Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
ПРЕДИСЛОВИЕ
Предлагаемая вниманию читателя книга представляет собой учебник, рассчитанный прежде всего на тех, кто, приступая к изучению молекулярной биологии, хотел бы систематизировать знания о строении и функциональных свойствах белка. Построение материала в известном смысле традиционно — после вводных глав, в которых кратко излагаются сведения, об аминокислотах и пептидах, а также о выделении и первичной характеристике белков, рассматриваются основные уровни организации их структуры, реакции модификации, которым они - подвергаются в биологических системах. Обсуждению функциональных свойств белков посвящено несколько отдельных глав. Выбор тех или иных групп белков для рассмотрения диктовался прежде всего необходимостью познакомить читателя с белками, исследование которых служило и еще продолжает служить фактической основой для выработки концепций этой отрасли науки. Понятно, впрочем, что в рамках учебника было невозможно, да и вряд ли нужно давать описание хотя бы основных групп белков.
Автор счел бы свою задачу выполненной, если бы читатель смог на относительно небольшом материале получить представление об основных результатах исследования белков и возникающих новых проблемах. Учебник составлен на основе лекционного курса, читаемого автором на биологическом факультете Московского государственного университета для студентов, специализирующихся по молекулярной биологии и вирусологии, и близок к курсу, читаемому на химическом факультете-МГУ. От читателя потребуется, безусловно, знание основ биохимии и органической химии, однако пробелы в них, если они обнаружатся, могут быть легко восполнены с помощью общих руководств, а также рекомендуемой литературы, которая послужит также более углубленному изучению тех или иных вопросов.
Можно надеяться, что книга будет полезной не только для студентов и аспирантов, но и для научных сотрудников, которые соприкасаются в своей работе с проблемами молекулярной биологии, в частности с белками.
Предлагаемая вниманию читателя книга является частью учебника по молекулярной биологии, издаваемого под редакцией акад. А.С.Спирина. С благодарностью отмечая его инициативу в написании учебника, автор считает необходимым отдать долг памяти профессору Вадиму Олеговичу Шпикитеру, который участвовал в обдумывании плана книги. Автор глубоко благодарен своим сотрудникам и друзьям, практический опыт и взгляды которых сыграли неоценимую роль в формировании представлений о белке, изложенных в этой книге.
В.М.Степанов
ВВЕДЕНИЕ
Изучение белков имеет давнюю традицию, богатую и исполненную драматизма, однако современные представления об их строении сформировались лишь за последние четыре десятилетия. Заметим, что, несмотря на крупные результаты и исключительно быстрый технический прогресс, закономерности организации этих биологических макромолекул никак нельзя считать полностью познанными. К числу ключевых проблем исследования белка относится прежде всего выяснение правил, управляющих формированием его пространственной структуры, свертыванием полипептидной цепи. Можно думать, что немало нового скрыто в динамике белковой структуры. И все же, видимо, центральная роль принадлежит анализу функции белков.
Еще не так давно способность выступать в качестве биологических катализаторов представлялась настолько значимой особенностью белков, что их иные функцйи'невольно отодвигались в тень и выглядели если не второстепенными, то во всяком случае нетипичными, маргинальными. Бесспорно, в таком подходе отражались как состояние знаний, свойственное совсем недавнему времени, так и- действительно выдающееся значение биологического катализа. Нет также сомнения в том, что анализ соотношения строения и функциональных свойств ферментов до сих пор остается чрезвычайно важным и очень продуктивным направлением исследований. И все же нельзя не заметить, что результаты последних лет выявили множество новых аспектов функционирования белков как регуляторов биологических процессов — не только обмена веществ, но также роста и развития — как участнике системы коммуникаций, которые объединяют биологические молекулы, органеллы, клетки, ткани, органы в единую управляемую систему. По существу, открылся новый мир белков, и необходимо не только их описание, но и понимание способов действия столь разнообразных молекул.
Функция белка всегда индивидуальна, однако могут быть выделены некоторые общие принципы молекулярных механизмов действия белков, поскольку в них заложены такие фундаментальные этапы, как узнавание того или иного партнера, формирование единой структуры комплекса, в которой так или иначе проступают черты взаимодейству- , ющих молекул, действие высокоорганизованных ансамблей функцио- 5
нальных групп, организация микроокружения, глубоко влияющего на природу протекающих химических превращений, передача эффектов внутри молекулы или надмолекулярного комплекса и т.д.
Проблематика химии и биохимии белка изменилась еще и потому, что методический прорыв, связанный с развитием генной и белковой инженерии, открыл не только широкие возможности направленной реконструкции белков, но и показал перспективу создания белковых структур, в том числе и наделенных той или иной функцией de novo (с самого начала), не копируя достижения природы, а конструируя их заново. Разумеется, в этом скрыта уникальная возможность глубокой проверки истинности знания, приобретенного трудом нескольких поколений исследователей, и вместе с тем перспектива новых достижений,. научную и социальную значимость которых трудно переоценить. ,
, ГЛАВА! -
АМИНОКИСЛОТЫ
ot-Амицокислоты — мономеры, из которых построены пептиды и белки. Лишь двадцать аминокислот — так называемые белковые аминокислоты — встраиваются в полипептидную цепь в ходе трансляции. В дальнейшем в результате реакций посттрацсляциокной модификации некоторые из них превращаются в другие аминокислотные остатки (например, цистеин — в цистин, серин — в фосфосерин и т.п.). В при-' роде встречается гораздо большее число аминокислот. Например, множество "небелковых'1 аминокислот содержится в пептидных .антибиотиках, синтез которых протекает по нематричному механизму, целый ряд "небелковых" аминокислот участвует в процессах обмена. Таковы, в частности, гомосерин, аргининянтарная кислота, полуальдегид аспарагиновой кислоты — промежуточные продукты биосинтеза белковых аминокислот, азетидинкарбоновая кислота —г обычный компонент клеточного сока растений и т.д.
СН2СНО
К х™2к
сн|
I■ NH2-CH-C00H
СООН
Аэетидин- ' Полуальдегид.
карбоновая аспарагиновойкислотакислоты
В данной главе будут кратко рассмотрены химические свойства белковых а?-аминокислот (табл. 1.1). Нередко возникает вопрос, чем обусловлен именно такой набор белковых аминокислот, который выработан в ходе эволюции и универсален для всех ныне живущих организмов. Разумеется, однозначного ответа дать невозможно, тем более . что выбор мог диктоваться возможностью биосинтеза той или иной структуры. Однако очевидно, что набор боковых групп белковых \ аминокислот должен быть достаточно разнообразен.
Аминокислотные остатки с гидрофобными цепями различной гео
.*7
метрии позволяют сформировать компактное внутреннее ядро, Стабилизирующее структуру белка, Организовать гидрофобные контакты с его лигандами. Глицин,' лишенный бокового радикала, не заменим при сближении пептидных цепей, обеспечивает их повороты. Гидрофильные нейтральные аминокислоты — серин, треонин, аспарагин, глутамин — участвуют в образовании системы водородных связей, обеспечивают гидратацию белка.
Боковые цепи, содержащие ионогенные группы (остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот, гистидина, лизина и аргинина), помимо образования водородных связей участвуют в ионных взаимодйствиях как внутри белка, так и с другими молекулами. Остатки цистеина открывают возможность участия белка в окислительно-восстановительных процессах, а также служат предшественниками остатков цистина, образуя дисульфидные мостики — дополнительные факторы стабилизации белковой структуры. ' ■*•• .
В то же время нельзя не заметить, что многообразие функциональных групп белковых аминокислот не столь уж велико. Однако их химические возможности резко обогащаются в рамках специфической белковой структуры за счет образования пространственно организованных ансамблей. И все же для многих задач функциональных групп белка недостаточно, для их решения привлекаются специфически связываемые им лиганды — ионы металла, хромофорные группы, коферменты и т.п. •.
КИСЛОТНО-ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ
Кислотно-основные свойства аминокислот определяет одновременное присутствие в их структуре аминной и карбоксильной групп, кото-1 рые, будучи-предельно сближены, глубоко влияют друг на друга.
■ В нейтральной среде, в довольно широком диапазоне pH, о-амино- кислоты существуют как биполярные ионы, поэтому обычная запись формулы аминокислот, например глицина — NH2~СН2"~С00Н, условна. Правильнее было бы писать для нейтральных растворов КНд-СНг™ООО". Именно в такой форме биполярных иоНов — цвиттер-Ионов (устаревшее название "бетаиноподобная структура") — аминокислоты существуют в нейтральных растворах и кристаллах. Влияние положительно заряженной аммонийной, группы в «-положении делает а-карбоксиль- ную группу значительно более сильной по сравнению с карбоксилом алифатических кислот. Так, если рКа уксусной кислоты (pH, при котором диссоциация проходит наполовину) составляет 4,7, то у глицина рКа карбоксила равен 2,34. Примерно такие же величины рКа. свойственны карбоксильным группам других «-аминокислот (табл. 1.1).
Таблица 1.1. Аминокислоты, включающиеся в белки при трансляции (белковые аммеокисяо 1 ы)
Название
Сокращенное обозначение
Структура R
" pKa
pl
о-соой^:
боковой цепи
Аланин '
Ala, А
,-CH8 ’
t - "
2,34
9-69
6,01
<H
*1* t
Аргинин
Arg, R
—(СЯ2)зНН—
*-nh2
2,17
9,04
12,84
10,76
Аспарагин
Asn, N
”CH2-C0-NH2'
2,02
8,60
—.
5,41
Аспарагиновая
Адр, D
~CH2~€00H
1,88
. 9,60
3,65
2,77
кислота
Цистеин 1
$г ■-
Сув, С
—CH2~SH
1,71
8,18
10,28
5,02
Глутаминовая
Glu, Е
~CH2CH2"C00I
2,16
9,67
4,32
3,24 .
кислота
Глутамин
Gln,Q
I2CH/-C0 NH2 4
2,17
9,13
—
5,05
Глицин
Gly, G
-Я
2,34
9,60
—
5,97
Гистидин
His, H
• ”CH2"~C—
t—N
1,82
9,17
6,00
7,59
।
^CH
X
■ НН
eg, 1 ■
. • A
Иэолейцин
lie, I
—CH—CH2—CH3 '
2,36
9,68
—
6,02
h8
Лейцин .- >
Leu, L
-СНгП
2,36
9,60
*-
5,98
H8
Лизин
Ibys, К
^(CH2)4“^ffl2
2,18
9,12
10,53
9,82
Метионин
«Met, M
~€H2CH2-S—CH3
2,28
9,21
—
5,74
Фенилаланин
|phe, F
—CH2—СбН5
11,83
9,13
5,48
Продолжение'’табл. 1.1
‘Структура пролина приведена полностью.
Разумеется, карбоксильные группы, удаленные от о-аммонийной, например ^карбоксил аспарагиновой или 7-карбоксил глутаминовой кислот, не испытывают столь значительного влияния положительного заряда и по своим кислотным свойствам, по способности отдавать и принимать прогой приближаются к обычным жирным кислотам.
Точно так же а-ажиногруппа в о-аминокислотах испытывает влияние карбоксилат-аниона, присоединенного к тому же углеродному атому, и становится значительно женее основной, чем аминогруппа первичных алифатических аминов — ее рКа равен 9,6 — 9,7 в отличие 10
от 10,7 для этиламина. Влияние карбоксильной группы на свойства аминогруппы, в частности на ее основность, падает по мере возрастания расстояния между ними, поэтому Е-аминогруппа лизина практически не отличима по химическим характеристикам от алифатических аминов, ее рКа равен 10,5.
Если к нейтральному раствору «-аминокислоты, содержащему биполярные ионы, прибавлять кислоту, увеличивая концентрацию ионов водорода, последние будут присоединяться к карбоксилатным группам, превращая их незаряженные карбоксильные группы. При этом аминокислота, в которой заряды первоначально были скомпенсированы, приобретет суммарный положительный заряд, в частности в электрическом поле она будет перемещаться, к катоду. Напротив, если понижать концентрацию ионов водорода, добавляя щелочь, гидроксильные ионы будут реагировать с «-аммонийными группами, отщепляя протон и переводя их в незаряженные аминогруппы. В результате аминокислота приобретет суммарный отрицательный заряд и электрическом поле будет перемещаться к аноду:
■ RRR
I +Н*|-Л*|
NH*—CH—СООН ^=^ NH*—CH—COO" ^==^ NH2-CH-C00-
Сулимаркый заряд
■+10-1
Значение pH, при котором как аминная, так и карбоксильная группы аминокислоты полностью заряжены и , заряды скомпенсированы, называют изоэлектрической точкой (pl). Для - а-аминокислот, которые не имеют ионогенных групп в боковой цепи, величина р! равна полусумме рКа «-аминной и «-карбоксильной групп. Если аминокислота содержит дополнительные ионогенные группы, при расчете р! следует учитывать их вклад..
Например, р! аспарагиновой кислоты не может быть близкой к 6, как у моноаминомонокарбоновых кислот, так как при этом pH будет практически полностью диссоциирована ее ^-карбоксильная группа и аспарагиновая кислота, следовательно, будет нести суммарный единичный отрицательный заряд. Для его подавления необходимо значительно понизить pH — до 2,77, чтобы протонировать /^-карбоксил примерно на 90%, что оставит на этой группе около 0,1 отрицательного заряда. При столь низком pH начнется и протонирование' «-карбоксильной группы, которая сохранит около 0,9 отрицательного заряда. В сумме эти заряды скомпенсируют единичный положительный заряд аминогруппы, что и обеспечит изоэлектрическое состояние аспарагиновой
кислоты. Легко видеть, что р! в этом случае близка к среднему арифметическому из рКа о- и Д-карбоксильных групп. То же справедливо и для расчета р! глутаминовой кислоты, равной 3,24. Аналогично, рассчитывая изоэлектрическую точку лизина (pl = 9,82), используют среднее из рКа о- и £-аминогрупп.
ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ «-АМИНОКИСЛОТ
Эти реакции разделяют на характерные для «-аминогрупп, «-карбоксильных групп и протекающие с совместным участием обеих функций.
Реакции аминогрупп
В целом эти реакции аналогичны реакциям алифатических аминов. Ацилирование активированными производными кислот в присутствии основания, связывающего выделяющуюся кислоту, протекает достаточно легко. К таким реакциям, например, относят:
— ацилирование алгинокислот уксусными ангидридолг.
Уксусный -Уксусный -СН3I+ нн2-сн-соонАланинСН3I+ нн2-сн-соонАланинСН3
Уксусный -
Уксусный -
СН3
I
+ нн2-сн-соон
Аланин
СН3
I
+ нн2-сн-соон
Аланин
I
—> CH3-C0-NH-CH-C00H
N-Ацетил-аланин
ангидрид
— реакция с хлорангидридол! 5-диметилал1инонафталинсрл%фокислот,ы (дансилхлоридом) — дансилирование, — позволяющая превратить аминокислоту во флуоресцирующее соединение:
SO2C1SO2C1ДансилхлоридДансилхлорид
SO2C1
SO2C1
Дансилхлорид
Дансилхлорид
СИ8 СН3СИ8 СН3SO 2”NH-CH-€OOHSO 2”NH-CH-€OOHДансил-аланинДансил-аланин
СИ8 СН3
СИ8 СН3
SO 2”NH-CH-€OOH
SO 2”NH-CH-€OOH
Дансил-аланин
Дансил-аланин
Сходно протекает арилироеание весьма активным 1-фтор-£Д-ди- нитробензолом — реакция динитрофенилирования, сыгравшая большую роль в определении структуры пептидов. .
NO 2NO 2ОНI€Н3I+ NH2-CH-€ ООНОНI€Н3I+ NH2-CH-€ ООНNH—CH—СООНNH—CH—СООН
NO 2
NO 2
ОН
I
€Н3
I
+ NH2-CH-€ ООН
ОН
I
€Н3
I
+ NH2-CH-€ ООН
NH—CH—СООН
NH—CH—СООН
СН2
^,^-Динитрофтор- Орин бензол^,^-Динитрофтор- Орин бензолI ОН
^,^-Динитрофтор- Орин бензол
^,^-Динитрофтор- Орин бензол
£, ^-Динитрофенил- серин (ДНФ-серин); имеет характерную желтую окраску, (Атах и ЗбО.нм)
Реакция аминогруппы с альдегидами приводит к образованию непредельного соединения — так называемого основания Шиффа, в котором основность азота существенно понижена. Эта реакция обратима, и в кислой среде альдегид отщепляется с регенерацией аминокислоты. Для основания Шиффа характерна близость двойной связи к асимметрическому центру, что может способствовать рацемизации аминокисло- 13
ты за счет миграции двойной связи к о-атому углерода. Гидрирование двойной связи в основании Шиффа, например боргидридом натрия, стабилизирует связь С—N:
R—СН=О +nh2—СН—СООНR—СН=О +nh2—СН—СООНR-CH=N—CH—COOHR-CH=N—CH—COOHNaBH4NaBH4
R—СН=О +nh2—СН—СООН
R—СН=О +nh2—СН—СООН
R-CH=N—CH—COOH
R-CH=N—CH—COOH
NaBH4
NaBH4
Альдегид ВалинАльдегид ВалинОснование ШиффаОснование Шиффа
Альдегид Валин
Альдегид Валин
Основание Шиффа
Основание Шиффа
r-ch2-nh—сн—соон
N-Алкил-валин
К аналитически важным реакциям с карбонильными соединениями относят взаимодействие аминокислот с тприхетошЭргтденгидратол! (нингидрином): -
НингидринНингидринR—СНОR—СНОАльдегидАльдегидФиолетовый РуеманнаФиолетовый Руеманна(■^шах ~ 570 нм)(■^шах ~ 570 нм)+ С02 ++ С02 +
Нингидрин
Нингидрин
R—СНО
R—СНО
Альдегид
Альдегид
Фиолетовый Руеманна
Фиолетовый Руеманна
(■^шах ~ 570 нм)
(■^шах ~ 570 нм)
+ С02 +
+ С02 +
На этой реакции основано как качественное, так и количественное определение аминокислот (в том числе в автоматических анализато- 14 " .
pax). Флуоресцирующие производные образуются при реакции о- аминокислот' с о-фталевым альдегидом в присутствии меркаптоэтанола. Эта реакция позволяет определять очень малые, порядка пикомолей, количества аминокислот:
1 vt ИНаДв-СООН ^^"t-^-OH, .
сн^^^с-сно
о-Фталевый альдегид
сн2-сн2-онсн2-сн2-он
сн2-сн2-он
сн2-сн2-он
I R
c x c=c |.
-♦ II >-CH-OTH
■ /- CH\C=CH\
Продукт реакции, производное ’ изоиндола; интенсивно флуорео- Цирует Ащдх = 455 нм (Ац^ возбуждение равна 360 нм)
Реакции карбоксильных групп
Эти реакции аминокислот в определенной мере соответствуют реакциям алифатических карбоновых кислот. Этерификация протекает в безводных спиртах в присутствии кислотных катализаторов.' Так, фенилаланин этерифйцируется почти количественно в безводном метаноле в присутствии соляной кислоты или (лучше) тионилхлорида:
С 585С 6Н5
I, I
СИ3СН2
IСПЛ]„ I
NH2“CH—СООН 4- СН30Н♦NH3-CH-€00GH3- Cl-
Метиловый эфир фени^ аланина (хлоргидрат)
Эфиры аминокислот — важные исходные вещества для пептидного синтеза — могут гидролизоваться, в особенности в щелочной среде (реакция омыления\.
сн3-сн-соосн3сн3—сн-соон4- СН30Н
II
nh2nh2
Обработка эфиров аминокислот безводным аммиаком превращает их в амиды:
СбН5Сб^Б
сн2сн2
NH2-CH—СООСНз + NH3 ~* NH2-CH-C(HiH2
Амид фенилаланина
Для временной защиты смсарбоксильных групп, необходимой при пептидном синтезе, их превращают в трет-бутиловые эфиры путем реакции с изобутиленом в присутствии серной кислоты: .
СН2СН2NH2—СН—СООЯ 4- СНNH2—СН—СООЯ 4- СНСН2 СНз
СН2
СН2
NH2—СН—СООЯ 4- СН
NH2—СН—СООЯ 4- СН
5^* NH2—CH—СОО-С—СНз -
'I
СНз
Трельбутиловый эфирлейцина
Такие эфиры устойчивы в слабощелочных средах, но избирательно расщепляются кислотами с регенерацией свободной карбоксильной ' группой. '
Реакции с совместным участием о-аминной; ' и о-ксфбокеильной групп
Соли аминокислот с некоторыми ионами металлов, в частности с ионами двухвалентной меди, никеля, кобальта, образуются при участии как карбокс и лат-ион а (ионная связь), так и аминогруппы (координационная связь), причем возникают весьма устойчивые бицикличе-
ские (клешнеобразные, или хелатные) структуры, в которых ион металла координирован с двумя молекулами аминокислоты например •'
О
.■/С-0"№2
^2~<1l2^H2^H2~<ll2~€!H Си2* ^CH-H®2~CH2”CHfc™CH2”tffl2
^Н2-о-с^
■ II
О'
Медная соль лизина, в образовании’ которой участвуют карбоксильная и аминная группа при ty-утлеродном атоме. Е-Аминогруппа в комплекс не входит и остается свободной, что может^быть использовано для проведения реакций, специфически затрагивающих только удаленную аминогруппу,■
Такие комплексы интенсивно окрашены, например комплексы меди с аминокислотами — в фиолетово-голубой цвет. *’-
Известны реакции, переводящие аминокислоты с участием как аминной, так и карбоксильной групп в циклические структуры. Так, фосген превращает «-аминокислоты в так называемые М-харбоксиангид- риды, легко полимеризующиеся с отщеплением С02 и образованием полиаминокислот:
N-Карбоксиангидрид аланина
|НзСЯ3-ТН-Т0\
NH2-CH-C00H 4- С0С12—*'. О
- СОг Нагревание
СН3СН3Сйз
III
..-|<Н—СИ—CO-NH—CH-CO-ffi-CH—СО—...
Полиаланин
Очень важна реакция аминокислот с фвнилизотио^ггонатолг, которая сначала приводит к производному по о-аминогрудце —. фешишшохар- бамил-аминокислоте:
CHCH
CH
CH
. I
CH2
CeH5-it=C=S +' NH2—CH—COOH _♦’
Фенилизотиоцианат
NI CH—COOH -^NI CH—COOH -^Фенилтиокарбамил-Фенилтиокарбамил-лейцинлейцинCH .I , г CHc=o, 17 I NB N-CeHe x^s*£Фенилтиогидантоин(ФТГ) лейцинаCH .I , г CHc=o, 17 I NB N-CeHe x^s*£Фенилтиогидантоин(ФТГ) лейцина
NI CH—COOH -^
NI CH—COOH -^
Фенилтиокарбамил-
Фенилтиокарбамил-
лейцин
лейцин
CH .
I , г CHc=o
, 17 I NB N-CeHe x^s
*£
Фенилтиогидантоин(ФТГ) лейцина
CH .
I , г CHc=o
, 17 I NB N-CeHe x^s
*£
Фенилтиогидантоин(ФТГ) лейцина
Фенилтиокарбамиламинокислоты и некоторые их аналоги интенсивно поглощают в ультрафиолетовом свете, что используют при коли' чественном определении аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Обработка кислотами приводит к внутримолекулярной циклизации фенилтиокарбамиламинокислоты с образованием фенмтиошдантоиши '„
Эти производные аминокислот играют важную роль в анализе первичной структуры белка. •.
МЕТОДЫ СИНТЕЗА о-АМИНОКИСЛОТ
Химический синтез
Методы химического синтеза аминокислот весьма разнообразны. Многие из них нашли применение в промышленном производстве аминокислот, используемых в качестве добавок к кормам для сельскохозяйственных животных, а также в медицине. Рассмотрим лишь глав-
нейшие, не останавливаясь на тех методах, которые позволяют получать лишь одну аминокислоту.
Простейшие аминокислоты можно получать алгинолизолг а-галоид- карбонових кислот, например аланин — обработкой хлорпропионовой кислоты очень большим избытком аммиака, чтобы подавить побочную реакцию образования иминодикарбоновой кислоты:
СН3-СН-С00НСНз-СН-СООН
II
Cl + NH3► ' NH2
Синтез, предложенный еще в прошлом веке А.Штреккером, основан на реакции альдегида R—СНО с гуиайидолг калия и солями аммония, причем последние можно заменить мочевиной. Получающийся 'в последнем случае замещенный гидантоин (циклическое производное соответствующей аминокислоты) далее гидролизуют щелочью, получая D, L-аминокислоту. Таким способом в промышленности синтезируют D, L-метионин (аминокислоту, применяемую в медицине и в животноводстве), исходя из /2-метилтиопропионового альдегида, в свою очередь образующегося по реакции акролеина и метилмеркаптана.
CH3SH + СЙ2=СН-СН0 —► ch3s-ch2-ch2-cho Акролеин/^-Метилтиопропионовый
альдегид| + HCN
Н' .‘ Н
СН3—S—СН2—СН2—СС=о *5®2™Н2 CH3S-CH2-CH2-C-CN
III
NH NHОН
ХС^=0■.
ГидантоинЦиангидрин
D, L-метионина
I Гидролиз
CH3S-CH2CH2CH-T00H
nh2
D, L-Метионин
Альдегиды можно вводить в реакцию с заранее полученным гидантоином. Последующее гидрирование двойной связи и гидролиз приводят к получению рацемата соответствующей аминокислоты:
СвН5-СН0 + СН2——С=0 —♦ C6H5~€R=C-С=0
Гидантоин •H2/PdГидантоин •H2/Pd
Гидантоин •H2/Pd
Гидантоин •H2/Pd
♦-с6н5-сн2-снС=0Гидролиз||♦-с6н5-сн2-снС=0Гидролиз||NH NHNH NHГидантоин D, L-фенилаланинаГидантоин D, L-фенилаланина
♦-с6н5-сн2-снС=0
Гидролиз||
♦-с6н5-сн2-снС=0
Гидролиз||
NH NH
NH NH
Гидантоин D, L-фенилаланина
Гидантоин D, L-фенилаланина
С6Н5-СН2-СН-С00Н
I кн2
D, L-Фенилаланин
Разделение рацемических аминокислот
Как бы ни протекал химический синтез, он приводит к образованию смеси строго одинаковых количеств L- и D-изомеров аминокислоты — к ее рацемату. Практический интерес имеют, как правило, природные L-изомеры, поэтому важны способы разделения рацематов, позволяющие выделить L-изомеры. Химические методы разделения основаны на взаимодействии рацемических аминокислот или их производных с асимметрическими соединениями.
Так, прибегают к получению солей эфиров аминокислот с заранее полученным стереизомером аминокислоты, например с L-глутаминовой кислотой, ацилированной L-аминокислотой или какой-то другой асимметрической кислотой, в частности D-винной. Образующиеся диастереомерные соли обладают, как правило, разной растворимостью. Соль эфира L-изомера разделяемой аминокислоты с D-винной кислотой по растворимости отличается от соли, построенной из эфира D-аминокислоты и. D-винной кислоты. Это открывает возможность выделения изомеров дробной кристаллизацией. Сложность этого пути очевидна, поэтому к нему прибегают лишь в тех случаях, когда иные подходы не дают результата.
Наибольшее распространение получил ферментативный способ разделения рацематов аминокислот. Чаще всего используют способность фермента ацилазы L-аминокислот, содержащейся в почках животных или продуцируемой некоторыми микроскопическими грибами, 20
избирательно гидролизовать М-ацил-Ь-аминокислоты, не затрагивая D- изомеров. После исчерпывающего гидролиза ацилированной (чаще ацетилированной) аминокислоты в присутствий ацилазы образуется смесь свободной L-аминокислоты и ацетил-4)-аминокислоты, которые легко разделяются кристаллизацией или ионным обменом:
СН3СН3
SS -
II
СН2:СН2
сн2.сн2
N-Ацетил-D, L-метионинN-Ацетил-D, L-метионинL-МегионинL-Мегионин2 СН3С(НШ-С1М00Н ^-—» МН2-СН-С00Н
N-Ацетил-D, L-метионин
N-Ацетил-D, L-метионин
L-Мегионин
L-Мегионин
СНз. ISI .сн2Iсн2Iсн3ан®-сн-соонК-Ацетил-В-метионинСНз. ISI .сн2Iсн2Iсн3ан®-сн-соонК-Ацетил-В-метионинКак правило, после разделения проводят рацемизацию ацетил-4)- . аминокислоты, а образовавшийся рацемат вновь гидролизуют ацила- зой, достигая в конечном счете практически полного превращения - ацетил-4),L-аминокислоты в L-аминокислоту.
СНз
. I
S
I .
сн2
I
сн2
I
сн3ан®-сн-соон
К-Ацетил-В-метионин
СНз
. I
S
I .
сн2
I
сн2
I
сн3ан®-сн-соон
К-Ацетил-В-метионин
Интересно превращение рацемического лактама D, L-лизина (получаемого из доступного исходного соединения — капролактама) в L- лизин за счет совместного действия двух ферментов. Один из них — L- лизиилактаМаза — гидролизует с образованием L-лизина только L- изомер лактама, другой же ■ рацемаза — превращает нерасщепленный лактам D-изомера в рацемический лактам D,L-лизина. L-Изомер вновь гидролизуется лактамазой. Итогом является лактама D,L-лизина в L-лизин, применяемый добавки:
сн2-сн2
СЯ2 Рацемаза, Лактамаза
Ln2/1 ■ ■*
\/СИ
NH—СО
мн2
полное превращение в качестве кормовойNH2IСН2Iсв2Iсн2Iсн2NH2—CH—СООНполное превращение в качестве кормовойNH2IСН2Iсв2Iсн2Iсн2NH2—CH—СООНL-ЛизинL-ЛизинЛактам D, L-лизина
полное превращение в качестве кормовой
NH2
I
СН2
I
св2
I
сн2
I
сн2
NH2—CH—СООН
полное превращение в качестве кормовой
NH2
I
СН2
I
св2
I
сн2
I
сн2
NH2—CH—СООН
L-Лизин
L-Лизин
Ферментативный синтезаминокислот
Практически удобны способы получения аминокислот путем катализируемого специфическими ферментами превращения соединений- предшественигисов. При этом фермент обеспечивает стереонзбирателъ- ностъ реакции, образование только одного, как правило, L-изомера. Широко распространен синтез L-аспарагиновой кислоты путем присоединения аммиака к фумаровой кислоте, который катализируется аспартазой или микробными клетками, содержащими этот фермент:
НООС-СН.||+ мн3 А£2Е2^сн-соон*Фумаровая кислотаНООС-СН.||+ мн3 А£2Е2^сн-соон*Фумаровая кислотаСООН
НООС-СН.
||+ мн3 А£2Е2^
сн-соон*
Фумаровая кислота
НООС-СН.
||+ мн3 А£2Е2^
сн-соон*
Фумаровая кислота
H2N-CH—СООН
L-Аспарагиновая кислота
С6Н5Iсн2Iнн2-сн-сооиL-Фенил аланинС6Н5Iсн2Iнн2-сн-сооиL-Фенил аланинДля получения L-фенилаланина применяют реакцию коричной кислоты и аммиака, катализируемую фенилаланин-аммиак-лиазой: ,
С6Н5
I
сн2
I
нн2-сн-соои
L-Фенил аланин
С6Н5
I
сн2
I
нн2-сн-соои
L-Фенил аланин
СеНз-CHIФенилаланин-
11+ NH3 аммиак-лиаза
fr-C-COOH
Коричная кислота
Микробиологический синтезаминокислот
Способ основан на образовании свободных аминокислот некоторыми микроорганизмами из простого сырья — отходов сахарной промышленности, крахмала, ацетата и т.п. Используют мутанты микроорганизмов, утратившие некоторые ферменты разветвленного пути биосинтеза аминокислот, что приводит к усиленному образованию других аминокислот. Например, блокирование гомосериндегидрогеназы, ответственной за превращение полуальдегида аспарагиновой кислоты в гомосерин и далее в треонин, метионин, направляет практически весь полуальдегид аспарагиновой кислоты на синтез лизина. Дополнительно вводят мутации, снимающие торможение активности ферментов конечным продуктом цепи реакций, например лизином; иногда прибегают к 22
умножению числа генов, кодирующих ключевые ферменты биосинтеза данной аминокислоты.
Сочетание этих приемов позволило получить мутанты, способные, например, синтезировать до 100 г L-лизипа на 1 л культуральной жидкости при высокой степени конверсии исходных веществ в аминокислоту. Микробиологические, химические и отчасти ферментативные методы синтезе аминокислот положены в основу их промышленного производства, достигающего сотен и десятков тысяч тонн в год (лизин, Глутаминовая кислота, фенилаланин, аспарагиновая кислота, метионин). Эти аминокислоты применяют как добавки к кормам, вкусовые добавки, лекарственные препараты, исходные вещества для получения физиологически активных пептидов.')
■ -/
■■ ГЛАВА 2
г- ПЕПТИДЫ
Если карбоксильная группа одной ^аминокислоты ацилирует аминогруппу другой аминокислоты, то образующуюся амидную связь называют пептидной, а само соединение — пептидом*.
Hi^2
II
NH2—Cff—CO—NH—СН—СООЯ
•Пептидная связь ^
Таким образом, пептиды представляют собой соединения, которые построены из остатков а-аминокислот, соединенных между собой пептидными связями. Иногда для достаточно длинных пептидов применяют термин полипептиды. Заметим, что с участием аминокислот могут образовываться и другие амидные связи, например между *f карбоксильной группой остатка глутаминовой кислоты и Е-амйногруп- пой лизина при сшивании цепей фибрина в ходе старения тромба. Такие связи., химически близкие пептидным, к последним Не причисляют, иногда называют их изопептидными. -,(4
Образование пептидных связей в воде термодинамически невыгодно, этим обусловлена необходимость предварительной активации взаимодействующих групп (чаще — карбоксильной группы) при химическом синтезе пептидной связи, а также при ее биосинтезе. Однако кинетически пептидная связь достаточно стабильна, и ее гидролитическое расщепление происходит лишь при использовании химических
катализаторов (кислот или щелочей) либо при катализе специфическими ферментами (пептидазами)
Понятно, что в дипептидё, полученном конденсацией двух аминокислотных остатков, сохраняются как карбоксильная, так и аминная группы, поэтому присоединение к нему аминокислотных остатков может быть продолжено с обеих сторон, что открывает возможность образования очень длинных — в несколько сотен и даже тысяч аминокислотных остатков — пептидных цепей. В пептидной цепи различают /^-концевой (или алмтокоицевой) остаток, содержащий свободную аминогруппу, и С-коицевой остаток, который несет свободную о-карбо- ксильную группу. _ •
ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЕПТИДОВ
Подобно аминокислотам, пептиды, содержащие свободные аминную и карбоксильную группы, являются биподярнилт ионалт и имеют изоэлектрическую точку. Их растворимость в воде весьма различна и определяется как длиной пептида, так и природой образующих его аминокислот. Кислотно-основные свойства пептидов несколько отличаются от свойств аминокислот, поскольку взаимное влияние аминной и карбоксильной групп в них значительно слабее, чем в «-аминокислотах, а в длинных пептидах им вообще можно пренебречь. В пептидах рКа «-карбоксильной группы заметно выше, чем в аминокислотах, и составляет/ например, для аланил-аланина 3,12 (ср. с рКа 2,34 для карбоксила аланина и 4,7 для уксусной кислоты). Для карбоксильной группы аланил-аланил-аланина рКа = 3,39; с дальнейшим ростом цепи сохраняется значение, близкое к 3,4.
Некоторое повышение кислотности по сравнению с карбоксилом уксусной кислоты следует приписать влиянию соседней пептидной связи. Аналогично «-аминогруппа в пептидах становится менее основной, чем в «-аминокислотах: рКа «-аммонийной группы составляет 9,69 для аланина, 8,30 для аланил-аланина, 8,03 для аланил-аланил- аланина и с дальнейшим удлинением цепи не меняется.
В остальном химические свойства «-аминной и карбоксильной групп пептидов качественно близки свойствам аминокислот. В частности, они вступают в те же реакции, которые были описаны для аминокислот, кроме протекающих с одновременным участием обеих функциональных групп. Такие реакции для пептидов не характерны. Исключением является довольно легкая циклизация эфиров и некоторых других производных дипептидов, в которых активирована «-карбоксильная группа, приводящая к дикетопипер азиналг.
СНз СН3XX
I |сн3-сн с=о
№2~СН^0^-^Н--С(Н)СНз —► II
.0=ССН-СНз
Метиловый эфир 2,4-ДиметилдикетопиПеразин аланил-аланина
В сильнощелочных растворах пептиды дают окрашенные комплексы с ионами меди, построенные весьма сложно. На этом основаца так называемая биуретовая реакция. Разумеется, пептиды могут также вступать в реакции за счет функциональных групп, содержащихся в боковых цепях аминокислот (см. гл. 9).
. 2.2. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ
Синтез пептидов, основы которого были заложены Э .Фишером в начале стол гия, развился Ь обширную область синтетической органической химии. Описаны ■ синтезы весьма протяженных пептидов и нескольких, пока небольших, белков. Не умаляя значения последних работ, укажем, что для практического получения значительных количеств белка предпочтителен микробиологический синтез в рекомбинантных клетках; начал развиваться и биосинтез пептидов в бесклеточных системах. ' * -
Синтез пептидов определенной структуры, даже наиболее простых, требует предварительного временного блокирования (защиты) функциональных групп, которые не должны участвовать в реакции. Если этого не предусмотреть, будут получаться весьма сложные смеси продуктов. .
, . 2.2.1. Защита аминогруппы ■
о-Аминогруппу ацилирующей аминокислоты или пептида защищают так, чтобы блокирующую группировку после образования пептидной связи можно было отщепить, снять в достаточно мягких условиях, которые гарантировали бы целостность пептида. Одной из первых была предложена (сохранившая значение до сих пор) бензил- оксикарбонилъная группа (сокращенное обозначение Z, устаревшее название карбобензоксигруппа^ которую вводят, ацилируя аминокислоту или пептид бензидохсигбарбонилхлоридоли
СвН6СН2-0-С-С1 + nh2—св—соонСвН6СН2-0-С-С1 + nh2—св—соонБензилоксикарбо-нилхлоридБензилоксикарбо-нилхлоридВалинВалинСбИ6СН2~О-С-ИН—сн—соовБензилоксикарбонилвалинСбИ6СН2~О-С-ИН—сн—соовБензилоксикарбонилвалинii
СвН6СН2-0-С-С1 + nh2—св—соон
СвН6СН2-0-С-С1 + nh2—св—соон
Бензилоксикарбо-нилхлорид
Бензилоксикарбо-нилхлорид
Валин
Валин
СбИ6СН2~О-С-ИН—сн—соов
Бензилоксикарбонилвалин
СбИ6СН2~О-С-ИН—сн—соов
Бензилоксикарбонилвалин
i
i
свсвО . СИ
св
св
Если надобность в защите миновала, бензилоксикарбонильную группу отщепляют гидрированием в присутствии палладиевого катализатора или действием бромистого водорода в ледяной уксусной, кислоте: . '
О
CeHeCHs-^-C-NH-CB-C-NB".. Ь/Е1> MH2CIHHiH-. + COz + СДСНа
БензилоксикарбонилпептидБензилоксикарбонилпептидПептидПептид
Бензилоксикарбонилпептид
Бензилоксикарбонилпептид
Пептид
Пептид
Широко применяют трет-бртоксикарбонилъиуо (ВОС) группу. Ее . вводят, ацилируя аминогруппу ангидридом жржмпрет-бутилового эфира угольной кислоты (BOC-amtidpttdoju), отщепление же достигает-, ся мягким действием кислотных агентов — трифторуксусной кислоты или хлористого водорода в органических растворителях:
СН3 О О СН8. СН3 О
III II II II “
СН8~С—О-С-О-С-О-С—СНа+ НН2-СИ,-СШЛ —►(тг-С—О-С-ШНЯгСООН —►
СИзСВзСНз
ВОС-ангидридВОС-ангидридГлицинГлицинснз аснз ан*н*Трет-бутоксикарбонил- (ВОС)-глицин
ВОС-ангидрид
ВОС-ангидрид
Глицин
Глицин
снз а
снз а
н*
н*
С=СН2 СН<
СНзВОС-ПептидСНзВОС-ПептидПептид со свободнойПептид со свободнойИзобутиленИзобутилен
СНзВОС-Пептид
СНзВОС-Пептид
Пептид со свободной
Пептид со свободной
Изобутилен
Изобутилен
CH
CH
нс
CH
c
•c:
СН ^С
CH—CH2
CH
СН Fmoc-хлорид
CH:
HC
CH
CH
CH
С
CH3
+ NH2—CH—COHNH—CH2—CO-.
c
CH3
c
Fmoc-пептид
CH
^С
CH
CH
c
CH
CH
CH
c
CH3
c
ПептидПептидC=CH2 + C02 + NH2—CH~—CO—NH~CH2—CO—...
Пептид
Пептид
СИ ^с
CHCHCH
CH
CH
CH:
Известно множество других защитных групп, обладающих теми или иными преимуществами и недостатками и применяемых в различных схемах синтеза. Необходимость использования большого их набора обусловлена тем, что специфические группы требуются для защиты функциональных групп боковых цепей, причем деблокирование о- аминогрупп необходимо проводить каждый раз перед новой стадией синтеза, тогда как защита боковых групп не должна затрагиваться в этих условиях. Их отщепляют в самом конце синтеза пептида.
Защита ^карбоксильной группы
Для этой цели обычно используют превращение карбоксильной группы в метиловый или mpem-бутиловый эфиры по реакциям, описанным в гл. 1. Для отщепления метилового эфира прибегают к егб
омылению щелочью, которое не всегда протекает гладко и создает опасность рацемизации С-концевого остатка. Tpem-бутидовые эфиры удобно расщеплять мягкой обработкой кислотными агентами, например трифторуксусной кислотой:
...Mf-CHi-€OO-C—СН3 -^ ...МНЖ-СООН + С=СН2Iсн,/
сщ Трет-бутиловый эфирИзобутилен
Образование пептидной связи
Для образования пептидной связи, которое при химическом синте-' зе, как правило, проводят в отсутствие воды, необходима активация карбоксильной группи. Возможна, впрочем, и активация о-аминогруп- пи, однако ее практически не применяют. Активированное производное защищенной по аминогруппе аминокислоты или пептида может быть получено в отдельной реакции, а иногда и выделено или образовано непосредственно перед конденсацией с аминокомпонентом (аминокислотой или пептидом с защищенной карбоксильной группой).
Реакция в присутствии карбодиимидов. Ацилированная аминокислота реагирует с -№С=$Н ^карбрдиилгидной^-труппировкой, образуя соответствующую О-ачиллгочевину. Это активированное производное > вступает в реакцию с аминокомпонентом, причем образуются пептид ия двузамещенная мочевина: 28•
С6НцС6НцCAi
С6Нц
С6Нц
СН3СН3СН3СН3NHNH
СН3
СН3
СН3
СН3
NH
NH
Z—NH—CH—СООНZ—NH—CH—СООНZ~NH—CH—COO—СZ~NH—CH—COO—С
Z—NH—CH—СООН
Z—NH—CH—СООН
Z~NH—CH—COO—С
Z~NH—CH—COO—С
Бензилок сикар- бонил-аланинБензилок сикар- бонил-аланинNNNNСИСИСН2СН2СеНц■ Дицикло-гексил-карбо-ДИЙМИДСеНц■ Дицикло-гексил-карбо-ДИЙМИДС6НцО-АцилиэомочевинаС6НцО-АцилиэомочевинаХСН8 СНХСН8 СНСбНцСбНцNHNHСНзСНзСН2СН2С=ОС=О
Бензилок сикар- бонил-аланин
Бензилок сикар- бонил-аланин
N
N
N
N
СИ
СИ
СН2
СН2
СеНц■ Дицикло-гексил-карбо-ДИЙМИД
СеНц■ Дицикло-гексил-карбо-ДИЙМИД
С6Нц
О-Ацилиэомочевина
С6Нц
О-Ацилиэомочевина
ХСН8 СН
ХСН8 СН
СбНц
СбНц
NH
NH
СНз
СНз
СН2
СН2
С=О
С=О
Метиловый эфир.лейцинаМетиловый эфир.лейцинаNHNHСвИц Дициклогексил- мочевинаСвИц Дициклогексил- мочевина+ №2—СИ—СООСНз—► Z-NWH-C0-NB—СН—СООСНз
Метиловый эфир.лейцина
Метиловый эфир.лейцина
NH
NH
СвИц Дициклогексил- мочевина
СвИц Дициклогексил- мочевина
Метиловый эфирбензилоксикарбонил-аланил-лейцина.
Актмвмроеаммые эфиры. Иногда удобнее превратить О-ацилмочеви- ну 1 активированный эфир (с некоторым допущением и само это соединение можно рассматривать как активированный эфир; однако оно нестабильно, что может привести к нежелательным побочным реакциям). Для этого к реакционной смеси, содержащей О-ацилмочевину, прибавляют пентафторфенол, р-нитрофенол, N-оксисукцинимид и т.п.:
СНг-С^1
CeF5-OH ОаМ-СбНч-ОН | ‘ ^N-OH
■.•. ' СН2~ССО *
Пентафторфенол р-Нитрофенол N-Ю кси сукцинимид
Продукты переноса аминоацильного или пептидного остатка на оксигруппу этих соединений относительно устойчивы и могут быть выделены. Их взаимодействие с аминокомпонентом дает требуемый пептид:
СНзДициклогексил-СН3
।карбодиимид।
Пентафторфениловый эфир ВОС-аланинаПентафторфениловый эфир ВОС-аланинаB0C-NH-CH-C00H + Н0-СбГ5 c6H5N=C=^C§H5^ BOC-NH~€H-CO-OC6F5 ВОС-Аланин Пентафтор
Пентафторфениловый эфир ВОС-аланина
Пентафторфениловый эфир ВОС-аланина
фенол
СбЩ
СНзСНзсн2
СНз
СНз
boc-nh-ch-cooc6f5 + nh2-ch-cooch3 -♦
Метиловый эфир фенилаланина
С6Н5
СНз -СН2
II
—♦ B0C-NH-CH-C0-NH-CH—С00СН3
Метиловый эфир ВОС-аланид-фенилаланина
Симметричные ангидриды защищенных аминокислот. О-Ацилмоче- вина способна реагировать с карбоксильной группой второй молекулы защищенной аминокислоты, образуя. ее симметричный ангидрид. Последний является хорошим ацилирующим агентом и реагирует с аминокомпонентом, в результате чего получается пептид и отщепляется
защищенная аминокислота:
IСН2IСН2IB0C-NH—СН—СООНIB0C-NH—СН—СООНВОС~NH—СН—€00НВОС~NH—СН—€00НВОС-лейцинВОС-лейцинДиизопропилкарбодиимидДиизопропилкарбодиимидСНз ^.СНзСНI сн2IB0C-NH—СН—00^B0C-NH—СН—00х0СНз ^.СНзСНI сн2IB0C-NH—СН—00^B0C-NH—СН—00х0Симметричный ангидрид ВОС-лейцинаСимметричный ангидрид ВОС-лейцина
I
СН2
I
СН2
I
B0C-NH—СН—СООН
I
B0C-NH—СН—СООН
ВОС~NH—СН—€00Н
ВОС~NH—СН—€00Н
ВОС-лейцин
ВОС-лейцин
Диизопропилкарбодиимид
Диизопропилкарбодиимид
СНз ^.СНзСН
I сн2
I
B0C-NH—СН—00^B0C-NH—СН—00х0
СНз ^.СНзСН
I сн2
I
B0C-NH—СН—00^B0C-NH—СН—00х0
Симметричный ангидрид ВОС-лейцина
Симметричный ангидрид ВОС-лейцина
’С|1з ^СНз s
-1.CH
' СНз ,' CH 2 СНз
• ГI i
+NH2-CH-CO-NH-... —» BOC-NH—CH—CO-NH-CH-W-NH...
Пептид c N-концевым 1 Пептид c N-концевой последова-
.аланином,тельностью BOC-Leu-Ala—...
Известно и применяется гораздо большее число способов активации карбоксильных групп; их описание можно найти в специальных руководствах..
Тактика пептидного синтеза
Изложенные подходы позволяют проводить направленный синтез весьма сложных пептидов. Оптимальный путь синтеза выбирают исходя из ряда соображений. Особое внимание уделяют предотвращению рацемизации, наиболее вероятной у Са-аТоМа того остатка, карбоксильная группа которого активирована. Это обусловлено тем, что активирующие группы вызывают смещение электронной плотности не только от углерода карбонильной группы (что необходимо для облегчения атаки этого'атома Нуклеофильной амивоТруппоЙ минокомпонбнта), но и от Са-атомй ' Последнее благоприятствует отщеплению атома водорода, находящегося при этом углероде, в виде протона. Такое отщепление переводит остающиеся три заместителя у о-ато а углерода в плоскую тригональную конфигурацию. При. возврате протона, который может подойти к Са-атому с обеих сторон плоскости, происходит обра
зование равной смеси L- и D-изомеров, т.е. рацелшзацая. Таким обра
зом, активация карбоксильной группы несет в себе потенциальную
опасности рацемизации С-концевых остатков аминокислот в пептидных
фрагментах:- СЙ3R-CO-NH-C—C00-C6F5I' нфрагментах:- СЙ3R-CO-NH-C—C00-C6F5I' нСН3- =* R-CO-MI-C—COO^gFsСН3- =* R-CO-MI-C—COO^gFs
фрагментах:- СЙ3
R-CO-NH-C—C00-C6F5
I' н
фрагментах:- СЙ3
R-CO-NH-C—C00-C6F5
I' н
СН3
- =* R-CO-MI-C—COO^gFs
СН3
- =* R-CO-MI-C—COO^gFs
Карбанион, образуемый благодаря активации карбоксильной группыКарбанион, образуемый благодаря активации карбоксильной группы
Карбанион, образуемый благодаря активации карбоксильной группы
Карбанион, образуемый благодаря активации карбоксильной группы
Отщеплениё и присоединение протона у С^-атома приводит к рацемизации
Амидные связи уретанового тина в бензилоксикарбонил- и ВОС- аминокислотах менее благоприятствуют рацемизации по сравнению с обычными пептидными связями. Следовательно, планируя синтез пептида, выгодно не конденсировать * его фрумерты, поскольку для этого пришлось бы активировать карбоксильные^ группы .пептидов, а присоединять к растущему пептида защищенные активированные аминокислоты одну за другЬй начиная t С^сор левого аминокислотного остатка. Синтез длинных пептидов иногда приходится все же проводить из фрагментов, которые затем соединяют друг с другом. В этом случае стараются выбирать фрагменты так чтобы в С-концевом полод жении каждого из них оказывался остаток глицина, который не содержит асимметрического атома и, Значит, не может рацемизоваться, или остаток пролина, в котором нет атоМа водорода при агуглеродном . атоме и не может происходить рацемизация по Описанному выше механизму. Если такой прием почему-либо невозможен, прибегают к конденсации фрагментов, используя азиды пептидов, '— метод, прк котором опасность рацемизации минимальна, хотя и не исключена вовсе
, Исключительно ценным развитием ступенчатого синтеза пептидов явился твердофазный метод синтеза пептидов, предложенный Р.Меррифилдом. C-Концевую аминокислоту присоединяют к полимерной матрице сложноэфирной связью, исцодьзуя, например, реакцию .соли аминокислоты с активными бромметильными группами на поверхности поперечно сшитого полистирола: -
СН3 .
Faoc-NH-CH-tiOO- + Вг-СН2-С6Н4~... к матрице
СНз
I.
ГиосН^Н-СВ-СО-0СН2~СД- --к матрице
После образования сложноэфирной связи между С-концевым остатком и матрицей отщепляют защитную группу (обычно ВОС или Fmoc), обрабатывая полимер соответственно кислотой или амином:
Обработка пиперидином
СНз
NH2“СН-^}-0СН2~СбН4“...к матрице
К освободившейся о-аминогруппе присоединяют аминокислоту, предшествующую С-концевой, используя для этого ангидрид защищенной аминокислоты или иной способ активации — реакцию в присутствии карбодиимида, пентафторфенйлового эфира защищенной аминокислоты и т.п.:
С6Н5.
I
СН2СН3
II
Fmoc-NH~CH~CDDCcF5 + NH2~СН-СО-0СН2“С6Н4—... к матрице
С6Н5
СН2 СНа
.11'
Fmoc~^H—С1Ю0~^Н—СН^СО-0СН2"~СбН4—•. .к Матрице
Затем снова отщепляют защитную группу
| Обработка пиперидином
С6Н5
СН2СНз
II
NH2-CH-C0-NH-CH-C0-0CH2-C6H4-...k матрице
Фенилаланил-аланин
и повторяют цикл, присоединяя следующий аминокислотный остаток, и т.д.
Такие циклы можно повторять много раз, получая весьма длинные пептидные цепи, содержащие до 100 остатков и более. Многостадийный синтез на твердофазном носителе выгоден прежде всего тем, что ОН; позволяет избежать потерь синтезируемого пептида, неминуемых при выделении продукта синтеза в обычных условиях. Выход на стадии присоединения аминокислоты и отщепления защитной группы достигает, как правило, 99 — 99,5%, в частности за счет применения большого избытка ацилирующего компонента. Важно и то, что растущие пептидные цепи, будучи связаны с носителем, защищены от 2-5633
агрегации — явления, резко ограничивающего возможности синтеза длинных пептиды в растворе. •
Твердофазный синтез пептидов, который состоит из строго одинаковых повторяющихся стадий, удалось автоматизировать —’ были созданы автоматические синтезаторы пептидов.
На практике метод все же ограничен неполнотой присоединения ациламинокислоты в отдельных циклах. Понятно, что "недостроенный11 в том или ином цикле пептид будет ацилирован в следующем, что приведет к пропуску аминокислотного остатка. Образование таких пептидов с ошибочными последовательностями даст при синтезе длинного пептида весьма сложную смесь продуктов. Метод оказался особенно продуктивным в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией, которая х позволяет выделить главный * компонент среди множества продуктов твердофазного синтеза.
Сочетание твердофазного синтеза и зысокоэффективной жидкостной хроматографии в настоящее время — главний способ получения небольших количеств 15—20-членних пептидов, в частности пептидных детерминант, используемых для получения специфических антител к тому или иному белку.
Применение различных приемов пептидного синтеза,' но преимуществу твердофазного, позволило получить некоторые, как правило, не очень большие белки. Первоначально эти работы имели только принципиальный характер, демонстрируя возможность чисто химического синтеза белков. В последнее время, однако, проведены синтезы белков, имеющие практическое значение. В частности, в значительных количествах удается получать инсулин, ряд других пептидных гормд^ нов, например кальцитонин рыб (32 аминокислотных остатка), синтезируемый партиями по 50 — 100 г, фактор роста эпителия (53 остатка), росттрансформирующий фактор а (50 остатков), интерлейкин-3 (140 остатков), aj- и а2-интерфероны лейкоцитов человека и их аналоги, панкреатический ингибитор трипсина. Синтезирована и использована для определения пространствённой структуры протеиназа вируса иммунодефицита человека, пептидная цепь которой содержит 99 аминокислот. Характерно, что свертывание полученных синтетически пептидных цепей в нативную структуру происходит самопроизвольно и не вызывает существенных затруднений.
Несмотря на То что получение белков в значительных количествах в ближайшем будущем будет, по-видимому, основано на микробиологическом синтезе или синтезе в бесклеточной системе, вбзможны и дальнейшие успехи в развитии химических способов получения крупных пептидов и белков. Определенные перспективы имеет и так называемый полусинтез белков, при ■ котором полипептидную цепь белка 34
собирают из пептидных фрагментов, полученных ограниченным протеолизом и чисто химическим путем с использованием химических, а иногда энзиматических методов их конденсаций. Такой подход был применен в частности, для получения проинсулина человека присо- единениез ряда синтетических пецтидных звеньев к выделенным из природного инсулина А- и В-цепям.
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ
Протеолитические ферменты в обычных условиях катализируют гидролиз пептидных связей. Однако могут быть подобраны такие условия, при которых равновесие оказывается сдвинутым в сторону образования пептидной связи. Так, в концентрированных растворах бензилоксикарбонил4г-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L- фенидаланина металлопротеиназы, например термолизин, катализируют образование пептидной связи между ними, причем продукт реакции (метиловый эфир бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилалани- на), будучи малорастворимым, выпадает в осадок в виде солй с еще одной молекулой метилового- эфира L-фенилаланина. Именно эта низкая растворимость продукта, которая выводит его из сферы реакции, смещает равновесие в сторону синтеза. Цосле снятия защитной группы каталитическим гидрированием получают метиловый эфир L- асд^ртил-Ь-фенилаланина — аспартам — соединение, превосходящее сахарозу по сладости в 200 раз. Процесс используют для промышленного получения аспартама:'
.СООНС gHs
нч^2СН2
. „ (€6H5CH20-C0-NH-CH—СООН + NH2-CH—СООСНз М^^опр^еиназа > Бензилоксикарбонил-L-Метиловый эфир
г аспарагиновая кислотаL-фенилаланина
СООНС6Н5
„,-. СН2сн2
—► CeH5CH20-C0-WI-CH—CO-NH-СН-СООСНз^ZEL_>
' |а Метиловый эфир бензилоксикарбонил- Удаление защитной группы
Ь-аспартил-Ь-фенилаланинакаталитическим гидрированием
COOHCels
I .I
II
—♦ NHS-CB—CO-NB-CH—COOCHj-
Метиловый эфир Ь-еспартил-"L-фенилаланина (аспартам)
Еще один способ смещения равновесия в сторону синтеза — проведение катализируемой протеиназой реакции пептидною синтеза в органическом растворителе в присутствии малых количеств воды, достаточных только для гидратации фермента. Применяют при ферментативном синтезе и предварительную активацию одного из компонентов. Так, эфиры ацилированных пептидов в присутствии сериновых протеиназ быстро реагируют с аминокомпонентами — производными аминокислот или пептидов, образуя более .длинные пептиды. Сдвиг равновесия в сторону синтеза в этом случае обеспечен активацией ацилируюгцею пептида за счет его превращения в сложный эфир; скорость катализируемого ферментом синтеза пептидной связи из эфира пептида гораздо выше скорости гидролиза этой же пептидной связи ферментом.
Описаны катализируемые ферментами частичные трансформации пептидов, например превращение свиного инсулина в инсулин человека, отличающийся от первого только заменой С-концевого остатка аланина в В-цепи на треонин. Это достигается путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединения вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина, присутствующего в реакционной смеси в большом избытке:
-Pro—Lys™Ala 4- ТЬг~0~С(СНз)д 3^522^ ^^^уд^^р-ц^од^
Инсулин свиньи
Отщепление защитной О-тпрет-бутильной * группы -Инсулин человекаОтщепление защитной О-тпрет-бутильной * группы -Инсулин человека(показан Оконец
Отщепление защитной О-тпрет-бутильной * группы -
Инсулин человека
Отщепление защитной О-тпрет-бутильной * группы -
Инсулин человека
В-цепи)
ПРИРОДНЫЕ ПЕПТИДЫ
Пептиды в природных объектах не только появляются в качестве промежуточных продуктов деградации белка, они часто играют самостоятельную физиологическую роль.
Пептидные антибиотики в большинстве своем синтезируются микроорганизмами пр особому нематричному механизму и содержат в- своем составе ряд небелковых аминокислот, а также D-изомеров. Многие из них являются чиклопептидалт. Среди таких антибиотиков отметим циклодекапептид фалейчидин S — антимикробный агент широкого спектра действия:
D-Phe —> Pro'—♦ Vai —* Orn —♦ Leu
I1
Led ♦— Orn ♦— Vai ♦— Pro ♦— D-Phe
Грамицидин S ’
Следует обратить внимание на присутствие в молекуле небелковой ами
-. нокислоты - орнитине - и D-изомера фенилаланина. Стрелки показывают направление пептидных связей в цикле.■'
. ■ Эффективным иммунодепрессантом служит другой циклопептидный антибиотик — циклоспорин содержащий N-метилированные и другие гебелковые аминокислоты (непредельную оксиаминокислоту, оншино-
: Масляную кислоту, остаток D-аланина):
В последнее время обнаружены пептидные антибиотики, продуцируемые клетками животных, в особенности лимфоцитами. Они образуются по обычному пути биосинтеза белковых структур.
Пептидные гормоны, в более широком смысле — регуляторные пептиды, играют важнейшую роль В управлении метаболическими процессами в развитии организма, передаче сигналов. К их числу принадлежат некоторые короткие пептиды, например, окситоцин, стимулирующий сокращение матки и лактацию:-
SS
. II .
Суе—Туг—lie—Gin—Asn—Cys—Pro—Leu—Gly—NH2
•Окситоцин
Сходно построен нонапептид вазопрессин, подавляющий диурез и повышающий давление крови. Адренокортикотропный гормон (АКТГ), пептидная цепь которого состоит из 39 аминокислотных остатков, регулирует функцию надпочечников и может затрагивать целый ряд процессов, в том числе мотивацию, обучаемость, поведение,
а-Меланоцитостиму. ирующий гормон CH3C0—Ser—Туг—Ser—Met— Glu—His—Phe—Arg—Trp—Gly—Lys—Pro—Val-NH2 контролирует образование меланина в пигментных клетках позвоночных, но влияет и на функционирование нервной системы, поведенческие реакции, а также развитие плода.
Следует отметить, что функции пептидных гормонов, как правило, многозначны, причем нередко в них удается выделить участки последовательности, ответственные за отдельные типы биологической активности. Для пептидных гормонов характерны процессы посттрансляционной модификации: в случае о-меланоцитостимулирующего гормона — ацетилирование о^Нг-группы и амидирование о-карбоксила.
Биосинтез пептидных гормонов и других регуляторных пептидов протекает так же, как и синтез белков. Многие физиологически активные пептиды, в особенности короткие, синтезируются в виде пре^ше- ственников — полипептидов гораздо большей длины. Последние затем подвергаются ограниченному протеолизу специфическими ферментами, которые, действуя на строго определенные связи, высвобождают активные пептиды. Так, энкефалины — пептиды, взаимодействующие с теми же рецепторами, что и морфин, и представляющие собой природные анальгетики, — синтезируются в виде предшественника, в пептидной цепи которого последовательности энкефалина Туг—Gly—Gly— Phe—Leu или Туг—Gly—Gly—Phe—Met повторяются несколько раз. Йм
предшествуют и за ними следуют пары Arg—Arg, которые служат сигналом для действия специфической протеиназы, расщепляющей пептидную связь после такой пары остатков аргинина:
Пептидные связи, атакуемые специфическойпротеиназой в предшественнике энкефалина
—Arg—Arg—Ту г—Gly—Gly—Phe—Leu—A rg—A rg—
Остатки, отщепляемые карбоксипептидазой
Оба остатка аргинина затем отщепляются специфической карбоксипептидазой, высвобождающей энкефалин.
Нередко оказывается, что пептиды могут имитировать поведение соответствующих пептидных фрагментов белка в его взаимодействии с другими биологическими молекулами, в частности с иными белками, например с рецепторами или структурообразующими молекулами. Так, пентапептидный фрагмент белка соединительной ткани ламинина, имеющий последовательность Туг—lie—Gly—Ser—Arg, ответствен за присоединение к этому белку клеток. Пентапептид такой же структуры способен препятствовать этому, по-видимому, блокируя рецепторы на поверхности клеток, вовлеченные во взаимодействие с ламинином.
ГЛАВА 3
* ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ
Выделение практически чистого индивидуального белка (в таких случаях нередко употребляют не вполне удачный термин "гомогенный белок") — необходимая предпосылка для изучения его строения и функциональных свойств. Технические приемы, используемые для этого, весьма многообразны и быстро совершенствуются, причем наряду с развитием микрометодов все чаще возникает необходимость масшта- бйрования процессов, с тем чтобы получать крупные'количества высо- коочищенных белков для нужд медицины и биотехнологии. Особенно обострилась потребность в эффективных методах разделения белков с развитием генно-инженерных способов их получения. В данной главе рассмотрены лишь наиболее общие принципы препаративной химии белков.
ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ
Получение чистых химических индивидуальных белков включает в себя как удаление небелковых примесей, так и разделение между собой собственно белковых компонентов. Последняя часть задачи в силу сходства физико-химических свойств белков особенно сложна, поэтому именно ее решение определяет выбор тех или иных схем выделения белка. При этом необходимо учитывать некоторые особенности поведения, присущие всем белкам.
К ним относится прежде всего способность белков подвергаться денатурации, т.е. претерпевать такие изменения пространственного строения, которые приводят к утрате или частичной потере функциональных свойств. Правда, денатурация во многих случаях обратима, однако эта обратимость не обеспечивается автоматически, а требует в каждом отдельном случае подбора специальных приемов. В то же время полностью или даже частично денатурированные белки весьма уязвимы для необратимых повреждений, в особенности для действия протеолитических ферментов, поэтому условий, способствующих денатурации, следует всемерно избегать.
Для предотвращения тепловой денатурации выделение белка проводят при нцзкой температуре, обычно при 4 °C. Необходимо также избегать крайних значений pH. Белки легко денатурируют при низкйх pH из-тза протонирования отрицательно заряженных в нормальных условиях карбоксильных групп и возникающего вследствие этого резкого преобладания положительных зарядов, которое благоприятст1- вует развертыванию компактной структуры. В щелочной среде при pH 10 и выше утрачиваются положительные заряды, обусловленные прЬ^ тонированием е-аминогрупп лизина, и опять-таки наступает декомпенсация зарядов на поверхности, дестабилизирующая глобулу. Одно^ временно фенольные гидроксилы тех остатков тирозина, которые были скрыты внутри глобулы, получив отрицательный заряд, стремятся' выйти на поверхность, что также способствует денатурации белка. ' м
В еще более щелочных растворах происходят реакции, необратимо" повреждающие белок, — отщепление серы от остатков цистеина и цистина, /2-элиминирование фосфатных остатков в фосфопротеинах, отщепление полисахаридных цепей, присоединенных к остаткам серина^' гликопротеинах. Образующиеся в результате этих реакций остатка непредельной аминокислоты — дегидроаланина — присоединяются ^ близлежащим е-аминогруппам лизина с образованием так называемого лизиноаланина — соединения, присутствие которого в кислотном гид-' ролизате белка свидетельствует о глубоком повреждении его струк
туры:
40
I " II
c=ec=oc=o
IOH- II
СН-СНгО-Г^"^ C=CH2 + NH2-(CH2),-CH
. NHNHNH
I।.।
ФосфосеринДегидроаланин I Лизин
II
C=oC=o
II
CH—CH2*NH—(CH2)4—CH
.. II
NH 1 NH
I" I
,Лизино^ланин
Причиной денатурации может стать применение органических раст- eppumexetit способных нарушить существенную для стабильности белка систему гидрофобных контактов внутри глобулы. Надо также учитывать возможность денатурации белка на границе раздела фаз, в особенности при образовании пены. При выделении очень малых количеств белка, не редком в современной биохимии, следует считаться с потерями, вызываемыми его. адсорбцией, часто необратимой, на поверхности отекла или полимерных материалов, особенно значительной на заключительных стадиях очистки.
Особую опасность при выделении белков представляют содержащиеся и исходном материале протеолитические ферменты, даже если ($и присутствуют 'в следовых количествах. Повреждение, которое приводит к образованию ложных множественных форм белка, а иногда и его глубокое расщепление становятся особенно вероятными, если схема выделения включает условия, приближающие белок к денатураций- Для предотвращения протеолиза необходимо уже на ранних стадиях очистки включать операции, направленные на отделение цротеиназ, прибавлять к смеси ингибиторы различных классов про- ^иназ. Очень важно проводить очистку белка быстро, что снижает опасность протеолиза и вероятность денатурации. .
} Распространено мнение об особой нестабильности чистых белков. Действительно, содержащиеся в неочищенных препаратах посторонние бедки в определенной мере защищают белок от денатурирующих воздействий и протеолиза. На промежуточных стадиях, когда полная
очистка еще не достигнута, опасность протеолиза увеличивается, с удалением же следов протеиназ на завершающих этапах очистки стабильность белка должна вновь возрасти. Впрочем, возрастает и опасность сорбционных потерь на поверхностях, которые могут восприниматься экспериментатором как присущая чистому белку нестабильность. '
ХАРАКТЕРНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ, НА КОТОРЫХОСНОВАНО ИХ РАЗДЕЛЕНИЕ
На каких физико-химических особенностях белков могут быть основаны способы их разделения? Во-первых, это размер молекулы, ее геометрия. На использовании этой особенности базируются методы гель-хроматографии и ультрафильтрации, отчасти электрофорез в гелях. ■ ' /
Во-вторых, характерное для данного белка распределение заряженных групп на его поверхности. Соотношение катионных и анионных групп в белке меняется в зависимости от pH, изоэлектрические точки белков — р! (значения pH, при котором положительные и отрицательные заряды белка полностью компенсированы и суммарный заряд равен нулю) существенно различаются у разных белков. Известны белки, являющиеся в физиологических условиях катионными, анионными или молекулами без заметного преобладания того или иного заряда. На различии заряда белков при разных pH основано их разделение методами электрофореза, изоэлектрического фокусирования, изоэлектрической и ионообменной хроматографии. Существенно, однако, не только соотношение заряженных групп, определяющее значение pl. Белки со сходными изоэлектрическими точками могут различаться распределением заряженных функциональных групп по поверхности глобулы. Последние размещаются более илй менее равномерно либо, наоборот, образуют локальные сгущения, гроздья одинаково заряженных групп, что сказывается при ионнообменной хроматографии белка.
В-третьих, белки различаются числом и характером гидрофобных участков поверхности, что используют при гидрофобной хроматогра- фИ”- '
Заметим, что ни один из рассмотренных выше признаков не может сам по себе обеспечить выделение индивидуального белка из сложной смеси — они недостаточно характеристичны, не гарантируют избирательности очистки. Значительно более перспективно в этом отношении использование для выделения функциональных свойств белка. Действи-
тедьно, среди множества белков в исходном материале найдется немало таких, которые имеют сходную молекулярную массу или близкие изоэлектрические точки, однако число, например, фосфатаз или амилаз будет заведомо небольшим. Очевидно, что метод выделения, основанный на использовании способности этих ферментов взаимодействовать со своим специфическим субстратом, несравненно избирательнее, чем любой прием, базирующийся на разнице физико-химических свойств.
Схемы выделения белков, использующие только один какой-либо принцип, редки, обычно различные подходы к фракционированию сочетаются и дополняют друг друга.
РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЕ.ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ (ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ)
v ' . ;
В этом методе используют гранулированные «мн поперечно-сшитых гидрофильных материалов, например декстрана (сефадекс, сефароза и их аналоги), полиакриламида (биогели и их аналоги), поливинилового спирта (тойоперл). Гранулы образованы трехмерной сеткой полимера, которая непроницаема для крупных молекул, частично проницаема для молекул промежуточного размера и хорошо проницаема для небольших молекул', солей и воды. В зависимости от среднего размера ячейки полимерного геля и геометрии молекулы последней доступна ббльшая или меньшая часть общего объема гранул геля.
L При движении раствора, содержащего белки и другие молекулы, по колонке, которая заполнена набухшими гранулами геля, компоненты смеси, проникшие в гель, задерживаются в нем. Таким образом они отстают от более крупных молекул, которые не ■ могут войти - внутрь гранул и находятся только в омывающем их растворе. Не будучи включенными. в гель, крупные молекулы появляются в элюате, как только через колонку пройдет "свободный" объем раствора Vo, равный ^объему раствора, заключенному ' между гранулами геля. Последний определяется плотностью упаковки и геометрией гранул. Для сферических частиц, в виде которых обычно и выпускаются материалы для гель-хроматографии, свободный объем составляет 30—36% общего объема колонки Vt-
v Если размеры молекул белка таковы, что они могут проникать в поры, составляющие некоторую часть объема гранул, то будет наблюдаться задержка элюции и белок появится в объеме Ve, связанном с коэффициентом доступности Кдост (долей объема гранул, доступной данному виду молекул) соотношением
V _ Ve ~ Vo.
жДост-У1 - v0 ‘
где Vt — полный объем колонки, за вычетом той его часта, которая приходится на сам гельобразующий полимер. ’,.
Каждому белку в зависимости от размеров его молекулы соответствует свое значение Кдост, на чем и основано разделение при гель- хроматографии. Понятно, что если объем элюции Ve близок к свободному объему Vq, то ■ Кдост стремится к нулю и разделения белков, молекулы которых практически не входят в поры геля, не произойдет. Точно так же молекулы небольших размеров, для которых проницаем весь объем геля (Ve близок к Vt и Кдост стремится к единице), в геле с данными характеристиками не разделятся. Наи лучшее разрешение получается, если Кдост находится в пределах 0,4 — 0,6. Разумеется,' пределы разделения можно расширить, используя для высокомолекулярных белков крупнопористые, а для небольших — мелкопористые гели.
Строго говоря, при гель-хроматографии разделение белков опреде 1 ляется не молекулярной массой, a teojttempweqcujuti разАеради молек# лы. Соответственно, молекулы вытянутой формы за счет "кувыркания" в растворе труднее проникают в гели, чем сферические молекуйй такой же молекулярной массы. Этим объясняется ранняя элюция денатурированных белков, которые ведут себя как неупорядоченный рыхлый клубок, а не как компактная глобула.'- . ,
Простая зависимость между объемом элюции и молекулярной массой белка (справедливая, конечно, только для компактных сферических молекул) и легкость эксперимента сделали гель-хроматографию излюбленным методом определения молекулярной массы белков. Для этой цели колонку, заполненную соответствующим гелем, калибруют Набором белков с известными молекулярными массами, после чего определяют объем элюции изучаемого белка и вычисляют его молеку^-1 лярную массу интерполяцией (рис. 3.1). Точность метода не очень велика, но вполне достаточна для большинства практически встречающихся задач.1,1
При использовании данного метода необходимо учитывать ограничения, возникающие из-за того, что гельобразующий материал i У вполне инертен, как это предполагает теория метода, и может взаим< - ‘ действовать с разделяемыми веществами, что искажает зависимость объема элюций от размера молекулы. Это особенно сказывается при разделении малых количеств белка, так как сорбционная емкость4 матрицы геля невелика и в крупномасштабных бйытах ее вЗаимодейст- ■ вие с белком мало отражается на процессе. ’ 44.
Рис. ^.1. Графики зависимости между молекулярной массой белков и коэффициентом доступности для сефадексов серии G ’’сверхтонких” (Л) и сефарозы 2В, 4В и 6В (/
Наилучшие результаты достигаются, если Кдост для выделяемого белка лежит в диапазоне 0,4 - 0,6
Связывание белков гельобразующими материалами может быть вызвано ионообменными взаимодействиями, в частности* содержанием отрицательно заряженных групп в полисахаридных матрицах (сефароза, сефадекс), а также в полиакриламидныхх материалах! В последних карбоксильные группы возникают при спонтанном гидролизе амидов, в цолисахаридах же они могут образовываться в результате окисления. Задержка при гель-хроматографии, вызванная ионообменными взаимодействиями с матрицей, особенно характерна для катионных белков, например лизоцима и некоторых субтилизинов. Нередко она весьма значительна и может даже препятствовать отделению солей от белка. В аналитических опытах такое удерживание удается подавить значительным повышением ионной силы раствора.
Еще одна причина аномального удерживания веществ при гель- хроматографии, особенно заметная при выделений небольших молекул, например пептидов, — гидрофобное связывание с матрицей геля. Гидрофобные^ элементы включаются в гидрофильные полисахаридные матрицы при обработке их сшивающими агентами, в частности эпихлоргидрином, при синтезе сефадекса. Пептиды, содержащие гидрофобные, в особенности ароматические, остатки (фенилаланина, триптофана) иногда удерживаются матрицей столь значительно, что появляются в элюате позже неорганических солей.
Разрешающая способность метода не очень велика, в то же время простота проведения и мягкость условий эксперимента являются его бесспорными преимуществами. Применимость метода на первых этапах очистки ограничивается тем, что для удовлетворительного фракционирования белков объем наносимого раствора не должен превышать
3—5% общего объема колонки. Ввиду этого к гель-хромато^рафии обычно прибегают в середине или на завершающих этапах выделения белка. Разумеется, при отделении низкомолекулярных примесей, в частности прй обессоливании, объем образца может быть значительно большим, поскольку не требуется высокого разрешения. В таком упрощенном варианте гель-фильтрацию используют особенно часто.
Несмотря на указанные ограничения, гель-хроматография — удобный способ фракционирования белков. Его применяют и для отделения от белков низкомолекулярных примесей, в том числе солей.
В последнее время наряду с гельобразующими материалами для разделения белков по размерам начали применять- макропористые неорганические носители — макропористые стекло и силикагель. Обычно. поверхность этих материалов покрывают гидрофильными органическими веществами, чтобы исключить необратимую сорбцию белков. Жесткость этих материалов позволяет разделять белки йо размеру молекул при повышенных давлениях, что ускоряет процесс и снижает помехи со стороны диффузии. -
ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
БЕЛКОВ . д
Метод ионообменной хроматографии, основанный на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка, принадлежит к числу наиболее используемых. В хроматографии белков практически не применяют синтетические ионообменные смолы на основе полистирола, весьма популярные в аналитической химии, аминокислот и пептидов. Это объясняется, во-первых, большим содержанием поперечных сшивок, делающих материалы такого рода практически непроницаемыми для белков, во-вторых, сорбцией белков, подчас необратимой, на гидрофобной поверхности полистирола. . тч
По указанным соображениям для разделения белков используют ионообменники, в которых матрица ("подложка") отчетливо гидрсн филъна. Особенно распространены ионообменники, получаемые присоединением ионогенных групп к целлюлозе, поперечно-сшитым декстрач нам (сефадексы). ’ - .
Для получения катионитов в качестве- ионогенной чаще всего исг пользуют карбоксильную группу, рКа которой, несколько изменяющийт- ся в зависимости от микроокружения, близок к 4 (карбоксиметил (СМ)-производные целлюлозы, сефадекса, содержащие группировки ^сн-о-сн2соон).
;_ Карбоксильные группы таких ионитов отрицательно заряжены при pH ,5 и -выше и, следовательно, способны связывать белки, которые в этих услориях несут положительный заряд. Связывание белков усилит бается, е^и на их поверхности встречаются скопления ("гроздья") кетионры^ групп. При. прочих равных условиях с катионитом лучше связываются белки большей молекулярной массы, что объясняется кооперативностью многоточечного взаимодействия обширных участков поверхности такого белка с анионными группами ионообменника. ,
Десорбция белков, связанных катионитом, обычно достигается повышением ионной силы элюирующего раствора, причем взаимодействующие между собой заряженные группы белка и ионита оказываются в окружении противоположно заряженных ионов солей. В результате при определенной концентрации соли, характерной для каждого белка, электростатические взаимодействия между ним и ионитом снимаются и белок элюируется с колонки. Плавное увеличение ионной силы раствора, применение линейного или более сложного градиента концентрации соли вызывает десорбцию сначала наиболее слабо удерживаемых молекул, затем более прочно связанных белков и т.д. В препаративных опытах нередко прибегают к ступенчатой элюции, при которой концентрация соли повышается скачками. Это ускоряет разделение и позволяет собрать белок в небольшом объеме, однако легко приводит к образованию одним и тем же белком нескольких ложных пиков.1
• При промывании колонки с ионитом раствором соли подходящей концентрации белок десорбируется, иногда образуя довольно длинный '‘хвост", что может ,быть следствием неравномерного распределения ионных групп в сорбенте. Участки с их повышенным содержанием, скопления таких групп прочнее удерживают белок, что и вызывает задержку элюции и образование "хвоста". В такой ситуации скачкообразное повышение ионной силы элюирующего раствора резко улучшает условия десорбции, поэтому часть белка, которая в обычных условиях образовывала бы "хвост", десорбируется скачком, давая ложный пик.,
Ввиду этого следует определять белковый состав каждой фракции независимым методом, например электрофорезом в полиакриламидном геле, или подвергать сомнительные пики повторной хроматографии в тех же условиях. Несоблюдение таких предосторожностей нередко приводит к ошибочному обнаружению "множественных форм" беЛков.
В принципе для десорбции белков с катионитов можно прибегать и к градиенту pH. Например, понижение pH до 3—4 приводит к протонированию карбоксилатных ионов карбоксиметилцеллюлозы или анало- 47
гичных. ионитов и постепенной десорбции связанных с ними .белков. Можно рассчитывать и на достижение изоэлектрической точки сорбированного белка, что опять-таки вызвало бы его десорбцию. Однако такой прием используют не часто не только из-за опасности денатурации белков при понижении pH, но и из-за осложнений, связанных с \ сорбцией ионитом части ионов элюирующего раствора и неопределенностью вызываемых этим локальных изменений pH. По таким же соображениям не рекомендуется использовать в ионообменной хроматографии белков растворы, содержащие несколько разных катионов или анионов.
Помимо карбоксильных катионитов, о которых шла речь выше, применяют катиониты, содержащие сульфогруппы -SO", например
сульфопропилсефадекс. В отличие от карбоксильных сульфогруппы сохраняют отрицательный заряд практически при всех pH, используемых в хроматографии белков..
Ионогенные группы фосфо-целлюлозы слабее, чем у сульфопропил- сефадекса, но сильнее карбоксильных. Оказалось, что этот ионооб- менник может применяться в качестве биоспецифического сорбента при выделении некоторых ферментов фосфорного обмена.
Среди анионитов наибольшее распространение получили диэти*- аминоэтил (ЕЕАЕ)^целлюлоза и ее аналоги с иными матрицами;
сн2-сн3 СНЧННг-СНг-гГ
•СН2"СНз .гр»,.
Диэтиламиноэтильная группа, присоединенная к целлюлозе или другой полисахаридной матрице
. Основность диэтиламиноэтильной группы в сорбентах этого типа^ несколько ниже обычной из-за влияния окружающих ее гидроксильных групп, так что ее рКа равен 9,5. DEAE-целлюлоза эффективна как анионообменник вплоть до pH 8,5 — 9,0. Аниониты, содержащие четвертичные аммонийные группы, — QAE-сефадекс или QAE-сефароза —, сохраняют положительный заряд и при более высоких pH.
Хроматография белков на DEAE-целлюлозе и аналогичных анионитах, подобно хроматографии на катионитах, определяется многоточечным связыванием отрицательно заряженных групп белка (прежде всего карбоксильных) с катионными группами ионообменника. Как и при хроматографии на катионитах, десорбции белков достигают повышением ионной силы элюирующего раствора, ее можно проводить ступен- " чато или с применением градиента концентрации соли. И в этом слу- 48
чае не. рекомендуют градиенты pH и использование растворов, содержащих разные анионы. Например, при десорбции белков хлористым натрием с DEAE-целлюлозы, уравновешенной ацетатным буфером, помимо экранирования разноименно заряженных групп сорбента и белка происходит замещение удерживаемых анионитом ацетат-ионов ионами хлора. Если элюция проводится в слабокислых растворах, десорбированные ацетат-ионы, связывая протоны, вызовут сдвиг pH в щелочную сторону, что приведет к локальному изменению условий элюции и сделает процесс трудно контролируемым.
Рис. 3.2. Очистка щелочной фосфатазы ионообменной хроматографией:
/ - оптическая плотность при 280 нм, отражающая общее содержание белка; 2 - активность щелочной фосфатазы;
А — разделение неочищенного препарата на анионите Моно-Q при pH 8 в градиенте концентрации NaCl d - 0,35 М (3);
Б - хроматофокусирование на Моно-Р щелочной фосфатазы, очищенной на предыдущей стадии в градиенте pH (4);
В - хроматография фракции, выделенной на Моно-Р, на анионите Моно-Q в градиенте концентрации NaCl (5)
В последнее время в хроматографии белков все шире применяют ионодбменники на основе гидрофильных органических полимеров, получаемых в форме шариков строго одинакового диаметра (10 мкм) и обладающих большой рабочей поверхностью. Стандартность гранул таких ионитов снижает размывание хроматографических пиков за счет различий во времени диффузии белковых молекул внутри сорбента — фактор, ограничивающий эффективность обычных ионообменников с неодинаковыми гранулами. Носители этого типа жестки, что позволяет достигать весьма высоких скоростей протекания растворов через колонку при давлении порядка 20 атм. Совместное действие этих факторов резко повышает эффективность и скорость хроматографии бел-
ков на такого рода сорбентах, получившей название быстрой жидкостной хроматографии белков (английское сокращенное обозначение FPLC). В качестве сорбентов используют Моно-Ц — сильный анионит с четвертичными аммонийными группами, Моно-S — сильный катионит, содержащий сульфогруппы, или МоцоР — катионит с фосфатными группами (рис. 3.2 ). ,
К сожалению, до сих пор не удалось разработать достаточно эффективный способ препаративного электрофореза белков в гелях, хотя их аналитическое разделение электрофорезом в полиакриламидном геле дает очень хорошие результаты и является ведущим методом в исследовании белковых смесей и индивидуальных белков.
ГИДРОФОБНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ
Как известно, поверхность белковой глобулы богата гидрофильны-^ ми аминокислотами, но в то же время содержит немало (до половины от их общего содержания) гидрофобных остатков, нередко образующих скопления (’’гроздья”). Такие гидрофобные зоны, развитые в большей или меньшей степени, представляют характерную особенность структуры каждого белка, на чем и основан метод гидрофобной хроматографии. Соответствующие сорбенты синтезируют, включая ' гидрофобные группировки в гидрофильную матрицу, например в поПерЬчно- сщитую агарозу — сефарозу. По такому принципу построены, в частности, октил- и фенил сефароза: 'Vf. i*.
Фенилсефароза - ,-и*'
При пропускании белкового раствора через фенилсефарозу гидрофобные участки поверхности белков образуют контакты с фенильными группами, вытесняя прилегающие к этим структурам молекулы воды. Число и прочность таких контактов весьма различны у разных белков. Повышению их прочности способствует сорбция белков из концентрированных растворов солей, например сульфата аммония. Плавное ■понижение концентрации соли в растворе, протекающем через колонку с фенил сефарозой, приводит к поочерёдной десорбции белков (рис. 3.3). .
Сходным образом действуют сорбенты, полученные присоединением к макропористому кремнезему гидрофобных алкильных радикалов 50
различной длИны: Они, будучи жесткими, особенно подходят для работы при повышенном давлении в условиях высокоэффетстивной жидкостной ■ хроматографии (ВЭЖХ, англ. HPLC). Те из них, которые содержат длинные — С18- углеводородные цепи, малопригодны для разделения белков из-за слишком сильного, нередко необратимого'связывания, но могут применяться для хроматографии пеп-различной длИны: Они, будучи жесткими, особенно подходят для работы при повышенном давлении в условиях высокоэффетстивной жидкостной ■ хроматографии (ВЭЖХ, англ. HPLC). Те из них, которые содержат длинные — С18- углеводородные цепи, малопригодны для разделения белков из-за слишком сильного, нередко необратимого'связывания, но могут применяться для хроматографии пеп-26 60 66 60 МО ' Объем элюата, мл26 60 66 60 МО ' Объем элюата, млРис. 3.3. Выделение интерферона фибробластов человека гидрофобной хроматографией на фенилсефарозеCL-4B: ' " 'Рис. 3.3. Выделение интерферона фибробластов человека гидрофобной хроматографией на фенилсефарозеCL-4B: ' " 'тидов. Лучшие результаты дает 1" содержание белка в алюате, 2 - гра-тидов. Лучшие результаты дает 1" содержание белка в алюате, 2 - гра-хроматография белков на сорбентах, содержащих более короткие —- С< — Се-углеводородные цепи.хроматография белков на сорбентах, содержащих более короткие —- С< — Се-углеводородные цепи.диент концентрации этиленгликоля, использованного для десорбции, 5 - активность интерферона; хорошо видны ’’проскок”, содержащий белки, которые не свя-диент концентрации этиленгликоля, использованного для десорбции, 5 - активность интерферона; хорошо видны ’’проскок”, содержащий белки, которые не свя-Нередко гидрофобная хроматов зываются с сорбентом, и пик очищенного графия сочетается с другими эф- нн^рФфокаНередко гидрофобная хроматов зываются с сорбентом, и пик очищенного графия сочетается с другими эф- нн^рФфокафектами. Например, присоединение к активированной бромцианомфектами. Например, присоединение к активированной бромцианом
различной длИны: Они, будучи жесткими, особенно подходят для работы при повышенном давлении в условиях высокоэффетстивной жидкостной ■ хроматографии (ВЭЖХ, англ. HPLC). Те из них, которые содержат длинные — С18- углеводородные цепи, малопригодны для разделения белков из-за слишком сильного, нередко необратимого'связывания, но могут применяться для хроматографии пеп-
различной длИны: Они, будучи жесткими, особенно подходят для работы при повышенном давлении в условиях высокоэффетстивной жидкостной ■ хроматографии (ВЭЖХ, англ. HPLC). Те из них, которые содержат длинные — С18- углеводородные цепи, малопригодны для разделения белков из-за слишком сильного, нередко необратимого'связывания, но могут применяться для хроматографии пеп-
26 60 66 60 МО ' Объем элюата, мл
26 60 66 60 МО ' Объем элюата, мл
Рис. 3.3. Выделение интерферона фибробластов человека гидрофобной хроматографией на фенилсефарозе
CL-4B: ' " '
Рис. 3.3. Выделение интерферона фибробластов человека гидрофобной хроматографией на фенилсефарозе
CL-4B: ' " '
тидов. Лучшие результаты дает 1" содержание белка в алюате, 2 - гра-
тидов. Лучшие результаты дает 1" содержание белка в алюате, 2 - гра-
хроматография белков на сорбентах, содержащих более короткие —- С< — Се-углеводородные цепи.
хроматография белков на сорбентах, содержащих более короткие —- С< — Се-углеводородные цепи.
диент концентрации этиленгликоля, использованного для десорбции, 5 - активность интерферона; хорошо видны ’’проскок”, содержащий белки, которые не свя-
диент концентрации этиленгликоля, использованного для десорбции, 5 - активность интерферона; хорошо видны ’’проскок”, содержащий белки, которые не свя-
Нередко гидрофобная хроматов зываются с сорбентом, и пик очищенного графия сочетается с другими эф- нн^рФфока
Нередко гидрофобная хроматов зываются с сорбентом, и пик очищенного графия сочетается с другими эф- нн^рФфока
фектами. Например, присоединение к активированной бромцианом
фектами. Например, присоединение к активированной бромцианом
сефарозе диаминов различной длины дает сорбенты, в которых содержатся гидрофобные углеводородные цепочки наряду е двумя катионными /группами. Объединение черт гидрофобного сорбента и анионита в одном хроматографическом материале обогащает , его возможности. . '
Описанный выше способ проведения хроматографии на гидрофобном сорбенте — далеко не единственно возможный. Для сорбции4 белков не обязательно введение в раствор повышенных концентраций соли, а для элюции можно применять добавление органических растворителей, сдвиг pH. В некоторых случаях, когда связывание белка основано на сочетании гидрофобных и ионных взаимодействий, хорошие результаты дает элюция растворами солей. Отметим также, что признаки гидрофобной хроматографии встречаются и в других приемах, разделения белков, в особенности в аффинной хроматографии. *
х • 3.6. АФФИННАЯ, ИЛИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКАЯ, ’ 1 *ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ .
< н.
Как уже отмечалось, способы разделения белков, основанные на различиях в их физико-химических свойствах, не могут быть высокоспецифичными. С этой точки зрения гораздо перспективнее препаративные методы, которые базируются на функциональных различиях 51
белков. Для множества белков, включая ферменты, их ингибиторы, транспортные белки, иммуноглобулины, регуляторные белки, токсины, рецепторы, — главнейшая функциональная черта состоит в способной сти избирательно связывать те или иные лиганды — субстраты, коферменты, аллостерические эффекторы, антигены и т.п.
Такое , связывание по существу своему весьма специфично, и это свойство резко выделяет тот или иной белок из множества других. На использовании функционально обусловленной способности " белков обратимо связываться с соответствующими лигандами ■ и основан метод. аффинной, или биоспецифической, хроматографии..
Для синтеза аффинного сорбента отвечающий специфичности данного белка лиганд, (субстрат или его аналог при хроматографии фермента) присоединяют к инертной матрице так, чтобы возможно меньше затронуть те элементы его структуры, которые непосредственно участвуют во взаимодействии с белком. Иногда лиганд, прямо вводят в реакцию с функциональными группами на • поверхности матрицы, однако чаще их соединяют через промежуточное звено ("вставку", "ножку" и т.п.), чтобы отдалить лиганд от матрицы и .уменьшить пространственные препятствия для его сближения с белком.
К каждому из элементов структуры аффинного, сорбента предъявляются определенные требования. Матрица должна быть инертной W' не создавать стерических препятствий, для белка. Чаще всего' в качестве матрицы используют макропористые гели, образованные поперечно- сшитыми гидрофильными полимерами, например производное агарозы — сефарозу, синтетические ■ полимеры или неорганические носители макропористые производные кремнезема — силикагель или стекло. Присоединение лигандов к сефарозе (непосредственно или через вставку) обычно проводят, активируя ее бромцианом. Бромциан (сильный яд!) в щелочной среде реагирует с гидроксильными группами сефард^ зы, образуя весьма активный эфир изоциановой кислоты:,
хSп
^СН-ОН + Вг-Ч^► Н№ //п /(,
■Эфир изоциановой кислоты; ■
Последний взаимодействует затем с аминогруппами лиганда L или "вставки" с образованием производного изомочедины, которое является сильным основанием и в обычном диапазоне pH несет положитель- ныи заряд:
+ КН2
^СН-ЧН^ + NH2-L —* 'SCH-O—с—NH-L
Лиганд Производное изомочевины
Такик образом, присоединение Лиганда к сефарозе, активированной бром цианом, одновременно создает на матрице эквивалентное содержанию лиганда число катионных групп. Следовательно, такой сорбент помимо биоспецифического связывания белка лигандом может проявлять свойства анионита, что необходимо учитывать при его использовании.' . . - 1
Известны и другие способы присоединения лигандов к матрице,' однАКО в Каждом случае следует учитывать изменения в характере носителя, сопровождающие реакцию с лигандом, а также большую или меньшую неустойчивость образовавшейся связи, которая иногда может* вызывать постепенную "утечку" лиганда. Например, изомочевина может превр&щвтьс в производное гуанидина в присутствии значительных концентраций первичных аминов или аммиака, что влечет за собой отщепление лиганда. у
Сложнее требования, пре^мвляежме к лиганду. Он прежде всего должен достаточно сильно взаимодействовать с белком. Так, принято считать, что для получения сорбентов,-предназначенных для выделе- -ния ферментов, .в качестве лигандов могут быть использованы тккие ингибиторы или аналоги субстрата, которые имеют константу ингиби- ■ рования (субстратную константу), т.е. константу диссоциации фермент — лиганд, не хуже 10'4 М. При этом учитывается, что присоединение лиганда к матрице ухудшает (т.е. повышает) константу ингибирования по крайней мере на один порядок. ‘ - ‘ -
При подборе лигАндов для аффинной хроматографии ферментов приходится изменять структуру субстрата, чтобы предотвратить возможность его превращения ферментом в продукт, например, расщепления пептидного лиганда, если речь идет о хроматографии протеиназ. Очевидно, что сорбент, содержащий в качестве лиганда истинный субстрат, будет трансформирован при первом же контакте с ферментом и окажется непригодным.
При пропускании раствора, содержащего сложную смесь белков, других биополимеров, низкомолекулярных соединений, солей, пигментов и т.п., через биоспецифический сорбент, построенный по описанной выше схеме, лиганд образует комплекс только с тем белком, который имеет участок связывания, комплементарный структуре лиганда. В результате именно этот белок удерживается аффинной колонкой, тогда как все остальные компоненты смеси проходят через нее не задерживаясь.
После промывания колонки для удаления неспецифически удерживаемых примесей белок элюируют, изменяя состав протекающего через колонку раствора так, чтобы ослабить взаимодействие белка с лиган-
дом." Для этого прибегают к изменению pH, добавляют к элюенту неорганические соли, органические растворители. Все эти факторы, воздействуя на структуру эоны связывания лиганда и подавляя отдельные виды белок-лигандных взаимодействий, например ионные связи и гидрофобные контакты, обеспечивают десорбцию. В отдельных случаях прибегают к аффинной элюции раствором лиганда или его аналога. Этот прием, основанный на конкуренции за связывание белка между присоединенным к матрице и растворенным лигандами, весьма специфичен и эффективен, но дорог.
В качестве примера рассмотрим применение циклопептидного антибиотика— грамицидина S (см. гл. 2) — в качестве лиганда при аффинной хроматографии протеолитических ферментов. Он содержит ряд гидрофобных аминокислот, соответствующих специфичности многих протеиназ, и два остатка орнитина, 6-аминогруппЫ которых позволяют легко присоединить циклопептид к активированной бромцианом сефарозе или другим матрицам:
- . кн2 со-
^С№С-М1-(СН2)з-СН_ ;
NH- .
, Остаток орнитина, аминогруппа которого присоединена к активированной бромцианом сефарозе is
Грамицидин S связывает протеиназы различных классов, однако он устойчив к их действию и не подвергается гидролизу, по-видимому, из-за присутствия в структуре остатков D-фенилаланина, пролина, а также из-за особенностей конформации циклопептида. Следовательно, грамицидин S является природным аналогом субстратов протеину и хорошо подходит для роли лиганда широкой специфичности. Тыс, при пропускании через колонку с грамицидйн-8-сефарозой сложной смеси веществ, содержащихся в культуральной жидкости одного йз 'штаммов бактерии Bacillus subtilis, сорбент связывает только металлопротеиназу, которую удается полностью освободить от примесей и получить практически чистый белок? ^
Еще эффективнее сорбенты, содержащие такие лиганды, которые взаимодействуют не только с зоной связывания, но и с каталитическим центром фермента. Например, производные бензилянтарНой кислоты оказались хорошими лигандами для выделения карбоксипептидаз — ферментов, отщепляющих аминокислоты от карбоксильного конца пептидной цепи. Сходство лиганда с субстратами карбоксипептидаз на первый взгляд невелико, однако оказывается, что группа
Н00С~СН2 способна выступать в качестве своеобразного аналога пептидной связи:
Аминогруппа, используемая для присоединения лиганда к матрице
-CO-NH—CH—СООН-CO-NH—CH—СООНно-со-сн 2—CH—C000Hно-со-сн 2—CH—C000H
-CO-NH—CH—СООН
-CO-NH—CH—СООН
но-со-сн 2—CH—C000H
но-со-сн 2—CH—C000H
C-Концевой остаток фенилаланина в пептидном субстрате карбоксипептидазыC-Концевой остаток фенилаланина в пептидном субстрате карбоксипептидазыБензилянтарная кислота, имиБензилянтарная кислота, имитирующая структуру остаткафенилаланина; группу СО-NHзаменяет СО-СН2тирующая структуру остаткафенилаланина; группу СО-NHзаменяет СО-СН2
C-Концевой остаток фенилаланина в пептидном субстрате карбоксипептидазы
C-Концевой остаток фенилаланина в пептидном субстрате карбоксипептидазы
Бензилянтарная кислота, ими
Бензилянтарная кислота, ими
тирующая структуру остатка
фенилаланина; группу СО-NH
заменяет СО-СН2
тирующая структуру остатка
фенилаланина; группу СО-NH
заменяет СО-СН2
В результате /^-карбоксильная группа бензилянтарной кислоты взаимодействует с каталитическим центром фермента, а боковая бензильная группа и о-карбоксил — с компонентами зоны связывания субстрата. Образующийся комплекс лиганда, обычно присоединяемого к матрице через аминогруппу, введенную в парачтолоЯкение бензольного кольца, связывает фермент весьма прочно.
. Широко используют своеобразный вариант аффинной хроматографии^ основанный на применении в качестве лигандов синтетических красителей антрахиноновою ряда, например цибакрона голубого;
Антрахиноновый красительАнтрахиноновый краситель55/55/
Антрахиноновый краситель
Антрахиноновый краситель
55/
55/
Плоская структура, образованная тремя конденсированными ар ма- тическими кольцами замещенного антрахинона, к которому в положении 1 присоединены замещенный анилин и триазиновый цикл, «пробна ' избирательно взаимодействовать с целым рядом белков. Лиганд связывается, по-видимому, во впадинах, которые нередки на поверхности белков, в особенности в активных центрах ферментов. Высказывались предположения, что антрахиноны вместе с присоединенными ядрами анилина и триазина образуют структуру, стерически близкую природным лигандам, например таким коферментам, как NAD, и имитируют свойственный последним способ связывания с белками. Ввиду этого сорбенты, содержащие цибакрон голубой и некоторые другие антрахиноновые красители, особенно рекомендуются для аффинной хроматографии белков, содержащих NAD или иные соединения нуклеотйдной природы.
Нет необходимости, чтобы нуклеотид или сходное по строению соединение было похоже на субстрат — оно. может имитировать эффектор, регулирующий активность фермента. Так, например, хорошие результаты дает хроматография на антрахиноновых красителях аспар- таткарбамилазы, где нуклеотиды выступают как аллостерические эффекторы. , - г п- г
Впрочем, круг белков, связываемых этими сорбентами, значительно шире и включает, например, сывороточный альбумин. Последней легкр присоединяет разлйчные лиганды, в том числе некоторые лекарственные препараты и триптофан, который можно ( с большими оговорками) считать напоминающим конденсированные кольца антрахинона. Структура лиганда — замещенного антрахинона — не безразлична, поэтому, используя разные красители, удается получить серило сорбентов, не одинаково связывающих различные белки. ,
. 3.7. ИММУНОСОРБЦИЯ
К числу наиболее специфических принадлежит взаимодействие белков с антителами — илииуноглобулинсмии. Это свойство с успехом используют для создания биоспецифических сорбентов, в которых роль лиганда выполняют специфические в отношении выделяемого белка иммуноглобулины. Получение и применение такого рода сорбентов происходят примерно так же, как и в обычной аффинной хроматографии, отличаясь лишь немногими особенностями. Во-первых, ,присоединение иммуноглобулина G к матрице необходимо проводить в щадящих условиях. Установление между молекулой антитела и носителем множества ковалентных связей (которое может произойти, ^сли добиваться повышения емкости сорбента) благоприятствует денатура- 56
ции белка и может, следовательно, привести к утрате специфичности антитела.
' Во-вторых, использование обычных, поликлональных, антител, которые представляют Собой весьма сложную смесь молекул иммуноглобулинов различного строения, приводит к получению сорбента, в котором содержатся антитела с широким диапазоном сродства к выделяемому белку-антигену. Это затрудняет его сорбцию и в особенности десорбцию, так как диссоциация целого набора неодинаковых комплексов антиген—антитело может потребовать вариации условий элюции в весьма широком интервале, вплоть до весьма жестких. Это осложнение снимается, если доступны лито-клональные антитела, представляющие собой однородные молекулы иммуноглобулина. Десорбция и в этом случае может доставлять некоторые трудности из-за прочности комплекса, однако их удается • преодолеть, подавляя нековалентные взаимодействия между выделяемым белком и иммуноглобулином при помощи изменения pH, ионной силы, добавления в элюент органических растворителей или мочевины. ‘
Иммуносорбция особенно уместна как высокоспецифичный метод выделения небольших количеств особо ценных белков из сложных смесей, поскольку используемые сорбенты дороги и недолговечны из- за склонности иммуноглобулинов к денатурации. Очень важно, что к иммуносорбции можно прибегнуть даже в таких случаях, когда сведения о свойствах белка, в том числе чи о его функции, скудны. Если известна первичная структура, определенная по нуклеотидной последовательности гена, то возможно синтезировать ряд фрагментов его пейтидной цепи и, присоединив их к белку-носителю, иммунизировать таким конъюгатом животное. Это дает возможность получить антитела к исследуемому белку, несмотря на то что он не только не выделен, но и его функция пока неизвестна. Иммуносорбенты, синтезируемые присоединением таких антител к подходящему носителю, позволяют выделить белок.
3.8. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БЕЛКОВОЙ ИНЖЕНЕРИИ
/jД ЛЯ'ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ
н ю•
Методы генной инженерии позволяют присоединять к структурному ¥6ну белка последовательности, кодирующие такие белки или их фрагменты (домены), которые облегчают выделение конструкции в цел дм: Полученный гибридный (’’химерный ”) белок во многих случае ях, Хотя и не всегда, жизнеспособен, причем обе части ’’химеры” не зависимо друг от друга свертываются в компактные структуры. Это
•57
дает возможность, используя характерные свойства присоединенной к целевому белку структуры, провести специфическое выделение гибрида, после чего расщепить "шарнир", соединяющий обе его части.
Так, белки-гибриды, в которых одной из составных частей является белок А стафилококкрв, могут быть очищены хроматографией на колонках, содержащих присоединенные ковалентно иммуноглобулины. Белок А прочно связывается с последними. Гибридные белки, в состав которых входит /^галактозидаза или ее крупные фрагменты, могут быть очищены на колонках, специфически сорбирующих этот фермент, например содержащих ковалентно связанный аналог субстрата — аминофенилтиогалактозид. По завершении очистки гибридный белок подвергают ограниченному протеолизу или расщепляют связь между объединенными в его структуре белками специфическими химическими методами, например действием бромциана, и отделяют "целевой" белок от белка-носителя, что, как правило, не составляет затруднений.
Иногда к структурному гену белка присоединяют олигонуклеотид- ные фрагменты, которые кодируют короткие аминокислотные последовательности, наращивающие этот белок с аминного или карбоксильного конца. Эти последовательности выбирают так, чтобы они не препятствовали свертыванию белка и в то же время сообщали- всей конструкции то или иное характерное свойство, которое позволяет легко выделить такую молекулу даже из очень сложной смеси. Затем эти фрагменты отщепляют в мягких условиях.
Так, присоединение к карбоксильному концу дегидрофолатредук- тази Lys—Gly—Ser—Arg—Ser двух остатков гистидина дает последовательность Lys—Gly—Ser—Arg—Ser—His—His. Соседствующие остатки гистидина образуют комплекс с ионом Ni2*, который удерживается специально полученным сорбентом с хелатирующими группами. Это позволяет в одну стадию выделить клонированный Е.coli фермент из культуральной жидкости практически чистым, с 90%-ным выходом. Отщепление обоих остатков гистидина карбоксипептидазой А приводит к дегидрофолатредуктазе с G-концевой последовательностью Lys—Gly—Ser—Arg.
Предложено к аминному концу рекомбинантных белков-лимфоки- нов присоединять последовательность Asp—Туг—Lys—Asp—Asp—Asp— Asp—Asp—-Lys, которую связывает специально полученное антитело. После очистки белка (модифицированного присоединением тезкой последовательности) иммуносорбцией его обрабатывают энтеропептидазой — ферментом, специфически отщепляющим этот пептид (сж. гл. 11). По-видимому, описанный подход особенно перспективен для выделения и очистки рекомбинантных белков.
ГЛАВА 41
ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА
LL ПЫ*ВИЧНАЯ-СТРУКТУРА КАК УРОВЕНЬ.ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКА
.-ч - ).-г. 1 ■■•
К белкам относят полипептиды, способные самопроизвольно формировать ц удерживать определенную пространственную структуру. Нельзя указать такого порога, границы, которые резко отделяли бы белки от пептидов. Действительно, известная способность к образованию предпочтительных конформаций в растворах замечается уже у сравнительно коротких пептидов, более того, эта способность существенна для функции некоторых пептидов (например, гормонов), облегчая их взаимодействие с клеточными рецепторами. И всё же это только прообраз четкого соотношения между последовательностью аминокислот и пространственной структурой, которое составляет важнейшую отл мнительную особенность белка.
Стабилизация пространственной структуры требует хорошо развитой системы нековалентных взаимодействий, что может быть достигнуто лишь начиная, с некоторой длины полипептидной цепи. Известны белки, полипептиднаЯ цепь которых содержит всего.лишь около пяти-* десяти аминокислотных остатков. К ним относятся, например, панкреатический ингибитор трипсина, фактор роста эпителия, некоторые белки оболочек бактериофагов. Однако такие случаи относительно редки и белки чаще всего содержат 100 — 400 аминокислотных остатков в одной полипептидной цепи, образующей глобулярную структуру.
। Впрочем, длина полипептидной цепи может быть и гораздо большей, достигая тысячи остатков и более. Известны и так называемые пс ^белка. Они представляют собой еще более длинную полипёптид- ную цепь, формирующую последовательно несколько вполне автономию как в структурном, так и в функциональном отношении глобул, которые после разрезания полибелка по местам ’’перетяжек” протеиназами" существуют как независимые друг от друга ферменты. Видимо, сам по себе механизм биосинтеза не накладывает существенных ограничений на длину полипептидной цепи белка.
нСдедует подчеркнуть, что переход от пептида к прдбтранственно структурированной, компактной белковой глобуле определяется не механическим удлинением полипептидной цепи, а специфической последовательностью аминокислотных остатков. Иными словами, вовсе не обязательно случайно построенная полипептидная цепь самопроизвольно образует компактную пространственную структуру. Весьма
'' 59
вероятна, что способность к самосборке свойственна ограниченному кругу последовательностей, среди которых и те, что соответствуют природным белкам и отобраны в ходе эволюции. Во всяком случае известны последовательности аминокислот, не свертывающиеся в компактную структуру.I- •<.,/ .4.» f
Столь большое значение,«котороепридают самосборке пространственной структуры как отличительному признаку белка, объясняется тем, что именно она служит основой всех свойств белка, прежде всего его биологической функции. Физические характеристики белка как полимера полностью определяются его способностью формировать компактную глобулу, от особенностей которой зависит и олигомеризация многих белков. Химические и функциональные свойства белков зависят от специфических взаимодействий функцией;шьных групп, сближенных в его пространственной структуре. Вследствие этого поведение этих групп в белках коренным образом отличается от их реакционной способности в аминокислотах и небольших пептидах. Соответ' ственно белок может фрнхционироватъ, т.е. выступать в качестве фермента, структурного или транспортного белка, регулятора,, токсина, ингибитора только потому, что он обладает вполне определенным пространственным строением. .'>- г
Еще на заре современной химии белка датский биохимик К.Лин- дерштрем-Ланг предложил рассматривать четыре уровня организации белковой мелекулы: первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. Эта классификация закрепилась в литературе, поскольку в ней отразились реальные ступени формирования пространственного строения белковых молекул.* <ь
Первичной структурой называют последовательность аминокислотных остатков в молекуле белка. Она кодируется структурным геном .данного белка и содержит в себе все необходимое для самоорганизации его пространственной структуры» Последовательность аминокислот образуется в результате трансляции мРНК. Однако первичная структура зрелой белковой молекулы далеко не всегда полностью совпадает с непосредственным продуктом трансляции, который-, как правило, подвергается более или менее существенной ко- и посттрШс- ляционной модификации, процессингу, причем могут изменяться аминокислотные остатки, длина полипептидной цепи и т.п. (см. гл. 11).11
Для определения первичной структуры белка все чаще прибегМ^Т* к анализу последовательности нуклеотидов в соответствующем структурном гене или кДНК, что требует гораздо меньшего времени й' дает в целом более точные результаты. Однако такой путь" не всегда практичен, так как при этом необходимо выделение и клонирование гена. Кроме того, он не позволяет обнаружить посттрансляционные модифи- 60‘
кации, без выявления которых исследование структуры белка нельзя считать завершенным. Ввиду этого методы определения первичной структуры, основанные на анализе самого белка сохраняют свое значение и продолжают совершенствоваться. Помимо полного анализа первичной структуры те же методы применяют (обычно в неполном объеме) для первичной характеристики вновь выделяемых белков, сравнения белков между собой, анализа их функционально важных фрагментов, локализации групп, подвергшихся химическому модифицированию, и т.п..
' Число установленных первичных структур быстро нарастает — еще в 1866 г. их счет шел на единицы, в 1976 г. было известно около 600, в 1984 г. — 2500 последовательностей, содержащих около 0,6 млн. аминокислотных остатков, к концу 1989 г. эти цифры возросли соответственно до 14 400 и 4 млн.1.
ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ИНДИВИДУАЛЬНОСТИ БЕЛКА.
.МИКРОГЕТЕРОГЕННОСТЪ БЕЛКОВ
• - Определению первичной структуры белка предшествуют его очистка* (см. гл. 3) и установление химической индивидуальности, или, как принято говорить, юлилекности. Универсальных критериев гомогенности белка нет, наиболее строгим доказательством его индивидуальности являете^ однозначное установление первичной структуры, требующее большого труда и времени и не всегда доступное. Практически полезными, хотя и неполными, критериями индивидуальности белка служат:
4ыгг обнаружение при диск-электрофорезе или изозлектрофокусиро- вании единственной белковой полосы, проявляющей характерную для данного белка активность; весьма доказательны данные иммуно- эдентрофореза и иммуноблоттинга;
.г — обнаружение при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии анионного детергента (додецилсульфата натрия) единственной полосы, отвечающей, денатурированному белку, в особенности еслц им уноблоттинг подтверждает, что она несет антигенные детерминанты данного белка. В случае олигомерных белков, построенных из разных субъединиц, таких полос может быть несколько, однако анализу первичной структуры должно предшествовать разделение субъединиц;
— обнаружение единственного белкового пика, достаточно симметричного и совпадающего с пиком активности при ра личных методах жидкостной хроматографии (аффинной, ионообменной, гидрофобной, гельтхроматографии). Существенно, чтобы соотношение активности и '
содержания белка (удельная активность) оставалось постоянным по всеми пику; „ . '
— выявление единственной аминоконцевой последовательности. К идентификации аминоконцевого остатку для этой цели прибегают редко, так как расход белка для получения столь ограниченноД«информации оказывается неоправданно большим. . . , j
Эти приемы не единственны и не обязательны, доказательство индивидуальности строится по-новому для каждого белка Нередко при этом обнаруживается так называемая микрдгетерогениост-ь бедка, вызываемая, как правило, неоднозначностью постгранбляционных модификаций или случайными повреждениями белковых молекул i 1 vivo или. в процессе выделения. Возможна, впрочем, и гетерогенность, обусловленная функционированием аллельных генов, или альтернативным сплайсингом.^ ' ■ :
Среди наиболее частых причин микрогетерогенности укажем внутренние разрывы помтепти^ной цепи за счет случайного действия протеиназ, так называемые растрепанные концы (результат неоднозначного процессинга аминоконцевого участка белка), а также дезалт. дирование отдельных остатков аспарагина, реже глутамина. Последнее может происходить спонтанно, в особенности легко — в последовательности Asn—С1у и приводит к так называемой лщкрогетерогенности по заряду. Известна микрогетерогенность за счет неполноты фосфорилирования белка протеинкиназами или различий в структуре углеводных цепей гликопротеинов. .
Высказываемые иногда предположения о микрогетерогенности, обусловленной существованием стабильных конформеров белка с одинаковой первичной структурой, экспериментального подтверждения не получили и труднообъяснимы теоретически. Многие виды микрогете- рогенностй не препятствуют определению аминокислотной последовательности, однако осложняют анализ и должны учитываться при его проведении.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКА Г
Определение аминокислотного состава необходимо для характеристики исследуемого белка, а также пептидных фрагментов, получаемых в ходе анализа первичной структуры. Для расщепления до свободных аминокислот пептид или белок подвергают исчерпывающему гидролизу, нагревая его с постоянной кипящей (5,7 М) НС1 при. 105 ?С в течение 24 ч. Поскольку в таких условиях пептидные связи остатков изолейцина и валина ■ гидролизуются неполно, .проводят также 48- и 72^часовой гидролиз. В то же время серин и треонин недостаточно 62
устойчивы и заметно (примерно на 10%) расщепляются уже за 24 ч. Ввиду этого для получения более надежных величин содержание валина и изолейцина оценивают, экстраполируя найденные значения к пбескбйечному" времени, а сбДержание серина и треонина определяют <‘ экстраполяцией к "нулевому" времени гидролиза.
Некоторые аминокислоты вообще1' не выдерживают кислотного гидролиза и разрушаются практически полностью, поэтому для их определения требуются специально разработанные приемы. Прежде всего полностью гидролизуются до свободных аспарагиновой и глутаминовой Кислот их амиды — аспарагин и глутамин. Методы их прямого определения в белках до сих пор не разработаны. Для определения триптофана гидролиз белка проводят метансульфоновой кислотой СН3—SOgH в присутствии триптамина, защищающего индольное кольцо триптофана от деструкции. Для определения суммы цистина и цистеина белок перед гидролизом подвергают окислению надмуравьиной кислотой НСО—ООН, в результате чего эти остатки превращаются в остатки цистеиновой кислоты: '
SHSHон
SH
SH
сн2сн2—NH-CH-CO—NH-CH-COЦистеинЦистеин-NH-CH-CO--NH-CH-CO-ооНС-ООН,НС-ООН,Гидролиз5,7 К НС1Гидролиз5,7 К НС1o=s=oo=s=oсн2сн2NH2'CH—соонNH2'CH—соонЦистеиновая кислота (CysSOgH)Цистеиновая кислота (CysSOgH)'<'<сн2сн2SSSSсн2сн2^ Г г>/^ Г г>/-NH-CH-CO-Цистин-NH-CH-CO-Цистин
сн2
сн2
—NH-CH-CO
—NH-CH-CO
Цистеин
Цистеин
-NH-CH-CO-
-NH-CH-CO-
о
о
НС-ООН,
НС-ООН,
Гидролиз
5,7 К НС1
Гидролиз
5,7 К НС1
o=s=o
o=s=o
сн2
сн2
NH2'CH—соон
NH2'CH—соон
Цистеиновая кислота (CysSOgH)
Цистеиновая кислота (CysSOgH)
'<
'<
сн2
сн2
S
S
S
S
сн2
сн2
^ Г г>/
^ Г г>/
-NH-CH-CO-
Цистин
-NH-CH-CO-
Цистин
Поскольку определение последнейПоскольку определение последнейне позволяет судить о содержа-не позволяет судить о содержа-
Поскольку определение последней
Поскольку определение последней
не позволяет судить о содержа-
не позволяет судить о содержа-
нии раздельно остатков цистина и цистеина, данные аминокислотного анализа выражают в остатках "полуцистина". Окисление надмуравьиной кислотой превращает также остатки метионина в метионинсуль- фон, не разрушающийся при гидролизе в отличие от метионина:
.СН3
0=8=0I сн2I сн2I-NH-CH-CO-0=8=0I сн2I сн2I-NH-CH-CO-s
0=8=0
I сн2
I сн2
I-NH-CH-CO-
0=8=0
I сн2
I сн2
I-NH-CH-CO-
сн2
I нсо-оон
сн2
-NH-CH-CO-
МетионинМетионинсульфон
.(MetS02)
Для количественного определения аминокислот в кислотном гидролизате белка или пептида используют автоматические анализаторы, впервые описанные У.'Стейном, С.Муром и Д.Спекмэном. Их конструкции весьма разнообразны, однако все они основаны на хроматографическом разделении аминокислот на сульфополистирольных катионитах. Элюция аминокислот происходит в порядке, который определяется, во-первых, их кислотно-основными свойствами (аспарагиновая и глутаминовая кислоты элюируются в числе первых; гистидин, лизин и аргинин — последними); во-вторых, гидрофобными взаимодействиями боковых радикалов с полистирольной матрицей ионита (гидрофильные серин и треонин элюируются рано; глицин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин — примерно в порядке возрастания гидрофобности).
' В элюате автоматически проводится цветная реакция аминокислот с нитидрино.« (см. гл. 1), на которой и основано их количественное определение. Такой способ позволяет определять до 1—10 пмоль аминокислоты. Более чувствительно измерение флуоресценции продукта реакции аминокислот с о-фталевым альдегидом (см. гл. 1), позволяющим определять менее 1 пмоль.
Развивается новый подход к определению аминокислотного состава, при котором аминокислоты превращают в производные, интенсивно поглощающие свет в ультрафиолетовой или видимой области сиркт- ра, например в фенилтиокарбамил- (см. гл. 1) или р-диметиламино- фенилазофенилсульфонил ("дабсил")-производные:
СНз
«КI.
• ^-C6H4-N=N-C6H4-502-NH-CH-€00H
СНз
Дабсил-аланин
Эти производные разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонках, содержащих С^-производные кремнезема, и определяют содержание аминокислот спектрофотометрически. Метод обладает высокой чувствительностью и скоростью, позволяя определять доли пикомоль — фемтомоли аминокислот.
Оценивая результаты аминокислотного анализа белков и пептидов, необходимо учитывать ограничения, связанные прежде всего с относительной неточностью ("грубостью”) кислотного гидролиза белков. К сожалению, надежный метод полного ферментативного гидролиза белков, который был бы лишен этого недостатка, до сих пор не разработан. Точность самого метода определения аминокислот, как правило, заметно выше — порядка 2—3%. Учитывая это, следует с .осторожностью относиться, например, к данным о небольших (в 1—2 остатка) различиях в составе белков, поскольку они не выходят за пределы возможных погрешностей метода, особенно если речь идет о "трудных” для определения аминокислотах, разрушающихся при гидролизе, образующих трудно расщепляемые пептидные связи или. дающих низкий выход окраски при реакции с нингидрином (например, пролин).
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Подготовка белка к анализу
Подготовка белка к анализу первичной структуры призвана свести к минимуму влияние других, более высоких уровней его организации. Иными словами, объектом анализа должна быть неупорядоченная поли- пептидная цепь без каких-либо поперечных ковалентных связей (например, дисульфидных мостиков) так, чтобы все ее звенья, все пептидные связи были в равной мере доступны действию как химических реагентов, так и ферментов. К сожалению, в полной мере исключить помехи со стороны свойственных белку нековалентных взаимодействий не удается, однако разработаны приемы, позволяющие приблизиться к этой цели.
6565Итак, белок должен быть прежде всего подвергнут глубокой денатурации и утратить четвертичную, третичную и по возможности вторичную структуру. Если в нем имеются дисульфидные связи, прибегают к их расщеплению, используя, как правило, восстановление большим избытком меркаптосоединения, например дитиоэритрита или меркаптоэтанола: .
65
65
3-56
-NH-CH-CO-Iсн2?HS-CH2-CH2-OH r'МеркаптоэтанолICH2I-NH-CH-CO--NH-CH-CO-Iсн2?HS-CH2-CH2-OH r'МеркаптоэтанолICH2I-NH-CH-CO--NH-CH-CD--ICH2ISHS-CH2-€H2~OH+ ISHS-€H2-CH2-0HICH2•I-NH-CH-OD--NH-CH-CD--ICH2ISHS-CH2-€H2~OH+ ISHS-€H2-CH2-0HICH2•I-NH-CH-OD-
-NH-CH-CO-
I
сн2
?HS-CH2-CH2-OH r
'Меркаптоэтанол
I
CH2
I
-NH-CH-CO-
-NH-CH-CO-
I
сн2
?HS-CH2-CH2-OH r
'Меркаптоэтанол
I
CH2
I
-NH-CH-CO-
-NH-CH-CD--
I
CH2
I
SHS-CH2-€H2~OH
+ I
SHS-€H2-CH2-0H
I
CH2•
I
-NH-CH-OD-
-NH-CH-CD--
I
CH2
I
SHS-CH2-€H2~OH
+ I
SHS-€H2-CH2-0H
I
CH2•
I
-NH-CH-OD-
Эта реакция, которую обычно проводят в условиях, обеспечивающих денатурацию белка (в 8 М растворе мочевины или в 6 М гидрохлориде гуанидина при pH 8—9), имеет своим результатом превращение остатка цистина в два остатка цистеина со свободными сульфгидрильными группами. Сохранять такое производное и тем более использовать его для последующих превращений нельзя, так как после удаления избытка восстановителя, что обычно достигается гель-фильтрацией смеси, вновь произойдет замыкание дисульфидных связей за счет окисления свободных SH-трупп кислородом воздуха. Во избежание этого сульфгидрильные группы блокируют, обрабатывая восстановленный и денатурированный белок избытков иодуксусной кислоты, которая переводит остатки цистеина в устойчивый З-карбоксилгетилг- цистеин:
SHS-CH2-C00H
II
СН2 + 1-СН2-С00Н -♦ сн2
I■ I
-NH—CH—СО—-NH-CH—СО-
S-Карбоксиметилцистеин
Такое превращение необратимо. Если желательна последующая регенерация остатков цистеина, прибегают к получению S-сульфопроизводных, обрабатывая белок сульфитом натрия в присутствии ионов меди. Получающийся при этом 8-сулъфоу,истеин при действии избытка меркаптосоединений количественно переходит в цистеин:
S”503HSH
Ц HS-CHg-CH2-OH f 1„2
-NH-CH-CO--NH-CH-C0-
S-Сульфоцистеин
Несмотря на совершенствование автоматических методов определения первичной структуры, даже в благоприятных случаях редко удается в одной цепи за один прием определить последовательность более чем 50 аминокислотных остатков. Этого достаточно для исследования небольших белков, в остальных же случаях необходимо прибегать к фрагментации полипептидной цепи несколькими методами, с тем чтобы получить систему перекрывающихся пептидов. Определение их строения и сопоставление полученных данных приводят к установлению последовательности аминокислот всей полипептидной цепи белка.
Известны ферментативные и химические методы специфического расщепления полипептидной цепи.
Ферментативные методы фрагментацииполипептидной цепи
При выборе протеолитических ферментов, подходящих для избирательного гидролиза белка, особенно важна их специфичность. Как правило, пользуются так называемой первичной специфичностью протеиназ, т.е. их способностью преимущественно атаковать пептидные связи, образованные тем или иным аминокислотным остатком. Аминокислотные остатки субстрата принято обозначать латинской буквой Р с индексами, соответствующими номеру остатка, считая от расщепляемой связи к аминному концу ("влево"). Остатки, расположенные в сторону карбоксильного конца ("вправо" от гидролизуемой связи) обозначают Р' с соответствующим индексом:
. ..Р.Р„РпР|СОNHР, Р,Pg...
Если использовать эти обозначения, то первичной специфичностью следует считать способность той или иной протеиназы избирательно расщеплять пептидные связи, образованные остатками Pj и Рр Все протеиназы, однако, имеют более или менее выраженную вторичную специфичность:. скорость расщепления ими пептидной связи зависит не только от строения той аминокислоты, которая прямо участвует в ее построении своей карбоксильной или аминной группой (т.е. остатка Pj и Г,), но и от соседних аминокислотных остатков Р2, Pg, Р2, Рд и т.д.
Обычно в образовании комплекса с ферментом участвует не менее 5—6 аминокислотных остатков (см. гл. 10).
Влияние вторичной специфичности уменьшают, проводя гидролиз достаточно долго, так, чтобы расщепились и те пептидные связи, которые находятся в невыгодном для данного фермента окружении. Специфичность протеиназ редко бывает совершенно строгой: наблюда-
.67
ется и расщепление не характерных для данного фермента связей, нарастающее со временем. Все это требует оптимизации условий ферментативного гидролиза полипептидных цепей.
В настоящее время для специфического гидролиза белков при определении первичной структуры наиболее часто применяют следующие протеиназы.
Трипсин. Это фермент поджелудочной железы животных, который принадлежит классу так называемый сериновых протеиназ и специфически гидролизует пептидные связи, образованные карбоксильными группами остатков аргинина или лизина (Pi = Arg, Lye). Боковые цепи этих аминокислот несут на определенном расстоянии от о-углеродного атома положительно заряженную катионную группу. Показано, что в зоне связывания субстрата последняя входит во впадину, где расположена отрицательно заряженная Д-карбоксильная группа одного из остатков аспарагиновой кислоты трипсина:
Карбоксил остатка аспарагиновой ГУанидогруппа боковой цепи кислоты в зоне связывания суб- аргинина в субстрате трипсина страта трипсина
Электростатическое взаимодействие между катионной и анионной группами играет определяющую роль в специфичности трипсина. Это подтверждается тем, что замена аспарагиновой кислоты в зоне связывания субстрата другим остатком приводит к утрате способности гидролизовать пептидные связи аргинина или лизина.
Блокирование е-аминогрупп лизина в атакуемом трипсином полипептиде, например ацилированием цитраконовым ангидридом (см. гл. 9), приводит к замене катионной аминогруппы на анионную (карбоксилатную), поэтому в соответствующем производном трипсин расщепляет только пептидные связи аргинина. Это позволяет получить более крупные фрагменты белка, которые после их выделения из гидролизата выдерживают в слабокислом растворе, что вызывает отщепление остатка цитраконовой кислоты и высвобождение е-аминогрупп лизина. Затем такие пептиды с регенерированными остатками лизина вновь расщепляют трипсином.
Аналогично можно регулировать доступность пептидных связей аргинина гидролизу трипсином. Для этого блокируют гуанидогруппу аргинина, обрабатывая белок в щелочной среде дикетоном, например диацетилом, закрепляя образующийся при этом диол образованием комплекса с борной кислотой (см. гл. 9).
68
При гидролизе белка трипсином обычно используют pH, близкий 8, температуру 37 ’С и весовое соотношение фермент — субстрат 1:100, регулируя полноту гидролиза временем реакции. Нередко при гидро-, лизе трипсином расщепляются отдельные пептидные связи, соответствующие специфичности родственного фермента — химотрипсина. Это может объясняться присутствием в препарате трипсина примеси химотрипсина или продуктов ограниченного гидролиза трипсина, однако и вполне чистый трипсин может сам по себе обнаруживать не характерную для него специфичность.
Химотрипсин. Сериновая протеиназа поджелудочной железы, структурно родственная (гомологичная) трипсину. Химотрипсин специфически гидролизует (оптимум pH вблизи 8) пептидные связи, образованные карбоксильными группами ароматических аминокислот — фенилаланина, тирозина, триптофана и нередко лейцина, сравнимого.с этими остатками по гидрофобности (Pi = Phe, Туг, Тгр, Leu).
Термолизин. Металлопротеиназа, секретируемая клетками термофильной бактерии Bacillus amyloliquefaciens. Этот фермент, имеющий ион цинка в активном центре, оптимально активен при pH 6—8 и избирательно гидролизует пептидные связи, образованные с участием аминогрупп гидрофобных аминокислот — лейцина, фенилаланина, тирозина, валина, изолейцина (Pi = Leu, Phe, Туг, Vai, Tie). Фермент может применяться даже при 60—80 °C.
Glu, Asp-специфичные протеиназы (эндопротеиназы Gin—С). Сериновые протеиназы Staphylococcus aureus, а также некоторых стрепто- мицетов и термоактиномицетов. Ферменты гидролизуют пептидные связи, образованные окарбоксильными группами остатков глутаминовой кислоты, значительно реже аспарагиновой кислоты (Pi = Glu, Asp). Имеют в зависимости от субстрата и состава буферного раствора два оптимума pH: при 4 и 8. Характерная для этих протеиназ и весьма строго выдерживаемая специфичность хорошо дополняет специфичность других протеолитических ферментов, поэтому они все шире применяются в анализе структуры..
Эндопротеинза Lys-C. Протеолитический фермент из Lysobacter enzymogenes, специфически гидролизующий пептидные связи, образованные карбоксильной группой лизина, но не аргинина (Pi = Lys).
Эндопротеиназа Arg-C. Протеиназа из подчелюстной железы мыши, избирательно расщепляющая пептидные связи, образованные с участием карбоксильной группы аргинина (Pi = Arg).
Можно предполагать, что будут найдены и войдут в практику фрагментации белков и другие протеолитические ферменты с четко определенной специфичностью.
Химические методы специфическогорасщепления пептидных связей
Из множества предлагавшихся в различное время методов избирательного химического расщепления пептидных связей наибольшее распространение в практике анализа первичной структуры получило расщепление бромцианом, проводимое обычно в муравьиной или трифторуксусной кислоте. Эта реакция ведет к расщеплению пептидных связей, образованных с участием карбоксильной группы остатков л<е- тионина. Бромциан реагирует с серой тиоэфирной группы метионина, образуя сульфониевую соль. В этом промежуточном продукте положительный заряд на атоме серы индуцирует возникновение частичного положительного заряда (5+) на соседнем 7-атоме углерода боковой цепи метионина. Возникший таким образом на 7-углероде электрофильный центр подвергается атаке кислородным атомом карбонильной группы, на котором постоянно существует частичный отрицательный заряд, усиливающийся во время реакции, что обусловлено поляризацией связи 0=0. .
В результате смещение электронной плотности в этой группе и во всей пептидной связи завершается образованием ковалентной связи между т^-углеродным атомом и атомом кислорода, двойная связь С=0 переходит в простую, а связь С~N пептидной группы, обычно частично двойная, становится полностью двойной с переносом положительного заряда на ее атом азота:
СН3
I
S
I
СН2Вг
I +1
СН2С^1
I
СН3I♦S—сз<I6* сн21 \сн2 о«-' I IКН—сн—c-tm-c„аСН3I♦S—сз<I6* сн21 \сн2 о«-' I IКН—сн—c-tm-c„аМетилроданидМетилроданидсн2 осн2 о"КН~СН~С0"КН-Со
СН3
I
♦S—сз<
I
6* сн2
1 \
сн2 о«-
' I I
КН—сн—c-tm-c„
а
СН3
I
♦S—сз<
I
6* сн2
1 \
сн2 о«-
' I I
КН—сн—c-tm-c„
а
Метилроданид
Метилроданид
сн2 о
сн2 о
-КН-СНC=NH—С„
Имидоэфир лактона гомосерина
Одновременный разрыв связи S—СН2 освобождает летучий метил- роданид. Получившееся в результате внутримолекулярной реакции производное ил^идоэфира лактона голюсерина легко гидролизуется с разрывом связи С-N, что и завершает специфическое расщепление пептидной связи остатка метионина. На С-конце вновь образовавшегося пептидного фрагмента оказывается остаток гомосерина или его лактон, легко превращающиеся друг в друга:
-NH-CH-NH-CHСН2СН2€=ЯН-Са€=ЯН-СаФрагменты полипептидной цепи:N-концевой С-концевой►4
-NH-CH
-NH-CH
СН2
СН2
€=ЯН-Са
€=ЯН-Са
сн2о
II
-NH-CHС=0 + НН8-СО~
C-Концевой остаток Остаток аминокис- лактона гомосерина лоты, следующей за метионином
ОНОН
ОН
ОН
. JC-Концевой остаток
СН2гомосерина
I
сн8
I
-NH—СЯ—СООН
Метод расщепления бромцианом достаточно избирателен, затруднения встречаются лишь в тех случаях, когда за остатком метионина следуют серин или треонин. Характерно, что к расщеплению пептидных связей бромцианом прибегают при "вырезании" из гибридных генно-инженерных конструкций - пептидов или небольших белков, встроенных в структуру белка-хозяина для лучшей экспрессии в бактериальных клетках.
Среди других методов химического расщепления пептидной связи следует упомянуть более или менее избирательное выщепление остатков аспарагиновой кислоты при кратком нагревании белка или пептида в слабокислом растворе. Видимо, внутримолекулярный катализ с участием ^-карбоксильной группы аспарагиновой кислоты, которая может быть сближена с обеими пептидными связями, образованными
этим остатком, ответствен за преимущественный гидролиз именно этих связей. В еще более мягких условиях при выдерживании в кислых растворах избирательно расщепляются пептидные связи Asp—Pro.
Описаны также методы специфического расщепления пептидных связей триптофана, цистеина и пролина, однако они нашли лишь весьма ограниченное применение.
Разделение пептидов, полученныхфрагментацией полипептидной цепи
Разделение смесей пептидов, получаемых в результате ферментативного или химического расщепления полипептидной цепи белка, составляет одну из наиболее сложных, не стандартных, стадий анализа первичной структуры. Традиционная схема разделения состояла из большого числа стадий и, следовательно, была сопряжена с очень большими потерями пептидов, причем ведущую роль играла ионообменная хроматография пептидов чаще всего на сульфополистироль- ных катионитах с элюцией в градиенте pH. Метод дополняли гельфильтрацией, хроматографией и электрофорезом на бумаге или тонкослойной хроматографией.
В последние годы доминирует фракционирование пептидов высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на сорбентах с "обращенной фазой". Последние представляют собой мелкие частицы кремнезема с большой поверхностью, к которой ковалентно присоединены углеводородные цепи различной длины. Разделение на таких сорбентах определяется гидрофобными взаимодействиями между этими цепями, содержащими 4, 8, иногда 18 углеродных атомов (С4, Са, Cia), и гидрофобными элементами в структуре пептидов. Определенную роль играют и ионообменные эффекты. Пептиды элюируют при высоких давлениях — порядка 100 атм, используя градиент концентрации органических растворителей е различной десорбирующей способностью (метанол, ацетонитрил, изопропанол, диоксан), к которым для регулирования pH прибавляют трифторуксусную кислоту или буферные смеси.
Хорошие результаты дает также ионообменная хроматография на мелкозернистых ионитах типа Моно-Q и Moho-S (см. гл. 3) с использованием давления порядка 20 атм. Эти методы, обладающие высокой разрешающей способностью, позволили резко сократить число стадий выделения индивидуальных пептидов, снизить их потери и перейти к анализу первичной структуры очень малых (порядка сотен наномоль) количеств белка.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ПЕПТИДОВ -
Определение С-концевых аминокислот
Определение С-концевых аминокислот и последовательностей пептидов разработано недостаточно. Единственным химическим методом идентификации С-концевых аминокислот, получившим распространение, является исчерпывающий гидразинолиз пептидных связей. При нагревании совершенно сухого препарата белка или пептида с безводным гидразином все пептидные связи расщепляются им с образованием соответствующих гидразидов аминокислот;
R1 КгКп-1 Rn
II II
-NH-CH-CO-NH-CH—СО—...—NH—CH—C0-NH—СН-СООН
+ nh2-nh2
RiR2Rn-iRn
IIII
nh2-ch-co-nh-nh2 nh2-ch-co-nh-nh2 nm2-ch-co-nh-nh2 nh2-ch-cooh
о-Гидразиды всех аминокислот пептидной цепи С-Концевая
аминокислота
Последние, будучи основаниями (кроме а-гидразидов дикарбоновых аминокислот), легко отделяются (например, ионообменной хроматографией в условиях обычного аминокислотного анализа) от единственной свободной аминокислоты, содержащейся в продуктах гидрази- нолиза, которая и является С-концевым остатком.
Ферментативный метод, позволяющий не только идентифицировать С-концевой остаток, но и определить С-концевую последовательность небольшой длины, основан на последовательном отщеплении аминокислот от карбоксильного конца пептида (или белка) при действии карбоксипептидаз.
Карбоксипептидаза А. Фермент поджелудочной железы животных, содержащий ион цинка в активном центре. Активен в слабощелочной или нейтральной среде. Являясь экзопептидазой, фермент отщепляет от карбоксильного конца полипептидной цепи нейтральные и особенно легко гидрофобные аминокислоты. Труднее отщепляются остатки дикарбоновых аминокислот, еще труднее глицин и остатки, за которыми следует пролин. Не отщепляются вовсе пролин и остатки аргинина
и лизина.
' Карбоксипептидаза В. Также содержится в поджелудочной железе и гомологична карбоксипептидазе А, от которой отличается главным образом специфичностью, отщепляя С-концевые остатки аргинина и лизина.
Карбоксипеитидаза Y (от англ, yeasts — дрожжи). Содержится в клетках дрожжей. Имеет остаток серина в активном центре и обладает весьма широкой специфичностью, отщепляя почти любые аминокислотные остатки (в том числе и остатки пролина) от карбоксильного конца полипептидной цепи. Аналогичные ферменты выделены из грибов и растений.
При действии карбоксипептидаз на пептидный или белковый субстрат после отщепления С-концевого остатка хотя бы от части молекул открывается возможность высвобождения из цепи следующего остатка, затем третьего с С-конца и т.д. Ввиду этого для определения С-конце- вой последовательности необходимо количественно определить накопление аминокислот в зависимости от времени реакции. Анализ данных дополнительно осложняется весьма значительными различиями в скорости отщепления аминокислот, отражающими специфичность фермента. Так, гидрофобные аминокислоты настолько легко отщепляются карбоксипептидазой А, что их количество нередко оказывается почти таким же, как и содержание ранее отщепившихся гидрофильных остатков, пептидные связи которых гидролизуются гораздо медленнее. Скорость гидролиза зависит и от природы аминокислот, предшествующих отщепляемому остатку Р^ остатков — Pi, Р2 и т.д.
Таким образом, метод обычно дает возможность определить чередование лишь немногих, обычно 2—5, аминокислотных остатков на карбоксильном участке пептида.
Определение N-концевых аминокислот и последовательностей
Методы анализа пептидов с аминного конца разработаны значительно лучше, чем с карбоксильного, и являются основными при определении первичной структуры белков. -
Идентификация N-концевой аминокислоты важна как одно из доказательств индивидуальности пептида или белка. Классическим является применение для этой цели реакции динитрофенилирования. Ди- нитрофторбензол реагирует с о-аминогруппой белка или пептида с образованием окрашенного в желтый цвет (Атах w 350т360 нм, молярная экстинкция около 15 000) 2,4-динитрофенил (Впр)-производного (см. гл. 1). Одновременно в реакцию вступают и е-амицогруппы остат- 74
ков лизина, и гидроксильные группы тирозина. Затем динитрофенил- производное гидролизуют 5,7 М НС1 при 105° С, причем расщепляются все пептидные связи, но сохраняются Dnp-аминокислоты (кроме производных глицина и пролина). Их выделяют из гидролизата и идентифицируют.•
Метод почти полностью вытеснен так называемым дансильным методом. В этом случае в качестве реагента на аминогруппу используют 5-диметиламинонафталин-1-сульфохлорид ^дансилхлорид^ (см. гл. 1). Кислотный гидролиз полученного дансилпептида дает дансил- производное N-концевой аминокислоты, которое идентифицируют двумерной хроматографией на полиамидных пленках. Анализ облегчается интенсивной флуоресценцией дансил-производных в ультрафиолетовом свете, что обеспечивает высокую чувствительность метода, позволяющего работать с количествами пептида порядка нескольких наномоль.
Наиболее продуктивно определение N-концевой последовательности в пептидах и белках фенилтиогидантоиновым методом ступенчатого отщепления аминокислотных остатков, предложенным П:Эдманом. Метод основан на следующей цепи реакций.
Обрабатывая пептид в щелочной среде фенилизотио^ианатом, его превращают в фепмлтиокарбамил-производное*.
R1В-2Rn
III
СбН5-№=С=8 + nh2-ch-co-nh-ch-co-...-nh-ch-cooh —►
Фенилизо-'.
тиоцианат
Ri R2Rn
—► C6H5-NH-C-NH-CH-C0-NH-CH-C0...-NH-CH-<00H 5ЕзС00Н^
Фенилтиокарбамилпептид
.Смысл этой операции состоит во введении нуклеофильного атома серы в положение, благоприятствующее реакции с углеродом карбонильной группы N-концевого остатка, которая происходит на следующей стадии при обработке фенилтиокарбамил-производного трифторуксусной кислотой:
Ri
+ /NH CHR2Rn
^^U CeH5-NH=C^ |||
•^s—C-NH-CH-CO-...-M-CH-COOH
OHПромежуточный продукт
Ri.
|R2Rn
—* СбН5-МН-С^ I + nh2-ch-co~...~nh~ch-cooh
^8-0=0
Фенилтиазолинон Пептид, укороченный на один
аминокислотный остаток
Ri
I
-NH-CH
| Фенилтиогидантоин
-NH-C=O
Результатом этой - атаки является образование гипотетического промежуточного продукта, в котором атом углерода карбонила N-koh- цевого остатка приобрел тетраэдрическую конфигурацию. Далее происходит разрыв связи С—N в этом соединении, причем образуются циклический фенилтиазолинон (производное аминоконцевого остатка) и пептид, укороченный на одну аминокислоту.
Фенилтиазолиноны недостаточно устойчивы, поэтому их подвергают, предварительно отделив от остаточного пептида, более жесткой кислотной обработке при нагревании и переводят в стабильные фенилтиогидантоины. Последние идентифицируют тонкослойной хроматографией на полиамидных пленках, газожидкостной или высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Образовавшийся после отщепления N-концевого остатка остаточный пептид вновь обрабатывают фенилизотиоцианатом и подвергают далее такому же циклу превращений, отщепляя на этом Шаге вторую аминокислоту, считая с аминного конца. Повторение циклов приводит к ступенчатому отщеплению последующих аминокислотных остатков.
76
Используется также вариант метода Эдмана, при котором идентифицируют не фенилтиогидантоин или другое производное аминокислоты, отщепленной в данном цикле, а следующий за ней остаток, прибегая для этого к определению N-концевой аминокислоты в небольшой доле (аликвоте) остаточного пептида методом дансилирования. Остальную, главную, часть остаточного пептида вводят в новый цикл деградации по Эдману, затем вновь определяют N-концевую аминокислоту в остаточном пептиде, укороченном уже на два остатка, и т.д. Такой способ позволяет обычно определить последовательность 10—15 аминокислот.
Гораздо большие возможности открыла автоматизация' метода Эдмана: разработаны специальные приборы — автоматические секвенаторы белков и пептидов, основанные на его использовании. В одном из видов секвенатора пленку белка или пептида наносят на внутреннюю стенку быстро вращающегося стеклянного стаканчика, который затем используется как реактор. В него последовательно вводят фенилизотиоцианат, гептафтормасляную кислоту (высококипящий аналог трифторуксусной кислоты) и проводят циклизацию. Затем внутрь стаканчика подают ток 1-хлорбутана, который, распределяясь под действием центробежной силы по его внутренней стенке, экстрагирует отщепившийся фенилтиазолинон. Экстракт отводят из стаканчика и в отдельной операции превращают фенилтиазолин в фенилтиогидантоин. Укороченный белок или пептид остается в виде пленки на стенке стаканчика и далее подвергается следующему циклу отщепления по Эдману и т.д.
Все операции, включая подачу реагентов и промывание осадка белка или пептида, программированы. Прибор позволяет за сутки проделать 1.5 циклов отщепления. Выход. фенилтиазолинона на цикле обычно близок к 95—99%, что позволяет определить за один опыт последовательность в 20—50, а иногда и больше аминокислотных остатков, используя весьма малые, порядка сотен наномоль, количества белка или пептида.
Метод ограничивают побочные реакции, например образование пироглутаминовой кислоты из N-концевого глутамина, о*—Перегруппировка остатков аспарагиновой кислоты и в особенности неспецифическое расщепление пептидных связей при кислотной обработке. Неполное протекание реакции с фенилизотиоцианатом или циклизации влечет за собой постепенное "отставание'1 части пептидных цепей от общего хода отщепления аминокислот, вследствие чего на каждом шаге в анализируемой смеси появляются наряду с фенилтиогидантоином соответствующей аминокислоты более или менее значительные примеси фенилтиогидантоинов от предыдущих Циклов отщепления.
Ввиду этого при анализе протяженных последовательностей чрезвычайно важно, чтобы каждый цикл протекал с выходом, близким количественному. Существенным ограничением являются потери остаточного белка или пептида, в особенности короткого за счет его растворения в используемых реагентах. Радикальный способ борьбы с такими потерями состоит в ковалентном присоединении к инертной матрице, например к макропористому стеклу, содержащему аминные группы. К такому носителю удается присоединить пептиды, полученные при расщеплении бромцианом за счет реакции лактона гомосерина с аминогруппами: 1
Rn-iСН2ОIII-NH-CH-OHiR-C ИС=0C-Концевой лактон гомосеринаRn-iСН2ОIII-NH-CH-OHiR-C ИС=0C-Концевой лактон гомосерина+ NH2-~СН2-СН2—... стекло —►Аминогруппы, ковалентноприсоединенные к стеклу'+ NH2-~СН2-СН2—... стекло —►Аминогруппы, ковалентноприсоединенные к стеклу'
Rn-iСН2О
III
-NH-CH-OHiR-C ИС=0
C-Концевой лактон гомосерина
Rn-iСН2О
III
-NH-CH-OHiR-C ИС=0
C-Концевой лактон гомосерина
+ NH2-~СН2-СН2—... стекло —►
Аминогруппы, ковалентноприсоединенные к стеклу'
+ NH2-~СН2-СН2—... стекло —►
Аминогруппы, ковалентноприсоединенные к стеклу'
сн2-он
| Остаток гомосерина
Rn-i СН2
—► -NH—CH—СО-NH~СН-СО—NH-СН2СН2—... стекло
Пептид, ковалентно присоединенный к макропористому стеклу
Пептиды, содержащие остатки лизина, присоединяют к аминогруппам на поверхности стекла при помощи реакции с бифункциональным сшивающим реагентом, например р-фенилёндиизоцианатом:
+ S=C=N-C6H5-N=C=S + NH2CH2CH2-... стекло
nh2
Ri(СН2)4 Rn
I I I
NH2-CH-CO- ...-NH-CH-CO-..-NH-CH-C00H —*
N-Концевой остатокN-Концевой остаток1111(CH2)4(CH2)4RnRn
N-Концевой остаток
N-Концевой остаток
11
11
(CH2)4
(CH2)4
Rn
Rn
sss
s
s
NH—C—NH—C eHs—№—C~NH”€H2-€H2"*... стекло
-* NH—СН—СО—...—NH—CH—€0.: .~NH—CH—СООН
|Пептид, кова
; £—g.лентно присо-
I
.единенный к стеклу "
NH—С6Н4—KH-CS-NH—СН2СН2—.. стекло
Этот реагент образует мостики между носителем и остатками лизина в пептиде, но одновременно блокирует и о-аминогруппу первого аминокислотного остатка. Однако после кислотной обработки N-концевой остаток отщепляется от пептида, хотя и остается связанным со стеклом. При этом открывается аминогруппа второго аминокислотного остатка и становится возможным ступенчатое отщепление последующих аминокислот, хотя остатки лизина, прочно связанные с носителем, ускользают от анализа и ’'пропускаются”. Идентификацию первого аминокислотного остатка проводят в' отдельном опыте дансильным методом. Такие "твердофазные" секвенаторы применяют при анализе пептидов и небольших белков.
В еще одном типе секвенаторов — газофазном — принципиально те же реакции проводят с белком, сорбированным на пористой подложке, обрабатывая его парами реагентов и прибегая к жидкостной экстракции лишь для отделения фенилтиазолинонов. Это еще более снижает потери образца и дает возможность определять весьма протяженные последовательности, используя сотни пикомоль белков и крупных пептидов. Удается даже определять N-концевые последовательности в тех небольших количествах белков, которые содержатся в зонах, вырезанных из геля после электрофоретического разделения.
Методом Эдмана установлено подавляющее большинство последовательностей аминокислот при анализе первичной структуры белков.
ГЛАВА 5ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА
Вторичной структурой называют пространственное расположение атомов главной цепи молекулы белка на отдельных ее участках.
В соответствии с этим определением любой участок белка имеет вторичную структуру. Иногда рассматривают как вторичную структу- .79
ру только те ее элементы, которые являются периодическилиг. а-спи- ралъ и ^-структуру. Однако в белках нередко встречаются такие участки пептидной цепи, которые уложены вполне определенным способом, хотя их пространственная структура не содержит какого- либо периодически повторяющегося, регулярного мотива. Тем не менее к ним вполне приложимо понятие вторичной структуры. Следует различать два вида вторичных структур: регулярные и нерегулярные.
Понятие вторичной структуры, как подчеркивается в его определении, относится не ко всей белковой молекуле в целом, а к отделънылц более или менее протяженным участкалг ее полипептидной цепи. Обсуждая вторичную структуру, мы, по крайней мере на первых порах, абстрагируемся от дальних взаимодействий в молекуле белка, а также от вклада боковых групп аминокислотных остатков, концентрируясь на главной цепи белка. Ближние взаимодействия, которым принадлежит важнейшая роль в формировании вторичной структуры, определяются прежде всего особенностями пептидной связи.
СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПЕПТИДНОЙ СВЯЗИ
Пептидной называют связь, образованную о-аминной и о-карбок- сильной группами аминокислот. Традиционное изображение пептидной связи
не вполне правильно передает ее электронную структуру. Двойная связь С=4) карбонильной группы поляризована и в определенном смысле может быть представлена как одинарная связь с разделением зарядов:
С=0«—► с—о
причем отрицательный заряд локализуется на атоме кислорода.
Изучение кристаллических структур соединений, содержащих амидную связь, показало, что расстояние С-0 в них примерно на 10% больше свойственного карбонильной группе в альдегидах и кетонах. Напротив, связь С-N за счет смещения свободной электронной пары азота к углероду приобретает в определенной мере характер двойной и укорочена опять-таки примерно на 10%. По Л .Полингу, электронная структура пептидной связи передается двумя резонансными структурами: 80
п зичем на долю структуры II с двойной связью углерод—азот в гиб- р 1де приходится около 40%. В результате азот пептидной связи практически полностью утрачивает основность. То обстоятельство, что связь С-N в пептидной группировке имеет характер частично двойной, приводит к важным стереохимическим последствиям: вращение вокруг нее сильно ограничено, она задает плоскость, в которой располагаются шесть атомов: 0 и С карбонильной группы, атомы азота и водорода группы NH и Са-атомы обоих аминокислотных остатков.
Плоскостная геометрия пептидной группировки и затрудненность поворота вокруг С~N-связи делают возможным существование достаточно устойчивых гуис- и транс-изомеров, разделенных значительным энергетическим барьером (около 20 ккаль/моль), что делает превращение одного изомера в другой редким событием. Они отличаются тем, что Са-атомы главной цепи размещаются по одну (t#uc) или по разные (транс) стороны пептидной связи C""*N (рис. 5.1):
Рис. 5.1. Структура пептидной связи. А - транс — типичная, Б - ^нередко встречающаяся конфигурация пептидной связиРис. 5.1. Структура пептидной связи. А - транс — типичная, Б - ^нередко встречающаяся конфигурация пептидной связи
Рис. 5.1. Структура пептидной связи. А - транс — типичная, Б - ^нередко встречающаяся конфигурация пептидной связи
Рис. 5.1. Структура пептидной связи. А - транс — типичная, Б - ^нередко встречающаяся конфигурация пептидной связи
Атомы С^, С?+1, С и О карбонильной группы, N и связанный с ним Н лежат
в одной плоскости. Указаны межатомные расстояния в ангстремах и валентные углы. О конфигурации судят по ходу главной цепи
Цис 'Транс
Транс-изомер пептидной связи энергетически выгоднее дос-изомера примерно на 2,6 ккал/моль, так как сближение С^-атомов в последнем вызывает пространственные затруднения. Эта разница между изомерами в значительной мере снимается, составляя 0,5 ккал/мрль, если азот пептидной связи принадлежит пролину, поскольку в таком случае в обоих изомерах в доо-положении к Са-атому ацилирующего аминокислотного остатка оказываются CQ- или Статомы пролина. Рентгеноструктурный анализ аодтвердил, что пептидные связи в белках явля ются плоскими и представлены почти исключительно транс-изомерами. Цис-пептидные связи редки: их встречается, как правило, не более одной-двух на белок среднего размера, причем преобладают связи, образованные остатками пролина. Среди 32,5 тыс. пептидных связей в большой выборке изученных пространственных структур только 116 (0,36%) имели дос-конфигурацию, однако среди 1,5 тыс. связей Хаа—Pro1 цис-изомеров оказалось 6,5%. В качестве примера укажем дос-пептидные связи, образованные остатками Рго-93 и Рто-114 в панкреатической рибонуклеазе, Рто-168 в субтилизине и связь Ser-197 — Тут-198 в карбоксипептидазе А. .
Таким образом, пространственное строение полипептидной цепи может быть представлено как последовательность плоских элементов — пептидных группировок, соединяющихся между собой через Са-атомы, которые служат своего рода шарнирами. Вращение плоских пептидных группировок может происходить вокруг двух простых связей, которые соединяют атом азота с Са-атомом (N — Со) и Са-атом с углеродом карбонильной группы (CQ — С(0)). Жестких запретов для вращения вокруг этих связей нет, однако есть некоторые предпочтительные конформации.
СТЕРИЧЕСКИЕ ОГРАНИЧЕНИЯ И ВТОРИЧНАЯСТРУКТУРА ПЕПТИДНОЙ ЦЕПИ
Углы вращения вокруг связей N-Са и Са~С(0) называют соответст- фнно углами у и ^ (рис. 5.2). Для отсчета этих двугранных, углов тюибегают к следующему приему. Если представить, что наблюдатель смотрит вдоль связи N~€q, то ’’следующая” связь CQ~€(0) может оказаться заслоненной "предшествующей” связью С(0)~N. Такой конформации (заслоненной или цисоидной, очевидно, невыгодной стерически) соответствует угол у? = 0°. Если связь CQ—С(0) не заслонена и для
достижения заслоненной конфигурации связь C(O)~N нужно вращать по часовой стрелке, угол у? считается положительным и возрастает до 180°. В последнем случае достигается трансоидная конфигурация. В противоположном направлении отсчитываются отрицательные значения угла у? от 0° до —180°. Аналогично, для определения угла ф смотрят вдоль связи Сд-С(0), при этом заслоненной конформации (когда связь N-Са закрывает связь С(0)—N) приписывается угол ф = = 0°, а трансоидной — угол + или - 180°.
Угол ф определяется поворотом связи Nf-C^ вокруг связи С^ - С,', если смотреть по ходу пептидной цепи, т.е. от С^ к углероду карбонильной группы С j, как показано стрелкой.' Принято считать, что если первая связь закрывает связь Ct- - Nl+1 (цисоидная конфигурация), то угол ф равен 0°, если ясе эти связи находятся в наиболее удаленных положениях (трансоидная конфигурация), то угол ф равен + или -180°. Положительным считается вращение по часовой стрелке. Угол у? определяется поворотом связи Qt-i вокруг связи Nj - С^. Цисоидной конфигураций, при которой связи, примыкающие к Nj - С?, закрывают одна другую, соответствует у? = 0°, трансоидной - у? = = ± 180°. На рисунке изображена так называемая вытянутая конформация пептида, при которой углы у? и ф равны +180°.Угол ф определяется поворотом связи Nf-C^ вокруг связи С^ - С,', если смотреть по ходу пептидной цепи, т.е. от С^ к углероду карбонильной группы С j, как показано стрелкой.' Принято считать, что если первая связь закрывает связь Ct- - Nl+1 (цисоидная конфигурация), то угол ф равен 0°, если ясе эти связи находятся в наиболее удаленных положениях (трансоидная конфигурация), то угол ф равен + или -180°. Положительным считается вращение по часовой стрелке. Угол у? определяется поворотом связи Qt-i вокруг связи Nj - С^. Цисоидной конфигураций, при которой связи, примыкающие к Nj - С?, закрывают одна другую, соответствует у? = 0°, трансоидной - у? = = ± 180°. На рисунке изображена так называемая вытянутая конформация пептида, при которой углы у? и ф равны +180°.Значения углов у? и ф для какого-либо аминокислотного остатка характеризуют его положение во вторичной структуре. Если указать эти значения для всей последовательности аминокислот, то ими определится свертывание данного полипептида в пространстве. Как отмечалось, принципиально возможны любые наборы значений двугранных углов <р и ф, однако многие из них сопряжены со зна-
Угол ф определяется поворотом связи Nf-C^ вокруг связи С^ - С,', если смотреть по ходу пептидной цепи, т.е. от С^ к углероду карбонильной группы С j, как показано стрелкой.' Принято считать, что если первая связь закрывает связь Ct- - Nl+1 (цисоидная конфигурация), то угол ф равен 0°, если ясе эти связи находятся в наиболее удаленных положениях (трансоидная конфигурация), то угол ф равен + или -180°. Положительным считается вращение по часовой стрелке. Угол у? определяется поворотом связи Qt-i вокруг связи Nj - С^. Цисоидной конфигураций, при которой связи, примыкающие к Nj - С?, закрывают одна другую, соответствует у? = 0°, трансоидной - у? = = ± 180°. На рисунке изображена так называемая вытянутая конформация пептида, при которой углы у? и ф равны +180°.
Угол ф определяется поворотом связи Nf-C^ вокруг связи С^ - С,', если смотреть по ходу пептидной цепи, т.е. от С^ к углероду карбонильной группы С j, как показано стрелкой.' Принято считать, что если первая связь закрывает связь Ct- - Nl+1 (цисоидная конфигурация), то угол ф равен 0°, если ясе эти связи находятся в наиболее удаленных положениях (трансоидная конфигурация), то угол ф равен + или -180°. Положительным считается вращение по часовой стрелке. Угол у? определяется поворотом связи Qt-i вокруг связи Nj - С^. Цисоидной конфигураций, при которой связи, примыкающие к Nj - С?, закрывают одна другую, соответствует у? = 0°, трансоидной - у? = = ± 180°. На рисунке изображена так называемая вытянутая конформация пептида, при которой углы у? и ф равны +180°.
чительными стерическими помехами и отвечают весьма невыгодным энергетическим конформациям.j
Для описания стереохимии аминокислотных остатков в белкам удобна карта Рамачандрана, представляющая собой квадрат, по одной стороне которого отложены значения угла <р от —180° до +180°, а пО другой — значения угла ф (рис. 5.3, 5.4). Если бы не накладывалось никаких ограничений на стереохимию полипептидной цепи, то углы у и ф могли бы принимать любые значения и точка, характеризующая их набор, а значит, и конформацию того или ийого аминокислотного . остатка, могла бы оказаться в любом месте карты.
В действительности допустимы вовсе не любые комбинации углов р и ф. Это связано тем, что при изменении обоих углов изменяется и положение атомов в соседних аминокислотных остатках друг относительно друга. Сближение в пространстве атомов, особенно объемистых (кислорода, углерода, азота) приводит к их взаимному отталкиванию. Преодоление этого отталкивания требует значительных энергетических затрат, что. делает такую конфигурацию полипептидной цепи неустойчивой. Карты Рамачандрана подобны географическим, на них нанесены горизонтали, соответствующие тому или иному энергетическому уровню. Более выгодной конформации соответствует меньший энергетический уровень, который на карте Рамачандрана выглядит как долина, впадина; наименее выгодной отвечает гребень, хребет.
' Рассмотрим карту Рамачандрана для остатков глицина, не имеющих боковой группы (см. рис. 5.3). В этом случае разрешена довольно большая часть карты, возможен широкий набор углов р и ф. Однако случаи, когда эти углы близки к нулю, невыгодны: это отвечает заслоненной конфигурации, при' которой особенно сказывается перекрывание атомов кислорода карбонильных групп. Конформационная карта Рамачандрана для глицина проста — она показывает крестообразную "запрещенную11 возвышенность вдоль осей с р = 0°, ф = 0° и довольно обширные понижения, охватывающие не менее половины общей поверхности.
Эта особенность глицина как остатка с наименьшими конформационными ограничениями играет специфическую роль в формировании пространственной структуры белка. Характерно, что на картах Рамачандрана для реальных белков точки, соответствующие остаткам глицина, не сгущаются в двух главных долинах, как это свойственно для других аминокислот, а распределяются почти по всему полю. Очевидно, что остатки глицина используются в тех точках пространственной структуры белка, где необходима нестандартная конформация, в частности при резких поворотах пептидной цепи. Не случайно, что остатки глицина, казалось бы, не способные из-за отсутствия боковой 84
Рис. 5.3. Карта Рамачандрана для глицинаРис. 5.3. Карта Рамачандрана для глицинаРис. 5.4. Карта Рамачандрана для L-ал анинаРис. 5.4. Карта Рамачандрана для L-ал анинаОтложена потенциальная энергия для пары пептидных звеньев с остатком глицина между ними (изоэнергетические линии). Для глицина неблагоприятны кон- форшции, занимающие на этой карте крестообразную возвышенность вдоль значений <р и у, близких к 0е, что соответствует заслоненной конфигурации; обширные понижения (затемнены) отвечают разрешенным областям. Ср. рис. 5.13, на котором показано, что остатки глицина в реальных белках позволяют прилегающим пептидным связям занимать друг относительно друга весьма различные конформацииОтложена потенциальная энергия для пары пептидных звеньев с остатком глицина между ними (изоэнергетические линии). Для глицина неблагоприятны кон- форшции, занимающие на этой карте крестообразную возвышенность вдоль значений <р и у, близких к 0е, что соответствует заслоненной конфигурации; обширные понижения (затемнены) отвечают разрешенным областям. Ср. рис. 5.13, на котором показано, что остатки глицина в реальных белках позволяют прилегающим пептидным связям занимать друг относительно друга весьма различные конформациицепи непосредственно участвовать вцепи непосредственно участвовать вПоказано распределение потенциальной энергии для остатка аланина, окруженного двумя пептидными звеньями в координатах у и ^ (см. подпись к рис. 5.3). Глубокая долина в верхнем левом квадранте соответствует конформации, характерной для Д- структуры; соединенная с ней перевалом долина в левом нижнем квадранте - правой о-спирали (ад), обычно встречающейся в' белках. Небольшое понижение в правом верхнем квадранте соответствует крайне редкой левой о*-спирали (а^)- Следует обратить внимание, что карту можно свертывать относительно осей у, ^ = 0е, поэтому, например, долина, соответствующая /^структуре, продолжается у нижнего обреза карты слевафункционировании белка, чащеПоказано распределение потенциальной энергии для остатка аланина, окруженного двумя пептидными звеньями в координатах у и ^ (см. подпись к рис. 5.3). Глубокая долина в верхнем левом квадранте соответствует конформации, характерной для Д- структуры; соединенная с ней перевалом долина в левом нижнем квадранте - правой о-спирали (ад), обычно встречающейся в' белках. Небольшое понижение в правом верхнем квадранте соответствует крайне редкой левой о*-спирали (а^)- Следует обратить внимание, что карту можно свертывать относительно осей у, ^ = 0е, поэтому, например, долина, соответствующая /^структуре, продолжается у нижнего обреза карты слевафункционировании белка, чаще
Рис. 5.3. Карта Рамачандрана для глицина
Рис. 5.3. Карта Рамачандрана для глицина
Рис. 5.4. Карта Рамачандрана для L-ал анина
Рис. 5.4. Карта Рамачандрана для L-ал анина
Отложена потенциальная энергия для пары пептидных звеньев с остатком глицина между ними (изоэнергетические линии). Для глицина неблагоприятны кон- форшции, занимающие на этой карте крестообразную возвышенность вдоль значений <р и у, близких к 0е, что соответствует заслоненной конфигурации; обширные понижения (затемнены) отвечают разрешенным областям. Ср. рис. 5.13, на котором показано, что остатки глицина в реальных белках позволяют прилегающим пептидным связям занимать друг относительно друга весьма различные конформации
Отложена потенциальная энергия для пары пептидных звеньев с остатком глицина между ними (изоэнергетические линии). Для глицина неблагоприятны кон- форшции, занимающие на этой карте крестообразную возвышенность вдоль значений <р и у, близких к 0е, что соответствует заслоненной конфигурации; обширные понижения (затемнены) отвечают разрешенным областям. Ср. рис. 5.13, на котором показано, что остатки глицина в реальных белках позволяют прилегающим пептидным связям занимать друг относительно друга весьма различные конформации
цепи непосредственно участвовать в
цепи непосредственно участвовать в
Показано распределение потенциальной энергии для остатка аланина, окруженного двумя пептидными звеньями в координатах у и ^ (см. подпись к рис. 5.3). Глубокая долина в верхнем левом квадранте соответствует конформации, характерной для Д- структуры; соединенная с ней перевалом долина в левом нижнем квадранте - правой о-спирали (ад), обычно встречающейся в' белках. Небольшое понижение в правом верхнем квадранте соответствует крайне редкой левой о*-спирали (а^)- Следует обратить внимание, что карту можно свертывать относительно осей у, ^ = 0е, поэтому, например, долина, соответствующая /^структуре, продолжается у нижнего обреза карты слева
функционировании белка, чаще
Показано распределение потенциальной энергии для остатка аланина, окруженного двумя пептидными звеньями в координатах у и ^ (см. подпись к рис. 5.3). Глубокая долина в верхнем левом квадранте соответствует конформации, характерной для Д- структуры; соединенная с ней перевалом долина в левом нижнем квадранте - правой о-спирали (ад), обычно встречающейся в' белках. Небольшое понижение в правом верхнем квадранте соответствует крайне редкой левой о*-спирали (а^)- Следует обратить внимание, что карту можно свертывать относительно осей у, ^ = 0е, поэтому, например, долина, соответствующая /^структуре, продолжается у нижнего обреза карты слева
функционировании белка, чаще
других оказываются инвариантними в семействах эволюционно родственных белков, что указывает на их незаменимость в структурообразован ии. ,
Очевидно, что набор разрешенных конформаций существенно уменьшится, если отойти от рассматривавшейся до сих пор упрощенной схемы и учесть стерическое влияние боковых цепей аминокислот. Было бы нелегко проанализировать вклад всех 19 боковых цепей, однако в этом нет необходимости. Наиболее значительные ограничения на конформационную свободу аминокислотных остатков накладывает появление простейшего заместителя у Са-атома — метильной груп-
пы в остатке аланина. Дальнейшие усложнения боковой цепи происхо-j дят сравнительно далеко от главной цепи и мало влияют на выбор е оптимальной конформации. Карта Рамачандрана для аланина в доста* точном приближении верна и для других аминокислот.
На этой карте (рис. 5.4) выявляются две долины, отвечающие стабильным конформациям, т.е. оптимальным сочетаниям углов <р и ф, и неглубокая впадина. Одна из долин соответствует правой ос-спирали, характерной для белков (у? = —57°, ф = —47°), другая — параллельной (5-структуре {ср = —119°, ф = +113°) и антипараллельной ^-структуре (р = -139°, ф = 4-135°).
То, что для обычных аминокислот разрешены лишь две области, две долины на конформационной карте, а значит, и два набора (с известными допусками) углов <р и ф, в какой-то мере предопределяет и ограниченность набора периодических вторичных структур. Так, присоединяя к аминокислотному остатку с набором у? = —57°, ф '= —47° другой остаток с примерно такими же двугранными углами, затем третий и т.д., получим периодическую вторичную структуру — «-спираль. Точно так же, соединяя в цепь остатки с двумя другими разрешенными наборами углов, придем к двум известным типам Д-струк- туры.
■5.3. РОЛЬ ВОДОРОДНЫХ СВЯЗЕЙ В ФОРМИРОВАНИИ
ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
До сих пор, обсуждая вторичную структуру, мы рассматривали упрощенную модель поведения аминокислотного остатка в пептидной цепи, концентрируя внимание на стерических ограничениях, которые могут быть вызваны его ближайшими соседями. Следующий шаг, усложняющий картину и вместе с тем приближающий ее к реальности, — учет нековалентных взаимодействий между ближними остатками в периодической вторичной структуре. При этом мы по-прежпему абстрагируемся от вклада боковых групп и пренебрегаем дальними взаимодействиями с другими частями молекулы.
Главная цепь полипептида содержит только один периодически повторяющийся элемент, способный устанавливать водородные связи, — пептидную группировку, которая при этом может выступать и как донор, и как акцептор.
Насколько существенной может быть стабилизация вторичной структуры за счет водородной связи? Для ответа на этот вопрос следует учесть фактор,, который до сих пор не рассматривался, — влияние окружающей белок воды. Вода способна эффективно конкурировать за
образование водородных связей, имея возможность быть и донором и акцептором:
Вода — донор водородной связи
О Вода — акцептор водородной связи Н^ ^
Можно предвидеть, что влияние воды будет снижаться при формировании компактной пространственной структуры белка, росте содержания пептидных связей, повышении вероятности их взаимодействия друг с другом. Действительно, изучение простейшей модельной системы N-метилацетамида (СНз—CQ-NH-CHs) показало, что при малых его концентрациях образование димеров, например
СН3СN—СН3
О Н
Н 6 I II
СН3—N—С—ОН»
за счет возникновения межмолекулярных водородных связей практически не наблюдается. Лишь при очень высокой концентраций N-метилацетамида .(до 10 М) он практически полностью димеризуется. В отсутствие же воды, например в тетрахлориде углерода, полная димеризация достигается уже при 0,2 М концентрации амида.
В белке реализуются оба эти эффекта — пептидные связи сближены, находясь в свернутой цепи, вероятность их встречи примерно такая же, как в 9М растворе N-метилацетамида. Разумеется, очень существенно и то, что сближение пептидных связей в белке происходит не случайным образом, как в концентрированном растворе амида, а в кооперативной системе. В то же время в компактной белковой* глобуле полярность окружения пептидной связи значительно меньше, 87
чем в воде. Сложение этих двух факторов и делает водородную связь между пептидными группировками весьма важным структурообразующим фактором.
Таким образом, стабильность вторичной структуры существенным образом зависит от ее включения в компактную третичную структуру белка. Напротив, в пептидах из-за меньшего их размера вторичная структура не обеспечивает необходимой стабильности. Так, даже довольно длинный природный пептид — глюкагон, содержащий 29 аминокислотных остатков, — существует в растворе как равновесная смесь конформеров, и только при образовании комплекса с белком-рецептором, т.е. при включении в компактную структуру за счет нековалентных взаимодействий, он образует а-спираль.
- 5.4. а-СПИРАЛЬ
В 50-х годах Л.Полинг и Р.Кори, основываясь на данных о структуре кристаллов аминокислот и простых пептидов, рассмотрели возможные периодические конформации полипептидной цепи и пришли к выводу, что наиболее вероятна структура, названная ими а-спиралгю. При этом в основу выбора именно этой вторичной структуры были положены следующие критерии:
Образование плотноупакованной компактной структуры без пустот и перекрывания атомов.
Максимальная насыщенность структуры водородными связями с тем условием, чтобы геометрия водородной связи Oee*H***N была близка к линейной.
Соблюдение межатомных расстояний и углов, свойственных аминокислотам и простым пептидам.
С соблюдением этих условий можно построить как правую, так и левую а?-спирали, однако правая Of-спираль оказывается энергетически несколько выгоднее левой, если пептидная цепь образована L-аминокислотами. Левой of-спирали отвечает на карте Рамачандрана небольшая впадина с углами <р = 4-57° и ^ = 4-47°. Теоретические выводы Полинга и Кори в дальнейшем полностью оправдались. Of-Спираль, действительно, представляет собой один из основных, хотя и не единственный тип вторичной структуры.
а?-Спираль характеризуют следующие параметры. Теоретически предсказанные величины двугранных углов <р = —58°, ^ = —41°; средние значения, по данным рентгеноструктурного анализа 57 белков, у? = —62°, ^ = —41°. Ее радиус равен 2,3 А, высота подъема спирали,
приходящаяся на один аминокислотный остаток, — 1,5 А, среднее число остатков на один оборот — 3,6, шаг спирали (т.е. высота, на которую пептидная цепь поднимается за один оборот) — 5,4 А. Все карбонильные группы в о-спирали ориентированы в одном направлении — вперед, если считать по ходу пептидной цепи, от аминного конца к карбоксильному, а №*-Н-группы — назад.
Рис. 5.5. Правая оспираЛь. А - показаны только Car-атомы; Б - все атомы скелета пептидной цепи; В - более полная структура
Пептидная цепь (от N- к С-концевому остатку) направлена сверху вниз. Водородные связи соединяют карбонильный кислород t-го остатка с водородом NH- группы (t + 4)-го. В пространстве соседствуют боковые цепи аминокислот, разделенных двумя или тремя остатками. Размещение атомов в спирали кажется свободным только потому, что они для наглядности показаны в уменьшенном масштабе. С учетом реальных радиусов атомов а-спираль представляет собой плотно упакованную структуру, лишенную внутреннего канала и не проницав емую даже для воды. В проекции на ось спирали расстояние между соседними Са атомами составляет 1,5 X, угол поворота, приходящийся на один остаток, равен 100°. На полный поворот спирали (360°) приходится 3,6 остатка
Между С—О- и N-Н-группами устанавливаются водородные связи (рис. 5.5.) так, что карбонильная группа i-го остатка образует связь с N—Н-грушюй (i 4- 4)-го, карбонильная группа (i + 1)-го — с N-Н-груп- пой (i + 5)-го и т.д. То, что "над" карбонильной группой i-ro остатка оказывается NH-группа, а не карбонил, (i + 4)-го остатка, примерно и соответствует 3,6 остатка на оборот спирали.
Каждая пептидная группа поляризована и характеризуется определенным дипольным моментом, причем отрицательный заряд концентрируется на кислороде карбонильной группы, а положительный — на атоме азота. Из-за однонаправленности пептидных групп в а-спирали их дипольные моменты согласуются и о-спираль как целое приобретает дипольный момент, на ее концах концентрируются частичные отрицательный и положительный заряды, что может играть в белке существенную функциональную роль.
Возможности образования водородных связей между пептидными группами в о-спирали использованы сполна. В этом смысле о-спираль является как бы насыщенной, внутренне замкнутой. Она не способна (в отличие от ^-структуры) к взаимодействию с другими элементами вторичной структуры за счет образования водородных связей между
пептидными группами.
Рис. 5.6. Распределение гидрофильных и гидрофобных аминокислот на поверхности одной из а-спиралей аполипопротеина С-1:Рис. 5.6. Распределение гидрофильных и гидрофобных аминокислот на поверхности одной из а-спиралей аполипопротеина С-1:I- гидрофильная поверхность, II - гидрофобная поверхность, на которой легко проследить гребень, который образуют (снизу вверх) боковые цепи лейцина, валина, двух остатков фенилаланина, метионина и снова лейцинаI- гидрофильная поверхность, II - гидрофобная поверхность, на которой легко проследить гребень, который образуют (снизу вверх) боковые цепи лейцина, валина, двух остатков фенилаланина, метионина и снова лейцинаВ формировании пространственной структуры белка важную роль играют нековалентные контакты, в которых участвуют боковые цепи аминокислот, входящих в а-спи- раль. При этом существенно, что на поверхности отпирали оказываются сближенными боковые цепи аминокислот, разделенных двумя или тремя остатками в пептидной цепи. Если в этих позициях находятся гидрофобные аминокислоты, они Образуют своеобразный гидрофобный гребень. Взаимодействие между такими гребнями используется как способ упаковки а-спиралей в пространственной структуре белка. Точно так же могут быть образованы и гидрофиль-В формировании пространственной структуры белка важную роль играют нековалентные контакты, в которых участвуют боковые цепи аминокислот, входящих в а-спи- раль. При этом существенно, что на поверхности отпирали оказываются сближенными боковые цепи аминокислот, разделенных двумя или тремя остатками в пептидной цепи. Если в этих позициях находятся гидрофобные аминокислоты, они Образуют своеобразный гидрофобный гребень. Взаимодействие между такими гребнями используется как способ упаковки а-спиралей в пространственной структуре белка. Точно так же могут быть образованы и гидрофиль-
Рис. 5.6. Распределение гидрофильных и гидрофобных аминокислот на поверхности одной из а-спиралей аполипопротеина С-1:
Рис. 5.6. Распределение гидрофильных и гидрофобных аминокислот на поверхности одной из а-спиралей аполипопротеина С-1:
I- гидрофильная поверхность, II - гидрофобная поверхность, на которой легко проследить гребень, который образуют (снизу вверх) боковые цепи лейцина, валина, двух остатков фенилаланина, метионина и снова лейцина
I- гидрофильная поверхность, II - гидрофобная поверхность, на которой легко проследить гребень, который образуют (снизу вверх) боковые цепи лейцина, валина, двух остатков фенилаланина, метионина и снова лейцина
В формировании пространственной структуры белка важную роль играют нековалентные контакты, в которых участвуют боковые цепи аминокислот, входящих в а-спи- раль. При этом существенно, что на поверхности отпирали оказываются сближенными боковые цепи аминокислот, разделенных двумя или тремя остатками в пептидной цепи. Если в этих позициях находятся гидрофобные аминокислоты, они Образуют своеобразный гидрофобный гребень. Взаимодействие между такими гребнями используется как способ упаковки а-спиралей в пространственной структуре белка. Точно так же могут быть образованы и гидрофиль-
В формировании пространственной структуры белка важную роль играют нековалентные контакты, в которых участвуют боковые цепи аминокислот, входящих в а-спи- раль. При этом существенно, что на поверхности отпирали оказываются сближенными боковые цепи аминокислот, разделенных двумя или тремя остатками в пептидной цепи. Если в этих позициях находятся гидрофобные аминокислоты, они Образуют своеобразный гидрофобный гребень. Взаимодействие между такими гребнями используется как способ упаковки а-спиралей в пространственной структуре белка. Точно так же могут быть образованы и гидрофиль-
мыв, в частности заряженные, поверхности. Поэтому о-спираль - может быть чисто гидрофобной, что характерно для трансмембранных участков белков, или амфифильной, т.е. обладающей как гидрофобной, так и гидрофильной сторонами*(рис. 5.6).
* Длина а-спиральных участков в глобулярных белках относительно невелика и обычно составляет 5—15 аминокислотных остатков, редко превышая 3—4 оборота сдирали; в фибриллярных белках она гораздо протяженнее. Иногда наблюдаются изломы о-спирали, обычно в местах включения остатков пролина, прерывающих систему водородных связей. При этом ось спирали отклоняется на 20—30°.
/9 СТРУКТУРА
Набор углов, отвечающий этой структуре, соответствует на карте Рамачандрана обширной глубокой впадине. В отличие от о-спирали Р- cmpyicmypa стабилизируется взаимодействиями между соседними отрезками пептидной y,enu, т.е. несколько более далекими контактаг-'
Рис. 5.7. Параллельная ^структура
Показана модель параллельного /S-складчатого слоя в флаводоксине. Водородные связи (пунктирные линии) образуют 10-членные циклы. Стрелки указывают направление хода пептидных цепей
ми. Эти отрезки могут быть направлены в одну сторону — параллельная /9-структура (угол у = —119е, ^ = +113е) -т- или в противоположную — антипараллелъная /9-структура (у = —139", ^ = 4-135е).
Рассмотрим систему водородных связей между двумя отрезками пептидной цепи, образующими параллельную ^-структуру. В этом случае (рис. 5.7) NH-rpynna какого-либо остатка в отрезке Л дает водородную связь с карбонильной группой г-го остатка пептидной цепи Я, а карбонильная группа того же аминокислотного остатка цепи Л — с NH-группой (г + 2)-го остатка в параллельной цепи В. Важно, что (г + + 1)-й остаток цепи В при этом как бы пропущен и его NH- и карбонильная группа во взаимодействии с цепью Л не участвуют. Точно так же далеко не все 0=4)- и NH-группы цепи Л участвуют во взаимодействии с цепью В.
этих участковэтих участковТаким образом., два отрезка параллельной /9-структуры соединяются водородными связями, что приводит к формированию больших циклов из 12 атомов. Еще раз подчеркнем, что в каждой из цепей во взаимодействии с соседней участвует только половина групп, которые могли бы образовать водородные связи. Следовательно, каждый из
этих участков
этих участков
пептидной цепи может образовать такую же систему
МаМаРис. 5.8. Антипараллельная /9-структураРис. 5.8. Антипараллельная /9-структураПоказан антипараллельный /9-складчатый слой в супероксиддисмутазе. Водородные связи (пунктирные линии) образуют чередующиеся 8- и 14-членные циклыПоказан антипараллельный /9-складчатый слой в супероксиддисмутазе. Водородные связи (пунктирные линии) образуют чередующиеся 8- и 14-членные циклы
Ма
Ма
Рис. 5.8. Антипараллельная /9-структура
Рис. 5.8. Антипараллельная /9-структура
Показан антипараллельный /9-складчатый слой в супероксиддисмутазе. Водородные связи (пунктирные линии) образуют чередующиеся 8- и 14-членные циклы
Показан антипараллельный /9-складчатый слой в супероксиддисмутазе. Водородные связи (пунктирные линии) образуют чередующиеся 8- и 14-членные циклы
водородных связей еще с одним отрезком, тот, в свою очередь, с другими и т.д. В отличие от аг-спирали, насыщенной водородными связями и не способной поэтому взаимодействовать с другими участками белка на уровне вторичной структуры, каждый отрезок пептидной цепи в ^-структуре открыт для формирования более протяженной системы водородных связей. .
В антипараллелъной Д-структуре (рис. 6.8) водородные связи образуются между противоположно направленными пептидным” группировками соседних отрезков, что приводит к чередовав г^о 8- и 14членных циклов. И в этом случае во взаимодействии с соседней пептидной цепью участвуют не все, а каждый второй аминокислотный остаток. Половина пептидных групп остается свободной, что дает возможность присоединить к каждому из двух антипараллельно направленных отрезков еще по одному отрезку пептидной цепи, и т.д. Таким образом, и антипараллельная ^-структура не насыщена водородными связями и'способна давать весьма протяженные образования, в которые включено несколько участков пептидной цепи. •
Число аминокислотных остатков в отрезке пептидной цепи, образующем ^-структуру, обычно колеблется от 3 до 8. Протяженная ft— структура, так называемый ^-слой, или ^-складчатый лист (рис. 5.9), чаще всего состоит из 2—< десяти.
цепей, хотя иногда их число достигает ицепей, хотя иногда их число достигает иРис. 5.9. /З-Складчатый слойРис. 5.9. /З-Складчатый слойА - антипараллельный /^-складчатый слой; вид "сверху"; прерывистыми линиями обозначены водородные связи, зачернены /3-атомы боковых групп; z Б - вид "сбоку"; хорошо видны складчатость и размещение боковых групп по обе стороны слояА - антипараллельный /^-складчатый слой; вид "сверху"; прерывистыми линиями обозначены водородные связи, зачернены /3-атомы боковых групп; z Б - вид "сбоку"; хорошо видны складчатость и размещение боковых групп по обе стороны слояБоковые группы аминокислотных остатков, соседних в пептидной цепи, при образовании р- структуры оказываются по разные стороны ее поверхности. Сама же поверхность имеет складчатую форму, причем складки заданы о-угле- родными атомами остатков, находящихся в соседних цепях. Отходящие от о-углеродных атомов боковые группы образуют своего рода гребни. Это позволяет формировать довольно протяженные поверхности, насыщенные однотипными (например,
цепей, хотя иногда их число достигает и
цепей, хотя иногда их число достигает и
Рис. 5.9. /З-Складчатый слой
Рис. 5.9. /З-Складчатый слой
А - антипараллельный /^-складчатый слой; вид "сверху"; прерывистыми линиями обозначены водородные связи, зачернены /3-атомы боковых групп; z Б - вид "сбоку"; хорошо видны складчатость и размещение боковых групп по обе стороны слоя
А - антипараллельный /^-складчатый слой; вид "сверху"; прерывистыми линиями обозначены водородные связи, зачернены /3-атомы боковых групп; z Б - вид "сбоку"; хорошо видны складчатость и размещение боковых групп по обе стороны слоя
Рис. 5.10. Протяженный 3- складчатый слой (в карбан- гидразе человека)
Десять отрезков Д-структуры (преимущественно антипаралле- льной) закручены друг относительно друга, образуя супервторичную структуру, которая напоминает винтовую лестницу. Угол между первым и последним отрезками близок к 220°. Показаны ацетилированный аминный - AcNH- и карбоксильный - СООН-концы полипептидной цепи
гидрофобными) боковыми радикалами. Гидрофобные поверхности З- складчатого слоя, взаимодействуя между собой или с гидрофобными же гребнями а-спиралей, могут участвовать в построении внутримолекулярных гидрофобных ядер,. стабилизирующих пространственную структуру белка.
Следует иметь в виду, что поверхность Д-складчатого листа редко является плоской, чаще она закручена влево, если смотреть перпендикулярно ходу отрезков. Угол между соседними отрезками цепи составляет при этом около 25°. Многократное повторение такого мотива ' приводит к закручиванию листа в структуру, подобную винтовой лестнице. В результате угол между крайними отрезками пептидной цепи в Д-листе колеблется от 0° в структуре конканавалина А до 70—80° в дезоксирибонуклеазе I, 100° в нуклеотидсвязывающем домене дегидрогеназ и даже достигает 220° в карбангидразе (рис. 5.10).
Описаны также "барабаны”, получающиеся при сворачивании протяженного /Элиста, когда крайние отрезки пептидной цепи смыкаются, формируя между собой систему водородных связей, которая свойственна /^-структуре. Очевидно, что /2-структура в таких случаях утрачивает характер локального образования, подчас пронизывая всю белковую глобулу (и перерастает рамки данного в начале главы определения вторичной структуры). Учитывая это, к протяженным 3~ складчатым листам, играющим важную роль в формировании третичной структуры белка, применяют термин супервторичная структура. .
На рис. 5.11 приведена схема NAD-связывающего домена глицераль- дегидфосфатдегидрогеназы, иллюстрирующая многообразие вторичных структур в этой молекуле.
Рис. 5.11. Схема вторичных структур в NAD-связывающем домене глицен ральдегидфосфатдегидрогеназы
Тонкими линиями показаны водородные связи в Of-спиралях (например, от NH- группы остатка 19 к С—О остатка 15 и т.д.), участках параллельной (от NH и С=О остатка 3 к соответственно С=О остатка 27 и NH остатка 29) и антипараллельной /9-структуры (отрезки 56-61 и 62-67). Есть и участки последовательности, например 134-141, которые не образуют системы водородных связей
/2-ИЗГИБ
Как омшираль, так и /2-структура обычно представлены в глобулярных белках сравнительно короткими отрезками, поэтому значительная часть вторичной структуры белка приходится на разного рода петли, позволяющие изменить направление пептидной цепи. Наиболее экономный структурный элемент, позволяющий повернуть полипептид на 180°, используя всего три пептидные группировки, получил название Р-изгиба (рис. 5.12). /2-Изгиб стабилизируется одной водородной связью. Его образованию могут мешать объемистые боковые цепи аминокислот, поэтому предпочтительно включение в него остатка глицина. Заметим, что /2-изгиб практически всегда оказывается на поверхности белковой глобулы, поэтому нередко он играет существенную роль в ее взаимодействии с другими молекулами, например с иммуноглобулинами.
Приведенная на рис. 5.13 карта Рамачандрана для реального белка, основанная на данных рентгеноструктурного анализа, показывает, что большинство аминокислотных остатков имеет конформацию, свойственную о-спирали или /2-структуре. Лишь точки, соответствующие углам у? и ^ для остатков глицина, оказываются мало связанными конформационными ограничениями и распределены почти по всему полю карты.
Рис. 5.12. /2-Изгиб (две возможные структуры)
Поворот пептидной цепи на 180° происходит на отрезке, содержащем четыре аминокислотных остатка, причем между кислородом карбонильной группы 1-го остатка и водородом NH-группы 4-го образуется стабилизирующая изгиб водородная связь
Рис. 5.13. Карта Рамачандрана для гЛутатионредуктазы:
А - точки, отвечающие конформации 419 аминокислотных остатков (исключая глицин), сгущаются в понижениях, долинах, которые соответствуют онспирали (нижний; левый квадрант) и ^-структуре (верхний левый квадрант), встречаются и на перевале между ними. Небольшая группа остатков имеет конформацию, характерную для левой О-спирали (у = 60е, ^ = 40°); Б - точки, отвечающие 41 остатку''глицина, из которых 29 соответствуют наборам углов фиф, не разрешенным для других аминокислотных остатков
Таблица 5.1. Относительное содержание в глобулярных белках аминокислотных остатков, принадлежащих различным типам вторичной структуры (по данным рентгеноструктурного анализа)
/
Белок
"Содержание аминокислот, %
о-спираль
/3-структура'
/3-изгиб,
нерегуляр
ные участки
Миоглобин.
79
0
5
16
Парвальбумин
62
5
17
16
Адёнилаткиназа’
54
12 '
19
-15
Инсулин
51
24
12
13
Лактатдегидрогеназа
45
24
6
25
Лизоцим4
41
16
23
20
Цитохром с
39
0
24
37
Карбоксипептидаза А
37
15
26
22
Термолйзин
36
22
18
24
Субтилизин BPN
31
10
22
37
Ингибитор трипсина
28
33
3
36
4-56
97
Продолжение табл. 5- 1
Белок
Содержание аминокислот, %
о-спираль
/2-структура
/2-изгиб.
, нерегулярные участки
Папаин
28
14
.17 ’
41
Нукдеаза ■
24
' 15 .
18
43
Рибонуклеаза А
23
' 40
" 13
24
о-Химотрипсин
9
34
34..
■ 1и
,.23
Эластаза \
7
.52
. 26 .
.15
Конканавалин
■ 2
51*
9
38
Относительное содержание вторичных структур различного типа,в белках меняется в очень широких предела^ (табл. 5.1), причем ^;оля нерегулярных структур подчас оказывается весьма значительной >
ОБ УСТОЙЧИВОСТИ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Оценивая факторы, которые определяют стабильность вторичной структуры, следует учитывать, что стерические ограничения, делающие благоприятными не любые, а-только определённые -наборы двугранных углов у.и V'. отнюдь не запрещают иных сочетаний. В то же время система водородных связей; типичная-для эДёментов вторичной структуры, в воде достаточно уязвима, поскольку и группы NH, и карбонильные группировки могут взаимодействовать не только между собой, но и с молекулами воды, что приводит к дестабилизации структуры. К тому же в глобулярных белках протяженность участков вторичной структуры ограничена, а кооперативность в рамках отдельного ее элемента невысока. * ‘ f'' - ”
Таким образом, взятые сами по себе, в отдельности от компактной белковой глобулы, элементы = вторичной структуры не должны обладать значительной стабильностью. Это подтверждает ряд эксперимен- • тов, в которых наблюдали за структурообразованйем сравнительно коротких пептидов, воспроизводивших последовательность аминокислот в о-спиральныХ участках белка. Обнаружено, что такие пептиды', в Частности фрагменты глобинов или' спиральный участок миогемэрйт- рина, в водных растворах содержат лишь флуктуирующие зародышевые а-спирали, причем равновесие, как правиле, смещено в' сторону 98
развернутых структур. Устойчивость ск-спиралей заметно возрастает при понижении полярности среды путем добавления органических растворителей. Например, фрагмент 69—87 миогемэритрина, полностью спирализованный в белке, в смеси вода — трифторэтанол содержал около 50% а-спирали, причем спирализованной оказывалась преимущественно С-концевая половина пептида, тогда как в воде наблюда- • лось лишь временное образование отдельных оборотов пептидной цепи, быстро распадавшихся. Отмечалось также образование /3-изгибов в водных растворах коротких пептидов.
Следовательно, элементы вторичной структуры приобретают устойчивость только после их объединения в компактную белковую глобулу, поскольку в последней резко повышается кооперативность системы нековалентных взаимодействий, а значительная часть структуры оказывается погруженной в среду с полярностью гораздо меньшей, чем у воды. Наконец, немаловажно, что в компактной структуре значительная часть внутримолекулярных водородных связей скрыта от воздействия воды и вероятность их разрыва гораздо меньше.
Итак, вторичная структура как устойчивое образование существует только в рамках компактной белковой глобулы.* Однако флуктуирующие мерцающие элементы вторичной структуры, которые могут возникать уже, на коротких участках пептидной цепи, очень важны как предпосылка формирования пространственной структуры, по-видимр- му, начинающегося со взаимодействия, "схлопывания" соседних ct- спиралей, /3-изгибов, а затем и элементов /3-структуры. Такие ассоциаты, еще недостаточно стабильные, могут служить зародышами возникновения компактной структуры, единицами ее свертывания.
,5.8. О (СООТНОШЕНИИ МЕЖДУ ПЕРВИЧНОЙ
И ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРАМИ
Как уже говорилось, при описании вторичной структуры пренебрегают боковыми радикалами аминокислот и ролью дальних взаимодей- . ствий. Однако по мере уточнения картины эти факторы необходимо учитывать: так, уже переход от глицина к аминокислоте с простейшей боковой цепью — аланину — резко сужает выбор возможных конформаций, еще резче уменьшается он для пептидных связей, включающих иминный азот пролина. Более тонкий учет влияния индивидуальных особенностей аминокислот выявляет некоторые предпочтения в образовании той или иной вторичной структуры.
Это обусловлено не только стереохимическим влиянием боковых цепей на стабильность конформации, но и тем, как они укладываются
99
на поверхности возникающей структуры, каков рбразующийся при этом рисунок. Цапример, если гидрофобные остатки распределены в первичной структуре так, что разделяются двумя-тремя остатками полярных аминокислот, то образуется своеобразный гребень из гидрофобных радикалов о-спирали, направленных по одну сторону. За счет взаимодействия таких гребней может начаться формирование пространственной структуры, которая, в свою очередь, стабилизирует вторичную. Таким образом, предпочтительное образование того или иного типа регулярной вторичной структуры может определяться не только природой аминокислотных остатков, но и характером их размещения на данном участке пептидной цепи.
Весьма полезным оказался статистический анализ установленных пространственных структур белка, который позволил приписать отдельным аминокислотным остаткам параметры, характеризующие их большую или меньшую склонность встраиваться в а-спираль, /3-структуру или образовывать /3-изгиб. Если просматривать вновь определенную первичную структуру, используя ’’окно”, соответствующее нескольким идущим подряд остаткам, то удается, например, выявить характерные скопления остатков, склонных встраиваться в а-спирали. Это позволяет предполагать, что в данном белке они свернуты в о- ■спираль. Такое предположение проверяется соответствием остатков, расположенных на концах спирали, аминокислотам, обычно занимающим такое положение. Дальнейшие уточнения дают соображения стереохимического характера.
Разработано несколько приемов предсказания вторичной структуры белков по их первичной структуре, из которых наибольшее распространение получили методы, предложенные П.Чоу и Дж.Фасманом, О-Птицыным и А.Финкельштейном, а также В.Лимом. Как показала проверка на ряде белков, вероятность предсказания а-спиральных участков достаточно велика, хуже предсказываются /3-структурные элементы и изгибы.
Трудность однозначного предсказания вторичной структуры понятна, так как после образования какого-либо ее элемента он Одолжен включиться в третичную структуру, т.е. войти в систему ■ дальних взаимодействий. Последние могут стабилизировать вторичную структуру! но могут и нарушить ее. Ввиду этого всегда существует некоторая вероятность, что предсказание не оправдается. Действительно, анализ большого числа пространственных структур белков показал, что одни и те же короткие аминокислотные последовательности могут образовывать в разных белках одинаковые вторичные структуры, что установлено, например, для восьми гепта- и гексапептидных участков. Однако нередки и такие случаи, когда идентичные последовательно- 100 ' ' _
сти дают разные вторичные структуры в белках различного строения. Это найдено для семи гексапептидных отрезков. В частности, одна и та же последовательность
Asn—Ala—Ala—lie—Arg—Ser '
имеет в фосфофруктокиназе конформацию о-спйрали, расположенной между двумя другими «-спиралями, тогда как в термолизине она входит в /^-складчатый слой вместе с четырьмя другими фрагментами пептидной цепи. '
Итак, дальние взаимодействия в рамках третичной структуры могут вносить заметные коррективы в соотношение первичная структура — вторичная структура, делая его далеко не всегда однозначным. Важно, однако, что успешное предсказание ряда вторичных структур, в особенности «-спиральных участков, с определенностью указывает на то, что это соотношение реально существует. Предсказание вторичных структур помогает при сравнений белков, хв частности в таких случаях, когда сопоставление первичных структур не выявляет значимого процента совпадающих аминокислотных остатков (например,1 их меньше 15%), однако есть основания заподозрить, что эти белки тем не менее родственны и обладают сходной пространственной структурой. В отсутствие прямых данных по укладке полипептидных цепей таких белков сходство предсказываемых элементов вторичной структуры может служить полезным аргументом. Нередко предсказание вторичной структуры позволяет выявить характерные, особенности отдельных участков белка: например, гидрофобные «-спирали могут оказаться трансмембранными.
5.9. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Наиболее надежным является определение вторичной структуры по результатам рентгеновского анализа пространственного строения белка. Однако этот метод сложен и требует значительного времени, существенно уступая в скорости современным способам установления первичной структуры, поэтому важно хотя бы примерно оценивать содержание отдельных типов вторичной структуры в белке. Кроме того, рентгеноструктурный анализ не позволяет следить за изменениями пространственной, а значит, и вторичной структуры белка в растворе в условиях, особенно интересных для изучения функции.
Для такого рода задач используют оптические методы — исследование кругового дихроизма или дисперсии оптического вращения. Оба эффекта основаны на электронных взаимодействиях между хромофора?-
101
ми — карбонильными группами соседних пептидных связей. Такие взаимодействия существенно зависят от взаимной ориентации карбонильных групп в пространственной структуре, а значит, от конформации соответствующих участков полипептидной цепи белка.
Так, набору углов <р и *ф, свойственному тому или иному типу вторичной структуры белка, отвечает характерный спектр кругового дихроизма. В наблюдаемых спектрах реальных белков вклады отдельных типов вторичной структуры, суммируются. Сопоставление спектров кругового дихроизма для ряда белков, имеющих, по данным рентгеноструктурного анализа, существенно разное содержание а-спиралей, Р- структурных элементов, /2-изгибов, участков с нерегулярной структурой, позволяет найти базисные спектры, свойственные этим видам вторичной структуры. Спектр кругового дихроизма изучаемого белка может быть представлен как сумма базисных спектров. Вклад каждого из них пропорционален содержанию соответствующего типа вторичной структуры в данном белке.
Такой способ обычно дает результаты, неплохо согласующиеся с данными рентгеноструктурного анализа. Как правило, легче предсказывается содержание е-спиралей, обладающих более выраженными особенностями спектра кругового дихроизма, несколько сложнее — содержание /^-структурных элементов и /2-изгибов. Однако главное достоинство метода — не в определении абсолютного содержания отдельных типов вторичной структуры. Он особенно ценен для наблюдения за тем, как изменения условий сказываются на вторичной, а значит, и на третичной структуре белка. Метод незаменим при исследовании денатурации белков, характеристике белковых фрагментов и фибриллярных белков.
ГЛАВА 6
ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА
Третичной структурой называют распределение в пространстве всех атомов белковой молекулы. При этом не учитывают взаимодействия этой глобулы с соседними глобулами или субъединицами. Часто понятие третичной структуры сужают, концентрируя внимание на наиболее устойчивом ее элементе — свойственном данному белку способе укладки полипептидной цепи в пространстве. Характерно, что для больших групп эволюционно родственных белков, подчас очень значительно отличающихся по первичной структуре и, значит, по распределению всех атомов в пространстве, способ укладки полипептидной цепи остается в главных чертах неизменным. Это показывает, что допускаемое 102 -
упрощение оправдано, так как оно эту жнет существенные черты третичной структуры. '
Известное сходство приведенного определения третичной структуры с понятием вторичной структуры лишь внешнее, поскольку вторичная структура характеризует относительно небольшой участок белка и определяется локальными нековалентными взаимодействиями, тогда как третичная структура зависит от всей риМмы взаимодействий — ковалентных и некввалентных — в белковой глобуле. . ,,
Третичная структура — основа функционалъности белка, которая требует точной пространственной организации больших ансамблей, построенных из множества аминокислотных остатков и их боковых групп. Такие ансамбли формируют активные центры ферментов, зоны связывания других биологических молекул, эффекторные центры белков и т.д., поэтому нарушение третичной структуры белка (денатурация) неизменно приводит к утрате им способности функционировать.
СТАБИЛЬНОСТЬ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКА
Стабильность третичной структуры зависит от системы нековалентных взаимодействий внутри белковой глобулы. Некоторые, белки дополнительно стабилизируются ковалентными — дисрлъфидн'ими — связями; однако немало белков, в том числе достаточно стабильных, вовсеих лишены. ‘ , , ' , " ’
Среди нёковалентных взаимодействий, реализующихся при образовании пространственной структуры белка, наибольшую точность в фиксировании межатомных расстояний и углов обеспечивают водородные связи. Им, как известно, принадлежит решающая роль В формировании вторичной структуры, в особенности периодических ее элементов: о-спиралей и ^-структур. В дополнение к этому водородные связи соединяют между собой и с главной цепью множество функциональных, групп боковых цепей аминокислотных остатков, например
О
Ч^Ч^Н^В • •(^С-СН2^€(НН1
•о—сн2—Серин\-- v t-А. ip ;•о—сн2—Серин\-- v t-А. ip ;~СВ2—СН2—СН2—CB2~N~fl~СВ2—СН2—СН2—CB2~N~flо=с—СН2-СН;о=с—СН2-СН;Тирозин Глутаминовая ’ Аспарагин кислота
•о—сн2—
Серин\
-- v t
-А. ip ;
•о—сн2—
Серин\
-- v t
-А. ip ;
~СВ2—СН2—СН2—CB2~N~fl
~СВ2—СН2—СН2—CB2~N~fl
о=с—СН2-СН;
о=с—СН2-СН;
NH2
ЛизинЛизинГлутамин
Лизин
Лизин
Существенно, что внутри белковой глобулы реализуется не менее 90% возможных водородных связей» .
Система водородных связей наряду- с другими- нековалентными взаимодействиями — ван-дер-ваалъсоеъ1ми связями и электро статическими контактами — чрезвычайно важна для стабилизации компактной нативной белковой глобулы. Действительно, изменение свободной энергии и, значит, константа К равновесия пептидная цепь «—* белковая глобула в первом приближении определяется уравнением
. j..
АС^епь — BTlnK ,= ДНцепь ■ TASцепь-
(Подчеркнем, что ролью воды, окружающей белок, мы пока' пренебрегаем, рассматривая белковую молекулу как бы находящейся В вакууме, на это и указывают индексы “цепь”.)
В этом выражений величина ДНцепь отрицательна, что отражает вклад нековалентных взаимодействий, устанавливающихся внутри белковой глобулы. Для стабилизации глобулы эта величина должна компенсировать энтропийный член — ТД8, который положителен, так как свертывание неупорядоченного клубка — неструктурированной ’ полипептидной цепи — в глобулу упорядочивает структуру и влечет за собой убыль энтропии пептидной цепи, а ёледовательно, AS отрицательна, Если такая компенсаций достигнута, то К окажется равной единице и, значит, доли нативных и денатурированных молекул белка станут равными. Для того чтобы равновесие отчетливо сдвинулось в сторону образования компактной структуры, понадобится существенное превышение ДНцепь над -^TAS.
Соотношение же этих двух величин зависит прежде всего от числа Нековалентных связей, устанавливающихся при свертывании полипептидной цепи в глобулу, а значит, от длины пептидной цепи. Этим объясняется обсуждавшаяся уже граница между пептидами и белками. В то же время видно, что с ростом температуры Т член TAS рано или поздно превысит по абсолютной величине АН и пространственная структура утратит стабильность — произойдет тепловая денатурация белка.
Реальная картина, однако, существенно зависит от учета взаимодействия белка с растворителем, обычно с водой. Действительно, вода способна образовывать водородные связи как с пептидными группировками, так и с функциональными группами белка, конкурируя с формированием внутримолекулярных связей.
Если сравнить развернутое, денатурированное состояние бет/ка со свернутым, нативным, то окажется, что при упаковке внутрь глобулы полярной группы: 104■.
последняя дает водородную связь с какой-либо другой полярной группой белка;► ..•
разрываются водородные связи, которые обе эти группы — донор и акцептор — в развернутой цепи, имели с водой; -, ,
устанавливаются водородные связи освободившихся11 молекул воды с другими ее молекулами. .•.. .,
.Рассмотрим, например, доведение двух полярных групп — гидроксила серина и амидной группы аспарагина, образующих. внутримолекулярную водородную связь при свертывании цепи в компактную структуру:- '„ .
СНгОНг-.О^ 4-,(Ш...0-*С-"С 2СН2"" ”^
Серин ’ Н।
•.Аспарагин . , ,( .,,
. Водородные связи с водой в развернутой цепи.
t • —► -СН20Н„.0=С-ОН2СН2-+ н-о ✓н
NHz .. ,^Н.
.Внутримолекулярная водо- Межмолекулярная водородная
родная связь в компакт- . связь между молекуламином белкеводы .
кой мере структурированный расТворит&Ль. Каждая ее молекула способна участвовать в образовании четырех водородных связей с Другими молекулами воды.' В результате выводе сосуществуют, находятся в динамическом равновесии со свободными молекулами относительно протяженные квазикристаллические лъдоподобные структуры. Полярные соединения, в том числе полярные группы белка, относительно легко включаются в Такие-структуры, устанавливая водородные связи с окружающей белок водой
Сложнее обстоит дело при взаимодействии с водой неполярны! бо
ковых цепей белка. На модельных соединениях — простейших углево
дородах — показано, что они могут в небольшой степени растворяться
в воде. При этом Их молекулы, не способные устанавливать водородные связи, включаются в своеобразные
Рис. 6.L Додекаэдр, образованный молекулами воды, соединенными , водородными связямиРис. 6.L Додекаэдр, образованный молекулами воды, соединенными , водородными связямиВнутри додекаэдра эбразует- ся полость диаметром около 5 А, в которой может быть размещено гидрофобное, т.е. не дающее водородных связей с водой, соединение. Формирование додекаэдра или аналогичных травильных структур с более крупными полостями требует упорядочения молекул воды, тем большего, .чем больше поверхнб^р. разместившегося в полости соединения.. Это привод* к понижению энтропии системы и делает выгодным объединение гидрофобных элементов белка в ядроВнутри додекаэдра эбразует- ся полость диаметром около 5 А, в которой может быть размещено гидрофобное, т.е. не дающее водородных связей с водой, соединение. Формирование додекаэдра или аналогичных травильных структур с более крупными полостями требует упорядочения молекул воды, тем большего, .чем больше поверхнб^р. разместившегося в полости соединения.. Это привод* к понижению энтропии системы и делает выгодным объединение гидрофобных элементов белка в ядро’’пустоты" в динамической структуре воды— полости, ячейки. Последние Образованы молекулами Воды, связанными между собой водородными связями (рис. 6.1).
Рис. 6.L Додекаэдр, образованный молекулами воды, соединенными , водородными связями
Рис. 6.L Додекаэдр, образованный молекулами воды, соединенными , водородными связями
Внутри додекаэдра эбразует- ся полость диаметром около 5 А, в которой может быть размещено гидрофобное, т.е. не дающее водородных связей с водой, соединение. Формирование додекаэдра или аналогичных травильных структур с более крупными полостями требует упорядочения молекул воды, тем большего, .чем больше поверхнб^р. разместившегося в полости соединения.. Это привод* к понижению энтропии системы и делает выгодным объединение гидрофобных элементов белка в ядро
Внутри додекаэдра эбразует- ся полость диаметром около 5 А, в которой может быть размещено гидрофобное, т.е. не дающее водородных связей с водой, соединение. Формирование додекаэдра или аналогичных травильных структур с более крупными полостями требует упорядочения молекул воды, тем большего, .чем больше поверхнб^р. разместившегося в полости соединения.. Это привод* к понижению энтропии системы и делает выгодным объединение гидрофобных элементов белка в ядро
По существу, это напоминает так называемые соединения включения. Возникновение таких ячеек означает упорядочение, ■ выключение из хаотического движения значительного числа молекул воды, т.ё. уменьшение энтропии растворителя — воды. Уменьшение энтропии, которое оказывается тем большим, чем больше поверхность раздела неполярные группировки — вода/ ограничивает растворение углеводородов в, воде:' термодинамически выгодным оказывается расслоение системы, образование двух фаз — водной и углеводороДнЬй.
Нечто аналогичное сопровождает и растворение в воде пептидной цепи, несущей неполярные боковые группы. Каждая из таких групп оказывается в ячейке окруженной структурированными молекулами воды, что приводит к уменьшению энтропии системы. "Отслаивание” углеводородных радикалов в этом случае, понятно, невозможно, — они нанизаны на скелет полипеПтидной цепи. Поэтому реализуется другой процесс —- свертывание глобулы, при котором значительная часть (не менее
половины) гидрофобных боковых цепей оказывается скрытой от контакта с окружающей белок водой. .При этом нередко наблюдается образование своеобразных внутримолекулярных ’'капель” из гидрофобных боковых цепей аминокислот, "гидрофобных ядер" более или менее сложной формы. Иногда такие ядра вытянуты, напоминая полумесяц, иногда распадаются на два-три самостоятельных небольших ядра.
Важно, что уменьшение поверхности соприкосновения гидрофобных групп с водой приводит к установлению между ними так называемых гидрофобных контактов. Заметим, что сближение неполярных групп влечет за собой установление ван-дер-ваальсовых контактов между ними, в определенной мере также стабилизирующих белковую глобулу. Однако вклад этих весьма слабых взаимодействий в энергетику процесса свертывания белка невелик, тогда как роль гидрофобрных контактов, иными словами, роль изменения энтропии растворителя цри свертывании белка очень значительна. • ,
Термодинамика свертывания белковой глобулы характеризуется тем, что факторы, способствующие образованию колтагбтной нативной структуры, и факторы, действующие в противоположнол! направлении, почти сбалансированы. Изменение свободной энергии при свертывании белка, содержащего примерно 100 аминокислотных остатков, составляет около 10 ккал/моль, или всего лишь 0,1 ккал в расчете на один аминокислотный остаток. Для сравнения укажем, что энергия водородной связи составляет около 3 ккал.
Еще важнее, что эта удивительно небольшая величина оказывается разностью двух достаточно крупных, но сбалансированных величин. Последнее приводит к тому, что белковая глобула может утрачивать стабильность, разворачиваться уже при относительно небольшом изменении указанных величин. Например, утрата только одной водородной связи при замене в лизоциме фага Т4 треонина изолейцином снижала температуру денатурации белка на 11°. Существенно, что дестабилизация ' третичной структуры белка может быть вызвана не только воздействием на белок, но и излгенениелг структуры растворителя — воды.
Известно несколько способов оценки гидрофобности боковых г^епей алтнокислот, входящих в состав белка. Согласно одному из них, предложенному Р.Вольфенденом, определяют распределение соединений, моделирующих боковую цепь того или иного остатка между водой и находящимся в равновесии с ней паром. Так, боковая цепь треонина аппроксимировалась этиловым спиртом, радикал аланина — метаном и т.п. В этих условиях гидрофобные соединения будут стремиться покинуть воду и перейти в пар.
Оказалось, что по величине константы равновесия паровая
107
фаза/вода (т.е. по склонности перехода в пар) боковые цепи аминокислот могут быть собраны в следующие группы:
Константа порядка 102 — глицин, лейцин, изолейцин, валин, аланин.
Константа порядка 101 — фенилаланин, цистеин, метионин.
Константа порядка 10'4 — треонин, серин, триптофан, тирозин.
Константа порядка 10‘8 — аспарагин, лизин, глутамин, глутамат, гистидин, аспартат.
Константа 10'14 — аргинин.
Первые две группы включают в себя гидрофобные аминокислоты, боковые цепи которых стремятся избежать контакта с водой. Помещение глицина в первую группу объясняется тем, что молекула водорода плохо моделирует атом водорода в глицине. В действительности при упаковке остатков глицина в белке особенно значителен вклад пептидной группировки —NH^H-С0~", поэтому глицин трудно отнести к гидрофобным остаткам. Впрочем, известны случаи, когда в фиксированной третичной структуре белка метиленовая группа остатка глицина —СНг- выполняет роль гидрофобного звена.
Третья—пятая группы включают гидрофильные аминокислотные остатки. Для пролина в рамках данного подхода нельзя предложить модели. Анализ пространственных структур множества белков показывает, что указанное отнесение аминокислот к гидрофобным или гидрофильным в общем коррелирует с их распределением преимущественно внутри или на поверхности белковой глобулы (табл. 6.1, 6.2).
6.2. ГИДРОФОБНОЕ ЯДРО
Как правило, гидрофобное ядро состоит исключительно из гидрофобных боковых цепей, лишь изредка в него оказывается погруженным гидрофильный, тем более заряженный аминокислотный остаток. Принято считать, что такие исключения обусловлены какими-то функциональными требованиями.
В гидрофобное ядро, которое, как уже отмечалось, вовсе не обязательно приближается к сферической конфигурации, но более или менее компактно, обычно входит 20—30% обгцего числа аминокислотных остатков. В нем особенно представлены объемистые остатки лейцина, изолейцина, фенилаланина, валина. Так, ДНКаза I, полипеп- тидная цепь которой состоит из 259 аминокислотных остатков, при формировании структуры образует три гидрофобных ядра, в которых содержится 70% имеющихся в этом белке гидрофобных остатков. Тенденцию к погружению гидрофобных боковых цепей (прежде всего аланина, валина, изолейцина, лейцина, фенилаланина и метионина) 108•
внутрь глобулы этого фермента, типичную и для других белков, иллюстрирует табл. 6.1.,
Таблица 6.1. Доступность для воды боковых цепей . аминокислотных остатков ДНКазы I
Аминокислота
Всего
Остатков
Недоступны для воды
Частично и полностью доступны
Процент доступных
Ala
22
13
9
41
Vai
25
17
■8
32 .
lie
12
12"
0
0
Leu
23
11
12
52
Phe
И
8
3.
27
Met
4
3
1
25
Pro
9
2
7
78
Trp
3
0-
3
100
Gly
9
3
б
67
Cys
4
1
3
75
Ser
31
4
27
87
Thr
14
3
И
79
Туг
15
3
12
80
Asn
12
2
10
83
Gin
9
1
8
89
Asp
20
3
17
85
Glu
10
2
8
80
His
6
0
6
100
Lys
9
0
9
100
Arg
12
1
И
92
. Общность тенденции к погружению гидрофобных боковых цепей внутрь глобулы подтверждает анализ пространственных структур 9 белков, которые содержат в общей сложности 2000 аминокислотных остатков, в том числе 587 (29%) скрытых, т.е. образующих гидрофобные ядра (табл. 6.2). х
Упаковка боковых цепей аминокислот в гидрофобном ядре, как правило, близка к плотной (рис. 6.2), что делает эффективными ван- дер-ваальсовы взаимодействия между углеводородными структурами — дополнительный фактор стабилизации пространственной структуры. У эволюционно родственных белков с однотипной третичной структурой объем гидрофобного ядра обычно меняется мало — появление более крупных боковых групп компенсируется мутациями, которые приводят
" 109
Таблица 6.2. Даля аминокислотных остатков, которые после свертывания белка оказываются скрытыми, практически недоступными растворителю
Аминокислота
Процент скрытых остатков
от общего числа остатков данного типа
от суммы скрытых остатков
Не
65
12
Vai
56
15
Met
50
2
Cys
50
2
Phe
48
5
CySH
-47
3
Leu
41
ю
Ala
38
12
Gly
37
10
Thr
25
5,5
Ser
24
8 -
Pro
24
3
Trp
23
1,5
Glu
20
2
His
19
1
Asp
14,5
3
Тут
13
2
Asn
10
2
Gin
6,3
2
Lys
4
од
Arg
0
0
к уменьшению объема находящихся с ними в контакте боковых радикалов. Все же было бы неправильным сводить стабилизирующее действие гидрофобного ядра только к его объему — структурная организация имеет немалое значение.
Примером может служить весьма тонкая зависимость стабильности белка гена V бактериофага fl и его мутантов от природы аминокислот, образующих гидрофобное ядро. Так, замена изолейцина-47 на валин устраняет одну метильную группу из гидрофобного ядра, замена валина-35 на изолейцин, напротив, вводит дополнительную метильную группу. Следовательно, в двойном мутанте Пе-47 —► Vai; Val-35 —♦ Не объем гидрофобного ядра остается таким же, как и в белке дикого типа, хотя упаковка гидрофобных групп во внутреннем ядре белка, НО
Рис. 6.2. Поперечное сечение (скол) модели лизоцима куриного яйца:/ - отчётливс полярные группы, 2 - умеренно полярные, 3 - гидрофобные. Видно, что последние сконцентрированы . внутри глобулы, но могут выходить на поверхность, в частности во впадине активного центра (слеваРис. 6.2. Поперечное сечение (скол) модели лизоцима куриного яйца:/ - отчётливс полярные группы, 2 - умеренно полярные, 3 - гидрофобные. Видно, что последние сконцентрированы . внутри глобулы, но могут выходить на поверхность, в частности во впадине активного центра (слева
Рис. 6.2. Поперечное сечение (скол) модели лизоцима куриного яйца:
/ - отчётливс полярные группы, 2 - умеренно полярные, 3 - гидрофобные. Видно, что последние сконцентрированы . внутри глобулы, но могут выходить на поверхность, в частности во впадине активного центра (слева
Рис. 6.2. Поперечное сечение (скол) модели лизоцима куриного яйца:
/ - отчётливс полярные группы, 2 - умеренно полярные, 3 - гидрофобные. Видно, что последние сконцентрированы . внутри глобулы, но могут выходить на поверхность, в частности во впадине активного центра (слева
естёсТйенйо, должна несколько' йзме^? нитЬся':1 Оба'’ мутанта,” СодерЖп^иё' одиночные Замены Ile-47 ~* Vai и Val-35 —♦ Не, как й двойной мутант, О' котором говорилось Ьыше/ похожи на ' исходный белок по строению и' функции, однако значительно менее стабильны.
Гидрофобное ядро окружено наружной оболочкой, имеющей контакт с водой. В ней содержатся гидрофильные аминокислотные остатки, но наряду с ними немало и боковых цепей гидрофобных аминокислот — до половины их общего содержания. Нередко образуются своего рода гйд- рофобные пятна, "лоскуты11, которые придают поверхности белка мозаичный характер, чередуясь со строго гидрофильными участками. Такие гидрофобные выходы могут иметь функциональное значение — они формируют гидрофобные участки зон связывания субстратов и других лигандов, участвуют в белок-белковых
взаимодействиях, в частности в стабй- । вверху). Полярные остатки формируй лизации четвертичной структуры. 107 о6оло^к- дка (например, сле- _ва внизу) проникая внутрь глобулы
Разумеется, границы между гидро
фобным ядрбм и поверхностным слоем белка не так уж резки, более того, нередко обнаруживаются включенные в пространственную Структуру "МолекуЛы воды, участвующие в поддержании' системы внутримолекулярных водородных связей путем образования мостиков между функциональными группами боковых цепей аминокислот ' !.
' ' 613. РОЛЬ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ В СТАБИЛИЗАЦИИ' ^ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ НЕКОТОРЫХ БЕЛКОВ *
Дисульфидные связи образуются - при ' окислений сближенных в прбстранственной структуре белке остатков цистеина! в 'остатки цистина. Как уже упоминалось, это единственный тип ковалентных связей участвующих 6 дополнение к обсужденным выше гековалентным взаимодействиям в стабилизации Третичной структуры Дисульфидные
' '-111
связи встречаются далеко не во всяком белке, более того, известны весьма стабильные, в том числе термостабильные, белки, совсем лишенные их. Таким образом наличие в белке дисульфидных связей вовсе не является непременным условием его стабильности, однако роль этих связей нельзя и недооценивать.
Вклад дисульфидной связи в конформационную стабильность белка существенно. зависит от ее расположения в пространственной структуре. Полученные для ряда белков (панкреатической рибонуклеазы, лизоцима, легкой цепи иммуноглобулинов) оценки вклада дисуль- ■ фидных связей в энергию стабилизации нативной пространственной структуры находятся в пределах 2,3 — 5 ккаль/моль. Значимость этих величин очевидна, если сравнить их с небольшой — порядка 10 ккал/моль — энергией стабилизации белковой глобулы. По-видимому, стабилизация белковой структуры дисульфидными связями объясняется прежде всего тем, что они, сохраняясь'в денатурированном белке, резко сокращают число возможных конфигураций развернутой полипеп- тидной цепи, понижая тем самым ее энтропию. -
Как следствие, переход от такой развернутой цепи, содержащей дисульфидные связи, к нативной компактной структуре оказывается сопряженным с меньшей убылью конформационной энтропии и, следовательно, более выгодным, чем прй отсутствии дисульфидных связей.
• Вероятно также, что сохранение в развернутой цепи ковалентных дисульфидных связей между участками, которым надлежит быть сближенными в нативной глобуле, облегчает поиск правильного пути образования пространственной структуры, благоприятно сказывается на
, кинетике ренатурации белковой молекулы.'"
Очевидно, что оба эти фактора, способствующие ренатурации белковой глобулы и препятствующие ее денатурации, могут действовать только после формирования пространственной структуры белка. Образование же дисульфидных связей в ходе биосинтеза не предшествует свертыванию полипептидной цепи ’в глобулу, а как бы сопутствует этому процессу, идет параллельно с ним.
При формировании белковой глобулы, вероятно, могут возникать промежуточные состояния, где некоторые дисульфидные связи "неправильны", т.е. образованы не теми остатками цистеина, между которыми они устанавливаются в нативной структуре белка/ Лишь на конечной стадии может’происходить их "корректировка".
, Опыты по введению дополнительных дисульфидных связей в некоторые белки методами белковой инженерии показали, что далеко не всегда это приводит к повышению стабильности белка.
В большинстве случаев трудно" судить с достаточной определенностью, почему для стабилизации некоторых белков используются ди- 112.-
сульфидные связи, тогда как другие белки вполне, устойчивы только за счет нековалентных взаимодействий. По-видимому, дисульфидные связи важны для "кинетической11 стабилизации (устойчивости к- внешним факторам) секреторных белков, функционирующих вне более или менее постоянной внутриклеточной среды. Ясно, что дисульфидные связи, часто множественные, особенно важны для стабилизации маленьких белков, в которых не может возникнуть обширной системы нековалентных взаимодействий. Таковы, например, многие ингибиторы протеиназ, в частности панкреатический ингибитор трипсина. Его пептидная цепь, состоящая всего из 54 аминокислотных остатков, так хорошо стабилизирована четырьмя дисульфидными связями, что этот белок, несмотря на малые размеры, сохраняет компактную грушевид- ' ную форму при нагревании до 95 °C.
Впрочем, эти соображения н^ могут рассматриваться как сколько- нибудь жесткие правила, так как нетрудно указать секреторные, а также небольшие белки, не имеющие дисульфидных связей и тем не менее вполне стабильные.*
6.4. ФОРМА, КОМПАКТНОСТЬ И ДИНАМИКА
.'МОЛЕКУЛЫ БЕЛКА
Геометрическая форма глобулярных белков в первом приближении может бкть аппроксимирована эллипсоидом вращения, у которого отношение полуосей, как правило, не превышает 2:1. В то же время поверхность глобулярных белков никак нельзя считать гладкой: она как бы изрыта, содержит впадины, а иногда весьма глубокие щели. Такая изрытость -существенна для функционирования белка. Например, сорбция субстрата в достаточно хорошо сформированной щели в глобуле' фермента переводит реакцию с его участием в совершенно новую среду. Как следствие, субстрат изолируется от воды, дегидратируются его функциональные группы, процесс протекает в среде с диэлектрической постоянной около 4—5, тогда как диэлектрическая постоянная воды составляет 80.■
Внутреннее гидрофобное ядро белков нередко описывали' как "жирную каплю", уподобляя ее структуру гидрофобному ядру мицеллы мыла или другого поверхностно-активного вещества. Хотя такое сравнение неплохо отражает физическую сущность сил, диктующих погружение гидрофобных элементов белка внутрь его глобулы, оно неточно. Боковые цепи гидрофобных аминокислот, образующие внутреннее ядро, не свободны, а достаточно плотно упакованы, приближаясь скорее к кристаллу, чем к жидкой капле. Это особенно справедли-
во для ядра, но свойственно и пространственной структуре белка в целом. ,
Анализ белковых кристаллов показывает, что плотность упаковки - атомов в белковой глобуле, т.е. отношение суммы ван-дер-ваальсовых объемов аминокислотных остатков к объему глобулы, лежит в пределах 0,72—0,77, что1 вполне сравнимо с типичным диапазоном плотности упаковки в кристаллах органических соединений, 0,68—0,80 и выше интервала 0,60—0,65, характерного для органических жидкостей.
Все же и представление о белковой глобуле как о квазикристаллй- ческом образовании также не вполне точно, поскольку для пространственной структуры белка, включая и плотноупакованные ее участки, характерна определенная динаиаика. Система водородных и других нековалентных связей в белке допускает локальные флуктуации, например частичное и обратимое ."расстегивание" а-спиралей или Р- структур. Очевидно, этим объясняется и большая подвижность аминокислотных остатков, расположённых на концах упорядоченных элементов вторичной структуры, по сравнению с "внутренними" остатками, перемещение которых потребовало бы серьезных, нарушений кооперативной системы нековалентных взаимодействий. В сочетании с наличием небольших' пустот все это позволяет молекулам малого размера, например воде, перемещаться внутри пространственной структуры, несмотря на отмеченною плотность ее упаковки. Это делает возможным, в частности, обмен атомов водорода скрытых внутри глобулы "внутренних" пептидных связей с окружающей, белок водой. Известны и функционально важные миграции молекул внутри белка.'
Понятно, что аминокислотные остатки, расположенные на поверхности белка, еще более динамичны. Это особенно справедливо для длин-т ных и, как правило, хорошо гидратированных боковых цепей лизицв- Они нередко оказываются "невидимыми" при рентгецоструктурном анализе, так как образующие их метиленовые группы по мере удаления от а-углеродного атома описывают окружности все большего радиуса. Вследствие этого их электронная плотность оказывается как бы "размазанной", распределенной в довольно большом объеме. При рентгеноструктурном анализе миоглобина боковая цепь остатка.Lys-98, направленная в раствор, прослеживается только до, ^углеродного атома, тогда как в Lys-77, аминогруппа которого фиксирована солевой связью с остатком Glu-18, отчетливо выявляются все атомы углерода и азота. Нередко значительной подвижностью (до 10 А) обладают петли нерегулярной структуры на поверхности белка. В целом поверхностный слой белка характеризуется значительно большей подвижностью, 4ем внутреннее ядро. • .
В то же время многие элементы структуры белков, содержащие 114
Номер аминокислотного остатка
Рис. 6.3. Динамика пептидного скелета в глутатионре- дуктазе
B-Фактор характеризует (в первом приближении) под- вижность аминокислотных остатков (их номера нанесены на оси абсцисс). Первые 17 аминокислот вообще не фиксированы. Пики соответствуют участкам с высокой подвижностью, минимумы - остаткам, вовлеченным в каталитический механизм и потому менее подвижным, в частности Glu-47, Cys-58, Cys-63, Lys-66, Tyr-197, Glu-201, Val-370, His-467
компоненты каталитического центра или иные функционально важные остатки, нередко оказываются менее подвижными, чем наружные петли. Этим, видимо, обеспечивается точность их взаимодействия с субстратами и другими лигандами, что, конечно, не отрицает возможности перемещений с небольшой амплитудой (рис. 6.3).
Разумеется, известны и гораздо более значительные изменения пространственной структуры белка, индуцируемые теми или иными факторами конформационные перестройки, которым принадлежит немалая роль в функционировании белковых модекул. Однако следует учитывать и описанную выше ’’микроскопическую" динамику пространственной структуры белка. Так, проникновение молекулы кислорода к месту его связывания гемом в миоглобине не могло бы произойти за разумные времена, поскольку доступ к этой точке белка закрыт боковыми цепями аминокислот. Лишь их флуктуации позволяют кислороду проникать внутрь миоглобина и выходить наружу, видимо, за счет механизма, близкого к диффузионному (см. гл. 8). Более того, атомные флуктуации могут выполнять роль своего рода ’’смазки" при перемещениях крупных участков структуры, препятствуя их "залипанию", а также помогать "причаливанию", взаимной подгонке поверхностей белковых глобул при образовании ими четвертичной структуры, формировании комплексов ферментов с субстратами и ингибиторами.
В табл. 6.3 обобщены данные о динамике, свойственной молекуле белка.
Таблица 6.3. Основные типы движений в белковой молекуле
Тип движения
Амплитуда, А ■
Время, с
Атомные флуктуации (несогласованные перемещения отдельных атомов, например повороты на 20 - 60° вокруг простых связей пептидного
0,01 - 1
10'15 - IO-11
скелета и боковых групп)
Коллективные (согласованные) перемещения групп атомов (от нескольких до сотен)
0,01 - 5
10"12 - 10-3
Индуцированные внешними факторами (например, связыванием субстрата) изменения конформации
0,5 - 10
IO'9 -103
Заметим, что источником первых двух типов движений могут быть тепловые колебания, тогда как движения третьего типа — крупные перестройки, — как правило, происходят за счет энергии взаимодействия белка с теми или иными лигандами. Необходимо подчеркнуть, что динамика структуры белка не тоЛько отражает физические особенности его организации, но и играет большую роль в его функционировании.
Для изучения динамических возможностей, заложенных в молекулах белка и их отдельных участках, прибегают к методу молекулярнодинамического моделирования. Используя распределение атомов в пространстве, полученное методом рентгеноструктурного • анализа, приписывают атомам небольшие значения скоростей, распределенные случайным образом, и рассчитывают положение атомов и скорости, которые они приобретут через очень короткий интервал времени — порядка 10"15 с. При этом учитывают взаимодействия каждого атома с его соседями, используя мощные ЭВМ. Далее переходят к следующему интервалу времени и т.д. Затем изменяют набор скоростей, как бы переходя к более высокой температуре, тогда как начальное распределение скоростей выбиралось близким тому, которое отвечало бы абсолютному нулю. Постепенное приближение к распределению скоростей, свойственному температуре его реального функционирования, позволяет судить о динамических возможностях структуры в целом и его отдельных фрагментов за времена порядка 10'10 с. 116
6;5. ОСОБЕННОСТИ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗАКАК ГЛАВНОГО ИСТОЧНИКА ИНФОРМАЦИИО ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЕ БЕЛКА
Рентгеноструктурный анализ кристаллов белков является доминирующим методом определения их пространственной структуры. В последнее время развивается также изучение пространственного строения белков в растворах ■ методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР), однако эти исследования, значение которых нельзя переоценить, пока ограничиваются сравнительно небольшими белками.
Не вдаваясь в обсуждение техники рентгеноструктурного анализа, кратко рассмотрим возможные его огр анич ения. Поскольку с помощью рентгеноструктурного анализа изучают строение белковой молекулы в кристалле, важнейший вопрос состоит в том, насколько точно состояние этой молекулы в кристалле отражает ее строение, а значит, и поведение в растворе, которое существенно для ее биологической роли. Казалось бы, взаимодействия между белковыми глобулами, обязательно возникающие при кристаллизации, способны сильно исказить строение белка, что существенно уменьшило бы ценность метода. Однако, как показали многочисленные наблюдения, этого не происходит.
Такое заключение подтверждается, во-первых, тем, что данные о пространственной структуре белков в растворе, полученные методом ЯМР, согласуются с результатами рентгеноструктурного анализа. Во- вторых, в кристаллах некоторых ферментов удалось наблюдать каталитическую активность, что указывает на сохранение в кристалле конформации, присущей нативному белку. Более того, пропитывание кристаллов раствором субстрата (а чаще — его аналога), ставшее стандартным приемом кристаллографии белков, приводит к его связыванию в активном центре. Это опять-таки указывает на сохранение нативной структуры в кристалле. В-третьих, для белков, в кристаллах которых содержатся по-разному ориентированные молекулы, последние, несмотря на различие в контактах с "соседями”, имеют практически идентичные пространственные структуры, если пренебречь некоторыми, обычно небольшими, отличиями в положении функциональных групп на поверхности контакта.
Заметим, что изменение конформации или отбор одной из нескольких конформаций при кристаллизации небольших органических соединений — события не столь уж необычные. Сохранение же конформации при кристаллизации белков обусловлено особенностями строения белковых кристаллов. Последние обязательно содержат большой об^ем воды, буферных солей — растворителя, из которого велась кристалли-
117
зация. Доля растворителя в белковых кристаллах достигает 50 % и ■ более к общему объему. Поэтому белковая молекула в кристалле, хотя . и имеет целый ряд нековалентных контактов с соседними, остается как бы погруженной в ту же среду, где она находилась до кристаллизации. В частности, удается выявить слой из нескольких сотен молекул воды, непосредственно связанных с поверхностью белка и составляющих его гидратную оболочку. Таким образом, в~ силу своеобразия белковых кристаллов их образование не вызывает значительных структурных изменений в белке и метод рентгеноструктурного анализа дает, как правило, картину, правильно отражающую строение белковой молекулы в растворе.
Следует, однако, указать на весьма существенное ограничение, связанное с тем, что динамика белковой структуры в кристалле ограничена контактами с соседними молекулами. Это особенно верно для крупных структурных перестроек, поэтому необходимо иметь в виду известную тенденцию приуменьшать динамические возможности белка, базируясь на результатах рентгеноструктурных исследований.
ДОМЕНЫ В БЕЛКАХ .
Свойственный белкам способ организации пространственной структуры .— формирование гидрофобного ядра и мозаичной поверхности, содержащей как гидрофильные, так и гидрофобные элементы, — на первый взгляд, ограничивает размеры глобулы, поскольку с увеличением ее объема строго гидрофобное ядро будет составлять все меньшую долю. В какой-то мере это так, но ограничение затрагивает лишь размеры данным способом организованной структуры, а не молекулы в целом. Действительно, начиная примерно с молекулярной массы 14 -^ 16 кДа прослеживается тенденция к формированию белковой молекулы из двух (и более) в той или иной степени независимо образованных глобул, каждая из которых имеет свое гидрофобное ядро. Такие глобулы — дожены. — формируются различными отрезками одной и той же полипептадной цепи.'.
Доменами в белках называют области в третичной структуре, которым свойственна определенная автономия структурной организации. Автономия эта подчас столь значительна, что домены могут независимо от других частей белковой молекулы поддерживать и даже формировать пространственную структуру. Во многих случаях удается разделить домены, подвергнув белок ограниченному протеолизу.
В рамках биологической функции данного белка домены нередко, хотя и не всегда, выполняют собственные задачи, и тогда структурная автономия домена дополняется функг^иональной. Например, нуклеотид- 118■ '
Рис. 6.4. Третичная структура одного из доменов протромбинаРис. 6.4. Третичная структура одного из доменов протромбинаПри активации, этот домен - первый "крингл" (остатки 66-144) - обеспечивает связывание протромбина с фосфолипидом. Изломы "ленты1* соответствуют, «-углеродным атомам аминокислотных остатков; заПри активации, этот домен - первый "крингл" (остатки 66-144) - обеспечивает связывание протромбина с фосфолипидом. Изломы "ленты1* соответствуют, «-углеродным атомам аминокислотных остатков; засвязывающий домен дегидрогеназ, имеющий, независимо от койкрет- ной функции того или иного фермента одинаковый способ укладки црлипептидной цепи, ответствен за взаимодействие с одним из субстратов реакции —, коферментом NAD или NADH. Аминоконцевые домены (кринглы) ферментов системы свертывания крови обеспечивают связывание с липидами мембраны и другими белками (рис. 6.4), аминб- концевые домены иммуноглобулинов формируют центр связывания антигена.
Рис. 6.4. Третичная структура одного из доменов протромбина
Рис. 6.4. Третичная структура одного из доменов протромбина
При активации, этот домен - первый "крингл" (остатки 66-144) - обеспечивает связывание протромбина с фосфолипидом. Изломы "ленты1* соответствуют, «-углеродным атомам аминокислотных остатков; за
При активации, этот домен - первый "крингл" (остатки 66-144) - обеспечивает связывание протромбина с фосфолипидом. Изломы "ленты1* соответствуют, «-углеродным атомам аминокислотных остатков; за
' Однако в ряде случаев для доменов нельзя указать отдельной функциональной роли. Например, в структуре протеолитического фермента папаина хорошо различимы два домена, каждый из которых имеет гидрофобное ядро. В N- чернены дисульфидные свя^и. По-вкдимо- концевом домене оно содержит два остатка валина, два — изолейцина, один — лейциНа, в С-концевом — два. остатка валина, два лейцина, пять — изолейцина, два — фенилаланина. Между доменами, соединенными непрерывной пептидной цепйю, устанавливается ряд гидрофобных контактов. Во впадине, разделяющей домены, расположен каталитический центр, причем образующие его функциональные группы размещены в обоих доменах. Быть может, на ранних этапах эволюции папаина домены - и имели . какую-то функциональную автономию, но в современном ферменте она полностью утрачена (рис. 6.5).’4
Чаще всего домены формируются автономным свертыванием последовательно расположенных участков полипептидной цепи, хотя известны случай, когда пространственная структура домена образована двумя далеко отстоящими друг от друга отрезками первичной структуры белка.*•
му, такова жё третичная структура других Принглов" - функционально специализированных доменов в ферментах бцстемы гемостаза (в тромбине их два, в плазминогене - пять)му, такова жё третичная структура других Принглов" - функционально специализированных доменов в ферментах бцстемы гемостаза (в тромбине их два, в плазминогене - пять)Наличйе доменов, видимо, создает структурные предпосылки для большей, чем в рамках единой пространственной структуры, внутренней гибкости, динамики белковых молекул, достигаемой
му, такова жё третичная структура других Принглов" - функционально специализированных доменов в ферментах бцстемы гемостаза (в тромбине их два, в плазминогене - пять)
му, такова жё третичная структура других Принглов" - функционально специализированных доменов в ферментах бцстемы гемостаза (в тромбине их два, в плазминогене - пять)
Рис. 6.5. Домены в структуре протеолитического фермента папайи - папаина-
Прерывистыми линиями намечено направление впадины между двумя домена^ ми, в которой связывается субстрат и размещен каталитический центр. Пептидная цепь завершает построение N-концевого домена к 110-му остатку и начинает формирование С-концевого со 111-го. Взаимодействие между доменами усиливается тем, что участок 1-16 N-концевого домена контактирует с С-концевым доменом, а С-концевой фрагмент последнего (остатки 208’212) - с N-концевыМ - доменом. В каталитический центр входят остаток Cys-25 (в N-концевом домене), His-159 и Asn-175 (оба - в С-концевом домене). Заштрихованными прямоугольниками обозначены дисульфидные связи
смещением доменов относительно друг друга. Зоны, прилегающие к междоменному контакту; представляют собой в первом приближении впадину, опоясывающую белок. Это облегчает размещение участков специфического связывания , белком различных лигандов, дегидратацию последних.
Предполагают, что домены соответствуют раннел^у этапу эволюции пространственной структуры многих белков, образовавшихся из глобул существенно меньшего размера. ’ Например, необычно маленькая протеиназа вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), пептидная цепь которой состоит всего лишь из 99 аминокислотных остатков, по способу свертывания похожа на домены пепсина — протеиназы, действующей по сходному механизму. Поскольку протеиназа ВИЧ активна только как димер, можно думать, что она эволюционно родственна 120 4
какому-то древнему предшественнику доменов пепсина. Интересно, что границы доменов часто соответствуют границам экзонов. Это опять- таки'позволяет предполагать, что они могли выступать как своеобразные блоки в процессе эволюции белков.
Домены составляют подуровень структурной организации белка на пути от вторичной к третичной структуре, и свертывание достаточно крупных белковых глобул при биосинтезе белка проходит, вероятно, через стадию формирования доменов.
ОБРАЗОВАНИЕ ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКАИЗ ЭЛЕМЕНТОВ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
' Укладка элементов вторичной структуры: аг-спиралей, /?-структур- ных отрезков, /^-изгибов — в третичной структуре подчиняется, по- видимому, определенным правилам. "*'■
Упаковг d-спиралей. Для поверхности а-спиралей характерно образование гребней, разделенных впадинами — ’’канавками”. Чаще всего такой гребень образуется боковыми радикалами аминокислот, которые разделены тремя аминокислотными остатками — боковая цепь г-го остатка оказывается в контакте с боковой цепью (г + 4)-го остатка, последняя — с боковой цепью (г + 8)-го остатка и т.д. Реже встречаются гребни, образованные г-, (г + 3)-, (г + 6)-м остатками. Вхождение гребня во впадину соседней а-спирали требует, чтобы угол между осями спиралей был близок соответственно —50° для гребня типа г + 4 или 20° для типа г + 3. Это .обеспечивает достаточно плотный Контакт между боковыми цепями, наблюдаемый в реальных белках. Расстояние между осями контактирующих ct-спиралей составляет Д,8 — 12 А в зависимости от длины- боковых цепей (в среднем 9 А); среднее 11 захождение” боковых цепей друг за друга в контакте 2,3 А. Таким образом, при упаковке о-свиралей в пространственной структуре непосредственно взаимодействуют только концы боковых цепей аминокислотных остатков. .-
Упаковка а-спирали и ^-структуры. /3-Слои в белках часто закручены. Боковые группы ■ аминокислот, входящих в такую структуру, образуют гребни — г-й остаток взаимодействует с (г + 2)-м, тот с (г + + 4)-м и т.д. Во впадину между двумя такими гребнями может укладываться любой из описанных выше гребней ог-спирали. Именно так сформировано около 90% реально наблюдаемых контактов се- спираль — ^-структура, причем направления их осей параллельны.
Упаковка p-листов. Известны два типа взаимодействия /3-листов. Один из них состоит в укладке одного листа поверх'другого с поворо- 121
том на —30е, другой (так называемая ортогональная упаковка) сводится к тому, что, по существу, непрерывный /9-слой перегибается и складывается сам на себя, причем угол между его отрезками приближается к 90°. Иногда такой способ укладки описывают Как барабан или цилиндр. Поверхности /2-складчатых листов, обеспечивающие контакт с другими элементами вторичной структуры, на 60—70% образованы гидрофобными боковыми цепями валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина, ,аланина. Видимо, разветвленные цепи особенно подходят для организации гидрофобных контактов.
ТОПОЛОГИЯ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙ В БЕЖ XИ КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОСТРАНСТВЕННЫХСТРУКТУР
Выше были рассмотрены различные способы установления нековалентных контактов между элементами вторичной :труктуры. Существуют правила, которым подчиняется укладка периодических элементов вторичной структуры в пространственной структуре белков.
Элементы вторичной структуры, образованные соседними участками пептидной цепи, обычно соседствуют и в пространственной структуре. Типичны следующие соединения элементов вторичной структуры: аа — две антипараллельно упакованные аг-спирали; РР — два антипараллельных отрезка /2-структуры; Рар — о-спираль, окруженная двумя отрезками /2-структуры. Такие структуры — единицы свертывания — являются, по существу, первым шагом от вторичной к третичной структуре, на их долю приходится до 2/з белковой глобулы.
Соединения между отрезками периодической вторичной структуры в единицах свертывания типа рхр, где X — ct-спираль или отрезок ^структуры, почти неизменно являются "правыми", т.е. направлены по часовой стрелке, если смотреть по ходу пептидной цепи.
3. Эти соединения не пересекаются и не образуют узлов пептидной цепи..
Физические основы этих правил не вполне ясны. Возможно, сближение в пространственной структуре соседних элементов пептидной цепи объясняется энтропийными факторами.
При всем многообразии пространственных структур белков удается выделить относительно небольшое число типов укладки полипептид-^ ной цепи, причем к одному типу могут принадлежать белки, вовсе не( имеющие эволюционного родства. Очевидно, что ограниченность набора типов пространственной структуры диктуется существованием опре- 122'.
Рис. 6.6, Третичная структура миогемэритрина — белка, представляющего собой пучок четырех а- спиралейРис. 6.6, Третичная структура миогемэритрина — белка, представляющего собой пучок четырех а- спиралейРис. 6.7. Третичная структура суперок- сиддисмутазы—/^-структурного белкаРис. 6.7. Третичная структура суперок- сиддисмутазы—/^-структурного белка
Рис. 6.6, Третичная структура миогемэритрина — белка, представляющего собой пучок четырех а- спиралей
Рис. 6.6, Третичная структура миогемэритрина — белка, представляющего собой пучок четырех а- спиралей
Рис. 6.7. Третичная структура суперок- сиддисмутазы—/^-структурного белка
Рис. 6.7. Третичная структура суперок- сиддисмутазы—/^-структурного белка
Восемь отрезков /2-структуры соединены поворотами или петлями, есть небольшой участок а-спирали. Кружками показано расположение ионов металлов
деленных правил, которые управляют свертыванием полипептидной цепи в компактную глобулу.
Выделены следующие главные типы пространственной структуры:
а-Спиралъ«ые белки, построенные преимущественно из о-спира- лей. Простейший структурный мотив в таких белках — пучок четырех ск-спиралей, оси которых более или менее параллельны. Именно такую структуру имеют миогемэритрин (рис. 6.6), Н-субъединица ферритина. Типично о-спиральными белками являются глобины. '
{3-Белки, образованные преимущественно ^-складчатыми слоями. В большинстве таких белков /3-слои наложены под небольшим углом или ортогональны. Примерами таких белков могут служить пепсин и другие аспартильные протеиназы, супероксиддисмутаза (рис. 6.7), большое семейство белков—переносчиков метаболитов (например, жирных кислот).
а, (3-Белки, в которых а-спирали и отрезки /2-структуры чередуются. Обычно это приводит к формированию центрального ^-складчатого листа, окруженного с обеих сторон а-спиралями, экранирующими его от воды. Этот тип пространственной структуры очень распространен. К нему принадлежат NAD-связывающие домены дегидрогеназ, триозофосфатизомераза (рис. 6.8) и около десятка других белков, структурно близких к этому ферменту. .
Рис. 6.8. Третичная структура трио- зофосфатизомеразы—типичного а/р- белкаРис. 6.8. Третичная структура трио- зофосфатизомеразы—типичного а/р- белкаРис. 6.9. Третичная структура лизоцима — а А- Р~ белкаРис. 6.9. Третичная структура лизоцима — а А- Р~ белкаО-Спиральный и /2-структур- ный домены (последний— в левой верхней части рисунка) отчетливо разделеныО-Спиральный и /2-структур- ный домены (последний— в левой верхней части рисунка) отчетливо разделены
Рис. 6.8. Третичная структура трио- зофосфатизомеразы—типичного а/р- белка
Рис. 6.8. Третичная структура трио- зофосфатизомеразы—типичного а/р- белка
Рис. 6.9. Третичная структура лизоцима — а А- Р~ белка
Рис. 6.9. Третичная структура лизоцима — а А- Р~ белка
О-Спиральный и /2-структур- ный домены (последний— в левой верхней части рисунка) отчетливо разделены
О-Спиральный и /2-структур- ный домены (последний— в левой верхней части рисунка) отчетливо разделены
Характерно чередование восьми отрезков /2-структуры и восьми сь-спиралей, экранирующих /2-слой от воды
(а + Р}-Белки, в которых ан:пирали и отрезки /2-структуры не чередуются, а скорее группируются с себе подобными так, что часть молекулы приобретает пространственную укладку чисто о-спирального типа (тип 1, см. выше), другая — чисто /2-типа (тип 2), нередко с элементами (а//2)-структуры. К этому типу% относится лизоцим куриного яйца (рис, 6.9).
ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ
Сказанное выше справедливо для глобулярных белков, функционирующих в водном окружении, — белков цитозоля и секреторных. Иные закономерности управляют формированием структуры лгелгбранны® белков, точнее, интегральных белков, пронизывающих мембрану. Белки, локализованные на поверхности мембраны, содержат специализированный гидрофобный домен,, выполняющий роль якоря, или иную гидрофобную структуру, например ковалентно связанный липидный фрагмент, в остальном же их пространственное строение определяется обычными для всех белков правилами. Интегральные белки, включе- 124 *
ГОГ
Внеклеточное пространство
tliSVx p
Д/ДДх/х/Ду отмоти) ^99^9? (Сджухр (Зий© ммхЗю Q
ЦитоплазмаД
H00C<)®(s)(d)(n)(^^
Ду«Д
Ж Дд
ДЁ,
уД5Х
'К)
A
Б
Рис. 6.10. Гипотетическая схема ориентации структурных элементов трансмембранного белка—/?2-адренэргического рецептора в мембране:
А— мембрану (заштрихована) пронизывают семь O’-спиральных участков, очень богатых гидрофобными аминокислотами. Петли, показанные в верхней части рисунка, выступают во внеклеточное пространство и участвуют в связывании эффектора, в нижней— направлены в цитозоль и обеспечивают взаимодействие с G-белком, передающим сигнал. Зачернены остатки цистеина;
Б—та же схема, рассматриваемая со стороны внеклеточного пространства; S обоз. начает атомы серы цистеина или цистина. Сплошными линиями показаны внеклеточные участки полипептидной цепи, прерывистой — внутриклеточные
ние которых в мембрану происходит котрансляционно, видимо, вообще не могут удерживать нативную структуру в чисто водном окружении. Они содержат несколько трансмембранных фрагментов, преимущественно образованных отрезками o’-спиралей, содержащих гидрофобные аминокислоты. Последние соединяются внемембранными петлями, направленными как в цитозоль, так и во внешнюю среду (рис. 6.10).
Внешние петли в мембранных белках эукариот, как правило, сильно гликозилированы, что усиливает их гидрофильность. Внутримем- бранные а-спирали могут контактировать друг с другом, образуя пучки; однако внутреннего гидрофобного ядра они не формируют. Отсутствует и фактор, вызывающий его образование, — трансмембранные участки белка контакта с водой не имеют.
Тем большая роль в поддержании единой структуры может принадлежать ван-дер-ваальсовым силам (которые действуют между боковыми цепями аминокислот, образующих онспирали)’ электростатическим взаимодействиям погруженных в неполярную среду ионизованных групп и Диполей, присущих ^-спиралям Э пред елейную роль могут играть и дисульфидные связи, соединяющие трансмембранные а-спирали. Наконец, внемембранные домены,; формируя свою структуру по обычным правилам, могут стабилизировать'целостность третичной структуры этих белков, выполняя роль своеобразных организаторов. Трансмембранными могут быть и участки /2-структуры.
Исследование строения трансмембранных белков, которым принадлежат столь важные; функции, как транспорт молекул внутрь клетки, межклеточные,взаимодействия, образование ионных каналов и передача внешних сигналов в клерку, весьма сложно. В' отдельных случаях удается получить их кристаллы, заменив их естественное окружение — липиды — синтетическим поверхностноактивным веществом. Дальнейшее изучение таких кристаллов идет обычным путем. В более сложных ситуациях прибегают к ограниченному протеолизу, расщепляющему внемембранные участки полипептидной цепи, Химической модификации, направленной на эти же участки. Общую укладку элементов вторичной структуры удается наблюдать, используя электронный микроскоп. •
" _ ., ; 6.10 ДЕНАТУРАЦИЯ.БЕЛКА
Денатурацией называют существенное изменение вторичной и третичной структуры белка, т.е. нарушение, разупорядочение системы нековалентных взаимодействий, не затрагивающее его ковалентной структуры. Денатурация, как правило, сопровождается утратой белком функциональных свойств, его инактивацией. Однако инактивация сама др себе не может служить надежным критерием денатураций. К денатурации не следует относить конформационные переходы в белке г прц которых одна кооперативная система нековалентных взаимодействий перестраивается в другую. Принципиальная разница состоит в том, что в это случае оба состояния упорядочены, тогда как характерным признаком денатурации является именно утрату упфядоченг ности, которая приводит к возрастанию энтропии системы.
Понятие "существенности" изменения пространственной структуры в приведенном выше определении денатурации не поддается количественной, оценке., Чаще всего приходится иметь дело с достаточно резким, скачкообразным переходом от нативного состояния к денатурированному, что диктуется кооперативностью третичной - структуры
. ’• 127
белка. Однако встречаются, по-видимому, и случаи, когда белок претерпевает частичную денатурацию, например вследствие утраты пространственной организации одним из образующих его доменов- или нарушения системы нековалентных взаимодействий в каком-либо участке супервторичной структуры.'
Качественное рассмотрение показывает, Что • денатурация белка может быть вызвана действием ряда факторов. Так, повышение теллпе- ратуры приводит к возрастанию вклада энтропийного фактора, что обусловливает тепловую денатурацию, происходящую, как правило, скачкообразно. Температура денатурации белков весьма различна и существенно зависит от других условий, например многие белки заметно стабилизируются ионами кальция. Некоторые белки отличаются термостабильностью. Это особенно свойственно белкам термофильных организмов, адаптировавшихся к жизни при повышенных температурах. Например, протеолитический фермент секретируемый термофильными бациллами, — термолизин — сохраняет активность до 80 °C.
Денатурации способствует воздействие на белок реагентов, наруша- юи^их нековалентные взаиллодействия, прежде всего систему водородных связей. Как уже отмечалось, стабильность пространственной структуры белка требует образования не менее 90% возможных водородных связей внутри белковой глобулы. Понятно, что разрыв значительной их части вызовет кооперативный переход нативной структуры в денатурированное состояние. Чаще всего для денатурации, белка применяют концентрированные (6—8 М) растворы -ллочевины. Молекула мочевины как бы имитирует пептидную связь и способна выступать и как донор, и как акцептор водородных связей, конкурируя с пептидными группировками и другими функциональными группами белка, образующими в нативной структуре внутримолекулярные водородные ебязи:
н
Н—N—СО—NHz
III
—С—NCH 2C=0.. .H—NCO—NH2
II‘
HO '
H
II
h2n—c—nh2h—n—co-nh2
- Денатурация белка при увеличении содержания мочевины в раствор ре происходит скачком, как правило, в небольшом интервале ее концентрации. Например, денатурация лизоцима наблюдается при переходе от 3,2 к 4,0 М раствору мочевины. Заметим, что • денатурирующее действие высоких крнцентраций мочевины может быть связано и с
нарушением, структуры воды опять-таки за счет образования ею водородных связей с молекулами мочевины. Это должно привести к. резкому ослаблению стабилизирующей роли гидрофобных контактов.
Еще более сильным денатурирующим агентом является солянокислый гуанидин (обычно 6 М раствор)
В этом случае действуют те же факторы, что и при использовании мочевины: конкуренция с пептидными и функциональными группами белка за водородные связи и нарушение структуры воды. В дополнение к ним сказывается и очень высокая ионная сила — гуанидин является очень сильным основанием и практически всегда полностью протонирован, .поэтому в концентрированных его растворах исключаются внутрибелковые электростатические взаимодействия и, следовательно, устраняется еще один из факторов, способных стабилизировать пространственную структуру.
Денатурирующим действием на белки обладают и органические растворители. Они способны устанавливать контакты с гидрофобными амйнокислотными остатками белка, лишая гидрофобное ядро его стабилизирующей роли. Одновременно многие растворители, например спирты, формамид, муравьиная кислота, как бы переключают на себя водородные связи, поддерживающие третичную структуру. С дальнейшим повышением концентрации растворителя может нарушиться и структура воды, что устранит фактор, от которого зависит формирование внутримолекулярных гидрофобных контактов в белковой глобуле.
Денатурирующее действие органических растворителей весьма индивидуально И зависит от природы растворителя, белка, других условий (например, температуры). Учет этих факторов позволяет в ряде случаев избежать денатурации и применять органические растворители при фракционировании белков, их хроматографии, а иногда и проводить реакции с участием ферментов в органических растворителях, В таких случаях, по-видимому, важно, чтобы белок сохранял те
молекулы воды, которые связаны водородными связяйй с функциональными группами на его поверхности, т.е. гидратйую оболочку. Известны и белки, легко переносящие высокие концентраций органических растворителей.
Эффективными денатурирующими агентами ЯвляЮтЬя ионные детергенты, . среди которых особенно частб используют анионный детергент — додецилсулъфат натрия: ■ г ■ ч - б '
L • CH3-(CH2)ii-OS03Na+ •
. Его длинная гидрофобная цепь образует контакты с гидрофобными остатками белка, что при концентрации детергента , около 0,5 мМ приводит к полному развертыванию третичной структуры. Взаимное отталкивание практически всегда отрицательно! заряженных сульфатных групп влечет зр собой вытягивание комплекса додецилсулъфат гт белок в палочковидную структуру, - несущую столь большое число отрицательных зарядов додецилсульфата, что вклад собственных ионных групп белка оказывается, как правило (но не всегда!),, малосущественным. Такой способ денатурации нащел широкое, применение при электрофоретических исследованиях белков в полиакриламидном геле. v ........ л. ,
; Как и при. действии других денатурирующих агентов, развертывание белка в присутствии додецилсульфата происходит скачкообразно. Например,, бактериальная рибонуклеаза — барназа - при 0,65 мМ детергента и 37 °C связывает сразу 14 молекул додецилсульфата на одну молекулу белка," состоящую из 110 аминокислотных остатков. При меньших концентрациях реагента белок сохраняет стабильность и комплекса с детергентом практически не образует. . .
Подвижность отрицательно заряженных комплексов-додецил сульфат — белок в силу примерно .одинаковой плотности заряда (как правило, связывается практически постоянное количество додецилсульт- фата: примерно 0,4 г на 1 г, белка), а также одинаковой (палочковидной) формы комплексов определяется только длиной,-полипецтидной цепи. Это сделало- электрофорез в присутствии додецилсульфата наиболее. распространенным способом определения молекулярной массы полипептидных цепей. Сказанное справедливо, если в белке нет дисульфидных связей, которые не позволят цепц развернуться в линейную структуру. I Ввиду этого денатурацию додецилсульфатом натрия обычно дополняют восстановлением дисульфидных связей меркаптоэтанолом или дитиоэритритом. Иногда обработку детергентом ведут при 100 °C, добавляя в смесь концентрированную мочевину, с тем чтобы обеспечить наиболее полную денатурацию белка.
Денатурация белка может происходить и при экстремальных значениях pH. Так, в сильно кислых растворах полностью протонируются отрицательно заряженные карбоксильные группы остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Это приводит к тому, что на поверхности белка сохраняются, только положительные заряды катионных групп, взаимное отталкивание которых приводит к развертыванию глобулы, одновременно протоны разрывают ряд водородных связей. В щелочных растворах (при pH 11 и выше) утрачивают положительные заряды аминогруппы лизина и приобретают отрицательные — фенольные группы тирозина, что опять-таки ведет к резкому преобладанию отрицательных зарядов и развертыванию глобулы. Этому же способствует и разрыв ряда водородных связей, в том числе Образованных водородом фенольных групп тирозина. Известны, однако, белки, адаптированные, например, к высокой кислотности. Так, пепсин сохраняет свою структуру и активность при pH 1—2. Этому, видимо, благоприятствует почти полное отсутствие катионных групп в этом белке.
Установить полноту денатурации, т.е. полное исчезновение системы нековалентных взаимодействий, свойственных нативной структуре, довольно трудно. Обычно ограничиваются тем, что наблюдают за изменением какого-либо характерного для пространственной структуры белка физического параметра, например дисперсии оптического вращения или спектра флуоресценции, при углублении условий денатурации — повышении концентрации мочевины, росте температуры и т.п. Полагают, что денатурация завершилась, если наблюдаемый параметр достигает некоторого предельного значения, например если спектр флуоресценции перестает изменяться, достигнув формы, характерной для белка, в котором все остатки триптофана и тирозина равно доступны ’ растворителю. Разумеется, это не дает полной гарантии исчезновения верх нековалентных контактов, однако можно надеяться на отсутствие протяженных элементов третичной структуры, сохраняющих кооперативность.
Денатурация белка нередко осложняется повреждением его ковалентной структуры. Так, продолжительное действие мочевины при повышенной температуре может сопровождаться карбамилированием аминогрупп лизина:
-сн2-сн2^н2 + nh2-co-nh2 —► -ch2-oh2-nh-co-nh2 + NH3
ЛизинЛизинГомоцитруллин
Лизин
Лизин
(В действительности реакция, видимо, протекает с участием циано
вой кислоты HNC0, находящейся в равновесии с мочевиной .)
Довольно часто наблюдается гидролиз амидных групп аспарагина и глутамина (дезамидирование), в особенности если в белке есть последовательность Asn—fily. К целому ряду повреждений, в том числе к расщеплению остатков цистина с образованием дегидроаланина, ведет щелочная обработка белков. Все эти факторы следует контролировать, что становится критически важным, если имеется в виду ренатурация белка — перевод денатурированного белка в нативное состояние.
РЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКА
Денатурацию белка в определенных условиях in vitro удается обратить, перейдя от развернутой полипептидной цепи к компактной глобуле, имеющей вполне определенную пространственную структуру. Этот процесс, называемый ренатурацией, моделирует, хотя и не в полной мере, свертывание полипептидной цепи в глобулу в ходе трансляции при биосинтезе белка
Как известно, пространственная структура белка определяется его первичной структурой. Известное соотношение один ген — один белок в сущности эквивалентно утверждению, что генетически детерминированной последовательности аминокислот достаточно для того, чтобы однозначно предопределить ее свертывание в свойственную тому или иному белку третичную структуру. Разумеется, в общем случае такое заключение справедливо лишь для условий, близких к существующим в данной клетке при биосинтезе данного белка, которые могут включать в себя определенный диапазон pH, присутствие некоторых ионов, Например ионов кальция, а также кофакторов, присущих этому белку, например коферментов, гема и т.п.
При соблюдении указанных условий будет достигнуто рассмотренное выше соотношение факторов, от которого зависит стабильность белковой глобулы, т.е. создадутся термодинамические предпосылки формирования нативной структуры — ренатурации белка.
Это положение было подтверждено успешными опытами по ренатурации белков in vitro, проведенными впервые К.Анфинсеном и сотрудниками в 60-х годах, на панкреатической рибонуклеазе и лизоциме, а затем и на ряде других объектов.
Многие белки, в том числе обладающие внутримолекулярными дисульфидными связями, полностью денатурируют в присутствии высоких концентраций . мочевины или солянокислого гуанидина с одновременным расщеплением дисульфидных связей восстанавливающими агентами (меркаптоэтанолом, меркаптоуксус ной кислотой или
дитиоэритритом). Это, естественно, сопровождается их полной инактивацией. ■
- При медленном удалении денатурирующего агента и восстановителя (например, диализом или гель-фильтрацией) происходят формирование нативной структуры, замыкание дисульфидных связей (для чго часто достаточно окисления кислородом воздуха) и полное восстановление активности белка. В специальных опытах была подтверждена правильность образования дисульфидных связей, что свидетельствует, в дополнение к реактивации, о восстановлении нативной структуры. На примере одного из белков — лизоцима — этот вывод был прямо подтвержден методом рентгеноструктурного анализа. Табл. 6.4 иллюстрирует эффективность ренатурации ряда белков.
Таблица 6.4. Ренатурация белков, денатурированных обработкой 8 М мочевиной или б М солянокислым гуанидином с одновременным восстановлением дисульфидных связей
Белок
Молекулярная масса, Да
Число S-S связей
Выход, %
теоретический*
достигнутый
РибоНуклеаза
18 000
4
1
95
Лизоцим
12 000
4
■ 1
50-80
Такаамилаза* *
40 000
4 + SH
0,3
48
Трипсиноген
25 000
4
1
60 '
Пепсиноген
38 000
3
6,7
50
Сывороточный альбумин
65 000 •
17
—
50
' "Теоретический выход рассчитан
в предположении, что
дисульфидные
связи образуются случайно.
**о-Амилаза Aspergil lus oryzae.
Может показаться, что вывод о предопределенности пространственной структуры последовательностью аминокислот, подтверждаемый указанными выше опытами, не вполне строг. Дело в том, что экспериментальное доказательство полноты разрушения всех нековалентных взаимодействий при денатурации белка затруднено, поэтому нельзя исключить сохранения какой-то части ядра нативной структуры. Этот довод опровергается, однако, тем, что целый ряд (правда, небольших) белков удалось получить химическим синтезом их полипептидных цепей из производных аминокислот. Такие пептидные цепи неизменно 133
давали при ренатурации хороший выход активного (и, значит, нативного) белка (см. гл. 2).:
Несмотря на успешное образование нативной структуры, ренатура- ция белков in vitro протекает весьма медленно, что не соответствует высокой скорости свертывания третичной структуры в физиологических условиях. По-видимому, наиболее существенна трудность выбора оптимального, кинетически выгодного пути перехода от развернутой полипептидной цепи к компактной пространственной структуре. Число . всех возможных способов свертывания достаточно длинной полипептидной цепи настолько велико (среди них окажется множество непродуктивных, тупиковых), что переход к правильной структуре простым перебором различных конформаций потребовал бы огромного времени.
Реальное свертывание белка, очевидно, происходит по одноллу, во всяком случае неллногилл путялл, что резко сокращает время формирования нативной структуры. Свертывание полипептидной цепи in vivo по необходимости синхронизировано с ее биосинтезом, что уже открывает возможность выбора определенного пути, так как формирование пространственной структуры может происходить котрансляционно. Более того, при свертывании белка в физиологических условиях может быть существенной та конформация, в которой полипептидная цепь покидает пептидилтрансферазный центр рибосомы, и даже темп образования цепи — есть данные о задержках трансляции на участках ' цепи, являющихся границами между элементами вторичной структуры.
Понятно, что при ренатурации белка in vitro оба указанных фак' тора работать не могут и она (хотя и в этом случае протекает не случайным образом, а по ограниченному числу путей) требует для поиска этих путей гораздо более значительного времени, чем in vivo.
Существование определенного пути свертывания полипептидной цепи, считавшееся до недавнего времени весьма вероятной гипотезой, поддерживает ряд экспериментальных фактов. Так, дисульфидные связи в панкреатическом ингибиторе трипсина и рибонуклеазе замыкаются в определенном порядке, причем не обязательно сразу происходит образование "правильных" связей, т.е. тех, которые существуют в конечной форме — нативном белке. Иногда наблюдается временное образование дисульфидной связи между остатками цистеина, которые, видимо, сближаются в промежуточном соединении. Впоследствии такая дисульфидная связь вступает в реакцию обмена с другими, еще не окисленными остатками цистеина и расщепляется, уступая место связям, характерным для нативной конформации.
Применение метода направленного мутагенеза (белковой инженерии) показало, что наряду с аминокислотным^ остатками, критически • 134
важнйми для формирования устойчивой пространственной структуры белка, ' встречаются и такие, замена- которых иными не сказывается на стабильности белковой глобулы, но серьезно влияет на кинетику свертывания поли- пептидной цепи. Следовательно, эти аминокислотные остатки Важны для возникновения промежуточных структур на пути к нативной, устойчивой глобуле.
Так, при свертывании су-субъединицы трипто- фансинтетазы (рис. 6.11) наблюдается промежуточная ступень, на которой крупный N-концевой домен (содержащий аминокислотные остатки 1—
Рис. 6.11. Третичная структура «-субъединицы триптофансинтетазы •Рис. 6.11. Третичная структура «-субъединицы триптофансинтетазы •Образована, как и триозофосфаТизомераза, чередующимися «-спиралями (цилиндры) и отрезками Д- структуры (стрелки). Маленькими кружками в центре показано место связывания ингибитора. Стрелкой обозначена граница между N- и С-концевыми доменами, в этом районе по остатку Arg-188 происходит гидролиз трипсином, который приводит к разделению доменов. Номера указывают порядок расположения элементов вторичной структурыОбразована, как и триозофосфаТизомераза, чередующимися «-спиралями (цилиндры) и отрезками Д- структуры (стрелки). Маленькими кружками в центре показано место связывания ингибитора. Стрелкой обозначена граница между N- и С-концевыми доменами, в этом районе по остатку Arg-188 происходит гидролиз трипсином, который приводит к разделению доменов. Номера указывают порядок расположения элементов вторичной структуры188 и образованный шестью отрезками параллельной Д-структуры и пятью о-спиралями) уже свернут, тогда кай С-концевой фрагмент (начинающийся со 189-го остатка и формирующий в нативном белке два отрезка Д-структуры и три о-спирали; всего 80 аминокислотных остатков) еще денатурирован, неупорядочен. Заметим, что'в этом белке нет пространственно отграниченных Д9менов — его структура
Рис. 6.11. Третичная структура «-субъединицы триптофансинтетазы •
Рис. 6.11. Третичная структура «-субъединицы триптофансинтетазы •
Образована, как и триозофосфаТизомераза, чередующимися «-спиралями (цилиндры) и отрезками Д- структуры (стрелки). Маленькими кружками в центре показано место связывания ингибитора. Стрелкой обозначена граница между N- и С-концевыми доменами, в этом районе по остатку Arg-188 происходит гидролиз трипсином, который приводит к разделению доменов. Номера указывают порядок расположения элементов вторичной структуры
Образована, как и триозофосфаТизомераза, чередующимися «-спиралями (цилиндры) и отрезками Д- структуры (стрелки). Маленькими кружками в центре показано место связывания ингибитора. Стрелкой обозначена граница между N- и С-концевыми доменами, в этом районе по остатку Arg-188 происходит гидролиз трипсином, который приводит к разделению доменов. Номера указывают порядок расположения элементов вторичной структуры
достаточно компактна, речь идет о доменах как промежуточных формах свертывания «-субъединицы.
бреди мутантов этого фермента были отобраны такие, которые* затрагивают контакты между N- и С-концевым доменами. Phe-22 N- концевого домена, контактирующий с 8-м Д-структурным отрезком в С- кодцевом домене, был заменен на Leu. При этом замедлились скорости денатурации и ренатурации, но не была затронута стабильность белка. Очевидно, что это обусловлено понижением стабильности переходного состояния при свертывании. Замена Gly-234 в С-концевом домене на аспарагиновую кислоту замедлила развертывание в большей мере, чем свертывание. Поскольку первый и восьмой Д-структурные отрезки, в которые включены соответственно фенилаланин и глицин, 135
сближены в третичной структуре свернутой субъединицы, их взаимное "причаливание" играет, по-видимому, важную роль в формировании промежуточного продукта свертывания, ускоряя процесс рена- турации. ’
Исследование кинетики ренатурации ряда белков позволяет в первом приближении так описать этот процесс. Сначала быстро образуются короткие отрезки вторичной, структуры — «-спирали, /Элисты, Д-изгибы. Понятно, что каждый такой участок сам по себе, до образования компактной глобулы, недостаточно стабилен, поэтому соответствующие элементы вторичной структуры то возникают, то распадаются, "мерцают” (рис. 6.12).
Рис. 6.12. Конформационные состояния фрагмента ,69-87, соответствующего С-к^нцевой «-спирали миогемэритрина (по данным ЯМР):
а - набор неустойчивых конформаций, которые пептид принимает в воде; б - преимущественная. конформация пептида в менее полярной среде (смесь вода - три- фторэтанол), при которой С-концевая часть образует «-спираль; в - конформация пептида в компактной структуре миогемэритрина - «-спираль охватывает всю последовательность; цифрами обозначены номера остатков в пептиде а и б и соответствующем фрагменте миогемэритрина (в)
-■ Затем такие участки относительно организованной структуры, составляющие в совокупности фрагмент полипептидной цепи из 50—150 аминокислот (будущий домен белка), как бы "схлопываются” за счет нековалентных взаимодействий. При этом образуется так называемая расплавленная глобула, которая в целом близка к нативной пространственной структуре и отличается от нее меньшей компактностью и < иным размещением боковых цепей аминокислотных остатков. Далее происходит уточнение структуры на уровне доменов, после чего устанавливается контакт между последними. Этими относительно медленно. протекающими стадиями завершается формирование белковой глобулы, и она приобретает активность.
В свете обсужденных данных о ренатурации белков гп vitro очевидно, что свертывание белка, предопределенное его первичной структурой, может быть во многих случаях воспроизведено с достаточно хорошим выходом. Помимо рассмотренных выше кинетических ограничений следует учитывать и то, что in vivo пространственная структура в норме формируется каждой вновь синтезируемой молекулой в отдельности, без накопления развернутых, денатурйрованных структур.
Роль последнего фактора стала особенно очевидной при сверхсинтезе чужеродных белков в, микробных клетках. В таких системах нередко наблюдается накопление внутри клеток-продуцентов так называемых тел включения, которые представляют собой агрегаты денатурированных пептидных цепей. Если белок содержит дисульфидные связи, в таком агрегате они образуются беспорядочно, во многих случаях межмолекулярно. Возникновение агрегатов можно объяснить тем, что при интенсивно протекающем сверхсинтезе одновременно на многих рибосомах образуются лишенные структуры пептидные цепи, появление которых значительно опережает процесс свертывания. Как следствие, молекула не успевает "перебрать” промежуточные конформации и найти путь свертывания. Вместо этого она агрегирует с сосед- , ними, также еще не свернутыми полипептидными цепями.
Как правило, отделение тел включения от других компонентов клетки проходит без затруднений, что облегчает их очистку. Однако в дальнейшем возникает непростая проблема ренатурации полученного белка, для которой во многих случаях так и не удается отыскать удовлетворительное решение. Обычный прием состоит в том, что агре- ' тированный белок сначала переводят в раствор и добиваются полного разрушения агрегатов, применяя концентрированные мочевину или солянокислый гуанидин в присутствии соединений, восстанавливающих дисульфидные связи (например, меркаптоэтанола). Затем прибегают к более или менее плавному удалению денатурирующего реагента и восстановителя, создавая условия постепенной ренатурации белка,
‘ '137
причем поддерживают низкую концентрацию последнего. Для образования дисульфидных связей применяют мягко действующую окислительно-восстановительную систему, например смесь 10 мМ окисленного и 1 мМ восстановленного глутатиона. В ряде случаев такой прием дает хорошие результаты: так, практически количественно проходит ренатурация интерлейкина-2, полипептидная цепь которого состоит из 133 аминокислот и содержит одну дисульфидную связь и один “непарный'1 остаток цистеина.
Ренатурация мембранных белков представляет собой отдельную задачу. Трансмембранный белок — бактериородопсин — после его экстракции из мембраны и хроматографической очистки в смеси органических растворителей удалось рёНатурировать, поместив в смесь фосфолипида и поверхностно-активного соединения. Очевидно, что и в этом случае самосборка белка в присутствии липида приводит от денатурированной молекулы к структуре, свернутой так же, как нативный белок.
Таким образом, ренатурация белка принципиально возможна и во многих случаях практически осуществима, однако ряд препятствий, преимущественно кинетических, может серьезно-затруднить, а иногда полностью остановить этот процесс. Необходимо подчеркнуть, что способность полипептидной цепи белка самопроизвольно образовывать пространственную структуру еще не означает, что в реальных условиях биосинтеза этот процесс протекает без участия внешних факторов, в том числе ряда белков, выступающих как катализаторы свертывания полипептидной цепи.
Одной из причин замедленного формирования пространственной структуры белка in vivo могла быть задержка в образовании дисульфидных связей. Существует так называемый перегруппировывающий фермент — протеиндисулъфидизомераза, — ускоряющий перебор возможных дисульфидных связей и тем самым поиск правильно образованных. В его присутствии ренатурация протекает гораздо быстрее. Так, 70%-ная ренатурация панкреатической рибонуклеазы при действии этого фермента, выделенного из печени, происходит уже за 30 мин, тогда ^ак спонтанная реактивация за это время так мала, что еще не обнаруживается.
Протеиндисульфидизомераза в эукариотических клетках содержится в эндоплазматическом ретикулуме и является димерным белком, каждая из субъединиц которого содержит два домена, структурно близких тиоредоксину, небольшому белку, участвующему в окислительно-восстановительных процессах. Каждый из, этих доменов, видимо, и содержит каталитический центр, в котором имеется группировка из двух остатков цистеина (восстановленная форма), способных рас- 138
щеплять дисульфидную связь в белке-субстрате, образуя за этот счет собственную дисульфидную связь (окисленная форма). В свою Очередь, окисленная форма протеин дисульфидизомеразы, реагируя со свободными SH-группами цистеина в субстрате, вызывает образование в этом белке дисульфидной связи, чем и обусловлен быстрый перебор в нем всех возможных дисульфидных мостиков:
Видимо, такую же роль может играть и сам тиоредоксин, причем in vivo катализируемый этими ферментами дисульфидный обмен сочетается с образованием все большего числа дисульфидных связей в белке-субстрате за счет действия системы восстановленный глутатион ~ окисленный глутатион по схеме
SHS
Белок^ 4- GSSG —► Белок^ I 4- 2 GSH^SH•
ОкисленныйВосстановленный
глутатионглутатион
В ряде случаев медленной стадией, лимитирующей скорость рена- турации белка, оказывается у«с,тра7<с-изолдеризауия отдельных пептидных связей, прежде всего образованных иминогруппой пролина. Как уже отмечалось при обсуждении вторичной структуры (см. гл. 5), разница в энергии таких цис- и транс-пептидных связей невелика, поэтому переход одного изомера в другой при денатурации белка вполне вероятен. Обратный переход из цис-формы, как правило, неблагоприятной для свертывания, в транс-форму — ту, в которой и существует подавляющее большинство пептидных связей в белке, также требует определенной энергии активации. Ввиду этого молекула, еще не завершившая образование пространственной структуры, вынуждена как бы "дожидаться" благоприятной изомеризации пептидной связи пролина.i .
Существует весьма распространенный фермент — пролггл-цис^транс- изомераза (в эукариотических клетках это уикло^плпк, способный специфически связывать антибиотик — иммунодепрессант циклоспорин). Он катализирует цис,транс-изомеризацию пептидных связей пролина и тем ускоряет свертывание цепи в компактную структуру.
Заметим, что два упомянутые фермента, катализирующие ренатура- цию белка, все же далеко не обеспечивают тех скоростей свертывания полипептидной цепи, которые соответствовали бы скорости трансляции. Установлено, что при формировании пространственной структуры белка in vivo полипептидная цепь не предоставлена сама себе, а взаимодействует с целым рядом специализированных белков, получивших название шаперонов, функция которых — обеспечить быстрое нахождение Правильной пространственной структуры.
Известен ряд семейств шаперонов,' которых особенно много среди так называемых белков теплового шока. Последние названы так, потому что они синтезируются клерками в больших количествах в ответ на воздействия, неблагоприятные для эффективного свертывания третичной структуры белков, в частности на повышение температуры. Однако они образуются и действуют и в нормальных условиях.
Одно из семейств шаперонов составляют так называемые стресс- белки 70 эукариотических клеток, имеющие молекулярную массу около 70 кДа. Они образуют комплексы с еще не завершившими свертывание полипептидными цепями, предотвращая их взаимодействие между собой и нежелательную агрегацию. Эти белки состоят из двух взаимодействующих между собой доменов. Один из доменов образует комплекс с участками развернутой полипептидной цепи, другой — связывает АТР и способен расщеплять его, являясь медленно действующей АТРазой. При гидролизе АТР белок переходит в другое конформационное состояние и его комплекс с полипептидной цепью распадается.
Полипептидные цепи белков, которые подлежат транспорту из цитоплазмы, за счет образования комплексов со стресс-белками 70 удерживаются в развернутом, наиболее приспособленном для переноса через мембрану состоянии. Продолжительность жизни таких комплексов задается, по-видимому, временем, требующимся для внутримолекулярного гидролиза АТР, связанного стресс-белками 70 (ср. гл. 12). Пока не ясно, катализируют ли эти белки непосредственно само образование вторичной или третичной структуры. Не исключено, что их роль ограничивается предотвращением нежелательных для этого процесса межмолекулярных взаимодействий, агрегации еще не свернутых полипептидных цепей.
140 - • ' ' •
Еще одну группу широко распространенных белков, вовлеченных в формирование третичной структуры, составляют так называемые шапе- ронины — белки, кодируемые генами GroEL и GroES у E.coli. Белки GroEL образованы субъединицами с молекулярной массой около 60 кДа, которые формируют своеобразную" четвертичную структуру, построенную из двух лежащих одно на другом колец по семь субъединиц в каждом. Предполагают, что частично свернутая полипептидная цепь располагается на поверхности такого кольца. Отдельные ее участки, связанные субъединицами шаперонина с различной прочностью, могут высвобождаться из комплекса и формировать свойственную им вторичную структуру, не встречая помех со стороны соседних участков или других полипептидных цепей, удерживаемых в связанном состоянии. В таких условиях формирование регулярных элементов вторичной структуры происходит как бы поочередно. По завершении этого процесса комплекс распадается, что зависит, как и в рассмотренном выше случае, от расщепления АТР, связанного GroEL-белком. Белки GroES с молекулярной массой 10 кДа ассоциируют с белком GroEL и каким-то образом регулируют его АТРазную активность и, значит, время жизни комплекса.
О СООТНОШЕНИИ МЕЖДУ ПЕРВИЧНОЙИ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРАМИБЕЛКА
Положение о том, что последовательность аминокислотных остатков полипептидной цепи белка несет о себе всю информацию, необходимую и достаточную для формирования однозначной пространственной структуры, относится к числу фундаментальных принципов моле-, кулярной биологии. Границы приложимости этого принципа и некоторые особенности его реализации требуют комментариев.
Прежде всего этот принцип еще не означает, что любая случайно заданная последовательность аминокислот обязательно даст устойчивую компактную структуру — ведь богатый экспериментальный материал, который обобщен в этом положении, относится к эволюционно отобранным первичным структурам, а не к случайным последовательностям аминокислотных остатков. Пока, видимо, трудно дать решение этой проблемы в общем виде, она все еще остается дискуссионной. Распространено мнение, что однозначное соотношение между последовательностью аминокислот и пространственной структурой является уникальным свойством относительно небольшой доли всех возможных первичных структур — именно тех, которые были отобраны в ходе эволюции белков.
■ Согласно иной точке зрения, круг последовательностей, способных к свертыванию в компактную глобулу, гораздо шире. Очевидно лишь, что такил! свойством обладает, далеко не любая последовательность аминокислот. Так, фрагмент 1—126 нуклеазы стафилококков (белка, содержащего 149 аминокислотных остатков ,в пептидной цепи) не образует сколько-нибудь устойчивой пространственной структуры, хотя по размеру он вполне сравним с множеством небольших белков. Панкреатическая рибонуклеаза (содержит 124 аминокислотных остатка в полипептидной цепи) после отщепления четырех остатков с карбоксильного конца утрачивает способность к ренатурации. По-видимому, не является компактным, хотя и содержит элементы вторичной структуры, ^казеин. Известно немало мутантов природных белков, в которых одна аминокислотная замена полностью дестабилизирует структуру. Следовательно, существуют полипептидные цепи, не способные в обычных условиях свернуться в компактную однозначную пространственную структуру.
Однако тенденция к образованию более или менее компактной, пусть еще несовершенной пространственной .структуры присуща, по- видимому, достаточно широкому набору последовательностей аминокислот.
В то же время нет полной уверенности, что данной последовательности аминокислот обязательно соответствует одна и только одна пространственная структура, единственный минимум свободной энергии. Иными словами, вопрос сводится к возможности существования двух (или более) альтернативных пространственных структур для одной и той же последовательности аминокислот. В большинстве изученных случаев ренатурация приводит к. восстановлению нативной структуры белка; имеются лишь указания на возможность образования третичной, структуры, отличающейся от нативной, при ренатурации яичного альбумина. Если последний факт и верен, то он выглядит исключением.
Учитывая' это, следует полагать, что для полипептидных цепей существующих в природе белков соответствие первичная структура — пространственная структура в подавляющем большинстве случаев, действительно, однозначно. Это, разумеется, не означает, что тот или иной белок не может под воздействием внешних факторов, например образования комплекса с каким-либо лигандом, принимать различные конформации. Такая ситуация вполне реальна, более того, типична. Обсуждается иное — возможно ли, чтобы в одинаковых условиях белок мог образовывать две пространственно различные формы.
Необходимо иметь в виду и еще одну особенность соотношения между первичной и третичной структурами белка. Если данной после- 142 .
дов&^ельности аминокислот отвечает, как правило, единственный способ свертывания з пространстве, единственная третичная структура белка, то обратное потрясение невернр. Данному способу свертывания полипептидной цепи соответствует, как показывает опыт, не одна, а целое семейство последовательностей аминокислот. Иными словами, справедливо соотношение , - -
• . ■•: '•"bi . . -
с , Семейство первичных структур *— ■ —» Пространственная структура
, Очевидно, что должны существовать определенные закономерности, правила, своего рода стереохимический код, управляющий формированием пространственной структуры из данной последовательности аминокислот. Раскрытие. этого кода — важнейшая задача физической химии, бедка, решение которой еще не достигнуто, несмотря на наличие ряда интересных подходов. ,
Тем не менее некоторые особенности стереохимического кода могут быть обсуждены Прежде ^сего °н вырожден, т.е. одной третичной структуре одному способу укладки пептидной цепи отвечает, как уже отмечалось, набор последовательностей аминокислот. Так,. • весьма близкую пространственную структуру имеют глобины — содержащие гем белки, связывающие кислород, в том числе гемоглобины и миоглобины различных, видов животных, легглобин растений и, т.д. Эти пептидные цепи, отличающиеся составом и последовательностью аминокислот, состоят примерно из 140—150 остатков (см- гл. 8).
Поскольку все ори дают прр свертывании однотипную пространственную укладку полипептидной цепи, отличающуюся лишь в деталях, очевидно, что далеко не все аминокислотные остатки в. равной мере ответственны за образование третичной структуры. Такое заключение подтверждается многими экспериментами по направленной замене аминокислотных остатков в отдельных позициях полипептидной цепи методом сайт-специфического мутагенеза. Так, замена остатка Рго-86 в лизоциме фага Т4 на Gly, Ser, Cys, Leu, Asp, Arg и His влекла з^ собой небольшие по величине, хотя, и простирающиеся иногда на 20 А изменения в структуре. Тем не менее, все эти мутантные белки, почти. не отличались от исходного по температурной стабильности и сохраняли в'целом тот же способ укладки полипептидной цепи в пространстве.
, Интересно, что гораздо значительнее изменилась их ферментативная .активность, несмотря на то что точка замены отстоит на 24 А от каталитического центра. Впрочем, нередки и такие случаи, когда замена единственного остатка резко влияет ■ на стабильность белка. Показано, например, что замена в аденилаткиназе EjgoH Ser-87 на Pro снижает содержание о-спиралей с 50 до 39% и делает структуру белка
\ неустойчивой при 40 °C,, что приводит in vivo к глубокому протеоли-тическому расщеплению и полной утрате фермента.i
Можно было бы думать, что существует определенное число аминокислотных остатков, которые решающим образом влияют на образова- ' ние пространственной структуры. Однако число инвариантных остатков, т.е. аминокислот, неизменно занимающих одно и то же положение в полипептидных цепях достаточно многочисленного семейства эволюционно родственных белков, обычно невелико, подчас 20—30% или Значительно меньше. Так, в белках оболочки вирусов растений, близких вирусу мозаики табака, из 158 остатков инвариантны 25 (16%), а в семействе карбоксипептидаз, включающем ферменты животных и некоторых микроорганизмов, примерно из 310 аминокислотных остатков — только 42 (13%). В семействе глобинов инвариантных остатков удивительно мало — всего шесть. Было бы чрезвычайно трудно представить себе, чтобы весь набор элементов вторичной структуры (в глобинах это а-спирали), а также все способы их укладки в третичную структуру могли диктоваться столь малым числом инвариантных аминокислотных остатков даже с учетом довольно крупной инвариантной структуры — гема.-
Таким образом, следует искать какие-то другие общие черты в семействах первичных структур белков. Достаточно устойчивым признаком оказывается распределение по последовательности гидрофобных и гидрофильных" аминокислотных остатков. В особенности важно непременное наличие в определенных позициях гидрофобных аминокислот (инвариантно гидрофобных остатков).
Например, в гемоглобинах млекопитающих 33 позиции в первичной структуре всегда заняты гидрофобными аминокислотами — инвариантно гидрофобны. Столь высокая значимость инвариантных гидрофобных остатков в первом приближении понятна — почти все они необходимы для формирования гидрофобного ядра. Гидрофобные остатки важны для организации контактов между элементами вторичной структуры "при свертывании. Наконец, характерное распределение гидрофобных и" гидрофильных остатков нужно для воспроизведения элементов вторичной структуры.
Разумеется, инвариантными гидрофобными остатками не исчерпываются те характерные черты, которыми определяется формирование пространственной структуры данной последовательностью аминокислот. По-видимому, существенно сохранение последовательностей определенного типа, задающих повороты пептидной цепи. Частб инвариантны остатки глицина, включение которых придает цепи гибкость, снимая многие ограничения на набор углов <ри ф Наконец, инвариантны и те аминокислотные остатки, которые, возможно, не участвуя в 1441.
формировании пространственной структуры, незаменимы для характерной функции белка, например входят в его активный центр.
Удивительно, что в некоторых случаях для образования правильной пространственной структуры не обязательна целостность собственно полипептидной цепи. Так, продукт ограниченного прртеолиза панкреатической рибонуклеазы субтилизином — рибонуклеаза S — содержит один разрыв полипептидной цепи после А1а-20. Пептидный фрагмент 1—20 может быть отделен от остаточного белка (21—124), однако при смешении они вновь формируют активную рибонуклеазу S, третичная структура которой лишь в точке разрыва цепи отличается от строения исходной рибонуклеазы.
Та же панкреатическая рибонуклеаза, в полипептидной цепи которой содержится 124 аминокислотных остатка, после отщепления четырех аминокислот с карбоксильного конца утрачивает способность к свертыванию. Дисульфидные связи при окислении предварительно восстановленного фрагмента 1—120 образуются неправильно, не в том порядке, который свойствен нативному белку. Однако • в присутствии С-концевого пептида 105—124 происходит регенерация структуры и активности фермента. Для нуклеазы стафилококков (149 аминокислотных остатков) показано, что при смешивании фрагментов 1—126 и 49—149 их взаимодополняющие участки, например 1—48 и 49—149, образуют глобулу, а оставшийся лишним фрагмент 49—126 не входит в компактную структуру и может быть отщеплен трипсином, если ренатурированный фермент стабилизирован присутствием аналога субстрата.
.< Ренатурация белка из двух фрагментов, иногда перекрывающихся, может быть, видимо, объяснена тем, что .соответствующие участки первичной структуры способны, каждый сам по себе, образовывать элементы ’’мерцающей” вторичной структуры, которые при взаимодействии фрагментов быстро находят путь к закреплению уже значительно более стабильной пространственной структуры. Разумеется, нельзя считать, что ренатурировать, образуя единую третичную структуру, могут фрагменты, подученные каким угодно способом, — разрыв цепи, должен происходить на разрешенном участке, выбранном так, чтобы фрагменты могли с известной вероятностью автономно формировать элементы вторичной и, возможно, третичной структуры. Ренатурация белка из крупных фрагментов пептидной цепи, видимо, .близка комплементации — восстановлению активности белка при смешивании двух неактивных полипептидных цепей, несущих мутации в разных сайтах.■
Итак, код, определяющий однозначность соотношения между спо- собой укладки полипептидной цепи в пространстве (третичной струк- „ "145
турой) и целым семейством аминокислотных, последовательностей, несомненно, вырожден. Однако меру этой вырожденности не следует переоценивать, поскольку речь идет об устойчивости . важной, ж не исчерпывающей специфику белка характеристики — способа .свертыд^ ния полипептидной цепи в пространстве. Эта устойчивость позволяет, пользуясь одной. и той же третичной структурой, иметь множество пространственных структур, отличающихся распределением,,.,функциональных групп на поверхности белка и, значат» имеющих различные функциональные возможности. Заметим, что однотипность способа пространственной укладкк пептидных цепей, принадлежащих одному семейству, не означает идентичности — возможны отличия в деталях, которые опять-таки могут оказаться функционально значимыми.
Сказанное, иллюстрируют данные по мутантам хорошо изученного белка — лизоцима. У птиц отряда Gallifonnes в структуре лизоцимов яичного белка содержится неподалеку от активного центра кластер, который образован одним из двух наборов аминокислотных остатков:
Thr-40 ... Пе-55 ... Ser-91 ' или , ,
Ser-40 ... Val-55 ... Thr-91 , я
В этих позициях другие аминокислотные остатки не встречаются, более того, неизвестны и природные лизоцимы, которые отвечали бы переходным наборам аминокислотных остатков, например Ser-40, Ile- 55, Ser-91 и т.п. Полученные методом направленного мутагенеза все возможные переходные формы оказались качественно, весьма похожими на оба исходные варианта, в частности обнаруживали, близкую удельную активность. Рентгеноструктурный анализ показал, itc структура белковой глобулы достаточно пластична и может адаптировать небольшие изменения в строении боковых цепей. Так, при замене Ser-91 на Thr дополнительная метильная группа треонина частью заполняет имевшуюся в структуре "пустоту”, частью использует пространство, высвобождающееся после вызванного этой заменой поворота зоновой группы 11е-55 вокруг связи CQ~ С^. Вместе с тем такие обобщенные характеристики* устойчивости белковой глобулы, как' температура тепловой денатурации или температурная стабильность активности, у переходных форм, как правило, не оказываются промежуточными, а выходят за пределы этих же характеристик у исходных ферментов. Tai&iM образом, не вызывая драматических изменений в свойствах, замены аминокислот в указанных позициях не безразличны для’функ- 146
циональных свойств фермента, и не могут рассматриваться как вполне ’’нейтральные”.
Меру вырожденности Стереохимического кода, связывающего пер-, винную и третичную структуру белка, позволяют оценить опыты М.Пташне и сотрудников. Методами белковой инженерии был проведен обмен о-спиралями, узнающими ДНК, между двумя белками-репрессорами: сто и 434. Ниже сравниваются фрагменты, кодирующие гомологичные а-спиральные участки в этих белках:
сто Gin Gin Ser Не Glu Gin Leu Glu Asn Gly Lys*** ***
434 Gin Gin Ser He Gin Leu I le Glu Ala Gly Vai(звездочками отмечены идентичные остатки)
Замена указанного участка в репрессоре 434 на последовательность с го-репрессор а дала устойчивый гибридный белок — репрессор*, функционально похожий на сго-репрессор. Таким образом, вполне удалась пересадка большого фрагмента — «-спирали — в структурно родственный, но далеко не идентичный белок, где эта «-спираль смогла, очевидно, установить нековалентные взаимодействия с оставшейся структурой репрессора 434. Этот результат хорошо подтверждает вырожденность соотношения между третичной и первичной структурами. Однако, казалось бы, симметричная операция — пересадка «-спирального фрагмента репрессора 434 в сго-репрессор — привела к нестабильному белку, не способному существовать в клетке. Выяснилось, что остаток лейцина, имеющийся в «-спирали cro-белка, мешает установлению ее контакта с остаточной структурой белка 434. Лишь после замены одного этого остатка на свойственный репрессору 434 изолейцин структура гибридного белка стабилизировалась, и он получил возможность существовать и функционировать. Эти данные, не отрицая вырожденности стереохимического кода, указывают на ее существенные ограничения.•
. Несмотря на то что код, определяющий соотношение между первичной и третичной структурами белка, не расшифрован, делаются попытки предсказания пространственной структуры белка по известной первичной структуре, а также решения обратной задачи — подбора такой последовательности аминокислот, которая обеспечивала бы формирование третичной структуры заданного типа. Такое решение получено пока для относительно простых структур. Удалось сконструировать аминокислотные последовательности, не существующие в
природе и не являющиеся близкими аналогами природных, которые тем не менее способны формировать компактную пространственную структуру заранее заданного типа. Иными словами, сделаны первые шаги к синтезу белков de -novo.
Один из таких белков представляет собой пучок из четырех а- спиралей, соединенных петлями. По такому же Типу образована пространственная структура природных миогемэритрина и цитохрома с'. Последовательность а-спиральных участков этого белка такова: Gly—Glu—Leu—Glu—Glu—Leu—Leu—-Lys—Lys—Leu—Lys—Glu—Leu—-Leu—Lys— Gly, а соединяющих их петель —Pro—Arg—Arg—. Распределение же участков вторичной структуры в пептидной цепи следующее: Met-cy- спираль—петля—а-спираль—петля—о-спираль—петля—а-спираль—СООН.
Этот белок, ген которого был синтезирован и клонирован в бактериальных клетках, удалось выделить. Показано, что он достаточно устойчив, например для его развертывания при комнатной температуре требуется 7М раствор солянокислого гуанидина.
Другой белок, полученный de novo, также представляют собой пучок о-спиралей, образованных последовательностями, содержащими только серин и лейцин. Он способен встраиваться в мембраны и формировать каналы, проводящие катионы через фосфолипидную бислойную мембрану. Таким образом, удалось создать заново структуру, обладающую хотя бы несложной функцией. Описан и синтезирован de novo /Структурный белок. Делаются попытки создания ферментов de novo.
. ГЛАВА 7
ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА
Четвертичной структурой называют размещение в пространстве взаимодействующих между собой субъединиц, образованных отдельными полипептидными цепями белка. .
В формировании четвертичной структуры участвуют не пептидные цепи сами по себе, а глобулы, образованные каждой из этихцепей в отдельности. Таким образом, понятие четвертичной структуры относится к ансамблю глобул. Взаимодействие между последними достаточно сильно, так что ансамбль выступает как единая молекула, в то же время каждая из объединившихся глобул — субъединиц — сохраняет значительную автономию, как правило, выраженную гораздо ярче, чем автономия домена в рамках третичной структуры.
Известны, однако, случаи, когда два или несколько полипептидов составляют единую глобулу. Как правило, это является следствием 148 ' /
ограниченного протеолиза — локального расщепления на отдельные отрезки первоначально целостной полийептидной цепи, образовавшей глобулу по обычным правилам формирования третичной структуры. Такие белки, естественно, не следует относить к числу имеющих четвертичную структуру. '
Примером может служить инсулин. Его мономер построен из двух пептидных цепей А и В, содержащих соответственно 21 и 30 аминокислотных остатков. Однако эти цепи образуют единую структуру, получающуюся после "вырезания ” соединяющего их пептида С из молекулы проинсулина, поэтому нет оснований считать их субъединицами. Другой пример —. конканавалин А (молекулярная масса 26 кДа). Этот растительный белок относится к лектинам и специфически связывается с углеводными компонентами на поверхности клеток. Очищенный конканавалин представляет собой смесь целых и поврежденных протеолизом молекул, причем в последних пептидная цепь расщеплена на два фрагмента с молекулярными массами 20 и 6 кДа. Понятно, что такие поврежденные молекулы по структурной организации не отличаются принципиально от неповрежденных и нет оснований приписывать им четвертичную структуру, несмотря на наличие двух пептидных цепей.■
Следует еще раз подчеркнуть, что речь идет о белках, формирующих единую глобулу. В некоторых белках полипептиднаЯ цепь образует при свертывании несколько глобул (доменов), между которыми устанавливается система нековалентных взаимодействий. Последующее протеолитическое разрезание участков цепи, соединяющих домены между собой, делает их вполне автономными, переводит в ранг субъединиц, формирующих четвертичную структуру.
Иногда в литературе используют термин ’’агрегат” как синоним понятия ’’четвертичная структура”, с чем трудно согласиться, поскольку ■ последнее подразумевает весьма высокий уровень организации — объединение субъединиц в. люлекулу, стабилизированную системой нековалентных взаимодействий. Токио так же нет оснований классифицировать как четвертичную структуру надмолекулярные (например, мультиферментные) комплексы или протяженные структуры, такие, например, как оболочки фагов (рис. 7.1) или белковые кристаллические тела включения в некоторых бациллах, хотя в механизме их образования немало общего с формированием четвертичной структуры.
Четвертичная структура.— последний уровень в организации белковой молекулы, к тому же не обязательный — до половины известных белков ее не имеют. Граница между белками, имеющими четвертичную структуру и лишенными ее, не всегда вполне определенна. Некоторые белки сравнительно легко диссоциируют на субъединицы уже в 149
Рис. 7.1. Расположение белков (F, G, Н), образующих оболочку капсида фага 0*174
Зачерненные пятиугольники соответствуют осям симметрии пятого порядка, треугольники - третьего порядка, "линзы" - второго порядка
обычных условиях. В то же время известно возникновение более или менее стабильных димеров в растворах некоторых белков, которые не классифицируются как обладающие четвертичной структурой: такова, например, панкреатическая рибонуклеаза. Заметим, что поверхности белков, насыщенные функциональными группами и весьма неровные, склонны к образованию хотя бы слабой системы взаимодействий, на чем основана, в частности, кристаллизация белков. Такие взаимодействия следует, по-видимому, рассматривать как своеобразный зародыш, способный послужить в эволюции белка исходной точкой для развития достаточно совершенной четвертичной структуры.
СТЕХИОМЕТРИЯ И ГЕОМЕТРИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙСТРУКТУРЫ
Субъединицы, образующие четвертичную структуру белка, могут быть совершенно различными как по строению, так и по функциональным свойствам. Такие белки относят к гетер олгернылк Они встречаются довольно часто, позволяя объединить в одной структуре несколько взаимосвязанных функций, создать полифункциональную молекулу. К гетеромерам относится, например, протеинкиназа, в кото- 150
рой одна из субъединиц (С -^ каталическая) ответственна за собственно ферментную активность и катализирует перенос фосфата АТР на белок,_ а другая является регуляторной (R). В отсутствие циклического АМР последняя связана с С-субъединицей в комплекс Л—С и ингибирует ее При образовании комплекса с сАМР четвертичная -структура распадается и С-субъединица оказывается способной фосфорилировать белковые субстраты. Ярким примером гетеромерного белка может служить РНК-полимераза.
В хомомериих белках субъединицы одинаковы. С ними сходны и такие, строго говоря, гетеромерные белки, субъединицы которых не одинаковы, но достаточно сходны как по способу свертывания поли- пептидной цепи, так и функционально. ',
Частоты, । с которыми встречаются белки, построенные из Двух, трех, четырех и т.д. субъединиц, весьма различны. Так, для более или менее случайной выборки из примерно 200 белков с молекулярной массой не более 300 кДа оказалось димеров 102, тетрамеров 58, гексамеров 23, тогда как тримеров только 9, пентамеров ни одного, октамеров 3. Таким образом, подавляющая часть белков, имеющих четвертичную структуру, приходится на димеры, тетрамеры и гексамеры, причем последние встречаются у белков с молекулярной массой, большей 100 кДа."
Геометрия симметричных димеров очевидна. То же относится и к тримерам, которые весьма редки, ■ однако встречаются, В частности, они могут играть существенную роль при образовании трансмембранных каналов,.поскольку своего рода пучок из трех субъединиц сам по себе образует внутренний канал. В ■ тетрамериих белках субъединицы могут размещаться в вершинах квадрата, что встречается редко, или же занимать вершины тетраэдра (рис. 7.2). Последний тип четвертичной структуры, в котором каждая субъединица взаимодействует с тремя остальными с различной силой, а молекула в целом оказывается весьма компактной, наблюдается особенно часто. Для гексамериых белков характерна октаэдрическая упаковка гораздо реже встречаются плоские гексагональные структуры. .
Субъединицы; образующие симметричную четвертичную структуру, бывают идентичными, но могут И отличаться, будучи в то же время однотипными, эволюционно родственными белками, которые обладают одинаковым способом свертывания пептидной цепи в пространстве. В этих случаях формирование четвертичной структуры имеет характерные особенности. Если, например, тетрамерный белок образован структурно гомологичными однотипными субъединицами а и Д то в зависимости от степени их отличия возможны две ситуации. В первом случае, когда контакты о—а, Р— о и Р—Р отличаются существенно, образу' 151
Рис. 7.2. Четвертичная структура альдолазы скелетных мышц кроликаРис. 7.2. Четвертичная структура альдолазы скелетных мышц кроликаФермент состоит из четырех одинаковых субъединиц, расположенных в вершинах тетраэдра (две, выделенные жирными линиями, расположены ближе к читателю). Межсуб^- единичные взаимодействия в этом случае обеспечиваются гидрофобными контактами между боковыми радикалами аминокислот, образующих а-спиралиФермент состоит из четырех одинаковых субъединиц, расположенных в вершинах тетраэдра (две, выделенные жирными линиями, расположены ближе к читателю). Межсуб^- единичные взаимодействия в этом случае обеспечиваются гидрофобными контактами между боковыми радикалами аминокислот, образующих а-спиралиется четвертичная структура типа «2^2>. Другие же наборы субъединиц нестабильны и практически не обнаруживаются. Так, в частности, построены молекулы гемоглобинов. Если же межсубъединичные контакты практически равноценны, оказывается возможным образование набора всех ■ возможных . четвертичных структур, т.е. .а4, «зА, а-^ а\Ра и Д, причем доля каждой из этих множественных форм (заметим, что это далеко не единственная причина появления множественных ^форм белков) определяется относительным содержанием субъединиц а и р. .
Рис. 7.2. Четвертичная структура альдолазы скелетных мышц кролика
Рис. 7.2. Четвертичная структура альдолазы скелетных мышц кролика
Фермент состоит из четырех одинаковых субъединиц, расположенных в вершинах тетраэдра (две, выделенные жирными линиями, расположены ближе к читателю). Межсуб^- единичные взаимодействия в этом случае обеспечиваются гидрофобными контактами между боковыми радикалами аминокислот, образующих а-спирали
Фермент состоит из четырех одинаковых субъединиц, расположенных в вершинах тетраэдра (две, выделенные жирными линиями, расположены ближе к читателю). Межсуб^- единичные взаимодействия в этом случае обеспечиваются гидрофобными контактами между боковыми радикалами аминокислот, образующих а-спирали
Типичным примером является дактатде^дрогеназа чело
века, построенная из четырех субъединиц. Последние могут быть двух типов: М- (от англ. Muscle — мышечная) субъединица, преобладающая в гладких мышцах, и Н- (от англ, heart — серДечная) субъединица, преимущественно синтезируемая в сердечной мышце. Для лактат дегидроген азы возможен следующий набор множественных форм: i4, М3Н1, М2Н2, М1Нз, Н4. Заметим, что множественные формы, различия между которыми обусловлены генетически, а не вызваны посттрансляционными модификациями или повреждением белка, принято называть изоформами. Разница в первичной структуре субъединиц отражается на соотношении катионных и анионных групп, что приводит к различиям в заряде изоформ и позволяет легко разделить их методом электрофореза. Такой анализ изоферментного состава лактатдегидрогеназы крови позволяет следить за поступлением
в кровь лактатдегидрогеназы некоторых органов, в частности сердца при развитии соответствующей патологии, Например при. некрозе сердечной мышцы. В последнем случае возрастет содержание изоформ, обогащенных Н-субъединицей. Этот подход нашел применение в медицинской диагностике и биохимической генетике.
। 7.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ СУБЪЕДИНИЦАМИ,СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ ЧЕТВЕРТИЧНУЮ СТРУКТУРУ
Межст/бъединичные контакты, которые определяют существование четвертичной структуры, представляют собой весьма развитую систему нековалентных взаимодействий. Ковалентные дисульфидные связи весьма редко используются для стабилизаций четвертичной структуры (например, они соединяют легкие и тяжелые, цепи в иммуноглобулинах), причем даже в этих случаях они играют подчиненную роль, дополняя нековалентные контакты. ; •
В организации сети межсубъединйчных контактов важная роль принадлежит водородным связям. Очень часто система таких связей соединяет в одну очень протяженную структуру ^-складчатые листы контактирующих субъединиц. Если на поверхность субъединицы выходит крайний отрезок, Д-складчатого листа, то такой же отрезок будет занимать Соответствующее положение в другой субъединице. Поворот последней на 180° позволит сблизить упомянутые отрезки так, что между ними установится характерная для антипараллельной СТРУК" туры система водородных связей. Например, в четвертичной структуре алкогольдегидрогеназы лошади, фермента, катализирующего превращение различных спиртов в .альдегиды, две субъединицы, контактируя, образуют протяженный Складчатый слой, который состоит из 12 пептидных отрезков. В зоне контакта в общей сложности устанавливается 8 водородных связей между С=0- и N-Н-труппами главной цепи:
Субъединица 1
Субъединица 2
Arg-312
c=o
H-N
Gly-316
Тгр-314
0=0-•••••
H-N
Trp-314
Тгр-314
N-H
0=C ‘
Trp-314
Gly-316
N-h......
0=C
Trp-312
Leu-301
N-H......
0=C
Met-303
Leu-301
0=0
H-N
Met-303
Met-303
N-H
0=C
Leu-301
Met-303
0=0
H-N
Leu-301
В дополнение к этой системе могут возникать и отдельные водородные связи между функциональными группами разных субъединиц.
Как ни значима роль водородных связей, сами по себе они не смогли бы обеспечить поддержание достаточно устойчивой четвертичной структуры, особенно в водных растворах. Как и при образовании
третичной структуры, большое значение имеют при этом контакты между гидрофобными группами и целыми гидрофобными участками на поверхности взаимодействующих субъединиц. Уже упоминалось, что 6кол<^ половины гидрофобных аминокислотных остатков локализовано в поверхностном слое белка, поэтому возникновение таких контактов вполне объяснимо. Так, четвертичная структура адкогольдегидрогена- зы кроме водородных связей стабилизируется гидрофобными контактами, в которых со стороны ■ каждой из двух субъединиц участвуют два остатка метионина, один — лейцина, три — изолейцина, два — пролина, один — триптофана, в общей сложности 18 остатков, размещенных на площади 600 А2. Гидрофобные боковые группы этих остатков в изолированной субъединице имели бы термодинамически невыгодные контакты с водой, упорядочивая ее структуру. Поэтому формирование межсубъединичного контакта приводит к возрастанию энтропии системы, и равновесие оказывается сдвинутым в сторону олигомера.
Сочетание системы водородных связей и гидрофобных контактов делает очень прочным связывание субъединиц алкогольдегидрогеназы. Диссоциация четвертичной структуры этого белка достигается только в 8 М мочевине. ” •
Межсубъединичные контакты нередко содержат ионные пары, в которых устанавливаются электростатические взаимодействия между противоположно заряженными функциональными группами субъединиц, например между карбсксилат-ионами остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот и катионными группами боковых цепей лизина или аргинина. При этом вовсе не обязательно образование только ионцых пар — нередко возникают целые системы, кластеры пространственно сближенных разноименных зарядов. Исключение воды из межсубъединичного контакта делает такие взаимодействия г не слишком устойчивые на поверхности белка, весьма значимыми.
Анализ четвертичной структуры нескольких белков показал, что среди аминокислотных остатков, обеспечивающих межсубъединичные контакты, 67% являются неполярными, 20 — полярными, 13% несут заряженные группы.
В целом зона контакта между' субъединицами представляет собой кооперативную систему нековалентных взаимодействий, стабильность которой существенно зависит от внешних условий и, что особенно важно, даже от небольших изменений в пространственной структуре каждой из взаимодействующих субъединиц. Здесь кроется молекуляр^ ный базис одной из наиболее специфичных функций четвертичной структуры — ее способности передавать структурные перестройки одной субъединицы на другие.
Прочность четвертичной структуры может колебаться в широких пределах. Ее иногда измеряют долей поверхности субъединиц, которая участвует в межсубъединичном контакте и оказывается скрытой от воды при формировании структуры.■
Заметим, что стабилизация четвертичной структуры обусловлена качественно теми же нековалентными взаимодействиями, от которых зависит и устойчивость третичной структуры, хотя вклад гидрофобных контактов несколько меньше. Различие носйт скорее количественный характер: как правило, третичная структура значительно прочнее четвертичной, поэтому при воздействии факторов, нарушающих отмеченные связи, четвертичная структура обычно утрачивается первой, диссоциируя на сохранившие нативность субъединицы. Это правило имеет исключения, важно, однако, что относительно меньшая стабильность четвертичной структуры дает большие преимущества при использовании ее изменений как факторов регуляции функциональных свойств белков.
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КОНТАКТОВМЕЖДУ СУБЪЕДИНИЦАМИ
Известно несколько типов организации межсубъединичных взаимодействий, которые характеризуются различной ролью элементов вторичной структуры в формировании контакта. Выше, на, примере аль- когольдегидрогеназы, был подробно рассмотрен довольно часто встречающийся способ, основанный на взаим о действии между собой Р~ структурных отрезков, которые расположены на периферии соседствующих субъединиц. Это приводит к формированию весьма протяженного /^-складчатого слоя. Межсубъединичные контакты могут образовываться и за счет взаимодействия между функциональными группами, которые размещены на поверхности /^-складчатых слоев.
Распространены и другие способы образования четвертичной структуры. Так, в цитоплазматической малатдегидрогеназе димер удерживается в основном нековалентными взаимодействиями внутри пучка шести параллельных а-спиралей — по три из каждой субъединицы. Понятно, что при этом главная роль принадлежит боковым группам аминокислотных остатков, соответственно расположенных в о-спира- лях. В четвертичной структуре некоторых белков, например триозо- фосфатизомеразы, главная роль принадлежит пептидным петлям," участвующим в установлении нековалентных взаимодействий между ' субъединицами.
Особенно характерны белки, которые несут специализированные
155
структуры, позволяющие обратим о устанавливать или расщеплять межсубъединичные контакты, так называемые лейциновые молнии. В таких белках (к ним, в частности, принадлежит целое семейство регуляторов транскрипции) имеется характерная последовательность, в которой каждое седьмое положение занимает остаток гидрофобной аминокислоты, чаще всего лейцина. При образовании этой последовательностью а-спирали разветвленные гидрофобные группы остатков лейцина образуют своеобразный "редкий*1 гребень, будучи разделены двумя оборотами а-спирали. (Напомним, что ее периодичность — 3,6 остатка.) Две такие спирали, принадлежащие разным субъединицам и направленные одинаково, свертываются в двойную суперспираль (ср. разд. 14.3). Последняя стабилизируется гидрофобными контактами между остатками лейцина, выстраивающимися в плотный гребень. Такой процесс действительно напоминает застегивание "молнии".
СПОСОБЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ■ СТРУКТУРЫ
Наибольшую информацию о четвертичной структуре бедка дает метод рентгеноструктурного анализа, однако он применим, как правило, на завершающих этапах исследования. Между тем хотя бы приближенные сведения об этом уровне организации необходимы с самого начала. Соответственно особое значение имеют способы мягкой дис-. социации четвертичной структуры, позволяющие выделить субъединицы или какие-то промежуточные структуры в нативном состоянии. Общего решения такой задачи нет, так как прочность четвертичной структуры может быть весьма различной. Однако представления о характере сил, которые обусловливают стабильность четвертичной структуры, помогают в поиске условий, благоприятствующих диссоциации межсубъединичных контактов..
Так, молекула гемоглобина, образованная из четырех субъединиц и имеющая формулу «2^21 уже в 0,5 М NaCI диссоциирует на димеры по схеме а202 * 2аД что указывает на весьма слабые связи между одноименными субъединицами. В других случаях удается добиться диссоциации четвертичной структуры в присутствии умеренных концентраций мочевины или солянокислого гуанидина — реагентов, вызывающих расщепление межсубъединичных водородных связей, а также гидрофобных контактов. Довольно хорошие результаты дает исчерпывающая модификация аминогрупп лизина ангидридами дикарбоновых кислот, например янтарным ангидридом: 156
./С0~СН2.
—CH2-OH2-NH2 4-0I—► -СНг-СНг^-СО-СНг-СНг-СОО-
^О-СНг
Лизин ЯнтарныйСукциноил-лизин
ангидрид
В результате такой реакции, затрагивающей практически только е- аминные группы остатков лизина, которые в нормальных условиях полностью протонированы и несут положительный заряд, последние заменяются отрицательно заряженными карбоксилат-ионами сукцино- ильных группировок. Происходит резкое изменение поверхностного заряда белковой Глобулы (в данном случае субъединицы). Появление на контактирующих поверхностях субъединиц одноименных отрицательно заряженных групп резко ослабляет взаимодействие между ними и приводит к диссоциации четвертичной структуры. Определение молекулярной массы диссоциированных субъединиц, как и исходного белка, проводят методом седиментационного анализа или чаще гельфильтрацией.
. Впрочем, при первичной характеристике белка обычно прибегают к жесткой денатурации молекулы, разрушению в ней всех нековалентных взаимодействий, что вызывает, естественно, и полную утрату четвертичной структуры. Излюбленный прием состоит в обработке белка анионным детергентом — додецил сульфатом натрия. Как уже отмечалось в разд. 6.10, этот детергент прочно связывается с гидрофобными элементами полипептидной цепи и вызывает ее полное развертывание в палочковидную структуру, заряженную отрицательно, причем количество связавшегося додецилсульфата в расчете на единицу длины полипептидной цепи, а значит, и плотность отрицательного заряда весьма постоянны. Ввиду этого электрофоретическая подвижность таких комплексов зависит только от длины цепи, что дает возможность выяснить, состоит ли изучаемый белок из одного или нескольких видов субъединиц, отличающихся по молекулярной массе. Сравнение же электрофоретических подвижностей субъединиц и набора стандартных белков с известными молекулярными массами позволяет определить и молекулярные массы субъединиц.
Заметим, что проведение электрофореза комплексов бедок — додецилсульфат в свободном растворе невозможно, так как зоны разделяемых компонентов будут перемешиваться из-за неизбежной конвекции. Чтобы снизить этот эффект, электрофорез проводят в гелях полиакриламида, поперечносшитого метилен-бисакриламидом. Полимерная сетка, плотность которой определяется концентрацией взятого для приготовления геля акриламида и сшивающего компонента, соз-
‘'157
Дает препятствия для перемещения к аноду отрицательно заряженных комплексов тем большие, чем больше длина пептидной цепи. Регулируя плотность геля, можно подобрать оптимальные условия для определения той или иной величины молекулярной массы. Точность . метода вполне удовлетворительна для анализа четвертичной структуры.
Для определения cmemojuempmt четвертичной структуры требуется знать, из скольких видов субъединиц построен белок и какова их молекулярная масса. Если при этом известна молекулярная масса нативного белка, можно сделать определенные предположения о его четвертичной структуре. Несколько сложнее обстоит дело при изучении белков, имеющих разные субъединицы одинаковой или очень близкой молекулярной массы. В таких случаях используют определение N-концевых аминокислот или последовательностей, которые могут оказаться характерными для каждой из субъединиц, или же прибегают к поиску способа диссоциации белка на субъединицы, сохранившие третичную структуру, что позволяет разделить их каким-либо из хроматографических методов.
ч 7.5. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ
'СТРУКТУРЫ БЕЛКА
Подробный анализ функциональной роли четвертичной структуры может быть дан только на примере конкретных белков, что выходит за рамки данной главы. Мы остановимся поэтому только на некоторых принципиальных положениях. Нередко утверждалось, что построение крупных белковых молекул из не очень длинных пептидных цепей, образующих четвертичную структуру, позволяет снизить опасность ошибок трансляции. Действительно, даже одна ошибка в биосинтезе , достаточно длинной полипептидной цепи, состоящей, например, из 1000 аминокислотных остатков, может дестабилизировать его структуру и сделать весь синтез бессмысленным. В том случае, если белок - такого же размера был бы построен, например, из четырех субъединиц по 250 аминокислотных остатков каждая, такая же ошибка вызовет потерю только одной субъединицы.
Эти соображения, видимо, несправедливы, поскольку, как выяснилось в последнее время, многие белки синтезируются в виде очень длинных (по нескольку тысяч аминокислотных остатков) предшественников, так называемых полибелков, в дальнейшем нарезаемых на функциональные .глобулы. Следовательно, ошибки трансляции не накладывают серьезных ограничений на размер пептидной цепи, по- 1М '
этому трудно представить, чтобы четвертичная структура развилась кЙк сПосОб ЗапЫты От них.1’ "‘'
“■ Можно предположить, что четвертичная структура способна выполнять Одну Или несколько следующих функций.
" 1. ОбьедяненвЮ нескольких »заимосвязанна функций в единой структуре. Эта особенность- четвертичной структуры лежит в основе пространственной Организации, совмещения' в единой структуре нескольких функционально ■ активных центров, каждый Из которых размещается на отдельной субъединице — такова, например, РНК-полимё- раза. Иногда по сходным Принципам, но гораздо более сложно, организуются очень крупные полиферментные комплексы: -
•2. АрхтектурНа* функция. Четвертичная структура позволяет формировать из сравнительно небольших глобулярных субъединиц прострнсТвенные образования весьма сложной конфигурации, Обеспечивающие специфические функциональные возможности белка. *
Так, ;у ферритина (белок животных) молекула построена из 24 субъединиц, окружающих большую внутреннюю полость. Эта полость предназначена для хранения оксида железа — в ней размещается до 3500 группировок FeO.OH (рис. 7.3). Еще один пример такой же функции — формирование двумя субъединицами небольшого белка утеро- глобина полдсти размером 15x7x8 А, которая служит для связывания стероидного гормона — прогестерона. Субъединицы фермента трипто- фансинтетазы E.coli катализируют две реакции:
' - ' ' а-Реакция— Индол-З-глицерофосфаТ—* Индол 4-... _|_ О-Рлицеральдегид-З-фосфат
обесйечивается «-субъединицей
. :1:О■ >-‘■
о 1 ^-Реакция — L-Серин + Индол —♦ L-Трйптофан + Н2О
•.»:-<,. -П’.1.* г ...-,
— димером ^-субъединиц. Объединение этих субъединиц в четвертичную структуру «2^2 открывает возможность проводить суммарную ъ$-‘ реакцию:*1 :*° ”
L-Серин + Индол-З-глицерофосфат ——► L-Триптофан. +
.+ D-Глицеральдегид-З-фосфат.
Существенно, ■ что продукт первой реакции — индол — служит субстратом второй, которая протекает с участием другого каталитического центра'. Четвертичная структура этого фермента, который можно рассматривать как прообраз полиферментных комплексов, построена так, что субъединицы образуют своего рода туннелЬ. ho которому индол ■■159
IIРис. 7.3. Четвертичная структура ферритинаРис. 7.3. Четвертичная структура ферритинаФерритин - гетерополимерный белок, построенный’ из 24 структурно близких легкой и тяжелой субъединиц. Молекула представляет собой полую сферическую оболочку, пронизанную каналами, через которые внутрь поступают ионы железа. По-видимому, субъединицы в ходе формирования четвертичной структуры последовательно объединяются в димеры, тетрамеры, гексамеры, октамерыФерритин - гетерополимерный белок, построенный’ из 24 структурно близких легкой и тяжелой субъединиц. Молекула представляет собой полую сферическую оболочку, пронизанную каналами, через которые внутрь поступают ионы железа. По-видимому, субъединицы в ходе формирования четвертичной структуры последовательно объединяются в димеры, тетрамеры, гексамеры, октамерыперемещается от одного центра к другому, не переходя в раствор. Этим обеспечивается высокая эффективность суммарного процесса, приводящего к синтезу триптофана. Очевидно, что в рассмотренном случае реализуется и принцип объединения функций в единой структуре..
I
I
Рис. 7.3. Четвертичная структура ферритина
Рис. 7.3. Четвертичная структура ферритина
Ферритин - гетерополимерный белок, построенный’ из 24 структурно близких легкой и тяжелой субъединиц. Молекула представляет собой полую сферическую оболочку, пронизанную каналами, через которые внутрь поступают ионы железа. По-видимому, субъединицы в ходе формирования четвертичной структуры последовательно объединяются в димеры, тетрамеры, гексамеры, октамеры
Ферритин - гетерополимерный белок, построенный’ из 24 структурно близких легкой и тяжелой субъединиц. Молекула представляет собой полую сферическую оболочку, пронизанную каналами, через которые внутрь поступают ионы железа. По-видимому, субъединицы в ходе формирования четвертичной структуры последовательно объединяются в димеры, тетрамеры, гексамеры, октамеры
По-видимому, некоторые белки, которые соединяют в единой структуре две взаимосвязанные функции, могли проходить в своей эволюции стадию формирования четвертичной структуры из двух самостоятельных субъединиц. В дальнейшем , произошло слияние их структурных генов и, следовательно, объединение полипептидных цепей * в одну. В результате, как можно предполагать, субъединицы как бы перешли в ранг доменов в единой молекуле.
Заложенные в четвертичной структуре возможности используются и при создании функциональных центров белков.
Так, активные центры ряда дегидрогеназ формируются аминокислотными остатками, расположенными на разных субъединицах этих ферментов. Это позволяет организовать активный центр, охватывающий субстрат со многюс сторон, изолировать его от воды. Например, в алкогольдегидрогеназе лошади “карман", в котором находится активный центр, образован боковыми цепями аминокислот, принадлежащих двум одинаковым субъединицам. Субъединица 1 дает для этого три остатка лейцина, по два — серина и фенилаланина, по Одному — валина, изолейцина, пролина и треонина. Субъединица 2 — остатки метионина, лейцина и серина.
В триозофосфатизомеразе зона связывания субстрата также образована двумя субъединицами, которые при взаимодействии с фосфатной группой субстрата сближаются, закрывая его от окружающего растворителя, так'что реакция протекает при полном его отсутствии. Центр связывания антигена иммуноглобулином образован аминокислотными остатками, расположенными на двух полипептидных цепях — легкой и тяжелой — иммуноглобулина.
Обеспечение множественных взаимодействий белка с протяженными структурами. За счет образования четвертичной структуры два 160 '.
или несколько функциональных центров белка могут объединяться в одном крупном образовании и устанавливать кооперативное взаимодействие с какими-либо протяженным^ биологическими молекулами. Например, за счет существования четвертичной структуры иммуноглобулины типа С объединяют в одной молекуле два идентичных центра связывания антигена, позволяя 'в-то же время в известных пределах изменять расстояние между ними за счет конформационной гибкости. Кооперативность взаимодействия таких антигенсвязывающих центров с макромолекулярными антигенами, например бактериальными стенка- , ми, делает комплексы антиген—иммуноглобулин гораздо более прочными, чем это наблюдалось бы для мономерного белка.
Не менее важно существование большого семейства ДНК-связыва- ющих белков в виде димеров, содержащих опять-таки два идентичных участка связывания. Такие белки, как следствие, способны прочно связываться с повторяющимися последовательностями в двух цепях двуспиральной ДНК. По такому принципу "построены по крайней мере некоторые белки-репрессоры, в частности сго-репрессор фага Л. Для нескольких семейств белков, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, возможно, по-видимому, образование димеров, из одинаковых (гомодимеры) и разных (гетеродимеры) субъединиц. Понятно, что функциональная роль гомо- и гетеродимеров существенно отличается, так как оказывается различной зона белка, способная связываться с соответствующим участком ДНК. Следовательно,, само образование четвертичной-структуры регулирует функцию таких белков.
Регуляторная функция. Главная функциональная особенность четвертичной структуры, по-видимому, смысл ее существования, состоит в том, что относительно слабые взаимодействия между субъединицами, характер которых существенно зависит от третичной структуры каждой из них, особенно удобны для регуляторных воздействий, управления активностью белков. Ввиду относительной слабости межсубъединичных контактов изменения в третичной структуре какой- либо субъединицы, вызванные ее взаимодействием с субстратом или иным лигандом, -передаются на зону ее контакта с другой субъединицей, изменяя характер этой зоны. Такое изменение приводит к перестройке всей четвертичной структуры и обеспечивает передачу эффекта от одной субъединицы к другим, объединенным в ее рамках (см., например, гл. 8 и 12).
Зона контакта между субъединицами, будучи относительно слабым элементом белковой структуры, легко воспринимает и изменения, происходящие при посттрансляционной модификации белка, например при включении или отщеплении фосфатного остатка (см. гл. 11), что опять-таки используется как регуляторный механизм.
6-56161 '
Рис. 7.4. Четвертичная структура ас- партаткарбамилтрансферазы Е.соИРис. 7.4. Четвертичная структура ас- партаткарбамилтрансферазы Е.соИС1-С6 -' каталитические субъединицы, образующие два тримера С1-СЗ и С4-С6; R1-R2, R3-R4,m R6-R6 - димеры регуляторных субъединиц; eg, ро, дп и al - ■ домены, из которых построены эти субъединицы; стрелками показаны оси сим-С1-С6 -' каталитические субъединицы, образующие два тримера С1-СЗ и С4-С6; R1-R2, R3-R4,m R6-R6 - димеры регуляторных субъединиц; eg, ро, дп и al - ■ домены, из которых построены эти субъединицы; стрелками показаны оси сим-Примером белка, четвертичная - структура которого обеспечивает очень сложную регуляцию, будучи и сама весьма непростой, является аспартаткарбамилтранс- . фераза E.coli (рис. 7.4). В этом ферменте, ключевом в биосинтезе пиримидинов, шесть каталитических субъединиц С объединяются в два тримера, которые в ответ на присоединение субстратов могут' в большей или меньшей степени взаимодействовать между собой; Регуляторные субъединицы 1 образуют три димера, имеющие контакт 6с каталитическими субъединицами* Это позволяет ингибировать фермент СТР (конечным продуктом пути биосинтеза пиримидинов) и активировать его
Рис. 7.4. Четвертичная структура ас- партаткарбамилтрансферазы Е.соИ
Рис. 7.4. Четвертичная структура ас- партаткарбамилтрансферазы Е.соИ
С1-С6 -' каталитические субъединицы, образующие два тримера С1-СЗ и С4-С6; R1-R2, R3-R4,m R6-R6 - димеры регуляторных субъединиц; eg, ро, дп и al - ■ домены, из которых построены эти субъединицы; стрелками показаны оси сим-
С1-С6 -' каталитические субъединицы, образующие два тримера С1-СЗ и С4-С6; R1-R2, R3-R4,m R6-R6 - димеры регуляторных субъединиц; eg, ро, дп и al - ■ домены, из которых построены эти субъединицы; стрелками показаны оси сим-
метрии АТР, видимо, за счет изменения конформации регуляторных субъединиц, которое через перестройку четвертичной структуры передается на каталитические субъединицы. Стехиометрия четвертичной структуры фермента отвечает формуле (Сз)2(<2)з- ' .
ГЛАВА 8
ГЛОБИНЫ .
Глобины — семейство эволюционно родственных бзиков, которые способны обратимо связывать киевsopод и обеспечивают его хранение и транснорт в биологических системах *
Глобины широко распространены в мире животных. Легглобин — белок, содержащийся в клубеньках бобовых растений, — также относится к глобинам. Глобины принадлежат к так называемым сложным белкам и содержат характерный небелковый компонент (простетическую' труппу) — «ёл, представляющий собой комплекс двухвалентного железа и порфирина: *
Гем играет ключевую роль в функционировании глобинов, так как именно к нему, точнее — к включенному в его структуру иону двухвалентного железа, присоединяется молекула кислорода.
Особенность глобинов состои^ в том, что в норме связывание молекулы кислЬрода не вызывает окисления железа до трехвалентного. Функциональный смысл этой особенности понятен — окисление привело бы к расходованию кислорода и сделало бы невозможным его транспорт и хранение. Таким образом, при анализе строения этих белков следует уделить главное внимание способу связывания кислорода и молекулярным механизмам, которые позволяют управлять его присоединением и отщеплением. / м
Существует два главных типа глобинов: миоглобин, содержащийся в мышцах и обеспечивающий хранение кислорода, и гемоглобин—- белок, сосредоточенный в эритроцитах и ответственный за перенос кровью кислорода от легких к тканям. Изучение строения и функциональных черт глобинов, в котором особо важная роль принадлежит рентгеноструктурным исследованиям М.Перутца, Дж.Кендрью и их сотрудников, оказало большое влияние на4формирование современных пред-, ставлений о структуре, функции и эволюции белков.
МИОГЛОБИН
Миоглобин и субъединицы гемоглобина имекут очень близкую третичную структуру, их пеотйдные цепИ свернуты в пространстве сходным образом. Вполне определенное, хотя и заметно меньшее, сходство обнаруживают и их первичны* структуры. В то же время миоглобин лишен четвертичной структуры и его функция ограничивается только хранением кислорода. Гакиь образом, миоглобин — более простой белок, б лее древний, чем гемоглобин. * А
Пептидная цепь миоглобина млекопитающих состоит из 153 аминокислотных остатков. Сравнение первичных структур миоглобинов 24 видов животных показывает, что 82 положения во всех этих белках занимают одни и Те же аминокислоты. Следыгрельно, примерно половина остатков в указанной выборке миоглобинов неизменна, инвариантна, другие же остатки могут заменяться, что, однако, практически. не отражается на укладкё полипептидной цепи, ее третичной структуре. Впрочем, многие из замен не и: меняют существенным образом химической природы данного остатка — гидрофильные аминокислоты заменяются гидрофильными, гидрофобные — гидрофобные 1, т.е. наблюдаются по преимуществу так называемые консервативные замены.
Миоглобин, как и другие глобины, — четко выраженный о-спиралъ- ный белок (рис. 8.1). Его пространственная структура образована восемью о-спиралями, последовательно обозначаемыми буквами от А до И (от аминного к карбоксильному концу цепи). В о-спиралях содержится 75% всех аминокислотных остатков, остальные приходятся на повороты и неупорядоченные концевые остатки пептидной цепи. Неспираль- мые участки обозначают двумя буквами, соответствующими спиралям, между которыми расположен поворот, или спирали и аминному (N) либо карбоксильному (С) концу пептидной цепи. Например, НС соответствует участку между последней спиралью Н и С-концёвой аминокислотой. Для аминокислотных остатков миоглобина принято указывать буквенное обозначение о-спиралй, "в которой данный остаток находится, и Нго порядковый номер в ней; г
Около 30 аминокислотных остатков, точнее — их боковые цепи, образуют внутреннее гидрофобное ядро миоглобина, стабилизирующее его пространственную структуру. Ядро, в котором можно выделить три сегмента, или "кластера", содержит остатки валина, лейцина, изолейцина, фенилаланина и аланина. Упаковка боковых цепей этих аминокислот в кластерах достаточно плотна и в то же время допускает определенную свободу их движения друг относительно друга. В одном из кластеров есть впадина, достаточная, например, для размещения атома1 164
Рис. 8.1. Пространственная структура миоглобина
Показаны только Св-етомы. Между спиралями Е и Г расположен гем (указам стрелкой). Близкую структуру имеют субъединицы гемоглобина
ксенона. Кластеры объединяет в гидрофобное ядро планарная молекула гема, как бы вставленная внутрь структуры миоглобина.
При этом с водой контактирует только ребро молекулы гема, погруженной в белок, как в своего рода корзинку, образованную двумя о- спиралями (Е н F) и выстланную гидрофобными боковыми цепями аминокислот. Гем не имеет ковалентных связей с белком, удерживаясь нековалентными взаимодействиями. Всего насчитывается 80 межатомных контактов между белком и гемом, что обеспечивает достаточно прочное удерживание последнего.
С обеих сторон плоскости гема, “над” и “под" атомом железа, располагаются имидазольные кольца двух остатков tucmuduHa (рис. 8.2). Один из них, занимающий восьмое положение в отпирали F (His F8) и наиболее приближенный к атому железа, называют ррохсижаль- яыж. Атом азота его имидазольного кольца находится в контакте с атомом железа, так что можно думать об образовании между ними ковалентной связи. Другой остаток гистидина, занимающий седьмое 165
Рис. 8.2. Зона присоединения кислорода в миоглобине и субъединицах гемоглобинов • -'
Находящийся в центре порфирина атом-железа (Ее2*) свя- - зан с атомом азота имидазольного кольца проксимального гистидина F8. Молекула кислорода располагается при связывании между группой N-H имидазольного кольца дистального гистидина Е7 и атомом железа под углом к плоскости гема‘'।
положение в о-спирали Е (His Е7), называют дисталып т, так как он относительно удален от атома железа. Между последним и имидазольной группой этого остатка есть,свободное пространство, в котором и размещается связываемая миоглобином молекула кислорода, причем один из ее атомов непосредственно подходит к железу, 'другой — к имидазолу His Е7. Замена, дистального гистидина глицином ухудшает связывание кислорода в 1000 раз. ,
В миоглобине некоторых моллюсков положение Е7 занято не гистидином, а валином, что также приводит к значительному понижению сродства к кислороду. Очевидна, что водородная связь, образуемая имидазольной группой дистального гистидина с кислородом, .способствует связыванию последнего. Таким образом, вокруг двухвалентного железа гема пять координационных мест заняты атомами азота (четыре из них принадлежат порфирину, пятый — His F8), одно — кислородом. I
Пространство, в котором связывается молекула кислорода, не име- 166
ег, однако, постоянного выхода в окружающую миоглобин воду. Предполагают, что боковые группы остатка His Е7 и соседнего с ним Arg CD3 могут занимать несколько разных положений, образуя ‘.воего юда '^двер- цу". Ее открытие позволяет молекуле ясло- рода подойти к гему. Неясно, ’’дожидается". ли кислород случайного открывания -дверцы" в результате тепловых колебаний ■ или как-то его индуцирует. Очевидно, что динамика молекулы миоглобина играет существенную роль в его функции.»'.
Напомним, что в юрмал иых условиях в миоглобине и других глобинах при присо-т единении кислорода окиёления железа кв наблюдается. Судя по модельным опытам,
. „ 6 А А А^,<шрг.и.Рис. 8.3/ Кривые зависимости степени насыщения кислородом миоглобина (I) и гемоглобина (2) в заг- висимости от парциального давления кислорода.. „ 6 А А А^,<шрг.и.Рис. 8.3/ Кривые зависимости степени насыщения кислородом миоглобина (I) и гемоглобина (2) в заг- висимости от парциального давления кислорода.это как-то связано сэто как-то связано спогружением комплекса гем—кислород в гидрофобную среду, каковой является окружение гема в глобинах. Если все же окисление происходит и железо переходит в трехвалентное состояние, то образуется так называемый ферридтохлобшц уже не способный функционировать. Место связывания кислорода в нем занято водой. Заметим, что ту же впадину между атомом железа и дистальным гистидином могут | снимать и другие молекулы. Например, СО связывается с гемом примерно в 200 раз прочнее .кислорода, лишая глобин возможности функционировать.'
. „ 6 А А А^,<шрг.и.
Рис. 8.3/ Кривые зависимости степени насыщения кислородом миоглобина (I) и гемоглобина (2) в заг- висимости от парциального давления кислорода.
. „ 6 А А А^,<шрг.и.
Рис. 8.3/ Кривые зависимости степени насыщения кислородом миоглобина (I) и гемоглобина (2) в заг- висимости от парциального давления кислорода.
это как-то связано с
это как-то связано с
Кислород- легко связывается миоглобином — полное насыщение белка достигается уже при парциальном давлении около 10 мм рт.ст., а 60%-ное — при 1 мм рт.ст. (рис. 8.3). Таким образом, i миоглобин хорошо приспособлен к хранению кислорода в «мышцах, насыщаясь им уже при весьма низких парциальных давлениях, характерных для тканей. Однако он не мог бы обеспечить транспортной функции: насытившись кислородом в легких, он с трудом отдавал бы его в капиллярах. Эту задачу решает родственный миоглобину, но построенный более сложно белок — гемоглобин.
ГЕМОГЛОБИН
Все гемоглобины млекопитающих имеют четвертичную структуру и состоят из четырех субъединиц. Практически всегда это две пары одинаковых субъединиц, так что гемоглобины стехиометрически могут
быть представлены формулами вида «2^2, «212» «2^2 и т.д. Пептидные цепи, соответствующие субъединицам гемоглобинов, .обнаруживают сходство . первичных. структур, «являются, голюлогичнъиии. Так, при сравнении первичных структур а- и /3-цепей гемоглобина А человека, которые состоят соответственно, из 141 и 147 аминокислот, совпадает около половины остатков. Гомология выявляется и при сравнении последовательностей гемоглобинов и миоглобинов, хотя она менее выражена.
В то же время третичная структура, и способ укладывания поли- пептидных цепей в пространстве у миоглобинов и субъединиц гемоглобинов весьма близки, что отражает их, (волюционное родство, проис- . хождение от одного предшественника. Таким образом, субъединицы - гемоглобина построен^ почти так же, как описанная выше молекула миоглобина: о-субъединца образована семью, р —. восемью «-спиралями. Присоединение молекулы кислорода к субъединицам гемоглобина, каждая из которых содержит гем, в первом приближении протекает так же, как и при насыщении миоГобина. .
Главное различие функциональных свойств миоглобина и гемогло- * бина состоит в том, «/то четвертичная структура сообщает молекуле гемоглобина способность регулировать присоединение и отщепление кислорода, придает ей кооперативные свойства, которых лишен мио-" глобин. С учетом этого дальнейшее рассмотрение свойств гемоглобина будет посвящено анализу четвертичной структуры этого белка и ее функциональной роли.
Четвертичная структура гемоглобина
В четвертичной 1 структуре гемоглобина субъединицы образуют тетраэдр, стабилизированный межсубъединичными, контактами — системой нековаленТных связей. Эти контакты, На которые приходится в общей сложности примерно 1/5 всей поверхности четырех субъединиц, весьма различны по числу нековалентных взаимодействий и, следовательно, по прочности (рис. 8.4). Наиболее развит и наиболее устойчив контакт между сь-субъединицей и одной из /Субъединиц — так называемый контакт al — pi. В его образований участвует 34 аминокислотных остатка, ПО атомов сближены в нем на расстояние, меньшее 4 ) Если принять общую площадь межсубъединичных контактов за 100%, тона контакт «1 — /31 и идентичный ему «2 — /32 придется 60%, что отвечает весьма сложной сети по преимуществу гидрофобных взаимодействий и нескольких водородных связей. Контакт той же al-субъединицы с другой /Субъединицей, так называемый контакт al — Р2, выглядит иначе, так как его образуют другие участ-
Рис. 8.4. Модель четвертичной структуры гемоглобина •
Диски, помеченные буквой Н,' - гемы. Видны контакты al /92 и а2 ^1 Показано, что слабый контакт ala2 зависит от взаимодействия N-koh- цевых остатков валина и С-концевых - аргинина
ки поверхности глобул. В его формировании участвует 19 остатков аминокислот, образующих гидрофобные контакты и водородные связи. На его долю (вместе с таким же контактом а8.— /И) приходится 33% общей поверхности межсубъединичных контактов. Как следствие, он значительно слабее контакта al — /91.
Еще слабее контакты между одноименными субъединицами, al — a2 и /91 — /92, которые представлены немногими, зреимущественно ионны ми, взаимодействиями. На них приходится около 7% общей поверхности контакте®, стабилизирующие четвертичную структуру. Таким образом, два Контакта) т.е. al —- $, и а2 — /92, доминируют в структуре молекулы, гемоглобина. В определенных условиях иапрймер в 2М NaCl, гемоглобин диссоциирует на, димеры a — /9, сохраняющиеся благодаря прочному контакту al ■— /91. Практически четвертичная структура гемоглобина как бы образована двумя относительно жестко связанными димерами a — ^ которые удерживаются вместе более слабыми взаимодействиями ^диллер диллеров).
Рис. 8.5.. Поворот и смещение а^диме- ров в четвертичной .структуре гемогло- ■ бина друг относительно друга при переходе белка из дезокси- В оксиформуПоворот составляет примерно 16 , смещение - 0,8 А. Димеры фиксируются в новой позиции за счет изменений контакта аХ^й (ем. рис. 8.9)•взаиморасположение димеров можетРис. 8.5.. Поворот и смещение а^диме- ров в четвертичной .структуре гемогло- ■ бина друг относительно друга при переходе белка из дезокси- В оксиформуПоворот составляет примерно 16 , смещение - 0,8 А. Димеры фиксируются в новой позиции за счет изменений контакта аХ^й (ем. рис. 8.9)•взаиморасположение димеров может
Рис. 8.5.. Поворот и смещение а^диме- ров в четвертичной .структуре гемогло- ■ бина друг относительно друга при переходе белка из дезокси- В оксиформу
Поворот составляет примерно 16 , смещение - 0,8 А. Димеры фиксируются в новой позиции за счет изменений контакта аХ^й (ем. рис. 8.9)•
взаиморасположение димеров может
Рис. 8.5.. Поворот и смещение а^диме- ров в четвертичной .структуре гемогло- ■ бина друг относительно друга при переходе белка из дезокси- В оксиформу
Поворот составляет примерно 16 , смещение - 0,8 А. Димеры фиксируются в новой позиции за счет изменений контакта аХ^й (ем. рис. 8.9)•
взаиморасположение димеров может
В определенных условиях изменяться за счет изменения характера менее прочных контактов al — j92 и особенно al — о2 и /И — 92. Не следует думать, что слабые контакты между субъединицами, не слишком значимые для поддержания целостности молекулы, не важны функционально. Наоборот, именно сочетание слабых и сильных взаимодействий обусловливает кооперативность четвертичной структуры гемоглобине^ что, по-видимому, характерно и для многих других белков, обладающих этим уровнем организации.,
Как показал рентгеноструктурный анализ, четвертичная структура молекулы гемоглобина может находиться в одном из двух состояли*, отличающихся поворотом димеров a — 9 друг относительно друга (рис. 8.5). Одно из них устойчиво, если субъединицы насыщены кислородом и молекула гемоглобина содержит четыре молекулы кислорода, — оксигемоглобин. Другое стабильно, если субъединицы кислорода не содержат, — дезоксигемоглобин. Промежуточные формы неустойчивы, их содержание в любой момент времени невелико. Существованию двух взаимопревращающихся форм четвертичной структуры гемоглобин и обязан кооперативностью связывания и отщеп* ления кислорода, а также рядом других функциональна важных свойств. -
Присоединение кислорода к гемоглобинуж ampoi •» хающие его изменения третичной структуры
Принято следующее, весьма огрубленное, описание цепи событий, • сопровождающих присоединение молекулы кислорода к какой-либо из субъединиц гемоглобина..
Молекула кислорода проникает внутрь субъединицы и размещается между атомом железа гема й имидазольной групйой дистального гистидина, которая, видимо, образует с одним из атомов кислорода 170 'z
водородную связь. Присоединение кислорода изменяет, электронное состояние атома железа, который до этого находился как бы ’’над" плоскостью гема, а теперь смещается на 0,4 — 0,8 А, приближаясь к кислороду и втягиваясь в плоскость Порфиринового кольца (рис. 8.6). Это движение приводит к соответственному смещению имидазола проксимального гистидина, образующего с железом связь, близкую к, ковалентной. Смещение имидазола вызывает далее смещение всего остатка гистидина Hie F8 и всей о-спирали F, в которой этот остаток расположен Понятно, что изменение структуры, начатое небольшим , перемещением атома железа, охватывает немало атомов белка.
Важнык ' последствием такого
Рис. 8.6. Изменения конформации вблизи гема, сопр^вожда- ющке присоединение кислорода к атому железа и переход субъединицы гемоглобина из дезокси-..в оксиформуРис. 8.6. Изменения конформации вблизи гема, сопр^вожда- ющке присоединение кислорода к атому железа и переход субъединицы гемоглобина из дезокси-..в оксиформуАтом железа втягивается .в плоскость порфиринорого кольца, что'вызывает смещение связанного с ним остатка гистидина F8> за которым следуетАтом железа втягивается .в плоскость порфиринорого кольца, что'вызывает смещение связанного с ним остатка гистидина F8> за которым следуетструктурного перехода является то, движение всей спирали Е и поворот что боковая р-оксибензильная группа ^ , ,”.
Рис. 8.6. Изменения конформации вблизи гема, сопр^вожда- ющке присоединение кислорода к атому железа и переход субъединицы гемоглобина из дезокси-..в оксиформу
Рис. 8.6. Изменения конформации вблизи гема, сопр^вожда- ющке присоединение кислорода к атому железа и переход субъединицы гемоглобина из дезокси-..в оксиформу
Атом железа втягивается .в плоскость порфиринорого кольца, что'вызывает смещение связанного с ним остатка гистидина F8> за которым следует
Атом железа втягивается .в плоскость порфиринорого кольца, что'вызывает смещение связанного с ним остатка гистидина F8> за которым следует
остатка тирозина Туг НС2, располагавшаяся в дезоксигемоглобине
между спиралями F и Н, из-за их сближения вынуждена покинуть это
место в структуре и выйти на поверхность молекулы (рис. 8.7). Заметим, что остаток Туг НС2 предшествует С-концевому Arg НСЗ.
Резкое изменение позиции, соседнего тирозина влечет за собой и изменение в расположении этого остатка аргинине, а значит, сразу двух заряженных групп: о-карбоксил ат-иона и. гуанидиниевой группировки, — которыми, он обладает До присоединения кислорода заря- * женные функциональные группы С-концеВого остатка Arg НСЗ одной из а-цепей (al-цепи) участвовали в образовании двух солевых связей. Карбоксилат-ион взаимодействовал с протонированной а-аминбгруп- пой N-концеуого рцтэджа другой л-цепи (®2) обслуживая al —- a2- контакт. Катирииая гуанидогруппа образовывала соль с карбоксил ат- ионом Азр-126 в той же цепи al.. После присоединения кислорода С- концевой аргинин утрачивает обе эти связи и приобретает способность практически свободно вращаться. То же происходит и с С-концевым аргинином цепи а2, так что в оксигемоглобине контакт между одноименными субъединицами al — a2, и без того слабый, становится мало
существенным.
ДезоксифордиДезоксифордиРис. 8.7. Передача эффекта смещения спирали F на С-коицёвой аргининКакова! цепь тирозина Туг НС2 из-за сближения спиралей F и G оказывается "вытолкнутой" из пространства между ними, что приводит в движение С-концевой ' остатбк аргинина (показано пунктиром). Это влечет за собой разрыв со?е<жых мостиков, в которых участвуют концевые остатки аминокислотРис. 8.7. Передача эффекта смещения спирали F на С-коицёвой аргининКакова! цепь тирозина Туг НС2 из-за сближения спиралей F и G оказывается "вытолкнутой" из пространства между ними, что приводит в движение С-концевой ' остатбк аргинина (показано пунктиром). Это влечет за собой разрыв со?е<жых мостиков, в которых участвуют концевые остатки аминокислот
Дезоксифорди
Дезоксифорди
Рис. 8.7. Передача эффекта смещения спирали F на С-коицёвой аргинин
Какова! цепь тирозина Туг НС2 из-за сближения спиралей F и G оказывается "вытолкнутой" из пространства между ними, что приводит в движение С-концевой ' остатбк аргинина (показано пунктиром). Это влечет за собой разрыв со?е<жых мостиков, в которых участвуют концевые остатки аминокислот
Рис. 8.7. Передача эффекта смещения спирали F на С-коицёвой аргинин
Какова! цепь тирозина Туг НС2 из-за сближения спиралей F и G оказывается "вытолкнутой" из пространства между ними, что приводит в движение С-концевой ' остатбк аргинина (показано пунктиром). Это влечет за собой разрыв со?е<жых мостиков, в которых участвуют концевые остатки аминокислот
Рис., 8.8. Схема электростатических взаимодействий (показаны тойкими линиями) в молекуле гемоглобина
Субъединицы условно изображены стрелками, направленными к С-кон- - цам. При присоединении кислорода (оксигенировании) эти связи утра
чиваются
Аналогично, в результате присоединения молекулы кислорода к гему Д-субъединицы (02) происходит конформационная перестройка, ^ начинающаяся со сближения дистального гистидина с железом гема. Ее итогом оказывается разрыв солевых связей С-концевого остатка Hi8-146. Одна из них — между карбоксилат-ионом С-концевого гистидина и протонированной аминогруппой лизина Lyt-40 цепи al, другая — между имидазолий-катионом His-146 и карбоксилатом Asp-94 в той же цепи 02. Это влечет за собой ослабление контакта al — 02 (рис. 8.8). •
Функциональная роль четвертичной структуры гемоглобин»
В общей сложности при переходе от дезоксигемоглобина к полностью оксигенированной, насыщенной кислородом молекуле утрачивается восемь ионных связей как внутри субъединиц, так и между ними, причем затрагиваются относительно слабые контакты al — а2 и 01 — 02. Ослабление последних приводит к релаксации молекулы гемоглобина и даёт возможность ее половинам — a —. 0-димерам — изменить свою ориентацию друг относительно друга. Это смещение достигает 7 А (см. рис. 8.6); при этом наиболее прочный контакт al — 01 практически не затрагивается.
Перемещение димеров a — ^ происходит как бы скачком, так как существует два споооба организации нековалентных взаимодействий на контакте al —.02. Его поверхность можно огрубленно представить в виде ласточкин хвоста (рис. 8.6), причем в одной (дёзокси-, или Т) форме относительное расположение субъединиц стабилизируется, частности водородной связью между ТугС7 al-субЬединицы и карбоксилом AspGl субъединицы 02. При переходе в окси(И)-форму эта связь утрачивается, зато карбоксильная группа AepGl al-субъединицы, оказавшись в стерически благоприятном положении после перемещения димеров друг относительно друга, дает водородную связь с Авп€4 субъединицы 02 Таким образом, контакт al — 02 работает как своеобразный переключатель, способный принимать одно из двух состояний в зависимости от того, присоединился или нет кислород к соответствующим субъединицам. .
Итак, присоединение молекулы кислорода к субъединице гемоглобина вызывает целую последовательность структурных изменений, распространяющихся от гема к периферии глобулы я смещающих ионизованные группы на ее поверхности. Речь идет о типичном для третичной структуры белка явлении — передаче эффекта на значительные расстояния. Если бы такой эффект оставался только в рам*-173
Оксигенироеание
Рис. 8.9, Переход al /% -контакта при оксигенировацри гемоглобина
Контакт, имеющий форму "ласточкина хвоста", при оксигенировании и переходе молекулы из Т- в R- состояние может также находиться в Одном из Двух состояний. Утрата водородной связи Туг С7—Asp G1 между al- и ^2-субъединицами компенсируется установлением связи между Asp G1 и Asn G4
из четырех субъединиц. Более
ках' третичной структуры, ' его вклад был бы ре столь значительным. Однако в гемоглобине он приводит к изменению ионцых взаимодействий в слабом контакте между субъединицами, изменяя его и способствуя кооперативному переходу четвертичной структуры в иное состояние. )
Следовательно, изменения, происшедшие в одной ^з субъединиц при присоединении кислорода, могут быть переданы на остальные субъединицы, которым будет выгодно изменить конформацию так, 1 чтобы их третичная структура соответствовала пере- мировавшейся четвертичной, а значит, стала бы благоприятной для присоединения молекул кислорода. Понятно, что такая перестройка четвертичной структуры, ее переход из свойственной дезоксигемоглобину Т (от англ, tight — стянутый)-формы в характерную для оксигемоглобина релаксированную R ..- (оу. англ. . ге!ахе<1)-форму маловероятны (хотя в какой-то мере и "Возможны), если молекула кислорода присоединилась только к одной того, необходимость , описанных
изменений третичной структуры, противоречащих Т-структуре гемоглобина, препятствует; присоединению первой молекулы кислорода и благоприятствует ее отщеплению.
Следовательно, присоединение первой и в меньшей мере второй молекулы. кислорода будет протекать с трудом. Для него потребуется заметно большее парциальное давление кислорода, чем для насыщения миоглобина, где таких задержек нет. Действительно, этот процесс — начало насыщения гемоглобина кислородом — происходит в альвеолах легких, где парциальное давление кислорода велико.
i Очень важно, что после присоединения двух молекул кислорода к Гемоглобину четвертичная структура с примерно равной вероятностью Сможет оказаться кай в Т-, так и в 1-форме. Последняя способствует присоединению третьей молекулы кислорода, после которого вероятность перехода всей структуры, в том числе и четвертой субъединицы, пока не ’’заряженной” кислородом, в структуру, облегчающую присоединение к ней кислорода,' становится весьма высокой. Это ведет к быстрому завершению процесса насыщения всей тетрамерной молекулы кислородом. Таким образом, присоединение кислорода и гемоглобину, будучи кооперативным процессом, как бы следует принципу ’’отдай имеющему”, что -обеспечивает полноту ’’нагрузки" молекул- перенбсчиков кислородом в лёгких;
В тканях первая молекула кислорода отщепляется с определенными затруднениями, так как это требует изменений в контакте субъединиц, противоречащих свойственной оксигемоглобину четвертичной структуре. Однако эти затруднения преодолеваются благодаря низкому парциальному давлению кислорода, которое делает обратную реакцию маловероятной. Отщепление последующих молекул кислорода облегчается с каждым шагом, что приводит к. полной "разгрузке” транспортной молекулы. Так, кооперативность обеспечивает эффектив- , ный перенос кислорода от легких к тканям. Как полагают физиологи, в отсутствие кооперативных эффектов, например, если бы эритроциты содержали миоглобин Вместо гемоглобина, животные погибали бы, от кислородной недостаточности в тканях.
л 8.2.4. 2,3-Днфосфоглнцерат — эффектор, регулирующий функцию гемоглобина •
Рис. 8.10. Связывание дифосфоглицерата (DPG) с катионными группами ^-субъединиц гемоглобина
Электростатические взаимодействия анионных групп 2,3-дифосфоглицерата с катионными группами дезоцсигемоглобина (заштрихованы) существенно усиливают контакт между субъединицами, прежде всего очень слабый ^1/^контакт. Стабилизация дезоксиформы эквивалентна понижению сродства к кислороду. Сродство может быть повышено у гемоглобинов, способных связывать кислород при низком парциальном давлении, за счет ослабления взаимодействия с эффектором. Так, в гемоглобине ламы связывание ослаблена заменой His-2 на Asn-2, в гемоглобине F (плода), - заменой His-143 на Ser-143, что уменьшает число катионных групп белка, взаимодействующих с анионными группировками эффектора
Стабилизация дезокси формы понижает сродство к кислороду гемоглобина, образовавшего комплекс с 2,3-ди фосфоглицератом. В отсутствие эффектора — 2,3-дифосфоглицерата — гемоглобин А взрослого человека насыщается кислородом на 50% при 12 мм рт.ст., в присутствии же ди фосфоглицерата для 50%-ного насыщения гемоглобина кислородом необходимо уже его парциальное давление, равное 50 мм 176
»т.ст. 2,3-Дифосфоглицерат — соединение, структурно ничего общего ] te имеющее с кислородом и связывающееся участком гемоглобина, , далеким от места присоединения кислорода. Тем не менее оно существенно влияет на взаимодействие кислорода и гемоглобина. Обладающие такой способностью соединения, которым принадлежит большая [роль в регулировании функции белков в организме, получили назва- *ние аллостерических (структурно далеких) эффекторов. Важно отметить, что сама возможность такого воздействия эффектора на структурно удаленный функциональный центр белка основана на способности четвертичной структуры отвечать на относительно слабые воздействия..1
Изменения зоны связывания 2,3-дифосфоглицерата способны значительно влиять на сродство гемоглобина к кислороду. Так, в ^9-цепях гемоглобина южноамериканской ламы, живущей на больших высотах и нуждающейся в адаптации к пониженному парциальному давлению кислорода, остатки His-2 заменены остатками аспарагина, которые не несут катиОнной группы и не могут участвовать в связывании 2,3- дИфосфоглицерата. 'Как следствие, дезоксиформа гемоглобина ламы оказывается менее стабилизированной и сродство к кислороду повышается. 50%-ное насыщение гемоглобина ламы наступает уже при парциальном давлении кислорода, равном 24 мм рт.ст. Функциональный смысл такой замены вполне очевиден, тем более -что у одногорбого верблюда (эволюционного предка ламы), живущего на равнине, место связывания 2,3-дифосфоглицерата представлено семью катионными группами, включая и остатки His-2 ^цепей.
Гемоглобин F плода человека (Детальный) синтезируется только во время беременности и должен обеспечивать перенос кислорода от плаценты, где его парциальное давление составляет всего около 12 мм рт.ст. к тканям плода (по выражению физиологов, "плод дышит на высоте Эвереста”). Понятно, что гемоглобин F должен обладать бдль- шим сродством к кислороду, чем гемоглобин взрослого человека. Это также достигается за счет замены His-143 в ^-цепи гемоглобина F на серин, что ослабляет связывание 2,3-дифосфоглицерата и уменьшает стабилизацию дезоксиформы гемоглобина. '
8.2.5. Участие гемоглобина в транспорте СОг и ионов водорода
. Кооперативные эффекты четвертичной структуры определяют способность гемоглобина выполнять помимо переноса кислорода ряд других транспортных функций, важных для физиологии кровообращения.
Гемоглобин переносит ионы водорода и СО^ направляющиеся в ...177
тканях, к легким. Перенос ионов водорода обусловлен так называемым эффектом Бора. Как уже говорилось,, при насыщении гемоглобина кислородом рвутся, а при его отщеплении — восстанавливаются ионные связи между отдельными функциональными группами. Разрыв или, наоборот, образование ионных связей сказывается на способности функциональных групп связывать протон. Это особенно характерно для сравнительно слабых оснований, рКа которых близок к физиологи-; ческому значению pH. В таком случае уже небольшие изменения рКа существенно влияют на способность группы присоединять и, значит, переносить протон. Такими группами являются о-аминогруппа и имидазольная группа гистидина. Так, в оксигемоглобине имидазольная группа С-концевого His-143 /Уцелей свободна и имеет, по-видимому, нормальный рКа для гистидина, близкий 6. После отщепления кислорода в тканях эта имидазольная группа восстанавливает ионную связь с карбоксилат-анионом остатка Asp-94 той же цепи, т.е. оказывается в поле отрицательного заряда. Понятно, что протон с бблыпим трудом может покинуть имидазолий-катион, если положительный наряд последнего компенсирован сближенной с ним отрицательно заряженной группой.
Таким образом, способность имидазольного кольца С-концевого гистидина к связыванию протона регулируется положением этого кольца в пространственной структуре, его участием или неучастием в ансамбле с карбоксильной группой. Как следствие, дезоксигемоглобин, в котором основность имидазольной группы His-143 возрастает, присоединяет протон и переносит его от тканей к легким, Где при насыщении гемоглобина кислородом и переходе его четвертичной структуры в релаксированную R-форму ион водорода отщепляется.
Перенос С02 гемоглобином обусловлен его способностью присоеди- . пяться к сг-аминогруппам белка с образованием так называемой карбаминовой кислоты — полуамида угольной кислоты:
R01-
IIII -
в=с=о + №2-св-с(нш-... —• -о-чнямн-со-ии-
' Карбаминовая кислота
Эта реакция протекает в тканях с аминогруппами дезоксигемоглобина. Появившиеся отрицательно заряженные остатки карбаминовой кислоты вступают в ионные взаимодействия с катионными группами белка, дополнительно стабилизируя дезоксиформу; В легких при насыщении гемоглобина кислородом протекает обратная реакция, которая ведет к выделению С02.■ ''
178'-
Аномальные гаигоглобинЫ
В ■ популяции человека Господствует нормальный гемоглобин А, 1однако с частотой примерно 1/1000 встречаются аномальные гемоело- /бины — мутантные белки, в которых произошла одиночная замена ! аминокислотного; остатка другим. Такие; замены могут происходить во многих положениях — известно около 200 аномальных гемоглобинов, тогда как о- и ^9-цепь в Сумме содержат 288 аминокислотных остатков. Функциональные последствия замен весьма различны. Многие из них, в особенности происходящие на поверхности и не связанные с радикальным изменением природы аминокислотного остатка, безразличны для функциональных свойств, нейтральны и никак t не выявляются клинически. Известно, однако, немало аномальных гемоглобинов, носители которых в большей или меньшей степени страдают от недостаточности функции гемоглобина. Тяжесть . таких молекулярных болезней различна и обычно снижается за счет присутствия у гетерозигот нормального гемоглобина А. . . ■■" и , 11
Аномальные гемоглобины принято называть по местности, в которой была впервые обнаружена данная мутация. Во многих случаях удается, основываясь ш данных о строении гемоглобин*, объяснять молекулярные механизмы того или иного нарушения ^структурных и функциональных свойств гемоглобина. - г г
В. гемоглобине Вена остаток Тут-130 в /1-цепи заменен аспарагиновой кислотой. Ее карбоксильная группа втягивается в гидрофобное ядро, занимая в нем место фенильногр кольца тирозина, что дестабилизирует молекулу. Носители данной мутации страдают гемолитической анемией. / .• . •
, В гемоглобине ХаммерслАкт замена .РЬе-42 в /1-цепи серином приводит к утрауе весьма важного гидрофобного контакта с^гемом. Более того, в гидрофобное окружение гема вторгается гидрофильная группа, а вслед за ней — вода. В результате дестабилизации гидрофобного, ядра /1-цепь оказывается неустойчивой, легко теряет гем, происходит нежелательное окисление железа.
В гемоглобине Бостон дистальный Eis. Е7 a-цепи заменен тирозином, фенольная группа которого образует ионную связь с ионом железа рема, не оставляя места для связывания молекулы кцелорода. Аналогичная замена дистального гистидина на тирозин в ^епи приводит к образованию аномального гемоглобина Саскатун.
К весьма серьезным последствиям приводят замены аминокислот в зонах контактов между субъединицами. Так, замена Туг-35 в /1-цепи на фенилаланин дезорганизует al — /91-контакт, так что белок- распадается на мономеры.
Как уже отмечалось, нейтральными нередко оказываются мутации , затрагивающие аминокислотные остатки на поверхности мюлекуль. Однако в гемоглобине S1 (серповидно-клеточная анемия) замена • по - верхностного остатка Glu-б в Дщепн валином приводит к образованию дезоксиформой надмолекулярных агрегатов -* протяженных пучков, а затем и кристаллических структур. По-вйдимому," появление гидрофобной аминокислоты в этой позиции недопустимо, так как ее боковая группа находит какую-то контактную площадку в другой части молекулы гемоглобина S, что и вызывает неконтролируемую агрегацию. Следует учитывать, что концентрация гемоглобина в- эритроцитах очень велика и приближается к 35%, поэтому угроза образования агрегатов и , даже осадков весьма реальна. Агрегаты гемоглобина S вызывают искажение формы эритроцитов, нарушая кровообращение в капиллярах. -, • и 1
Есть основания полагать, что мутация, приведшая к образованию гемоглобина S вместо гемоглобина А, произошла в средние века на Аравийском п-ве, откуда распространилась по путям миграции В некоторых тропических районах распространения малярии эта мутация стала закрепляться, поскольку возбудитель малярии плохо адаптируется к существованию в эритроцитах, измененных присутствием агрегатов аномального гемоглобина. Это явление «ожег служить простейшей моделью закрепления мутантных белков в - популяции под давлением отбора. .
- Разумеется, аномальными могут быть не только гемоглобины, но и любые другие белки. 3 частности, описан ряд аномальных альбуминов сыворотки крови человека. -
ГЛАВА 9
■ ХИМИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ БЕЛКОВ
Химическое модифицирование, т.е. проведение химических реакций, изменяющих ковалентную структуру белка, представляет собой бдин из важнейших приёмов, используемых при характеристике функциональных групп белка. Метод долгое время доминировал в изучении структурно-функциональных отношений в белках, однако в последнее время он утратил монопольное положение, уступая во многих отношениях быстро развивающемуся сайт-специфическому мутагенезу. Тем не менее он в полной мере сохраняет значение как способ первичного поиска функционально значимых группировок в белковой молекуле, в особенности таких, которые наделены аномальной реакционной способ- 180
костью (хотя на завершающих стадиях исследования метод сайт-спе- пифического «утагенеза имеет серьезные преимущества). .
Вместе-с тем реакции химического модифицирования лежат в основе создания необратимых ингибиторов ферментов, используются при иммобилизации белков, особенно ферментов и антител, для биотехнологических задач, а также для изучения топографии поверхности белков и их локализации в сложных структурах, например мембранах и других надмолекулярных образованиях.
Реакции химической модификации белков очень многочисленны. Лишь немногие, наиболее представительные из них, будут рассматриваться далее.
М- ОСОБЕННОСТИ МЕТОД/ ХИМИЧЕСКОГОМОДИФИЦИРОВАНИЯ
Обсуждая особенности метода, прежде всего следует подчеркнуть яркую специфичность белков как объектов симического модифициро-. вания. Нередко, приступая к химическому модифицированию, исследователь вынужден исходить из упрощенного представления о белке как носителе определенного набора функциональных групп принадлежащих боковым цепям аминокислотных остатков. При этом химические свойства последних как бы приравниваются к хорошо описанным и достаточно просто предсказываемый свойствам соответствующих групп в низкомолекулярных соединениях,- в частности в пептидах и аминокислотах. Обзор реагентов, применяемых для модификации белков, который будет дан ниже, по существу основан именно на таком упрощении. . . .
ч Не следует, однако, забывать об ограниченности этого подхода. Действительно^ часть функциональных групп, главным образом те, что расположены на поверхности глобулы, окружены водой и не входят в систему контактов с другими группировками белка. С достаточным приближением они могут рассматриваться как аналогичные по реакционной способности таким же группам в- малых молекулах, в частности пептидах. Однако число таких ."канонических" групп не столь уж велико и, главное, не ими определяется химическая специфичность, особенность белковой молекулы.
Можно указать три основные причины радикального изменения химической активности функциональных групп, включенных в макромолекулу белка. *
Часть функциональных групп ■ скрыта внутри • глобулы и, сле-
\
дователъно, недоступна для химических реагентов (до тех пор, пока белок сохраняет нативную структуру). Так, в сравнительно небольшом белке — карбоксипептидазе А — полностью, скрыты, внутри где Зулы один остаток тирозина и два триптофана; 13 остатков тирозина и 6 — триптофана находятся в поверхностном слое и частично доступны растворителю. Только четыре остатка тирозина погружены р окружающую белок воду и могут проявлять такие же химические .свойства, как тирозин в небольших пептидах. Реакции химической модификации, рассчитанные на полное замещение всех доступных групп данного типа, используют для подсчета, и идентификации скрытых (англ, buried) функциональных групп. .
. 2. Многие функционалъные . группи контактируют с. соседними группировками в белке, образуя своеобразные ансамбли. Участие в таких ансамблях способно сильно'. Подчас до полной неузнаваемости, изменить реакционную способность партнере з. Это подтверждается, в частности, тем, что константы диссоциации и соответствующие, им рКа ионогенных групп белка лежат в весьма широких диапазонах, иными словами, кислотно-основные свойства этих групп сильно зависят от их микроокружения. »
Так, в небольших пептидах онкарбоксильные, группы боковых цепей аспарагиновой и глутаминовой кислот имеют, рКа, близкий 4,7, будучи похожими в этом отношении на карбоксил уксусной и других алифатических карбоновых кислот. Во всей совокупности белков, однако, их рКа охватывают огромный интервал: от 1,5 (одна их карбоксильных групп активного центра пепсина) до 7,5 (карбоксильная группа остатка Glu*49 в агсубъединице триптофансинтетазы). Таким образом, в белках карбоксильные группы могут выступать и как весьма сильные кислотные группировки, практически полностью, диссоциированные в физиологическом диапазоне pH, и как очень слабые, диссоциированные едва ли наполовину даже в нейтральной среде, а их константы диссоциации могут изменяться на шесть порядков.
Изменение реакционной способности той или иной функциональной группы может быть вызвано не только ее взаимодействием с какой-то другой группой (например, со второй карбоксильной группой, одна из которых становится сильной, а другая — слабой кислотой), но и локальным изменением полярности микроокружения данной группы. Например, полагают, что погружение ^-карбоксильной группы остатка Glu-35 в гидрофобный участок Лизоцима куриного яйца затрудняет диссоциацию протона, поскольку образующийся при этом анион не может стабилизироваться гидратацией; рКа этой группы близок 6.
Поверхности белковой глобулы далеко не безразлична к реагентам, применяемым при модификации. Даже если эти реагенты не 182 '
содержат специально подобранных структур, способствующих избирательному связыванию в той или иной зоне белка (так называемая аффинная модификация), они с большой вероятностью будут связываться белком за счет взаимодействия с заряженными группами, гидрофобными участками поверхности, донорами или акцепторами водородных связей и т.п. Таким образом, собственно модификации предшествует связывание реагента определенным участком белковой структуры. Это приводит как бы к локальному концентрированию реагента в данной точке белковой молекулы и резко повышает вероятность вступления в реакцию функциональных групп, возможно, случайно соседствующих с участком связывания реагёнта.
. Нетрудно видеть, что отмеченные выше особенности поведения белка в реакциях химической модификации не случайны, а отражают фундаментальные свойства его структурной организации и функционирования. С методической точки зрения это означает, что при трактовке результатов химической модификации нельзя полагаться на сведения о реакционной способности соответствующих групп в модельных соединениях. Строго говоря, в каждом случае после проведения реакции и выделения продукта модификаций (или разделения, если их несколько) необходимо прямыми методами установить, какие имен-, но функциональные группы данного белка подвергались модификации, и определит^, каким аминокислотным остаткам в полипептидной цепи белка они принадлежат. Таким образом, приводимый далее обзор реагентов и их реакций с функциональными группами белка дает лишь общую ориентировку относительно возможностей применения метода химического модифицирования. .
ТИПОВЫЕ РЕАКЦИИ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП БЕЛКА 1
е-Амяногруппы
£-Аминогруппы принадлежат боковым цепям остатков лизина; Они ' располагаются, как правило, на поверхности глобулы, достаточно доступны и обладают химическими свойствами, характерными для алифатических первичных аминов, рКа этих групп обычно близок 10, поэтому реакции с этими группами проводят в слабощелочных средах при pH 8 и выше, т.ё. в условиях, когда они хотя бы частично депрото- нированы и могут выступать в качестве нуклеофильных агентов. Заметим, что о-аминогруппы реагируют сходным образом, однако на их реакционной способности сказывается несколько меньшая основность (рКа около 8).
Ацилирование. Эти группы, легко ацилируются, для чего могут быть использованы многие реагенты, например активированные эфиры кислот:.,
. СН2~С(К..СН2~С0>.
-CH2-NH2 + Ifjv~О—СО—R —♦ -CH2~NH—СО-К + | JH)H
• . СН2~С(ГCH2-rC(K
Е-Амино- N-Оксисукцинильный Ацилированная N-Оксисукци- группа эфир кислоты RCOOH ' Е-аминогруппа нимид
Однако близкие по нуклеофильности фенолят-иони остатков тирозина, как правило, вступают параллельно в ту же реакцию. Для более избирательного блокирования аминогрупп можно воспользоваться гораздо меньшей стабильностью, к гидролизу сложных эфиров, получающихся при ацилировании фенольного гидроксила тирозина. Эта неустойчивость особенно значительна в случае моноэфиров дикар-* боновых кислот, которые образуются при ацилировании гирозина ангидридами, например янтарной или цитраконовой дислот: В этих случаях продукты модификации тирозина настолько нестабильны, что практически не обнаруживаются, так что удается достигнуть специфического ацилирования Е-аминогрупп лизина:
- /СО-С-СНз4.
-ch2-nh2 + of II -♦ -CH2-NH—€0-C-CHs
■\«0-CHII
иоос-сн
Е-Аминогруп- ЦитраконовыйEN-Цитраконил-
па лизина ангидридпроизводное'
В полученном производном картонная в обычных условиях аминогруппа заменена анионным карбоксилат-ионом.. Существенно, что продукты ацилирования аминогрупп лизина ангидридами дикарбоновых кислот вследствие сближенности высвободившейся при реакции карбоксильной группы с вновь образованной амидной связью лабильны и в кислой среде остатки дикарбоновых аминокислот отщепляются, ысвобождая Е-аминогруппы остатков лизина. Такую возможность обратимого блокирования £-аминогрупп лизина используют для того, чтобы проводить гидролиз трипсином модифицированного, например цитраконилированного, белка сначала только по остаткам аргинина, а после разделения получающихся крупных фрагментов и деблокирования €-аминогрупп — по остаткам лизина.'*^
Арилжроваиие. Е-Аминогруппы остатков лизина могут выступать в качестве нуклеофильных агентов в реакциях с ЙД-динитрофторбензо- лом и другими ароматическими активированнымй галоидными соединениями:
е-Амино- 2,4-Динитрофтор- группабензоле-Амино- 2,4-Динитрофтор- группабензол2,4-Динитрофенил- производное2,4-Динитрофенил- производное
е-Амино- 2,4-Динитрофтор- группабензол
е-Амино- 2,4-Динитрофтор- группабензол
2,4-Динитрофенил- производное
2,4-Динитрофенил- производное
В образующемся динитрофенил-производном характерного желтого цвета (Ащах и 350т360 нм) азот аминогруппы полностью утрачивает основные свойства, а" гидрофильная аминогруппа заменяется весьма гидрофобной структурой. '■
Образование оснований Шиффа. Аминогруппы реагируют с альде-, Гидами, взаимодействуя с карбонильной группой в два этапа по следующей схеме:
/: у .
-CHz-NHz + 0=СН-СбН5 —* -CHz-NH-CH-CsHs —♦ -ен2-№=сн-СбН5
е-Амино- Бензаль-'Бензаль-йроиэ-
группа дегид. водное (основа-
ние Шиффа)
Эта реакция избирательна, однако основания Шиффа малоустойчивы и легко, особенно в кислой среде, расщепляются с регенерацией свободных аминогрупп и альдегида.' Учитывая это, прибегают к закреплению образовавшейся структуры путем восстановления двойной связи -~CH=N-- боргидридом натрия NaBH4:
-€Н2“№«Н-^бН5 —B£h -СН2-Ж-<Н2-С6Н5
Превращение в амидины. Модификация Е-аминогрупп лизина указанными реагентами приводит к изменению заряда в данной точке белковой молекулы, а иногда к введению гидрофобного заместителя. Реакция с имидоэфирами отличается тем, что в ее результате катионная аминогруппа завещается также катионной амидиновой — основность которой несколько выше, Чем у аминов: •
г
NH
-ch2-nh~chiе-Амидин-ch2-nh~chiе-Амидин- I
-ch2-nh~chiе-Амидин
-ch2-nh~chiе-Амидин
-CH2-NH2 + CH8O-CHl —►е-Амино- Имидоэфир
группа
Если заместитель R невелик, то такая модификация приведет только к замене аминогруппы на амидиновую — ни заряд, ни гидрофильность при этом заметно не изменятся, что позволит с большей уверенностью интерпретировать результаты модификации. По этим же соображениям бис-имидоэфиры охотно используют для соединения двух белковых молекул друг с другом. При обработке производного белка, модифицированного имидоэфиром по описанной схеме, большим избытком первичного амина, например метиламина, происходит перенос амидиновых групп на этот амин, остатки лизина высвобождаются и белок удается регенерировать.
Фенольные группы тирозина
■ Гидроксильные группы тирозина в белках располагаются частично внутри, частично на поверхности белковой глобулы. В последнем случае для них характерен рКа * 10, соответствующий полупереходу:
-СН2-СЛ“0Н -♦ -ЧШ2-СбН4-0-
Образующийся при этом фенолят-ион весьма активно вступает в реакции, свойственные также и е-аминогруппам дизина, в частности в реакцию ацилирования.^•"
Ацилирование. Эта реакция может проводиться различными реагентами, например ацетилимидазолом:,.
N=CH.
-СН2~СвН4-0НpN-OOCH3 —> -СН2~СбН4~0~СО-СН8
СН=СН
Гораздо характернее для тирозина, однако, реакции замещении в ароматическом ядре, рассматриваемые далее.
Иодированно. Эту реакцию особенно часто применяют как способ введения радиоактивных изотопов иода в белковую молекулу. Источником атомов иода может служить комплекс иода и йодистого калия; в некоторых случаях используют иод, образующийся при окислении 186'
иодид-йона в присутствии фермента пероксидазы. Последний способ делает реакцию боЛее избирательной, так как образование свободного иода происходит там, куда может проникнуть крупная молекула пероксидазы. Иодирование приводит к образованию как моно-, так и дииодтирозина, причем замещение пройсходит в снпсложении: '
ТирозинТирозинМоноиодтирозйнМоноиодтирозйнДииодтирозинДииодтирозин
Тирозин
Тирозин
Моноиодтирозйн
Моноиодтирозйн
Дииодтирозин
Дииодтирозин
частицы обычно выступает нитроний-частицы обычно выступает нитроний-о-Нитротирозин ’о-Нитротирозин ’ТирозинТирозин
частицы обычно выступает нитроний-
частицы обычно выступает нитроний-
о-Нитротирозин ’
о-Нитротирозин ’
Тирозин
Тирозин
Результат введения иода в остаток тирозина неоднозначен: наряду, с включением в структуру одногоилидвух объемистых атомов иода становится значительно более кислым гидроксил фенольной группы. Эту реакцию нередко используют для мечения белка радиоактивным иодом, причем модификации могут подвергаться различные
остатки тирозина, локализованные на его поверхности.
Нитрование. Нитрование достигается действием тетранитрометана
C(N02)4, причем в роли активной катион *N02,:■
1 И в этом случае возможно, хотя и проходит со значительно большим трудом, введение второй нитрогруппы (также в о-полоЖенйе).
.’"187
Гидроксильная группа в (мштротирозцне, по существу, такая же, как - в нитрофеноле, имеет выраженные кислотные свойства Наряду с нитроний-катионами тетранитрометан образует и частицы со. свойствами свободных радикалов *N02. Они также реагируют с образованием о- нитротирозина, однако неспаренный электрон, делокализованный в ароматическом ядре, вызывает ряд побочных реакций, в частности димеризацию остатков о-нитротирозина.
,> Азосочеганже. Реакция остатков тирозина с ароматическими солями диазония, также являющимися катионными реагентами, опять-таки приводит к образованию моно- и ди-е-замеЩенных продуктов с достаточно протяженной системой сопряженных двойных связей, что придает им глубокое, обычно красно-оранжевое окрашивание (так называемая реакция Паули, иногда применяемая для обнаружения белков и пептидов, содержащих тирозин или гистидин):
ОНОН
I '|
. НС ^СННС ^C-WHC^-SO;
||| + *N2~C6H4—50з -► || I
нс>. ^сн „ ж,
Диазо сульфани-
I
левая кислотаi
• nI
сн2сн2
II
ТирозинПродукт азосочетания
Эта реакция также приводит к усилению кислотных свойств гидроксильной труппы тирозина. Она достаточно специфична, затрагивая помимо тирозина лишь остатки гистидина. Однако иногда наблюдается реакция солей диазония с аминогруппами лизина, дающая чрезвычайно нестабильные триазены. Для аналитического определения о- нйтро- и азотирозина иногда прибегают к восстановлению соответственно нитро- или азогрупп до аминогруппы. Получающийся при этом о-аминотирозин сохраняется при полном кислотном гидролизе белка и может быть определен с помощью аминокислотного анализатора^
Реакции карбоксильных групп
v-Карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот, как правило, весьма многочисленны и в большинстве своем размещены в поверхностном слое белка. Как уже упоминалось, их реакционная способность существенным образом зависит от микроокружения? 188 • -
Наиболее часто применяют следующие методы модификации этих групп.-
- Реакция с аминами в присутствии карбодиимидов. Эту реакцию проводят вводе, используя водорастворимые харбодиимиды, например N-этил-и '-триметил аминолропил карбодиимид:
.ЯгЙб^^^НЗЙгНЖг^Нз^
Реакция с этим или другими карбодиимидами протекает по следу- ■ ющей схеме (^-Н^С^-Я2 — карбодиимид, R3~NH2 — алифатический амин, часто метиловый эфир глицина):
RiRi
-II
.N ' NH
III,
-сн2-саон + с—►—сн2со-о-с+ r3nh2 -»
I
R.2,
Карбок-Карбо-о-Ацилизо- Амин
силдиимидмочевина
.■ R1
NH
—» -си2-«н<и-и, + 0=0
-NH
'I
R-2
Амид • Замещеннаямочевина
Если провести исчерпывающее 'замещение карбоксильных групп в белке, используя в качестве амицц метиловый эфир глицина или лучше метиловый эфир небелковой аминокислоты, например норвалина, то по аминокислотному составу продукта реакции можно определить число карбоксильных групп, которые в нее вступили и, следовательно, число доступных для реагента карбоксильных групп. Как правило, оно велико и скрытыми оказываются лишь единичные группы. '
Следует иметь в виду, что продукт активации Карбоксильной группы— о-ацилизомочевина — может не только вступать в реакцию с амином, но и стабилизироваться в результате внутримолекулярного переноса ацильного остатка с атомом кислорода на азот. Это приводит к образованию весьма стабильной N-ацилмочевины:.
RiRi
NHNH
I - I
R-CO-O-C-♦С=0
. NR—СО-N
R2 -^2
о-АцилмочевинаN-Ацилмочевина•
Реакции с алифатическими диазосоединениями. Стабильные алифатические диазосоединения, например производные диазоаЦетамида, в присутствии ионов меди реагируют с некоторыми карбоксильными груцпами, например с карбоксильной группой одного из остатков аспарагиновой кислоты в активном центре пепсина или других аспартильных протеиназ:
Си 2**
-ОН2-СООН + N2CH-CO-NH-R - -♦ -СН2-С00-СН2-С(НШ-1 + n2
Карбоксиль- ЗамещенныйЗамещенный эфир
ная группа диазоацетамидгликолевой кислоты
Алкилирование карбоксильных групп. В качестве агентов, алкилирующих некоторые карбоксильные группы в белках, могут использоваться о-галоидкетоны, . например р-бромфенацилбромид Bi—СН2С0“"СбН4Вг и его аналоги, а также о^-галоидкислоты. Реакция с р-бром фен ацил бромидом протекает следующим образом:
-CH2-C0U + Вг-СНг-СО-Се^Вг —♦ -СН2С00СН2С0-СбН4Вг
Карбоксильная р-Бромфейацилр-Бромфенациловый
группа (реаги- бромид 'эфир -
гует в виде аниона)
Модификация остатков метионина
Остатки метионина в белках и особенно пептидах легко окисляются до л^етионинсульф оксида;■
СН3
S + i202
СН2
I сн2
-nh-ch-cq-
СН8I s*-o-I, CHiI сн2. I -NH-CH-CO-МетионинсульфоксидСН8I s*-o-I, CHiI сн2. I -NH-CH-CO-МетионинсульфоксидСНзСНзSSсн2сн2СН2СН2НСО ОННСО ОНвьинаявьинаяСН2СН2кислотакислотаСН2СН2В ряде случаев эта реакция протекает даже под действием кислорода воздуха. В более жестких условиях, например при действии надмуравьиной кислоты, окисление проходит глубже и приводит к ме- тионинсулъфону.
СН8
I s*-o-
I
, CHi
I сн2
. I -NH-CH-CO-
Метионинсульфоксид
СН8
I s*-o-
I
, CHi
I сн2
. I -NH-CH-CO-
Метионинсульфоксид
СНз
СНз
S
S
сн2
сн2
СН2
СН2
НСО ОН
НСО ОН
вьиная
вьиная
СН2
СН2
кислота
кислота
СН2
СН2
-NH-CH-CO--NH-CH-CO-
-NH-CH-CO-
-NH-CH-CO-
-NH-CH—€0-
Метионинсульфон
Для модифицирования остатков метионина чаще, однако, применяют алкилирующие агенты, например уже упоминавшийся р-бромфен- ацилбромид или а-галоидзамещенные кислоты, в частности иодуксус- ную кислоту или бе амид. При этом характерно, что сера метионина реагирует с такого рода соединениями даже в слебокиелой среде, когда большинство других нуклеофильных групп белка, в частности имидазольные группы гистидина, в реакцию не вступают, будучи протонированы:
СНзСН3
I . I
S +1-СН2С00Н —tS*-€H2C00H
II
сн2.сн2
II
сн2сн2
1I
-NH-CH-CO-WH-CH-OO-
S-Карбоксиметилметионин
Аналогично протекает реакция остатков метионина с а-бромкетонами.
Модификация остатков цистеина
Сульфгидрильные группы остатков цистеина весьма реакционноспособны и могут участвовать как в реакциях замещения в качестве нуклеофильного компонента, чему благоприятствует их диссоциация с бразоВанием тиолЯт-иона (рКа около 8), так и подвергаться окислению или образовывать прочные соли с ионами тяжелых металлов.
Алкилирование тиоловых групп. Деловые группы легко алкилируются в слабощелочной среде.. Например, при действии. иодуксусной кислоты остатки цистеина превращаются в S-карбоксимети л цистеин, при действии иодацртамида — в S-карбокс амидометил цистеин:
SH 's—ch2-conh2
I. I
сн2 + i-ch2-coni2 —•СН2'
II
-NH-СИ—СО-_-NH-CH—СО-
Цистеин Иодацетамид S-Карбоксамидометил- a *t1
. цистеин
Тиоловая группа цистеина легко присоединяется к двойным связям, если они активированы сопряженной карбонильной группой или други способом:■
SH'СН2-С(К
| сн-с=о|}в-с2н5
СН2 + II Jh-CzHs —»св2—S-CH—«К
|.С1Н^=0I
-nh-ch-co--кн-сн-со-
ЦистеинW-Этилмале-Замещенный
имидимидсукцинимид
имид
имид
' Окислена сульфгидрильных групп. Сульфгидрильные группы остатков цистеина могут окисляться с образованием дисульфидных групп, т.е. превращаться в остатки цистина в сравнительно мягких условиях, в частности под действием сислорода воздуха. Эта реакция специфична и может сопровождаться лишь окислением серы в метионине. Иногда,. в частности при ренатурации белков, для. перевода остатков цистеина .в остатки цистина прибегают к реакции дисульфидного обмена,. для чего особенно подходящей считается окисленная форма глутатиона:" * ’
tHJIu—Cys-Gly•SS• I.Т-Glu~Суе~€1угОкисленная формаглутатионаtHJIu—Cys-Gly•SS• I.Т-Glu~Суе~€1угОкисленная формаглутатионаCys—IHSHSI. Cys—Cys—IHSHSI. Cys—БелокБелок—► 2t“G1u—Cys-Gly +I ■ SB—► 2t“G1u—Cys-Gly +I ■ SBБелок со свободными " тиоловыми группамиБелок со свободными " тиоловыми группамиCys~. I+ SI's<.гCys—Cys~. I+ SI's<.гCys—БелокБелокВосстановленная форма глутатионаВосстановленная форма глутатиона
tHJIu—Cys-Gly
•S
S
• I.
Т-Glu~Суе~€1у
г
Окисленная форма
глутатиона
tHJIu—Cys-Gly
•S
S
• I.
Т-Glu~Суе~€1у
г
Окисленная форма
глутатиона
Cys—
I
HS
HS
I
. Cys—
Cys—
I
HS
HS
I
. Cys—
Белок
Белок
—► 2t“G1u—Cys-Gly +
I ■ SB
—► 2t“G1u—Cys-Gly +
I ■ SB
Белок со свободными " тиоловыми группами
Белок со свободными " тиоловыми группами
Cys~
. I
+ S
I's<.г
Cys—
Cys~
. I
+ S
I's<.г
Cys—
Белок
Белок
Восстановленная форма глутатиона
Восстановленная форма глутатиона
Белок с внутримолекулярнойдисульфидной связью
Разумеется,’ эта реакция обратима, однако равновесие может быть практически полностью сдвинуто в сторону образования дисульфидной (как правило, внутримолекулярной) связи в белке за счет большого избытка окисленной формы глутатиона. На реакции дисульфидного обмена основано использование так называемого реактива Эллмана — 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной) кислрты для количественного определения свободных сульфгидрильных групп в белкам. При взаимодействии с последними происходит восстановление дисульфидной связи в реактиве. Образующаяся 5-меркапто-2-нитробензойнвя кислота за счет диссоциации сульфгидрильной группы в щелочной среде дает харак-
терное кеЛтое окрашивание и может быть количественно определена спектрофотометрически:11:*терное кеЛтое окрашивание и может быть количественно определена спектрофотометрически:11:*+ H“S~€ys—Белок+ H“S~€ys—БелокП .П .
терное кеЛтое окрашивание и может быть количественно определена спектрофотометрически:11:*
терное кеЛтое окрашивание и может быть количественно определена спектрофотометрически:11:*
+ H“S~€ys—Белок
+ H“S~€ys—Белок
П .
П .
/СН=С1К*.^^
CDOHCDOHсоо-соо-/Смешанный дисульфид
CDOH
CDOH
соо-
соо-
' н
Дианион5иеркапто-2-нитробс^зойуойкислоты; интенсивно окрылен
Образованмё меркаптидов металлов. Сульфгидрильная группа, будучи ионизована, , т.е. в форме меркаптид-иона, специфически взаимодействует с катионами многих тяжелых металлов и металлорганиче- скими соединениями, Образуя весьма прочные .меркаптиды. Аналитическое значение имеют реакции с катионом двухвалентной ртути
а также р-гйдрокси- (или р^хлор-)меркурбенздатом
^^2-8" + "Hg-C^-fOO- ^ -CHz^ig-CACOO- '
• 1р-МеркУрб^йвоат
’, (с Hg* мож< *’. (<
-быть связан €1"
или ОН")
■ .• .1 I'>-.-< .*'•1
Связь Hg-S в таких соединениях занимает промежуточное положение между ионной и ковалентной и, как правило, достаточно прочна. 194
Образование меркаптида р-меркурбензойной кислоты сопровождается характерным изменением УФ-спектра, что может быть использовано для Количественного определения свободных сульфгидрильных групп в белках и пептидах, хотя этот способ менее удобен, чем реакция Эллмана. ,
9-2.6. Модификация им {даэольной группы гистидина
Алкилирование. Имидазол., гистидина легко вступает в реакции алкилирования, например с подуксусноА пеислотой или ее алтдом в нейтральной или слабощелочной среде, "Причем в зависимости от микроокружения этой группы в белке или способа связывания алкилирующего реагента реакция может происходить по одному или по другому атому азота (по N-1 или N-3): - "
N—СН2-С00-N—СН2-С00-—С—С-N (1)-N (1)CH .CH .NNCHCH66| (3)Н| (3)НI (3). ОН 2—CW"I (3). ОН 2—CW"11I ) • • UI ) • • U
N—СН2-С00-
N—СН2-С00-
—С
—С
-N (1)
-N (1)
CH .
CH .
N
N
CH
CH
6
6
| (3)
Н
| (3)
Н
I (3)
. ОН 2—CW"
I (3)
. ОН 2—CW"
1
1
I ) • • U
I ) • • U
N-1 (а) и N-3 (б}-карбоксиметил гистидин
Следует учитывать, что двойная связь, в системе №=С—N имидазола гистидина способна переяещатъся и занимать любое из двух положений. Реакция алкилирования не является характерной только для гистидина, она может протекать также с остатками метионина, лизина и даже с некоторыми карбоксильными группами, что зависит от pH и в значительно большей мере от особенностей микроокружения модифицируемого остатка.
Азосочетание. Реакция азосочетания может затрагивать в имидам зольной группе гистидина как атом С-2, так и атом С-4.
—СN
(4 JcHCM
КМзЗОз-ЧЗД-^ИКДва продукта азосочетания:
| по атому С-2 и атому С-4 И
•I‘ <
Продукты азосочетания гистидина с различными солями диазония '(на схеме показана реакция с амидом диазосульфаниловой кислоты) имеют интенсивную, обычно красно-оранжевую окраску (реакция Паули).
Для избирательной деструкции остатков гистидина прибегают к фоТоокислению кислородом в присутствии сенсибилизирующих красителей.
Модификация гуанцдогруппы аргмнмна
Эта задача является особенно трудной, поскольку 6-гуанидогруппа аргинина является очень сильным основанием (рКа и 14) и может быть депротонирс * ка, что позволило бы ей выступать в качестве нуклеофила лишь в крайне жестких условиях, при такой концентрации щелочи, которая обрекает белок на глубокую денатурацию. Удается, однако, Использовать д)ы избирательной модификации' аргинина способность гуанидогруппы вступать в реакции образования гетероциклов, с некоторыми дикетон мм или альдегидокетоками:
и I с=о IСбН5-С=Ои I с=о IСбН5-С=ОФенил-глиоксальФенил-глиоксальГуанидогруппааргининаГуанидогруппааргининаI ^Н®-СН2--H"O-C-NHCcHsПродукт присоединенияI ^Н®-СН2--H"O-C-NHCcHsПродукт присоединения
и I с=о I
СбН5-С=О
и I с=о I
СбН5-С=О
Фенил-глиоксаль
Фенил-глиоксаль
Гуанидогруппааргинина
Гуанидогруппааргинина
I ^Н®-СН2--
H"O-C-NH
CcHs
Продукт присоединения
I ^Н®-СН2--
H"O-C-NH
CcHs
Продукт присоединения
_ 9.2.8. Модификация индола а триптофане
Индольная группировка весьма , лабильна, в частности она претерпевает деструкцию при фотосенсибилизированном окислении. Среди химических методов упомянем реакцию с (мттрофекилсрл^фекилхло- ридо^ которая протекает по о-углеродному атому пиррольной части индола: , f
Заканчивая краткий обзор реагентов, используемых при модификации отдельных аминокислотных остатков в белках отметим, что ко многим аминокислотам этот метод вовсе неприменим Гаковы все *ид-
рофобные аминокислоты, глицин, пролин. Нет общих подходов к модификации серина, треонина, аспарагина и глутамина.
9.3. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ХИМИЧЕСКОГО *^ МОДИФИЦИРОВАНИЯ,:
Необходимо еще раз подчеркнуть, что приведенные выше данные о реакциях функциональных ^рупп белка ориентировочны. За исключением, возможно, образования меркаптидов, эти реакции не могут рассматриваться как строго специфичные Ввиду этого ис^полхование результатов химического модифицирования представляет большие возможности. Как правило, необходимо разделение продуктов модификации, за которым должна следовать локализация мбдифицирован- ных аминокислотных остатков путем фрагментации белка и выделения пептидов, содержащих остаток реагента. Экстраполяция результатов, полученных при действии тех или иных реагентов на функциональные группы в модельных структурах — аминокислотах?, Пептидах и даже белках, весьма опасна, особенно если речь идет о компонентах активных центров, поскольку химические свойства таких групп могут быть сильно видоизменены вследствие их участия в системе нЬковалентных Взаимодействий.‘*
; 9.3.1. Химическое модифицирование как способ выявленияроли функциональных групп белка
Как отмечалось, в исследовании структуры и. функциональных свойств белка данный > метод в значительной мере вытесняется еайт- специфическим мутагенезом (белковой инженерией). Тем не менее при изучении механизма действия многих белков начальные сведения, о функционально значимых аминокислотных остатках . были получены именно методом химического модифицирования. Так, участие карбоксильных групп Двух остатков аспарагиновой кислоты в аспартильных протеиназах было впервые продемонстрировано при помощи специфических реакций с производными диазоацетамида' и диазокетонами, при изучении сериновых протеиназ огромную роль сыграло выявление особой роли остатка серина, специфически реагирующего с. диизоцро- пилфторфосфаТом и т.д. Эти результаты в дальнейшем подтвердились рентгенострук^урцыми иссдедова^цями и сайт-сцрцифическим мутагенезом. Нет сомнения, что метод химической модификации будет и в дальнейшем играть ответственную роль, в особенности при поиске функционально важных структур в новых семействах белков.
Это обусловлено тем, что функционально активный центры, как правило, содержат1 ансамбли групп, функциональные групнь в необычном окружении, что изменяет, делает нестандартными их_химические свойства. Именно поэтому поиск аминокислотных остатков, обладающих аномальной реакционной "способностью, составляет bi кный этап исследования белка.,.,.
В то. же время следует учитывать еще одну трудность, внутренне присущую трактовке результатов, полученных, любым, методом модифицирования. Получив данные о том, что присоединение к некоей группе белка заместителя Я- вызывает характерное измявшие эго функциональных свойств, например утрату активности, нелегко определить, произошло ли это вследствие блокирования данной функцией нальной группы или ясе в результате введения остатку Я в„данную точку белка, где его присутствие недопустимо (например, из-^ вызываемых этим заместителем стерических осложнений), Расчет, на то, что применение, реагентов с очень небольшими радикалами, 1, снимет проб? лему, вряд ли оправдан, так как помехи вовсе не обязательно связаны с размерами. Это делает результаты химического модифицирования не всегда однозначными. Заметим что и * метод сайу-специфиЧ ского мутагенеза сопряжен с такой же неопределенностью. Впрочем, это осложнение может быть снято, если удается использовать не' один, а серию реагентов с принципиально различными Я.
Аффю ой ю реагенты *>у^ у ' ■ . * ^ii. •-■.г ■• « a i
Как бы ни был построен реагент, используемый при химической модификации,- его взаимодействие с той или иной функциональной группой всегда начинается с того) что он связывается в эе окрестности.' Таким образом, специфичность, избирательность реакции определяется не только химическими особенностями, внутренне Присущими данной функциональной группе в- Волковой структуре, ’но и наличием вблизи нее- благоприятных (или, наоборот, неблагоприятных) условий для связ Ыв<Пмм людифичирующело реагента. Лдя изучения функцис • нальных групп в активном центре 'белка выгодно использовать такие соединения, в которых собственно- химически активная ф^ЦЙа присоединена к структуре, ’’узнающей” ктивный центр, точнее ту его часть, которая ответственна за связываний Ы10цифического чи^ШДа (например, субстрата или эффектора). Такие адресованные р^енты с большой вероятностью сорбируются в активном центре и аетем образуют ковалентную связь с теми или иными функциональными группами, локализованными в нем. Протеканию реакции благоприятствует сближение химически активной группы реагента и модифицируемого s ий.199
нокислотного остатка, поэтому собственная реакционная, способность первой может и не быть высокой.,, ,
Д качестве примера можно указать на целый ряд пептидилбром- метилкетонов, построенных следующим образом:
1С(нш-(Жгсо--кн-(Ж1г--ан^^
... *,,^4> ,
.’ "Адресующая" часть реагента
Активная группа г .
■•/ Пептидная (адресующая) часть такой молекулы. специфически присоединяется к протеиназе за счет образования система водородных связей между пептидными группировками аналога субстрата и фермента, а также взаимодействия боковых радикалов Ri, R2 и &з с зоной связывания. В результате реакционноспособная группировка С0СН2Вг оказывается пространственно сближенной с активным центром. В сериновых протеиназах она избирательно реагирует с имидазольной группой гистидина, принадлежащего активному центру:
. НС-7- ” - С-СН2
II
■ RCO-NHCHRaCO^CHR^OHWCHRjCO-^^ N ^N Остаток
41*гистидина
Остаток реагента■ ' .
Химическое модифм^ированме в изучешшГ(| ц
" iмежмолекулярных мешлекссж я синтезе
чконъкгат(И1--6алж>1
■ Важной областью применения шмической модификации является соединение, "сшивка" белковой7 молекулы с другими молекулами, сближенными с ней в биологических структурах. Это открывает воз
можность изучения геометрии подчас весьма сложных межмолекулярных комплексов. Так, бифунта^ноналъный реагент, диметил-3,3-ди- тиобис-пропиоимидат
NH .> NH
. - IIII '
СНзО-С-ОНгСНз-б-З-СНгСНг-С-ОСНз
способен модифицировать, подобно монофункциональному имидоэфи- ру, Е-амий труппы лизина, отстоящие друг от друга примерно на 12 А. Это позволяет ’'сшивать" соседние белки в субъединице рибосом, F-актин и фрагмент миозина, белки в мембранах эритроцитов и т.д. Существенно, что "сшивка" содержит в этом случае дисульфидную связь, которая может быть в дальнейшем расщеплена мягким восстановлением. Это приводит к разделению белкой, образовавших конъюгат, и облегчает их идентификацию. Образуемые при помощи таких же или аналогичных реагентов Внутримолекулярные сшийки иногда используют для оценки расстояний между функциональными'группами на поверхности белковой глОбулы.
Разумеется, бифункциональные сшивающие реагенты могут содержать и неодинаковые реакционноспособные группы. Это особенно удобно при получений конъюгатов объединяющих белки с разными функциональными свойствами, например иммуноглобулины и ферменты (обычно пероксидазу или фосфатазу), что необходимо для чммуно- ферментного анализа: Одним из таких реагентов является N-ексйсуй- цинильный эфир «-малеимидобензойиой кислоты:
। • х : * * '* -
•442Г>.1 >Г\• Й '^ U
N-Замещенный малеимид;
реагирует с тиоловымигруЙНами / W Г
А-Оксисукцинимид-— -. *
ный эфир; реагирует. , :■
с аминогруппами
Его малеимидная группа способна присоединять сульфгидрильные группы цистеина, W Ммжсисушщнильный эфир ацилирует «-аминогруппы остатков лйзина. Поскольку Вти реакции протекают в различных условиях, можно избежать образования случайных пар белков.
Получили распространение модифицирующие реагенты, содержащие фотойктивируелгун) фенилвзи^ную группировку. При освещении замещенных фенилазидов УФ-свегом с длиной волны 265—275 нм эти, в обычных: условиях вполне устойчивые, вещества распадаются. с. образованием промежуточных аренов *- соединений с высокой реакционной способностью/1 Последние, будуЧи. пространственно -сближенными, могут реагировать с различными функциональными группами белка, включая и такие, которые принято считать инертными. В принципе возможна даже реакция нитрена с С-fl-группами, однако чаще затрагиваются функциональные группы Н—I:
СбН^зCeHs~^: + Н~Х-белок' —♦ СА'Ч^И-белок
Фенил-Арен ' '
азид'. 1
.. Встраивание фенил азидных группировок в структуру реагента, имеющего еще одну химически активную группу,. дозволяет сначала модифицировать белок за счет последней. После этого фотоактивация создает в уже модифицированном белке новый высокоактивный центр (арен), способный образовывать ковалентные связи как с соседними молекулами белка (полисахаридами, липидами и т.д.), так и с пространственно близкими группировками внутри той же молекулы. Например, показанный ниже бифункциональный реагент дает возможность присоединить фотоактйвируемую группу к аминогруппам белка:
О ,•<
NeNe|| г. >С0~СН2 Группа, реагирующая ^НШ^ЖгЬ^’^МС ■ ’• | ь преимущественно с
Ne
Ne
^^СО-ЧШа аминогруппами белка
Фотоактивируемая группировка
, . .ЗА Другие области применения химического ^ t . ... ? модифицирования батюв .
Реакции химического модифицирования позволяют образовывать Ковалентные связи между белками и мерастворилюв матрицей, йапри- tep полисахаридами (агароза и ее производные, в том числе ’’сефарозы”, целлюлоза), органическими полимерами (полиакриламид поливиниловый спирт ’’тОйрперл"), неортадетескими . материалами (макропористое стекло и силикагель), Для этой цели используют целый ряд реагентов. Так, при иммобилизация на полисахаридах применяют
предварительную активацию матрицы бромцианом, после чего получившийся эфир циановой кислот^ образует амидин с.Е-аминогруппой бел а, Эту, реакцию используют и как способ присоединения лигандов к матрице при синтезе аффинныз сорбентов (см. гл. 3);
асто иммобилизацию белков проводят, используя диальдегид (обычно глутаровый диальдегид) для сшивания свободной 5-аминогруппы 'бедка с аминогруппой носителя:
Белок ’ (Я®2**ЛН2 4* 0=-СН“ЧШ2СН2СЙ2**Ч?Я-4) -Ь NH2 СН2”""^Матрицу
БелоК~СН2—NH=CH™C62CH2CH2~CH=#f—СН2~ Матрица
202 ’*-
Для большей стабильности иммобилизации малоустойчивые связи —CH=?i'-^- гидрируют боргидридом натрия НаШЦ, переводя их в очень прочные связи "СНг"^®—• •
Модификация позволяет изменить растворимость белка. Например, присоединение к химотрипсину нескольких гидрофобных полимерных цепочек "ОН^СЯгО^НгСНгО-^гСНз^Н делает этот фермент растворимым в органических растворителях, что открывает возможность его использования как катализатора* в органическом синтезе. ^
- ГЛАВА 10
" ФЕРМЕНТЫ 4
Обмен веществ был бы невозможен без резкого ускорения реакций, на которых он основан, без согласования во времени1 и пространстве множества биохимических процессов, т.е. без 'участия биологических катализаторов — ферментдв. Биокаталитически ускоряются самые различные превращения, в том числе и такие, которые с точки зрения традиционной химии, казалось бы, не нуждаются' в катализе. Например, спонтанно протекающее отщепление воды от угольной кислоты с образованием СОг оказывается- слишком медленным для регулирования pH крови, и эта, на первый взгляд простая, реакция' катализируется специфическим ферментом — карбангидразой.
Как известно, катализаторы не создают той или иной реакций, а лишь ускоряют достижение' равновесия, увеличивая скорости как прямого, так и обратного превращения. Как и любые катализаторь!, ферменты ускоряют биохимические реакции за счет • снижения энергии активации — того энергетического барьера, который отделяет одно состояние системы (исходные соединения) от другого (продукты реакции). При этом; строго говорЫ'; несколько изменяется путь, по которому протекает, реакция. Разница в - эффективности ферментов и Традиционных 'катализаторов, используемых в химии, казалось бы чисто количественная. Так, энергия активации распада пероксида водорода на кислород и воду ** 11
• , • Н2О2 11 Яа0 + У 2O2
составляет 18 ккал/моль, мелкодисперсная платина снижает ее до 12 ккаль/моль, а фермент каталаза — до 5,6 ккал/моль, что ускоряет реакцию соответствен^) на 6 и 12 порядков, Столц высокая эффективность ферментов определяет их роль как организаторов биохимиче-
". 203
ских процессов. Действительно, благодаря каталитическому действию ферментов в организме становятся возможными такие реакции, которые в отсутствие эффективного катализа были бы неуловимы за разумные времена наблюдения.'' •
■ Таким образом, ферменты как бы создают, делают осуществимыми многие превращения веществ, не мыслимые в отсутствие биокатализа. Более того, нередко фермент ускоряет один из нескольких термодинамически возможных путей превращения вещества, тем самым избирая его. Следовательно, ферменты выступают не только как ускорители, но и как своеобразные организаторы обменных процессов, чему также способствует и возможность регулирования их активности.
• Роль биокатализа была, выявлена еще в прошлом веке при изучении процессов брожения. Именно с брожением связаны оба установившиеся в литературе названия биокатализаторов — энзим и фермент. Из этих синониме® в русскоязычной литературе применяется лишь последний наряду, впрочем, с терминами энзимология и энэимятиче- схи* Ферменты имеют белковую природу, однако обнаружена способность некоторых-форм РНК катализировать реакции, т.е. выступать в качестве ферментов. Предполагают, что эта способность молекул РНК сыграла большую роль в эволюции биокатализа до того, как ферментативная функция перешла к белкам — биополимерам, более приспособленным к выполнению этой задачи.г < -
- Во многих случаях молекула белка использует в ходе биокатализа небелковые соединения — кофакторы, в частности ионы металлов, которые выступают как компоненты каталитического центра фермента. Отделение таких кофакторов, обычно связанных с белком нековалентно, приводит к а*оферментам, комплекс же фермента и кофактора носит название голофермента. .‘
;. ... _11. i '. Гt • .г
СИСТЕМАТИКА ФЕРМЕНТОВ V
Каждая из примерно 2—3 тыс. реакций обмена в клетке катализируется своим ферментом; следовательно, даже без учета видовых различий существует не менее 2—3 тыс. ферментов. Это число значительно вырастет, если учесть, что реакции одного и того же типа могут1 катализироваться ферментами различной Природы., а также рассматривать ферменты, вовлеченные в передачу сигналов и процессы, свойственные многоклеточным (например, ферменты системы свертывания крови). Вероятно, общее число видов ферментог приближается к десяти тысячам.
Для строго обоснованной классификации столь большого числа’ ферментов пока недостаточно данных. Рациональной была бы Система- 204•
тика, основанная на эволюционных соотношениях между ферментами, глубоком знании их структурных и функциональных особенностей. Это позволило бы объединять в таксоны соответствующих рангов ферменты, возникшие в ходе эволюции одного предшественника. Такая систематика в настоящее время создается для некоторых групп ферментов, в частности для протеиназ.{*
Однако для практического применения систематики, базирующейся на эволюционных предпосылках, требуется не только предварительное изучение множества родственных ферментов, но и получение большого объема данных о свойствах й, главное, структуре классифицируемого фермента, на что трудно рассчитывать на первых этапах исследования. Ввиду этого принятая официально классификация ферментов использует в качестве, основного отличительного признака их субстратную специфичность, характер проводимых ими реакций, т.е. именно то свойство, которое определяется первым при обнаружении и выделении фермента. Этот признак практически удобен, однако следует учитывать, что он может объединять ферменты различного происхождения, структуры и даже механизма действия.
• Международная классификация ферментов (КФ) разделяет ферменты в соответствии с типом катализируемых ими реакций на следующие шесть классов.
Оксидоредуктазы. К этому классу 'Принадлежат все ферменты, катализирующие окислителшог*восстановительные реакции. Субстрат, подвергающийся окислению, рассматривают как донор водорода, поэтому к ферментам данного класса нередко применяют термин дегидрогеназа, хотя это название отражает только одно из двух возможных направлений реакции. Термин оксидаза употребляют только • тех случаях, когда 02 выступает как непосредственный акцептор водорода.
Трансферазы. ферменты этого класса переносят ту или иную группу от одного соединения к другому. К их числу принадлежат, например, киназы — ферменты, переносящие фосфорильный остаток АТР на различные субстраты, аминотрансферазы (трансаминазы), переносящие аминогруппу аминокислот на кетокислоты.
Fix <-рояааы. Эти ферменты можно рассматривать как трансферазы, переносящие ту или иную группировку на молекулу воды. Выделение их в особый класс оправдано чрезвычайно широкой распространенностью гидролаз, вовлеченных, в частности, в процессы деградации биополимеров. Известны гидролазы, катализирующие гидролиз (НО, С-К, (Н€, 0~Р и ряда других Связей. Иногда один и тот же фермент способен катализировать гидролиз связей разной природы. Так, некоторые Протеиназы, расщепляющие пептидные связи в белках, могут даже с большей эффективностью гидролизовать сложные эфиры, выступая ' '. '-206
как эстеразы. Выбор термина протеиназа в таких случаях основан на представлениях о физиологической роли данного фермента и, следов»* тельно, о характере его природного субстрата.
Лиазы. К ним относят ферменты, разрывагогцио связи €”"С, С”О, C~N и некоторые другие путем элиминиро ания соответствующей молекулы с одновременным Образованием двойной* связи. В обратной реакции лиазы катализируют присоединение молекул воды, аммиака и Т.д. по двойной связи. Таков, например, гистидин-аммиак-лиаза — фермент, отщепляющий аммиак от гистидина с образованием ненасыщенной урокаиновой кислоты: ’ .14 ‘ ; ‘ •
с—сн2-сн-соонс—сн2-сн-соонСЕ^Н-СООН + NH3СЕ^Н-СООН + NH3
с—сн2-сн-соон
с—сн2-сн-соон
СЕ^Н-СООН + NH3
СЕ^Н-СООН + NH3
, НС, НС.сн.снnh2nh2’ НС.’ НС.жжГистидинГистидинУрокаиковая кислотаУрокаиковая кислота
, НС
, НС
.сн
.сн
nh2
nh2
’ НС.
’ НС.
ж
ж
Гистидин
Гистидин
Урокаиковая кислота
Урокаиковая кислота
“ Изомеразы. Ферменты этого типа катализируют геометрические или структурные Перестройки, изомеризации в пределах одной молекулы. К ним, в частности, относятся рацемазы, таутомеразы, циклоизомеразы. В качестве примера укажем на рацемазу лактама лизинИ, катализирующую взаимный переход L- и D-мзомерОв этого соединения (см. гл 1), триозофосфатизомеразу, катализйрующук взаимопревращение фосфоглицериновогб альдегида и диоксйацетонфосфата. '
♦Лигазы (синтетазы). К этому классу относятся ферменты, катализирующие соединение двух молекул, сопряженное с гидролизом АТР^ Фни играют ключевую роль в процессах биосинтеза, 'обеспечивая За гчет энергии гидролиза АТР протекание таких реакций;' которые сами по себе были бы термодинамически невыгодными. Примером могут служить аминоацил-тРНК-синтетазы. ' 4 ,;а • ‘
Каждый из перечисленных шести классов ферментов разбивают (опять-таки по признаку специфичности) на подклассы 'и подподклассы, которым присваиваются • порядковые Номера в соответствии с Международной классификацией Накример, гиДролазы, ‘ расщепляющие эфиры карбоновых кислот, относятся к' классу 3 (гидролазы), подклассу 3.1 (ферменты,' Действующие на сложйбэфирнЫе связи) и подподклассу 3.1.1 (гидролазы эфиров карбоновых кислот). Конкретный фермент внутри подподкласса получает свой порядковый номер. Так, липаза, гидролизующая триацилглицерины, имеет номер 3. 1.3. - • •
ОБЩИЕ ПОНЯТИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА
При анализе способа действия ферментов прибегают крядуупро- щений, в определенной мере отражающих существенные черте этого процесса. Прежде всего учитузают, что с субстратом, непосредственно контактирует не вся молекула фермента, а лиши ре, часть ~ активный центр. Последней не может быть очерчен строго определенными границами# поскольку каждый его компонент так иди инач^ взаимодействует с другими участками молекулы белка. Эти взаимодействии обычно весьма существенны для каталитического механизма, изменяв реакционную способность функциональных групп активного центра, фиксируя их в структуре белковой глобулы или создавая благоприятствующее катализу специфическое микроокружение. Таким образом, понятие . активный центр является в определенном смысле абстракцией, которая отражает существеннее особенности фермента, но в то же время как бы огрубляет описание катализа. '
Упрощая картину далее, активный центр подразделяют на зону связывания субстрата и собственно каталитический центр. При этом предцрдргается, что зона связывания ответственна за формирование комплекса фермент — субстрат (так называемого комплекса^ихаэлц- са^, за выбор субстрата, его закрепление, и правильную ориентацию относительно каталитического центр!. функциональные, группы, каталитического центра непосредственно участвуют -в. превращении субстратами., это упрощение полезно, если не забывать о его относительности, условности В ре^лы дх ферменто-субстратных комплексах rpyi г - пы каталитического центра обычно (йбпользук^ся для ci тыкания субстрата, а белковые структуры, образующие зону связывания,, нередко участвуют в динамических процессах, вмешиваясь в каталитический механизм.. . ''
Условность понятия активны^ центр подчеркивается и тем, Что последний не удается физически отделить от, остальной части ^едеку- лы фермента. , На рубеже 50—бОх годов появлялись сообщения об удачном "вырезании” активных. центров из ферментов, в частности протеиназ. Е|сэ они, однако, оказались результатом экспериментальных ошибок. £ установлением пространственного строения множества ферментов стало ясно, что, как .правило, их активные, центры формируютпся из аминокислотных стятков, далеки^. Эру рт друга в последовательности аминокислот, но сближающихся, .при образовании третичной структуры. .^ . ,, ,N ... ,. . . . Например, в активном центре пепсина ключевая роль принадлежит остаткам аспарагиновой кислоты 35 и 215, которые сближаются при свертывании полипептидной цепи, состоящей из 321 аминокислотного
остатка, в пространственную структуру.. Очевидно, что при попытке "вырезать” из белковой глобулы те участки последовательности, которые включают компоненты активного центра, получилось - бы крайне неустойчивое образование, состоящее из нескольких пептидных фрагу ментов, а главное,. было бы утрачено специфическое окружение функциональных групп каталитического центра, которое определяет их химические особенности. . /
В то же время структуру фермента в целом нельзя считать неприкасаемой. Молекулы многих ферментов способны противостоять довольно значительным повреждениям/ в том числе отдельным разрывам полипептидных цепей, адаптировать целый ряд замен аминокислотных остатков другйми; иногда удается заметно уменьшить их размеры без утраты активности. Принципиально возможно и получение относительно небольших каталитических активных структур, при том, однако, непременном условии, что они сохранят стабильность пространственного строения, т.е. будут соответствовать по размерам и стабильности по- меньшей мере рангу домена.
. 10.3. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА
Основы кинетики ферментативных реакций были заложены Л .Михаэлисом и М.Ментен еще в 1913 г. Предложенное ими уравнение, связывающее скорость реакции с концентрациями фермента и субстрата, в дальнейшем преобразовывалось, однако подход в принципиальных чертах сохранился и за уравнением остались эти имена.
Согласно модели Михаэлиса—Ментен, фермент Е и субстрат S взаимодействуют со скоростью, характеризуемой константой k+i, образуя фермент-субстратный комплекс ES, получивший название ^олтлекс Михаэлиса. Этот комплекс, в котором субстрат, присоединенный к ферменту нековалентными связями, еще, сохраняет свою химическую природу,, распадается с константой скорости k-j на фермент и субстрат, но может и превратиться в продукт (или продукты) Р,. высвободив фермент Е, со скоростью; характеризуемой константой к*2:
Е + S; ^ ES —* Е + Р. i-
Как правило, фермент-субстратный комплекс ES чаще распадается на исходные компоненты, чем превращается с образованием продукта реакции Р, т.е. k+i > k+г- Конечно, именно превращение субстрата в продукт представляет главный интерес при изучении ферментативных 208 . '
реакций. Накоплением продукта в единицу времени и определяется скорость реакции. -
При выводе уравнения Михаэлиса—Ментен необходимо прежде всего найти зависимость концентрации фермеит^субстратного комплекса от концентраций фермента и субстрата, поскольку. скорость Образования продукта пропорциональна концентрации комплекса ES Скорость образования ES равна k+i [Е] [S], скорость же его. распада определяется суммой двух процессов: диссоциации фермент-субстрат- ного комплекса на компоненты со скоростью k-i [ES] и ’его расцада с образованием продукта со скоростью k*2[ESJ. -
Итак, скорость распада комплекса ES по двум путям равна сумме этих скоростей (k-i 4 к*2)[Е£]. Кинетика Михаэлиса—Ментен приложима- к уже установившимся, стационарным, процессам, хогда скорости образования и распада комплекса Михаэлиса р^вна, т,е. сохраняется его постоянная концентрация. Для такого процесса справедливо равенство ,
bi[E][S] = (k-j 4 k+2)[ES], "
,” 'Frei[S] ( 4
преобразуя которое получим [ESJ = ^. 4- к "1
k*i
Дробь -к"1 + -— называют константой Михаэлиса Кт. Легко видеть, что она характеризует соотношение скоростей распада (числитель) и образования (знаменатель) комплекса Михаэлиса ES- Если к+2мдла по сравнению с. k-i,. т,е. распад комплекса на исходные компоненты. — фермент и субстрат -^ оказывается значительно вероятнее, чем его распад с образованием продукта Р, величиной к*2 можно пренебречь и константа Михаэлиса оказывается равной константе диссоциации субстрата л - . • ,. ' ,>•..;*
К =
■f■fS. Ki
■f
■f
Как уже отмечалось, это соотношение часто оказывается справедливым, поэтому константу Михаэлиса Кт нередко приравнивают Kg. Следует, однако, помнить об' условности такого упрощения. Заменяя дробь в знаменателе предыдущего уравнения на Кт, получаем
Заметим, что приведенное уравнение входят текущие концентрации свободного фермента и субстрата которые, строго говоря, не сов^ .. "'209
падают с их начальными концентрациями, гораздо легче поддающимися определению. Впрочем, различиями в начальной [S ) и текущей
концентрациях субстрата можно пренебречь, приняв [S 1 * [S], по*' r;U-I i" •
. скольку уравнение Михаэлиса—Ментен справедливо только для не- болыпих степеней . превращения субстрата (о чем нельзя забывать, определяя активность ферментов). Напротив, текущая концентрация фермента существенно отличается от его полной концентрации [Е^ вследствие связывания большей или меньшей доли молекул фермента в комплекс Михаэлиса:
' й = пу-пв].
Подставляя это выражение для текущей концентрации фермента -в приведенное выше уравнение, после преобразований получаем
'- к„ + [S] •<
^то уравнение описывает зависимость концентрации фермент-суб- стратного комплекса от исходных концентраций фермента и субстрата. Так как скорость образования продукта реакции V равна k^EES], то
7 Ь; [E^tS] •
v = v+ |Уравнение Михаалисаг-Ментен
Следует иметь в. виду, что это уравнение определяет , начальную скорость стационарной реакции Vo, индекс ”0” о пуще» для упрощения. Из выведенного уравнения следует, что скорость реакции пропорциональна общей концентрации фермента, тогда рак ее зависимости от концентрации субстрата оказывается значительно более, сложно^. ,
Рассмотрим, как выглядит эта зависимость ц наиболее характерных случаях. Напомним, что „
k + i ’ -
и если k+2 < k-i (что наблюдается достаточно часто), то в первом приближении Кт к V, иначе говоря, константа Михаэлиса равна константе диссоциации фермент-субстратного комплекса — "субстратной константе".
210
Если концентрация субстрата много меньше Кт, т.е. [S] < Кт (случай, соответствующий действительно низкой концентрации субстрата или плохому его связыванию ферментом — большому значению I»), то величиной [S] в знаменателе уравнения Михаэлиса—Ментен можно пренебречь и ^скорость реакции оказывается пропорционально^ концентрации и субстрата, и фермента, а' само уравнение приобретает ^ид * '
” ■ V = ^[E1[S]. ’
Это выражение соответствует уравнению скорости ‘ бимолекулярной реакции. Дробь -? ? , которая отвечает константе скорости бимолекулярной реакции, иногда называют бимолекулярной константой скорости и используют сортветствующие величины при сопоставлении эффективности действия однотипных ферментов.
Если концентрация субстрату много больше Km, [S] > Кт (концентрация субстрата сама по себе велика или фермент хорошо связывает субстрат, чему соответствует низкая Кт), то величиной Кт в знаменателе .можно пренебреги скорость реакции V = ^{E^J оказывается пропорциональной концентрации фермента, а от концентрации субст рата не зависит. Иными словами, фермент оказывается насыщенным субстратом, свободного фермента в, реакционной смеси нет. Стоит обратить внимание на то, что концентрация субстрата в ферментативных реакциях важна не сама по себе, а в сопоставлении с константой, Михаэлиса, характеризующей Соответствие данного субстрата фер
менту.
Концентрация субстрата, (51Концентрация субстрата, (51Рис. 10.1. Зависимость скорости V катализируемой ферментом ре-Рис. 10.1. Зависимость скорости V катализируемой ферментом ре-Сказанное1 иллюстрирует рис. 10.1. При небольших концентрациях субстрата скорость * реакции пропорциональна его содержанию в реакционной смеси, Затем наблюдается все возрастающее отклонение зависимости от линейной и, наконец, при концентрациях субстрата, значительно превышающих Кт, зависимость скорости реакции от концентрации субстрата практически исчезает' причем сама скорость Достигает11‘1 максимального
Концентрация субстрата, (51
Концентрация субстрата, (51
Рис. 10.1. Зависимость скорости V катализируемой ферментом ре-
Рис. 10.1. Зависимость скорости V катализируемой ферментом ре-
(при данной концентрации фермента) акции от концентрации субстрата значения'Й
max — к*2р^ •
Это другая форма уравнения МихаэЭто другая форма уравнения МихаэСледовательно, V = У-1^-^
Это другая форма уравнения Михаэ
Это другая форма уравнения Михаэ
лиса—Ментен.
Если концентрация субстрата равна констйнте Михаэлиса, то Km + [S] =2[S] И V = Vmax/2.
Приведенное соотношение показывает физический смысл константы Михаэлиса для пары фермент—субстрат: она численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции достигает половит ям максимальной величины.
Необходимо иметь в виду, что кинетика Михаэлиса—Ментен справедлива для многих, но не для всех реакций, катализируемых ферментами. Существенные отклонения от нее обнаруживают,1 в частности, ферменты, активность которых возрастает с увеличением концентрации субстрата.
Величины Vmax и Кщ очень важны для характеристики ферментных реакций; разработан ряд приемов их определения. Наиболее популярен способ расчета данных в соответствии с преобразованным уравнением Михаэлиса—Ментен — так называемый метод двойных обратных величин,/предложенный ГЛайнуивером и Д.Берком. Уравнение Михаэлиса—Ментен преобразуют так, чтобы оно выражало’ величину, обратную скорости реакции 1/V (т.е. время, необходимое для превращения определенного количества субстрата) в функции обратной концентрации субстрата (его разбавления) 1/S:
1 Кт 1,1
V Vmax [8] Vmax
В такой форме уравнение Михаэлиса—Ментен эквивалентно уравнению прямой вида у = ах + Ь, где у = 1/V, х = 1/S,
а-А_ ь-2_
.’max - ’шах
Km 1Vmax Т?Km 1Vmax Т?т.е. описывает прямую, отсекающую отрезки на координатных осях (рис. 10.2). Если при возрастании концентрации субстрата до очень высоких значений 1/ S] стремится к нулю, то 1/V оказывается равным 1/Vmax- Такт образом, измерив отрезок, отсекаемый прямой на оси 1/V, можно вычислить Vmax- Если же 1/V равно нулю, то
Km 1
Vmax Т?
Km 1
Vmax Т?
1
Vmax
и Кт оказывается равной - [S]. 212-
Известны й другие, в том числе и более удобные для Обработки данных, преобразования уравнения Михаэлиса- Ментен, использование которых рписано в, специальных руководствах. В последнее время расчеты на ЭВМ вытесняют графические методы. .
Применение уравнения Михаэлиса—Ментен позволяет количественно. характеризовать эффективность действия ферментов, сравнивать их действие на различные субстраты. Как уже говорилось, значение Кт с определенными оговорками
Рис. 10.2. Зависимость величины, обратной скорости реакции 1/V (время, затрачиваемое на превращение единицы вещества), от величины, обратной концентрации субстрата 1/[S] (разведение):Рис. 10.2. Зависимость величины, обратной скорости реакции 1/V (время, затрачиваемое на превращение единицы вещества), от величины, обратной концентрации субстрата 1/[S] (разведение):-1/Кщ * отрезок, отсёкммый на оси г, 1/ Vbwy ~ отрезок, отсекаемый на оси у-1/Кщ * отрезок, отсёкммый на оси г, 1/ Vbwy ~ отрезок, отсекаемый на оси упозволяет Оценить сродство различных ферментов к их субстратам. Величины Кщ лежат в весьма широком интервале концентраций, обычно начинаясь с миллимолярных. Встречаются и значительно большие значения К^ что может быть связано с использованием субстратов, не
Рис. 10.2. Зависимость величины, обратной скорости реакции 1/V (время, затрачиваемое на превращение единицы вещества), от величины, обратной концентрации субстрата 1/[S] (разведение):
Рис. 10.2. Зависимость величины, обратной скорости реакции 1/V (время, затрачиваемое на превращение единицы вещества), от величины, обратной концентрации субстрата 1/[S] (разведение):
-1/Кщ * отрезок, отсёкммый на оси г, 1/ Vbwy ~ отрезок, отсекаемый на оси у
-1/Кщ * отрезок, отсёкммый на оси г, 1/ Vbwy ~ отрезок, отсекаемый на оси у
вполне отвечающих специфичности фермента. Понятно, что для небольших субстратов, например HCOjj нелегко организовать достаточно
развитую систему взаимодействия с ферментом, поэтому величины Кт, вероятно, будут высокими.
Константы Михаэлиса становятся значительно ниже, связывание —
эффективнее, если субстрат является протяженным и с ним возможно установление большого числа нековалентных контактов. Так, панкреатическая эластаза (фермент, природными субстратами которого являются белки или пептиды) весьма слабо связывает простейший модельный субстрат — метиловый эфир ацетил-Ь-аланина. Кт составляет в этом случае 170 мМ. С удлиненней пептидной цепи Кт быстро понижается, связывание улучшается. Так, для метилового эфира ацетил-ала- нил-ал анина Кщ равна 22 мМ, для метилового эфира ацетил^аланил— аланил-аланина — 0,4 мМ. >
Впрочем, не следует думать, что в процессе эволюции, ферментов действуют факторы, направленные на постоянное понижение Кт и улучшение связывания субстратов. Йо-видимому, достигается оптимальное связывание, характерное для каждой пары фермент—субстрат. В клетке субстраты многих ферментов содержатся в концентрациях,
существенно меньших Km, а следовательно, ферменты не работают в режиме насыщения. Таким образом, для природных систем типична ситуация, когда скорость ферментативной реакции зависит от концентрации субстрата и повышение последней не требует непременно усиления биосинтеза фермента. .■ /V - vt.
А.Фершт и сотрудники, изучая свойства тирозил-РНК-синтетазы, обратили внимание на то, что Кт для одного из субстратов — АТР — равна 2,5 мМ, что на несколько порядков выше констант диссоциации, известных для комплексов АТР е другими белками. Так, Кт миозина по АТР равна 10‘10 мМ. Совершенно очевидно, что прочное, связывание такой крупной молекулы, как аденозинтрифосфат, способной образовывать целую сеть нековалентных связей с белком, вполне осуществимо.- Эта возможность не реализована в тирозцл-тРНК-синтетазе не потому, что фермент несовершенен. Видимо, прочное связывание АТР с участием большого числа фермент-субстратных контактов привело бы к жесткой системе, в которой перемещения субстрата ртноси- тельно каталитического центра были бы крайне затруднены, что снизило бы эффективность катализа. К тому же такое' ’’совершенство” излишне, поскольку внутриклеточная концентрация АТР близка к 2—3 мМ, а значит, ’’идеальный” фермент с лучшим связыванием вряд лй получил бы серьезный выигрыш за счет снижения Кщ.
Важной характеристикой эффективности действия фермента является константа к*2, описывающая распад фермент-субстр^г^ого комплекса с образованием продукта реакции. Как было показано выше, Vmax = k*2 [E^J - Зная общую концентрацию [Е^ (для этого необходимо не просто знать концентрацию болкА в растворе, а определить, пользуясь специально разработанными методами, концентрации активных центров), можно рассчитать число молекул субстрата, преврагца- нпцихся в продукт за единицу времени (1 с) при полном насыщении фермента субстратом. Эта величина, которую называют число оборотов; весьма различна у разных ‘ферментов. Так, для карбангидразы она ‘равна 60 000, для лизоцима — Всего лишь 0,5. Следует подчеркнуть, что число оборотов характеризует максимально возможную скорость работы фермента, но не его эффективность .в реальных условиях; когда насыщения субстратом нет. ' ~
Если механизм превращении ES в продукт более сложен, в частности многостадиен, константу к+2 заменяют константой реакции первого порядка к^ат- *
Более точной мерой эффективности в условиях, приближающихся к реальным, даёт бимолекулярная константа скорости k*2/Km. Подставляя в это выражение Km — (k-i + к+г)/к+1, получим
Анализируя это выражение, можно видеть, что его величина существенно зависит от величины к*ь т.е. от скорости образования комплекса Михаэлиса, а последняя имеет свой предел, определяемый скоростью диффузии частиц в* растворе, и не может превышать числа столкновений субстрата и" фермента. Действительно, известны ферменты, например карбангидраза и ацетилхолинэетераза, для которых величина к^Д» близка к пределу и ограничивается только частотой столкновений фермента и субстрата. .
" * ' 10.4. ИНГИБИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ
Ингнбйронанне, т.е. полное идя частичное подавление активности ферментов при сОхран #ий их первичной н пространственной структуры? — один из важнейших путей регуляций биохимических процессов и в то же время продуктивный способ изучения биокатализа. Различают обратимые и необратимые ингибиторы.
К необратимым относят такие ингибиторы^ которые инактивируют фермент, образуя с i ий связь, Достаточно устойчивую и практически не диссоциирующую в условиях, типичных для его действия. Обычно это ковалентная связь с одной из функциональных групп каталитического центра.
Заметом, что нередко удается подобрать такие условия, при которых / инактивирующая группировка отщепляется и фермент реактивируется, однако поскольку эти условия принципиально отличны от тех, при которых происходило ингибирование, последнее все же считается необратимым. * ■
Для примера рассмотрим ингибирование протеолитического фермента папаина, имеющего в каталитическом центре тиоловую группу цистеина, соединениями ртути. Реакция иона двухвалентной ртути с этой тиоловой группой приводит к образованию трудно диссоциирующего меркаптида:
Папаии^СНа—вН + Hg2t —* Папаин—СН2“S—Hg*
Фермент утрачивает в результате этой реакции активность, и ингибирование в данных условиях необратимо. Однако в присутствии избытка других тиоловых соединений, например меркаптоэтанола, происходит перераспределение ионов ртути между ними и цистеином в
активном центре папаина, вследствие чего последний высвобождается и папаин полностью восстанавливает свою активность:
nanaMH-CH2S-flg* + HSCH2CH20H —* Папаин-СН25Н + *Hg-SCH2CH20H
Такую последовательность превращений использую* на практике как способ хранения папаина, предотвращающий егб саморасщепле- ние, автолиз. .Тем не менее ингибирование ’папаин! ионами ртути рассматривают как необратимое.
- С возможностью действия необратимых ингибиторов следует считаться, в частности, при выделении ферментов. Так; ионы ртути, свинца, меди и ряда других тяжелых металлов, блокируя сульфгидрильные группы некоторых ферментов, могут их инактивировать, что требует тщательного их удаления из растворов, а иногда применения комплексонов. ■
■ Среди необратимых ингибиторов выделяются специфические реагенты на функциональные группы каталитическою центра ферментов. Избирательность их действия повышается, если они содержат структуры, способствующие их- связыванию в активном Центре или, что еще эффективнее, воспроизводят строение переходного фермент-субстрат- ного комплекса. Например, при действии диизопропилфторфосфата на трипсин или другие сериновые протеиназы ингибитор ацилйрует активную гидроксильную группу серина в активном центре фермента, однако образующееся соединение, будучи структурным аналогом переходного состояния, устойчиво к дальнейшему гидролизу, поэтому фермент не может регенерироваться и оказывается необратимо ингибированным. Диизопропилфторфосфат необратимо ингибирует также холинэстеразы, что дедает его сильным ядом. .
Необратимое ингибирование встречается и в природе. Именно так пенициллины инактивируют В,В-кюбРКсипептидазу — фермент, вовлеченный в биосинтез муреина — полимера который входит в структуру стенок бактериальных клеток. Пенициллины, в известной мере имитирующие строение субстрата этого фермента, увязываются с нимки ацилируют с раскрытием ^лактамного цикла гидр оксид ьнутгрутшу серина в активном центре фермента, что вызывает его необратимое ингибирование. ' . . ,
Взаимодействие обратимых ингибиторов с ферментом по схеме
Е+ Д^=± Щ
описывается константой ингибирования Kj, которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермент—ингибитор EI: - . . 216 ■ 1 "
Очевидно, что Kj численно равна концентрации ингибитора, при которой половика молекул фермента оказывается связанной в комплекс фермент—ингибитор.
. Обрати/w^ ингибиторы в свою очередь подразделяют на конкурентные и неконкурентные. К коякуреятныж относятся ингибиторы, взаимодействующие с той же зоной поверхности фермента, которая связывает субстрат, а следовательно, способные конкурировать с ним за фермент. Впрочем, участки связывания субстрата и конкурентного ингибитора вовсе не обязательно совпадают — для конкуретных отношений достаточно их части «него перекрывания. Ввиду этого ингибитор химически может быть и не похож на субстрат, поскольку зоны связывания нередко поливалентны. Так, индол и,/3-нафтол конкурентно ингибируют протеиназу а-химотрипсин, хотя в них трудно усмот-- реть какую-либо аналогию с пептидами. Речь, видимо, идет об использовании в обоих случаях одного и того же гидрофобного участка хи
мотрипсина.5.,.,/,,.•
.Уравнение скорости ферментативной реакции в присутствии конкурентного ингибитора несколько сложнее уравнения Михаэлиса— Ментен:. -
)
- УУЙ-КДГЮТТГО) '
Введение ’’кажущейся" константы Михаэлиса К^ = Km(l + [I]/[Ki]) приводит ' уравнение к канонической форме уравнения Михаэли- са—Ментен1. ‘Таким образом, присутствие в системе конкурентного ингибитора Эквивалентно увеличению константы Михаэлиса, причем степень этого увеличения определяется величиной отношения концентрации ингибитора к константе ингибирования, Т.е. к параметру, характеризующему йфд^ность взаимодействия данного ингибитора' с ферментом. 1,
.Понятно, что максимальная скорости и соответствующая константа ккат характеризуют скорость превращения в продукт уже образовавшегося фермент-субстратного комплекса, поэтому на них присутствие конкурентного ингибитора повлиять не может. Изменение же кажущейся константы Михаэлиса учитывает снижение эффективной концентрации фермента, Поскольку комплекс фермейт—конкурентный ингибитор с субстратов не взаимодействует:
Конкурентное ингибирование распространено в природе, его используют в практических целях для регулирования активности ферментов. По этому механизму действуют, например, природные ингибиторы протеиназ и амилаз, комплементарность которых соответствующим активным центрам так велика и связывание- столь сильно, что их действие нередко выглядит как практически необратимое ингибирование из-за очень малых величин констант диссоциации комплексов, фермент-ингибитор. Многие лекарственные препараты, нацеленные на подавление нежелательной активности фермента, конструируются как конкурентные ингибиторы, причем подбираются такие их структуры, которые максимально соответствуют строению зоны связывания фермента, чтобы понизить Кр Так; аналоги субстратов ренина — протеиназы, вовлеченной в регуляцию давления крови, — которые вместо расщепляемой ферментом пептидной связи —СО—МН—содержат устойчивую к гидролизу структуру, например, -Ч)0*-СН2~', имеют Kj порядка 1 • 10"9М и могут иметь терапевтическое значение.
Неконкурентное ингибирование принципиально отличается от конкурентного: в этом случае ингибитор не затрагивает зону связывания субстрата, а присоединяется к ферменту по иному пути, вызывая инактивацию каталитического центра. Поскольку ингибитор и субстрат связываются в Таком случае различными участками фермента, ингибитор может присоединяться как к свободному ферменту, так и к фер- мент-субстратному комплексу, в обоих случаях инактивируя фермент. Именно независимость зон связывания делает невозможной конкуренцию между субстратом и ферментом; следовательно, неконкурентное ингибирование не может быть снято избытком субстрата. f '
Итак, для неконкурентного Ингибирования справедлива следующая схема:/ ,
+S■-
Е зй:18 —*Е + Р
I+ll !Н.
EI S^EIS-
+S
Уравнение скорости ферментной реакции в присутствии неконкурентного ингибитора выглядит следующим образом:*
218. ..
V - [I] + Ki [S] + Km ■
Как уже говорилось, характер связывания субстрата ферментом в присутствии неконкурентного ингибитора не изменяется, отсюда и сохранение Кго. Напротив, величина ¥щах корректируется множителем Ii/([I] + Kt),, величина которого тем меньше, чем больше концентрация ингибитора по сравнению с константой ингибирования. Здесь снова концентрация действующего вещества, в данном случае ингибитора, сравнивается с характерной для него константой ингибирования^ Уменьшение^эффективной максимальной скорости соответствует снижению активности каталитического .центра при связывании неконкурентного ингибитора. ч>-
Неконкурентное ингибирование может быть следствием нескольких способов взаимодействия фермента и ингибитора. Возможно, ингибитор, связывающийся-с функциональными группами каталитического центра, настолько мал, что не вызывает помех связыванию субстрата,— так, 'Например, могут вести себя- ионы водорода, протонирующие функциональные группы, которые участвуют в катализе.
Ингибитор может связываться на участке, примыкающем к каталитическому центру, и перекрывать последний, практически не затрагивая зоны связываний субстрата. Такие; ситуации особенно вероятны для ферментов с несколькими субстратами, которые связываются каждый на своем участке. Наконец в особенности, для ферментов сложной структуры, возможно, что присоединение ингибитора к участку, отдаленному от каталитического центра, вызовет такие изменения в структуре фермента, которые передадутся в активный центр и нарушат его строение, вызвав инактивацию фермента. Это частный случай аллостерического ингибирования ферментов, весьма распространенного механизма регуляции их активности. /. г , i
Принципы'функционирования,: общие для всехферментов, реализуются в Каждом случае в свойственный данному ферменту способ связывания субстрата и каталитический механизм. Если связывание субстратов и обусловленная им специфичность ферментов получили в последние годы достаточно подробное описание, то способ действия каталитического центра- практически ни в одном случае не может считаться окончательно установленным, хотя для ряда ферментов предложены механизмы, весьма близкие к реально существующим. Мы рассмотрим данные о механизме функционирования некоторых ферментов, уделяя особое внимание чертам,, имеющим общее значение й типичным для биологических катализаторов различной природы. '1
СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ
Сериновые протеиназы, названные так по аминокислотному остатку, характерному для их активных центров, широко распространены в природе и вместе с протеолитическими ферментами других классов (^аспартильными, цистеиновыми и металлопротеиназами) обеспечивают глубокое расщепление белков — основу их катаболизма — и целый ряд реакций ограниченного протеолиза, имеющих регуляторное значение. Известно несколько семейств, объединяющих эволюционно родственные сериновые протеиназы. Для животного мира очень характерны многообразные сериновые протеиназы, принадлежащие к семейству химотрипсина, т.е. сходные с химотрипсином (наиболее изученным ферментом этого типа) по пространственной структуре, строению и механизму действия каталитического центра. К этому же семейству относятся некоторые сериновые протеиназы стрептомицетов. Сериновые протеиназь другого семейства — субтидизины -т особенно характерны для прокариот, но встречаются также в растениях и животных. Известно и третье семейство — сериновые карбоксипептидазы, продуцируемые животными, грибами, дрожжами и растениями. Однотипность строения каталитических центров и глубокое сходство механизмов действия ферментов этих семейств, совершенно не похожих друг на друга по пространственной структуре, объясняются, по-видимому, конвергентной эволюцией белков-Предшественников.
В дальнейшем изложении обобщены данные о механизме действия сериновых протеиназ.
. - ■10.6.1. Связывание субстрата
Зона связывания субстрата в Протеиназах, участвующая в образовании . комплексов с белками или их фрагментами, достаточно протяженна. Обычно с ней могут взаимодействовать 5—8 аминокислотных остатков — по 2—4 по обе стороны расщепляемой пептидной связи. Наблюдать связывание истинных субстратов — пептидов значительной длины — методами рентгеноструктурного анализа не удается из-за чрезвычайно малых времен существования таких комплексов, в которых субстрат, быстро расщепляется. Ввиду этого исследуют комплексы ферментов с аналогами субстратов. Так, подробно описано взаимодействие альдегидопептидов (соединений, в которых С-концевой остаток заменен амицоальдегидом) с ферментом семейства химотрипсина — протеиназой А стрептомицетов:
Аминоальдегид
"При взаимодействии с сериновой протеиназой альдегидная группа образует полуацеталь с гидроксилом. серина активного центра. Эта связь служит моделью переходного фермент-субстпратного комплекса, получающегося при взаимодействии с гидроксильной группой остатка серина в активном центре и карбонила расщепляемой пептидной связи:<
НН
II
10КО
- ri :и
-aMiH-CH~€-0~CH2-(Ser) -C0-NH-CH-C~0-CH2-(Ser)
НNH-
ПолуацетальПродукт взаимодействия
фермента с пептидной. группой
Образующийся весьма стабильный комплекс позволяет описать систему взаимодействий между -ферментом и субстратом на участке, предшествующем атакуемой пептидной связи. Взаимодействия фермента и С-концевой части субстрата изучали на других моделях, в_
частности на комплексах ферментов и природных белковых ингибиторов протеиназ.. . л . *
На участке, предшествующем атакуемой пептидной связи, фермент формирует с субстратом своего рода антипараллельную /3-структуру, образуя три водородные связи. Их дополняют еще четыре водородные связи с функциональными группами каталитического центра. Уклады
вание пептидного субстрата в зоне связывания сопровождается небольшим смешением окружающих ее участков фермента, а также отщеплением цепочки молекул воды, которце гидратировали функциональные группы свободного фермента, образуя с ними водородные связи.
Система водородных связей между субстратом и ферментом дополняется рядом гидрофобных контактов. Важнейшие из них образует боковая цеПь того аминокислотного остатка, карбонильная группа которого принадлежит атакуемой ферментом пептидной связи. Согласно принятой номенклатуре, такой аминокислотный остаток обозначают Р1, предшествующий ему — Р2,. далее Pg, Р4 и т.д., следуя к аминокон- 221
цевому остатку субстрата. Остаток, чья аминогруппа образует атакуемую связь, обозначают Рр следующий — Р^ и т.д. Соответствующие этим остаткам 'участки зоны связывания субстрата обозначают S4, S3, 82» Si, Sp 82*
Протеиназа. А стрептомицетов, гидролизующая пептидные связи, в которых участвует карбоксильная группа гидрофобных аминокислот, т.е. близкая по специфичности к" химотрипсину, образует с боковой цепью остатка* Pi около 40 нековалентных контактов. Связывание этой гидрофобной группы сопровождается' вытеснением молекул воды из гидрофобной впадины Si- Столь развитая система нековалентных контактов придает особо важное значение остатку Pi, природа, которого в основном определяет выбор расщепляемой пептидной связи сериновыми протеиназами, иными словами, специфичность этих ферментов, хотя последняя зависит (пусть в меньшей степени) и от соседних аминокислотных остатков.
Интересно, что в образовании гидрофобных контактов с субстратом участвуют остатки аланина, глицина, треонина, глутамина, пролина, выстилающие зону Si фермента. На первый взгляд, участие этих,' в большинстве своем гидрофильных, аминокислот в построении гидрофобной зоны связывания парадоксально, однако в этом сказывается принципиальная разница в поведении одних и jex же остатков в растворе и при включении в фиксированную пространственную структуру белка. В последней даже лгетиленовая группа глицина, будучи ^как бы отделенной, изолированной от гидрофильных пептидных связей, способна вести себя как гидрофобный элемент. Такие небольшие сами по * себе элементы, закрепленные в пространстве водородными связями соседних групп, образуют своего рода гидрофобную мозаику, выстилающую впадину, "карман" в зоне связывания субстрата **
Видимо, такой способ формирования 'идрофобнЫХ зон Даже эф-' фективнее, чем использование для этой цели-отчетливо гидрофобных аминокислот с крупными боковыми группами, поскольку зафиксировать последние в поверхностной руктуре белка, в частности лиГпить их способности вращаться, сложнее, чем1 фиксировать- маленький гидрофобный элемент. ” ' ’ ' , - ., •' т
У сериновых протеиназ, специфически расцепляющих пептидные связи, которые образованы карбоксильными, группами Лизина или1 аргинина — трипсина и его аналогов, — такжё реаЛизутЬтся множест-1 венные контакты между полипептидной цепью субстрата и ферментом.'! И в этом случае особенно важно установление системы водородных-1 связей между пептидной цепью субстрата и ферментом: ' -г
Пептидная цепь, остатков Pj“Fз субстрата•<•('<'. X •■ , Vf, )..Пептидная цепь, остатков Pj“Fз субстрата•<•('<'. X •■ , Vf, )..Аминокислотные остатки ферментаАминокислотные остатки ферментаАминеякислотные остатки фермента (трипсина)Аминеякислотные остатки фермента (трипсина)
Пептидная цепь, остатков Pj“Fз субстрата
•<•('<'. X •■ , Vf, )..
Пептидная цепь, остатков Pj“Fз субстрата
•<•('<'. X •■ , Vf, )..
Аминокислотные остатки фермента
Аминокислотные остатки фермента
Аминеякислотные остатки фермента (трипсина)
Аминеякислотные остатки фермента (трипсина)
-^няш2-^няш2Связывание остатка Pi в основном определяется электростатическими взаимодействиями между катионны пи группами в боковой Цепи субстрата "*NHg в случае лизина .или гуанидиниевой группой
-^няш2
-^няш2
*' в случае аргинина — и карбоксилат-анионом остатка
№2 ‘
аспарагиновой кислоты, расположенного на дне гидрофобной впадины Si (Asp-189,b трипсине) (рис. 1Q.3). Такому электростатическому взаимодействию благоприятствует изоляция ионной пары от контакта с водой. ;1 . - .
Кроме того, оно дополняется системой водородных связей между гуанидо или ^ иногруппой субстрата и карбоксилат-ионом Asp 189, а также кислородными атомами ряда С=0-трупп фермента. Замена остатка Asp-189 на остаток лизина в трипсине, проведенная методами белковой инженерий, радикально изменила специфичность фермента, который перестал гидролизовать пептидные связи аргинина и лизина, но приобрел (правда, слабую) способность расщеплять; связи, образованные гидрофобными остатками фенилаланина, лейцина, тирозина т.е. по специфичности стал близким другому ферменху того же семейства — химотрипсину. . .
- . "" ■ 223
5er-zso5er-zsoРис. 10.3. Разме1Цёнйе боковой цепи остатка Pi субстрата в зоне. Si трипсина. Л - взаимодействия NH 3-группы лизина, Б - гуанидо группы аргинина:полыми кружками обозначены атомы кислорода, зачерненными - азота,' IV - молекулы воды, удерживаемые ферментом; пунктиром показаны водородные связи, цифрами - их длина в ангстремахРис. 10.3. Разме1Цёнйе боковой цепи остатка Pi субстрата в зоне. Si трипсина. Л - взаимодействия NH 3-группы лизина, Б - гуанидо группы аргинина:полыми кружками обозначены атомы кислорода, зачерненными - азота,' IV - молекулы воды, удерживаемые ферментом; пунктиром показаны водородные связи, цифрами - их длина в ангстремахИногда остаток Pi не столь доминирует в определении специфичности, и больший вес приобретают взаимодействия с ферментом других аминокислотных остатков субстрата. Например, специфичность калликреина — аналога трипсина, вовлеченного в регуляторные механизмы у животных, — определяется присутствием аргинина в положении Pi и'гидрофобного остатка в положении Р2 субстрата и оказывается, таким образом, гораздо более узкой.
5er-zso
5er-zso
Рис. 10.3. Разме1Цёнйе боковой цепи остатка Pi субстрата в зоне. Si трипсина. Л - взаимодействия NH 3-группы лизина, Б - гуанидо группы аргинина:
полыми кружками обозначены атомы кислорода, зачерненными - азота,' IV - молекулы воды, удерживаемые ферментом; пунктиром показаны водородные связи, цифрами - их длина в ангстремах
Рис. 10.3. Разме1Цёнйе боковой цепи остатка Pi субстрата в зоне. Si трипсина. Л - взаимодействия NH 3-группы лизина, Б - гуанидо группы аргинина:
полыми кружками обозначены атомы кислорода, зачерненными - азота,' IV - молекулы воды, удерживаемые ферментом; пунктиром показаны водородные связи, цифрами - их длина в ангстремах
При действии протеиназ на нативные белковые субстраты специфичность гидролиза определяется не только и даже не столько последовательностью аминокислот расщепляемого участка, сколько его пространственной, стерической доступностью. Так, погружение всего активного центра калликреина в своего рода впадину за счет удлинения прилегающих к нему пептидных петель фермента делает практически невозможным гидролиз обычных белковых субстратов, даже если онц содержат последовательность гидрофобный остаток •— аргинин- Калликреин атакует только такой белок, в котором соответствующая его специфичности последовательность расположена на выступе белка-су^трата, комплементарном впадине активного центра фермента. Так,достигается очень узкая практически уникальная специфичность калликреина — фермента, участвующего в отщеплении вазоактивных пептидов от белковых предшественников, но практически не действующего на другие белки. ., ,
Отметим еще одну особенность связывания белковых субстратов в активном центре протеиназ. При образовании комплексов с достаточно 224 *
длинными пептидами, перекрывающими активный центр, укладка 1полипептидной цепи в зоне связывания требует, как предполагают, (определенного ее "перекручивания”, некоторого искажения плоскостной структуры атакуемой ферментом пептидной связи, что создает благоприятные условия для ее перехода из плоской в пирамидальную конфигурацию, близкую к переходному состоянию. Следовательно, уже на стадии образования комплекса Михаэлиса при связывании -субстрата подготавливается стереохимический переход, имеющий ключевое значение для эффективного катализа.
Характерные для сериновых протеиназ черты связывания субстрата — множественность взаимодействий, точность ориентации относительно групп каталитического центра и преимущественное связывание конформации, стереохимически приближенной к той, которая существуй1 в переходном комплексе, — типичны для многих ферментов. Необходимо подчеркнуть, что две важнейшие стадии катализа — связывание субстрата и собственно каталитическое превращение, — хотя и рассматриваются . раздельно, в действительности слиты в единый механизм.
10.5.2. Каталитический механизм
Топография каталитического центра сериновых протеиназ описана достаточно подробно. Изучение структуры комплексов ферментов этого класса с различными аналогами субстратов и ингибиторами в сочетании с данными по кинетике катализа, химической модификации отдельных групп фермента, метода ЯМР и белковой инженерии привели к следующим представлениям о механизме действия 'сериновых протеиназ.
В превращении субстратов наибольшая роль принадлежит гидроксильной группе серина-195 (здесь и далее нумерация остатков дается по последовательности наиболее изученного фермента — «-химотрипсина), имидазолу His-57, Д-карбоксильной группе Asp-102, а также пептидным* группам остатков Ser-195 и Gly-193. Таким образом, в сериновых протеиназах, как и в других ферментах, активный центр собран из. аминокислотных остатков, расположенных в совершенно разных участках полипептидной цепи, но сближенных в пространственной структуре фермента (рис. 10.4).
Как правило, компоненты каталитического центра взаимодействуют с соседними группами фермента, что закрепляет их в определенной ориентации и видоизменяет химические характеристики. Например, •карбоксильная группа остатка Asp—102 образует с соседями четыре водородные связи, которые стабилизируют ее анионную форму и, как
225
Рис. 10.4. Расположение функциональных групп в каталитическом центре сериновыхРис. 10.4. Расположение функциональных групп в каталитическом центре сериновыхпротеиназпротеиназПоказаны компоненты каталитического центраПоказаны компоненты каталитического центракольца His-57. Последнеекольца His-57. Последнее- остатки серина, гистидина и аспарагиновой- остатки серина, гистидина и аспарагиновойочень характерно дляочень характерно для
Рис. 10.4. Расположение функциональных групп в каталитическом центре сериновых
Рис. 10.4. Расположение функциональных групп в каталитическом центре сериновых
протеиназ
протеиназ
Показаны компоненты каталитического центра
Показаны компоненты каталитического центра
кольца His-57. Последнее
кольца His-57. Последнее
- остатки серина, гистидина и аспарагиновой
- остатки серина, гистидина и аспарагиновой
очень характерно для
очень характерно для
следствие, смещают рКа этого остатка к 2—3 вместо 3,6 (величины, характерной для обычной Д-карбоксиль- ной группы аспарагиновой кислоты). Соседство этого карбоксилат-иона стабилизирует протон на одном из атомов имидазольной группы гистидина — именно на том, который обращен к Asp-102, — и вместе с тем определенную электронную
структуру имидазольного
функциональных групп белка и не имеет аналогий в поведении таких же групп, в частности имидазольной, в небольших молекулах. Окружение функциональных групп в белке анизотропно. ,функциональных групп белка и не имеет аналогий в поведении таких же групп, в частности имидазольной, в небольших молекулах. Окружение функциональных групп в белке анизотропно. ,кислоты; зачернены атомы азота и кислорода, участвующие в механизме катализа. Прерывистыми линиями обозначены водородные связи. Нумерация дана по аминокислотной последовательности химотрипсина; в других сериновых протеиназах эти аминокислоты могут занимать другие места в первичной структуре фермента, но их относительное расположение в пространстве строго сохраняется
функциональных групп белка и не имеет аналогий в поведении таких же групп, в частности имидазольной, в небольших молекулах. Окружение функциональных групп в белке анизотропно. ,
функциональных групп белка и не имеет аналогий в поведении таких же групп, в частности имидазольной, в небольших молекулах. Окружение функциональных групп в белке анизотропно. ,
Влияние микроокружения на поведение функциональных групп в ферменте весьма существенно, и все же реакционная способность ком
понентов активного центра сериновых протеиназ в отсутствие субстг-
рата не обнаруживает резких различий, которые выходили бы за рамки обычных вариаций в химических свойствах функциональных групп на поверхности белка. Так, сообщения о том, что имидазол His- 57 и карбоксил Asp-102 в активном центре белка как бы поменялись свойствами, причем имидазол оказался более кислым, чем карбоксильная группа, оказались ошибочными. Точно так же нельзя думать, что в свободном ферменте происходит эстафетный перенос отрицательного заряда от карбоксилат-иона Asp-102 на Ser-195 и гидроксил последнего превращается в гидроксидный ион — чрезвычайно сильный нуклеофил. Такая передача заряда была , бы сразу же обесценена реакцией
гидроксид-иона с водой:
Ser-СН2—0" 4- Н-О-Н —► Ser-CH2H)H + 0Н'
Напротив, в фермент-субстратном комплексе химические свойства" участников каталитического процесса, в том числе функциональных 226 ■ ■
Рис. 10.5. Механизм действия сериновых протеиназ:
А - функциональные группы в активном центре фермента. В левой полусфере - имидазол гистидина, за которым расположен карбоксил остатка аспарагиновой кислоты, фиксированный системой водородных связей, в правой - боковая цепь серина и две водородные связи оксианионной впадины;
Б - в правой полусфере - продукт взаимодействия субстрата (показан тирозин в положении Pj), кислород размещен в оксианионной впадине; протон, покинувший кислород гидроксильной группы серина, перемещается к азоту имидазола и далее - к атому азота расщепляемой пептидной связи;
В - молекула воды разместилась вблизи атома углерода карбонильной группы, причем ее протон переместился к азоту имидазола гистидина;
Г - гидроксильная группа воды присоединилась к углероду карбонильной группы, чем завершилось расщепление пептидной группы
групп каталитического центра, меняются очень существенно, что определяется не только развитой системой нековалентных взаимодействий, охватывающей ферменто-субстратный комплекс, но и изоляцией всей системы от воды. По справедливому замечанию М.Дьюара, само связывание фермента и субстрата предполагает как необходимую предпосылку отделение молекул воды, окружающих до реакции субстрат и заполняющих зону активного центра фермента. Вследствие этого каталитическая реакция переносится в совершенно иную среду. Это сообра •227
жение еще раз подчеркивает неразрывную связь обеих сторон биоката- литического процесса — связывания и собственно превращения субг страта.,
Гипотетический механизм действия сериновых протеиназ может быть описан следующим образом (рис. 10.5). Необходимо учитывать, что происходящие последовательно процессы в действительности могут протекать синхронно.
Связывание полипептидного субстрата в активном центре ставит карбонильную группу атакуемой пептидной связи в такую позицию, что ее кислород оказывается в так называемой оксианионной впадине. Образование этим атомом двух водородных связей с соответствующим образом ориентированными N~fl-группами, принадлежащими пептидным связям остатков Ser-195 и Gly-193, способствует поляризации связи С=0 и ее переходу в *С — 0‘, стабилизирует оксианион. Положительный заряд на углероде карбонильной группы за счет точного связывания субстрата фермейтом пространственно сближен с кислородом гидроксильной группы серина. Это вызывает поляризацию гидроксильной группы, которая принимает структуру, близкую к ~СНгтО'--- Н*, что резко усиливает нуклеофильность атома кислорода серина.
Таким образом, в рассматриваемой схеме увеличение нуклеофильности серина происходит под влиянием соответственно ориентированного и поляризованного 5а счет взаимодействия с ферментом карбонила субстрата, причем последний экранирует нуклеофил, защищая его от воды.
Ser-195К имидазолу Ser-195Ser-195К имидазолу Ser-195Далее образуется ковалентная связь между углеродом субстрата и кислородом субстрата, вероятно, более длинная и менее прочная, чем обычно (рис. 10.5, Б):,
Ser-195К имидазолу Ser-195
Ser-195К имидазолу Ser-195
Н ♦— ОксианионнаяН♦— Оксианионная~
впадина|впадина
NN
Протон, отщепившийся от гидроксила серина, перемещается по
траектории, которая задана имидазольной группой His-57, приближаясь к непротонированному атому азота, а затем переходит к **NH-rpyn- пе расщеплямой пептидной связи. Как известно, атом азота в пептидных группах практически лишен основных свойств из-за смещения свободной электронной пары, обслуживающей связь C~N, которая носит характер частично двойной. Однако после поляризации карбонильной группы в оксианионной впадине плоскостной характер пептидной связи утрачивается, связь С-N становится простой и атом азота приобретает свойства весьма сильного основания. Ввиду этого протон от имидазольной группы — слабого основания — переходит к группе —NH— описав своего рода дугу. Связь C~N разрывается и фрагмент пептидного субстрата высвобождается (рис. 10.5, В):
Структура, близкая к ацилферментуСтруктура, близкая к ацилферментуN—Концевой фрагмент субстратаN—Концевой фрагмент субстратаОксианионная впадинаОксианионная впадинаC-Концевой фрагмент субстратаC-Концевой фрагмент субстрата
Структура, близкая к ацилферменту
Структура, близкая к ацилферменту
N—Концевой фрагмент субстрата
N—Концевой фрагмент субстрата
Оксианионная впадина
Оксианионная впадина
C-Концевой фрагмент субстрата
C-Концевой фрагмент субстрата
Таким образом, выполнена первая задача катализа — расщеплена пептидная связь и высвобожден С-концевой фрагмент пецтида. Оставшаяся часть пептида (от остатка Pi до аминного конца) пока сохраняет связь с ферментом через остаток серина. По-видимому, эта связь может в определенных условиях стабилизироваться за счет восстановления карбонильной группы, взаимной компенсации положительного и отрицательного зарядов, так что фрагмент пептида образует с ферментом сложноэфирную связь — образуется так называемый ач1илферл1ент: -
SerSerАцилферментАцилферментN-Концевая часть субстратаN-Концевая часть субстрата
Ser
Ser
Ацилфермент
Ацилфермент
N-Концевая часть субстрата
N-Концевая часть субстрата
Действительно, при действии сериновых протеиназ на некоторые аналоги субстратов удается наблюдать, а иногда и выделить достаточно устойчивый ацилфермент. При гидролизе обычных субстратов, однако, Такая стабилизация, видимо, не обязательна и гидролизу подвергается производное с поляризованной карбонильной группой. Во всяком случае, после ухода С-концевого фрагмента пептида молекула воды занимает освободившееся место и располагается так, что образует водородную связь с азотом имидазольной группы, тогда как ее атом кислорода оказывается сближенным с положительно заряженным атомом углерода карбонильной группы. Это приводит к отщеплению протона, присоединяющегося к имидазолу, и образованию гидроксильного иона, легко взаимодействующего с положительно заряженным углеродом карбонила. Протон мигрирует к кислороду серина, в результате ч^го с расщеплением связи С-0 восстанавливается гидроксильная группа активного центра и высвобождается N-концевой фрагмент пептида, чем и завершается каталитический цикл (рис. 10.5, Г):
His-57His-57Ser-195
His-57
His-57
|I N-Концевой фрагмент
C====CHСН2 субстрата
III
H-NN...H
^СН^ ^O-t *с-—С
«А
Оксианионная впадина
Оксианионная впадина
His-57Ser-195
HH~0—C—CQ*— N-Концевой фрагмент
I] пептида
0
Эта стадия реакции протекает в целом аналогично первой, однако роль гидроксильной группы серина переходит к молекуле води.
Если принять, что происходит стабилизация промежуточного продукта и образуется ацилфермент, механизм гидролиза последнего окажется практически таким же. Следует лишь предположить поляризацию С=0-связи в сложноэфирной группе ацилфермента за счет водородных связей в оксианионной впадине, что приведет к появлению положительного заряда на атоме углерода карбонильной группы, т.е. к образованию того же самого промежуточного продукта, судьба которого прослежена выше.
Важнейшей чертой рассмотренного механизма действия сериновых протеиназ, по-видимому, типичной и для других ферментов, является стабилизация тетраэдрического переходного состояния в фермент- субстратном комплексе. Характерно, что весьма эффективными ингибиторами сериновых протеиназ являются алкилборные кислоты, в которых предсуществует тетраэдрическая конфигурация заместителей — трех гидроксильных групп и алкильного остатка, — имитирующая структуру переходного состояния. Особенно эффективны производные боронатного аналога фенилаланина, который связывается в участке Si за счет бензильной группы и в каталитическом центре; соответствующая константа ингибирования К) составляет 10*8 1:
Ser
I .
сн2
I
>
^А ♦— Взаимодействия в зоне Si
N)"
^ Оксианионная впадина
Алъдешдопептпиды — ингибиторы сериновых протеиназ, как упоминалось, образуют с серином активного центра ковалентную полуацетальную связь — структуру, аналогичную в известной мере ацилфер- менту. При этом свободный гидроксил связывается в оксианионной впадине так же, как это происходит с кислородом карбонильной группы в фермент-субстратном комплексе.
Хорошо известны ингибиторы сериновых протеиназ, которые при взаимодействии с ферментом проходят первую фазу каталитического процесса и образуют ацилфермент. Некоторые такие производные гидролизуются с измеримой скоростью, однако другие, в частности производные арилсульфофторидов и ряд фосфорорганических соединений, оказываются стабильными, что приводит к необратимому ингибированию фермента. Ниже показаны структуры стабильных ацилфер- ментов, получающихся при ингибировании сериновых протеиназ фе- нилметилсульфонилфторидом (слева) и диизопропилфторфосфатом (справа):
CH2-(Ser)СН2—(Ser)
Оо
II
0=8=0'0—Р=0
II
сн2о
Изложенные выше представления о механизме действия сериновых протеиназ подтверждены методами белковой инженерии. Замена серина активного центра в ряде ферментов этого семейства (при помощи сайт-специфичного мутагенеза) на аланин неизменно приводит к практически полной утрате активности. Замена компонентов каталитического центра в субтилизине (протеиназе бацилл) дала следующие результаты. Замена серина Ser-221 (остатка, соответствующего Ser-195 в химотрипсине) аланином снижала активность фермента примерно в 106 раз, причем практически весь эффект приходился на снижение каталитической константы ккат, а константа Михаэлиса сохраняла свое значение. Такие же результаты давала замена гистидина каталитического центра аланином. Несколько меньшим, но все же очень значительным, было падение ккат при замене Asp-32 аланином, ккат в этом случае составляла 4*10‘6 от величины, характеризующей исходный фермент. 232
Таким образом, все компоненты "триады” каталитического центра критически важны для эффективного катализа. Роль остатка аспарагиновой кислоты, которая может показаться менее значимой с учетом приведенного выше механизма, видимо, состоит в том, что карбоксилат-анион этого остатка, во-первых, фиксирует в пространстве имидазольное кольцо гистидина каталитического центра и, во-вторых, обеспечивает закрепление приведенного выше на схемах таутомерного состояния имидазольной группы.
Труднее анализировать этим методом роль N-Н-групп, образующих оксианионную впадину, так как в химотрипсине и гомологичных ему ферментах обе они принадлежат пептидному скелету. Однако в субти- лизине роль одного из компонентов оксианионной впадины выполняет амидная группа аспарагина. Замена этого остатка лейцином снижает эффективность поляризующего действия оксианионной впадины на С=0-группировку субстрата, вследствие чего активность снижается примерно в 103 раз, сохраняя тем не менее вполне заметный уровень.
10.6. ЛИЗОЦИМ
. Лизоцим относится. Лизоцим относитсяк классу гидролаз и представляет собой срав
. Лизоцим относится
. Лизоцим относится
нительно небольшой фермент, избирательно гидролизующий гликозидные. связи в муреине — сложном биополимере, из которого построены стенки бактериальных клеток. Структурную основу муреина (рис. 10.6) составляют полисахаридные цепи чередующихся остатков N-ацетйлглюкоза- мина и N-ацетилмура-
мовой кислоты, соединенных 1,4-Д-глико- зидными связями. К карбоксильным группам лактильных остатков N-ацетилмурамовой кислоты присоединены своеобразно построен-
Р-Гликоэидмая связьР-Гликоэидмая связьNAMNAMNAGNAGРис. 10.6. Повторяющееся дисахаридное звено в полисахаридной цепи муреинаРис. 10.6. Повторяющееся дисахаридное звено в полисахаридной цепи муреинаК карбоксильной группе лактильного фрагмента N-ацетилмурамовой кислоты (NAM) присоединяются поли- пептидные мостики, соединяющие полисахаридные цепи. Лизоцим атакует /Гликозидную связь между остатками NAM и N-ецетилглюкозамина (NAG), так' что атом кислорода этой связи оказывается у N-ацетилглю- козаминаК карбоксильной группе лактильного фрагмента N-ацетилмурамовой кислоты (NAM) присоединяются поли- пептидные мостики, соединяющие полисахаридные цепи. Лизоцим атакует /Гликозидную связь между остатками NAM и N-ецетилглюкозамина (NAG), так' что атом кислорода этой связи оказывается у N-ацетилглю- козамина2332338*-5б,
Р-Гликоэидмая связь
Р-Гликоэидмая связь
NAM
NAM
NAG
NAG
Рис. 10.6. Повторяющееся дисахаридное звено в полисахаридной цепи муреина
Рис. 10.6. Повторяющееся дисахаридное звено в полисахаридной цепи муреина
К карбоксильной группе лактильного фрагмента N-ацетилмурамовой кислоты (NAM) присоединяются поли- пептидные мостики, соединяющие полисахаридные цепи. Лизоцим атакует /Гликозидную связь между остатками NAM и N-ецетилглюкозамина (NAG), так' что атом кислорода этой связи оказывается у N-ацетилглю- козамина
К карбоксильной группе лактильного фрагмента N-ацетилмурамовой кислоты (NAM) присоединяются поли- пептидные мостики, соединяющие полисахаридные цепи. Лизоцим атакует /Гликозидную связь между остатками NAM и N-ецетилглюкозамина (NAG), так' что атом кислорода этой связи оказывается у N-ацетилглю- козамина
233
233
ные пептидные цепочки,"' поперечно соединяющие полисахаридные цепи в протяженную двумерную структуру. Известны лизоцимы животных, содержащиеся преимущественно в секрете слизистых оболочек, которые они защищают от микроорганизмов, лизоцимы бактериофагов, используемые для проникновения в бактериальную клерку и выхода из нее зрелого фага. Наиболее подробно изучен лизоцим бедка куриною яйца, который и будет рассматриваться далее. Он состоит из одной полипептидной цепи, содержащей 129 аминокислотных остатков.
Имеющиеся сведения о механизме действия лизоцима основаны по преимуществу на данных рентгеноструктурного анализа фермента и его комплексов с аналогами субстрата — олигосахаридами, построенными из N-ацетилглюкозамина.
Рис. 10.7. Связывание субстрата в активном центре лизоцимаРис. 10.7. Связывание субстрата в активном центре лизоцимаПоказана система водородных связей (обозначены стрелками), обеспечивающих связывание части субстрата - колец А, В, С. Эти связи дополняются ван-дер-ваальссвыми контактами, в частности с индольным кольцом триптофанаПоказана система водородных связей (обозначены стрелками), обеспечивающих связывание части субстрата - колец А, В, С. Эти связи дополняются ван-дер-ваальссвыми контактами, в частности с индольным кольцом триптофана- Г)П}. .- Г)П}. .
Рис. 10.7. Связывание субстрата в активном центре лизоцима
Рис. 10.7. Связывание субстрата в активном центре лизоцима
Показана система водородных связей (обозначены стрелками), обеспечивающих связывание части субстрата - колец А, В, С. Эти связи дополняются ван-дер-ваальссвыми контактами, в частности с индольным кольцом триптофана
Показана система водородных связей (обозначены стрелками), обеспечивающих связывание части субстрата - колец А, В, С. Эти связи дополняются ван-дер-ваальссвыми контактами, в частности с индольным кольцом триптофана
- Г)П}. .
- Г)П}. .
Образование комплекса протяженного полисахарида и фермента является результатом множественных нековалентных взаимодействий между ферментом и шестью последовательно расположенными моносахаридными звеньями А—В—0—D—Е—F, укладывающимися в зоне связывания субстрата (рис. 10.7).
По-видимому, наиболее прочно связывается звено С субстрата, расположенное неподалеку от расщепляемой гликозидной связи. С ним фермент образует четыре водородные связи — две за счет ацетамидной группировки субстрата, которая формирует нечто вроде Р- структуры с карбонильной группой остатка 107 и NH-группой остатка 59, и еще две связи за счет NH-групп индольных колец триптофана Тгр-62 и Тгр-63. Предшествующие звену С звенья А и В образуют с ферментом по одной водородной связи.
Определенную роль в формировании фермент-субстратного комплекса играют и ван-дер-ваальсовы взаимодействия, в частности между кольцом В и остатком Тгр-62. Впрочем, мутанты лизоцима, в которых этот остаток заменен на тирозин, фенилаланин или гйстидин, обладают даже несколько большей активностью.' Характерно, что укладка первых трех звеньев полисахаридной цепи — А, В и С — требует локальных изменений в прилегающих участках фермента. Так, индольное кольцо Тгр-62 перемещается на 0,7 А, Освобождая место для .плотного укладывания субстрата.
Есть основания полагать, что образование фермент-субстратного комплекса начинается со связывания моносахаридных звеньев А, В и С, вслед за которыми во впадину на поверхности фермента укладываются еще три звена: D, Е и F. Непосредственно наблюдать связывание этой части субстрата не удается, поскольку гексасахарид быстро расщепляется лизоцимом. Однако размещение модели гексасахаридного субстрата на пространственной модели фермента показало, что звенья Е и F не только легко укладываются, но и образуют, ряд нековалентных взаимодействий в зоне связывания.
Сложнее обстоит дело с остатком D, а именно его ^гликозидная связь с остатком Е атакуется ферментом в гексасахариде. Это звено нельзя разместить в зоне связывания фермента в обычной для моносахаридов конформации '’кресла” — оно не укладывается в субстратную щель из-за помех, вызываемых слишком близкими контактами атомов С-6 и 0-6 этого звена с лизоцимом. Эти помехи, однако, полностью снимаются, если звено D изменит свою конформацию и перейдет в напряженную конформацию “полухресла" (рис. 10.8).' Таким образом/ связывание субстрата должно благоприятствовать искажению- конформации вблизи атома углерода С-1 звена D, который непосредственно участвует в реакции. Характерно, что аналоги субстрата, содер- .235
Рис. 10.8. Конформация "полукресла'’, свойственны шестичленным циклам (в том числе моносахаридам) с двойной связью в цикле
жащие концевой глюконолактон, также имеющий конформацию полукресла, очень прочно связываются ферментом и выступают в качестве его ингибиторов.
Предполагают, что дальнейшее действие лизоцима (рис. 10.9) обусловлено сближением гликозидной связи соединяющей звенья D и Е, и карбоксильной группой остатка Glu-Зб, который входит в активный центр фермента. Эта карбоксильная группа находится в гидрофобном окружении, поэтому ее диссоциация привела бы к энергетически невыгодному образованию отрицательно заряженного карбоксилат-аниона в неполярной среде, где затруднена его гидратация. Как следствие, карбоксильная группа остатка Glu-Зб является более слабой кислотой по сравнению с другими карбоксильными группами лизоцима (ее рКа близок к 6) и, как правило, в свободном ферменте она удерживает протон.
При сближении с гликозидной связью субстрата в фермент-суб- стратном комплексе эта группа выступает как донор протона, присоединяющегося к гликозидному атому кислорода с образованием неустойчивого положительно заряженного оксониевою иона:
Гликозидный кислород о Ь ।/ L /
. ~С~О~Н ...0 -*♦ *4HLJH)* ♦—Оксониевый
I|ИОНИ.
Карбоксил Glu-35
Далее оксониевый ион стабилизируется за счет перемещения,' к атому кислорода электронной пары, обслуживавшей его связь с С-1- атомом звена D Следует разрыв :вязи между этими атомами и вместе с тем между звеньями D и Е, причем положительный заряд переносится на атом С-1 с образованием карбониевою иона. Дисахарид Е—F или 236
гис. 10.9. Механизм действия лизоцима
Протон карбоксильной группы Glu-35 переносится на сближенный с ним кислород гликозидной связи, образуя оксониевый ион, Далее электронная пара, обслуживавшая связь стома С-1 NAG и этого атома кислорода, переносится на последний, что приводит к разрыву гликозидной связи. В результате атом С-1 оказывается заряженным положительно, т.е. приобретает свойстве карбокатион®, имеющего плоскую структуру, чему благоприятствует конформация полукресла. Дополнительно заряд стабилизируется взаимодействием с отрицательно заряженной карбоксилатной группой остатка Аар- 62. На завершающей фазе реакции молекула воды занимает место ушедшего кислорода гликозидной саязи, поляризуется за счет взаимодействия с анионной формой Glu-35 и образовавшийся гидроксил-ион атакует несущий положительный заряд атом С-1 (остальные пояснения см. в тексте)
аналогичный фрагмент более длинного субстрата покидает после этого зону связывания субстрата, так как его соединяют с ней лишь немногие нековалентные взаимодействия, а связь с фрагментом А—В—€—D утрачена.
Остаток Glu-35 критически важен для каталитического механизма — его замена на глутамин, проведенная методом ййт-специфичного мутагенеза, лишает фермент активности. vTX
- t Положительный заряд на С-1 стабилизируется двумя^факторами:
Устанавливается электростатическое взаимодействие между ним и отрицательно заряженным карбоксил ат-анионом Asp-52, весьма эффективное в отсутствие воды, которая вытесняется с поверхности фермента при связывании субстрата. Заслуживает внимания' то',1 что кислотные свойства карбоксильной группы этого остатка в отличие от карбоксила Glu-35 усилены его гидрофильным окружением. Это объясняется тем, что анионная форма карбоксила Asp-52 стабилизируется путем включения в систему водородных связей с соседними остатками.
Следует обратить внимание на столь характерное для белков вообще изменение свойств функциональных групп за счет разницы в их микроокружении. Роль этой группы нельзя недооценить, но она, видимо, не абсолютно необходима — замена Asp-52 на аспарагин снижает удельную активность фермента примерно до 5% от исходной, но не приводит к полной его инактивации.
Положительный заряд на атоме С-1 частично компенсируется смещением электронной пары от соседнего с ним атома кислорода в цикле. При этом связь 0 — С* приобретает характер частично двойной, что приводит к плоскостной конформации всего этого участка кольца D и переходу атома С-1 из обычной тетраэдрической в тригональную
структуру:
Но как раз такая конформация, необходимая для стабилизации карбокатиона, соответствует структуре полукресла и реализуется • © фермент-субстратном комплексе за счет отмеченного выше искажения стереохимии кольца D при связывании олигосахарида. По-видимому, необходимая для этого энергия “заимствуется11 из энергии связывания протяженного субстрата.
Таким образом, электростатические и стереохимические эффекты в каталитическом центре лизоцима действуют согласованно, стабилизируя структуру плоского карбокатиона, характерную для переходного состояния в фердгент-субстратнолг комплексе. ,
Далее карбокатион подвергается атаке молекулой воды, которая связывается анионом остатка GLh-35, занимая примерно то же местом в котором находился кислород гликозидной связи перед .ее
расщеплением.,
Анион Glu-35 поляризует молекулу воды,- отрывая протон^ ,что соответствует свойствам карбоксильной группы этого остатка как
слабой кислоты. Образующийся сильный нуклеофил — ОНчион — атакует положительно заряженный атом углерода С-1 с одновременной нейтрализацией зарядов. Поскольку молекула воды приближается к плоскому карбокатиону с той же стороны, где находился кислород гликозидной связи, стереохимия атома С-1 полностью восстанавливается и гидроксильная группа при этом атоме занимает, подобно кислороду гликозидной связи, /3-положение:
Glu-35
Этим завершается цикл ферментативной реакции, в результате которого ^гликозидная связь в муреине оказывается гидролизованной, а лизоцим — готовым к последующим циклам каталитического
механизма.
Характерно, что лизоцим фага Т4 действует на полисахарид бактериальных стенок аналогично, также используя перевод моносахаридного звена при атакуемой связи в конформацию полукресла, однако в каталитическом механизме этого фермента принимают участие иные функциональные группы. Иск аж ние конформации субстрата как •существенный элемент каталитического механизма предполагают и для некоторых других ферментов, атакующих гликозидные связи, в частности для фосфорилазы.
В заключение отметим главнейшие черты механизма действия лизоцима:
организация системы нековалентных взаимодействий, фиксирующих протяженный субстрат;
стерические ограничения на связывание именно того звена в субстрате, гликозидная связь которого расщепляется, и, как следствие, перевод его в необычную конформацию, выгодную для стабилизации карбокатиона в переходном состоянии;
согласованное действие двух карбоксильных групп, одна из которых выступает в качестве донора протона, а другая в анионной форме способствует стабилизации карбокатиона в переходном комплексе.
АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗА
Как ни велики возможности ансамблей, образованных функциональными группами белка, в ряде случаев они недостаточны, например при катализе некоторых окислительно-восстановительных реакций. Такие затруднения, однако, могут быть преодолены путем вовлечения в механизм действия ферментов небелковых лигандов — ионов металлов или коферментов. Примером такого механизма является действие алкоюлъдегидрогеназы печени.ь
Этот фермент катализирует перенос гидрид-иона И* от группы СН2ОН первичных спиртов различной структуры на никотинамидную часть кофермента — никотинамидаденин динуклеотид , (NAD). Схематически эта реакция может быть представлена следующим образом:
ОН0
II
н-с-и —» с-я + н +н*
II
кк
Алкоголь-Гидрид-ион
дегидро-(переносится
геназана кофермент)
Тот же фермент, как обычно, способен катализировать и обратную реакцию — восстановление альдегида до спирта;
Хорошо изученная алкогольдегидрогеназа печени лошади построена из двух одинаковых субъединиц, каждая из которых содержит 6 одной полипептидной цепи 374 аминокислотных остатка и образует два домена. Каталитический долген, в Котором локализованы все компоненты активного центра фермента, в том числе и остатки, связыйАх ющие еще один небелковый лиганд — участвующий в катализе йой -цинка, — объединяет N-концевой (остатки 1—175) и С-концевой (остатки 319—374) фрагменты полипептидной цепи.
Коферл1ент(нуклеотид)связыв логций должен сформирован централь1 ным фрагментом (остатки 176—318). По вторичной и Третичной структуре он очень сходен с нуклеотидсвязывающими доменами других ферментов, хотя их первичные структуры не обнаруживают сколько-нибудь существенных соответствий. '-т 1
Предполагают, что характерная пространственная структура нук- леотидсвязывающего домена возникла на весьма ранних этапах эволКР- ции и многократно использовалась как готовый функциональный лх!^-
дуль, который мог объединяться с соответствующими каталитическими центрами, образуя различные ферменты, содержащие NAD в качестве кофермента. Понятно, что такой путь эволюции ферментов эффективнее создания всякий раз de novo функционально однотипной структуры. '
Контакт между субъединицами определяется преимущественно взаимодействием нуклеотидсвязывающих доменов, которые образуют своего рода "ядро1* димера. Как это нередко бывает при образовании четвертичной структуры, /^-складчатый лист одной субъединицы "стыкуется” с такой же структурой другой субъединицы, образуя весьма протяжейный /^-складчатый слой. Это взаимодействие дополняется развитой1 сетью гидрофобных контактов, в которых участвует около 30 аминокислотных остатков, что делает диссоциацию димера весьма трудной даже в 8 М мочевине. ,
Связывание кофермента. Аденозиндифосфатрибозный фрагмент NAD дает множество нековалентных контактов с ферментом. Аденин располагается в гидрофобном кармане, 2 '-гидроксил рибозы аденозина образует водородную связь с карбоксилом Asp-223, пирофосфатная группировка — солевую связь с гуанидином Arg-47, принадлежащего каталитическому домену. ’’Концевой”, т.е. ближайший к никотинамиду, остаток рибозы образует водородные связи с карбонильными группами Gly-293 и Ие-269. Множественность нековалентных связей обеспечивает точное размещение кофермента в активном центре алкогольдегидрогеназы. ,
Связывание субстрата. Зона связывания субстрата располагается в глубоком "кармане”, канале между каталитическим и нуклеотидсвязы- вающим доменами одной из субъединиц, но в нее входят и отдельные аминокислотные остатки второй субъединицы. Этот канал как бы выстлан гидрофобными боковыми цепями, что позволяет установить гидрофобные контакты с радикалом R спирта. Интересно, что формирование этого канала завершается после связывания NAD и вызванного этим изменения конформации фермента. Алкогольдегидрогеназа печени может связывать весьма различные спирты — от этанола до производных бензилового спирта С6Н5СН2ОН, w-оксикислот и даже стероидных спиртов., Важно лишь, чтобы они содержали гидрофобный фрагмент в своей структуре. Среди остатков, участвующих в связывании бензилового спирта, Leu-116 и Ьец-57, Val-294 и Phe-93. Сорбируясь, субстрат выталкивает из зоны связывания несколько молекул воды ив определенной мере стягивает прилегающую часть фермента в более компактную структуру. Не исключено, что это весьма небольшое изменение строения фермента, наведенное, связавшимся субстратом, играет существенную роль в катализе.
Рис. 10.1Q. Размещение субстрата в активном центре алкогольдегидрогеназыРис. 10.1Q. Размещение субстрата в активном центре алкогольдегидрогеназыПри связывании субстрата (спирта) его гидроксильная группа сближается с ионом цинка и утрачивает протон, превращаясь в алкоголят. В отщеплении протона и стабилизации алко- голята участвует система водородных связей с Ser-48 и His-51При связывании субстрата (спирта) его гидроксильная группа сближается с ионом цинка и утрачивает протон, превращаясь в алкоголят. В отщеплении протона и стабилизации алко- голята участвует система водородных связей с Ser-48 и His-51устанавливает непосредственнуюустанавливает непосредственную
Рис. 10.1Q. Размещение субстрата в активном центре алкогольдегидрогеназы
Рис. 10.1Q. Размещение субстрата в активном центре алкогольдегидрогеназы
При связывании субстрата (спирта) его гидроксильная группа сближается с ионом цинка и утрачивает протон, превращаясь в алкоголят. В отщеплении протона и стабилизации алко- голята участвует система водородных связей с Ser-48 и His-51
При связывании субстрата (спирта) его гидроксильная группа сближается с ионом цинка и утрачивает протон, превращаясь в алкоголят. В отщеплении протона и стабилизации алко- голята участвует система водородных связей с Ser-48 и His-51
устанавливает непосредственную
устанавливает непосредственную
Компоненты каталитического Центра. Каталитический центр алкогольдегидрогеназы содержит ион цинка, который окружен четырьмя лигандами, расположенными в вершинах неправильного тетраэдра. Три из них принадлежат белку — это тиоловые группы остатков Cys-46 и Cys-174 и имидазол His-67. Четвертое координационное место занимает кислород субстрата, а в его отсутствие — молекула воды. Гидроксильная группа остатка Ser-48 способна образовать водородную связь с кислородом лиганда — воды или спирта.
Вероятный механизм действия фермента. Предполагают, что спирт, гидрофобная цепь которого связана в гидрофобном канале фермента, ориентируется так, что его кислород связь с ионом цинка, вытесняя из
четвертого координационного положения находившуюся там молекулу воды (рис. 10.10). Это приводит к отщеплению протона гидроксильной группы, причем связь с ионом цинка образует алкоголят-анйон спирта К-СН20-:
CysCys
“ХI1
R—CH2OH 4-JD—Zn2*—Cys —♦ R-CH ~Q-“Zn2+—Cys 4- H*
8хI.I
HisHis
Понятно, что существование такой структуры, чрезвычайно чувствительной к гидролизу, возможно только внутри каталитического центра, где реакция разыгрывается в отсутствие контактов с водой. В этом еще раз проявляется характерная особенность ферментативного катализа — перенос реакции в благоприятную среду.
Алкоголят-анион далее стабилизируется путем смещения электронной плотности от атома кислорода алкоголята к связи С—0, которая в конечном счете превращается в двойную, а гидрид-ион от атома угле-, рода переносится, видимо, по структурно детерминированному пути в 242 -
положение 4 никотинамидного ядра кофермента, причем NAD* превращается в восстановленную форму NADH:
Никотинамидный фрагмент
NAD
Никотинамидный фрагмент
*NADH
R—С=0Zn—
Альдегид
При обратной реакции перенос гидрид-иона происходит от NADH к углероду альдегидной группы, двойная связь которой оказывается поляризованной за счет влияния связанного с ферментом иона цинка на атом кислорода. Такая поляризация усиливает частичный положительный заряд на атоме углерода карбонильной группы, что благоприятствует присоединению к этому атому гидрид-иона.
Рассмотренный пример показывает возможность обогащения функциональных свойств ферментов путем включения лигандов — иона металла и кофактора — в структуру активного центра.
ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА
Описанный механизм не является единственным для дегидрогеназ. Известны ферменты, которые способны катализировать сходную реакцию, не прибегая к использованию иона цинка или другого металла. Таковы, например, лактат- и малатдегидрогенази. Каталитический
243
-• центр лактатдегидрогеназы описан достаточно хорошо, что подтверждается успехом направленного изменения субстратной специфичности лактатдегидрогеназы термофильной бактерии Bacillus stearother- mophilus.।
Связывание пирувата в активном' центре лактатдегидрогеназы определяется в первую очередь электростатическим взаимодействием мексду карбоксилатной группой субстрата и гуанидогруппой остатка Arg-171 (рис. 10.11). Другие функциональные группы фермента, участвующие в связывании пирувата, одновременно выполняют и собственно каталитическую функцию — частый случай для небольших субстратов. Существенно, что образование ионной нары индуцирует характерное изменение конформации в активном центре — петля, включающая остатки 98—110,-смещается, прикрывая каталитический центр и связанный в нем субстрат. Этим достигается перенос реакции из воды в благоприятную для процесса среду, приближение к центру реакции — карбонильной группе субстрата сразу нескольких функциональных групп фермента.
Рис. 10.11. Каталитический центр лактатдегидрогеназы
При связывании пирувата в активном центре образуется ионная пара между кар- 6оксилат-ени0|ном субстрата и гуанидияиевой группой Arg-171. Взаимодействие протонированной имидазольной группы остатка His-193 с С—О-группировкой субстрата усиливает поляризацию последней, а образующийся дефицит электронов у углерода кетогруппы компенсируется переносом гидрид-иона Н" от сближенного с субстратом никотинамидного кольца кофермента. Замена Gln-102 аргинином и введение мутаций, небколько увеличивающих впадину зоны связывания, дает ферменту возможность свямуь оксалоацетат, и он становится малатдегидрогеназой
' Еще одним следствием такого переноса является значительное усиление взаимодействия между карбоксильной группой субстрата и гуанидином Arg-171, а также образование достаточно плотного окружения пирувата, что способствует повышению субстратной специфичности лактатдегидрогеназы. Этот фермент на три порядка активнее в отношении пирувата, чем оксалоацетата — субстрата малатдегидрогеназы, хотя оба фермента родственны, используют в качестве кофермента NAD, имеют сходную пространственную структуру и действуют по однотипному механизму.
В связанном пирувате карбонильная группа поляризуется под влиянием -сатионной гуанидогруппы Arg-109, принадлежащей подвижной петле. Это приводит к возрастанию частичного отрицательного заряда на кислородном атоме и 'положительногр — на атоме углерода группы С^О субстрата. Последнее облегчает перенос гидрид-иона от дигидропиридиновой формы никотинамидного фрагмента NADH на углерод карбонильной группы, в то. время как протон пространственно сближенного с субстратом имидазола His-193 переносится на отрицательно заряженный кислород, чем и завершается восстановление карбонильной группы и превращение пирувата в лактат.
Заметим, что роль имидазольного кольца His-193 как донора протона облегчается тем, что эта группа находится под влиянием карбоксила Asp-168, который отдает свой протон имидазолу, компенсируя переход протона от другого атома азота имидазола на карбонильный кислород субстрата. Таким образом, здесь реализуется нечто вроде "эстафеты заряда", впервые обнаруженной для ансамбля Asp—Hii в сериновых протеиназах. . .
Как уже отмечалось, фермент обладает весьма высокой субстратной специфичностью. Он на три порядка хуже катализирует близкую по характеру реакцию восстановления оксалоацетата. Видимо, связывание субстрата, отличающегося от пирувата присутствием еще одной карбоксильной группы, было бы сопряжено с переносом этого карбокси- лат-аниона из воды в зону связывания субстрата, а энергетические затраты на его дегидратацию не были бы ничем скомпенсированы. Замена остатка Gln-102 в подвижной петле фермента-на аргинин позволяет ввести в зону связывания субстрата модифицированного фермента катионную гуанидиновую группу, способную в отсутствие воды установить электростатическое взаимодействие со вторым карбоксилат- ионом оксалоацетата. Этого достаточно для превращения лактатдегидрогеназы в высокоэффективную малатдегидрогеназу: фермент катализирует реакцию с оксалоацетатом в 8400 раз эффективнее, чем с пируватом, и обнаруживает даже несколько лучшую активность, чемпри- родная малатдегидрогеназа.
ТРИОЗОФОСФАТИЗОМЕРАЗА
Триозофосфатизомераза — фермент, относящийся к классу рзояе- раз; катализирует взаимопревращения диоксиацетонфосфата и D-гли- церальдегид-3-фосфата:
о-о-ННо-о-НН
о-
о-
Н
Н
о-
о-
Н
Н
0=Р-ЧНШ2-С~С-ОН «—► 0=Р-0-€Н2-СН-С=0
0-0-0 Н0 Н0-0-ОНОН
0-
0-
0 Н
0 Н
0-
0-
ОН
ОН
АктиВный центрАктиВный центр
АктиВный центр
АктиВный центр
ДиоксиацетонфосфатДиоксиацетонфосфатD-Тлицеральдегид-З-фосфат
Диоксиацетонфосфат
Диоксиацетонфосфат
Фермент относится к числу наиболее эффективных: скорость превращения субстрата определяется скоростью его диффузии. Хорошо изучено строение триозофосфатизомеразы трипаносом, которой струк
турно близок фермент животных. Триозофосфатизомераза — димер, образованный идентичными субъединицами. Каждая из них представляет собой полипептидную цепь из 250 аминокислотных остатков, третичная структура которой относится к о?/^-типу и содержит правильно чередующиеся восемь а-спиралей и восемь отрезков ^~ структуры. ^-Структурные участки образуют внутренний цилиндр, защищенный от воды а-спиралями (рис. 10.12). В формировании каждого из двух' активных центров участвуют обе субъединицы, поэтому мономер не активен. В то же время меж-
ду активными центрами нет Рис. 10.12. Размещение каталитического кооперативности, иными слова- Центра в пространственной структуре ми, функционирование любого триозофосфатизомеразым
ИЗ них не зависит от того, дей- Функциональные группы каталитического ствует ли другой центр, хотя центра P^wi во впадине, которая ' закрывается при связывании субстрата за счет присутствие второй субъедини--перемещения петли, расположенной между ЦЫ обязательно.отрезком /?3 и спиралью ой
В связывании субстрата важнейшая роль принадлежит фосфатной группе, которая образует с ферментом семь Водородных связей, дополняемых ионным взаимодействием с аммонийной группой Lys-13. Образование фермент-субстратного комплекса вызывает довольно значительное — на 3 — 5 А — перемещение подвижной петли, содержащей остатки 167—178. Главным результатом этого изменения конформации фермента является исключение воды из активного центра, что благо
приятствует протеканию изомеризации.
В связанном субстрате (в качестве которого далее рассматривается диоксиацетонфосфат) один из атомов водорода метиленовой группы оказывается в поле отрицательно заряженного карбоксилат-иона остатка Glu-167. Этот водород отщепляется от субстрата как протон и переходит к карбоксилу Glu-167. Освободившаяся электронная пара, которая обслуживала связь C**fl, мигрирует к соседней связи С~С, делая ее двойной. Это влечет за собой поляризацию двойной связи С=0 с появ
лением на ее атоме кислорода отрицательного заряда, стабилизируемого электростатическим взаимодействием с катионной аммонийной
группой остатка Lys-13:
Gly-167Gly-167Glu-167Glu-167Перенос протонаПеренос протонаII2-О3Р—0-£Н2-С=С—Н' I I -О о2-О3Р—0-£Н2-С=С—Н' I I -О оHis-95His-95—CH2-NH3Н—CH2-NH3НLys-13 . *Lys-13 . *||| His-95HNС—||| His-95HNС—
Gly-167
Gly-167
Glu-167
Glu-167
Перенос протона
Перенос протона
I
I
2-О3Р—0-£Н2-С=С—Н
' I I -О о
2-О3Р—0-£Н2-С=С—Н
' I I -О о
His-95
His-95
—CH2-NH3Н
—CH2-NH3Н
Lys-13 . *
Lys-13 . *
||| His-95
HNС—
||| His-95
HNС—
Вся эта цепь превращений переводит субстрат в анионную форму неустойчивого ендиола:
20зР-О-СН2~С=СН
0_ ОН
Далее протон переходит от карбоксильной группы Glu-167 ко второму углеродному атому субстрата, присоединяясь к двойной связи
Одновременно между С-1 и атомом кислорода устанавливается двойная связь за счет отщепления протона от гидроксильной группы при С-1 и его миграции сначала к азоту имидазольной группы His-95, а затем к отрицательно заряженному кислороду при С-2 субстрата. Путь этой миграции предопределен, как и в механизме действия сериновых протеиназ, присутствием в активном центре имидазольной группы гистидина:
।Glu-167
С=0
И
I2-03Р-С-СН2-С—с—fl
н
нс^ сн|| His-95HNС—
Замена глутаминовой кислоты в положении 167 на аспарагиновую, проведенная методом белковой инженерии, отодвигает критически важную для катализа карбоксильную группу от субстрата примерно на 1 А, в результате чего скорость реакции снижается почти в 103 разиз То, что модифицированный таким образом фермент все же сохраняет!' активность, можно объяснить колебаниями в структуре фермент-субст-' ратного комплекса, которые могут, хотя и с малой вероятностью, сбли-! жать карбоксильную группу аспарагиновой кислоты с углеродными- атомами субстрата.' '
Таким образом, и в механизме действия триозофосфатизомеразы проявляются характерные черты ферментативного катализа — перенос реакции из водной фазы внутрь фермента, что обусловлено перемещением одного из участков структуры в ответ ца связывание субстрата; координированное действие ансамбля функциональных групп, включенных вместе с прочно связанным субстратом в единую интегрированную систему. 248
КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ("АВЗИМЫ")
Проверкой правильности понимания принципов ферментативного катализа, в особенности представлений о важнейшей роли, которая в этом процессе принадлежит стабилизации переходного комплекса путем его избирательного связывания в каталитическом центре, явилось создание искусственных ферментов, так называемых абзилюв. Абзимы (от англ. AntiBody -F enZYME)-представляют собой антитела, специфически связывающие структуры, которые химически близки переходному состоянию, образующемуся в процессе катализа. Метод создания абзимов основан на том, что среди огромного множества возможных структур иммуноглобулинов (см. гл. 13) всегда могут быть найдены такие, которые содержат соответствующим образом ориентированные группы и способны избирательно связывать стабильные химические соединения, структурно близкие переходному состоянию той или иной реакции.
При образовании комплекса с таким иммуноглобулином возникнут благоприятные условия для того, чтобы строение субстрата приблизилось к структуре переходного состояния. Иными словами, будет понижена энергия активации субстрата, т.е. энергия, которую необходимо затратить на его перевод из основного состояния в переходное. Соответственно должны возрасти вероятность его превращения в продукт, а значит, и скорость реакции. Разумеется, пока речь идет не о создании катализаторов, эквивалентных по эффективности ферментам, а о получении их упрощенных моделей, хотя некоторые из них, возможно, и окажутся практически пригодными.
Первый подход к созданию абзимов состоял в получении антител, специфически связывающих и стабилизирующих аналоги переходных состояний, свойственных гидролитическим реакциям. Очевидно, что антитело к соединению (гаптену), напоминающему конфигурацию переходного состояния,, будет стабилизировать эту структуру и тем самым понижать свободную энергию активации. Хорошо известно (см. разд. 10.5), что гидролиз амидов и сложных эфиров (например, щелочью) проходит через стадию образования тетраэдрического промежуточного продукта:
о о-о
II он- I II
~С—0—R ^ -C-O-R —♦ -С-0 + H-O-R
I он.
Тетраэдрическийпромежуточный продукт249
Анализ механизма действия гидролитических ферментов, в частно^ сти сериновых протеиназ (см. разд. 10.5), показывает, что его существенной чертой, действительно, является стабилизация ' переходного состояния, структурно близкого такому тетраэдрическому промежуточному продукту. Соответствующее соединение, которое имитировало бы такую структуру и содержало бы у одного углеродного атома три атома кислорода (или два атома кислорода и один азота при моделировании протеиназ), синтезировать не удается — оно слишком неустойчиво. Однако возможно получение достаточно стабильных тетраэдрических структур, стереохимически близких ему, в которых центральное положение вместо атома углерода занимает атом фосфора. Присоединение такого рода соединений к белку-носителю в качестве гаптенов и иммунизация этими производными животных позволяет получить антитела, специфически связывающие молекулы, близкие по структуре и конформации к переходному состоянию, через которое происходит гидролиз сложных эфиров или амидов карбоновых кислот.
Так, при создании абзимов, рассчитанных на ускорение гидролиза сложного эфира угольной кислоты — р-нитрофенил-ИДГРгриметилам- монийэтил карбоната
ОIО^-СА-О-С-О-СД-КЧСНз)»
— были получены иммуноглобулины, специфически взаимодействующие с тетраэдрическими заряженными фосфонатными и фосфатными аналогами переходного состояния реакций гидролиза этого. соединен
'-И-1 illнГЧС'М;т•Р1. I it:'-И-1 illнГЧС'М;т•Р1. I it:ния, которое выглядит следующим образом:
'-И-
1 illнГЧС'М;т
•Р1
. I it:
'-И-
1 illнГЧС'М;т
•Р1
. I it:
О"
02М-СбН4-(ЬС-(Н1 -^* 02N—С^—0—C”0~ft
ОН
Здесь R-C2H4-N*(CH3)3.
Его модель - фосфонатный аналог -,/п
О"У
о2н-СбН4-о-р-ся2-сн8-<М2-снг-со(и'«ч»
II■:№
О
имеет структуру, стереохимически близкую, хотя и отличающуюся рядом деталей, в частности непосредственным присоединением углеро- 250
да боковой цепи к центральному атому фосфора, длиной этой цепи, плотностью отрицательных зарядов на атомах кислорода и т.п. Фосфо- натный, аналог был присоединен через карбоксильную группу к белку- носителю. К этой конструкции получены моноклональные антитела, которые, как оказалось, катализировали гидролиз субстрата — эфира
—♦ 02Н-€бН4-0Нр-Нитрофенол—♦ 02Н-€бН4-0Нр-Нитрофенолугольной кислоты:
—♦ 02Н-€бН4-0Н
р-Нитрофенол
—♦ 02Н-€бН4-0Н
р-Нитрофенол
021^бН4Н)^-<)^2Н4^*(СНз)з р-Нитрофенил-триметиламмоний - этилкарбонат
Н0-С2Н4^(СН3)з 4—^ ^-ТриметиламмонийН0-С2Н4^(СН3)з 4—^ ^-Триметиламмонийшинном 4^(сн3)Неустойчивый полуэфиршинном 4^(сн3)Неустойчивый полуэфир
Н0-С2Н4^(СН3)з 4—^ ^-Триметиламмоний
Н0-С2Н4^(СН3)з 4—^ ^-Триметиламмоний
шинном 4^(сн3)
Неустойчивый полуэфир
шинном 4^(сн3)
Неустойчивый полуэфир
этанолэтанолугольной кислоты
этанол
этанол
Кинетика этой, как и обычных ферментативных реакций, подчиняется уравнению Михаэлиса—Ментен. Гидролиз ингибируется соединениями — аналогами переходного состояния, причем Kj оказывались значительно ниже субстратной Кт. Следовательно, в соответствии' с ожиданием антитело связывает аналог переходного состояния (это отражает К[) прочнее; чем субстрат (что характеризует Кт). Это подтверждает важность стабилизации переходного состояния для катализа. Скорость реакции зависит от первой степени концентрации гидроксильного иона и превышает некаталитическую в 103—104 раз. Разумеется, ферментативная реакция дала бы на несколько порядков большее ускорение, однако необходимо учитывать, что при. конструировании абзима моделировалась только одна, хотя и весьма важная, черта энзиматического катализа — стабилизация переходного состояния. К тому же, как указывалось, связывание фосфонатного аналога лишь приближенно, а н совершенно точно воспроизводит систему стабилизирующих взаимодействий. Существен принципиальный результат — создание фермента, пусть пока недостаточно эффективного, на основе имеющихся представлений об основных чертах каталитического процесса.
Для реакции характерна субстратная специфичность — антитело против аналога катализирует гидролиз только указанного выше соединения, но не родственного ему метил-р-нитрофенил карбоната:
.0
02N-€6H4-0-C-0*-€H3
Рентгеноструктурный анализ антитела, связывающего фосфорилхо- лин и, вероятно, имеющего что-то общее с рассматриваемым каталитическим антителом, показывает, что гуанидогруппа остатка Arg-62 и гидроксил Туг-33 тяжелой цепи могут взаимодействовать с кислородом фосфатной г^ппы. По-видимому, и в каталитическом антителе аналогичным образом стабилизируется переходное состояние и эти же аминокислотные остатки связываются с атомами кислорода в его'структуре. В то же время остаток Glu-35, также находящийся в тяжелой цепи, образует ионную связь с аммонийной группой субстрата, чем, в частности, обеспечивается специфичность абзима.
Иной путь моделирования принципов энзиматического катализа состоит в использовании антител для надлежающего сближения реагирующих колтонентов или участков претерпевающей превращение молекулы в активном центре. Так, антитело, специфически связывающее бициклический ингибитор хоризматмутазы, избирательно ускоряет' превращение хоризмовой кислоты в префеновую в 104 раз (ккат = = 2,7 мин-1, Кт = 260 мкМ).
Антитело к фосфатному аналогу 6-лактона, формула которого приведена ниже, ускоряет в 167 раз циклизацию фенилового эфира соответствующей 6-оксикислоты в лактон:
Фениловый эфир 6-оксикислотыФениловый эфир 6-оксикислотыПереходное состояние при его циклизацииПереходное состояние при его циклизации
Фениловый эфир 6-оксикислоты
Фениловый эфир 6-оксикислоты
Переходное состояние при его циклизации
Переходное состояние при его циклизации
+ Н0СвН5+ Н0СвН5NM0CH,NM0CH,
+ Н0СвН5
+ Н0СвН5
NM0CH,
NM0CH,
6-Лактон
6^56^5Вставка, используемая для присоединения лиганда к белку-носи-Вставка, используемая для присоединения лиганда к белку-носи-телюМН-С0-СН2СН2СН2С0-телюМН-С0-СН2СН2СН2С0-
6^5
6^5
Вставка, используемая для присоединения лиганда к белку-носи-
Вставка, используемая для присоединения лиганда к белку-носи-
телю
МН-С0-СН2СН2СН2С0-
телю
МН-С0-СН2СН2СН2С0-
Циклический фосфонат, ИМИТИРУЮЩИЙ . структуру переходного СОСТОЯНИЯ И реакции циклизации 6-оксикислоты
Интересные возможности открывает и введение в каталитические антитела дополнительных функциональных групп. Таким образом, получение абзимов не только подтверждает правильность современных представлений о природе ферментативного катализа, но и открывает принципиальную возможность создания биологических катализаторов нового типа, в том числе и для реакций, не существующих в природе.
ГЛАВА И
ПОСТТРАНСЛ^ЦИОННАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКА
Полипептидная цепь —■ первичный продукт биосинтеза белка — часто подвергается химическим превращениям, изменяющим ее ковалентную структуру. Такие превращения могут происходить как в процессе трансляции (котраксля^иомяая людификация), так и после ее окончания, нередко уже после сформирования пространственной структуры белка. Многообразие этих реакций, завершающих созревание белка или видоизменяющих его функциональные свойства, очень велико —- их число достигает 300—400. Иногда реакции посттрансляционной модификации называют процессинюл! (от англ, processing — обработка), подчеркивая этим, что они как бы завершают биосинтез белка. Этот термин не вполне точен, поскольку некоторые реакции, например фосфорилирование, могут происходить с одной и той же молекулой неоднократно, регулируя ее активность, другие, вероятно, служат сигналом к расщеплению бедка. -
Обычно реакции посттрансляциОнной модификации катализируются специфическими ферментами, хотя известны и внутримолекулярные превращения белков, происходящие без участия "внеЪних” ферментов. Реакции посттрансляционной модификации, как Правило, имеющие функциональный смысл, направленность, принято отличать от более или менее случайных поврежданпцих реакций, также весьма многочисленных, которые происходят с белками in ^гго^отражаясь на Их структурной целостности и функциональных свойствах. К ним относят,
например, реакции окисления, случайный протеолиз и некаталитическое дезамидирование белка, присоединение глюкозы к аминогруппам некоторых белков, в частности гемоглобина, при ее повышенном содержании в крови при диабете и т.п. .
Реакции посттрансляционной модификации являются нематричными прогрессами, они не кодируются непосредственно, поэтому нередко протекают неполно, что приводит к образованию множественных форм того или иного белка — продуктов частичного превращения.
Каков функциональный смысл реакций посттрансляционной модификации? На этот вопрос в обобщенной форме можно дать следующий ответ. Во-первых, несмотря на удивительное богатство структур, образуемых аминокислотными остатками и их ансамблями в пространственной структуре белка, это многообразие далеко не безгранично. Разумеется, образование комплексов с кофакторами (металлами, коферментами и т.п.) резко расширяет функциональные возможности белка. Однако и этот путь не всегда оказывается достаточным. В таких случаях структурная палитра белка может быть обогащена путем направленного преобразования боковых цепей тех или иных аминокислотных остатков, а иногда и молекулы в целом.
Во-вторых, что не менее важно, некоторые реакции посттрансляционной модификации, в особенности обратимые, позволяют управлять активностью белка или целых групп белков в ответ на изменяющиеся потребности клетки.
Заметим, что реакции посттрансляционной модификаций в отличие от предшествующих им стадий трансляции очень индивидуальны, иногда свойственны только одному белку — к таким относятся, например, гидроксилирование остатков йролина в коллагене, иодирование тиреоглобулина и некоторые другие. Специфичность посттрансляционной модификации открывает перспективу избирательного воздействия на процессинг и, следовательно, функцию тех или иных белков. }
Далее мы рассмотрим некоторые важнейшие реакции посттрансляционной модификации.
ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПЕРЕГРУППИРОВКИ В БЕЛКАХ
Эта группа превращений стоит особняком, поскольку они не катализируются каким-либо ферментом, а являются результатом внутримолекулярной реакции, направляемой, по-видимому, специфической пространственной структурой белка-предшественника. Последнее обстоятельство сближает такие реакции с каталитическими, поэтому иногда их описывают как автокаталитические процессы, хотя аналогия
не вполне справедлива, ибо в этом случае "активный центр" действует не многократно, как у ферментов, а только однажды.
Профермент гистидиндехарбоксилазы молочнокислых бактерий Lactobacillus, а также Clostridium perfringens синтезируется в виде одной полипептидной тг-цепи с молекулярной массой 34 кДа. При внутримолекулярной активации она превращается в цепи а и /8 с молекулярными массами соответственно 25 и 9 кДа. о^-Цепь несет на аминном конце остаток пировиноградной кислоты, который выполняет в активном центре фермента роль своеобразного кофактора и взаимодействует с аминогруппой гистидина, подвергающегося декарбоксилированию. Этот пирувоильный остаток функционально аналогичен пиридоксальфосфату — типичному кофактору ферментов аминокислотного обмена. Заметим, что r-цепь и продукт ее расщепления, построенный из а- и /9-цепей, образуют гексамерную четвертичную структуру.
Особенно интересен путь расщепления r-цепи на от- и /9-цепи, не являющийся гидролитическим. В последовательности аминокислот, которая соединяет будущие о- и /8-цепь
♦тг-Цепь♦
... —Thi—Ala—Ser“Ser—Phe—...
C-Конец /8-цепи —► ♦— N-Конец а*-цепи по-видимому, под влиянием пространственно сближенных' функциональных групп прогистидиндекарбоксилазы происходит такая перегруппировка, в которой непосредственно участвуют соседствующие остатки серина. Сначала карбонильная группа предшествующего остатка серина переносится с аминной на гидроксильную группу следу- юш[его остатка:
N, 0—ПереносНО-СНг ~С0—(НС Нг
ацильной^|*|
группы~С(НNH~СН~СО-Phe-H2N—CH-CO-Phe—
■ .т .
•Элиминируемый атом
.•,водорода
Это так называния К^О-ацильная миграция. Затем ацильный компонент (/3-цепь) негидролитически элиминируется за счет отщепления адатома водорода остатка серина (/3-элиминирование), оставляя на аминном конце уже образовавшейся отцепи весьма неустойчивый остаток дегидроаланина:
сн2
NH2-C—со-
Остаток дегидроаланина
Дегидроаланин, по-видимому, изомеризуется в иминопроизводное пирувоильного остатка, которое затем реагирует с водой, отщепляя аммиак и превращаясь в пирувоильный остаток:
।
СН2СН3„ _ СНз
II - I ^ I '
NH2-C—CO-Phe-NH=C—CO-Phe-0=C—CO-Phe-... + NH3
Дегидроаланил-Иминопирувоил-Пирувоил-;
Производные гистидиндекарбоксилазы,
Следует подчеркнуть, что собственно расщепление полипептидной цепи происходит в этом случае без участия воды, негидролитическим путем. Интересно, что у других ферментов аминокислотного обмена — лиоз, отщепляющих аммиак от фенилаланина или гистидина с образованием соответствующих непредельных кислот (коричной в случае фенилаланина или урокаиновой в случае гистидина), наблюдается похожее превращение, которое приводит, однако, не к расщеплению пептидной цепи, а к образованию дегидроаланина, по-видимому, стабилизированного в пространственной структуре фермента. Вероятно, предшественником дегидроаланина в Этих случаях является активированное производное серина или цйстеина. Дегидроаланин в таких ферментах входит в состав каталитического центра, выступая в качестве электрофильной группы. Заметим, что электрофильные Группы не свойственны традиционно построенным белкам.
• ;ф
ИОДИРОВАНИЕ ОСТАТКОВ ТИРОЗИНА
Эта реакция характерна для тиреоглобулина — высокомолекулярного белка, содержащегося в щитовидной железе и являющегося источником тироксина — гормона, влияющего на обменные процессы в тканях. Процесс начинается с избирательного иодирования немногих остатков тирозина в этом белке под действием иода, который образуется в свою очередь при окислении иодид-иона, катализируемом пероксидазой;
ДииодтирозинДииодтирозин
Дииодтирозин
Дииодтирозин
Иод далее атакует ОН-группу тирозина по радикальному механизму и, отщепляя водород с образованием HI, оставляет неспаренный электрон на кислороде тирозина. Этот электрон способен перемещаться по ароматической системе сопряженных связей и может быть локализован в пара-положении, что приводит к разрыву связи С “СНг по так называемому голюлитпическо^иу пути. Затем весь ароматический фрагмент, имеющий неспаренный электрон в пара-положении, внутримолекулярно переносится на кислород пространственно сближенного остатка дииод- тирозина:
НОНОАроматический фрагмент дииод-Ароматический фрагмент дииод-тирозинатирозинаОстаток диио# тирозинаОстаток диио# тирозинаНОНОI-C ^С~1I-C ^С~1с-нс-н'С:'С:ооПродукт ре- акции - тироксин, встроенный в пептидную цепь тиреоглобулинаПродукт ре- акции - тироксин, встроенный в пептидную цепь тиреоглобулинан—сн—с—NH—сн—СО——NH—сн—СО—I-C ^c-iI-C ^c-i
НО
НО
Ароматический фрагмент дииод-
Ароматический фрагмент дииод-
тирозина
тирозина
Остаток диио# тирозина
Остаток диио# тирозина
НО
НО
I-C ^С~1
I-C ^С~1
с-н
с-н
'С:
'С:
о
о
Продукт ре- акции - тироксин, встроенный в пептидную цепь тиреоглобулина
Продукт ре- акции - тироксин, встроенный в пептидную цепь тиреоглобулина
н—с
н—с
—NH—сн—СО—
—NH—сн—СО—
I-C ^c-i
I-C ^c-i
На модельных пептидах показано, что выход этой реакции, протекающей неферментативно, зависит от относительного расположения остатков тирозина, которое в тиреоглобулине, видимо, особенно благоприятствует процессу (для чего оба ароматических ядра должны быть копланарны). Иодированию и превращению в тироксин преимущественно подвергаются в этом белке остатки Туг-5, 1291, 2555, 2748.
Высвобождение тироксина из тиреоглобулина происходит под действием специфической аспартильной протеиназы, содержащейся в щитовидной железе.
ОБРАЗОВАНИЕ ОСТАТКОВ у-КАРБОКСИГЛУТАМИНОВОЙКИСЛОТЫ
С02 + СООНI сн2 I сн2 I-NH-CH—€0-С02 + СООНI сн2 I сн2 I-NH-CH—€0-Такая реакция происходит в некоторых животных белках, функционирование которых требует образования колтлекса с uonaju-u кальция. Она состоит в прямом включении С02 в у-метиленовую группу остатка глутаминовой кислоты:
С02 + СООН
I сн2 I сн2 I
-NH-CH—€0-
С02 + СООН
I сн2 I сн2 I
-NH-CH—€0-
НООС^ ^СООНСН
I сн2
I
—ми—с и—со—
Глутаминовая кислота у-Карбоксиглутаминовая кислота
Эта реакция, протекающая только в присутствии витамина К, свойственна протромбину и многим другим белкам системы свертывав ния крови, в которых карбоксилированию подвергаются несколько (обычно около 10) остатков глутаминовой кислоты в аминоконцевом участке полипептидной цепи. Остатки у-карбоксиглутаминовой кислой ты за счет двух сближенных карбоксильных групп могут образовывать комплексы с ионами кальция, связанными в то же время с фосфолипид дами клеточных мембран. Таким образом, ионы кальция выступают как своеобразные мостики, способствующие концентрированию белков системы свертывания крови на поверхности клеток, что облегчает их взаимодействие друг с другом: ..ч-
ФосфолипидФосфолипид-HN—сн—С0--HN—сн—С0-7~Карбоксиглутаминовая кислота
Фосфолипид
Фосфолипид
-HN—сн—С0-
-HN—сн—С0-
Сходную роль играют остатки 7-карбоксиглутаминовой кислоты и в белке костной ткани - остеокальцине, который взаимодействует с ионами кальция на поверхности частиц гидроксилапатита - минерального компонента кости. Аналогично модифицированы остатки глутаминовой кислоты в овокальцине и атерокальцине, некоторых белках хрящей, почечных канальцев, а также в некоторых белках рибосом, которые содержат и ^-карбоксиаспарагиновую кислоту.
Дефицит витамина К или присутствие его специфических ингибиторов, например дикуМарина, блокирует 7-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты и приводит к глубоким нарушениям функции соответствующих белков, в частности к торможению свертывания крови.
ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ.
.ГЛИКОПРОТЕИНЫ
Тлихопр о теинами называют белки', содержащие ковалентно связанный углеводный компонент. Основываясь на структурной роли углеводного компонента, гликопротеины можно разделить на два класса. К одному из них принадлежат так Называемые протеогликаны, их пептидная цепь настолько плотно унизана олигосахаридными цепочками, что молекула в целом выступает подобно разветвленному полисахариду, ее ; полипептидный скелет постоянно скрыт. Протеогликаны играют немалую роль в формировании межклеточного матрикса в тканях животных. Ко второму классу относятся такие гликопротеины, в которых полипептидная цепь формирует пространственную структуру по обычным правилам, свойственным белкам, а углеводные компоненты
присоединены к белковой глобуле. Далее речь будет идтй именно о таких гликопротеинах.
Известны два основных способа ковалентного присоединения олиго- сахаридных цепочек к белкам. •#•* **
К-Гликопротеины
В этих гликопротеинах углеводный компонент присоединяется N- гликозидной связмо (отсюда и название) к амидному азоту остатка аспарагина, включенного в пептидную цепь. Первым моносахаридным звеном, образующим N-гликозидную связь с аспарагином в гликопротеинах этой группы, всегда оказывается N-ацетидглюкозамин^ так что "узел" присоединения имеет следующую’структуру:
ох С=0
ЫУШ | •|
J—"0\ J —С~СН2*~СИАспарагин
<рн1
НО'1И X NH
N-Ацетилглкжозамин NH_*
।N-Глико видная связь
‘СО
I
сн« я
N-Гликозидная связь легко расщепляется в кислой среде, поэтому N- гликопротеины кислотолабилъны. В гликопротеинах этого типа к остатку аспарагина присоединен олигосахарид, в котором к "узловому" остатку N-ацетилглюкозамина присоединен 1-4-связью еще один остаток N-ацетилглюкозамина, далее следуют несколько остатков маннозы, могут встречаться остатки N-ацетилглюкозамина, галактозы, нейраминовой кислоты, фукозы и некоторые другие моносахаридные звенья. -
Биосинтез N-гликопротеинов происходит в шероховатом ретикулуме, причем на амидную группу аспарагина переносится под действием специализированного фермента за один шаг олигосахарид весьма сложной структуры GlcgManeGlcNAcj, где Glc - остаток глюкозы, Мап - маннозы, GlcNAc - N-ацетилглюкозамина. Далее он подвергается более или менее сложному процессингу - отщеплению концевых моносахе ридиых звеньев, в частности полному отщеплению остатков глюкозы при помощи гпецифических1 глюкозидаз, частичному - маннозы маннозидазами. В результате этого остается так называемое "ядро", К которому присоединяются другие моносахариды:-4"h
Ian-* Ian
ManI
Man -* ManMan —♦ "GlcNAc —♦ GlcNAc -* Ann
ManMan—> Man, r*
♦-——---—-—-- Ядро 11 ■•
<Олигоманноза —————————
За этим следует последовательное включение отдельных моносахаридных звеньев, в результате чего к "маннозному ядру11 присоединяются трисахаридные структуры NeuNAc ^ Gal ~* GlcNAc -♦, где NeuNAc - ацетилнейраминовая кислота» Gal - галактоза, иногда и другие моносахариды, например фукоза - Fuc. Эти реакции специфичны, поэтому образующаяся в результате завершенная структура олигосахарида различна у разных балков. Ниже показана типичная разветвленная структура углеводных компонентов некоторых М-гликопроте- инов:.
NeuNAc -> Gal -• GlcNAc v»
* „Fuc
NeuNAc-♦ GalGlcNAc ' X
Man -> GlcNAc -♦ GlcNAc-♦ Asn
Gal -» GlcNAc -* Man
Структура, типичная для белков сыворотки крови
ManGlcNAc
^ Мап ♦*1.
„ ^^ Мап —♦ GlcNAc —> GlcNAc —♦ Asn
Man ^
Gal -•GlcNAc -> Man "--
jN-Олигосахарид овальбумина
GlcNAc
.. N-Гликозилирование подвергаются лишь немногие из остатков аспарагина, имеющихся в белках. Например, в панкреатической рибонуклеазе из 34 остатков аспарагина гликозилируется только один, находящийся в последовательности Aen-Leu-Thr, что приводит к образованию так называемой рибонуклеазы В. Реакция протекает, как это нередко случается при посттрансляционной модификации, неполно, и значительная часть молекул ф^мента остается негликозилиро- ванной (рибонуклеаза А).
Исследование множества N-гликопротеинов показало, что присутствие оксиаминокислоты - треонина или серина через один остаток от аспарагина - служит сигналом для специфического фермента - олиго- сахаридтрансферазы, гликозилирующей аспарагин в последовательности Asn-Xaa-Ser(Thr), где Хаа - любая аминокислота. Это позволяет предсказать возможные точки N-гликозилированйя по первичной структуре белка. Фермент, катализирующий N-гликозилирование, - олигосахаридтрансфераза - "узнает амидную группу аспарагина, отделенного одним аминокислотным остатком от серина или треонина, если полипептидная цепь развернута. По-видимому, свертывание соответствующего участка в пространственную структуру препятствует гликозилированию. Этим объясняется отсутствие гликозилирования одного из двух остатков аспарагина в овальбумине in vivo, хотя in vitro удается присоединить олигосахариды к обоим остаткам, входящим в указанную выше характерную для N-гликозилирования последовательность.
Антибиотик туникамицин блокирует N-гликозирование белков. Фермент - гликопептидаза F - избирательно отщепляет олигосахариды от N-гликопротеинов.
N-Гликозилирование характерно для секреторных белков, попадающих в эндоплазматический ретикулум, хотя оно не является непременной предпосылкой секреции.
О-Гликопротенны
В гликопротеинах этого типа углеводный компонент присоединяется О-гликозидной связью к оксигруппе остатка серина или треонина, причем "узловое" положение всегда занимает остаток А-ацетилгалакто- замина: . .
СОСОСерин или треонинСерин или треонин
СО
СО
Серин или треонин
Серин или треонин
В отлИчие . от N-rликозилирования биосинтез О-гликопротеинов происходит ступенчато. Вслед за присоединением "узлового" N-аце- тилгалактозамина последовательно действующие гликозилтрансферазы присоединяют >-другие моносахаридные, звенья, образуя, например, следующую структуру: ' ...- а
. OU = Ч . .-•• Р ^ ! Ч I
. Gal ♦—NeuNAc т
GalNAc <- NeuNAc
- Однозначного "сигнала" . в первичной структуре О-гликопротеинов, который определял бы подлежащий модификации остаток серина или треонина, не обнаружено. Имеются, однако, указания на то, что гликозилируется гидроксильная группа остатка серина или треонина, который следует за остатком пролина и входит в ^8-изгиб. Это указывает на то, что гликозилирование происходит уже после формирования пространственной структуры белка.
, О-гликозидная связь расщепляется в щелочной среде, причем углеводный компонент отделяется от белкового вместе с водородом, принадлежащим о-углеродному атому серина, оставляя в полипептидной цепи дегидроаланин:
СОСО
R’• ОН'
-0-CH2-C-HСН2=С.
-от 3 . II
NHNH
II
О-Гликозидная связь Дегидроаланин
О-Гликозилирование встречается, не столь часто в глобулярных белках, оно более свойственно муцинам (веществам, определяющим группу крови) — гликопротеинам, относящимся к классу протеогликанов. Однако в иммуноглобулинах, напримрр, одновременно встречаются оба типа гликозилирования
Весьма сложен вопрос о функциональной роли углеводных компонентов в гликопротеинах. В некоторых, правда немногих, случаях удалось определить пространственную структуру гликопротеинов. Оказалось, что олигосахаридные цепочки не образуют сколько-
Рис. 11.1. Размещение углеводных цепей, присоединенных к остаткам аспарагина Asn-297 (выделены жирными линиями) между доменами С„2 иммуноглобулина G кролика п
Углеводные структуры образуют гидрофильную прокладку между поверхностями доменов '■
нибудь протяженных контактов с белковой глобулой, за исключением немногих водородных связей вблизи точки присоединения к белку, а направлены в сторону от глобулы и погружены в окружающую гликопротеин воду. Лишь для одного из иммуноглобулинов 6 оказалось, что углеводный компонент, содержащий шесть моносахаридных звеньев, как бы лежит на поверхности раздела двух доменов С 2 и играет, по-видимому, роль своеобразной гидрофильной прокладки площадью около 500 А2, не позволяя слипнуться гидрофобным поверхностям этих доменов (рис. 11.1). В других изученных случаях трудно говорить о структурообразующей роли углеводных компонентов.
Углеводный компонент практически никогда не участвует в, главной функции белка, т.е. не входит в состав каталитического центра или зоны связывания ферментов, активные участки регуляторных белков и т.п. Активность, измеренная для пар гликозилированных и негликозилированных ферментов, неизменно оказывается одинаковой. Сказанное не относится, впрочем, к случаям, когдр функция белка состоит в передаче сигнала — в таких белках, нд-
пример в некоторых гормонах, углеводный компонент нередко .критически важен для активности.
Как уже говорилось, гликозилирование сопровождает секрецию белков у животных, однако секреция может происходить и без гликозилирования; следовательно, включение углеводных компонентов есть результат, а не предпосылка секреции. Это хорошо иллюстрируют данные о доле гликопротеинов среди белков, содержащихся в секрете поджелудочной железы — 4,7%, коровьем молоке — 58%, синтезируемых в печени белках сыворотки крови — 59,7%. Однако в курином яйце гликозилировано около 97% суммы белков.
По-видимому, гликозилирование важно не для структуры или функции белка как такового, а для его взаимоотношений с другими компонентами клетки или организма, для его "поведения" в этих чрезвычайно сложных системах. Действительно, известно, что фосфорилирование одного из остатков маннозы в олигосахаридных структурах цитоплазматических" ферментов, например внутриклеточной аспартильной протеиназы — катепсина D, "адресует" их в лизосомы. Присутствие другого моносахарида — сиаловой кислоты в гликопротеинах крови — способствует их удержанию в кровотоке; белки, подвергшиеся отщеплению концевых остатков сиаловой кислоты, быстро удаляются печенью. Например, церулоплазмин, циркулирующий в крови в среднем около 50 ч, после отщепления концевой сиаловой кислоты удаляется за несколько минут.
Несомненна физиологическая роль углеводных компонентов в гликопротеинах мембран — они неизменно располагаются в той части молекулы, которая направлена в окружающую среду, но почти всегда отсутствуют в цитоплазматических доменах этих белков. Углеводные компоненты участвуют в процессах межклеточного "узнавания", дифференциации, трансформации клеток, фагоцитозе, процессах оплодотворения, во взаимодействии клеток с вирусами, связывании гормонов с рецепторными белками.
Интересны гликопротеины антарктических рыб, понижающие точку замерзания жидкостей, — их функциональная роль вполне очевидна. В полипептидной цепи одного из них содержатся многочисленные повторы Ala—Ala—Thr, причем к гидроксильным группам треонина присоединены дисахаридные звенья галактозил-N- ацетил галактозамина.
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ. ФОСФОПРОТЕИНЫ
Белки фосфорилируют специфические ферменты — протеинки- назы, которые катализируют перенос концевого фосфата АТР на гидроксильные группы остатков серина или треонина. Значительно реже наблюдается фосфорилирование гидроксила тирозина, так что содержание фосфотирозина составляет около 0,1% суммы фосфосерина и фосфотреонина; однако физиологическая роль этой модификации весьма велика.
НОIно—P=fl• IоIсн2I—кн—сн—со-Фосфо серинНОIно—P=fl• IоIсн2I—кн—сн—со-Фосфо серинНОIНО—Р=0IоI сн-сн, I—кн—сн—со—Фосфо треонинНОIНО—Р=0IоI сн-сн, I—кн—сн—со—Фосфо треонинФосфотирозинФосфотирозинСС
НО
Iно—P=fl
• Iо
I
сн2
I
—кн—сн—со-
Фосфо серин
НО
Iно—P=fl
• Iо
I
сн2
I
—кн—сн—со-
Фосфо серин
НО
IНО—Р=0
Iо
I сн-сн, I
—кн—сн—со—
Фосфо треонин
НО
IНО—Р=0
Iо
I сн-сн, I
—кн—сн—со—
Фосфо треонин
Фосфотирозин
Фосфотирозин
С
С
сн2
-NH-CH-CO-
. Фосфоэфирные -связи фосфопротеинов могут гидролизоваться специализированными ферментами -— фосфопротеинфосфатазали!. Таким образом, фосфорилирование — обратимый процесс. Белок за время своего существования может многократно переходить то в фосфорилированную, то в дефосфорилированную форму. Эта чрезвычайно важная особенность фосфорилирования — возможность обращения модификации — обусловила роль этой реакции как механизма, позволяющего регулировать активность белка и даже целых групп белков в ответ на изменяющиеся внутри- и внеклеточные стимулы.
Хорошо изучена роль фосфорилирования в регуляции фосфорилазы — фермента, катализирующего фосфоролиз запасного полисахарида — гликогена — с образованием глюкозо-1-фосфата, далее используемого в энергетическом обмене. Противоположную реакцию — включение остатка глюкозы из глюкозо-1-фосфата в гликоген — катализирует гликогенсинтетаза. Совместное действие этих двух ферментов позволяет проводить цикл превращений, показанный ниже: 266
Фосфорилаза а
Гликоген
-• Гликогенсинтетаза
Такой цикл требует управления, попеременного включения фосфорилазной или синтетазной активности с выключением противоположно направленной. Если бы такого управления не было, цикл превратился бы в бессмысленный. И действительно, активность гликогенфосфори- лазы контролируется целым рядом факторов, один из которых — ' фосфорилирование и дефосфорилирование этого фермента. Нефосфо- рилированная фосфорилиза b практически неактивна, но превращается в активную форму — фосфорилазу а — при фосфорилировании соответствующей протеинкиназой только одного остатка серина — Ser-14. Чем может быть объяснена активация фермента, субъединица которого состоит примерно из 400 аминокислотных остатков, в результате, казалось бы, небольшого изменения ковалентной структуры?
Подвергающийся фосфорилированию остаток серина расположен на границе контакта двух субъединиц фосфорилазы, т.е. в районе относительно слабых взаимодействий, который особенно легко поддается перестройке уже при малых изменениях ковалентной структуры. Присоединение фосфата к Ser-14 влечет за собой установление элект-' ростатического взаимодействия и появление сразу двух водородных связей между фосфоэфирной группой фосфосерина и гуанидогруппой остатка Arg-69, принадлежащего другой субъединице фермента и так
же локализованного на поверхности контакта:же локализованного на поверхности контакта:СН—СН2—0Р=0+ С—NH—СН2СН2—СН2—СНСН—СН2—0Р=0+ С—NH—СН2СН2—СН2—СНNH0. ... H2N -NH-. I .Фосфосерин-14 Аргинин-69 (другой субъединицы)NH0. ... H2N -NH-. I .Фосфосерин-14 Аргинин-69 (другой субъединицы)
же локализованного на поверхности контакта:
же локализованного на поверхности контакта:
СН—СН2—0Р=0+ С—NH—СН2СН2—СН2—СН
СН—СН2—0Р=0+ С—NH—СН2СН2—СН2—СН
NH0. ... H2N -NH
-. I .
Фосфосерин-14 Аргинин-69 (другой субъединицы)
NH0. ... H2N -NH
-. I .
Фосфосерин-14 Аргинин-69 (другой субъединицы)
Это изменяет систему нековалентных связей на поверхности контакта двух субъединиц, эффект передается в активный центр фермента. В результате пептидная петля, экранирующая активный центр в фосфорилазе Ь, отгибается и освобождает доступ субстрата к нему, активируя тем самым фермент.
Отщепление фосфата фосфопротеинфосфатазой вновь переводит
фосфосерин-14 в серин и восстанавливает свойственную неактивной фосфорилазе 6 систему нековалентных связей на границе между субъединицами, пептидная петля возвращается на прежнее место, блокируя каталитический центр. ,
Таким образом, столь значительные функциональные последствия фосфорилирования (и дефосфорилирования) обусловлены тем', что эти реакции происходят в относительно лабильной зоне белковой структуры — в области контакта субъединиц (как в рассмотренном случае) или доменов. Интересно, что регуляторное действие АМР на фосфорилазу основано на. похожем принципе — аденозинмонофосфат образует прочный нековалентный комплекс. с фосфорилазой Ь, связываясь на поверхности контакта субъединиц. Его фосфатная группа взаимодействует с двумя гуанидогруппами остатков аргинина и вызывает, как и в случае фосфорилирования Ser-14, цепь перестроек в структурно лабильной зоне фермента, опять-Таки открывая каталитический центр. Результатом является активация фосфорилазы 6 — фермента, практически не активного в отсутствие АМР. Разница в том, что фосфорилирование активирует фермент, переводя его в фосфорилазу а, не зависимо от концентрации эффектора (в данном случае АМР) внутри клетки и, следовательно, в определенной мере не зависимо от биохимического статуса клетки.
Как уже отмечалось, перенос фосфата АТР на фермент катализируется протеинкиназой. Активность этого фермента, в свою очередь, контролируется и зависит от содержания в клетке так называемого "вторичного мессенджера" — сАМР. сАМР-зависимая протеинкиназа состоит из неодинаковых субъединиц: регуляторной Я-субъедини-цы, способной связывать эффектор, т.е. сАМР, и каталитической С-субъеди- ницы. Регуляторная субъединица выступает как ингибитор протеинки- назы, р комплексе с ней каталитическая субъединица лишена активности. При связывании регуляторной субъединицей сАМР, которое происходит за счет нековалёнтных взаимодействий, она утрачивает способность образовывать четвертичную структуру. В результате каталитическая субъединица высвобождается и оказывается способной фосфорилировать белки. -
Снижение концентрации свободного сАМР в клетке приводит к тому, что синтезируемая в избытке регуляторная субъединица вновь связывается с каталитической субъединицей, вызывая ингибирование фермента. Так реализуется динамическое равновесие:
RC + сАМР ^=± R.cAMP + С
Таким образом, концентрация сАМР управляет активностью проте- инкиназы, а через нее — активностью гликогенфосфорилазы, в конеч- 268
ном счете —? мобилизацией энергии, запасенной клеткой в форме гликогена. В свою очередь, уровень с АМР определяется соотношением активностей аденгматгм^иклазы — фермента, превращающего АТР в сАМР, й фосфодиэстеразъц гидролизующей сАМР до АМР. Активность аденилатциклазы зависит от ряда внешних факторов, среди которых особенно важен гормональный контроль. Итак, фосфорилирование фосфорилазы 6 и ее превращение в активный фермент — фосфорилазу а — есть результат целого каскада ферментативных реакций, управляемого весьма тонко. Как уже упоминалось, фосфорилирование — не единственный путь воздействия на активность фосфорилазы.
Активация фосфорилазы, как видно из рассмотренного выше цикла, должна сопровождаться снижением активности гликогенсинтетазы. Этот фермент также существует в двух формах, однако в этом случае активная форма не фосфорилирована. При фосфорилировании соответствующей протеинкиназой она превращается в неактивную глико- генсинтетазу.
Гликоген- ,*х , . b с фосфорилаза х-»*Гликоген- ,*х , . b с фосфорилаза х-»*АктивнаяАктивнаяНеактивнаяНеактивнаяг ликогенсинтет а заг ликогенсинтет а заСледовательно, изображенный выше цикл синтеза и фосфоролиза гликогена следует дополнить довольно сложной схемой взаимопревращений активных и неактивных форм ферментов, катализирующих эти процессы:
Гликоген- ,*х , . b с фосфорилаза х-»*
Гликоген- ,*х , . b с фосфорилаза х-»*
Активная
Активная
Неактивная
Неактивная
г ликогенсинтет а за
г ликогенсинтет а за
I
Аденил атциклаЗа
1
Гормональный контроль
Необходимо иметь в виду, что и эта схема сильно упрощена. Выяснилось, что активность протеинкиназы может регулироваться кальлхо- д-ул-инол! — белком, связывающим ионы кальция, — и, следовательно, зависит от концентрации в клетке и этого вторичного мессенджера.
Аналогично, фосфорилированием и дефосфорилированием контро- ■ лируется активность целого ряда других метаболических ферментов, в частности синтетазы жирных кислот, пируватдегидрогеназы. Важно подчеркнуть, что реакции фосфорилирования и дефосфорилирования коренным образом отличаются от аллостерической регуляции ферментов, поскольку они не находятся в прямой зависимости от биохимического статуса клетки и, следовательно, могут использоваться для изменения активности'под воздействием внеклеточных сигналов, они удобны для регуляции на уровне организма. Известны и другие протеин- киназы, фосфорилирующие остатки серина или треонина в белках, в том числе независимые от сАМР или контролируемые cGNP, ди ацил гли церином.
Выбор остатка серина, подвергаемого фосфорилированию, может зависеть от последовательности аминокислот, кдторые его окружают. Так, сАМР-зависимая протеинкиназа быка фосфорилирует гидроксильную группу серина в последовательности
Arg—Arg—Ala—5е»—Val(Leu),
причем соседствующие остатки аргинина, видимо, направляют фермент.
Фосфорилирование по остаткам тирозина, которое катализируется специфическими протеинкиназами (тирозинкиназами), встречается значительно реже, чем фосфорилирование остатков серина и треонина, — на долю фосфотирозина приходится около 0,1% всего связанного с белком фосфата. Однако биологическая роль этой реакции очень велика, так как она активно используется для передачи сигналов в биологических системах._
Так, инсулин, связываясь с рецептором — трансмембранным белком, вызывает активацию его домена,, направленного в цитоплазму и являющегося тирозинкиназой. Тирозинкинавную активность индуцирует ряд факторов роста — белков, запускающих деление клеток по механизму, аналогичному описанному для инсулина. Рецепторы этих факторов — крупные .трансмембранные белки — связывают их на наружной поверхности мембраны. Образование комплекса фактор — рецептор передает сигнал через трансмембранную часть рецептора на - его цитоплазматический домен, являющийся тирозинкиназой. Активированная таким образом тирозинкиназа модифицирует внутриклеточные белки, передавая сигнал далее.
Тирозинкиназы фосфорилируют остатки тирозина в некоторых - внутриклеточных белках, вовлеченных в сложную систему регуляции клеточного деления, в которой также участвует и фосфорилирование белков по остаткам серина и треонина. Нарушение этой весьма слож- 270
ной регуляторной сети может привести к неконтролируемому делению клеток, опухолевому росту. Характерно, что онкобелки, структурно близкие нормальным белкам животной клетки, но вызывающие ее трансформацию, превращение в опухолевую, нередко оказываются тирозинкиназами. .
ADP-РИБОЗИЛИРОВАНИЕ
Реакция переноса ADP-рибозного остатка NAD на белки, катализируемая специфическими ферментами, используется для регуляции активности ряда ферментов, в том числе глутаминсинтетазы, где модифицируется остаток тирозина.
Аналогичную реакцию переноса ADP-рибозного фрагмента катализируют некоторые бактериальные токсины. Каталитический домен дифтерийного токсина, образующийся в результате ограниченного протеолиза, катализирует присоединение этого фрагмента к фактору элонгации EF-2 в клетках эукариот и архебактерий. Модификации подвергается производное гистидина (содержащееся в консервативном районе последовательности этого фактора) — дифтамид, в свою очередь образуемый многоступенчатой модификацией остатка гистидина.
На первом этапе аденозилметионин (AdoMet), обычно являющийся донором метильной группы, выступает при алкилировании имидазольного кольца как донор фрагмента -СН2~СН2~СН-СООН:
I
nh2
со_ AdoMet AdoCH3CQ_
н—c = c-ch2-ch-nh-—►h—c = c—ch2-ch-nh►
IIII
H-N ^NH—N^N
^CH^c
I
CH2 .
I
v CH2
I
■ HOOC—ch—nh2
Затем происходит исчерпывающее метилирование аминогруппы присоединившегося фрагмента. В этом случае аденозилметионин явля- -271
ется источником метильных групп, превращаясь в аденозил гомоцистеин (AdoHcy). Модификацию завершает амидирование карбоксильной, группы, которое протекает с одновременным гидролизом АТР и привод дит к дифтамиду:
со-со-н-сн-сс—сн2—€h-nh—с—сн2—€h-nh—н—сн—сс—СН2-СН—NH—с—СН2-СН—NH—H-NH-N-N-NHNHN■N■NССССAdoMet AdoHcyAdoMet AdoHcyсн2сн2СН 2СН 2ДифтамидДифтамидсн2сн2сн2сн2CH—N(CH3)3CH—N(CH3)3CH—N(CH3)3CH—N(CH3)3со-
со-
со-
н-с
н-с
с—сн2—€h-nh—
с—сн2—€h-nh—
н—с
н—с
с—СН2-СН—NH—
с—СН2-СН—NH—
H-N
H-N
-N
-N
HN
HN
■N
■N
С
С
С
С
AdoMet AdoHcy
AdoMet AdoHcy
сн2
сн2
СН 2
СН 2
Дифтамид
Дифтамид
сн2
сн2
сн2
сн2
CH—N(CH3)3
CH—N(CH3)3
CH—N(CH3)3
CH—N(CH3)3
СООНСООНсо—NH2
СООН
СООН
■ ADP-рибозилирование дифтамида, катализируемое дифтерийным токсином, инактивирует фактор элонгации EF, прерывая тем самым трансляцию, что приводит к гибели клетки.
ЛИПОПРОТЕИНЫ
К липопротеинам в строгом смысле этого термина принадлежат белки, содержащие ковалентно связанные липиды. Однако традиционно к ним относят белки, участвующие в транспорте липидов и образующие с ними нековалентные комплексы, например липопротеины крови. Мы рассмотрим только такие липопротеины, которые отвечают строгому определению.
Липопротеины с С-концевым гликолипидом
Обнаружено около 30 белков, которые встраиваются в мембраны животных клеток за счет гидрофобных взаимодействий между липида- Juu мембраны й своеобразно организованной С-концевой частью белка, представляющей собой гликолипид (так называемые "PIG-tailed"-бeл- ки — "белки со свиными хвостиками", от англ. Phospho-Inositol- Glycan). К ним принадлежат щелочная фосфатаза, глобулярная форма- ацетилхолинэстеразы, высоковариабельный гликопротеин поверхности трипаносом, адгезионный белок нервных клеток и т.д. 272
По завершении биосинтеза полипептидной цепи С-концевой участок гакого белка, содержащий от 17 до 31 остатка преимущественно гидро- . фобных аминокислот, отщепляется, заменяясь следующей структурой:
Белок^О^^^НзСНгО^ликан^люкозамин^осфоинозигтдиацилглидерин ■ Этаноламин
Гликолипидный фрагмент несколько различен у разных белков, отличаясь строением гликана, содержащего галактозу, набором жирных кислот в диацилглицериновом звене, среди которых отмечено присутствие пальмитиновой и миристиновой кислот.
Весь гликолипидный фрагмент удается в некоторых случаях удалить при действии протеиназы. Связь между глюкозамином и фосфоинозитом расщепляется при действии азотистой кислоты. Особенно характерно отщепление липйда при действии фосфолипаз D или С, которые гидролизуют соответственно фосфодиэфирные связи между инозитом и фосфатидовой кислотой или фосфоинозитом и диацйл- глицерином, что приводит, к отделению белка от мембраны. Имеются сведения, что фосфолипаза С каким-то образом участвует в механизме действия, инсулина, отщепляя гликолипидный фрагмент от липопротеин липазы. В результате последняя утрачивает связь с наружной мембраной жировых клеток, что сказывается на катаболизме триглицеридов. Во всяком случае, очевидно, что в рассматриваемых белках гликозил-фосфатидилинозит не является инертным "якорем”.
Липопротеины с ft-концевой липидной группировкой
' Известны два способа присоединения липидной группировки к ■.аминному концу белка. Простейший состоит в ^дифистоилировании — переносе остатка. Миристиновой кислоты — СНз(СН2)12С0~* от миристо- 4лкоэнзима А на «-аминогруппу N-концевого остатка глицина белка. Гидрофобный миристоильный остаток участвует в удерживании белка в липидном слое мембраны или, возможно, связывается специальным белком-рецептором.
Некоторые белки микроорганизмов, например /^-лактамаза Вас Ulus cercus, взаимодействуют с липидами мембран при помощи своеобразного липидного якоря. Последний формируется на аминном конце полипептидной цепи после отщепления от нее сигнального пептида, обеспечивающего перенос полипептидной цепи белка через мембрану. । В таких белках аминоконцевое положение неизменно занимает остаток > -цистеина. К его сульфгидрильной группе тиоэфирной связью присоединяется остаток диацилглицерина, затем еще один остаток жирной 9—56273 .
кислоты ацилирует о^аминогруппу цистеина,, что приводит к следующей структуре:
Различные остаткижирных кислотРазличные остаткижирных кислотR—СО—0СН2
Различные остаткижирных кислот
Различные остаткижирных кислот
R—СО—0—СН п
I Диацилглицерин
S Тиоэфирная связьS Тиоэфирная связьсн2
S Тиоэфирная связь
S Тиоэфирная связь
СН2
R—СО—NH—CH—СО—NH—...
Модифицированный
N-концевой цистеин
Сосредоточение сразу трех остатков жирных кислот у N-концевого цистеина делает аминоконцевую часть полипептидной цепи белка весьма гидрофобной, чем и обусловлена возможность его взаимодействия с липидами мембраны. Вся эта конструкция надежно удерживает белок связанным с мембраной, причем белковая' глобула полностью погружена в среду, прилегающую к мембране, например в периплазма^ тическое пространство бактериальных клеток. ^-।
Сказанным не ограничиваются структурные типы липопротеинов. По-видимому, белок резус-фактора (Rh-белок), локализованный в мембране эритроцитов человека, содержит несколько (до четырех) остатков пальмитиновой кислоты, присоединенных тиоэфирными связями к сульфгидрильным группам цистеина, что делает его очень гидрофобным:'
Тиоэфирная связь
R—СО—9гСН2
—«в—сн—со—
Остаток цистеина в полипептидной цепи
Пренилированные белки
Реакции S-пренилирования, заключающейся в присоединении изопреноидов к атому серы остатка цистеина, который локализован в Cl- концевом участке полипептидной цепи, подвергается около 100 бел ков н в частности белок las (см. гл. 12). Первоисточником пренильных груп^ 274'.'" 1
оо. СН^С—сн2—сн2—о—р—о-p- он. СН^С—сн2—сн2—о—р—о-p- онCH3-C^H^H2HW--O-P---OHCH3-C^H^H2HW--O-P---OHСНзСНзОН ОНОН ОНСНзСНзОН ОНОН ОНИзопентенил-пирофосфат (С5)Изопентенил-пирофосфат (С5)Диметилаллил-пирофосфат (С5)Диметилаллил-пирофосфат (С5)
о
о
. СН^С—сн2—сн2—о—р—о-p- он
. СН^С—сн2—сн2—о—р—о-p- он
CH3-C^H^H2HW--O-P---OH
CH3-C^H^H2HW--O-P---OH
СНз
СНз
ОН ОН
ОН ОН
СНз
СНз
ОН ОН
ОН ОН
Изопентенил-пирофосфат (С5)
Изопентенил-пирофосфат (С5)
Диметилаллил-пирофосфат (С5)
Диметилаллил-пирофосфат (С5)
Пирожок является изопеитенил-пирофосфат,. изомеризующийся с перемещением двойной связи в диметилаллил-пирофосфат:
о
Конденсация этих двух молекул с элиминированием пирофосфата дает, геранил-пирофосфат:
О
ООЧ)—Р—ОНЧ)—Р—ОН
О
О
Ч)—Р—ОН
Ч)—Р—ОН
ннприсоединениемприсоединениемСН3СН3СН3СН3СНзСНзОН ОНОН ОН
н
н
присоединением
присоединением
СН3
СН3
СН3
СН3
СНз
СНз
ОН ОН
ОН ОН
СН3СН3- СНзОН
СН3
СН3
Геранил-пирофосфат (Сю)
Далее молекула наращивается последовательным
изопентенил-пирофосфата по такому же механизму, причем на каждом * шаге присоединяется' Сб-звено. Это приводит к фарнезил-пирофосфату (Cis), являющемуся также предшественником стероидов и каротиноидов, и геранил-геранил-пирофосфату (C2q):
О О
сн3-с^н^н24он2^:^н^24сн2^^и^ц2чн^^^
Фарнезил-пирофосфат (С15)
О
СН3-С=СН~СН2-кН2-С=СН-СН2-^СН2-С=СН-СН2тОН2--С=СН--СН2-О-Р—О-Р-ОНI : I : I : I IIСН3-С=СН~СН2-кН2-С=СН-СН2-^СН2-С=СН-СН2тОН2--С=СН--СН2-О-Р—О-Р-ОНI : I : I : I IIСНзСНзСНзСНзСНзСНзСНзСНзОН ОНОН ОН
СН3-С=СН~СН2-кН2-С=СН-СН2-^СН2-С=СН-СН2тОН2--С=СН--СН2-О-Р—О-Р-ОН
I : I : I : I II
СН3-С=СН~СН2-кН2-С=СН-СН2-^СН2-С=СН-СН2тОН2--С=СН--СН2-О-Р—О-Р-ОН
I : I : I : I II
СНз
СНз
СНз
СНз
СНз
СНз
СНз
СНз
ОН ОН
ОН ОН
Геранил-геранил-пирофосфат (С20) (пунктиром отмечены Границы •повторяющихся Сз-звеньев)
' Фарнезильная или геранил-геранильная группы с отщеплением пирофосфата переносятся на" атом серы остатка цистеина, который расположен вблизи С-конца полипептидной цепи в последовательности
(НА—А^*! (так называемом СААХ-боксе), где С — остаток цистеина, А — остатки алифатических аминокислот, X — С-концевая аминокислота, определяющая, какой из двух типов реакции пренилирования осуществится. Если X — серии, метионин или глутамин, то к цистеину присоединяется фарнезил (Cis), если X — лейцин, то происходит присоединение гераяил-геранила (С2о). • '
Пренилирование белков включает в себя следующую цепь превращений. Пренилтрансфераза переносит пренильный остаток соответствующего пренил-пирофосфата на SH-группу остатка цистеина в белке, имеющем на Оконце СААХ-бокс. Затем специфическая пептидаза от- щейляет выполнившую роль сигнала последовательность А^А—X, после чего с участием метилтрансферазы метильная группа S-аденозилметио- нина переносится на карбоксил пренилированного цистеина, превращая его в метиловый эфир:
СИ3~С=СИ-СН2“СН2“С=СН-€И2-€Н2-С=СН-СН2-8
•—NH-CH-COOCtig
Метиловый эфир 8-фарнезил-цистеин& на С-конце пренилированного белка
Очевидно, что присоединение к белку крупной гидрофобной пренильной группировки благоприятствует его включению, в цитоплазматическую мембрану.' При этом существенно, что от типа пренильной группы зависит ориентация белка в мембране — фарнезилированные белки встраиваются во внешнюю мембрану, белки же, содержащие геранил-геранильный остаток, — во заутреннюю мембрану, обращенную к цитоплазме. Впрочем, у этого правила могут быть исключения, кроме того, в адресовании пренилированных белков участвуют, вероятно, и другие элементы их структуры. Таким образом, реакция пренилирования — один из процессов, определяющих локализацию белков в биологических структурах, их топогенез.
. 11.8. ОГРАНИЧЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ
Ограниченный протеолиз — важнейшая реакция посттрансляционной модификации белка. Обычный 11 неограниченный", глубокий протеолиз — засщепление белка протеиназами — протекает по принципу "все или ничего". Компактный белок, как правило, относительно устойчив к действию протеиназ, поскольку в нем практически нет необходимых для связывания протеолитических фермеНтов протяженных открытых" участков полипептидной цепи- Поэтому атака на первых 276 4 .
порах ограничивается расщеплением отдельных петель, концевых участков белка. Если же протеолизу подвергается "внутренний" участок полипептидной цепи, ставший доступным, например, за счет частичной (и обратимой) денатурации белковой глобулы, то пространственная структура дестабилизируется, белок-субстрат необратимо денатурирует и вся полипептидная цепь оказывается доступной протеолитической атаке. Результатом является глубокий гидролиз с образованием коротких фрагментов. При таком ходе протеолиза в гидролизате присутствуют исходный белок, количество которого постоянно уменьшается, и низкомолекулярные пептидные продукты гидролиза, содержание которых постоянно нарастает, промежуточные же продукты наблюдать не удается.
Ограниченный протеолиз, при котором процесс задерживается или полностью останавливается на промежуточных продуктах, возможен лишь тогда, когда продукты протеолиза сохраняют крлтактйост*, например при отщеплении фрагмента какого-либо из концов пептидной цепи, разрыве петли на поверхности глобулы или при расщеплении пептидной цепи между достаточно стабильными доменами белка.
Ход ограниченного протеолиза, его результат решающим образом зависят от особенностей стррктрры белка-србстрата. Вайду этого нередко, одинаковые или очень близкие результаты дает применение различных протеиназ, мес4о действия которых определяется особенностями пространственного строения субстрата. Если в разрешенном для атаки участке (шарнирный участок) последовательность аминокислотных остатков согласуется со специфичностью атакующей протеиназы, то эффективность процесса возрастает. Именно так обстоит дело при посттрансляционной модификации белков протеиназами.
Рассмотрим несколько типичных процессов ограниченного протеолиза.
Формирование белка неканонической структуры. <Биосинтез инсулина
Инсрлин, построейный из двух полипептидных цепей А и В, содержащих соответственно 21 и 30 аминокислотных остатков и соединенных между собой дисульфидными связями, слишком мал, чтобы сформировать стабильную глобулярную структуру с достаточной эффективностью. Действительно,, удается получить инсулин рекомбинацией раздельно синтезированных А- и В-цепей, причем остатки цистеина, окисляясь, образуют свойственную нативному белку систему дисульфидных связей. Однако такой процесс происходит медленно и дает, как правило, невысокий выход инсулина.
Гораздо легче образует третичную структуру предшественник инсулина — проинсулин, в полипептидной цепи которого "будущие'1 А- и В- цепи инсулина соединены пептидом С в последовательности В—С—А. Такой белок, содержащий в одной полипептидной цепи около 90 аминокислотный остатков, сворачивается в компактную структуру, далее следует замыкание дисульфидных мостиков, стабилизирующее молекулу в целом, после чего специальная протеиназ.а "вырезает" пептид С. Точки воздействия этой протеиназы предопределены двумя факторами — пространственной структурой проинсулина и присутствием'в его полипептидной цепи двух ..сигналов — двух пар катионных аминокислот, расположенных в последовательности таким образом:
В-цепь—Arg—Arg—С-пептид—Lys—Arg—А-цепь
Процессирующая такой предшественник протеиназа узнает пары аминокислот с катионными боковыми группами типа Arg—Arg, Lys—Arg и т.п. и расщепляет пептидную связь на С-конце таких пар. В результате будет вырезан пептид С «месте с последовательностью Lys—Arg на С-конце и освободятся цепи А и. В, причем на С-конце цепи В окажутся два остатка аргинина, которые необходимо отщепить. Это выполняет специализированная металлокарбоксипептидаза с оптимумом действия в слабокислой среде. х ,
Заметим, что сочетание действия протеиназы, гидролизующей пептидные связи после пары катионных аминокислот (такие ферменты обнаружены у животных и дрожжей), и карбоксипептидазы, отщепляющей затем эти аминокислоты (по специфичности фермент близок карбоксипептидазе В), используется в биосинтезе коротких пептидов, например энкефалина. Специфичность действия такой системы достаточно высока, и процессинг длинных предшественников происходит, видимо, еще до образования стабильной пространственной структуры. Так, пептидная цепь проопиомелацокортина, содержащая 235 ами- йокислотных остатков, расщепляется по такому способу в семи местах, образуя ' эндорфин, адренокортикотропный гормон, <у- и у-меланоци- тостимулирующие гормоны и другие физиологически активные пептиды. - 1
Разъединение белковых глобул в полибелках
В ряде случаев несколько структурно и функциональна различных белков синтезируется первоначально как одна полипептидная цепь очень большой длины, отдельные участки которой независимо друг от друга свертываются в белковые глобулы, образуя так называемый полибелок. Так, например, синтезируются ферменты биосинтеза жир- 278
ных кислот. Особенно характерен синтез * полибелков для pempaeupy-' сов. В дальнейшем происходит разрезание специфическими протеиназами пептидных перетяжек между отдельными . глобулами, после чего последние функционируют независимо. Так, в частности, разделяются компоненты полибелка вируса1 иммунодефицита человека. Видимо, точность расщепления полипептидных перетяжек в полибелке в этом случае столь существенна, что этот процесс не всегда может быть доверен протеиназам клетки-хозяина. Полибелок содержит весьма специфичную протеиназу вируса иммунодефицита человека, отдаленно родственную пепсину, которая узнает характерные последовательности аминокислот в перетяжках и точно разрезает их. Предполагают, что избирательное ингибирование таких протеиназ может быть использо- , вано как один из способов борьбы с вирусной инфекцией.
Разделение доменог
Эта реакция используется, в частности, как необходимый этап в . механизме действия ряда белковых токсинов, вырабатываемых микроорганизмами. Так, дифтерийный токсин синтезируется к^к протоксин, построенный из одной полипептидной Цепи, которая образует по крайней мере два структурно и функционально автономных домена. Один ’ из них ответствен за связывание токсина с рецептором мембраны атакуемой клетки, второй — представляет собой фермент, катализирующий перенос аденозиндифосфатрибозного фрагмента NAD на фактор элонгации ЕЕ, который при этом инактивируется. Комплекс токсин — рецептор, обязанный своим образованием связыванию первого домена с рецептором, после интернализации (втягивания внутрь клетки) оказывается в окруженном мембраной пузырьке — везикуле. ■
■ Для того чтобы получить возможность действия на фактор элонгации ЕЕ, каталитический домен должен покинуть везикулу, оказаться в цитоплазме. Токсин содержит структуру, позволяющую каталитическому домену проникнуть через мембрану, однако и после этого он еще сохранит связь с "узнающим" доменом. Следовательно, он не сможет покинуть везикулу, пока протеиназа подходящей специфичности не расщепит междоменный участок пептидной цепи. Это высвобождает каталитический домен и позволяет ему сблизиться с фактором ЕЕ.
Расщепление пептидной связи между о- и /2-субъединицами рецептора инсулина необходимо для активации этого белка. Соединяющий (шарнирный) участок пептидной цепи содержит очень характерную сигнальную последовательность Arg—Lys—Arg-Arg—la^, в который связь Arg—Хаа расщепляется специфическим протеолитическим ферментом. Найдены носители аномального гена рецептора инсулина,* в
279
котором отмеченная последовательность заменена на Arg-Lys-Arg- -Spr—Хаа. Замена Arg на Ser делает белок устойчивым к процессирующей протеиназе, домены не разделяются, что приводит к образованию неактивного рецептора. Гомозиготные носители такого мутантного гена страдают диабетом, который не компенсируется инсулином.
Интересно, что аналогично построенная сигнальная последовательность четырех катионных аминокислот определяет протеолитическую активацию гемагглютинина вируса гриппа, а также созревание гликопротеина поверхности вируса иммунодефицита человека. -
Активация предшественников ферментов
Многие ферменты, в особенности гидролазы, синтезируются в виде неактивных предшественников — проферментов, или зимогенов. Наиболее изучена активация предшественников панкреатических сериновых протеиназ — -трипсиногена и химотрипсиногена. В обоих случаях пептидная цепь фермента удлинена с аминного конца на несколько аминокислотных остатков — активационный пептид, протеолитическое отщепление которого превращает практически неактивный зимоген в активную протеиназу. Так, в трипсиногене быка аминоконцевая последовательность имеет такую структуру:
Активационный пептидТрипсин
. <> 4_—
Vai—Asp—Asp—Asp—Asp—Lys—lie-Vai—Gly™...
Связь, расщепляемая при активации,
трипсином или лучше энтеропептидазой .
Гидролиз трипсином именно пептидной связи Lys-Не определяется прежде всего ее доступностью — в молекуле трипсиногена содержится целый ряд пептидных связей, образованных остатками аргинина или лизина и атакуемых трипсином в денатурированном зимогене, однако в нативном белке расщепляется первой именно эта связь. При активации Трипсиногена образуется трипсин, способный активировать другие молекулы профермента, так что реакция в целом оказывается аутокаталитической и протекает с резким ускорением.
Характерно, что скорость активации, обеспечиваемая трипсином, гп тио все же оказывается недостаточной и активация инициируется специальным протеолитическим ферментом — энтеропептидазой (энтерокиназой), который содержится в секрете двенадцатиперстной кишки
и активирует трипсиноген примерно в 1000 раз быстрее трипсина. Столь высокая специфичность энтеропептидазы обусловлёна тем, что фермент узнает в трипсиногене предшествующую остатку лизина гроздь из четырех остатков аспарагиновой кислоты.
Отщепление активационного пептида от молекулы трипсиногена влечет за собой цепь изменений в пространственной структуре продукта активации. Аналогичные изменения претерпевает и продукт активации химотрипсиногена, хотя активационный пептид в этом случае выглядит совершенно иначе и сохраняет ковалентную связь с ферментом за' счет дисульфидной связи. Освободившаяся при активации ч аминогруппа остатка изолейцина (аминоконцевого в трипсине) прото- нируется. Катионная аммонийная группа втягивается вглубь глобулы ферлгеита вследствие стремления гидрофобных боковых групп остатков изолейцина и валина уменьшить поверхность контакта с водой.
Этому способствует образование ионной пары между о-аммонийной группой изолейцина и отрицательно заряженным карбоксилат-ионом боковой группы остатка Asp-194, причем разрывается существовавшая в зимогене ионная пара Абр-194 — His-40. Смещение карбоксильной группы остатка - Asp-194 приводит к локальным структурным перестройкам вблизи зоны связывания субстрата, в частности завершается формирование гидрофобного кармана за счет движения боковой цепи остатка Met-192. Видимо, немалую роль могут играть и некоторые ■ уточнения в размещении функциональных групп каталитического . центра. Заметим, что этот центр, по крайней мере в грубом приближении, предсуществует еще в проферменте, который обнаруживает (по небольшим субстратам) около 0,01% активности, присущей,активному трипсину.'
Активация трипсиногена сопровождается как бы фиксацией,' более точной организацией около 15% пространственной структуры — соответствующие атомы испытывают значительные колебания в молекуле профермента, но закрепляются в трипсине. Таким образом, расщепление пептидной связи Lys—Не запускает весьма сложный механизм локальных перестроек, активирующий молекулу^ Вслед за описанной начальной реакцией, определяющей образование активного фермента, наблюдается гидролиз других пептидных связей. Он приводит к образованию новых молекулярных форм трипсина, иногда несколько отличающихся от первичного продукта активации функциональными свойствами, например деталями специфичности. Сходно протекает активация химотрипсиногена, инициируемая также трипсином. Последующее расщепление некоторых связей в активном химотрипсине другими его молекулами дает целый набор молекулярных форм фермента.
Такой же механизм положен в основу активации протеиназ системы
•■281
свертывания крови, в которых при протеолизе единой полипептидной цепи обнажается а-аминогруппа N-концевого остатка в каталитическом домене активного фермента, что запускает, по-видимому, такую же цепь изменений структуры, активирующую фермент.
Разница ,состоит в том, что аминоконцевой район профермента, подчас очень крупная структура, сохраняет связь с собственно каталитическим ядром за счет дисульфидных и, вероятно, нековалентных взаимодействий. Это позволяет сообщить протеиназе новые функциональные особенности, например способность к связыванию с липидами мембран через ионы кальция за счет остатков у-карбоксиглутамийовой кислоты (см. разд. 11.3). ,
В предшественниках других протеиназ — пепсиногене и прокар- боксипептидазе — отщепляемый при активации (соответственно, пепсином или трипсином) пептид содержит около 40 аминокислотных остатков и, видимо, играет роль своеобразного экрана, прикрывающего активный центр фермента. Отщепление этого экрана, которое не требует строго однозначного протеолиза, как в случае рассмотренных выше сериновых протеиназ, и может быть результатом разрыва любой" пептидной связи в последовательности, соединяющей активационный пептид с будущим ферментом. Отсюда неоднозначность активации, которая может приводить к смеси активных ферментов, различающихся длиной и аминоконцевыми остатками (так называемые растрепанные концы).
Биологический смысл активации’ проферментов очевиден: она позволяет накопить значительные количества предшественника, чрезвычайно быстро превращаемого в активный фермент в результате всего лишь одной реакции — расщепления единственной пептидной связи. Синтез значительных количеств фермента de novo потребовал бы гораздо большего времени, что невыгодно, особенно в процессах пищеварения. В то же время накопление активных протеиназ внутри клетки может оказаться для нее далеко не безобидным. Биосинтез профермента позволяет снять и эту проблему.
Не следует думать, что активация зимогенов характерна лишь для ферментов животных. Обнаружено, что в виде предшественников синтезируются практически все протеиназы бактерий.
11.9. ПРОЦЕССИНГ АМИНОКОНЦЕВОГО РАЙОНА БЕЛКА
У многих белков подвергается модификации алинокоНцевой район. Как известно, в белках прокариот, в митохондриях и хлоропластах остаток метионина, инициирующий трансляцию, формилирован. N- Формильная группа удаляется ферментом форииилазой. У эукариот 282 . .
трансляция инициируется метионином. После того как длина пептидной цепочки, еще связанной с рибосомой, достигнет примерно 20 аминокислотных остатков, инициирующий метионин может отщепляться специальной алгинопептидазой; (Однако это не обязательно, и примерно у половины цитоплазматических белков животных аминоконцевой метионин сохраняется.)*.,-
Среди других N-концевых остатков доминируют относительно небольшие — аланин, серин и треонин. По-видимому, это обусловлено особенностями аминопептидазы, предпочтительно отцепляющей N- концевой метионин, если за ним следует аминокислота с небольшой боковой цепью. В тех случаях, когда аминокислота, следующая за концевым метионином, имеет объемистый радикал, метионин не отщепляется. сохраняясь на аминном конце белка. \
' Есть основания полагать, что природа N-концевой аминокислоты как-то связана с устойчивостью белка к внутриклеточному протеолизу. По-видимому этим обусловлена и распространенность блокирования аминоконцевого остатка ацетилированием — в общей сложности ацети- лйровац аминный конец у примерно 50% растворимых белков клеток млекопитающих. В этой реакций, катализируемой N-a-ацетилтрансфе- разой, донором ацетильной группы служит ацетилкоэнзим А. Чаще - всего встречаются на N-конце белков эукариот ацетилсерин, ацетил- аланин, ацетил метионин. В то же время известен и фермент, способный отщеплять от ^-ацетилированных белков ацетиламинокислоту, например ацепл аланин. Существенно, что отмеченные модификации обеспечивают - многообразие аминных концов полйпептидных цепей, которые в отсутствие таких реакций были бы неизменно представлены метионином. Не исключено, что отщепление N-концевого метионина важно и потому, что делает возможным многократное использование этой инициирующей аминокислоты, биосинтез котррой весьма не прост..
ГЛАВА 12'-
G-БЕЛКИ
Обширному классу GTP-связывающих, или G-белков, принадлежит особо важная роль в передаче сигнал) в клетку и внутри клетки. Их функциональное состояние, иначе говоря, способность к передаче сигнала другим белкам, определяется тем, содержат ли они связанную молекулу гуанозинтрифосф‘ата (GTP) или продукт ее гидролиза — ' гуанозиндифосфат (GDP). Сами эти белки обладают собственной СТРаз- ной активностью, поэтому G-белок, активированный нековалентным 283
■ ‘ присоединением GTP, постепенно гидролизует этот эффектор до GDP, возвращаясь при этом в неактивную форму:
Неактивная формаНеактивная формаАктивная формаАктивная форма
Неактивная форма
Неактивная форма
Активная форма
Активная форма
Комплекс б-белок-GDPКомплекс б-белок-GDPGDP+ GTP ♦-fl 'GDP+ GTP ♦-fl 'КомплексС-белок-СТРКомплексС-белок-СТР—*♦ Передача сигнала—*♦ Передача сигнала
Комплекс б-белок-GDP
Комплекс б-белок-GDP
GDP+ GTP ♦
-fl '
GDP+ GTP ♦
-fl '
Комплекс
С-белок-СТР
Комплекс
С-белок-СТР
—*♦ Передача сигнала
—*♦ Передача сигнала
Таким образом, важнейшей особенностью G-белков является способность удерживать активную конформацию и участвовать в передаче сигнала в течение определенного времени, что зависит от их СТРазной активности, а также от действия белковых факторов, которые либо способствуют обмену GDP на GTP и, следовательно, переводу белка в активное состояние, либо, напротив, усиливают, СТРазную активность G-белка и, значит, ускоряют его переход в неактивный комплекс с GDP. Структурно-функциональные осдбенцрсти G-бёлков иллюстрируются следующими примерами.
РЕПОК сЛ-nw
К G-белкам принадлежат некоторые онхобелки, в частности c-B-ras- онкобелок человека. G-белки, кодируемые мутантными генами семейства газ, нередко обнаруживаются в опухолях. Нормальный ген с-Н- газ кодирует так называемый белок р21 с молекулярной массой 21 «Да, локализованный в Цитоплазматической, мембране и являющийся потенциальным предшественником онкобелка — протоонко^елком. Его функция в нормальной клетке состоит, по-видимому, в том, что он воспринимает извне стимулирующие клеточный рост сигналы и передает их на белки-мишени внутри клетки, инициируя ее рост и деление.
К комплексу белка р21 с СТР присоединяется белок GAP (GTPase Activating Protein), который усиливает присущую этому комплексу СТРазную активность. Именно тройной комплекс р21 — GTP — GAP и является передатчиком сигнала.- В то же время в нем происходит гидролиз GTP до СВР, катализируемый белком р21. Последний сам по себе является очень медленно действующей СТРазой (ускорение гидролиза гуанозинтрифосфата примерно в 1000 раз, время полужизни комплекса р21 — GTP — около 1 ч). СТРазная активность резко (по некоторым оценкам, в 100 000 раз) возрастает при образовании тройного комплекса с активирующий белком GAP. Существенно, что в результате гидролиза СТР до GDP комплекс с GAP распадается и передача сигнала прекращ втся.
Таким образом, от эффективности гидролиза GTP зависит продолжительность действия сигнала, G-белок как бы содержит внутренний датчик времени, регулируемый за счет взаимодействия с GAP. Понятий, что применительно к отдельно взятой молекуле можно говорить лишь о большей или меньшей вероятнЬсти расщепления GTP за определенный промежуток времени. Однако, поскольку в передаче сигнала в
Рис. 12.1. Строение с-Н-гая белка р21 человека (остатки 1-171)Рис. 12.1. Строение с-Н-гая белка р21 человека (остатки 1-171)Видны четыре «-спирали, ^структурные учьстки А-/?в и петли L1-L8. Прямоугольником, пятиугольником и двумя кружками показано положение связанного GDPВидны четыре «-спирали, ^структурные учьстки А-/?в и петли L1-L8. Прямоугольником, пятиугольником и двумя кружками показано положение связанного GDPконкретной биологической системе участвует множество таких молекул, гидролиз GTP как бы задает время действия G-белка, т.е. продолжительность сигнала.
Рис. 12.1. Строение с-Н-гая белка р21 человека (остатки 1-171)
Рис. 12.1. Строение с-Н-гая белка р21 человека (остатки 1-171)
Видны четыре «-спирали, ^структурные учьстки А-/?в и петли L1-L8. Прямоугольником, пятиугольником и двумя кружками показано положение связанного GDP
Видны четыре «-спирали, ^структурные учьстки А-/?в и петли L1-L8. Прямоугольником, пятиугольником и двумя кружками показано положение связанного GDP
Белок р21 содержит 189 аминокислотных остатков в одной пептидной цепи. Последняя образует шесть ^структурных отрезков и четыре отпирали (рис. 12.1), причем для С-концевой половины белка характерна чередующаяся укладка элементов вторичной структуры ^—ос—^ог-р, напоминающая структурный мотив нуклеотидсвязы- вающего домена дегидрогеназ. Из десяти петель, соединяющих «-спиральные и /^-структурные участки, пять (LI, L2, L4, L9 и L10) образуют карман, в котором связываются GDP и GTP, причем с белком взаимодействуют и основание — гуанин, и рибоза, и фосфатные груцпы.
Петля L1, соединяющая N-концевой jS-структурный отрезок и первую аг-спираль, содержит последовательность: ' .
10 1112 ' 13 14 15
Gly~*Ala—Gljr-Gly—^al~Gly
Она как бы ’’оседлывает” фосфоэфирную связь,между /9-й т-фос- фатными группами субстрата, составляя, очевидно, часть СТРазного каталитического центра. В вирусных белках, принадлежащих к тому же семейству и построенных таким же образом, концевой (7) фосфат GTP внутримолекулярно переносится на гидроксил остатка Thr-59, а не на воду (так называемое аутофосфорилированиеУ Следует подчеркнуть, что с каталитическим центром сближен участок связывания активирующего белка — GAP.
Рис. 12.2. Изменения во взаимодействии между нуклеотидом и G-белком, сопровождающие гидролиз GTP до GDP.
Показаны только три- и дифосфатные фрагменты нуклеотидов. Молекула воды, которую активируют взаимодействия с остатками глутамина Gln-61 и его окружением, атакует связанную белком молекулу GTP, концевой 7-фосфатный остаток которой связан с NH-группами остатков треонина Thr-Зб в петле L2 и глицина Gly-60 в петле L4. Отщепление концевого у-фосфатного остатка приводит к образованию GDP. fe результате Thr-Зб и Gly-60, а следовательно петли L2 и L4, утрачивают непосредственный контакт с лигандом - молекулой GDP. Это вызывает изменение конформации петель, неблагоприятное для взаимодействия G-белка с белком, который участвует в передаче сигнала
‘. В гидролизе гуанозинтрифосфата участвует молекула воды, которая образует водородную связь -с карбонильной группой Thr-35 и активируется за счет взаимодействия с другими функциональными группами каталитического центра. Однако в свободном G-белке эти участки активного центра существуют в виде нескольких конформеров, из которых способен активировать указанную молекулу воды лишь один, чем и объясняется весьма тизкая эффективность катализа. По- видимому, в комплексе ros-белка с активирующим белком. (GAP) закрепляется имецно эта конформация, что и влечет за собой резкое ускорение гидролиза GTP.
Гидролиз GTP., связанного в активном центре G-белка, приводит к локальным изменениям, структуры в районе контакта с fl- и у-фосфат- ными группами GTP (рис. 12.2). Видимо, за отЦеплением у^-фосфатной 286
группы GTP следует приближение подвижных элементов белковой структуры к /3-фосфату GDP, как бы заполнение образовавшегося ’’зазора". Заметно изменяется, в частности, укладка петель L2 (остатки 26—36) и L4 (остатки 59—65),-а также способ связывания иона магния, взаимодействующего с активным центром белка р21 и GTP или GDP. Поскольку эти же петли обеспечивают взаимодействие с активирующим белком GAP, такой конформационный переход нарушает контакт р21 — GAP, прерывая тем самым передачу сигнала.
С-концевдй фрагмент с-Н-г as-белка, взаимодействующий, как предполагают, с рецептором, находящимся в мембране, соединен с описанным выше "каталитическим" доменом длинной at-спицалью, которая, видимо, участвует в передаче сигнала. У всех белков семейства ras на карбоксильном конце содержится характерная последовательность СААХ (где С — цистеин, А — алифатическая аминокислота), которая является сигналом для пренилирования тиоловой группы Суе-186 с последующим отщеплением С-концевого трипептида. Такая посттрансляционная гидрофобизация С-конца ras-белка (см. гл. 11) необходима для его присоединения к цитоплазматической стороне клеточной мембраны. ras-Белки, лишенные этой структуры, трансформирующим действием на клетки не обладают, хотя и сохраняют способность связывать и гидролизовать GTP. ' ‘
Белки, обеспечивающие ввод и вывод сигнала, передаваемого белком р21, пока строго не идентифицированы, хотя есть основания полагать, что одним из них является белок GAP, который в свою очередь взаимодействует с рецептором факторов роста. Видимо, другой белок катализирует обмен GDP на GTP — процесс, весьма медленно-протекающий в комплексе р21 — GDP.
Таким образом, сравнительно небольшой c-H-ras-белок вовлечен в сложную систему межмолекулярных взаимодействий, реализация которых решающим образом зависит от присутствия связанной им молекулы GTP и скорости ее гидролиза. Нетрудно понять, что столь сложная функция белка может легко нарушаться мутациями, затрагивающими отдельные аминокислотные остатки в нормальном белке — протоонкогене. Вследствие такого нарушения функциональных свойств мутантный белок может становиться собственно онкогеном.
Так, замещение остатка Gly-12 в петле, входящей в. каталитический центр, любой/аминокислотой, кроме пролина, резко снижает СТРазную активность, причем она перестает усиливаться за счет взаимодействия с GAP-белком. Как показал рентгеноструктурный анализ с применением метода, позволяющего наблюдать за гидролйзом GTP в динамике, мутация не вызывает крупных изменений в конформации зоны связывания GTP. Например, при замене Gly-12 —► Vai затрагиваются лишь
■ . 287
'позиции остатков Gly-60, Thr-38 и Gin-61, окружающих 7-фосфат GTP. В результате, однако, мутантный белок крайне медленно гидролизует GTP и как бы перестает "выключаться", продолжая посылать в клетку стимулирующие сигналы даже тогда, когда они не нужны, в отсутствие внешнего сигнала. Таким образом, белок c-H-ras становится способным трансформировать ■ нормальные клетки в опухолевые, т.е. приобретает трансформирующую активность.
Трансформирующую активность и, следовательно, превращение протоонкогена в онкоген вызывают и замены аминокислотных остатков 116 и 119, участвующих в связывании гуанинового фрагмента GTP, а также остатков 59, 61 и 63, которые мбгут влиять на конформацию петли, включающей остаток глицина Gly-12, снижая этим СТРазную активность. ■ '
В то же время аминокислотные замены На участке 35—40 снижают способность активированного c-H-ras-белка к трансформации клеток, хотя и не изменяют СТРазной активности или связывания GTP или GDP. По-видимому, этот участок вовлечен во взаимодействие с белком-мишенью, на который передается сигнал. Нарушение такого взаимодействия* лишает смысла активацию c-H-ras-белка при связывания GTP, прерывает передачу сигнала.
Основные черты строения и механизма действия ras 21-белка, по всей видимости, типичны для других G-белков, во всяком случае для их G-доменов. В частности, близкую структуру имеет G-домен фактора элонгации EF“Tu.
ТРАНСДУЦИН
Трансдуимн — гораздо более сложный G-белок, участвующий в передаче светового сигнала и, что чрезвычайно важно, в его огромном усилении. Схема его действия представляется следующим' образом (рис. 12.3). Молекула родопсина, улавливая фотон, переходит в активированное состояние и образует комплекс с трансдуцином, G-белком, содержащим связанную молекулу GDP. Образование комплекса активированный родопсин — трансдухуин ускоряет обмен связанного с последним GDP на GTP. Образующийся в результате такого обмена комплекс активированный родопсин — трансдухуин — GTP распадается с отщеплением активированного родопсина, который может взаимодействовать с другой молекулой трансдуцина и также перевести ее в активное состояние за счет обмена GDP на GTP. Таким образом реализуется первая ступень усиления сигнала — активированная молекула родопсина за время своего существования успевает взаимодействовать с несколькими сотнями
молекул трансдуцина, переводя их в. активную форму — комплекс
трансдуцин — GTP.
Высвобождающийся • после • отщепления родопсина трансдуцин, активированный GTP, образует комплекс с неактивной • формой фос
фодиэстеразы циклического гуанозинмонофосфата cGMP, в результатефодиэстеразы циклического гуанозинмонофосфата cGMP, в результатечего этот фермент активируется и начинает эффективно гидролизовать cGMP. Действие ферментного комплекса фосфодиэстераза — трансдуцин — GTP продолжается до тех пор, пока не произойдет гидролиз связанного GTP, катализируемый . самим трансдуцином. После этого отщепляется и утрачивает активность фосфодиэстераза, прекращается накопление GMP, а комплекс трансдуцин — GDP оказывается готовым к новому циклу усиления светового сигнала за счет связывания с активированным светом родопсином.
фодиэстеразы циклического гуанозинмонофосфата cGMP, в результате
фодиэстеразы циклического гуанозинмонофосфата cGMP, в результате
//Рис. 12.3. Цикл усиления светового сигнала с участием G-белка трансдуцинаРис. 12.3. Цикл усиления светового сигнала с участием G-белка трансдуцинаПри поглощении кванта света родопсин R переходит в активированное состояние R * и присоединяется к комплексу трансдуцин'GDP (Т; GDP). В тройном комплексе R1 T‘GDP гуанозиндифосфат быстро обменивается на GTP, после чего родопсин, выполнив свою функцию, но оставаясь активированным, вновь может образовать комплекс с другой молекулой трансдуцина, что усиливает сигнал примерно в пять раз. Трансдуцин, изменив свою конформацию за сЧет образования комплекса c GTP, приобретает способность взаимодействовать с неактивной формой фосфодиэстеразы (PDE,). В результате последняя активируется (PDE *) и тройной комплекс трансдуцин • GTP '‘активированная фосфодиэстераза (Т• GTP' PDE *) действует кш< эффективный катализатор гидролиза циклического GMP до тех йор, пока в нем не произойдет внутримолекулярный гидролиз GTP. За это время он успевает в среднем гидролизовать около 1000 молекул cGMP. После гидролиза GTP трансдуцин утрачивает способность связывать и активировать фосфодиэстеразу. • Последняя переходит - в неактивное состояние, а комплек с Т-GDP возвращается В ЦИКЛ * """'При поглощении кванта света родопсин R переходит в активированное состояние R * и присоединяется к комплексу трансдуцин'GDP (Т; GDP). В тройном комплексе R1 T‘GDP гуанозиндифосфат быстро обменивается на GTP, после чего родопсин, выполнив свою функцию, но оставаясь активированным, вновь может образовать комплекс с другой молекулой трансдуцина, что усиливает сигнал примерно в пять раз. Трансдуцин, изменив свою конформацию за сЧет образования комплекса c GTP, приобретает способность взаимодействовать с неактивной формой фосфодиэстеразы (PDE,). В результате последняя активируется (PDE *) и тройной комплекс трансдуцин • GTP '‘активированная фосфодиэстераза (Т• GTP' PDE *) действует кш< эффективный катализатор гидролиза циклического GMP до тех йор, пока в нем не произойдет внутримолекулярный гидролиз GTP. За это время он успевает в среднем гидролизовать около 1000 молекул cGMP. После гидролиза GTP трансдуцин утрачивает способность связывать и активировать фосфодиэстеразу. • Последняя переходит - в неактивное состояние, а комплек с Т-GDP возвращается В ЦИКЛ * """'Изложенная выше схема действия трансдуцина упрощена. В действительности трансдуцин • представляет собой белок, построенный из трех неодинаковых субъединиц. Одна из них — Та (39 кДа) — связывает GTP и GDP и катализирует 1 гидролиз GTP. Она содержит структуру, гомологичную белку с-Н- ras. Другая субъединица трансдуцина — Тр (35 кДа) — очень близка субъединицам Gi и Gs белков аденилатциклазной системы (см. ниже) и представляет собой полипеп- тидную. цепь, построенную
/
/
Рис. 12.3. Цикл усиления светового сигнала с участием G-белка трансдуцина
Рис. 12.3. Цикл усиления светового сигнала с участием G-белка трансдуцина
При поглощении кванта света родопсин R переходит в активированное состояние R * и присоединяется к комплексу трансдуцин'GDP (Т; GDP). В тройном комплексе R1 T‘GDP гуанозиндифосфат быстро обменивается на GTP, после чего родопсин, выполнив свою функцию, но оставаясь активированным, вновь может образовать комплекс с другой молекулой трансдуцина, что усиливает сигнал примерно в пять раз. Трансдуцин, изменив свою конформацию за сЧет образования комплекса c GTP, приобретает способность взаимодействовать с неактивной формой фосфодиэстеразы (PDE,). В результате последняя активируется (PDE *) и тройной комплекс трансдуцин • GTP '‘активированная фосфодиэстераза (Т• GTP' PDE *) действует кш< эффективный катализатор гидролиза циклического GMP до тех йор, пока в нем не произойдет внутримолекулярный гидролиз GTP. За это время он успевает в среднем гидролизовать около 1000 молекул cGMP. После гидролиза GTP трансдуцин утрачивает способность связывать и активировать фосфодиэстеразу. • Последняя переходит - в неактивное состояние, а комплек с Т-GDP возвращается В ЦИКЛ * """'
При поглощении кванта света родопсин R переходит в активированное состояние R * и присоединяется к комплексу трансдуцин'GDP (Т; GDP). В тройном комплексе R1 T‘GDP гуанозиндифосфат быстро обменивается на GTP, после чего родопсин, выполнив свою функцию, но оставаясь активированным, вновь может образовать комплекс с другой молекулой трансдуцина, что усиливает сигнал примерно в пять раз. Трансдуцин, изменив свою конформацию за сЧет образования комплекса c GTP, приобретает способность взаимодействовать с неактивной формой фосфодиэстеразы (PDE,). В результате последняя активируется (PDE *) и тройной комплекс трансдуцин • GTP '‘активированная фосфодиэстераза (Т• GTP' PDE *) действует кш< эффективный катализатор гидролиза циклического GMP до тех йор, пока в нем не произойдет внутримолекулярный гидролиз GTP. За это время он успевает в среднем гидролизовать около 1000 молекул cGMP. После гидролиза GTP трансдуцин утрачивает способность связывать и активировать фосфодиэстеразу. • Последняя переходит - в неактивное состояние, а комплек с Т-GDP возвращается В ЦИКЛ * """'
' из четырех тандемно повторяющихся участков' сходной первичной структуры, длиной около 86 аминокислотных остатков каждый. Эта субъединица прочно связана с третьей — 7-субъединицей (8 кДа). Образование комплекса ог*р~^ трансдуцина с активированным родопсином ускоряет обмен GDP на GTP и приводит к отщеплению ^- и 7-субъединиц, после чего освободившийся комплекс To-GTP активирует фосфодиэстеразу cGMP.
Действие этой системы, состоящей из трех белков с регулируемой активностью, приводит к тому, что поглощение молекулой родопсина единственного фотона влечет за собой расщепление примерно 500 000 молекул циклическою луаноэинмонофосфата, т.е. коэффициент усиления при передаче сигнала этой системой составляет 5-IO5, Существенно и то, что включение в систему G-белка трансдуцина обеспечивает не только усиление сигнала, но и регулирование его длительности.
СТИМУЛИРУЮЩИЙ БЕЛОК G, И ИНГИБИРУЮЩИЙ БЕЛОК Gi
аденилАтциклазной системы
Как известно, аденилатциклаза, катализирующая образование циклического аденозинмонофосфата из АТР, определяет внутриклеточный уровень сАМР — вторичного мессенджера, который, в свою очередь, регулирует целый, ряд биохимических процессов. Активность этого весьма важного для физиологии клетки фермента зависит от внёкле- . точных факторов, в частности адреналина, взаимодействующего со специфическим рецептором в клеточной мембране. Сигнал от рецептора к собственно аденилатциклазе передается стимулирунмцим белком Ga. Последний является гетеротримером и состоит из трех различных субъединиц. Субъединица Ga-a с молекулярной массой 45 или 52 кДа у животных является продуктом экспрессии одного и того же гена. Различие в длине ее пептидной цепи вызвано альтернативным сплай- синюм, который не одинаково протекает в различных клетках. Эта субъединица связывает GDP или GTP и катализирует гидролиз последнего. Комплекс Ga — GTP растворим в воде и способен активировать аденилатциклазу без участия других субъединиц.
Способ действия Са-белка представляется следующим. Комплекс Ga- о-субъединицы и GDP вступает во взаимодействие с комплексом ^ и 7- субъединиц, образуя неактивную форму белка — oGDP-/?-7. Замещение GDP на GTP в таком комплексе идет медленно, однако оно резко ускоряется при взаимодействии Са-белка со стимулирующим рецептором, находящимся в мембране. В результате замещения GDP на GTP построенная из трех субъединиц структура распадается, отщепляя комплекс 290. .
p—h в котором 7-субъединица, видимо, играет роль якоря, позволяющего белку присоединиться к мембране.
Высвободившаяся о-субъединица, содержащая связанный GTP, представляет собой собственно активную форму белка. Она образует комплекс с а^денилатциклазой, активируя этот фермент. Результатом является возрастание концентрации сАМР внутри клетки в ответ на относительно слабый внеклеточный сигнал, например присоединение гормона к рецептору. Продолжительность действия этого сигнала задается временем, которое необходимо для внутримолекулярного гидролиза он:убъединицей связанного GTP до GDP, после чего комплекс Gs-o-GDP вновь соединяется с ^—7-комплексом и белок возвращается в неактивное состояние..
Такая схема подтверждается тем, • что негидролизующиеся аналоги GTP, связываясь с а-субъединицей, постоянно поддерживают аденилат- циклазу в активированном состоянии. Gg-a-Субъединица может подвергаться ADP-рибозилированию, которое катализируется холерным токсином и состоит в модификации одного из остатков аргинина (Arg-207). Это вызывает снижение GTP-азной активности белка, что влечет за собой постоянную активацию аденилатциклазы и нарушение регуляции метаболических процессов. к„
Клеточные мембраны содержат и такие рецепторы, которые в ответ на связывание внешних эффекторов посылают сигналы, не активирующие, а, наоборот, ингибирующие аденилатциклазу. Действие таких рецепторов опосредовано особым ^ингибируюгц-им” в\-белхом и протекает, видимо, следующим образом. После связывания эффектора рецептор взаимодействует с Gi-белком, образованным тремя субъединицами: а, Д 7. Как и в рассмотренном ;ыше случае, это приводит к диссоциации белка на а-субъединицу, сохраняющую связь с рецептором до тех пор, пока не пройдет внутримолекулярный гидролиз GTP, и ^—7-комплекс. Последний построен из /3-субъединицы, такой же, как и в активирующем Сделке, и 7-субъединицы, которая точно так же играет роль мембранного якоря. ^—7-Комплекс связывает а-субъединицу стимулирующего белка aGs в тройной неактивный комплекс oG$ - GDP- ^—7, не позволяя ей активировать аденилатциклазу. Таким образом, ингибирующий Gi-белок действует, высвобождая в ответ на связывание эффектора ингибитор активирующего С5-белка — комплекс ^7; Время, в течение которого этот комплекс свободен от контакта с о-субъедини- цей, зависит от того, насколько быстро последняя расщепит связанный GTP.,
В заключение отметим распространенность G-белков как передатчиков сигналов со своего рода встроенным таймером. Обнаружено около 150 генов таких белков Для многих из них функция пока неизвестна, '-291
не установлено даже, принадлежат ли они к стимулирующему 9я~ или ингибирующему Gt-типу; соответственно их относят к Со-белкам В то же время возрастает число G-белков, участвующих в усилении слабых внешних сигналов. Например, найден G-белок, вовлеченный в восприятие запахов.
G-белками являются многие белковые факторы' трансляции. Как уже упоминалось, фактор EF-Tu, состоящий из 393 аминокислотных остатков, содержит* G-домен (остатки 1—199). При образовании этим белком комплекса с фактором EF-Ts последний как бы раскрывает молекулу EF-Tu и "вставляет" в нее GTP, выталкивая GDP. Вызванные этим конформационные изменения , G-домена (остатки 1—199) передаются двум другим доменам, взаимодействующим с аминоацил- тРНК и рибосомой. После образования комплекса EF-Tu—GTP-рибо- сома—аминоацил—тРНК ускоряется гидролиз GTP в каталитическом центре G-домена. Очевидно, что СТРазная активность G-домена в значительной мере зависит от того, изолирован ли EF-Tu-фактор или находится в комплексе с рибосомой и аминоацил-тРНК. Иными слот вами, существует многосторонняя связь между тонкой структурой каталитического центра G-домена и лигандсвязывающими участками поверхности EF-Tu-белка, которая реализуется, по-видимому, за счет относительно небольших, но функционально важных конформационных изменений.
После гидролиза GTP до GDP связь EF-Tu-фактора с рибосомой и аминоацил-тРНК резко ослабевает. Если по каким-либо причинам гидролиз GTP произойдет слишком быстро, EF-Tu-фактор не успеет выполнить свою роль организатора комплекса аминоацил-тРНК с рибосомой, что приведет к понижению точности трансляции.
Таким образом, 0-белки представляют собой эффективные регуляторы, способные усиливать внешни* сигнал и определять длительность его дейгтеин Они используют для этого весьма чувствительные конформационные изменения, сопровождающие связывание GTP или GDP, а также способность к внутримолекулярному гидролизу GTP, причем все эти факторы могут существенным образом изменяться при. образовании комплексов G-белков с другими белками.
ГЛАВА 13
, ИММУНОГЛОБУЛИНЫ
Иммуноглобулины — белки, синтезируемые в организме позвоночных и способные распознавать и специфически связывать чужеродные молекулы — антигены^ а также включать механизм их эли- 292
мймирования (удаления), выполнил тем самым защитную функцию антител. Заметим, Что белки, обладающие свойством избирательно связывать другие молекулы, не редки. Более toro, хорошо известны случаи образования белками чрезвычайно прочных комплексов с различными соединениями — лигандами. К ним относятся, например, комплексы авидИна или его микробного аналога -^ стрептавидина — с биотином, комплексы ферментов и их природных ингибиторов и т.п. Таким образом, само по себе связывание иакромолекул или других лигандов не представляет собой уникального свойства иммуноглобулинов. х
Необычна способность этого семейства белков, обладающих целым рядом общих, постоянных для него структурных черт, создавать огромное многообразие центров связывании, комплементарных множеству антигенов, совершенно различных химически. Сразу же заметим, что реЧь не идет о создании той или иной особью антитела, ком, плементарйого данному антигену. Возникновение такой структуры есть результат более или мейее длительного эволюционного процесса, на уровне организма происходит лишь отбор клеток, несущих предсу- ществующую генетическую информацию о ней, и, возможно, некоторая ее модификация. Важно, что такая структура практически вгегда может быть найдена. Следовательно, при описании семейства иммуноглобулинов необходимо в первую очередь выяснить структурные предпосылки, которые обеспечивают решение этой функциональной задачи. .
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА G
Среди известных типов иммуноглобулинов иммуноглобулин G обладает наиболее простой структурой и особенно хорошо изучен. Его молекула имеет четвертичную структуру И' образована двумя тяжелыми (Н) и двумя легкими (L) цепями (еубъединицами), что отражает формула H2L2. Целостность четвертичной структуры поддерживается как нековалентными взаимодействиями, так и межсубъединичными дисульфидными связями (рис. 13.1). (
В пространственной структуре и легкой, и тяжелой цепей иммуноглобулинов четко прослеживаются домены, • отвечающие отрезкам последовательности, которые содержат примерно 110 аминокислотных остатков. Домены схбдны по способу укладки полипептидной цепи и могут быть отнесены к типичным Структурным белкам. Так, в С,- домене четыре антипараллельных отрезка пептидной цепи образуют
IIРис. 13.1. Строение молекулы иммуноглобулина G:Рис. 13.1. Строение молекулы иммуноглобулина G:Н - тяжелая цепь, L - легкая цепь, С^ иН - тяжелая цепь, L - легкая цепь, С^ иС„ - константные области, L и LH - ваНLnриабельные области; 1 - гипервариабельные участки легкой цепи, 2 - гипервариабельные участки тяжелой цепи, 3 - шарнирная область, 4 ~ участок связывания комплемента, 5 - углевод, 6 - внутрицепьевые дисульфидные связи, 7 - межц^пьевые дисульфидные связи; Fab - фрагмент, связывающий антиген, Fc - кристаллизующийся фрагмент -С„ - константные области, L и LH - ваНLnриабельные области; 1 - гипервариабельные участки легкой цепи, 2 - гипервариабельные участки тяжелой цепи, 3 - шарнирная область, 4 ~ участок связывания комплемента, 5 - углевод, 6 - внутрицепьевые дисульфидные связи, 7 - межц^пьевые дисульфидные связи; Fab - фрагмент, связывающий антиген, Fc - кристаллизующийся фрагмент -один ^-складчатый слой, еще три ’отрезка — другой, примерно параллельный первому. Между этими слоями, в формировании которых участвует примерно -60% аминокислотных остатков, расположено гидрофобное ядро, в которое включена и дисульфидная сйязь, соединяющая эти два 0- слоя, будучи примерно перпендикулярна им.
I
I
Рис. 13.1. Строение молекулы иммуноглобулина G:
Рис. 13.1. Строение молекулы иммуноглобулина G:
Н - тяжелая цепь, L - легкая цепь, С^ и
Н - тяжелая цепь, L - легкая цепь, С^ и
С„ - константные области, L и LH - ваНLn
риабельные области; 1 - гипервариабельные участки легкой цепи, 2 - гипервариабельные участки тяжелой цепи, 3 - шарнирная область, 4 ~ участок связывания комплемента, 5 - углевод, 6 - внутрицепьевые дисульфидные связи, 7 - межц^пьевые дисульфидные связи; Fab - фрагмент, связывающий антиген, Fc - кристаллизующийся фрагмент -
С„ - константные области, L и LH - ваНLn
риабельные области; 1 - гипервариабельные участки легкой цепи, 2 - гипервариабельные участки тяжелой цепи, 3 - шарнирная область, 4 ~ участок связывания комплемента, 5 - углевод, 6 - внутрицепьевые дисульфидные связи, 7 - межц^пьевые дисульфидные связи; Fab - фрагмент, связывающий антиген, Fc - кристаллизующийся фрагмент -
Третичная структура других доменов аналогична, отличаясь лишь деталями. В целом же сходство их строения настолько значительно, что домены иммуноглобулинов принято рассматривать , как потомки небольшого прародительского белка, который в ходе эволюции был включен в качестве нескольких повторов в гораздо более протяженные и функционально специализи
рованные структуры. Легкие цепи иммуноглобулина G состоят из двух
таких доменов, тяжелые — из четырех (рис. 13.2).
Если сравнивать первичные структуры полипептидных цепей целого ряда индивидуальных иммуноглобулинов ^моноклональных антител) у то оказывается, что в аминоконцевых* доменах как легких, так и Тяжелых цепей наблюдается очень высокий процент аминокислотных замен. Соответствующие фрагмента полипептидной цепи получили
название вариабельных и обозначаются V (вариабельный домен легкой цепи) и V„ (вариабельный домен тяжелой цепи).
Остальные домены, в которых аминокислотные замены встречаются редко, называют константными и обозначают С^ — константный район легкой цепи, С 1, С 2, С 3 — константные домены тяжелой цепи, Н Н п
номера которых возрастают к карбоксильному концу полипептида.
Четко выраженная доменная организация молекулы иммуноглобу-
лина делает возможным самостоятельное существование, а в ряде случаев и функционирование отдельных ее частей при условии, что в них сохраняются v более или менее сложные ансамбли доменов. Так, давно известны аномальные* белки Бенс-Джонса, которые представляют собой димеры L-цепей.
. Домены иммуноглобулинов, соответственно расположенные. в разных цепях, взаимодействуют между собой, как правило, за счет нековалентных связей, что приводит к промежуточным подуровням структурной организации. Например, вариабельные домены V,- и V„ взаимодействуют весьма тесно, образуя единый центр связывания антигена. Такой "сдвоенный" домен (иногда называемый Fv-juody- лем) обладает определенной подвижностью как целое относительно следующего модуля — сдвоенного домена С. -у С„1. Более того, два таких сдво- L п
енных домена (модуля) — Vr + V„ и Ст + С„1 — объединяются в общую структуру: Fab'-фрагмент (от англ. Fragment antibody-binding — антиген- связывающий фрагмент).
Рис. 13.2. Домены в Fab-фрагменте иммуноглобулина GРис. 13.2. Домены в Fab-фрагменте иммуноглобулина GВариабельные домены легкой (VL) иВариабельные домены легкой (VL) итяжелой (V ) цепей объединяются в п_домен, непосредственно взаимодействующий с антигеном. Константные участки (Cyl и С^) этих цепей также ■ образуют домен. Стрелками показаны участки цепей, протеолиз которых приводит к разделению доменовтяжелой (V ) цепей объединяются в п_домен, непосредственно взаимодействующий с антигеном. Константные участки (Cyl и С^) этих цепей также ■ образуют домен. Стрелками показаны участки цепей, протеолиз которых приводит к разделению доменовЭтот фрагмент может быть отщеплен при помощи ограниченного протеолиза от остальной части. молекулы — Fc-фрагмента (от англ, crystallizable — кристаллизующийся), в который входят две, С-кон- цевые половины тяжелых цепей, образованные доменами С„2 и С„3.
Рис. 13.2. Домены в Fab-фрагменте иммуноглобулина G
Рис. 13.2. Домены в Fab-фрагменте иммуноглобулина G
Вариабельные домены легкой (VL) и
Вариабельные домены легкой (VL) и
тяжелой (V ) цепей объединяются в п_
домен, непосредственно взаимодействующий с антигеном. Константные участки (Cyl и С^) этих цепей также ■ образуют домен. Стрелками показаны участки цепей, протеолиз которых приводит к разделению доменов
тяжелой (V ) цепей объединяются в п_
домен, непосредственно взаимодействующий с антигеном. Константные участки (Cyl и С^) этих цепей также ■ образуют домен. Стрелками показаны участки цепей, протеолиз которых приводит к разделению доменов
п Н
Fc-фрагмент не участвует непосредственно в связывании антигена, однако ответствен за взаимодействие со специфическими рецепторами иммуноглобулинов на поверхности клеток и необходим для инициирования целого каскада реакций, направленных на элиминирование связанного антителом антигена.
Существенно, что Fab'-фрагмент не только устойчиво удерживает
свою пространственную структуру и может существовать, как независимая молекула, но достаточно автономен и функционально, в полной мере сохраняя способность связывать молекулу антигена. Fab '-Фрагменты в составе целой молекулы иммуноглобулина G способны двигаться как целое относительно Fc-фрагмента, что придает иммуноглобулину так называемую сегментную гибкость. Это позволяет каждому из двух центров связывания, локализованных в аминоконцевой части Fab'-фрагментов, реагировать с соседними антигенными участками в протяженной структуре, например в бактериальной стенке. Угол между осями Fab'-фрагментов в целых молекулах иммуноглобулина может существенно меняться, приближаясь даже к 180°. Гибкость обеспечивается и специфическими особенностями первичной структуры распо
ложенного на стыке С^1 и 0^2 доменов шарнирного участка, богатого
остатками пролина (на примере иммуноглобулина 7-Gl Daw):
4Шарнирныйучасток
К L—цепитSК L—цепитSК Н—цепи ' К Н—цепи
К L—цепи
т
S
К L—цепи
т
S
тт
SS
Cys—Asp-Lys—Thr—tiis—Th r~Cys-P ro-P ro—Cys-Pro-Ala—Pro—Glu-Leu-
T
ПепсинПепсинПапаин
Пепсин
Пепсин
(показаны связи, расщепляемые ферментами)
Ограниченный протеолиз в этом случае легко осуществим, так как доменная структура продуктов расщепления достаточно устойчива и способна противостоять глубокому гидролизу протеиназой. В результате действие последней ограничивается междоменным шарнирным участком пептидной цепи. При этом в зависимости от условий, в частности от специфичности протеолитического фермента, гидролиз проходит то ’'слева", то "справа" от межсубъединичных дисульфидных связей, что приводит в первом случае к Fab '-фрагментам, во втором — к их димерам — (ГаЬ)2-фрагментам. К получению Fab'- и (Fab)2- фрагментов прибегают • при производстве антитоксических сывороток. Интересно, что специфический протеолиз шарнирного участка используется патогенными микроорганизмами для инактивации иммуноглобу-1 лина А, содержащегося в секрете слизистых оболочек.
Итак, существование в иммуноглобулине нескольких подуровней структурной организации за счет взаимодействия доменов, располо- 296
женных в разных цепях этого белка, является необходимой предпосылкой его функционирования. Эта особенность строения иммуноглобулина не объясняет, однако, возможности образования в рамках семейства структурно весьма близких белков огромного множества антител, способных специфически связывать различные антигены.
ЦЕНТР СВЯЗЫВАНИЯ АНТИГЕНОВ
Как упоминалось, центр связывания антигенов формируют совместно вариабельные домены легкой и тяжелой цепей: V- и V . По спосо
бу пространственной укладки пептидных цепей они похожи, образуя, как и другие домены иммуноглобулинов, два ^-складчатых слоя, которые отстоят один от другого примерно на 10 А и соединены внутридо-
менной дисульфидной связью. Пространство между слоями заполнено гидрофобными боковыми: цепямименной дисульфидной связью. Пространство между слоями заполнено гидрофобными боковыми: цепямидостаточно плотно- упакованными аминокислот. Все эти устойчивыедостаточно плотно- упакованными аминокислот. Все эти устойчивыеV -доменов предопределены сходством их пер-V -доменов предопределены сходством их пер-черты третичной структуры V- иL2черты третичной структуры V- иL2вичнойвичнойструктуры.структуры.Однако петли, соединяющие отрезки /9-структуры в каждом из этих доменов, резко отличаются по последовательности аминокислот, если сравнивать между собой однотипные антитела с разной специфичностью — они гцпервариабельны (рис. 13.3, 13.4).Три гипервариабель- -Однако петли, соединяющие отрезки /9-структуры в каждом из этих доменов, резко отличаются по последовательности аминокислот, если сравнивать между собой однотипные антитела с разной специфичностью — они гцпервариабельны (рис. 13.3, 13.4).Три гипервариабель- -ные петли каждого из доменов пространственно сближены и объединяются в единую весьма неровную поверхность — зону связывания антигена. Последняя образова-ные петли каждого из доменов пространственно сближены и объединяются в единую весьма неровную поверхность — зону связывания антигена. Последняя образова-L3L3Рис. 13.3. Пространственное строение вариабельного домена легкой цепи одного из иммуноглобулиновРис. 13.3. Пространственное строение вариабельного домена легкой цепи одного из иммуноглобулиновСкладчатыми полосками изображены Д-структурные от- резки; LI, L2, L3 - гипервариабельныё петли, соединя- на шестью петлями: L1, ющие эти отрезки (соответствуют районам, определя- L2, L3 (из V -Домена) И ющим комплементарность, - CDR)Складчатыми полосками изображены Д-структурные от- резки; LI, L2, L3 - гипервариабельныё петли, соединя- на шестью петлями: L1, ющие эти отрезки (соответствуют районам, определя- L2, L3 (из V -Домена) И ющим комплементарность, - CDR)
менной дисульфидной связью. Пространство между слоями заполнено гидрофобными боковыми: цепями
менной дисульфидной связью. Пространство между слоями заполнено гидрофобными боковыми: цепями
достаточно плотно- упакованными аминокислот. Все эти устойчивые
достаточно плотно- упакованными аминокислот. Все эти устойчивые
V -доменов предопределены сходством их пер-
V -доменов предопределены сходством их пер-
черты третичной структуры V- и
L2
черты третичной структуры V- и
L2
вичной
вичной
структуры.
структуры.
Однако петли, соединяющие отрезки /9-структуры в каждом из этих доменов, резко отличаются по последовательности аминокислот, если сравнивать между собой однотипные антитела с разной специфичностью — они гцпервариабельны (рис. 13.3, 13.4).
Три гипервариабель- -
Однако петли, соединяющие отрезки /9-структуры в каждом из этих доменов, резко отличаются по последовательности аминокислот, если сравнивать между собой однотипные антитела с разной специфичностью — они гцпервариабельны (рис. 13.3, 13.4).
Три гипервариабель- -
ные петли каждого из доменов пространственно сближены и объединяются в единую весьма неровную поверхность — зону связывания антигена. Последняя образова-
ные петли каждого из доменов пространственно сближены и объединяются в единую весьма неровную поверхность — зону связывания антигена. Последняя образова-
L3
L3
Рис. 13.3. Пространственное строение вариабельного домена легкой цепи одного из иммуноглобулинов
Рис. 13.3. Пространственное строение вариабельного домена легкой цепи одного из иммуноглобулинов
Складчатыми полосками изображены Д-структурные от- резки; LI, L2, L3 - гипервариабельныё петли, соединя- на шестью петлями: L1, ющие эти отрезки (соответствуют районам, определя- L2, L3 (из V -Домена) И ющим комплементарность, - CDR)
Складчатыми полосками изображены Д-структурные от- резки; LI, L2, L3 - гипервариабельныё петли, соединя- на шестью петлями: L1, ющие эти отрезки (соответствуют районам, определя- L2, L3 (из V -Домена) И ющим комплементарность, - CDR)
Hl, H2 и НЗ (из ¥„-домена). Эти петли почти точно совпадают с гипервариабельными участками аминокислотной последовательности ¥- доменов, так называемыми районами, определяющими . комплемен- тарностп-ъ (от англ. Complementarity Determining Regions, сокращенно CDR).
Замены аминокислот в этих петлях (рис. 13.5) Приводят к замещению одних боковых цепей. другими и, следовательно, к изменению рельефа и всего характера антигенсвязывающей зоны, чем и определяется ее способность быть комплементарной молекулам самой различной природы. Поверхность антигенсвязывающего района изменяется еще и потому, что замены аминокислот в гипервариабельных участках влияют на. конформацию образуемых ими петель. Может изменяться и длина петель, в особенности петли НЗ.
Рентгеноструктурный анализ комплексов антиген — антитело (по техническим причинам обычно исследуют комплекс, образованный Fab-фрагментом, а не целой йолекулой иммуноглобулина) позволил вскрыть основные факторы, которыми определяются прочность и высокая специфичность их образования.
Прежде всего это плотная подгонка поверхности активного центра антитела к структуре антигена. Макромолекулы, в особенности белки, вступают в реакцию с данным иммуноглобулином лишь частью своей поверхности — так называемым эпитопом. -Для комплексов лизоцима с
Рис. 13.4. Расположение гипервариабельных участков в антигенсвязывающей зоне иммуноглобулинаРис. 13.4. Расположение гипервариабельных участков в антигенсвязывающей зоне иммуноглобулинаКвадратами обозначены ^-спиральные отрезки, рассматриваемые с торца, зигзагообразными линиями - гипервариабельные петли. Остальные обозначения общепринятые;' ср. рис. 13.БКвадратами обозначены ^-спиральные отрезки, рассматриваемые с торца, зигзагообразными линиями - гипервариабельные петли. Остальные обозначения общепринятые;' ср. рис. 13.Биндивидуальными .
Рис. 13.4. Расположение гипервариабельных участков в антигенсвязывающей зоне иммуноглобулина
Рис. 13.4. Расположение гипервариабельных участков в антигенсвязывающей зоне иммуноглобулина
Квадратами обозначены ^-спиральные отрезки, рассматриваемые с торца, зигзагообразными линиями - гипервариабельные петли. Остальные обозначения общепринятые;' ср. рис. 13.Б
Квадратами обозначены ^-спиральные отрезки, рассматриваемые с торца, зигзагообразными линиями - гипервариабельные петли. Остальные обозначения общепринятые;' ср. рис. 13.Б
иммуноглобулинами (моноклональными антителами) показано, что их контактирующие поверхности подогнаны настолько точно, что на площади примерно в 700 А2 оказы- аются вытесненными все молекулы воды, которые гидратировали оба белка.
Это удаление связанной, а значит, упорядоченной воды повышает неупорядоченность системы в целом, что приводит к росту энтропии и благоприятствует образованию прочного комплекса. Вместе с
Рис. 13.5. Модель антигенсвязывающего участка пространственной структуры одного ,из иммуноглобулинов -Рис. 13.5. Модель антигенсвязывающего участка пространственной структуры одного ,из иммуноглобулинов -
Рис. 13.5. Модель антигенсвязывающего участка пространственной структуры одного ,из иммуноглобулинов -
Рис. 13.5. Модель антигенсвязывающего участка пространственной структуры одного ,из иммуноглобулинов -
Контурные линии, подобно горизонталям топографической карты, проведены через 2 X, • гипервариабельные учасТки легких и тяжелых цепей обозначены соответственно LI, L2, L3, Hl, Н2 и НЗ. Замены аминокислотных остатков, происходящие на этих участках, могут изменять как рельеф поверхности контакта с антигеном, .так и ее характер, например распределение заряженных, полярных и неполярных групп
тем сближение функциональных групп, прйнадлежащих антигену и антителу, позволяет.установить целый ряд ван-дер-ваальсовых контактов, водородных и ионных связей. Так, при образовании комплекса лизоцима и Fab'-фрагмента иммуноглобулина возникает 126 межатомных контактов, в том числе 14 водородных связей и одна ионная связь между аминогруппой лизина и карбоксилат-иондм аспарагиновой кислоты^
Аминокислотные остатки моноклонального Взаимодействующие с ними антитела Hyfiel-Юостатки лизоцима
Домен V^•
Gly-16His-15, Gly-16, Lys-96Gly-16, ?yr-20 -Asn-93, Lys-96Thr-89, Asn-93Gly-16His-15, Gly-16, Lys-96Gly-16, ?yr-20 -Asn-93, Lys-96Thr-89, Asn-93Gly-30
Gly-16
His-15, Gly-16, Lys-96
Gly-16, ?yr-20 -
Asn-93, Lys-96
Thr-89, Asn-93
Gly-16
His-15, Gly-16, Lys-96
Gly-16, ?yr-20 -
Asn-93, Lys-96
Thr-89, Asn-93
Asn-31 (Н-связь).
Asn-32 (Н-связь)
Tyr-50
Gln-53 (Н-связь)
Туг-20Tyr-20, Arg-21Arg-21Туг-20Tyr-20, Arg-21Arg-21Arg-70Arg-73, Leu-75LyB-97Trp53, Lys-97, Ile-98, .Ser-100, Asp-101Arg-21, Ser-100Авр-101 "Trp-63, Leu-75, Asp-101Asp-101Asp-101, Gly-102Arg-21, Ser-100, Gly-102Arg-21, Lys-97, Ser-100'Arg-70Arg-73, Leu-75LyB-97Trp53, Lys-97, Ile-98, .Ser-100, Asp-101Arg-21, Ser-100Авр-101 "Trp-63, Leu-75, Asp-101Asp-101Asp-101, Gly-102Arg-21, Ser-100, Gly-102Arg-21, Lys-97, Ser-100'
Туг-20
Tyr-20, Arg-21
Arg-21
Туг-20
Tyr-20, Arg-21
Arg-21
Arg-70
Arg-73, Leu-75
LyB-97
Trp53, Lys-97, Ile-98, .
Ser-100, Asp-101
Arg-21, Ser-100
Авр-101 "
Trp-63, Leu-75, Asp-101
Asp-101
Asp-101, Gly-102
Arg-21, Ser-100, Gly-102
Arg-21, Lys-97, Ser-100'
Arg-70
Arg-73, Leu-75
LyB-97
Trp53, Lys-97, Ile-98, .
Ser-100, Asp-101
Arg-21, Ser-100
Авр-101 "
Trp-63, Leu-75, Asp-101
Asp-101
Asp-101, Gly-102
Arg-21, Ser-100, Gly-102
Arg-21, Lys-97, Ser-100'
Ser-91 (Главная цепь).’.
Asn-92 (Й-связь, главная цепь).
Туг-9б (Н-связь)
Домен ¥ц'
Thr-30
Ser-31 (Н-связь) '
Авр-32 (Ионная связь)
Туг-33 (Н-связь).
Tyr-бО (Н-связь),
Ser-52 (Н-связь)
Туг-бЗ (Н-связь) ;
Ser-54 v
ser-бв: :
Туг*58 (Н-связь)
Trp-96ё
Полное вытеснение воды из зоны связывания антигена стабилизирует водородные и ионные связи. Результатом является весьма высокая прочность комплекса, характеризующаяся константой связывания порядка 107—1010 М"1. * -
Заметим, что рельеф поверхности контакта антигена и антитела может быть весьма различным. Поверхность бывает почти плоской, со впадинами или выпуклостями. Например, одно из антител к лизоциму частично заполняет своим выпуклым центром связывания впадину, в которой размещается субстрат этого фермента, и поэтому является его ингибитором. У лизоцима в этом комплексе Площадь контакта с иммуноглобулином составляет около 15% всей доступной растворителю поверхности белка.
В качестве эпитопа нередко выступает несколько сближенных в пространственной структуре белка-антигена участков последовательности. Определена структура трех комплексов лизоцима с моноклональными антителами. Суммарная площадь эпитопов в них — около 40% поверхности белка, а поскольку ■ известно, что существуют и другие эпитопы, ло-видимому, практически все или почти все доступные участки молекулы белка могут обладать иммунологической активностью.
Еще один источник способности семейства иммуноглобулинов связывать антигены самой различной структуры состоит в том, что поверхность зоны связывания, образованная VT- и V -доменами составляет около 2000 А2 и намного превышает обычную площадь эпитопа на Поверхности белка-антигена (500—1000 А2, у большинства небелковых 300 '
антигенов она еще меньше). Вследствие этого для образования комплементарной эпитопу . структуры может использоваться не вся поверх- - носТь зоны связывания доменов V, и Vu, а какая-то ее часть, в наи
большей мере соответствующая строению антигена.
МНОГООБРАЗИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Своеобразна организация структурных генов иммуноглобулинов, которая призвана обеспечить возможность образования очень большого числа антител. Гены, кодирующие легкие и тяжелые цепи, собираются из менъших по размеру генов, одни из которых, особенно многочисленные, кодируют вариабельные домены V, и V (V-гены), а другие, которых гораздо меньше, — константные части молекулы (С-гены).
Так, константные доацгы легких цепей кодируются несколькими генами, что приводит к синтезу двух типов легких цепей: ® и А. В гаплоидном геноме человека имеется один ген ае-цепи и несколько — A-цепи. Число генов, которыми кодируются вариабельные домены, гораздо больше. Так, существует около 100 генов V^, на которых записаны аминокислотные последовательности вариабельных доменов легких цепей типа ®.•
Заметим, что небольшой участок L-цепи, расположенный непосредственно перед константным районом — J (от англ, joining — соединяющий), кодируется особо.и так же вариабелен. При созревании В-лим- фоцитов из этих отрезков собираются гены L-цепей, в которых путем рекомбинации объединяются гены VT“~Jt.—€., что приводит к возможности образования весьма многообразных легких ю-цепей.
Аналогично, из генов V„ (которых около 100) путем их рекомбинации с генами Du, Ju и С„ образуются гены тяжелых цепей — V “D “J„—Си. Общее число вариантов зон связывания при этом составит около 10 млн. Эта величина еще более возрастет, если учесть вклад соматических мутаций, которые приводят к дополнительным заменам аминокислотных остатков в вариабельных доменах иммуноглобулинов.
Своеобразный механизм формирования генов иммуноглобулинов обеспечивает возникновение очень большого числа аминокислотных последовательностей, а' доменная организация этих белков и концентрирование замен в немногих гипервариабельных отрезках цепи позволяет создавать в зоне связывания антител чрезвычайно разнообразные по рельефу и распределению функциональных групп поверхности, •
среди которых всегда можно найти такую, которая комплементарна поверхности того или иного антигена.
Помимо рассмотренных выше иммуноглобулинов G существуют иммуноглобулины еще четырех классов: М, А, Е и D. Их молекулы также построены из доменов и организованы по такому же принципу. В иммуноглобулинах М и Е тяжелые цепи дополнены еще одним доменом— соответственно С^4 и Сс4, в иммуноглобулинах А и М С-концевые районы тяжелых цепей соединены между собой с участием специальной J- цепи. Есть и другие отличия в их структуре, в' частности содержание и распределение углеводных цепей. Иммуноглобулин 1 образует пентамеры (L2H2)s- Мембранно-связанные "иммуноглобулины, которые принадлежат классам М и D, содержат на С-концах тяжелых цепей небольшие домены, образованные преимущественно гидрофобными аминокислотами, которые выполняют роль якоря, удерживающего молекулу иммуноглобулина на наружной поверхности мембраны.
Таким образом, доменный принцип организации структуры и функции иммуноглобулинов чрезвычайно плодотворен и позволяет, используя один и тот же структурный мотив, создать богатую палитру антигенсвязывающих белков. Видимо, по такому же плану построены и некоторые рецепторы клеточных мембран.
ГЛАВА 14ФИБРИЛЛЯРНЫЕ БЕЛКИ
Фибриллярные белки выполняют по преимуществу структурные функции, однако их роль ничуть не м^нее значительна, чем роль, глобулярных белков, велико и число фибриллярных белков, особенно возросшее с открытием белков цитоскелета и межклеточного матрикса. Далее будут рассмотрены лишь некоторые, наиболее изученные фибриллярные белки. ■ " _
КОЛЛАГЕН
Коллаген ("образующий клей") является, видимо, Наиболее распространенным белком многоклеточных./ Так, у млекопитающих он составляет по. массе около */4 суммарного белка. Коллаген — важнейший компонент соединительной ткани, он входит в структуру кожи, костей, сухожилий, кровеносных сосудов, хрящей, зубов. Его главная функция — образование нерастворимых фибрилл высокой прочности.
Существует не менее десяти структурных генов, которые кодируют различные молекулярные формы коллагена, отличающиеся первичной 302 ' 1
структурой, а иногда и пространственным строением. Кодируемые иМи коллагены по-разному распределены в органах и тканях. Коллаген типа I, наиболее распространенный в организме и содержащийся в коже, сухожилиях, костях, роговице глаза, построен из двух полипеп- тидных цепей: al и отличающейся первичной структурой цепи а2; коллагены других типов образованы тремя одинаковыми и характерными для данного типа полипептидными цепями. Каждая из полипеп- тидных цепей коллагена образована примерно 1000 аминокислотных остатков. Для коллагена характерна интенсивная посттрансляционная модификация, глубина которой зависит от органа или ткани и изме-^ няется с возрастом животного.•
В первичной структуре полипептидных цепей, образующих фибриллы коллагенов I—IV, четко выражен повторяющийся на протяжении всей цепи структурный мотив: GlyХаа—Yaa (где Хаа и Yaa — различные аминокислоты), причем часто встречается структура GlyPro—Нур. Этому соответствует высокое содержание глицина и пролина, а также оксипролина (Йур). 4
Оксипролии^ встречающийся только в коллагене и эластине, образуется как результат котра-нсляционной модификации пролина, которая происходит еще до завершения синтеза полипептидной цепи. Пролин, включенный в пептидную цепь, гидроксилируется содержащим Двухвалентное железо ферментом пролилхидроксилазой. ',
Фермент катализирует реакцию кислорода с пролином, при которой происходит гидроксилирование 4-го атома пролина, второй же атом молекулы кислорода реагирует с кетоглутаратом, превращая его в сукцинат и С02. Двухвалентное состояние железа сохраняется в этих условиях благодаря' восстановительному действию аскорбиновой кислоты: ■.
Кегоглутаровая кислота Янтарная кислота
ноос—со—€Н2СН2С00Н♦ ноос—СН2СН2С00Н + С02
сн2
сн—со—
I ' I'
о=со=с
|| Оксипролин
Рис. 14.1. Тройная спираль коллагенаРис. 14.1. Тройная спираль коллагенаТочками -отмечены NH- группы остатков глицина, занимающих каждое третье положениеТочками -отмечены NH- группы остатков глицина, занимающих каждое третье положение‘ Гидроксилированию по С-4 подвергаются только те остатки пролина, которые предшествуют остаткам глицина в последовательности Pro-С1у~Хаа~Уаа. Аналогичным образом (котрансляцйонно) лизин- гидроксидаз а гидроксилирует по 6-углеродным атомам остатки лизина, предшествующие глицину. Гидроксильные группы оксилизина
Рис. 14.1. Тройная спираль коллагена
Рис. 14.1. Тройная спираль коллагена
Точками -отмечены NH- группы остатков глицина, занимающих каждое третье положение
Точками -отмечены NH- группы остатков глицина, занимающих каждое третье положение
—СООН
II -
сн (СН2) 2—сн—сн2—кн2
—NH
служат точкой гликозилирования. К ним последовательно присоединя- , ются галактоза и глюкоза. Отмеченные модификации происходят в фибробластах и открывают собой целую последовательность дальнейших превращений коллагена. Не претерпевший более глубоких модификаций '’незрелый" коллаген называется тропоколлагеном и может быть выделен из кожи молодых животных.
Тропоколлаген имеет форму стержня длиной 3000 А и диаметром 15 А и представляет собой три идущие в одном направлении поли- пептидные цепи, скрученные в спирали (рис. 14.1). Каждая, из них аналогична спирали хорошо изученного модельного полипептида— поли-Ь-пролина. Последняя отличается от ot- спирали уже тем, что в ней невозможна стабилизация водородными связями вдоль спирали, поскольку отсутствуют донорные группы NH. Вследствие этого конформация поли-Ь- пролина диктуется практически только пространственными ограничениями со стороны пирролидиновых колец остатков пролина. На один оборот спирали приходится точно три аминокислотных остатка. Далее три параллельно направленные спирали типа поли-Ь- пролина в коллагене закручиваются в пучок, образуя суперспираль.
Три спирали связаны между собой поперечными водородными связями. Роль глицина, обязательно занимающего каждое третье положение в пептидной цепи, состоит в том,
что он позволяет трем цепям коллагена сблизиться, так как не создает стерических помех в центре спирали, не имея боковой группы. Объемистые пирролидиновые кольца пролина и оксипролина направлены наружу (рис. 14.2).
< Стабильность тройной спирали определяется кооперативными взаимодействиями, ее денатурация — переход в желатину — обычно происходит скачком в небольшом температурном интервале, середину которого принято называть телтературой плавления хол- лагена. Интересно, что температура плавления коррелирует с содержанием суммы РЬткткЬв пролина и оксипролива и как-
Рис. 14.2. Взаимодействие полипептидных цепей коллагена за счет образования водородных связей Между остатками глицина (обозначены литерой G)Рис. 14.2. Взаимодействие полипептидных цепей коллагена за счет образования водородных связей Между остатками глицина (обозначены литерой G)Необходимое для этого сближение цепей обеспечивается регулярно расположенными, остатками глицина, не имеющими боковых цепейНеобходимое для этого сближение цепей обеспечивается регулярно расположенными, остатками глицина, не имеющими боковых цепейто связана с температурой тела животного, превышая ее на несколько
Рис. 14.2. Взаимодействие полипептидных цепей коллагена за счет образования водородных связей Между остатками глицина (обозначены литерой G)
Рис. 14.2. Взаимодействие полипептидных цепей коллагена за счет образования водородных связей Между остатками глицина (обозначены литерой G)
Необходимое для этого сближение цепей обеспечивается регулярно расположенными, остатками глицина, не имеющими боковых цепей
Необходимое для этого сближение цепей обеспечивается регулярно расположенными, остатками глицина, не имеющими боковых цепей
градусов.,. N , ьл, л-
Сумма остатке 1 фо- Температура, плав- Темофееу! л тела - .- ,^ шам.^ жпуемшнв ления коллагена, °C . животного, * С
■\ - '''’, 'А.*
Кожа теленка
232 .
•"■ <; V- 1
39
37
> акулы
191
29
24-28
V
> трески
155
. 16
10-14
Такая ^подогнанность" температуры плавления к температуре тела, видимо, обусловлена необходимостью обеспечить эластичность коллагеновых Волокон. Гидроксилирование пролина повышает стабильность и температуру-плавления коллагена, поэтому нарушение гидроксилирования, например при цинге за счет недостатка витамина С, приводит к поражению кожи, сосудов, выпадению зубов и т.п.
Образование тройной спирали коллагена может происходить спонтанно, однако это медленный процесс. In vivo такой скорости было бы недостаточно. Поэтову коллаген синтезируется в виде предшественни-
!!ка — проколлагена, который имеет молекулярную массу 140 кДа, в то время как молекулярная масса собственно a-цепи равна. 95 кДа. В предшественнике N- и С-концевые участки трех полипептидных цепей, первичная структура которых лищена характерного,- "коллагенового" мотива, формируют глобулярныеструктурай, которые затем объединяются, взаимодействуя между с бой, причем контакт-между С-концевы- ми глобулами дополнительно стабилизируется межцепьевыми дисуль-
!
!
фидными связями
В результат? м пекула проколлагена приобретает форму своеобразной гантели,1 в которой будущие коллагеновые пептидные цепи сближены и направлены1 параллельно, что резко упрощает и ускоряет свертывание тройной ’ спирали,, Таким образом^ концевые глобулы выполняют функцию "монтажных устройств^,.облегчая правильную
,7,7сборку молекулы проколлагена. -
,7
,7
Проколлаген синтезируется и секретируется в межклеточное пространство фибробластами. Вянем специфические праколлагенпептидазы отщепляют выполнившие свою '"роль глобулярные домены, оставляя тройную спираль, образованную прлипеПтидными цепями, в каждой из которых структурный мотав Gly-laa—Yaa повторяется 338 раз (рис. 14.3). ■ :^.-^;.
Молекулы тропоколлагена упаковываются в коллагеновые волокна, располагаясь в них параллельно, однако со сдвигом по отношению друг к другу примерно на V* длины молекулы. Между концом одной молекулы и начало! другой образу гея просвет в 400 А, который служит в костной ткани центром образования гиДроасмлапатита.
Далее коллагеновое волокно стабилизируется целой системой поперечных сшивок. Среди процессов п ре нсляционцрй модификации, определяющих созревание коллагена особенно важно образование ал*- лизина (альдегидо-производного лизина) под действием лизиноксида- зы: * ‘ t ^ „ w ‘ .
СОСО
I~ I
CHi—(СН2)2—СН2—CH2*~NH2 —*- —► СН—(СН2) 2—СН2СН0
II"? .
№-> -■^«-■^-х4№..-»^^
. :» Лизин -V. ^ v^^:^-^л., . Аль-йизин ^ ^-=v ;.-» .
Аналогичное Превращение в альдегид претерпевы т и оксили^йн. Лизиноксидаза - ■' медьсодержащий фермент, в котором в качестве
мРНК тРНК-*
Рибосомы Аминокислоты
Трансляция
Начало
ХРивроксилирования
Про-а-цепиОН ^ он,-—~^°*0НПро-а-цепиОН ^ он,-—~^°*0НW АОН УклавкаW АОН Уклавкамолекул ОНмолекул ОН
Про-а-цепи
ОН ^ он,-—~^°*0Н
Про-а-цепи
ОН ^ он,-—~^°*0Н
W А
ОН Уклавка
W А
ОН Уклавка
молекул ОН
молекул ОН
Образование спирали,гидроксилированиепрекращается
МмМ11.а w 66*
проколлагена Пткозилированиеон он ■ 'o'6"’6'
„ -0. он он он он»Ж, “ ««^„ -0. он он он он»Ж, “ ««^
„ -0. он он он он
»Ж, “ ««^
„ -0. он он он он
»Ж, “ ««^
Тропоколлаген
Формирование фибриллиобразование альвегидов
коллагенколлагенОбразование поперечных связей
коллаген
коллаген
Ри<;. 14.3. Схема биосинтеза, сборки тройной спирали, формирования волокна и посттрансляционной модификации коллагена (остальные пояснения см. в тексте) ; 1
кофактора выступает пиридоксаль. Далее спонтанно, без участия ферментов, образуется шиффово основание с пространственно. сближенной аминогруппой остатка лизина, находящегося в другой полипептидной цепи:
II
СОСО
СН—(СН2)2—СН2—сн2—nh2 + осн—сн2—(СН2)2—сн
NH ЛизинI Аль-лизин NH
II
со' ■со
I.•I
сн—(СН2)2—сн2—СН2—N=CH—СН2—(СН2)2—сн
NHОснование ШиффаNH
II
Связь —№СН~, сама по себе малоустойчивая, восстанавливаясь до —Ж-СН2—, превращается в весьма прочную поперечную сшивку — так называемый лизинонорлейцин:
II
сосо
СН(СН2)4—НН—(СН2)4—СН
II
NHНН
'II
Лизинонорлейцин
Альдегидные группировки аль-лизина, будучи весьма реакционноспособными, легко вступают в реакции альдолгной, а затем и кротоновой конденсации. Далее возможно присоединение к активированной двойной связи имидазольной группы гистидина и еще более сложные превращения:
н—С=он—С=оСН2СН2Продукт кротоновой конденсации двух остатков аль-лизинаПродукт кротоновой конденсации двух остатков аль-лизинаСН2СН2СН2СН2
н—С=о
н—С=о
СН2
СН2
Продукт кротоновой конденсации двух остатков аль-лизина
Продукт кротоновой конденсации двух остатков аль-лизина
СН2
СН2
СН2
СН2
Боковые цепи двух остатков аль-лизина
н—С=0н—С=0НС=0
н—С=0
н—С=0
Фрагмент гистидина
Фрагменталь-лизинаФрагменталь-лизинаСоединение в один узел двух остатков лизина и остатка гистидина
Фрагменталь-лизина
Фрагменталь-лизина
н сн2
I
СН2 « Фрагмент
Iаль-лизина
Количество и характер возникающих при этом поперечных связей позволяют регулировать эластичность волокна.
Таким образом, биосинтез коллагена включает целую цепь посттрансляционных модификаций. В фибробластах синтезируется и собирается проколлаген, в котором уже проходит образование остатков оксипролина, оксилизина и гликозилирование последних. После ■ сек
реции проколлаген подвергается ограниченному протеолизу, который приводит к отщеплению концевых глобулярных структур и образованию тропоколлагена. Далее происходит созревание этого еще сохраняющего водорастворимость белка и возникает более или менее разветвленная система поперечных межцепьевых "сшивок". Интенсивность последнего процесса зависит от возраста животного и природы ткани, в которой локализован коллаген, что позволяет регулировать физические свойства структур, в которые он включен.
Биологическая значимость этой последовательности превращений подчеркивается тем, что нарушение' хотя бы одного из ее звеньев приводит к серьезным нарушениям в формировании соединительной ткани. Например, блокирование лизиноксидазы биогенным амином — латирином NH?CH2CH2CN (^аминопропионйтрил), попадающим в организм животного при поедании им определенного вида горошка, делает
невозможным образование аль-лизина и тем самым прерывает дальнейшее формирование поперечных сшивок, стабилизирующих коллагеновые волокна, что приводит к глубоким поражениям кожи. Образование поперечных связей тормозится и при дефиците ионов меди, входящих в активный центр лизиноксидазы.
Интересно, что в стенках клеток растений содержатся оксипролин- богатые гликопротеины, играющие роль структурообразующих белков. Другой структурный компонент стенок растительных клеток — гли- цин-богатый белок, найденный в бобовых. В его аминокислотной последовательности на долю глицина приходится 60%. Предполагают, что этот белок образует /3-структуру.
ЭЛАСТИН
Эластин — нерастворимый фибриллярный белок, играющий важную роль в формировании эластичних тканей, прежде всего стенок артерий, легких и связок. Полипептидная цепь его предшественника — тропоэластина, — синтезируемая, как и коллаген, фибробластами, состоит примерно из 760 аминокислотных остатков. Более половины из них приходится на глицин и аланин, четверть — на типично гидрофобные аминокислоты, среди которых особенно много валина, в то время как число гидрофильных аминокислот очень невелико. Содержание пролина в эластине (11%) значительно, меньше, чем в Коллагене. Часть остатков пролина гидроксилирована, однако оксипролин, по- видимому, не играет существенной роли в эластине и, возможно, образуется попутно, как следствие высокой активности пролйнгидроксила- зы в фибробластах, где синтезируется и коллаген. '
Для первичной структуры эластина характерно обилие повторяющихся участков последовательности, например последовательность' Pro—(Пу—Vai—(Пу—Vai встречается в эластине по меньшей мере 11 раз подряд. Эластин построен из большого числа чередующихся гидрофобных и гидрофильных участков полипептидной цепи, которые соответствуют множеству относительно коротких экзонов ’ в структурном гене этого белка. Гидрофильные участки обогащены лизином.
По-видимому, гидрофобные участки ответственны за агрегацию, чрезвычайно характерную для эластина. Гидрофильные же определяют образование межмолекулярных сшивок, которые делают агрегацию необратимой. Примерно в середине каждого из гидрофильных участ-^ ков содержатся остатки лизина, разделенные двумя-тремя остатками' других аминокислот, часто аланина, например Lys-Ala-Ala-Lys,1 Lys—Sei—Ala-Ala—Ly s—Val-Ala—Ala-Lys, Lys-Ala-Pro-Lys.
Цри созревании тропе ластика почти все остатки лизина превращаются в аль-лизин под действием того же медьсодержащего фермента ли^иноксидазы, который модифицирует коллаген. Образовавшиеся при этом, альдегидные группы вступают в. реакции конденсации, с другими остатками аль-лизина, а также с. е-аминогрунпой зще, не окисленного остатка лизина, в результате чего , четыре сближенных в " агрегате остатка лизина дают десмозун —• аминокислоту с пиридиниевым ядром, объединяющую в один узел четыре участка пептид] )й цепи эластина:
—МН—сн—со-
I -
(СН2)3
I , I I
СОСИсо
I / t I
СЙ-(СНг)7"СН . СН-(СНг)тСН
IIIII
Десмозин объединяет в узел четыре остатка лизинаДесмозин объединяет в узел четыре остатка лизинаNBCHCHNI
Десмозин объединяет в узел четыре остатка лизина
Десмозин объединяет в узел четыре остатка лизина
- : --NH-CH-CO-- ■'"? -
Сщивки такого типа делают эластин нерастворимым в воде,- в то время как участки между ними,-имеющие конформацию неупорядоченного । клубка, сохраняют способность к обратимому растяжению, чем и обусловлена растяжимость связок и стенок артерий. Инактивация лизицокецдазы, которая может быть вызвана дефицитом ионов меди или блокированием пиридоксаля в активном .центре фермента (вследствие реакции с аминогруппой ^-аминопропионитрила — латири- на), тормозит созревание' эластина и приводит к утрате эластичности связок и артерий, а иногда к разрыву аорты.
КЕРАТИНЫ
Кератин — структурообразующий фибриллярный белок, синтезируемый эпителиальными клетками и образующий в них так называемые промежуточные филаменты. — тяжи, участвующие в построении цитоскелета. В цитоскелет клеток других типов входят белки, родственные кератину. Из кератина же построены роговые образования —
\-.311
мотав из семимотав из семиРис. 14.4. Двойная спираль кератинаРис. 14.4. Двойная спираль кератинаволосы, ногти, когти, клювы перья, шипы, панцирь, сухой наружный слой кожи.'*.* 1 <
мотав из семи
мотав из семи
Рис. 14.4. Двойная спираль кератина
Рис. 14.4. Двойная спираль кератина
По мере перемещения эпителиальных клеток к поверхности синтез кератинов становится все более интенсивным и в конечном счете волокна кератина заполняют всю клетку, поверхностные структуры которой оттесняются на периферию волокна, образуя его оболочку — кутикулу..-.
В эпителиальных клетках не менее 20 структурных генов кодирует синтез кератинов, принадлежащих к одному из двух типов: I или II; кератины типа III синтезируются в качестве белков цитоскелета в неэпителиальных клетках. Все кератины, являясь эволюционно родственными белками, построены по одному плану. Так, эпидермальный кератин II человека содержит в одной полипептидной цепи 562 аминокислотных остатка, причем его N- и С-концевые фрагменты (своего рода домены), по-видимому, де имеют какой-либо доминирующей регулярной вторичной структуры, тогда как последовательность центральной части полипептидной цепи, которая соответствует четырем экзонам, состоит из состыкованных четырех о-спиральных доменов. В каждом из них многократно повторяется одинаковый структурный инокислотных Остатков, среди которых первый и четвертый, как правило, гидрофобны. Например, с 386-го остатка начинается фрагмент (гидрофобные остатки выделены -полужирным шрифтом): Ile^~Gln—Arg-beu~Arg~Ser—Glu~^Ile~Asp~flis— —Val~Lys—Lys—Gin-Oys-Ala—Asn-Lee и т.д.
Регулярное появление гидрофобных боковых ■ цепей через каждые три или два - аминокислотных остатка в а-спиральных участках кератина приводит к образованию своеобразных гидрофобных "гребней", взаимодействие между которыми стабилизирует суперспираль, так называемую протофибриллу, образующуюся при закручивании двух (рис. 14.4) одинаково направленных цепей кератина друг относительно друга.. По-видимому концевые неспиральные участки в полипептидных цепях кератина, как и в колЛйгб* не, выполняют "монтажную11 функцию, способствуя их правильной укладке и ускоряя образование суперспирали. Одиннадцать протофибрилл, соединяясь в пучок, образуют лгикрофибридлу, микрофибриллы собираются в фибриллы.
При образовании роговых структур — волос,
шерсти, панциря и т.п~ — большую, роль играет белок матрикса, в который погружены фибриллы кератина. Этот неспиральный белок в отличие от собственно кератина очень богат остатками цистеина, которые, окисляясь, образуют • многочисленные дисульфидные мостики, упрочняющие структуру фибрилл кератина и делающие их практически нерастворимыми. Так, цистеин-богатые белки волос человека и шерсти овцы, очень похожие ho. первичной структуре, содержат в полипептидной цепи 168 аминокислотных остатков, из которых 36% приходятся на цистеин, превращающийся при окислении в цистин. Характерна N-концевая последовательность богатого серой белка волос человека, в которой остатки цистеина занимают каждое третье или четвертое место: 4 ■ *• ; • ■
Met-Gly-Cys-Ser-(Лу-Суй-Ser^ly-Gly-fiys-(Лу-Ser^er-Cys-Gly-.
-GlyMJyr^lyHser-Arg-Cys^ly-Gly-Cys-Sei ■'Ser-Ser-Cya-Cye-Tf
. Содержание остатков цистина в кератиновых роговых образованиях сильно зависит от вида животного, пищевого рациона, Природы эпидермальных тканей. Так, содержание цистина в шерсти овцы значительно выше, чем в ее рогах. Оно достигает 20% в панцире черепахи. ■ » —
Растягивание кератиновых волокон при одновременном ix увлажнении приводит к глубокой реорганизации вторичной структуры: а- спираЛьные цепи, вытягиваясь, переходят в ^-структуру с одновременным установлением системы межцепьевых водородных связей, Чему способствует и увлажнение. Такой переход и обусловленное им растяжение кератиновых волокон, например волос, обратимы — при "снятии нагрузки и понижении влажности происходит переход в а-спиральную структуру и сокращение длины.. Это свойство используют при устройстве психрометров — приборов, регистрирующих влажность воздуха. ; . - ’
Восстановление дисульфидных связей, проводимое обычно действием избытка меркаптосоединения (тиогликолевой кислоты или меркаптоэтанола), снимает поперечные сшивки в богатом цистином белке матрикса и делает, волокна кератина весьма гибкими, поддающимися формованию. Последующее окисление вызывает образование уже иного, набора дисульфидных связей и фиксирует . новую форму волокна. Такую обработку применяют при ’’химической" завивке волос, а также для придания шерстяным тканям, построенным из кератина, несминаемых складок.
ФИБРОИН ШЕЛКА • ь -
К /2-структурным фибриллярным белка» Относятся фиброин шелка и бедок' партини. В фиброине шелка полип стадные цепи, богатые глицином и аланином, содержат протяженные повторяющиеся Последовательности Ala—Gly, например ’ л ‘ ’
” ' —(Ala—Gly)4—Туг—Gly—(Ala—Gly )j—Туг—Gly—Ala—Ala—Ser—Gly—•
! ? -(Ma-Gly)2, •' '
. , - - . • '■■ Уу x ^
и образуют антипараллельную Д-структуру. Боковые цепи остатков аланина, чередующихся в последовательности фиброина с глицином, располагаются пр одну сторону /1-складчатого листа, так что гидрофобные контакты сежду ними дополнительно стабилизирукУг структуру. Близкие к полностью вытянутым ПолипеПтидные цепи фиброина придакУг Волокну прочность, однако эластичность его невелика и определяется по преимуществу менее регулярными участками структуры. В природной шелковой нити типично фибриллярный белок фиброин погружен в своего рода матрикс, образованный другим, но менёе упорядоченным структурно белком — сери-цихол!. ’ ,г! -** ■ ^
♦ ♦ * .
Завершая рассмотрение особенностей некоторых фибриллярных белков, отметим, что их первичная структура, как правило, содержит характерные "мотивы" t т.е. повторяющиеся одинаковые или однотипные последовательности аминокислот, которые обеспечивают формирование весьма протяженной регулярной вторичной структуры* .
. Граница между глобулярными и фибриллярными белками не столь резка, как ого может показаться. Нередко компактные глобулярные и вытянутые фибриллярные элементы совмещаются в. рамках одной и той же структуры /Это свойственно предшественникам фибриллярных белков, например проколлагену, но встречается .и в зрелых глобулярных белках, например в гемагглютинине вируса гриппа, ряде балков, регулирующих активность ДНК с участием "лейциновой молнии", и т.п. - * , , ■ .
Вместе с гем немалый интерн представляют . белки, образованные очень длинными полипептидными цепями, которые, однако, в отличие от рассмотренных выше фибриллярных белков формируют пространственную структуру в виде длинной гирлянды обычно небольших, функционально специализированных глобул. В таких цолидоменных белках 314
соотношение длины и сечения молекулы характерно для фибриллы, что отражается на их физико-химических свойствах, однако присутствуют и черты, свойственные типично глобулярным образованиям. Форма их гигантских макромолекул нередко далека от линейной фибриллы и подчас весьма сложна.
Такого рода белки играют важную роль в образовании внеклеточ- . ного матрикса соединительной ткани — специфической среды, в которую погружены клетки. Они участвуют в процессах эмбрионального развития тканей, внутритканевой подвижности клеток, их закреплении, наконец, в расселении опухолевых клеток — метастазировании.
'14.5. ФИБРОНЕКТИН
Фибронекупин — высокомолекулярный гликопротеин (молекулярная масса около 500 000 Да), образованный двумя почти идентичными субъединицами, содержится в сыворотке крови, а также присутствует в виде нерастворимых агрегатов s соединительной ткани. Его субъединицы содержат одну полипептидную цепь и соединены в С-концевом . районе дисульфидными связями. Полипептидная цепь каждой из них образует последовательно целый ряд доменов, которым соответствуют сходные участки полипептидной цепи — своего рода повторы, которые могут быть отнесены к трем различным типам. Интересно, что аналогичные повторы (и, следовательно, домены аналогичного строения) присутствуют в других белках иной функции. Так, повторы типа I структурно близки одному из доменов тканевого активатора плазминогена.
Отдельные ' участки последовательности фибронектина, видимо, домены или их группы; функционально различны. Так, пять повторов типа I, охватывающих аминоконцевую последовательность фибронектина, направляют агрегацию его молекул, участвуют в образовании межклеточного * матрикса, связываясь с гликозиламиногликаном — гепарином — огромной разветвленной молекулой, пронизывающей всю структуру межклеточного матрикса. Следующие шесть повторов (доменов), два из которых также принадлежат I типу, отвечают за взаимодействие с еще одним белком межклеточного матрикса — коллагеном.
Один из повторов типа III, расположенный в центральном участке полипептидной цепи и свернутый примерно так же, как домены иммуноглобулинов, образован семью Д-структурными отрезками. Он содержит чрезвычайно характерную последовательность аминокислот Arg—Gly—Asp (RGD в однобуквенной записи). Эта последовательность, встречающаяся в несколько ином окружении и в некоторых других белках, например в тромбине, специфически связывается с рецептором ..'315
на поверхности клеток, так называемым нитпегринол! а$А. Это обеспечивает адгезию клеток к фибронектину и играет важную роль в их ориентированном перемещении внутри соединительной' ткани. Интересно, что сравнительно короткие пептиды, содержащие RGD-последовательность, имитируют способность фибронектина взаимодействовать с рецепторами на поверхности клеток. .
Домены типа III, структурно близкие иммуноглобулину, встречаются и в других гигантских белках, например в белке мышц титине (молекулярная масса 3000 000 Да), где они, как полагают, придают полипептидной цепи способность к обратимому растяжению за счет обратимого перехода компактной пространственной структуры в развернутую и наоборот.
В фибронектине далее следуют домены, связывающие гепарин, и вблизи карбоксильного конца молекулы — связывающие фибрин. Расположенный на самом С-конце небольшой домен ответствен за антипараллельную ориентацию полипептидных цепей субъединиц и образование между ними двух дисульфидных связей.
■ Из сказанного видно, что фибронектин за счет соединения в весьма протяженной и гибкой структуре ряда функциональных доменов, настроенных на избирательное связывание — адгезию макромолекул и целых клеток, обеспечивает достаточно динамичную пространственную организацию межклеточного матрикса. Очевидно, что эта функция чрезвычайно важна в развитии соединительной ткани и организма в целом. Присутствующий в крови растворимый фибронектин играет ответственную структурообразующую роль в процессе заживления ран.
ЛАМИНИН
Лалтнин — белок, участвующий в формировании внеклеточного матрикса и закреплении клеток, — образован очень длинными поли- пептидными цепями и по своей геометрии мог бы быть отнесен к фибриллярным белкам, однако довольно протяженные его участки представляют собой цепочки глобул небольшого размера, структурно сходных с одним из факторов роста. Таким образом, ламинин нельзя безоговорочно считать традиционным фибриллярным белком, хотя по контурам молекулы и функциональным свойствам между Ними немало общего. ,
Этот гликопротеин с молекулярной массой около 900 000 Да является главным компонентом базальной мембраны, на которой формируется соединительная ткань. Известно несколько ламининов, отличающихся деталями структуры и локализацией в той или иной ткани, 316
Рис; 14.5. Структурная организация ламинина:
А, В1 и В2 - полипептидные цепи, С- концы которых находятся в нижней части рисунка. Направленные параллельно спиральные районы, по-видимому, образуют единую суперспираль. Один из ее участков ответен за рост нейритов и адгезию нервных клеток. G - крупная глобула, образованная С-концевым районом А-цепи.
Римскими цифрами обозначены домены в полипептидных цепях ламинина. Домен III цепи В ответствен за связывание с рецептором на поверхности клетки и содержит последовательность Туг Не Ser Gly Arg. N-Концевые глобулярные домены цепей В1 и В2 связывают коллаген IV
так что речь идет о " целом семействе полидоменных белков.
Ламинин связывается с коллагеном типа
структурообразующихIV, характерным дляструктурообразующихIV, характерным длябазальной мембраны, протеогликаном — гепарансульфатом — и другими макромолекулами, в частности главным белком базальной мембраны Hudotenoju, что приводит к формированию многокомпонентной сетчатой структуры — матрикса. Помимо того, ламинин обеспечивает связывание клеток эпителия с базальной мембраной. Ламинин (рис. 14.5) построен из трех полипептидных цепей: A-цепи (молекулярная масса 440 000 Да), В1-цепи (225 000 Да) и В2-цепи (205 000 Да). C-Концевые районы всех трех цепей могут образовывать весьма протяженные .акпирали, построенные из множества гептадных повторов, характерных для суперспирализованных белков, например, кератинов.
структурообразующих
IV, характерным для
структурообразующих
IV, характерным для
По-видимому, С-концевые о-спиральные районы всех трех цепей сплетены в единую весьма жесткую палочкообразную структуру — суперспираль длиной около 700—800 А, которая завершается глобулой, построенной за счет выступающего С-концевого участка А-цепи. N-Концевая часть А-цепи формирует, вероятно, несколько доменов, включая так называемые цистеинбогатые участки, в которых примерно 317
на 50 аминокислот приходится 8 остатков цистеина. Эти домены структурно аналогичны фактору роста эпителия (EGF), имеют жесткую палочковидную структуру и, что примечательно, нередко обнаруживаются в структуре белков животных.
N-концевые участки цепей В1 и В2 как бы откинуты в стороны от аналогичного участка цепи А, поэтому молекула ламинина приобретает форму креста, образованного тремя короткими отрезками и одним длинным, причем каждый из трех коротких лучей завершается двумя небольшими, а длинный — одной крупной глобулой. Центральная часть крестообразной структуры стабилизирована несколькими дисульфидными связями. N-Концевые участки легких цепей В1 и В2 также образуют по два глобулярных домена и жесткие палочковидные структуры, построенные аналогично фактору роста эпителия EGE.
В одном из таких EGF доменов цепи В1 находится участок узнавания рецептора ламинина, расположенного на поверхности клеток. Этот участок ответствен за адгезию клеток и их направленное перемещение. Характерно, что сравнительно короткий пентапептид — фрагмент последовательности в этом домене ламинина, имеющий строение Туг—Не—Gly—Ser—Arg, — способен конкурировать с ламинином за взаимодействие с клеточным рецептором и препятствовать адгезии клеток, в том числе, например, клеток меланомы базальной мембраной. Связывание коллагена IV, характерного компонента базальной мембраны, обеспечивается глобулами на коротких лучах креста, участок связывания нидогена (150 кДа) расположен в EGF-подобном домене цепи В2. ' " , ' ■ ' ,.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА' - ■"•*. и r.•. • . -.''
Общие руководства и учебные пособия ’
., .,.,., ?•.**^Jj/l -мхУ.-, » f Гг * e *
СтраверЛ Биохимия -Мл Мир, 1984. >*?' /'-♦
. Увйт ‘А.,* Хендлер Ф., Олма Э. и др. Основы биохимии- М.: Мир, 1981.
Т-’К»^ ^^-. -'^ .^; ч г г- l.^.,.^;--- X • • '
Ленинджер А, Основы биохимии;• Мл Мир, 1985. ^> >
Овчинников КХА. Биоорганиче^ская химия. - Мл Просвещение, 1987.
• '(• ww.'!,<h. . - ‘я ' .1 -ь -л, 1- •.vr-?1..-•■ . '• -г • ’ • ; р ; i,
и ; н;^:^ 1 J - -•-ч. .. --
К пиве 1.
Якубие ^1д Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, б^лки. ■ ■ Мл Мир, 1985.
Cheirastry апЗ Biochemistry of the Ammo Acids/G.C. Barrett, ed. - London,
N.Y.:1 bhapm^n and HaUt/1985.,
;=>u-^»i,_ац.И\=.1к-'" '
-■•^‘Ч .LVvyr1 Z^t -, i t ,-*J3,i' :•♦ .,Ьь^ •1?1
HwgSice ^СДМ Ешхайт X. Аминокислоты, пептиды/белки. - Мл Мир,, 1981 М. Bodansky. Peptide ^hemistry. A. Practical Textbook. - N.Y: Springer-Verlag, 1988.
К главе 3
Скоупс P. Методы очистки белков. - Мл Мир, 1985.
Ост<?рлигк Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и хроматография. - Мл Наука, 1981.
. Остерлмт Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофот^уси- рованием, иммунозлекТрофорезом и радиоизотопным)! методами. - Мл Наука, 1983.' "
Остериввн Л.А. Хроматография белков и Нуклеиновых кислот; - Мл Наука, 1985.‘'
К пт» 4
Прахтическа* химАя белка/Под ред. Л. Дарбре - Мл Мир, 1989.
К главе 5
• Шдльц Г., Ширмер Р. Принципы структурной я рганизации 1 белков. — Мл
Мир, 1982.'•. *1'*’.: of. ■-[ ../.7'?.->. ' л >i -,y.-<1 Г
Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая'химяд- - Мй ММ0,<4984. Тг 4; .2;
1985. Т. 3.Ж1 .imb-r.t "г/ <^ ч я
К главе 64
Кантор Ч. Шиммел-П. Биофизическая химия, еМл Мир, 1984. Т. 1/т г’
Шульц Г., Ширмер ' Р. Принципы структурной организации белков -k-М.: Мир, 1982.
Кйрплус М., Мах-Каммон Дж.Э Динамйка белковой структуры//В мире науки. 1986. № 6. С. 4-15..•.
Chothia С. Principles that1 det^rmim the lAructm^ of proteins//Ann.,Bi^ chem. 1984. V. 53. P. 537-572.... .
Ptitsym O.B. Protein Folding: Hypotheses and Experiments//J. Prot. Chem.
1987. V 5. P. 273-293.-.,
Privalov P.L. Stability of Proteins//Adv. Protein ;Cbein.'^ 1979.'V» 83.'^P.
167-241; 1982. V. 35. P. 1-104.* ^
Methods in Enzymology/C.H.W. Hits, S.N. Timashev, Eds. - Enzyme structure.'.
-Academic Press, N.Y., London, 1986. V. 130. Part K; 1986. V. 131. Part L.
Gdhing M.-J., Sambrook K. Protein folding in the cell//Nature. 1992. V. 355. P. • 33-45.
■ К главе 8
Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. - Мл Мир, 1981.
Т. 3.’
К там 91
Glazer A.N. The Chemical Modification of Proteins by Group-Specific and SiteSpecific Heagents//The Proteins/Eds. H. Neurath, R.L. Hill. - N.Y., Academic Press, 1976. V. II. P. 1-103.
К главе 10 "
Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. - Мл Мир, 1980. Л
Дюш Э., Пенни К, Биоорганическая химия. - Мл Мир, 1983.
Schultz G. The Interplay Between Chemistry and Biology in the Design of Enzymatic Catalyst//Science. 1988. V. 240. P. 426-433.
320.•
К new 11
Metkod» m Enzymology, Poettranslational Modifications/F.WoId, K. Moldave, Eds. - Academic Press, N.YM London, Д983. V. 106. Part A; 1984. V. 107. Part B.
Pasttranslational Covalmt Modifications of Proteins/B.C. Johnson, Ed. - Academic Press, N.Y., London, 1983.
.' К пеане 12
Kazird К, Itoh Щ* KWzasa T et al. Structure and Function of Signaltransducing GTP-binding Proteins/ZAnn Rev, Biochem- 1991. У. 60. P._ 349-400.
/. ■ '{'Wh^Y'- vf:- &*ы.: • ь KlW® 13 .*., .
Имхр^лйшх^од ред, У. Пол * М.: Мир,. 1987 Т. 1.-•
..',’£)№',‘1 .КЛШ' !;у^1;1 ? !t:Kl9SW,Ul.; -
Фрейзер Р._ Кератины/Молекулы и клетки. - М. Мир,. 1970. Выл 5, Q 118
133.’. '‘
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ '«>•
Абзимы 249
Аденилатциклаза 269, 290 Аденозинмонофосфат ., .циклический 269,290.,
Адренокортикотропный ,., гормон (АКТГ) 38 АДФ-Рибозилирование 271 Азосочетание 188, Д 95, 196 * Активный центр фермента 207» 225, 226*
Аланин 9*, 19
Алкилборные кислоты 231 .. .f ч ■ Алкилирование карбоксильных групп 190 ," ( ч ,.
- тиоловых групп. 192 Алкогольдегидрогеназа) 153, 240. Аллостерические эффекторы 177 Альбумин сывороточный 56 Альдегид о-фталевый 15 .„ Альдегидопептиды 2321
Аль-лизин 306, 308, 309 * Аминогруппа(ы). аминокислот 8, 12-18 - защита при синтезе пептидов 25 ^-Аминогруппы 183 ^-Аминогруппы лизина 183 Аминокислотный анализ 62 Аминокислоты 7-23 -амиды 16 ;< -аминогруппы 12-15 ,- - анализаторы автоматические 64 - ароматические 69 - ацетилирование 283 - ацилирование 12
-..'•-_- — _* Y - У" -
/Звездочкой отмечены страницы, на или формулы.
ЗЙ
- белковые 7
- гидразиды 73
- гидрофильные 8, 108 р/ . г ч-/' - гидрофобные 7, 69, 73, 108 :q ч- \ - дабсил-производные 64 * ,.• :№'?.!• - доступность боковых цепей для воды 109*, 110,;*', , „->ч« ; i'; a/i
защищенные, симметричные ангидриды 30<. ,а-?ям- .
инвариантные 144, " •иг'' м^
Карбоксильные группы 15-18 •■ -.и; <
кислотно-основные свойства 8 и
С-концевые, определение 73г.-. ^ ‘ - N-концевые, определение 74 л; г У
цебелковые 7 -. • чи> г йо««ч4 .У/ - реакции с металлами.16. >: ”<и . 1 --химические 12 >, .-• ч»Ьш\ и -синтез 18-23.<:;■ Ул
эфиры 16.' ;...V...»41 7. г/. L
Аминолиз а-галоидкарбоновых: кислот
19'‘,^<.--,?г.лш.-./з/
Аминопептидазы 283 У- •, гйл^ .ч
Аминртрансферезы 205 г >•^
ВОС-ангидрид 26, 30*, 32* r..v Ангидриды дикарбоновых кислот, модификация аминогрупп лизина 156- 157* г; ;.<. : Ч- -.:Ги‘' <■*/ 4v'"- ^
Анемия серповидно-клеточная 180
Аниониты 48
Антибиотики пептидные 37 ^ Аятиген(ы) 292, 295 *.а ч - эона связывания 297 . - - центр связывания 295, 297, 298 *
которых помещены рисунки, таблицы
Антитела каталитические 249-251 * - моноклональные 57, 294, 298, 299 * - поликлональные 57
Антрахинонового ряда красители 55
Апоферменты 204
Аргинин 8, 9 *
модификация 196
Аргининянтарная кислота 7
Арены 201, 202*
Арилирование 13, 185
Аспарагин 8, 9 *, 63
Аспарагиновая кислота 8, 9 *, 63
- вьпцепление остатков 71 1
- полуальдегид 7»
- синтез 22
Аспартат 35, 36 *■'
Аспартаткарбамилтрансфераза 162*
Атерокальцин 259
Аутокаталитическая реакция 280
Аутофосфорилирование 285 4
Аффинной хроматографии метод 52
Аффинные реагенты 199
N-Ацетилгалактозамин 262 *
N-Ацетилглюкозамин 260
Ацетилимидазол 186
Ацетилкоэнзим А 283
Ацетилтрансфераза 283
Ацилаза L-аминокислот 20, 21 * 1
О-Ацилмочевина 28, 29* -
Ацилфермент 229
NO-Ацильная миграция 255
Бактериородопсин, ренатурация 138
Белковой молекулы динамика 114- 116*
- уровни организации 60
Белковые кристаллы 117
Белок(ки), активностью управление 161
аминокислотного состава определение 64
Бенс-Джонса 295
^взаимодействие с водой 106, 107
внутримолекулярные перегруппировки 254
выделение 39-58
гель-хроматография 43
гетеромерные 150
гидратация 8
гликозилирование 259
глобулярные, поверхность, структура, форма 113, 114
гомогенность 39, 61
гомомерные 151
денатурация 127
единицы свертывания 122
мембранные 124-126 *
- интегральные 124
- ренатурация 138
методы разделения 51
микрогетерогенность 62
множественные формы 152, 254
модификация котрансляционная 253
- посттрансляционная 253
определение 59
паутины 314
пентамерные 151
первичной и вторичной структур соотношение 99
полусинтез 34
полярные группы Юб
пространственная структура 117
формирование 99
"растрепанные концы" 62
самосборка 60
GTP-связывающие 283
"со свиными хвостиками" 272 г ~
теплового шока 140
тепловые колебания 116
-тетрамерные 151, 152*
гримерные 151
фибриллярные 302 *
физико-химические особенности 42
фосфорилирование 266
функциональных групп реакционная способность 181-183
"химерный" 57 -C-H-ras284, 285* G-Белки 283
Бензилоксикарбонилхлорид 25, 26 *
Бензилоксикарбонильная группа 25
Биполярные ионы 8, 24
Бифункциональные сшивающие реагенты 200
СААХ-Бокс 276
Бора эффект 178
Бромциан 52, 70
Вазопрессин 38
Валин 10 *
Ван-дер-ваальсовы связи 104
Взаимодействия нековалентные 103
Вода, влияние на белок 87 Водородные связи 8, 86, 103, 105 *, 106 *, 153.
Вторичная структура 79-102, 122
- водородные связи 86
- мерцающая 99
- нерегулярные элементы 80
- оптические методы определения 101, 102
- регулярные элементы 80
- устойчивость 98
^-Галактозидаза 58
Гель-хроматография 43
Гем 162, 163*
Гепарин 315
Геранил-геранил-пирофосфат 275 *
Геранил-пирофосфат 275 *
Гетеродимеры 161
Гемоглобин(ы) 163, 167-180
А 179
F (фетальный) 177
R 174, 175
-S180
324
Т 174, 175
аномальные 179-180
Бостон 179
Вена 179
гистидин дистальный 165, 166 *
- проксимальный 165, 166 *, 171
релаксация молекулы 173
Саскатун 179
транспорт СОг и Нг 177
Хаммерсмит 179
четвертичная структура 168, 169 *, 172*
кооперативность 170
функциональная роль 173
Гидантоин 19, 20 *
Гидразинолиз пептидов 73
Гидролазы 205, 233
Гидрофобное ядро белка 108, 111 *,
ИЗ, 164
Гидрофобность аминокислот, способы оценки 107
Гидрофобные контакты 107, 154
Гидрофобный гребень о-спирали 90
Гипервариабельные петли иммуноглобулинов 297 *, 298 *
Гистидин 8, 9 *
алкилирование 195
модификация 195
Гистидиндекарбоксилаза 255 Гликогенсинтегаза 267, 269 * Гликогенфосфорилаза 269 * N-Гликозидная связь 260 О-Гликозидная связь 262, 263 *
Гликозилирование белков 259
Гликолипиды 272, 273 *
Гликопротеины 259-265
функциональная роль углеводных компонентов 263, 264 * Глицеральдегидфосфат 246 *
Глицеральдегидрофосфатдегидрогена- за 95 *
Глицин 8, 9 *
нестандартная конформация 84, 85 * Глобины 162-163
типы 163
Глобула расплавленная 137
Глутамин 8, 9 *, 63,
Глутаминовая кислота 8, 9 *, 63
Глутаровый диальдегид 202
Глутатионредуктаза 97 *
Голоферменты 204
Гомодимеры 161
Гомосерин 7, 71, 78 *
Гомосериндегидрогеназа 22
Грамицидин S 37, 54
Fmoc-Группа 26, 27 *
Гуанидин солянокислый 129, 132, 133 *, 138, 156
Гуанидогруппы аргинина модификация 196, 197*
Дальние взаимодействия в белках 99
Дансилирование 12
Дансилхлорид 12 *, 75
Дансильный метод 75'
Двойных обратных величин метод 212, 213*
Дегидроаланин 40, 256
Дегидрогеназа 205
Дегидрофолатредуктаза 58
Дезамидирование 132
Дезоксигемоглобин 170-172 *, 175
Денатурация 40, 65, 127
тепловая 104
факторы 128-132
Десмозин 312■
Десорбция белков при хроматографии 47, 50, 51 *
Детергенты ионные 130
Диазосоединения алифатические 190
Дииодтирозин 187*, 257*
Дикетопиперазин 24, 25 *
Дикумарин 259
Димер(ы) 151, 169
Диметилаллил-пирофосфат 275 * Динитрофенилирование 13, 74 Динитрофторбензол 13 *, 74, 185 * Диоксиацетонфосфат 246 *, 247 Дипольный момент отпирали 90 Дисперсии оптического вращения метод 101
Дисульфидного обмена реакция 193 Дисульфидные мостики (связи) 8, 111 Дитиоэритрит 133
Дифосфоглицерат 175, 176 * Дифтамид 272
Дифтерийный токсин 272 Диэтиламиноэтил (ДЕАЕ)-целлюлоза 48
Додецилсульфат натрия 130, 157 Домены 118-120* - иммуноглобулинов вариабельные 294, 295 *
- константные 294, 295 * - разделение 279
Зимогены 280
0-Изгиб 96-98 *, 135, 263 Изолейцин 9 *
Изомеразы 206 Изопентенйл-пирофосфат 275 * , Идопептидные связи 23 Изоформы белков 152
Изоэлектрическая точка И * Иммобилизация белков 202 Иммуноглобулин(ы) 56, 292 - антигенсвязывающий участок 299 * - классы 302 - многообразие 301 - сегментная гибкость 296 - G 293, 294 *
Иммунодефицита человека вируса протеиназа 34
Иммуносорбция 56
Ингибирование ферментов 215
- конкурентное 217
- неконкурентное 218
- необратимое 215
- обратимое 217
Ингибиторы сериновых протеиназ 231, 232
Инсулин 34, 36 *, 149, 277
Интегрин 316
Интерлейкин 34
Интерфероны 34
Иодирование 186
Ионы биполярные 8, 24
Калликреин 224
Кальмодулин 269
Кальцитонин 34
Карбамилирование 131
Карбаминовая кислота 178
Карбангидраза 203
Карбобензооксигруппа 25
Карбодиимиды 28, 29 *, 189
N-Карбоксиангидриды 17 7-Карбоксиглутаминовая кислота 258 Карбоксильная(ые) группа(ы) 8 - - активация 28 - - аспарагиновой и глутаминовой кислот 188
- защита 16
S-Карбоксиметилцистеин 66 *
Карбоксипептидазы 54, 73, 74, 182, 220
Карбониевый ион 236
Катализ ферментативный 207
Катализаторы биологические 203
Катепсин D 265
Катиониты 46, 48
Кератин 311, 312*
Киназы 205
Коллаген 302, 305 *, 307 *, 315
температура плавления 305
тройная спираль 304 *, 307 *
Коллагеновые волокна 306, 307 *
326
Конденсация альдольная 310
кротоновая 308
Конканавалин А 149
Консервативные замены 164
Константа диссоциации субстрата 209
ингибирования 216
Михаэлиса 209
- "кажущаяся" 217
- физический смысл 212
скорости бимолекулярная 211, 214
Конформации стабильные 85 *, 86
C-Концевой (аминокислотный) остаток 24
N-Концевой (аминокислотный) остаток 24
Кооперативная система нековалентных взаимодействий 154
Кринглы 119
Лактатдегидрогеназа 152, 243
каталитический центр 244 *
субстрат 244
Ламинин 316, 317 *
Латирин 309
Легглобин 162
Лейцин 9 *
Лейциновые молнии 156, 314
Лиазы 206, 256
Лигазы 206
Лиганды 53, 293
Лизин 8, 9 *, 21
Лизина лактам 21
синтез 22, 23
Лизинлактамаза 21
Лизиноаланин 40, 41 *
Лизиноксидаза 306, 309, 311
Лизинонорлейцин 306, 308 *
Лизоцим 233, 234 *
Механизм действия 237 * 239
Липопротеины 272
/2-Листы 136
упаковка 121
Льдоподобные структуры в воде 106
МалатдегидрогенАза 243
Межсубъединичные контакты 163
Меланоцитостимуяирующий гормон 38
Меркаптоуксусная кислота 132
Меркаптоэтанол 65, 66 *, 132, 137
Металлопротеиназа 54, 69
Метионин 9 *, 19, 63,64 *
модификация 191
Метионинсульфоксид 191
Метионинсульфон 63, 64 * 191
Миоглобин 163-165 *, 167 *
Миристоилирование 273 ‘
Михаэлиса комплекс 207, 208
Моделирования молекулярно-динамического метбд 116
Модификации аминокислот реагенты 183-198’г
Модификация аффинная 183
Модифицирование химическое 180
Fv-Модуль в иммуноглобулине 295
Моноиодтирозин 187
Мочевина 132, 133*, 137, 156
Муреин 233 * -
Мутагенез сайт-специфический 134,
180,198, 232, 237
Муцины 263
Нековалентные взаимодействия в
белке 90, 163
- во вторичной структуре 86
Нидоген 317
Нингидрин 14
цветная реакция с аминокислотами 64
Нитрование 187. '
о-Нитротирозин 187*
Носители макропористые 46
Оборотов число 214
Овокальцин 259
Оксиаминокислота 262
Оксианионная впадина 228-230 *
Оксигемоглобин 170-172*
Оксидаза 205
Оксидоредуктазы 205
Оксипролин 303-305 *, 316
N-Оксисукцинимид 29 *
Окситоцин 38
Оксониевый ион 236
Олигосахаридтрансфераза 262
Омыления реакция 16
Онкобелки 271, 284
Онкоген 287
Остеокальцин 259
Паули реакция 188, 196
Пентафторфенол 29 *
Пепсиноген 282
Пептид(ы) 23
активационный 280-
способы получения 34 я ’
определение первичной структуры 73,74
предшественники регуляторных пептидов 38
природные 36
свойства 24
синтез ферментативный 36
- твердофазный метод 32
- химический 25
Пептидидбромметилкетоны 200
Пептидная связь 23, 80, 81
- образование 28
-'расщепление 70
- tjac, транс 81 *-83
- изомераза 139
Пептидные петли, роль в нековалент- ных взаимодействиях 155,156
Первичная(ые) структура(ы) 59-79, 141
- методы определения 65
- эволюционно отобранные 141
последовательности, задающие
повороты пептиднрй цепи 144
,327
•Полиакриламид 43
Полибелки 59, 158
разделение 278
Полипептиды 23
-Полипептидная цепь неупорядоченная 65- „
- пути свертывания 134-136 * RCD-Последовательность 315 Посттрансляционной модификации реакции 7<
Пренилирования реакция 274
Пренилтрансфераза 276 ■
Проинсулин 35, 278
Прокарбоксипептидаза £82
Проколлаген 306
Проколлагенпептидаза 306 ..
Пролин 10 *, 310
Простетическая группа 162
Пространственная структура белка, - ’ связь с первичной структурой 141
Протеиназа(ы) 205
аспартильные 258
сериновые 68, 69, 220
- активный центр 225, 226 *
- катализ 225
- механизм действия 227 *, 228, 231
системы свертывания крови, механизм действия 281-282
Протеинди сульфидизомераза 138, 139*
Протеинкиназы 150, 265
специфичность вторичная 67
- первичная 67
Протеогликаны 259s
Протеолиз глубокий 276 .
ограниченный 276, 277
Протоонкобелки 284
Протоонкоген 287
Проферментов активация 280 - - биологический смысл 282 , Процессинг 60, 253,260 328
Районы иммуноглобулинов, определяющие комплементарность 298
Рамачандрана карта 84, 85 *, 91, 96, .97*
’’Растрепанные концы” 282
Рацемазы 21, 206
Рацематы аминокислот 20 - - способ разделения 20 Рацемизация 31
Резус-фактора белок 274 Ренатурация белка 132 - кинетика 133 *-136 Ретровирусы 279 РНК-полимераза 151 Росттрансформирующий фактор а 33 Руеманна фиолетовый 14 *
Связь ионная 16
координационная 16
Секвенатор(ы) автоматический(е) 77 - газофазный 79 Серин 8, 9 *, 103 *
Серицин 314
Сефадекс 43
Сефароза 43, 50, 52
Сиаловая кислота 265
Синтез белков de now 148 Синтетазы 206 ^Складчатые листы 93, 153 ^Складчатого слоя формирование 155 ДСлой 93, 94 * Соединения включения 106 о-СЦираль(и) 80, 88, 97 *, 123, 136 * - амфифильная 91 - гидрофобная 91 - гребни 121 - левая 85 * 88, 97 * - нековалентные взаимодействия 155 - правая 85 *, 88, 89 * - упаковка 121, 122 Специфичность ферментов субстратная'205
Сплайсинг альтернативный 290 *
Стереоизбирательность реакции 22
Стереохимического кода выраженность 147
Стресс-белки 140и
^-Структура. 80, 91, 96 */ 97 * - антипараллельная 85 *, 86, 92-93 *, 314
нерегулярная 80': *■
параллельная 85 *; 86, 91 *, 92
регулярная 80>
^Структурных отрезков взаимодействие 155- - '
Субтилизины 220
Субстрата связывание 220 - • •
Субъединицы, зона контакта 161, 162 *
Сульфгидрильных групп окисление 193*
Сульфопропилсефадекс 48 j
Сульфоцистеин 66 *
Супервторичная структура 94
Таутомеразы 206
Тела включения 137.г.
Термолизин 69
Тиоредоксин 138, 139 е •
Тиреоглобулин 256, 257 *
Тирозин 10*, 187*, 188*
иодирование 256
Тирозинкиназы 270
Тироксин 257 *
Титин 316
Тойоперл 43 44
Токсинов белковых механизм действия 279
Трансаминазы 205
Трансдуцин 288, 289 *
Трансферазы 205
Треонин 8,9*
Tpem-бутиловые эфиры 16, 26, 28 *
Tpem-бутоксикарбонильная группа 26
Третичная структура белка 88, 94, 101-148, 155
дестабилизация 107
образование из элементов вторичной структуры 121
- - перенос эффекта на значительные расстояния 173
стабильность 103
Трикетогидриндегидрат 14
Триозофосфатизомераза 246
каталитический центр 246 *
Трипсин 68, 224 *, 280 *
ингибитор 34
электростатическое взаимодействие 68
Трипсиноген 280
Триптофан 10 *
модификация 197
Тропоколлаген 304, 306 *
ТропоэласГИн 311
Туникамицин 262
Уравнение Михаэлиса - Ментен 208- 211
Фактор роста эпителия 34
Фарнезил-пирофосфат 275 *
Фотоактивируемая фенилазидная группировка 201 х
Фенилаланин 9 *, 15, 20, 22
Фенилизотиоцианат 17, 75
Фенилсефароза 50 *,
Фенилтиазолинон 76
Фенилтиогидантоин 18
Фенилгидантоиновый метод 75, 76 *•
Фенилтиокарбамил-аминокислота 17, 18*
Фенольные группы тирозина, модификация 186
Фермент-субстратный комплекс 207, 208 *, 226
- переходный, модель 221
Ферменты 203-253 - ингибирование 215 - катализ 207 - - кинетика 208 - международная классификация 205 - механизм действия 242 - предшественников активация 280 \ - протеолитические 41 - систематика 204.
Ферримиоглобин 167 Фиброин шелка 314 Фибронектин 315.
Флуоренилметилоксикарбонильная
' '■ труппа 26.
Формилаза 282
Фосген 17
Фосфодиэстераза 269,,, .
Фосфопротеинфосфатазы 267-269 *
Фосфопротеины 266
Фосфорилазы 266-268 - активация 267,
Фосфорилирование белков 266
Фрагмент антигенсвязывающий . иммуноглобулина 296,
ГаЬ/-Фрагмент 295 (ГаЬ)2-Фрагменты 296 Fc-Фрагмент 295
Химотрипсин 69, 220
Химотрипсиноген 281
Хелатные структуры 17
Хроматография аффинная 52
жидкостная 34
- быстрая (FPLC), метод 50
- высокоэффективная (ВЭЖХ) 72
гидрофобная 50 - ионнообменная, метод 46, 49 *
Хромофоры 101
, Цвиттер-ионы 8
Циклопептиды 37
Циклоспорин 37,140
Циклофилин 140
Цистеин 8, 9 е, 63 е, 192 е
модификация 192
Цистеиновая кислота 63 *
Цистин 8, 63 е
Цис, транс-изомеризация пептидной связи 139.
Четвертичная структура ИЗД 2 - - анализ функциональной роли
158 62,.
,- - кооперативные эффекты Щ. ,, • - - способы пяткой диссоциации 156 - - стехиометрии определение 150, 158,
Шаперонины 141" t
Шапероны ГО,. v у
Шарнирный участок в иммуцо- • глобулинах 296 , -.
.Шиффа основание .13, 14е, 185, 308е
.ч . . -" -V f-'^ V
Экзоны 310* -'
Экзопептидазы 73
Эластин 310
Электростатические контакты 104
Эллман® реактив 193, 194 * .
Эндопротеиназы 69•
Энзимы 204
Энкефалины 38, 39 *.
Энтеропептидаза 58, 280
Эпитоп 298, 300,
Эстеразы 206. ,
Эфиры активированные 29* \
Ядерного магнитного резонанса метод . 118, 136 е
Циклоизомеразы 206
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие 3
Введение 5
Глава 1. Аминокислоты'., 7
Кислотно-основные свойства аминокислот ....' 8
Химические реакции «-аминокислот 12
Реакции аминогрупп ...л 12
Реакций карбоксильных групп 15
Реакции с совместным участием «-аминной и «-карбоксильной групп'.'..../...*. 16
Методы синтеза «-аминокислот 18
Химический синтез.’ 18
Разделение рацемических аминокислот 20
Ферментативный синтез аминокислот 22
Микробиологический синтез аминокислот".^!..."22
Глава 2. Пептиды.'.'.23
Химические свойства пептидов 24
Химический синтез пептидов".; 25
Защита аминогруппы 25
Защита «-карбоксильной группы 28
Образование пептидной связи 28
Тактика пептидного синтеза 31
Ферментативный синтез пептидов 35
Природные пептиды ; 36
Глава 3. Выделение белю® 39
Особенности выделения белков 40
Характерные свойства белков, на которых основано их разделение 42
Разделение белков по молекулярной массе. Гель-хроматография (гель-фильтрация) 43
Ионообменная хроматография белков 46
331
Гидрофобная хроматография белков — 50
Аффинная, или биоспецифическая, хроматография белков 51
Иммуносорбция? 56
Перспективы использования белковой инженерии для выделения белков.' 57
Глава 4- Первичная структура белка - 59
Первичная структура как уровень организации белка 59
Доказательство индивидуальности белка. Микрогетерогенность белков. 61
Определение аминокислотного состава белка 62
Методы определения первичной структурыti65
4-4.1. Подготовка белка к анализу; 65
Ферментативные методы фрагментации полипептидной цепи 67
1 4.4.3. Химические методы специфического расщепления пептидных связей 70
Разделение пептидов, полученных фрагментацией полипептидной цепи 72
Определение первичной структуры пептидов 73
Определение С-концевых аминокислот л. 73
Определение N-концевых аминокислот и последовательностей 74
Глава 5. Вторичная структура 79
Структурные особенности пептидной связи 80
Стерические ограничения и вторичная структура пептидной цепи ...... 83
Роль водородных связей в формировании вторичной структуры 86
а-Спираль 88
^-Структура 91
^-Изгиб 96
Об устойчивости вторичной структуры 98
О соотношении между первичной и вторичной структурами99
Оптические методы изучения вторичной структуры 101
Глава б. Третичная структура белка._ 102
Стабильность пространственной структуры белках 103
Гидрофобное ядро „ 108
Роль дисульфидных связей в стабилизации третичной структуры некоторых белков - 111
Форма, компактность и динамика молекулы белка 113
Особенности рентгеноструктурного анализа как главного источника информации о пространственной структуре белка 117
Домены в белках ....; 118
Образование третичной структуры белка из элементов вторичной структуры. 121
Топология полипептидных цепей в белках и классификация пространственных структур.’ 122
Особенности структуры мембранных белков 124
Денатурация белка 127
Ренатурация белка 132
О соотношении между первичной и пространственной структурами белка 141
Глава 7. Четвертичная структура белка 148
Стехиометрия и геометрия четвертичной структуры 150
Взаимодействия между субъединицами, стабилизирующие четвертичную структуру.' 153
Структурная организация контактов между субъединицами 155
Способы исследования четвертичной структуры 156
Функциональное значение четвертичной структуры белка 158
Глава 8. Глобины*. 162
Миоглобин....... 164
Гемоглобин 167
Четвертичная структура гемоглобина 168
Присоединение кислорода к гемоглобину и сопровождающие его изменения третичной структуры 170
Функциональная роль четвертичной структуры гемоглобина 173
2,3-Дифосфоглицерат - эффектор, регулирующий функцию гемоглобина 175
Участие гемоглобина в транспорте СОг и ионов водорода 177
Аномальные гемоглобины 179
Глава 9. Химическое модифицирование белков 180
Особенности метода химического модифицирования* 181
Типовые реакции химической модификации функциональных .
групп белка 183
е-Аминогруппы 183
333
Фенольные группы тирозина ...... 186
Реакции карбоксильных групп'. ....188
Модификация остатков метионина.*". 191
Модификация остатков цистеина-. 192
Модификация имкдазольнбй группы гйстидина....Л 195
Модификация гуанидогруппы аргинина; 196
Модификация индола в триптофане".,..197
Области применения метода химического модифицирования198
Химическое модифицирование как способ выявления роли функциональных групп белка"..'.... 198
Аффинные реагенты 199
Химическое модифицирование в изучении межмолекулярных комплексов и синтезе конъюгатов белков 200
Другие области применения химического модифицирования " белков 202
Глава 10. Феженты ' 203
Систематика ферментов .'. 204
Общие понятия ферментативного катализа.,207
Оснрвные положения кинетики ферментативного катализа 208
Ингибирование ферментов 215
10-5.. Сериновые протеиназы'..' 220
Связывание субстрата., 220
Каталитический механизм;.'.'_ 225
Лизоцим"^. 233
Алкогольдегидрогеназа _. :...240
Лактатдегидрогеназа 243
Триозофосфатизомераза 246
Каталитические антитела ("абзимы"). 249
Глава 11. Посттрансляционная модификация белка 253
Внутримолекулярные перегруппировки в белках 254
Иодирование остатков тирозина 256
Образование остатков 7-карбоксиглутаминовой кислоты 258
Гликозилирование белков. Гликопротеины 259
N-Гликопротеины 260
О-Гликопротеины 262
Фосфорилирование белков. Фосфопротеины 266
' 11.6. ADP-рибозилирование; 271
Липопротеины 272
334
Ц.7.1. Липопротеины с С-концевым гликолипидом,.,..,.. 272
. 41.7^2. Липопротеины с N-концевой липидной группировкой ..«j.....273
‘,11.7.3. Пренилированные белки ...'...'..,....,.,....:.,........ 274
Д1,8. Ограниченный протеолиз.-.,,,..,2..-.»».276
, 11.8.1. Формирование бедка неканонической структуры. Биосинтез ид- ,
1 ^сулина .........,,..»...,-....„.» 277
Разъединение белковых глобул в.полибелках.....,«,..,..,.,....,>..;. ,278
* 11.8.3. Разделение доменов »».•••« ^ .»-279
етимцщ 1р*едщественяиков ферментов ........т.......;..»,..^.....,...», 280 11.9. Процессинг аминоконцевого района белка.,..»....„,.„t...........282
Г^ова 18. G-белкм ................,...ч 283
12Л. Белок с-Н-газ „....,...,....»...»...............,.,v..у 284
.12,2. Трансдуцин 288
Стимулирующий белок Gs и ингибирующий белок Gt аденилатциклазной системы...»„,.».'290
Глава 18. ТАммутоглвбулмны.»■ ;»..',292
. 13.1. Молекулярная организация иммуноглобулина G.»».„-.. 293
Центр связывания антигенов„.. 297
Многообразие иммуноглобулинов...»..,..,»,»».,.^»„301
Глава Ц. Фибриллярные белки ..,»3Q2
Коллагет 302
Эластин......,,L...310.
Кератины 311
Фиброин шелка,...;....,.,.„.... ЗИ
Фибронектин 315
Ламинин ?...,....,...M....,.,,r...„,.„.,„,J.^. ЗШк
Рекомендуемая литература .2»..,.' 319
Предметный указатель 322
• Учебное издание
Степане» Валентин Михайлович "
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ.
СТРУКТУРА и ФУНКЦИИ БЕЛКОВ‘ •. '*^ * ; ицн ч-* л - *4^
Редактор АС. Орлова. Художник Ю.Г. • Черепанов. Художественный редактор Е.А. Вишнякова Технические редакторы Е.И. Герасимова, Л\А. Овчинникова Корректор Г.И. Кострикова Оператор В.Н. Дум/Sap
ИВ № 9592
ЛР № 010146 от. $5.12.91. Изд. № Х/Е-77. Сдано в набор 13.12.93.
Подл, в печать 16.01.96., Формат 60x88Vi6- Бум. газетн.
Гарнитура "Русская”. Печать офсетная. Объем 20,58 усл печ. л. 20,58 усл.кр.-отт. 21,35 уч.изд.л. Тираж 5000 экз. Зак. №56
Издательство "Высшая школа", 101430, Москва, ГСП-4,Неглинная ул, д. 29/14.
Набрано на персональном компьютере издательства.
Отпечатано в АООТ "Оригинал", 101898, Москва, Центр,
Хохловский пер. 7. • .•
• о-аминогруппой
В последнее время, особенно в автоматическом синтезе пептидов, все чаще используют 9-флуоренилметилоксикарбонильную группу (Fmoc-группу). Ее вводят, действуя на аминокислоту или пептид соответствующим Хлорангидридом:
Вызывает элиминирование водорода, указанного стрелкой.
В целом никакого выигрыша в числе водородных связей при свертывании глобулы произойти не цожет так как одновременно утрачиваются водородные связи цепь — вода. Важно, чтобы неизбежный проигрыш —снижение числа водородных связей в результате того, что при свертывании какие-то полярные группы, погрузившись в глобулу,
не найдут партнера и не смогут образовывать водородной связи, —. не оказался слишком значительным (этим-то и диктуется необходимость образовать максимально высокое их число внутри глобулы: как уже отмечалось, не менее 90%). Понятно, что столь высокая степень насыщения глобулы водородными связями не может быть реализована хаотически. Гораздо эффективнее в этом смысле регулярные элементы вторичной структуры.
При свертывании глобулы убывает энтропия пептидной ^спи, но одновременно происходит возрастание энтропии растворителя — воды. Последнее играет, решающую роль в стабилизации третичной структуры белка, что объясняется следующими соображениями.
IN—Ацетилгалактозамин
В. М. Степанов
«жж
3 /
Структура и функции белков
В. М. Степанов
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
Структура й функции белков
Под редакцией академика А.С. Спирина
Рекомендовано Государственным комитетом Российской Федерации по высшему образованию . в качестве учебника для студенте» ■ высших учебных заведений, • обучающихся по направлению и специальности "Бислогия"■
МОСКВА "ВЫСШАЯ ШКОЛА" 1996
ББК 28.070
С 79
УДК 577.2
Федеральная целевая программакнигоиздания России
Издание осуществлено при поддержке Российского фондафундаментальных исследований по проекту 96-04-28700
%Рецензенты:..
. кафедра биохимии Московского государственного университета . им.
М.В. Ломоносова (зав. кафедрой - проф. А.Д. Виноградов); ..
проф. Ю.П. Винецкий (Государственный научно-исс тедовател>ский ин-т генетики и селекции промышленных микроорганизмов)
J
■ Стеванов В.М.
079 Молекулярная биология. Структура й функции белков: Учеб, для биол. спец.. вузов/Под реД. А.С.Спирина. -^ М.: Высш, шк., 1996. — 335 с.: ил.■
, ISBN 5-06-002573-Х
Книга завершает ряд учебников по теме "Молекулярная биология" ("Моле- к^уфная биология. Структура рибосомы и биосинтез белка" - 1986 г.; "Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот" - 1989 г.). В ней рассмотрены основные черты строения и функционирования белков,; 'все уровни ' организации структуры этих биополимеров. Обсуждены особенности функци$яироваиия важнейших типов белков - ферментов, транспортных, фибриллярных; кратко рассмотрены свойства аминокислот и пептидов, реакции посттрансляционной модификации. *
,1909010000 * 054 ,ВВК28.О7О
С ""<&(<«)-■В7А
‘ N 5-06-002573-Х' '© В.М.Степанов, 1996 (