях между двумя гидрофильными отрезками находится гидрофобный участок, погруженный в мембрану клетки.

Как обсуждалось в гл. 5, структурные гены для тяжелых цепей содержат особый сегмент, контролирующих синтез мембраиассоциированной формы иммуноглобулинов. Он отделен от сегментов, контролирующих синтез доменов тяжелой цепи интроном.

Синтезируемые на особых полисомальных комплексах тяжелые цепи рецепторного IgM после объединения с легкими цепями образуют 8S мономеры, накапливающиеся в особых вакуолях. Последние морфологически и структурно отличимы от системы цистерн, куда поступают пептидные цепи и собираются из них секретируемые клеткой иммуноглобулины. 8S мономеры рецепторного IgM не объединяются в 19S пентамер. По-видпмому, это связано с особенностями строения С-концевых отрезков тяжелых цепей и отсутствием в вакуолях, где идет сборка 8S мономеров, J-цепей. Именно в форме 8S мономера рецепторный IgM встраивается в цнтоплазматниескую мембрану.

Одновременно с синтезом и встраиванием новых иммуноглобулиновых рецепторов с клеточной поверхности высвобождаются ранее синтезированные молекулы ре-

J/k2\ z\c

Мембрана

Цитоплазма

Рпс. 49. Строение рецепторного IgM В-лимфоцитов

цепторов. Время полуобмена (смена на 50%) иммуноглобулиновых рецепторов у малых лимфоцитов из селезенки неиммунпзированных мышей составляет 4—6 ч (Е. Vritetta, J. Lhr, 1972). С той же скоростью происходит обмен антигенсвязывающих рецепторов лимфоцитов из селезенки мышеи на 9-й день после иммунизации эритроцитами барана (Б. Юрин и др., 1976, 1977). Важен

факт, что скорость обмена иммуноглобулиновых рецепторов резко возрастает при активации лимфоцитов и превращении их в бласты (Е. Unanue, 1975).

Если обработать В-лимфоциты на холоду антииммуноглобул иновым и антителами, меченными флуорохромом, можно наблюдать в люминесцентном микроскопе равномерное краевое свечение большинства клеток. Из этого следует, что иммуноглобулиновые рецепторы достаточно равномерно распределены по поверхности клетки. Если в течение короткого срока проинкубировать при 37° С клетки, обработанные антителами против иммуноглобулинов, выявится различная степень неравномерности распределения рецепторных иммуноглобулинов: от мелких скоплений (patches) или полулуний, до расположенных на одном из полюсов клетки «шапочек» (caps). Это означает, что при 37° С бивалентные антииммуногло- булиновые антитела вызывают латеральные перемещения рецепторов по мембране. Такой эффект вызывает только бивалентные антииммуноглобулины пли их F(ab')2- фрагменты, но не одновалентные Fab'- или Fab-фрагменты. Следовательно, латеральная подвижность рецепторов возникает только после их «сшивания» между собой. Такую «сшивку» вызывают также поливалентные антигены или бивалентные гаптены, но не одновалентные гаптены, поэтому последние не вызывают перемещения рецепторов.

Если на поверхности лимфоцита находятся рецепторы двух изотппов (например, IgM и IgD), то с помощью моноспецифпческнх антиизотипическпх сывороток можно вызвать перемещение и формирование шапочек только из рецепторов одного изотппа, т. е. рецепторы каждого пзотппа не связаны между собой. Имму ноглобулиновые рецепторы структурно независимы и от других мембранных белков, например Fc-рецептора, 1а-антигена и др. (F. Loor, L. Forni, В. Pernis, 1972).

Перемещение иммуноглобулиновых рецепторов по клеточной поверхности требует энергетических затрат. Процесс можно подавить ингибиторами клеточного дыхания. .

Агрегаты рецепторов либо поглощаются лимфоцитом (engulfing), либо сбрасываются в среду (shedding). Вслед за этим на поверхности клетки появляются новообразованные рецепторы.

Поперечная «сшивка» иммуноглобулиновых рецепторов поливалентными лнгаюамн или бивалентными анти- 7* 195

иммуноглобулиновыми антителами — важный этап в активации лимфоцитов. Так, в частности, антиизотипиче- скпе антитела, добавленные к В-лимфоцитам, вызывают пл поликлональную активацию. В том случае, когда в качестве мишеней служат В-лимфоциты, взятые от донора, ранее иммунизированного каким-то антигеном, анти- 卩-антнтела способны, подобно антигену, стимулировать биосинтез антител (Т. Kishimoto, К. Ishizaka, 1975; S. Friedman et al., 1976). Но в этом случае будут стимулированы не только клетки иммунологической памяти к определенному антигену, но н все остальные В-лимфоци- ты. В результате активация лимфоцитов будет носить поликлональный характер. Такая поликлональная активация, сопровождающаяся продукцией больших количеств иммуноглобулинов, представляет собой сложный биохимический процесс. Одним из факторов, регулирующих его, служат циклические нуклеотиды. Накопившийся в первые часы после активации лимфоцитов циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) подвергается затем расщеплению фосфодиэстеразой цАМФ. Только при снижении уровня цАМФ возможна активация синтеза белка. При продолжительном увеличении в активированных клетках концентрации иАМФ они утрачивают способность к пролиферации и биосинтезу иммуноглобулинов. Сказанное выше служит основанием для понимания многих особенностей биологии лимфоцитов, в том числе феномена супрессии изотипа.

Если новорожденным мышам вводить регулярно мо- носпецифические антнте」а против IgM мыши (анти-ц), наблюдается полное подавление синтеза IgM п резкое снижение продукции IgG и IgA. Состояние иммунодепрессии можно поддерживать периодическим введением антн-卩.В противном случае постепенно начинает восстанавливаться сначала синтез IgG, IgA и вслед затем IgM (D. Manning, 1976). Подавление продукции иммуноглобулинов под действием антн-卩 обусловлено исчезновением В-лимфоцитов, несущих на своей поверхности IgM, IgG, IgE и IqA, а также плазматических клеток, продуцирующих эти им муногло б 5г л ины. Супрессия изотипа обусловлена наличием на поверхности В-лимфоцитов новорожденных мышеи рецепторного IgAI. Эти клетки служат мишенями для антп-ц. Поскольку их блокирование и элиминация исключают в дальнейшем продукцию не только IgM, но и иммуноглобулинов всех других классов, это доказывает, что В-лимфоциты с рецепторами IgM-

изотипа служат предшественниками клеток, продуцирующих 11 м м ун о гл обул и 11 ы всех других классов.

Кроме антн-卩 способностью подавлять продукцию иммуноглобулинов всех других классов обладают только антитела против IgD. Последние оказывают иммуносупрессивный эффект при введении новорожденным животным. Это не удивительно, если принять во внимание, что клетки новорожденных экспрессируют одновременно рецепторы изотипов М и D. Что касается антител против IgG (антн-丫)или IgA (анти-а), то они вызывают подавление продукции иммуноглобулинов только того изотипа, против которого они направлены.

Супрессия изотипа может быть воспроизведена в культуре клеток селезенки неиммунизированного донора. II в этом случае анти-[1-антитела подавляют антиген- зависимую продукцию антител различных классов (IgM, IgG, IgA), а анти-Y и анти-ct — только антител соответствующего класса. Отсутствие строгой специфичности проявляется лишь в случае испытания супрессивного действия антител против отдельных подклассов IgG: анти- IgGl-антнтена подавляют синтез как IgGl, так и IgG2, и наоборот (С. Pierce, 1972).

Считали, что Механизм супрессии пзотипа может заключаться в элиминации путем фагоцитоза лимфоцитов, прореагировавших с чужеродными антпизотипическими антителами. Процесс, очевидно, более сложен. Уже говорилось, что супрессия наблюдается лишь при действии антител на незрелые В-лпмфоциты. Причина этого установлена при культивировании 〃z vitro В-лимфоцитов эмбриона или новорожденного в присутствии анти-ц-анти- тел. Анти-ц-антитела вызывали быстрое исчезновение с поверхности клеток рецепторов IgM-типа. Этому предшествовал процесс агрегации рецепторов н образования «шапочек». Различие в поведении незрелых и зрелых В-лимфоцитов в присутствии анти-ц заключалось в том, что незрелые клетки на продолжительный срок (5 суток наблюдения) теряли способности ресинтезпровать рецепторы. Зрелые лимфоциты полностью восстанавливали эту способность через 48 ч после удаления анти-ц-аптптел (М. Raff, 1975; С. Sidman, Е. Unanue, 1975).

Влияние анти-|и-антител не ограничивается подавлением синтеза IgM-рецепторов, но затрагивает также процессы синтеза некоторых мембранассоцпированных белков, в частности 1а-антигена ( см. гл. 10), рецепторов для бактериального ЛПС (см. ниже). Существенно, что по-

добно анти-ц-антителам на незрелые В-лимфоцпты действует поливалентный антиген (разумеется, только на В-лимфоцнты, имеющие рецепторы к этому антигену) (С. Bruyns, 1976). Очевидно,《сшнвка» между собой иммуноглобулиновых рецепторов служит трансмембранным сигналом, который в незрелых клетках блокирует синтез рецепторов и других мембранных белков. Причиной этого может быть недостаточно эффективная регуляция в незрелых клетках процесса метаболизма цАМФ, вследствие чего его уровень после воздействия анти-р-антител остается продолжительное время высоким.

11ммуноглобулиновые рецепторы В-лимфоцитов достаточно строго рестриктированы по аллотипу, т. е. у гетерозиготного индивидуума иммуноглобулиновые рецепторы индивидуальной В-клетки имеют, как правило, легкие п тяжелые цепи одного аллотипа. Способность клетки экспрессировать полипептидные цепи иммуноглобулинов только одного из двух возможных аллотипов получила название аллельного исключения (S. Sell, 1977). Аллельное исключение не абсолютно, так как небольшое число В-лимфоцитов экспрессирует оба аллотипа, если эти клетки принадлежат гетерозиготным особям. Однако их число уменьшается после антигенной или митогенной стимуляции. Зрелые плазматические клетки синтезируют иммуноглобулины только одного аллотипа (см. гл. 1). Необходимо особо подчеркнуть, что лимфоциты способны экспрессировать неаллельные варианты генов, контролирующих аллотипическую специфичность разноименных полипептидных цепей. Так, в случае одновременной экспрессии двух изотипов (например, рецепторов IgM- п IgD-нзотнпов) иа поверхности лимфоцита выявляются аллотипические маркеры, характерные для ц- и 6-цепей (см. гл. 3).

Антитела против аллотипов легких н тяжелых цепей способны вызвать in vitro и in vivo супрессию аллотипа. Так, если до рождения гетерозиготные кролики с легкими цепями Ь4Ь5 получали от матери, имеющей аллотип Ь4 антн-Ь5-антнтела, у новорожденных было резко снижено содержание иммуноглобулинов с легкими цепями аллотипа Ь5 и В-лпмфоцитов с иммуноглобулиновыми рецепторами аллотипа Ь5 (S. Sell, 1976). Одновременно компенсаторно увеличивалось число клеток с рецепторами, содержащими легкие цепи противоположного аллотипа. Длительность супрессии достигала 15 недель.

В опытах in vitro показано, что преинкубация клеток

селезенки гетерозиготных доноров с антиаллотипически- мн антителами или их F(аЬ'')2-фрагментами приводит к подавлению продукции иммуноглобулинов с цепями су- прессируемого аллотипа. Было доказано, что плазматические клетки не являются мишенями для антиаллотипиче- ских антител. В качестве мишеней для них служат только лимфоциты, причем эффект антител не связан с их цитотоксическим действием на клетку.

Изучение механизма супрессии аллотипа позволило глубоко проанализировать механизмы дифференцировки В-клеток, роль в этом процессе регуляторных Т-клеток. На модели хронической супрессии аллотипа у мышей было установлено, что феномен супрессии связан с активацией определенной категории Т-супрессоров (L. Herzen- berg et al., 1967). Эти клетки подавляют активность Т-хелперов, необходимых для дифференцировки В-клеток с соответствующим аллотипическим маркером. Супрессоры реализуют свое действие за счет продукции гуморального супрессорного фактора. Вся система: Т-хелпер—Т-супрессор, по-впдпмому, специфична для каждого аллотипа. Действие антиаллотипических антител связано с активацией Т-супрессоров, контролирующих экспрессию данного аллотипа. При этом В-клеткп, способные к экспрессии данного аллотипа, не исчезают.

Крайне интересно в этой связи, что Т-клеткп способны, по-впдимому, экспрессировать гены, продукты которых сходны по своему строению VL-доменам (см. ниже). Возможно поэтому антиаллотипические антитела, направленные к маркерам, которые расположены в вариабельных участках молекулы иммуноглобулина, могут действовать на Т-клетки.

Помимо маркеров, характеризующих изотип и аллотип, иммуноглобулиновые рецепторы каждой индивидуальной В-клетки несут строго определенные идиотипические детерминанты. При этом индивидуальная клетка В-ряда экспрессирует только один идиотип вне зависимости от числа экспрессируемых пзотипов и аллотипов. Это означает, в частности, что все молекулы иммуноглобулиновых рецепторов, продуцируемых индивидуальными В-лпмфоцитами, имеют идентичные вариабельные районы легких и тяжелых цепей L Так, в случае экспрессии

Редкие случаи обнаружения В-лимфоцитов с нмм }т н or лоб ули- новыми рецепторами, направленными к разным антигенам, не обсуждаются нами.

В-лимфоцитом двух различающихся по изотипу иммуноглобулиновых рецепторов (например, IgM и IgD) и тот и другой идентичны по идиотипу. Это не удивительно, если вспомнить, что идиотипические детерминанты локализуются в вариабельных районах легкой и тяжелой цепей (см. гл. 3). Кроме того, в индивидуальной В-клетке, как правило, экспрессируется только один ¥ц- и один Vb-гены (см. гл. 5). А появление двух видов мРНК для тяжелых цепей, отличающихся по константным районам, но совпадающих по вариабельным, происходит в процессе сплайсинга (см. гл. 5).

Антитела, продуцируемые плазматическими клетками, имеют тот же идиотип, что и иммуноглобулиновые рецепторы родительских В-лимфоцитов.

Проблема идиотипической специфичности антиген- связывающпх рецепторов касается не только иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов, но и антигенсвя- зывающнх рецепторов Т-лимфоцитов, поэтому мы обсудим ее в следующем разделе.

Т-клетки. Все субпопуляции Т-лимфоцитов, как эффекторных, так и регуляторных, которые специфически взаимодействуют с антигеном н реагируют на него, несут на своей поверхности рецепторы для антигена. Эти рецепторы не имеют иммуноглобулиновой природы, поскольку клетки Т-ряда не способы синтезириовать им муноглобул ины. По-видимому, в некоторых Т-клет- ках функционируют гены, сходные с Vl- и JL-сегментами н Ун-сегментом генов для полипептидных цепей иммуноглобулинов, но об этом несколько позже.

В отличие от В-лимфоцитов не все субпопуляцин Т- лимфоцптов способны связывать водорастворимые антигены. Этими свойствами не обладают Т-хелперы и Т-киллеры. Рецепторы этих клеток распознают антигенную детерминанту в сочетании с детерминантами антигенов основного комплекса гистосовместимости, например макрофагов, процессировавших антиген (см. гл. 10). Напротив, Т-супрессоры, очевидно, имеют достаточно большое н поэтому убедитепьно регистрируемое сродство к растворимым антигенам и гаптенам. Сказанное выше объясняет причины значительных трудностей в химическом изучении структуры антигенсвязывающих рецепторов Т-лимфоцитов. Все же благодаря применению методов аффинной хроматографии (иммуносорбция) клеток на твердофазном сорбенте, содержащем известные гаптены,

удалось выделить антигенсвязывающие рецепторы Т-кле- ток, имеющих высокое сродство к гаптену (U. Krawinkel et al., 1977, 1979). Таким же способом были выделены антигенспецифические факторы, продуцируемые и секретируемые Т-супрессорами (Т. Tada, К. Okumura, 1979).

Принципиально важно, что, подобно иммуноглобулиновым рецепторам В-лимфоцитов и антителам, рецепторы Т-супрессоров и продуцируемых ими антигенспецифиче- ских супрессорных факторов совпадают по идиотипу и распознают одну и ту же детерминантную группу (U. Krawinkel, Н. Wigzell, Н. Binz, 1975—1980). Помимо идиотипических маркеров рецепторы Т-супрессоров несут аллотипические детерминанты, характерные для консервативных участков последовательности Vn-района. Вся совокупность этих данных позволяет заключить, что Т-супрессоры экспрессируют продукт Ун-гена, который входит в состав их антигенраспознающего рецептора.

Новые данные о строении антигенсвязывающих рецепторов Т-лимфоцитов получены в последнее время при изучении молекулярно-генетическими методами Т-клеток человека и мыши, в том числе гибридов Т-хелперов с клетками плазмацитомы. Такие клетки приобретают способность продуцировать в больших количествах белки, принадлежащие к числу рецепторных. Исследования, выполненные двумя научными коллективами на основе сходных методических принципов, дали во многом сходные результаты (Y. Yanagi et al., 1984; S. Hedrick et al., 1984). Из клеток выделяли очищенную мРНК, методом обратной транскрипции получали ее ДНКовую копию и анализировали нуклеотидную последовательность этой ДНК и первичную структуру белка, синтезированного при использовании указанной ДНК как матричной. Синтезированные полппептидные цепи имели два участка: вариабельный и константный. Вариабельный участок имел большую степень сходства первичной структуры с вариабельным участком легких цепей иммуноглобулинов. Краине интересно, что С-концевые участки пол и пептидных цепей указанных рецепторных белков Т-лимфоцптов человека п мыши имели сходство аминокислотных последовательностей, достигавшее 80%. Это свидетельствует о том, что в обоих типах клеток был идентифицирован один и тот же ген. Так как константные участки были сходны по своему строению с константными доменами иммуноглобулинов, авторы пришли к заключению, что рецепторные белки Т-лимфоцитов, обладающих хелпер-

ными функциями, подобны по своему строению легким цепям иммуноглобулинов. Вместе с тем эти белки имеют ряд особенностей, не позволяющих отождествить их с легкими цепями иммуноглобулинов. Кроме того, существуют несомненные отличия строения генов для этих белков н генов для легких цепей иммуноглобулинов. Дальнейпше исследования в этом направлении сулят важные результаты.

Так как идиотипические детерминанты представлены на В- п Т-лимфоцитах, последние могут стать мишенями для действия антиидиотипнческих антител. Как в опытах in vivo, так и при изучении биосинтеза антител в клеточных культурах с помощью антиидиотипнческих антител удается получить два противоположных эффекта: подавление продукции антител данного идиотипа (супрессия идиотипа) или усиление экспрессии того же идиотипа.

Супрессия идиотипа может быть результатом прямого воздействия антиидиотипнческих антител на В-клетки с рецепторами данного идиотипа или на Т-клетки, экспрессирующие тот же идиотип. Механизм супрессии различен в зависимости от возраста реципиента, дозы использованных антиидиотипнческих антител, их видовой принадлежности II эффекторных свойств. Как продемонстрировал К. Эйхман (К. Eichmann, 1974, 1975), для супрессии идиотипа обязательно наличие Fc-участка в молекуле антитела и благодаря этому способности фиксироваться на поверхности фагоцитов.

С другой стороны, антиидиотипические антитела способны усилить синтез антител данного идиотипа и даже в отсутствие антигена индуцировать их синтез. Это возможно, по данным К. Эйхмана и К. Раевского (К. Eichmann, К- Rajewski, 1975), при воздействии антиидиоти- пнческнх антител на клетки иммунологической памяти.

Для понимания биологической значимости феномена супрессии идиотипа важно то обстоятельство, что в организме происходит спонтанное образование антииднотипи- ческнх антител. Возникая при иммунизации, антиидиоти- ппческие антитела могут играть существенную роль в регуляции иммунного ответа и прежде всего в изменении идиотипической специфичности антител. Обобщив имеющиеся факты, Н. Ерне (N. Jerne, 1974) сформулировал так называемую теорию сети (network), отводящую аутологичным антиидиотипическим антителам важную роль в ауторегуляцпи иммунной системы.

Fc-рецепторы

В гл. 6 уже рассказывалось об Fc-pe- цепторах лимфоцитов и других типов клеток, обеспечивающих фиксацию на клеточной поверхности иммуноглобулинов различных классов. Сходные по функции Fc-рецепторы находятся на поверхности лимфоцитов, макрофагов, пOv^IIмopфIIo^IДepныx лейкоцитов, фибробластов, клеток паренхимы печени (гепатоциты), трофобластов плаценты и др. Однако не следует думать, что Fc-рецепторы всех этих клеток идентичны по своему строению. Об этом свидетельствуют данные, приведенные ниже в этом разделе.

В случае к」еток лимфоидного ряда Fc-рецепторы находят главным образом на малых лимфоцитах В-ряда. Лимфобласты того же ряда также несут Fc-рецепторы. Зрелые плазматические клетки не связывают иммуноглобулины через Fc-рецептор. Избирательность связывания им му ноглобул п нов Fc-рецепторамп отчетливо выражена, н перекрестные реакции могут быть только между отдельными подклассами. Поскольку классо- (подклассо-) специфические особенности строения иммуноглобулинов определяются строением константных участков тяжелых цепей, распознающие их Fc-рецепторы обозначают как Fs, Fj Fea, Fce.

Индивидуальный лимфоцит имеет Fc-рецепторы только одного типа и, следовательно, способен связывать иммуноглобулины только одного класса (подкласса). Антитела в составе иммунного комплекса также связываются Fc-рецепторами; они фиксируются значительно прочнее, чем иммуноглубины в монодисперсной форме (A. Basten et al., 1972, 1974).

Существует несколько, хорошо зарекомендовавших себя методов выявления Fc-рецепторов. Антитела определенного класса можно использовать для сенсибилизации такого корпускулярного антигена, как ксеногенные эритроциты. После смешивания избытка сенсибилизированных антителами эритроцитов с лимфоцитами образуются так называемые розетки: лимфоциты, окруженные эритроцитами (рис. 50). Число лимфоцитов, образующих розетки, соответствует числу лимфоцитов с Fc-рецепторами к иммуноглобулинам того класса, которые использовали для сенсибилизации эритроцитов. Если пометить ИММ V ног л о бу л ины с помощью флуорохрома, то лимфоциты с Fc-рецепторами можно увидеть по краевому свече-

нию с использованием люминесцентного микроскопа. При использовании радиомеченых иммуноглобулинов для выявления клеток с Fc-рецепторами используют технику радиоавтографии.

Fc-рецепторы не взаимодействуют с Fab- и F(ab')2- фрагментами и легкими цепями, но реагируют с изолированными Fc-фрагментами, полученными с помощью папаина. Последние способны конкурировать с нерасщеп-

Fc遶T*Агрегиро - 十 ванный IgGFc遶T*Агрегиро - 十 ванный IgGIIПП33FcFcСенсиЬмизи- =/ роЗанньЕ зр^^рзципСенсиЬмизи- =/ роЗанньЕ зр^^рзципРис. 50. Выявление FCy-реиепторов лимфоцитов (Л) с помощью радиомеченого агрегированногоIgG (/) или техники розеткообразования с использованием эритроцитов (Э), обработанных IgG-антителами (//)Рис. 50. Выявление FCy-реиепторов лимфоцитов (Л) с помощью радиомеченого агрегированногоIgG (/) или техники розеткообразования с использованием эритроцитов (Э), обработанных IgG-антителами (//)

Fc

遶T*

Агрегиро - 十 ванный IgG

Fc

遶T*

Агрегиро - 十 ванный IgG

I

I

П

П

3

3

Fc

Fc

СенсиЬмизи- =/ роЗанньЕ зр^^рзцип

СенсиЬмизи- =/ роЗанньЕ зр^^рзцип

Рис. 50. Выявление FCy-реиепторов лимфоцитов (Л) с помощью радиомеченого агрегированного

IgG (/) или техники розеткообразования с использованием эритроцитов (Э), обработанных IgG-антителами (//)

Рис. 50. Выявление FCy-реиепторов лимфоцитов (Л) с помощью радиомеченого агрегированного

IgG (/) или техники розеткообразования с использованием эритроцитов (Э), обработанных IgG-антителами (//)

ленными иммуноглобулинами соответствующего класса за Fc-рецептор.

Если на В-лимфоцитах обнаружены Fc-рецепторы к иммуноглобулинам всех классов, за исключением IgD, на Т-лимфоцитах человека найдены Fc-厂 и Рсц-рецепторы. Fcg-рецепторы характерны для Т-хелперов, a Fcv-peu.en- торы — для Т-супрессоров. Для Т-лпмфоцитов мышей характерны те же по специфичности Fc-рецепторы, что и для В-лимфоцитов.

При иммунизации число лимфоцитов, несущих Fc-рецепторы, возрастает. Так, при иммунизации мышеи эритроцитами барана число лимфоцитов с Рсг-рецепторамп возрастает в селезенке более чем в два раза. При заражении крыс нематодами Nippostrongylus brasiliensis, индуцирующими синтез антител IgE-класса, значительно возрастает число лимфоцитов, несущих Рсе-рецептор (Т. Honjo, 1982). В этой связи существенно, что в культуре лимфоидных клеток in vitro иммуноглобулины определенного класса, например IgE, IgA, индуцируют синтез лимфоцитами соответствующих Fc-рецепторов: Fce или Fca (К. Yoboi et al., 1982; Y. Gebel, 1982). Очевидно, сами иммуноглобулины служат индукторами для синтеза Fc-рецепторов.

Изучение природы Fc-рецепторов сопряжено со значительными трудностями, обусловленными изоляцией этих ассоциированных с мембраной клетки белков без их деградации. Наиболее перспективны методы аффинной хроматографии, когда переведенные с помощью детергента в раствор рецепторы связывают на иммобилизованных агрегированных иммуноглобулинах. Несмотря на известную противоречивость полученных данных, большинство исследователей сходятся на том, что Fc-рецепторы представляют собой гликопротеины с молекулярной массой около 50 000—60 000. Хотя в ряде случаев выделяли более тяжелый материал, он представлял собой, видимо, димеры или более интенсивно агрегированные рецепторы. Не исключено, что Fc-рецептор состоит из нескольких идентичных субъединиц, связанных дисульфидными мостиками или нековалентно. Значительный интерес представляют данные, что Fc-рецептор, по крайней мере для одного из подклассов IgG мыши (IgG2b), ассоциирован с ферментом —фосфолипазой Аг, причем активность последней существенно возрастает при взаимодействии Fc-рецептора с иммуноглобулином (Т. Suzuki et al., 1982). Возможно, такой комплекс, встроенный в мембрану клетки, обеспечивает трансмембранную передачу сигнала после связывания клеткой иммуноглобулинов через Fc-рецсп- тор. В самом деле, расщепляя фосфоэфирные связи, играющие крайне важную роль в организации цитоплазматической мембраны, активированная через посредство Fc-рецептора фосфолипаза способна обеспечить, в частности, локальное впячиванпе мембраны.

Здесь мы переходим к проблеме функциональной роли Fc-рецепторов клеток иммунной системы. К настоящему времени только в одном случае доказана роль Fc-рецептора лимфоцитов в иммунологических реакциях, а именно, в зависимой от антител клеточной цитотоксичности (см. гл. 6). Лимфоциты, участвующие в реакции, имеют Fc-рецептор, но лишены ряда маркеров, характерных для В-лимфоцитов. Их относят к «нулевым» клеткам, 〃/〃 К-клеткам (killer cells). Феномен, впервые продемонстрированный Г. Мёллером (G. Moller, 1972), состоит в цитотоксическом действии К-клеток на клетки-мишени, сенсибилизированные IgG-антителами. ^-клeтки прикрепляются к клеткам-мишеням через Fc-участок молекулы антитела. Реакцию блокируют Fc-фрагменты. Описанный процесс может реализоваться in vivo при аутоиммунных заболеваниях н опухолевом

росте. Он может иметь существенное значение при некоторых инфекционных заболеваниях, связанных с внутриклеточным паразитизмом бактерий, грибов, простейших, когда некоторые антигены возбудителя экспрессированы на поверхности зараженной клетки макроорганпзма: например, пастереллезе, кандидозе, лейшманиозе.

Вопрос о роли Fc-рецепторов макрофагов и других клеток в иммунологических реакциях рассматривался в 1'л. 6. Здесь следует лишь сказать, что сравнительное изучение строения рецепторов лимфоцитов и макрофагов оказалось полезным инструментом для понимания организации их молекул. Из-за трудностей, связанных с накоплением достаточного количества материала для химического изучения особое значение при исследовании структуры Fc-рецептора приобрел метод антигенного анализа. Приведем схематически результаты такого анализа, выполненного И. Сычевой с соавторами (1982, 1983).

К изолированным аффинной хроматографией Fc-pe- цепторам клеток селезенки мыши получали антитела на кроликах. Эти антитела и их Fab- и F(abz)2-фрагменты обладали способностью экранировать рецептор, препятствуя взаимодействию с ним агрегированного IgG, меченного радиоактивным иодом. Fab-фрагменты анти- FcR-антнтел экранировали также Fc-рецепторы перитонеальных макрофагов мыши. После адсорбции препарата Fc-фрагментов с помощью макрофагов в препарате оставались еще фрагменты антител против FcR-лимфоцитов селезенки. Это позволяет заключить, что при иммунизации клетками селезенки образуются по крайней мере две группы антител: одни против FcR-лимфоцитов, другие —— против FcR-макрофагоподобных А-клеток. Так как после адсорбции макрофагами экранирующее действие Fab- фрагментов нз aHTH-FcR-антнтел в отношении рецепторов лимфоцитов уменьшалось, значит в каждом из изучаемых Fc-рецепторов есть две группы антигенных детерминант. Одна из них сходна или даже идентична у Fc-рецепторов лимфоцитов и макрофагов. Вторая — специфична для каждого вида рецепторов.

В развитие описанных исследований было сделано важное наблюдение: антитела против Clq мыши реагируют с Fc-рецептором лимфоцитов и макрофагов мыши, и наоборот. При изучении реакции анти-РсЙ-антптел (а точнее их Fab-фрагментов) с Clq было установлено, что обработанный фрагментом Clq способен фиксироваться комплексом антигена с IgG-антнтеламн, но, будучи свя-

зан комплексом, не способен фиксировать Clr-Cls и обеспечивать тем самым иммунный гемолиз. Как описано в гл. 8, Clq связывается с IgG своими глобулярными областями (головками), а фиксация С1г и Cis происходит коллагеноподобной областью молекулы Clq (или стеблем). Это послужило основанием для заключения, что в молекуле Fc-рецептора, как и в молекуле Clq, существует коллагеиоподобный участок. То, что часть антител против Fc-рецептора и Clq реагирует перекрестно с коллагеном (II. Сычева и др., 1983, 1984), служило еще одним подтверждением указанного заключения. В его пользу свидетельствуют также данные М. Лууза (М. Loos, 1980) о подавлении синтеза Fc-рецепторов в присутствии ингибиторов метаболизма оксипролпна, содержащегося, как известно, в коллагене. Наконец, на это указывали данные аминокислотного анализа очищенного Fc-рецептора одной из перевиваемых лимфоидных линий, выявившего необычно высокое содержание в этом белке пролина, глицина и лизина (Т. Suzuki, 1981). В свете всех этих данных представляется, что молекула Fc-рецептора состоит из двух частей, одна из которых глобулярная, а другая — коллагеноподобная. Заманчиво предположить, что коллагеноподобная часть сходна у Fc-рецепторов, экспрессируемых различными клетками, а глобулярная, посредством которой связывается Fc-участок иммуноглобулина, уникальна.

СЗ-рецептор

На поверхности лимфоцитов, макрофагов и некоторых других клеток (например, эритроцитов и тромбоцитов некоторых биологических видов, клеток паренхимы почек) находятся рецепторы для модифицированного третьего компонента комплемента. Модифицированными принято называть образующиеся при активации СЗ фрагменты: СЗЬ и C3d (см. гл. 8).

Выявление рецепторов для модифицированного СЗ осуществляют с помощью техники розеткообразования, напоминающей технику выявления Fc-рецепторов (см. раздел 9.2). Используют эритроциты, сенсибилизированные субагглютиннрующей дозой IgG-антител (рис. 51). К ним прибавляют очищенные первый, четвертый, второй и третий компоненты комплемента. Сенсибилизированные эритроциты инициируют активацию классического пути связывания комплемента (см. гл. 8). Образуется

комплекс сенсибилизированных антител с активирован- ннмн Cl, С4, С2 и СЗ. К этому комплексу можно прибавить еще очищенные белки, участвующие в дальнейшем расщеплении СЗЬ, а именно СЗЬ-инактиватор (C3hJNA, или фактор /), а также 0IH. Посколь-

Рис. 51. Выявление рецепторов, к активированным компонентам комплемента техникой розеткообразования. А — получение тест-ре- агентов: эритроцитов с фиксированными на их поверхности различными комплексами активированных компонентов комплемента и регуляторных белков; Б — формирование комплекса лимфоцита, имеющего рецепторы для активированных компонентов комплемента с эритроцитами, связавшими комплемент (С'):

Э — эритроцит, Л — лимфоцит

ку при участии двух последних компонентов и какой-либо сериновой протеиназы (например, плазмина) идет распад СЗЬ до СЗс и C3d, последние, будучи связанными с сенсибилизированными эритроцитами, образуют еще два реагента для выявления СЗ-рецепторов. Добавтяя указанные комплексы к лимфоцитам или другим клеткам-

мишеням, можно получить ризеткн (разумеется, если на клетке есть соответствующий рецептор).

Как следует из табл. 10, В-лимфоциты (человека) имеют рецепторы для СЗЬ, C3bINa, C3d, pIH. Помимо лимфоцитов подобными рецепторами обладают эритроциты и лейкоциты.

Таблица 10. Рецепторы для комплемента на клетках крови человека

Клетки крови

Рецепторы для:

СЗЬ

C3bINA

C3d

Bih

В-лимфоциты

++

++

Моноциты

+ +

Нейтрофилы

++

Эозинофилы

—

++

Эритроциты

—

—

—

Рецептор, связывающий СЗЬ, представляет собой гликопротеин, который удалось очистить из солюбилизированных детергентом мембран эритроцитов, В-лимфоцитов и моноцитов человека с помощью аффинной хроматографии и некоторых других методов (D. Fearon, 1980). Очищенный белок обладает свойством ингибировать образование розеток между эритроцитами, покрытыми СЗЬ, и различными клетками, несущими СЗЬ-рецептор, включая В-лимфоциты. Изолированный рецептор утрачивает это свойство после обработки нейраминидазой или перпода- том, в то время как инкубация с трипсином или краткосрочное прогревание при 85° С не приводило к его инактивации. Это свидетельствует об определяющей роли углеводного компонента в связывании рецептором СЗЬ. Более того, удалось установить, что реакцию между рецептором и СЗЬ блокируют D-глюкоза, D-галактоза, D-фукоза, L-фукоза и D-ксплоза. L-глюкоза, L-галактоза, L-ксилоза и D-манноза не влияли на реакцию. Следовательно, СЗЬ-рецептор принципиально отличается не только от антигенсвязывающих рецепторов лимфоцитов, но л от Fc-рецептора, поскольку активность последнего определяется именно его белковой частью (Т. Suzuki, 1981).

Молекулярная масса СЗЬ-рецептора окончательно не установлена. Полученные различными авторами величины колеблются от 55 0000 до 205 000. Поскольку очищен-

ный СЗЬ-рецептор лимфоцитов обладает молекулярной массой 50 000, можно предположить, что эта величина соответствует минимальной функциональной единице рецептора для комплемента.

По-видимому, СЗЬ в форме димера или более крупного агрегата способен активировать in vitro ряд биохимических процессов в лимфоцитах, макрофагах и тучных клетках. Он увеличивает включение 3Н тимидина в ДНК, усиливает клеточное дыхание, способствует высвобождению ряда ферментов (р-галактозндазы, дезаминазы)т хемотаксических факторов (М. Dierich, 1983).

Интерес к функциональной роли СЗЬ-рецептора В-лимфоцитов в нммунном ответе определяется тем, что этот рецептор начинает экпрессироваться В-лимфоци- тами мыши примерно к 14-му дню после рождения в период функционального созревания В-клеток. Именно в этот период под влиянием антигена В-лимфоциты способны превратиться в антителопродуцирующие клетки.

Посредством СЗЬ-рецептора на поверхности лимфоцита могут фиксироваться иммунные комплексы, связавшие комплемент. При этом существенное значение имеет содержание комплемента в среде. В случае избытка комплемента при 37° С происходит быстрое высвобождение с поверхности лимфоцитов иммунных комплексов, фиксированных через СЗЬ (см. гл. 8). Только будущие исследования позволят достоверно оценить функциональную роль различных по специфичности рецепторов для модифицированного СЗ (см. рис. 51).

Другие рецепторы

К настоящему времени получены убедительные доказательства существования на В-лимфопн- тах рецептора для липополисахарида (ЛПС) из грамот- рицательных бактерий. Связываясь с этим рецептором, ЛПС в качестве поликлонального митогена активирует В-лимфоциты.

В-лимфоциты активируются на поликлональной основе также а-1,3-декстраном и имеют, видимо, рецепторы для этого полисахарида. Распознавание указанного вида декстрана весьма специфично, так как а-1,6-декстран нс активирует В-лимфоциты (A. Coutinho et al., 1980).

На лимфоцитах Т- и В-ряда находятся рецепторы для некоторых белков растительного происхождения, облада-

Ю1цих митогенным действием. К числу этих митогенов относятся фитогсмагглютинин (ФГА), конканавалии А (КонА) и многие другие белки. Помимо митотичсскои активности у этих бел ков выражено свойство агглютинировать лимфоциты и некоторые другие клетки (прежде всего эритроциты). Общее наименование этих соединений ——лектины было предложено еще в 40-х годах В. Бойдом (W. Boyd). Клеточные рецепторы для лектинов содержат углеводный компонент, определяющий их специфичность. Лектины способны взаимодействовать с разнообразными гликопротеинами, в том числе с теми иммуноглобулинами, содержание углеводов в молекуле которых достаточно велико. В частности, иммобилизованный на сефарозе КонА связывает имм 5гн огло б ул ины класса А.

Т- и В-лимфоциты различаются по набору рецепторов для лектинов. Так, ФГА обладает митогенной активностью только для Т-лимфоцитов, а КонА, действуя преимущественно на Т-лимфоциты, способен активировать и В-лимфоциты (J. Stobo, 1972).

Известно несколько сообщений о наличии на поверхности лимфоцитов человека рецептора для Clq компонента комплемента. Ксеногенные эритроциты, «нагруженные» Clq, образуют розетки с лимфоцитами, находящимися в циркуляции (A. Tenner, N. Cooper, 1980, 1981; R. Gupta et al., 1978). Каких-либо достоверных сведений о природе и функциональной роли рецепторов не получено.

Некоторые вирусы имеют высокое сродство к лимфоцитам. Так, вирус Эпштейн-Барр (EBV), вызывающий инфекционный мононуклеоз, связывается всеми лимфоцитами из крови и миндалин человека, имеющими иммуноглобулиновые рецепторы и рецепторы для третьего компонента комплемента. Практически все эти клетки принадлежат к В-лимфоцитам. Не исключено, что рецептором для этого вируса служит рецептор для СЗЬ. Действительно, моноклональные антитела к этому рецептору способны препятствовать фиксации EBV на лимфоцитах. К инслу вирусов, имеющих специфическое сродство к Т-лимфоцитам, относятся вирусы корн и герпеса.

Индукция и регуляция иммунного ответа

Процессы, протекающие с момента поступления антигена в организм до появления в периферических лимфоидных органах антителопродуцирующих клеток и антигенреактивных Т-лимфоцитов, относят к индуктивной фазе иммунного ответа. В этот период происходят протекающие с участием макрофагов (А-клеток) превращения антигена в высокоиммуногенную форму, активация Т-лимфоцитов, регулирующих иммунный ответ и, наконец, антигензависимая дифференцировка предшественников антителопродуцир5гющих клеток и эффекторных Т-лимфоцитов.

Процессинг антигена

Переработка антигена в макрофагах (процессинг антигена) служит необходимым условием для реализации тимусзависимого иммунного ответа —— как гуморального, так и клеточно-опосредованного. Роль макрофагов в антигенспецифической активации Т-лимфоцитов убедительно демонстрируют опыты ш vitro. Для этого используют взвесь клеток селезенки или лимфатического узла, из которой удалены А-клетки, что легко осуществить благодаря способности этих клеток прикрепляться к поверхности стекла пли пластика при 37° С. Лимфоидные клетки остаются при этом во взвеси. Если к лимфоидным клеткам, свободным от А-клеток, добавить антиген и культивировать их в полноценной питательной среде, ни цитологическими методами, ни по включению 3Н-тимидина в ДНК не удается зарегистрировать пролиферации Т-лимфоцитов. Она наступает только после добавления сингенных А-клеток. При этом А-клетки (или макрофаги) не удается заменить интенсивно фагоцитирующими сегментоядерными лейкоцитами (нейтрофилами) и, например, хорошо прикрепляющимися к стеклу или пластику фибробластами.

Процесс захвата и переработки растворимого антигена макрофагами протекает в две стадии. Первая — может протекать при температуре ниже 37° С и не требует энергетических затрат. Этот процесс состоит в неспецифической адсорбции молекул антигена на цитоплазматической мембране. Вслед за этой фазой наступает вторая——зависимая от температуры. Если на этой стадии макрофаги поместить в среду без глюкозы, содержащую 2-дезоксиглюкозу и азид натрия (вещества, блокирующие анаэробное и аэробное дыхание соответственно), процессинг антигена не произойдет, и макрофаги окажутся неспособными активировать Т-лимфоциты. В свою очередь, если после адсорбции антигена на поверхности макрофагов при 4° С проинкубировать клетки с трипсином, произойдет десорбция антигена, однако макрофаги сохранят способность связать новую порцию антигена. Но если обработку трипсином произвести после адсорбции антигена при 4° С и последующей инкубации клеток при 37° С, то удалить антиген с клеточной поверхности не удастся. Антиген находится в такой форме, что нечувствителен к действию протеиназы и не может быть экранирован антителами к нему для рецепторов Т-лимфоцитов (A. Rosenthal, 1978). Все это указывает на несомненные конформационные превращения антигена в ходе температурозависимой фазы процессинга.

Описанные выше эксперименты выполняли с использованием в качестве антигенов глобулярных белков. Антигенные детерминанты последних, распознаваемые антителами и иммуноглобулиновыми рецепторами В-лимфоцитов, практически целиком относятся к числу конформационнозависимых (см. гл. 2). Закономерно предположить, что в ходе процессинга антигена в макрофагах конформационнозависимые детерминанты разрушаются. Сохраняются лишь детерминанты, распознаваемые Т-хелперами, структура которых мало зависит от пространственной конформации нативного белка (см. гл. 2).

Достоверно установлено, что макрофаги, проинкубированные прп 37° С с антигеном, способны присоединять к себе лимфоциты, образуя ш vitro клеточные скопления—кластеры. В том случае, когда с макрофагами, обработанными данным антигеном, взаимодействуют лимфоциты, полученные от животного, иммунизированного тем же антигеном, клетки образуют устойчивый кластер, не разрушающийся в течение 24—72 ч. Оба типа клеток должны также иметь родство по 1-району основного ком-

плекса гистосовместимости. Кластеры не разрушаются под действием трипсина. Лимфоциты, входящие в состав кластера, принадлежат к Т-клеткам, в составе кластера они начинают пролиферировать.

В зависимости от природы антигена для пролиферации Т-лимфоцитов в кластерах необходимо совпадение макрофагов н лимфоцитов либо по одному (I-A), либо по

Рис. 52. Процессинг антигена в макрофагах. А — молекула антигена в фаголизосоме после захвата макрофагом; Б — слияние лизосомы, содержащей фрагменты молекулы антигена, с цитоплазматической мембраной макрофага:1а — белок, Д1 и Д2 — фрагменты молекулы антигена с разными детерминантамиРис. 52. Процессинг антигена в макрофагах. А — молекула антигена в фаголизосоме после захвата макрофагом; Б — слияние лизосомы, содержащей фрагменты молекулы антигена, с цитоплазматической мембраной макрофага:1а — белок, Д1 и Д2 — фрагменты молекулы антигена с разными детерминантами

Рис. 52. Процессинг антигена в макрофагах. А — молекула антигена в фаголизосоме после захвата макрофагом; Б — слияние лизосомы, содержащей фрагменты молекулы антигена, с цитоплазматической мембраной макрофага:

1а — белок, Д1 и Д2 — фрагменты молекулы антигена с разными детерминантами

Рис. 52. Процессинг антигена в макрофагах. А — молекула антигена в фаголизосоме после захвата макрофагом; Б — слияние лизосомы, содержащей фрагменты молекулы антигена, с цитоплазматической мембраной макрофага:

1а — белок, Д1 и Д2 — фрагменты молекулы антигена с разными детерминантами

двум (I-A и I-C) субрайонам 1-района основного комплекса гистосовместимости (рис. 52). Например, в случае такого антигена, как миоглобин, пролиферативный ответ Т-лимфоцитов требует совпадения макрофагов и лимфоцитов по двум субрайонам, если идет речь об ответе на два антигенных фрагмента: с 1-го по 32-й остатки и с 1-го по 53-й остатки. При совпадении только по одному субрайону удается получить пролиферативный ответ Т-лимфоцитов только на процессированный макрофагами фрагмент с 1-го по 55-й аминокислотные остатки.

Как уже указывалось в гл. 2, Ir-гены контролируют ответ на тпмусзависимые антигены, поскольку генетически детерминированные различия иммунного ответа определяются строением участка молекулы антигена, являющегося носителем детерминантных групп (в случае конъюгированных антигенов). Эти детерминанты распознают Т-хелперы, но прежде они должны быть представлены (презентированы) макрофагами. Значит, функция генов иммунного ответа (Ir-генов) реализуется скорее всего на уровне макрофагов, представляющих антиген Т-клеткам. В этой связи большой интерес представляют следующие опыты.

Изучали способность макрофагов морских свинок линий 2 и 13 и их Fi-гибридов процессировать инсулин свиньи и активировать затем Т-хелперы. В случае макрофагов линии 13 активация Т-хелперов, необходимая для продукции антител против инсулина или на присоединенные к его молекуле динитрофенильные группы, зависит от строения аминоконцевого пептида р-цепи (пепти 工 включает 16 аминокислотных остатков). Макрофаги линии 2 не способны представлять указанный фрагмент инсулина лимфоидным клеткам. В этой связи существенно, что пептид с 1-го по 16-й остатки p-цепи и даже с 5-го по 16-й ——определяет специфическую пролиферацию Т-хелперов в той же мере, как и вся молекула инсулина. Следовательно, в пределах пептида, ограниченного 5-м — 16-м остатками p-цепи инсулина, находится та детерминанта этого антигена, которая после презентирования пептида макрофагами распознается Т-хелперами. При этом, по внднмому, только одна аминокислота в позиции 10 (гистидин) является критической для определения ответа Т-хелперов. С учетом сказанного выше и данных, изложенных в гл. 2, можно заключить, что Т-хелперы распознают очень маленькие фрагменты антигена, пространственную структуру которых трудно оценить. Число детерминант для Т-хелперов в молекуле белкового антигена существенно меньше числа детерминант, распознаваемых иммуноглобулиновыми рецепторами В-лимфоцитов, отвечающих на тот же антиген. Крайне существенно, что в пределах структуры, распознаваемой Т-хелперами, отсутствуют во многих случаях детерминанты для для антител и рецепторов В-лимфоцитов. Это служит объяснением того факта, что антитела против данного антигена не способны экранировать детерминанты процессированного макрофагами антигена, который распознают Т-хелперы.

Чем же определяется генетический контроль иммунного ответа на уровне представляющих антиген макрофагов? Как вытекает из данных генетического анализа, роль Ir-генов сводится к контролю синтеза 1а-белков (продуктов генов 1-района основного комплекса гистосовместимости) ,которые в мембране макрофага вступают в ассоциацию с фрагментами молекулы процессированного антигена.

1а-6е〃кн представляют собой неоднородную группу гликопротеинов, являющихся интегральными компонентами цитоплазматической мембраны макрофага, В-』нм-

фоцита, активированного Т-лимфоцита. Молекула образована двумя полипептидными цепями с молекулярными массами 33 000 и 28 000, обозначаемыми как а- и р-цспи; р-цепь (в большей степени неоднородная) кодируется структурным геном, локализованным в 1-А-субрайоне (В-ген), a-цепь — в зависимости от строения в I-A- или 1-С-субрайонах (а-ген).

В чем состоит генетическая рестрикция (от англ, restriction — ограничение) иммунного ответа на уровне макрофагов, представляющих антиген? В том, что образующиеся фрагменты молекулы антигена объединяются на поверхности макрофага с соответствующими 1а-бел- ками. Гипотетический механизм процесса изображен на рис. 52. Возникающую структуру распознают Т-лимфоциты. Их рецепторы связывают не только антиген, но и аутологичный la-белок. Действительно, если после процессинга антигена обработать макрофаги антителами против 1а-белка, такие клетки не способны активировать Т-лимфоциты.

Из рис. 52 следует, что на поверхности одного макрофага формируются комплексы la-белков с разными фрагментами молекулы антигена. Макрофаг способен представлять несколько различных антигенов или несколько различных фрагментов одного антигена. В силу того, что ответ на отдельные детерминанты даже одного антигена контролируется разными Ir-генами, различные антигенные детерминанты должны быть представлены в комплексе с разными 1а-6е』камн (продуктами Ir-генов). А из этого, в свою очередь, следует, что один и тот же макрофаг способен экспрессировать продукты различных Ir-генов, т. е. различные по строению ia-белкн.

Соответствующие 1а-6елкн образуют комплексы с разными фрагментами молекулы антигена (или разными антигенами). Но в таком случае необходимо постулировать, что взаимодействие la-белков с разными фрагментами антигена носит специфический характер, т. е. между ними должна существовать определенная комплемен- тарность (см. рис. 52). Вариабельность первичной структуры p-цепи 1а-6елка, как и в случае иммуноглобулинов, допускает существование значительного числа комплементарных структур, образуемых 1а-6елком (Н. Me Devitt, 1981).

Обсуждавшиеся выше проблемы являются однси из наиболее «горячих точек» современной иммунологии. Знакомя читателя с рядом фактов и гипотез, мы, в частности.

ставим перед собой цель побудить интерес к ознакомлению с текущей научной литературой в этой захватывающей воображение области молекулярной иммунологии.

Функция Т-хелперов

Макрофаги, несущие антиген, и находящиеся с ними в кластере Т-лимфоциты продуцируют гуморальные медиаторы, управляющие пролиферацией лимфоидных клеток. Один из таких факторов ——интерлейкин / (IL1)—белок с молекулярной массой около 15000—25 000, продуцируемый в небольших количествах покоящимися макрофагами. Его продукция резко возрастает, если макрофаги стимулированы. Стимулирующий эффект оказывает как собственно антиген, так и Т-лимфоциты, взаимодействующие с макрофагом на специфической основе. Интерлейкин 1 способствует пролиферативному ответу Т-клеток на антиген. В свою очередь, интерлейкин 1 индуцирует в Т-клстках фенотипа Ly 1+2~3- продукцию другого медиатора — интерлейкина 2 (IL2), который поддерживает уже начавшуюся пролиферацию Т-клеток под действием антигена (или митогена). Клетки указанного выше фенотипа, продуцирующие интерлейкин 2, относятся к Т-хелперам.

Значительный интерес представляет тот факт, что активированные антигеном или митогеном Т-клетки образуют рецепторы для интерлейкинов обоих типов. По- зтому действие антигена подготавливает клетку к действию интерлейкинов, которые уже поддерживают начавшийся процесс активации (S. Howie, W. Ale Bride, 1982).

Активированные Т-хелперы способны продуцировать антигенспецифический Т-хелперный фактор (TFh), который способен заменить Т-хелперы в культуре клеток in vitro и обеспечить в присутствии антигена активацию В-лимфоцитов. Указанный фактор не содержит структур, соответствующих константному участку тяжелой цепи иммуноглобулина, но он имеет идиотипические детерминанты, совпадающие по структуре с такими же детерминантами антител п иммуноглобулиновых рецепторов, и реагирует с антителами против ia-белка. Поэтому можно предположить присутствие в его структуре вариабельного участка тяжелой цепи и 1а-6епка. Видимо, описываемый фактор концентрируется на поверхности В-лимфоцита с помощью антигена.

Помимо TFh на В-лимфоциты действует продуцируемый Т-клетками (очевидно, хелперами) так называемый замещающий Т-клетки фактор (T-cell replacing fac- tor-TRF). Фактор представляет собой белок с молекулярной массой 40 000, который вовлечен в процесс анти- гензависимой дифференцировки В-лимфоцитов в антителопродуцирующие клетки. TRF — антигеннеспецифичен и может продуцироваться другими Т-клеткамп, нежели те, которые продуцируют специфический Т-хелперный фактор. Не исключено, что участие интерлейкинов в регуляции активности В-лнмфоцитов осуществляется при участии у-пнтерферона, синтез которого Т-хелперами стимулируют IL-2.

Перечисленные факторы, в изучение которых наибольший вклад внесли М. Тауссиг с соавторами (М. Taussig et al., 1978), А. Шимпль, Е. Веккер, Р. Гершон и др. (A. Schimpl, Е. Wecker, 1975; R. Gershon, С. Metzler, 1978), С. Мизель (S. Mizel, 1981, 1983), Дж. Уотсон (J. Watson, 1981, 1983), не единственные медиаторы кооперативного взаимодействия Т- и В-лпмфоцитов, описанные за весь период изучения проблемы. Исследования в этом направлении являются одной из «горячих точек». Полученные результаты открывают новые возможности для регуляции иммунологических реакций в норме и патологии. Этому будет несомненно способствовать получение на основе методов генной инженерии интерлейкинов и интерферонов. Практические шаги в этом направлении уже сделаны.

Достаточно ли участие гуморальных факторов (специфических и неспецифических) и антигена, чтобы обеспечить превращение В-лимфоцитов в антителопродуцирующие клетки? По-внднмому, нет. Существуют данные, что В-лпмфоциты можно разделить на две субпопулящш, одна из которых обязательно требует прямого взаимодействия с Т-хелперамп, чтобы превратиться в антптелопро- дуценты, а другая ——нет. Эти свойства коррелируют с экспрессией мембранного антигена, обозначенного как Lyb 5. Не имеющие его Lyb 5- В-клетки нуждаются в прямом взаимодействии, в то время как Lyb 5+ В-клетки могут обходиться без него (J. Asano, 1981). В чем сущность этих различий, пока не ясно. Но даже в том случае, когда прямой контакт не требуется, для реализации действия антигенспецифического Т-хелперного фактора нужны макрофаги.

Клеточно-опосредованная супрессия

Одновременно с активацией Т-хелперов антиген вызывает накопление и активацию другого класса регуляторных лимфоцитов — супрессоров. Подавляющая часть клеток-супрессоров принадлежит к Т-лпмфо- цитам. О них в основном пойдет речь в этом разделе. В конце его мы кратко остановимся на проблеме В-супрессоров.

Супрессия, осуществляемая Т-клеткамн, может быть специфической (только ответ на данный антиген) и неспецифической; т. е., подобно Т-хелперам, Т-супрессоры могут осуществлять антигензависимую и антигеннезави- симую регуляцию иммунного ответа.

Наиболее общие отличительные особенности Т-супрессоров и Т-хелперов состоят в следующем. Супрессорн удается обнаружить через короткий срок (48 ч) после иммунизации, причем первоначально в тимусе, а затем в селезенке. Хелперы первоначально выявляются в лимфоузлах и селезенке иммунизированного животного. Супрессоры существенно более чувствительны к радиационному облучению п действию таких цитостатиков, как циклофос- фан. Супрессоры и хелперы отличаются по антигенным маркерам. Хелперы принадлежат к фенотипу Ly 1+2一3一, супрессоры — к Ly L2+3+. Хелперы и супрессоры отличаются по строению антигенсвязывающих рецепторов и продуцируемых ими внеклеточных регуляторных факторов.

Появление первоначально в тимусе специфических Т-супрессоров служит одним из признаков того, что активация Т-супрессоров антигеном в отличие от Т-хелперов происходит, по-видимому, без уиастня макрофагов. Об этом также свидетельствует тот факт, что белковые антигены, не содержащие агрегатов и по этой причине неэффективно захватываемые макрофагами (см. также гл. 11), обусловливают появление Т-супрессоров. Видимо, антиген в свободном виде непосредственно стимулирует предшественники Т-супрессоров — Т-лимфоциты фенотипа Ly 1+2+3+.

Способность Т-супрессоров распознавать антиген и взаимодействовать с ним определяется наличием на поверхности этих клеток антигенсвязывающих рецепторов (данные о строении этих рецепторов обсуждались в гл. 9). Напомним лишь, что есть ряд признаков того, что тяже-

лая цепь рецептора Т-супрессоров кодируется Vn-геном (возможно, с участием D- и J-сегментов) и еще одним геном, не имеющим родства с Сп-генами. Тандем генов, кодирующих такую полппептидную цепь, может возникнуть в результате транслокации Vn-гена в другой локус хромосомы, чем тот, где находятся Сн-гены, или в результате переноса сегмента ДНК, содержащего Vn-ген, в другую хромосому (что допустимо с генетических позиций) .Предположение о том, что V-гены могут экспрессироваться не только в иммуноглобулинах, но и белках неиммуноглобулиновой природы (нашедшее теперь подтверждение при изучении рецепторов для антигена на Т-лимфоцитах), было высказано А. Кульбергом в 1975 г.

Специфическая супрессия иммунного ответа реализуется лишь в случае совпадения Т-супрессора и В-клетки по I-ранону генов основного комплекса гистосовместимости. Однако в отличие от В-лимфоцитов и Т-хелперов, экспрессирующих на своей поверхности белки, кодируемые I-A-субрайоном, Т-супрессоры экспрессируют детерминанты, кодируемые I-J-субрайоном. Эти белки, по-ви- 工нмому, ассоциированы на молекулярной основе с анти- генраспознающим белком, о чем свидетельствуют данные о строении продуцируемого Т-супрессорами фактора (факторов), обозначаемого как TsF (см. гл. 9).

Тонкий механизм специфической супрессии иммунного ответа изучен пока недостаточно. По крайней мере, одной из клеток-мишеней для Т-супрессоров (продуцируемых ими супрессорных факторов) служат Т-хелперьь

Значительный вклад в изучение внеклеточных факторов, продуцируемых Т-супрессорами, внесли М. Тауссиг (М. Taussig, 1975), Т. Тада с сотрудниками (Т. Tada et al., 1979, 1980) и др. Приведем одно из интересных с им- мунохимической точки зрения исследований Т-супрессор- ного фактора (L. Adorini, G. Doria, Р. Riccardi-Gasta- gnoli, 1982). Изучавшийся фактор подавлял у мышей ответ против лизоцима куриного яйца. Подавление было строго специфичным (фактор, в частности, не оказывал влияния на ответ против тринитрофенилированного лизоцима) .Фактор супресспровал ответ не против всей молекулы лизоцима, а только против детерминант, локализованных в N-концевой и С-концевой частях молекулы. Причем в отношении этих детерминант супрессия осуществлялась только при совпадении Т-супрессоров с другими клетками, участвовавшими в иммунном ответе по 1-району генов основного комплекса гистосовместимости.

Продуцируемые Т-супрессорами факторы неоднородны и по структуре, и по функции. Так, очищенные с помощью иммуносорбции факторы, взаимодействующие с азофениларсаниловой кислотой и подавляющие иммунный ответ на эту детерминанту, можно разделить на два основных типа. Один из них рестриктирован в отношении генов основного комплекса гистосовместимости (активен при совпадении клеток по I району), другой действует в обход барьера гистосовместимости. Наконец, есть супрессорный фактор, который распознает не антигенную детерминанту, а идиотипическую детерминанту антигенсвязы- вающих рецепторов В-клеток (возможно, и Т-хелперов).

Опосредованная Т-к」еткамн супрессия иммунного ответа может быть и неспецифической по отношению к антигену. Отвечающие за неспецифпческую супрессию клетки появляются в селезенке вскоре после антигенной стнмуляинн и обладают свойством подавлять иммунный ответ в опытах in vitro или in vivo на антигены, не имеющие родства с тем, который послужил индуктором супрессоров. Неспецифической Т-супрессии приписывают с достаточным основанием реализацию механизма подавления иммунного ответа на один антиген с помощью другого, не родственного первому антигену (R. Gershon, 1978; М. Taussig, 1978). Указанный феномен, получивший название феномена конкуренции неродственных антигенов, имеет не только теоретическое, но и несомненное практическое значение, так как благодаря ему при вакцинации многокомпонентными антигенами, входящими в состав вакцинных препаратов, одни антигенные компоненты вакцины могут препятствовать продукции антител на другие.

Супрессия антителами

После появления в ходе иммунного ответа антител последние сами по себе или в комплексе с антигеном начинают оказывать супрессирующее воздействие на биосинтез антител. Этот феномен можно продемонстрировать в модельных экспериментах, либо иммунизируя животных комплексами антиген-антитело, либо сочетая процедуру иммунизации с введением антител.

При иммунизации иммунными комплексами, приготовленными в избытке антитела, интенсивность иммунного ответа оказывается заметно меньшей, нежели при

введении только антигена пли комплексов антиген-антитело, содержащих молярный избыток антигена. Казалось бы, объяснение этому очень простое — антитела просто экранируют антигенные детерминанты, которые должны быть распознаны иммунокомпетентными лимфоцитами. Однако анализ феномена показывает, что супрессия наблюдается и в том случае, когда в иммунном комплексе экранированы не все детерминантные группы антигена. Более того, эффективность ингибирующего действия антител даже снижается, когда все или почти все детерминантные группы антигена экранированы (J. Uhr, G. Moller, 1968). Кроме того, иммуносупрессия наблюдается в том случае, когда для образования иммунного комплекса используют не целую молекулу IgG-антитела, а бивалентные Р(аЬ')2-фрагмснтн, хотя последние формируют преципитат и агглютинируют корпускулярные антигены (бивалентные фрагменты в 100—1000 раз менее эффективны в подавлении иммунного ответа, нежели нерасщепленные антитела, если из тех и других приготовить иммунные комплексы) (N. Sinclair, 1969).

IgG-антитела способны специфически подавить иммунный ответ, если они введены за 24—48 ч до антигена. Эффект наиболее выражен при первичном иммунном ответе на самые разнообразные по природе антигены: как корпускулярные, так н растворимые. Торможение выражается в полном отсутствии у пммунизировгнных животных IgM- и IgG-антител или значительном снижении их содержания. В лимфоидных органах резко снижено число антителопродуцирующих клеток. Оба эти факта указывают на то, что иммуносупрессия обусловлена в】на- нием введенных антител на процесс антигензавпсимсй пролиферации и дифференцировки В-лимфоцптов.

Специфичность иммуносупрессивного действия антител не очень велика. Так, например, при подавлении иммунного ответа на конъюгированный антиген моноклональными антителами против гаптена они способны также частично подавить продукцию антител против белка- носптеля (М. Briiggemann, К- Rajewsky, 1982). Другне факты свидетельствуют о том, что IgG-антитела подавляют иммунный ответ как в отношении экранированных, так и оставшихся свободными антигенных детерминант. Если допустить, что эти детерминанты доступны для антител в той же мере, что и для иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоиитов, необходимо заключить, что подавление иммунного ответа антителами происходит нс-

смотря на то, что антиген может быть распознан предшественниками антителопродуцирующих клеток п (или) регуляторными Т-лимфоцитами.

Прямое экранирование антителами детерминантных групп антигена, вероятно, не сложит единственным фактором, определяющим их участие в регуляции биосинтеза антител. Это вытекает из данных сравнительного изучения иммуносупрессивного действия IgG-антител и их F(ab')2-фрагментов. Если бы иммуносупрессивное действие антител сводилось к экранированию детерми- нантных групп антигена и агрегации последнего бивалентными антителами, то F(ab')2-фрагменты антител не отличались бы от нерасщеплепных антител по способности подавлять иммунный ответ. Однако при использовании препаратов фрагментов, тщательно очищенных от не- расщепленных антител, оказалось, что они почти в 1000 раз менее активны, чем нерасщепленные IgG-антитела. Причина этого не в быстрой элиминации F(ab')2- фрагментов из организма (см. гл. 7). Сравнительное изучение влияния IgG-антител и их F(ab')2-巾рагментов на синтез антител в культуре клеток селезенки также показало, что фрагменты характеризуются крайне низкой активностью (R. Lees, N. Sinclair, 1973).

Переходя к рассмотрению молекулярных п клеточных механизмов регуляторного действия антител в иммунном ответе, необходимо в первую очередь подчеркнуть, что иммуносупрессивное действие антител не связано с необратимым блокированием предшественников антите.юпро- дуцирующих клеток. Обработанные антителами клетки селезенки неиммунизированной мыши способны эффективно отвечать на антиген в организме облученного сингенного реципиента (J. Haughton, R. Nash, 1969; A. The- ophilopulos, F. Dixon, 1979). Предварительная обработка антителами клеток селезенки, освобожденных от А-к」е- ток, не оказывает влияния на способность лимфоцитов отвечать в присутствии макрофагов на антиген продукцией антител i〃 vitro (С. Pierce ；969; G. Haughton, J. Adams, 1970).

Таким образом, антитела не препятствуют реакции на антиген В-лимфоцитов и, как следует из многих данных, Т-хелперов. Вместе с тем ряд фактов свидетельствует о том, что точкой приложения действия антител могут служить клетки макрофагального ряда. Установлено, что перитонеальные клетки от нормальных мышей и мышей, получивших инъекцию IgG-антител против эрптро-

цитов барана, не отличаются по своей способности захватывать эритроциты. I1о если проинкубированные с антигеном макрофаги интактных доноров индуцируют у сингенных интактных доноров продукцию антител, аналогично обработанные антигеном макрофаги от доноров, получивших антитела, не вызывают иммунного ответа (R. Ryder. R. Schwarts, 1969; G. Haughton, J. Adams, 1970). Только макрофаги (но не лимфоидные клетки) после обработки их антителами теряют способность поддерживать иммунный ответ в культуре клеток селезенки (С. Pierce, 1969). Существенно, что подавление иммунного ответа, вызванное I gG - антител а м и, удается отменить в результате введения сингенных (но не аллогенных) макрофагов от предварительно иммунизированных доноров.

Одно из предположений состоит в том, что антитела влияют на процесс презентации антигена А-клетками (макрофагами). Что произойдет, если проннкубнровать с антителами макрофаги, уже процессировавшие антиген? Через Fc-рецептор антитела могут присоединиться к поверхности макрофага. Одновременно своими активными центрами они способны связаться с доступными для них детерминантами процессированного антигена. Следствием этого будет впячивание участка поверхности макрофага и превращение его в фаголпзосому, как это произошло бы в случае фагоцитоза опсонизнрованых антителами антигенов (см. гл. 6).

Ряд фактов, полученных в последнее время, свидетельствует в пользу другого механизма подавления иммунного ответа антнтеламн. Антитела в комплексе с антигеном способны индуцировать синтез антипдиотипиче- ских антител, а также вызывать появление Т-супрессоров, специфичных к тем же идиотипическим детерминантам (М. Caulfield et al., 1983). Особенно эффективным индуктором в обоих случаях могут быть макрофаги, несущие на своей поверхности комплекс антиген-антитело. Антиидиотипические антитела и продуцируемый указанными Т-супрессорами идиотипспецифический Т-супрессор- ный фактор реагируют с идиотипическими детерминантами рецепторов В-лимфоцитов, ответственных за продукцию антител данной специфичности и инактивируют их.

Все сказанное выше приобретает особое значение в свете фактов, свидетельствующих, что в физиологических условиях антитела действительно оказывают специфическое угнетающее воздействие на продукцию антител той

же специфичности. Один из убедительных экспериментов выполнен М. Графом и Дж. Уром (М. Graf, J. Uhr, 1969). Кроликов иммунизировали внутривенно бычьим сывороточным альбумином и бактериофагом. Через 2—3 недели у животных брали кровь, форменные элементы крови

отделяли, а плазму пропускали через колонку с иммуноотделяли, а плазму пропускали через колонку с иммуносорбентом, представляющим фиксированный на нерастворимой основе бычий альбумин. После удаления из плазмы антител к альбумину ее смешивали с форменными элементами крови и вновь вводили кролику. Указанную процедуру повторяли 4—6 раз с интервалом в 1 ч. Таким способом у подопытного кролика удаляли до 80% антител к альбумину, не изменяя сколько-нибудь содержание антител против бактериофага. Через 1—2 дня содержание антител к бычье-

отделяли, а плазму пропускали через колонку с иммуно

отделяли, а плазму пропускали через колонку с иммуно

D 5 10 15 20 25 五7 35Крема > суткиD 5 10 15 20 25 五7 35Крема > суткиРис. 53. Синтез антител к бычьему сывороточному альбумину (I) и бактериофагу (2) у кролика до и после избирательного удаления из его сыворотки антител к бычьему сывороточному альбумину (момент извлечения антител указан стрелкой)Рис. 53. Синтез антител к бычьему сывороточному альбумину (I) и бактериофагу (2) у кролика до и после избирательного удаления из его сыворотки антител к бычьему сывороточному альбумину (момент извлечения антител указан стрелкой)му альбумину начина

D 5 10 15 20 25 五7 35

Крема > сутки

D 5 10 15 20 25 五7 35

Крема > сутки

Рис. 53. Синтез антител к бычьему сывороточному альбумину (I) и бактериофагу (2) у кролика до и после избирательного удаления из его сыворотки антител к бычьему сывороточному альбумину (момент извлечения антител указан стрелкой)

Рис. 53. Синтез антител к бычьему сывороточному альбумину (I) и бактериофагу (2) у кролика до и после избирательного удаления из его сыворотки антител к бычьему сывороточному альбумину (момент извлечения антител указан стрелкой)

ло возрастать, достигая максимума к 5-му дню после кровопускания (рис. 53). Уровень антител против бак

териофага не изменялся. Тщательно выполненные экс

перименты и контрольные опыты показали, что наблюдаемое увеличение синтеза антител обусловлено лишь

удалением антител из циркуляции.

Возможность специфического подавления продукции антител за счет введения антител той же специфичности уже нашла практическое применение для предотвращения гемолитической болезни новорожденных, вызванной несовместимостью матери и плода по D-антигену Rh-cn- стемы. В случае резус-по лож и тельного плода у резус-от- рпцательной матери при первой беременности образуются крайне низкие уровни антирезусных антител, но в момент родов при возникновении ретроплацентарных кровоизлияний за счет вторичного ответа содержание антирезусных антител резко возрастает. В случае повторной

беременности эти антитела проникают через плаценту, что приводит к возникновению гемолитической болезни у новорожденных. За счет введения матери антирезусных антител сразу после родов удается подавить образование у нее собственных антител против Rh (D) -антигена. Анти- резусные антитела получают от резус-отрицательных мужчин — добровольцев, иммунизированных резус-поло- жительными эритроцитами.

Усиление биосинтеза антител

Усиление антителами. Индуцированный антигеном биосинтез антител начинается, как правило, с синтеза IgM-анти тел. Это характерно и для тимусне- зависимого, и для тимусзависимого иммунного ответа. В отличие от IgG-антител IgM-антитела имеют более низкое сродство к антигену, не обладают цитофильными свойствами, а в силу большой молекулярной массы и стоксовского радиуса молекулы не проникают так быстро, как IgG, в экстраваскуляркое пространство. По этим причинам защитное действие IgM-антител менее выражено, чем у IgG-антител и ускоренный переход на синтез именно IgG-антител биологически оправдан, в связи с чем представляется закономерным, что IgM-антнтела не подавляют, а усиливают иммунный ответ. Этот феномен впервые убедительно продемонстоирсвали К. Генри и Н. Ерне (С. Henry, N. Jerne, 1968), изучавшие влияние IgM-антител на пролиферацию антителопродуцпрующих клеток против эритроцитов барана. Механизм этого явления изучен недостаточно, но его специфичность не вызывает сомнения. Возможно, эффект IgM-антител связан с их способностью как поливалентного антитела эффективно концентрировать антиген и тем самым способствовать его процессированию в макрофагах.

IgA-антител а также способны усиливать иммунный ответ (С. Stokes et al., 1981). Этими свойствами обладает, по-видимому, не только циркулирующий IgA, но и секреторный IgA, присутствующий в молозиве. А это означает, что поступающие сразу после рождения вместе с молозивом IgA-антитела обеспечивают не только пассивную защиту, но н в качестве иммуностимулятора повышают иммунореактивность новорожденных млекопитающих.

IgA-антитела присутствуют в циркуляции не только в мономерной, но и в полимерной форме (см. гл. 3). По-

этому антитела этого класса способны, как и IgM, концентрировать антиген. Как для IgA, так и для IgM на поверхности макрофагов нет Fc-рецепторов. Все сказанное позволяет предположить, что механизм усиления иммунного ответа с помощью IgA- и IgM-антнте工 одинаков.

Адъюванты. Вещества, нсспецифически усиливающие иммунный ответ, получили название адъювантов. К их числу относятся соединения, концентрирующие антиген на месте введения и обеспечивающие тем самым его более интенсивный захват макрофагами. Этим свойством обладает сорбирующая белки А1(ОН)з или различные масла, образующие с водным раствором белкового или другого антигена устойчивые эмульсии. В эксперименте для усиления иммунного ответа (прежде всего гуморального) используют некоторые виды бактерий. В их числе аттенуированный (ослабленный) бычий штамм туберкулезной палочки (Mycobacterium tuberculosis), называемый также бацилла Кальметт-Герена (Ва- ciltis Calmette-Guerin), или БЦЖ (BCG), коклюшная палочка (Bordetella pertussis), ЛПС грамотрицательных бактерий н ряд других. Адъюватными свойствами обладают некоторые синтетические полимеры, как аналоги биополимеров (полинуклеотиды), так и неприродные соединения (полианионы, поликатионы, полиамфолиты). Значительный интерес представляет изучение механизма действия последней группы веществ, открывающее новые подходы к пониманию механизма иммунного ответа и сулящее большие перспективы для иммунопрофилактики. Р. Петровым с соавторами (1983) изучено влияние на иммунный ответ ряда соединений указанного типа: поливинплпирпдина, сополимера акриловой кислоты и N-винилпирролидона п некоторых других.

Установлено, что полиэлсктролиты способны усиливать антпгензависимую пролиферацию антителопродуцирующих клеток, а в случае тимуезавиепмых антигенов замещать Т-хелперы. Об этом, в частности, свидетельствуют демонстративные эксперименты на бестнмусных мышах nude, у которых сополимер акриловой кислоты и N-винилпирролидона обеспечивали эффективную пролиферацию антителопродуцирующих клеток при иммунизации тимусзависимым антигеном — эритроцитами барана. Как оказалось, тот же сополимер обеспечивает более эффективное взаимодействие макрофагов с лимфоцитами, а также вызывает ряд других эффектов. На основа-

нии всех этих данных Р. Петров, Р. Хаитов и др. (1977—1983) разработали и исследовали ряд искусственных антигенов. В качестве детерминант служили различные ароматические соединения, белки, комплексные бактериальные антигены. Было показано, что комплексы простых гаптенов и белков с поликатионами обеспечивают тимуснезависимость иммунного ответа. Углубленное изучение действия поликатионов на лимфоидные клетки и в первую очередь на цитоплазматическую мембрану (Р. Атауллаханов и др., 1983) позволит расшифровать молекулярные механизмы, определяющие особенности действия этих соединений при иммунном ответе.

Молекулярные основы иммунологической толерантности и аутоиммунных болезней

Иммунологическая толерантность

Иммунологической толерантностью называют приобретенную под влиянием антигена неспособность данного индивидуума отвечать реакциями гуморального или клеточно-опосредованного иммунитета на этот антиген; при этом другие особи данного биологического вида способны отвечать на этот антиген.

Из определения следует, что иммунологическая толерантность не нмеет ничего общего с генетически предетерминпрованной неспособностью отвечать на тот или иной антиген, например, из-за отсутствия соответствующих генов иммунного ответа. Состояние толерантности индуцирует антиген, который в иных условиях был бы способен вызвать у того же индивидуума иммунный ответ. Значит, главное условие возникновения толерантности —соблюдение ряда условий при контакте антигена с клетками, участвующими в иммунном ответе. Хотя к настоящему времени экспериментально проверено много схем индукции иммунологической толерантности.

выделим здесь всего несколько из них, чтобы охарактеризовать ряд главных условий, необходимых для индукции рассматриваемого состояния.

Любой по химической природе антиген в свободном виде или как компонент клетки способен индуцировать специфическую иммунологическую толерантность у новорожденных, в то время как у взрослых особей того же вида он вызывает иммунный ответ. Именно этим можно в первую очередь объяснить то обстоятельство, что в норме не возникают реакции гуморального и клеточно-опосредованного иммунитета на свои собственные антигены — важное условие выживания биологических видов, имеющих хорошо развитую иммунную систему. Следовательно, явление иммунологической толерантности столь же важно, как и иммунореактивности, и именно благодаря обоим этим явлениям высшие организмы способны высокоэффективно поддерживать свой антигенный гомеостаз.

Иммунологическую толерантность можно индуцировать у взрослых особей, лишь варьируя в широких пределах дозу вводимого антигена. В случае тимусзави- симых антигенов состояние толерантности возникает при использовании крайне низких доз растворимых антигенов, например, глобулярных белков. Толерогенная доза антигена в этом случае ниже дозы, способной вызвать иммунный ответ. Как в случае тимусзависимых, так и тимуснезависимых антигенов (в частности, бактериальных полисахаридов), иммунологическую толерантность можно индуцировать, используя очень большие дозы антигена, значительно превышающие дозу, оптимальную для иммунного ответа. Такие формы иммунологической толерантности, которые зависят от дозы вводимого антигена, обозначают как низкозонную и высокозонную, что соответствует низкой и высокой дозам вводимого антигена.

При одной и той же специфичности (одинаковой структуре антигенных детерминант) толерогенными пмн взрослых особей свойствами будет обладать антиген с более высокой, чем у иммуногенной формы того же вещества, эпитопной плотностью (например, конъюгированный антиген с большим числом гаптенных групп). В свою очередь, более выраженными толерогенными свойствами будет обладать антиген с высокой устойчивостью к действию гидролитических ферментов (напрн- мер, антигены, содержащие неприродные D-аминокисло-

ты). Еще одна особенность строения антигена, благоприятствующая проявлению его толерогенных свойств,—— отсутствие в составе белкового антигена агрегатов.

Состояние иммунологической толерантности у взрослых животных может быть вызвано сочетанием антигенной стимуляции с иммуносупрессией. С целью подавления нммунореактнвностн используют радиационное облучение, а также вещества, токсичные для быстроделящлхся клеток, например циклофосфан, метотрексат, 6-мерка птопурпн.

На первый взгляд кажется, что перечисленные выше условия для индукции толерантности мало связаны между собой и не могут быть сведены в единую систему. Ниже мы постараемся продемонстрировать такую связь. Здесь же хотелось бы подчеркнуть, что изучение механизма иммунологической толерантности имеет несомненное значение для развития теоретической иммунологии. Что касается прикладных аспектов проблемы, то они более, чем значимы, так как прямо связаны с решением проблемы пересадки органов н тканей, выяснения причин II поиска путей профилактики и терапии аутоиммунных заболеваний и ряда других проблем.

Индукция II поддержание специфической иммунологической толерантности обусловлены влиянием антигена (толерогена) как на Т-, так и В-лимфоциты, экспрессирующие рецепторы к этому антигену. Кроме того, в возникновении 11 поддержании состояния толерантности несомненная роль принадлежит А-клеткам (макрофаги). Конечным выражением возникшего состояния толерантности в отношении антигенов, способных индуцировать биосинтез антител, является неспособность прекоммити- рованных к данному антигену В-лимфоцптов превращаться в антителопродуцирующие клетки. Этот специфичный по отношению к данному антигену процесс может быть обусловлен прямым избирательным действием антигена (толерогена) на В-лимфоциты. Опосредованное толерогенное действие антигенов, принадлежащих к числу тимусзависимых, связано с их влиянием на Т-лимфоциты. Основной клеткой-мишенью здесь выступают Т-супрессоры. Наконец, в силу особенностей физико-химических свойств толерогенов их процессирование в А-клетках протекает иначе, чем антигена, индуцирующего иммунный ответ. Если принять во внимание все сказанное II ряд не обсуждавшихся здесь фактов, можно заключить, что в случае тимуснезавпсимых антигенов

к летк а м и - м ишеням и при индукции толерантности служат В-лимфоциты и А-клетки. При индукции толерантности к тнмусзавнснмнм антигенам в возникновении и поддержании этого состояния могут быть заинтересованы все три типа клеток.

Каковы причины того, что в поздний антенатальный период и сразу после рождения антиген проявляет себя как толероген? Причина кроется в особенностях биологии лимфоцитов на определенном этапе их созревания в онтогенезе.

У мышей удается индуцировать толерантность только в тот период эмбрионального развития, когда В-лимфоциты уже экспрессируют рецепторный IgM. Следовательно, эти клетки способны специфически распознавать антиген. Будучи поливалентным, антиген «сшивает» между собой антигенсвязывающие рецепторы незрелых В-клеток. Последствия этого, видимо, идентичны таковым после «сшивания» иммуноглобулиновых рецепторов эмбриональных В-лимфоцитов с помощью антиизотппи- ческих анти-ц-антител (см. гл. 3). Напоминим, что при «сшивании» иммуноглобулиновых рецепторов, незрелых В-лимфоцитов клетка, потеряв рецепторы, на продолжительное время теряет способность их ресинтезировать. Зрелые В-лимфоциты в тех же условиях эффективно регенерируют антигенсвязывающие рецепторы. Подобно антиизотипической сыворотке на В-лимфоциты эмбриона влияет поливалентный антиген. Продолжительное подавление синтеза иммуноглобулиновых рецепторов В-клетками эмбриона после контакта с толерогеном может стать причиной ареактивности к данному антигену. Это, по-видимому, связано, в свою очередь, с недостаточно эффективной регуляцией обмена циклических нуклеотидов в незрелых В-клетках и сохранении на продолжительный срок высокого уровня цАМФ в клетках после «сшивания» рецепторов.

Процесс биосинтеза иммуноглобулиновых рецепторов В-клетка ми может нарушаться также у взрослых животных при индукции толерантности с помощью полисахаридов регулярного строения в качестве толерогенов. Аналогичная ситуация может иметь место при индукции толерантности к медленно метаболирующим конъюгированным антигенам, например пол плиз ину, большое число боковых аминогрупп в молекуле которого замещено диннтрофенильными радикалами. В опытах in vitro установлено, что обработка лимфоцитов антигенами регу-

лярного строения с высокой эпитопной плотностью приводит как бы к «замораживанию» иммуноглобулиновых рецепторов (М. Feldmann, Е. Diener, 1970). Будучи жестко связанными на относительно больших участках клеточной поверхности, иммуноглобулиновые рецепторы в этих условиях не способны к перемещению по клеточной поверхности. Поэтому толерогены указанного строения не вызывают 〃z vitro при 37℃ агрегации клеточных рецепторов, формирования «шапочек» и в конечном cqe- те исчезновения рецепторов с поверхности. Хотя биохимические следствия описанного явления (т. е. «замораживания» рецепторов) не изучены, предполагают, что отдаленным (на несколько суток) следствием «замораживания» рецепторов будет утрата на продолжительный срок способности к экспрессии рецепторов.

По-видимому, далеко не безразлично для индукции толерантности, с какими по изотипу иммуноглобулиновыми рецепторами взаимодействует толероген. Избирательное удаление IgD-рецепторов с поверхности зрелых В-лимфоцнтов (за счет обработки клеток папаином) способствует возникновению состояния ареактивности в .популяции В-клеток под действием толерогена (J. Cambier et al., 1977).

Если на клеточном уровне ареактивность иммунокомпетентных клеток можно вызвать непродолжительным «от нескольких часов до 3—5 суток) контактом лимфоцитов с толерогеном, то в условиях организма необходим более продолжительный контакт с толерогеном. Сущность различий может состоять главным образом в том, что 〃z vivo идет непрерывное пополнение пула иммунокомпетентных В-лимфоцптов в ходе антигеннезави- •симой дифференцировки стволовых клеток (см. гл. 1). Поэтому для более эффективного достижения состояния толерантности необходимо хотя бы частичное истощение пула предшественников В-лимфоцптов, прекоммитиро- ванных к данному антигену. А для этого требуются либо большие дозы антигена (частое его введение), либо использование в качестве толерогена медленно метаболи- рующего вещества (например, пневмококкового полисахарида).

В случае тнмуезавненмнх антигенов важнейшая роль в возникновении и поддержании состояния толерантности принадлежит Т-супрессорам. Стало очевидным после наблюдения Р. Гершона и К. Кондо (R. Gershon, К. Kondo, 1971), что толерантность к эритроцитам бара-

на можно вызвать у нормального животного, перенося ему клетки селезенки от толерантных к этому антигену сингенных доноров. Те же авторы показали, что клетки селезенки, ответственные за перенос толерантности, принадлежат к Т-лимфоцитам, специфичным к антигену, использованному для индукции толерантности. Позднее эти данные были многократно воспроизведены для разных тимусзависимых антигенов и было доказано, что упомянутые Т-клетки относятся к Т-супрессорам (см. гл. 1 и 10).

Активацию Т-супрессоров вызывают белковые антигены, свободные от примеси агрегатов. Как показано выше, в этой форме такие антигены вызывают состояние толерантности. Синтетические полипептиды и полученные на их основе конъюгированные антигены в условиях, благоприятствующих возникновению состояния толерантности (см. выше), также активируют Т-супрессоры. Точный механизм активации не известен.

Клетками-мишенями для продуцируемого Т-супрессо- рами фактора (см. гл. 10) служат Т-хелперы. Функционально выключая их, этот фактор тем самым препятствует активации В-лимфоцитов антигеном.

Помимо Т-супрессоров определенное влияние на поддержание состояния толерантности оказывают антитела и их комплексы с антигеном. Сам факт возникновения антител у толерантных животных не противоречит представлению о том, что состояние рассматривается как специфическая иммунологическая ареактивность. Биосинтез антител в ограниченных количествах, очевидно, совершенно необходим для поддержания состояния толерантности, а механизм их действия может быть подобен уже рассматривавшемуся в гл. 10 механизму иммуносупрессии, обусловленному антителами. Так, IgG-антитела (а именно антителам этого класса приписывают основную роль в поддержании толерантности — G. Voisin, 1971; G. Voisin, et al., 1972) могут, как обсуждалось в гл. 10, сами по себе или в комплексе с антигеном подавлять иммунный ответ. Если исходить из гипотезы, согласно которой иммуносупрессивное действие IgG-антител связано с уменьшением под их влиянием доли представленного А-клетками антигена (см. раздел 10.4), можно понять их роль в поддержании толерантности. Действительно, уменьшая долю представленного антигена, антитела опосредованно увеличивают долю свобод-

ного антигена, который способен активировать предшественники Т-сунрессоров (см. гл. 10).

Состояние иммунологической толерантности вне зависимости от использованного метода индукции всегда ограничено во времени. Оно завершается спонтанно в том случае, если не предпринимаются специальные усн- лня для поддержания толерантности. Спонтанный выход из состояния толерантности обусловлен полной элиминацией из организма толерогена. Взамен ареактпвных иммунокомпетентных клеток в периферических лимфоидных органах появляются функционально полноценные лимфоциты — потомки недифференцированных предшественников. По этой причине выходу из состояния толерантности будут способствовать любые экспериментальные приемы, усиливающие регенерацию лимфоидной ткани, например умеренные дозы радиационного облучения, цитостатики типа циклофосфана. Тот же эффект дает перенос сингенных лимфоидных клеток от нормальных доноров.

Прекращение состояния толерантности, обусловленное так называемыми перекрестно реагирующими антигенами, мы рассмотрим в следующем разделе.

Аутоиммунные болезни

Утрата иммунологической толерантности к антигенам собственных клеток н тканей влечет за собой аутоиммунную реакцию, т. е. реакцию иммунной системы организма против собственных антигенов. При продолжительной во времени аутоиммунной реакции за счет эффекторной активности комплекса антиген-антитело возникают разнообразные патофизиологические состояния. В зависимости от органной локализации процесса (природы антигенов, к которым утрачено состояние толерантности) возникает характерный патологический процесс, являющийся фенотипическим проявлением данного аутоиммунного заболевания.

Какие обстоятельства способствуют утрате иммунологической толерантности? В предыдущем разделе приводились некоторые способы прекращения состояния толерантности. Эти результаты, полученные в эксперименте, в принципе значимы для объяснения возникновения аутоиммунного процесса. Так, при хронической лучевой болезни достаточно часто наблюдаются аутоиммунные реакции (Р. Петров, Ю. Зарецкая, 1970; R. Schwartz,

. Аутоиммунные заболевания часто коррелируют с лимфопролиферативными процессами у человека и животных (F. Burnet, 1970).

Важное место в развитии аутоиммунных болезней принадлежит, по-впдимому, срыву толерантности к собственным антигенам под влиянием перекрестно реагирующих антигенов. Рассмотрим этот феномен.

В качестве толерогена может быть использован антиген (например, белок или конъюгированный белковый антиген, содержащий несколько, условно три, детерминант) .Эти детерминанты распознаются В-лимфоцитамп. Допустим, столько же детерминант распознается Т-хелперами. Использованный антиген тимуезавпеим, и поэтому толерантность, выражающаяся в отсутствии синтеза антител против детерминант А, Б и В, обусловлена блокированием Т-хелперов, распознающих детерминанты X, Y, Z (Т-хелперы блокируются, как уже обсуждалось, активированными толеригеном Т-супрессорами). Теперь толерантному животному вводят другой белок с детерминантами А, Д и Е, распознаваемыми В-клетками, и детерминантами X, V, W, распознаваемыми Т-хелперами. Т-хелперы, распознающие детерминанты V и W, не блокированы при индукции толерантности к первому антигену и способны оказать помощь В-клеткам, отвечающим на все детерминанты второго антигена, включая и детерминанту А, общую для первого антигена — толерогена и второго ——перекрестно реагирующего с толеро- геном. Поскольку толерантность на Т-завпспмые антигены не обусловлена блокированием В-лимфоцитов, будет происходить продукция антител, направ.1енных к детерминанте А. Тем самым перекрестно реагирующий антиген прервет состояние толерантности по отношению к первому антигену. Если от абстрактной модели перейти к конкретному эксперименту, можно показать, например, возможность срыва толерантности к динитрофени- лированному IgG быка (толероген) с помощью динитрофенил прованного IgG человека. Срыв толерантности выражается в синтезе антител против динитрофениль- ной группы благодаря подключению к ответу Т-хелперов, распознающих детерминанты, общие для IgG человека и быка.

Число примеров срыва толерантности перекрестно реагирующими антигенами можно значительно увели- чпть. Некоторые подобные случаи имеют важное значение для патологии, поскольку как микроорганизмы, так

и собственные антигены с измепснпой структурой могут служить источником перекрестно реагирующих антигенов. В случае собственных антигенов изменения их структуры могут носить конформационно-зависимый характер. Примером может служить детерминанта (или детерминанты), появляющаяся в молекуле IgG-антнте- ла после образования последним комплекса с антигеном. Новые детерминанты, возникающие в Fc-участке молекулы (С. Неппеу, К. Ishizaka, 1968), способны в принципе обусловить срыв толерантности по отношению к собственному IgG и появление аутоантител к собственному IgG. Такая ситуация имеет место при тяжелом аутоиммунном заболевании человека ——ревматоидном артрите. Аутоантитела к собственным иммуноглобулинам, циркулирующие у таких больных, получили название ревматоидного фактора. Анти иммуноглобулины синтезируются и при других хронических заболеваниях человека, характеризующихся образованием иммунных комплексов.

Одна из ситуаций, приводящих к появлению новых антигенных детерминант, — формирование надмолекулярных структур, в частности структур на клеточной поверхности, когда клетки заражены вирусами, патогенными грибами, простейшими, некоторыми видами бактерий (бру цел лы, пастереллы). Причина появления новых детерминант — экспрессия на цитоплазматической мембране некоторых антигенов инфекционного агента.

Таким образом, как сами инфекционные агенты при внеклеточном паразитизме, так и контролируемые их геномами антигены в сочетании с антигенами хозяина (внутриклеточный паразитизм) служат источником перекрестно реагирующих антигенов, способных сорвать состояние толерантности к собственным антигенам мак- роорганпзма.

Принимается, что такие важнейшие аутоиммунные заболевания человека, как ревматизм, ревматоидный артрит и др., возникают под влиянием инфекционных агентов. В случае ревматизма — это патогенные стрептококки, некоторые из антигенов которых перекрестно реагируют с антигенами тканей сердца (И. Лямперт и др., 1975; М. Kaplan et al., 1971). В индукции патологического процесса при ревматоидном артрите важную роль отводят вирусу Эпштейн — Барр. Размножаясь в В-лимфоцитах, он становится источником ДНК, образующей комплекс с коллагеном. В результате конформа-

ционных изменении последнего возникают новые антигенные детерминанты, а как следствие этого — новый перекрестно реагирующий антиген. Процесс на этом, по мнению X. Фаденберга (Н. Fudenberg, 1978), не заканчивается, так как с появлением аутоантител к коллагену в комплексе с последним они изменяют свою конформацию II теперь сами служат источником перекрестно реагирующего антигена. Так появляются антииммуноглобулины —ревматоидный фактор, о котором шла речь выше. Изложенная внше концепция, хотя и не принадлежит к общепринятым, представляет значительный интерес как пример широкого биологического мышления иммунолога.

В заключение этого раздела необходимо подчеркнуть роль генетических факторов в возникновении аутоиммунных заболеваний. Их возникновение прямо связано с активностью Т-системы иммунитета и прежде всего тех ее механизмов, которые отвечают за генерацию Т-супрессоров. Дефицит последних несомненно способствует возникновению аутоиммунной патологии, разумеется при наличии в том числе перекрестно реагирующих антигенов. Большую помощь в понимании этих важных вопросов оказывают работы по изучению аутоиммунных заболеваний лабораторных животных. В гл. 2 уже говорилось о новозеландских мышах (NZB и NZW) и некоторых других линиях мышей, у которых спонтанно возникает аутоиммунный процесс. При этом доминирует иммунный ответ против ДНК и собственных эритроцитов с образованием соответствующих по специфичности антител. Существенно, что эти мыши инфицированы вирусом мышиного лейкоза. Выделенный из мышей NZB переносит подобное заболевание нечувствительным реципиентам. Предположение, что вирус нарушает процесс генерации Т-супрессоров, представляется нам весьма перспективным для понимания патогенеза аутоиммунных заболеваний.

Улучшение техники выявления Т-супрессоров в сочетании с генетическим анализом будет способствовать выяснению ведущих этиологических факторов аутоиммунных заболеваний человека.

Методология иммунохимического эксперимента

В этой главе мы ставим задачу рассмотреть принципы основных методов, используемых в иммунохимии, и охарактеризовать области применения иммунохимических методов в биохимии и молекулярной биологии.

Очистка иммуноглобулинов и антител

Практически во всех исследованиях, где применяется реакция антиген-антитело, целесообразно использовать в качестве источника антител не антисыворотку, а выделенные из нее пмм>7ноглобулины (желательно одного класса) или очищенные антитела. Применение цельной антисыворотки нежелательно по трем основным причинам. 1. Концентрация антител в ней может быть недостаточна, чтобы ебеспечить необходимую чувствительность реакции для выявления лиганда (антигена, гаптена). 2. Антисыворотка, полученная даже против индивидуального белка, содержит набор антител против разных антигенных детерминант этого белка, а также антитела против следовых примесей других белков. Вместе с тем исследователю часто необходимо использовать антитела только против какой-либо- одной детерминанты или одного белка. 3. Реакция антиген-антитело высокоспецифнчна, но далеко не всегда способ регистрации реакции (например, агглютинация, преципитация) достаточно специфичен, чтобы без постановки целого ряда контролен исключить ложные (кажущиеся) проявления реакции. Вероятность таких ложных проявлений реакции наиболее велика при использовании в качестве источника антител антисыворотки, содержащей десятки различных белков и других соединений, способных в ряде случаев влиять на течение реакции антиген-антитело.

Далеко не всегда можно получить антитела в очищенном виде (см. ниже). Поэтому прибегают к выделению лишь иммуногл обулнновой фракции сыворотки или имм\ноглобулинов одного из классов (как правило, IgG). Кратко рассмотрим особенности применяемых методов выделения сывороточных иммуноглобулинов.

Высаливание. Иммуноглобулины и прежде всего IgG характеризуются наименьшей степенью гидратации среди белков сыворотки. Поэтому они прежде других белков выпадают в осадок при прибавлении к сыворотке солей, энергично связывающих воду и в силу этого разрушающих гидратную оболочку белковой молекулы. Так, при концентрации сульфата аммония 34—35% насыщения из сыворотки выпадает IgG, не содержащий практически примеси других белков. Наиболынеп полноты осаждения можно достичь при значении pH 7,0—7,2, т. е. близком к изоэлектр и чес ко ii точке наименее заряженных молекул IgG. Осажденные сульфатом аммония имм\ ноглобулины обычно полностью растворяются после удаления соли диализом. Простота метода п возможность с его помощью значительно увеличить удельную концентрацию иммуноглобулинов в растворе делает его одним из наиболее популярных методов выделения иммуноглобулинов.

Для высаливания иммуноглобулинов используют также сульфат натрия. IgG осаждают при концентрации солн. равной 18%. После повторного осаждения белка в тех же условиях удается получить препараты, содержащие лишь незначительные примеси других сывороточных белков.

При нейтральных значениях pH IgG осаждается 0,1 М раствором сульфата цинка. Так как при этом не происходит осаждения IgA, метод нашел применение для выделения из сыворотки человека иммуноглобулинов класса А.

Осаждение спиртом.и Фракционирование сывороточных белков спиртом широко используют в производстве различных сывороточных препаратов, в том числе коммерческих препаратов гамма-глобулина человека из донорской и плацентарной крови. В настоящее время в лабораторной практике метод практически не применяют из-за его трудоемкости.

Препаративный электрофорез. Предложены различные модификации метода, позволяющие выделять и фракционировать иммуноглобулины. Обычно применя-

ют методы зонного электрофореза в блоках, содержащих инертный, водонерастворпмый носитель: специально обработанный крахмал, сефадекс, полиакриламид и др. В виде блока используют также различные гели, главным образом агара и агарозы. Методом препаративного электрофореза удается выделить из сыворотки иммуноглобулины различных классов, а в сочетании с ионообменной хроматограграфией и отдельные подклассы.

Ионообменная хроматография и гель-фильтрация. Эти методы получили в настоящее время наибольшее распространение. Для ионообменной хроматографии, как правило, используют диэтил аминоэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза) или ДЭАЭ-сефадекс. Ионообменни- ки уравновешивают буферными растворами низкой ионной силы (0,005—0,02 моль) при pH 7,2—8,2 с целью выделения IgG. В указанных условиях наименее заряженная часть молекул IgG не фиксируется на ионообменни- ке, в то время как другие иммуноглобулины и сывороточные белки связаны. Фракционирование можно проводить методом колоночной хроматографии или в объеме. С целью экономии ионообменника для очистки IgG целесообразно выделить первоначально из сыворотки общую глобулиновую фракцию осаждением сульфатом аммония при 50 %-ном насыщении.

При очистке IgG с помощью ионообменной хроматографии неизбежны ощутимые потери. Во-первых, по степени растворимости в растворах низкой ионной силы IgG, как н ряд других сывороточных глобулинов, состоит из двух видов молекул: высокорастворимых, образующих фракцию псевдоглоб}\тпнов, и мало растворимых, составляющих фракцию эуглобулинов. Антитела распределены в обеих фракциях. Однако из-за особенностей техники ионообменной хроматографии (проведение процедуры с использсванием растворов низкой ионной силы) фракция эуглобулинов теряется. Во-вторых, в силу значительной неоднородности IgG по электрическому заряду (изоэлектрические точки в диапазоне pH 6,6— 7,6) часть молекул связана с ионообменником даже при хроматографии в буфере pH 6,8—7,2. В результате общий выход IgG едва превышает 50%.

С использованием ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе (сефадексе) можно разделить иммуноглобулины IgM и IgA, используя непрерывный (линейный) или ступенчатый градиент концентрации буферного раствора. Разделение достаточно грубое, и для полу-

чения очищенных препаратов приходится прибегать к ряду других процедур: гель-хроматографии на сефадек- сах G-150 или G-200, ионообменной хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе.

Специфическая очистка антител. Антитела могут быть извлечены из смеси других белков только с помощью антигена. При этом антитело определенной специфичности может быть отделено также от других по специфичности антител с теми же физико-химическими свойствами. Процедура состоит из двух частей: получения комплекса антиген-антитело и его диссоциации с последующим разделением антигена и антитела. Рассмотрим основные методические приемы, используемые для очистки антител.

Получение комплекса антиген-антитело в нерастворимом виде. В случае низкодисперсных антигенов: бактерий, клеток эукариот после сорбции антител достаточно промыть комплекс, чтобы приступить к элюции антител. В случае высокодисперсных антигенов, включая растворимые в воде биополимеры, комплекс получают в форме преципитата (см. ниже). Наиболее универсальный способ состоит в приготовлении иммобилизованных на водонерастворимом носителе антигенов или гаптенов. Носителями служат порошок целлюлозы, сефадекс, сефароза, биогель. Антигены (гаптены) фиксируют ковалентно. Предложены десятки способов фиксации антигенов на носителе, различающиеся в том числе тем, какая группировка антигена использована для его присоединения к носителю. Приведем в качестве примера предложенный А. Гурвичем (1958) метод фиксации белковых антигенов на целлюлозе с помощью так называемого галлондоал- килата:

NO,

Хлористый N ( m -шипобей шлоксиметил -пиридиний) пмоидалкила!

Широко в настоящее время применяется метод фиксации антигенов на сефарозе (сефадексе), активированной бромцианом.

Иммобилизованные антигены (гаптены) получили название иммуносорбентов. В случае применения им му-

носорбентов для колоночной хроматографии этот способ становится одним из вариантов аффинной хроматографии, т. е. метода фракционирования, основанного на высокой степени сродства адсорбируемого вещества к сорбенту.

Элюция антител. Диссоциацию комплекса антиген- антитело с целью элюции антител производят либо путем специфического вытеснения их избытком простого гаптена, либо неспецифически. В последнем случае в зависимости от строения антигена, а следовательно, типа связей между антигеном н антителом применимы самые разнообразные способы. О них шла речь в гл. 4. Чаще других используют буферные растворы с низкими значениями pH: 2,4—3,0. Реже применяют щелочные буферные растворы, концентрированные (8—10 М), нейтральные растворы аминов (мочевины) или растворы с достаточно высокой концентрацией хаотропных ионов: I-, C\S-. Если используют иммуносорбент с ковалентно ■связанным антигеном, нет опасности попадания антиге- .на в раствор антител в описанных условиях. Поэтому достаточно провести диализ элюированных антител против изотонического раствора хлорида натрия, чтобы завершить процедуру их выделения. То же относится и к элюции антител с сорбента с помощью гаптена. Обычно применяют гаптен с низким сродством к антителу, чтобы с достаточной полнотой удалить его затем из элюата антител. Например, при выделении антидпнптрофенпльных антител используют в качестве гаптена динптрофенол, константа сродства которого на два порядка меньше, чем константа сродства к антителу динитрофениллизина. Динитрофенол можно затем удалить на „онообменнике (напрпмер, дауэкс 1X10). В то же время достаточно полное освобождение раствора антидинптрофенильных антител от динитрофениллизина практически невозможно, в снлу чего этот высокоэффективный диссоциирующий агент не применяется для получения антидинитро- фенильных антител.

При использовании в качестве естественных иммуносорбентов низкодпсперсных антигенов велика опасность загрязнения антигеном элюированных антител даже при применении достаточно мягких способов элюции последних. Чтобы исключить или уменьшить элюцию антигена, например, с поверхности бактериальной клетки, находящиеся на ее поверхности высокомолекулярные вещества фиксируют с помощью глутарового альдегида.

При низких значениях pH в концентрированных растворах амннов или в присутствии хаотропных агентов конформация антител изменяется. Однако эти изменения носят в основном обратимый характер. О качестве выполнения процедуры очистки можно судить по- двум критериям: специфической активности антител (т. е. связывание ими антигена или гаптена) и по содержанию агрегированного материала (последнее устанавливают с помощью гель-фильтрации). Присутствие агрегатов сигнализирует или о наличии в растворе антител антигена н, следовательно, иммунных комплексов, или о денатурации антител.

Хранение антител можно осуществлять в замороженном виде или после высушивания (лиофилизация). Предварительно антитела концентрируют, так как хра* ненце в сильно разбавленном виде неизбежно приведет к их денатурации. Оптимальная концентрация антител при хранении в замороженном виде 5 мг/мл.

Аффинная хроматография в иммунологии

В предыдущем разделе говорилось об основном из применяющихся в иммунологии методе аффинной хроматографии — выделении антител с помощью- иммобилизованного антигена (гаптена). Кратко охарактеризуем другие варианты метода, применяемые в иммунологии.

На нерастворимом носителе (сефароза, целлюлоза) могут быть иммобилизованы антитела, так что с помощью такого сорбента можно извлечь из смеси антигенов определенный антиген. Ковалентное связывание антител с носителем производят по возможности в мягких условиях, чтобы исключить их денатурацию. В связи с необходимостью фиксировать большие количества белка для приготовления нммуносорбента крайне редко используют очищенные антитела. Обычно используют выделенные из антисыворотки иммуноглобулины.

Емкость сорбентов с антителами значительно ннже, чем с антигеном, по следующим причинам: 1. Число активных центров в антителах, содержащихся в антисыворотке в наибольших количествах, а именно IgG, равно двум; число детерминант в молекуле антигена, как правило, больше. 2. Стерический фактор при иммобилиза-

ции антител оказывает значительно большее влияние на связывание лиганда в случае иммобилизованных антител, нежели антигена.

С целью уменьшения вероятности пространственного экранирования активного центра антитела носителем желательно присоединять антитела к носителю через «гибкую ножку» (spacer). Функцию ножки могут выполнять бифункциональные реагенты типа бпсдиазобензи- дина, различные по длине алифатической цепи бромацетил ьные производные и др.

Если иммуносорбент с иммобилизованными антителами предполагают использовать прежде всего для извлечения из смеси определенного антигена (но не для получения его в чистом виде), фиксацию антител можно осуществить по типу «сэндвича». Первоначально иммобилизуют на носителе такой же антиген или антиген, перекрестно с ним реагирующий, а затем к иммуносорбенту добавляют большой избыток антител (антисыворотка) .Часть активных центров антител, присоединенных к иммобилизованному антигену, окажется свободными. Именно за счет них《сэндвнч»-сор6ент будет связывать определенный антпген из раствора.

С помощью иммуносорбента для антигена могут решаться задачи, имеющие существенное значение для молекулярной биологии. Приведем в качестве примера выделение на иммуносорбенте типа «сэндвич» полирибосом, синтезирующих легкие полипептидные цепи (Е. Сидорова и др., 1978). Сорбент был «нагружен» антителами против легких цепей иммуноглобулинов мыши. Выделенные из клеток мышиной плазмацитомы полирибосомы для легких цепей (использовали технику градиентного центрифугирования) содержали растущие легкие цепи. Как следует из этой и других работ, растущие полипептидные цепи уже имеют, по крайней мере, часть антигенных детерминант, характерных для данной полипептидной цепи, поэтому растущая цепь избирательно связывается с иммобилизованными антителами против этой цепи, а вместе с ней связываются с иммуносорбентом полирибосомы, содержащие мРНК для легких цепей. Теперь остается промыть иммуносорбент, путем фенольной экстракции выделить РНК н очистить мРНК общепринятым способом. Описанный принцип или аналогичные методы извлечения мРНК позволяют получить препараты определенной информационной нуклеиновой кислоты свыше 90% чистоты.

Используемые в иммунохимии методы аффинной хроматографии не всегда основаны на реакции антиген-антитело. Например, исходя из высокого , сродства к Fc-участку молекулы IgG белка А, продуцируемого Staphylococcus aureus, можно выделить из сложной смеси белков и дру! их самых разнообразных по природе веществ, содержащихся в питательном бульоне, где выращивали стафилококк, именно белок А. В качестве сорбента при этом используют иммобилизованный на сефарозе IgG человека. Белок А можно затем элюировать без потери активности раствором роданида натрия (И. Тарханова, II. Сычева, 1980).

С помощью сорбента с иммобилизованным IgG из сыворотки (плазмы) можно извлечь Clq, а из лизата клеток селезенки — Fc-рецептор.

При любом способе аффинной хроматографии большое внимание должно быть уделено оценке степени специфичности сорбции лиганда. Здесь целесообразно привести некоторые примеры неспецифической сорбции различных веществ на иммуносорбентах, чтобы показать, какими многообразными знаниями необходимо обладать для выбора адекватного метода исследования.

В период становления техники иммуносорбции (конец 50-х годов) внимание специалистов привлек аминополистирол ——коммерческий препарат низкой стоимости, который без особых затрат и потери рабочего времени мог быть использован в качестве носителя для фиксации белковых антигенов. В самом деле, аминогруппы аминополистирола можно диазотировать нитритом натрия в разбавленной соляной кислоте. Затем с помощью реакции азосочетанпя в слабощелочной среде к полимеру можно ковалентно присоединить любые белки, содержащие тирозин. Однако полученные таким способом иммуносорбенты связывали неспецифически значительные количества сывороточных иммуноглобулинов, видимо, за счет гидрофобных взаимодействий. От этого полимера как носителя пришлось отказаться.

Другим примером неспеццфической сорбции может служить связывание третьего компонента комплемента такими поперечно сшитыми полисахаридами, как сефароза и сефадекс. Последние служат излюбленным носителем для самых разнообразных сорбентов, применяемых в целях аффинной хроматографии. Если сорбент на основе этих носителей применяется для извлечения како-

го-то белка из плазмы или сыворотки крови, может происходить неспецифпческая сорбция третьего компонента комплемента.

Регистрация реакции антиген (гаптен)-антитело

Разнообразие методов очень велико. Все их можно разделить на две группы в зависимости от того, оценивается 〃н реакция с одновалентным гаптеном или поливалентным антигеном В случае реакции антител с одновалентными гаптенами видимых превращений образующегося комплекса не происходит. В силу этого для его обнаружения приходится прибегать к различным флзпко-хпмическим нлн химическим методам» позволяющим оценить молекулярную массу, оптические» электрохимические или другие свойства реагирующих соединении и их комплексов. Что касается реакции поливалентных антигенов с антителами, то она может быть проведена при таких соотношениях реагентов, прн которых возникнут легко регистрируемые визуально продукты: агглютинаты клеток, белковый преципитат (осалок). Система может быть усложнена за счет комплемента, п тогда о результатах реакции судят по убыли комплемента в результате его связывания комплексом антнген-ан- титело.

Реакция гаптен-антитело. Равновесный диализ 〃 его модификации. Техника постановки реакции состоит в следующем. В двухкамерном сосуде камеры разделены мембраной, проницаемой для низкомолекулярного гаптена, но не антитела. Гаптен и антитело помещают в разные камеры. За счет диффузии гаптен, проходя через мембрану, переходит в камеру с антителом к нему и взаимодействует с антителом. В результате в камере, содержащей антитело, будет находиться как связанный, так н свободный гаптен. Количество последнего после установления равновесия окажется равным количеству гаптена в камере, не содержащей антитела. Следовательно, в камере, содержащей антите.ю, возникнет инкремент концентрации гаптена, равный его количеству, связанному антителом. Зная содержание антитела в молях и определив содержание свободного и связанного гаптена, можно определить константу равновесия (К) из уравнения: г/с = 〃К—гК, где г——число молей гаптена на моль антитела, с ——молярная концентрация свободного

гаптена, “ ——число активных центров в молекуле антитела. Не обсуждая здесь методы регистрации концентрации гаптена (см. ниже), отметим, что отношение г, К и с нелинейно вне зависимости от степени чистоты антител в том случае, если последние немоноклональны или, иными словами, неоднородны по степени сродства к гаптену. Следовательно, оперируя по л и к л она льным и антителами, можно определить среднее значение величины К для всей совокупности активных центров. Степень неоднородности антител по величине сродства к гаптену (индекс гетерогенности а) можно вычислить по формуле 】ogr("—г) = а log Ко + а log с. Значение величины а = 0,7 достаточно типично. При этом около 25% активных центров имеет величину константы равновесия, в шесть раз превышающую среднюю константу связывания Ко. Остальные 75% антител имеют величины ^ в пределах между Ло/6 и бЛо. Только для моноклональных антител величина а принимает значение, равное 1.

Сказанное выше применимо также и к оценке результатов реакции гаптен-антитело другими методами.

Весьма удобная модификация метода равновесного диализа была предложена Г. Фапрчло и Дж. Фрутоном (G. Fairchlough, J. Fruton, 1968). Приводим краткое описание метода. В колонку с сефадексом G-25, уравновешенным раствором, содержащим гаптен (например, ди- нитрофеннллизин), вносят порцию антител к гаптену. Для вымывания антител из колонки используют раствор гаптена той же концентрации, что и в колонке. На старте антитела связывают определенное количество гаптена и, перемещаясь в колонке, все время создают в той зоне, где находятся, инкремент концентрации гаптена. В то же время в той зоне, откуда антитела ушли, образуется отрицательный нндемент концентрации гаптена, н эта зона перемещается вслед за зоной, где находятся антитела. Перемещение зоны с отрицательным инкрементом концентрации гаптена (или «ямы») соответствует скорости гель-фильтрации гаптена. Профиль элюции представлен на рис. 54. Оценив по величине отрицательного инкремента количество • связанного гаптена (г), можно рассчитать константу равновесия.

Метод равновесного диализа в его различных модификациях —'общепринятый способ оценки реакции антител с простыми гаптенами. Его чувствительность зависит только от чувствительности методов оценки концентрации гаптена. Наиболее чувствительным, разумеется, яв-

0,0750,0753勿 0,260 0,220 0,180 勿仞3勿 0,260 0,220 0,180 勿仞1 乜"5-0J05 -0,095 -4函1 乜"5-0J05 -0,095 -4函Рис. 54. Гель-фильтрация антител против динитрофенильной группы на колонке с сефадексом G-25, уравновешенным буферным раствором, содержащим динитрофениллизин:/ ——определение оптической плотности проб при 360 нм (пик поглощения динитрофенильной группы), //—— дифференциальная спектрофотометрия проб при 280 нм против буфера, содержащего дини- трофениллизинРис. 54. Гель-фильтрация антител против динитрофенильной группы на колонке с сефадексом G-25, уравновешенным буферным раствором, содержащим динитрофениллизин:/ ——определение оптической плотности проб при 360 нм (пик поглощения динитрофенильной группы), //—— дифференциальная спектрофотометрия проб при 280 нм против буфера, содержащего дини- трофениллизин12 3456 789 // 7Номера проб12 3456 789 // 7Номера пробляется радиоизотопная техника с использованием меченных радиоактивными изотопами гаптенов.

0,075

0,075

3勿 0,260 0,220 0,180 勿仞

3勿 0,260 0,220 0,180 勿仞

1 乜"5

-0J05 -0,095 -4函

1 乜"5

-0J05 -0,095 -4函

Рис. 54. Гель-фильтрация антител против динитрофенильной группы на колонке с сефадексом G-25, уравновешенным буферным раствором, содержащим динитрофениллизин:

/ ——определение оптической плотности проб при 360 нм (пик поглощения динитрофенильной группы), //—— дифференциальная спектрофотометрия проб при 280 нм против буфера, содержащего дини- трофениллизин

Рис. 54. Гель-фильтрация антител против динитрофенильной группы на колонке с сефадексом G-25, уравновешенным буферным раствором, содержащим динитрофениллизин:

/ ——определение оптической плотности проб при 360 нм (пик поглощения динитрофенильной группы), //—— дифференциальная спектрофотометрия проб при 280 нм против буфера, содержащего дини- трофениллизин

12 3456 789 // 7

Номера проб

12 3456 789 // 7

Номера проб

Оптические методы. С помощью оптических методов можно охарактеризовать изменения оптических свойств гаптена после образования им комплекса с антигеном.

При реакции антител с динптрофенил(тринитрофенил) лизином в спектре поглощения гаптена происходят характерные изменения. С помощью дифференциальной спектрофотометрии удается зарегистрировать длинноволновое (красное) смещение спектра поглощения нптрофенильной группы. Это явление, которое впервые наблюдали Дж. Литл и X. Айзен (J. Litle, И. Eisen, 1968), обусловлено образованием комплекса с переносом электрона между остатком триптофана в активном центре антитела и нитрофенильной группой, являющейся акцептором электрона. Хотя метод позволяет зареги

стрировать взаимодействие гаптена с антителом, он мало применим для изучения кинетики реакции. Следует заметить, что степень переноса электрона, а следовательно, и характер спектра неодинаковы у антител к нитрофениль- ной группе от животных разных видов, что само по себе затрудняет сравнительный анализ.

Гаптены, являющиеся производными фолиевой кислоты, также образуют в активном центре комплексы с остатком триптофана по типу комплекса с переносом электрона. Акцептором электрона в молекуле гаптена выступает птеридиновая группа, а донором электрона — остаток триптофана.

Реакция гаптена с антителом может быть зарегистрирована с помощью техники спектрофлуорометрии. Как известно, флуоресценция триптофансодержащих белков обусловлена почти исключительно индольными остатками триптофана. Последние, находясь в неполярном микроокружении, флуоресцируют с максимумом при 330 нм в случае облучения белка ультрафиолетом с длиной волны 270—290 нм. Если в активном центре антитела находится гаптен, одна из полос в спектре поглощения которого совпадает с полосой поглощения триптофана, лроисходит тушение флуоресценции триптофана, содержащегося в молекуле антитела, а следовательно, флуоресценции собственно молекулы антитела (S. Velick et al., 1963). Такой феномен наблюдается при взаимодействии нитрофенильных гаптенов с направленными к ним антителами. Степень тушения достигает 70% для нерас- щепленного антитела и 90% для его Fab-фрагмента. Чувствительность метода при использовании чистых ан- тнте.】 очень велика: на одно определение достаточно 50 нг антител.

Тушение флуоресценции антител с помощью гаптена не обусловлено прямым контактом гаптена с хромофором. Тем не менее существует тесная связь между сродством антител к гаптену и эффективностью тушения флуоресценции антитела. Возможно, большая часть остатков триптофана в молекуле антитела осуществляет безизлучательный переход из возбужденного в основное состояние, передавая энергию одному пли нескольким остаткам триптофана в районе активного центра; последние отвечают за флуоресценцию всей молекулы.

Эффективность тушсннн флуоресценции зависит от числа остатков триптофана в активном центре антитела. Их число больше у антител с высокой степенью сродства к гаптену. В случае антидинитрофенильных антител различия в числе остатков триптофана в антителах высокого и низкого сродства достигают четырех остатков на моль.

Спектрофлуорометрия может быть использована для оценки взаимодействия некоторых полициклических ■флуоресцирующих красителей (как гаптенов) со своими антителами. Эти соединения характеризуются свойством при переходе из водной среды в неполярное микроокружение резко увеличивать квантовый выход флуоресценции. Примером может служить 4-анплинонафталин-суль- 4)онат (АНС):

4«Ани.1и»онафга:нш-!-сульфонаг(АНС)

При взаимодействии АНС со своими антителами интенсивность флуоресценции гаптена существенно возрастает наряду с коротковолновым смещением спектра флуоресценции. Метод очень чувствителен и позволяет регистрировать реакцию при концентрации антител 10-5 моль и ниже. При этом удается оценить связывающие свойства антител, сродство которых к лиганду порядка 102—104 М-L

Радиоспектроскопия. Синтез стабильных нптроксид- ных (иминоксильных) радикалов с различными реакционноспособными группами позволил использовать их, в частности, для метки гаптенов. Нитроксидные радикалы содержат неспаренный электрон и могут быть охарактеризованы методом электронно-парамагнитного резонанса (ЭПР). Спиновая метка была впервые использована «Л. Стриером и О. Гриффитом (L. Stryer, О. Griffith, 1965) для получения иминоксильных производных дпнп- тробензола:

Ди нитрофенил ьное производное аитроксидного (иминоксильного) радикала

При взаимодействии этого соединения с антидинитро- фенильными антителами спектр иминоксилыюго радикала, полученный с помощью радиоспектрометра, изменялся. Эти изменения можно было связать с уменьшением вращательной свободы радикала, наблюдаемым, в частности, при замораживании водного раствора радикала.

На основании этих данных была разработана техника оценки реакции гаптен-антитело методом ЭГ1Р. Данные, полученные этим и другими методами, совпадают.

Рассматриваемая техника может быть использована для оценки реакции антител с самыми разнообразными гаптенами при условии, что при связывании гаптена в активном центре антитела будет происходить частичная или полная иммобилизация пминоксильной метки. Дж. Сна и Л. Пьете (J. Hsia, L. Piette, 1969) применили ■метод для изучения кинетики реакции р-азобензойной кислоты и р-азофснилтриметиламмония с соответствующими антителами. При этом оказалось, что существует прямая зависимость между степенью сродства антител к гаптену и степенью иммобилизации метки.

Метод нашел практическое применение, в частности, для массового нммуно.тогнческо〕。определения морфина в voqe (США). К наркотику были получены антитела и использованы в тест-системе после присоединения ими- ноксильного радикала. Пробы мочи освобо/кдали от соли и добавляли к антителам против морфина. Если в моче содержался наркотик, он блокировал активные центры антител. Тогда добавленный в качестве компонента тест-системы морфин, меченный имипоксильным радикалом, оставался несвязанным и спектр метки соответствовал спектру иминоксила в растворе. При отсутствии морфина в моче происходила иммобилизация нмнно- ксила. входящего в состав тест-гаптена.

Меченные импнокспльпыми радикалами гаптены нашли применение в изучении размера полости активного центра антитела (J. Hsia, L. Piette, 1969). Готовили производные гаптена (например, динятрофенильного), отличающиеся между собой длиной алифатической цепи, к одному концу которой присоединяли динитрофенильную группу, а к другому ——иминоксильную группу. Длина соединяющей две группировки «ножки» варьировала от 0,8 до 1,7 нм. При длине «ножки» вместе с динитрофе- нильной группой, равной 1,0 нм, вращательные движения иминоксильного радикала в присутствии динитрофе- нильных антител существенно ограничивались. Это свидетельствовало в пользу иммобилизации радикала в активном центре антитела. Но стоило увеличить длину ножки еще на 0,2 нм, как ограничения для вращательных движений радикала резко уменьшались. Из этих опытов следовало, что протяженность центра для динит- рофенильной группы составляет 1,0—1,2 нм.

Реакция антиген-антитело. Преципитация. Образование нерастворимого комплекса при смешивании высокодисперсного антигена с антителами называют преципитацией. Этот феномен достаточно сложен по своему механизму. Выяснено, что наиболее эффективно преци- питируют антиген антитела М-класса. К ним приближаются по активности антите-

± + + + 2± + + + 2+ + + ±+ + + ±Номера про5 с Возрастающим количеством антигенаНомера про5 с Возрастающим количеством антигенаРис. 55. Реакция количественной преципитации:Рис. 55. Реакция количественной преципитации:/ — содержание в пробах свободно-го антитела, 2 — содержание впробах свободного антигена; а—зона избытка антитела. 6 — зонаэквивалентности, в — зона избыткаантигена/ — содержание в пробах свободно-го антитела, 2 — содержание впробах свободного антигена; а—зона избытка антитела. 6 — зонаэквивалентности, в — зона избыткаантигенала, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G. М. Гейдельбергер и Д. Кендалл (М. Heidelberger, D. Kendall, 1937) разработали количественный метод реакции преципитации и описали основные закономерности реакции применительно к антителам IgG-класса.В том случае, когда к постоянному количеству антитела добавляют возрастающие количества антигена, количество преципитата будет возрастать до определенного максимума. Затем с увеличением дозы антигена количество преципитата начнет уменьшаться вплоть до его полного исчезновения (рис. 55). Удалив преципитат, в надосадочной жидкола, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G. М. Гейдельбергер и Д. Кендалл (М. Heidelberger, D. Kendall, 1937) разработали количественный метод реакции преципитации и описали основные закономерности реакции применительно к антителам IgG-класса.В том случае, когда к постоянному количеству антитела добавляют возрастающие количества антигена, количество преципитата будет возрастать до определенного максимума. Затем с увеличением дозы антигена количество преципитата начнет уменьшаться вплоть до его полного исчезновения (рис. 55). Удалив преципитат, в надосадочной жидко

± + + + 2

± + + + 2

+ + + ±

+ + + ±

Номера про5 с Возрастающим количеством антигена

Номера про5 с Возрастающим количеством антигена

Рис. 55. Реакция количественной преципитации:

Рис. 55. Реакция количественной преципитации:

/ — содержание в пробах свободно-го антитела, 2 — содержание впробах свободного антигена; а—зона избытка антитела. 6 — зонаэквивалентности, в — зона избыткаантигена

/ — содержание в пробах свободно-го антитела, 2 — содержание впробах свободного антигена; а—зона избытка антитела. 6 — зонаэквивалентности, в — зона избыткаантигена

ла, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G. М. Гейдельбергер и Д. Кендалл (М. Heidelberger, D. Kendall, 1937) разработали количественный метод реакции преципитации и описали основные закономерности реакции применительно к антителам IgG-класса.

В том случае, когда к постоянному количеству антитела добавляют возрастающие количества антигена, количество преципитата будет возрастать до определенного максимума. Затем с увеличением дозы антигена количество преципитата начнет уменьшаться вплоть до его полного исчезновения (рис. 55). Удалив преципитат, в надосадочной жидко

ла, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G. М. Гейдельбергер и Д. Кендалл (М. Heidelberger, D. Kendall, 1937) разработали количественный метод реакции преципитации и описали основные закономерности реакции применительно к антителам IgG-класса.

В том случае, когда к постоянному количеству антитела добавляют возрастающие количества антигена, количество преципитата будет возрастать до определенного максимума. Затем с увеличением дозы антигена количество преципитата начнет уменьшаться вплоть до его полного исчезновения (рис. 55). Удалив преципитат, в надосадочной жидко

сти можно определить наличие свободных антигена и антитела. Опыт показывает» что в пробах, соответствующих левой части кривой (прежде всего в начальной ее части), весь добавленный антиген находится в преципитате, а в надосадочной жидкости присутствуют антитела. В точке, соответствующей максимальному содержанию преципитата, весь добавленный антиген и все антитела, содержавшиеся в пробе» находятся в преципитате. В пробах, соответствующих правой части кривой, в надосадочной жидкости содержится свободный антиген. Соотношение реагентов, соответствующее образованию максимального количества преципитата, называют точкой эквивалентности. Определив в этой точке содержание белка в преципитате и вы-

чтя из полученной величины количество добавленного антигена (если это белок), получают содержание антител в анализируемом объеме антисыворотки.

Приведенные выше расчеты основаны на теории количественной преципитации, разработанной М. Гейдель- бергером и Д. Кендаллом. Ммн впервые доказано, что в состав преципитата не вовлекаются никакие сывороточные белки, за исключением антител. Разумеется, в состав преципитата могут быть вовлечены компоненты системы комплемента: Clq и СЗЬ. Чтобы исключить зто, из сыворотки предварительно удаляют комплемент (например, другим иммунным комплексом) или инактивируют его прогреванием сыворотки при 56еС в течение 30 мин.

Содержание антител в пробе, соответствующей любой точке зоны избытка антител, можно определить по формуле АЬп=ах •——匕炉，где ^ьп 一 количество антител в преципитате, % — количество добавленного антигена, а и 匕一константы, величины которых находят по графику. Величину а находят по точке пересечения экспоненты с осью ординат. Величина b равна тангенсу угла наклона экспериментальной кривой к оси абсцисс.

Выразив отношение АЬп/х через R, значение АЬп находят из уравнения Abn=2Rx ——R2a2A где Л — количество преципитата в точке эквивалентности.

Указанное уравнение основано на законе действующих масс. Оно применимо для описания реакции количественной преципитации только в зоне избытка антител и точке эквивалентности.

Реакция количественной преципитации является первой иммунологической реакцией, учет результатов которой является строго количественным, поскольку без количественного учета реакций невозможно введение химических представлений в любую биологическую дисциплину.

Реакция преципитации не принадлежит к числу чувствительных реакций определения антител (антигена). Если концентрация антител в пробе ниже 0,5 мг/мл, преципитат образуется медленно. Для полноты осаждения комплекса пробы приходится'оставлять на холоду на несколько суток. При низкой концентрации антител преципитат вообще не выпадает. Однако агрегация антител антигеном все же идет и, чтобы ее оценить, прибегают к технике нефелометрии. Прибор основан на оценке степени рассеивания света, в качестве источника которого

служат либо ртутнне лампы, либо лазеры. Благодаря большой мощности монохроматического излучения, обеспечиваемого лазером (например, гелий-неонового), удается зарегистрировать даже небольшую степень рассеяния света.

Согласно принятой технике нефелометрии оценивают интенсивность светорассеяния при соотношении антиген- антитело, соответствующему зоне избытка антител. В этом случае метод используют для количественного определения не антител, а антигена. Время предварительной инкубации смеси реагентов от нескольких минут до 1 ч.

113yqeнне теоретических основ реакции преципитации оказалось важной вехой как в изучении строения и свойств антител, так и в исследовании механизма реакции антиген-антитело. Имеются основания утверждать, что при взаимодействии антител с по^чпвалентным антигеном происходит образование «решетки», напоминающей кристаллическую (рис. 56). По данным электронной микроскопии, антитела, участвующие в формировании преципитата, имеют Т-образную форму, т. е. угол между Fab-участками молекулы достигает 180°. Это существенно для формирования самой решетки н придания ей достаточной степени жесткости. Важная роль принадлежит при этом району 《талнн》. При разрушении меж- цепьевых дисульфидных связей в этом районе антитела еще сохраняют способность преципитировать антиген, но время формирования преципитата резко возрастает.

Необходимо подчеркнуть, что антитела разного видового происхождения, относящиеся к и м му но гл обул ин а м G, по-разному ведут себя в реакции преципитации. Так, комплексы, образованные антителами лошади против ■белковых антигенов (например, против бактериальных токсинов), растворимы в избытке антитела (феномен прозоны). Это можно связать с большим электрическим зарядом IgG-антител лошади в сравнении с IgG-антитс- ламп кролика той же специфичности и, как следствие этого, их большей растворимостью.

Реакция преципитации в еел吐 Преципитация комплекса а н тиген - а нтитело непосредственно в инертном геле (как правило, агаре или агарозе) нашла широкое применение для анализа антигенов. Современные модификации метода основаны на том, что взаимодействие антигена и антитела происходит непосредственно в толще геля, куда реагирующие соединения поступают за

счет диффузии. Для этого гель не должен быть слишком плотным, обычно готовят 0,7-—1,0%-ные гели.

Широко используемы甘 метод двойной диффузии в агар^ предложенный О. Ухтерлони '(О- ~Ouchterlony^ 1948), состоит в том, что антиген (ы) и антитело (а) помещают в лунки, проделанные в тонком слое геля на

Рис. 56. Структура комплекса, образованного IgM- антителами и поливалентным антигеном (эритроцит): Э — эритроцит, Д — детерминанта антигена Ат — антитела

небольшом расстоянии друг от друга. Диффундируя в гель, антиген и антитело встречаются и возникающие комплексы образуют преципитат. Преципитат формируется в виде тонкой линии, когда соотношение реагентов близко к точке эквивалентности. Зона преципитации проницаема для антигенов и антител, не взаимодействующих с теми, которые образовали преципитат. В результате может образоваться несколько зон преиитпа- ции, каждая из которых соответствует индивидуальному антигену и антителам к нему. Положение зоны преципитации относительно лунок с антигеном и антителом за-

висит от двух факторов: коэффициента поступательной диффузии данного вещества и его концентрации. Коэффициент диффузии определяется, как известно, размером и формой молекулы. Концентрационная зависимость зоны преципитации определяется необходимое гью достижения эквивалентных отношений реагентов для эффективного формирования преципи га га.

Помимо выявления антигенной неоднородности метод двойной диффузии в геле позволяет сравнить антигенное строение нескольких веществ и выявить наличие -сходства и различий между ннмн. Как всякий иммунологический метод, метод двойной диффузии в геле нмеет ограничения, основное из которых ——спектр антител в ис- •следуемой антисыворотке. Так, в ранних работах при сравнительном изучении антигенного строения IgG кролика и его Fab- и Fc-фрагментов использовали антисыворотку против IgG кролика, полученную от коз. Исследователям не было тогда известно, что животные этого вида не образуют практически антител против детерминант Fab-участка молекулы. Поскольку при использовании этой антисыворотки Fc-фрагмент давал реакцию антигенной идентичности с нерасщепленной молекулой IgG, сделали ошибочное заключение об отсутствии в Fab-участке видоспецифическпх антигенных детерминант. Ошибка была исправлена после исследования фрагментов молекулы IgG с помощью антннммуногло- ■булиновых сывороток, полученных от животных других видов. В антисыворотке осла против IgG кролика содержится примерно равное количество антител против антигенных детерминант Fab- и Fc-участком. На этом примере можно еще раз убедиться в необходимости использования при антигенном анализе антисывороток, полученных от животных разных видов (см. гл. 2).

Одним из часто применяемых в настоящее время вариантов реакции преципитации в геле является метод радиальной иууноди巾巾!/зи/ Он был разработан Дж. ФэЙ1ГД1~Ра11еу, 1965) и Г. Манчиии (G. Mancini, 1965) для количественного определения антигенов. При постановке реакции этим методом первоначально готовят гель, содержащий антисыворотку в разведенном виде (1 : 50— 1 : 200). В тонком слое такого геля продеты- вают лунки, в которые вносят антиген в различных концентрациях. Диффундируя в гель, антиген реагирует с содержащимися в нем антителами и образует преципитат в форме кольца вокруг лунки с антигеном. Так как

преципитат выпадает при эквивалентных соотношениях реагентов, диаметр кольца будет неодинаков вокруг лунок, содержащих различные количества антигена. Чем больше концентрация антигена, тем 'больший диаметр будет у образующегося кольца преципитации (рис. 57).

АА00© .@©0 ◎ ◎◎

А

А

6630203020WW40 6D 80 ЮОДиаметр , мм к 240 6D 80 ЮОДиаметр , мм к 2Рис. 57. Радиальная иммунодиффузия по Манчини. А — зоны преципитации в форме колец; Б — график зависимости диаметра зон преципитации от концентрации антигенаРис. 57. Радиальная иммунодиффузия по Манчини. А — зоны преципитации в форме колец; Б — график зависимости диаметра зон преципитации от концентрации антигенаzt EaaEHWszt EaaEHWsСравнивая кольцо преципитации образца антигена, концентрация которого не известна, с кольцами преципитации стандартного антигена, по калибровочной кривой находят его концентрацию. Метод особенно широко применяется с тех пор, как ряд фирм стал выпускать готовые пластины геля с антисыворотками и необходимые стандарты.

6

6

30

20

30

20

W

W

40 6D 80 ЮО

Диаметр , мм к 2

40 6D 80 ЮО

Диаметр , мм к 2

Рис. 57. Радиальная иммунодиффузия по Манчини. А — зоны преципитации в форме колец; Б — график зависимости диаметра зон преципитации от концентрации антигена

Рис. 57. Радиальная иммунодиффузия по Манчини. А — зоны преципитации в форме колец; Б — график зависимости диаметра зон преципитации от концентрации антигена

zt EaaEHWs

zt EaaEHWs

^мяуноэлектрофорез. Метод, введенный П. Грабаром (Р. Grabar et al., 1956), сочетает высокую разрешающую способность электрофоретического анализа макромолекул со специфичностью их выявления с помощью реакции преципитации в геле. Исследуемый образец подвергают электрофорезу в геле агара или агарозы. Затем параллельно оси движения исследуемых веществ в электрическом поле проделывают в геле траншею и заполняют ее антисывороткой. При встречной диффузии в геле

антитела и антигены, подвергнутые электрофоретическому разделению, образуют зоны преципитации в форме дуг-

Существует большое число модификаций основного метода, имеющих целью повысить его чувствительность. К ним относятся противоточный и двухмерный электрофорез, радиоиммуноэлектрофорез и др.

Агглютинация. Агрегация низкодпсперспых (пераст- воримых) антигенов с помощью антител называется агглютинацией. Антигенами могут быть бактерии, клетки крови (чаще всего эритроциты), другие клетки. Если антитела направлены против антигенов, являющихся составной частью бактериальной стенки или клеточной мембраны, реакцию обозначают как активную (активная агглютинация). Пассивной называют агглютинацию клеток антителами против антигенов, сорбированных или присоединенных ковалентно к клеточной мембране (обычно эритроцита). Во всех случаях, когда речь идет об агглютинации эритроцитов, реакцию называют гемагглютинацией (активная илн пассивная).

Реакция агглютинации по своему механизму не отличается от реакции преципитации. «Сшивка» бивалентными или поливалентными антителами (IgG или IgM) приводит к формированию «решетки» (см. рис. 21). В силу несоизмеримо больших размеров корпускулярного антигена по сравнению с молекулой антитела поперечная сшивка, например, двух соседних эритроцитов может оказаться недостаточной для их фиксации. Устойчивость агрегата растет по мере формирования «решетки», обеспечивающей связывание клеток по многим точкам. Именно поэтому поливалентные антитела намного эффективнее агглютинируют антигены в сравнении с бивалентными. Так, IgM-гемагглютинины более чем в 1000 раз активнее в реакции гемагглютинации, чем IgG- гемагглютинины.

Реакция агглютинации не имеет строго количественного учета. Однако практическая ценность ее столь велика, что и по сей день она остается важным инструментом как в руках исследователя, так и врача-лаборанга.

Активную агглютинацию используют в практических целях для определения групп крови, в диагностике инфекционных заболеваний.

Пассивная гемагглютинация — наиболее распространенный вариант реакции агглюгинации, применяемый главным образом в исследовательской работе. Фиксация

])астворимых белковых антигенов на поверхности эритроцитов осуществляется разными способам”. Некоторые способы основаны на предварительной обработке эритроцитов химическими соединениями, повышающими сродство поверхности клетки к белкам. Чаще всего эритроциты обрабатывают танином^ СгС1з- В других случаях

Рис. 58. Присоединение к поверхности эритроцита белкового антигена с помощью бис-диазобензидина (БДБ)

«пришивают» белковый антиген к поверхности эритроцита бифункциональными соединениями, в числе которых глутаровый альдегид, диазотированный диаминодп- фениламин, водорастворимые карбодиимиды (рис. 58). Для получения эритроцитов, «покрытых» полисахаридным антигеном, достаточно проинкубирова гь их в растворе полисахарида: полисахарид адсорбируется на поверхности эритроцитов, не подвергнутых какой-либо обработке. Гаптены, содержащие реакционноспособные группы, можно ковалентно присоединять к поверхности эритроцита. Так, при обработке эритроцитов динитрофенилсульфоновой кислотой к их. поверхности через свободные аминогруппы присоединяются динитрофснильныс радикалы.

Антитела также фиксируют на поверхности эритроцитов. Сенсибилизированные антителами эритроциты агглютинируют в присутствии антигена и, следовательно, могут быть использованы для обнаружения антигенов.

Для большей доступности активных центров антигел их присоединяют к поверхности клетки через «ножку». Один из вариантов такого метода (А. Оловников, 1968) связан с предварительной агрегацией иммуноглобулинов глутаровым альдегидом и последующей фиксацией агрегатов на обработанных глутаровым альдегидом эритроцитах (агрегат-агглютинация).

Реакция связывания комплемента (РС1\). Эта реакция относится к чувствительным непрямым методам регистрации реакции между антигеном и антителом. Она применима лишь в случае антител, относящихся к классам IgG и IgM, которые активируют комплемент по классическому пути.

Реакцию выполняют в два этапа. Первоначально проводят реакцию антиген-антитело в присутствии комплемента (обычно это сыворотка морской свинки). После инкубации смеси определяют содержание несвязавшего- ся комплексом (не активированного) комплемента с помощью реакции иммунного гемолиза (см. гл. 8).

Количественный вариант реакции связывания комплемента в одной из принятых модификаций (И. 1 арха- нова, А. Коников, 1957) основан на связывании комплемента в зоне эквивалентности системы антиген-антитело. К равным количествам антител добавляют антиген в возрастающей концентрации и комплемент. Пробы оставляют на 1 ч при 37℃ или на 18 ч при 0℃. Затем в каждой пробе определяют количество свободного комплемента по способности последнего лизировать эритроциты барана, сенсибилизированные IgG-антителами кролика против эритроцитов барана. Количество связанного комплемента выражают в СН50, т. е. количестве комплемента, необходимом для 50%-ного гемолиза сенсибилизированных антителами эритроцитов. Если выразить графически зависимость между количеством антигена в пробе и количеством связанного комплемента, полученная экспериментальная кривая окажется подобной кривой, описывающей зависимость между количеством белка преципитата н количеством добавленного антигена (см. рис. 55 и 59). В одной и той же системе антиген-антитело соотношение реагентов, соответствующее образованию максимального количества преципитата, с одной стороны, и максимальному количеству связанного комплемента, с другой, обычно совпадают. Однако в отличие от реакции преципитации РСК чувствительнее по меньшей мере в 50—100 раз, т. е. во столько раз можно развести анти-

сыворотку и во столько же раз уменьшить дозу антигена по сравнению с реакцией количественной преципитации, чтобы количественно охарактеризовать связывание комплемента в точке эквивалентности системы.

Связывание комплемента иммунным комплексом, содержащим эритроциты, нашло широкое применение для обнаружения клеток, синтезирующих антитела. Метод

локального гемолиза

Количество антигена, мк2Количество антигена, мк2Рис. 59. Реакция связывания комплемента в количественной модификацииРис. 59. Реакция связывания комплемента в количественной модификациив геле, предложенный Н. Ерне (N. Jerne, С. Henry, 1963), основан на реакции ком пле- мснтзависимого гемолиза эритроцитов после сенсибилизации эритроцитов антителами, продуцируемыми отдельными клетками. В рас-' плав агара или агарозы вносят взвесь клеток селезенки или лимфоузла от животного, иммунизированного ксено-

Количество антигена, мк2

Количество антигена, мк2

Рис. 59. Реакция связывания комплемента в количественной модификации

Рис. 59. Реакция связывания комплемента в количественной модификации

генными эритроцитами.

В агар добавляют также большой избыток тех же эритроцитов. Агар разливают тонким слоем в чашки Петри и инкубируют последние 1 ч при 37° С. За этот срок антителопродуцирующие клетки секретируют некоторое количество антител, которые присоединяются к окружающим клетку эритроцитам. Затем на чашки наслаивают раствор комплемента и снова инкубируют их при 37° С. Комплемент диффундирует в агар и, связываясь эритроцитами, сенсибилизированными антителами, вызывает их лизис. При просмотре чашек невооруженным глазом будут видны круглые зоны просветления в агаре, число которых соответствует числу антителопродуцирующих клеток. Мето工 может быть применен для определения клеток, продуцирующих антитела против самых разнообразных антигенов. Антигены или гаптены при этом фиксируют на поверхности эритроцитов, засеваемых в агар. После связывания антител против соответствующего антигена эритроциты в присутствии комплемента лизируются (так называемый пассивный гемолиз).

Радиоиммунологические методы. Это наиболее чувствительные из широко используемых в лабораторной

практике методов регистрации реакции антиген-антитело. Существует много модификаций метода, но принцип един: либо антиген, либо антитела метят радиоизотопами и судят о протекании реакции, измеряя радиоактивность водонсрастворимого комплекса.

Чаще всего в настоящее время антиген или антитела метят радиоактивным иодом (1251). Иод включается по остаткам тирозина, причем, как правило, образуется ди- иодтирозин. При этом стремятся ввести в молекулу антитела (белковый антиген) следовые количества иода —— несколько атомов на молекулу. В противном случае может произойти значительное изменение структуры и свойств антитела или антигена.

Самый простой случай применения радиомечсного антигена, например сывороточного альбумина,— определение антител к этому антигену в исследуемой антисыворотке. Меченый 1251-альбумин прибавляют к антисыворотке. Смесь инкубируют около 1 ч, после чего осаждают сывороточные иммуноглобулины сульфатом аммония при 40%-ном насыщении. Поскольку альбумнн нс осаждается указанными конценграциями сульфата аммония, его присутствие в преципитате может быть следствием только формирования комплекса между альбумином и антителами к нему.

Часто радиоиммунный анализ основан на принципе конкуренции меченого антигена с немеченым. Например, требуется установить, содержится ли в изучаемом препарате данный антиген? Существует тест-система, состоящая из такого же антигена, меченного радиоактивным г'одом, и антител к нему. Исследуемый препарат инкубируют первоначально с антителом, а затем добавляют меченый тест-антиген. Затем иммунный комплекс осаждают либо сульфатом аммония, либо антииммуноглобу- линовой сывороткой. Если радиоактивность в опытной пробе ниже, чем в контрольной (где содержатся только компоненты тест-системы), значит в изучаемом образце содержится антиген, сходный или идентичный радиомс- ченому антигену тест-систсмы. Тот же метод может быть построен на принципах иммуносорбции с использованием иммобилизованных антител. При этом отпадает необходимость осаждения иммунного комплекса. Методы, основанные на принципе конкуренции, нетрудно выполнить на количественной основе. Именно таким способом могут определяться различные гормоны, причем в количе-

ствах, не выявляемых ни одним из известных биохимических методов (от 1 до 100 пг вещества).

В биохимии часто возникает задача изучения скорости биосинтеза различных биологических макромолекул. Новообразованное вещество, включившее в процессе биосинтеза радиомеченые предшественники (меченные по ,4С или 3Н аминокислоты, пуриновые или пиримидиновые основания, сахара), можно выявить с помощью той или иной модификации метода радиоиммунного анализа. При этом наиболее целесообразно использовать анти гола против изучаемого вещества, иммобилизованные на инертном носителе. Ряд примеров такого анализа приводился выше, в частности метод определения скорости биосинтеза Clq (см. гл. 8). Практически методом радиоиммунного анализа можно определить место биосинтеза и скорость биосинтеза любого органического соединения, против которого можно получить антитела.

Метод инактивации фага. Метод разработан в лаборатории М. Села в конце 60-х годов. Этот метод является, видимо, наиболее чувствительным среди других иммунологических методов. Чисто теоретически с его помощью можно обнаружить всего несколько молекул антител или антигена. Принцип метода состоит в инактивации бактериофага, конъюгированного с определенным антигеном, при помощи антител против этого антигена. Фаг конъюгируют с антигеном (например, инсулином, ангиотензином), используя глутаровый альдегид, водорастворимые карбодиимиды пли другие реаюнты. Конъюгацию проводят в мягких условиях, чтобы не инактивировать фаг. При постановке опыта конъюгированный фаг и антитело против присоединенного к нему антигена смешивают с бактериальными клеткамн-мншенямн и заключают в тонкий слой мягкого агара. В качестве контроля используют только конъюгированный с антигеном фаг. В контроле фаг, заражая бактериальные клетки, вызывает их гибель. При этом вокруг каждой фаговой частицы образуется зона просветления в агаре — бляшка (plaque). В опыте за счет взаимодействия антител с антигеном, фиксированным на поверхности фаговой частицы, фаг утрачивает способность заражать бактериальные клетки. В силу этого число бляшек в опытной пробе меньше, чем в контрольной. В качестве примера приведем определение этим методом простагландинов. С помощью антител против простагландина F2a и бактериофагов, конъюгированных с простагландинами, можно

определить 140 пг простагландина F2a и 7>< 104 пг простагландина Ei. Принцип определения ничем не отличается от обсуждавшегося в предыдущем разделе принципа конкуренции антигенов за антитело тест-системы. Различия в чувствителыюсти определения сравниваемых простагландинов прямо коррелируют со степенью их структурных отличий (напомним, что антитела были направлены против простагландина Fza).

Метод инактивации фага достаточно трудоемок и может быть использован только для решения определенных исследовательских задач.

Иммуноферментный анализ. Метод широко внедрен в лабораторную практику в последнее время. В основе метода—использование антител, меченных ферментами (чаще всего пероксидазой). Конъюгацию осуществляют глутаровым альдегидом или другим бифункциональным реагентом. Реакцию проводят в условиях, исключающих инактивацию фермента. Техника постановки реакции состоит в следующем. Антиген адсорбируют на поверхности лунок в пластинах из полистирола. Если антитела, меченные ферментом, направлены к адсорбированному антигену, они окажутся фиксированными в лунках. Затем в лунки вносят раствор субстрата (если к антителам присоединена пероксидаза, то это перекись водорода и индикатор — диаминобензидин). В результате ферментативного превращения субстрата появится цветной продукт. Степень окраски пропорциональна количеству сорбированных антител с ферментом.

Иммуноферментный метод пригоден для определения как антител, так и антигенов в и сел сдо в а тел ьских лабораториях и клинике. Он не требует дорогостоящего оборудования н во многих случаях может с успехом заменить радиоиммунологические методы.

Иммунохимические методы в биохимии

В этом разделе будут приведены несколько выразительны^ примеров использования методологии современной иммунохимии для решения актуальных задач молекулярной биологии и классической биохимии.

Выделение высокоочищенных мРНК. Сущность подхода состоит в использовании антител против соответствующего белка для извлечения полирибосом, содержа-

ших растущую полипсптндную цепь этого белка. Экспериментально доказано, что растущая цепь приобретает антигенную специфичность, характерную для этого белка, очевидно, за счет постепенного (начиная с N-конца) формирования ею третичной структуры. Извлечение полирибосом может быть осуществлено с помощью техники иммуносорбцпи при использовании иммобилизованных антител (см. раздел 12.2) или путем преципитации комплекса антитело ——растущая полипептидная цепь-пол псом а с помощью антииммуноглобулиновых антител (I. Schechter, 1972). Выделение мРНК из преципитата осуществляется па основе общепринятых методов.

Изучение топографии компонентов рибосом. Эта задача служит важной составной частью изучения проблемы биосинтеза белка. Один из перспективных подходов для ее решения — иммуноэлектронная микроскопия. Например, с 'помощью антител против определенного рибосомного белка можно специфически «сшить» соответствующие рибосомные субчастицы. Выделив затем димеры «сшитых» бивалентными IgG-антитслами субчастиц, их изучают с помощью электронной микроскопии и определяют локализацию соответствующего белка.

Описанная выше схема исследования по ряду причин недостаточно эффективна. Во-первых, таким способом нельзя решить важный вопрос о расположении в субчастице РНК, прежде всего ее концевых участков, так как получить к ним антитела при иммунизации собственно РНК невозможно. Во-вторых, достаточно трудно получить в иммунохимически чистом виде различные белки, входящие в состав рибосомы, что позволило бы иметь антитела к строго определенному белку. Обе эти трудности можно обойти в случае модификации рибосомной РНК и белков гаптенами и последующей димеризации рибосомных частиц антителами против этих гаптенов. В качестве примера подобного исследования можно привести работу, выполненную И. Шатским, М. Кожухаро- вой, Л. Мочаловой и А. Богдановым (1978—1982).

С целью локализации 3'-конца 16S РНК малой субчастицы рибосомы Е coll его мо дифициро в а л и гаптеном на основе лактозы. В состав гаптена входила алифатическая аминогруппа. После окисления цис-гликольной группы рибозы в 16S РНК образующийся диальдегид обрабатывали гаптеном: 6-N-[p-(О-лактозИеТ)-бснзпл]-6- амипогексиламин и восстанавливали образующееся основание Шиффа боргидридом. Модифицированную такнм

способом РНК использовали для реконструкции 30S субчастицы. Реконструированные субчаетицы обрабатывали IgG-антилактозидными антителами кролика. При градиентном центрифугировании обработанных подобным способом субчастиц появлялся «тяжелый» компонент с коэффициентом седиментации около 40S. Агрегация реконструированных субчасгиц носила строп специфический характер, т. е. была обусловлена антителами к лактозиду, которые взаимодействовали с группировка?*1П гаптена, присоединенными к 3'-концам 16S РНК. Последующий анализ агрегатов в электронном микроскопе позволил доказать наличие димеров рибосомных часгиц, «сшитых» антителами, и определить место фиксации последних на субчастице.

С целью разработки метода модификации гаптенами рибосомных белков был использован белок S12. Использовали дшштрофенильный гаптен, который вводили в молекулу белка по сульфгидрильным группам. Моднфиии- рованный белок использовали для реконструкции 30S субчастицы. То, что такой белок действительно вошел при реконструкции в состав субчастицы, было доказано следующими иммунохимическими методами.

Последовательной инкубацией модифицированных по белку S12 субчастиц с антидинитрофснильными антителами кролика и антителами против IgG кролика, меченными изотиоцианатом фауоресцеина. После градиентного ультрацентрифугирования меточом спсктрофлуори- метрии было установлено напнине флуорохрома в пике 30S субчастии. Это доказывает включение модифицированного белка в реконструированную субчастицу и доступность гаптенной группировки для антител.

Обработкой с помощью меченых Fab-фрагментов антидинитрофснильных антител 30S субчастиц, которые реконструированы в присутствии белка S12, содержащего динитрофенильную группу. Радиоактивность была обнаружена в пике 30S субчастиц.

Тем самым двумя независимыми иммунохимичсскнми методами доказано включение меченного гаптеном белка в состав реконструированной рибосомы и доступность гаптенной группировки для антител. Последнее нашло также подтверждение в факте формирования димеров субчастиц, содержащих модифицированный белок S12 в присутствии антидинитрофснильных антител.

Метод иммуноэлектронной микроскопии может быть использован для изучения топографии не только рибо-

сом пых частиц, но и самых разнообразных самособираю- щихся 11 адм олскул я р н ы х структур.

Рецепторы для гормонов. Изучение строения и функции клеточных рецепторов, в том числе рецепторов д.ля гормонов,— одна из важных проблем биохимии. Значительный прогресс этих исследований связан с обнаружением и изучением свойств аутоантител против клеточных рецепторов для гормонов. Оказалось, что аутоантитела к рецептору для инсулина, будучи добавлены к клеткам печени, вызывают следующие инсулиноподобные эффекты： активируют внутриклеточный синтез гликогена и усиливают транспорт аминокислот в клетку. Указанные эффекты вызывают только бивалентные антнтела или их бивалентные F(abz)2-фрагмеиты, но не моновалентные Fab-фрагменты. Последние способны лишь блокировать связывание инсулина рецепторами (С. Kahn, С. Crunfeld et al., 1980).

О чем свидетельствуют приведенные данные? Прежде всего о том, что важнейшая из известных функций инсулина ——активация синтеза гликогена ——зависит от способности гормона «сшивать» на поверхности клетки- мпитенп несколько рецепторов для этого гормона.《С山“в- ка» рецепторов бивалентными антителами имитирует эффект гормона. Здесь прослеживается прямая аналогия с влиянием антиидиотипнческих антител на клетки им- MyHOv4oni4ccKoii памяти. Как обсуждалось в гл. 9, анги- идиотипическис антитела имитируют в этой ситуации эффект антигена. Иными словами, в обоих сравниваемы?; случаях очевидно, что роль индуктора (будь то гормон или антиген) сводится к изменению структурной организации рецепторов для индуктора на поверхности высокодифференцированной клетки.

Изучение эндокринной регуляции метаболизма с им- муиохимических позиций получило в последнее время новый существенный стимул. Антитела к некоторым гормонам н медиаторам (инсулину, p-адрснэргическому антагонисту ——алпренололу) использовали для получения антиидиотппичсских антнтел и анализировали их способность конкурировать с некоторыми лигандами или имитировать их действие. Эти антитела реагировали с клеточными рецепторами для гормонов или медиаторов строго специфично, т. е. в зависимости от того, каким по специфичности антителом они были индуцированы. Существенно, что антиидиотипические антитела против антител к гормону при добавлении к клеткам имитировали

ряд эффектов, инд5 цируемых обычно соответствующим гормоном (индуктором). Так, антитела против идиотипических детерминант антител к инсулину вызывают подобно инсулину усиление поглощения клетками а-амипо- масляной кислоты (К. Segc, Р. Peterson, 1980). Антитела против идиотипических детерминант антител к алпрено- лу, связываясь с р-адренэргическими рецепторами клеток, усиливают активацию аденилатциклазы катехоламином (A. Schreiber et al., 1979; Homey et al., 1981).

Из приведенных данных следует, что существует известное структурное подобие антител к гормонам и клеточных рецепторов для гормонов. Посвященные этой теме недавно появившиеся работы, выполненные на стыке биохимии н иммунохимии, могут стать важным направлением теоретической и прикладной биохимии.

Химия белков и энзимология. Роль иммунохимических исследований в изучении строения и функции белков со всей очевидностью вытекает из результатов работ по анализу антигенной структуры белков, структурно-функциональному изучению антител. Эти вопросы широко освещались в предшествующих главах. Здесь представляется целесообразным привести несколько примеров применения антител для анализа ферментов.

Установлено, что антитела к ферменту способны оказать на него конформирующее влияние. Так, антитела к каталазе способны стабилизировать структуру мутантной формы фермента и повысить его активность. Дру1 ой пример активирующего действия антител — влияние антител против рибонуклеазы на частично гидролизованный фермент. Известно, что расшепление рибонуклеазы субтилизином, приводящее к отщеплению N-концевого пептида из 20 аминокислотных остатков, лишает фермент активности. Если смешать указанный пептид (S-пептпд) и остальную часть молекулы (S-бслок, образованный 104 остатками) с антителами против рибонуклеазы, появится активный фермент, не отличающийся по специфичности от рибонуклеазы (В. Cinaclcr, 1971).

Антитела против ферментов не направлены к структурам непосредственно в активном центре, однако они могут полностью (в случае лецп гиназы) пли частично (в случае уреазы, каталазы, папаина, рибонуклеазы) экранировать его. В некоторых случаях антитела к ферментам вообще нс оказывают никакого влияния на функцию последних (щелочная фосфатаза, дифенолоксидаза).

Роль антител как стерического фактора хорошо про-

анализирована на примере а цетилхол инэстеразы. Если ацетил холинэстераза из эритроцитов быка не инактивируется антителами против этого фермента, то а цетил холинэстераза из электрического органа электрического ската после преципитации специфическими антителами в зоне эквивалентности проявляет следовую ферментативную активность. Это выражается в том, что гидролиз ацетилхолина замедляется примерно в 1000 раз. Если использовать субстрат с меньшей скоростью диффузии, чем у ацетилхолина (индофеиилацетат), то активность фермента в составе преципитата окажется соизмеримой с активностью свободного фермента. Эти данные позволяют понять результат другого эксперимента, в котором изучали гидролиз ацетилхолина свободной холинэстеразой и холинэстеразой в составе преципитата (в обоих случаях добавляли также фенил-триметиламмоний—• ингибитор ацетилхолинэстеразы). При дозе ингибитора, вызывающей торможение активности свободного фермента на 75%, фермент в составе преципитата был даже более активен, чем свободный. Из приведенных опытов следует, что эффект антител против фермента связан прежде всего с их опосредованным влиянием на доступность активного центра фермента для субстрата. Основная причина стерических помех кроется в агрегации фермента бивалентными антителами. В самом деле, моновалентные Fab-фрагменты антител против холинэстеразы вообще не влияют на активность фермента.

Приведенные данные удивительным образом коррелируют с наблюдениями, касающимися механизма нейтрализации антителами бактериальных токсинов (см. гл. 6). И дело здесь не только в том, что некоторые бактериальные гоксины — ферменты. Основное — необходимость межмолекулярных «сшивок» для эффективного пространственного экранирования активных центров, будь то ферментов, токсинов или других биологически активных соединений. Такие «сшивки» могут обеспечить лишь бивалентные или мультивалентные антитела.

Антитела к ферментам могут быть использованы для выделения фермента на иммуносорбентс. Это целесообразно как для очистки фермента, так и для удаления ого из реакционной смеси/Ферменты, фиксированные на сорбенте с иммобилизованными антителами против фермента, применяют с целью осуществления гетерофазного катализа. Существует ряд доводов в пользу применения иммобилизованных ферментов, в том числе фиксирован-

ных на иммуносорбеите. Наконец, при использовании сопряженных энзиматических систем, где отдельные ферменты значительно отличаются по кинетическим характеристикам, может потребоваться снижение скорости превращения субстрата одним из ферментов; это осуществимо с помощью антиферментных антителу

Эволюционная биохимия. Вопросы, связанные с изучением сходства строения белков разных биологических видов, с успехом могут решаться, в том числе с использованием методов антигенного анализа. Примером такого анализа служат собственно иммуноглобулины и многие другие белки.

Биосинтез и катаболизм белков. Использование ра- дпоиммупологичсской техники для изучения биосинтеза белков неоднократно обсуждалось на страницах этой книги. Иммунохимичсскпй анализ промежуточных продуктов катаболизма белков является также одним из основных инструментов в изучении проблемы (см. гл. 7).

Определение гормонов “ других соединений. Различные варианты иммунологической техники широко применяются в клинике и практически вытеснили какие-либо другие методы определения гормонов. Расширяется использование иммунологической техники для определения наркотиков, сердечных алкалоидов и других фармакологических веществ.

Моноклональные антитела

Неоднородность антител по физико-химическим свойствам и специфичности служит во многих случаях непреодолимым препятствием для их изучения и применения. В крайне редких случаях при иммунизации животных синтезируются однородные антитела, которые по всем критериям, включая идиотипическую характеристику, являются продуктом только одного клопа плазматических клеток и, следовательно, моноклональными. В подавляющем большлпствг случаев при иммунизации развивается поликлональный ответ.

Источником моноклональных иммуноглобулинов (см. гл. 3) служат клетки множественной миеломы человека и мышиной плазмацитомы. xVIiionie из них обладают специфическим сродством к некоторым гаптенам и антигенам. Такие иммуноглобулины могут быть в принципе отнесены к моноклональным антителам. Однако трудно

надеяться отыскать в «библиотеке» моноклональных иммуноглобулинов те из них, которые будут специфически связывать лиганды, интересующие в данный момент исследователя.

Как сочетать способность к продукции очень больших количеств однородных иммуноглобулинов, свойственную клеткам плазмацитомы, с возможностью п]юдукции такими клетками антител заданной специфичности? Только соединив достоинства клеток плазмацитомы н селекционированных антигеном популяций иммунокомпетентных клеток в одной клетке. Такая возможность существует на основе слияния клеток и получения так называемых гибридом. Гибридизацию клеток селезенки от иммунизированных мышей с клетками мышиной плазмацитомы впервые осуществили Г. Келлер я К. Мильштейн в 1975 г. (С. Kohler, С. Milstein). С тех пор работы в этом направлении получили большой размах, превратившись в новую отрасль биотехнологии — искусственное получение моноклональных антител требуемой специфичности, идиотипа и других наперед заданных свойств.

Техника получения гибридом, анализа продуцируемых ими иммуноглобулинов и другие специальные вопросы описаны к настоящему времени в ряде обзоров и монографий, в том числе и на русском языке (см. рекомендуемую литературу). Изложение нх не входит в нашу задачу. Что касается возможностей применения моноклональных антител в молекулярной иммунологии, существующих объективных ограничений при получении реально моноспецифнчных антител, то эти вопросы обсуждались в различных главах настоящей книги. Не вызывает сомнения, что гибридомная техника обогатила возможности ие только исследователя-иммунолога, но н специалистов в самых различных областях биохимии, где могут и должны использоваться иммунохимические методы.

Рекомендуемая литература

Безвертенко И. А. Аффинная хроматография. Киев, 1978.

Введение в им му ногенетику/Х.Фьюденберг, Дж. Пннк,

Д. Стайтс, Ан-Чуанг-Ванг. М., 1975.

Введение в иммунологию/И. Вейсман, Л. Худ, В. Вуд. М., 1983.

Зотиков £. А. Антигенные системы человека и гомеостаз. М., 1982.

11ммуноглобулины/Под ред. Г. Литмена и Р. Гуда. М., 1981.

11ммунологические методы/Под ред. X. Фримеля. М., 1979.

Иммунохимия в клинической лабораторной практике/Под ред.

А. М. Уорда, Дж. Т. Уичера. М., 1981.

Ку^ьберг Л. Я. Имму я оглобул ины как биологические регуляторы. М., 1975.

Кулъберг ,4. Я. Антииммуноглобулины. М., 1978.

Лимфоциты: выделение, фракционирование н характеристика/

Под ред. Дж. Б. Натвига, П. Перлманна, X. Вигзелля. М・,1980.

Ляшенко В. А., Воробьев А. А. Молекулярные основы иммуногенности антигенов. М., 1982.

Механизмы иммунопатологии/Под ред. С. Коена, П. А. Уорда и Р. Т. Мак-К?аскн. М” 1983.

Моноклональные антитела/Под ред. Р. Г. Кеннета, Дж. МакКерна, К. Б. Бехтол. М., 1983.

Образование антнтел/Под ред. Л. Глинна и М. Стюарта. М, 1983.

Петров Р. В. Иммунология. М., 1982.

Петров Р. В., Хаитов Р. М*, Атауллаханов Р. И. Иммуногенетика II искусственные антигены. М., 1983.

Структура и функция антител/Под ред. Л. Глинна и М. Стюарта. М., 1983.

Фонталин Л. Н., Певницкий Л. А. Иммунологическая толерантность. М., 1978.

Фриденттейн А. Я-, Лурия Е. А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. М., 1980.

Чард Т. Радиоиммунологические методы. М・，1983.

Benacerraf 6, Unanue £. R Textbook of Immunology. Baltimore/ London, 1981.

Gottlieb P. D. Immunoglobulin genes. Mol. Immunol., 1980, vol. 17, pp. 1423—1435.

Handbook of experimental Immunology/Ed. by D. M. Weiz. Ox- ford/London, 1979.

Immunobiology of proteins and peptides/Ed. by M. Z. Atassi, A. B. Stavitsky. NY—Ldn, 1977.

Immunology/Ed. by C. F. Bach. NY, 1982.

Kafz D. H. Lymphocyte differentiation, recognition and regula-

Nisonoff A., Hopper J. E., Spring S. B. The antibody molecule. NY, 1975.

Reid К. B. R. Proteins involved in the activation and control of the two pathways of human complement. — Biochemical Society Transactions, 1983, vol. 11, pp. 1—12.

Rosenthal A. B. Determinant selection and macrophage function in genetic control the immune response. — Immunol. Rev. 1978, vol. 40, p. 136.

Sell S. Immunology, immunopathogy and immunity. Maryland/NY, 1975.

Sidman Ch. В-Lymphocyte differentiation and the control of IgM ц-chain expression.— Cell, 1981, vol. 23, pp. 379—389.

Терминологический словарь

Аллотипы — индивидуальные структурные особенности легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов данного биологического вида; определяются различиями первичной структуры, которые находят отражение в различиях антигенного строения (детерминанта аллотипическая).

Альтернативный путь ——механизм активации системы комплемента, не требующий участия Cl, С4 и С2. Прн этом активация СЗ достигается при участии специальных факторов: В, О н пропердина.

Анафилаксия — системная или местная реакция организма на комплекс антигена и литофильных антител (IgG- или IgE-класса). Обусловлена высвобождением из тучных клеток вазоактивных аминов (гистамин, серотонин) и некоторых других биологически активных веществ.

Анафилатоксины — фрагменты третьего и пятого компонентов комплемента (СЗа и С5а), вызывающие высвобождение вазоактивных аминов, расширение сосудов н увеличение их проницаемости, изменение тонуса гладких мышц.

Антигены — биополимеры (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты) или их синтетические аналоги, индуцирующие реакции гуморального и (или) клеточноопосредованного иммунитета.

Антигены конъюгированные — антигены, представляющие собой белки, полисахариды пли различные синтетические полимеры, к которым в качестве дстермипант- ных групп присоединены самые разнообразные органические соединения.

Антидетерминанта ——участок молекулы антитела, связывающий детерминанту антигена. Образуется при участии вариабельных доменов легкой и тяжелой полипептидных цепей иммуноглобулинов.

Антитела — иммуноглобулины, специфически связывающие антигены или гаптены.

Белок Бенс-Джонса — димеры (реже мономеры) легких полипсптидных цепей иммуноглобулинов, содержащиеся в моче больных множественной миеломой.

Валентность антигена — число ангигснных детерминант одинакового строения.

Валентность антитела ——число антидстерминаит (активных центров) в молекуле антитела. У иммуноглобулинов классов G, D, Е и А (в форме мономера) число антидетерминант равно двум, у иммуноглобулинов класса М — десяти.

Вариабельный район ——аминоконцевой участок легкой илн тяжелой цепи иммуноглобулина, характеризующийся значительными индивидуальными различиями первичной структуры.

Вариотип — структура инвариантг!ых аминокислотных последовательностей в пределах вариабельных районов легкой и тяжелой цепей. Антигенные детерминанты этого типа называют также framework.

Гаптен — аналог детерминантной группы антигена, взаихюдействующий с антителами, но не вызывающий их продукции. Различают одно-, ди- и мультивалентные гаптены в зависимости от числа содержащихся в молекуле идентичных детерминантных групп.

Гены иммуноглобулинов — сегменты ДНК, кодирующие аминокислотную последовательность полипептидных цепей и м мун о г л о б ул ин о в. Легкие цепи кодируют три сегмента: Vl, Jl и Cl. Вариабельный район тяжелой цепи кодируют три сегмента: Vh, D и Jr. Константные районы тяжелых цепей кодируют С-сегменты, которые обозначают в зависимости от класса цепи как Cv> &, Са, Сб II Се.

Гипервариабельные участки ——участки аминокислотной последовательности вариабельных районов с наибольшими индивидуальными вариациями первичной структуры.

Детерминанта антигенная, конформационнозависимая——детерминанта, структура которой, а следовательно, II специфичность зависят от пространсгвеннон конформации антигена. Характерна для глобулярных белков и синтетических полипептидов регулярного строения, образующих устойчивую вторичную структуру.

Детерминанта антигенная, секвенциального типа — детерминанта, структура которой опре工езяется только

последовательностью соответствующих аминокислотных остатков, сахаров или оснований в белках, полисахаридах ил и нуклеиновых кислотах, равно как и их синтетических аналогах. Крайне редко встречается в белках, но характерна для разветвленных (branch) синтетических полипептидов, не имеющих упорядоченной вторичной структуры, а также для полисахаридов, имеющих в своем составе разветвленные боковые цепочки олигосахаридов.

Детерлшнантная группа ——структура молекулы антигена, распознаваемая антителами (иммуноглобулиновыми рецепторами В-лимфоцитов). Термин «дстерминант- ная группа» приложим также к структурам антигена, распознаваемым Т-лимфоцитами. Последние отличимы по строению и пространственной локализации от детерминант, распознаваемых В-лимфопитами (исключение—- детерминанта для Т-суппрессоров).

Домены иммуноглобуланов ——устойчивые глобулярные образования, характерные для третичной структуры полипептидных цепей иммуноглобулинов; стабилизированы дисульфидными и нсковалентными связями. Различают вариабельные (V) и константные (С) домены легких и тяжелых цепей.

Идиотип — структурные особенности иммуноглобулинов, продуцируемых индивидуальными плазматическими клетками (клонами клеток). Определяются строением вариабельных районов легких и тяжелых цепей. 11диоти- пические антигенные детерминанты расположены в непосредственной близкостн от антидстерминанты антитела. В иммуноглобулиновых рецепторах В-лимфоцитов и аи- тигенспецифических рецепторах Т-супрессоров также существуют идиотипические детерминанты, совпадающие по строению с аналогичными детерминантами антител той же специфичности.

Изотип. — видоспецифическис особенности иммуноглобулинов, определяемые строением константных районов тяжелых цепей. Изотипические антигенные детерминанты характерны для каждого класса (подкласса) и?л- муноглобулинов.

Иммуноглобулины ——семейство сывороточных белков, характеризующихся сходством принципов структурной организации и способностью в качестве антител взаимодействовать с антигенами. Различают пять классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE.

Иммунодолшнантная группа ——участок детерминант- ной группы антигена, который вносит наибольший вклад во взаимодействие детермпнантной группы с антидетср- минангон антитела.

Классический путь — механизм активации системы комплемента. Включает пять характерных для этого пути инициирующих компонентов: Clq, СIr, Cis, С4 и С2.

К-Клетки — лимфоциты, способные фиксировать антитела через Fc-участок молекулы и обусловливать реакцию антптелозависимой клеточной цитотоксичности (antibody mediated cell cytotoxicity).

Комплемент ——семейство белков сыворотки крови, способных после их активации, в том числе комплексом антиген-антитело, вызывать необратимые повреждения клеток-мишеней и ряд других реакций. Включает 11 белков классического пути активации п несколько дополнительных компонентов, необходимых для альтернативного пути акТ11вации.

Конвертаза СЗ -— фермент, активирующий ключевой компонент системы комплемента СЗ. Различают конвер- тазу классического пути активации ——комплекс активированных четвертого и второго компонентов комплемента (С4Ь 2а) и конвертазу альтернативного пути—активированный фактор В (Вв).

Лимфокины ——белки неиммуноглобулиновой природы, продуцируемые лимфоцитами и обладающие различной биологической активностью. В числе лимфокинов интерферон и интерлейкины — факторы, регулирующие пролиферацию н дифференцировку лимфоцитов.

Лимфоциты — клетки, содержащиеся в центральных (костный мозг и тимус) и периферических (селезенка, лимфоузлы) органах иммунной системы, а также в крови и лимфе. Обусловливают реализацию антигензависимых реакций гуморального н клеточного иммунитета.

В-Лимфоциты (В-клеткп)—лнм巾ощпы, происходящие из бз рсы (фабрициева сумка) у птиц или се аналога у млекопитающих.

Макрофаги — крупные фагоцитирующие клетки, находящиеся в самых различных органах. Выполняют важную вспомогательную роль в индукции и регуляции гуморального л клеточного иммунигета прежде всего благодаря переработке и представлению (презентация) антигена лимфоидным клеткам.

Представление (презентация) антигена ——процесс захвата п переработки антигена макрофагами, приводящий

к появлению на поверхности этих клеток высокоиммуно- гсиного комплекса антигена с белками, кодируемыми iо- намн 1-раноиа основного комплекса гистосовместимости.

Рецепторы для иммуноглобулинов (Fc-рецспторы)—— интсграл.ные компоненты мембраны лимфоцитов, макрофагов и некоторых других клеток, связывающие через Fc-участок молекулы иммуногло бул ины разных классов. Гликолппопротеины по химической природе.

Рецепторы для компонентов комплемента —- гликопротеины, находящиеся на поверхности В-лимфоцитов и некоторых других клеток н способные нзаимодействовагь с рядом активированных компонентов комплемента и продуктов их дальнейшей деградации: СЗЬ, C3d.

Рецепторы иммуноглобулиновые ——белки иммуноглобулиновой природы, являющиеся интегральными компонентами мебраны В-лимфоцитов. Способны подобно антителам специфически взаимодействовать с антигенами (гаптенами). Отличаются от сывороточных иммуноглобулинов строением С-концевых участков тяжелых цепей.

Реагины — антитела IgE-класса у человека, фиксирующиеся через Fc-участок своей молекулы на поверхности тучных клеток. Обеспечивают после взаимодействия со специфическим антигеном высвобождение из тучных клеток вазоактивных аминов и других медиаторов анафилаксии.

Гимусзависимый иммунный ответ——иммунный ответ, требующий участия Т-хелперов и макрофагов. Связан с особенностями строения антигена, который обозначают как тимусзависимыи. К числу этих антигенов относятся глобулярные белки, чужеродные эритроциты и другие клетки. Контролируется генами иммунного ответа (1г- генами).

Фактор D — проактиватор СЗ-конвертазы альтернативного пути активации комплемента.

Предметныйуказатель

Агглютинация 258

Агрегатагглютинация 260

Аллельное исключение 198

Аллергены 126

Аллотип 17

Аллотипическне маркеры 80, 81*

Анатоксин 141

Анафилаксия 128

—субстанции 126, 146

Лнафилатоксины 181

Антиген, выбор дозы 45

—детерминантные группы 22

—мембранный дифференци- ровочный В-лимфоцитов (MBLA) 11

—поливалентный 198

—соматический 40

—HTLA 11

—1а 11

О-Антнген полный 40*, 45

Антиген-антитело, комплекс 166, 169, 190

получение в нерастворимом виде 241

,реакция преципитации 252

—(гаптен)—антитело, регистрация реакции 246

Антнгензавнсимая дифференцировка лимфоцитов 16

Антигенная специфичность 52, 53, 117

—структура белков, методы изучения 27

Антигенные детерминанты, типы 75

—маркеры 10, 11*

Антигенный анализ 32

Антигенраспознающие рецепторы лимфоцитов 52

Лнтигенсвязывающие рецепторы 17

Антигены 10, 14, 20

--белки 27

—конъюгированные 20, 22, 27

—крови групповые 46

—нуклеиновые кислоты 37

—перекрестно реагирующие 234

—полипептиды 27

―полисахариды 39

—синтетические полинуклеотиды 37

— тимусзависимые 18

— тпмуснезависимые 18, 128

Антидетерминанта 25

—организация структуры 103

Антниммуноглобулнны 237

Антисыворотка моноспецифиче- ская 77

Антитела 12

—автономия лпгандсвязываю-

' тих участков структурная 72

— активность специфическая 243

—активный центр 91, 92, 94*, 97*, см. также Антидетерми- панта

—биосинтез, усиление адъювантами 227

ан гителами 226

— влиянием на процесс презентации антигена макрофагами 224

—моноклональные 30, 270

——нейтрализация вирусов 143*, 144

— подавление иммунного ответа, механизм 224

—полиспецифнчность 98

—применение для анализа ферментов 268

—продукция 16

—происхождение многообразия 112

—роль в усилении фагоцитоза 142

—специфичность 32

—тушение флуоресценции гаптеном 249

—участие в высвобождении биогенных аминов из тучных клеток 145

—цитотропные 126

Антитоксины 141

Артрит ревматоидный 236

Белки Бенс-Джонса 79

Болезни аутоиммунные 228, 234

роль генетических факторов 237

человека 39

Болезнь новорожденных гемолитическая 225

— хроническая лучевая 234

Вирус Эпштейн-Барр 211, 236

Воспаление 162, 163

—индукторы 163, 166

Гаптен 20, 24, 25*, 96*

I емагглютинацпя 49, 258

Гемопоэз 9

Гены иммунного ответа 46, 214

—иммуноглобулиновые, организация 107. 109*, 111*

——основного комплекса гистосовместимости 53

Гепатоциты 189

Гпбридомы 271

Гпперчувствителыюсть замедленного типа 51, 186

—немедленного типа 126

Гомоцптотропины 126, 127, 129

Групповые вещества крови 47, 48*

Детерминангная группа антигена 26

структура 41

Детерминанты антигена, распознаваемые В- и Т-лимфоцитами 49

—аллотипические 79

—вариотипичсскпе 90

—идиотипические 87, 199

—изотипические 76

—конформационные (конфор- мационнозавиенмые) 31

—секвенциальные 32, 33, 36

размер 37*

Домен 65, 69, 71*

Идиотип 17

Иммунитет клеточно-опосредованный 12, 51

Иммунная система 7

клетки 7

op гэны 7

Иммунное прикрепление, феномен 172, 183

Иммунные комплексы 190

Иммунный ответ 13, 15, 20, 102

гены 214

генетическая рестрикция

генетический контроль 215

индукция и регуляция 212

на тимусзавпспмые антигены 50

первичный 17

подавление 38

антителами, механизм 224

регуляторное действие антител 223

Иммуноглобулин А, структура субдголекулярная 61*

единица транскрипции, гипотетический механизм формирования 116*

рецепторный 196

—D рецепторный 192

—Е рецепторный 129*» 191, 196

—G, третичная структура доменов 70*

фрагменты молекулы, усиливающие фагоцитоз 161

—М, рецепторный 129*. 194*, 196

структура субмолекулярная 60"

Иммуноглобулины 54, 55

―аллотип 75

―антигенное строение 75

—антигензавнеимые функции 140

—афферентная функция 123

—биосинтез 107

— вариабельные участки 63

—вариотип 76

—гиперварпабельные участки 63

—идиотип 76

—изотип 75

—интерференция эффекторных функций 151, 152

— катаболизм 153

—консервативные участки 63

—константные районы 63

—кролика 83

аллотипы 85*

—легкие цепи 56

пространственная структура 69

— межцепьевые дисульфидные связи 57

—моноклональные, полиспеци- фнчность 102

—мыши 86

аллотипнческие маркеры 86"

—независимость путей синтеза 193

—неспецифические 100

—новообразованные, секреция 122

—нормальные См. Иммуноглобулины неспецифические

—организация четвертичной структуры 69

—полимерные формы, сборка 122

—преодоление плацентарного барьера 124

—принцип самосборки молекулы 58

—продукты распада и воспаление 163

—реабсорбция в извитых канальцах почек 124

——рецепторы на перитонеальных макрофагах 132*

—связывание белка Л Staphylococcus aureus 139

Clq субкомпонента первого компонента комплемента 134

СЗ 133

——структура первичная полипептидных цепей 63

субмолекулярная 55*

—«сшивка» рецепторов 195, 198, 231

—«талия» молекулы 57, 66,

68*, 74, 131, 160, 254

—трансляция легких н тяже- □ых цепей 120

—тяжелые цепи 56

пространственная структура 69

—фиксация на макрофагах (моноцитах) и лимфоцитах 131

тучных клетках и базофилах 126

—фрагменты с хемотактически- ми свойствами 162

—человека 81

молекулярные формулы 57*

свойства 56*

•— экспрессии двух классов одновременной, механизм 117

—эффекторный центр 123—125

—эффекторные функции 123, 140

антигеннезависимые

124

Иммунодомиианта 27

Иммупо доминантная группа 33

11мму кодоминантные группы О-антигенов 41, 43*

Иммунологическая защита, механизм 143

-—толерантность См. Толерантность им м у 11 ол огическ а я

Иммунологический паралич 54 IАммунореактивность 7 Иммуносорбенты 241 Интерлейкины 217

Интроны 110

Инфекционная активность 144

Кластеры 213

А-Клетки См. Макрофаги

К-Клетки 147

Клетки антителопродуцирующие 17

—иммунологической памяти 17, 120, 192

—купферовы 14

―нулевые 147, 205

— плазматические 16

—продуцирующие антитела 16

——распознающие полисахариды 46

—стволовые 7, 10

антигеинезависимая дифференцировка 232

Комплемент, активация системы 140

—альтернативный путь активации (связывания) 138, 175 механизм инициа

ции 178

петля уснлення 177*

фактор В 177

О 177

—биологические реакции при активации системы 185*

— ингибиторы системы 179

——классический путь активации 135, 168. 169*

компоненты 167

концевые (терминальные) 167

—классический и альтернативный пути активации (связывания) 167, 168*

ключевой компонент 174

структурное подобие 179*

——компонент системы ключевой 167, 168*

—компоненты, биосинтез 186

СЗ, С4 и С5, структура 173*

——основные характеристики белков системы 167*

—продукты протеолиза 181

—регуляторные белки системы 179

—рецепция клетками 207

—система 166

— субкомпонент Clq первого компонента комплемента, структура 135*, 170*

—химия 167

—эффекторные функции системы 182

Комплементарпость 91

СЗ-Конвертаза 170, 177—180

— расщепление третьего компонента комплемента 173

Конкуренция неродственных антигенов 221

Кооперация клеточная 18

Кроветворение, основной орган 7

Лейкоэгрессин 162

Лектины 211

Лидерный пептид 110, 114*

Лизоцим, «пептид ——петля», структура 36*

—строение молекулы 35*

Лимфатическая система человека 8

Лимфатический узел, структура 12, 13*

Лимфобласты 16

Лимфоидные органы 7, 10, 12

Лимфопоэз 9, 13

Лимфоциты 7

—бласттрансформация 155

—рецепторы 191

— связывание иммунных комплексов 147, 150

спонтанная трансфромация 155

В-Лимфоциты 9, 10, 12

—механизм дифференцировки 129*

——рецептор для липополисахарида из грамотрицательных бактерий 210

Т-Лимфоциты 9, 10, 12

―активация 19

—антигенсвязывающие рецепторы, строение 201

—дп（|）ференцировка 18, 19

Липополисахаридный комплекс

45

Макрофаги 7, 14, 153, 160, 230

—роль в антпгенспецнфической активации Т-лимфоцитов 212

Мсмбранатакующий комплекс 174, 175, 180

Метод антигенного анализа 206

—двойной диффузии в агаре 255

—иммуноферментного анализа 78, 264

—иммуноэлектрофореза 257

—инактивации фага 263

—«метки по сродству» 93, 94*

— нефелометрии 253

—равновесного диализа 24, 104, 246

—радиальной иммуноднфф^^- зии 78, 256, 257*

— радиоизотопный 248

—радиоиммунного анализа 78, 261

—радиоспектроскопии 250

—спектроф<пуорометрии 249

—специфической сорбции 80

—электронно-парамагнитного резонанса в иммунологии 250“

Методы анализа перекрестно реагирующих полисахаридов 44

—аффинной хроматографии в иммунологии 243

—нммунохимпческис в биохимии 264

—оптические в иммунологии 248

—очистки иммуноглобулинов и антител 238

Миоглобин, строение молекулы 29*

Моноциты 14

Морфин» определение в моче 251

Нуклеотиды циклические 196

Опсонины 142

Поликлональная активация

В-лимфоцитов 39, 46

Полисахарид Фримана 41

Преципитация количественная, теория 253

Прозона, феномен 254

Пропердин 176

Простагландины, определение 263

Процессинг антигена 15, 212, 214*

—пре-мРНК 114*, 118

Реагины 126

Реакция азосочетания 23

— анти ген-антитело 91

—гаптен-антитело 104

——пассивной кожной анафилаксии 128, 131*

—преципитации в геле 254

——связывания комплемента

260, 261*

Резистентность естественная

166

Резус-фактор 49

S——S -Реком би нация 115, 117

Референс-гаптен 24, 25*

СЗ-Рецептор 207

Рецепторные белки 191

Рецепторы для антигена, В- клеткн 191

Т-клетки 200

комплемента на клетках крови человека 209*

Fc-Рецепторы 11, 203, 204*

—,структура 207

—、функциональная роль 205

Рипш 162

Розеткообразованпс, техника

204*, 208*

Секреторный компонент 61

Сингенные реципиенты 15

Система крови АВ0(Н) 47

Системная красная волчанка

152

Сплайсинг 114, 200

— альтернативный 118, 119

Н-Субстанция 47, 48*

Супрессия аллогена 198, 199

—антителами 221

—идиотипа 202

—изотипа 196, 197

феномен 196

—клеточно-опосредованная 219

Супрессоры 219

Т-Супрессоры 19, 38, 128, 157, 199, 200, 232, 237

—активация 233

Тафтсин 161

Теория сети 202

Тест-антиген 23

Тимозин 9

Тпмопоэтин 9

Тимостимулин 9

Тимоциты 9

Тимус 8二 9

Токсины бактериальные, нейтрализация 140

Токсофориая группа 141

Толерантность иммунологическая 15, 20

—срыв 235

Транскрипции единица 119, 120

Участок шарнирный 74

Fab-Участок 73, 138

Г'с-Участок 125, 127

Фабрициева сумка 9

Фагоцитарный индекс 143^

Фагоциты 14

Фактор, замещающий Т-клеткн 218

—нефритический 178

—ревматоидный 236, 237

—Т-супрессорный 220

—Т-хелперный антигенспеци- фический 217

—Lewis 47

Fab-Фрагмент 58, 59*, 60, 95

—эффекторные функции 154

Fab'-①рагмент, патофизиологические изменения после введения 164*, 165

F(ab')2-Фрагмент 59*

Fab'—F (abz) 2-Фрагменты 154

—неспецифическая регуляция биосинтеза антител 156

——усиление иммунного ответа на тимусзависимые антигены 156

Facb-Фрагмент 59, 69

Fc-Фрагмент 58, 59*, 60, 158

—антигепнезависимая поликлональная активация В-лимфо- цитов 159, 161

Fr'-① рагмент 159

Fd-Фрагмент 92

Fv-Фрагмент 59*, 70

Т-Хелперы 18, 50, 128

—функция 217

Хемотип 41

J-Цепь 61

Цитотоксичность клеточная 146, 205

Цитотропины 126

Экзоны ПО

Экзотоксины 140

Экзоцитоз 183

Эпитопная плотность 22

С1-Эстераза 170, 171

Оглавление

Предисловие 3

Введение 5

Глава 1. Система иммунитета 7

Клетки и органыиммунной системы 7

Иммунный ответ 13

Глава 2. Антигены 20

Конъюгированные антигены 22

Белки и синтетические полипептиды 27

Нуклеиновые кислоты и синтетические полинуклеотиды 37

Полисахариды 39

Групповые антигены крови 46

Детерминанты антигена, распознаваемые В- и Т-лпм- фоцптами 49

Антигенная специфичностьигенотипрецнпнента..52

Глава 3. Иммуноглобулины 54

3』.Структурная организацияиммуноглобулинов...55

Первичная структура полипептидных цепей иммуноглобулинов 63

Пространственная структура легкой и тяжелой цепей и организация четвертичной структуры иммуноглобулинов 69

Антигенное строение иммуноглобулинов 75

Глава 4. Активный центр антитела 91

Организация активного центра 92

Организация структуры анти детерминанты 103

Кинетика и термодинамика реакции гаптен-антптело 104

Глава 5. Биосинтез иммуноглобулинов 107

Организация структурных генов 107

Процессинг пре-мРНК 118

Трансляция легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов 120

Секреция новообразованных иммуноглобулинов ..122

Глава 6. Эффекторные функции иммуноглобулинов . . .123

Антигеннезависимые эффекторные функции 124

Антигензависпмые эффекторные функции 140

Глава 7. Катаболизм иммуноглобулинов. Биологические свойства продуктов расщепления 153

Глава 8. Комплемент 166

Химия комплемента 167

Классический путь активации 168

Альтернативный путь активации 175

Регуляторные белки системы комплемента ....179

Биологически активные пептиды 181

Эффекторные функции системы комплемента . . .182

Биосинтез компонентов комплемента 186

Глава9. Рецепторы лимфоцитов 191

Рецепторы для антигена 191

Fc-рецепторы 203

СЗ-рецептор 207

Другие рецепторы 210

Глава10. Индукция и регуляция иммунногоответа.. .212

Процессинг антигена 212

Функция Т-хелперов 217

Клеточно-опосредованная супрессия 219

Супрессия антителами 221

Усиление биосинтеза антител 226

Глава 11. Молекулярные основы иммунологической толерантности и аутоиммунных болезней....228

Иммунологическая толерантность 228

Аутоиммунные болезни 234

Глава 12. Методология иммунохимического эксперимента .238

Очистка иммуноглобулинов и антител 238

Аффинная хроматография в иммунологии . ...243

Регистрация реакции антиген (гаптен)-антитело . .246

Иммунохимические методы в биохимии 264

Моноклональные антитела 270

Рекомендуемая литература 272

Терминологический словарь 274

Предметный указатель 279

АЛЕКСАНДР ЯКОВЛЕВИЧ КУЛЬБЕРГ молекулярная ИММУНОЛОГИЯ

Заведующий редакцией Л Г. Гаврилов. Редактор Д. С. Орлова. Младший редактор 七.И. Попова. Художник В."・ Хомяков.

Художественный редактор Г. А. Коленкова. Технический редактор R С. Родичева, Корректор С・ К・ Завьялова.

ИБ-4885

Изд. № Е-458. Сдано в набор 14.012.85. Под,п. в печать 04.07.85.

Т-11633. Формат 84X108V32. Бум. тип. № 1. Гарнитура литературная.

Печать высокая. Объем 15,12 усл. печ. л. 15.12 уели кр.-отт.

15,82 уч.-изд. л. Тираж 10 000 экз. Зак. № 1258. Цена 95 коп.

Издательство «Высшая школам, 101430, Москва, ГСП-4, Неглинная ул.ш д. 29/14.

Московская типография № 8 Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли, 1U1898, Москва, Центр, Хохловский пер・，7.

2 Котн — рассчитано на основе приведенной в тексте формулы с использованием в качестве референс-гаптена е-ДНФ-Ь-лизина.

В 20—40-е годы было синтезировано большое число самых разнообразных антигенов, представляющих собой белки, коьдэюгнрованнне © разнообразными ароматнчес- кими соеднненнимк, гетероцикламн, включая пуриновые и пиримидиновые основания, аминокислотами и олиго- пепт11аамиДюно- и олй госа ха р и да ми, органическими кислотами, стероидами> Все перечисленные вещества в составе антигена способны индуцировать образование взаимодействующих с ними антител. Обширный фактический материал, в накоплении которого особенно значителен вклад К- Ландштейнера и его сотрудников, открыл исключительные возможности для понимания принципов распознавания антигенных детерминант антителами.

Необходимость стерического соответствия антигенной детерминанты и активного центра — антидетерминанты —антитела со всей очевидностью вытекает, в частности, из того факта, что анъитела, направленные к орто-, мета- и пара-аминобензойным кислотам, практически не реагируют перекрестно. Антитела также отчетливо различают право- и левовращающие изомеры виннокаменной кислоты. Менее очевидным является факт строгой специф|ичности распознавания антителами р-аминобензойной и р-аминофенилсульфоновой кислот:

А. Я. ЮИЬБЕРГ

3『t"HK%「”，HClK；иммунологи#

А. Я. ЮИЬБЕРГ

Молекулярнаяимм>нноиогия

.Москва

«Высшая школа»

1985

ББК 28.070

К 90

УДК 612

Рецензенты:

кафедра иммунологии 2-го Московского медицинского институтаим. Н. И. Пирогова (зав. кафедрой акад. АН СССР, проф.

Р. В. Петров); кафедра биохимии Киевского государственногоуниверситета им. Т. Г. Шевченко (зав. кафедройпроф. Н. Е. Кучеренко);

д-р хим. наук, проф. А. А. Богданов (Московский государственныйуниверситет им. М- В. Ломоносова)

Рекомендовано Учебно-методическим управлениемпо высшему образованию Министерства высшего и среднегоспециального образования СССР для использованияв учебном процессе

Кульберг А. Я

К90 Молекулярная иммунология. Учеб, писоб.——М.: Высш, шк., 1985. — 287 с., ил.

В пер.: 95 к.

В книге впервые системно изложены основы молекулярных иммунологических реакций. С позиций физико-химической биологии рассмотрены значение реакций иммунитета в регуляции постоянства внутренней среды организма, принципы организации иммунной системы, химия антигенов и антител, строение и биосинтез иммуноглобулинов, вопросы взаимосвязи между строением и функцией антител, химия и биохимия системы комплемента и др. Отдельный раздел посвящен описанию важнейших методов современной иммунологии.

2007020000—358ББК 28.070

“ 001(01)—8599—8557.04