Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
Предисловие редактора перевода
Совсем недавно слово «биотехнология» отсутствовало в нашем языке; вместо него мы употребляли слова «промышленная микробиология», «техническая биохимия» и т. п. Новый термин, объединивший в себе все прежние названия, появился примерно 10 лет назад. Это незначительное на первый взгляд событие нельзя сводить только к тому, что кому-то посчастливилось придумать удачное слово; за ним кроются гораздо более глубокие причины. Биология, составляющая научную основу любых практических использований биологических процессов и систем, за последние несколько десятилетий сделала огромный скачок на пути познания жизненных явлений, и прежде всего в области микробиологии, энзимологии, молекулярной биологии и молекулярной генетики. Новые открытия объединили разрозненные прикладные направления, подвели под них единую фундаментальную основу. В результате биотехнология стала наукой о практическом использовании биологии в целом, а не отдельных ее ветвей, как это было прежде. В этом именно и заключается подлинный смысл явлений, отмеченных введением нового термина.
Еще с конца прошлого столетия микроорганизмы стали основой производства целого ряда полезных продуктов (органических кислот, этанола для технических целей, ферментов, витаминов, антибиотиков и т. п.). Они нисколько не утратили своего значения и сейчас, оставаясь главными《машинами》биологического производства. Более того, перспективы их дальнейшего применения вырисовываются все яснее. Достаточно указать, что из всего огромного разнообразия микроорганизмов, существующих в природе, используется лишь незначительная их часть, и притом не самым эффективным образом, поскольку наши знания о генетике и биохимии микроорганизмов не всегда достаточны.
Лишь в недавнее время стали использовать для практических целей растительные клетки, а животные клетки отчасти вследствие дороговизны их культивирования нашли лишь ограниченное применение, главным образом для получения моноклональных антител. Но методы, основанные на культивировании и растительных, и животных клеток все же пробили себе дорогу в биологическую промышленность и со временем, по-ви- димому, найдут здесь более широкое применение.
Уже используются в биологической промышленности разнообразные биомолекулы, особенно ферменты, и из них в первую
очередь амилазы и протеазы (они применяются в пивоварении и производстве моющих средств). Однако нестойкость и относительная дороговизна ферментов сдерживает внедрение их в промышленность. Крупным успехом стало создание иммобилизованных ферментов, что позволило решить по крайней мере часть технологических проблем.
И все же первое место в современной биотехнологии принадлежит, конечно, генетической инженерии (технологии рекомбинантных молекул ДНК). Она предоставила исследователям новую, исключительно ценную возможность — изменять генетическую программу бактериальных, растительных и животных клеток, и тем самым как бы завершила формирование биотехнологии. Вероятно, поэтому само название «биотехнология» появилось после того, как возникла генетическая инженерия.
Мы надеемся, что предлагаемый вниманию советских читателей перевод книги «Биотехнология», изданной в Англии в 1985 г., будет весьма полезным, поскольку у нас в стране нет подобных руководств, а в них испытывается нужда. В книге намечены исторические корни биотехнологии, что позволяет проследить весьма своеобразные пути ее развития. Большое внимание уделено традиционным отраслям биотехнологии, так как увлечение новыми направлениями не должно приводить к забвению старых, которые и теперь составляют главную часть биологического производства.
Книга отражает в значительной степени опыт и подходы английских биотехнологов (за исключением трех, все авторы англичане), но это нисколько не умаляет ее достоинств. Главы несколько неравномерны по объему и содержанию, поскольку они написаны разными авторами. Можно спорить, следовало ли включать в 10-ю главу подробные математические выкладки, касающиеся работы различных биореакторов, но, вероятно, и в таком виде эта часть книги найдет своего читателя.
В книге часто обсуждаются экономические аспекты применения биотехнологии, что особенно ценно сейчас, когда в нашей стране происходит перестройка экономической системы.
Биотехнология многолика и по своим историческим корням, и по своей современной структуре, объединяющей элементы фундаментальных наук и таких прикладных отраслей, как химическая технология, машиностроение и экономика. Поэтому по биотехнологии могут быть написаны разные книги, и это руководство представляет собою одно из возможных.
В заключение хотелось бы поблагодарить аспирантку кафедры математического моделирования МХТИ им. Д； И. Менделеева В. В. Софенину за помощь при редактировании гл. 10.
Цель этой книги — дать читателю полное, глубокое представление о том, что такое современная биотехнология. Корни ее уходят в далекое прошлое, а будущее обещает быть блестящим. Хочется думать, что наш труд окажется полезным как для исследователей в этой области, так и для биотехнологов-практиков, которые хотят расширить свой кругозор. Мы не пытались написать исчерпывающий обзор, однако считаем, что эта книга может стать хорошим введением в большинство главных проблем биотехнологии, которые освещены в ней ведущими специалистами, Для тех, кто пожелает ознакомиться с этими проблемами более глубоко, мы после каждой главы приводим обширные списки литературы.
Работа над этой книгой была начата одним из ее редакторов за четыре года до выхода издания в свет. Отсюда вовсе не следует, что авторы пренебрегали своими обязанностями: просто практические исследования оставляли им слишком мало свободного времени. За этот период число редакторов книги выросло от одного до трех, но некоторых рукописей мы так и не получили! Будем надеяться, что они будут опубликованы во втором издании.
Редакторы хотели бы выразить свою благодарность некоторым авторам этой книги, представившим рукописи за три года до выхода ее в свет, за проявленное ими долготерпение. Мы хотели бы также поблагодарить всех авторов и издательство за их стремление довести наше общее сложное дело до успешного завершения. Мы рады, что нам удалось выступить единым фронтом, и надеемся, что наши читатели получат от этой книги и пользу, и удовольствие.
Авторы гл. 3 хотели бы поблагодарить д-ра Дж. Эделмена, руководителя исследований в RHM PLC, за разрешение опубликовать результаты, а также администрацию Frish Dites Partnership за информацию о микопротеине. Авторы гл. 4 и 6 выражают свою благодарность г-же Д. Фаулер, выполнившей рисунки. Автор гл. 9 искренне признателен своим коллегам по Ротамстедской экспериментальной станции за фотографии, иллюстрирующие текст: д-ру Барбаре Мосс (рис. 9.1 и 9.2), д-ру Д. Хеймену (рис. 9.3—9.6), д-ру М. Джонсу (рис. 9.7 и 9.8) и д-ру Р. Нелсону (рис. 9.9 и 9.10).
Биотехнологический центрЯ. Дж. Хиггинс
Кренфилдского технологическогоД. Дою. Бест
института, сентябрь 1984 г.〃宛.Джонс
Глава /
Что такое биотехнология?
И. Хиггинс
Введение
Биотехнология — это не просто новомодное, броское название одной из древнейших сфер деятельности человека; так могут думать одни только скептики. Само появление этого термина в нашем словаре глубоко символично. Оно отражает широко распространенное, хотя и не общепринятое мнение： считается, что применение биологических материалов и принципов в ближайшие десять — пятьдесят лет радикально изменит многие отрасли промышленности и само человеческое общество. Нетрудно убедиться, что интерес к этой науке и темпы ее развития в последние годы росли очень быстро. Свидетельств тому множество. Это и появление бесчисленных небольших частных биотехнологических фирм, и образование правительственных комитетов, призванных оценить возможности нового направления, и чтение лекций по биотехнологии во многих университетах. Правительства большинства наиболее развитых стран, как, впрочем, и ряда развивающихся, уже вложили значительные средства в развитие биотехнологии. Надо сказать, что как размеры этих вкладов, так и эффективность их использования далеко не одинаковы. Специалисты, участвующие в развитии биотехнологии, единодушно считают, что в масштабах государства успех в этой области может быть достигнут только при участии правительственных органов. Их поддержка чрезвычайно важна для развития этой сложной междтгсципли-нарной технологии. От появления идеи до ее воплощения в разных отраслях биотехнологии лежит большой путь, и лишь в немногих странах, в частности в США, действуют сегодня адекватные экономические механизмы, создающие основу для оптимального развития этой технологии, причем в значительной мере независимого от администрации.
Может быть, правильнее всего называть биотехнологией использование в промышленности биологических систем или процессов. В основе ее лежит уникальность биологических систем в отношении узнавания и катализа. Проявляется это при распознавании других биологических систем или определенных хи-
мических соединений, а также в удивительной способности ферментов катализировать широкий спектр химических реакций в мягких условиях. Даже сегодня химикам не удается создать катализаторы, превосходящие по своей эффективности и специфичности биологические катализаторы, кроме того, наши знания о механизмах ферментативного катализа остаются весьма скудными. Несмотря на все достижения химии, которые лежат в основе многих отраслей промышленности, мы еще очень мало знаем о природе катализа.
Человек использовал биотехнологию многие тысячи лет: люди занимались пивоварением, пекли хлеб. Они придумали способы хранения и переработки продуктов путем ферментации (производство сыра, уксуса, соевого соуса), научились делать мыло из жиров, изготавливать простейшие лекарства и перерабатывать отходы. Однако только разработка методов генетической инженерии, основанных на создании рекомбинантных ДНК (гл. 7), привела к тому «биотехнологическому буму》，свидетелями которого мы являемся. Эти методы не только открывают возможности улучшения уже освоенных процессов и продуктов, но и дают нам совершенно оригинальные способы получения новых, ранее недоступных веществ, позволяют осуществлять новые процессы. Сама история этой науки ——генетической инженерии — яркий пример того, как сложно прогнозировать внедрение в практику достижений фундаментальных наук. Разработка технологии рекомбинантных ДНК—результат значительных вложений в развитие молекулярной биологии за последние сорок с лишним лет. А ведь не так давно, в конце 60-х годов, многие биологи сетовали, что слишком уж много внимания уделяется этой престижной области биологии и химии, которая не дает ничего полезного. Сегодня нам ясно, что открытия молекулярной биологии глубоко скажутся на судьбе человечества.
Хотя популярность биотехнологии обусловлена главным образом использованием технологии рекомбинантных ДНК, нужно подчеркнуть, что и в других областях науки был сделан ряд крупных открытий, повлиявших на ее развитие. Наиболее важные в этом плане достижения отражены в табл. 1.1. Их вклад в различные отрасли биотехнологии обсуждается в последующих главах этой книги.
Вряд ли найдется иная, помимо биотехнологии, область науки, к которой так подходят следующие слова: 《Нет и еще тысячу раз нет: я не знаю такой науки, которую можно было бы назвать прикладной. Есть наука и есть области ее применения, и они связаны друг с другом, как плод с взрастившим его деревом» (Пастер, 1871; цитата взята из Revue Scientifique).
Таблица 1.1. Области науки, в которых недавно были получены новые результаты, важные для развития биотехнологии
Генетическая инженерия (технология рекомбинантных ДНК)
/Ферменты (выделение, иммобилизация, стабилизация)
Биокатализ 〈
'Целые клетки микроорганизмов и клетки макроорганизмов (иммобилизация, стабилизация),
Иммунология (особенно моноклональные антитела)
/Производство
Технология ферментации〈
'Переработка отходов
Биоэлектрохимия
Использование научных достижений в биотехнологии тесно связано с фундаментальными исследованиями и осуществляется на самом высоком уровне современной науки. Удивительная научная многоликость биотехнологии, о которой уже шла речь, отчетливо видна из рис. 1.1. Не все перечисленные на нем от-
Организация/КоординацияОрганизация/КоординацияГенетимеГенетимеМикробиологияМикробиологияЭлектроникаЭлектроникабиотехнологиябиотехнологияимическаяимическаятехнологиятехнологияБиохимия/Биохимия/ХимияХимия1к4еканическая1к4еканическаятехнологиятехнологияНаучныеНаучныеосновыосновы—попученин—попученинпищевыхпищевыхпродуктовпродуктовТехнологияТехнологияпищевомпищевомпромышлен-промышлен-БиохимическаяБиохимическаятехнологиятехнологияРис. 1.1. Междисциплинарная природа биотехнологии.Рис. 1.1. Междисциплинарная природа биотехнологии.
Организация/Координация
Организация/Координация
Генетиме
Генетиме
Микробиология
Микробиология
Электроника
Электроника
биотехнология
биотехнология
имическая
имическая
технология
технология
Биохимия/
Биохимия/
Химия
Химия
1к4еканическая
1к4еканическая
технология
технология
Научные
Научные
основы
основы
—попученин
—попученин
пищевых
пищевых
продуктов
продуктов
Технология
Технология
пищевом
пищевом
промышлен-
промышлен-
Биохимическая
Биохимическая
технология
технология
Рис. 1.1. Междисциплинарная природа биотехнологии.
Рис. 1.1. Междисциплинарная природа биотехнологии.
расли науки вносят свой вклад в осуществление каждого конкретного биотехнологического процесса или в получение того или иного продукта, но, как правило, таких отраслей несколько.
В наши дни определилась одна важная особенность развития некоторых перспективных разделов биотехнологии: необходимость тесного международного сотрудничества специалистов, ученых и технологов. Дело в том, что лишь немногие научные коллективы в мире обладают достаточным опытом работы в этой области. Ярким примером тому служит многонациональ-
ность ряда основанных в последние годы крупнейших международных биотехнологических фирм.
В заключительной части этой главы мы вкратце остановимся на проблемах развития и перспективах основных направлений биотехнологии, а также рассмотрим некоторые экономические вопросы. Это будет своего рода вступлением к более детальному обсуждению задач биотехнологии в последующих главах.
12 Исторические перспективы
До тех пор, пока всеобъемлющий термин «биотехнология» не стал общепринятым, для обозначения наиболее тесно связанных с биологией разнообразных технологий использовали такие названия, как прикладная микробиология, прикладная биохимия, технология ферментов, биоинженерия, прикладная генетика и прикладная биология. Если не принимать в расчет производства мыла, то первая же из числа возникших «технологий» такого рода стала предшественницей прикладной микробиологии. Наши предки не имели представления о процессах, лежащих в основе таких технологий. Они действовали скорее интуитивно, но в течение тысячелетий успешно использовали метод микробиологической ферментации для сохранения пищи (например, при получении сыра или уксуса), улучшения вкуса (например, хлеба и соевого соуса) и производства спиртных напитков. Пивоварение до сих пор остается наиболее важной (в денежном исчислении) отраслью биотехнологии. Во всем мире ежегодно производится около 1011 литров пива стоимостью порядка 100 млн. фунтов стерлингов. В основе всех этих производств лежат реакции обмена веществ, происходящие при росте и размножении некоторых микроорганизмов в анаэробных условиях. В конце XIX в. благодаря трудам Пастера были созданы реальные предпосылки для дальнейшего развития прикладной (технической) микробиологии, а также в значительной мере и биотехнологии. Пастер установил, что микробы играют ключевую роль в процессах брожения, и показал, что в образовании отдельных продуктов участвуют разные их виды. Его исследования послужили основой развития в конце XIX и начале XX вв. бродильного производства органических растворителей (ацетона, этанола, бутанола и изопропанола) и других химических веществ, где использовались разнообразные виды микроорганизмов. Во всех этих процессах микробы в бескислородной среде осуществляют превращение углеводов растений в ценные продукты. В качестве источника энергии для роста микробы в этих условиях используют изменения энтропии при превращениях веществ. Совсем иначе обстоит дело в аэробных процессах при контролируемом окислении химических веществ до углекислого
газа и воды. При этом организмы извлекают гораздо больше энергии.
Процессы такого рода, в которых биомасса, т. е. возобновляемый источник сырья, используется для получения химических веществ, играли ведущую роль на первом этапе развития современной биотехнологии. По мере становления нефтехимии на смену многим из них пришли химические процессы. В тех случаях, когда некоторые химические соединения, например цитрат, ацетат и итаконат, широко использовались при производстве пищевых продуктов, их продолжали получать путем брожения, самым выгодным с экономической точки зрения путем. В некоторых странах (например, в Италии) таким способом вырабатывали даже технический этиловый спирт. Сегодня под влиянием энергетического кризиса производство спирта из растительного сырья получает все более широкое распространение в США и Бразилии и, видимо, вскоре выйдет на первый план в странах Дальнего Востока.
Сахара
Фру к тозо-1,6-дифосфат
Дигидроксиацетонфосфат < -'L-NADHV►NAD* 1「лицерол-fX -фосфатIДигидроксиацетонфосфат < -'L-NADHV►NAD* 1「лицерол-fX -фосфатI厂 лииерапьАе「РШ-3-фос4>ат厂 лииерапьАе「РШ-3-фос4>атРеакции Эмбдена- МейергофаРеакции Эмбдена- МейергофаПируватПируват
Дигидроксиацетонфосфат < -'
L-NADH
V►NAD* 1
「лицерол-fX -фосфатI
Дигидроксиацетонфосфат < -'
L-NADH
V►NAD* 1
「лицерол-fX -фосфатI
厂 лииерапьАе「РШ-3-фос4>ат
厂 лииерапьАе「РШ-3-фос4>ат
Реакции Эмбдена- Мейергофа
Реакции Эмбдена- Мейергофа
Пируват
Пируват
■СО2■СО2
■СО2
■СО2
Глицерол
NAD* у Обь1чныи Ацетальдегид
Этанол у— —^^«£^— —Н50з~
Ацетальдегид бисульфит,примесное соединение
Рис. 1.2. Переключение спиртового брожения у дрожжей на образование глицерола.
Возвращение к производству органических соединений путем брожения вполне возможно, но в Европе это будут скорее всего лишь наиболее дорогостоящие вещества. Очевидным исключением здесь может быть превращение в технический спирт винных рек ЕЭС. Это, конечно, странная политика, странная биотехнология и по меньшей мере необычная экономика, предлагающая химической промышленности нечестные условия соревнования.
На рис. 1.2 показано, какие биохимические реакции лежат в основе одного из первых процессов «современной» биотехно-
логии. Этот рисунок представляет определенный интерес в связи с тем, что он иллюстрирует «инженерный» принцип модификации нормального метаболизма дрожжей при образовании ими спирта. При добавлении бисульфита к сбраживаемой среде ацетальдегид не может выступать в роли акцептора восстановительных эквивалентов, образующихся в реакциях пути Эмбдена——Мейергофа. В результате таким акцептором служит 中ос- фодиоксиацетон, а вместо этилового спирта образуется глицерол. Этот процесс оказался особенно ценным, когда в ходе первой мировой войны возросли потребности в глицероле (его использовали для производства взрывчатых веществ).
Следующим важным этапом в развитии биотехнологии хозяйственно ценных веществ была организация промышленного производства антибиотиков. Отправной точкой здесь послужило открытие Флеммингом, Флори и Чейном химиотерапевтической активности пенициллина (1940 г.). Сегодня годовой оборот этой отрасли составляет около 2 млрд, фунтов стерлингов.
Как получение химических соединений и пищевых добавок путем брожения, так и синтез антибиотиков всегда велись в асептических условиях, но некоторые современные процессы (например, образование белка одноклеточными организмами) осуществляют в еще более жестком режиме. Обеспечение таких особых условий ——многоплановая задача. Она решается инженерами-химиками и микробиологами (подробнее об этом будет рассказано в гл. 10). С другой стороны, использование микроорганизмов при переработке отходов (гл. 6) не требует создания стерильных условий; напротив, вообще говоря, чем больше разных микроорганизмов принимает в этом участие, тем лучше. Впрочем, при планировании и создании заводов по переработке отходов инженеры-химики и микробиологи столкнулись с проблемами иного круга. Процесс минерализации органических отбросов, основанный на использовании активного ила, был разработан в 1914 г. С тех пор он был существенно модернизирован, стал более сложным и производительным и используется сегодня во всем мире для переработки стоков.
В наше время переработка стоков в анаэробных условиях смешанной микрофлорой, в результате чего попутно образуется биогаз (который состоит в основном из метана и СО2), применяется все более широко. Такая переработка энергетически высокоэффективна, так как позволяет сохранять и концентрировать энергию, содержащуюся в различных компонентах стоков (с газом регенерируется более 80% свободной энергии). В некоторых случаях, в частности в сельскохозяйственных общинах, с помощью этого процесса можно получать значительную часть необходимой энергии. Так, в Китае построено более 18 млн. генераторов биогаза. В развитых странах с высоким
потреблением энергии превращение отходов в биогаз может покрыть лишь несколько процентов их энергетических потребностей. Тем не менее на крупных заводах по переработке отходов биогаз часто сжигают в тепловых машинах, которые приводят в действие электрогенераторы. В последние годы разработаны также небольшие установки, предназначенные для переработки отходов сельского хозяйства.
Развитие биотехнологической промышленности после второй мировой войны
Помимо постоянного усовершенствования процессов, о которых речь шла ранее, в последние сорок лет был разработан ряд новых; некоторые из них перечислены в табл. 1.2. Мы обратимся к этим процессам в последующих главах книги, но четыре
Таблица 1.2. Некоторые новые направления, развивающиеся на основе биотехнологии, и продукты, получаемые с ее помощью
ОтрасльОтрасльСельское хозяйствоСельское хозяйствоПроизводство химических веществЭнергетикаКонтроль за состоянием окружающей средыПроизводство химических веществЭнергетикаКонтроль за состоянием окружающей средыПищевая промышленностьМатериаловедениеМедицинаПищевая промышленностьМатериаловедениеМедицинаПримеры
Отрасль
Отрасль
Сельское хозяйство
Сельское хозяйство
Производство химических веществ
Энергетика
Контроль за состоянием окружающей среды
Производство химических веществ
Энергетика
Контроль за состоянием окружающей среды
Пищевая промышленность
Материаловедение
Медицина
Пищевая промышленность
Материаловедение
Медицина
Получение новых штаммов, новые методы селекции растений и животных (включая клонирование)
Получение органических кислот (например, лимонной, итаконовой), использование ферментов в составе моющих средств
Увеличение потребления биогаза, крупномасштабное произзодство этанола как жидкого топлива
Улучшение методов тестирования и мониторинга, прогнозирование превращений ксенобиотиков благодаря более глубокому пониманию биохимии микроорганизмов, усовершенствованию методов переработки отходов, особенно промыиь леиных
Создание новых методов переработки и хранения пищевых продуктов, получение пищевых добавок (например, полимеров, продуцируемых микроорганизмами аминокислот), использование белка, синтезируемого одноклеточными организмами, и ферментов при переработке пищевого сырья
Выщелачивание руд, дальнейшее изучение и контроль биоразложения
Применение ферментов для усовершенствования диагностики, создание датчиков на основе ферментов, использование микроорганизмов и ферментов при производстве сложных лекарств： (например, стероидов), синтез новых антибиотиков, применение ферментов в терапии
наиболее интересных — производство аминокислот, белка одноклеточных организмов (БОО), превращение стероидов и культивирование клеток животных и растений — мы вкратце рассмотрим в этом разделе.
За последние тридцать лет производство аминокислот в аэробных микробиологических процессах получило все более широкое распространение. В наибольшем количестве вырабатывались два продукта — глутамат натрия (ежегодное производство в мире — около 150 000 т), который служит усилителем вкуса, и лизин (ежегодное производство в мире—15 000 т), который используют как пищевую добавку. В мире за год продается аминокислот на сумму 1 млрд, фунтов стерлингов, причем большую часть поставляют японские фирмы. Особую роль Японии в некоторых областях биотехнологии мы обсудим в этой главе в разделе «Экономические и коммерческие аспекты биотехнологии».
Микроорганизмы могут превращать растительную биомассу с низким содержанием белка в пищевые продукты с высоким его содержанием. В крупных промышленных масштабах этот процесс использовался в Германии: там в ходе первой мировой войны выращивали дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые добавляли главным образом в колбасу и супы. Таким путем удавалось компенсировать около 60% довоенного импорта пищевых продуктов. Сходные процессы на основе пищевых дрожжей Candida arborea и Candida utilis использовались и во время второй мировой войны. В 60-х годах ряд нефтяных и химиче- ских компаний начали исследования и разработки по созданию новых процессов получения БОО, предназначенного для добавления в пищу людям и животным (гл. 3). В какой-то мере это было связано с недостатком белковой пищи в мире. В качестве субстратов использовали нефть, метан, метанол и крахмал; большинство продуктов вырабатывали для добавления в корм животным. В целом процессы на основе метанола и крахмала оказались наиболее конкурентоспособными, В западных странах самый крупный завод был построен компанией ICI: там в одном ферментере при участии метанолпотребляющей бактерии Methylophilus methylotrophus получают из метанола около 70 000 т белка прутина (Pruteen) в год. При помощи технологии рекомбинантных ДНК были модифицированы механизмы ассимиляции азота этими бактериями, Мто привело к увеличению выхода продукта. Это было одним из первых доказательств практической значимости и потенциальных возможностей генетической инженерии (гл. 7). В СССР ежегодно производится более 1 млн. т БОО, в основном из углеводородов и отходов растениеводства. Один из немногих высококачественных продуктов из БОО, пригодный для человека, поставляется для проб-
ной продажи в Англии фирмой Rank Hovis McDougall. Его вырабатывают из гриба, выращиваемого на содержащем углеводы сырье (гл. 3).
Хотя в наше время, и особенно в последние двадцать лет, интерес к использованию ферментов в промышленности все более возрастает, их внедрение в производство происходит медленно. Набор используемых сегодня ферментов весьма невелик и применяются они в основном в пищевой промышленности. Правда, за последние несколько лет значительно возросло число ферментов, применяемых в медицине (главным образом для диагностики). И все же в целом рынок ферментов остается сравнительно небольшим, порядка 250 млн. фунтов стерлингов в год. Основные причины такого относительно медленного развития—нестабильность ферментов, сложность выделения продуктов переработки и проблемы, связанные с добавлением или заменой кофакторов. Однако в некоторых случаях эти сложности удается обойти путем использования интактных клеток микроорганизмов. Такой способ стал играть особенно важную роль в 50-х годах при крупномасштабном производстве лекарственных препаратов стероидной природы. Было установлено, что многие микроорганизмы способны строго направленно и стереоспецифически гидроксилировать сложные молекулы стероидов. Уже на ранних этапах этого метода было сделано важное наблюдение: оказалось, что плесневый гриб Rhizopus arrhizus способен стереоспецифически, по 11-му положению гидроксилировать женский половой гормон прогестерон. Это существенно упростило производство кортизона, который применяют для лечения артрита. До внедрения нового метода это соединение получали с помощью химического синтеза, включавшего 37 стадий, с выходом 0,02%, и поэтому стоимость 1 г его составляла 200 долларов. Благодаря внедрению в этот процесс этапа, основанного на биотрансформации и существенно упрощающего синтез, цена упала до 68 центов за 1 г. Впоследствии был выделен еще ряд микроорганизмов, способных специфически гидроксилировать Другие углеродные атомы кольца, а недавно микробные системы начали использовать для превращения фитостероидов в C-19-стероидные гормоны с менее громоздкими молекулами. Они находят широкое применение, в частности как пероральные противозачаточные средства.
Химическая промышленность, особенно в США и Японии, проявляет постоянный интерес к разработке аналогичных процессов получения других дешевых продуктов на основе микробиологического окислительного катализа. Считается, что таким путем удается осуществлять более экономичные процессы, чем их нынешние аналоги в химической промышленности (гл. 4).
Ряд производств, например получение вакцин, стал гораздо эффективнее после освоения методов культивирования растительных и животных клеток в большом объеме. Был разработан также метод слияния клеток различных линий, что позволило, в частности, ученым фирмы Unilever получить новые клоны масличных пальм, как более урожайных, так и дающих продукцию более высокого качества.
Перспективы развития биотехнологии
В будущем благодаря расширению сферы своего применения биотехнология сделает весомый вклад в повышение уровня жизни (табл. 1.3). Быстрее всего ее применение даст результаты в
Таблица 1.3. Сфера применения методов биотехнологии
Приборы для аналитической химии
Процессы биосинтеза и биодеградации
У гл ер од сод ер ж ащее сырье для химической промышленности Химическая переработка (очистка продукта) Химические продукты, использующиеся в быту:
клеи, детергенты, красители, волокна, вкусовые добавки, желирующие вещества и загустители, камеди и растительные клеи, душистые вещества, пигменты, пластики, смазки, воска и пр.
Источники энергии
Контроль за состоянием окружающей среды (воздух, вода и почва)
Пища и напитки (сельскохозяйственное производство и пере- ，работка)
Здравоохранение (диагностика, лечение), борьба с болезнями растений и животных
Добыча минерального сырья на суше и в море
медицине, но в более отдаленном будущем (лет через десять), по мнению наиболее компетентных специалистов, самый большой экономичский эффект будет получен от применения биотехнологии в сельском хозяйстве и химической промышленности. Ниже мы вкратце обсудим некоторые последние достижения этой науки, потенциально важные для медицины, энергетики, производства пищевых продуктов и напитков, получения химических соединений, различных материалов, для защиты окружающей среды и для сельского хозяйства. Многие из этих аспектов обсуждаются более подробно в последующих главах.
Медицина
2—13442—1344В последнее время все мы имели возможность убедиться, что благодаря применению технологии рекомбинантных ДНК были достигнуты крупные успехи в медицине. Многие фирмы, напри-
2—1344
2—1344
眼У顆熠WE幾発КА им. Н. И.九七…некого “ЗАЙСКОГО『UG.；浒ШПЕТ(
ПОМОЩИ мик- в медицине, производства них пойдет вПОМОЩИ мик- в медицине, производства них пойдет вмер, весьма преуспели в разработке эффективных методов промышленного производства человеческого интерферона (для этого гены человека были клонированы в микроорганизмах). Отметим, впрочем, что многие и сейчас сомневаются в эффективности интерферона как антивирусного и противоопухолевого средства. Помимо гена интерферона были клонированы гены инсулина и гормона роста человека. Эти гены экспрессируются и в бактериях. В целях крупномасштабного производства были клонированы гены многих других белков человека, необходимых для диагностики или для лечения. Когда мы писали эту
ПОМОЩИ мик- в медицине, производства них пойдет в
ПОМОЩИ мик- в медицине, производства них пойдет в
книгу, уже поступил в продажу полученный при робов инсулин человека, который используется Большое значение имеет и разработка методов моноклональных антител. Более подробно речь о гл. 8. Способы их применения сведены в табл. 1.4.
Таблица 1.4. Возможные способы применения моноклональных антител
Область медициныОбласть медициныСпособ примененияСпособ применения
Область медицины
Область медицины
Способ применения
Способ применения
АнализДиагностикаИммунодиагностикаИммуноочисткаТерапияАнализДиагностикаИммунодиагностикаИммуноочисткаТерапия
Анализ
Диагностика
Иммунодиагностика
Иммуноочистка
Терапия
Анализ
Диагностика
Иммунодиагностика
Иммуноочистка
Терапия
Структурные зонды для идентификации специфических особенностей на поверхности клеток
Наборы реактивов для диагностики беременности
Выявление Адрогенннх рецепторов для диагностики некоторых форм рака молочной железы
Точное определение количества специфических антигенов
Очистка антигенов, например интерферона
Направленный пёренос токсинов в раковые клетки, инактивация ядов, пассивная иммунизация, лечение аутоиммунных болезней
Не приходится сомневаться, что все шире и шире в диагностике, терапии и при трансплантации клеток и тканей будут использоваться ферменты.
К числу активно разрабатываемых, но не вышедших еще из «детского возраста» сфер применения биотехнологии, которые окажут, наверное, наибольшее влияние на развитие медицины и промышленности, относятся биоэлектроника и биоэлектрохимия, в которых используется взаимодействие биологических, электрических и электронных систем. В последние годы здесь достигнуты заметные успехи. Так, принципы электронной инженерии
нашли применение при разработке инфузионных насосов, а также эффективных комплексных устройств, в которых используются биологические соединения, чаще всего ферменты или антитела, и различные типы электродов. Создан целый ряд чувствительных датчиков, например контролирующих содержание глюкозы (для применения в медицине) или же нервных газов (в военных целях). Действие большинства из разработанных на сегодня датчиков основано на улавливании продуктов действия ферментов. Для этого используются обычные электроды с иммобилизованной на них биологической системой. Новые подходы в этой области ставят своей целью создание более чувствительных и эффективных приборов и расширение сферы их применения. В основе работы таких устройств лежит процесс прямого переноса электронов между электродами и окислительно-восстановительными центрами белков. Делаются попытки подключения белков ко входу полупроводниковых приборов.
Если не вдаваться в детали, то в количественном отношении наиболее широко в медицине применяются фермент-содержа- щие датчики нескольких разновидностей для определения содержания глюкозы. На их основе будет разработан ряд устройств, например дешевые, точные и надежные приборы для проведения анализов in vivo. Считается, что основное применение они найдут при регуляции содержания сахара в крови у больных диабетом. Недостаточно точный контроль уровня сахара при этой болезни, по-видимому, приводит к развитию отдаленных, опасных для жизни побочных последствий диабета. Использование датчиков позволит замкнуть цепь контроля в аппаратах «искусственная поджелудочная железа».
В ближайшие десять лет, по-видимому, поступят в продажу и другие датчики, позволяющие, например, определять содержа* ние отдельных компонентов крови. Появятся и биоэлектронные иммуносенсоры, причем в некоторых из них будет использоваться полевой эффект транзисторов. На их основе предполагается создать относительно дешевые приборы, способные определять и поддерживать на заданном уровне концентрацию широкого круга веществ в жидкостях тела, что может вызвать переворот в диагностике.
Специфические каталитические свойства биологических систем не нашли пока столь широкого применения, как это прогнозировалось в начале 60-х годов; в то же время новые методы, основанные на способности таких систем к узнаванию, скоро будут внедрены как в медицине, так и в промышленности, особенно по мере усовершенствования технологии. Объяснение тому простое: во многих случаях на практике химические катализаторы при всех их недостатках с экономической точки зрения оказываются выгоднее, чем биокатализаторы. Попытки хи-
миков решить проблему специфического узнавания не слишком обнадеживают, и поэтому, если удастся преодолеть некоторые трудности, связанные с сопряжением систем и их стабильностью, биологический подход в целом окажется предпочтительней. Успешно развивается и направление, связанное с разработкой датчиков, основанных на использовании комбинации иммобилизованных, стабилизированных микроорганизмов и электродов.
Энергетика
В ходе эволюции в биологических системах сформировался ряд весьма совершенных механизмов превращения энергии. На рис. 1.3 представлены основные известные их типы, часть которых
• ' — Электричество 江 8
Рис. 1.3. Основные пути превращения энергии в живых системах, используется разными способами, особенно реакции 1, 2 и 9. Более подробно мы обсудим их в гл. 2. Отметим, что биомасса постоянно используется для получения электрической энергии за счет небиологических эквивалентов в реакциях 8 и И.
Что касается возможного вклада биотехнологии в решение проблем энергообеспечения, то здесь в отличие от других областей ее применения предсказать что-либо гораздо сложнее. В последние годы немало говорилось об «энергетическом кризисе»: запасы ископаемого топлива ограничены, а население растет, и потребление энергии per capita все увеличивается. В этом контексте обсуждаются и перспективы использования ядерной энергии. Неравномерность распределения запасов ископаемого топлива, а также наличие ряда сложных политических и экономических факторов делают любые предсказания особенно сложными. Наиболее важным является здесь то обстоятельство,
что около 99,4%, или 1,7-1023 калорий в год, доступной нам неядерной энергии мы получаем от Солнца, и часть ее аккумулируется в биомассе, хотя и с малой эффективностью, порядка 1——2%. По этой причине биомасса представляет собой постоянно возобновляемый источник' химической энергии. Ее можно сжигать или довольно простыми способами превращать при помощи микроорганизмов в жидкое или газообразное топливо (метан, этиловый спирт или водород). Однако биомасса используется и для других целей: она служит пищей для людей и дает ряд ценных видов сырья.
Со временем биомасса, видимо, будет все более распространенным исходным продуктом при производстве сырья для химической промышленности на основе биотехнологических процессов. Примером такого рода может быть превращение лигнина в соединения ароматического ряда.
Конкуренция за имеющиеся в наличии запасы биомассы усугубляется тем, что площади, пригодные для ее производства, из-за роста населения постоянно уменьшаются. По этой причине дать точный глобальный прогноз использования энергии» получаемой из биомассы, довольно трудно. Отметим, однако, что из-за недостатка ископаемого топлива в некоторых странах (например, в странах Южной и Северной Америки) производство этилового спирта путем ферментации становится все более популярным, особенно для использования в качестве добавки и/или для замены нефти как горючего на транспорте. Если рассматривать это производство само по себе, то экономическая его обоснованность оказывается весьма сомнительной, но оно приемлемо для некоторых стран по политическим соображениям (Бразилия, США).
В последнее время вновь пробудился интерес к разработке биотопливных элементов, с помощью которых можно с высокой эффективностью и при обычной температуре получать из ряда видов топлива и биомассы электрическую энергию. Хотя эти устройства и находят уже применение (например, в качест* ве специальных датчиков), в большинстве случаев с их помо- щью сложно получить на электродах ток достаточной плотно* сти, что позволяло бы использовать их в качестве крупномасштабных преобразователей энергии. Возможно, однако, что уже в ближайшем будущем они найдут применение в специальных областях энергетики. Единственным исключением среди них является «гибридный» водородный биотопливный элемент: в нем водород, образующийся при брожении, используется в обычном водород-кислородном элементе. Впрочем, и другие биотопливные элементы могут со временем ^айти применение для получения дешевой электроэнергии путем переработки стоков, отходов или окиси углерода.
Поскольку солнечный свет является мощным источником энергии, а количество имеющейся биомассы ограничено, некоторые биотехнологи, работающие над проблемами энергетики^ занялись разработкой двух проблем, решение которых позволило бы повысить эффективность использования солнечной энергии. Во-первых, они пытаются найти практические способы повышения эффективности конверсии солнечного света в биомассу, например путем выращивания водорослей при высокой концентрации углекислого газа и ограниченной освещенности в биореакторах со строго контролируемыми условиями роста. Во- вторых, они изучают возможность получения водорода путем расщепления воды при участии фотосистемы фотосинтезирующих организмов, т.е. путем биофотолиза. Технически проще всего получать водород, используя интактные сине-зеленые водоросли или процессы ферментации (брожения). Надо сказать, однако, что если биотехнология всерьез намерена внести в будущем весомый вклад в производство энергии, то ей придется решить нетривиальную техническую задачу: на основе биофото* лиза разработать сложный реактор, включающий упорядоченные стабильные биофотосистемы,
В самом ближайшем будущем биотехнология станет играть все возрастающую роль и при добыче нефти. Поскольку цены на нефть растут, добыча ее из сложных в эксплуатации залежей становится все более экономически выгодной. Здесь могут оказаться полезными микроорганизмы. Во-первых, некоторые образуемые ими полимеры, особенно производные ксантана, можно использовать в качестве компонентов закачиваемых в пласт растворов, обладающих нужными реологическими характеристиками, для добычи остаточной нефти (гл. 5). Во-вторых^ в нефтяной промышленности используются поверхностно-актив- ные вещества микробного происхождения. С экономической точки зрения производство таких веществ будет особенно выгодным, если их удастся получать путем микробиологической переработки отходов, содержащих нефть. Как правило, экономические характеристики биотехнологических процессов улучшаются, если удается совместить переработку отходов с производством полезного продукта.
Некоторые группы ученых работают сегодня над разработкой более долгосрочных крупномасштабных программ. Предполагается, например, вводить подходящие микроорганизмы непосредственно в нефтяной пласт, чтобы ускорить отток нефти из пористых пород.
J.4.3. Пищевые продукты и напитки
Традиционные способы использования микроорганизмов при производстве различных сортов пива, вина и сброженных про、 дуктов совершенствовались тысячелетиями, и все же до недавнего времени в них было больше искусства, чем технологии. Только с развитием микробиологии мы получили возможность контролировать качество продуктов, добились большей надежности и воспроизводимости процессов ферментации и научились получать новые типы продукции (например, БОО и вкусовые добавки). Сегодня нам еще трудно с уверенностью говорить о том, каких успехов удастся достичь в этой области с помощью биотехнологии, но самые общие тенденции вырисовываются довольно ясно. Наиболее успешными представляются два взаимосвязанных направления. Во-первых, на смену традиционным способам производства пищи постепенно придут биореакторы, в которых будут расти клетки животных или растений или же микроорганизмы. Дело в том, что выход продукции при использовании ферментеров или биореакторов может быть существенно выше, чем в сельском хозяйстве: идущие в них процессы гораздо более интенсивны. Развитию этого направления способствует и все возрастающая конкуренция за имеющиеся земельные ресурсы. Во-вторых, эта альтернативная технология будет становиться все более производительной благодаря использованию методов генетической инженерии, которые позволяют получать улучшенные линии клеток и штаммы микроорганизмов.
Такая тенденция в развитии пищевой промышленности путем интенсификации биотехнологических процессов уже проявилась в полной мере при выработке ценных пищевых добавок. Наиболее яркий пример — производство лимонной кислоты (гл. 3). Сегодня ее получают главным образом микробиологическим методом, а не из цитрусовых. Намечается также рост использования микробных белков в питании человека.
Новые возможности открываются и в развитии нетрадиционных способов выработки пищевых продуктов. Так, в Японии говядина стоит дорого и производится в недостаточном количестве. Эта страна представляет собой поэтому потенциально очень емкий рынок для сбыта хороших заменителей говядины, изготовленных на основе других белковых продуктов.
Химические соединения
Применение биологических систем для производства химических соединений в принципе дает ряд преимуществ, однако сегодня лишь малое их число получают с помощью биотехнологиче-
ских процессов. К ним относятся сравнительно дешевые, но используемые в больших количествах как топливо этиловый спирт и метан, а также ряд ценных и довольно дорогих веществ, применяющихся в медицине и для пищевых целей (лимонная кислота, итаконовая кислота, аминокислоты, стероиды и антибиотики) .
В принципе производство химических веществ на основе биокатализа имеет следующие преимущества: специфичность^ легкость контроля, работа при низких температурах, совместимость с окружающей средой и простота. Особенно важны два первых из них. Так, химическая промышленность органических соединений базируется сегодня в значительной мере на нефти, а большинство производимых ею продуктов переработки нефти получают путем частичного окисления сырья. Достичь специфического контролируемого и частичного окисления при помощи существующих катализаторов довольно сложно, а микроорганизмы осуществляют эти типы реакций мастерски, без труда.
По ряду причин биотехнологии еще только предстоит внести свой вклад в развитие химической промышленности, хотя уже сегодня мы многое знаем о потенциально полезных в этом плане биологических системах. Одна из главных проблем заключается в том, что основанные на биотехнологии отрасли химической промышленности будут использовать нетрадиционную технологию. Реакции, как правило, будут идти при низких температурах и давлении, в водной среде, хотя ряд экспериментальных систем работает и в органической фазе, В некоторых случаях скорость таких процессов невелика, а катализаторы не очень стабильны. Однако важнее всего, видимо, то обстоятельство, что наибольшее влияние на развитие химической промышленности по вполне понятным причинам оказывают химики. По сравнению с другими областями технологии разработка методов биотехнологического катализа до недавнего времени велась здесь малыми силами и при скудном финансировании.
Роль биокатализа в химической промышленности сегодня весьма необычна. С одной стороны, появление генетической инженерии воскресило к нему интерес, поскольку появилась возможность существенно улучшить рабочие характеристики биокатализаторов, особенно интактных микроорганизмов. С другой стороны, на разработку таких новых процессов требуется немалое время (от десяти до двадцати лет) и это наряду с высокой стоимостью изысканий и внедрения приводит при организации производства к крупным расходам (10—25% от общей стоимости осуществления проекта). Новые возможности для более широкого применения биокатализаторов в химической промышленности возникли, когда она столкнулась с рядом эко- комических проблем.
Все эти соображения, а также тот факт, что недавнее внедрение биопроцессов в многотоннажное производство некоторых химических соединений (например, окиси пропена) привлекли к себе большое внимание, позволяют думать, что скоро мы станем свидетелями использования биокатализа, в первую очередь для синтеза небольших партий веществ с высокой прибавочной стоимостью. Опыт, накопленный при производстве таких веществ, поможет развитию многотоннажного производства химических соединений.
Существуют три главных способа синтеза химических соединений на основе биокатализа: 1) путем использования культур клеток растений или животных, образующих дорогостоящие вещества; 2) путем использования микроорганизмов, при необходимости измененных методами генетической инженерии, для биосинтеза или модификации химических веществ; 3) путем использования измененных методами генетической инженерии микроорганизмов в качестве «устройства для экспрессии генов растений и животных, что позволяет синтезировать в больших количествах особые, присущие только высшим организмам химические соединения.
Сделаны первые попытки объединить химическую, биологическую и электронную технологии, и здесь, по-видимому, будут достигнуты выдающиеся результаты. Таким путем могут быть созданы специфические датчики для регуляции процессов в химической и пищевой промышленности, для медицинской диагностики, мониторинга и контроля, для наблюдения за состоянием окружающей среды. Особенно заманчивой кажется возможность создания полупроводниковых биодатчиков, основанных на микрочипах (micro-chipe). Такие устройства после их усовершенствования будут достаточно дешевы в производстве и позволят одновременно контролировать многие параметры при помощи одного крошечного биоэлектронного прибора. Все это может быть выполнено в течение пяти — двадцати лет. Более простые датчики, основанные на использовании полупроводников или технологии тонких слоев, будут разработаны в ближайшие пять лет.
В следующем разделе мы обсудим перспективы развития производства пластмасс, эмульгаторов и загустителей при участии микроорганизмов.
Материалы
Биотехнология может оказать влияние на получение и использование различных материалов по меньшей мере тремя способами. Во-первых, она будет способствовать развитию добычи промышленного сырья, например нефти и других полезных ис-
копаемых. Во-вторых, все более широко станут использоваться продукты микробного происхождения, например для производства разлагаемых с помощью микроорганизмов пластмасс, эмульгаторов и загущающих веществ. Наконец, будут усовершенствованы способы защиты различных веществ от разрушения их микроорганизмами.
Подробно перспективы дальнейшего усовершенствования микробиологических способов выщелачивания руд, а также использования полимеров и поверхностно-активных веществ микробного происхождения при добыче нефти обсуждаются в гл. 5* Наиболее многообещающим сырьем для производства биопластмасс является одно из резервных веществ клеток, полн-р- гидрокси бутир ат (ПГБ). В настоящее время в промышленности ведутся активные исследования как самого этого вещества и его производных, так и способов их получения.
Проблема биоповреждений обычно не обсуждается в ряду проблем биотехнологии, но она, без сомнения, весьма актуальна и сложна с технической точки зрения, а роль ее в экономике весьма существенна.
Биоповреждения ——неизбежное следствие важнейшей роли микроорганизмов в круговороте элементов в биосфере. Проявления биоповреждений весьма многообразны: от порчи пищевых продуктов до загрязнения смазочных масел и топливных систем, разрушения бетона и развития электрохимических процессов коррозии под влиянием микроорганизмов. Биотехнология поможет создать новые методы борьбы с биоповреждениями благодаря более глубокому пониманию лежащих в их основе процессов. На этой базе могут быть созданы новые биотехнологические процессы. Примером такого рода служит использование ферментов в пищевой промышленности.
На основе биотехнологических принципов будут созданы новые тапы датчиков для контроля уровня микробного загрязнения сырья.
/46. Окружающая среда
По мере того как увеличивается население Земли и развивается промышленность, все более серьезной становится проблема охраны окружающей среды. В решении такого рода задач биотехнология будет играть все возрастающую роль, в частности, в том, что касается разработки новых или усовершенствования существующих способов переработки отходов. Такие методы и системы будут создаваться в значительной мере на основе исследований в области химической инженерии, но свое веское слово скажут также физиологи микроорганизмов, биохимики и генетики. Новейшие процессы переработки необычных отходов
бупут основаны на использовании микроорганизмов, обладающих новыми, неизвестными ранее или искусственно созданными катаболическими способностями. Более подробно эти две возможности мы обсудим в гл. 6.
Окружающая среда является, без сомнения, как бы общим знаменателем для всех видов деятельности, о которых пойдет речь в этой книге, так как все они оказывают на нее влияние. Так, расширение использования биотехнологии в химической промышленности должно привести к созданию новых ее отраслей, лучше совместимых с окружающей средой. Такие же надежды возлагаются и на биоинженерию. Разработка биодатчиков поможет осуществлять мониторинг и контролировать условия среды. Понятно, что проблемы защиты окружающей среды неразрывно связаны с сельским хозяйством.
Сельское хозяйство
Точки соприкосновения биотехнологии и сельского хозяйства весьма многообразны. Продукция сельского хозяйства может использоваться в промышленности, например для производства этилового спирта из излишков низкокачественного вина. Такой подход получил дальнейшее развитие: для выработки спирта •сельскохозяйственные культуры начали выращивать специально. Большая часть продукции современного сельского хозяйства •служит сырьем для развитой пищевой промышленности. В качестве сырья могут использоваться и отходы сельского хозяйства: в частности, большое внимание уделяется возможности получения топливного газа из навоза с сохранением его ценности как удобрения. Для усовершенствования процессов в этой отрасли необходимо иметь более четкое представление о скорости разложения различных субстратов и роли микроорганизмов, в них участвующих.
В ветеринарии биотехнология используется для получения вакцин и сывороток. Если, как ожидается, вакцины удастся получать при помощи микроорганизмов, модифицированных методами генетической инженерии, мы станем свидетелями окончательного искоренения таких опасных заболеваний; как ящур и сонная болезнь. Для увеличения выхода мяса могут использоваться гормоны роста. Современная биотехнология дает нам и корм для скота, например белково-витаминный концентрат. Впрочем, нужно еще доказать, что его применение экономически целесообразно, по крайней мере в западных странах.
Биотехнология поможет разработать новые способы улучшения сельскохозяйственных культур как по урожайности, так и по качеству. Можно будет использовать полученные с ее помощью заменители дорогостоящих химических удобрений или
пестицидов или же добавки к ним. Так, потребности в азоте удастся удовлетворить путем внедрения биологической фиксации азота, основанной на симбиозе, а в фосфоре — путем вмешательства в процессы, происходящие в микоризах. Задачей отдаленного будущего является передача способности к фиксации азота непосредственно отдельным сельскохозяйственным культурам путем введения в них гена нитрогеназы; в результате такие растения приобретут способность к синтезу фермента, катализирующего реакцию фиксации азота. Это позволит сэкономить энергию, затрачиваемую сегодня при химическом синтезе аммиака. Есть надежда, что вместо пестицидов мы в будущем сможем использовать методы биологического контроля — как широко известные, так и основанные на применении новых природных соединений. Так, например, в борьбе с одной из болезней растений, корончатым галлом, могут помочь бактерии. С бабочками-вредителями можно бороться с помощью Bacillus thuringiensis. Разработка таких методов не только принесет пользу сельскому хозяйству, но и сыграет важную роль в поддержании на должном уровне условий окружающей среды.
По общему мнению, наибольший вклад биотехнологии в сельское хозяйство следует ожидать за счет улучшения свойств самих растений путем использования методов рекомбинантных ДНК и протопластов растений. Применительно к бобовым и злакам метод регенерации целых растений из отдельных клеток не дал пока сколько-нибудь значительных результатов. Однако работа с люцерной была небезуспешной, и это позволяет надеяться, что опыты с бобовыми тоже будут более результативными по мере разработки все более подходящих условий культивирования. Применяя подобную технологию, быть может, удастся получить белки злаков, содержащие незаменимые аминокислоты, которых сейчас в них нет.
Экономические и коммерческие аспекты биотехнологии
Биотехнология (в широком смысле этого термина) уже сегодня имеет большое экономическое и социальное значение. Главная цель этого раздела книги — проанализировать ее возможное влияние на экономику, описать механизмы новой биотехнологии, ее быстроразвивающиеся, новые, многообещающие методы. Чтобы читатель мог составить представление об объеме продукции биотехнологической промышленности, скажем, что бродильная промышленность Великобритании дает в год продукции приблизительно на 9 млрд, фунтов стерлингов. В мире производится антибиотиков на 2 млрд, фунтов, а аминокислот и ферментов — на 1 млрд, фунтов и 250 млн. фунтов соответственно.
Если оценить рыночную стоимость отдельных видов биотехнологической продукции относительно несложно (например, в западных странах дешевых, надежных, точных датчиков глюкозы одноразового пользования за год продается на 800 млн. фунтов), то предсказать в целом спрос на все виды продукции и процессы, основанные на применении биотехнологии, гораздо сложнее. Тем не менее в табл. 1.5 мы приводим относительно
Таблица 1.5. Оценка спроса на мировом рынке в 2000 г. на различные виды продукции «новой биотехнологии» (в млрд, фунтов стерлингов)
Химические вещества
Энергия
Пищевые продукты
Медицина
5656Прочие (например, повышение полноты извлечения нефти, контроль загрязнения окружающей среды, биопластики, выщелачивание руд)
56
56
обоснованные оценки, взятые из разных источников. Предполагается, что во всем мире эта развивающаяся отрасль промышленности будет давать к 2000 г. продукции на 56 млрд, фунтов в год, что приблизительно в шесть раз больше, чем дает сейчас бродильная промышленность Великобритании. Предсказания относительно дальнейшего развития биотехнологической промышленности сделать еще сложнее, но, вероятно, и в будущем столетии она будет продолжать развиваться быстрыми темпами.
Интересная особенность данных, приведенных в табл. 1.5, заключается в следующем: в отличие от общепринятого представления, согласно которому биотехнология найдет основное применение в медицине, они говорят, что к концу века это будет относительно узкая сфера ее применения. Впрочем, данная отрасль может оказаться весьма доходной и в ближайшем будущем развиваться наиболее быстрыми темпами. Так, уже поступил в продажу человеческий инсулин. Для лечения рака в 1987 г., видимо, будет широко использоваться интерферон, а в 1988—1989 гг. он найдет применение как антивирусное и противовоспалительное средство. Ожидается, что к 1990 г. общедоступными станут вакцина против гепатита В и человеческий гормон роста.
Логика развития биотехнологии
Механизмы развития биотехнологии заметно различаются в разных частях света и зависят от политических и экономических факторов, характерных для Запада и Востока, Севера и Юга,
стран третьего мира и развитых стран, капитализма и социализма. Суть технологии также различна: страны третьего мира обычно развивают альтернативные варианты технологий. Так, в некоторых странах Дальнего Востока небольшие местные Fe- нер,аторы биогаза удовлетворяют значительную часть энергетических потребностей сельских общин. В странах с развитой экономикой такие установки гораздо менее популярны. В СССР и других социалистических странах развитие биотехнологии обычно определяется централизованно. В частности, это позволило осуществить крупную программу по производству белково- витаминного концентрата. В настоящее время из углеводородов и растительных отходов там производится за год более миллиона тонн этого продукта.
В Японии правительство играет важную роль в координации развития биотехнологии в университетах и исследовательских институтах, но разработка и реализация идей осуществляется главным образом крупными биотехнологическими фирмами.
Правительства большинства западных стран в последние годы выдвинули ряд программ, направленных на содействие развитию биотехнологии. Необходимость их разработки определяется сложной, междисциплинарной природой этой технологии и продолжительностью подготовительного периода при разработке способов производства большинства видов продукции. Кроме того, поскольку многие важные открытия в биотехнологии делаются на переднем крае науки, многие из ведущих ученых, принимающих участие в таких исследованиях, работают в государственных учреждениях, чаще всего в системе высшего образования. Правительства должны умело финансировать именно самые нужные исследования, способствовать развитию различных областей науки и помогать как частному, так и государственному сектору в их попытках довести дело до коммерческого продукта, даже если подготовительная работа требует много времени. Неблагоприятный экономический климат последних лет делает такую «каталитическую функцию» правительства тем более важной, что расходы на исследования и разработки в учреждениях частного сектора сокращаются.
Что касается США, то правительство этой страны давно вкладывает значительные средства в развитие различных отраслей биотехнологии, а крупные фирмы медицинской, биологической и энергетической промышленности уже осуществляют важные программы в области биотехнологии. Кроме того, возникают и частнопредпринимательские биотехнологические фирмы. Такие скромные по масштабу, новые промышленные предприятия появляются не только в США; небольшое их число основано и в Западной Европе. Некоторые из этих европейских фирм являются «получастными» в том смысле, что они ра-
ботают в тесном контакте с правительственными или частными финансовыми учреждениями. Таким образом, участвующие в развитии биотехнологии фирмы могут быть отнесены к четырем основным категориям. 1. Специализированные биотехнологические фирмы, опирающиеся главным образом на технологию рекомбинантных ДНК. 2. Крупные, обычно международные фирмы, занятые добычей нефти, получением пищевых продуктов^ химических веществ, переработкой сельскохозяйственной продукции или же работающие в фармакологической промышленности. Эти фирмы уделяют развитию биотехнологии часть своих исследовательских и производственных ресурсов. 3. Более мелкие фирмы, специализирующиеся в биотехнологическом производстве; они выпускают, например, препараты для медицины, продукты ферментации. 4. Фирмы, поставляющие оборудование для биотехнологической промышленности.
Специализированные биотехнологические фирмы, а их сейчас в США около двухсот, немало способствовали динамическому развитию технологии. Многие из них, без сомнения, потерпят крах. Выживут и добьются успеха те фирмы, которые способны вести дела на высоком уровне, преданы делу и подходят к нему творчески; такие качества воспитываются в ходе деятельности. В более отдаленном будущем некоторые из них, несомненно,, будут поглощены более крупными международными фирмами. Общеизвестно, что сегодня больше всего новых биотехнологических производств организуется в США и это (по меньшей мере частично) определяется тем, что небольшие фиРмЬ1 научились успешно использовать опыт и творческий потенциал ученых и технологов, которые работают в них в условиях относительной свободы от множества обязанностей, без перерывов в работе и конфликтов. Тем не менее ясно, что сегодня существует слишком много таких фирм, которые пытаются наладить выпуск относительно небольшого набора продуктов, и доля неудачников будет большой. Недавно Комитет технологических оценок при конгрессе США провел анализ перспектив производства биотехнологических продуктов в мире (см. список рекомендуемой литературы). Был сделан вывод, что сегодня ведущее положение занимают США. Они сохранят его и в будущем, при более или менее выраженной конкуренции со стороны Японии. Из этого документа следует также, что европейские страны достигнут в этом деле меньших успехов.
Защита авторских прав 6 биотехнологии
Подходы к проблеме защиты авторских прав при внедрении открытий в области биотехнологии в целом сходны с известными для других видов деятельности. Так, коммерчески важные
открытия могут охраняться путем использования «технологии внутри фирмы» или же обычным патентованием. Патентование в биологических науках — это весьма специфический вид правовой деятельности, но во многих случаях (например, новое устройство для поточной переработки или новый датчик) сложности при патентовании сходны с таковыми для любой другой технологии. Впрочем, появление технологии рекомбинантных ДНК поставило и ряд новых интересных правовых вопросов. Упомянем, например, ставшую сегодня широко известной заявку на патент (патент Коена — Бойера), поданную в 1980 г. Стамфордским и Калифорнийским (Сан-Франциско) университетами. Этот патент ограничивает право пользования широким кругом методов генетической инженерии. Хотя многие крупнейшие фирмы и купили лицензии на эту технологию, правомочность патента нельзя считать полностью доказанной. Нужно еще посмотреть, как сложится патентование в столь необычной области создания новых форм жизни.
Правила техники безопасности в биотехнологической промышленности и контроль продукции
Как известно, существуют стандарты безопасности новых видов продукции. К числу наиболее строгих из них относятся те, которые касаются медицинских препаратов, а также продуктов, потребляемых в животноводстве и особенно в пищевой промышленности. Используемые при этом методы и требования хорошо обоснованы, и, хотя затраты на контроль велики, это не мешает выработке доброкачественных продуктов биотехнологии, например грибного белка для питания людей (гл. 3). Тем не менее сама возможность использования генетической инженерии вызвала в 70-х годах озабоченность общественности и стала предметом обсуждения. Правительства стран, в которых возникли такие дебаты, создали подотчетные обществу организации, призванные контролировать использование методов генетической инженерии. Естественно, что в разных странах для этой цели были разработаны как разные методы контроля, так и несколько неодинаковые стандарты. Спустя десять лет в результате накопления опыта использования новых методов биотехнологии, мониторинга и контроля стало очевидным, что первоначальные правила безопасности были излишне строгими. Эти правила для большинства обычных генетических манипуляций постепенно смягчились. В то же время для некоторых манипуляций правила, касающиеся условий и способов производства, остались очень строгими и будут по необходимости оставаться таковыми. В этом плане правительство Японии было
настолько осторожно, что это даже замедлило развитие технологии рекомбинантных ДНК в этой стране. Впрочем, сегодня работы по биотехнологии в Японии развиваются очень быстро, так как правила были смягчены, и эта страна уже вышла на уровень, достигнутый в Западной Европе и Америке.
В Великобритании контроль за работой с рекомбинантными ДНК осуществляется специальной правительственной Организацией здравоохранения и безопасности. И эта организация, и ученые следуют рекомендациям Консультативной группы по генетическим манипуляциям (GMAG), которая разработала правила проведения исследований. Эти правила в основном регламентируют уровни безопасности при проведении различных исследований. Ученые должны заблаговременно получать разрешение GMAG для проведения своих опытов, и научные работники проявляют высокую сознательность при использовании этих правил.
Заключительные замечания
В этой главе мы попытались дать читателю общее представление 。биотехнологии, ее корнях, нынешнем состоянии и перспективах. В последующих главах мы более подробно рассмотрим положение дел в различных отраслях биотехнологии. Эти главы были написаны специалистами, вклад которых в биотехнологию и тем самым в улучшение общего уровня жизни не вызывает сомнений. Разнообразие видов их деятельности до прихода в биотехнологию убедительно свидетельствует о широте этой науки и возможностях ее практического применения. Среди авторов есть не только «биотехнологи с академическим уклоном》， но и лица, тесно связанные с деловым миром и с наукой, сотрудник международной биотехнологической фирмы, главный управляющий крупнейшей фирмы продовольственных товаров и крупный специалист-клиницист. Такова уж природа этой науки!
ЛИТЕРАТУРА
Atkinson В., Mavituna F. (1983). Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, Macmillan, Byfleet, Surrey.
Brenner S„ Hartley B. £, Rodgers P. J. (eds.) (1980). New Horizons in Industrial Microbiology, Royal Society, London.
Bull A. T., Ellwood D. C., Ratledge C. (eds.) (1979). Microbial Technology: Current Status, Future Prospects, Soc. gen. Microbiol. Symp., 29.
Commercial Biotechnology: An International Analysis (Washington DC: US Congress Office of Technology Assessment, OTA-BA-218, January 1984).)
Coombs 丄(1984), The International Biotechnology Directory, The Nature Press, New York.
Crespi R. S. (1982). Patenting in the Biological Sciences, John Wiley and Sons, Chichester.
3—1344
Hamdi S. (1983). Biotechnology for Investors, Laing and Cruikshank, London. Old R 步・，Primrose S. В (1980). Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, Blackwell Scientific Publications, Oxford*
Phelps С. E, Clarke P. H, (eds.) (1983). Biotechnol. Biochem. Soc. Symp., 48“ Rehm H.-]., Reed G. (eds.) (1981). Biotechnology, Vol. 8, Verlag Chemiex
Weinheim.
Rose A. H. (ed.) (1980). Microbial Enzymes and Biosensors, Economic Microbiology 5, Academic Press, London.
Rothman H., Stanley R*, Thompson S., Towalski Z. (1981). Biotechnology: A Review and Annotated Bibliography, Frances Pinter, London.
Science (1983). 219, no. 4585.
Scient. Am. (1982). 247.
Scott C. D, (ed.) (1982). Fourth Symposium in Biotechnology in Energy Production and Conservation, Biotechnol. Bioeng. Symp., 12.
Senior P. /., Windass J. (1980). The ICI Single Cell Protein Process, BiotechnoL Lett., 2, 205—210.
Wiseman A. (ed.) (1983). Principles of Biotechnology, Surrey University Press# /Chapman and Hall, New York.
Глава 2
Энергия и биотехнология
Д. Холл, Дж. Кумбс, И. Хиггинс
Введение
В этой главе мы обсудим роль биотехнологии в производстве высококачественного топлива («premium fuels») из биологиче- €кого сырья. Начнем с того, что термин «биомасса», который многими микробиологами понимается в относительно узком смысле, сегодня при описании самых общих принципов производства разнообразных видов высококачественного топлива и веществ специального назначения из растений, выращенных непосредственно для этих целей, или из биологических отходов, образующихся, например, в сельском хозяйстве или пищевой промышленности, используется в более широком смысле. В основе как запасания энергии (фотосинтез), так и переработки сырья (биомассы) в более ценное топливо (путем ферментации) лежат биологические процессы. Особое внимание сегодня уделяется разработке более изощренных генетических методов: считается, что они сыграют важную роль как при выведении улучшенных сортов растений с более высокой урожайностью, так и новых форм микроорганизмов для осуществления процессов конверсии. Кроме того, вполне возможно создание комбинированных искусственных систем, включающих отдельные компоненты животных и растений. Таким путем можно получить газообразный водород, связанный С или NH3.
Как видно из рис. 2.1, получение топлива по схеме «биомасса——биотехнология» основывается на сочетании фотосинтеза, животноводства, кормопроизводства и ферментации с использованием наиболее подходящих организмов. Все это должно быть совмещено с инженерным обеспечением сбора урожая, его перевозки, обработки и получения конечного продукта. Единственным поставщиком энергии в такой системе является солнечный свет (этап фотосинтеза). Соответственно все другие потребности должны быть удовлетворены за счет комбинированных источников энергии (ископаемого топлива, электроэнергии или части самой биомассы). Следовательно, определяющим фактором является отношение количества солнечной энергии, запасенной в конечном продукте, к энергии, затраченной на его
производство. Очевидно, что в практической жизни вопросы экономии играют главную роль, однако в большинстве современных программ по использованию энергии биомассы им отводится второстепенное значение. На первом плане стоят задачи самообеспечения, обмена продукцией с другими странами^ увеличения занятости в сельской местности или использования излишков сельскохозяйственных продуктов. В результате правительствам приходится субсидировать программы по производству энергии из биомассы, однако эти вложения не имеют особого смысла, если весь процесс не дает энергетического выигрыша.
Солнечная энергий
Рис. 2.1. Взаимосвязи между биомассой и биотехнологией.
К сожалению, сегодня многие системы дают относительно небольшой энергетический «доход», а иногда энергия в них даже теряется. Следовательно, с биотехнологических позиций более всего нуждаются в усовершенствовании процессы, связанные именно с производством энергии. Прежде всего нужно увеличить «урожай энергии» с гектара посевов и уменьшить одновременно затраты на сельское хозяйство. Далее, необходимы энергетически более эффективные способы переработки, особенно лигноцеллюлозы. Наконец, мы должны научиться получать продукцию в более концентрированной форме для уменьшения энергетических затрат при переработке.
Таким образом, упор в этой области будет делаться на энергетическую сторону процессов производства биомассы и конверсии при фотосинтезе, животноводстве и ферментации.
Получение биомассы: технология, основанная на солнечной энергии
Солнце является неиссякаемым источником энергии. Каждый год на поверхность Земли поступает 3-2024 Дж энергии, в то время как запасы нефти, природного газа, угля, урана по оценкам эквивалентны 2,5-1022 Дж (8-1011 т в «угольном эквиваленте»), Понятно, что менее чем за неделю Земля получает от Солнца такое же количество энергии, какое содержится во всех невозобновляемых ее запасах. Проведем иное сравнение: если бы только 0,1 % поверхности Земли занимали коллекторы, использующие солнечную энергию с коэффициентом полезного действия около 10%, то были бы удовлетворены все текущие потребности в энергии в мире за год (3* 1020 Дж).
Однако у солнечной энергии есть два недостатка: она поступает неравномерно и диффузно. Поэтому необходимо, во- первых, разработать какие-то системы накопления, так чтобы энергия была доступна по потребности, а во-вторых, создать коллекторы большой площади. Оба этих фактора накладывают жесткие, но все же преодолимые экономические ограничения на использование систем на основе солнечной энергии. Производство биомассы путем фотосинтеза решает обе проблемы: во-первых, коллекторы могут быть выращены из семян и, во-вторых, получаемый продукт стабилен и может храниться. Впрочем, и при получении и использовании биомассы для выработки энергии возникают свои проблемы, которые, однако, уравновешиваются премуществами: ее можно получать во всем мире, она возобновляется и производится в согласии — в экологическом смысле ——с окружающей средой.
Преимущество использования солнечной энергии, заключенной в биомассе, в том, что она запасается в форме органических веществ и поэтому ее можно хранить и перемещать во времени и пространстве (табл. 2.1). К недостаткам относятся малая эффективность (обычно менее 1 % и редко более 2%) использования солнечной энергии при фотосинтезе, при образовании продукции растениеводства, диффузный, а часто и сезонный характер продукции и высокое весовое содержание влаги. По этим причинам для получения высококачественного, богатого энергией сырья необходимо осуществить его сбор, перевозку, удаление воды, концентрирование или же химическую или биологическую переработку и упаковку. Если же задачей является превращение биомассы в ценные виды топлива, то думать приходится не только об удалении воды и увеличении удельного содержания энергии, но и о том, как получить продукт, совместимый с технологией, для которой он предназначен.
Ранее основным путем использования растительного сырья в
ВыгодыВыгодыТаблица 2.1, Некоторые выгоды и проблемы внедрения технологий, предназначенных для получения энергии из биомассы
Выгоды
Выгоды
Проблемы
Экономия энергииВозобновляемостьГибкость технологий и разнообразие продуктов； высокое удельное содержание энергии в некоторых из нихДля внедрения уже разработанных технологий требуются небольшие капиталовложения; доступны при любом уровне доходовМогут быть внедрены на основе имеющихся рабочей силы и ресурсовХорошие перспективы развития биологических и инженерных основУвеличивается занятость и повышается квалификацияВо многих случаях — умеренная стоимостьЭкологическая безопасностьНе увеличивается содержание СО2 в атмосфереЭкономия энергииВозобновляемостьГибкость технологий и разнообразие продуктов； высокое удельное содержание энергии в некоторых из нихДля внедрения уже разработанных технологий требуются небольшие капиталовложения; доступны при любом уровне доходовМогут быть внедрены на основе имеющихся рабочей силы и ресурсовХорошие перспективы развития биологических и инженерных основУвеличивается занятость и повышается квалификацияВо многих случаях — умеренная стоимостьЭкологическая безопасностьНе увеличивается содержание СО2 в атмосфереКонкуренция за земельные и водные ресурсыНеобходимость отвода земельНа начальных этапах ——трудности с оценкой запасовЧасто — сложности в оценке себестоимостиНужны удобрения, земельные площади и водаЗависимость от существующих методов ведения сельского и лесного хозяйства, социальные факторыОбъемистое сырье: сложности с перевозкой и хранениемЗависимость от изменений климата Малая эффективность конверсии СезонностьКонкуренция за земельные и водные ресурсыНеобходимость отвода земельНа начальных этапах ——трудности с оценкой запасовЧасто — сложности в оценке себестоимостиНужны удобрения, земельные площади и водаЗависимость от существующих методов ведения сельского и лесного хозяйства, социальные факторыОбъемистое сырье: сложности с перевозкой и хранениемЗависимость от изменений климата Малая эффективность конверсии Сезонность
Экономия энергии
Возобновляемость
Гибкость технологий и разнообразие продуктов； высокое удельное содержание энергии в некоторых из них
Для внедрения уже разработанных технологий требуются небольшие капиталовложения; доступны при любом уровне доходов
Могут быть внедрены на основе имеющихся рабочей силы и ресурсов
Хорошие перспективы развития биологических и инженерных основ
Увеличивается занятость и повышается квалификация
Во многих случаях — умеренная стоимость
Экологическая безопасность
Не увеличивается содержание СО2 в атмосфере
Экономия энергии
Возобновляемость
Гибкость технологий и разнообразие продуктов； высокое удельное содержание энергии в некоторых из них
Для внедрения уже разработанных технологий требуются небольшие капиталовложения; доступны при любом уровне доходов
Могут быть внедрены на основе имеющихся рабочей силы и ресурсов
Хорошие перспективы развития биологических и инженерных основ
Увеличивается занятость и повышается квалификация
Во многих случаях — умеренная стоимость
Экологическая безопасность
Не увеличивается содержание СО2 в атмосфере
Конкуренция за земельные и водные ресурсы
Необходимость отвода земель
На начальных этапах ——трудности с оценкой запасов
Часто — сложности в оценке себестоимости
Нужны удобрения, земельные площади и вода
Зависимость от существующих методов ведения сельского и лесного хозяйства, социальные факторы
Объемистое сырье: сложности с перевозкой и хранением
Зависимость от изменений климата Малая эффективность конверсии Сезонность
Конкуренция за земельные и водные ресурсы
Необходимость отвода земель
На начальных этапах ——трудности с оценкой запасов
Часто — сложности в оценке себестоимости
Нужны удобрения, земельные площади и вода
Зависимость от существующих методов ведения сельского и лесного хозяйства, социальные факторы
Объемистое сырье: сложности с перевозкой и хранением
Зависимость от изменений климата Малая эффективность конверсии Сезонность
качестве топлива во всем мире (а сегодня — во многих развивающихся странах) было прямое сжигание главным образом древесины и ——в меньших масштабах — остатков урожая и навоза. В настоящее время на разных стадиях разработки находится ряд систем термической модификации такого сырья. Среди них ——установки на основе пиролиза, газификации и гидрогенизации. Отметим, что для всех этих процессов нужно сырье с относительно низким содержанием воды, а протекают они при высокой температуре. Биологические процессы обладают тем преимуществом, что для них пригодно сырье с высоким содержанием воды, а осуществляются они в интервале температур от 25 до 65 ℃. Разнообразие планируемых для использования видов сырья (биомассы) иллюстрирует табл. 2.2.
Сегодня для этой цели применяются главным образом сахарный тростник, кукуруза, древесина и стоки, навоз и бытовой мусор, а также отходы сельского хозяйства и промышленности: багасса, меласса, побочные продукты производства бумаги и целлюлозы.
Таблица 22 Источники биомассы для выработки топлива
Отходы
Наземные растения
Водные растения
Навоз
Активный ил
Бытовой мусор
Пищевые отходы Стоки
Отходы древесины, сахарного тростника
Солома
Шелуха
Корки цитрусовых
Багасса
Меласса
Л игноцеллюлоза
Деревья: эвкалипты тополя ели, сосны Leucaena, Casuarina
Культуры, содержащие крахмал
Кукуруза
Кассава
Культуры, содержащие сахар
Сахарный тростник
Сахарная свекла
Водоросли
Одноклеточные:
Chlorella
Scenedesmus
Navicula
Многоклеточные: бурые водоросли
Растения
Водяной гиацинт
Тростник, камыш
Ресурсы
Основными поставщиками биомассы, идущей на топливо, служит сельское и лесное хозяйство. Пытаясь оценить их нынешние возможности, следует, видимо, исходить из наличных земельных площадей, урожайности современных культур, продуцирующих сахар и крахмал, и числа работников, занятых в сельском хозяйстве. Ежегодный прирост биомассы во всем мире составляет около 2-1011 т (табл. 2.3), из них приблизительно 1,2-1011 т со-
Таблица 2.3. Годовой прирост биомассы в тоннах
Общая первичная продукция (органические ве-
2.1011
щества)
Леса (сухое вещество)
9-1010
Зерновые (урожай)
1,5-109
в пересчете на крахмал^
1 • 109
Корнеплоды (урожай)
5,7・ 108
в пересчете на крахмал
2,2-108
Культуры, дающие сахар (урожай)
1 • 109
в пересчете на сахар
9 • 10'
ставляет древесина (в пересчете на сухое вещество). Примерно 60% вырубаемой древесины используется как топливо. Если потребление и возобновление леса сбалансированы, то прирост, не идущий сегодня в дело, составляет 3-1010 т, что эквивалентно около 1010 т целлюлозы.
Данные о распределении лесов во всем мире приведены в табл. 2.4. В ней же указаны земельные площади, используемые
Таблица 2.4. Наличные земельные площади и их использование (в %)
Земельная площадь, млн. га
Площади, занятые многолетними культурами
Пашни
Пастбища
Леса
Орош а- емые земли
Во всем мире
13 078
0,7
10
23
32
Развитые страны
5 484
0,4
12
23
34
0,9
Развивающиеся страны
7 593
0,9
10
23
30
США
936
0,2
20
26
31
18,4
Канада
922
—
5
3
36
0,05
Европа
472
3,2
30
19
32
2,8
СССР
2 227
仇2
10
17
41
0,7
Азия
2 757
1,0
16
20
22
4,6
Южная Америка
1 753
1,2
65
25
53
Африка
2 964
0,5
7
27
22
0,3
Океания
842
0,1
5
56
22
разными отраслями растениеводства, а также площади орошаемых земель. В табл. 2.5 указаны площади, занимаемые ле-
Таблица 2.5. Площади, занимаемые лесами, и запасы древесины
Площадь лесов, млн. га
Запасы древесины
всего, млн. м3
м3/га
м3 на душу населения
США
220
20 200
92,1
95,3
Канада
250
17 800
71,2
809,1
Европа
144
14 900
103,5
29,1
СССР
770
81 800
106,2
324,6
Азия и Океания
448
38 70Q
72,9
18,7
Южная Америка
631
92 000
145,8
362,2
Африка
188
35 200
187,2
90,0
сами, запасы древесины в них и, кроме того, доступное для использования ее количество в пересчете на душу населения. Обращают на себя внимание два обстоятельства: во-первых, колоссальные запасы древесины в Канаде, СССР и Южной Америке (в основном в Бразилии и тропиках) и, во-вторых, нехватка ее в настояще время в Азии, где быстро растущее население расходует биомассу в основном на топливо, используя ее. с малой эффективностью, без регулярного возобновления.
Нынешний уровень производства сахара и крахмала из основных сельскохозяйственных культур в мире представлен в табл. 2.6. Эти данные позволяют еще раз обратить внимание на хорошо известный факт: в развивающихся странах общая уро-
®s
■S
S
S
03
СО
二
ООСО3990，
« 1 00-1 11 £ ^ ^ н - 1
—
2 1 21111 Й51
6 寸 6116099旦
-
9工
一
oz 寸СЧ 寸 COQOCNVOOOOg*
gg。6coi 16ts
C4ZO9go8i6寸 I2
Z C ZI890
二
OZC4о 寸 z 8co 088Si
6，00C8iOi9OW
ZCFI100a 寸 Z
—
z 6m06co ggi665
—мIICiCO'—'IО。&•
91g106c СЧ0068О_
89cM9 — 860I2
CO a—
二
9 寸 g61000968co
счюс寸co 寸 сч 11g®
—
g cgH
99。g80s
9 c 寸1虫 —U
COCO8_
—
OZZZ 6r СЧО8 叱 В二
寸
69m1861yfi9O。
寸 co —9 寸 寸
в о4 IIл
2 s
二
6g 91coi0g甘
—寸 acQiiioiо
-
虫 寸 &9s
10900z寸寸 8O99i°
寸 Z9ZC4i9г
X га
й Й g爲;
—
0 co 9CO1coe0gl9[
69cZ寸 6cMi访
二
96 寸a寸 g江
gzgoo 19«
—
COx
g09
3|1Go09cMM
Z9CO I£
3Xd°
d廿'<UwM
h 3 力S
^ss^Scq-I 1 Иs 2
add umhuv&vo?
жайность обычно гораздо ниже, чем в Северной Америке и Европе, где она наиболее высока. Особенно низка урожайность в африканских и многих азиатских странах.
Приведенные здесь данные проливают свет на причину многих конфликтов при получении энергии за счет биомассы в странах, где не хватает древесины и продуктов питания и где нужно разрешать дилемму: что важнее — пища или энергия. Отметим, тто если удастся повысить продуктивность и сельского, и лесного хозяйства, то можно решить обе задачи. Применение агролесных комплексных систем поможет смягчить остроту многих таких проблем. Для этого нужно оценить пределы продуктивности с учетом эффективности фотосинтеза, пределов урожайности культур и особенно в зависимости от внешних источников энергии в сельском хозяйстве и эффективности ее применения. Еще одна возможность интенсификации заключается в отборе или выведении новых, дающих высокий выход биомассы разновидностей растений, которые можно выращивать на засушливых, болотистых, засоленных или излишне обводненных землях, продуктивность которых сегодня не идет в сравнение с достигнутой в сельском или лесном хозяйстве. Рассмотрим все эти вопросы более подробно.
Фотосинтез
Фотосинтез является ключевым процессом жизнедеятельности и осуществляется в основном в растениях. В простейшей форме он описывается реакцией
Растения
Н2О + СО2 —>- Органические вещества + О2.
Солнечная энер-гия
Кроме углерода, водорода и кислорода в ходе светозависимых реакций, протекающих в растениях, в состав органических веществ включаются также азот и сера.
Основные процессы фотосинтеза сегодня уже хорошо известны. Они протекают в хлоропластах (рис. 2.2), которые поглощают СО?, поступающий в растение путем диффузии. Первичный процесс карбоксилирования осуществляется в строме (части хлоропласта, содержащей мало мембран) и катализируется рибулозобисфосфат-карбоксилазой (РБФК). В результате образуются две молекулы трехуглеродной кислоты (фосфоглицерата, ФГ), которые затем восстанавливаются с образованием молекул трехуглеродного сахара — триозофосфата. Это вещество в хлоропластах служит предшественником крахмала, но может поступать и в цитоплазму, где оно используется при синтезе сахарозы. Часть связанного углерода повторно поступает в вое-
становительный пентозофосфатный цикл (ВПФ-цикл), поддерживая фонд акцептора СО2, рибулозобисфосфата.
ВПФ-цикл《работает》в направлении синтеза, используя энергию гидролиза АТР и окисления NADPH. АТР и NADPH
Рис. 2.2. Хлоропласты высшего растения.
образуются в ходе так называемых световых реакций фотосинтеза, которые идут в мембранных (тилакоидных) структурах хлоропластов. Для восстановления СО2 до СН2О нужно не менее четырех электронов. Имеющиеся на сегодня данные говорят в пользу «Z-схемы» фотосинтеза, который протекает в резуль-
тате кооперативного взаимодействия двух фотосистем (ФС I и ФС II, рис. 2.3), объединенных связующей цепью реакций переноса электрона. Восстановление NADP до NADPH происходит в ФС I при участии содержащего серу и железо белка ферредоксина.
-0,8
П~кП~кСВЕТ (фотосистема II, 4 фотона)СВЕТ (фотосистема II, 4 фотона)Рис. 2.3. Схема переноса электронов при фотосинтезе.Рис. 2.3. Схема переноса электронов при фотосинтезе.
П~к
П~к
СВЕТ (фотосистема II, 4 фотона)
СВЕТ (фотосистема II, 4 фотона)
Рис. 2.3. Схема переноса электронов при фотосинтезе.
Рис. 2.3. Схема переноса электронов при фотосинтезе.
Свет улавливается своеобразными антенными хлорофилл- белковыми комплексами, и энергия его передается в реакционный центр (Р7Оо) ФС I, представляющий собой особым образом устроенный комплекс хлорофилла а и белка. Здесь происходит разделение заряда, и в результате восстанавливается ферредоксин. Электроны поступают от воды и передаются на Р7оо по связующей электрон-транспортной цепи от ФС II. В ходе идущей при участии ФС II реакции из воды образуется О2.
Переносчики электронов располагаются внутри мембраны тилакоидов таким образом, что поперек нее формируется электрохимический градиент, сопряженный с переносом электронов.
Соответствующий электрохимический потенциал используется для синтеза АТР. Белок, участвующий в этом процессе, известен как сопрягающий фактор и обладает свойствами обращенной АТРазы.
Длина волны света, поглощаемого хлорофиллами и другими фотосинтетическими пигментами, определяется свойствами этих молекул; именно от этого зависит, какая часть солнечного спектра может быть использована растениями (фотосинтетически активная радиация, ФАР). Она составляет в пересчете на энергию 45—50% всего падающего на растение солнечного света. Способность улавливать свет — первый из ограничительных факторов, определяющий эффективность фотосинтеза, если исходить из количества падающего света.
При малой освещенности фотосинтез лимитируется световыми реакциями, а при более высокой интенсивности света или более низкой температуре — возможностями темновых реакций метаболизма углерода. У многих С3-растений умеренного климата световое насыщение наблюдается при 100—150 Дж/м-2- -с"1, что соответствует 50%-ной интенсивности солнечного света. При высоких интенсивности света и температуре влаги обычно не хватает (водный стресс). Стресс выражается в закрытии устьиц и подавлении метаболизма углерода. Таким образом, в полевых условиях взаимодействие световых и темновых реакций и их регуляция за счет диссипации (рассеивания) излишней световой энергии становятся определяющими.
В функционирующих хлоропластах каждая электрон-транспортная цепь может осуществлять акт передачи каждые 15 мс. На ярком свету молекула хлорофилла в среднем поглощает фотон один раз в 100 мс, а в условиях слабого или рассеянного освещения даже реже. Однако, поскольку каждый реакционный центр связан с несколькими сотнями светособирающих молекул пигмента, интенсивность переноса электронов увеличивается. Время с момента поглощения света до попадания возбуждения в ловушку измеряется пикосекундами. Однако перенос электрона осуществляется медленно, и лимитирующая реакция синтеза АТР протекает за время порядка 20 мс.
Как показано на рис. 2.3, в ходе фотосинтеза энергия электронов изменяется от потенциала воды (+0,8 В) до потенциала СН2О (—0,43 В). Эта разность потенциалов эквивалентна 480 кДж. Таким образом, ВПФ-цикл должен был бы работать с высокой эффективностью, чего в действительности не наблюдается.
Все дело в том, что фермент РБФК способен катализировать и окислительную реакцию между РБФ и О2, в результате которой образуются ФГ и фосфогликолат. Эта окислительная реакция конкурирует с реакцией карбоксилирования за 2 ФГ, в ре-
зультате чего углерод направляется по C-2-пути фотодыхания,, в ходе которого образуется СО2, утрачиваемый растением.
В результате окислительных процессов и фотодыхания в Сз-растениях эффективность фотосинтеза уменьшается на 15—— 50% в зависимости от вида растений и условий окружающей среды. Эти изменения обусловлены действием нескольких факторов: 1) потерей субстрата карбоксилирования; 2) потерей углерода из ВПФ-цикла; 3) потерей СО2 растением; 4) уменьшением диффузионного градиента, способствующего диффузии в растение.
Скорость фотосинтеза зависит от поступления СО2 в лист, что в свою очередь зависит от градиента концентрации СО2 и от ряда противодействующих факторов, связанных с наличием физических и биологических барьеров для диффузии и ассимиляции:
Р^К^СО^ + г. + г^
где К — коэффициент диффузии; ri соответствует разным типам противодействия. Варьирующее противодействие при диффузии г2 ——это сопротивление устьиц. Сила его контролируется светом, водой и концентрацией СО2. В частности, при недостатке воды устьица смыкаются.
Противодействие гз (сопротивление мезофилла) зависит от наличия ферментных компонентов, способных к ассимиляции СО2. Сродство фермента РБФК можно охарактеризовать константой Михаэлиса (Км). Согласно большинству последних оценок, Км по СО2 для РБФК составляет 10—20 мкМ, что эквивалентно содержанию СО2 в атмосфере, находящемуся в равновесии с содержанием его в воде. Другими словами, если в клетке нет механизма концентрирования СО2, то этот фермент будет работать со скоростью, равной примерно половине оптимальной.
Механизмы концентрирования СО? существуют у некоторых водорослей и ряда высших растений с С4-типом фотосинтеза. Группа С4-растений включает несколько родов； в основном это тропические растения. К их числу принадлежат такие коммерчески важные культуры, как сахарный тростник, кукуруза и сорго, а также тропическая «слоновья трава》(Pennisetum). В опытах с этими растениями была зарегистрирована максимальная скорость образования сухого вещества: у них имеется дополнительный цикл карбоксилирования (С4-путь), который работает, как насос, перекачивающий СО2 из атмосферы к месту восстановительной реассимиляции за счет ВПФ-цикла в клетках об* кладки проводящих пучков. Вначале углекислый газ атмосферы ассимилируется с образованием четырехуглеродных кислот (малата и аспартата) в наружном (мезофильном) слое фотосинтезирующей ткани. Эти кислоты переносятся в слой клеток об-
кладки проводящих пучков, где СО2 высвобождается и заново ассимилируется. В результате этого процесса фотодыхание в Сграстениях не так выражено, что увеличивает скорость фотосинтеза и продуктивность. Впрочем, хотя эти растения и ассимилируют углерод более эффективно, они потребляют допол- яительную энергию для осуществления реакций Сунута, и поэтому менее эффективно используют энергию света. С4-растения также с большим успехом используют воду и меньше страдают от повышенной температуры. Отметим, однако, что лишь немного видов С4-растений способны хорошо расти в местностях с умеренным климатом. ,
'2.3.1. Эффективность фотосинтеза
Эффективность фотосинтеза с точки зрения производства биомассы можно оценить через долю общей солнечной радиации, попадающей на определенную площадь за определенное время, которая запасается в органических веществах урожая. Продуктивность системы можно оценить по количеству органического сухого вещества, получаемого с единицы площади за год, и выразить в единицах массы (кг) или энергии (мДж) продукции, полученной с гектара за год.
Выход биомассы зависит, таким образом, от площади коллектора солнечной энергии (листьев), функционирующих в течение года, и числ<а дней в году с такими условиями освещенности, когда возможен фотосинтез с максимальной скоростью, что определяет эффективность всего процесса. Результаты определения доли солнечной радиации (в %), доступной растениям ^фотосинтетически активной радиации, ФАР), и знание основных фотохимических и биохимических процессов и их термодинамической. эффективности позволяют рассчитать вероятные предельные скорости образования органических веществ в пересчете на углеводы.
Растения используют свет с длиной волны от 400 до 700 нм, т\ е. на долю ФАР приходится 50% всего солнечного света. Это соответствует интенсивности на поверхности Земли 800— 1000 В т/м2 за обычный солнечный день (в среднем). Усредненная максимальная эффективность превращения энергии при фотосинтезе на практике составляет 5——6%. Эти оценки получены на основе изучения процесса связывания СО2, а также сопутствующих физиологических и физических потерь. Одному молю связанного СО2 в форме углевода соответствует энергия 0,47 МДж, а энергия моля квантов красного света с длиной волны 680 нм (наиболее бедный энергией свет, используемый в фотосинтезе) составляет 0,176 МДж. Таким образом, минимальное число молей квантов красного света, необходимое для свя-
зывания 1 моля СО2, составляет 0,47:0,176 = 2,7. Однако, поскольку перенос четырех электронов от воды для фиксации одной молекулы СО2 требует не менее восьми квантов света, теоретическая эффективность связывания равна 2,7:8 = 33%. Эти расчеты сделаны для красного света; ясно, что для белого света эта величина будет соответственно ниже. В наилучших полевых условиях эффективность фиксации в растениях достигает 3%, однако это возможно лишь в короткие периоды роста и, если пересчитать ее на весь год, то она будет где-то между 1 и 3%.
На практике в среднем за год эффективность фотосинтетического преобразования энергии в зонах с умеренным климатом составляет обычно 0,5—1,3%, а для субтропических культур — 0,5—2,5%. Выход продукта, который можно ожидать при определенном уровне интенсивности солнечного света и разной эффективности фотосинтеза, легко оценить из графиков, приведенных на рис. 2.4.
Эффективность фотосинтезаЭффективность фотосинтезаСреднее количество солнечной энергии за год, Вт/м2 (100 Йт/м2- 3150 МДж/м 2 за год)Среднее количество солнечной энергии за год, Вт/м2 (100 Йт/м2- 3150 МДж/м 2 за год)Рис. 2.4. Ожидаемая (хорошая) урожайность однолетнего растения как функция годичной солнечной энергии при разной эффективности фотосинтеза (Hall* 1982).Рис. 2.4. Ожидаемая (хорошая) урожайность однолетнего растения как функция годичной солнечной энергии при разной эффективности фотосинтеза (Hall* 1982).чо」BlqooBW МОХА。^охътчо」BlqooBW МОХА。^охът
Эффективность фотосинтеза
Эффективность фотосинтеза
Среднее количество солнечной энергии за год, Вт/м2 (100 Йт/м2- 3150 МДж/м 2 за год)
Среднее количество солнечной энергии за год, Вт/м2 (100 Йт/м2- 3150 МДж/м 2 за год)
Рис. 2.4. Ожидаемая (хорошая) урожайность однолетнего растения как функция годичной солнечной энергии при разной эффективности фотосинтеза (Hall* 1982).
Рис. 2.4. Ожидаемая (хорошая) урожайность однолетнего растения как функция годичной солнечной энергии при разной эффективности фотосинтеза (Hall* 1982).
чо」BlqooBW МОХА。^охът
чо」BlqooBW МОХА。^охът
Интенсификация фотосинтеза методами биотехнологии
Увеличение выхода биомассы за год в существующих сегодня системах растениеводства может быть достигнуто двумя путями: во-первых, за счет увеличения скорости фотосинтеза до пре*
делов, возможных в оптимальных условиях, во-вторых, путем удлинения периода оптимального фотосинтеза.
Для того чтобы достичь этой цели, необходимо оценить относительную важность различных факторов, ограничивающих фотосинтез. Действие этих факторов определяется как внутренними фотобиологическими и физиологическими ограничениями,, так и теми характеристиками окружающей среды, которые сказываются на проявлении этих лимитирующих факторов. К числу таких важнейших факторов относятся: индекс урожайности^ свет, СО2, вода, температура, питательные вещества, вредители и болезни, влияние кислорода и фотодыхание, темновое дыхание, ограничение скорости переноса электронов, содержание ферментов карбоксилирования, светособирающих пигментов, диссипация энергии в побочных реакциях и скорость переноса веществ из хлоропластов.
Действие основных лимитирующих факторов можно ослабить путем увеличения энергетических затрат при культивировании, но к их числу относятся и неконтролируемые факторы внешней среды. Для получения большого количества биомассы нужны тщательный отбор и выведение сортов растений, способных эффективно использовать благоприятные условия окружающей среды при минимальных затратах.
Наибольшие успехи в повышении урожайности' сельскохозяйственных культур были достигнуты путем улучшения как селекционной работы, так и агротехники. Однако в общем селекция была в основном направлена на увеличение индекса урожайности культур, а не общего количества собираемой биомассы.
Приросты урожайности за счет улучшения агротехники обычно связаны с увеличением энергозатрат (в форме горючего для тракторов, удобрений и средств защиты растений, получаемых за счет ископаемого топлива). В результате урожай с единицы площади возрастает, но в пересчете на затраченную энергию падает. Такие изменения приемлемы при выращивании пищевых культур, но нежелательны для «энергетических», когда необходимо получить большой урожай биомассы при малых энергозатратах. Ясно, что эффективные системы производства биомассы потребуют дополнительного вклада энергии. Величину его, а также ожидаемый выигрыш (в смысле увеличения энергопродуктивности) еще предстоит оценить.
Существенное увеличение выхода продукции было достигнуто в ходе отбора растений с листьями оптимальной формы, ригидности и расположения, имеющих улучшенный тип кроны и способных эффективнее улавливать свет. В принципе эффективность фотосинтеза можно повысить и путем изменения одного или нескольких составляющих его процессов или' факторов:：
улавливания света и переноса электронов; 2) усвоения углекислого газа и регуляции реакций основного обмена углерода, включающих темновое дыхание и фотодыхание; 3) свойств мембран, особенно структуры липидов и температурной чувствительности; 4) анатомических признаков для увеличения экономичности использования СО? и воды.
Проведя оценку существующих сортов культур как потенциальных продуцентов биомассы, мы можем улучшать их путем применения новых способов разведения, изучения их фотосинтетических возможностей и размножения растений нетрадиционными способами. Реализовать эта возможности в будущем ломожет использование технологии рекомбинантных ДНК. Для продвижения вперед в этой области нам необходимо: 1) разработать методы выявления положительных изменений в фотосинтезе и приспособить сложные лабораторные тесты для работы в долевых условиях; 2) предложить методы усиления генетической изменчивости; 3) понять, как организован геном растений и хромосома хлоропласта и как регулируется их работа; 4) выявить типы изменений, которые могут быть в них вызваны; 5) разработать новые способы селекции, направленные на ускорение размножения и генетическую стабилизацию сортов.
Методы усиления генетической изменчивости многообразны: для этой цели используют .культуру тканей, слияние протопластов, перенос одиночных генов, гаплоиды., опыление облученной пыльцой, химический мутагенез, замену митохондриальных и хлоропластных геномов и т. д. Направленный перенос распоз наваемых признаков может быть осуществлен методами гене， тической инженерии. Здесь стоят проблемы выбора вектора, включение гена в геном и экспрессии нового признака в условиях сложной системы регуляции у растений как на генетическом, так и на метаболическом уровне.
Таким образом, работы по увеличению продуктивности растений, выращиваемых для получения энергии (биомассы), в опытах in vitro будут успешными, если мы: 1) установим генетические пределы продуктивности; 2) выявим индивидуальные гены, ответственные за это свойство (признаки); 3) выделим ДНК или РНК, кодирующие эти признаки; 4) встроим их при помощи ферментов рестрикции и лигаз в подходящий вектор для амплификации в бактериях; 5) введем накопленный таким путем материал в вектор, подходящий для его переноса в желаемый вид растений; 6) стабилизируем введенную ДНК в геноме нового хозяина таким образом, чтобы она экспрессировалась как доминантный признак, наследуемый по законам Менделя; 7) разработаем методы скрининга для выявления таких измененных растений; 8) будем применять альтернативные подходы, используя для увеличения изменчивости и менее спе-
цифичные методы, например мутагенез (химический и радиационный) при работе с культурами тканей и протопластов или естественную изменчивость, с отбором форм с более эффективным фотосинтезом.
Хотя сведения о ядерном геноме и пластоме хлоропластов, а также о механизмах регуляции работы генов при синтезе белков в хлоропластах и других частях клеток накапливаются очень быстро, воплощение генно-инженерных возможностей в практику — дело будущего, отстоящего на десятилетия. Отметим также, что для решения проблемы продуктивности особое внимание уделяется сегодня развитию фундаментальной фотобиологии. Предполагается, что в будущем эти знания воплотятся в практику. Пока этого не произошло, производство топлива из биомассы должно опираться на обычное сельское и лесное хозяйство.
Сельское и лесное хозяйство
Соотношение видов энергии
При анализе работы любой сельскохозяйственной системы важно учитывать, как соотносится количество энергии, запасенной в системе, с энергозатратами на ее получение (отношение энергии на входе и выходе). Для систем по производству биомассы это имеет особое значение. Табл. 2.7 дает представление о ве-
Таблица 2.7. Соотношение энергонакопления и энергозатрат в сельском хозяйстве Англии
В среднем по фермамСпециализированным молочнотоварнымГлавным образом молочнотоварнымПоставляющимкрупный рогатый скот и овецовецсвиней и птицу злаковыеЯчмень (и овес)Кукуруза (на зерно)Пшеница (на зерно)КартофельСахарная свеклапо сахаруобщий выходВ среднем по фермамСпециализированным молочнотоварнымГлавным образом молочнотоварнымПоставляющимкрупный рогатый скот и овецовецсвиней и птицу злаковыеЯчмень (и овес)Кукуруза (на зерно)Пшеница (на зерно)КартофельСахарная свеклапо сахаруобщий выход5 ^^ ^94346 6‘'2 сГ о 00012231 345 ^^ ^94346 6‘'2 сГ о 00012231 34ТравыПри малой эффективности только выпас выпас и сеноПри высокой эффективности сеносилосГорох свежий консервыМорковьБрюссельская капустаТепличный салат'Птица (мясо)(яйца)РыбаМолокоТравыПри малой эффективности только выпас выпас и сеноПри высокой эффективности сеносилосГорох свежий консервыМорковьБрюссельская капустаТепличный салат'Птица (мясо)(яйца)РыбаМолоко161622001000000220010000004 4 9 11 24 4 9 11 22001 I052001 I0544
В среднем по фермам
Специализированным молочнотоварным
Главным образом молочнотоварным
Поставляющим
крупный рогатый скот и овец
овец
свиней и птицу злаковые
Ячмень (и овес)
Кукуруза (на зерно)
Пшеница (на зерно)
Картофель
Сахарная свекла
по сахару
общий выход
В среднем по фермам
Специализированным молочнотоварным
Главным образом молочнотоварным
Поставляющим
крупный рогатый скот и овец
овец
свиней и птицу злаковые
Ячмень (и овес)
Кукуруза (на зерно)
Пшеница (на зерно)
Картофель
Сахарная свекла
по сахару
общий выход
5 ^^ ^94346 6‘'2 сГ о 00012231 34
5 ^^ ^94346 6‘'2 сГ о 00012231 34
Травы
При малой эффективности только выпас выпас и сено
При высокой эффективности сено
силос
Горох свежий консервы
Морковь
Брюссельская капуста
Тепличный салат
'Птица (мясо)
(яйца)
Рыба
Молоко
Травы
При малой эффективности только выпас выпас и сено
При высокой эффективности сено
силос
Горох свежий консервы
Морковь
Брюссельская капуста
Тепличный салат
'Птица (мясо)
(яйца)
Рыба
Молоко
16
16
22001000000
22001000000
4 4 9 11 2
4 4 9 11 2
2
001 I05
2
001 I05
4
4
личине этого отношения и иллюстрирует некоторые проблемы энергетически интенсивного сельского хозяйства, возникающие, например, при выращивании растений в теплицах. Она иллюст-
рирует также малую эффективность превращения энергии в системах, включающих животных. В доступную для использования форму^ превращается лишь одна десятая часть энергии, потребляемой животными и растениями, выращиваемыми в теп- лицах. И тепличные растения, и продукция животноводства —— важные компоненты современного сельского хозяйства. Отме・ мим, однако, что небольшое уменьшение поголовья животных, выращиваемых для употребления в пищу, если это окажется целесообразным, высвободит большое количество органических продуктов, которые могут быть использованы как пища, топли- во и т. д. Сопоставление величин энергетического коэффициента (выход/вход) при производстве зерна кукурузы в США показа- 』。,что он уменьшился с 3,7 в 1945 г. до 2,8 в 1970 г. Важно отметить, что удвоение урожая было достигнуто за счет увели- чения втрое энергозатрат, в основном вследствие более широко- го применения удобрений. В Великобритании кукурузу выращи- ^ают в основном на корма, т. е. растения используются целиком, и поэтому энергетический коэффициент варьирует от 5 до 9. Если бы удалось уменьшить потребление широко используемых азотных удобрений (а на их долю приходится часто до 50% энергозатрат) без уменьшения урожая, например путем биологической фиксации азота, использования навоза или ила из биореакторов, то мы бы сэкономили много энергии. Хотя в прошлом практика широкого применения азотных удобрений и критиковалась, следует отметить, что на каждый джоуль энергии, затраченный на азотные удобрения для растений, приходится 4—6 Дж запасенной ими энергии. Фотосинтез выступает в роли катализатора, обеспечивающего «прирост» энергии, но растения не могут эффективно развиваться в отсутствие оптимального количества азота (как и других элементов: фосфора, калия и микроэлементов) .
Во многих отраслях сельского хозяйства значительная часть образовавшейся биомассы остается после уборки в почве или на ее поверхности. Проблема интегрированной системы топли- во/пища заключается в том, что, поскольку использоваться могут все части растений, все их можно и убирать, но такая практика недопустима. Вынос минеральных питательных веществ при рубке леса можно компенсировать внесением неорганических удобрений, но в тропиках, где почвы обычно более 《слабые》， эта мера часто оказывается недостаточной, так как главным фактором устойчивости почвы являются ее органические компоненты. Они служат источником питательных веществ для различных микроорганизмов, осуществляющих процессы минерализации и фиксации атмосферного азота, а также ответственны за улучшение комковатой структуры почв и их способность удерживать воду. В делом из экосистем, не получающих под-
крепления извне, можно изымать не более 10—20% ежегодного прироста сухого вещества, однако и это относится лишь к случаям, когда большую часть года существует сомкнутый листовой полог. Если почва оголена, то скорость потери органического вещества возрастает. Когда целью сельского и лесного хозяйства является производство и топлива, и пищи, следует совместно выращивать деревья и полевые культуры таким образом, чтобы в системе происходило достаточное накопление или возврат органического вещества.
Древесина как сырье для производства биотоплива
Как сырье для производства биотоплива древесина обладает рядом достоинств: выход продукции в пересчете на гектар очень высок; из древесины мы получаем значительно больше биомассы, чем из любого другого источника; разведение лесов требует гораздо меньших вложений, чем выращивание других культур. К числу недостатков нужно отнести длительность роста до зрелости, а также тот факт, что главный компонент древесины, лигноцеллюлоза, очень сложна для переработки. В ближайшем будущем наиболее удобным и доступным источником сырья будут отходы деревообрабатывающей промышленности, но впоследствии все возрастающее значение будет приобретать «выращивание топлива》. Поскольку основные затраты связаны с очисткой земли и посадкой, особое внимание уделяется сегодня выращиванию твердодревесинного быстрорастущего порослевого леса. Здесь дело, вероятно, можно организовать так, чтобы получать продукцию каждые пять лет. Подсчитано, что лесоводческая «энергоферма» может ежегодно давать около 10—30 т биомассы с гектара.
С начала 50-х годов нашего века в Аргентине и Бразилии на таких энергофермах на относительно большой площади (8000 га) выращивали эвкалипт и производили древесный уголь для выплавки стали. В других странах (например, в Южной Америке и Австралии) производят древесную массу, используемую для получения ацетатцеллюлозного волокна. В больших масштабах таким путем производят сырье для выработки бумаги и лесоматериалов. В зонах умеренного климата пробуют выращивать Salix и Populus, а в тропиках — Leucaena и Casuarina, но больше всего продукции (в тех местах, где их можно выращивать) дают Eucalyptus.
Eucalyptus —зто род вечнозеленых растений, в состав которого входит более 450 видов, разновидностей и гибридных форм. Большинство их происходит из Австралии, где на их долю приходится до 95% древесины леса. Они растут там и в сухих, и в заболоченных местах, на почвах самых разных типов. Сегодня
они встречаются уже почти по всему земному шару, кроме регионов, где бывают морозы или же нерегулярно выпадают дожди. При благоприятных условиях они растут быстрее, чем породы с мягкой древесиной (например, Pinus radiata). Спустя Ю лет после посадки годовой прирост древесины составляет Ю т на гектар. Такие приросты получают лишь в посадках Pinus radiate двадцатипятилетнего возраста.
Наилучший результат был получен в хозяйстве Aracruz pulp and fuelwood, расположенном в 500 км к юго-востоку от Рио-де- Жанейро: при выращивании в отличных погодных условиях отборных сортов Eucalyptus на площади 50 000 га удалось получить за год 45 т древесины с гектара. Посадочный материал получали путем вегетативного размножения эксплантатов листьев.
Трудности в использовании древесины или лигноцеллюлозы в качестве сырья для производства жидких энергоносителей заключаются в том, что переработка их сложна: ведь для получения такого топлива, как этиловый спирт, или же такого химиката, как бутанол, необходимы относительно чистые растворы соответствующих сахаров.
Водоросли 〃 водные растения
Потенциальный урожай биомассы у пресноводных и морских растений весьма велик, но чрезвычайно большое содержание воды во многих этих растениях при сборе и сложность сушки на солнце препятствуют использованию их как топлива путем прямого сжигания. По этой причине наиболее подходящей технологией переработки водных растений и сырых отходов земледелия в топливо, корма и удобрения является анаэробная ферментация. Эти растения просто процветают в сточных водах. Они успешно очищают воду и хорошо при этом растут. Таким образом, они могут играть двойную роль: улучшать состояние окружающей среды и служить важным источником энергии.
В ряде стран из водяных гиацинтов получают биогаз. Их стали использовать для этой цели, поскольку растения эти исключительно быстро растут, причем на поверхности водыг и их легко собирать. Можно использовать и водоросли, растущие в прудах, в которых перерабатываются сточные воды, содержащие органические вещества (которые загрязняют среду и/или требуют больших затрат на удаление). Такая технология особенно пригодна для стран, где много солнца и к тому же нередко возникают проблемы переработки жидких отходов.
Саму идею использовать водоросли и бактерии в биологических системах, функционирующих за счет энергии солнечного света, нельзя считать новой, но в последнее время на нее стали обращать больше внимания. Одно из достоинств микробиологи-
ческих систем заключается в том, что в зависимости от условий они могут быть или технологически сложными, или же простыми. Выбор наиболее подходящей системы определяется местными «за и против», например соленостью и температурой. Избранные для культивирования виды в этом случае легко приспосабливаются к окружающей среде.
Многие жидкие и полутвердые отходы — идеальная среда для роста фотосинтезирующих водорослей и бактерий. При хороших условиях они быстро наращивают биомассу и осуществляют эффективное превращение солнечной энергии (3,5%); выход продукции составляет 50——80 т с гектара в год. Собранные водоросли можно прямо скармливать животным, получать из них метан или сжигать для получения электроэнергии. При этом одновременно происходит переработка отходов и очистка воды. По существующим оценкам затраты на такие системы в условиях Калифорнии составляют 50—75% от затрат на обычные системы переработки сточных вод. Главная хозяйственная проблема здесь — затраты на сбор продукции. Ее можно решить, используя иные виды водорослей, которые легче собирать, и новые технические приемы «сбора урожая». Для полной переработки жидких стоков сегодня пытаются применять двухступенчатые водоемы с водорослями. В первом водоеме выращивают водоросли, которые собирают путем фильтрации, во втором — азотофиксирующие сине-зеленые водоросли (их тоже легко собирать) ;питательные вещества для их роста поступают из первого водоема. Для увеличения продуктивности можно использовать и промышленные отходы, включая СО2. Из собранной биомассы путем сбраживания можно получать метан (в пересчете на энергию— 1,1 МДж на килограмм водорослей), причем отходы от такой переработки будут содержать практически весь азот и фосфор биомассы водорослей. Это хорошее удобрение для сельского хозяйства. Один гектар водорослевых прудов может давать удобрения для 10—50 гектаров полей.
Путем оптимизации урожаев удается получить в форме метана до 200 КДж с гектара в год с учетом энергозатрат и потерь при переработке. На широте 30° это соответствует годовой эффективности фотосинтетических процессов, равной 1,5%.
В Калифорнии средний урожай водорослей составляет более 100 кг сухого вещества с гектара в декаду. Летом он бывает в три раза больше. При урожае 50—60 т сухого вещества с гектара в год из него можно получать 74 000 кВт/ч электроэнергии. Были сооружены водорослевые пруды объемом 106 л, в которых фотосинтез идет равномерно и с эффективностью 2—3%. При крупных предприятиях по откорму скота и птицы водоросли выращивают в прудах, куда поступают отходы животноводства. Около 40% азота отходов фиксируется водорослями, которые
затем скармливают животным. В культивируемых сегодня зеленых водорослях содержится 50—60% белка, а в сине-зеленых, с которыми ведутся опыты, содержание экстрагируемого белка доходит до 60—70%. Водорослевые пруды, в которых перерабатываются стоки, нашли применение по меньшей мере в десяти странах, и интерес к таким системам как возможным поставщикам энергии и удобрений все возрастает.
Отметим, что из водорослей могут быть получены некоторые углеводороды и редкие химические вещества. Так, у широко распространенной зеленой водоросли Botryococcus braunii 'углеводороды в зависимости от условий роста и разновидности могут составлять до 75% сухой массы. Длина углеводородной цепи при этом варьирует от С】？ до С34. Они накапливаются внутри клеток, и водоросли, в которых их много, плавают на поверхности. После сбора водорослей эти углеводороды легко отделить экстракцией каким-либо растворителем или методом деструктивной отгонки. Таким путем может быть получено вещество, аналогичное дизельному топливу и керосину. В. braunii широко распространены в природе; они встречаются в самых разных местах: от солоноватых озер Австралии (где высохшие остатки этих водорослей, известные под названием Coorongite, послужили в прошлом поводом для нефтяной лихорадки) до водохранилищ Лондона. Сходные породы, обнаруженные в других частях света, называют по месту их обнаружения (N'haugellite в Мозамбике, балхашит в Казахстане и т. п.).
Оценки продуктивности были получены лишь для лабораторных культур, выращенных в условиях постоянного освещения, и в случае непредсказуемых вспышек размножения водорослей в природных условиях. Для установления продуктивности В. braunii при массовом культивировании использовать эти оценки довольно сложно. По мнению группы австралийских ученых, прежде всего нужно провести следующие исследования: 1) определить условия, обеспечивающие максимальную скорость роста и образования углеводородов в лабораторных и полевых условиях； 2) на опытных установках выяснить, можно ли при интенсивном выращивании добиться скорости роста В. braunii, соизмеримой с известной для других водорослей; 3) разработать соответствующие методы выращивания, сбора и переработки; 4) оценить применимость получаемого продукта как альтернативного источника топлива и смазочных веществ.
В Израиле на опытных установках проводятся эксперименты с зеленой одноклеточной водорослью Dunaliella bardawil'. она способна использовать солнечную энергию для синтеза глицерола, важного органического соединения, широко используемого промышленностью. Dunaliella может расти и размножаться в среде с широким диапазоном содержания соли: и в воде океа-
нов, где она невелика, и в почти насыщенных солевых растворах Мертвого моря. Она накапливает свободный глицерол, чтобы противодействовать неблагоприятному влиянию высоких концентраций солей в среде, где она растет. При оптимальных условиях и высоком содержании соли на долю глицерола приходится до 85% сухой массы клеток. Из проведенных опытов следует, что для роста этим водорослям нужна всего лишь морская вода, углекислый газ и солнечный свет. Таким образом, они являются весьма многообещающими биосинтетическими агентами для превращения энергии солнечного света в энергию химических соединений, запасаемую в молекулах глицерола.
После переработки эти водоросли можно использовать в качестве корма для животных, так как у них нет неперевариваемой клеточной оболочки, присущей большинству других водорослей. Кроме того, они содержат значительное количество пигмента ^-каротина. Таким образом, благодаря возможности получения трех продуктов — глицерола, пигмента и белка — это опытное производство представляется вполне перспективным с экономической точки зрения, хотя точные оценки продуктивности и затрат пока отсутствуют.
Для получения масел или углеводородов не обязательно использовать именно водоросли или культуры микроорганизмов. Подходящим сырьем для прямого получения жидкого углеводородного топлива являются и некоторые высшие растения.
Масличные растения
Растительные масла могут быть получены из самых разнообразных растений. Помимо хорошо известных нам подсолнечников, пальм, кокосовых орехов, оливок и арахиса для этой цели используются и более экзотические виды: джоджоба и гваюла (оба ——растения пустынь), клещевина, рапс (семена), растения, выделяющие млечный сок, эвкалипты, тыквы, копайба, малме- лейро, орехи бабассу и др. Масла из этих растений, как и из многих других, исследуются в разных странах. Однако, прежде чем принимать решение об использовании этих масел как топлива и о налаживании их производства, необходимо оценить их стоимость, а также количество энергии, необходимое для выращивания соответствующих растений и переработки сырья. Нет ■смысла выращивать растения и получать из них литр растительного масла, если при этом затрачивается два литра первосортного горючего. Определяющий фактор здесь ——урожайность, т. е. количество масла, которое фермер может получить с гектара посевов, а также денежные затраты и трудоемкость. Опыты с подсолнечником и соей на юге Африки и на Среднем Западе
США показали, что можно получить до тонны масла с гектара. Даже если использовать не самый лучший способ отжима. Содержание масла в собранном сырье составляет при этом 40— 50% по массе. Выход масла в две тонны с гектара считается обычным; сообщалось, что он может достигать и пяти тонн. Такое масло стоит около двух долларов за галлон (20 пенсов за литр). При этом запасенная в продукте энергия относится к энергозатратам при выращивании и переработке урожая как 3—10 к 1.
Главное препятствие для дальнейшего развития отрасли — низкая биопродуктивность имеющихся сортов растений. Между тем опыт осуществления специальных программ (которые должным образом финансировались) говорит о перспективности возделывания масличных культур. Так, с успехом была выполнена совместная научная и прикладная программы Великобритании и Малайзии по выведению высокопродуктивных сортов масличной пальмы. Были получены рекордные урожаи, до 14 тонн масла с гектара в год, что в 2—3 раза превосходит обычные; эти новые сорта быстро размножили путем использования метода культуры тканей.
Получение топлива из пальмового масла имеет ряд преимуществ перед выработкой этилового спирта из сахара или крахмалсодержащего сырья. Пальмовое масло получать проще, урожай можно собирать круглый год, при производстве образуется меньше отходов, загрязняющих окружающую среду, и при этом одним из «отходов» производства является богатый белком корм для животных. В идеальном случае можно будет использовать выращенное растение целиком и получать набор разных продуктов. При этом возврат энергии очень велик, и для производства топлива не требуется воды.
Растительное масло можно использовать в чистом виде или в смеси с дизельным топливом для применения в двигателях компрессионного зажигания. Однако эффективность работы и долговечность таких машин увеличиваются, если масло переработать в метиловые или этиловые эфиры. С другой стороны, многие виды растений синтезируют углеводороды, которые можно непосредственно использовать как горючее или химическое сырье. Из последних наиболее известен каучук, получаемый из культивируемых деревьев Hevea brasilensis. С химической точки зрения такие углеводороды — это вещества, более восстановленные, чем углеводы. Их можно использовать непосредственно, не прибегая к микробиологической или термохимической модификации, без чего не обойтись в случае углеводов.
В настоящее время предпринимаются серьезные попытки вывести и наладить выращивание сортов растений, синтезирующих углеводороды более низкой молекулярной массы, чем у каучу-
ка. Предполагается, что из них можно будет получать жидкое топливо со свойствами, близкими к таковым у нефти.
Поиски растений с высоким содержанием углеводородов периодически проводились и раньше. В 1921 г. была опубликована монография, в которой сообщалось о содержани «каучука» в растениях Северной Америки. За четыре года до смерти (1932 г.) американский изобретатель Томас Эдисон изучил в этом плане около 2000 видов растений. Он нашел, что многие растения содержат углеводороды, но только у одного-двух из них молекулярная масса была настолько высока, что они могли в принципе служить заменителем натурального каучука из Hevea. Такие поиски велись в основном среди растений, выделяющих млечный сок ——латекс. Последний представляет собой похожую на молоко 30%-ную эмульсию углеводородов и является тем сырьем, из которого на плантациях получают натуральный каучук. Отметим, что многие виды растений, особенно из семейства Euphorbiaceae, накапливают в латексе углеводороды с существенно меньшей, чем у каучука, молекулярной массой (10—— 20 тыс., а не 1—2 млн.). Именно среди веществ с такой молекулярной массой ведутся сегодня поиски заменителей нефти.
Из представителей рода Euphorbia латекс выделяет почти каждый вид. У дюжины видов Euphorbia он изучен, и в большинстве случаев в нем обнаружены углеводороды, но молекулярная масса их гораздо ниже, чем у каучука.
Эти растения содержат 10±5% восстановленных органических веществ, экстрагируемых ацетоном и бензолом. Если исходить из содержания «нефти» в 10%, то, по грубой оценке (Calvin, 1976), при ежегодном урожае биомассы в 10 т сухого вещества с акра можно получить 1 т углеводородного сырья. Затраты на выращивание при этом составляют около 150 долл, на акр в год, т. е. примерно 20 долл, за баррель. Эти расходы не включают затрат на переработку, как, впрочем, и стоимость биомассы отходов. Дополнительные расходы, когда такая «нефть» используется не как топливо, еще предстоит оценить. По предварительной оценке стоимость продукта не слишком отличается от цены природной нефти, что стимулировало дальнейшие исследования. Однако проведенные недавно полевые опыты показали, что получение 1,5 т «нефти» с гектара возможно только на поливных землях, а при выращивании без полива выход продукции гораздо ниже.
По-видимому, вопрос о том, получаем ли мн выигрыш в энергии (отношение запасенной энергии к затраченной более единицы) при выращивании таких культур, нельзя считать решенным. Ситуация прояснится, если удастся оценить денежную стоимость и энергосодержание побочных продуктов производства.
Натуральный каучук можно получить из растущей в пустыне гваюлы, что и делали в прошлом в больших масштабах. Во время второй мировой войны министерство сельского хозяйства США провело большую работу по окультуриванию гваюлы, и сегодня это растение ——наиболее реальный кандидат для получения масел разного назначения и углеводородов. Результаты исследования гваюлы найдут широкое применение и особенно важны для осуществления перспективных планов получения углеводородов из новых видов растений.
Чтобы установить возможность интродукции масличных и углеводород-образующих культур, было изучено большое число видов растений (Buchanan et al., 1978). Полагают, что вполне реально при «одомашнивании» этих растений увеличить выход сухой массы на 50%, а содержание углеводородов и масел — в два-три раза. Такие прогнозы кажутся вполне оправданными в свете последних достижений селекционеров растений и агрономов, работающих с такими привычными культурами, как Hevea. Для того чтобы сравняться с Hevea, необходимо, чтобы выход масла и углеводородов с гектара в год составлял не менее двух тонн, а другие показатели были бы сходными с представленными в табл. 2.8.
Таблица 2.8. Урожайность и состав продукции модельных масличных и углеводород-образующих культур (как основа для оценки вновь осваиваемых культур; Buchanan et al.} 1978)
Компонент
Каучуконосы
Масличные (с побочным образованием каучука)
Масличные
Гуттаперченосы
I
I
п
1 1 11
I
Всего сухого вещества
13 500
100
17 900
100
22 500
100
11500
100
Общий белок
1 485
и
1 610
1350
6
1 150
10
Каучук
1 350
10
360
Гуттаперча
—
—
—
—
1 380
12
Масло
810
6
2 150
12
2 250
10
920
8
Полифенолы
945
7
1 250
7
4 050
18
805
7
Экстр агир ованный остаток
10 395
77
14 140
79
16 200
72
8 395
73
Урожай оценивается после уборки и отражает вес наземной части растений, жай в кг иа 1 га, II — сухое вещество, %.
I — уро-
Лишь немногие из большого числа изученных видов растений были отобраны для более детального изучения как потенциальные продуценты каучука (13 видов), масла и каучука (И видов), масла (9 видов) и гуттаперчи (3 вида). В табл, 2.8
приведены теоретически возможная урожайность и состав сырья, а также другие интересующие нас характеристики новых культур.
Углеводороды и масла можно использовать после выделения и химической переработки, например гидрокрекинга и/или этерификации. Отметим, однако, что во всем мире производится сегодня всего около 40-106 т растительных масел в год, а другие производства развиты еще недостаточно. По этой причине сбраживание сахара в этиловый спирт остается сегодня главным промышленным способом крупномасштабного производства жидкого горючего для нужд транспорта из биомассы растительного сырья. Однако, как уже отмечалось, главная проблема при использовании сахара или крахмала — малый объем производства и употребление их в пищу. Единственным потенциально важным сырьем для бродильной промышленности остается поэтому лигноцеллюлоза. Создание способов переработки этого сырья в жидкие полуфабрикаты, пригодные для сбраживания,—главная задача биотехнологии.
Переработка и различные виды топлива
Производство исходного сырья
Что касается этилового спирта как топлива, то почти все существующие способы его производства основаны на переработке мелассы, сока сахарного тростника, кукурузного крахмала или же в меньшей мере маниока. Сбраживание — это лишь одна из стадий процесса; помимо него сюда относятся выращивание растений, их уборка, перевозка на заводы, приготовление сусла, сбраживание, перегонка, обезвоживание, денатурация, изготовление смесей и реализация продукции. Кроме того, приходится решать вопрос об удалении или переработке жидких отходов (кубовых остатков). Понятно, что рассказать обо всем этом подробно здесь невозможно, и поэтому мы обратим внимание лишь на те стороны проблемы, которые важны в плане технической осуществимости, баланса энергии и экономики, но в то же время касаются и микробиологических аспектов работы этой системы, которые могут быть улучшены биотехнологическим путем. Их можно разделить на две группы. Первая связана с природой сырья, в котором должно содержаться нужное количество сбраживаемого сахара, получаемого дешевым способом и при малых энергозатратах, а вторая — с отгонкой спирта. В этом последнем случае можно уменьшить затраты (как энергетические, так и экономические), если повысить концентрацию спирта в продукте ферментации.
При получении этилового спирта из сахар-содержащих культур отжим содержащего сахар сока ведется стандартными способами. Простые сахара из сахарного тростника можно получить механическим отжимом сока, а в случае сахарной свеклы—диффузионным методом. Крахмалистое сырье нужно механически измельчить до консистенции жидкого теста, а затем нагреть для разрушения крахмальных зерен. Далее можно применить различные варианты гидролиза, основанного на использовании разных сочетаний кислот и/или применении ферментов. Обычно для разжижения исходного продукта применяют термофильную (90 ℃) бактериальную амилазу. На следующем этапе для осахаривания при 50——60 ℃ (т. е. гидролиза декстринов до глюкозы) используют глюкоамилазу. В пересчете на образовавшуюся глюкозу выход составляет 51 % (по массе). Однако, поскольку около 5% сахара расходуется растущими клетками на энергетические нужды, а также на синтез других органических соединений (глицерола, уксусной кислоты, ацетальдегида и ряда других соединений, в основном высших спиртов), предельный выход составляет около 48% в пересчете на исходный сахар. Весовой выход продукта зависит также от природы сырья:
кг инвертированного .сахара = 0,484 кг этилового спирта = 0,61 л,
кг сахарозы = 0.510 кг этилового спирта = 0,65 л, 1 кг крахмала = 0,530 кг этилового спирта = 0,68 л.
Эти различия обусловлены тем, что в реакции гидролиза олигосахаридов и более высокомолекулярных соединений участвует вода.
При малотоннажном производстве степень очистки исходного сырья, получаемого, например, из кукурузы, может быть очень небольшой. С другой стороны, на более крупных заводах использование обычного метода мокрого помола, который применяется при производстве высококачественного сиропа из глюкозы, дает то преимущество, что при этом удается получить ряд ценных побочных продуктов, например кукурузное масло и глютен. Доходы от их .продажи позволяют снизить реальные затраты на производство спирта. Даже при маломасштабном производстве на основе цельного зерна твердые остатки и дрожжи имеют цену как корм для скота. В зависимости от исходного сырья содержание сахара в сбраживаемом продукте варьирует, но на практике, чтобы получить достаточно высокую концентрацию спирта в сусле, содержание обеспечивающих брожение твердых веществ должно быть в пределах 16—25%. Это важно, поскольку потребление пара в обычных системах для перегонки при производстве 96%-ного спирта из 5%-ного сусла вдвое больше, чем из 10%-ного.
В настоящее время главные сложности, связанные с производством спирта как горючего., связаны с тем, что сырье для
этого процесса является одновременно и сырьем для： производства пищевых продуктов и кормов. Из-за этой конкуренции стоимость сырья весьма высока. В зависимости от типа сырья 60——85% конечной продажной цены получаемого сегодня спирта составляет стоимость сырь5г. Отметим далее, что, за исключением спиртовых заводов, перерабатывающих сахарный тростник, на которых волокнистая часть стеблей (багасса) используется как топливо, в птироко распространенных процессах получения спирта тратится больше энергии, чем ее содержится в получаемом продукте. Эти проблемы можно будет решить, если в качестве исходного сырья будет использоваться целлюлоза и! удастся разработать новый энергетически более выгодный метод выработки спирта.
Сложность использования целлюлозы заключается в том, что в природном состоянии в клеточных стенках растений она находится в составе нерастворимого комплекса с гемицел л юл оз а- ми и лигнином. Кроме того, за счет образования водородных связей отдельные молекулы целлюлозы определенным образом' ориентируются относительно друг друга и образуют микрофибриллы, которые в какой-то мере подоб'ны кристаллам, что препятствует действию гидролитических агентов. Даже после исчерпывающего гидролиза веществ растительных клеток дрожжи, которые обычно используются при получении спирта, неспособны усваивать пятиуглеродные сахара, уроновые кислоты и феноль” ные соединения, образующиеся из сопутствующих целлюлозе1 веществ клеточных стенок растений.
Чтобы решить эту проблему, работа ведется в нескольких направлениях. При создании одних методов ставится цель получить глюкозный сироп, и основное внимание уделяется гидролизу целлюлозы. В других случаях предпринимаются попытки, разрушить ферментами возможно большую часть лигноцеллюлозы——либо после разделения клеточных компонентов химически* ми методами, либо с помощью бактерий, способных непосредственно атаковать как целлюлозу, так. и гемицеллюлозу. Размол — наиболее эффективный физический способ предварительной подготовки сырья, но он дорог и энергоемок. Высказывались предположения, что размол в замороженном состоянии обойдется дешевле.
Для делигнификации можно использовать химическую обработку такими веществами, как едкий натр, надуксусная кислота или гипохлорит натрия. Под действием- щелочи волокна набухают и разделяются. Гидролиз ведут либо минеральными кислотами, либо биологическими методами. В последнем случае используют гидролизующие целлюлозу ферменты грибов, например Trichoderma, Aspergillus либо Sporotrichum. После отделения целлюлозы и гемицеллюлозы для сбраживания глюкозы в*
спирт можно использовать дрожжи. Если для сбраживания используют бактерии, например Klebsiella или Aeromonas, то из пентоз можно получить бутанол. Другая возможность заключается в том, что лигноцеллюлозу используют как субстрат для бактерий Clostridium thermocellum.
Типичный процесс производства глюкозы из целлюлозы включает механическую первичную обработку, размягчение паром или химическую делигнификацию. Для осуществления всех этих операций нужна энергия. При использовании химических методов возникают сложности, связанные с коррозией и нейтрализацией стоков. Процессы, основанные на использовании растворителей, нередко дорогостоящи: приходится регенерировать растворитель. Что касается свойств продукта, определяющих саму возможность действия на него ферментов, то к ним относятся степень кристалличности, лигнификации и размер частиц.
Наиболее хорошо изучена смесь целлюлоз, образуемых Trichoderma viride и Т. reesei. Детально исследована кинетика их действия. Получены мутантные штаммы, или разновидности (например, штамм С-30), обладающие высокой активностью. Выяснено, что смесь целлюлаз Т. reesei включает три компонента: энйо-фермент (фракция Сх), который атакует субстрат бессистемно, экзо-1,4-глюканазу (фракция С", в результате действия которой образуется целлобиоза, и 1,4-глюкозидазу, которая превращает целлобиозу в глюкозу. Обычно содержание глюкозидазы в смеси невелико и его приходится увеличивать, добавляя ферменты других грибов, например Aspergillus. От них несколько отличается фермент возбудителей бурой гнили: эти грибы способны образовывать Н20з, в результате чего процессы первичного разрушения идут быстрее.
При использовании таких ферментных смесей возникают сложности, связанные с тем, что и активность ферментов, и их образование ингибируются конечным продуктом катализируемой реакции. Так, 0,01 %-ный раствор целлобиозы ингибирует активность целлюлазы на 75%. Есть надежда, что путем модификации активности фермента, его регуляции и синтеза с помощью мутагенеза, селекции и методов рекомбинантных ДНК удастся получать более активные и стабильные ферментные препараты, в меньшей степени ингибируемые конечным продуктом. Было проведено изучение многих других организмов в плане возможного их использования для разрушения лигноцеллюлозы. Некоторые из них перечислены в табл. 2.9. Лигнин деградируют некоторые штаммы Erwinia, а также дрожжи Trichospora fermentans; ряд грибов, относящихся к числу хорошо известных родов Мисоу, Penicilliumf Trichoderma и Aspergillus, образуют активную ксиланазу.
Таблица 2.9. Микроорганизмы, изученные в плане их использования для расщепления лигноцеллюлозы
Целлюлоза и целлюлазы Trichoderma viride Г. reesei
Г. koningii
Coniphora cerebella
Sporotrichum pulverulentum
Polyporus adustus
Myrothesium verrucaria PeniciUlum furdculosutn FttsarEtn solmi Aspergillus wentii Coniphora thermophila Thielavia terrestris Phanaerochaete chrysosporium Clostridium thermohydrosulfuricum Clostridium thermocellum Clostridium thermosaccharolyticum Thermomonospora spp.
Ксиланаза
Chaetomum trilaterale
Глюкозидаза
Aspergillus phoenicus
Лигнааа
Erwinia spp.
Trichospora fermentans
Ферментация
Получение метана (биогаза) методом анаэробной переработки сырья и производство этилового технического спирта путем сбраживания при участии дрожжей ——два главных примера биологических технологий, которые могут использоваться для получения более высококачественного топлива из растений.
Если принять, что исходным сырьем является глюкоза, общую схему осуществляемых превращений можно представить следующим образом:
Производство биогаза: СбН^Об —>- 3(СН4) +3(СО2), Производство этанола: СбН^Об ~2(СН3СН2ОН) +2(СО2).
Мы не будем рассматривать здесь все тонкости биохимических процессов, лежащих в основе этих превращений. Отметим только, что в ходе анаэробных превращений часть небольшого количества энергии, высвобождающейся в реакциях, запасается в АТР. Это соединение используется как источник энергии для роста клеток и поддержания жизнедеятельности бактерий или дрожжей. Поэтому, хотя метаболизм у этих микроорганизмов и не столь эффективен (в плане использования субстрата для роста), как у организмов, растущих в присутствии кислорода и
5—1344
при дыхании стехиометрически разлагающих глюкозу до углекислого газа и воды, в результате брожения удается получить достаточно высокий выход продуктов. К тому же удельное содержание энергии в них выше, чем в исходном субстрате — биомассе. В зависимости от фазового состояния (жидкость, твердое вещество или газ), температуры и давления реагирующих веществ и продукта теплоты сгорания (калориметрические) составляют приблизительно 16 кДж/г для глюкозы, 30 кДж/г для этилового спирта и 56 кДж/г для метана.
Хотя в основе как анаэробных процессов, так и производет- ва этилового спирта путем брожения лежат микробиологические- процессы переработки сырья для получения высококачественного топлива из биомассы, только в этом и заключается, наверное, их сходство.
Этиловый спирт
Производство этилового спирта при помощи дрожжей основана на давно устоявшейся технологии (см. также гл. 3). Для получения топливного спирта необходимо осуществить ряд процессов (рис. 2.5): подготовить сырье, провести брожение, отгонку и очистку, обезвоживание (если предполагается использовать продукт в смеси с нефтью), денатурацию и организовать хранение. Нужно также переработать кубовые остатки (захоронить или использовать на корм животным и т. п.). На каждой стадии есть свои узкие места, о которых надо всегда помнить, поскольку это прямо определяет саму возможность использования процесса сбраживания для получения жидкого топлива, его энергобаланс и экономичность.
Объем производства крупных спиртовых заводов может быть очень большим: они ежегодно потребляют тысячи тонн сырья и выпускают миллионы литров продукции. Наибольший вклад в： энергобаланс страны производство топливного спирта дает в： Бразилии. В 1982 г. там было получено 5-109 л спирта, и производство его по программе Proalcool расширяется. Ожидается^ что в 1985 г. будет получено более II• 109 л.
Программа эта осуществляется главным образом на заводах^ где проводят прямое сбраживание сока сахарного тростника; часть спирта производится из мелассы. Вторая крупная нацио* нальная программа ——это производство 《бензирта》 (gasohol} в США: оно основано на сбраживании кукурузного крахмала. В 1984 г. ежегодное производство этого продукта составляло 5-108 галлонов.
Технический спирт применяют главным образом как горючее для двигателей внутреннего сгорания. Чаще всего, его нсполь广 зуют в смесях, но при наличии подходящих машин и в чисток»
ЭтанолРис. 2.5. Схема процесса производ-
виде. Разница между этими двумя способами заключается в том, чт0 во избежание разделения фаз для смешивания с нефтью нужно использовать обезвоженный спирт. С другой стороны, специально сконструированный двигатель может работать и на 95 %-ной смеси спирта с водой, получаемой при первичной отгонке. Хотя этиловый спирт можно использовать для приготовления пищи, обогрева, освещения или производства пара и электричества, особой выгоды получить здесь не удается. Дело в том, что в процессе превращения биомассы в этанол происходит значительная потеря энергии.
Энергия потребляется на всех стадиях переработки спирта. Больше всего тратится ее на концентрирование и обезвоживание при перегонке. Энергию эту можно получать из отходов сырья (багассы, соломы и т. д.), сжигая древесину или ископаемое топливо, газ, нефть или уголь. В целом энергозатраты на переработку сырья близки к количеству энергии, получаемой в форме спирта. По этой причине энергообеспечение всего процесса должно идти либо за счет переработки отходов, либо за счет использования самого дешевого топлива.
Основную массу вырабатываемого на крупных предприятиях спирта получают сегодня при помощи дрожжей ^accharomy- ces, обычно S. cerevisiae, но иногда и S. uvarum (carlsbergensis) и S. diastaticus]. Первая задача здесь — подобрать дрожжи, подходящие для переработки определенного субстрата. Дрожжи S. cerevisiae могут расти на глюкозе, фруктозе, мальтозе и мальтотриозе, т. е. на сахарах, содержащихся в их обычной «пище», которую они получают от сахар- или крахмал-содержащих растений. S. diastaticus может также использовать, декстрины, а ки- ды Kluyveromyces fragilis и К・ lactus — лактозу.
Образование этилового спирта дрожжами — это анаэробный процесс, но для их размножения нужен кислород. В следовых количествах кислород, возможно, нужен и для поддержания жизнедеятельности клеток, образующих спирт. В ходе метаболизма осуществляется сложная регуляция образования этанола из глюкозы. Сам процесс метаболизма, жизнеспособность клеток, их рост, деление и образование спирта зависят от концентрации субстрата, кислорода и конечного продукта (спирта). Большую роль в увеличении выхода сыграл отбор штаммов дрожжей, более устойчивых к повышенным концентрациям как субстрата, так и спирта.
По возможности содержание твердого сбраживаемого компонента в сырье должно быть 16—25% (вес/объем), тогда ко-, нечная концентрация этилового спирта составит 6—12%. Для большинства видов дрожжей оптимальная для их жизнедеятельности температура лежит в пределах от 25 до 33 ℃. Осуществление процесса при pH 4—5 уменьшает опасность микробного
Зхера〃兄’以 @т6техполо2и允 一 69 загрязнения и препятствует развитию так называемых «дрожжей-убийц». Требования к дополнительным источникам питания определяются природой сырья, используемого при подготовке субстрата. Так, если сырьем служит меласса, то приходится добавлять вещества — источники азота и фосфора, а если в основе лежит высоко очищенный гидролизат крахмала, то может понадобиться добавить незаменимые микроэлементы и витамины.
Существуют три основных способа сбраживания сахар-со^ держащего сырья: периодический, периодический с повторным использованием клеток и непрерывный. При периодическом процессе субстрат сбраживается после внесения в него свежевыра- щенной закваски, полученной в аэробных условиях. Брожение протекает в анаэробных условиях, и весь оставшийся субстрат превращается при этом в спирт. После завершения брожения дрожжи удаляют, и для следующего цикла получения спирта выращивают новую порцию закваски. Размножение дрожжей является дорогостоящей процедурой, так как расходуется много субстрата.
При использовании дрожжей по периодической схеме около 5% сахара расходуется на рост клеток и энергообеспечение синтеза других соединений: глицерола, уксусной кислоты, ацетальдегида и сивушных масел (в основном высших спиртов). По этой причине максимальный выход составляет около 48% от субстрата по массе. При использовании дрожжей продуктивность варьирует в пределах 1——2 г этилового спирта в 1 ч на 1 г клеток (сухое вещество). Более значительные выходы (2,5—3,8 г) получены в опытах с бактериями, например Zymotnonas mobilis^ однако такие организмы еще только предстоит внедрить в промышленность. Продуктивность ферментера зависит от режима работы, штамма дрожжей, плотности клеток и природы субстрата, Она варьирует от 1 г*л-1*ч-1 до более 10 г*л-1-ч-1. Поскольку концентрация спирта при брожении растет, а субстрата—уменьшается, за разумные промежутки времени полностью использовать сахар иногда не удается.
Недостатки процесса (длительное сбраживание и неполное использование субстрата) можно частично устранить, применяя периодическую схему с повторным использованием клеток. При этом в конце цикла дрожжевые клетки отделяют от сброженной пульпы и сохраняют для использования в следующем цикле. Следует иметь в виду, однако, что положительным в периодическом процессе является его устойчивость к нарушениям режима, поэтому установку может обслуживать персонал не слишком высокой квалификации. В то же время для него характерна малая объемная продуктивность: за 36 часов брожения образуется 5% -ный (вес/объем) раствор спиртз, что соответствует
образованию в среднем 1,4 г спирта на 1 л за 1 ч. Путем при- менения схемы с повторным использованием клеток или же непрерывного брожения выход можно повысить до более чем ]0「.лт.^т. При этом клетки отделяют от барды и используются заново; тем самым поддерживается высокая концентрация клеток в среде.
Для работы по этим схемам нужны квалифицированные работники, более крупные капиталовложения и сложные контролирующие устройства. При непрерывном процессе степень использования субстрата для образования спирта зависит от разведения. Для достижения высокой продуктивности она должна быть велика, но при таких условиях уменьшается среднее время задержки субстрата. Иными словами, задачи оптимизации двух факторов — объемной продуктивности и полноты использования сахара ——противоречат друг другу. Выбор регламента сбраживания должен строиться исходя из стоимости субстрата, необходимых капиталовложений и производственных расходов. Они в свою очередь должны определяться в связи с особенностями всей схемы получения продукции.
По завершении сбраживания концентрация спирта составляет 6—12%. Она зависит от штамма дрожжей и начальной концентрации сахара. Важно достичь наивысшей концентрации спирта, так как от этого зависит расход пара на перегонку: он увеличивается от 2,25 кг на 1 л 96%-ного спирта при отгонке 10%-ного раствора до более чем 4 кг при отгонке 5%-ного. Дополнительный пар нужен для получения безводного спирта из язеотропной смеси вода ——этиловый спирт, кипящей при постоянной температуре. Обычно для этого используют десятикратный по отношению к количеству удаляемой воды объем бензола. Сначала при 64—84 ℃ отгоняется азеотропная смесь бензола, воды, спирта, а после удаления всей воды, при 68,25 ℃, — другая азеотропная смесь — бензола и спирта. После отгонки всего бензола остается лишь абсолютный спирт, который собирают, а бензол используют повторно.
Главными побочными продуктами производства являются СО2, дрожжи, сивушные масла и кубовые остатки. Каждый из них обладает определенной ценностью, но переработка жидких остатков может быть затруднена. В большинстве случаев, поскольку за пищевой спирт нужно платить большой налог, алкоголь денатурируют. Для этого добавляют вещества, придающие ему горький вкус, или смешивают его с бензином.
Энергобаланс
Общий баланс энергии как при производстве спирта, так и при анаэробной переработке может быть слабо положительным или даже отрицательным, поскольку при производстве сырья, его
переработке, сортировке, очистке или отжиме потребляется значительное количество энергии. Эти энергозатраты покрываются за счет использования остатков растительного сырья (багассы или соломы), сжигания древесины или ископаемого топлива. Используются также «тепловые отбросы» электростанций.
Если рассматривать лишь производство этилового спирта, то количество энергии, расходуемой на выработку одного литра продукта, равно или превышает ее количество, запасенное в данном объеме спирта. Поэтому, чтобы получить выигрыш, энергообеспечение процесса должно осуществляться за счет возобновляемых источников либо энергопоставляющих побочных продуктов. На сегодняшний день производство на основе сахарного тростника ——это единственный пример процесса с положительным энергобалансом. Необходимую энергию получают, сжигая отжатый тростник (багассу). С другой стороны, производства на основе крахмала или сахарной свеклы требуют дополнительных энергозатрат. Если для этого используется нефть, то выигрыш в энергии в пересчете на жидкое топливо бывает либо небольшим, либо нулевым. С другой стороны, когда топливом служит уголь, то мы по сути имеем дело с одним из процессов превращения его в жидкое горючее для транспорта. Это позволяет экономить энергию, запасенную в нефти. Отметим также, что в производствах на основе сахара или крахмала стоимость сырья составляет 60——85% от стоимости получаемой продукции; здесь возможны и снижение цен, и повышение урожайности. В результате с учетом качества энергии, стоимости и экономичности этот процесс привлекает все большее внимание.
Научные исследования нацелены сегодня на увеличение эффективности использования субстрата, выхода продукта в объемном исчислении, его концентрации и на разработку способов осуществления процесса при повышенной температуре. Эти усовершенствования помогут экономить дорогой субстрат путем снижения его затрат на выращивание клеток (повторное их использование или иммобилизация) или подавления побочных реакций, дающих нежелательные продукты (глицерол, ацетат и т. п.). Кроме того, они помогут экономить энергию: уменьшится необходимость охлаждения ферментеров, снизятся затраты на перегонку. Все эти изменения будут плодом совместной работы микробиологов и инженеров.
Если рассматривать микробиологическую сторону процесса, то основной целью здесь является улучшение ответа микроорганизмов на изменение концентрации О2, подбор концентрации субстрата и специфичности его использования, повышение концентрации спирта. Нужно оптимизировать температуру, соотношение стадий брожения и роста клеток, образование побочных продуктов и флокуляционные характеристики дрожжей. Послед*
нее особенно важно, поскольку самоосаждающиеся клетки легко отделить простым отстаиванием, не используя дорогие и энергоемкие центрифуги. Основной способ улучшения производства по-прежнему состоит в селекции устойчивых штаммов дрожжей. Неустойчивость частично обусловлена осмотическими эффектами, а частично — влиянием накопленного спирта на проницаемость мембран. Один из возможных выходов заключается в расширении набора используемых организмов (путем включения, например, Z. mob ills, видов Clostridium и т. п.). Другой путь — использование генетических методов для передачи полезных качеств от различных дрожжей и бактерий дрожжами S. cerevi- siae. Вторая возможность кажется особенно привлекательной, так как при работе с этими дрожжами промышленностью накоплен большой опыт. Кроме того, хорошо изучен их жизненный цикл и генетика, получены плазмидные векторы. Следует сказать, что многие используемые промышленностью штаммы дрожжей являются полиплоидными, не принадлежат к определенному типу скрещивания, а жизнеспособность образуемых ими спор низка. Все это затрудняет их генетический анализ и улучшение при помощи обычных методов скрещивания, что и заставляет обратиться к рекомбинантным методам. Сейчас ведутся эксперименты по переносу генов амилазы и целлюлазы в клетки дрожжей.
Что касается самого брожения, то уже выполнена большая работа для систем с иммобилизованными клетками, что позволит сделать процесс непрерывным, без повторного использования клеток. Разрабатываются также системы с повторным использованием дрожжей и отгонкой спирта при пониженном давлении (вакуумное брожение). Сложности в разработке обеих систем связаны с интенсивным выделением СО2, который нужно удалять, и с необходимостью контролировать рост клеток. Нужна очищенная, не содержащая взвешенных частиц стерильная питательная среда. Далее, немалые затруднения возникают из-за высокой стоимости среды, поскольку для достижения большой продуктивности нужны высокие степени разведения, а при высоком разведении плохо используется субстрат. По этим причинам, возможно, придется остановиться на серийном выращивании. В случае микробного заражения потребуется система дублирования. Учитывая все это, сегодня подобные системы вряд ли будут экономически конкурентоспособными.
Все эти проблемы придется решать биотехнологам, используя опыт и микробиологов, и инженеров.
Получение метана в анаэробных условиях
При переработке сырья в анаэробных условиях получается смесь газов — метана и углекислоты, которые образуются в результате разложения сложных субстратов при участии смешанной популяции микроорганизмов разных видов. Поскольку искомый продукт — это газ, сбор его не составляет труда: он просто выделяется в виде пузырьков. Впрочем, иногда при более сложных способах его использования или распределения по трубам возникает необходимость в очистке от примесей или в компрессии.
В анаэробном реакторе можно перерабатывать самое разнообразное сырье: отходы сельского хозяйства (испорченные растительные или пищевые продукты), стоки перерабатывающих предприятий, содержащие сахар, жидкие отходы, образующиеся на сахарных заводах или при отжиме пальмового масла, бытовые отходы, сточные воды городов и спиртовых заводов. Можно перерабатывать и специально выращиваемые культуры, включая и экзотические, растущие в пресной или морской воде или на бросовых землях: водяной гиацинт, гигантские бурые водоросли или слоновью траву.
Весьма важно, что сырье с высоким содержанием целлюлозы (или лигноцеллюлозы) не так просто использовать для иных целей: оно дешево или вообще не имеет коммерческой ценности. Обычно масштабы переработки невелики (в пределах одной фермы или деревни), хотя были разработаны и проекты более крупных установок для переработки стоков или же промышленных отходов. В масштабах государства наибольший вклад в энергетический бюджет страны вносит такая переработка в Китае, где построено около семи миллионов небольших (на одну семью) реакторов.
Неочищенный биогаз обычно используют для приготовления пищи и освещения. Его можно применять как топливо в стационарных установках, вырабатывающих электроэнергию. Сжатый газ в баллонах пригоден как горючее для машин и тракторов. Его можно подавать в газораспределительную сеть. В последнем случае требуется некоторая очистка биогаза: осушка, удаление углекислоты и сероводорода. Очищенный биогаз ничем не отличается от метана из других источников, т. е. природного газа или же SNG (синтетический газ, получаемый из угля или водород содержащего сырья). Хотя в большинстве случаев конструкция реакторов рассчитана на получение метана, который используется как топливо, строить такие установки имеет смысл не только для этой цели. Нередко, особенно в развитых странах умеренного пояса, реакторы используют главным образом для переработки отходов.
Установки для производства биогаза по принципу все возрастающего объема можно сгруппировать следующим образом: 1) реакторы в сельской местности в развивающихся странах (обычно имеют объем 1—20 м3)； 2) реакторы на фермах развитых стран (объем 50—500 м3); 3) реакторы, перерабатывающие отходы промышленности (например, сахарных, спиртовых заводов и т. п., объем 500—10 000 м3); 4) свалки бытовых и промышленных отходов (объем 1—20-106 м3).
Понятно, что детали технического устройства таких систем могут сильно различаться. Так, существует несколько конструкций небольших реакторов ——от простейшей бродильной ямы в грунте с фиксированным объемом газа до подземных или полу- подземных баков с металлическим или резиновым накопителем газа с изменяющимся объемом. Эти установки могут работать в режиме полного перемешивания, полного вытеснения, в режиме контактных процессов, как анаэробные фильтры или реакторы с псевдоожиженным слоем. Конструкция таких устройств определяется типом перерабатываемого сырья. Задача заключается в том, чтобы не допустить потери микроорганизмов при работе системы. Это достигается либо путем повторного их использования, либо помещением в реактор поддерживающего субстрата, на котором и растут клетки. Последний способ особенно хорош в случае, когда в реактор поступает раствор с низким содержанием взвешенных частиц.
В развитых странах используется множество разнообразных установок. Это определяется конкретной задачей ——очисткой стоков или же достижением нужного качества газа. Среди них есть и небольшие реакторы, мало чем отличающиеся от описанных, и крупные установки с приспособлениями для очистки газа, электрогенераторами, компрессорами и очистителями воды. Иногда их строят в составе одного комплекса с другими крупными объектами: канализационными станциями, сахарными и спиртовыми заводами, животноводческими фермами и молокозаводами. В некоторых случаях бывает необходимо провести предварительную обработку или разведение питательного раствора. Это делается для оптимизации размера частиц во взвесях, увеличения глубины переработки или уменьшения токсического действия высоких концентраций азота.
В тех случаях, когда главной задачей является переработка отбросов, приходится прежде всего механическим способом отделять крупноразмерную фракцию, например солому и прочее. При применении такого способа, а также при переработке сточных вод предприятий пищевой промышленности отношение содержания растворенных углеводов к нерастворимым, содержащим лигноцеллюлозу веществам существенно увеличивается, и обычно доля твердых частиц бывает небольшой. Вследствие
этого скорость подачи раствора в реактор и время удержания уменьшаются. Впрочем, с инженерной точки зрения установка может быть и сложнее, чтобы обеспечить оптимальное взаимодействие микробов с субстратом.
Чтобы получить наибольший объемный выход продукции с небольшой установки, скорость подачи субстрата должна быть возможно большей, а это в свою очередь связано с поддержа' нием высокой концентрации жизнеспособных бактерий. При этом могут возникнуть сложности как в случае субстратов с высоким содержанием нерастворимых веществ, так и субстратов, содержащих много растворимой органики. В первом случае в реакторе накапливаются неразрушаемые или медленно разрушаемые вещества, которые в конечном счете будут составлять более 80% твердых веществ в осадке реактора. Во втором — переработка растворенных, полностью разрушаемых веществ приведет к образованию высокоактивного ила, и бактерии будут составлять до 90% осадка. Удержать такой ил в реакторе будет сложно. Впрочем, недавно был предложен ряд конструкций, в которых эти проблемы решены. Помимо механического измельчения сырья с успехом применяется неполный кислотный или щелочной гидролиз образующих его частиц либо целлюлолитические ферменты. Еще одно усовершенствование заключается в механическом перемешивании подаваемого сырья с илом. Для этой же цели через реактор повторно пропускают выделившийся газ. Перемешивание осадка, содержащего активные бактерии, или создание тока жидкости может увеличить количество выделяющегося газа в зависимости от того, какой вид сырья используется в процессе.
При решении вопроса об использовании более сложных с инженерной точки зрения, усовершенствованных сооружений или же каких-то вариантов процесса в первую очередь надо оценить стоимость их работы. Сегодня из их числа более практичными могут оказаться системы, перерабатывающие отходы (когда затраты на их обезвреживание высоки), а не те крупномасштабные установки, которые вырабатывают газ как сырье для энергетики. Отметим, однако, что наиболее крупные установки для получения биогаза всегда очень просто устроены: это могут быть свалки отходов, в основном бытового мусора. О самой возможности использования метана, образующегося в таких мусорных кучах, задумались, когда стали искать способы предотвращения взрывов и пожаров, возникающих в результате выделения в них газа. Кислород, оказавшийся в мусоре при образовании куч, быстро используется аэробными бактериями и грибами, в результате чего условия в них становятся анаэробными. Влажность поддерживается либо просачивающейся дождевой водой, либо грунтовыми водами. Если буферная способность ма-
териала достаточна для поддержания нейтральных значений pH, то складываются благоприятные условия для образования метана. Газ выделяется в смеси с СО?. Собирают его при помощи труб, проложенных в толще мусора под полотнищами пленки.
Вклад этих технологий в энергообеспечение конкретных регионов в обозримом будущем (скажем, десять лет) в значительной мере будет определяться местными условиями. Они будут зависеть, с одной стороны, от наличия земельных площадей и сельскохозяйственного сырья, а с другой — от доступности нефти и газа и цен на них. Важную роль сыграют как новые разработки в области микробиологической технологии, так и инженерные решения, нацеленные на повышение эффективности работы таких систем при меньших капитальных вложениях и энергопотреблении.
Микробиологические основы процесса
Переработка сырья в метан происходит в ходе сложных взаимодействий в смешанных популяциях микроорганизмов. По особенностям обмена веществ их можно подразделить на три основные группы: первая осуществляет первичный распад полимерных веществ, вторая образует летучие жирные кислоты, в частности уксусную, водород и СО2, а третья — метан (метан- образующие бактерии).
В осуществлении первой стадии процесса принимают участие разнообразные анаэробные бактерии, превращающие в растворимые вещества множество соединений, включая целлюлозу, жиры и белки. Ключевую роль при этом играют процессы разложения целлюлозы, так как большинство видов сырья или сточных вод обогащены лигноцеллюлозой. По оптимальной температуре жизнедеятельности эти бактерии можно отнести к одной из трех групп: термофильным организмам, живущим при 50— 60 ℃, мезофильным (30—40°) и психрофильным, предпочитающим комнатную температуру (около 20 ℃). Большая часть исследований была выполнена для реакторов, работающих на основе мезофилов. При повышенной температуре скорость распада исходного сырья, особенно целлюлозы, увеличивается, а это — /важное преимущество. Скорость образования метана лимитируется интенсивностью процессов разложения сырья. Именно поэтому время удержания при работе с некоторыми субстратами бывает так велико.
Время удержания можно уменьшить, если повысить температуру, но это требует энергозатрат. Для получения тепла можно сжигать часть получаемого метана (а в крайних случаях— 51 весь газ). Можно использовать и тепловые отбросы сопутст-
вующих производств (например, воду, использованную в них для охлаждения). Горячую воду можно получать и с помощью солнечных батарей.. Бактерии, работающие на первом этапе, лучше всего растут при pH от 6 до 7. В культуре рост многих разлагающих целлюлозу бактерий подавляется по механизму обратной связи при накоплении конечных продуктов гидролиза, однако в смешанной популяции бактерий, существующей в анаэробном реакторе, происходит быстрое усвоение этих продуктов и подавление не так выражено. В результате скорость разрушения полимеров оказывается выше, чем можно было бы ожидать. Конечные продукты, обладающие свойствами ингибитора, удаляются с помощью бактерий второй группы, которые превращают различные сахара, аминокислоты и жирные кислоты в летучие жирные кислоты, СО? и водород.
В ходе этого процесса образуется ряд летучих жирных кислот (молочная, уксусная, пропионовая и др.), но главным субстратом при синтезе метана является уксусная кислота. Метан- образующие бактерии могут также синтезировать метан из СО2 и Нг. Оптимум pH для них тот же (6——7), что и для бактерий первой группы, и это важно, поскольку нарушение баланса образования и потребления кислот приведет к падению pH, если система не обладает достаточными буферными свойствами. Всякое падение pH по этой причине преимущественно сказывается на активности метанобразующих бактерий, что вызывает дальнейшее закисление среды и прекращение образования метана. С этим можно бороться, добавляя известняк или аммиачную воду, но при внесении ионов аммония следует соблюдать осторожность. Метанобразующие бактерии могут использовать аммонийные ионы как источник азота, но при высоких концентрациях они ингибируют их рост. К числу других веществ и соединений, способных ингибировать процесс, относятся кислород и окисленные соединения, такие, как нитрат и нитрит, сульфидьг> цианиды, свободные ионы металлов (меди, цинка или никеля), галогены, формальдегид и сероводород. Система чувствительна также к резким скачкам температуры.
Выход продукции
При образовании метана, когда субстратом является глюкоза, весовой выход газа составляет только около 27%, а выход энергии (теоретически)—более 90%. Однако на практике из-за сложного состава сырья, перерабатываемого в анаэробных реакторах, и низкой эффективности его переработки валовый выход энергии составляет от 20 до 50%. Определение выхода биогаза——задача более сложная, чем выхода метана. Прежде всего нужно уточнить, что мы хотим измерить: валовый выход
(биогаз-СО2 в смеси с метаном) или же один метан. Состав газа существенно изменяется в зависимости от условий в реакторе», а также от природы подаваемого в него сырья. Теоретически? при переработке углеводов на СО? и метан эти газы должны образовываться в равных количествах. На самом деле не весь. С°2 выделяется в виде газа, так как он растворяется в воде гг может взаимодействовать с гидроксил-ионами с образованием- бикарбонатов. Концентрация образующегося бикарбоната будет зависеть от скорости протока жидкости, pH, температуры и содержания в жидкой фазе ионов металлов и других веществ.
Количество образующегося бикарбоната сильно зависит or содержания белка в сырье: чем оно больше, тем богаче биогам метаном. Обычно биогаз содержит 60—70% метана. Он образуется со скоростью 0,5 м3 на килограмм сухой массы летучих компонентов; время удержания составляет около 15 суток. Это соответствует приблизительно 0,3 м? метана на килограмм сухой массы твердых компонентов. Впрочем, точные оценки дать сложно, так как выход зависит от условий работы системы,, сырья и конструкции реактора.
В последних сообщениях об установках, перерабатывающих биомассу разного качества, приводятся выходы от 0,17 до» 0,4 м3 метана на килограмм сухой массы сырья. Скорость загрузки при этом составляла от 1 до более чем 10 кг сырья на* кубометр реактора в сутки, время удержания 10—40 суток, а глубина переработки субстрата от 20 до более чем 70%.
Повышение выхода за счет увеличения содержания энергии в продукте будет способствовать повышению валового производства энергии реактором. К сожалению, это не говорит о чистом выходе энергии, который будет существенно ниже, так как при таком ведении процесса энергозатраты возрастут. Количе* ство энергии, которую необходимо подать в конкретную систему〉 будет определяться характером идущего в ней процесса. Он 洋 свою очередь определяется микробной флорой и природой используемого сырья.
Задачи научных исследований
Сегодня нам еще немного известно о биохимии микробов, участвующих в процессе. Внимания требует и инженерная сторона дела: нужно усовершенствовать способы закачки сырья, измерения объемов газа, теплообеспечения, использования двигателей внутреннего сгорания для производства электроэнергии и системы контроля. Основой существенного улучшения экономических показателей могло бы стать уменьшение времени удержания, нужного для эффективной переработки нерастворимых компонентов. Для этого следует в первую очередь улучшить способы подготовки сырья.
Бесклеточные системы
Одна из привлекательных возможностей, предоставляемых технологией 《солнеиной энергетики», заключается в использовании делых организмов как биологических катализаторов при производстве аммиака и водорода за счет солнечной энергии. Опыты с цианобактериями (сине-зелеными водорослями) и зелеными водорослями показали, что они способны образовывать водород м кислород путем прямого фотолиза воды. Лежащий в основе этого явления процесс фотосинтеза сформировался в результате генно-инженерной деятельности Природы. Фотосинтезирующие бактерии неспособны разлагать воду, но могут на свету образовывать большие количества водорода (без примесей кислорода) ял и аммиака. Для этого им нужны только простые органические м неорганические субстраты. Такие вещества содержатся в промышленных отходах, и поэтому превращение солнечной энергии фотосинтезирующими бактериями вполне может быть сопряжено с переработкой отходов.
В ряде лабораторий ведутся на молекулярном уровне исследования различных процессов образования водорода, а также :механизмов реакции расщепления воды. В образовании водорода принимают участие гидрогеназа и нитрогеназа. Сегодня •активно изучаются свойства этих ферментов из разных организмов, в частности механизмы регуляции их синтеза и активности, а также стабильность в присутствии кислорода. Предметом важных исследований является также образование восстанови- :тельных эквивалентов и поток электронов к этим ферментам, которые при определенных условиях служат факторами, лимитирующими активность. Эти опыты позволят понять суть указанных процессов и попытаться оптимизировать выделение водорода имеющимися в нашем распоряжении генетически охарактеризованными организмами. Ряд исследователей-генетиков занят отбором мутантов с повышенной способностью к образованию водорода или аммиака. Примерами удачного применения методов генетической инженерии для создания ферментов с желаемыми свойствами может быть получение устойчивой к кислороду гидрогеназы. Удалось повысить содержание гидрогеназ в клетках и получить микроорганизмы, способные выделять фиксированный ими азот в окружающую среду в форме амми- ака.
В ходе первых исследований была отчасти выяснена физиологическая и биохимическая основа процессов образования Н2 л NH3 у фотосинтезирующих организмов, определены условия, необходимые для максимального проявления этой способности. В будущем на основе результатов опытов с целыми клетками мн сможем подобрать условия для максимального и долговре-
менного образования Н2 и NH3, оценить техническую возможность создания лабораторных реакторов с иммобилизованными клетками фотосинтезирующих организмов.
Комбинированные системы, образующие водород
Около десяти лет назад в области исследований возобновляемых источников энергии было сделано замечательное открытие. Было показано, что если взять мембраны, содержащие хлорофилл, и добавить к окружающему раствору ферменты, действующие как катализаторы, то на свету будет происходить разложение воды (фотолиз) на водород и кислород (рис. 2.6). Это открытие
Рис. 2.6. Схема сопряжения процессов поглощения солнечной энергии и образования водорода на основе стабилизированных хлоропластных мембран и гидрогеназных ферментов (Hall, 1982).
было первым шагом на пути к созданию фотореактора, при помощи которого энергия Солнца может запасаться в ценном топливе—водороде. Фотохимики и фотобиологи проявляют большой интерес к этим исследованиям, поскольку получение «солнечного водорода» из воды открывает новые перспективы в энергетике. Процессу фотолиза присущ ряд особенностей, которых нет у каких-либо других систем преобразования энергии. Субстратом в нем является обычная вода, источником энергии с неограниченным запасом — солнечный свет, а продуктом — водород. Его просто хранить, он не загрязняет окружающую среду. Процесс этот циклический, поскольку при потреблении водорода регенерируется субстрат-—вода. Система привлекательна и тем, что она работает при обычной температуре; в ней не образуются токсичные промежуточные соединения.
Задача создания стабильной биологической системы, способной работать многие годы, а не часы, чрезвычайно сложна и, быть может, нерешаема. Если бы мы смогли понять суть биологических процессов, нам, возможно, удалось бы их имитиро-
вать путем создания полной системы синтеза. Такие системы могли бы использовать свет любой интенсивности в широком диапазоне температур и этим напоминали бы производящие электроэнергию солнечные батареи. Надо сказать, что фотобиологический способ производства водорода не вышел еще из стен лабораторий. Целесообразность его дальнейшего развития только предстоит доказать в ходе многоплановых исследований. Впрочем, наши представления о возможностях использования этой системы в практике могут быстро измениться: достаточно будет и одного крупного открытия при изучении фотобиологиче* ских и фотохимических реакций разложения воды.
Несмотря на успешные опыты по стабилизации мембран хлоропластов (для этого применялась иммобилизация ферментов и закрепление их в пленках альгинатного геля и полиуретановых матрицах), они вряд ли войдут как составная часть в промышленные системы по улавливанию солнечной энергии. Тем не менее результаты изучения состава хлоропластов и обмена веществ в них могут послужить основой для создания таких систем. Чего же мы можем ожидать от исследований в этой 06d ласти? В реакциях фотолиза воды в мембранах хлоропластов», идущих при участии фотосистемы II, принимает участие комплекс белков с хлорофиллом и магнием. Сегодня нам мало чта известно и о расположении в нем ионов магния, и о механизмах фотолиза воды в растениях.
Для практических целей может оказаться необходимым отделить активируемую светом стадию фотосинтеза, на которой образуется кислород, от стадии темновых реакций, где выделяется водород. Одностадийная система будет продуцировать смесь кислорода и водорода, и их улавливание и разделение со всей площади коллектора солнечной энергии могут оказаться невыполнимыми. Но можно представить себе и двухстадийный процесс, на первом этапе которого будет функционировать фотока- талитическая система, в которой образуются неокисляемый переносчик и кислород. Кислород можно улавливать, а образовавшийся переносчик водорода будет использоваться на второй стадии, когда осуществляется темновая реакция образования водорода. Вслед за этим переносчик направляется обратно в первый^ отсек'установки, восстанавливается там в ходе световой реакции и может использоваться для повторного цикла реакций.
Переломный момент в проводимых сегодня исследованиях наступит, когда удастся разработать эффективную стабильную систему, имитирующую фотосистему II мембран хлоропластов, т. е. процесс, в ходе которого вода разлагается на кислород и водород с образованием протонов и восстановительных эквивалентов. Со вторым этапом, связанным с выделением водорода в системе, ситуация, видимо, обстоит проще, поскольку в нашем；
распоряжении есть большой выбор необходимых переносчиков электронов и катализаторов образования водорода. Отметим, однако, что чувствительность многих этих веществ к кислороду ограничивает возможность их применения. Очень важно отыс- 1кать соединение, которое могло бы выполнять функции гидрогеназы, т. е. служить кислородоустойчивым редокс- и протонным переносчиком.
Остановимся теперь на водородном фотореакторе. Если бы нам удалось обойтись без реакции расщепления воды и просто ■использовать восстановленные соединения, например аскорбиновую кислоту, сульфид натрия, ЭДТА или дитионит в качестве доноров электронов, то можно было бы без труда получить ста- Сильную систему, интенсивно образующую водород. В роли -фотокатализатора в ней мог бы выступить какой-нибудь пигмент (например, флавин или даже стабильная фотосистема I :мембран хлоропластов), а в роли переносчиков протонов и электронов——красители, гидрогеназа или платина. Можно использовать для этого стабильные ферменты и иммобилизованные системы. Уже созданы небольшие фотореакторы, в которых при надлежащих условиях образование водорода идет с высокой скоростью, до нескольких литров Н2 в минуту.
Не так-то просто будет получить искусственные мембраны /для замены нестабильных биологических прототипов, но исследования в этом направлении уже ведутся. Делаются попытки .применить для этой цели различные решетки с набухающим слоем, силикаты глин (монтмориллониты и гекториты). Последние, как известно, способны образовывать стабильные интерка- .пяционные соединения с разнообразными ионными комплексами и полярными молекулами, например с водой.
262 Электроэнергия
Одним из интересных аспектов общей проблемы улавливания солнечной энергии является использование компонентов биологических мембран для генерации электропотенциалов. Таким путем можно попытаться создать солнечную батарею. Так, в липидные пузырьки или в стопку липидных мембран, содержащих некоторые красители, можно встроить фотосистему пурпурных бактерий и один из белков мембран Halobacterium. Всю эту систему можно поместить на подложку — нитроцеллюлозный фильтр и установить его между двумя отсеками сосуда. При ос- ъещении фильтра возникает разность потенциалов. Такую систему можно использовать и для перемещения ионов (например, Na+) и тем самым для обессоливания. Подобные фотоэлектрические эффекты уже наблюдались, но сопротивление при этом бнло слишком велико для получения достаточно большой силы *тока.
Недавно было сконструировано устройство, в котором мембраны хлоропластов использовались в составе фотогальванического элемента для генерирования тока. При освещении объединенных полуэлементов зарегистрирован потенциал 220 мВ и ток: 800 мкА при плотности тока 16 мкА/см2 (использованы платиновые электроды). В одном полуэлементе мембранами хлоропластов осуществляется фотолиз воды, в то время как в другом идет только частичная реакция (фотосистема I) с образованием низкого потенциала. Полуэлементы соединены искусственной мембраной, проницаемой для ионов, но не для переносчика электронов (красителя). Возможно, эту очень интересную фотогальваническую батарею удастся модифицировать так, что у двух ее полюсов будут выделяться О2 и Нг, а тока она давать не будет.
Биотопливные элементы
и другие биоэлектрохимические устройства
После того как в конце XIX в. были созданы топливные элементы, появилась возможность эффективно осуществлять превращение химической энергии в электрическую. Дело в том, что» на эти элементы не распространяются ограничения, налагаемые циклом Карно. Дальнейшее их усовершенствование шло тем не менее медленно: оказалось, что обеспечить эффективный электрокаталитический перенос электронов от используемого топлива на анод элемента сложно. В результате удалось создать лишь водородный элемент, дающий достаточную плотность тока. Он успешно работает при низких температурах и пригоден для крупномасштабного производства энергии. Схема, объясняющая принципы работы обычного топливного элемента, приведена на рис. 2.7. Был предложен ряд элементов, использующих другие виды топлива (спирты, углеводороды), но они работают лишь при высоких температурах и дают ток небольшой плотности при малом коэффициенте полезного действия. Это ограничивает их применение для производства энергии, но некоторые типы топливных элементов используются для других целей. Так, один из. них применяется в качестве датчика в детекторах, выявляющих наличие спирта в выдыхаемом воздухе.
Важной отличительной чертой биологических систем является их способность к контролируемому окислению различных «топлив» при низкой температуре. Неудивительно, что биоэлектрохимики долгое время пытались приспособить участвующие в этих реакциях катализаторы для работы в топливных элементах. Ведь в процессах дыхания в живых организмах и реакциях, идущих в биоэлектрохимических элементах, есть много о6・ щего.
°2°2Рис. 2.7. Схема строения простейшего кислород-водородного топливного элемента.Рис. 2.7. Схема строения простейшего кислород-водородного топливного элемента.Анод Мембрана КатодАнод Мембрана КатодПервые опыты с биологическими топливными элементами и батареями провел в 1910 г. английский ботаник Поттер. Погружая платиновый электрод в анаэробную культуру дрожжей или Escherichia coli, он обнаружил, что на нем образуется потенциал, отрицательный по отношению к
°2
°2
Рис. 2.7. Схема строения простейшего кислород-водородного топливного элемента.
Рис. 2.7. Схема строения простейшего кислород-водородного топливного элемента.
Анод Мембрана Катод
Анод Мембрана Катод
нове других организмов и топлив.нове других организмов и топлив.потенциалу такого же электрода, находящегося в аэробной стерильной среде. Напряжение в цепи было при этом 0,3—0,5 В, а сила слабого тока составляла 0,2 мА. За последующие 50 лет было описано множество биотопливных элементов, работающих на ос- В конце 50-х и начале 60-х
нове других организмов и топлив.
нове других организмов и топлив.
годов интерес к таким устройствам у исследователей, работавших по космическим программам, сильно возрос.
В целом разработанные модификации можно разделить на три основные группы, описание которых дается далее.
Биотопливный элемент на неэлектроактивных веществах
В таких элементах организмы или ферменты используются для превращения неэлектроактивных топлив в электроактивные их производные, которые затем окисляются в обычных элементах. Вот пример такого процесса:
Сбраживающий
Глюкоза>Н2,
микроорганизм
Н2> 2Н+ + 2е_ (на аноде),
2Н+ + -^- О2 + 2е~> Н2О (на катоде).
Деполяризирующий биотопливный элемент
В таких элементах микроорганизмы или ферменты применяются как катализаторы в электрохимической реакции, протекающей на одном или обоих электродах. Так, можно собрать водородную ячейку с ферментом гидрогеназой, катализирующим реак-
цию на аноде, и другим ферментом, лакказой, работающим на катоде:
Н2> 2Н+ + 2е~ (на аноде).
Гидрогенназа
2Н+ + — О2 + 2е~Н2О (на катоде).
2Лакказа
Регенерируемый биотопливный элемент
В этом устройстве биологический компонент предназначен для регенерации электрохимически активных веществ, которые и взаимодействуют с одним или обоими электродами. На рис. 2.8
WWVWWVРис. 2.8. Биотопливный элемент на основе микробной метанолдегидрогеназы. МДГ — метанолдегидрогеназа, ФЭС — феназинэтосульфат, ФМС — феназинметосульфат.Рис. 2.8. Биотопливный элемент на основе микробной метанолдегидрогеназы. МДГ — метанолдегидрогеназа, ФЭС — феназинэтосульфат, ФМС — феназинметосульфат.
WWV
WWV
Рис. 2.8. Биотопливный элемент на основе микробной метанолдегидрогеназы. МДГ — метанолдегидрогеназа, ФЭС — феназинэтосульфат, ФМС — феназинметосульфат.
Рис. 2.8. Биотопливный элемент на основе микробной метанолдегидрогеназы. МДГ — метанолдегидрогеназа, ФЭС — феназинэтосульфат, ФМС — феназинметосульфат.
приведена схема одного из таких устройств. Это — недавно созданный биотопливный элемент на основе фермента; в качестве топлива в нем используется метанол.
Хотя некоторые биотопливные элементы стали экономически выгодными и в них были достигнуты достаточно высокая плотность тока на электроде (до 40 мА/см2) и мощность (около I кВт), они еще не доведены до того уровня, чтобы их можно было широко внедрять в практику.
Отметим, однако, что в самое последнее время технология биотопливных элементов сильно шагнула вперед. Это касается и элементов с ферментами, где в качестве топлива используются спирт и окись углерода, и элементов с клетками микроорганизмов. Оба этих типа элементов принадлежат к числу регенерируемых. В последних используются редокс-медиаторы, способные обратимо проникать сквозь стенку и мембрану микробных клеток. Эти медиаторы реагируют с комцрнентами элект- рон-транспортной цепи, вызывая нечто вроде короткого замыкания в биохимической электрохимической системе и подсоединяя
ее одновременно к аноду топливного элемента (рис. 2.9). В таких устройствах в качестве топлива применяются сахара кл!£ вещества стоков, но теоретически для этой цели может быть использовано любое вещество, пригодное для роста микробов. Такие элементы могут работать довольно длительное время (от нескольких недель до месяцев), и наиболее совершенные опытные- их образцы по эффективности вполне сопоставимы с лучшими моделями элементов на основе ферментов. Для превращения: световой энергии в электрическую были созданы и похожие на них фотобиоэлектрохимические элементы, в которых электроны,, обладающие высокой энергией, поступают на анод от электрон- транспортной цепи фотосинтезирующих микроорганизмов.
Рис. 2.9. Принципиальная схема регулируемого Щ^го целые клетки микроорганизма.Рис. 2.9. Принципиальная схема регулируемого Щ^го целые клетки микроорганизма.топливного элемента, содержа-*топливного элемента, содержа-*
Рис. 2.9. Принципиальная схема регулируемого Щ^го целые клетки микроорганизма.
Рис. 2.9. Принципиальная схема регулируемого Щ^го целые клетки микроорганизма.
топливного элемента, содержа-*
топливного элемента, содержа-*
Судя по современному состоянию разработок биоэлектрохи- мических элементов, вполне реально, что их можно будет использовать в тех устройствах, где нужна относительно небольшая мощность, например для медицинских или военных целей,, а также для производства электроэнергии в отдаленных районах. В ближайшем будущем биотопливные элементы будут использоваться как чувствительные датчики, поскольку сила тока в них пропорциональна количеству переработанного топлива. В гл. 4 мы обсудим перспективы использования сходных 6ио・ электрохимических элементов в биохимическом синтезе.
ЛИТЕРАТУРА
Общие вопросы
Barnard G. W, (1983), Liquid Fuel Production from Biomass in the developing■ countries: An Agricultural and Economic Perspective. In： Bioconversion Systems (ed. Wise D. L.), pp. 112—268, CRC Press, Boca Raton, Florida.
Barnard G. W.f Hall D. 0. (1982). Energy from renewable resources: ethanob fermentation and anaerobic digestion. In: Biotechnology, Vol. Ill (Chapter 7)i (ed. Dellweg H.), Verlag Chemie, Weinheim,
Barnett A., Pyle D. L., Subramanian S. K. (eds.) (1978). Biogas Technology in the Third World: a Multidisciplinary Review, Inti. Devi. Res. Council, 60 Queen St, Ottawa KIP 5Y7.
BioEnergy Council (1981, 1984). International BioEnergy Directory, BioEnergy Council, P. O. Box 12807, Arlington, Virginia 22209.
Boland D. L., Turnbull J. W. (1981). Selection of Australian trees other than Eucaliptus for trials as fuelwood species in developing countries, Aust. For., 44, 235—246.
Buchanan R. A. et al. (1978). Hydrocarbon and rubber-producing crops, Econ. Bot, 32, 131—153.
Cannell M. G. R. (1982). World Forest Biomass and Primary Production Data, Academic Press, London.
<BNS (1982). Economic Evaluation and Conceptual Design of Optimal Agricultural Systems for Production of Food and Energy, Center Biol. Natural Systems report to US-Dept. Energy, Washington DC 20545.
<IQA (1978) Guayule, Centro Invest!, Quimica Appl., Aldama Ote 351, Saltillo, Mexico.
Coombs 丄(1980), Renewable sources of energy (carbohydrates), Outl. Agric., 10, 235—245.
Co加 W. A. (ed.) (1983). Biomass Utilization, Plenum Press, New York.
Яаг1 D. £. (1975). Forest Energy and Economic Development, Clarendon Press, Oxford.
^Goldman /. C. (1979). Outdoor mass cultures, Water Resour., Wash., 13, 1—19.
Good M E. (1981). Fuel from biomass. In: Beyond the Energy Crisis, Vol. II (ed. Fazzolari R. A. and Smith С. B,), pp. 491—498, Pergamon Press, Oxford.-
Jiall D. O. (1980). Renewalbe resorces (hydrocarbons), Outl. agric., 10, 246— 255; (1981). New Scientist, 89, 524—526.
-Hall D. O. (1981). Solar energy through biology: fuel for the future. In: Advances in Food Producing Systems for Arid and Semi Acid Lands, (ed. Mannasah J. T. and Briskey E. J.), Academic Press, New York.
HM D. O. (ig82). Biomass for energy： fuels now and in the future, J. R. Soc.
Arts, 130, 457—471; (1982). Experientia, 38, 3—10.
iHall D. O. (1984). Photosynthesis for energy. In: Advances in Photosynthetic Research, Vol. II (ed. Sybesma C.), pp. 727—740, Martinus Nijhoff, The Hague.
Hall D. O., Barnard G. W., Moss P. A. (1982). Biomass for Energy in the Developing Countries, Pergamon Press, Oxford.
Jie den K. (1982). Swedish energy forestry, Biomass, 2, 1—3.
■Higgins /. /., Hill H. A. O. (1979). Microbial generation and interconversion of energy sources. In： Microbial Technology (eds. Bull A. T., Ellwood D. C. and Ratledge C.), Soc. gen. Microbiol Symp., 29, 359—377.
IHobson 声.M, Bousfield S., Summers R. (1981). Methane Production for Agricultural and Domestic Wastes, Appl. Sci. Publ., London.
Hughes D £ (ed.) (1982). Anaerobic Digestion (1981). Elsevier, Amsterdam. 3CE (1978). Alcohol Fuels, Inst. Chem. Eng., NSW Branch, Sydney, Australia. Johnson J., Hinman H. E (1980). Oil and rubber from arid land plants, Science, 208,460—464.
Kingsolver В. E. (1982). Euphorbia lathyrus reconsidered: its potential as an energy crop for arid lands, Biomass, 2, 287—295.
.Klass D. L., Emert G. H, (1981). Fuels from Biomass and Wastes, Ann. Arbor Sci. Publ. Michigan.■ ■
^Leach G. (1976), Energy and Food Production, IPC Press, Guildford, UK. Lewis C. (1983). Biological Fuels, Edward Arnold, London.
Lipinsky E. S. (1981), Chemicals from biomass: petrochemical substitution .options, Science, 212, 1465—1471.…
Lipinsky Е. S. (1981). Systems Study of Animal Fats and Vegetable Oils for Use as Substitute and Emergency Diesel Fuels, Report to US Dept, Energy by Battelle, Columbus, Ohio 43201.
McLaughlin /., Hoffman /. /. (1982). Survey of biocrude-producing plants from the southwest, Econ. Bol, 36, 323—339.
Moss P. 4, Hall D. 0. (1982). Biomass for energy in Europe, Int. J. Solar Energy, 1, 239—262.
Nair P. K. (1980). Agroforestry Species, Inti Council Res. Agroforestry, PO Box 30677, Nairobi.
NAS (1977). Methane Generation from Human, Animal and Agricultural Wastes, Natl Acad. Sci. USA, Washington DC 20418.
NAS (1981). Firewood Crops: Shrub and Tree Species for Energy Production. Natl Acad. Sci. USA, Washington, DC 20418.
NAS (1982). Priorities in Biotechnology R and D for International Development, Natl Acad. Sci. USA, Washington DC 20418.
NEPA (1981), Du petrole sur nos terres, Motorisation et Technique Agricola Suppl. March 1981, NEPA (S. A.) 10 rue Martel, Paris 75493.
OALS (1980). A Technology Assessment of Guayule Rubber Commercialisation^ Office Arid Lands Studies, Univ. Ariz., Tuscon, Arizona.
OTA (1980). Energy from biological Processes, Office of Technology Assessment US Congress, Washington DC 20510.
Paiz W., Chartier R, Hall D. O. (eds.) (1981). Energy from Biomass, Appl. Sci. Publ., London.
Pimentel D, Pimentel M. (1979). Food, Energy and Society, Edward Arnold, London.
Rabson R, Rogers P. (1981). The role of fundamental biological research in developing future biomass technologies. Biomass, 1, 17—38.
Richmond A., Preiss K. (1979). The biotechnology of aquaculture. Interdisc. Sci. Rev.( 5, 60—68.
Royal Society London (1982). Industrial and Diagnostic Enzymes, Phil. Trans, Roy. Soc. bond.*
SAE (1981), Fuels from Crops, Soc. Automative Engin., Natl. Sci. Centre, Melbourne, Australia.
Scurlock J, M.。.，Hall D. O. (1984). Energy from Biomass in Europe. In: 5th Canadian Bioenergy R and D Seminar (ed. Hosnain S.), pp. 56—65, Elsevier, London.
Shetef G., Soeder C. J, (eds.) (1980). Algae Biomass, Production and Use, Elsevier, Amsterdam.
Silversides R. (1982). Energy from forest biomass —its effect on forest management practices in Canada, Biomass, 2, 29—42.
Slesser M., Lewis C. (1979). Biological Energy Resources, Spon, London.
Sonalysts Inc. (1981). Assessment of Plant Derived Hydrocarbons, Report to US-Dept. Energy, Washington DC 20545.
Stafford D. A., Wheatley 及丄，Hughes DE (eds.) (1980). Anaerobic digestion, Appl. Sci. Publ., London.
Steinbeck K. (1981). Short-rotation forestry as a biomass sourse: an overview In： Energy from Biomass (eds. Paiz W., Chartier P. and Hall D. O.), pp. 163二 171, Appl. Sci. Publ., London.
Stewart G. A. et aZ. (1979). The Potential for Liquid Fuels from agriculture and Forestry in Australia, CSIRO, Div. Chemical Technology, Canberra.
Stewart G. A. et al, (1982). The Potential for Production of Hydrocarbon Fuels from Crops in Australia, CSIRO Div. Chem. Technol., Canberra, Australia.
Strub A„ Chartier P., Schleser G. (eds.) (1983). Energy from Biomass, Vol. 2, Appl. Sci. Pub!,, London.
Teri (1982). Biogas Handbook, Tata Energy Res. Inst, Bombay 4000023, India.
Trindade J. C. (1981). Energy cropsthe case of Brazil. In: Energy from Biomass (eds. Paiz W., Chartier P., Hall D. O.), pp. 59—74, Appl. Sci. Publ., TI^1 北2丽)Energy Balances in the Production and End-use of Alcohols Deri- ved from Biomass, TRW Crop. US Dept. Energy, Washington DC 20545.
Zaborsky 0. R. (ed.) (1981). Handbook of Biosolar Resources, Vol. II, Resource Materials, CRC rPess, Boca Raton, Florida.
Фотосинтез
Beadle C L” Long S. R, Hall D. 0., Imbamba S. K, Olembo R.丄(1985). Photosynthesis in Relation to Bioproductivity, UN Environment Programme, PO Box 30552, Nairobi (publ. Tycooly Inti. Dublin).
Coombs J (1982). Improving biomass productivity. In: Energy from Biomass, Vol. II (eds. Strub A„ Chartier P., Schleser G.), pp. 105—110, D. Reidel Publishing Co., Dordrecht, Holland.c 〔
Coombs /., Hall D. O., Chartier P. (1983). Plants as Solar Collectors, D. Reidel Publishing Co., Dordrecht, Holland..
Cooper J. P. (ed.) (1975). Photosynthesis and Productivity in Different Environments, Cambridge University Press.
Ebeling W. et al. (1982). Improving agricultural productivity, Econ. Impact, 39, 6—47
Edwards G, Walker D A. (1983). C・3, C-4: Mechanisms of Cellular and Environmental Regulation of Photosynthesis, Blackwell Scientific Publications, Ox-
Govindjee (ed.) (1982). Photosynthesis, Vol. 1 and 2, Academic Press, New
Hall D. O., DaSilva £.丄(1983). Photosynthesis: a bisolar tool for development, Nature Resour., 19 (2), 2—10.
Hall D. Q, Rao К. К (1981). Photosynthesis, 3rd edn., Edward Arnold, London.
Hall D. 0., Paiz W. (eds.) (1982). Photochemical, photoelectrochemical and pho- tobiological processes, D. Reidel Publishing Co., Dordrecht, Holland.
Halliwell B. (1981). Chloroplast Metabolism, Clarendon Press, Oxford.
Oswald IF. J. (1981). Algae as solar energy converters. In： Energy from Biomass (eds. Paiz W・，Chartier P., Hall D. O), pp. 633—646, Appl. Sci. Publ., London.
Pirson 4, Zimmerman M, H. (eds.) (1977). Encyclopaedia of Plant Physiology: Photosynthesis, Vol. 5, Springer Verlag, Berlin.
UK-ISES (1976). Solar Energy —a UK Assessment, UK Section Inti Solar Energy Soc., 19, Albemarle St., London Wl.
Бесклеточные системы
Bolton J. R., Hall D. 0. (1979), Photochemical conversion and storage of solar energy, Ann. Rev. Energy, 4, 353—406.
Braun A. M. (ed.) (1983). Photochemical Conversions, UNESCO, Presses Polytechnic Romandes, Lausanne.
Calvin M (1982). Plants can be direct fuel source. Biologist, 29, 145—148;
(1980). Energy, 4, 851—870.
Connolly 丄 S. (ed.) (1981). Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy, Academic Press, New York.
Этанол
Coombs J. (1981). Ethanol — the process and the technology for production of liquid transport fuel. In： Energy from Biomass (eds. Paiz W.( Chartier P., Hall D. O.), pp. 279—291, Appl. Sci. Publ., London.
Da Silva J. G. (1978). Energy balance for ethyl alcohol production from crops. Science, 201, 903—906.
Ferchak 丄 D., Qye £. D. (1981), Utilization of biomass in the U. S. for the production of ethanol fuel as a gasoline replacement, I and II, Solar Energy, 26, 9—25.
Khan A. S., Fox R.步.(1982). Net energy analysis of ethanol production in NE Brazil, Biomass, 2, 213—232.
Kovarik B. (1982). Fuel Alcohol, IIED/Earthscan, 10, Percy Street, London WL.
Lamed R., Zeikus /. G. (1980). Ethanol production by thermophilic bacteria, J. Bacteriol., 144, 569—578.
Lyons T. P. (1981). Gasohol, a step to energy independence, Alltech Publ.,. Lexington, Kentucky 40503.
SERI (1981). Alcohol Fuels Program Technical Review, Solar Energy Res. Inst.,. Golden, Colorado 80401,
Stone J. E, Marshall H. B. (1980). Analysis of Ethanol Production from Cellulosic Feedstocks, Dept Energy, Mines and Resources, Ottawa.
Биотопливные элементы
Aston W.丄，Turner A. P. F. (1984). Biosensors and biofuel cell's, BiotechnoL genet. Eng. Revs, 1, 89—120.
Bennetto H. P. (1984). Microbial biofuel cells. Life Chem. Reps, (in press).
Higgins 7. J., Hammond R. C, Plotkin E,匕 Hill H. A. O, Uosaki K, Eddo- wes M. J., Cass A. E. G.(1980). Electroenzymolo^y and biofuel cells, In: Hydrocarbons in Biotechnology (eds. Harrison D. E. F., Higgins Г. J., Watkinson R. J.), pp. 181—193, Heyden, London.
Turner A. P. F” Aston W.丄，Higgins T.几 Dams G., Hilt Я. A. O. (1982)'. Applied aspects of bioelectrochemistry: Fuel cells, sensors and bioorganic synthesis, Biotechnol. Bioeng. Symp., 12, 401—412.
Глава 3
Пищевые продукты, напиткии биотехнология
Г. Бич, М. Мелвин, Дж. Таггарт
Введение
3.1.1. Микроорганизмы и пищевые продукты
Оставим на время в стороне проблемы, связанные с сельским хозяйством, о котором речь пойдет в других разделах, и обратимся к производству пищевых продуктов и напитков. Это производство основано на переработке сырья, в основном постав- .ляемого сельским хозяйством, или же на использовании определенных веществ. Все органические вещества, применяемые в пищевой промышленности, в принципе могут использоваться микроорганизмами. Уже одно это говорит о ключевой роли микробиологии при производстве продуктов питания: здесь микробы могут играть и положительную, и отрицательную роль. Последняя, видимо, более выражена: не случайно меры предосторожности против нежелательной деятельности микробов занимают такое важное место при производстве пищи и ее потреблении. Размножение микробов может вызвать нежелательные изменения качества пищевых продуктов или их внешнего вида. При этом нередко образуются вещества, обладающие токсическим действием. Понятно, что явная порча пищи и связанные с этим экономические убытки весьма нежелательны, однако наиболее опасным следствием размножения микробов в пищевых продуктах является образование токсинов. Некоторые микроорганизмы при подходящих условиях образуют токсины, вызывающие серьезные заболевания или даже смерть.
В биотехнологии микроорганизмы играют положительную роль, поэтому возможности их применения для сохранения пищи уже, чем при ее производстве. Ниже мы приведем несколько примеров того, как используется биотехнология в первом варианте, однако в этой главе мы в основном рассмотрим те процессы, в которых микробы активно участвуют в производстве пищи. Мы обсудим также применение современных методов и знаний для интенсификации этих производств.
./.2. Две разновидности биотехнологии
Если рассмотреть, чем занимается сегодня биотехнология, то нетрудно убедиться, что существуют две ее разновидности, различающиеся по ценности получаемых продуктов и по масштабу
их производства. Различия эти ясны из табл. 3.1. Биотехнология маломасштабного производства, дающего дорогую продукцию специального назначения, сильно отличается от биотехнологии пищевой промышленности. Определяется это экономикой. Пищу получают из относительно недорогого сырья и относительно дешевыми способами. Стоимость конечного продукта не оправдывает дорогостоящих исследований по модернизации производства, как это имеет место, например, при получении антибиотиков, да это и не требуется. Даже производство микробных ферментов и их использование в пищевой промышленности, связанное с применением сложной технологии, правильно было бы считать биотехнологией крупномасштабного производства дешевых продуктов. Каждый, кто знаком с технической биохимией, зна-
Основные направления биотехнологических исследований и разработокСтоимость научных нс- следований и развитияОсновные направления биотехнологических исследований и разработокСтоимость научных нс- следований и развитияГенетические манипуляцииГенетические манипуляцииПовышеннаяПовышеннаяТехнология ферментации, инженерия про цессовПониженнаяТехнология ферментации, инженерия про цессовПониженная
Основные направления биотехнологических исследований и разработок
Стоимость научных нс- следований и развития
Основные направления биотехнологических исследований и разработок
Стоимость научных нс- следований и развития
Генетические манипуляции
Генетические манипуляции
Повышенная
Повышенная
Технология ферментации, инженерия про цессов
Пониженная
Технология ферментации, инженерия про цессов
Пониженная
Маломасштабные
Крупвюмасштабные
Таблица 3.1. Два типа биотехнологий
Объем установки Стоимость продукции Тип продукции
100—1000 л
Высокая
Для медицины, фармацевтической промышленности, высокоспециализированная
10 000 л
Невысокая
Предметы потребления^ малоспециализированная
ет, что получить ферменты высокой чистоты и специфичности — задача трудоемкая и сложная. Такие препараты дороги, и их не применяют при выработке пищевых продуктов. Здесь используют полуочищенные ферменты. Очистку проводят до такой степени, чтобы их можно было применять в относительно небольшом объеме. К исключениям относится тот случай, когда фермент иммобилизуют на твердом носителе, сквозь который пропускают субстрат. В таких проточных реакторах фермент успешно используется многократно, и это оправдывает применение высоко- очищенных препаратов. Не следует, впрочем, думать, что перспективы биотехнологии в пищевой промышленности ограничены. Правильнее говорить о разумных пределах затрат на производство пищи. Здесь нужен большой выход продукта и простая
технология. По этим причинам главными в биотехнологии пищевой промышленности являются методы крупном а сшта бного производства продуктов.
.1.3. Границы применения биотехнологии s пищевой промышленности
Спектр продуктов питания, получаемых при помощи микроорганизмов, обширен: от вырабатываемых с древних времен за счет брожения хлеба, сыра, йогурта, вина и пива до новейшего вида пищевого продукта — грибного белка микопротеина. Микроорганизмы при этом играют разную роль： используются продуцируемые ими ферменты или другие метаболиты, с их помощью сбраживается пищевое сырье, а некоторые из них выращиваются для непосредственного потребления. В пищевой промышленности для осуществления процессов применяют как чистые культуры микроорганизмов, так и дикие формы, содержащиеся в значительном количестве в сырье, которые начинают размножаться при создании надлежащих условий. Последний способ особенно характерен для традиционных бродильных производств, зародившихся во времена, когда о микробах еще ничего не знали. В мире промышленного производства такие процессы обычно ведутся под гораздо более строгим контролем：. Особенно это относится к выбору штамма и чистоте культур используем мых микроорганизмов.
До недавнего времени биотехнология использовалась в пищевой промышленности с целью усовершенствования освоенных процессов и более умелого использования микроорганизмов, но будущее здесь принадлежит генетическим исследованиям по созданию более продуктивных штаммов для конкретных нужд^ внедрению новых методов в технологии брожения. Таким путем мы сможем повысить выход и качество выпускаемой продукции и освоить производство новых ее разновидностей.
Молочные продукты
. Общие сведения
В пищевой промышленности ферментацию применяют главным образом для получения молочных продуктов. В сквашивании молока обычно принимают участие стрептококки и молочнокислые бактерии; лактоза при этом превращается в молочную кислоту. Путем использования иных реакций, которые сопутствуют главному процессу или идут при последующей обработке, получают и другие продукты переработки молока. Среди них — пахта： сметана, йогурт и сыр- Свойства конечного, продукта аависят при
этом от характера и интенсивности реакций ферментации. Те реакции, которые сопутствуют основному процессу образования молочной кислоты, и определяют обычно особые свойства продуктов. Так, именно вторичные реакции ферментации, идущие при созревании сыров, определяют вкус отдельных их сортов. В некоторых таких реакциях принимают участие пептиды, аминокислоты и жирные кислоты, присутствующие в продуктах.
В молоке лри ферментации могут протекать шесть основных реакций, и в результате образуются молочная, пропионовая или лимонная кислота, спирт, масляная кислота или же происходит колиформное газообразование. Главная из этих реакций — образование молочной кислоты. На ней основаны все способы ферментации (сквашивания) молока. Лактоза молока гидролизуется при этом с образованием галактозы и глюкозы. Обычно талактоза превращается в глюкозу еще до сквашивания. Имеющиеся в молоке бактерии преобразуют глюкозу в молочную кис- лоту. Образование сгустка казеина происходит в изоэлектрической точке этого белка (pH 4,6) под действием молочной кисло "гы. Этот процесс лежит в основе сыроварения (разд. 3.2.2).
При производстве швейцарского сыра ключевую роль играет маслянокислое брожение с образованием углекислого газа. .Именно оно обусловливает своеобразный вкус (букет) этих сыров и образование глазков. Характерный вкус пахты, сметаны и сливочного сыра формируется в результате лимоннокислого брожения. Он складывается из составляющих вкусов диацетила, пропионовой и уксусной кислот и других близких к ним соединений.
Молочные продукты, полученные на основе спиртового брожения, мало известны в Европе и Америке. Такой тип брожения нашел применение при переработке молока в России, но при производстве других продуктов он считается нежелательным. Юбычно рост вызывающих его дрожжей (Torula) стараются подавить. Нежелательны также маслянокислое брожение и коли- .формное газообразование.
Различные процессы ферментации молока проводят сегодня .в контролируемых условиях. В течение многих прошедших тысячелетий они осуществлялись при участии бактерий, исходно присутствующих в молоке. В наше время для этого используют разнообразные закваски, позволяющие получать молочные продукты нужного качества и типа. Применяющиеся при этом культуры живых бактерий могут представлять либо один какой-то ,штамм определенного вида (культуры моноштаммов), либо несколько штамов и/или видов (многоштаммовые или смешанные культуры). Коммерческие культуры-закваски состоят из бактерий, образующих молочную кислоту и пахучие вещества. В табл. 3.2 перечислены некоторые виды бактерий, используе-
Таблица 32 Функциональная роль некоторых бактерий, используемых при переработке молока
Культура
Функция
Использование
Propionibacterlum
Формирование вкуса, об-
Производство швейцар-
Р. shermanii
Р. petersonii
разование глазков
ского сыра
Lactobacillus
L. casei
L. helveticus
L. bulgaricus
L. lactis
Образование кислоты
Созревание,закваска
для швейцарского сыра, производство сыров типа швейцарского^
Leuconostoc
Образование вкусовых
Производство сметаны.
L. dextranicum
веществ из лимонной
сливочного масла, за-
L. citrovorum
кислоты (главным образом диацетила)
квасок
Streptococcus
S. thermophilus
S. lactis
S. cremoris
Образование кислоты
Производство йогурта и швейцарского сыра,, закваски для сыров
мые при производстве молочных продуктов методом ферментации, и указана их роль в этих процессах, а также продукты,, получаемые с их помощью. Выбор и состав используемых комбинаций из этих штаммов и видов бактерий определяются желаемыми свойствами и условиями получения продуктов, напри* мер скоростью образования молочной кислоты.
Последующие разделы посвящены разнообразным молочным- продуктам, вырабатываемым путем ферментации, рассмотрению* способов их производства и возможных путей их усовершенствования.
Сыр
Сыроварение — один из древнейших процессов, основанных на ферментации. При производстве сыра сохраняется питательная? ценность молока. Сыр упоминается в книгах писателей Древней Греции и Рима. Всего лишь несколько его сортов было получено 《по плану》， большинство же ——результат счастливой случайности. Известны самые разнообразные сыры — от очень мягких до твердых. Различие между ними определяется тем, что все- натуральные мягкие сыры содержат много воды, 50—60%,. а твердые ——всего лишь 13——34%. Хотя свойства сыров чрезвычайно разнообразны, в процессе' выработки всех их есть многообщего. Первый этап — это подготовка культуры молочнокислых бактерий и засев ею молока. Затем молоко створаживают^ для чего обычно применяют фермент реннин. После отделения'
водянистой жидкости (сыворотки) полученную творожистую массу подвергают термообработке и прессуют в формах. Далее сгусток солят и ставят на созревание.
Инокуляция
В прошлом сыроделы полагались на бактерии, имеющиеся в натуральном молоке. Присутствие в нем как нужных, так и нежелательных микробов приводило к тому, что разные партии сыра отличались друг от друга.
В наши дни в сыроварении предпочитают использовать молоко с минимальным количеством бактерий и применяют закваски, содержащие различные микроорганизмы в пропорции, обеспечивающей наилучшее качество. Набор бактерий определяется температурой термообработки (табл, 3.3).
Таблица 3.3. Закваски, используемые при разных температурах обработки сгустка при производстве сыра
ЗакваскаЗакваскаТемпература -формированиясгустка, ℃
Закваска
Закваска
〉3842—4649—54〉3842—4649—54S. lactis или 5. cremoris
〉3842—46
49—54
〉3842—46
49—54
S thermophilus +
S. lactis
S. thermophilus +
bulgaricus или
helveticus или
lactis
Существуют три причины, по которым образование молочной кислоты так важно в сыроварении: 1) она способствует образованию сгустка при добавлении реннина; 2) уменьшает объем сгустка, что облегчает отделение сыворотки; 3) молочная кислота препятствует развитию нежелательных микроорганизмов в ходе производства и при созревании сыра; 4) она влияет на эластичность сгустка и способствует слипанию и затвердению творожистой массы; 5) сказывается на характере и выраженности ферментативных превращений в ходе созревания, участвует в формировании вкусового букета сыра.
При производстве конкретных сортов сыра скорость образования кислоты зависит от применения определенных заквасок. Новинка в этой области — концентрированные, глубоко замороженные или лиофильно высушенные закваски, которые сыровары добавляют прямо в молоко. При получении сухих заквасок главная сложность — не повредить клетки. Состав заквасок со
временем меняется. В 60-х годах использовали закваски на основе молока и фосфатного буфера, а затем — на основе сыворотки. Потом стали применять сильно забуференные среды, что предотвращало падение pH ниже 5,2. Предложено также использовать большие объемы заквасок с контролируемыми свойствами, что позволяет поддерживать pH на уровне 6,2.
Створаживание
После внесения закваски для формирования сгустка и сыворотки обычно добавляют сычуг. Роль последнего заключается в превращении жидкого молока в гель (сгусток). Если этот экстракт сычуга не применяется, то получают творожистую массу параказеината кальция. Различие между двумя этими способами створаживания молока в том, что без сычуга оно занимает до 16 ч, а с ним — всего 15—30 мин. Время, проходящее от момента добавления закваски до внесения сычуга, называется временем созревания молока (до 60 мин в зависимости от сорта сыра). За этот период бактерии успевают выработать достаточно кислоты, чтобы активировать реннин.
Сычуг, применяемый в с&роварении,——это часть желудка телят. В последние двадцать лет ввиду нехватки этого сырья были предприняты поиски его заменителей. Функции реннина могут выполнять большинство протеиназ, однако реннин помимо створаживания молока участвует и в протеолизе, происходящем в сыре при созревании. Любой заменитель сычуга должен, кроме створаживания молока, обеспечивать и эту реакцию. Большинство известных заменителей реннина обладают большей, чем у сычуга, протеолитической активностью при равной способности к створаживанию. Такая избыточная активность может уменьшать выход сыра и содержание в нем жиров. Кроме того, некоторые продукты протеолиза искажают вкус готового сыра. Так, горечь сыра определяется некоторыми пептидами, образующимися в сырах при длительной выдержке. Быстро созревающие и плесневые сыры менее подвержены порче: возможно, в ходе созревания протеолиз заходит не слишком далеко. Многие протеиназы могут створаживать молоко, и поиск возможных заменителей сычуга вели именно среди протеиназ растений, животных, бактерий и грибов. Как выяснилось, большинство препаратов- ко агул я нтов из растений обладает слишком большой протеолитической активностью. Наилучшие заменители были получены из микробов； они в достаточном количестве поступают на рынок в Америке и Европе.
Два заменителя сычуга, которые сегодня предлагаются поставщиками, получают довольно сложным путем из плесневого гриба Mucor miehei. Эти заменители считаются более подходя* 7—1344
щими для производства большинства сыров, чем аналогичные вещества из М, pusillus. В США 60% сыра выделывают с помощью коагулянтов из микробов. Будущее этой отрасли связана с применением методов генетической инженерии: реннин будут синтезировать бактерии. Эта проблема освещена в обзоре Грина (Green, 1977).
Термообработка и прессование
После коагуляции сгустки измельчают, что способствует полному отделению сыворотки. Затем эту смесь определенное время нагревают. После термообработки отделяют сыворотку и создают условия для накопления молочной кислоты, меняющей химический состав массы. В ходе этой операции, как и при последующих обработках, создается характерная текстура (строение массы) сыра. Затем проводят посол и прессование, а также иную, если требуется, особую обработку.
Такая особая обработка нужна при производстве отдельных сортов сыра и заключается в следующем: 1) заражении спорами голубых плесневых грибов при производстве рокфора и голубых сыров; 2) нанесении на поверхность спор белых плесневых грибов при производстве камамбера и бри; 3) нанесение бактерий, нужных для созревания некоторых сыров (Port Salute St. Paulin). Примером таких бактерий поверхностного созревания является Brevibacterium linens.
Созревание
Если необходимо, на следующем этапе сыры отправляют н週 созревание или выдержку. К этой группе сыров относятся чеддер и швейцарский; сливочные сыры не выдерживают. Созревание происходит в специальных помещениях с контролируемой температурой и длится до четырех лет. В зависимости от сорта сыра температура созревания варьирует от 2 до 16℃. Микроорганизмы и ферменты в ходе этого процесса гидролизуют жиры, белки и некоторые другие .вещества молодого сыра. В результате их распада образуются вещества, придающие сырам характерный вкус. Поскольку процесс этот длительный, сокращение его экономически выгодно. Большинство способов ускорения созревания основано на увеличении скорости ферментативного превращения белков или жиров сыра. Сыры с резким вкусом типа Danish Blue изготавливать проще, чем с более тонким. Еще сложнее получать ускоренным методом чеддера Чтобы добиться естественного сочетания обеспечивающих вкуе веществ, необходимо тщательно подобрать ферменты, добавляемые к исходному продукту. Ранее мы уже говорили об образо-
Пшце8bLe продукты, на/штки и биотехнолоен凡 99 еании пептидов бактериями закваски. Эти пептиды могут придать сыру нежелательную горечь, портящую его вкус. Добавление протеиназ приведет к нужному результату лишь при определенном уровне активности, иначе пострадает вкус сыра. Можно надеяться, что эту проблему удастся решить с помощью новых микробных пептидаз. Обнадеживающие результаты получены с одной из протеиназ Bacillus subtilis, нейтразой. Для сыров со средней интенсивностью вкуса время созревания было -сокращено с четырех до двух месяцев, а для сыров с полным вкусом — с двадцати до шести. Если фермента добавить в меру, горечь не появляется. Нейтраза удобна и тем, что если сыр выдерживать при 6℃, то скорость созревания становится такой же, как у сыра без добавки, что при неожиданном падении ■спроса на сыр дает большие преимущества. Влияние липаз на созревание менее определенно, хотя указывалось, что они ускоряют его при производстве чеддера. При использовании ферментов, добавляемых к молоку, часть их теряется с сывороткой при отделении ее от сгустка. Это невыгодно и, кроме того, наличие ферментов в сыворотке затрудняет ее продажу. Для решения этих проблем предложено использовать ферменты, заключенные в микрокапсулы. Это один из возможна путей.
Уменьшить время производства и созревания можно, используя молоко с гидролизованной лактозой. Гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы осуществляется ^-галактозидазой (лактазой). Для этого в сырое молоко добавляют S. lactis; при этом лактоза гидролизуется на 70%. Ускорение производства и созревания сыра происходит, видимо, в результате стимулирующего влияния глюкозы на рост и образование кислоты бактериями закваски. Впрочем, ряд ученых иначе трактует влияние молока ■с гидролизованной лактозой. Некоторые из них считают, что, хотя глюкоза и стимулирует рост бактерий закваски, она не ускоряет созревания. Механизм действия молока с гидролизованной лактозой не выяснен, но известно, что сыры, полученные на этой основе, действительно созревают быстрее. Если этот механизм станет нам известен, его можно будет с пониманием использовать на практике.
Ускорить созревание можно еще одним способом — увеличив количество бактерий в закваске. При этом содержание протеиназ и пептидаз будет выше, что и приведет к ускорению созревания. Важно, что скорость накопления кислоты останется прежней, а при производстве определенных сыров это имеет большое значение. Сегодня для предотвращения излишнего накопления кислоты генетически обусловленные свойства бактерий заквасок изменяют методами теплового шока, сенсибилизации и обработкой растворителями. Некоторые мутантные формы бактерий образуют больше протеазы или липазы на фоне
обычного количества кислоты. Использование заквасок на основе таких мутантов приводит к более быстрому созреванию; начальные этапы процесса при этом не меняются. Когда генетика бактерий закваски получит должное развитие, мы сможем создавать микроорганизмы для определенных целей. Главное преимущество здесь в том, что в отличие от ферментов модифицированные закваски — это естественный компонент системы. В табл. 3.4 приведены примеры использования ферментных
Таблица 3.4. Примеры использования ферментных добавок для ускорения созревания сыров (Law, 1980)
Тнп сыра
Добавляемые ферменты
Стадия добавления
тип
источник
Cheddar
Кислые и нейтральные протеиназы, пептидазы, липазы, декарбоксилазы
Различные коммерческие препараты и ферменты животных
Сгусток
Cheddar
Липаза, протеиназа
Ткани желудка те-
Молоко,
Romano
Parmesan
ленка
сгусток
Gouda
Протеиназа
Aspergillus oryzae
То же
Edam
Протеиназа + пептида-
Pseudomonas fluores-
Молоко
Cheddar
за
cens
Rossiiskii
Протеиназа
Панкреатин
Mozzarella
Липазы,эстеразы
(микроинкапсулированные)
Секрет из сычуга телят
Blue
Липаза
Aspergillus spp.
Сгусток
добавок для ускорения созревания сыров. Более подробные сведения содержатся в специальной литературе.
Сыворотка
Сыворотка ——это побочный продукт сыроварения; вкратце об этом уже говорилось ранее. Не так давно ее относили к отходам промышленности, но в последнее время в этой области наметились изменения: все популярнее становится использование сыворотки для производства подсластителей при помощи лактазы. В Англии получаемые при этом глюкозу и галактозу предполагается использовать в хлебопечении, кондитерской промышленности и для производства мороженого. Лактазу получают из Aspergillus niger. Получение сахаров из сыворотки налажено как в США (Corning/Kroger), так и в Англии (Corning/Dairy Crest).
Йогурт
Это один из древнейших продуктов, получаемых путем ферментации. После термообработки молоко заквашивают добавлением 2—3% закваски йогурта. Главную роль здесь играют бактерии Streptococcus thermophillus и Lactobacillus bulgaricus. Для получения желаемой консистенции продукта, вкуса и запаха эти организмы должны содержаться в культуре приблизительно в равных количествах. Кислоту в начале заквашивания образует в основном S. thermophillus. Смешанные закваски нужно часто обновлять, поскольку повторные пересевы неблагоприятно сказываются на соотношении видов и штаммов бактерий: в них начинает доминировать L. bulgaricus.
4. Масло
Из молочных продуктов проще всего получать масло. В зависимости от сорта производимого масла используют сливки с концентрацией от 30—32 до 30—40%. При их сбивании эмульсия масла в воде превращается в эмульсию воды в масле.
При производстве масла для улучшения вкуса и лучшей сохранности используют особые культуры бактерий. Улучшение вкуса было достигнуто путем создания специальных штаммов бактерий, отобранных по способности синтезировать нужные вещества, влияющие на вкус. Первыми для этой цели были использованы штаммы Streptococcus lactis и близких видов, а затем —смешанные культуры, включающие Streptococcus lactis, Leuconostoc citrovorum и L. dextranicum.
Помимо улучшения вкуса, таким путем удается устранить некоторые нежелательные привкусы. Перспективный способ доработки масла основан на добавлении липаз. Внедрение его позволит пускать масло в продажу непосредственно из маслобойки.
Сброженная пахта
Сброженный продукт получают из свежей пахты, а чаще из снятого молока путем добавления закваски, используемой при производстве масла. Эта закваска представляет собой смесь молочнокислых стрептококков (S. lactis или S. cremoris) и образующих ароматические вещества бактерий (L. citrovorum и 厶.dextranicum). И те и другие бактерии нужны для формирования полноценного вкуса и запаха пахты; стрептококки при этом доминируют. Роль молочнокислых стрептококков в закваске заключается в образовании молочной кислоты (она дает желаемых кисловатый вкус), свертывании молока и снижении
pH до значений, при которых образующие ароматические вещества бактерии синтезируют наибольшее количество летучих кислот.
6. Сметана
Ее готовят почти так же, как сброженную пахту. К сливкам добавляют 0,5—1% закваски, используемой при производстве масла. Далее продукт выдерживают, пока концентрация кисло* ты не достигнет 0,6%.
Новые продукты
Известно, что некоторые люди не переносят лактозу; для них можно выпускать молоко, обработанное ^-галактозидазой — ферментом, который уменьшает содержание лактозы. Для этой цели нужно разработать недорогой промышленный способ производства такого молока. ^-Галактозидазу получают из дрожжей, плесеней и бактерий. 、
Хлебопродукты 工
Хлеб и другие продукты,
В Англии большинство хлебопродуктов производится по 風но- логии Chorleywood Bread Process, но в других странах йёполь- зуется много других технологий хлебопечения. Для производства хлеба до сих пор применяют в основном дрожжи Saccharo- myces cerevisiae. Обычно их растят в ферментерах периодического действия на мелассе (свекловичной или сахарного тростника).
В простейшем случае готовят тесто, смешивая при комнатной температуре муку, воду, дрожжи и соль. При замесе слои теста перемещаются, создаются условия для образования пузырьков газа и подъема теста. Замешанному тесту дают возможность «подойти», а затем режут на куски нужного веса, формуют (при этом тесто раскатывают и складывают, чтобы получить нужную текстуру) и выдерживают во влажной атмосфере. При выдержке и на первой, следующей за ней стадии выпечки образовавшиеся при замесе и формовке《зародыши》газовых пузырьков наполняются углекислым газом. Он выделяется в ходе анаэробного сбраживания глюкозы и мальтозы муки. Поднявшееся тесто выпекают. В ходе этого термического процесса крахмал желатинизируется, дрожжи погибают и тесто частично обезвоживается. В результате мы получаем имеющий определенную форму, плотный по консистенции .продукт; с легкой ячеистой структурой и очень вкусной корочкой
Помимо углекислого газа при анаэробном брожении образуются разнообразные органические кислоты, спирты и эфиры. Все они заметно влияют на формирование вкуса хлеба.
В Германии и США из ржаной муки выпекают хлеб с кислинкой. Основа технологии здесь та же, что и при выпечке хлеба из пшеничной муки, но при замесе к тесту добавляют предварительно сброженную смесь ржаной муки и воды, заквашенную смешанной культур。立 лактобацилл. Содержащаяся в этой закваске (опаре) кислота и придает хлебу особый вкус.
3.32 Продукты гидролиза крахмала
Крахмал трех основных поступающих на рынок сортов получают по обычной технологии. Способы производства кукурузного, пшеничного и картофельного крахмала были неоднократно и подробно описаны (см. разд. «Литература»). Гидролиз этих разновидностейкрахмала в промышленном масштабе осуществляется разными способами: только кислотой, кислотой и ферментами и только ферментами. В первой четверти нашего века использовалась простая обработка кислотами, на смену которой пришли сегодня более совершенные технологические процессы. История развития. аМй отрасли может быть хорошим примером отклика биотехнологии на запросы потребителей и производства.
В середине 60-х годов на смену кислотному и кислотноферментативному процессам пришел ферментативный способ переработки крахмала, основанный на последовательном применении а-амилазы, В. subtilis и амилоглюкозидазы Л. oryzae или Л. niger. Главное его преимущество связано с увеличением скорости процесса, уменьшением уровня загрязнения продуктами реверсии, получением продукта с высоким декстрозным эквивалентом (ДЭ). Величина ДЭ гидролизата [в используемой шкале глюкоза (декстроза) соответствует 100 ед.] отражает глубину гидролиза крахмала, для которого ДЭ считается равным нулю.
Следующим важным шагом было внедрение в производство термостабильных а-амилаз, главным образом из В. Uchenifor- mis и В. amyloliquefaciens, работающих при температуре 100 ℃ и позволяющих после обработки аминоглюкозидазой получать продукцию с ДЭ, близким к 100.
Высокотемпературное ожижение крахмала сегодня стало обычным промышленным процессом, но следующий этап, осахаривание, до сих пор осуществляется при участии «обычной» глюкоамилазы A. niger путем одноразовой обработки. Предлагалось использовать для этого иммобилизованные ферменты, но широкого применения они пока не нашли.
Кроме производства глюкозы, наиболее заметным успехом в этой отрасли промышленности был выпуск смесей глюкозы и фруктозы. Этот продукт известен под названием изоглюкозы или кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы. Возможности промышленного применения этой технологии особенно ярко выявились в США, где крахмал-содержащее сырье производится в избытке, а собственного сахара не хватает. Изоглюкоза может заменять сахарозу в большинстве видов пищи. Что касается Европы, то производство изоглюкозы здесь сдерживается по экономическим причинам.
Сырьем для производства изоглюкозы служит деионизованный гидролизат крахмала, получаемый описанным ранее методом, с ДЭ, возможно более близким к 100. Изомеризация осуществляется ферментами из различных организмов. Выбор их определяется тем, насколько просто с ними работать, нуждаются ли они в кофакторах и стабильны ли. Источником фермента чаще всего бывают виды Streptomyces, В. coagulans, Actinoplanes missouriensis и виды Arthrobacier. После изомеризации и дальнейшей обработки образуется продукт, содержащий до 90% фруктозы, хотя исходное сырье, получающееся после установления равновесия в реакции изомеризации, представляет собой смесь глюкозы (51 %) и фруктозы (42%) с олигосахаридами (7%).
Используя разнообразные амилазы, трансглюкозидазы и ферменты, атакующие разветвленные молекулы, удается получить множество разновидностей гидролизата крахмала, которые находят широкое применение в промышленности. На рис. 3.1 сопоставлены данные о сырье, промежуточных и конечных продуктах этого производства.
Бродильные производства
Производство алкогольных напитков
Получение напитков путем спиртового брожения — одно из древнейших бродильных производств. Первыми из таких напитков были, видимо, вино и пиво. До появления работ Пастера в конце XIX в. о сути протекающих при брожении процессов и их механизмах было известно очень мало. Пастер показал, что брожение без доступа воздуха осуществляется живыми клетками дрожжей, при этом сахар превращается в спирт и углекислый газ. Тогда же было показано, что брожение осуществляется под действием каких-то веществ, находящихся внутри дрожжевых клеток. Одно из главных нововведений в области микробиологии брожения было предложено Хансеном, работавшим в исследовательском центре Карлсберг в Копенгагене с
ДЭДЭПроцессПроцессВещество Действующий агентВещество Действующий агентКонечный продукт、Конечный продукт、IОжижениеIОжижение6-812-14426394-966-812-14426394-96КонверсияКонверсияОсахариваниеОсахариваниеДеионизация,изомеризацияДеионизация,изомеризацияКрахмалI а-Амилаза + нагревание +Ожиженный _ перемешиваниеа Декстрин (твердый)крахмалIct-АмилазаКрахмалI а-Амилаза + нагревание +Ожиженный _ перемешиваниеа Декстрин (твердый)крахмалIct-АмилазаКонвертированный ot-Амилаза/кислоты 许 Сахар с малым ДЭкрахмал(твердый)Пулпуланаза / В -амилазаКонцентрированныйа мальтозный сироп а-Амилаза/кислота _ _ = Сахар с дЭ =42 (сироп)Конвертированный ot-Амилаза/кислоты 许 Сахар с малым ДЭкрахмал(твердый)Пулпуланаза / В -амилазаКонцентрированныйа мальтозный сироп а-Амилаза/кислота _ _ = Сахар с дЭ =42 (сироп)АминоглюкозидазаСахар с ДЭ=63а (сироп)Декстрозный . сиропАминоглюкозидазаСахар с ДЭ=63а (сироп)Декстрозный . сиропIИзомероэаI1__ХроматографическоеГразделениеIИзомероэаI1__ХроматографическоеГразделениеСахар с вь^соким ДЭ (сироп} а(твердый}(кристаллы)а Изоглюкоза (сироп)а 96%-ный сироп фруктозыСахар с вь^соким ДЭ (сироп} а(твердый}(кристаллы)а Изоглюкоза (сироп)а 96%-ный сироп фруктозы
ДЭ
ДЭ
Процесс
Процесс
Вещество Действующий агент
Вещество Действующий агент
Конечный продукт、
Конечный продукт、
I
Ожижение
I
Ожижение
6-8
12-14
42
63
94-96
6-8
12-14
42
63
94-96
Конверсия
Конверсия
Осахаривание
Осахаривание
Деионизация,изомеризация
Деионизация,изомеризация
Крахмал
I а-Амилаза + нагревание +
Ожиженный _ перемешиваниеа Декстрин (твердый)
крахмал
Ict-Амилаза
Крахмал
I а-Амилаза + нагревание +
Ожиженный _ перемешиваниеа Декстрин (твердый)
крахмал
Ict-Амилаза
Конвертированный ot-Амилаза/кислоты 许 Сахар с малым ДЭкрахмал(твердый)
Пулпуланаза / В -амилазаКонцентрированный
а мальтозный сироп а-Амилаза/кислота _ _ = Сахар с дЭ =42 (сироп)
Конвертированный ot-Амилаза/кислоты 许 Сахар с малым ДЭкрахмал(твердый)
Пулпуланаза / В -амилазаКонцентрированный
а мальтозный сироп а-Амилаза/кислота _ _ = Сахар с дЭ =42 (сироп)
АминоглюкозидазаСахар с ДЭ=63
а (сироп)
Декстрозный . сироп
АминоглюкозидазаСахар с ДЭ=63
а (сироп)
Декстрозный . сироп
IИзомероэа
I1__
ХроматографическоеГ
разделение
IИзомероэа
I1__
ХроматографическоеГ
разделение
Сахар с вь^соким ДЭ (сироп} а(твердый}
(кристаллы)
а Изоглюкоза (сироп)
а 96%-ный сироп фруктозы
Сахар с вь^соким ДЭ (сироп} а(твердый}
(кристаллы)
а Изоглюкоза (сироп)
а 96%-ный сироп фруктозы
Рис. 3.1. Стадии гидролиза крахмала.
дрожжами дикого типа. При производстве пива эти дрожжи доставляли массу неудобств. Хансен выделил чистые культуры дрожжей и использовал их в пивоварении; тем самым он стал пионером применения таких культур при производстве пива.
Алкогольные напитки получают путем сбраживания сахарсодержащего сырья, в результате которого образуются спирт и углекислый газ. Сбраживание осуществляется дрожжами рода Saccharomyces, В одних случаях используется природный сахар (например, содержащийся в винограде, из которого делают вино), в других сахара получают из крахмала (например, при переработке зерновых культур в пивоварении). Наличие свободных сахаров обязательно для спиртового брожения при участии Saccharomyces, так как эти виды дрожжей не могут гидролизовать полисахариды. Образование этилового спирта из глюкозы происходит по схеме Эмбдена — Мейергофа — Парнаса, представленной на рис. 3.2.
В производстве спиртных напитков применяют штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae или S. carlsbergensis. Различие между ними заключается в том, что S. carlsbergensis могут полностью сбраживать раффинозу, a S. cerevisiae к этому не способны. '
Фру к тозо-1,6-дифосфатФру к тозо-1,6-дифосфатСН2ОНс=оСН2ОНс=оснго®Дигидроксиацетонфосфат
Фру к тозо-1,6-дифосфат
Фру к тозо-1,6-дифосфат
СН2ОН
с=о
СН2ОН
с=о
’看 NAD +
,、NADH
СН2О®снонСН2О®снонATP ADPATP ADPСОО'З-ФосфоглицератСОО'З-ФосфоглицератСН2О®СНОНCOO©СН2О®СНОНCOO©L З-ДифосфоглицератL З-ДифосфоглицератснгонСНО(Р;соо^2-ФосфоглицератснгонСНО(Р;соо^2-ФосфоглицератРис. 3.2. Реакции метаболического пути Эмбдена——Мейергофа——Парнаса.Рис. 3.2. Реакции метаболического пути Эмбдена——Мейергофа——Парнаса.342. Пиво
СН2О®
снон
СН2О®
снон
ATP ADP
ATP ADP
СОО'
З-Фосфоглицерат
СОО'
З-Фосфоглицерат
СН2О®
СНОН
COO©
СН2О®
СНОН
COO©
L З-Дифосфоглицерат
L З-Дифосфоглицерат
снгон
СНО(Р;
соо^
2-Фосфоглицерат
снгон
СНО(Р;
соо^
2-Фосфоглицерат
Рис. 3.2. Реакции метаболического пути Эмбдена——Мейергофа——Парнаса.
Рис. 3.2. Реакции метаболического пути Эмбдена——Мейергофа——Парнаса.
Для осуществления спиртового брожения прежде всего необходимо, чтобы в пивоваренном сырье образовался сахар. Традиционным источником нужных для этого полисахаридов всегда был ячмень, но в качестве дополнительных используются и другие виды углевод-содержащего сырья. И сегодня ячменный солод составляет основу пива. Ячменный солод и другие компоненты измельчают и смешивают с водой при температуре до 67 ℃. В ходе перемешивания природные ферменты ячменного
солода разрушают углеводы зерна. На заключительной стадии раствор, называемый суслом, отделяют от нерастворимых остатков. Добавив хмель, его кипятят в медных котлах. Для производства пива с определенным содержанием алкоголя сусло после кипячения доводят до нужной плотности. Удельная плотность сусла определяется содержанием экстрагированных сахаров, подлежащих сбраживанию. По истечении определенного времени брожение заканчивается, дрожжи отделяют от пива и выдерживают его некоторое время для созревания. После фильтрации и других необходимых процедур пиво готово. Схема производственного процесса дана на рис. 3.3.
Начатое по инициативе Хансена использование индивидуальных штаммов дрожжей в пивоварении сегодня стало нормой: это культуры S. cerevisiae и S. carlsbergensis. Первые представляют собой дрожжи поверхностного и глубинного брожения: они применяются в производстве эля. Вторые — дрожжи глубинного брожения, их используют в производстве легкого пива.
Хотя генетика дрожжей развивается уже в течение многих лет, мы лишь недавно научились осуществлять селекцию дрожжей, используемых в производстве пива. По мере углубления наших знаний о свойствах дрожжей и тех качествах, которые они придают конечному продукту, все успешнее идет работа по выведению новых штаммов пивных дрожжей. В конечном счете мы сможем создать штамм, позволяющий получить идеальный продукт. Требования к таким идеальным дрожжам будут, естественно, зависеть от способа сбраживания и желаемых качеств пива. К числу наиболее важных свойств относятся продуктивность, способность формировать осадок, сбраживать мальтотриозу и т. д. Принимаются во внимание и вкусовые качества получающегося пива, т. е. образование веществ, ответственных за их формирование. Ранее основным способом получения штаммов, дающих продукт нужного качества, был их отбор из существующих пивных дрожжей. Вести отбор было выгоднее, чем заниматься гибридизацией, отчасти из-за малой способности пивных дрожжей к спорообразованию и низкой жизнеспособности аскоспор. В каждом аске образуется от одной до четырех спор, но не все они освобождаются при созревании. Дрожжи из рода Sacharomyces размножаются в основном вегетативно. При этом за счет множественного латерального почкования формируются сферические, эллипсоидные или реже цилиндрические дочерние клетки. Поскольку для развития технологии пивоварения могут понадобиться штаммы дрожжей, отличающиеся по свойствам от обычно используемых, придется прибегнуть к гибридизации. Основным вкладом биотехнологии в пивоваренную промышленность будет создание штаммов дрожжей, способных давать пиво с желаемыми свойствами.
ПомолПомолРезервуарРезервуарПодготовка к процессуПодготовка к процессуЕмкостьДля суслаЕмкостьДля суслаПроцесс пивоваренияПроцесс пивоваренияЯчменьЯчменьПолучениесолодаПолучениесолодаDDа ева евПобочные продуктыПобочные продуктыОтходы переработкиОтходы переработкиКорм для скотаКорм для скотаХмельХмельОдобренияОдобренияРастворение сахараРастворение сахараОтходы переработки хмеляОтходы переработки хмеляПечь для сушкихмеляПечь для сушкихмеляМедный котелМедный котелхолодильник jiiiiiiiiiiiiliiхолодильник jiiiiiiiiiiiiliiДрожжиДрожжиИзбытокИзбытокдрожжейдрожжейпищевые цели)пищевые цели)国国БродильныйБродильныйЕмкостиДляхраненияЕмкостиДляхранения
Помол
Помол
Резервуар
Резервуар
Подготовка к процессу
Подготовка к процессу
Емкость
Для сусла
Емкость
Для сусла
Процесс пивоварения
Процесс пивоварения
Ячмень
Ячмень
Получениесолода
Получениесолода
D
D
а ев
а ев
Побочные продукты
Побочные продукты
Отходы переработки
Отходы переработки
Корм для скота
Корм для скота
Хмель
Хмель
Одобрения
Одобрения
Растворение сахара
Растворение сахара
Отходы переработки хмеля
Отходы переработки хмеля
Печь для сушки
хмеля
Печь для сушки
хмеля
Медный котел
Медный котел
холодильник jiiiiiiiiiiiilii
холодильник jiiiiiiiiiiiilii
Дрожжи
Дрожжи
Избыток
Избыток
дрожжей
дрожжей
пищевые цели)
пищевые цели)
国
国
Бродильный
Бродильный
ЕмкостиДляхранения
ЕмкостиДляхранения
д-ра 既戮P聯‘提霓产e в основе пивоварения (с любезного разрешения
343. Вино
Необходимое условие любого спиртового бродильного процесса—наличие сахара в сырье. Так, в производстве вина используется сахар виноградного сока. Почти все вино в мире делают из винограда одного вида, Vitis vinifera. Сок этого винограда — прекрасное сырье для производства вина. Он богат питательными веществами, служит источником образования приятных запаха и вкуса, содержит много сахара; его природная кислотность подавляет рост нежелательных микроорганизмов.
Виноделие в отличие от пивоварения до самого последнего времени было основано на использовании диких местных дрожжей. Единственная обработка, которой подвергали виноград до отжима, — окуривание его сернистым газом, чтобы сок не темнел. Кроме того, сернистый газ подавляет деятельность не-вин- ных дрожжей; это позволяет винным дрожжам, которые менее чувствительны к нему, осуществлять брожение без помех. При изготовлении красного вина гребни, косточки и кожица до конца брожения находятся в виноградном сусле (мусте), а белое вино делают из чистого сока. Обычно окуривание сернистым газом проводят до того, как раздавливают ягоды, но иногда его добавляют и на более поздних стадиях.
В табл. 3.5 перечислены виды дрожжей, наиболее часто встречающиеся на кожице виноградных ягод. В прошлом именно эти дикие дрожжи и осуществляли спиртовое брожение. Сегодня в тех районах, где виноделием начали заниматься недавно, широко применяются дрожжевые закваски. Связано это с тем, что желаемая микрофлора может и отсутствовать, а инокуляция стандартной культурой дрожжей позволяет получать вина с нужными свойствами. Кроме того, количество используемого сернистого газа ограничено законом, и это побуждает применять дрожжевые культуры-закваски. Виноделы не очень-то полагаются на дрожжи дикого типа, если нет уверенности, что конкуренция со стороны не-винных дрожжей не подавлена. Использование заквасок дает ряд преимуществ: сокращается лаг-период размножения дрожжей, образуется продукт с известными свойствами, уменьшается вероятность появления нежелательного вкуса, поскольку в брожении не участвуют дикие невинные дрожжи. В будущем использование специально созданных штаммов будет все более расширяться: это гарантирует необходимые вкусовые качества вин. Смешанные закваски позволяют получать продукцию с полным букетом, что невозможно при работе с индивидуальными штаммами.
Вкусовые различия между сортами винограда определяются особыми веществами. Так, в формировании вкуса мускатных сортов участвуют производные терпенов, линалоол и гераниол.
а также в винограднома также в виноградномИсточникИсточникCandida pulcherrima (новое название—Metschnikowia pulcherrima)С. scottii (новое название — Leucospo- ridlutn scottii)Debaryomyces phaffitEndomycopsts lindtieriHansenula saiurnusKloeckera africanaК» apiculataPichia fermentansSaccharomyces acidifactens (ныне — разновидность S. bailti)S. bayanus (включ. S. oviformls)S. bisporusS. carlsbergetisis (новое название —S. uvarum)S. cerevisiaeS. chodatai (новое название — S. itali- cus)S. coreanusS. elegatis (новое название —S. bailii var. bailii)S. elegans vaar intermedia (новое название—S, bailii var. bailii)S. globosusS. heterogenicusS. italicusCandida pulcherrima (новое название—Metschnikowia pulcherrima)С. scottii (новое название — Leucospo- ridlutn scottii)Debaryomyces phaffitEndomycopsts lindtieriHansenula saiurnusKloeckera africanaК» apiculataPichia fermentansSaccharomyces acidifactens (ныне — разновидность S. bailti)S. bayanus (включ. S. oviformls)S. bisporusS. carlsbergetisis (новое название —S. uvarum)S. cerevisiaeS. chodatai (новое название — S. itali- cus)S. coreanusS. elegatis (новое название —S. bailii var. bailii)S. elegans vaar intermedia (новое название—S, bailii var. bailii)S. globosusS. heterogenicusS. italicusS. oviformis (новое название — S. bay- anus)S. pastorianus (новое название — S. bayanus)S. roseiS. rouxiiS. steineri (новое название — S. itali- cus}Torulopsts bacillaris (новое название—Torulopsts stellata)Torulopsis burgeffiatia (новое название ——M. pulcherrima)S. oviformis (новое название — S. bay- anus)S. pastorianus (новое название — S. bayanus)S. roseiS. rouxiiS. steineri (новое название — S. itali- cus}Torulopsts bacillaris (новое название—Torulopsts stellata)Torulopsis burgeffiatia (новое название ——M. pulcherrima)Обычны для сусла и вина; на винограде。Чехословакия; незрелый виноград в Новой ЗеландииВиноград в провинции КоньякВиноград и сусло, БразилияВино, полученное из поздно собранного виноградаВесьма обычны для винограда, сусла и винаВесьма обычныВиноград, сусло и виноИспортившиеся вина, виноград», устойчивы к сернистому газу (фруктофиллы)Виноград, сусло и виноВиноград, образуют мало спиртаВиноград, реже ——вина (применяются при производстве легкого пива)Классические винные дрожжи; по-ви^ димому, наиболее распространен* ныеВиноград в Грузии (СССР)Виноград; редкий вндВиноград и вино (фруктофил)Виноград в БразилииВиноград, виноградный сок и вино; встречаются редкоВиноград, сусло, виноградный сок; встречаются редкоВиноград и виноградный сок, вырабатываемый в местностях с теплым климатомВиноград, сусло и вино; обычный видВиноград, сусло; обычны для брожения по типу LoireВиноград и вино; обычный вид Перезрелый виноградВино и виноградВиноград и вино (фруктофил)Виноград и суслоОбычны для сусла и вина; на винограде。Чехословакия; незрелый виноград в Новой ЗеландииВиноград в провинции КоньякВиноград и сусло, БразилияВино, полученное из поздно собранного виноградаВесьма обычны для винограда, сусла и винаВесьма обычныВиноград, сусло и виноИспортившиеся вина, виноград», устойчивы к сернистому газу (фруктофиллы)Виноград, сусло и виноВиноград, образуют мало спиртаВиноград, реже ——вина (применяются при производстве легкого пива)Классические винные дрожжи; по-ви^ димому, наиболее распространен* ныеВиноград в Грузии (СССР)Виноград; редкий вндВиноград и вино (фруктофил)Виноград в БразилииВиноград, виноградный сок и вино; встречаются редкоВиноград, сусло, виноградный сок; встречаются редкоВиноград и виноградный сок, вырабатываемый в местностях с теплым климатомВиноград, сусло и вино; обычный видВиноград, сусло; обычны для брожения по типу LoireВиноград и вино; обычный вид Перезрелый виноградВино и виноградВиноград и вино (фруктофил)Виноград и сусло
а также в виноградном
а также в виноградном
Источник
Источник
Candida pulcherrima (новое название—Metschnikowia pulcherrima)
С. scottii (новое название — Leucospo- ridlutn scottii)
Debaryomyces phaffit
Endomycopsts lindtieri
Hansenula saiurnus
Kloeckera africana
К» apiculata
Pichia fermentans
Saccharomyces acidifactens (ныне — разновидность S. bailti)
S. bayanus (включ. S. oviformls)
S. bisporus
S. carlsbergetisis (новое название —
S. uvarum)
S. cerevisiae
S. chodatai (новое название — S. itali- cus)
S. coreanus
S. elegatis (новое название —S. bailii var. bailii)
S. elegans vaar intermedia (новое название—S, bailii var. bailii)
S. globosus
S. heterogenicus
S. italicus
Candida pulcherrima (новое название—Metschnikowia pulcherrima)
С. scottii (новое название — Leucospo- ridlutn scottii)
Debaryomyces phaffit
Endomycopsts lindtieri
Hansenula saiurnus
Kloeckera africana
К» apiculata
Pichia fermentans
Saccharomyces acidifactens (ныне — разновидность S. bailti)
S. bayanus (включ. S. oviformls)
S. bisporus
S. carlsbergetisis (новое название —
S. uvarum)
S. cerevisiae
S. chodatai (новое название — S. itali- cus)
S. coreanus
S. elegatis (новое название —S. bailii var. bailii)
S. elegans vaar intermedia (новое название—S, bailii var. bailii)
S. globosus
S. heterogenicus
S. italicus
S. oviformis (новое название — S. bay- anus)
S. pastorianus (новое название — S. bayanus)
S. rosei
S. rouxii
S. steineri (новое название — S. itali- cus}
Torulopsts bacillaris (новое название—Torulopsts stellata)
Torulopsis burgeffiatia (новое название ——M. pulcherrima)
S. oviformis (новое название — S. bay- anus)
S. pastorianus (новое название — S. bayanus)
S. rosei
S. rouxii
S. steineri (новое название — S. itali- cus}
Torulopsts bacillaris (новое название—Torulopsts stellata)
Torulopsis burgeffiatia (новое название ——M. pulcherrima)
Обычны для сусла и вина; на винограде。
Чехословакия; незрелый виноград в Новой Зеландии
Виноград в провинции Коньяк
Виноград и сусло, Бразилия
Вино, полученное из поздно собранного винограда
Весьма обычны для винограда, сусла и вина
Весьма обычны
Виноград, сусло и вино
Испортившиеся вина, виноград», устойчивы к сернистому газу (фруктофиллы)
Виноград, сусло и вино
Виноград, образуют мало спирта
Виноград, реже ——вина (применяются при производстве легкого пива)
Классические винные дрожжи; по-ви^ димому, наиболее распространен* ные
Виноград в Грузии (СССР)
Виноград; редкий внд
Виноград и вино (фруктофил)
Виноград в Бразилии
Виноград, виноградный сок и вино; встречаются редко
Виноград, сусло, виноградный сок; встречаются редко
Виноград и виноградный сок, вырабатываемый в местностях с теплым климатом
Виноград, сусло и вино; обычный вид
Виноград, сусло; обычны для брожения по типу Loire
Виноград и вино; обычный вид Перезрелый виноград
Вино и виноград
Виноград и вино (фруктофил)
Виноград и сусло
Обычны для сусла и вина; на винограде。
Чехословакия; незрелый виноград в Новой Зеландии
Виноград в провинции Коньяк
Виноград и сусло, Бразилия
Вино, полученное из поздно собранного винограда
Весьма обычны для винограда, сусла и вина
Весьма обычны
Виноград, сусло и вино
Испортившиеся вина, виноград», устойчивы к сернистому газу (фруктофиллы)
Виноград, сусло и вино
Виноград, образуют мало спирта
Виноград, реже ——вина (применяются при производстве легкого пива)
Классические винные дрожжи; по-ви^ димому, наиболее распространен* ные
Виноград в Грузии (СССР)
Виноград; редкий внд
Виноград и вино (фруктофил)
Виноград в Бразилии
Виноград, виноградный сок и вино; встречаются редко
Виноград, сусло, виноградный сок; встречаются редко
Виноград и виноградный сок, вырабатываемый в местностях с теплым климатом
Виноград, сусло и вино; обычный вид
Виноград, сусло; обычны для брожения по типу Loire
Виноград и вино; обычный вид Перезрелый виноград
Вино и виноград
Виноград и вино (фруктофил)
Виноград и сусло
Таблица 3.5. Дрожжи, Обитающие на винограде, сусле и вине (Kunkee, Goswell, см. Rose, 1977)
Роды и виды
Различные вкусовые оттенки появляются при выдержке вина; хорошо известно, что свой вклад вносит взаимодействие с древесиной и воздухом при хранении в деревянных бочках.
После завершения спиртового брожения молодое вино хранят в особых условиях, чтобы оно не испортилось. Если вино не предполагается подвергать яблочно-молочнокислому дображи- ванию, его обрабатывают сернистым газом, что подавляет окислительные процессы, вызывающие его потемнение. До этого из вина удаляют дрожжи, чтобы прекратить брожение.
Первосортные вина подвергают выдержке разного рода в за- еисимости от типа вина, а более дешевые разливают, как правило, в тот же год, когда они получены. Трудности при выработке дешевых вин обычно связаны с их склонностью к вторичному, яблочно-молочнокислому брожению, которое развивается ко времени разлива. Если вино склонно к такому брожению, ■его искусственно вызывают до разлива, а если нет, то подавляют. При производстве первосортных красных вин такое брожение даже желательно. Оно составляет естественную часть процесса и происходит при хранении. Этот тип брожения осуществляется молочнокислыми бактериями, в частности Leuconostoc、 Lactobacillus и Pedicoccus. Оно не идет при низких значениях pH; создав такие условия, его можно подавить. В белых винах яблочно-молочнокислое брожение происходит реже, так как pH в них ниже. Среди новшеств в этой области упомянем использование для инициации брожения вместо бактерий иммобилизованных ферментов.
Некоторые особые сорта вин, например сотерны, получают при участии гриба Botrytis cinerea. Его развитие на ягодах приводит к их обезвоживанию и повышению содержания сахара, что и определяет сладкий вкус вина. Заражение должно происходить только перед сбором винограда. Представляет интерес и еще один процесс, называемый углекислотной мацерацией. Красные вина, которые должны созреть к 15 ноября в год сбора винограда, получают особым способом. Виноград не давят, а помещают целиком в бродильные чаны, где держат в атмосфере углекислого газа. Брожение идет либо прямо в ягодах, в анаэробных условиях, либо в соке, выделяющемся в результате разрушения кожицы углекислым газом. Микробиология этого процесса пока не исследована.
В крепленых винах часть спирта получается при сбраживании винограда дрожжами, а часть добавляется. К числу таких вин относятся портвейн, херес и мадера (разд. 3.4.4).
Дальнейшие успехи виноделия будут определяться использованием более эффективных штаммов винных дрожжей и коммерческих препаратов дрожжевых заквасок. Это позволит получать вина особого качества.
Спирт
Производство перегнанного спирта моложе, чем неперегнанных спиртных напитков, но и его корни теряются в веках. Для получения напитка, содержащего 40% (по объему) спирта, нужна перегонка. Ее и сегодня осуществляют в перегонных аппаратах, представляющих собой модификации устройства, предложенного в 1830 г. Коффи и носящего его имя. Различия в сортах спиртовых продуктов зависят в основном от природы сырья, а также от того, подвергался ли конечный продукт выдержке. В спиртовом производстве используются пригодные для этой цели штаммы Saccharomyces. Крупные спиртовые заводы всегда ведут свою собственную культуру дрожжей в специальных средах. Выбор штамма дрожжей при производстве спирта определяется их продуктивностью в особых условиях бродящего сусла. Брожение должно идти активно с образованием спирта в количестве, близком к теоретическому пределу. Хотя в качестве сырья можно использовать разнообразные продукты, некоторые сорта спирта обычно производят из вполне определенных его типов. Так, коньяк, получаемый при перегонке вина, делают из винограда, а шотландский виски ——из ячменного солода. Другие напитки —американский виски, джин и водку, которые обычно делают из зерна (например, кукурузы), можно производить и на основе другого подходящего сырья. Ром обычно получают нз мелассы сахарного тростника или свеклы. Когда сырьем служит зерно (например, пшеницы или кукурузы), до сбраживания необходимо гидролизовать крахмал до сахаров. Так, виски — это продукт перегонки пива без хмеля. Первые стадии процесса производства виски такие же, что и при приготовлении сусла в пивоварении. Однако если применяют кукурузу или другие зерновые, то до приготовления сусла непосредственно в бродильных чанах проводят обработку крахмала в зерне ферментами солода.
Если для производства спирта используют мелассу, такие предварительные операции не нужны, поскольку углеводы в ней содержатся в форме, пригодной для сбраживания. Тем не менее сырье все же приходится подготавливать к процессу: осветлять, подогревать и разводить водой, чтобы получить концентрацию сахара, оптимальную для брожения. После подготовки сырья добавляют культуру подходящих дрожжей и ведут сбраживание. В конце его, когда концентрация спирта достигнет 9—11% (по объему), отделяют дрожжи путем отстаивания. Остатки их перед перегонкой можно удалить центрифугированием. Применяются два способа: кубовый и непрерывной перегонки (патент Коффи). После этого продукт либо отправляют на созревание (например, виски), либо проводят завершающие операции и
разливают по бутылкам (джин, водка). Для продажи спирто- продукты обычно разводят до стандартной концентрации в них спирта (40% по объему).
Остановимся на некоторых важных особенностях производства отдельных разновидностей спиртопродуктов. Очень важно использовать правильный штамм дрожжей. При выработке рома для производства сортов с сильным запахом обычно применяют штаммы дрожжей Schizosaccharomyces, а с менее интенсивным—быстро работающие Saccharomyces, Отметим,, что процесс образования спирта ускоряется бактериями Clostridium saccharobutyricum. Самый лучший ром получают в том случае^ когда соотношение бактерий к дрожжам составляет 1:5. Культуру бактерий вносят, когда концентрация этанола достигает 3,5—4,5%, а сахара — 6% (вес/объем).
Штаммы дрожжей, используемые в спиртовой промышленности, должны сохранять жизнеспособность вплоть до концентрации этанола 12—15% (по объему). Кроме того, если в качестве сырья используется зерно, дрожжи должны обладать способностью гидролизовать низкие олигосахариды до глюкозы. Это необходимо для полного превращения крахмала в этиловый спирт и углекислый газ.
Перегонка ——дорогостоящий этап процесса, так как он энергоемок. Использование дрожжей, выдерживающих повышенные концентрации спирта, уменьшает энергозатраты на этом атапе> поскольку для достижения одной и той же концентрации спирта надо отгонять меньше воды. Ожидается, что работа по созданию новых штаммов дрожжей, устойчивых к еще более высоким концентрациям спирта, будет успешной.
Пока углеводы не переведены в форму, усваиваемую дрожжами, брожение не происходит. Добавление гидролизующих крахмал ферментов ускоряет этот процесс. Для этого обычно применяют амилазу из культуральной жидкости штаммов Bacillus subtilis и амилоглюкозидазу, выделяемую из культур грибов штаммов Aspergillis niger и близких форм. Ферменты используются и при подготовке сусла, и при спиртовом брожении (см. разд. 3.3.2, где эти вопросы рассматриваются более подробно).
345. Сидр
Сброженный яблочный сок известен под названием сидр. В технологии производства сидра и вина есть много сходного.
Когда делают сидр, яблоки прежде всего измельчают в кашицу и отжимают сок. Для этого применяют как прессы, так и другие устройства, работающие на иных принципах. Способы подготовки сока перед брожением весьма разнообразны; он может использоваться как без обработки, так и после подавления в нем естественной микрофлоры и замещения ее дрожжами под-
ходящих штаммов. Чаще всего к соку добавляют сернистый газ, нем подавляют развитие Kloeckera apiculata, неблагоприятно влияющих на вкус готового сидра. Вслед за этим можно начинать брожение. Оно происходит либо при участии диких дрожжей, либо после добавления дрожжевой культуры-закваски. Требования, предъявляемые к дрожжам при производстве сидра, в общем те же, что и в других бродильных процессах: они должны обеспечивать полноту сбраживания, высокую его скорость и легко выпадать в осадок. Так как Saccharomyces растут медленно, при крупномасштабном производстве сидра нередко к обработанному сернистым газом соку добавляют те или иные чистые культуры дрожжей. Разные штаммы дрожжей образуют специфические ароматические вещества. Поэтому при производстве сидра точно так же, как в пивоварении, можно использовать разные штаммы для придания сидру специфического вку* са. Чтобы получить сидр определенного сорта, добавляемые дрожжи должны преобладать над дикими, быстрее размножаться и определять конечные свойства продукта. Запуск процесса доминирующей формой дрожжей ——один из наиболее широко используемых способов, применяемых при крупномасштабном лроизводстве сидра. Важно, чтобы дрожжи были способны образовывать полигалактуронидазу, необходимую для гидролиза деэтерифицированннх пектинов до галактуроновой кислоты. В противном случае в конце брожения сидр не просветляется. Для просветления сидра нередко добавляют гидролизующие пектин ферменты, включая полигалактуронидазу; их получают из грибов (разд. 3.7.3).
Для подавления развития всех штаммов дрожжей, кроме нужных для ферментации, при производстве сидра применяют сернистый газ по той же схеме, что и в виноделии. Если не заботиться о чистоте аппаратуры и не применять газ, дикие дрожжи могут размножиться и вытеснить культурные. При выборе конкретного штамма дрожжей нужно также учитывать, какие вкусовые вещества они передадут образующемуся продукту; можно получить сидр как с небольшим, так и с заметным содержанием сивушных масел. Для придания сидру необходимых качеств нужно использовать определенный штамм дрожжей.
По завершении брожения сидр отделяют от дрожжей и осветляют. Поскольку в сидре есть яблочная кислота, то, как и в вине, в нем может начаться яблочно-молочнокислое брожение. Такое брожение не идет, если сидр очень кислый или его держат на холоде.
Как и в случае пивоварения, развитие производства сидра будет определяться селекцией новых штаммов дрожжей, позволяющих получать продукты со свойствами, отвечающими вкусам разных потребителей.
Уксус
Хотя уксус и не принадлежит к алкогольным напиткам, мы решили остановиться на его производстве в этом разделе, поскольку одна из двух стадий его получения включает спиртовое брожение.
Уксус — это продукт, содержащий не менее 4% (вес/объем) уксусной кислоты; его получают с помощью двухстадийного процесса. Вначале осуществляют спиртовое брожение, в ходе которого сахар сырья превращается в спирт при участии S. се- revisiae. Сырьем может быть любой продукт, который сбраживается с образованием спирта. После завершения этого этапа дрожжам дают осесть и собирают надосадочную жидкость. Содержание спирта доводят до 10—13%, и, если в ходе брожения для подавления роста бактерий добавлялся сернистый газ> его перед дальнейшими операциями удаляют. На следующем этапе этиловый спирт превращается в уксусную кислоту (про* межуточным продуктом является ацетальдегид). Все процессы получения уксуса идут при участии смешанных культур Aceto- bacter; в некоторых случаях применяют закваски. На этой стадии основную роль играют бактерии Л. schuetzenbachii, A, curvim, A. orleanense и близкие к ним микроорганизмы. Брожение происходит в аэробных условиях с потреблением больших количеств кислорода и выделением тепла. Ранее этот второй процесс шел медленно, но его удалось усовершенствовать и увеличить конверсию этилового спирта в уксусную кислоту. Метод глубинной ферментации в этом производстве применить долгое время не удавалось. Проблему удалось решить лишь после второй мировой войны: этому помогли исследования по аэрации культур при производстве антибиотиков. Сегодня эта технология нашла широкое применение.
Белковые продукты
Традиционные белковые продукты,, получаемые путем ферментации
Микроорганизмы начали использовать в производстве белковых продуктов задолго до возникновения микробиологии. Достаточно упомянуть всевозможные разновидности сыра, а также продукты, получаемые путем ферментации соевых бобов. И в первом, и во втором случае питательной основой является белок. Способы производства этих продуктов рассмотрены в разд. 3.2 и 3.7. При выработке их при участии микробов происходит глубокое изменение свойств белоксодержащего сырья. В результате получают пищевые продукты, которые можно дольше хранить
(сыр) или удобнее потреблять (соевый творог). Микробы играют роль и в производстве некоторых мясных продуктов, предназначенных для хранения. Так, при изготовлении некоторых сортов колбасы (bologna, salami) используется кислотное брожение, обычно при участии комплекса молочнокислых бактерий. Образовавшаяся кислота способствует сохранности продукта и вносит вклад в формирование его особого вкуса. Кислотообразующие бактерии используются и при засоле мяса — еще одном способе консервации. Ряд блюд восточной кухни получают путем ферментации рыбы: для этого применяют плесневые грибы и дрожжи.
Этим, пожалуй, и ограничивается использование микроорганизмов в переработке белков. Возможности современной биотехнологии в этих производствах невелики, за исключением сыроделия (разд. 3.2.2). Другое дело — выращивание и сбор микробной массы, перерабатываемой в пищевые продукты: здесь биотехнология может проявить себя во всей полноте.
352. Белок одноклеточных организмов
По многим важным показателям биомасса микроорганизмов может обладать весьма высокой питательной ценностью. В немалой степени эта ценность определяется белками: у большинства видов они составляют значительную долю сухой массы клеток. На протяжении десятилетий активно обсуждаются и исследуются перспективы увеличения доли белка микроорганизмов в общем балансе производимого во всем мире белка. Такое увеличение возможно как в косвенной форме, путем введения белковых добавок в корм животным (что уменьшает потребность в таких продуктах, как соевая и рыбная мука), так и в прямой, путем получения продуктов питания. О белках, идущих на корм скоту, речь идет в гл. 9. Здесь мы рассмотрим те случаи, когда биомасса микроорганизмов непосредственно используется в пищу.
Чтобы отличать такой тип продуктов от белков высших многоклеточных животных и растений, для микробного белка придумано специальное название — белок одноклеточных организмов (BOO)L Производство его связано с крупномасштабным выращиванием определенных микроорганизмов, которые собирают и перерабатывают в пищевые продукты. В основе лежит технология ферментации — ветвь бродильной промышленности и производства антибиотиков. Чтобы осуществить возможно более полное превращение субстрата в биомассу микробов, тре-
1 В отечественной литературе обычно употребляется термин «белково-ви- таминный концентрат», но он уже по смыслу. — Прим, перев.
буется многосторонний подход. Выращивание микробов в пищевых целях представляет интерес по двум причинам. Во-первых, они растут гораздо быстрее, чем растения или животные: время удвоения их численности измеряется часами. Это сокращает сроки, нужные для производства определенного количества пищи. Во-вторых, в зависимости от выращиваемых микроорганизмов в качестве субстратов могут использоваться разнообразные виды сырья. Что касается субстратов, то здесь можно идти по двум главным направлениям: перерабатывать низкокачественные бросовые продукты или ориентироваться на легкодоступные углеводы и получать за их счет микробную биомассу, содержащую высококачественный белок. И в том и в другом случае технология ферментации играет ключевую роль. Здесь важно подобрать оптимальный состав среды, создать определенные условия для роста, разработать конструкции ферментеров, правила их эксплуатации и системы контроля, выработать методы отделения биомассы от культуральной среды. Промышленное производство белка одноклеточных организмов всегда осуществляется методом глубинного культивирования в жидких средах; применяются как одноэтапное, так и непрерывное культивирование. Непрерывное культивирование сложнее, чем одноэтапное, но более экономично: производительность ферментеров выше. Именно этот метод был избран для промышленного производства БОО.
Непрерывное культивирование
Метод непрерывного культивирования основан на поддержании в системе динамического равновесия. Для перемешиваемой глубинной культуры постоянного объема это означает постоянство скорости роста микроорганизмов, которое обеспечивается путем равномерного ее разбавления свежей питательной средой (при сохранении объема). Среды, используемые при непрерывном культивировании, всегда составляют таким образом, чтобы один из субстратов (обычно это источник углерода) лимитировал рост, поэтому его содержание в культуральной жидкости минимально. Такой способ широко применяется в экспериментах по физиологии микроорганизмов. Даже в микробиологических лабораториях, где работа с чистыми культурами в асептических условиях — обычное дело, опыты по непрерывному культивированию требуют особого внимания. Специальное устройство аппаратуры, строгое соблюдение правил работы — все направлено на то, чтобы избежать загрязнения посторонней микрофлорой. Важность асептики при непрерывном культивировании стано- вится особенно ясной, если учесть, что метод этот представляет интерес как для лабораторий, так и для промышленности толь-
ко в том случае, если стационарное состояние культуры удается поддерживать в течение нескольких дней, недель или даже месяцев. Все это время культуру надо перемешивать, подавать непрерывно стерильную питательную среду и воздух и часть ее постоянно удалять. Температура должна поддерживаться постоянной; обычно регулируется и pH среды. Нужно периодически отбирать пробы для контроля постоянства условий и чистоты культуры. При промышленном производстве условия асептики могут быть соблюдены только в специальных сложных установках. В их конструкции должна быть учтена необходимость стерилизации перед началом каждого производственного Цикла. Это касается также работы любого датчика или пробо- отборника, встроенного в ферментер для непрерывного наблюдения и контроля всех параметров культуры.
О мерах безопасности при производстве белкаодноклеточных организмов
Микроорганизмы, традиционно используемые в пищевой промышленности, часто входят в состав конечного продукта (хотя доля их там обычно невелика). Как показывает опыт, безопасность этих продуктов не вызывает сомнений. Особенность белка одноклеточных организмов заключается в том, что этот продукт^ во-первых, практически целиком состоит из микробной биомассы и, во-вторых, в его производстве нередко принимают участие микробы, опыт использования которых мал и которые ранее в пище отсутствовали. Понятно, что государственные учреждения, контролирующие качество пищевых продуктов, требуют, чтобы выходу на рынок БОО предшествовали испытания на безопасность нового продукта. Такие испытания всегда дорогостоящи, и это сдерживает развитие производства, в частности производства продуктов на основе БОО, особенно предназначенных в пищу. По этой причине крен в развитии производства БОО был сделан в сторону выработки кормов для животных,, а не белков, непосредственно идущих в пищу. Правила оценки безвредности и способы тестирования продуктов, идущих на приготовление кормов, менее жесткие, а роль эстетического фактора не столь значительна. По этой причине для производства таких белков можно использовать более широкий круг субстратов, в том числе и органические вещества отходов. К числу БОО-продуктов, производимых промышленностью на корм животным, относятся Pruteen фирмы ICI (биомасса бактерий, выращенных на метаноле), Toprina фирмы ВР (дрожжи, выращенные на н-алканах) и грибная масса, получаемая по технологии фирмы Finnish Рekilo. При ее производстве в качестве субстрата используется сульфитный щелок, отход бумажной
Пшцев&е продукты, нагштки 〃 биотехно几оеи兄 11 9 промышленности. Все эти БОО выпускаются в виде слабо окрашенных порошков.
БОО-продукты, предназначенные в пищу, немногочисленны. Из их числа давно применяется дрожжевой экстракт (гидролизат пекарских дрожжей). Вообще говоря, это не белковая пища, так как используется он в небольшом количестве как вкусовая и витаминная приправа. Кроме того, это скорее побочный продукт бродильной промышленности, а не главный продукт процесса производства БОО. Во время второй мировой войны в пищевых целях в Германии выращивали дрожжи Candida, но это производство не получило дальнейшего развития. Относительно недавно фирма Hoechst стала выпускать на основе бактерий, растущих на метаноле, продукт, содержащий 90% белка. Он представляет собой одно из веществ, получаемых при фракционировании клеток выращенных бактерий. Сообщалось, что этот белок обладает нужными функциональными свойствами и его можно использовать в пищу. Процесс, разработанный фирмой Hoechst, позволяет получат^ ряд продуктов лишь на основе значительных вложений и поэтому относится скорее к группе маломасштабных биотехнологий по градации, используемой в табл. 3.1. Единственный новый официально разрешенный вид белковой пищи микробного происхождения — это микопротеин, производство которого налажено в Англии фирмой Ranks Hovis Me Dougall.
3.53 Грибной белок (микопротеин)
Микопротеин — это пищевой продукт, состоящий в основном из мицелия гриба. При его производстве используется штамм Fusarium graminearum, выделенный из почвы. И процесс, и продукт——это результат осуществления программы по их интенсивному развитию, изучению и испытанию. Микопротеин производят сегодня на опытной установке методом непрерывного выращивания. В качестве субстрата используется глюкоза и другие питательные вещества, а источниками азота служат лммиак и аммонийные соли. Общая схема функционирования установки приведена на рис. 3.4. После завершения стадии ферментации культуру подвергают термообработке для уменьшения содержания рибонуклеиновой кислоты, а затем отделяют мицелий методом вакуумного фильтрования.
Если сопоставить производство микопротеина с процессом синтеза белков гшвотных, то выявится ряд его преимуществ. Помимо того чта здесь выше скорость роста (это характерно для производства всех БОО-продуктов), превращение субстрата в белок происходит несравненно эффективнее, чем при усвоении пищи домашними животными. Это отражено в табл. 3.6.
СубстратСубстратРис. 3.4. Схематическое изображение производства микопротеина.Рис. 3.4. Схематическое изображение производства микопротеина.Работа ведется при соблюдении правил гигиеныРабота ведется при соблюдении правил гигиеныРабота ведется в асептических условияхРабота ведется в асептических условияхПродукцияИсходный продуктбелок, гобщая, гКороваСвиньяКурицаFusarium grami- nearum1 кг кормаТо же》1 кг углеводов + неорганический азот14414913668 говядины200 свинины240 мяса1080 клеточной массы, сырая массаПродукцияИсходный продуктбелок, гобщая, гКороваСвиньяКурицаFusarium grami- nearum1 кг кормаТо же》1 кг углеводов + неорганический азот14414913668 говядины200 свинины240 мяса1080 клеточной массы, сырая массаТаблица 3.6. Эффективность конверсии при образовании белка для различных животных и Fusarium graininearumТаблица 3.6. Эффективность конверсии при образовании белка для различных животных и Fusarium graininearumрис. 3.5. Строение гиф Fusarium graminearum. Микрофотография получена с помощью сканирующего электронного микроскопа.рис. 3.5. Строение гиф Fusarium graminearum. Микрофотография получена с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Субстрат
Субстрат
Рис. 3.4. Схематическое изображение производства микопротеина.
Рис. 3.4. Схематическое изображение производства микопротеина.
Работа ведется при соблюдении правил гигиены
Работа ведется при соблюдении правил гигиены
Работа ведется в асептических условиях
Работа ведется в асептических условиях
Продукция
Исходный продукт
белок, г
общая, г
Корова
Свинья
Курица
Fusarium grami- nearum
1 кг корма
То же
》
1 кг углеводов + неорганический азот
14
41
49
136
68 говядины
200 свинины
240 мяса
1080 клеточной массы, сырая масса
Продукция
Исходный продукт
белок, г
общая, г
Корова
Свинья
Курица
Fusarium grami- nearum
1 кг корма
То же
》
1 кг углеводов + неорганический азот
14
41
49
136
68 говядины
200 свинины
240 мяса
1080 клеточной массы, сырая масса
Таблица 3.6. Эффективность конверсии при образовании белка для различных животных и Fusarium graininearum
Таблица 3.6. Эффективность конверсии при образовании белка для различных животных и Fusarium graininearum
рис. 3.5. Строение гиф Fusarium graminearum. Микрофотография получена с помощью сканирующего электронного микроскопа.
рис. 3.5. Строение гиф Fusarium graminearum. Микрофотография получена с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Нелишне напомнить, что корма для животных должны содержать некоторое количество белка, до 15—20% в зависимости от вида животных и способа их содержания. Положительным фактором является и волокнистое строение выращенной культуры (рис. 3.5); текстура массы мицелия близка к таковой у естественных продуктов, поэтому у продукта может быть имитирована текстура мяса, а за счет добавок — его вкус и цвет. Плотность продукта зависит от длины гиф выращенного гриба, которая определяется скоростью роста. На рис. 3.6 показано, как выглядит готовый сформованный продукт. Для хранения его обычно замораживают, но иногда и высушивают до порошка путем распыления.
рис з б. Так выглядит искусственная пища из грибного белка микопротеина-рис з б. Так выглядит искусственная пища из грибного белка микопротеина-После проведения всесторонних исследований питательной ценности и безвредности микопротеина министерство сельского
рис з б. Так выглядит искусственная пища из грибного белка микопротеина-
рис з б. Так выглядит искусственная пища из грибного белка микопротеина-
хозяйства, рыболовства и пищевых продуктов дало разрешение на его продажу в Англии. Содержание основных питательных веществ в нем указано в табл. 3.7.
Таблица 3.7. Средний состав микопротеина и сравнение его с составом говядины
Состав, % (на сухой вес)
Компоненты
микопротенн
постный сырой бифштекс
Белки
47
68
Жиры/
14
30
Пищевые волокна
25
Следы
Углеводы [
10
0
Зола\
3
2
РНК (рибонуклеино-
1
Следы
вая кислота)
Пищевые добавки и ингредиенты
Подкислители 亨；
Подкислители применяются в основном как вкусовые добавки Для придания продуктам «острого» вкуса. В практику они вошли скорее всего в результате широкого использования органических кислот для сохранения пищи.-
По-видимому, самым популярным подкислителем в пищевой промышленности сегодня является лимонная кислота. Сначала этот важный продукт получали, отжимая сок из лимонов (в Италии): таким путем до начала 20-х годов удовлетворялось три четверти мировой потребности в лимонной кислоте. Сегодня ее получают при участии A. niger, сбраживая мелассу и содержащие глюкозу гидролизаты. Отметим, что процесс сбраживания нужно строго контролировать, так как лимонная кислота в отличие от других вторичных метаболитов играет важную- роль в регуляции обмена веществ. При консервировании помидоров широко используют яблочную кислоту； ее образует Л. fla- ims* К числу других кислот, находящих широкое применение в пищевой промышленности, относятся итаконовая (продуцент —— 4. terreus), глюконовая, используемая в форме глюконолактона (продуцент — Л. niger), и фумаровая (виды Rhizopus).
Аминокислоты (см. также гл. 4)
Сегодня во всем мире производится более 200 000 т аминокислот в год; их используют главным образом как добавки к кормам и пищевым продуктам. Основную часть аминокислот полу-
чают методами ферментации, но все большее значение приобретают химический и ферментативный синтез.
Главными продуктами, получаемыми по технологии ферментации, являются глутаминовая кислота (продуцент — Согупе- bacterium glutamicum) и лизин (В. flavum). В большом количестве производят еще две аминокислоты, глицин и метионин, ио до сих пор только методом химического синтеза.
Витамины 卫 пигменты
Основные потребности промышленности в этих соединениях удовлетворяются за счет природных источников и химического синтеза, но два из них, p-каротнн и рибофлавин, традиционно .получают методами биотехнологии. Последний образуется при глубинном культивировании Eremothecium ashbyii или Ashbya gossypii. Возможности микробиологического производства нетоксичных пищевых красителей исчерпаны далеко не полностью； р-каротина сегодня вырабатывают очень мало, а важную группу красителей красного цвета до сих пор получают из виноградных выжимок (экстракта).
364 Усилители вкуса ， ；
Расщепляя с помощью нуклеазы Penicillum citrinum нуклеиновые кислоты, получают в промышленном масштабе б^нуклео- тиды (содержащие главным образом инозин и гуанин), которые) находят применение как усилители вкуса. Вещества, усиливающие оттенки вкуса, содержатся и в природных пищевых продуктах. Главным усилителем вкуса считается натриевая соль глутаминовой кислоты: ее можно получить при помощи Micrococcus glutamicus. Пионером использования усилителей вкуса является Япония, но сам принцип применялся при создании рецептов многих блюд во всем мире.
3.65 Жиры и масла
Анализ перспектив использования жиров и масел, продуцируемых бактериями (в особенности содержащих необычные поли- ненасыщенные жирные кислоты, а потому дорогостоящих), показал, что в нынешних экономических условиях использовать эти вещества вместо жиров растительного и животного происхождения нецелесообразно.
Растительные клеи и загустители
Натуральные растительные клеи, получаемые из камедей растений или морских водорослей, принадлежат к числу давно известных пищевых добавок; в Китае, например, они широко
употреблялись еще в первом столетии до нашей эры, а об их использовании упоминается даже в Ветхом завете. Растительные клеи относятся к группе пищевых добавок — гидроколлоидов. Их применяют для изменения консистенции пищевых продуктов: эти вещества способствуют их загущению и образованию студней. Структура пищевых продуктов при этом стабилизируется, улучшаются их внешний вид и вкус.
Большое значение для этой отрасли имеет разработка промышленного производства полисахаридов пзpseudomonas spp. Их предполагается использовать вместо Хлюком'аннозы, одного из наиболее широко применяемых загустителей. Свойства этого нового продукта детально изучены. В кондитерской промышленности и при производстве мороженого в качестве стабилизатора сегодня широко используется декстран из Leuconosioc mesen- teroides (гл. 5).
Фрукты и овощи
Консервированные овощи
Как и в случае многих других разновидностей пищевого сырья, необходимость сохранения овощей для употребления их в течение всего года привела к созданию ряда новых пищевых продуктов. До того как в практику вошли консервирование в банках и замораживание, для сохранения овощей использовалась главным образом соль. Низкие концентрации соли (2—2,5%) при переработке содержащих сахара овощей с малой долей белков не препятствуют брожению с образованием кислот, идущему при участии бактерий. Этот способ дает хорошие результаты, но если белка в овощах много (горох, фасоль),то продукт портится. Если такие овощи засаливают, то соли добавляют столько, чтобы полностью подавить брожение. Когда соли добавляют мало, основную роль в консервации играют молочнокислые бактерии. Образование молочной кислоты из сахаров препятствует развитию бактерий кишечной группы, протеолитических бактерий, анаэробных и спорообразуюгцих видов.
Кислую капусту готовят из свежей измельченной капусты. После добавления соли на первых стадиях брожения доминируют бактерии Leuconosioc mesenteroides, которые в анаэробных условиях превращают сахара в молочную и уксусную кислоты^ этиловый спирт, маннитол, эфиры и СОг- В дальнейшем образование молочной кислоты из сахаров и маннитола осуществляется при участии Lactobacillus plantarum. Разложение ман- нитола ——важный этап, так как он придает продукту горький вкус. Хотя при получении кислой капусты условия сбраживания
в какой-то степени контролируются, применять закваски нет необходимости, так как никаких преимуществ они не дают.
Пикули делают из засоленных огурцов. Конечный продукт получают путем полного или частичного сбраживания либо без такой обработки. При брожении важную роль опять-таки играют молочнокислые бактерии, осуществляющие ферментацию сахаров. Соли обычно добавлят немного, и рассол с самого начала подкисляют уксусной кислотой. Если к нему добавляют укроп и другие пряности, то получают укропные пикули.
Оливки перерабатывают путем засолки и обработки щелоком. Когда консервируют зеленые плоды, молочнокислое брожение осуществляется при участии Leuconostoc mesenteroides, а затем Lactobacillus planarum и продолжается от шести до десяти месяцев. Спелые оливки либо не сбраживают вовсе, либо сбраживают недолго. И в том и в другом случае большое значение имеет обработка щелоком, так как при этом удаляется олеуропеин (глюкозид, имеющий горький вкус).
Микроорганизмы играют важную роль и на определенных стадиях выработки некоторых других продуктов, особенно кофе и какао. При замочке плодов на них развиваются молочнокислые бактерии и дрожжи, что способствует отделению кожуры от зерен； влияние микробов на качество конечного продукта незначительно.
Приведенные примеры использования микроорганизмов в переработке овощей — это процессы с простой технологией. Хотя в случае засолки деятельность микробов и определяет основные свойства конечного продукта, суть ее проста — это в основном образование кислоты. Сходную продукцию можно получить за более короткое время — для этого достаточно добавить к свежим овощам соответствующие кислоты и тем самым обойтись без брожения. Отметим, что, хотя для сохранения овощей используются главным образом консервирование в банках и замораживание, спрос на заквашенные продукты сохраняется, так как они обладают специфическим вкусом.
Продукты из сои
Соя издавна принадлежит к числу главных пищевых культур в странах Азии, особенно в Китае и Японии. В восточной кухне она служила главным поставщиком белка и масла задолго да того, как ее стали использовать как источник этих веществ в странах Запада. На основе соевых бобов на Востоке вырабатывают множество традиционных пищевых продуктов; их особый вкус определяется деятельностью микроорганизмов. Это главным образом грибы, в частности представители рода Aspergillus.
Соевый соус готовят на основе кашицы из набухших и отваренных бобов сои. В нее вносят закваску, содержащую разнообразные микроорганизмы, главным образом Aspergillus oryzae. В ходе выдержки в течение 3—5 сут при 25—30° гриб активно разрастается на поверхности. Затем в смесь добавляют соль (до 20%) и оставляют ее созревать на 0,5—2 года. В настоящее время применяют чистые культуры Л. oryzae, поэтому срок выдержки сокращается до одного-трех месяцев. В завершение жидкость сливают с массы или отделяют под прессом и получают соевый соус. Помимо ускорения процесса путем использования чистых культур разработаны и сугубо химические способы получения соевых гидролизатов. Так готовят несброжен- .ный соевый соус.
В Японии из размельченных соевых бобов (иногда с добавкой риса) делают похожую приправу — тамари. Продолжительность сбраживания при этом меньше, чем в случае китайского соевого соуса, а ведущую роль в процессе играет Aspergillus tamari. Еще одну приправу, мизо, готовят в Японии из отваренных соевых бобов, которые заражают Л. oryzae,. добавляют к ним соль и воду и ставят на созревание на несколько дней, после чего тщательно измельчают. Когда делают натто, сваренные соевые бобы укутывают в рисовую солому и ставят на созревание на 1—2 сут. Главную роль здесь играет Bacillus subtilis, образующая слизистую пленку.
В восточной кухне часто используется соевый сыр, или курд. Соевые бобы сначала замачивают и измельчают в пасту, а затем отжимают ее через полотно. Для створаживания применяют соли кальция и магния и полученный продукт формуют в виде кубиков. В ходе выдержки в течение месяца при 14 ℃ активно развиваются белые плесневые грибы» Окончательное созревание происходит в рассоле или особым образом сделанном вине.
Современная биотехнология, видимо, лишь в малой степени может способствовать развитию этих традиционных производств. Все произошедшие здесь изменения заключались обычно в уменьшении времени ферментации; в отдельных случаях процессы стали безмикробными. Впрочем, возможно дальнейшее усовершенствование процессов путем улучшения штаммов и контроля за ферментацией. Кроме того, соевые бобы могут стать тем сырьем, из которого на основе традиций восточной кухни для рынка как Запада, так и Востока можно будет получать совсем новые продукты ферментации. В этих случаях перерабатываются целые бобы, однако известны уже и полученные с помощью биотехнологии новые продукты из белков сои. Их вырабатывают путем контролируемого гидролиза белков сои •ферментами микроорганизмов. Свойства таких продуктов (растворимость, вкус и т. д.) можно в определенной мере регулиро-
вать. Наиболее привлекательным из них представляется изоэлектрический растворимый гидролизат белков сои. Как заменитель мяса он лучше, чем блюда из соевых бобов. В странах〉 где население получает с пищей недостаточно белка, им обогащают безалкогольные напитки.
ЗУ.З^Д^именение ферментов при выработке фруктовых соков
Применение ферментов из микроорганизмов — один из главных, путей, которые биотехнология использует и будет использовать- для обновления пищевой промышленности. Наибольшие успехи были достигнуты при производстве фруктовых соков: здесь используют такие ферменты, как пектиназы, целлюлазы, гемицел- люлазы, амилазы и протеиназы. Эти ферменты применяются не только в давно освоенных производствах; с их помощью удалось расширить ассортимент и добиться большего выхода продукции из сырья. Ферменты используются на следующих основных стадиях переработки фруктов. 1. Обработка мезги: разрушение мякоти при выработке фруктовой кашицы или нектаров; увеличение выхода сока; лучшее отделение веществ, ответственных за цвет и вкус. 2. Обработка сока: уменьшение вязкости; облегчение изготовления концентратов; упрощение процедур осветления, фильтрования и стабилизации сока.
Выбор ферментов и способов их применения для получения наилучших результатов при выработке соков производится с учетом трех обстоятельств. 1. Активности фермента. Для получения желаемого действия при производстве фруктовых соков, необходимо подобрать правильную концентрацию, температуру и продолжительность обработки. 2. Необходимости деградации пектина. Качество продукции сильно зависит от типа пектина и свойств конкретного фермента. 3. Механизмов осветления. Этот процесс состоит из трех последовательных стадий. Понимание их особенностей исключительно важно при производстве соков: это стадии дестабилизации, коагуляции и осаждения.
При производстве соков из фруктов большую роль играют пектины. Если их слишком много, то соки получаются излишне вязкими и мутными. Контролируя содержание пектинов, удается существенно повысить выход сока и его качество. Пектиновые вещества, или пектины, представляют собой гетерополисахариды, производные галактуроновой кислоты. Они являются субстратами для ряда ферментов: пектинлиаз, пектатлиаз, по- лигалактуронидаз или пектинэстераз. Действие их заключается в деполимеризации путем расщепления глюкозидных связей】 пектиноэстеразы атакуют этерифицированные карбоксильные группы.
Заключение
.1. Ближайшие перспективы
По оценкам примерно 15% реализуемой продукции пищевой промышленности вырабатывается на основе биотехнологии, но влияние ее на эту промышленность сегодня не больше, чем 25 лет назад (Tonge, Jarman, 1981). Определяется это тремя причинами. 1. Производство пищевых продуктов и сегодня является трудоемкой отраслью промышленности с большим объемом ручного труда и низким уровнем технологии. Многие производственные йроцессы в ней есть не что иное, как увеличенные копии кулинарных приемов. Наука, изучающая их основы, слабо развита, а суть самих процессов не до конца понята. 2 В «табеле о рангах» биотехнологии, о котором речь шла в начале этой главы, изготовление пищевых продуктов относится 丛 крупнотоннажным производствам с малой прибавочной стоимостью. В сущности именно малая прибавочная стоимость пищевых продуктов мешает вкладывать средства в изучение и развитие производства и методов определения безопасности продуктов, а это необходимо для того, чтобы сделать биотехнологические процессы и продукты конкурентоспособными. 3. Главные усилия при модернизации производства пищевых продуктов должны быть направлены на уменьшение или полное подавление нежелательных изменений, вызываемых биологически активными побочными продуктами. Сегодня для описания таких процессов применяется термин «отрицательная биотехнология»; по сути здесь решаются задачи сохранения пищи. Вне зависимости от термина такие исследования все же не относятся к числу важнейших в биотехнологии. В ближайшем будущем новой технологии основные успехи будут достигнуты, по-види- мому, при производстве продуктов с высокой прибавочной стоимостью: пищевых и вкусовых добавок, пищевых красителей и функциональных агентов. Выпуск таких продуктов в чем-то сходен с производством новых лекарственных препаратов в фар- ^авцевтической промышленности: обязательны испытания на безвредность; необходимы надежные источники сырья с высокой, но приемлемой стоимостью.
Отдаленные перспективы
Затраты на организацию многотоннажных биотехнологических производств столь велики, что лишь фирмы, способные осуществлять долгосрочные стратегические программы, могут решиться на внедрение такой технологии. Главное преимущество новой ■технологии заключается в том, что выход продукции с фермен-
тера или биореактора несравненно выше, чем от растения или животного, так что производство предметов потребления таким способом всегда оказывается более выгодным.
Как это ни парадоксально, именно продуктивность оказалась тем важным фактором, который повлиял на внедрение этой технологии. Планируемая замена привычных предметов потребления сказалась на финансовой сфере, и это повредило экономике. Подобные неблагоприятные явления относительно часто происходят при производстве продуктов с малой прибавочной стоимостью. В последние годы они сопутствовали производству изоглюкозы. Развитие этой технологии в [странах ЕЭС сдерживалось системой квот и налогов. В то же время в США программа по производству спирта-горючего получила поддержку правительства (Economic Development Administration, 1981) в форме дотаций и налогов в масштабах всей страны и отдельных регионов. По-видимому, искусственно привносимые влияния на экономическую жизнеспособность той или иной программы будут иметь место и впредь: нужно учитывать, что сельское хозяйство играет в экономике стран особую роль.
Однако в будущем, когда потребности в той или иной продукции превысят возможности традиционных технологий, преимущества, связанные с большей продуктивностью, все же проявятся. Примером того, как биотехнология помогает решать задачи, стоящие перед пищевой промышленностью, может быть такой факт: лимонную кислоту сегодня получают с помощью грибов, и в результате земельные площади в Европе не пришлось занимать посадками лимонных деревьев.
ЛИТЕРАТУРА
Arima К. (1977). Recent developments and future directions of fermentations in Japan, Devs ind. Microbiol., 18, 78—117.
Aunstrup K. (1979). Production of extracellular enzymes. In: Applied Biochemistry and Bioengineering, Vol. 2 (eds. Wingard L. B., Katchalski-Katzir E* and Goldstein L.), pp. 27—69, Academic Press, London.
Birch G. G., Blakebrough M, Parker K.丄(eds.) (1981). Enzymes and Food Processing, Appl. Sci. Publ., London.
Beech F. W. (1972). Cider making and cider research: a review, J, Inst. Brew., 78, 477—490.
Beauchat L. R. (ed.) (1978). Food and Beverage Mycology, AVI Publishing, Westport, Connecticut.
Collins T. H. (1968). A Summary of Breadmaking Processes, Flour Milling and Baking Research Association Report Number 13.
Economic Development Administration (1981). Alternative Utilization of Wheat Starch, US Department of Commerce, Washington DC.
GUcksman M. (1969). Gum Technology in the Food Industry, Academic Press, London.
Green M. L. (1977). Review of the progress of dairy science: milk coagulants, J. Dairy Res., 44, 159—188.
Greenshields R. M (1978). Acetic Acid: vinegar, In: Primary Products of Meta- bolism (ed. Rose A. H.), pp. 121—186, Academic Press, London.
Herbert D., Elsworth R., Telling R. C. (1956) . The continuous culture of bacteria;, a theoretical experimental study, J. gen. Microbiol., 14, 601—622.
Hersom A. C., Hulland E* D. (1980). Canned Foods. Thermal Processing and： Microbiology, p. 43, Churchill Livingstone, Edinburgh.
Hirose У., Sano K., Shibai H. (1978). Amino acids. In: Annual Reports on Fermentation Processes, Vol. 2 (ed. Perlman D.), pp. 155—189, Academic Press- London.
Howling D. (1979). The general science and technology of glucose syrups. In: Sugar： Science and Technology (eds. Birch G. G. and Parker K. J.), pp. 259— 285, Appl. Sci. Publ., London.
Jarman T. R. (1979). Bacterial alginate synthesis. In: Microbial Polysaccharides- and Polysaccharases (eds. Berkeley R. C. W.} Gooday G. W. Ellwood D. C.), pp. 35—50, Academic Press, London.
Jarvis B., Holmes A. W. (1982). Biotechnology in relation to the food industry. J. Chem. Tech. Biotechnol., 32, 224—232.
Jarvis J Paulus K. (1982). Food preservation： an example of the application of negative biotechnology, J. Chem. Tech. Biotechnol., 32, 233—250.
Koot E R., Armbruster E C. (1967). Production and use of dextrose. In: Starch: Chemistry and Technology, Vol. II (eds. Whistler R. L. and Paschall E. F.), pp. 553—568, Academic Press, London.
Yankee R. E. (1967). Malo-lactic fermentation. In: Advances in Applied Micro- biology, Vol. 9 (ed. Umbreit W. W.), pp. 235—279, Academic Press, London.
Lancrenon X. (1978). Recent trends in the manufacturing of natural red colours^ Process Biochem., 13, no. 10( 16.
Law B. A. (1980). Accelerated ripening of cheese, Dairy Inds, Inti, May 1980, 17, Law B. A. (1981). Short cuts to faster flavour. Food, March 1981, 17—19. Lorenz K・(1981). Sourdough processes — methodology and biochemistry, Bakers* Dig., 55, 32—36.
MacLeod G., Seyydain~ArdebUi M. (1981). Natural and simulated meat flavors〉 Crit. Rev. Food Sci. Nut., 14, 309—437.
Maga Л A. (1974). Bread Flavor, Crit. Rev. Food TechnoL, 5, 55—142.
Radley /. A, (ed.) (1976), Starch Production technology, Appl. Sci. Publ.y London.
Rankine В. C (1972). Influence of yeast strain and malo-lactic fermentation on; composition and quality of table wine, Am. Enol. Vitic., 23, 152—158.
Ratledge C. (1979). Resources conservation by novel biological processes. L Grow fats from wastes, Chem. Soc. Rev., 8, 283—295.
Reed G. (ed.) (1975). Enzymes in Food Processing, Academic Press, London.
Reed G. (ed.) (1982). Prescott and Dunn's Industrial Microbiology, 4th end. Macmillan, London.
Robinson R. K. (1981). Dairy Microbiology, Vol. 2, Appl. Sci. Publ., London.
Rose A. H, (ed.) (1977). Alcoholic Beverages, Academic Press, London.
Rose A. H. (ed.) (1982), Fermented Foods, Academic Press, London.
Schierholt J. (1977). Fermentation processes for the production of citric acid* Process Biochem., 12, no. 9, 20—21.
Schlingmann M, Faust U., Scharf U. (1981). Bioproteins for human nutrition,, FIE Conference, 1981, London.
Scharma S. C. (1981). Gums and hydrocolloids in oil-water emulsions, Food Technol., 35, no. 1, 59—67.
Sittig W. (1982). The present state of fernentation reactors, J. Chem. Tech. Bio- technol., 32, 47—58.
Sodeck G” Modi J., Kominek Л, Salzbrunn W. (1981). Production of citric acid according to the submerged fermentation process. Process Biochem., 16 no，& 9—11.''
Spinks A. (Chairman) (1980). Biotechnology: Report of a Joint Working Party,p. 35, HMSO, London.丄丄•广.f .
Stevens T.丄(1966). A method of selecting pure yeast strains for ale fermentations, J. Inst. Brew., 72, 36A373.ф .± u i ..
Tonge G. M, Jarman T・ R (1981). Opportunities for biotechnology in the food industry, FIE Conference, 1981, London.
Whitworth D 4, Ratledge C. (1974). Microorganisms as a potential source of oils and fats, Process Biochem., 9, no. 9, 14—22... j
Wierzbicki L. £, Kosikowski E V. (1972). Food syrups from acid whey treated with beta-galactosidase of Aspergillus niger, J. Dairy Sci., 56, 1182一1184.
Williams A. (1975). The history of the Chorleywood bread process. In: Breadmaking: The Modern Revolution (ed. Williams A.), pp. 25"—39, Hutchinson Benham, London.„ ,
Yamada K, Kinoshita 丄，Tsunoda「，Aida K. (1972). The Microbial Production af Amino Acds by Fermentation, John Wiley and Sons, New York.
Глава 4
Химия и биотехнология
Д. Бест
Введение
Во всех главах этой книги, так или иначе, затрагивается вопрос об использовании удивительной способности биологических систем к узнаванию и выполнению каталитических функций. Быть может, наиболее эффективное применение такие системы могут найти в современной химической промышленности. Мы знаем, что биомасса тоже представляет собой сложную химическую систему, а большинство процессов и продуктов биотехнологии имеют биохимическую природу, будь то производство веществ, используемых как горючее (гл. 2), получение путем брожения продуктов питания и напитков (гл. 3), синтез биополимеров (гл. 5), использование организмов, участвующих в круговороте химических веществ на Земле (гл. 6), применение сложных химических соединений в медицине (гл. 8) или сельском хозяйстве (гл. 9). В этой главе речь пойдет главным образом о принципах, перспективах и технологии получения химической продукции на базе биотехнологии. Основное внимание будет уделено химическим процессам и соединениям, которые в других главах не обсуждаются.
Корни современной прикладной микробиологии и соответственно биотехнологии уходят в химическую промышленность начала нынешнего века: именно тогда были разработаны основы промышленного производства ряда химических веществ (например, ацетона, этилового спирта, бутандиола, бутанола и изопропанола) из углеводов растений (об истории развития таких производств рассказано в гл. 1). На смену этой важной отрасли промышленности пришла быстро развившаяся нефтехимическая промышленность. Однако сейчас запасы ископаемого сырья стали предметом конкуренции, так как оно требуется для производства химических веществ, энергии и даже пищевых продуктов; все это усугубляется повышением цен на нефть и уголь. В таких условиях применение процессов нового типа при производстве химических веществ из возобновляемой биомассы становится все более перспективным. Идет переоценка возмож-
Химия и технологи兄133 ностей использования модернизированных процессов, по сути своей подобных разработанным в начале века.
В этом направлении уже сделаны первые шаги. Так, глицерол получают с помощью водорослей; активно ведется работа по изучению возможности использования лигнина древесины. С технической точки зрения это сложная проблема: решение ее откроет новый путь получения многих ценных ароматических соединений, играющих столь важную роль в современной химической промышленности.
Помимо новых способов получения химических веществ из биомассы биотехнология дает нам также более эффективные и производительные катализаторы для осуществления химических взаимопревращений. Они могут использоваться двояким путем. Во-первых, специфичность действия фермента (или ферментов) может применяться при катализе in vivo или in witro простых, но технически трудно осуществимых превращений. Примером такого рода служит гидроксилирование стероидов при синтезе лекарственных веществ. Во-вторых, с их помощью можно осуществлять полный биосинтез сложных и дорогостоящих тонких химических продуктов из простых составных частей, например образование антибиотиков в ходе вторичного метаболизма у грибов. В табл, 4.1 приведены различные варианты использования биокаталитической активности. Многообещающей областью дальнейшего развития представляется производство ценных веществ из растений [среди которых упомянем терпены (ароматические вещества) и алкалоиды (используемые при производстве лекарств)] путем массового культивирования клеток растений.
Развитие современной химической биотехнологии
Бродильное производство растворителей
О бродильном производстве глицерола шла речь в гл. 1, а о получении этанола — растворителя, пищевого продукта, промежуточного вещества в реакциях химического синтеза и горючего — в гл. 2. К числу других важных бродильных производств относится получение ацетона и бутанола. Впервые в промышленном масштабе они были осуществлены в Манчестере Вейсманном в ходе первой мировой войны. Ацетон был необходим для производства кордита и как метательное взрывчатое вещество в тяжелой артиллерии. До начала военных действий его импортировали из Германии. Ацетон низкого качества получали путем сухой перегонки древесины, но для упомянутых целей нужен был высококачественный растворитель.
Биокатализ на стадии роста НерегулируемыйИзменение среды с целью модификации метаболизмаПолучение мутантов, способных к сверхпродукции промежуточных продуктов метаболизмаИндукция определенных ферментативных процессовИнгибированная ферментацияНаправленный синтез из предшественников в обход метаболического контроляБиокатализ по завершении ростаОдностадийные превращения, позволяющие обойтись без очистки фермента или принятия мер по сохранению его стабильностиМногостадийные процессы ферментативной конверсииБиокатализ in vitroИспользование очищенного фермента для одностадийной конверсии какого-либо природного субстрата Одностадийное образование химических промежуточных продуктов из неприродных субстратов с использованием очищенных ферментов с широким спектром действияМногостадийные полусинтетические метаболитические процессыХимический катализ на основе био* логических принциповСоздание химических аналогов ферментативных процессовПолучение химических катализаторов с биологической специфичностью (образование«биоорганическихкомплексов》)Биокатализ на стадии роста НерегулируемыйИзменение среды с целью модификации метаболизмаПолучение мутантов, способных к сверхпродукции промежуточных продуктов метаболизмаИндукция определенных ферментативных процессовИнгибированная ферментацияНаправленный синтез из предшественников в обход метаболического контроляБиокатализ по завершении ростаОдностадийные превращения, позволяющие обойтись без очистки фермента или принятия мер по сохранению его стабильностиМногостадийные процессы ферментативной конверсииБиокатализ in vitroИспользование очищенного фермента для одностадийной конверсии какого-либо природного субстрата Одностадийное образование химических промежуточных продуктов из неприродных субстратов с использованием очищенных ферментов с широким спектром действияМногостадийные полусинтетические метаболитические процессыХимический катализ на основе био* логических принциповСоздание химических аналогов ферментативных процессовПолучение химических катализаторов с биологической специфичностью (образование«биоорганическихкомплексов》)Белок одноклеточных организмов Органические кислоты, аминокислотыАминокислотыБелок одноклеточных организмов Органические кислоты, аминокислотыАминокислотыАнтибиотикиАминокислоты, антибиотикиАнтибиотикиАминокислоты, антибиотикиИзомеризация глюкозы, получение глюконата, трансформация стероидовТрансформация стероидовГлюкозоизомераза, аминокислотыПолучение гидрохинона с помощью глюкозооксидазыИзомеризация глюкозы, получение глюконата, трансформация стероидовТрансформация стероидовГлюкозоизомераза, аминокислотыПолучение гидрохинона с помощью глюкозооксидазы
Биокатализ на стадии роста Нерегулируемый
Изменение среды с целью модификации метаболизма
Получение мутантов, способных к сверхпродукции промежуточных продуктов метаболизма
Индукция определенных ферментативных процессов
Ингибированная ферментация
Направленный синтез из предшественников в обход метаболического контроля
Биокатализ по завершении роста
Одностадийные превращения, позволяющие обойтись без очистки фермента или принятия мер по сохранению его стабильности
Многостадийные процессы ферментативной конверсии
Биокатализ in vitro
Использование очищенного фермента для одностадийной конверсии какого-либо природного субстрата Одностадийное образование химических промежуточных продуктов из неприродных субстратов с использованием очищенных ферментов с широким спектром действия
Многостадийные полусинтетические метаболитические процессы
Химический катализ на основе био* логических принципов
Создание химических аналогов ферментативных процессов
Получение химических катализаторов с биологической специфичностью (образование«биоорганических
комплексов》)
Биокатализ на стадии роста Нерегулируемый
Изменение среды с целью модификации метаболизма
Получение мутантов, способных к сверхпродукции промежуточных продуктов метаболизма
Индукция определенных ферментативных процессов
Ингибированная ферментация
Направленный синтез из предшественников в обход метаболического контроля
Биокатализ по завершении роста
Одностадийные превращения, позволяющие обойтись без очистки фермента или принятия мер по сохранению его стабильности
Многостадийные процессы ферментативной конверсии
Биокатализ in vitro
Использование очищенного фермента для одностадийной конверсии какого-либо природного субстрата Одностадийное образование химических промежуточных продуктов из неприродных субстратов с использованием очищенных ферментов с широким спектром действия
Многостадийные полусинтетические метаболитические процессы
Химический катализ на основе био* логических принципов
Создание химических аналогов ферментативных процессов
Получение химических катализаторов с биологической специфичностью (образование«биоорганических
комплексов》)
Белок одноклеточных организмов Органические кислоты, аминокислоты
Аминокислоты
Белок одноклеточных организмов Органические кислоты, аминокислоты
Аминокислоты
Антибиотики
Аминокислоты, антибиотики
Антибиотики
Аминокислоты, антибиотики
Изомеризация глюкозы, получение глюконата, трансформация стероидов
Трансформация стероидов
Глюкозоизомераза, аминокислоты
Получение гидрохинона с помощью глюкозооксидазы
Изомеризация глюкозы, получение глюконата, трансформация стероидов
Трансформация стероидов
Глюкозоизомераза, аминокислоты
Получение гидрохинона с помощью глюкозооксидазы
Бродильный процесс (ферментация) был основан на переработке крахмала, концентрация которого составляла до 3,8% (вес/объем), анаэробными спорообразующими бактериями Clostridium acetobutylicum. Превращению подвергалось до 30% субстрата, в результате чего получалась смесь растворителей (60% бутанола, 30% ацетона, 5—10% этанола, изопропанола и мезитилоксида). Остальная часть субстрата в ходе процесса, представленного на рис. 4.1, превращалась в водород и углекислый газ.
Поскольку образовывались большие объемы газов, при крупномасштабном производстве перемешивания не требовалось.
КрахмалКрахмалГлюкозаГлюкозаГ люкозо-6-фосфатГ люкозо-6-фосфатТриозофосфатТриозофосфат4Н +4Н +ПируватПируватАцетоацетил -СоААцетоацетил -СоААцётил-СоААцётил-СоААцетонИзопропанолАцетонИзопропанолн-Бутанолн-Бутанол
Крахмал
Крахмал
Глюкоза
Глюкоза
Г люкозо-6-фосфат
Г люкозо-6-фосфат
Триозофосфат
Триозофосфат
4Н +
4Н +
Пируват
Пируват
Ацетоацетил -СоА
Ацетоацетил -СоА
Ацётил-СоА
Ацётил-СоА
Ацетон
Изопропанол
Ацетон
Изопропанол
н-Бутанол
н-Бутанол
Рис. 4.1. Схема реакций ацетон-бутанольного брожения.
а главная сложность заключалась в гашении пены. В зависимости от штаммов отношение ацетон: спирт несколько варьировало. Многие микробы, разрушающие крахмал и способные образовывать растворители, могут также сбраживать мелассу при содержании сахара в среде до 6% (вес/объем). Фактором, определяющим количество использованного субстрата, оказалась чувствительность организмов, участвующих в процессе, к н-бутанолу (верхний предел — около 1,2%, по объему) и ацетону (0,4%). Заражения бродильных емкостей аэробными бактериями обычно не происходило, и главной проблемой была инфекция бактериофагами. Впоследствии выяснилось, что участвующие в процессе микроорганизмы можно《иммунизировать》 путем нескольких пересевов в присутствии бактериофага. Было установлено, что фаговая инфекция является штамм-специфич- ной.
Растворители отделяли от среды отгонкой. В конце первой мировой войны главную роль стало играть производство бутанола: он нашел применение при получении широкого круга
веществ, включая мочевиноформальдегидные пластмассы, пластификаторы и тормозные жидкости. Побочный продукт, водород, стал использоваться в производстве синтетического метанола и для гидрогенизации пищевых масел; углекислый газ либо сжижали, либо превращали в сухой лед. Твердые вещества отходов содержали большое количество рибофлавина (витамина В?), и их можно было использовать как богатую белком добавку к кормам.
После второй мировой войны бродильное производство этих растворителей, однако, сильно сократилось, так как относительная стоимость нефтехимических продуктов по сравнению с полимерами сахаров уменьшилась. Производство н-бутанола путем ферментации продолжалось лишь в ЮАР. Однако в настоящее время получение бутанола с помощью ферментации становится все более выгодным, и очень может быть, что методами генетической инженерии удастся создать такие микроорганизмы-продуценты, применение которых перетянет чашу весов в сторону этого способа. Главный недостаток существующих штаммов ——низкая устойчивость к конечным продуктам и относительно низкий выход растворителей.
В ходе второй мировой войны активно исследовалась возможность получения бутилен-2,3-гликоля; в последнее время к этому процессу микробиологической конверсии также проявляется интерес. Одной из проблем молочной промышленности является использование сыворотки. Между тем она может быть источником углерода при образовании бутиленгликоля бактериями Klebsiella pneumoniae или Enterobacter aerogenes, который превращают затем в сырье для производства синтетического каучука.
Производство органических кислот
Среди органических кислот самая важная — уксусная. На рынок США ее ежегодно поступает около 1,4 млн. т общей стоимостью до 500 млн. долл, (без учета уксуса). В прошлом основную часть уксусной кислоты получали путем микробиологического окисления этанола, но сегодня, за исключением производства уксуса, этот процесс по экономическим соображениям не применяется. Впрочем, в результате ведущихся исследований термофильных бактерий, способных превращать целлюлозу в уксусную кислоту, а также штаммов Acetobacter и Clostridium, способных синтезировать ее из водорода и углекислого газа, этот метод, может быть, восстановит свои позиции. Техническая уксусная кислота используется при выработке многих химических веществ, включая каучук, пластмассы, волокна и инсектициды. При обычном способе производства мик-
робиологическая конверсия этанола в уксусную кислоту при участии штаммов Acetobacter и Gluconobacter идет в аэробных условиях и поэтому, строго говоря, не является процессом брожения. Уксус по праву считается важнейшим продуктом микробиологической промышленности (см. гл. 3).
В конце XIX в. началось промышленное производство молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii, L. leichmannii и L. bulgaricus. Это был один из первых процессов, где применялась частичная стерилизация среды нагреванием. Этот микроаэрофильный процесс осуществляется при высокой температуре (45——50°). В нем используют содержащее крахмал сырье, которое предварительно обрабатывают ферментами или подвергают кислотному гидролизу (разд. 4.2.6). L・ bulgaricus активно сбраживает лактозу и может поэтому использовать молочную сыворотку в качестве питательного субстрата. В других случаях конверсии подвергается сахароза (концентрация 12—18%, вес/объем). Процесс идет 3— 4 суток; при этом в больших количествах выделяется углекислый газ, что облегчает создание в среде оптимальных полуаэроб- ных условий. Описаны также способы конверсии 1,2-пропандиола в молочную кислоту при помощи Arthrobacter oxydans, Alca- ligenes faecalis или Fusarium solanL Эти микроорганизмы в основном образуют L( + )-изомер молочной кислоты, но некоторые штаммы L. leichmanii синтезируют D(—)-изомер. Было изучено образование молочной кислоты при непрерывном культивировании. В одностадийном процессе выход в случае L. del- brueckii составлял 89 г/л в сутки. При использовании препаратов молочнокислых бактерий, иммобилизованных в альгинатных гелях, степень конверсии достигала 97%. Доля L( + )-изомера составляла 90%, а время полужизни—100 суток. В этих процессах молочную кислоту получают в форме кальциевой соли; чтобы выделить конечный продукт, ее обрабатывают серной кислотой. Молочную кислоту используют в качестве добавки к безалкогольным напиткам, эссенциям, фруктовым сокам, джемам и сиропам, для декальцификации кож в дубильной промышленности, а также при производстве пластмасс, когда Ь( + )-форму полимеризуют в полилактат, применяемый для производства пластиковых оберток. Соли молочной кислоты используются в медицине.
Производство лимонной кислоты методом ферментации при участии грибов (рис. 4.2) также принадлежит к числу давних биотехнологических процессов; оно было налажено в 1893 г. Его развитие шло в тесной связи с разработкой многих фундаментальных аспектов микробиологии. Вначале основные проблемы были связаны с микробным загрязнением. В поисках их решения было найдено, что процесс можно вести при очень
ГлюкозаГлюкозаФруктозо-6 фосфатФруктозо-6 фосфатPi ®NH4*Pi ®NH4*㊀㊀Фруктозо-1,6-дифосфатФруктозо-1,6-дифосфатТриозосросфатТриозосросфатк+, NH,Ацетил-СоАк+, NH,Ацетил-СоАМалатМалатЦитрат 一Цитрат 一ФумаратФумаратИзоцитратИзоцитратСукцинатСукцината -Кетоглутарата -Кетоглутарат
Глюкоза
Глюкоза
Фруктозо-6 фосфат
Фруктозо-6 фосфат
Pi ®
NH4*
Pi ®
NH4*
㊀
㊀
Фруктозо-1,6-дифосфат
Фруктозо-1,6-дифосфат
Триозосросфат
Триозосросфат
к+, NH,
Ацетил-СоА
к+, NH,
Ацетил-СоА
Малат
Малат
Цитрат 一
Цитрат 一
Фумарат
Фумарат
Изоцитрат
Изоцитрат
Сукцинат
Сукцинат
а -Кетоглутарат
а -Кетоглутарат
Стимуляция потока углерода при гликолизе
(^ Стимуляция (^ Подавление
Рис. 4.2. Производство лимонной кислоты.
низких pH, и это почти не сказывается на образовании кислоты грибами. В таких условиях создавать и поддерживать стерильность гораздо проще. За 1—2 недели ферментации при высоких концентрациях сахара в сырье выход достигал 60%. Наибольший выход получали, когда тем или иным способом ограничивали рост мицелия. Первоначальный вариант процесса основывался на поверхностной ферментации, но в 1950 г. было внесено важное изменение — освоено глубинное культивирование. Было
показано, что стабильный процесс глубинной ферментации возможен только в том случае, Ьслн он осуществляется в две стадии: на первой идет рост мицелия, а на второй (в несодержащей фосфор среде)—образование лимонной кислоты. За короткий срок были разработаны схемы, основанные на использовании дешевого углеводного сырья: мелассы, крахмала и глюкозного сиропа. Наличие ионов металлов в исходном сырье приводит к резкому падению выхода; их нужно удалять либо путем осаждения гексацианоферратом, либо пропусканием через ионообменные смолы, либо применением солей четвертичного аммония. Для устранения вредного влияния этих примесей широко используется также метанол и другие низшие спирты. Механизм их действия неизвестен. Возможно, они как・то влияют на цитоплазматическую мембрану. В 60-х годах для производства лимонной кислоты был предложен новый процесс на основе н-парафинов (С9-30) и штаммов Corynebacterium, Arthro- bacter и Brevibacterium, но рыночной продукции с его помощью получено не было. Изучалось также образование лимонной кис- лоты дрожжами Candida. Они синтезируют смесь лимонной и изолимонной кислот в соотношении, зависящем как от генети* ческих факторов, так и от условий ферментации. Было найдено, что ключевую роль здесь играет аконитат-гидролаза: мутанты с малой активностью этого фермента продуцировали больше лимонной кислоты. Растущие на углеводородах дрожжи также способны синтезировать лимонную кислоту из глюкозы. Гриб Trichoderma viride образует большое количество цитрата из глюкозы； это позволяет вырабатывать лимонную кислоту из целлюлозы. С помощью некоторых видов Penicillium можно вести ферментацию с образованием Ls-алло-изолимонной кислоты, диастереомера изолимонной кислоты.
В промышленном производстве лимонной кислоты в основном используется Aspergillus niger, но применяется также и Л. wentii. Процесс ферментации очень сложен, так как лимонная кислота является продуктом первичного метаболизма этих грибов, и любое сколько-нибудь существенное выделение этого промежуточного соединения обмена веществ в окружающую среду свидетельствует о сильном нарушении метаболизма, возникающем вследствие его дисбаланса или генетических нарушений. Рост грибов обычно регулируют путем изменения состава среды (Р, Мп, Fe, Zn), Субстрат должен легко усваиваться; негидролизованные полимеры обычно не используют, так как в этом случае внеклеточный гидролиз будет лимитировать скорость всего процесса.
Сверхпродукция лимонной кислоты является ответной реак・ ине卤 на недостаток фосфата, но при выраженной нехватке металлов лимитирующим фактором не обязательно является фос-
фат. Роль металлов при этом до конца еще не понята. Оптимум pH составляет 1,7—2,0; в более щелочной среде происходит образование заметных количеств щавелевой и глюконовой кислот. Таким образом, тщательный контроль за культуральной средой позволяет обойти регуляторные системы обмена и создает оптимальный фон для образования лимонной кислоты. Видимо, в этих условиях стимулируется гликолиз и обеспечивается неограниченное поступление углерода в реакции промежуточного метаболизма. Уровень накопления цитрата зависит при этом от поступления оксалоацетата.
При недостатке марганца активность ферментов цикла трикарбоновых кислот уменьшается, что в свою очередь подавляет анаболизм. Такое нарушение обмена приводит к повышению концентрации аммонийных ионов внутри клеток, и они могут смягчать ингибирующее влияние цитрата на фосфофруктокина- зу. Кроме того, марганец, видимо, как-то влияет на биохимические свойства поверхности клеток и морфологию гиф. Поскольку в процессе потребляется много кислорода, возможно повторное окисление цитоплазматического NADH без образования АТР, В нем участвует альтернативная, а не основная цепь дыхательных реакций. В результате без сколько-нибудь выраженного изменения обмена возникает метаболическая «утечка» (flux) через гликолиз. Эта утечка, происходящая при участии конститутивной пируваткарбоксилазы и некоторых ферментов ВДкла трикарбоновых кислот, а также необычная кинетика действия ферментов, участвующих в метаболизме оксалоацетата, приводят к увеличению внутриклеточной концентрации цит- рата. Последний способствует дальнейшему накоплению цитрата путем ингибирования изоцитратдегидрогеназы.
В промышленном производстве лимонной кислоты применяется несколько вариантов процесса. Традиционным твердофазным вариантом является процесс Коджи; он имеет много общего с процессом поверхностной ферментации. Глубинная ферментация с технической точки зрения сложнее, чем поверхностная, но возможна в разных вариантах: периодическом с подпиткой и непрерывном. Периодическая ферментация используется при работе с глюкозосодержащими субстратами, а ее вариант с подпиткой чаще применяется при переработке мелассы. Непрерывное культивирование, дающее наибольший выход продукта, также возможно, но применение этого способа в промышленности в обозримом будущем маловероятно. Для процесса характерно два максимума скорости: роста и образования продукта. На первом этапе образуется значительное количество продукта, зависящее от скорости роста. На втором этапе рост отсутствует, а предельное количество образующегося продукта определяется концентрацией биомассы. В конце ферментации массу мицелия
отделяют фильтрованием и промывают. Затем при рН<3,0 осаждают щавелевую кислоту в форме оксалата кальция. Богатый белком мицелий можно использовать на корм скоту. Лимонную кислоту осаждают из жидкой фазы в форме кальциевой трехзамещенной соли в комплексе с четырьмя молекулами воды. Осадок отфильтровывают, промывают и свободную кислоту получают путем обработки сульфатом кальция. Далее ее очищают при помощи активированного угля и ионообменных смол. Можно также экстрагировать кислоту растворителем.
У лимонной кислоты приятный кислый вкус, она хорошо растворима в воде. Ее широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Эфиры лимонной кислоты применяются в производстве пластмасс. Поскольку лимонная кислота связывает (хелатирует) металлы, ее используют для их очистки. В составе детергентов она легко разрушается живыми организмами, и ею заменяют фосфаты.
Другие органические кислоты.
Процессы, основанные на микробиологической ферментации, разработаны и для получения ряда других органических кислот. Средн них ——глюконовая кислота и ее производные, яблочная, виннокаменная, салициловая, янтарная, пировиноградная и кое- вая кислоты. Хотя некоторые из них и поступают на рынок, в нынешних условиях в большинстве случаев такое производство экономически невыгодно. о
D-глюконовая кислота и ее 6-лактон представляют собой простые продукты окисления (дегидрогенизации) глюкозы (рис. 4.3). Еще в начале 20-х годов было налажено промышленное производство этой кислоты из глюкозы при участии Aspergillus niger. Нейтрализация кислоты позволяла получать большой выход продукта. В погруженных культурах за 48 ч конверсия субстрата составляла 90%. Исследования на полупромышленных установках показали, что если ферментацию вести при повышенном давлении, то выход кислоты за 24 ч составляет 95% от теоретического при использовании раствора глюкозы с концентрацией 150—200 г/л. Процесс можно вести в полунепрерывном режиме, заново используя мицелий (до девяти раз подряд). Более того, концентрацию глюкозы можно довести до 350 г/л, если для удаления кислоты использовать комплексообразование с соединениями бора и получать боро- глюконат кальция. Однако для осуществления этого процесса нужны особые, устойчивые штаммы. От него отказались после того, как было выяснено, что эта соль неблагоприятно влияет на кровеносные сосуды животных. Контроль за pH осуществляли путем добавления углекислого кальция либо едкого натра.
сн2он
ОН
D-Глюкоза
I Ферментация
CH 20H
нЖ
ОН
6 -Ллюконолактон
I Спонтанный гидролиз
снгон
неон
пеан
носн
неон
соонD-Глюконовая кислотасоонD-Глюконовая кислотаФерментативныйпроцессФерментативныйпроцессснгон■неонснгон■неонСН2ОНС —оСН2ОНС —онеонноснС —онеонноснС —онеонносннеонноснсн2онС = онеон —сн2онС = онеон —неоннеонноснс=оноснс=о■ аскорбиновой кислоты■ аскорбиновой кислотыСООН2-ОксоглюконоваякислотаСООН2-ОксоглюконоваякислотаСООН 5-Оксоглюконовая . кисло та ' 1 ^ХимическийСООН 5-Оксоглюконовая . кисло та ' 1 ^ХимическийСООН2,5-Диоксоглюконовая кислотаСООН2,5-Диоксоглюконовая кислотаФерментативный L-Идоновая ферментация кисло та 1^―Ферментативный L-Идоновая ферментация кисло та 1^―ФерментацияФерментацияС ООНС ООНнеоннеонноснноснснгонносннеонснгонносннеон
соон
D-Глюконовая кислота
соон
D-Глюконовая кислота
Ферментативныйпроцесс
Ферментативныйпроцесс
снгон
■неон
снгон
■неон
СН2ОН
С —о
СН2ОН
С —о
неон
носн
С —о
неон
носн
С —о
неон
носн
неон
носн
сн2он
С = о
неон —
сн2он
С = о
неон —
неон
неон
носн
с=о
носн
с=о
■ аскорбиновой кислоты
■ аскорбиновой кислоты
СООН
2-Оксоглюконоваякислота
СООН
2-Оксоглюконоваякислота
СООН 5-Оксоглюконовая . кисло та ' 1 ^Химический
СООН 5-Оксоглюконовая . кисло та ' 1 ^Химический
СООН
2,5-Диоксоглюконовая кислота
СООН
2,5-Диоксоглюконовая кислота
Ферментативный L-Идоновая ферментация кисло та 1^―
Ферментативный L-Идоновая ферментация кисло та 1^―
Ферментация
Ферментация
С ООН
С ООН
неон
неон
носн
носн
снгон
носн
неон
снгон
носн
неон
носнС—оноснС—оСООН
носн
С—о
носн
С—о
D (+) -Винная кислота
соон
2-Оксоглюконовая кислота
Синтез аскорбиновой кисоты
Рис. 4.3. Органические кислоты, получаемые из глюкозы.
Было найдено, что образование глюконата прямо связано с количеством глюкозооксидазы в среде. Этот фермент в промышленном масштабе получают методом ферментации.
Натриевая соль глюконовой кислоты используется для извлечения металлов. Когда pH процесса контролируют с по-
мощью едкого натра, получают именно эту соль. Был разработан непрерывный процесс ее производства, при котором выход ^натриевой соли из 35%-ного (вес/объем) раствора глюкозы •составляет 95%. Предпринимались попытки применить при брожении иммобилизованные системы (как целые клетки, так и глюкозооксидазу). Натриевая соль глюконовой кислоты в присутствии едкого натра играет роль ловушки кальция и поэтому используется в составе щелочных средств для мытья бутылок. Она также способна связывать ионы железа в широком диапазоне pH и как препятствующий отложению железа агент применяется в составе щелочных препаратов для борьбы со ржав- яиной. Кальциевые и железные соли глюконовой кислоты применяются как пероральные и внутривенные препараты в медицине, а чистая кислота ——как моющее средство в молочной промышленности. Глюконолактон находит применение как медленно действующий подкислитель в составе пекарских порошков, при переработке мяса и в других отраслях пищевой промышленности.
Процесс образования глюконовой кислоты при участии бактерий нашел ограниченное применение лишь в некоторых странах Востока. Например, так называемый «чайный гриб» (ассоциация дрожжей, уксуснокислых и глюконовокислых бактерий) превращает подслащенный заваренный чай в напиток, содержащий смесь этих кислот. Малая эффективность реакций окисления глюкозы, идущих при участии бактерий, определяется тем, что одновременно с главным процессом идет образование 2-оксоглюконовой, 5-оксоглюконовой и диоксоглюконовой кислот. Для выработки этих кислот, которые могут служить субстратами для дальнейшей биологической или химической переработки, были разработаны специальные процессы. Так, 5-оксоглюконовую кислоту можно гидрогенизировать в ходе химиче« ской реакции и получить L-идоновую кислоту, которая в свою очередь служит субстратом в ферментативной реакции синтеза 2-оксогулоновой кислоты (рис. 4.3). Такие превращения можно осуществить и чисто биологическим путем: при помощи видов Acetobacter глюкозу переводят в 2,5-диоксоглюконовую кислоту, которая превращается в 2-оксогулоновую кислоту при участии Corynebacterium или Brevibacterium в ходе двух- или одностадийного процесса на основе смешанных культур этих бактерий. Выход продукта, правда, невелик. 2-Оксогулоновая кислота — весьма ценный продукт, так как ее метиловый эфир в щелочных условиях легко превращается в аскорбиновую кислоту.
Виннокаменная кислота является обычным побочным продуктом виноделия. Однако ее можно получать и путем микроб- ?ной трансформации 5-оксоглюконовой кислоты. Штаммы, спо-
собные превращать глюкозу в 5-оксоглюконат через глюконат^ могут путем дальнейшей ферментации образовывать тартрат. Для этой цели обычно используют мутанты Acetobacter и GLu* conobacter. Виннокаменную кислоту можно вырабатывать также из транс- или qwc-эпоксиянтарной кислоты. Соли ее (тартраты) находят широкое применение в пищевой промышленности^ но методы биотехнологии в ее производстве обычно не используются.
Яблочную кислоту, которая применяется в качестве подкислителя в пищевой промышленности, можно получать из фумаровой либо путем ферментации при участии видов Paracolo- b act rum, либо с помощью иммобилизованной фумаразы. Описаны также способы ее получения из н-парафинов при помощи дрожжей и из этанола при участии Schizophyllutn commune.
Итаконовую кислоту, идущую на производство пластмасс и красителей, получают с высоким выходом путем ферментации глюкозы с участием грибов из рода Aspergillus, Совсем недавно на основе биотехнологии из углеводных субстратов, а также С12-14-парафинов при участии Candida hydrocarbofurmarica получали 2-оксоглутаровую кислоту, но на смену этому способу пришло каталитическое окисление бензола.
Большинство органических кислот, вырабатываемых с помощью микробов, является продуктом переработки пищевого сырья; исключение составляют кислоты, производимые из н-парафинов. О возможности использования других видов углеводородного сырья как потенциального источника более ценных органических соединений говорится уже давно, но лишь немногие процессы используются сегодня для получения промышленной продукции. Так, из нафталина при помощи микробов вырабатывают салициловую кислоту и другие окисленные его производные. Об этом в последние двадцать лет писали не раз (Cain, 1980; Tangnu, Ghose, 1980, 1981),
К числу бактерий, способных вырабатывать салициловую кислоту (рис. 4.4) при росте в средах с нафталином, принадлежат многие виды Pseudomonas, Achromobacier и Corynebacte- rium. Запатентован способ выработки о-гидроксибензальпиро- виноградной кислоты и 1,2-дигидро-1,2-дигидроксинафталина при участии видов Nocardia. Большинство диких штаммов бактерий, расщепляющих нафталин, при хорошей аэрации в простых солевых средах редко образует салицилат в концентрации, превышающей 1%, но путем изменения сред и отбора подходящих штаммов могут быть получены и более высокие выходы.
Одним из основных факторов, влияющих на выход, является доступность субстрата, и накопление салицилата происходит лишь при постоянном присутствии нафталина: это угнетает дальнейшие окислительные превращения. Механизм деградации
зависит от относительной концентрации нафталина и салициловой кислоты. Сложность заключается в том, что полиаромати- ческий нафталин плохо растворим в воде, в среде ферментации он обычно присутствует в виде тонкой взвеси. Добавление эмульгаторов типа Span 80, Span 20, лецитина, кефалина и других поливиниловых спиртов существенно увеличивает накоп-
НафталинНафталинНафталин-оксигеназаНафталин-оксигеназаннХимическая дегидратацияХимическая дегидратацияНакопление мутантамиНакопление мутантамиХимическое производствоХимическое производство。/ идроксибензаль- пировиноградная киспота。/ идроксибензаль- пировиноградная киспота1,2-Дигидроксинафталин - оксигеназа1,2-Дигидроксинафталин - оксигеназаПируват► КлеткиПируват► КлеткиНакопление в результате изменения среды или применения методов генетической инженерииНакопление в результате изменения среды или применения методов генетической инженерииДегидрогеназаДегидрогеназаСНОСНОСалициловый альдегидСалициловый альдегидонсалициловогоонсалициловогоальдегидаальдегидасалициловойKucnoTtJсалициловойKucnoTtJДекарбоксилазаДекарбоксилазаОНОНКатехолКатехолДальнейшаядеградацияДальнейшаядеградация
Нафталин
Нафталин
Нафталин-оксигеназа
Нафталин-оксигеназа
н
н
Химическая дегидратация
Химическая дегидратация
Накопление мутантами
Накопление мутантами
Химическое производство
Химическое производство
。/ идроксибензаль- пировиноградная киспота
。/ идроксибензаль- пировиноградная киспота
1,2-Дигидроксинафталин - оксигеназа
1,2-Дигидроксинафталин - оксигеназа
Пируват► Клетки
Пируват► Клетки
Накопление в результате изменения среды или применения методов генетической инженерии
Накопление в результате изменения среды или применения методов генетической инженерии
Дегидрогеназа
Дегидрогеназа
СНО
СНО
Салициловый альдегид
Салициловый альдегид
онсалицилового
онсалицилового
альдегида
альдегида
салициловой
KucnoTtJ
салициловой
KucnoTtJ
Декарбоксилаза
Декарбоксилаза
ОН
ОН
Катехол
Катехол
Дальнейшаядеградация
Дальнейшаядеградация
Рис. 4,4. Микробиологическая конверсия нафталина в полезные органические вещества.
ления салицилата, так как при этом повышается доступность субстрата. Обычно используют чистый нафталин, но салицилат можно получать и из неочищенных нафтафракиий. Примеси (алкилнафталины, тиофен, бензотиофен и крезолы) этому не мешают.
В ходе ферментации pH быстро падает, так что нужно использовать сильно забуференные среды с высокой концентрацией фосфата либо добавлять мочевину или углекислый кальций. Для максимального накопления салицилата необходимы ионы
различных металлов. Сообщалось, что выход можно еще более ■повысить, если внести в среду особые добавки: органические и неорганические производные алюминия или бора, пантотеновую кислоту и ряд других веществ. Ферментация регулируется накапливающимся продуктом, а не субстратом; удаление салицилата из среды снимает его ингибирующее влияние на рост и приводит к дальнейшему образованию салициловой кислоты. Продукт отделяют двумя способами. Для этого используют анионообменную смолу (типа амберлит IRA-400), которую либо вносят прямо в среду, либо помещают в диализный мешок; при этом салициловая кислота адсорбируется смолой. Культуральную жидкость можно пропускать через колонку с ионообменной смолой, смонтированную около ферментера. При этом концентрация продукта в ферментере все время поддерживается на низком уровне, что многократно увеличивает выход (до 6 раз); возрастает полнота извлечения продукта. Альтернативный способ удаления продукта — диализная ферментация. Применение этого процесса на небольшой опытной установке позволило увеличить выход салицилата от 10 до 206 г/л. Преимущество метода состоит в том, что удается избежать неблагоприятного воздействия ионообменных смол; с другой стороны, приходится использовать большие объемы жидкой среды, что снижает концентрацию в ней продукта. Применяются и другие, более традиционные способы отделения продукта, например экстракция растворителем. Производство салицилата путем ферментации также страдает от фаговой инфекции, и приходится вести работу по селекции устойчивых к фагам мутантов.
Показано, что деградация нафталина и салицилата микроорганизмами нескольких родов детерминируется плазмидами. Так, за превращение нафталина в салицилат ответственна плазмида NAH: она несет гены ферментов, осуществляющих этот процесс (нафталиноксигеназы, 1,2-диоксинафталиноксигеназы, дегидрогеназы салицилового альдегида). Таким образом, у многих микроорганизмов, использующих нафталин, генетическая информация для осуществления этого процесса закодирована в плазмиде, но это бывает не всегда. В ходе использования таких плазмид создаются предпосылки для встраивания соответствующего генетического материала в хромосомы клеток хозяина, что превращает штаммы в продуценты салицилата. Способность использовать или окислять нафталин обычно закрепляется при росте на нафталине, салицилате или его аналогах, таких как бензоат или аминобензоат. Описаны интересные процессы сопутствующего окисления: мутантные штаммы Pseudomonas putida, выращенные на среде с глюкозой, которая служит единственным источником углерода и энергии, способны окислять нафталин до дигидрокси-1,2-дигидронафталина и 1,2-
гидроксинафталина на основе индукции ферментов нафталином или другими соединениями-индукторами, происходящей после- завершения роста. Первое из этих соединений после кислотной1 дегидратации превращается в а-нафтол — важное моноокислен* ное производное нафталина (рис. 4.4).
4. Аминокислоты (см. также гл. 3)
Производство аминокислот при помощи бактерийи 〃％ мутантов
Все аминокислоты, из которых состоят белки, являются L-a-амино- (или имино-) кислотами. Они находят применение- как пищевые добавки, приправы, усилители вкуса, как сырье в парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве других веществ. Их можно получать как из природных продуктов (главным образом при гидролизе белков растений), так и путем химического, микробиологического или ферментативного синтеза. Если химический синтез дает продукт- рацемат, который требует дальнейшей обработки (разд. 4.2.6), то последние два метода позволяют получить оптические чистые аминокислоты.
Секретом большинства производственных процессов с участием микроорганизмов, о которых говорится в этой главе, является изменение условий среды: именно за счет этого достигается синтез избыточных количеств желаемого продукта. Необходимого дисбаланса метаболизма можно добиться путем эмпирического изменения таких факторов, как концентрация субстрата, pH, концентрация продукта, или же путем установления критических уровней содержания других веществ (ионов металлов, органических добавок) в среде. При переводе биологических процессов образования аминокислот на коммерческую основу были выработаны новые способы желаемых изменений метаболизма у организмов-продуцентов, направленных на увеличение выхода промежуточных продуктов, образование которых в иных условиях находится под строгим метаболическим контролем.
Для производства аминокислот бактерии стали использоваться с начала 50-х годов. Штаммы их постоянно улучшали генетическими методами, выделяя ауксотрофные мутанты и мутанты с измененными регуляторными свойствами. Чтобы обеспечить образование аминокислот в больших количествах, в любом случае необходимо изменить систему регуляции обмена. Для этого можно либо стимулировать потребление субстрата в некоторых путях биосинтеза и выделение аминокислот в среду>
либо подавить побочные реакции и процессы деградации аминокислот.
Производство таких аминокислот, как L-глутамат, L-валин, DL-аланин, L-глутамнн и L-пролин, при участии диких штаммов бактерий основано либо на использовании присущих этим бактериям особенностей метаболизма, либо на стимуляции образования аминокислот в ответ на изменение условий внешней среды. Образовывать аминокислоты способны бактерии многих родов (например, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Aerobacter, Microbacterium, Escherichia), причем они настолько продуктивны, что производство становится рентабельным. Так, вцды Corynebacterium или Brevibacterium, выращиваемые на углеводном сырье (гидролизат крахмала, мелассы из сахарного тростника и свеклы), на этаноле или ацетате при наличии достаточного количества биотина в среде способны синтезировать до 30 г/л глутамата. Для накопления этой аминокислоты важным условием является полное или частичное подавление активности а-кетоглутаратдегидрогеназы. Образование продукта увеличивается при добавлении р-лактамных антибиотиков (пенициллина, цефалоспорина С), поверхностно-активных веществ и жирных кислот. Влияние двух последних агентов обусловлено увеличением проницаемости клеточных мембран для глутамата, которая зависит от внутриклеточной концентрации жирных кислот и липидов. Путем изменения условий среды процесс ферментации, в ходе которого образуется L-глутамат, может быть переключен на синтез L-глутамина или L-пролина. При высокой концентрации биотина и ионов аммония создаются благоприятные условия для образования L-пролина, а при больших концентрациях аммония и ионов цинка в слабо кислой среде усиливается синтез L-глутамина. DL-аланин, видимо, образуется в реакции трансаминирования при участии пирувата; затем он подвергается рацемизации ферментом ал ан ин р ацем а зой.
Ауксотрофные мутанты не могут образовывать ингибиторы соответствующего метаболического пути, работающие по принципу отрицательной обратной связи, так как у них отсутствует определенная ключевая ферментативная реакция. Поэтому при выращивании мутантного штамма в среде с минимальной концентрацией необходимого питательного ингредиента они способны образовывать избыточные количества вещества-предшественника или близких к нему метаболитов блокированной реакции. Так, первые реакции в цепи биосинтеза L-аргинина (рис. 4.5) у Corynebacterium glutamicum ингибируются по механизму обратной связи самим конечным продуктом, и образование соответствующих ферментов подавляется L-аргинином. У цитруллинового ауксотрофа этой бактерии отсутствует фермент, называемый орнитин-карбамоилтрансферазой, который
Перенос ацетильной группы -.Перенос ацетильной группы -.N -АцетиглутаматN -АцетиглутаматN -Л цетилглу тамипфосфа гN -Л цетилглу тамипфосфа гГлутаматГлутаматa-Кет。2flyтаратa-Кет。2flyтарат.一 N -Ацетилорнитин.一 N -Ацетилорнитин^■Ацетилглутамат- семиальдегид^■Ацетилглутамат- семиальдегидОрнитинОрнитинК^рбамилфосфат (орнигин-карбамоилтрансфераза)
Перенос ацетильной группы -.
Перенос ацетильной группы -.
N -Ацетиглутамат
N -Ацетиглутамат
N -Л цетилглу тамипфосфа г
N -Л цетилглу тамипфосфа г
Глутамат
Глутамат
a-Кет。2flyтарат
a-Кет。2flyтарат
.一 N -Ацетилорнитин
.一 N -Ацетилорнитин
^■Ацетилглутамат- семиальдегид
^■Ацетилглутамат- семиальдегид
Орнитин
Орнитин
ЦитруллинЦитруллинАргининсукцинатАргининсукцинатАспартат,АТРАспартат,АТР..、》АргининФумарат
Цитруллин
Цитруллин
Аргининсукцинат
Аргининсукцинат
Аспартат,АТР
Аспартат,АТР
Ингибирование аргинином по механизму обратной связи
. Репрессия аргинином по механизму обратной связи
Рис. 4.5. Биосинтез L-аргинина,
катализирует превращение орнитина в цитруллин на одном из промежуточных этапов биосинтеза L-аргинина. Синтез аргинина не идет, что приводит к снятию ингибирования по принципу обратной связи со всех ферментов этого пути и накоплению избытка орнитина. Ауксотрофиые мутанты находят применение и в тех случаях, когда необходимо синтезировать соединения, являющиеся конечными продуктами разветвленных цепей мета- болических реакций. Так, L-аспартат является общим предшест- венником для L-лизина, L-треонина, L-метионина и L-изолей- Цина. Первая реакция в процессе образования всех этих амино- кислот катализируется аспартокиназой, активность которой может быть ингибирована по механизму обратней связи при
совместном действии L-лизина и L-треонина. У мутантов, аук- сотрофных по гомосерину или треонину/метионину, существенно снижается внутриклеточная концентрация L-треонина, что снимает блокаду с аспартокиназы и позволяет клеткам накапливать L-лизин,
Получить ауксотрофные мутанты, способные накапливать конечные продукты неразветвленных цепей биосинтеза, например L-аргинин, невозможно. В таких случаях приходится отбирать мутанты с частично нарушенной регуляцией биосинтеза, что позволяет получить повышенный выход конечного продукта. Такие мутанты известны под названием регуляторных; их отбирают по устойчивости к аналогам аминокислот или же среди ревертантов ауксотрофов. В основе использования аналогов аминокислот лежит их сходство с природными аминокислотами. Они ингибируют рост бактерий, но этот эффект может быть уменьшен путем добавления соответствующей природной аминокислоты. Таким образом, аналоги выступают в роли искусственных, работающих по принципу обратной связи, ингибиторов ферментов, обеспечивающих биосинтез природных аминокислот, и одновременно подавляют процесс их включения в белки. Появление мутантов, устойчивых к этим ложным ингибиторам, означает, что регуляторные ферменты соответствующего пути обмена становятся у них нечувствительными к аналогу. Так, серусодержащий аналог лизина S- (2-аминоэтил) -L-цистеин является у Brevibacterium flavum ложным, действующим по принципу обратной связи ингибитором аспартокиназы. Устойчивые к его действию мутанты вырабатывают фермент, который в 150 раз менее чувствителен к ингибированию по механизму обратной связи, чем фермент исходного штамма, и в результате продуцируют до 33 г/л лизина. Для увеличения выхода можно воспользоваться как ауксотрофией, так и дефектами регуляции одновременно. Так, у Corynebacterium glutamicum и Brevibacterium flavum сверхпродукции L-треонина не наблюдается, поскольку происходит сочетанное ингибирование по механизму обратной связи аспартокиназы и L-треонином, и L-лизином, а L-треонин ингибирует и гомосериндегидрогеназу. Мутант, устойчивый к аналогу треонина, а-амино-р-оксивалериановой кислоте, синтезирует в избыточном количестве треонин, так как. ферменты его, ингибированные этой аминокислотой, десенсибилизированы. Принимающие участие в синтезе треонина гомосериндегидрогеназа и киназа также «выключаются» L-метиони- ном, и поэтому ауксотрофы по метионину образуют L-треонин с еще большим выходом.
Регуляторные мутанты можно получить путем трансдукции,, проводя при этом отбор отдельных мутаций, вызывающих полное рассогласование регуляторных механизмов, а затем объеди-
1ЙЯЯ эти признаки путем ко-трансдукции. Таким способом у одного штамма последовательно может быть закреплена устойчивость к нескольким аналогам (гл. 7).
Производство аминокислот из биосинтетическихпредшественников
Использование предшественников при производстве аминокислот позволяет успешно «обходить» метаболический контроль, осуществляющийся по механизму обратной связи и репрессии. Рассмотрим процесс синтеза L-лейцина из L-треонина через а-кетобутират. Первый фермент в этом пути биосинтеза, гидратаза, у Serratia marcescens ингибируется L-изолейцином по механизму обратной связи. При добавлении в среду D-треонина происходит индукция D-треонингидратазы, которая L-изолейцином не ингибируется, и поэтому синтез L-изолейцина из D-треонина может миновать метаболический контроль. С другой стороны, для того чтобы обойти контроль, можно использовать предшественники, превращаемые в ходе обмена в кетобутират (например, а-амино-, а-бром- и а-гидроксибутират); точно так же при участии гидроксиметилтрансферазы и в присутствии достаточного количества метилентетрагидро фолата из предшественников глицина можно получать L-серин. В качестве поставщиков С-1 могут выступать глицин, формальдегид, формиат, саркозин, холин или метионин. При наличии в среде глицина, глюкозы и метанола метиониновый ауксотроф Artrobacter glo~ biformis образует до 5,2 г/л L-серина. Для такой конверсии, а также для образования L-глутамата, L-метионина и ароматических аминокислот могут использоваться и другие штаммы растущих на метаноле бактерий.
Синтез аминокислот с помощью ферментов
Об использовании чистых ферментов для нужд химии подробно будет говориться в разд. 4.2.6, а здесь мы остановимся на том, какова роль и ожидаемые преимущества применения ферментов при синтезе аминокислот. Эти процессы бывают одно- и многостадийными, а используемые в них методы весьма разнообразными от применения in situ интактных, но не растущих организмов до иммобилизованных препаратов. В этой связи целесообразно рассмотреть пять классов ферментов.
Гидролитические ферменты (или гидролазы), например L-a-амино-е-капролактам-лиаза (синтез L-лизина) или 2-амино- тиазолин-4-карбоксилатгидролаза (синтез L-цистеина) (рис. 4.6). Чтобы можно было использовать неочищенные ферменты, целые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами, вы-
&С、с/СН2 Н2&С、с/СН2 Н2Рацемическая смесьD- и L-Л-Амино- ^-капролактама 4РацемазаРацемическая смесьD- и L-Л-Амино- ^-капролактама 4РацемазаH2N(CH2)4CH(NH2)COOH
&С、с/СН2 Н2
&С、с/СН2 Н2
Рацемическая смесь
D- и L-Л-Амино- ^-капролактама 4
Рацемаза
Рацемическая смесь
D- и L-Л-Амино- ^-капролактама 4
Рацемаза
L -Лизин
+
ГидролазаIГидролазаIL-2 -Амино-及-тиазолин- А-карбоксилатL-2 -Амино-及-тиазолин- А-карбоксилатсоонсн2—сн—СООН-IГидролаза ПNH?L -Цистеинсоонсн2—сн—СООН-IГидролаза ПNH?L -ЦистеинS -Карбамоил- L -цистеинS -Карбамоил- L -цистеинD' а -Амино- £ -капролак там
ГидролазаI
ГидролазаI
L-2 -Амино-及-тиазолин- А-карбоксилат
L-2 -Амино-及-тиазолин- А-карбоксилат
соонсн2—сн—СООН-
I
Гидролаза ПNH?
L -Цистеин
соонсн2—сн—СООН-
I
Гидролаза ПNH?
L -Цистеин
S -Карбамоил- L -цистеин
S -Карбамоил- L -цистеин
Место гидролитической атаки
Рис. 4.6. Применение гидролитических ферментов при производстве аминокис- лот.
зывающими изменение проницаемости. Кроме того, могут быть получены мутанты, у которых искомый продукт не вовлекается более в обмен веществ.
Лиазы. Эти ферменты часто используются в реакциях дезаминирования. Так, для образования L-аспарта из фумарата аммония может использоваться (в обратной реакции) аспартаза, или L-аспартат — аммиак-лиаза. В качестве доноров аммо- ния могут, кроме того, выступать гидразин или гидроксиламин. Сходным образом L-фенилаланин — аммиак-лиаза может катализировать распад L-фенилаланина с образованием транс-ко- ричной кислоты и аммиака. Хотя обычно равновесие в этих реакциях сдвинуто в сторону реакций распада, при высоких концентрациях аммонийных ионов начинают преобладать процессы синтеза.
Ферменты, содержащие пиридоксальфосфаг Это обычные коферменты, участвующие в метаболизме аминокислот. Они катализируют множество реакций： рацемизацию, трансаминирование, декарбоксилирование, реакции замещения и элиминации и являются своего рода универсальными. По-видимому, роль этих коферментов состоит в активации аминокислот, что облегчает их взаимодействие с апоферментом. Мы рассмотрим здесь лишь несколько ферментов из этой группы. Так, L-тирозин — фенол-лиаза (p-тирозиназа) катализирует реакцию ^-элиминации, в которой тирозин распадается с образованием пнрувата, фенола и аммиака. При оптимальных условиях Erwinia herbi- cola может синтезировать очень много этого фермента (до 10%
,0)^ -Тирозиназа
《а) Процесс, обратный элиминации
СНзСОСООНПируватСНзСОСООНПируват+ N%Аммиак+ N%АммиакОНОН+ Н2О+ Н2ОCH2CH(NH2)COOHCH2CH(NH2)COOH
СНзСОСООН
Пируват
СНзСОСООН
Пируват
+ N%
Аммиак
+ N%
Аммиак
ОН
ОН
+ Н2О
+ Н2О
CH2CH(NH2)COOH
CH2CH(NH2)COOH
Тирозин
CH2OHCH(NH2)COOHСеринCH2OHCH(NH2)COOHСеринОНОНL-ДОФАL-ДОФА
CH2OHCH(NH2)COOH
Серин
CH2OHCH(NH2)COOH
Серин
ОН
ОН
L-ДОФА
L-ДОФА
CH2CH(NH2)COOHCH2CH(NH2)COOHТриптофанТриптофанИндолИндол+ СНзСОСООН + NH3+ СНзСОСООН + NH3⑶ L-Метионин - у • лиазаCH3SeH + СН3СН2СОСООН 十 NH3 Метилселвнол а -Кетобутират Аммиак⑶ L-Метионин - у • лиазаCH3SeH + СН3СН2СОСООН 十 NH3 Метилселвнол а -Кетобутират АммиакСН3 — Se — (CH2)2CH(NH2)COOH + Н2ОСелен метионинСН3 — Se — (CH2)2CH(NH2)COOH + Н2ОСелен метионин
CH2CH(NH2)COOH
CH2CH(NH2)COOH
Триптофан
Триптофан
Индол
Индол
+ СНзСОСООН + NH3
+ СНзСОСООН + NH3
⑶ L-Метионин - у • лиаза
CH3SeH + СН3СН2СОСООН 十 NH3 Метилселвнол а -Кетобутират Аммиак
⑶ L-Метионин - у • лиаза
CH3SeH + СН3СН2СОСООН 十 NH3 Метилселвнол а -Кетобутират Аммиак
СН3 — Se — (CH2)2CH(NH2)COOH + Н2ОСелен метионин
СН3 — Se — (CH2)2CH(NH2)COOH + Н2ОСелен метионин
《2) Триптофаназа; процесс, обратный (3 -элиминации
Пировиноградная Аммиак
кислота
Рис. 4.7. Реакции синтеза, катализируемые пиридоксалевыми ферментами.
растворимого белка). Его используют для синтеза тирозина: ■в иммобилизованной форме он применялся для непрерывного его производства. Субстратная специфичность этого фермента такова, что он может также осуществлять реакцию ^-замещения между DL-серином и пирокатехолом, в результате которой образуется L-ДОФА (рис. 4.7). Примером широкого распространенного в природе фермента, осуществляющего дезаминирование, может служить L-триптофан — индол-лиаза (триптофаназа).
Она катализирует реакции аф-элиминации и ^-замещения и. также характеризуется широкой субстратной специфичностью (L-триптофан, L-цистеин, З-метил-Ь-цистеин, р-хлор-Ь-аланин,, L-серин). Действие ее может быть обращено, и тогда она будет способствовать синтезу L-триптофана из индола, пирувата и аммиака. Примером индуцибельного фермента является L-ме- тионин — у-лиаза: она катализирует реакцию элиминации, где субстратами могут быть разнообразные аминокислоты, включая производные L-метноннна и L-цистеина. L-метионин расщепля- ется с образованием метантиола, а-кетобутирата и аммиака. Когда фермент «работает на синтез», его можно применять для производства новых серусодержащих аминокислот на основе- алкантиолов и арилтиоспиртов. Фермент может также расщеплять селенметионин. Использование селенолов в обратных реакциях замещения, идущих с образованием гомоцистеинов., содержащих селен вместо серы, — это первый случай, когда селен удалось включить в состав аминокислот (рис. 4.7).
Эту лиазу можно применять для синтеза меченых аминокислот.
Дегидрогеназы аминокислот, например лейцин- и аланиндегидрогеназы. Эти ферменты катализируют обратимые реак- ции дезаминирования. Их применяют в непрерывных процессах, синтеза аминокислот из соответствующих кето-аналогов. В мембранном реакторе дегидрогеназы аминокислот удерживаются ультрафильтрующей мембраной и используют в своей работе один и тот же пул NADH, который сохраняется в реакторе, так как ковалентно связан с полиэтиленгликолем. Регенерация его в ходе процесса осуществляется с помощью формиатдегидрогеназы (разд. 4.4.2).
Глутаминсинтаза. Этот фермент катализирует АТР-зави- симую реакцию аминирования глутамата, которая была сопряжена со сбраживанием сахара дрожжами. Высвобождающаяся при брожении энергия используется для синтеза глутамина. При распаде фруктозо-1,6-дифосфата, образовавшегося прв сбраживании глюкозы, продуцируется АТР, которая необходима для энергоснабжения эндергонической реакции, катализируемой синтазой. При использовании бесклеточного экстракта пекарских дрожжей и глутаминсинтазы Gluconobacter suboxy- dans из глюкозы, глутамата и ионов аммония в качестве субстратов с высоким выходом (92 мол. %) был получен глутамин.
Применение аминокислот
Аминокислоты находят применение во многих сферах.
Их используют в качестве пищевых добавок. Так, лизи* ном, триптофаном и треонином обогащают растительные белк% а метионин включают в блюда из сои.
При выработке пищевых продуктов аминокислоты находят (применение в роли усилителей вкуса и добавок. Благодаря выраженному мясному вкусу широко используется L-энантиомер мононатриевой соли глутаминовой кислоты. Глицин добавляют как подсластитель, бактериостатическое вещество и антиоксидант.
Аминокислоты применяются в медицине (вливания), -а некоторые их аналоги используются для лечения психических заболеваний.
В химической и фармацевтической промышленности аминокислоты широко используются как предшественники в производстве детергентов, полиаминокислот (из них делают синтетические волокна и пленки), полиуретана и химикатов для сельского хозяйства.
Антибиотики 〃 стероиды.
Антибиотики (группа веществ микробного происхождения) играют большую роль в нашей жизни. В медицине и ветеринарии они с успехом применяются как противомикробные и противоопухолевые препараты; с их помощью контролируется рост растений и ведется борьба с болезнями. Все антибиотики были выделены в ходе систематического скрининга микроорганизмов； число их было существенно увеличено путем химической модификации, цель которой состоит в 1) расширении спектра действия и повышении эффективности; 2) снижении токсичности и устранении нежелательных побочных эффектов; 3) создании аналогов, устойчивых к разрушению микробами и обладающих поэтому большим временем полужизни; 4) усовершенствовании способов их введения.
Со времени открытия и описания первых антибиотиков получили путевку в жизнь целое поколение полусинтетических пенициллинов, цефалоспоринов, аминогликозидов, тетрациклинов, рифамицинов, макролидов и линкозаминидов. Эти соединения очень сложны, и метод полного химического синтеза не может конкурировать с их производством методом ферментации. Поскольку микробы могут разрушать антибиотики, возникла мысль модифицировать природные антибиотики ферментами микроорганизмов (вспомним о превращениях стероидов), но лишь немногие из таких веществ оказались экономически приемлемыми (6-аминопенициллановая кислота, 6-диметилтет- рациклины). Существует три основных способа получения новых антибиотиков.
Прямая ферментация. В этом случае используются образующие антибиотик микроорганизмы, которые синтезируют новые биологически активные соединения в присутствии подходя-
Таблица 4.2
БензилпенициллинБензилпенициллинNHNHIIIIХ= СН2ОНY = CH3NHХ= СН2ОНY = CH3NHСтрептомицинСтрептомицин
Бензилпенициллин
Бензилпенициллин
NH
NH
II
II
Х= СН2ОН
Y = CH3NH
Х= СН2ОН
Y = CH3NH
Стрептомицин
Стрептомицин
щих предшественников или ингибиторов метаболизма. Так, Penicillium chrysogenum не только синтезирует пенициллин, на и включает фенилуксусную кислоту в бензилпенициллин, а другие предшественники — в аналоги пенициллина. Этот принцип находит широкое применение, например, при получении новых блеомицинов путем добавления аминов к культуре <S. verticillus-
и новых актиномицинов — путем добавления 4-метилпролина к среде для выращивания S・ parvulus. При подавлении синтеза антибиотиков также иногда образуются полезные вещества. Так, при подавлении процесса присоединения хлора S. aureofa- ciens образует тетрациклин, а не хлортетрациклин. Если в среду ферментации добавить L-метионин, то ингибируются реакции метилирования и синтезируется 6-деметил-7-хлортетрациклин (табл. 4.2).
Мутанты организмов-продуцентов иногда образуют биологически активные промежуточные продукты какого-то определенного пути биосинтеза антибиотиков либо соединения, которые могут оказаться полезными как предшественники при создании новых аналогов. «Блокированные» мутанты этого типа не способны образовать нужный антибиотик, если в среде отсутствует метаболитический предшественник, который в норме образуется при участии фермента, действующего вслед за
в -сн2соон -н -онсн3со——сн3
Рис. 4.8. Структура рифамицина.
блокированным звеном метаболизма. Поскольку ферменты^ участвующие во вторичном метаболизме, нередко обладают относительно низкой субстратной специфичностью, аналоги предшественников антибиотиков могут быть относительно легко превращены мутантом в аналоги самого антибиотика в ходе процесса, известного как мутационный биосинтез, или мутасин- тез. Nocardia mediterranei синтезирует около двадцати разных рифамицинов (рис. 4.8). Путем добавления барбитала ход ферментации и как следствие спектр образуемых антибиотиков существенно меняется. Мутанты этого организма, у которого
подавлена способность к ацилированию, образуют предшественник рифамицина В ——рифамицин SV, который служит исходным веществом для получения многих синтетических рифами- цинов (например, рифампицина, препарата для лечения туберкулеза, который действует и на возбудителя проказы). „Другой мутант, с блокированным метилированием, синтезирует 27-деметилрифамицин SV, ценный субстрат для синтезов, который исключительно сложно получить химическими методами.
Особенно успешно модификация антибиотиков микробами идет в следующих двух процессах.
а. При ферментативном гидролизе пенициллина с образованием 6-аминОпенициллановой кислоты (6-АПК, рис. 4.9), которая является ценным исходным продуктом при производстве некоторых полусинтетических, важных для медицины аналогов
о но нПенициллинПенициллинноноСНзСН3СООНСНзСН3СООНЬ-Аминопенициллановая кисло таЬ-Аминопенициллановая кисло таРис. 4.9. Гидролиз пенициллина с образованием 6-АПК (ядра молекулы пенициллина) или пенициллиновой кислоты.Рис. 4.9. Гидролиз пенициллина с образованием 6-АПК (ядра молекулы пенициллина) или пенициллиновой кислоты.СН3СН3 соонСН3СН3 соонNHNH— соон— соонПеницилпоиноваяПеницилпоиновая
о н
о н
Пенициллин
Пенициллин
но
но
СНз
СН3
СООН
СНз
СН3
СООН
Ь-Аминопенициллановая кисло та
Ь-Аминопенициллановая кисло та
Рис. 4.9. Гидролиз пенициллина с образованием 6-АПК (ядра молекулы пенициллина) или пенициллиновой кислоты.
Рис. 4.9. Гидролиз пенициллина с образованием 6-АПК (ядра молекулы пенициллина) или пенициллиновой кислоты.
СН3
СН3 соон
СН3
СН3 соон
NH
NH
— соон
— соон
Пеницилпоиновая
Пеницилпоиновая
пенициллина. В промышленности 6-АПК, ядро молекулы пенициллина, получают путем гидролиза пенициллина или бензилпенициллина при участии штаммов, с высоким выходом образующих в ходе ферментации пенициллинацилазу; для этой же цели используют также иммобилизованную пенициллинацилазу.
Исходя из типа пенициллина, который ацилазы предпочтительно гидролизуют, их подразделяют на группы. Некоторые из них способны катализировать и обратные реакции. На основе 6-АПК было получено более 40 000 полусинтетических пенициллинов. В некоторых случаях не было необходимости выделять •6-АПК： примером может быть превращение бензилпенициллина в ампициллин. Гидролиз бензилпенициллина осуществляют при •участии мутанта Kluyvera citrophila, после чего в ферментер
вносят мутант Pseudomonas melanogenum и метиловый зфнр DL-фенилглицина. Условия процесса изменяют таким образом, чтобы они способствовали образованию ампициллина (рис. 4.10). В роли катализатора выступает ацилаза, образуемая вторым мутантным организмом, которая не способна в этих условиях гидролизовать или синтезировать бензилпенициллин. В ходе этого двухстадийного процесса образуется только ампициллин [D (—) -а-аминобензилпенициллин].
ФенилглицинФенилглицинРис. 4.10. Синтез ампициллина.Рис. 4.10. Синтез ампициллина.
Фенилглицин
Фенилглицин
Рис. 4.10. Синтез ампициллина.
Рис. 4.10. Синтез ампициллина.
б. В клинике широко применяются аминогликозидные анти* биотики (стрептомицин, неомицин, канамицин, гентамицин). Бактерии, способные их инактивировать, были выделены н& только от больных, но и как самостоятельные, образующие антибиотики штаммы. Их ферментативная активность может быть, частью механизма детоксикации, при помощи которого организмы-продуценты защищают себя от неблагоприятного воздействия образуемых ими же веществ. К числу модификаций, происходящих при инактивации антибиотиков, относятся N- ацетилирование, О-фосфорилирование, О-аденилирование и О-нуклеотидилирование. Установление механизма модификации позволило планировать и осуществлять химический синтез новых аналогов, устойчивых к такой инактивации.
Инактивация антибиотиков по другому механизму, включая1 гидролиз, гидроксилирование, эпоксидирование, сульфоокисление, фосфорилирование или восстановление, обычно приводит
к образованию или полностью, или частично неактивных про* изводных. Их изучение позволит синтезировать новые аналоги, выявить те участки молекул, которые ответственны за антибиотическую активность, а также создать рациональные основы «конструирования» антибиотиков и усовершенствования производства.
Пенициллиназы (^-лактамазы) гидролизуют ^-лактамное кольцо молекулы субстрата и являются основой устойчивости болезнетворных бактерий к пенициллинам и цефалоспоринам. В результате гидролиза амидной связи кольца образуется пенициллиновая кислота (рис. 4.9), которая полностью лишена антимикробной активности. Эти ферменты синтезируются многими бактериями; они могут различаться по строению и специ-
1-Аминоцефалоспорановая кислота
Рис. 4.11. Гидролиз цефалоспорина С.
фичности. Глубокое изучение механизмов их действия позволило наладить производство устойчивых аналогов антибиотиков, таких как ампициллин и карбенициллин, а также найти природные ингибиторы лактамазы — клавулановую и оливановую кислоты. р-Лактамазы используются для оценки количества пенициллинов в пищевых продуктах и биологическом сырье, а также для инактивации пенициллина в молоке, что предотвращает аллергические реакции у его потребителей.
В некоторых случаях получить полезные предшественники с помощью микробов не удается. Так, при выработке цефалоспорина в основном образуется цефалоспорин С, который приходится затем химическим методом гидролизовать до 7-амино- цефалоспорановой кислоты (рис. 4.11) и уже ее использовать
как субстрат для получения новых полусинтетических цефалоспоринов.
Способность микроорганизмов выступать в роли химических катализаторов впервые удалось использовать в полной мере для синтеза промышленно важных стероидов. В последние тридцать лет субстратная и стереоспецифичность ферментов нашла широкое применение в производстве стероидов при осуществлении разнообразных реакций: гидроксилирования, дегидроксилирования, эпоксидирования, окисления, восстановления, гидрогенизации, дегидрогенизации, этерификации, гидролиза эфиров и изомеризации. Целью всеобъемлющих исследований в этой области было осуществление специфических структурных перестроек стероидов при мягких условиях. Специфичность таких реакций определяется либо выбором определенного вида микроорганизмов, либо химической модификацией субстрата, стереохимически исключающей другие реакции. Понимание зависимости между строением молекул субстрата и характером его перестройки, осуществляемой микроорганизмами, позволило сформулировать требования для каждой конкретной реакции, например для гидроксилирования. В определении скорости и направления реакции главную роль, как выяснилось, играют положение и ориентация замещающих групп в молекулах стероидов. История развития методов микробиологического преобразования стероидов представляет собой прекрасный пример сочетания химического подхода со специфичностью и разнообразием биологических систем. Кроме того, на этой основе может быть осуществлен синтез новых стероидов, обладающих лучшими фармакологическими свойствами.
Первый запатентованный процесс микробной трансформации стероидов был разработан в 1937 г., но внедрить его в промышленность удалось лишь в 1952 г. [процесс 11-а-гидроксилирова- ния прогестерона некоторыми видами грибов (рис. 4.12)]. С технологической точки зрения этот процесс не потерял значения и теперь. Сегодня в нем используются виды грибов с весьма высокой субстратной специфичностью относительно места гидроксилирования. Дальнейшее усовершенствование процесса может быть основано на использовании спор грибов или же на изменении состава культуральных сред. Упомянутая выше трансформация может быть выполнена с высоким выходом при концентрации субстрата 20—50 г/л. Сходным образом по положению 7 и 14 может быть гидроксилирован дезоксикортикостерон. Если провести ба-метилирование ядра молекулы стероида, то нежелательного гидроксилирования по 7а-положению не произойдет. Направленное гидроксилирование путем химиче* <кой модификации широко используется для повышения эффективности процесса.
ооНО、、НО、、7 7 а -厂идроксипрогестерон7 7 а -厂идроксипрогестеронРис. 4.12. Схема применяемого в промышленности метода микробной трансформации прогестерона.Рис. 4.12. Схема применяемого в промышленности метода микробной трансформации прогестерона.
о
о
НО、、
НО、、
7 7 а -厂идроксипрогестерон
7 7 а -厂идроксипрогестерон
Рис. 4.12. Схема применяемого в промышленности метода микробной трансформации прогестерона.
Рис. 4.12. Схема применяемого в промышленности метода микробной трансформации прогестерона.
Большинство поступающих в продажу стероидов, обладающих противовоспалительным действием, — это производные преднизолона, и именно этим определяется важная роль про* цессов микробного гидроксилирования кортикостерона (вещества S Рейхштейна) и его производных. В промышленном масштабе производство гидрокортизона путем гидроксилирования кортикостерона осуществляется при участии некоторых видов грибов (например, Cunninghamella blakesleeana) с начала 50-х годов. За это время процесс был неоднократно усовершенствован. Проблемы, связанные с деградацией субстрата, которая происходит при обычных условиях производства, можно решить- путем регулярного его добавления или использования других микроорганизмов, например Thieghemella orchidis. Кроме того^ ход синтеза можно контролировать, применяя метод химической модификации. Так, метилирование по 16а-положению подавляет нежелательное восстановление кетогруппы при С-20, а образование уксуснокислого эфира по С-17 стереохимически препят* ствует другим побочным реакциям. Конечное превращение гид-
Curvuiaria lunataCurvuiaria lunata▼▼Arthrobacter simplexArthrobacter simplexРис. 4.13. Превращение вещества S Рейхштейна в преднизолон.Рис. 4.13. Превращение вещества S Рейхштейна в преднизолон.
Curvuiaria lunata
Curvuiaria lunata
▼
▼
Arthrobacter simplex
Arthrobacter simplex
Рис. 4.13. Превращение вещества S Рейхштейна в преднизолон.
Рис. 4.13. Превращение вещества S Рейхштейна в преднизолон.
рокортизона в коммерческие продукты со структурой пред- лизолона также осуществляется с помощью микробов. Химические методы здесь явно проигрывают по сравнению с микробиологическими. Одной мз главных реакций в этом процессе является образование 1,2-двойной связи; для дегидрогенизации по положению 1 используют главным образом Mycobacterium globiforme л Arthrobacter simplex. Выход этой реакции зависит от того, б какой форме подается су6・ •страт. Если он поступает в •среду в микрокристаллах, то концентрацию субстрата мож- ；но довести до 400 г/л и получить выход 80—90%. При модификации прегнана получают ：многие фармакологически ценные кортикоиды, гестагены и анестезирующие средства стероидной природы. Их производство основано на проведении широкого спектра превращений, осуществляемых микробами.
Другой важной группой соединений, модифицируемых с помощью микробов, являются -андростаны и эстраны. Их жпользуют в промышленном синтезе половых гормонов и
■минералокортикоидных соединений. Примером такого рода служит превращение дрожжа-
■ми 4-андростен-3,17-диона в
тестостерон. Все возрастающее значение приобретает процесс окислительного расщепления боковой цепи С^-стероидов: он
позволяет использовать дешевые стероиды для производства лредшественников, идущих на синтез стероидов, крайне нужных фармакологам. И в этом случае приходится проводить химическую модификацию, чтобы предотвратить разрушение
аг
«скелета» молекул стероидов. Она заключается в гидроксилировании по положению С-9 и направляет процесс микробной перестройки структур на разрушение боковых цепей. Так, холе・ стерол или его соли превращаются в 4-холестен-З-он и 1,4-анд- ростадиен-3,17-дион. Для более глубокого знакомства с проблемой микробной трансформации стероидов мы отсылаем читателя к литературе, приведенной в конце главы.
Дальнейшие успехи в области применения методов микробиологии в химии стероидов будут основаны на применении иммобилизованных клеток и органических растворителей, что позволит расширить масштабы производства.
Коммерческие аспекты применения ферментов
Применение ферментов в химической технологии обычно бывает обусловлено их высокой избирательностью и стереоспецифичностью, однако, как отмечалось ранее, эти их свойства не всегда оказываются желательны. Примером такого рода могут служить случаи использования широкой субстратной специфичности фермента для производства аналогов основного продукта. Второе важное преимущество технологии на основе ферментов перед химическим катализом заключается в том, что при относительно мягких условиях удается достичь более высоких скоростей превращений. Об использовании отдельных ферментативных реакций для получения аминокислот и антибиотиков мы уже говорили; в этом разделе будет описано сегодняшнее положение дел в сфере использования ферментных препаратов в промышленности (табл. 4.3).
Протеиназы
Протеиназы давно применяются в пищевой промышленности. Ранее ферменты для этих целей выделяли из животных и растений; сегодня их частично замещают протеазы микробов. Первым ферментом, нашедшим применение в промышленности, была а-амилаза (такадиастаза) из Aspergillus oryzae, производство которой началось в 1890 г. Эти препараты содержали значительную примесь протеазы, и их рекомендовали использовать как средство, способствующее пищеварению. Отметим, что производство и поступление на рынок такого рода продуктов было весьма ограниченным вплоть до начала 60-х годов, когда их стали использовать в составе детергентов. Впрочем, о такой возможности было известно за пятьдесят лет до этого; средство для замачивания белья, содержащее соду и панкреатические ферменты, продавалось еще в 1913 г. Крупный успех в производстве и продаже таких средств был достигнут лишь
Таблица 4.3
после того, как стали использоваться протеазы Bacillus subtilis, в особенности субтилизин Carlsberg. В конце 60-х годов приблизительно 50% всех детергентов, выпускавшихся в Европе и США, уже содержали протеазы. Постоянно ведется работа по увеличению активности ферментов (особенно их способности удалять пятна) и стабильности их в моющих растворах. Еще одна отрасль, где наблюдалось бурное развитие технологий на основе протеаз,——это производство сыра. Здесь все усилия были направлены на поиск микробных заменителей сычуга телят. Для выработки протеаз в промышленном масштабе нужны штаммы микроорганизмов, синтезирующие внеклеточные протеазы с высоким выходом. Эти ферменты подразделяют сегодня на три группы: сериновые, кислые и металлопротеазы.
Среди сериновых протеаз на первом месте стоит субтилизин Carlsberg. При участии Bacillus licheniformis ежегодно производится около 500 т очищенного фермента. Накопление протеазы начинается в конце логарифмической фазы роста микробов, и выход фермента увеличивается при использовании аспорогенных штаммов (они удобны еще и тем, что при этом удается исключить технически сложную операцию по отделению спор от фермента). Сериновые протеазы не гидролизуют белки до аминокислот. В стиральные порошки обычно добавляют 0,5%
(по весу) препарата, содержащего 3% активного фермента. Хотя содержание фермента в них и мало, при стирке он концентрируется на пятнах белковой природы из-за сродства к субстрату. В меньшей степени применяются протеазы алкало- фильных видов Bacillus: они активны при pH 9—12 и температуре выше 50 ℃.
В состав металлопротеаз входит атом металла, обычно цинка, без которого фермент не активен. В промышленности ме・ таллопротеазы получают с помощью Bacillus amyloliquefaciens и В. thermoproteolyticus. Специфичность действия этих ферментов выше, чем у сериновых протеаз, но их нельзя использовать как «микробный сычуг», так как уровень неспецифического протеолиза у них все же весьма высок. Они применяются в пивоварении, при гидролизе белков ячменя, так как сериновые протеазы ингибируются веществами солода. Удаление с их помощью белков позволяет избежать помутнения пива при охлаждении, которое происходит в результате взаимодействия белков с тан- нинами при хранении пива на холоде. С той же целью часто используются протеазы растений папаин и бромелаин.
Кислые протеазы синтезируются грибами. По свойствам они похожи на пищеварительные ферменты животных пепсин и реннин. Применяют их для гидролиза соевого белка при производстве соевого соуса, в хлебопекарной промышленности (здесь с их помощью видоизменяют свойства клейковины муки так, чтобы получить мягкое, пластичное тесто, из которого делают бисквиты), как средства, способствующие пищеварению или же предотвращающие помутнение пива при охлаждении. Большинство протеаз вызывает свертывание молока, но творог получается невкусным, из-за глубокого гидролиза казеина. Субстратная специфичность кислых протеаз термофильных грибов Мисог pusillus и Мисог miehei уже. Они похожи на ферменты сычуга и широко применяются для створаживания молока. Менее широко используются протеазы Enthothia parasitica, так как они обладают большей, чем «сычужные^ ферменты Мисогу протеолитической активностью; они применяются, например, при выделке эмментальского сыра. Разрабатывается и другой подход: на основе технологии рекомбинантных ДНК проведено клонирование и получена экспрессия гена реннина телят в микроорганизмах (например, Е. coli). Синтезированный таким способом фермент успешно прошел испытания при опытном производстве сыра (гл. 3).
Протеазы находят применение и в кожевенной промышленности, при удалении шерсти и умягчении кож. Такая обработка делает кожи мягкими и эластичными.
Глюкозоизомераза
«Королевой》иммобилизованных ферментов в промышленности можно считать глюкозоизомеразу, которая катализирует превращение глюкозы во фруктозу. Коммерческие препараты ее известны под фирменным названием《Sweetzyme》или《Маха- zyme》. Их появление послужило толчком для развития крупного производства фруктозного сиропа. При высоких концентрациях субстрата и нейтральных pH несладкая глюкоза с выходом 42—47% изомеризуется ферментом в более сладкую фруктозу. Такие фруктозные сиропы (Isomerose, Isosyrup, Cornsweet, Isosweet) сегодня широко потребляются пищевой промышленностью. Запатентовано множество способов иммобилизации и использования как самой изомеразы, так и содержащих ее клеток. Процесс идет при 60—65 ℃ при pH 7,0—8,5 в присутствии ионов магния. При производстве насыщенного фруктозного сиропа из кукурузы в качестве субстрата используется либо глюкоза, либо продукт комплексной ферментативной переработки, заключающейся в ожижении и осахаривании крахмала.
Амилазы и амилоглюкозидазы
Использование ферментов в производстве крахмала позволяет контролировать глубину его гидролиза и получать продукцию с желаемыми свойствами： вязкостью, сладостью, осмотическим давлением и устойчивостью к кристаллизации. Гидролиз катализируется ферментами трех разновидностей: эндоамилазами, экзоамилазами и а-1,6-глюкозидазами.
Эндоамилазы ——это а-амилазы, они расщепляют а-1,4-глю- козидные связи в амилозе и амилопектине с образованием олигосахаридов с разной длиной цепи и a-конфигурацией при Ci-атоме глюкозы, способной служить восстановителем. Для ожижения крахмала при высокой температуре используют термостабильные а-амилазы. Так, температурный оптимум у фермента из Bacillus amyloliquefaciens лежит при 70 ℃, а у амилазы В. licheniformis — при 92 ℃. Непродолжительное время последняя может работать при температуре до 110℃. В этих условиях активность фермента стабилизируется ионами кальция и высокой концентрацией субстрата в среде. Для ожижения крахмал диспергируют в воде при нагревании; для уменьшения вязкости и во избежание оседания крахмала при охлаждении проводят частичный его гидролиз. При одностадийном ожижении фермент добавляют в самом начале, до приготовления суспензии, которое проводят при 150℃ в течение 5 мин, после чего гидролиз ферментом ведут 2 ч при 95℃ .При кис-
лотно-ферментном ожижении. фермент, вносят после желирова- ния крахмала, вызванного нагреванием.
При осахаривании используются термостабильные а-амила- зы, особенно мальтогенные ферменты из грибов. Лучше всего они работают при 55 ℃ и концентрации субстрата 30—40%. Процесс обычно продолжается более 48 ч. Получаемые из крахмала сиропы содержат много мальтозы (40—5(5%); они находят применение при производстве карамели и замороженных десертных блюд.； Для получения сиропов с очень высоким содержанием мальтозы (80%) мальтогенные экзоамилазы используются вместе с а-1,6-глюкозидазами.
Экзоамилазы расщепляют а-1,4-глюкозидные связи, а глю- когенные экзоамилазы гидролизуют а-1,6-глюкозидные связи в разветвленных молекулах олигосахаридов, в то время как мальтогенные экзоамилазы (например, р-амилаза злаков) не способны проходить эти точки ветвления. Последовательное удаление низкомолекулярных компонент (глюкозы или мальтозы) с нередуцирующего конца полимерной молекулы крахмала приводит к постепенному уменьшению вязкости; образующийся продукт имеет p-конфигурацию при Ci-атоме восстанавливающей молекулы глюкозы. Для промышленных целей глюкоамилазы получают из Aspergillus niger или Rhizopus spp. Это низкоспецифичные ферменты, которые гидролизуют связи а-1,3 и а-1,6 медленнее, чем а-1,4. Они стабильны в широком диапазоне pH и более активны при 75 ℃, хотя обычно им приходится функционировать при 65 ℃. Эти ферменты могут также катализировать полимеризацию глюкозы с образованием мальтозы и изомальтозы, но осахаривание никогда не достигает равновесия, и эта реакция особого значения не имеет. В препаратах этих ферментов присутствует загрязняющая примесь трансглюкозилаза, катализирующая образование несбраживаемых олигомеров глюкозы за счет реакции переноса молекул глюкозы при осахаривании. Это может существенно снижать выход глюкозы. Глюкоамилазы применяются в основном в производстве концентрированного сиропа (90—97% D-глюкозы), из которого вырабатывают кристаллическую глюкозу или же концентрированные фруктозные сиропы (см. предыдущий раздел). Для получения максимального выхода продукта при осахаривании ключевое значение имеет процесс ожижения; при ферментативном ожижении выход продукта больше, чем при кислотном, так как в этом случае образуется меньше побочных продуктов. Глюкоамилазы применяются также при выработке сиропов с высоким декстрозным эквивалентом или с высокой степенью конверсии (35—43% глюкозы, 30—37% мальтозы и 8—13% мальтотриозы) для пищевой промышленности. Сиропы, полученные кислотным гидролизом, обрабатывают мальтогенными и глюкогенными ами-
лазами. Состав продукта при этом зависит от соотношения использованных в производстве ферментов.
Большинство разновидностей крахмала, важных в промышленном отношении, содержит 80% амилопектина, который лишь частично расщепляется в ходе ферментативного гидролиза. Под действием а-амилаз из него образуются производные декстринов, которые далее уже гидролизоваться не могут. Так как по точкам ветвления гидролиз под действием глюкоамилаз идет медленно, используют а-1,6-глюкозидазы, из них в промышленном масштабе — пуллуланазу (пуллулан-6-глюканогидролазу).
Ферментативная переработка крахмала проводится сегодня в широком диапазоне pH. Задачей будущего является выделение термостабильных ацидофильных ферментов, что позволит вести переработку при одном и том же pH (4—5).
Другие ферменты, имеющие коммерческое значение(см. также гл. 3)
Сегодня ферменты применяются наиболее широко для превращения углеводов, играющих особую роль в пищевой и молочной промышленности. Так, р-галактозидазу (лактазу) применяют для гидролиза лактозы в снятом молоке. Получаемый безлактозный продукт используется теми людьми, организм которых не способен синтезировать лактазу. Этот фермент применяется, кроме того, для переработки лактозы сыворотки в глю- козогалактозные сиропы, а также подкисленной сыворотки, образующейся при получении творога.
Под действием инвертазы из сахарозы получают глюкозу. Для определения количества глюкозы в жидкостях тела в клиниках в последнее время стала широко использоваться глюкозо- оксидаза — как в свободной форме, так и иммобилизованная.
На коммерческий уровень поставлено ферментативное разделение рацемических смесей аминокислот и эфиров терпенов. Такие смеси аминокислот образуются при химическом синтезе, и разделение их по оптическим свойствам составляющих имеет важное практическое значение. Известно, что для этого можно использовать соответствующие физико-химические методы (механическое разделение, избирательная кристаллизация, хроматографическое разделение) и химические подходы (фракционная кристаллизация солей диастереомеров), но гораздо более эффективными и удобными оказываются процессы, основанные на стереоспецифичности ферментов. Укажем некоторые из используемых здесь приемов.
Получение асимметричных производных, например образование амидов Ы-ацил-Ь-аминокислот, катализируемое папаином, бромелином или фицином. Так； взяв анилин и папаин, мы
получаем нерастворимые L-анилиды аминокислот. Их можно гидролизовать химическим способом и получить L-изомер.
Асимметричный гидролиз. В этом случае осуществляется стереоспецифический гидролиз производных аминокислот, в результате которого образуется лишь один энантиомер. Эфиры L-аминокислот гидролизуют протеолитическими ферментами (например, химотрипсином); нужный продукт и не вступающие в реакцию D-эфиры разделяют по растворимости.
Использование амидаз. Эти ферменты из почек и поджелудочной железы млекопитающих или из микроорганизмов стереоспецифически гидролизуют амиды L-аминокислот, которые затем отделяют методом дифференциальной растворимости. Амиды менее склонны к спонтанному гидролизу, чем эфиры, и с помощью этого метода получают оптически более чистые препараты аминокислот.
Стереоспецифический гидролиз N-ацил-Ь-аминокислот, В этом случае используются аминоацилазы или карбоксипептидазы, и в результате образуются L-аминокислоты. Ацилазы получают из самых разных микроорганизмов. Иммобилизованная аминоацилаза одного из грибов успешно использовалась в установке для непрерывного ферментативного разделения.
В конце 60-х годов в промышленности стали применять метод разделения рацемических смесей эфиров терпенов при помощи гидролаз: было обнаружено, что ферментативный гидролиз этих эфиров идет только в том случае, если эфирная связь экваториальна или же легко принимает эту конформацию. Разделение по оптическим свойствам зависело также от положения диастереомерных центров; оно шло успешно в случае эпимеров вторичных спиртов. В качестве катализатора применяли дрожжи, иммобилизованные в полиуретане. Опыт проводили с DL-ментолсукцинатом, для которого в водонасыщенном н-геп- тане степень конверсии составила 72,6%. В результате был получен оптически чистый L-ментол. Этот метод разделения с производительностью 800 кг был запатентован. Рацематы терпенов можно разделять и путем обращенного гидролиза: сначала при участии липазы получают эфиры, а затем гидролизуют их химическим методом.
Будущее технологии иммобилизованных ферментов
Сегодня в промышленности реализовано всего четыре крупномасштабные технологии на основе иммобилизованных ферментов (глюкозоизомеразы, аминоацилазы, пенициллинацилазы и лактазы). Последнюю иммобилизовали на частицах кремнезема и применяли для конверсии лактозы сыворотки в глюкозу и га-
лактозу. В обозримом будущем иммобилизованные ферменты могут быть использованы для следующих целей.
Холинэстераза может применяться для определения пестицидов. Степень ингибирования этого фермента в присутствии пестицидов оценивают электрохимическими или колориметрическими методами.
Аналогичным образом другие ферменты могут использоваться для определения токсических веществ. Так, карбоангидраза очень чувствительна даже к малым концентрациям хлор- производных углеводородов, гексокиназа — к хлордану, линдану и токсафену.
Иммобилизованная диизопропил фторфосфатаза нервных клеток кальмара может найти применение для обезвреживания фосфоорганических нервных газов (зомана, зарина).
Иммобилизованная гепариназа может применяться для предотвращения тромбообразования в аппаратах искусственного кровообращения.
Иммобилизованная билирубиноксидаза может использоваться для удаления билирубина из крови новорожденных, страдающих желтухой.
Предложен новый способ применения иммобилизованного гемоглобина. Суть его состоит в том, что включенный в полиуретановую матрицу белок образует «гемогубку», способную поглощать кислород прямо из воды с эффективностью 80%. Далее кислород высвобождается из полимера под действием слабого электрического разряда или в вакууме. Предполагается, что такая система может снабжать кислородом водолазов либо работающие под водой двигатели.
Возможно, вскоре удастся создать системы из нескольких иммобилизованных ферментов. Так, если заключить в микрокапсулы три фермента — уреазу, глутаматдегидрогеназу и глюкозодегидрогеназу, то их можно будет использовать для удаления мочевины из крови больных с почечной недостаточностью.
Иммобилизованные ферменты найдут дальнейшее применение в молочной промышленности. При производстве сыра могут использоваться иммобилизованные свертывающие молоко белки ——реннин и пепсин. Для гидролиза жира в молоке можно использовать иммобилизованные липазы и эстеразы.
Разнообразные иммобилизованные ферменты со временем найдут применение и в датчиках для быстрого анализа. Сегодня в таком качестве используются лишь несколько ферментов, но когда будет решена проблема стабилизации, их число увеличится. Особенно полезными из-за их высокой стабильности могут оказаться ферменты термофилов.
Получение химических веществ из биомассы
Биотехнология на основе растительных клеток
Растения издавна являются поставщиками химических соединений для самых разных отраслей химической промышленности. Это не только такое сырье, как сахара, но и целый набор сложных вторичных метаболитов, например каучук, кокаин, вещества, использующиеся в качестве красителей, вкусовых добавок и пряностей. Получить такие вещества методом химического синтеза часто бывает невозможно из-за сложности их строения. Сегодня, воодушевленные успехами биотехнологии, ученые вновь обращаются к царству растений. Они не только пытаются отыскать пути к улучшению способов выработки уже освоенной продукции (например, аймалина и кодеина), но и разработать новые принципы биотрансформации и получить новые продукты. Нам предстоит в ближайшие годы заставить гены растений работать в бактериальных клетках; сложность этой задачи состоит в том, что мы плохо знаем, как они работают даже в собственных клетках. Кроме того, вторичные метаболиты образуются в результате многоступенчатых процессов, о регуляции которых нам тоже почти ничего не известно. Можно думать, что путем использования культур растительных тканей мы сможем разработать новые подходы к получению ценных химических продуктов, особенно лекарственных веществ, а также улучшить сорта растений. Работая с культурами тканей растений, мы сможем контролировать образование таких веществ и при этом не зависеть от капризов погоды и не думать о вредителях растений, которые так сильно влияют на образование нужных нам веществ.
Культуры растительных тканей можно получить из любого вида растений. При этом используются разнообразные среды. Познание особенностей физиологии и биохимии таких культур позволили значительно повысить их урожайность и выход биомассы. Однако многие такие культуры не могут считаться истинными автотрофами, так как для роста им необходимы внешние источники углерода (в форме глюкозы или сахарозы), азот, минеральные вещества и факторы роста. Сегодня мы умеем получать большое количество биомассы (20—30 г/л), но повысить выход интересующих нас веществ обычно удается лишь за счет снижения выхода биомассы и подавления роста. Выход различных веществ в культуре может быть в 10 раз выше, чем в случае растения, но для этого необходимо разработать новые стратегии скрининга и селекции, особенно если искомый продукт образуется в малых количествах.
С проблемами биотехнологии растительных клеток можно познакомиться на примере организации промышленного производства первого вещества, полученного из культуры тканей растения. Известно, что корни растения Lithospermum erytrorhizon -содержат шиконин и его производные. Это растение издавна .используется в Японии как лекарственное, поскольку оно обладает антибактериальной и противовоспалительной активностью. Шиконин, ярко-красное вещество, производное нафтохонина, применяли и как краситель. Для того чтобы концентрация ши- конина в корнях достигла 1—2%, возраст растения должен со- -ставлять 5——7 лет. Так как выращивать Lithospermum erythror- hizon в промышленном масштабе в Японии невозможно, его приходилось ввозить из Кореи и Китая, а поэтому стоимость чистого природного вещества составляла 4500 долл, за 1 кг. Представлялось заманчивым наладить его промышленное производство на основе культуры тканей растений. Клетки растений не выделяют вторичные продукты в среду, а запасают их в вакуолях и органеллах, что затрудняет их получение. Однако накопление шиконина облегчает отбор наиболее продуктивных линий, поскольку содержащие этот краситель клетки имеют ярко-красный цвет. Удалось выделить линию, накапливающую до 15% шиконина на сухую массу клеток. Последующая оптимизация среды позволила достичь тринадцатикратного увеличения лродуктивности. Был разработан двухступенчатый процесс культивирования, в котором на первой стадии создавались оптимальные условия для наращивания биомассы, а на втором —для образования вторичных продуктов. Клетки растят в суспензионной культуре; для этого лучше всего подходят эрлифтные ферментеры, так как в них осуществляются одновременно как интенсивное перемешивание, так и разделение клеток, а вероятность повреждения относительно хрупких клеток минимальна. Процесс производства шиконина начинается с наращивания клеток в ферментере объемом 200 л. Затем его содержимое переносят в аппарат объемом 750 л и проводят экстракцию обычными химическими методами. Выход продукта за один цикл составляет 5 кг, поэтому стоимость его гораздо ниже, чем при получении упомянутым выше способом.
Шиконин можно выделять и иным способом ——путем изменения pH среды или же добавления некоторых влияющих на проницаемость клеток веществ, например диметилсульфоксида. Такой подход может оказаться полезным при работе с иммобилизованными клетками: в этом случае благодаря селективной проницаемости можно будет постоянно удалять вторичные метаболиты из внутриклеточных вакуолей без глубокого нарушения первичного обмена веществ. Необходимо отметить, что иммобилизация, осуществленная наиболее мягким, щадящим мето-
дом, может способствовать внутриклеточному накоплению со* единения в ответ на создание микроокружения, имитирующего условия в продуктивных частях растения. Рост можно замедлить, направив питательные вещества на образование вторичных продуктов метаболизма. Так, клетки Catharanthus, иммобилизованные в альгинат-акриламидной матрице, в больших количествах выделяют в среду аймалин и серпентин. Для получения ряда алкалоидов, производных индола [аймалина, винбластина и винкристина (два последних соединения применяются при лечении рака)], можно, по-видимому, использоватк барвинок Catharanthus roseus. Необходимо отметить, что концентрация этих алкалоидов обычно крайне мала, и их приходится выделять из смеси других образуемых растением алкалоидов. Кроме того, в культурах тканей винбластин и винкри- стин не образуются, но разработан альтернативный способ их производства. Эти алкалоиды представляют собой асимметричные димеры катарантина и виндилина, причем катарантин мож- но получать методом культивирования в большом количестве с относительно небольшой примесью других алкалоидов. Димеры затем можно синтезировать химическим путем.
Культивируемые ткани растений применяются также для проведения биотрансформации. Примером такого рода может служить образование стимулирующего работу сердца дигоксина, путем 12-р-гидроксилирования дигитоксина в суспензионных, культурах или в иммобилизованных клетках наперстянки Digi^ tails lanata. На основе этих систем, а также иммобилизованных клеток моркови удалось осуществить и синтез ряда новых кар- денолидов.
Методы культивирования тканей растений применялись и для улучшения сортов сельскохозяйственных культур: повышения их устойчивости к болезням и неблагоприятным условиям среды>. увеличения содержания сахарозы и крахмала, повышения урожайности. Эти методы используют для выведения более продуктивных древесных пород—источников лигноцеллюлозы, а также растений ——продуцентов эластомеров (гваюла, молочай) или масла (масличная пальма, соя).
Таким образом, перспективы развития биотехнологии на основе растительных клеток представляются весьма многообещающими. Будет налажено производство новых лекарственных препаратов, подсластителей, средств защиты растений, веществ для косметической и парфюмерной промышленности. Возможности этой быстро развивающейся технологии будут еще более расширены в результате дальнейшей разработки способов получения гибридов путем слияния протопластов.
432 Химические вещества, получаемые из биомассы
Известно, что после окончания второй мировой войны химиче- <кая промышленность получала из природного газа и нефти разнообразные виды сырья высокой чистоты в большом количестве и по относительно стабильным ценам. Сегодня многое зв этой сфере изменилось, кроме того, за последние пятнадцать лет больших успехов достигла биотехнология. Все это побудило переоценить возможности использования биомассы для производства химических веществ. До развития нефтехимии из биомассы получали многие виды сырья для химической индустрии, например жиры и масла (для производства мыла и детергентов), метанол (путем сухой перегонки древесины) и растворители (за счет сбраживания крахмала и сахаров). Цены и доступность этого сырья (биомассы) существенно менялись. Как уже говорилось в этой главе и в гл. 5, большую роль в производстве химических веществ и полимеров, которые находят применение во многих отраслях промышленности, играет биомасса в виде сбраживаемых сахаров. Но в этом разделе мы уделим особое внимание использованию главных запасов биомассы — лигноцеллюлозы. Утилизация биомассы основана на процессе ее конверсии в сбраживаемые субстраты, которые в свою очередь служат сырьем для многих отраслей микробиологической промышленности, производящих химические вещества, горючее и продукты питания. При этом необходимо эффективно использовать все компоненты биомассы: целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин. Лигнин защищает полиглюкан от действия ферментов, так что для успешного использования полимерной целлюлозы необходимо прежде всего удалить гемицеллюлозы, далее разрушить комплекс лигнина с целлюлозой, а затем — и кристаллическую структуру самой целлюлозы. Эти задачи могут быть решены с применением разнообразных химических, физических и микробиологических методов.
Гемицеллюлозы легко удаляются путем растворения в слабой кислоте в ходе первичной обработки биомассы. При производстве глюкозы из древесины довольно успешно применяется гидролиз слабым раствором кислоты при высоких давлении и температуре. Этот способ нашел применение в ряде стран. Гораздо эффективнее гидролиз концентрированной кислотой, но для осуществления этого процесса требуются большие капиталовложения. Особенно успешно применяется плавиковая кнсло- т'а, причем безводную кислоту можно регенерировать. Лигноцеллюлозу можно также размалывать и затем подвергать радиационному облучению в больших дозах. Получаемый такими способами лигнин различается по своим свойствам. Очищенные лигнины используются при выработке клеев, смол, адгезивов.
типографской краски, для диспергирования красителей; они применяются как адсорбенты, изоляторы, используются при добыче нефти, в асфальтовых смесях и при нанесении полимеров. После удаления лигнина экстракцией растворителями получают кристаллическую целлюлозу, которая идет на нужды бумажной- промышленности. Рентабельность этого процесса определяется главным образом стоимостью регенерации растворителя. Примером одностадийного процесса, протекающего в мягких условиях, является экстракция фенолом при 100 ℃, когда лигнив и гемицеллюлозы растворяют в феноле, а высвободившуюся после фильтрования целлюлозу используют для выделки бумажной массы. По мере остывания фенольного экстракта гемицеллюлоза концентрируется главным образом в водной фазе, отделяясь от масел и лигнина, которые можно использовать для производства новых порций фенола методом гидрокрекинга. Таким образом, в отношении фенола и энергетических потребностей—это самообеспечивающийся процесс. При «паровом взрыве》 лигноцеллюлоза претерпевает превращения, в результате которых она становится более чувствительной к фермен* тативному гидролизу (как в рубце животных, так и вне его). При этом увеличивается и выход реакционноспособных лигнинов, высвобождаемых под действием слабой щелочи. При разрушении замораживанием используется жидкий аммиак. В случае умеренно твердой древесины метод автогидролиза на основе парового взрыва дает отходы, пригодные для -дальнейшей пере* работки микробами； древесина хвойных и тропических пород， более богатая лигнином, плохо поддается такой обработке.
Для ферментативного превращения целлюлозы в глюкозу необходимы дорогостоящие целлюлазы и, возможно, для их получения придется провести отбор мутантов с повышенной целлюлолитической активностью. Достигнутая на сегодня скорость гидролиза целлюлозы всё еще низка,, но такую переработку можно объединить с процессом брожения при участии дрожжей,, так что глюкоза будет и образовываться, и потребляться в одном и том же ферментере. Достоинства и недостатки такого процесса были изучены на опытных установках. Проведены исследования по клонированию генов целлюлаз и включению их в геном подходящих организмов-хозяев, которые тем самым приобретают способность к деградации содержащих целлюлозу субстратов. Такой прием позволяет осуществлять более широкомасштабное и эффективное производство химических веществ； из биомассы с помощью ферментов. Альтернативой прямой микробной конверсии является применение высокотемпературных анаэробных процессов при участии Clostridium thermocellum^ когда одновременно идут и гидролиз, й ферментация. ■
При помощи ферментов ксиланаз гемицеллюлозы могут быть разрушены с образованием пентозных сахаров. Найдены виды дрожжей, способные осуществлять ферментацию пентоз, но они чувствительны к спирту. Порог этой чувствительности может быть изменен генетическими методами; кроме того, путем клонирования гена ксилоизомеразы дрожжам Saccharomyces может быть передана способность потреблять ксилозу. Это позволит им осуществлять конверсию ксилозы (субстрата, на котором они не растут) в ксилулозу (субстрат, который они сбраживают).
Биодеградация лигнина ——это окислительный процесс, осуществляемый в первую очередь грибами. Высвобождающейся пр比 этом энергии, по-видимому, недостаточно для обеспечения роста микроорганизмов. Сегодня изучению микробиологических и биохимических аспектов деградации лигнина уделяется все больше внимания. Показано, что в эксперименте внеклеточные ферменты гриба Phanerochaete chrysosporium могут осуществлять деградацию лигниновых модельных субстратов, при этом в нро~ цессе окислительного расщепления пропильных боковых цепей лигнина участвует перекись водорода.
Обнаружено, что Acetobacter xylinum может синтезировать целлюлозу из сахаров и крахмала. Это создает предпосылки для получения чистого полимера, необходимого для производства вискозы, целлофана и других целлюлозных полимеров, вырабатываемых сегодня на основе лигноцеллюлозы, из которой удален лигнин.
Дискутируется вопрос о том, смогут ли конкурировать с таким сырьем, как целлюлоза, хитин (высокомолекулярный полимер N-ацетилглюкозамина) или же хитозан (сходный полимер- с небольшим числом ацетилированных N-групп), особенно если： иметь в виду, что запасы их ограничены. Хитин можно получать из антарктического криля (рачков), отходов при переработке* водных животных, имеющих панцирь, или же из грибного мицелия —отхода бродильной промышленности. Оба полимера могут иметь разнообразное применение: как адгезивы, коагулянты, переносчики лекарственных веществ, а также как добавки пр施 выдёлке бумаги и тканей.
Перспективы развития
В будущем влияние биотехнологии на развитие химической промышленности будет определяться возможностью объединения принципов микробиологии, биохимии и химической технологии. Основной предпосылкой использования биологического катализа в химии является способность ферментов катализировать энантиомерно однозначные, стереохимически определенные реакции 42—1344
синтеза. Сегодня многие биологические процессы имеют такие характеристики, что с экономической точки зрения они не могут конкурировать с альтернативными химическими процессами. Принято считать, что для успешного осуществления крупномасштабного биологического процесса, направленного на получение некоего химического соединения, необходимо, чтобы прибавочная стоимость продукта составляла 500—1000 долл, за тонну сверх стоимости сырья. Впрочем, все же существуют области, в которых применение биотехнологии обещает быть перспективным.
Тип реакции: прямые реакции окисления — восстановления; использование обычных ферментов для проведения нетривиальных реакций; белковая инженерия, нацеленная на изменение свойств катализатора； использование биокатализа в неводных средах.
Конфигурация реактора: оптимизация биокатализаторов методами генной инженерии; выбор термостабильных систем :или использование иммобилизованных конфигураций； разработка дешевых, эффективных и общеудобных методов повторного использования кофактора; химическая инженерия в связи с проблемами крупномасштабных биокаталитических систем (см. гл. 10).
44，Тип реакции
Реакции прямого окисления и оксигенации
Для преобразования сложных молекул в ходе органического синтеза используются оксидоредуктазы со строгой структурной, сайт- и стереоспецифичностью. В случае более широкой субстратной специфичности эти ферменты могут использоваться как катализаторы типовых реакций. В реакциях превращения ■спиртов в карбонилы находят применение нуклеотид-зависимые дегидрогеназы. Так, хорошо изучена алкогольдегидрогеназа из печени лошади: известны ее субстратная специфичность и стереохимия катализируемых реакций. Она атакует моно-, ди- и тетрациклические структуры. Построена модель ее активного центра, что позволяет прогнозировать активность этого фермен- та в отношении новых субстратов (см. разд. 4.1.1). Отметим, что ациклические вторичные спирты ——плохой субстрат для этого фермента, и если ставится задача осуществления синтеза на их основе, то целесообразно попытаться использовать другие дегидрогеназы (возможно, термофильные). Особенность оксигеназ состоит в их способности с высокой эффективностью и специфичностью включать кислород прямо в органические субстраты； проведение такого прямого окисления неактивирован-
ных органических субстратов ——вечный камень преткновения в работе химика-синтетика. Реакции этого типа весьма разнообразны: они лежат в основе превращения алканов в спирты, олефинов — в эпоксиды, сульфидов — в сульфоксиды; это реакции гидроксилирования ароматического кольца и его раскрытия, а также окислительного деметилирования. Вполне возможно, что результаты глубокого изучения механизма активации и присоединение кислорода ферментами найдут применение для создания новых химических каталитических систем. В последнее время большое внимание уделялось использованию различных микробных оксигеназных систем в стереоспецифическом эпоксиокислении олефинов, в результате которого образуются «строительные блоки» для синтеза полимеров. В микроорганизмах, окисляющих алканы и алкены, функционируют соответствующие монооксигеназы, но если исходить из нынешнего уровня технологии, то вряд ли хоть один процесс такого типа целесообразен с экономической точки зрения. Поскольку оксигеназы нестабильны, принято считать, что эти процессы основаны на биокаталитической активности целостных организмов. Предложен интересный альтернативный путь таких превращений: трехступенчатый ферментативный процесс с участием оксидаз、 (рис. 4.14). На первом этапе пиранозо-2-оксидаза из гриба-ба- зидиомицета катализирует образование перекиси водорода, используя в качестве субстрата и источника энергии глюкозу.. Далее галопероксидаза осуществляет реакцию перекиси водо* рода с алкеном и ионом какого-либо галогена с образованием алкенгалогидрина, от которого затем отщепляются атомы водорода и галогена и образуется соответствующий алкеноксид. Побочными продуктами процесса являются фруктоза и глюконовая кислота. Стереоспецифичность окислительного катализа может иепользоваться в процессе синтеза диэпоксимономеров для производства стереорегулярных полимеров. Мономерные единицы могут быть получены и путем превращений бензола под действием оксигеназ (гл. 5) или в результате двойного мо- ноокисления дифенила с образованием 4,4-дигидроксидифенил а.
Использование обычных ферментов s нетривиальныххимических реакциях
В органическом синтезе ферменты применяются пока не очень широко в основном потому, что большинство интересующих исследователей веществ не являются их природными субстратами. Приходится специально изучать субстратную специфичность ферментов и условия протекания реакций, катализируемых наиболее освоенными промышленностью ферментами, с тем чтобы выяснить возможность вовлечения этих ферментов в каталити-
CHz^^CH — СНз +。2ПропанCHz^^CH — СНз +。2ПропанNADH2 NADNADH2 NAD/°\
CHz^^CH — СНз +。2Пропан
CHz^^CH — СНз +。2Пропан
NADH2 NAD
NADH2 NAD
Например, метанмонооксигеназы, алканмонооксигеназы, алкенмонооксигеназыНапример, метанмонооксигеназы, алканмонооксигеназы, алкенмонооксигеназы石石Рис. 4.14. Осуществляемое при участии микроорганизмов образование мономеров эпоксидов. Л — прямое окисление с помощью монооксигеназ с широким спектром действия; 5 ——многоступенчатый процесс.Рис. 4.14. Осуществляемое при участии микроорганизмов образование мономеров эпоксидов. Л — прямое окисление с помощью монооксигеназ с широким спектром действия; 5 ——многоступенчатый процесс.CH?—СН — СНз + Н2О1,2-Эпоксипропан
Например, метанмонооксигеназы, алканмонооксигеназы, алкенмонооксигеназы
Например, метанмонооксигеназы, алканмонооксигеназы, алкенмонооксигеназы
石
石
Рис. 4.14. Осуществляемое при участии микроорганизмов образование мономеров эпоксидов. Л — прямое окисление с помощью монооксигеназ с широким спектром действия; 5 ——многоступенчатый процесс.
Рис. 4.14. Осуществляемое при участии микроорганизмов образование мономеров эпоксидов. Л — прямое окисление с помощью монооксигеназ с широким спектром действия; 5 ——многоступенчатый процесс.
ческие процессы, интересующие химика-синтетика. Так, промыш* ленностью производится фермент глюкозооксидаза, проявляющий высокую специфичность к донору электронов D-глюкозе. С другой стороны, специфичность его к акцепторам электронов гораздо шире, и природный акцептор, кислород, может быть заменен некоторыми синтетическими красителями. Это послужило основой для использования фермента в реакции восстановления бензохинона в гидрохинон (рис. 4.15), причем реакция шла в три раза быстрее, чем в присутствии кислорода. Фермент может восстанавливать и другие хиноны (некоторые из них применяются в биологии и медицине), а также ряд ароматических нитросоединений. Было показано, что галактозооксидаза катализирует реакцию стереоспецифического превращения алифатических спиртов (не сахаров) в альдегиды; так, глицерол превращается в S-(—)-глицеральдегид. Для разделения р-арил-
D -Глюкоза +。2D -Глюкоза +。2ОНОНD Тлюконолактон + Н20D Тлюконолактон + Н20E.FADH2 + ГлюконолактонE.FADH2 + ГлюконолактонЕ FAD + ГлюкозаЕ FAD + ГлюкозаE.FADH2 + О2E.FADH2 + О2E.FAD + Н2О2E.FAD + Н2О2
D -Глюкоза +。2
D -Глюкоза +。2
ОН
ОН
D Тлюконолактон + Н20
D Тлюконолактон + Н20
E.FADH2 + Глюконолактон
E.FADH2 + Глюконолактон
Е FAD + Глюкоза
Е FAD + Глюкоза
E.FADH2 + О2
E.FADH2 + О2
E.FAD + Н2О2
E.FAD + Н2О2
石
D-Г люкоза + БензохинонD-Г люкоза + БензохинонРис. 4.15, Использование глюкозооксидазы и неприродных акцепторов электродов при химическом синтезе органических веществ. А — обычная реакция; £ — реакция с неприродным акцептором электронов.Рис. 4.15, Использование глюкозооксидазы и неприродных акцепторов электродов при химическом синтезе органических веществ. А — обычная реакция; £ — реакция с неприродным акцептором электронов.k D -Глюконолактон + Гидрохинонk D -Глюконолактон + Гидрохинон
D-Г люкоза + Бензохинон
D-Г люкоза + Бензохинон
Рис. 4.15, Использование глюкозооксидазы и неприродных акцепторов электродов при химическом синтезе органических веществ. А — обычная реакция; £ — реакция с неприродным акцептором электронов.
Рис. 4.15, Использование глюкозооксидазы и неприродных акцепторов электродов при химическом синтезе органических веществ. А — обычная реакция; £ — реакция с неприродным акцептором электронов.
k D -Глюконолактон + Гидрохинон
k D -Глюконолактон + Гидрохинон
акролеинов может быть использована ксантиноксидаза, так как она окисляет транс-изомер в сто раз быстрее, чем цис.
Изменяя условия, в которых действует фермент, мы также можем существенно повлиять на химические особенности катализируемой реакции. Так, пероксидаза из хрена гидроксилирует ароматические соединения с небольшой специфичностью и малым выходом. Понижение температуры с 25 до 0℃ подавляет побочные реакции, в результате чего в основном гидроксилируются пара-заметценные ароматические соединения по мета-иоло- жению и vice versa. Карбоксиэстераза из печени свиньи способна осуществлять как реакцию трансэтерификации, так и гидролиз эфиров, причем последняя реакция доминирует, поскольку плохо растворимые спирты не могут эффективно конкурировать с молекулами воды. Фермент можно заставить работать по первому механизму, применив двухфазные системы, в которых фермент растворен в минимальном объеме воды, а основная органическая среда образована спиртом и эфиром.
Инженерия белка
Белковая инженерия может быть основана на химической модификации готового белка или на методах генетической инженерии, позволяющих получать модифицированные варианты природных белков.
Конструирование определенного биологического катализатора ведется с учетом как специфичности белка, так и каталитической активности металлоорганического комплекса. Вот примеры такой модификации, проведенной для получения «полу- синтетических биоорганических комплексов». Миоглобин кашалота способен связывать кислород, но не обладает биокатали- тической активностью. В результате объединения этой биомолекулы с тремя электрон-переносящими комплексами, содержащими рутений, которые связываются с остатками гистидина на поверхности молекул белка, образуется комплекс, способный восстанавливать кислород при одновременном окислении ряда органических субстратов, например аскорбата, со скоростью- почти такой же, как для природной аскорбатоксидазы. В принципе белки можно модифицировать и другими способами. Рассмотрим, например, папаин. Он относится к числу хорошо изученных протеолитических ферментов, для которого определена трехмерная структура. Поблизости от остатка цистеина-25 на поверхности белковой молекулы располагается протяженный желобок, в котором протекает реакция протеолиза. Этот участок может быть алкилирован производным флавина без изменения доступности участка связывания потенциальных субстратов. Такие модифицированные флавопапаины использовались для окисления Ы-алкил-1,4-дигидроникотинамидов, и каталитическая активность некоторых из этих модифицированных белков была существенно выше, чем у природных флавопротеин-NADH- дегидрогеназ. Таким образом удалось создать очень эффективный полусинтетический фермент. Использование флавинов с высокоактивными, находящимися в определенном положении элек* трон-оттягивающими заместителями, возможно, позволит разработать эффективные катализаторы для восстановления никотинамида.
Крупные успехи, достигнутые за последнее время в химическом синтезе ДНК, открыли перед белковой инженерией принципиально новые возможности: конструирование уникальных,, не встречающихся в природе белков. Для этого необходимо и дальнейшее развитие технологии, так чтобы изменение генов методами генетической инженерии приводило к предсказуемым изменениям белков, к улучшению вполне определенных функциональных их характеристик: числа оборотов, Км для конкретного субстрата, термостабильности, температурного оптимума»
стабильности и активности в неводных растворителях, субстратной и реакционной специфичности, потребности в кофакторах, оптимуме pH, устойчивости к протеазам, аллостерической регуляции, молекулярной массы и субъединичного строения. Обычно такого улучшения достигали с помощью мутагенеза и отбора, а в последнее время — путем химической модификации и иммобилизации. Для успешного конструирования конкретного типа молекул белка необходимо выявить ряд основополагающих закономерностей, связывающих структурные особенности белков и их желаемые свойства. Так, зная точную кристаллическую структуру молекулы изучаемого белка, мы можем идентифицировать те ее участки, которые следует направленно модифицировать для увеличения его каталитической активности. Такая модификация может состоять в изменении аминокислотной последовательности белка.
Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы — субтилизина они применили метод химической модификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы химической модификации не только жестки и неспецифичны; они плохи еще и тем, что с их помощью невозможно вызвать множественные желаемые изменения, особенно если модифицируемые аминокислотные остатки погружены в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия, основанная на генетической инженерии. Сегодня она осуществля- 'ется при помощи двух хорошо освоенных методов (гл. 7). Так, <айт-специфический мутагенез осуществляется следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подходящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти ——пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов.
Тирозил-тРНК—синтетаза катализирует реакцию аминоацилирования тирозиновой тРНК, которая включает активирование тирозина с помощью АТР с образованием тирозил аденилата. Ген этого фермента, выделенный из Bacillus stearothermophilus9
был встроен в бактериофаг М13. Затем каталитические свойства фермента, особенно его способность связывать субстрат, были изменены путем сайт-специфической модификации. Так, треонин-51 был заменен на аланин. Это привело к двукратному увеличению связывания субстрата, видимо, из-за невозможности образования водородной связи между этим остатком и тирозил- аденилатом. При замене аланина пролином нарушается конфигурация молекулы фермента, но способность к связыванию субстрата увеличивается в сто раз, так как облегчается его взаимодействие с гистидином-48. Сходные сайт-специфичные изменения были получены в р-лактамазе, и обычно они сопровождались инактивацией фермента. Замена серина-70 на цистеин приводиг к образованию р-тиоллактамазы, константа связывания у которой не отличается от таковой для природного фермента, но активность по отношению к пенициллину составляет всего 1—2%.. Тем не менее активность этого мутантного фермента в отношении некоторых активированных цефалоспоринов не меньше исходной активности или даже превышает ее; эти белки такж& более устойчивы к действию протеаз.
Мутации, вызываемые путем сайт-специфичного воздействия^ используют сегодня для проверки адекватности результатов структурных исследований. В некоторых случаях с их помощыо удалось показать, что структурная стабильность белка и его каталитическая активность могут быть разобщены. Накопив достаточное количество информации о взаимосвязи между стабильностью структуры белка и его функцией, мы, возможно, сумеем осуществлять тонкую регуляцию активности биологических катализаторов и создавать полностью синтетические их аналоги. Недавно появилась работа, в которой сообщалось а клонировании первого синтетического гена фермента, кодирующего активный .фрагмент молекулы рибонуклеазы.
Биологический катализ 6 неводных средах
Известно, что биологический катализ осуществляется в природе в водной среде, но сфера применения ферментов в биотехнологии не может ограничиваться только этими условиями. Нередко нужно подвергнуть изменению структуры липофильных или водонерастворимых веществ, например стероидов или углеводородов. Применение органических растворителей может не только увеличить каталитическую активность определенного фермента путем повышения доступности субстрата, но и сместить равновесие соответствующей химической реакции.
Главным фактором здесь является стабильность биокатализатора в органическом растворителе. Активность ферментов во многих не смешивающихся с водой органических растворителях.
нередко сильно падает. Так, в качестве катализаторов реакции дегидрирования стероидов в среде бензола и гептана использовали разные виды Nocardia. Для увеличения их стабильности применяли иммобилизацию; при этом нужно было учитывать гидрофобность носителя. Бактерии, заключенные в гидрофобные гели, обладали большей каталитической активностью, чем находящиеся в гидрофильном окружении, что определялось характером распределения субстрата между гелем и окружающим его растворителем. Сегодня мы умеем конструировать носители с нужной степенью гидрофобности: для этого используются фо- тосшиваемые преполимеры смол и уретановые преполимеры. Иммобилизация фермента на поверхности или внутри твердого носителя повышает его устойчивость к действию органических растворителей, препятствуя разрушению третичной структуры белка в таких средах. Многие ферменты, катализирующие реакции превращения липофильных субстратов in vivo, локализуются в мембранах, и иммобилизация как бы имитирует их стабилизированное связанное состояние в мембранах. Так, для синтеза этилового эфира N-ацетил-Ь-триптофана из этанола и К-ацетил-Ь-триптофана использовали химотрипсин в хлороформе. Липаза, иммобилизованная на гидрофобном полимере, катализирует в н-гексане реакцию переэтерификации. Таким путем из оливкового масла и насыщенных высших жирных кислот получают заменитель кокосового масла.
Комбинируя разные описанные в этой главе способы, мы •сможем существенно расширить границы применения биологических катализаторов в производстве и анализе химических веществ, применяемых в промышленности.
Конфигурация реактора 7T
Оптимизация биокатализатора
Особенности конфигурации биореактора, используемого в биотехнологическом процессе, определяются биохимическими и биофизическими свойствами избранного биокатализатора. От его природы зависит также и способ дальнейшей переработки полученного продукта. В этой связи при разработке процесса особое значение приобретает улучшение свойств катализатора методами генетической инженерии, например изменения тех физических параметров, которые определяют его способность ра- ботать в определенной среде, специфичность и производительность, а также локализацию синтезируемого продукта (вспомним о внеклеточном образовании некоторых веществ клетками растений). Более подробно роль генетических методов в решении задач биотехнологии разбирается в гл. 7.
Регулировать особенности протекания процесса можно также путем разумного выбора катализатора. Сегодня большие- усилия затрачиваются на выделение, изучение свойств и способов использования термофильных микроорганизмов и их ферментов во многих уже применяющихся в промышленности био- катализируемых реакциях. Получаемые при этом преимущества определяются увеличением стабильности белков и их более- высокой каталитической активностью. Модернизировать процессы можно и путем применения организмов, обитающих в экстремальных условиях (например, при низких pH или высоких концентрациях солей). Так, для производства органических кислот имеет смысл попытаться использовать ацидофильные галофилы; галофильные виды уже сейчас применяются при выработке полиолов (образование глицерола при участии Duniella).
Применение иммобилизованных биокатализаторов как в составе целых организмов, так и в виде изолированных ферментов будет играть все большую роль в разработке и проведении биотехнологических процессов, поскольку это облегчает работу с ними, повторное их использование и отделение продукта реакции. Сама иммобилизация тоже может благоприятно сказываться на стабильности и рабочих характеристиках катализатора, что в конечном счете может создать основу для кардинального пересмотра экономической конкурентоспособности определенного типа биопроизводства.
Повторное использование кофактора
Для проявления каталитической активности 30% известных ферментов нужен один из пяти кофакторов (NAD, NADP, АТРУ FAD либо СоА). Само применение этих ферментов в биокатализе будет определяться тем, удастся ли повторно использовать эти дорогие вещества либо вообще обойтись без них. Существует три подхода к решению этой проблемы: ферментативный,, химический и электрохимический.
Ферментативную регенерацию кофакторов, например, можно осуществить при участии ряда имеющихся в продаже ферментов, которые в качестве восстановителя используют дешевые субстраты. В этом направлении была проведена большая работа по использованию формиатдегидрогеназы ——фермента, который катализирует восстановление NADH при превращении формиата в углекислый газ. Так как продукт реакции является газом,, он легко удаляется из реакционной смеси и не мешает выделению из нее продукта реакции. Основная трудность здесь — потеря самого кофактора из реакционной смеси. Предпринимались попытки повторного использования регенерированного кофактора в такой системе путем присоединения его к более крупным
Химия 〃 технолог
:молекулам с сохранением его каталитической активности. Такой комплекс можно удерживать в реакторе при помощи ультра- 4)ильтрующей или гидрофобной жидкой мембраны. NAD включали в полиэтиленгликоль (с мол. массой 10 000——40 000) и использовали в мембранном реакторе. К сожалению, каталитическая активность таких иммобилизованных кофакторов обычно сильно падает и составляет всего несколько процентов от их активности в свободной форме. Коферменты и соответствующие регенерирующие ферменты стабилизировали также путем иммобилизации в структуре гелей.
Химическое окисление NADH можно осуществить в реакции присоединения к нему кислорода с использованием акцепторов электронов вроде PMS/DCPIP или FMN.
Несомненный интерес представляет и электрохимическое окисление NAD(P)H и восстановление NAD(Р)+. Для окисления восстановленных коферментов был предложен ряд электродов. Осуществить стереоспецифическое электрохимическое восстановление оказалось гораздо сложнее. Недавно были разработаны соответствующие процессы с применением электродов с ферментами, которые участвуют в реакции стереоспецифического восстановления за счет электрохимического восстановления редокс-центров ферментов. Это удалось осуществить благодаря разработке методов переноса электронов между электродами и этими редокс-центрами. В результате в некоторых случаях каталитический процесс протекает в отсутствие кофактора. Такое замещение кофактора модифицированным электродом, видимо, легче осуществить для реакций восстановления, чем окнсленн兄.
Будущий вклад биотехнологии е химическую промышленность
Источником сырья для различных отраслей химической промышленности в обозримом будущем будут нефть и ее производные. Получаемые из них с малыми затратами продукты вряд ли потребуется производить при помощи какой-то другой технологии. Факторами, которые могут оказать сильное влияние на внедрение биотехнологии в эту область, являются истощение источников сырья, повышение стоимости энергии и постоянная необходимость эффективной переработки отходов. Уменьшение доступных источников горючего приведет к тому, что все более широко будут использоваться ресурсы биомассы. Бродильные производства и технологии на основе ферментов будут и далее дополнять спектр обычных химических технологий. Что же касается применения биотехнологии в крупномасштабных производствах химических веществ или полимеров, то перспективы здесь весьма
ограничены. С экономической точки зрения наиболее целесооб-^ разным представляется использование специфических преимуществ биокаталитических процессов в малообъемных производствах редких химических веществ с высокой прибавочной стой* мостью.
ЛИТЕРАТУРА
Современная химическая биотехнология
Atkinson В., Mavituna 尸.(1983). Biochemical and Bioengineering Handbook^ Nature Press, UK.
Cain R. B. (1980). Transformation of aromatic hydrocarbons. In: Hydrocarbons in Biotechnology (eds. Harrison D. E. F., Higgins I. J. and Watkinson R.)> pp. 99—133, Heyden, London.
Dellweg H. (ed.) (1983). Biotechnology, Vol. 3： Biomass, Microorganisms for Special Applications, Microbial Products 1, Energy from Renewable Sources* Verlag Chemie, Weinheim.
Evelegh D E. (1981). The microbiological production of industrial chemicals^. Scient. Am., 245, 154—178.
Godfrey T., Reichelt /. (1983). Industrial Enzymology: The Application of Enzymes in Industry, The Nature Press, Macmillan, UK.
Kieslich K., Sebek О. K. (1979). Microbial transformation of steroids. In: Annual Reports on Fermentation Processes, Vol. 3 (ed. Perlman D.), pp. 267—297〉 Academic Press, New York.
Peppier H. /., Perlman D. (eds.) (1979). Microbial Technology, Vol. 1 and 2: Microbial Processes, Academic Press, London.
Rose A. H. (ed.) (1978—1980). Economic Microbiology Series, Vol. 2: Primary Products of Metabolism, Vol. 3: Secondary Products of Metabolism, Vol. 5二 Microbial Enzymes and Bioconversions, Academic Press, London.
Schindler /., Schmid R. D. (1982). Fragrance or aroma chemicals: microbial synthesis and enzymatic transformation — a review, Process Biochem.. 17(5) 2—8.
Scott C D (ed.) (1983). Fifth Symposium on Biotechnology for Fuels and Che- micals, Biotechnology and Bioengineering Symposium Number 13, John Wiley and Sons, New York.
Sebeh О. K, Kieslich K. (1977). Microbial transformation of organic compounds: alkanes, alicyclics, terpenes and alkaloids. In: Annual Reports on Fermentation Processes, Vol. I (ed. Perlman D.), pp. 267—297, Academic Press, New York.
Smith J. E, Berry D R., Kfisiiansen B, (eds.) (1983). The Filamentous Fumgi: Volume IV, Fungal Technology, Edward Arnold, London.
Получение химических веществ из биомассы
Curtin М. Е. (1983). Harvesting profitable products from plant tissue culture Biotechnology, 1 (8), 649—657.”
Eveleigh D E. (1983). Biological routes for cellulose utilisation. In: Biotech'83 Proceedings of the International Conference on the Commercial Applications and Implications of Biotechnology, pp. 539—548, Online Conferences Ltd Midlesex, UK.
尸〃叱 Z. E„ Lipinsky £. S. (1983). Production of chemicals via advanced biotech- nological processes. In： Biotech'83, Proceedings of the International Conference on the Commercial Applications and Implications of Biotechnology pp. 523—538, Online Conferences Ltd., Middlesex, UK.
F唾er 耳.*• (1981). Plant cell biotechnology to produce desirable substances Chem. Ind., 7, 229—233.*
Jones L. Н. (1983). Plant cell cloning and culture products. In: Biotechnology (eds. Phelps C. F. and Claire P. H.), pp. 221—232, Biochemical Society Symposium Number 48, Biochemical Society, London.
Staba E. Л (ed.) (1980). Plant Tissue Culture as a Source of Biochemicals, CRC Press, Boca Raton, Florida.
Перспективы развития
Brown G. A, Manecke G” Wingard 乙 В. (eds.) (1978). Enzyme Engineering,. Vol. 4, Plenum Press, New York.
Klibanov A. M. (1983). Unconventional catalytic properties of conventional enzymes: applications in organic chemistry, Basic Life Sci., 25, 497—518.
Maugh T.方.(1984). Semisynthetic enzymes are new catalysts, Science, 223, 154—156.
Maugh T. H. (1984). Need a catalist? Design an enzyme, Science, 223, 269— 271.
Neidleman S. Geigert J・(1983). Biological galogenation and epoxidation. In: Biotechnology (eds. Phelps C. F. and Clarke P. H.), pp. 39—52, Biochemical' Society Symposium Number 48, Biochemical Society, London.
Omata T., Iida T.f Tanaka A., Fukui 5. (1979), Transformation of steroids by gel- entrapped Nocardia rhodochrous cells in organic solvents, Eur. J. appl. Microbiol. Biotechnol., 8, 143—155.
Pye E. K., Weetail H. H. (eds.) (1978). Enzyme Engineering, Vol. 3, Plenum Press, New York.
Ulmer К. M. (1983). Protein engineering, Science, 219, 666—671.
Wingard L. B., Berezin /. У., Klyosou A. A. (eds.) (1980). Enzyme Engineerings Future Directions, Plenum Press, New York.
Wiseman A. (ed.) (1977—1983). Topics in Enzyme and Fermentation Biotechnology, Vols. 1—7, Fillis Horwood, Chichester.
Материалы и биотехнология
К. Брайерли, Д. Келли, К. Сил, Д. Бест
Введение
-Вероятно, из всех аспектов микробиологической технологии меньше всего рекламируется и больше всего недооценивается применение микроорганизмов для экстракции металлов из минералов, для концентрирования и извлечения драгоценных металлов из растворов, а также для получения новых промыш- -ленных биоматериалов.
Еще за 1000 лет до нашей эры римляне, финикийцы и люди .других ранних цивилизаций извлекали медь из рудничных вод или вод, просочившихся сквозь рудные тела. В XVII в. валлийцы в Англии (графство Уэльс) и в XVIII в. испанцы на месторождении Рио-Тинто применяли такой процесс «выщелачивания» для получения меди из содержащих ее минералов. Эти .древние горняки и не подозревали, что в подобных процессах экстракции металлов активную роль играли бактерии. В настоящее время этот процесс, известный как бактериальное вы- “щелачивание, применяется в широких масштабах во всем мире Л л я извлечения меди из бедных руд, содержащих этот и другие ценные металлы в незначительных количествах. Биологическое ■выщелачивание применяется также (правда, менее широко) для высвобождения урана. Проведены многочисленные исследования природы организмов, участвующих в процессах выщелачивания металлов, их биохимических свойств и возможностей применения в данной области. Результаты этих исследований показывают, в частности, что бактериальное выщелачивание может ^широко использоваться в горнодобывающей промышленности и, по всей видимости, сможет полностью удовлетворить потребности в энергосберегающих, не оказывающих вредного влияния на -окружающую среду технологиях.
Несколько менее известно, но столь же важно использование микроорганизмов в горнодобывающей промышленности для извлечения металлов из растворов. Некоторые прогрессивные технологии уже включают биологические процессы для получения шеталлов в растворенном состоянии или в виде твердых частиц й1з моечных вод, остающихся от переработки руд. О способности
микроорганизмов накапливать металлы известно уже давно,, и энтузиасты издавна мечтали об использовании микробов для получения ценных металлов из морской воды. Проведенные исследования рассеяли некоторые надежды и в значительной степени определили области применения микроорганизмов. Извлечение металлов при их участии остается многообещающим способом дешевой обработки загрязненных металлами промыш^ ленных стоков, а также экономичного получения ценных металлов.
Давно известно и о способности микроорганизмов синтезировать полимерные соединения; в самом деле, большинства компонентов клетки — это полимеры. Однако на сегодняшний день менее 1 % всего количества полимерных материалов производит микробиологическая промышленность; остальные 99% получают из нефти. Пока биотехнология не оказала решающега влияния на технологию полимеров. Возможно, в будущем с помощью микроорганизмов удастся создавать новые материалы специального назначения.
Биоповреждение обычно не рассматривают как один из аспектов биотехнологии, но тем не менее оно имеет огромное экономическое значение. Микробы способны разрушать материалы, находящиеся в земле и под водой; они размножаются в промышленных водах, нефтепродуктах и эмульсиях, вызывая коррозию промышленных сооружений или образование слизи,, а также повреждают топливные баки. Последнее создает особенно серьезные проблемы в авиации и заставляет проводить- дорогостоящие контрольные измерения.
Цель этой главы состоит в том, чтобы рассмотреть роль микроорганизмов в коррозии, в извлечении металлов и получении биоматериалов. Описаны отдельные микроорганизмы и их использование в современной технологии, а также их значение- для дальнейшего развития технологии на нашей планете.
Микробное выщелачивание
Методы извлечения меди из пород, содержащих минералы, путем обработки их кислыми растворами используются уже много- веков. Однако лишь в 50-е и 60-е гг. нашего столетия выяснилось, что в получении металлов из минералов решающую роль играют бактерии. В 1947 г. Кол мер и Хинкл выделили из шахтных дренажных вод бактерию Tiobacillus ferrooxydans. Этот организм окислял двухвалентное железо и восстанавливал се- русодержащие соединения, а также, возможно, и некоторые^ металлы. Вскоре оказалось, что он участвует и в переводе медш из рудных минералов в раствор.
Сейчас известны и другие микроорганизмы, активно уиаст* вующиё в извлечении металлов из минералов; большинство минералов сульфидной природы разрушается именно этим путем. Хотя технология бактериального выщелачивания используется в основном для извлечения меди и урана, она находит достаточно широкое применение и в переработке минерального сырья.
В данном разделе рассматриваются организмы, участвующие в выщелачивании металлов, и механизмы их. действия. Описаны сферы применения микробного выщелачивания в настоящем и возможное будущее биоэкстрактивной металлургии.
Выщелачивающие микроорганизмы
В бактериальном выщелачивании участвуют следующие микроорганизмы.
Thiobacillus ferrooxidans
Этот наиболее изученный из всех выщелачивающих организмов почти всегда можно выделить из среды, в которой происходит окисление железа или минералов. Т. ferrooxidans, вероятно, представлен в различных природных средах штаммами с температурными оптимумами от 10 до 30 °C. Максимальная .переносимая температура равна 37℃ (или ниже).
Leptospirillum ferrooxidans
Этот организм, который, видимо, лучше называть Ferrovibrio, впервые был выделен в Армении, однако теперь известно, что юн встречается во многих местах, где осуществляется выщелачивание. Он может расти при 40 ℃ и pH 1,2 на пирите (FeSs) и, по-видимому, окисляет только железо, не затрагивая серу. Этим он отличается от Т. ferrooxidans, который окисляет серу пак же хорошо, как железо.
Thiobacillus thiooxidans, Т. acidophilus и Т. organoparus
Эти ацидофильные организмы окисляют только серу и ее соединения, а также действуют на серу пирита совместно с Lep・ tospirillium ferrooxidans. Они могут участвовать в окислении серы, образующейся в результате химической реакции между зонами трехвалентного железа и сульфидами меди. Т. thiooxi- dans изменяет pH среды, в которой он растет, до значительно меньших величин (〜0,65), чем те, которые переносит хорошо ■охарактеризованный штамм Т. ferrooxidans, и способен таким
образом повышать эффективность прямого кислотозависимого выщелачивания сульфидов (например, PbS, CdS, NiS) в присутствии элементарной серы.
Умеренные термофилы
Обнаружены различные термофильные, окисляющие пирит, железо и серу бактерии, которые лучше всего растут при температурах около 50 ℃. Эта группа умеренных термофилов включает факультативных гетеротрофов, хемолитотрофных гетеротрофов и автотрофов, причем обнаруживаются все новые и но-
Рис. 5.1. Микрофотография Sulfolobus brierleyi, растущего на элементарной сере при 60 ℃. Получена с помощью сканирующего электронного микроскопа (увеличение 10 000).
вые организмы этого класса. Данные организмы могут играть существенную роль в выщелачивании саморазогревающихся минералов и угольных отвалов.
Крайние ацидотермофилы
Лучше всего изучен род Sulfolobus (рис. 5.1). Все его виды окисляют серу, а некоторые (например, S. brierleyi) способны к окислению железа и таких минералов, как халькопирит. Эти
13-1344
организмы переносят температуру до 85 ℃ и выделены в основном из горячих источников. Впрочем, недавно из дренажных вод угольных отвалов был получен организм, сходный с Sulfo- lobus. Род Sulfolobus относится к Archebacteriaceae — отдельной группе бактерий, которую предлагают считать третьим царством живых организмов. Представители этого рода, вероятно, играют важную роль в выщелачивании минералов при повышенных температурах.
Все упомянутые выщелачивающие бактерии переводят металлы в раствор различными путями. Соответствующие методьр были названы «прямыми» и «непрямыми». Окислительным процессом, 《прям。》 катализируемым бактериями, является окис* ление железа,
4FeSO4 + О2 + 2Н2 SO4 —> 2Fe2 (SO4)3 +2HaO,(1}
и окисление серы,
S8 + 12О2 + 8Н2 О ——> 8H2 SO4.(2》
Ряд минералов непосредственно окисляется некоторыми выщелачивающими организмами. Примерами такого рода могут быть окисление пирита,
4FeS2 + 15О2 + 2Н2О —> 2Fe2 (SO4)3 + 2Н2 SO4,(3>
и сфалерита,
ZnS + 2О2 ——> ZnSO4(4>
Ион трехвалентного железа служит сильным окисляющим агентом, переводящим в раствор многие минералы, например халькоцит,
Cu2 S + 2Fe2 (SO4)3 —> 2CuSO4 + 4FeSO4 + S°,(5>
и уранинит,
UO2 + Fe2 (SO4)3 ——> UO2 SO4 + 2FeSO4.(6》
Выщелачивание, происходящее при участии иона трехвалентного железа, который образуется в результате жизнедеятельности бактерий, называют «непрямой» экстракцией. Нередко в ходе этой химической реакции образуется элементная сера [реакция (5)], которая может непосредственно окисляться бактериями до серной кислоты [реакция (2)].
Промышленное применение биоэкстрактивной металлургии
В настоящее время бактериальное выщелачивание, известное- также как биогидрометаллургия или биоэкстрактивная металлургия, применяется в промышленных масштабах для перевода в растворимую форму меди и урана.
Выщелачивание медных отвалов
Методы, использовавшиеся в XVIII в. на месторождении Рио- Тинто (Испания) для извлечения меди из груд выветрившейся породы, в основном сохранились до наших дней. В нынешнем ■столетии выщелачивание отвалов, как называют этот процесс, развивалось в США; оно используется для получения меди из бедных руд [содержащих менее 0,4% меди (по весу)], а также из отвального материала с очень низким содержанием меди. Такие отвальные материалы накапливаются при крупномасштабной открытой разработке руды. Бедную руду или отвальную породу перевозят из карьера куда-либо поблизости (обычно в долину), где естественный уклон дает возможность собирать используемые растворы. Во избежание загрязнения под- лочвенных и поверхностных вод выбирают непроницаемые для воды участки. Отвалы, образующиеся в результате работы землеройной техники, имеют огромные размеры, достигая в высоту 300 и более метров. Самым большим в мире отвалом является Бингхэм-Каньон («Кеннекотт Коппер Корпорэйшн»), Он вмещает около 3,6-1012 кг породы.
Для начала процесса выщелачивания отвал смачивают водой, подкисленной серной кислотой до pH 1,5—3,0, путем ее распыления, полива или инъекции через трубы, помещенные вертикально внутри породы. Этот кислый раствор, или «выщелачиватель», просачивается сквозь бедную руду или отвальные материалы. Он содержит кислород и углекислый газ и создает благоприятную среду для размножения ацидофильных гиоба- цилл, широко распространенных в сульфидных рудах. В некоторых случаях содержание Thiobacillus ferrooxidans превышает 106 клеток на 1 кг породы и на 1 мл выщелачивающего раствора. Этот организм активно окисляет растворимые ионы двух- валентного железа и воздействует на серу- и железосодержащие минералы. Активность Т. ferrooxidans необходима для оптимального выщелачивания. При pH ниже 3,5 окисление железа перестает зависеть от pH:
d (Fe+2)“ J-=K‘ (Fe+2) (O2),
где Xz= 1,0-10-7 атм-^мин*-1 при 25 ℃. Следовательно, при кислых значениях pH, необходимых для выщелачивания отвалов, и в отсутствие 7. ferrooxidans железо оставалось бы в двухвалентном состоянии и экстракция меди из сульфидных минералов -была бы минимальной. Т. ferrooxidans ускоряет окисление двухвалентного железа в 106 раз. При окислении медно-сульфидных минералов нередко образуется элементарная сера. Эта сера маскирует частицы минералов, ограничивая воздействие на
аз*
них со стороны трехвалентного железа. Т. ferrooxidans, присутствующая в количестве 103—105 клеток на 1 г породы и на 1 мл выщелачивающего раствора, окисляет некоторые растворимые- соединения серы и элементарную серу. Разрушение серы этим организмом приводит к удалению маскирующего слоя серн尸 окружающего некоторые частицы минералов, и усиливает процесс выщелачивания. Таким путем Thiobacillus thiooxidans и Thiobacillus ferrooxidans совместно разлагают минералы сульфидной природы и являются мощным окислителем для растворения медно-сульфидных минералов и образования серной кислоты. Эта последняя создает благоприятную среду для деятельности микроорганизмов и удерживает ионы двухвалентной мед圧 в растворе.
Поскольку при выщелачивании отвалов в среде развиваются природные тиобациллы, никакого засева не проводят. Проявлению необходимой активности микроорганизмов способствуют обеспечение кислотности отвала и обилие кислорода. Последнее достигается путем аэрирования выщелачивающего раствора; циркуляции воздуха внутри породы способствует и особая форма отвалов (с гребнями или ребрами). Иногда вертикальна внутри отвала помещают трубы с отверстиями и через них продувают сжатый воздух, способствующий протеканию биологических и химических реакций.
В выщелачиваемых отвалах происходит также много важных небиологических реакций. Самой ценной с экономической точки зрения является окисление медно-сульфидных минералов образующимися биологическим путем ионами трехвалентного железа [например, реакция (5)]. К другим небиологическим реакциям, протекающим в выщелачиваемых отвалах, относятся гидролиз солей трехвалентного железа с последующим осаждением основного сульфата трехвалентного железа,
Fe2 (SO4)3 + 2Н2О —> 2Fe (ОН) (SO4) + Н2 SO4, (7) растворение карбонатных минералов,
СаСО3 + Н2 SO4 + Н2О —> CaSO4 + 2Н2О + СО2, (8) и твердофазные превращения, приводящие к образованию вторичных минералов. Все эти реакции стабилизируют pH отвальных пород и выщелачивающего раствора на нужном уровне.
Выщелачиваемые отвалы имеют значительные размеры. Это создает много инженерных проблем и может препятствовать деятельности бактерий и протеканию важных химических реакций. К таким проблемам относятся, во-первых, уплотнение отвалов и образование осадков, которые затрудняют взаимодействие раствора с минералами, во-вторых, попадание внутрь отвалов крупных минерализованных глыб, мало подверженных
разрушению, и в-третьих, повышение температуры отвалов за счет протекания в них экзотермических реакций. Так, в Бингхэм-Каньоне было отмечено повышение температуры выше 80 ℃. При таких температурах тиобациллы инактивируются, но может повышаться активность термофильных выщелачивающих бактерий. Из отвалов были выделены ацидотермофильные штаммы TH, близкие к Thiobacillus, однако крайне термофильные штаммы Sulfolobus не обнаружены. Правда, это не исключает их существования в подобных средах.
Из выщелачиваемых отвалов вытекают растворы, содержащие 0,75—2,2 г меди в 1 л. Эти растворы направляют в отстойники; медь из них получают путем осаждения с использованием железа или экстракцией растворителями. В первом случае создают условия, при которых растворы контактируют с железом и протекает следующая реакция:
CuSO4 + Fe° Cu° + FeSO4. (9)
«Отработанные» выщелачивающие растворы вновь поступают в отвал. В последние годы для получения меди из раствора начали применять экстракцию растворителями. Ионы меди из водной фазы экстрагируют органическими жидкостями, только частично растворимыми в воде. Затем медь извлекают из органического растворителя.
Выщелачивание урана
Для экстракции урана бактерии применяются реже. Для того чтобы при выщелачивании урана можно было использовать микробиологическую технологию, руда и/или связанные с ней породы должны быть богаты сульфидными минералами и не слишком интенсивно поглощать кислоту. Бактериальное выщелачивание урана применяли в восточных районах Канады для извлечения остаточного урана на уже выработанных площадях, а также из отвалов. В первом случае стенки и крыши забоев (при подземной выработке) промывали обычной или подкисленной водой. Для роста бактерий достаточно 3—4 месяцев, за это время Т. ferrooxidans окисляет железо до трехвалентного состояния. Затем трехвалентное железо окисляет восстановленный уран до растворимого окисленного состояния в соответствии с реакцией (6). По прошествии этого периода забои снова промывают. Промывные воды, содержащие уран, собирают и извлекают из них уран с помощью ионного обмена либо экстрагируют растворителями.
Бактериальное выщелачивание применялось в Канаде и в качестве первичного средства для получения урана. Рудное тело разрушали взрывом и осуществляли выщелачивание in situ.
Как и при выщелачивании меди в отвалах, при выщелачивании in situ часто приходится осуществлять инженерные мероприятия, что отрицательно сказывается на активности бактерий.
3. Возможности применения бактериального выщелачивания
Инженерные проблемы,
Из-за огромных масштабов операций по выщелачиванию отвалов активность бактерий, развивающуюся в ходе процесса, можно контролировать только в ограниченной степени. Для наиболее эффективного использования бактериального выщелачивания необходимо создавать такие инженерные схемы, которые позволяли бы осуществлять определенный контроль за активностью микробов. Помимо выщелачивания отвалов в горнорудной промышленности существуют и другие средне- и высокотехнологичные процедуры, при которых для экстракции металлов используются гидрометаллургические процессы (реакции, происходящие в воде). Эти технологии (выщелачивание in situ, чановое выщелачивание, кучное выщелачивание) применимы и к процессам бактериальной экстракции металлов.
Выщелачивание in situ с успехом используют для извлечения урана из песчаниковых формаций с низким содержанием рудного минерала. Выщелачивающие растворы вводят в неразрушенное урансодержащее рудное тело через инъекционную скважину. Эти растворы, содержащие химический окислитель (например, перекись водорода), взаимодействуют с минералом, окисляя уран и переводя его в растворимую форму. Далее урансодержащие растворы выкачивают из минерализованной зоны через выходные скважины (рис. 5.2). На западе США и в южном Техасе, где широко практикуется выщелачивание in situ, применяют карбонатные растворы с нейтральным pH. По всей видимости, бактерии в этом процессе экстракции не участвуют. Технология in situ находит применение не только при выщелачивании урана. Тот же подход возможен и при экстракции других металлов, присутствующих в низких концентрациях в глубоко залегающих месторождениях. Бактерии могут использоваться для выщелачивания сульфидных минералов или для разрушения жильных минералов при извлечении металлов с помощью других гидрометаллургических технологий. Большинство исследований по использованию бактерий для выщелачивания in situ было проведено в лаборатории при высоких давлении и температуре. Эти исследования показали, что гидростатическое давление в 30,4 МПа (эквивалентное давлению на глубине в 3000 м) не сказывается на жизнедеятельности
Производственная скважинаПроизводственная скважинаПроизводственная скважинаПроизводственная скважинаРис. 5.2. Схематическое изображение процесса выщелачивания in situ. А. Контрольные скважины для отбора проб с целью наблюдения за передвижением выщелачивающего раствора из рудного тела. 5. При обычно используемой для выщелачивания in situ схеме «пяти точек» объем выщелачивающего раствора, выкачиваемого из четырех рабочих скважин, больше, чем объем вводимого раствора. Это сводит к минимуму возможность загрязнения подпочвенных вод.Рис. 5.2. Схематическое изображение процесса выщелачивания in situ. А. Контрольные скважины для отбора проб с целью наблюдения за передвижением выщелачивающего раствора из рудного тела. 5. При обычно используемой для выщелачивания in situ схеме «пяти точек» объем выщелачивающего раствора, выкачиваемого из четырех рабочих скважин, больше, чем объем вводимого раствора. Это сводит к минимуму возможность загрязнения подпочвенных вод.
Производственная скважина
Производственная скважина
Производственная скважина
Производственная скважина
Рис. 5.2. Схематическое изображение процесса выщелачивания in situ. А. Контрольные скважины для отбора проб с целью наблюдения за передвижением выщелачивающего раствора из рудного тела. 5. При обычно используемой для выщелачивания in situ схеме «пяти точек» объем выщелачивающего раствора, выкачиваемого из четырех рабочих скважин, больше, чем объем вводимого раствора. Это сводит к минимуму возможность загрязнения подпочвенных вод.
Рис. 5.2. Схематическое изображение процесса выщелачивания in situ. А. Контрольные скважины для отбора проб с целью наблюдения за передвижением выщелачивающего раствора из рудного тела. 5. При обычно используемой для выщелачивания in situ схеме «пяти точек» объем выщелачивающего раствора, выкачиваемого из четырех рабочих скважин, больше, чем объем вводимого раствора. Это сводит к минимуму возможность загрязнения подпочвенных вод.
железоокисляющих бактерий. Однако при закачивании растворов на большую глубину ограничивающим фактором для использования бактерий может оказаться гипербарический кислород. Влияние высокой температуры, существующей на большей глубине, недостаточно изучено. Не исключено также, что из-за более низкой проницаемости для бактерий монолитных, сильно уплотненных включений в месторождениях эффективность выщелачивания резко уменьшается. Эта возможность также не изучалась детально. Несмотря на все эти пробелы в наших знаниях, можно утверждать, что достоинством технологии in situ является то, что она представляет собой систему, в которой можно контролировать много факторов, в том числе содержание кислорода и питательных веществ, pH т. д.
Чановое выщелачивание используется в горнорудной промышленности для извлечения урана, золота, серебра и меди из окисных руд. Медные и урановые руды сильно измельчают и смешивают с растворами серной кислоты в больших емкостях (обычно размером 30X50X6 м) для перевода металла в растворимую форму. Время выщелачивания, как правило, составляет несколько часов. Медь получают из кислого раствора электролизом, уран — ионообменным путем или экстракцией растворителем. Ферментация в чанах, а также в отстойниках с постоянным или предварительным перемешиванием может с успехом применяться для бактериального выщелачивания потому, что при этом легко контролировать факторы, влияющие на активность микроорганизмов. К этим факторам относятся: размер частиц руды, ее качество, плотность пульпы (масса руды на единицу объема раствора), pH, содержание углекислого газа, кислорода, время удержания (время нахождения частиц в реакторе), температура и содержание питательных веществ. Хотя руда и не стерилизуется, возможен строгий контроль за видовым составом и количеством микроорганизмов. Чановое выщелачивание создает предпосылки для использования специфических штаммов микроорганизмов (например, ацидотермофиль- ных бактерий) или микробов-выщелачивателей, полученных методами генетической инженерии. Вначале чановое выщелачивание применяли для руд с очень высоким содержанием металлов, однако эта технология может использоваться и в случае материалов более низкого качества. При этом следует учитывать экономические и технологические факторы.
Кучное выщелачивание применяют для химической экстракции урана, меди, золота и серебра. При выщелачивании урана и меди руду измельчают и помещают на специальные водонепроницаемые поверхности. При извлечении меди и урана кучи могут содержать 10—50-108 кг руды и в высоту достигать 4,5—5,5 м. Вершины куч выравнивают и наносят на них раствор серной кислоты. Новые кучи часто помещают поверх уже существующих. Такой способ выщелачивания урана и меди сходен с выщелачиванием отвалов; однако здесь используются более концентрированные растворы серной кислоты, частицы породы меньше по размеру, а качество породы (содержание металла в ней) выше. Кучное выщелачивание длится несколько месяцев, а для выщелачивания отвалов требуются годы. Этот метод применим также для экстракции золота и серебра из руд и даже из отходов, подобных шламу (пустая порода, остающаяся после извлечения руды и размельчения). Чтобы обеспечить эффективное протекание выщелачивающего раствора, тонко измельченный шлам должен быть подвергнут агломерации (спекание в шарики). В щелочных растворах цианидов серебро и золото
образуют комплексы, которые затем отделяют от раствора с помощью активированного угля. Кучное выщелачивание требует относительно небольших капиталовложений и технического обеспечения и представляет собой легко реализуемую систему. Благодаря небольшим масштабам операций при таком выщелачивании величину частиц породы, размеры куч, контакт между раствором и частицами, аэрацию, pH, состав растворов можно строго контролировать； с таким выщелачиванием хорошо сопрягаются процессы биоэкстракции. Их использование расширяет возможности методов кучного выщелачивания, позволяя осуществлять извлечение других металлов или проводить предварительную биологическую обработку материала до начала обычных процессов экстракции.
Экономическая значимость
Хотя процессы биологического выщелачивания и представляют собой альтернативу обычным процессам экстракции, маловероятно, что микробиологическая технология в ближайшем будущем заменит такой издавна существующий процесс, как выплавка металлов. Тем не менее, подобно другим гидрометаллургическим процессам типа кислотного кучного выщелачивания урановых и медных окисных руд и выщелачивания золотоносных и серебряных руд с помощью цианидов, эффективные методы бактериального выщелачивания, несомненно, могут оказать заметное влияние на технологию переработки минерального сырья.
Предполагается, что микробиологическая технология позволит перерабатывать руды и отходы, использование которых обычными методами неэкономично. Примерами такого рода являются переработка огромных количеств шламов и отходов с небольшим, но все же заметным содержанием драгоценных или стратегических металлов, а также экстракция металлов, заключенных в минеральных матриксах. Бактерии легко разлагают пирит, арсенопирит и другие минералы с освобождением металлов.
Еще одна область применения биологического выщелачивания, которая обещает быть экономически выгодной,——избирательное выщелачивание некоторых металлов; при этом один из металлов какого-либо минерала переходит в раствор, а остальные остаются нерастворенными. Некоторые минералы для увеличения их способности к флотации можно подвергнуть предварительному биологическому выщелачиванию. Флотация представляет собой метод разделения минералов, состоящий в том, что образуемая реагентами пена поднимает на поверхность во-
ды некоторые тонко измельченные минералы, тогда как другие тонут.
Последствия для окружающей среды, к которым ведет использование многих обычных методов добычи руд, их обогащение, а также выплавка металлов, весьма существенны. Общепринятые способы добычи и обогащения руд часто ведут к нарушению поверхностных слоев Земли из-за создания гигантских открытых карьеров и гор пустой породы и шламов. Это может создавать экологические проблемы. При выплавке металлов из сульфидных руд и сжигании углей с высоким содержанием серы образуются зола и двуокись серы, представляющие потенциальную опасность для окружающей среды. Биогидрометаллургия в сочетании с технологией выщелачивания in situ способна уменьшить разрушение земной поверхности, вызываемое разработкой и обогащением руд общепринятыми методами, а также устранить необходимость в выплавке металлов из сульфидных минералов. С помощью этого подхода можно будет извлекать сульфидные минералы при небольшом их содержании и большой глубине залегания. Разработка подобных месторождений общепринятыми подземными методами или открытым способом нерентабельна.
Одна из самых многообещающих возможностей бактериального выщелачивания ——использование его для удаления серы из угля перед сжиганием последнего. Выщелачивающие бактерии легко катализируют растворение неорганической (пиритной) серы, содержащейся в каменном угле; однако на органическую серу эти бактерии не действуют. Были исследованы и другие бактерии, способные эффективно удалять серусодержа- щие органические вещества из каменного угля.
Прежде чем проводить точный экономический анализ технологии бактериального выщелачивания, необходимо тщательно изучить все ее достоинства и недостатки, сравнив их с таковыми для существующих пирометаллургических и гидрометаллургических процессов. По сравнению с обычными методами добычи и обогащения руд и выплавки металлов бактериальное выщелачивание может оказаться вполне конкурентоспособным благодаря меньшим энергозатратам, снижению расхода реагентов при экстракции металлов, а также меньшему влиянию на окружающую среду.
Недостатки метода
В предыдущих разделах в общих чертах говорилось о практическом использовании бактериального выщелачивания в настоящее время и в перспективе. Однако немедленное практическое применение бактериального выщелачивания сдерживается по
ряду причин. Главное препятствие заключается в том, что процесс еще плохо исследован как на опытных установках, так и в полевых условиях. Большинство экспериментов было проведено в полупроизводственных условиях. Поэтому трудно судить об экономической значимости процессов бактериального выщелачивания и оценить технологические трудности, которые могут возникнуть при широкомасштабном промышленном использовании микробиологических процессов. Обычно применяемые процессы бактериального выщелачивания страдают также от недостатка хорошей техники. Вполне вероятно, что создание специальной системы оптимизации биологической активности сильно расширило бы,использование бактерий при выщелачивании. К параметрам, которые должны при этом учитываться, относятся температура, питательные вещества, содержание кислорода и углекислого газа, размер частиц, качество минерала, плотность пульпы (масса частиц на единицу объема выщелачивающего раствора), скорость протекания выщелачивающего раствора и pH.
Процессы бактериального выщелачивания нередко протекают медленнее, чем химические процессы, в которых мелкие частицы обрабатывают сильными реагентами при повышенных температуре и давлении. При экстракции металлов из ряда минеральных концентратов быстрые химические процессы экономически более выгодны. Однако в тех случаях, когда при обработке минералов стоимость химических реагентов и энергозатраты очень высоки, а скорость переработки не имеет решающего значения, правильно выбранные, технологичные способы бактериального выщелачивания могут оказаться предпочтительными.
При бактериальном выщелачивании сульфидных минералов в системе должно образовываться достаточное количество кислоты и не содержаться слишком много минералов, поглощающих кислоты. Для бактерий, окисляющих железо и серу, требуется кислая среда. Поэтому для переработки непригодны руды и отходы, поглощающие кислоты в большом количестве.
Для выщелачивания металлов in situ бактерии применялись мало. При подземном выщелачивании с помощью растворов следует принимать во внимание такие факторы, как влияние на активность бактерий повышенного гидростатического давления и гипербарической оксигенации. Гидростатическое давление воз~ никает в результате введения выщелачивающих растворов под давлением, а также за счет веса столба жидкости, а гипербарическая оксигенация обусловлена введением кислорода под давлением в рудное тело in situ для регенерации окисляющего агента. Однако при использовании бактерий кислород в такой концентрации не нужен, поскольку эти организмы сами регене-
рируют окислитель. Кислород требуется лишь в концентрациях, необходимых для обеспечения жизнедеятельности микроорганизмов. Первоначально технология выщелачивания in situ применялась для пород типа песчаников; при этом размельчать породу не было необходимости, поскольку она обладала высокой проницаемостью для выщелачивающего раствора. Для выщелачивания такого типа микроорганизмы не использовались. При бактериальном же выщелачивании встает вопрос: не будет ли рост бактерий на ненарушенном массиве пород ограничивать проницаемость и не уменьшится ли при этом циркуляция раствора? Такая проблема вряд ли возникнет при выщелачивании рудных тел in situ, предварительно разрушенных взрывом или иным способом.
Если какой-то микробиологический процесс отработан для выщелачивания металла (металлов) из определенного рудного тела, то вряд ли его удастся применить без изменений для получения оптимальных результатов при выщелачивании подобного металла из другого рудного тела. Даже если металлы сходны, тип рудного минерала и содержащей его породы вполне могут различаться. Выщелачивающие бактерии действуют на разные минералы неодинаковым образом. Известно, например, что некоторые халькопириты огнеупорнее других, и такие огнеупорные руды устойчивее к прямому действию микроорганизмов или. продуктов их жизнедеятельности.
В связи с огромными объемами перерабатываемого материала выщелачивание проводят под открытым небом, а не в помещениях со строго контролируемыми условиями. Поэтому микроорганизмам приходится «работать» при разных погодных условиях, существенно различающемся насыщении минеральными солями и неодинаковых pH. Ни система в целом, ни рудное тело не бывают стерильными: в них всегда присутствуют природные бактерии. Специально подобранные или мутантные штаммы выщелачивающих бактерий должны хорошо сочетаться с природной микрофлорой. Несомненно, что с помощью генетических манипуляций могут быть получены штаммы с повышенной способностью окислять железо или минералы, а также переносить высокие концентрации металлов или кислот. Работы в этом направлении ограничиваются неполнотой наших знаний обо всех интересующих нас микроорганизмах и о деталях механизма разложения сульфидных минералов; кроме того, мы почти ничего не знаем о генетических особенностях выщелачивающих микроорганизмов (например, об их хромосомных картах, наличии и функциях плазмид, способности к трансформации или переносу плазмид). Здесь имеется широкое поле для исследований, очень важных с точки зрения биотехнологии.
Превращение, накопление
и иммобилизация металлов микроорганизмами
Побуждаемая строгими законами об охране окружающей среды, необходимостью извлечения ценных металлов и очистки промышленных вод для их повторного использования, горнорудная промышленность все шире применяет новые физико-химические технологии для очистки сточных вод. Слишком часто эти технологии оказываются крайне дорогостоящими и неэф- ■фективными. Все больше фирм приходят к убеждению, что для очистки сточных вод можно использовать биологические про- дессы, причем эти процессы могут быть более экономичными и эффективными, чем обычно применяемые методы. Некоторые промышленные предприятия широко используют эти процессы для удаления из рудничных сточных вод примесей неорганических ионов. Применяемые системы обычно представляют собой большие отстойники или проточные пруды с медленным течением, в которых растут водоросли и микроорганизмы. Эти организмы накапливают растворенные металлы и их частицы или ■образуют продукты, переводящие примеси в нерастворимую форму. Обычно используемые процессы биологической очистки сточных вод мало подвержены прогрессу, эту технологию можно рассматривать как несложную. Исследования последних лет .показывают, что многие микроорганизмы способны накапливать металлы в больших концентрациях и содержат структурные компоненты, которые могут избирательно связывать специфические ионы. Селекция микроорганизмов, способных накапли- ；вать металлы, и создание технически более совершенных систем в целях использования этих организмов для удаления всех или отдельных загрязняющих ионов, присутствующих в малых количествах в больших объемах сточных вод, могли бы получить широкое применение в горнодобывающей промышленности и ；в других отраслях индустрии, где образуются сточные воды.
Извлекать металлы из окружающей среды способны все ■микроорганизмы, поскольку такие металлы, как железо, маг- 'ний, цинк, медь, молибден и многие другие входят в состав ■ферментов или пигментов, подобных цитохромам или хлоро- •филлам. В ряде случаев металлы накапливаются микроорганизмами в значительных количествах; в бактериальной клетке могут содержаться ионы калия в концентрации 0,2 М, даже если в среде калий присутствует в концентрациях 0,0001 М и ниже. В ходе эволюции у микроорганизмов сформировались системы поглощения, специфичные к определенным металлам и способные к значительному их концентрированию. В результате метаболических реакций, протекающих у микроорганизмову могут происходит различные превращения металлов: выделяе-
мые в окружающую среду продукты метаболизма способны образовывать комплексы с металлами или осаждать их из растворов; некоторые металлы могут переводиться с их помощью- в летучие формы и удаляться из раствора; металлы могут окисляться или восстанавливаться. Так, в разделе, посвященном выщелачиванию металлов, мы уже рассматривали окисление железа [Fe(II)—>Fe(III) +е~]. Fe(III) может также восстанавливаться до Fe(II) при дыхании ряда бактерий. За счет использования восстановительных эквивалентов дыхания может происходить восстановление селената, селенита, теллурата и теллурита до свободных металлоидов; таким путем осуществляется иммобилизация этих металлоидов.
Летучая
Металлоорганические、 соединения комплексы или осадок/
металла (например, г —；
Fe, Си, Ni, Мп)I、
'Металлы
Рис. 5.3. Возможные взаимодействия между металлами и микробной клеткой: поверхностная адсорбция, внутриклеточное накопление, перевод в летучук> форму, комплексообразование с выделяемыми органическими соединениями и внеклеточное осаждение.
Ниже перечислены основные механизмы иммобилизации,, комплексообразования или других способов удаления металлов из растворов микроорганизмами: 1) перевод в летучую форму; 2) внеклеточное осаждение; 3) внеклеточное комплексообразование и последующее накопление; 4) связывание клеточной поверхностью； 5) внутриклеточное накопление.
Все эти реакции изображены на рис. 5.3. Понятно, что указанные процессы могут перекрываться, поскольку один из них способен давать начало другому или быть его составной частью.
Перевод в летучую форму
В настоящее время твердо установлено, что многие микроорганизмы способны метилировать ртуть. Это приводит к превра- гщению ионов Hg(II) из осадка или раствора в метилртутные соединения (например, диметилртуть), которые уходят в атмо- ■сферу. Такое превращение может быть важным этапом в природном круговороте ртути. Возможно также микробиологическое метилирование других металлов, например мышьяка, тел- -лура и селена, которые таким способом удаляются из почвы и воды. Подобные процессы могут играть важную роль в при- [роаннх циклах этих металлов и иметь значение, например, при образовании обедненных селеном почв или при удалении ток- <сичных металлов при обработке сточных вод. Как бы то ни 'было биотехнологические исследования, направленные на уменьшение или увеличение подобной микробной активности, представляются весьма перспективными.
⑤.32 Внеклеточное осаждение
Металлы могут иммобилизовываться и накапливаться в почвах и в осадочных породах за счет связывания с продуктами мета- Холизма микробов или с накапливающимися органическими •остатками. Эти процессы издавна использовались человеком при очистке сточных и промышленных вод. При обычной очистке сточных вод образующийся ил содержит целый набор металлов, перешедших из воды. Живые клетки и органические остатки, присутствующие в отстойниках или проточных прудах, 'будут накапливать эти металлы, которые впоследствии оказываются в осадках. Для удаления металлов из промышленных стоков или из рудничных вод в горнорудной промышленности используют пруды, в которых 《цветут》 водоросли (их усиленный рост стимулируется органическими или минеральными питательными веществами, которые содержатся в воде).
Один из наиболее удачных примеров внеклеточного осаждения—перевод металлов в осадок путем осаждения сероводородом, образуемым сульфатредуцирующими бактериями. Эти бактерии обитают в анаэробных средах во всех частях земного шара (в озерных, океанических и некоторых речных осадках, ^бескислородных почвах, болотах и т. п.), и с их помощью происходит сопряжение окисления органических веществ с восстановлением сульфатов до сульфидов:
Н2 SO4 + 8Н =国 S + 4H2。. (10) Эта реакция может приводить к осаждению металлов в почвах 蜜 осадках, например в виде пирита (FeS2). В масштабе геологического времени таким способом могут накапливаться боль-
шие массы сульфидов металлов, например CuS. К образованию сульфидов ведет разложение биомассы водорослей в осадочных породах. Схематически такой процесс представлен на рис. 5.4. Оба этих процесса осуществляются в природе и используются человеком в относительно небольших масштабах, если говорить об общем количестве загрязненной металлами воды, которая нуждается в очистке. Потенциальные возможности применения биотехнологии для бактериального восстановления сульфатов в
Стадия 1: рост и отмирание водорослей и осаждение биомассы
Стадия 2: отложение и накопление сульфидов металлов в осадках
Рис. 5.4. Существующая в природе система осаждения металлов. Отмершие водоросли оседают на дно водоема (стадия 1) и при их последующем разложении под действием микроорганизмов образуется сероводород, осаждающий металлы (стадия 2).
целях очистки вод от металлов, а также для извлечения металлов из разбавленных растворов совершенно очевидны. На рис. 5.5 показаны две высокотехнологичные системы такого рода. В одноступенчатой системе в хемостат с культурой сульфат- редуцирующих бактерий непрерывно поступает раствор, загрязненный каким-либо металлом и содержащий сульфат и питательные вещества типа лактата или в зависимости от природы используемой бактерии углеводород либо органическую кислоту. Для одновременного разложения сложных органических остатков можно применять смешанные культуры бактерий^
функционирующих в анаэробных условиях. При более строго контролируемом процессе для получения сероводорода следует использовать раздельные культуры сульфатредуцирующих бак* терий; при этом сероводород необходимо прокачивать сквозь загрязненную металлом воду, протекающую через осадочный чан. Сульфид металла будет осаждаться, а поток свободной от металла (или по крайней мере сильно очищенной) воды — вытекать из резервуара. Потери избыточного сульфида можно контролировать, меняя соотношение между поступающими сульфатом и металлом. Однако некоторое количество избыточного растворимого сульфида все-таки неизбежно образуется. Его можно удалять путем спонтанного химического окисления, если поддерживать на соответствующем уровне количество растворенного сульфата. Альтернативным решением является окисле-
Одностадийная система
Поступление питательных веществ(сульфат, лактат) и примесей металловПоступление питательных веществ(сульфат, лактат) и примесей металловНепрерывная культура сульфатредуцирующих бактерии в хемостатеНепрерывная культура сульфатредуцирующих бактерии в хемостатеРис. 5.5. Две высокотехнологичные системы извлечения металлов из растворов в виде сульфидов. В одностадийной системе применяют сульфатредуцирующих бактерии; в двустадийной системе образуется сероводород, который в дальнейшем используется для осаждения металлов в отдельном резервуаре.Рис. 5.5. Две высокотехнологичные системы извлечения металлов из растворов в виде сульфидов. В одностадийной системе применяют сульфатредуцирующих бактерии; в двустадийной системе образуется сероводород, который в дальнейшем используется для осаждения металлов в отдельном резервуаре.Удаление бактерий вместе с илом, содержащим нерастворимый сульфид металла
Поступление питательных веществ(сульфат, лактат) и примесей металлов
Поступление питательных веществ(сульфат, лактат) и примесей металлов
Непрерывная культура сульфатредуцирующих бактерии в хемостате
Непрерывная культура сульфатредуцирующих бактерии в хемостате
Рис. 5.5. Две высокотехнологичные системы извлечения металлов из растворов в виде сульфидов. В одностадийной системе применяют сульфатредуцирующих бактерии; в двустадийной системе образуется сероводород, который в дальнейшем используется для осаждения металлов в отдельном резервуаре.
Рис. 5.5. Две высокотехнологичные системы извлечения металлов из растворов в виде сульфидов. В одностадийной системе применяют сульфатредуцирующих бактерии; в двустадийной системе образуется сероводород, который в дальнейшем используется для осаждения металлов в отдельном резервуаре.
ние сульфида серуобразующими фотосинтезирующими бактериями в трехступенчатом процессе. Далее возможно экономически： выгодное получение элементарной серы. Излишки газообразного сероводорода легко вновь использовать в цикле.
Внеклеточное комплексообразование
Некоторые микроорганизмы синтезируют специфические химические соединения, обладающие высоким сродством к определенным металлам. Наиболее известны соединения, образующие- комплексы с железом. Молибден, ванадий и другие микроэлементы, участвующие в метаболизме бактерий, также способны поступать в клетку в форме внеклеточных комплексов. Хот/
эти комплексообразующие соединения не осаждают металлы, на их основе может быть создана новая технология извлечения отдельных металлов из растворов. Для иммобилизации растворенных металлов пригодны комплексообразующие агенты, выделенные из культур микроорганизмов, а также химически синтезированные соединения, имитирующие эти агенты. Эффективность связывания металлов с подобными соединениями можно увеличить путем повышения их емкости по отношению к данным металлам, увеличения скорости соответствующих реакций и специфичности комплексообразующих агентов. Для этого можно попытаться синтезировать химическим путем такие агенты, для которых в качестве моделей служили бы природные продукты. Перспективным представляется и создание методами генетической инженерии микроорганизмов, синтезирующих нужные ве- одества в большом количестве.
Внутри-沙 внеклеточное накопление металлов микроорганизмами
О прямом накоплении металлов микроорганизмами уже шла речь в предыдущих разделах. Теперь мы рассмотрим лежащие .в основе этого явления биохимические процессы и возможности их использования в прикладной микробиологии. Идея применения микроорганизмов для извлечения металлов из растворов издавна представлялась привлекательной не только для очистки воды, но и для получения ценных или экономически важных металлов. Возможность эксплуатации такого процесса концентрирования несомненна, поскольку хорошо известна способность живых организмов извлекать металлы из разбавленных растворов и накапливать их. Многие растения и животные концентрируют элементы из окружающей их среды в миллионы раз.
Возможные пути биотехнологического использования накопления металлов микробами иллюстрирует рис. 5.6. Существуют два альтернативных механизма: накопление металлов организмами в растущей культуре и суспензиями нерастущих организмов. Конечно, можно использовать и проточные колонки с иммобилизованными микроорганизмами или другие биофильтрую- щие устройства. Если предполагается применение растущих .культур, то потребуется довольно сложная технология. Необходимо учесть и привести в соответствие друг с другом следующие факторы: 1) скорость роста организма (проточная культура) ;2) способность к накоплению металла и, следовательно, скорость его включения; 3) возможная токсичность металла для данных организмов; 4) конкуренция за извлекаемый металл между данным организмом и возможными комплексообразующими агентами среды (органическими и неорганически-
мн); 5) конкуренция между данным металлом и другими необходимыми металлами за включение в организм. Будучи высокотехнологичным, процесс извлечения металлов с помощью растущих культур требует учета слишком многих параметров и создает много проблем. Более привлекательным представляется накопление металлов нерастущими или иммобилизованными микроорганизмами. При этом легче определять и контролировать физико-химические условия среды, в которой находятся клетки, и их способность к накоплению металла. Кроме того, металл может быть переведен в раствор, относи-
Раствор металла
Рис. 5.6. Возможные способы извлечения металлов из раствора с помощью» микроорганизмов в качестве биосорбентов.
тельно свободный от комплексообразующих агентов, в концентрациях, нелетальных для живых клеток.
После концентрирования металла в микроорганизме возникает проблема извлечения из него металла. Для этого можно- использовать либо недеструктивный способ высвобождения металла из микроорганизма, либо экстракцию путем разрушения. В последнем случае микроорганизмы подвергают пирометал^ лургической обработке либо разрушают их концентрированной щелочью или кислотой. Выбор метода определяется тем, насколько легко высвобождается металл из микроорганизма и насколько ценен сам микроорганизм для того, чтобы имело смысл повторно его использовать. Ясно, что, если стоимость получения микроорганизма высока, его повторное использование весьма желательно. С другой стороны, если данный орга-
низм представляет собой дешевый побочный продукт иных производств (например, дрожжи) и/или извлекаемые металлы являются крайне ценными (например, металлы платиновой группы), то экономически предпочтителен деструктивный процесс. В любом варианте выбор организма и процесса экстракции должен определяться основными свойствами аккумулирующих металл микробных систем; самое главное — четкое понимание биохимических процессов, характерных для данного микроорганизма.
Микроорганизмы способны концентрировать металлы одним из следующих способов: 1) внеклеточное накопление участвующих или не участвующих в метаболизме металлов путем связывания или осаждения их на клеточной стенке или мембранах; 2) внутриклеточное накопление нужных для метаболизма металлов (например, К, Fe, Mg, Мо, следы Си, Ni); 3) внутриклеточное накопление относительно больших количеств несущественных для метаболизма металлов (например, Со, Ni, Си, Cd, Ag) в основном с помощью механизмов, служащих для накопления существенных для метаболизма металлов.
Поглощение некоторых металлов дрожжами и бактериями осуществляется почти исключительно за счет поверхностного связывания; примером служит накопление урана дрожжами или свинца у Micrococcus. Внутриклеточное накопление может сопровождаться незначительным поверхностным связыванием; пример тому — накопление калия. Процесс накопления металлов нередко характеризуется двухфазной кинетикой (рис. 5.7).
Рис. 5.7. Обычно наблюдаемая кинетика накопления металлов бактериями: стадия 1 ——энергонезависимая, стадия 2—энергозависимая.Рис. 5.7. Обычно наблюдаемая кинетика накопления металлов бактериями: стадия 1 ——энергонезависимая, стадия 2—энергозависимая.euuEiaw OJOHHegHS。Os-Luahnuo*euuEiaw OJOHHegHS。Os-Luahnuo*
Рис. 5.7. Обычно наблюдаемая кинетика накопления металлов бактериями: стадия 1 ——энергонезависимая, стадия 2—энергозависимая.
Рис. 5.7. Обычно наблюдаемая кинетика накопления металлов бактериями: стадия 1 ——энергонезависимая, стадия 2—энергозависимая.
euuEiaw OJOHHegHS。Os-Luahnuo*
euuEiaw OJOHHegHS。Os-Luahnuo*
Сразу после введения металла в среду последний быстро связывается с клеточной поверхностью за счет независимого от энергии процесса, а затем происходит медленный перенос металла в цитоплазму клетки. Последний процесс часто является энергозависимым и протекает лишь при активном дыхании. Он может блокироваться дыхательными ядами и анаэробиозом, ингибирующими аэробное дыхание или запасание энергии. У бактерий связывание металлов с клеточной поверхностью происходит интенсивнее, чем у большинства дрожжей; так, скорость связывания металлов у Saccharomyces cerevisiae намного ниже, чем у Escherichia coli или Bacillus (рис. 5.8). Связанные с клеточной поверхностью металлы легко отделяются от нее хелатирующими агентами или разбавленными кислотами; например, кобальт, связанный с поверхностью Bacillus^ легко удаляется при помощи ЭДТА (рис. 5.8). На внутриклеточное накопление металла ЭДТА не влияет. Бактериальные системы представляются предпо1пительньши для удаления металлов с последующим быстрым связыванием; однако энергозависимое поглощение металлов в случае дрожжей часто оказывается более эффективным, чем для бактерий. У различных штаммов родственных бактерий уровень поверхностного связывания существенно различается. Например, Bacillus megate- rium КМ (при концентрации 1 г сухой массы на литр) при 20 ℃ •связывает 43 мг кадмия на 1 г сухой массы из раствора, содержащего Cd в концентрации 112 мг/л (в то время, как В. polymyxa — всего 10 мг Cd на 1 г сухой массы). Сильно связывающий штамм В. megaterium (при концентрации 1 г сухой массы клеток на литр) извлекает 38 и 68% кадмия из растворов, содержащих соответственно 112 и 11 мг Cd в 1 л.
Последующее накопление металлов внутри клетки, как правило, требует специфических транспортных систем. Четко установлено, что поглощение никеля или кобальта происходит при участии системы транспорта магния, а поглощение рубидия, вероятно, при участии системы транспорта калия. Различные металлы могут конкурировать за карбоксилы, гидроксилы и другие участки связывания на поверхности клетки или за транспортные системы. При поступлении в клетку иона какого- ■либо металла из цитоплазмы выходят одноименно заряженные ионы. В зависимости от организма это могут быть протоны, ионы магния или калия (рис. 5.9).
Над применением микроорганизмов в биотехнологии в качестве биосорбентов металлов еще предстоит поработать. Недавно было показано, что уран может сорбироваться из морской воды или из растворов водорослями, дрожжами или Pseudomonas. Pseudomonas накапливает уран в цитоплазме (рис. 5.10), а для Saccharomyces характерно поверхностное
0204060Время, мин0204060Время, минРис. 5.8. Поглощение кобальта дрожжами и бациллами из 0,002 М PIPES. (Norris, Kelly, 1977; Norris, Kelly, 1979.) 1—Saccharotnyces cerevisiae, 2 — Bacillus megaterium, 3 — кобальт, удерживаемый В. megaterium после промывки 1 мМ ЭДТА.Рис. 5.8. Поглощение кобальта дрожжами и бациллами из 0,002 М PIPES. (Norris, Kelly, 1977; Norris, Kelly, 1979.) 1—Saccharotnyces cerevisiae, 2 — Bacillus megaterium, 3 — кобальт, удерживаемый В. megaterium после промывки 1 мМ ЭДТА.^00«5 _^^х^ ^к,я^」5疝Hq 后 дбн бзБ^нвтув0OBGahul/OH^00«5 _^^х^ ^к,я^」5疝Hq 后 дбн бзБ^нвтув0OBGahul/OH
0204060
Время, мин
0204060
Время, мин
Рис. 5.8. Поглощение кобальта дрожжами и бациллами из 0,002 М PIPES. (Norris, Kelly, 1977; Norris, Kelly, 1979.) 1—Saccharotnyces cerevisiae, 2 — Bacillus megaterium, 3 — кобальт, удерживаемый В. megaterium после промывки 1 мМ ЭДТА.
Рис. 5.8. Поглощение кобальта дрожжами и бациллами из 0,002 М PIPES. (Norris, Kelly, 1977; Norris, Kelly, 1979.) 1—Saccharotnyces cerevisiae, 2 — Bacillus megaterium, 3 — кобальт, удерживаемый В. megaterium после промывки 1 мМ ЭДТА.
^00«5 _^^х^ ^к,я^」5疝Hq 后 дбн бзБ^нвтув0OBGahul/OH
^00«5 _^^х^ ^к,я^」5疝Hq 后 дбн бзБ^нвтув0OBGahul/OH
связывание (рис. 5.11). Этот связанный уран легко удаляется,, и дрожжи можно использовать повторно. Потенциальные возможности развития технологии экстракции определяются многими факторами. 1. Специфичность связывания должна быть достаточной для удаления определенного металла или смеси металлов из разбавленного раствора. 2. Специфичность био- аккумулятора по отношению к металлу должна быть эквивалентной таковой для физико-химических методов (ионный обмен, экстракция растворителями и т. п.). 3. Биоаккумулятор должен обладать способностью к извлечению из среды больших количеств металла. 4. Чтобы процесс был экономически?
Выход эквивалентного иона (заряда)Выход эквивалентного иона (заряда)Рис. 5.9. Схематическое изображение ионного равновесия, поддерживаемого микроорганизмами, которые накапливают металлы внутри клетки.Рис. 5.9. Схематическое изображение ионного равновесия, поддерживаемого микроорганизмами, которые накапливают металлы внутри клетки.
Выход эквивалентного иона (заряда)
Выход эквивалентного иона (заряда)
Рис. 5.9. Схематическое изображение ионного равновесия, поддерживаемого микроорганизмами, которые накапливают металлы внутри клетки.
Рис. 5.9. Схематическое изображение ионного равновесия, поддерживаемого микроорганизмами, которые накапливают металлы внутри клетки.
выгоден, стоимость извлекаемых металлов должна быть эквивалентна затратам на получение и, возможно, повторное использование микроорганизмов (или превышать их). 5. Другие вещества окружающей среды не должны оказывать вредного воздействия на биоаккумуляторы.
Широкое разнообразие микробных систем и возможность существенного изменения микроорганизмов генетическими методами позволяют надеяться на создание биотехнологии, отвечающей всем этим требованиям. Однако к спекуляциям по поводу разработки такой технологии следует относиться с осторожностью. Дело в том, что извлечение металлов с помощью микробиологических процессов подчиняется тем же химическим законам, что и получение их обычными физическими и химическими методами. По мере изучения способности микро-
Рис. 5.10. Электронная микрофотография Pseudomonas aeruginosa, демонстри-- рующая внутриклеточное накопление урана (увеличение 27 000). Фотография любезно предоставлена Дж. У. Стрэндбергом (G. W. Strandberg, Oak Ridge- National Laboratory, Oak Ridge, TN).
организмов к накоплению металлов может обнаружиться, что микробные системы способны служить лишь моделями для разработки технологий искусственного извлечения металлов.
Биополимеры
Введение
Термин «биополимеры» относится ко многим высокомолекулярным соединениям (например, к нуклеиновым кислотам, полисахаридам и липидам), синтезируемым самыми разными органнз- мами. В этом разделе мы особенно подробно рассмотрим образование микроорганизмами полисахаридов и поли-В-гидрокси- бутирата. Эти биополимеры часто синтезируются в ответ на
Рис. 5.11. Электронная микрофотография Saccharomyces cerevisiae NRRLY2574, демонстрирующая накопление урана на поверхности клеток (увеличение 35 000). Фотография любезно предоставлена Дж. У. Стрэндбергом (G. W. Strand- berg, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN).
специфические условия среды в тех случаях, когда соединения углерода не являются фактором, лимитирующим рост, и, следовательно, могут служить резервным источником углерода и/или энергии (разд. 5.4.7).
Полисахариды
Полисахариды служат источником энергии и структурными компонентами клеточных стенок и внеклеточных капсул. Многие из этих полимеров, имеющие коммерческую ценность как промышленные клеи, были получены из растительных тканей (экстракты семян и морских водорослей, древесные экссудаты ：и т. п.). Способность таких полисахаридов изменять реологические свойства воды, вызывая образование геля и влияя на
свойства водных растворов в потоке, привели к их широкому* промышленному использованию в самых различных ситуациях. Полисахаридные гидроколлоиды часто применяются в пищевой,, фармацевтической, парфюмерно-косметической, нефтяной, бумажной и текстильной промышленности. Например, из красных, водорослей производят в промышленных масштабах карраге- нан и агар, а из бурых ——альгинаты. Однако получение полисахаридов из растений и водорослей обладает своими недостатками.
Химический состав полисахаридов зависит от метаболических потребностей синтезирующих их организмов, связанных, в свою очередь с изменениями внешних условий (например, сезонные изменения, разные циклы развития растений, время их сбора и т. д.). Поэтому при производстве сырья невозможно- обеспечить контроль за его качеством.
При переработке происходят изменение и разрушение- продукта, поскольку такая переработка нередко включает грубые воздействия (щелочная экстракция, приводящая к р-эли- минации и разрушению; выщелачивание горячей водой; отбеливание). При этом конечный продукт может приобрести нежелательный запах или цвет.
Количество получаемого растительного продукта зависит от урожайности, погодных условий, заболеваний растений или' загрязнения окружающей среды.
При получении полисахаридов из микроорганизмов обеспечивается контролируемый синтез полимеров и постоянство продукции. Кроме того, микробные полисахариды часто обладают- уникальными физическими и химическими свойствами, улуч-- шенными функциональными характеристиками; биологическая! потребность в кислороде при их образовании невелика. Микроорганизмы синтезируют множество полисахаридов в форме- внеклеточных капсул или слизей, не связанных с клеточной; стенкой. Как правило, в их состав входит небольшой набор моносахаридов (нейтральные гексозы, метилпентозы, кетосахара,, аминосахара, уроновые кислоты), однако разное их сочетание дает полимеры с разнообразными физическими свойствами. Отметим, что получение микробных полисахаридов — относительно дорогой процесс: для его осуществления требуются1 большие капиталовложения и энергетические затраты и необходим квалифицированный персонал. Видимо, микробные полимеры не вытеснят окончательно крахмал и его производные из： всех сфер их использования. Оценивая целесообразность промышленного производства того или иного полисахарида, следует учитывать следующие факторы: 1) потенциальный объем годового производства продукта и спрос на него как в настоящее время, так и в будущем; 2) уникальность свойств данного
продукта по сравнению с другими микробными и растительными полисахаридами; 3) экономичность производства и предполагаемую длительность применения продукта.
Микроорганизмы, образующие полисахариды, найдены в самых разных средах, но вряд ли существует определенная стратегия их выделения. Было показано, что синтез полимеров идет как в аэробных, так и в анаэробных культурах. Установлено, что психрофильные микроорганизмы синтезируют полисахариды, относительно же активности такого рода у термофилов мало что известно.
Образование полисахаридов при брожении
Для образования большого количества полимера требуется легкодоступный и дешевый источник углерода. Ферментация позволяет культивировать организм-продуцент в строго определенных условиях среды, контролируя, таким образом, процесс биосинтеза и влияя на тип продукта и его свойства. Специфически изменяя условия роста, можно менять молекулярную массу и структуру образующегося полимера. В ряде случаев максимальная скорость синтеза полисахарида достигается в логарифмической стадии роста, в других — в поздней логарифмической или в начале стационарной. Обычно углеводными субстратами служат глюкоза и сахароза, хотя полисахариды могут образовываться и при росте микроорганизмов на н-алка- нах( C12-6i), керосине, метаноле, метане, этаноле, глицероле и этиленгликоле. Недостатком проведения процесса в ферментерах является то, что среда часто становится очень вязкой, поэтому культура быстро начинает испытывать недостаток кислорода; мы все еще не умеем рассчитывать соотношение между скоростью перемешивания неньютоновских жидкостей и подачей кислорода. Необходимо также контролировать быстрые изменения pH среды. И все же упомянутый метод позволяет -быстро синтезировать полимер для того, чтобы определить его физические свойства, .а также дает возможность оптимизировать состав среды, главным образом в отношении эффективности различных углеводных субстратов. Часто в качестве лимитирующего фактора применяют азот (соотношение углерод: азот — 10: 1), хотя можно использовать и другие (серу, магний, калий и фосфор). Природа лимитирующего фактора способна определять свойства полисахарида, например его вязкостные характеристики и степень ацилирования. Так, многие ■полисахариды, синтезируемые грибами, фосфорилированы. При недостатке фосфора степень фосфорилирования может уменьшаться или становиться равной нулю; в этих условиях может даже измениться соотношение моносахаридов в конечном по-
лимере. Недостаток калия приводит к снижению синтеза полисахарида из-за уменьшения поступления питательных веществ.
После удаления микробных клеток центрифугированием продукт извлекают из культуральной жидкости относительна мягким и простым способом, который включает осаждение органическими растворителями (спиртами, ацетоном). Таким образом уменьшается вероятность разрушения или модификации： полимера. Крупные клетки грибов лучше всего удалять центрифугированием. При крупномасштабном производстве эффективное удаление продуцента часто бывает затруднено, и культуральную жидкость пастеризуют нагреванием или гомогенизацией. Чтобы при отделении не возникало лишних сложностей, нужно разумно сбалансировать степень конверсии углеводного^ сьтрья и вязкость среды при завершении процесса. Нередко- осаждению полимера в присутствии смешивающихся с водо说 органических растворителей способствует добавление какого- либо электролита. Другой вариант этого метода предусматривает добавление растворителя в меньшем количестве, чем： требуется для осаждения полимера. После удаления твердых компонентов фильтрованием при 100 ℃ добавляют еще одну порцию растворителя для осаждения полисахарида. Можно также высушивать отфильтрованную культуральную жидкость, распылением, осаждать полимер путем добавления поливалентных катионов или с помощью четвертичных аммониевых соединений (цетилтриметиламмонийхлорида) в сочетании с метанолом. Последний метод используется нечасто.
Недостатки, присущие культивированию в ферментерах, для которого характерны постоянные изменения концентрации питательных веществ, микроорганизмов и синтезируемых продуктов, можно устранить, применяя непрерывные культуры. Исходно такие культуры использовались при изучении физиологии синтеза полисахаридов, однако они оказались весьма перспективными для получения стабильно высокой продуктивности. Рост микроорганизмов можно регулировать с помощью* только одного лимитирующего компонента и непрерывно контролировать остальные параметры. Таким образом можно изучать влияние разных лимитирующих питательных веществ； и разных скоростей роста при постоянных прочих условиях среды (например, регулировать количество растворенного кислорода путем изменения скорости вращения мешалки и интенсивности аэрации). У некоторых микроорганизмов, например у Xanthomonas catnpestris и Azotobacter utnzlandii, скорость образования полисахарида зависит от разведения, причем при- более низком разведении наблюдается увеличение выхода по* лимера. У других организмов синтез не зависит от разведения. В случае непрерывных культур возникает проблема стабиль
ности штаммов, т. е. появления вариантов, не образующих полисахарид. Все здесь определяется природой используемого организма и условиями его культивирования. Так, Xanthomo- nas juglandis, специфичный по отношению к хозяину вариант X. campestris, в культурах с ограниченным содержанием азота не меняется на протяжении более чем 900-часового непрерывного синтеза полисахарида; при этом наблюдается высокий выход полимера. Параметром, способствующим возникновению мутантов с измененной способностью к синтезу полисахаридов иногда служит ограничение по углероду в непрерывных культурах. Ферментацию с образованием полисахаридов удается контролировать многими способами, но постоянного выхода продукта можно достичь путем регуляции вязкости культуры.. Однако при культивировании в ферментерах с перегородками иногда образуются области с повышенной вязкостью из-за пристеночного роста или накопления полисахарида в других участках. При таких неоднородных условиях роста контроль за вязкостью среды осуществлять не удается.
К нерешенным биоинженерным проблемам относятся: большой расход энергии на перемешивание вязких сред, недостаток кислорода из-за неидеального перемешивания и необходимость постоянной обработки культуральной среды, включающей удаление клеток и использование больших количеств растворителей для осаждения. В связи с низкой концентрацией продукта (часто ниже 5%, вес/объем) требуются большие ферментеры (50—200 м3). Для оценки реологических характеристик культуральных сред проводят исследования на опытных установках. Полученные данные используют для изменения конструкции ферментеров и мешалок с целью увеличения их эффективности при работе с псевдопластичными культуральными средами.
Проблемы последующей обработки конечного продукта при синтезе полисахаридов связаны прежде всего с удалением микроорганизмов, что крайне важно, если этот продукт применяется в пищевой промышленности. Для разрушения бактерий1 используют литические и протеолитические ферменты, что в свою очередь приводит к дальнейшему загрязнению ср еды поскольку при этом добавляется потенциальный субстрат для роста микробов. При удалении бактериальных остатков фильтрованием применяют обработку полимера протеолитическими ферментами при щелочном pH с последующим добавлением кремниевого адсорбента. Во избежание деградации полимера при щелочном pH можно при необходимости подкислять среду. Для осветления растворов полисахаридов их пропускают через： иммобилизованные эндоглюканазы, что приводит к незначительному уменьшению вязкости вследствие гидролиза гликозидных связей.
В настоящее время осуществляется промышленное производство ряда микробных полисахаридов [декстран, ксантан, теллановая смола, занфло (Zanflo) и политран (Polytran)]. Получение многих других находится на стадии разработки. В следующем разделе описаны основные свойства полисахари
дов микробного происхождения и перспективы их применения.
Микробные полисахариды:
свойства, применение и коммерческая ценность
Ксантан [келтрол (Keltrol), келзан (Kelzan), Родогель (Rhodogel)]
Ксантан синтезируется Xanthomonas campestris при росте на тлюкозе, сахарозе, крахмале, кукурузной декстрозе и барде. В качестве источников углерода могут использоваться промышленные отходы, например сыворотка, образующаяся при выработке творога. Этот полимер, имеющий аллюлозный остов, построен из повторяющихся пятичленных блоков, содержащих D-глюкозу, D-маннозу, D-глюкуроновую кислоту; к некоторым из них присоединены остатки уксусной и пировиноградной кис- -лот. Мол. масса его варьирует от 2-106 до 15-106. Точная третичная структура ксантана еще не определена, однако результаты конформационного анализа позволяют предположить, что полимер имеет форму спирали. Остается выяснить, одиночная она или двойная. Ксантан был первым микробным полисахаридом, который начали производить в промышленном масштабе (1967 г.). Он нашел широкое применение в промышленности. Это вещество обладает высокой вязкостью при малых концентрациях и низкой скоростью сдвига. Вязкость его остается постоянной в широком диапазоне pH, не зависит от температуры и присутствия солей, например хлористого калия. В сочетании с растительным полисахаридом из семян лжеакации водные растворы ксантана образуют стабильные гели. Ксантан ■получают обычным способом в ферментере с использованием ■коммерческой D-глюкозы в качестве источника углерода. Перед осаждением полимера метанолом или изопропанолом в присутствии хлористого калия клетки обычно не удаляют. Изучалась возможность непрерывного получения ксантана, но про- .мышленное внедрение этого метода осуществлено не было.
Уникальные свойства ксантана предопределили его широкое применение в самых разных отраслях промышленности в качестве стабилизатора и средства для контроля за состоянием ■суспензий, гелеобразованием и вязкостью. Псевдопластические текучие свойства этого полимера в сочетании с устойчивостью 恥 нагреванию, кислотам, щелочам и присутствию катионов
обеспечивают ему преимущества над другими смазками в составе бентонитовых шламов, и ксантан широко используется при добыче нефти. Он применяется также для повышения выхода нефти, где в сочетании с поверхностно-активными веществами и углеводородами служит в качестве агента, контролирующего вязкость жидкости, закачиваемой в нефтеносные пласты. Молекулы полимера, использующегося для повышения выхода нефти, должны быть достаточно малого размера, чтобы они могли проникать в поры породы, образуя растворы, с высокой вязкостью, которая не изменяется при высоких концентрациях солей, высоких температурах и давлении, а также- под действием сдвиговых напряжений, создаваемых при работе насосов. Ксантан, очищенный от бактериальных остатков, обладает более низкой степенью удержания, чем широко используемый полиакриламид. При добыче нефти применяются водные растворы сульфатированного полисахарида, так как они подвержены меньшему разжижению под действием сдвиговых напряжений. В комплексах с бурой ксантан применяют в качестве гелеобразующего агента при производстве взрывчатых веществ.
В 1969 г. было разрешено использовать ксантан в пищевой промышленности для улучшения вкусовых свойств консервированных и замороженных продуктов, приправ, соусов, быстро приготовляемых продуктов, заправок, кремов и фруктовых напитков. Благодаря синергическому взаимодействию между ксантаном и растительными галактоманнанами вместе с камедью из семян лжеакации он нашел применение в производстве кормов, например консервированного корма для домашних животных, где он конкурирует с агаром; в качестве суспендирующего агента он используется также в производстве кормок с низким содержанием твердых компонентов. Простые и сложные эфиры ксантана применяют в косметике и в текстильной, промышленности.
Декстран
ДексТран ——это a-D-глюкан, синтезируемый самыми разными грамположительными и грамотрицательными бактериями, такими как Aerobacter spp., Streptococcus bovis и S. viridans,. а также Leuconostoc mesenteroides. В промышленности этот полимер получают выращиванием последнего из перечисленных микроорганизмов на сахарозе. Большинство полисахаридов являются продуктами внутриклеточного синтеза, однако при образовании декстрана субстрат не проникает в клетку. Декстраны классифицируют в зависимости от относительного содержания каждого из трех имеющихся типов связей (а・1->3»
@jf4 и “/—б), а также по растворимости в воде. Высокомолекулярный полимер осаждают органическими растворителями, n затем разрушают ферментативным путем (используя экзо- и эндодекстраназы) с помощью гидролиза слабой кислотой либо нагреванием до получения продукта с нужной молекулярной массой. Степень такой деградации контролируется по изменению вязкости. В качестве альтернативы можно использовать низкомолекулярные полисахариды как затравку для получения декстранов с желаемой степенью полимеризации. Бактериальные инокуляты часто неоднократно промывают солевым раствором для удаления примесей высокомолекулярных полимеров, которые в противном случае смогли бы послужить затравками при полимеризации. Помимо природы акцептора глюкозы, молекулярная масса декстрана определяется также концентрацией сахарозы и температурой реакции. При высокой концентрации сахарозы (70% по весу) образуется в основном однородный набор низкомолекулярных декстранов. При использовании низкомолекулярной декстрановой затравки (10 000—25 000) и небольших концентраций сахарозы (10% по весу, pH 5, 15℃) значительная часть получаемого продукта (50%) имеет мол. массу в пределах 50 000—100 000; при этом -отпадает необходимость в его дальнейшем фракционировании для применения в медицине.
Внеклеточный фермент, катализирующий синтез декстрана, декстрансахараза (сс-1,6-глюкан : О-фруктозо-2-глюкозил- трансфераза, К.Ф.2.4.1.5), является индуцибельным у Leuconos- ioc mesenteroides] у Streptococcus mutans или S. sanquis он синтезируется в течение логарифмической фазы роста. Этот фермент освобождает фруктозу и переносит глюкозные остатки на -связанную с ферментом молекулу акцептора. Растущая цепь декстрана остается прочно связанной с ферментом. Исследования иммобилизованной декстрансахаразы показали, что она образует продукты с узким спектром молекулярных масс, тогда как в растворимой системе синтезируются очень высокомолекулярные декстраны. Синтезирующие декстран организмы продуцируют большие количества этого фермента в растворимой -форме или в связанном с клеткой состоянии. Производство декстранов микробной природы остается, однако, ограниченным, несмотря на успехи в разработке бесклеточных систем.
Прежде всего декстраны используют в качестве заменителей плазмы (для увеличения объема крови); кроме того, они применяются в медицине для создания гидрофильного слоя на обожженных поверхностях в целях поглощения жидких экссудатов. Для разделения и очистки биологических молекул на・ ^одят широкое применение производные декстранов с поперечными сшивками, в которых функциональные группы (например.
карбоксиметильные или диаминогруппы) соединены с глюкозными остатками эфирными связями. Сульфатированные декстраны используют в качестве полиэлектролитов.
Микробный альгинат
Источником альгинатов издавна служили морские водоросли (например, Laminaria spp.), однако по природе своей этот источник непостоянен. Среди бактерий близкие к альгинату гетерополисахариды образуют из D-маннуроновой и L-глюкуроно- вой кислот Pseudomonas aeruginosa и Azotobacter vinelandiL Этот процесс осуществляют в промышленном масштабе, выращивая Azotobacter в условиях избытка углерода. Микробный альгинат отличается от соответствующего продукта из водорослей наличием О-ацетильных групп, связанных с остатками D- маннуроновой кислоты. Тип получаемого альгината можно изменять, варьируя различные параметры. Например, при низком содержании фосфата образуется в основном высокомолекулярный полимер с хорошим выходом, а при разной концентрации ионов кальция можно получать разное соотношение между маннуроновой и галактуроновой кислотами; это соотношение в свою очередь влияет на эпимеризацию одной кислоты в другую. Было изучено также образование микробного альгината в непрерывной культуре, где его выход при выращивании на сахарозе увеличивается до 50% по сравнению с 25% в ферментере. При высокой интенсивности дыхания могут происходить большие потери углеродного субстрата вследствие его превращения в углекислый газ. Максимальная скорость синтеза полисахарида в непрерывной культуре была достигнута при недостатке в среде молибдена. При ограниченном содержании фосфора и низкой плотности клеток в культурах Azotobacter vine- landii происходит дополнительная потеря углерода из-за синтеза поли-р-гидроксибутирата.
В настоящее время альгинаты из растительных источников используются в основном в пищевой промышленности в качестве загустителей или гелеобразующих агентов. Их применяют для стабилизации йогурта, для предотвращения образования кристаллов льда при получении мороженого; подобно производным пропиленгликоля, их добавляют в содержащие кислоту продукты, например в приправы для салатов, поскольку эти соединения образуют гели только при pH ниже 3. Альгинатные полисахариды превращаются в гель в присутствии поливалентных катионов (Са+2, Sr+2) и поэтому применяются для мягкой иммобилизации микроорганизмов. В других условиях подобное гелеобразование может быть нежелательным и его пытаются предотвратить, получая соответствующие производные полимера.
Геллановая камедь
Геллан ——полисахарид, состоящий из остатков глюкозы, рамнозы, глюкуроновой кислоты и содержащий О-ацетильные группы (3——4,5%),——получают методом аэробной ферментации при участии Pseudomonas elodea АТСС 31461 на каком-либо углеводном источнике углерода. Этот продукт существует в трех формах: нативной, низкоацетильной и низкоацетильной/освет- ленной. Низкоацетильная форма, легко получаемая из нативной нагреванием при рНЮ, образует при нагревании и охлаждении твердые хрупкие гели. Прочность геля зависит от концентрации камеди и солей, а также от природы присутствующих катионов. Наиболее прочный гель образуется при более низких концентрациях двухвалентных катионов (Са2+, Mg2+) по сравнению с одновалентными. Хотя этот полимер еще не был рекомендован для применения в пищевой промышленности, возможно, в будущем он заменит каррагенан и агар. Его уже используют в микробиологии в качестве компонента различных сред, где он известен под коммерческим названием гелрит (Gelrite). Здесь его преимуществами перед агаром являются более высокая прозрачность, та же прочность геля при вдвое меньшей концентрации полимера, меньшая токсичность и высокая устойчивость к действию ферментов.
Занфло (Zanflo)
Полисахарид занфло, получаемый из Erwinia tahitica, обладает сходными с ксантаном свойствами; единственное отличие состоит в том, что его вязкость претерпевает обратимые термические изменения (при температуре выше 60℃). Этот полисахарид, растворы которого обладают высокой вязкостью, состоит из остатков фукозы, галактозы, глюкозы и уроновой кислоты и содержит некоторое количество этерифицированных О-аце- тильных групп. В качестве источника углеводов при его выработке применяют лактозу, гидролизованный крахмал или их смеси. Этот полимер был создан специально для разметки дорожных покрытий, поскольку он устойчив к замораживанию —— оттаиванию и действию ферментов, а также обладает хорошей текучестью и наносится ровным слоем на поверхность. Благодаря этим качествам он может найти применение в лакокрасочной промышленности. Erwinia tahitica синтезирует также' целлюлазу; это налагает ограничения на использование занфло при производстве красок, содержащих целлюлозные загуо тители.
Политран (склероглюкан)
Политран представляет собой линейный р-1,3-глюкан, выделяемый грибом Sclerotium glucanicum и близкими к нему видами при выращивании в глубинной культуре на среде с кукурузным экстрактом. К каждому третьему остатку в цепи связью 0-1—6 присоединена одна D-глюкопиранозильная группа. Политран обладает псевдо пластическими свойствами в широком диапазоне pH и температуры и нечувствителен к различным солям. Его применяют для стабилизации бентонитовых шламов при бурении и для повышения нефтедобычи; он используется также в керамических глазурях, латексных и типографских красках и при дражировании семян. Этот нейтральный полисахарид разрушается экзоглюканазами до глюкозы и гентобиозы.
В настоящее время намечается возможность промышленного получения и многих других микробных полисахаридов. За последние пять лет в выделении и производстве различных полимеров наблюдается быстрый прогресс.
Микробные полисахариды, синтезируемые Alcaligenes spp.
Компанией Kelco в США за последнее время доведено до промышленных масштабов получение нескольких полисахаридов при участии различных видов Alcaligenes.
В глубинных культурах образуется с большим выходом полимер S130 неизвестной структуры. Он обладает высокой вязкостью при низкой концентрации, прекрасной р а створ и мостью, большой вязкостью в морской воде и в солевых растворах и не утрачивает этих свойств при высоких температурах (~ 149°C). Большинство растворов полисахаридов теряют свою вязкость при температурах свыше 93 ℃, а вязкость растворов полимера S130 при 149 ℃ остается такой же, как при комнатной темпе- ратуре. Кроме того, при таких высоких температурах он не разрушается в течение длительного времени, особенно в присутствии малых количеств кислорода. Будучи очень вязкими при низких скоростях сдвига, его растворы при высоких скоростях сдвига становятся жидкими почти как вода. Благодаря таким свойствам данный полимер может найти широкое при- менение в нефтяной промышленности в качестве хорошего су- ■спендирующего агента и вяжущего компонента буровых растворов с низким содержанием твердых частиц.
Сходными с S130 свойствами обладает полимер S194, кото* рмй, кроме того, нечувствителен к сдвиговым напряжениям. В сочетании с высокой устойчивостью к солям эти качества обусловливают его применение в роли суспендирующего агента 总 суспензиях пестицидов (концентрированные суспензии нера- 15*
створимого в воде материала), а также в суспензиях удобрений, используемых в сельском хозяйстве.
Полисахарид S198 содержит О-ацетильные и О-сукциниль- ные остатки; его получают при аэробной ферментации с использованием глюкозы в качестве источника углерода. Его растворы тоже обладают высокой вязкостью при низкой концентрации и достаточно стабильны в широком интервале pH и температур. Кроме того, благодаря устойчивости к сдвиговым напряжениям он является прекрасным суспендирующим агентом. S198 остается стабильным в среде, загрязненной тяжелыми металлами. Все это позволяет думать, что водорастворимые смеси на основе этого полисахарида могут быть использованы вместо смазочных материалов для гидравлических систем, изготавливаемых на основе нефти.
Курдлан
Курдлан — это а-1,3-глюкан, синтезируемый Alcaligenes faeca- fe, var. myxogenes, штамм 10C3. При нагревании до температуры выше 54 ℃ происходит необратимое гелеобразование этого полимера; прочность геля зависит от температуры： она постоянна в интервале 60—80 ℃ и возрастает в интервале 80— 100 ℃. При температуре выше 120 ℃ молекулярная структура этого полисахарида изменяется: одиночная спираль переходит в тройную. Курдлан нерастворим в холодной воде, и его гели можно получать также путем диализа щелочных растворов против воды. Этот полисахарид может найти применение в качестве гелеобразователя в кулинарии, он может использоваться как молекулярное сито, как подложка при иммобилизации ферментов и как связующий агент.
Пуллулан
Пуллулан представляет собой a-D-глюкановый полисахарид, состоящий из а-1 ->6-мальтотриозных и небольшого числа маль・ тотетраозных единиц. Он синтезируется Aureobacidium pullulans и образует прочные, упругие пленки и волокна, которые можно формовать. По сравнению с целлофаном и полипропиленом эти пленки мало проницаемы для кислорода. Пуллулан, возможно, найдет применение в качестве упаковочного материала или флюккулирующего агента в суспензиях глин в горной промышленности. Он устойчив к амилазам, но разрушается ферментом пуллуланазой.
Было описано также образование полисахаридов видами Arthrobacter, Beijerinckia и бактериями, использующими метан и метанол.
Биосинтез полисахаридов
Хотя у некоторых бактерий синтез полисахаридов (например, декстранов) осуществляется вне клетки, в большинстве случаев полисахариды синтезируются внутри нее, а для этого необходимо, чтобы соответствующий субстрат проник через клеточную мембрану. Почти во всех работах, касающихся биосинтеза полисахаридов, изучались организмы, имеющие небольшое промышленное значение или не имеющие его вовсе. Эти результаты можно, видимо, экстраполировать и на промышленные организмы.
Поглощение субстрата осуществляется путем облегченной диффузии, активного транспорта (при этом субстрат проникает в клетку в неизмененном состоянии) или групповой транслокации (при этом субстрат подвергается фосфорилированию). Скорость синтеза полисахарида, по-видимому, зависит от скорости поступления субстрата, которая, таким образом, может быть первым из факторов, лимитирующих синтез полисахарида. В то же время скорость конверсии углерода обычно очень высока, поэтому она, видимо, не может быть фактором, лимитирующим синтез. Специфические потребности в углероде для образования полисахарида иногда связаны со специфическими механизмами поглощения субстрата.
Субстрат, поступающий в клетку, подвергается превращениям в ходе анаболических или катаболических процессов; первые включают его превращение в полисахариды, липополисахариды или гликоген. Гликоген редко синтезируется в пролиферирующих бактериях, но он является возможным источником утечки углерода в условиях, неблагоприятных для роста микроорганизма. Примером такого рода может служить двустадийный процесс, при котором вслед за стадией роста микробов наблюдается синтез полисахарида. Контроль за синтезом гликогена осуществляется путем аллостерической регуляции образования ADP-глюкозы без участия изопреноидных липидов. Синтез экзополисахаридов зависит от наличия нуклеотиддифосфатмоносахаридов, например UDP-глюкозы. Ключевую роль в этом процессе играет UDP-глюкозо — пирофосфорилаза, катализирующая образование предшественников для синтеза полимеров клеточной стенки, например тейхоевых кислот и липополисахаридов, а также экзополисахаридов. Направление предшественников на синтез того или иного полимера осуществляется путем строгой регуляции активности таких активирующих ферментов. Одни нуклеотиддифосфатмоносахара (UDP-галактуроновая и GDP-маннуроновая кислоты) являются предшественниками в синтезе только экзополисахаридов, другие служат также активированными предшественниками при
образовании моносахаридов (например, UDP-глюкоза является предшественником D-галактозы и D-глюкуроновой кислоты). Чтобы какой-либо моносахарид включился в полисахарид, организм должен синтезировать активированный нуклеотидный предшественник. Единственным исключением является L-гулу- роновая кислота, присутствующая в бактериальном альгинате. Она образуется из GDP-маннозы и GDP-маннуроновой кислоты, но сама по себе не активирована. Альгинат синтезируется с использованием активированных маннуронозильных остатков, которые затем подвергаются действию эпимеразы in situ. Степень специфичности этой эпимеразы точно не известна, но она действует только на неацилированные остатки. L-гулуроновая кислота была найдена также в некоторых полисахаридах, не содержащих остатков маннуроновой кислоты. Отметим, что в полисахаридах были обнаружены моносахариды (например, амино- и метилуроновые кислоты, а также метилгексозы), для которых вообще не идентифицировано соответствующее активированное углеводное производное.
Дальнейший контроль за пулом активированных моносахаридов может осуществляться с помощью гидролаз UDP-сахаров, хотя эти ферменты и являются периплазматическими. Кроме того, некоторые ферменты, участвующие в синтезе нуклео- тиддифосфатуглеводов, связаны с мембраной и неизвестно, могут ли продукты этих реакций находиться в свободном состоянии в цитоплазме.
Затем углеводные остатки последовательно переходят от нуклеотида на липидный переносчик, которым обычно служит изопреноидный алкогольфосфат (С5о—Сбо), активированный при переносе сахарофосфата. Так образуются олигосахаридные блоки (от тетра- до октасахаридов), из которых путем последовательного их присоединения к редуцирующему концу цепи и образуется полисахарид. Точный механизм удлинения цепи и высвобождения，полимера неизвестен. Однако участие изопреноидных липидов не является обязательным: например, они не обнаружены у Azotobacter, синтезирующего альгинат. В тех организмах, где эти липиды присутствуют, контроль за синтезом экзополисахаридов может осуществляться за счет изменения доступности таких липидных переносчиков, которая в свою очередь может регулироваться изменением соотношения между свободным спиртом и фосфатом. Регуляция путем дефосфорилирования требует наличия ATP-зависимой киназы для реактивации свободного спирта. Сб5-изопреноид-алкоголь-кина- за ингибируется антибиотиком моеномицином. По-видимому, большинство клеток обладает достаточным количеством изопреноидных липидов для одновременного осуществления всех необходимых реакций синтеза, но если их не хватает, то полиса-
хариды будут синтезироваться только в позднюю логарифмическую фазу или при низкой^ температуре. Антибиотик бацитрацин эффективно связывается с изопреноидными липидами, так что они не могут участвовать в биосинтезе. У мутантов с повышенной резистентностью к этому антибиотику часто наблюдается более интенсивный синтез полисахаридов. Отмечено, что у мутантов, неспособных синтезировать пептидогликаны, образуется больше липидов, нужных для синтеза экзополисахари- дов. По-видимому, потребность в изопреноидных липидах при биосинтезе полисахаридов можно представить в виде следующего ряда: пептидогликан> липополисахарид >экзополисаха- рид.
В синтезе экзополисахаридов могут участвовать различные типы липидных переносчиков, а для синтеза гетерополисахаридов иногда требуется не один вид переносчиков. Модификации полимера, например О-ацетилирование или присоединение пи- руваткеталей, возможны до тех пор, пока он еще связан с липидным переносчиком. Ацетилирование не является обязательным этапом; его отсутствие может быть связано с тем, что в системе нет соответствующих ацетилаз либо достаточного количества предшественника, предположительно ацетил-СоА. При синтезе бактериального альгината ацетильные остатки, связанные в его молекулах с остатками D-маннуроновой кислоты, должны вводиться до эпимеризации; было высказано предположение, что эти ацетильные группы способны предотвращать эпимеризацию. Соотношение пируват/ацетат в ксанта- новых камедях сильно различается, и процесс модификации полимера должен включать механизм, обеспечивающий эти различия. Неизвестно, является ли присоединение пирувата одно- или многоступенчатым процессом; неизвестно также, зависит ли этот процесс от внутриклеточной концентрации фосфоенол пирувата. Полимер ксантан может к тому же состоять из содержащих и не содержащих остатки пирувата цепей в различных соотношениях.
Механизм высвобождения полимера из комплекса с липидным переносчиком до сих пор подробно не изучен. Видимо, какую-то роль здесь играет лигазная реакция, в ходе которой полимер освобождается и связывается с клеточной поверхностью. Обычно после экскреции полисахариды остаются связанными с клеточной стенкой; местом присоединения может служить какой-либо наружный мембранный белок. Очевидно, существует определенное число мест связывания, после насыщения которых избыток полисахарида выделяется уже в виде слизи. Возможно также, что места связывания «приспособлены» к полимеру определенного размера. По-видимому, слизистые мутанты образующих капсулы бактерий либо не имеют
фермента киназы, либо лишены самих мест связывания. Точная локализация мест связывания неизвестна, однако процесс ькскреции должен включать перемещение полимера от места его синтеза — цитоплазматической мембраны — к месту его конечной внеклеточной локализации; для этого гидрофильная молекула должна пройти сквозь гидрофобную мембрану. Высказывалось предположение, что у грамотрицательных организмов местом выхода полисахаридов могут быть участки адгезии (сайты Байера), где внутренняя и наружная мембраны соединяются друг с другом. Однако ни механизм этого явления, ни способы его регуляции до сих пор не известны.
Подходы /с усовершенствованию производства микробных полисахаридов
Использование микроорганизмов для получения промышленно ценных полисахаридов можно сделать более эффективным с помощью следующих усовершенствований: 1) увеличения скорости образования полисахаридов и повышения их выхода; 2) модификации получаемых полисахаридов; 3) изменения поверхностных свойств микроорганизмов-продуцентов для облегчения отделения клеток на последующих этапах переработки; 4) устранения ферментативных активностей, способных вызвать нежелательные модификации полисахаридов; 5) переноса генетических детерминант синтеза полисахаридов в технологически более удобные организмы-продуценты.
Скорость или степень превращения углеводного субстрата в полимерный продукт можно увеличить путем повышения удельной активности участвующих в синтезе ферментов, изменения механизмов регуляции синтетического процесса или увеличения доступности предшественников полисахарида. Число ферментативных стадий биосинтетического процесса зависит от сложности данного полимера, и любая попытка увеличить выход полимера должна быть основана на ясном представлении о данном биосинтетическом пути и механизмах его метаболического контроля. В настоящее время выход увеличивают путем отбора случайных мутантов. Скорость потребления субстрата можно повысить путем дупликации генов, продукты которых участвуют в формировании механизмов поглощения, но такой способ не обязателен, если у данного организма имеется несколько путей транспорта для каждого субстрата.
Для модификации полисахарида в целях улучшения того или иного его свойства также необходимо располагать некоторыми сведениями об особенностях данного пути синтеза. Ксан- тан в водных растворах образует микрогели за счет взаимодействия пируваткеталей полимера с катионами. Эти группы
можно удалить путем обработки полимера щавелевой или трифторуксусной кислотой. Существуют также мутанты, образующие ксантаны, лишенные остатков пирувата или ацетильных групп, а в остальном имеющие неизмененную углеводную структуру и более низкую вязкость. Однако отбор таких мутантов затруднен тем* что модифицированные продукты часто неотличимы от исходных полисахаридов, хотя колонии и могут различаться по внешнему виду и иметь тенденцию к прикреплению к поверхности культуральной среды. Другие способы решения данной проблемы предусматривают выращивание бактерий дикого тйпа в присутствии ингибиторов ацилирования или при недостатке калия либо магния. Можно также выделить мутанты, образующие полисахариды с большей молекулярной массой и, следовательно, с большей вязкостью, но в остальном не отличающиеся от обычных по химическому составу. Длина полимерных цепей иногда зависит от условий роста. Например, в непрерывных культурах Xanthomonas juglandis при малом разведении образуются более длинные неразветв- ленные молекулы.
Процесс выделения полисахаридов можно облегчить путем изменения поверхностных свойств микроорганизма-продуцента (например, за счет удаления поверхностного полимерного материала типа липополисахаридов). В подобных мутантных культурах происходит аутоагглютинация и спонтанная флокуляция, что уменьшает число необходимых операций центрифугирования. Однако нужно внимательно следить за тем, чтобы у таких мутантов клеточный материал, например белки, не 《утекал》из периплазматического пространства или не происходил лизис с загрязнением конечного продукта. К другим изменениям относятся мутации капсулообразующих организмов, приводящие к появлению стабильных, образующих слизи бактерий, а также получение устойчивых к фагам мутантов, что уменьшает риск заражения фагом в процессе производства.
Некоторые микроорганизмы образуют экзополисахариды, впоследствии разрушаемые гидролитическими ферментами. Например, Azotobacter vinelandii синтезирует альгинат и альгина- 3У (альгинат — лиазу). Продуценты ксантана часто выделяют активную целлюлазу, которая способна вызвать деградацию при последующем добавлении ксантана к продуктам, содержащим целлюлозу. Устранить такую нежелательную ферментативную активность можно либо путем умелого подбора условий культивирования, либо за счет использования мутантов, неспособных к образованию подобных гидролитических ферментов.
Штаммы, продуцирующие полисахариды, синтезируют так- ж^ другие полимерные продукты, например другие полисахари- 貝垃,поли-р-гидроксибутират или гликоген. При этом из нужного
биосинтетического процесса может изыматься значительное количество углерода. Следует заняться поисками мутантов, лишенных подобного рода альтернативных синтетических путей. Образование гликогена у прокариот отличается от других путей синтеза полисахаридов, и получение мутантов, дефектных по ключевым ферментам этого пути (ADP-глюкозопирофосфо- рилазе и гликоген-синтетазе), является эффективным решением данной проблемы. Однако для реализации этого подхода необходимо иметь представление о регуляторных механизмах обоих путей. Некоторые виды продуцентов курдлана синтезируют также значительные количества сукциноглюкана. Были получены мутанты Alcaligenes spp., Agrobacterium radiobacter и Rhizobium trifolii, не обладающие этой активностью. Выделены четыре типа мутантов: продуценты сукциноглюкана, продуценты курдлана, продуценты обоих полимеров и мутанты, не синтезирующие курдлан и образующие небольшие количества сукциноглюкана. Сукциноглюкан является гетерополисахаридом глюкозы и галактозы. Оба полимера содержат ацетильные группы и остатки пировиноградной кислоты. Механизм этих изменений в синтезе полимеров неизвестен.
В некоторых случаях предпочтительным является перенос генетических детерминант синтеза полисахаридов. Например, перенос детерминант синтеза альгината из штамма Pseudomonas aeruginosa, выделенного исходно от больного цистофибро- зом, в непатогенные виды Pseudomonas создает предпосылки для промышленного использования этого процесса. Положение генов, ответственных за синтез альгината, уже установлено. Представляет интерес и перенос генов, детерминирующих синтез ксантана, в хозяина, непатогенного для растений. Детерминанты синтеза полисахаридов можно ввести и в более быстрорастущие бактериальные штаммы. Выявлена также возможность превращения штаммов, не способных к синтезу экзополисахаридов, в штаммы — продуценты этих полимеров при помощи отбора на резистентность к карбенициллину. Эта методика с успехом применялась в опытах с некоторыми видами Pseudomonas с целью получения muc-мутантов, синтезирующих полисахариды. По всей вероятности, в подобных случаях у организмов дикого типа синтез альгината был супрессирован, а мутация по соответствующим генам создала условия для экспрессии.
Пол и-р-гидрокеибу тира г
Поли-р-гидроксибутират (ПГБ) — это термопластичный полиэфир, состоящий из повторяющихся блоков —СН (СН3)—СН2—СО—О— и, как было установлено более
50 лет назад, являющийся резервным энергозапасающим соединением. Он накапливается самыми разнообразными микроорганизмами (например, видами Alcaligenest Azotobacter,. Bacillus, Nocardia, Pseudomonas и Rhizobiutn). В некоторых условиях отдельные виды, в частности Alcaligenes eutrophus и Azo- tobacter beijerinckii, способны аккумулировать этот полимерный материал в таком количестве, что он составляет до 70% их сухой массы. Накоплению ПГБ внутри клеток при росте на углеводах или на других источниках углерода, например на метаноле, способствует недостаток фосфора или азота. Поэтому образование данного полимера может быть одностадийным процессом, при котором лимитирующим фактором является с самого начала роста определенное питательное вещество. Процесс может быть и двухстадийным, когда микроорганизмы сначала растят в среде, содержащей достаточное количество питательных веществ, для накопления биомассы, а затем переводят в условия, где лимитирующим рост фактором служит какой-либо компонент среды, кроме углерода, что вызывает значительное повышение уровня внутриклеточного ПГБ. К накоплению ПГБ способны многие виды, но выход продукта и молекулярная масса синтезируемого полимера у них обычно недостаточны для использования этих организмов в промышленном производстве данного полимера. Необходимо, чтобы содержание ПГБ в биомассе составляло не менее 30—40% (по весу), а мол. масса полимера была порядка 200 000—300 000. Поскольку ПГБ образуется в виде внутриклеточных гранул, его экстрагируют из микроорганизмов после разрушения клеток. Предпочтительным методом его очистки служит экстракция растворителями типа галогенированных углеводородов, например 1,2-дихлорэтаном. Альтернативный подход к получению полимера в пригодном к использованию виде состоит в прессовании в формах или экструзии высушенных клеток самого микроорганизма с содержанием ПГБ по весу не менее 50%. Для получения композиции, пригодной к созданию предметов определенной формы, клетки разрушают и при необходимости смешивают с нужным количеством экстрагированного полимера. Один из технологических подходов к изменению полимерных свойств ПГБ предусматривает изменение состава гомополимера in situ. Всегда считалось, что этот резервный энергетический материал является простым полиэфиром мономера p-гидроксибутирата. Однако сейчас установлено, что во многих случаях он представляет собой более сложный гетерополимер разных жирных p-гидроксикислот. Следовательно, состав этого полимера можно менять в процессе роста микроорганизма, например добавлением пропионовой кислоты к культуральной среде: таким способом в образующийся сополимер вводятся
остатки Р-гидроксивалерата. Это в свою очередь изменяет рео- \ логические свойства полимера.
Появление на рынке синтезируемых микробами гетерополимеров ПГБ вряд ли окажет существенное влияние на процветающую индустрию пластмасс; однако полезные свойства этого полимера, особенно его подверженность биодеградации, могут способствовать его применению в ряде областей.
Другие полимеры, образуемые микроорганизмами
Все описанные до сих пор биополимеры полностью синтезируются определенными микроорганизмами в процессе роста на том или ином источнике углерода. Существуют и иные способы получения новых полимерных материалов, предусматривающие использование микроорганизма лишь на отдельных этапах синтеза. При этом микроорганизм служит только микробиологическим катализатором для проведения химического превращения, которое в иных условиях затруднено. В гл. 4 уже упоминалось о реакциях гидроксилирования с участием микробов для получения фенолов и дигидродиолов в целях последующей химической полимеризации. Речь идет о биотехнологическом процессе, предложенном для получения нового полимера, полифенилена, который представляет интерес для специалистов по материаловедению благодаря своей термостабильности и высокой электропроводности. Этот полимер можно синтезировать из бензола и кислорода, используя генетический вариант Pseudomonas putida для осуществления начального превращения бензола в дигидродиол. Этот дважды окисленный продукт выделяется клетками в окружающую среду; его экстрагируют растворителями, а затем получают производные, необходимые для химического синтеза полифенилена. Существуют и иные возможности использования подобной технологии для получения полимеров нафталина и бифенила.
Биоповреждение материалов
/. Введение
Термин «биоповреждение» вошел в наш язык лишь в последнее время, но обозначаемые им процессы известны человеку издавна, с тех пор, как он начал перерабатывать природное сырье и заботиться о сохранности пищевых продуктов. Организмы, ответственные за процессы биоповреждения, сопровождали нас и в еще более отдаленном прошлом, будучи существенным звеном в круговороте элементов биосферы. Человек рано осознал необходимость защиты сырья и пищевых продуктов
от возвращения их в этот круговорот и стал использовать для замедления жизнедеятельности микроорганизмов консервирование или другие защитные способы. Консервирование как эмпирический процесс существует несколько тысячелетий, и имеется множество описаний его использования.
Однако для более полного понимания принципов этого процесса и его научного осмысления потребовалось появление микроскопа и возможностей селективного культивирования и идентификации организмов, вызывающих биоповреждения.
Начало исследованиям процессов биоповреждения положила вторая мировая война; это было связано с поступлением чувствительных к биологическим воздействием материалов на театры военных действий, где высокая температура и влажность ускоряли их порчу. С тех пор мы все более глубоко осоз-наем те проблемы, которые связаны с биоповреждениями продуктов, изготовленных из природного, а позднее — из синтетического сырья. Для полного понимания природы этих процессов требуются совместные усилия экологов, г физиологов, биохимиков и ученых других, небиологических направлений, таких как технология и материаловедение.
Определение биоповреждений
Под биоповреждением понимают «любое нежелательное изменение свойств какого-либо материала, вызванное жизнедеятельностью различных организмов». В широком смысле это процесс, приводящий к уменьшению ценности любого материала. При этом имеются в виду те свойства данного материала, которые обусловливают его использование в определенных целях. По своей природе эти изменения могут быть механическими, физическими или касаться эстетических свойств материала и не обязательно приводят к его химическому разрушению. Последний момент важен для определения различий между биоповреждением и биоразложением (биодеградацией). «Биоповреждение» —термин более широкий, «биоразложение» — ограниченный, относящийся только к разрушению какого-либо продукта (часто сырья), попавшего в окружающую среду (например, нефтепродуктов, пестицидов или детергентов). В общем смысле биоповреждение — процесс нежелательный, а биоразложение обычно рассматривается как желательный.
Употребление слова «организм» предусматривает участие в этом процессе представителей животного и растительного мира; так оно и есть на самом деле. Микроорганизмы как факторы биоповреждения широко изучались и хорошо представлены в литературе. Однако нельзя недооценивать роль насекомых, грызунов, зеленых растений (в том числе водорослей) и даже птиц.
3. Классификация процессов биоповреждения
Использование термина 《материалы》в определении биоповреждений означает, что речь идет о《неживом》，в отличие от патология, изучающей различные нежелательные процессы в живой материи. Различия эти зачастую очень тонки, иногда наблюдается перекрывание в том смысле, что организмы, обнаруживаемые в живой материи или органических остатках» сохраняют свою жизнедеятельность и в неживой материл, уменьшая ценность данного продукта в процессе хранения. Однако во многих случаях со смертью организма-хозяина изменяются условия питания и клеточные компоненты, что приводит к изменению и типа организма, «колонизирующего» данный материал. Так, говоря о действии грибов на хлебные злаки, мы разграничиваем «полевые грибы» и «грибы хранилищ».
Условно можно выделить три типа биоповреждений (табл. 5.1), которые часто в значительной мере перекрываются.
Таблица 5.1. Классификация типов биоповреждений
Процесс
Примеры
Механический
Химический
Повреждение «несъедобных» материалов (например, свинцовых труб, пластмассовых покрытий) грызунами и насекомыми (погрызы, сквозные отверстия). Повреждения дорожных покрытий, и стен, вызванные ростом растений
а) ассимиляционный
Использование в качестве источника питательных веществ субстратов, содержащихся в тех- или иных материалах (например, целлюлозы, древесины или кератина шерсти)
б) диссимиляционный
Продуцирование организмом какого-либо продукта (например, кислоты или токсичного вещества), вызывающего коррозию материала илй другие повреждения, в результате которых материал становится непригодным для использо^ вания
3. Засорение и загрязне-
Засорение трубопроводов; обрастание ракушками
ние
и водорослями корпуса судов; коррозия и потускнение декоративных покрытий и пластиковых занавесей в результате роста грибов иена самом материале, а на поверхностных загрязнениях
Об их наличии очень полезно знать при выборе направления исследований или при разработке рекомендаций, касающихся условий хранения продуктов и материалов.
Материалы, подверженные биоповреждениям
При описании биоповреждений легче всего проводить их классификацию по типу продукта. Однако это оказывается затруднительным, если мы имеем дело со сложными продуктами, например с красками, где встречаются комбинации исходного сырья, такого как целлюлоза и синтетический полимер; здесь классификация по типу продукта невозможна. Было показано, что среда, в которой хранится и используется данный продукт, часто оказывает заметное влияние на организмы, которые в нем обитают, и на активности этих организмов. В следующих разделах мы вкратце рассмотрим продукты, подвергающиеся биоповреждениям. Для более полного знакомства с этими процессами читателю следует обратиться к списку рекомендуемой литературы в конце главы.
Пищевые продукты
В тех странах, где наиболее остро стоит продовольственная проблема, особенно велики и потери сырья после уборки урожая. В развитых странах продукты различными способами защищают от грибов, насекомых и грызунов, так что потери сводятся к минимуму. При хранении зерна необходимо использовать различные химические и физические способы защиты, например пестициды и высушивание. Много неприятностей причиняет присутствие микотоксинов в продуктах, которые были заражены грибами, часто на ранних стадиях хранения. Это может приводить к браковке крупных партий зерна, тем более если оно используется в качестве корма. Особенно тщательной должна быть защита от заражения готовых продуктов. Упаковка может приводить как и подавлению роста микроорганизмов, так и к его стимулированию. Использование немногочисленных химических консервантов регулируется в соответствии с их химической природой законодательным путем.
* Целлюлоза
Целлюлоза в своей исходной форме, в виде различных волокон и древесины, столетиями служила сырьем для получения многих материалов и продуктов. Специалисты по защите материалов постоянно занимались вопросами сохранности изделий из материалов на основе целлюлозы, и сегодня результаты этих исследований широко используются в деревообрабатывающей и текстильной промышленности. Организмы, расщепляющие целлюлозу, составляют лишь небольшой процент от общего числа известных видов грибов и бактерий; несмотря на это.
разрушение материалов на основе целлюлозы представляет собой весьма распространенное явление и в ссочветствующих условиях может происходить очень быстро. В земле при 25 ℃ хлопчатобумажная ткань полностью теряет сеою прочность за 10 сут. Насколько нам известно, за разрушение целлюлозы ответственны скорее всего грибы. Условия внутри целлюлозных материалов (относительная влажность меньше 90%, очень низкое содержание азота, кислый pH) часто оказываются благоприятными для их развития. Разветвленные гифы грибов с легкостью проникают сквозь клеточные стенки, ближе к целлюлозе, обычно тесно связанной с лигниновой и гемицеллюлозной матрицей. Определенную роль, несомненно, играют и бактерии: они наверняка участвуют в разрушении пектиновых слоев и углублений в древесине мягких пород, что приводит к проникновению внутрь древесины воды и бактерий.
Подверженность древесины биоповреждениям обусловлена характером распределения в ней питательных веществ. Если древесина соответствующим образом не просушена, а заболонь не срезана для предотвращения миграции питательных веществ, то во влажных условиях может развиться ее голубое окрашивание и начаться поверхностное повреждение.
Для повышения качества или улучшения тех или иных свойств древесины ее можно химически модифицировать. Повышенной устойчивостью к микроорганизмам (видимо, из-за уменьшения гидролизуемости) обладают ацетат целлюлозы, вискоза и различные замещенные производные целлюлозы (например, карбокси- и этоксицеллюлоза). При введении в эмульсии замещенные производные целлюлозы действуют как наполнители и агенты, влияющие на вязкость.
Продукты животного происхождения
Большинство продуктов животного происхождения, чувствительных к биоповреждениям, имеет белковую природу. К ним относятся шкуры, шерсть и клеи. Бактерии и грибы часто оказывают неблагоприятное воздействие на шкуры и шерсть уже на ранних этапах их обработки. Более того, из-за большой загрязненности свежих шкур или шерсти их порча может начаться в течение 48 ч, еще на бойне или в помещении для стрижки. Для предотвращения этого процесса шкуры дубят, а шерсть обезжиривают. Однако при некоторых способах дубления шкуры вымачивают вначале в воде. Если такое вымачивание проводится при повышенных температурах и продолжается длительное время, происходит размножение бактерий. В коже, используемой для изготовления книжных переплетов, нередко бывает повышено содержание углеводов, что способствует раз-
витию плесени при хранении в условиях повышенной влажности.
В целом шерсть наиболее чувствительна к бактериям во время обработки, а клеи могут разрушаться как при хранении в различных емкостях, так и после высыхания и образования пленки.
Поверхностные покрытия
Поверхностные покрытия (краски, различные типы лаков) играют двоякую роль: они выполняют декоративную функцию и защищают покрываемую поверхность от вредных воздействий среды, в том числе и от микроорганизмов. Из-за постепенного отказа от введения свинца в состав красок и широкого распространения эмульсионных покрытий возникла проблема биоповреждения самих красок. Такое повреждение происходит как при хранении красок в емкостях, так и после нанесения их на поверхность и высыхания с образованием пленки. Большинство исследований в этой области направлено на создание эффективных защитных систем, которые действовали бы все то время, пока существует данное покрытие. Краски содержат пигменты, связывающие вещества, эмульгаторы, масла, смолы и смачивающие агенты; они могут быть растворены в воде или в специальных растворителях. Некоторые из этих ингредиентов, например казеин, крахмал, целлюлоза и пластификаторы, могут разрушаться микробами, а применение альтернативных, устойчивых к микробному разрушению компонентов зачастую невозможно. Развитие микроорганизмов в пленках очень сильно зависит от факторов окружающей среды: температуры, влажности, наличия на поверхности питательных веществ (например, удобрений, приносимых ветром). Повреждения в емкостях часто связаны с жизнедеятельностью бактерий, но могут быть обусловлены и развитием грибов. Кроме того, в жидких эмульсионных красках могут оставаться внеклеточные ферменты, например входящие в состав целлюлазной системы; эти ферменты способны снижать вязкость эмульсии.
Резины 〃 пластмассы
Резины и пластмассы представляют собой материалы, содержащие каучук или какой-либо синтетический полимер. До 50% их состава может приходиться на долю добавок, используемых в качестве пластификаторов, антиоксидантов и веществ, защищающих данный материал от гидролиза и УФ-света. Кроме того» добавки служат наполнителями и пигментами. Многие из них чувствительнее к повреждениям, чем сам полимерный «ске-
16—1344
лет». Так, поливинилхлорид (ПВХ) в непластифицированной форме очень устойчив к биоповреждениям, однако применение его как такового ограничивается тем, что он не пластичен. Для придания такому материалу пластичности в него вводят пластификатор, которым часто служит сложный эфир органической кислоты, однако этот же пластификатор повышает чувствительность материала к биоповреждениям.
Природные каучуки состоят из регулярно повторяющихся изопреновых остатков, подверженных окислению, в результате которого возрастает вероятность разрушения их под действием микроорганизмов. Введение поперечных сшивок и добавление антиоксидантов замедляют этот процесс. Были созданы синтетические каучуки с улучшенными свойствами, в том числе устойчивые к биоповреждениям. Очень устойчивы к действию микробов силиконовые, нитрильные и неопреновые резины.
В целом синтетические полимеры, используемые в качестве пластмасс (такие, как полиэтилен, полистирол и ПВХ), сами по себе устойчивы к микроорганизмам. Однако некоторые из полимеров, применяемых все более широко, оказались чувствительными к ним. Таковы полиуретаны—нечетко ограниченное семейство полимеров, выделяемое по признаку наличия уретановой группировки; молекула их содержит также замещенные мочевинные, биуретовые, амидные и аллофанатные группировки. Кроме того, для придания такому полимеру эластичности в него химическим путем вводят простые и сложные эфирные группировки. Большая часть всех этих группировок в соответ- -ствующих условиях чувствительна к химическому, а также, вероятно, к ферментативному гидролизу. Видимо, подверженность гидролизу определяется конфигурацией молекулы; известно также, что сложноэфирные связи особенно легко гидролизуются микроорганизмами. По крайней мере в одном случае было показано, что вероятность биоповреждения уменьшается в результате использования соединений, препятствующих гидролизу. Тем не менее наши знания относительно путей расщепления полиуретанов остаются далеко не полными. Высокая износоустойчивость полиуретанов и их стойкость к истиранию гарантировали им прочное место на рынке пластмасс, и маловероятно, что в ближайшем будущем им будет найдена замена.
Топлива и смазочные материалы
К этой группе веществ относятся прежде всего фракции нефти с четко выраженными гидрофобными свойствами. При их контакте с водой может происходить целый ряд процессов с участием микроорганизмов. Подобно пластмассам, эти продукты
содержат многочисленные добавки, улучшающие их свойства^ которые повышают чувствительность такого рода продуктов к биоповреждениям.
В качестве топлива для реактивных самолетов широко используют керосин. В емкостях для его хранения и в топливных баках самолетов неизбежно присутствует вода, поэтому на поверхностях раздела топливо — вода и вода — металл начина* ется рост грибов. При отсутствии контроля развивающиеся грибы отделяются от поверхности и попадают в топливную систему. Это приводит к засорению фильтров и топливопроводов и тем самым к искажениям показаний приборов. Из сред подобного рода неоднократно выделяли особый гриб Cladosporium resinae. Перемещение топлива внутри топливных систем самолета увеличивает аэрацию, а в ультразвуковом самолете топливо служит тепловым амортизатором. Внутри некоторых топливных баков температура доходит до 55°C. По-видимому, все это способствует росту термофильных грибов.
Более тяжелая фракция нефти (масла) используется промышленностью в гидравлических системах для их смазки, а также применяется для облегчения механической обработки металлов на токарных станках и при шлифовании. Попадание воды в такие системы приводит к их повреждению либо в результате заклинивания из-за снижения эффективности смазочного материала, либо в связи с началом коррозии, вызываемой кислыми промежуточными продуктами жизнедеятельности микробов. В металлообрабатывающей промышленности важнейшие проблемы связаны с микробным заражением рабочих жидкостей; оно вызывает расслоение эмульсий, коррозию обрабатываемых деталей и повышенный износ токарных станков. Относительная роль отдельных микроорганизмов в биоповреждениях масел подобного типа до конца не изучена. Однако в подходящих условиях, видимо, можно легко выделить организмы, способные к прямому использованию данного масла, разрушению эмульгатора и образованию сероводорода.
Металлы и камни
Строгих доказательств связи между активностью определенных микроорганизмов и процессами коррозии не существует. Возможны три механизма коррозии: образование корродирующих веществ (кислоты, сероводород, аммиак); образование ячеек с различной аэрацией; катодная деполяризация. Все это при- всщнт к。появлению ржавчины, а затем к разъеданию стенок емкостей для хранения горючего, имеющих водный отстой, и баков для самолетного топлива, а также к образованию в водопроводных трубах пробок, затрудняющих ток воды. Для за- 16*
щиты от коррозии применяются обычные методы, в том числе механические ингибиторы, поверхностные покрытия и анодная защита.
Камни подвержены воздействиям многочисленных химических и иных факторов окружающей среды, способствующих их эрозии. Проблема биоповреждений камня возникает в связи с применением его в строительстве или для изготовления памятников, когда необходимо сохранить данную конструкцию. Как и в случае металлов, продемонстрировать непосредственное участие микроорганизмов в подобных процессах разрушения крайне трудно. Тем не менее было предложено несколько механизмов. Первый из них — механическое воздействие: развитие микроорганизмов способствует накоплению воды, замерзание и оттаивание которой приводит к разрушению поверхностей. Второй механизм состоит в расширении и сжатии микробных клеток, а третий — в образовании хелатных комплексов между минералами и органическими кислотами, выделяемыми микробами. Было показано, что бактерии могут переводить в раствор нерастворимые фосфаты и силикаты за счет образования 2-кетоглутаровой кислоты. Видимо, в разрушении камней существенную роль играют не упоминавшиеся до сих пор лишайники, что может быть обусловлено их способностью к сжатию и расширению (изменение влажности от 15 до 300% за 2—3 ч) при высушивании или увлажнении и к проникновению внутрь пород. Недавно были изучены спилы пород, населенных лишайниками; показано, что гриб-симбионт способен глубоко в них проникать и избирательно растворять минеральные компоненты.
ЛИТЕРАТУРА
Микробное выщелачивание
Brierley С. L. (1978). Bacterial leaching, Crit. Rev. Microbiol., 6, 207—262.
Brierley C. L. (1982). Microbiological mining, Scient. Am., 247, 42—51.
Fenchel T., Blackburn T. H. (1979). Bacteria and Mineral Cycling, Academic Press, London.
Murr L. E., Tor ma 4 E, Brierley J. Д. (eds.) (1978). Metallurgical Applications of Bacterial Leaching and Related Microbiological Phenomena, Academic Press, New York.
Potter G. M. (1981). Design factors for heap leaching operations, Mining Eng., 33, 277—281.
Иммобилизация металлов
Kelly D P., Norris P. R., Brierley C. L. (1979). Microbiological methods for the extraction and recovery of metals. In: Microbial Technology: Current State, Future Prospects (eds. Bull. А. Т.» Ellwood D. C. and Ratledge C.), Cambridge University Press, Cambridge.
Norris Р. R, Kelly D. Р. (1979). Accumulation of metals by bacteria and yeast, Devs ind. Microbiol., 20, 299—308.
Norris P. R., Kelly D. P・(1977). Accumulation of cadmium and cobalt by Sac- charomyces cerevisiaet J. gen. Microbiol., 99, 317—324.
Norris P. R., Kelly D. R (1982). The use of mixed microbial culture in metal recovery. In： Microbial Interactions and Communities, Vol. I (eds. Bull A. T., Slater J. H.), Academic Press, London.
Strandberg G.取.，Shumate S. A, Parrot J. R. (1981). Microbial cells as biosorbents for heavy metals: accumulation of uranium by Saccharomyces cerevisiae and Pseudomonas aeruginosa, Appl. Environ. Microbiol., 41, 237—245.
Tuovinen О. H., Kelly D. P. (1974). Use of microorganisms for the recovery of metals, Int. Metall. Revs, 19, 21—31.
Биополимеры
Baird J. K, Sandford P. 4, Cottrell /. W. (1983). Industrial applications of some new microbial polysaccharides, Biotechnology, 1, 778—783.
Berkely R. C.步.，Gooday G. W.f Ellwood D. C. (eds.) (1979). Microbial Polysaccharides and Polysaccharases, Society for General Microbiology and Academic Press, London.
Dawes E 4, Senior P. J. (1973). Energy reserve polymers in microorganisms, Adv. Microbial. Physiol., 10, 136—266.
Sutherland /. W. (1982). Biosynthesis of microbial exopolysaccharides, Adv. Microbial Physiol., 24, 79.
Sutherland /. W. (1983). Extracellular polysaccharides, In: Biotechnology, Vol. 3, Biomass, Microorganisms, Products 1, Energy (ed. Dellweg H.), Verlag Chemie, Weinheim.
Биоповреждение материалов
Eggins H. 0. W.t Oxley T. 4 (1980). Biodeterioration and Biodegradation Bull., 16, 53—56.
Gilbert L. /., Lovelock D. W. (eds.) (1975). Microbial Aspects of the Deterioration of Materials, Academic Press, London.
Onions А. Я. S., Allsopp D., Eggtns H. 0. F. (1981). Smith's Introduction to Industrial Mycology, 7th edn, Edward Arnold, London.
Rose A, H. (ed.) (1981). Microbial Biodeterioration, Economic Microbiology, Vol. 6, Academic Press, London.
Seal 氏丄，Eggins ^. 0.步.(1981). The bioterioration of materials. In: Essays in Applied Microbiology (eds. Norris J. R. and Richmond M. H.), John Wiley and Sons, Chichester.
Глава 6 —
Окружающая среда и биотехнология
”.Бест, Дж. Джонс, Д, Стаффорд
Введение
С момента возникновения цивилизованного общества перед ним все время стояла проблема охраны окружающей среды. Из-за промышленной, сельскохозяйственной и бытовой деятельности человека постоянно происходили изменения физических^ химических и биологических свойств окружающей среды, причем многие из этих изменений были весьма неблагоприятны. Мы ожидаем, что биотехнология будет оказывать многообразное и все возрастающее влияние на способы контроля за окружающей средой и на ее состояние. Хорошим примером та- кого рода служит внедрение новых, более совершенных методов переработки отходов, однако этим применение биотехнологии в данной сфере отнюдь не ограничивается. Она будет играть все большую роль в химической промышленности и сельском хозяйстве и поможет хотя бы отчасти решить многие из существующих здесь проблем.
В этой главе мы рассмотрим проблему переработки отходов как в исторической перспективе, так и в плане той роли, которую биотехнология уже играет и будет играть в этой сфере. Мы остановимся также на применении биотехнологии в борьбе против недавно возникшей для окружающей среды угрозы — распространения ксенобиотиков и нефтяных загрязнений.
Сегодня быстро развиваются разнообразные отрасли промышленности, в которых процессы жизнедеятельности микроорганизмов используются для создания замкнутых систем, для контроля за загрязнением сточных вод, для использования альтернативных энергоресурсов и химического сырья в промышленности; эти процессы широко используются и в сельском хозяйстве. В развивающихся странах подобная деятельность, известная под названием «целенаправленная технология», могла бы привести к значительному повышению жизненного уровня и — что еще более важно — повышению качества жизни многих миллионов людей. Масштабы некоторых из этих новых биотехнологических процессов и их применение для реше-
ния задач охраны окружающей среды могут быть совершенно ошеломляющими. Так, для переработки отходов уже построены огромные биореакторы емкостью 4000—5000 м3. Поскольку концентрация бактерий в таком реакторе может быть порядка Ю8—109 клеток в 1 мл, биотехнологи получают в свое распоряжение достаточно мощный источник «биологической энергии».
Биологическая переработка отходов опирается на целый ряд дисциплин — биохимию, генетику, химию, микробиологию, химическую технологию и вычислительную технику. Усилия всех этих дисциплин концентрируются на трех основных направлениях: 1) деградация органических и неорганических токсичных отходов; 2) возобновление ресурсов для возврата в круговорот веществ углерода, азота, фосфора и серы; 3) получение ценных видов органического топлива.
Переработка отходов
Тысячелетиями отходы деятельности человека перерабатывались естественным путем, при участии соответствующих микроорганизмов. В наиболее широко распространенных установках для очистки сточных вод выполняются четыре основные операции (рис. 6.1).
При первичной обработке удаляются твердые частицы, которые либо отбрасываются, либо направляются в реактор.
На втором этапе происходит разрушение растворенных органических веществ при участии природных аэробных микроорганизмов. Образующийся ил, состоящий главным образом из микробных клеток, либо удаляется, либо перекачивается в реактор. По технологии, использующей активный ил, часть его возвращается в аэрационный тэнк.
На третьем этапе (необязательном) производится химическое осаждение и разделение фосфора и азота.
Для переработки ила, образующегося на первом и втором этапах, обычно используется процесс анаэробного разложения. При этом уменьшается объем осадка и количество патогенов, устраняется запах, а кроме того, образуется ценное органическое топливо ——метан.
Сходные процессы применяют при переработке промышленных сточных вод, особенно в химической, пищевой, целлюлозно-бумажной промышленности. Поэтому совершенно очевидно, что любые биотехнологические усовершенствования этих процессов найдут немедленное применение в промышленности. Такие усовершенствования могут быть направлены на увеличение мощности перерабатывающих установок, повышение выхода полезных побочных продуктов, на замену обычно применяе-
мых синтетических химических добавок, устранение запаха и удаление металлов, а также не поддающихся переработке соединений.
С.2.1. Аэробная переработка отходов (см. также гл. 9)
Аэробная переработка стоков — это самая обширная область контролируемого использования микроорганизмов в биотехнологии. Она включает следующие стадии: 1) адсорбция субстрата на клеточной поверхности; 2) расщепление адсорбированного субстрата внеклеточными ферментами; 3) поглощение растворенных веществ клетками; 4) рост и эндогенное дыхание; 5) высвобождение экскретируемых продуктов; 6) «выедание» первичной популяции организмов вторичными потребителями. В идеале это должно приводить к полной минерализации отходов до простых солей, газов и воды. Эффективность переработки пропорциональна количеству биомассы и времени контактирования ее с отходами.
Системы аэробной переработки можно разделить на системы с перколяционными фильтрами и системы с использованием активного ила.
Перколяционные фильтры
Перколяционный фильтр был самой первой системой, примененной для биологической переработки отходов, причем его конструкция фактически не изменилась со временени создания в 1890 г. Эта система используется в 70% очистных сооружений Европы и Америки и обладает рядом преимуществ, которые состоят в простоте, надежности, малых эксплуатационных расходах, образовании небольших излишков биомассы и возможности длительного использования установки (в течение 30—50 лет).
Основной недостаток перколяционного фильтра — избыточный рост на нем микроорганизмов; это ухудшает вентиляцию, ограничивает протекание жидкости и приводит в конечном счете к засорению фильтра и выходу его из строя. Одна из недавних модификаций установки состоит в использовании чередующегося двойного фильтрования (ЧДФ), когда фильтры, на которые сначала поступает поток жидкости, периодически меняют местами с другими фильтрами. ЧДФ особенно ценно при ■очистке промышленных стоков. Для разрушения слоев грязи в толще фильтров используют также обратную циркуляцию и пульсирующую подачу. Это улучшает величину биохимической потребности в кислороде (ВПК), но снижает нитрифицирующую активность. Другие модификации в конструкции и работе
установок с перколяционными фильтрами состоят в уменьшении скорости поступления жидкости для более равномерного распределения биомассы, а также в использовании прямой двойной фильтрации с большим объемом среды, когда на первый фильтр поступает больший объем среды и тем самым увеличивается его загрузка.
В 1970 г. на смену клинкеру, камню или гравию в системах с перколяционными фильтрами пришли пластмассы. Это позволило применять такие системы для переработки некоторых промышленных стоков высокой концентрации. Другим важным преимуществом явилось то, что пластмассы — легкий материал^ и это позволяет строить высокие, не занимающие много места очистные сооружения. Для создания оптимальной поверхностной площади, вентиляции и пористости пластмассы размалывают.
Основное изменение в конструкцию очистных сооружений в Англии было внесено в 1973 г., когда был создан вращающийся биологический реактор. Он представляет собой вращающиеся «соты» из пластиковых полос, попеременно погружаемые в сточные воды и поднимаемые на поверхность. При таком способе увеличивается площадь поверхности, с которой может контактировать биомасса, и улучшается аэрация (разд. 6.6).
Среда, в которой находится перколяционный фильтр, не является водной в прямом смысле, поскольку это всего лишь тонкая водная пленка над слоем биомассы. Определить, какие именно микроорганизмы присутствуют в среде, довольно трудно из-за сложности и гетерогенности биомассы. По-видимому, основной активной группой бактерий, участвующих в переработке сточных вод, служат ZoOgloea, хотя определенную роль играет и ряд других бактерий. В очистных сооружениях отмечается также активный рост некоторых видов нитчатых бактерий и грибов. Из водорослей чаще всего присутствуют сине-зеленые (Cyanophyceae) и Chlorophyceae. Встречаются и многочисленные Metazoa, в том числе земляные черви, насекомые и ракообразные. Мухи и черви очень важны для регуляции развития пленок. -
Активный "力
Переработка отходов с помощью активного ила, осуществляемая сложной смесью микроорганизмов, была предложена в 1914 г. Этот процесс более эффективен, чем фильтрация, и позволяет перерабатывать сточные воды в количестве, в десять раз превышающем объем реактора. Однако он обладает рядом недостатков: более высокими эксплуатационными расходами из-за необходимости перемешивания и аэрации; большими
трудностями в осуществлении и поддержании процесса; образованием большого избытка биомассы. Несмотря на все это, процесс, использующий активный ил, остается наиболее распространенным методом переработки сточных вод в густонаселенных районах, поскольку требует меньших площадей, чем эквивалентная фильтрационная система.
Как и в фильтрационные системы, в систему с активным илом были внесены некоторые изменения. Следующие из них связаны с аэрацией.
Градиентная аэрация, приводящая интенсивность аэрации в соответствие с потребностью в кислороде, которая на входе -больше, чем на выходе.
Ступенчатая аэрация, при которой по всей длине тэнка -сточные воды поступают с интервалами.
Констактная стабилизация, при которой повторно используемый ил аэрируется, что способствует более полной утилизации микроорганизмами любых доступных питательных компонентов. Это приводит к более полной ассимиляции отходов при возврате в основные рабочие тэнки. В результате объем ила на стадии аэробного разложения уменьшается, и поэтому в принципе это аналогично увеличению аэрации.
Использование чистого кислорода в закрытых тэнках, которые поэтому могут работать при более высоких концентрациях биомассы; таким образом уменьшается время пребывания сточных вод в тэнке и, кроме того, решается проблема «разбухания» (избыточного роста нитчатых бактерий и грибов, препятствующего оседанию ила).
о 5. Разработка колонного эрлифтного ферментера компанией ICI в 1974 г. (рис. 6.2). Он более экономичен, чем обычный, благодаря уменьшению времени пребывания сточных вод в тэнке и снижению эксплуатационных расходов.
Активный ил ——это истинно водная среда. Как и в перколяционных фильтрах, основная группа бактерий, участвующих в процессе переработки, — это Zoogloea. Считается, что активно растет только небольшая часть флокуляционного ила. По сравнению с перколяционными фильтрами в активном иле наблюдается меньшее экологическое разнообразие. Рост водорос- 』е力 ограничивается недостатком света, а виды и разнообразие присутствующих в иле простейших определяются степенью переработки отходов (рис. 6.3).
Для успешной переработки бытовых и промышленных отходов необходимо точно знать состав и концентрацию стоков. Это служит «руководством к действию》： зная качественные и количественные характеристики среды, можно сразу устано- внть, какой микробный посевной материал необходим для инициации работы системы. Часто бывает трудно показать, что
сdoEmdB5HwhAMKg
ngos SXSB
金гий^ошоЕО)'ITBLUSED-nhQ
^§ 5SS^&H—^— s^ яшзокхз г
§mEoucb
0^0£s^
Ш
Рис. 6.3. Микроорганизмы, присутствующие в активном иле. Микрофотографии получены с помощью сканирующего электронного микроскопа и любезно предоставлены Дж. Моррисом. A. Epistylis (Х1000). В Стебельчатые бактерии (Х16 ООО). В. Жгутиковые бактерии (Х5000). Г. Vaginocolidae (Х750). Д. Колония Epistylis sp. (Х350). £ Vorticella sp. (X1000).
Q
XH办E
7喝
-qHMEJ
-днгфихе «3®КО§^ .-9°'sd
именно те микроорганизмы, которых выделяют из систем биологической переработки отходов, осуществляют окисление присутствующих соединений.
Микробиологическое изучение любой системы, использующей активный ил, включает: 1) идентификацию микроорганизмов и определение их численности; 2) оценку микробиологической активности как популяции в целом, так и отдельных видов; 3) оценку соотношения между (1) и (2), с одной стороны, и количеством вводимых питательных веществ и продуктов переработки — с другой.
Микробиологическую активность активных илов можно оценивать по приросту биомассы или по интенсивности общего метаболизма; последний включает изменения, происходящие
в среде. Измерения могут проводиться и для какой-то отдель* ной популяции микроорганизмов. Можно показать, что активность ила связана с определенными бактериями, точно подсчитать их число и определить метаболическую активность. Далее можно выяснить, в какой мере та или иная специфическая активность ила определяется конкретными видами бактерий с известными свойствами, и установить, какое влияние оказывают на них неблагоприятные условия, в которых они оказываются из-за поступления в среду тех или иных питательных веществ или продуктов метаболизма других микроорганизмов. Для <точных вод, поступающих в емкость с активным илом, характерны высокие концентрации органических соединений и, следовательно, наличие больших количеств хемоорганотрофных видов, например Achromobacter, Flavobacterium, Pseudomonas и Moraxella, а также многих других бактерий. При высоких ^концентрациях неорганических соединений в стоках обнаруживаются бактерии Thiobacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter и Ferro- ■bacillus spp. окисляющие соответственно серу, аммиак и железо. Эти организмы были выделены из систем для переработки ютходов и идентифицированы с помощью методов селективных культур. В ходе этих работ важно установить, играют ли какие-либо виды главенствующую роль в тех процессах, которые протекают в активном иле. Этот аспект часто недооценивается, особенно небиологами. Нередко бывает трудно однозначно установить роль того или иного микроорганизма. Например, если из системы по переработке отходов выделены Tbiobacillus, окисляющие соединения серы, то это еще не означает, что вся активность такого рода определяется именно этими микроорганизмами: частичное окисление ряда соединений серы осуществляют и виды Pseudomonas.
Взаимосвязи между организмами, участвующими в катаболизме органических и неорганических субстратов, имеют важное значение для регуляции процессов, происходящих в активном иле. Промежуточные продукты метаболизма у одного вида бактерий способы оказывать влияние на процессы деградации у другого. Например, известно, что фенол подавляет активность организмов, окисляющих аммиак: он может ингибировать этот окислительный процесс даже при столь малых концентрациях, как 3—4 м. д.
Промежуточные продукты расщепления бензойной кислоты до катехола, сукцината и ацетата ингибируют образование ферментов, участвующих в начальных этапах расщепления. Катехол и сукцинат подавляют синтез ферментов, разрушающих ^бензоилформиат и бензальдегид, по механизму обратной связи, .а ацетат действует как катаболитный репрессор: наличие простого органического соединения подавляет расщепление более
сложных молекул до тех пор, пока это более простое соединение не будет использовано. Когда ингибирование снимается», синтезируются новые ферменты, ответственные за расщепление- более сложных ароматических структур. На практике при наличии в отходах гомологичных рядов каких-либо соединений необходимо образование ферментов, способных справиться с расщеплением самой сложной молекулы данного ряда. Полное расщепление таких соединений должно происходить в течение определенного минимального времени удержания (нахождения отходов в реакторе) в процессе переработки. Следовательно, можно предсказать, какая обработка потребуется для. окисления фенольных соединений; например, чем сложнее боковая цепь молекулы, тем больше времени необходимо для： ферментативного разрушения этого вещества.
Эффективность данного процесса можно повысить, изучив> механизмы регуляции метаболизма в микрофлоре систем с активным илом. Регуляция биодеградации ——это сложная задача. Однако, зная биохимию соответствующих процессов, мы^ по-видимому, сможем вмешиваться и в их регуляцию. Например, добавление к илу промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот в низких концентрациях (2——5 мг/л), глюкозы, аминокислот и витаминов (в частности, аланина и никотиновой кислоты) приводит к ускорению окисления ряда соединений. Введение этих промежуточных продуктов в состав： биомассы увеличивает энергетические потребности системы,, стимулирует синтез АТР за счет усиленного окисления неорганических веществ типа серы или аммиака. Понимание биохимии подобных процессов, видимо, даст возможность вмеши* ваться в процессы регуляции метаболизма.
Задача микробиолога-биотехнолога при разработке методов- очистки сточных вод состоит в более полном изучении и учете- взаимосвязи между активностью микроорганизмов, образованием хлопьев ила и производительностью установки по переработке отходов. В этом смысле превращения в системе активного ила следует рассматривать в основном как окислительные- процессы во влажной среде, сопровождающиеся увеличением объема ила, которое можно расценивать как вредное или полезное (последнее — когда ил используется повторно). Совершенно очевидно, что биологический способ переработки пригоден для множества различных органических и неорганических соединений и устраняет их вредное воздействие на окружающую среду.
Акт о защите среды от загрязнений от 1974 г. по мере претворения его в жизнь будет оказывать все возрастающее влияние на технологию очистки сточных вод. Термин «биодеградация» используется сейчас очень широко, но имеет множество：
толкований. Иногда под биодеградацией понимают полную минерализацию какого-либо соединения микроорганизмами с образованием углекислого газа, сульфата, нитрата и воды; это одна крайность. Другая крайность состоит в том, что данный термин используют применительно к незначительным изменениям соединений, приводящим к утрате некоторых характерных их свойств. Стандартные методы оценки деградации позволяют определить термин «биодеградация» следующим образом: 1) первичная деградация, при которой характерные свойства исходного соединения утрачиваются и перестают выявляться специфическими химическими тестами; 2) допустимая для окружающей среды биодеградация, при которой происходит минимальное изменение исходного соединения, необходимое для утраты его свойств (оба этих определения основаны на произвольных критериях и поэтому неточны); 3) окончательная биодеградация, включающая полное превращение исходного соединения в неорганические конечные продукты и связанная с нормальными процессами метаболизма микробов.
В ходе изучения деградации широкого круга органических веществ были выделены микроорганизмы, способные к разрушению весьма необычных соединений (рис. 6.4 и 6.5).
Принцип ^псевдоожиженного слоя》
Данная технология, введенная в практику в 1980 г.» во многих отношениях представляет собой сочетание систем перколяционных фильтров и активного ила. Она весьма экономична благодаря использованию высоких концентраций микроорганизмов и отсутствию необходимости в осаждении конечных продуктов. Существуют два основных типа установок.
Уловитель Саймона Хартли. Он был разработан на основании исследований, проведенных в научно-техническом институте Манчестерского университета. Биомассу наращивают в пустотах внутри прокладок из пористого полиэфира, которые удерживаются внутри реактора с помощью сеток. Прокладки периодически удаляют из реактора, густую биомассу (до 15 кг на каждый кубометр обводненного носителя) отжимают и пустые прокладки возвращают в реактор.
Оксигенатор Дорра — Оливера. Здесь в качестве подложки используется песок; его периодически выпускают из реактора, очищают и используют снова.
Возможное нежелательное последствие интенсификации -аэробной обработки — это излишнее образование ила. Стоимость его удаления может составить до 50% расходов на переработку сточных вод. Альтернативные решения состоят или
Лекарственные вещества,продуцируемые живыми системами
/н ' с — с/н ' с — с2 -с — с2 -с — сНикотинНикотин
/н ' с — с
/н ' с — с
2 -с — с
2 -с — с
Никотин
Никотин
£ Окислитель и ускоритель вулканизации£ Окислитель и ускоритель вулканизацииВ Противокоррозионные присадкиВ Противокоррозионные присадки
£ Окислитель и ускоритель вулканизации
£ Окислитель и ускоритель вулканизации
В Противокоррозионные присадки
В Противокоррозионные присадки
2-Меркап то бензо тиазол2-Меркап то бензо тиазолМорфолинМорфолин
2-Меркап то бензо тиазол
2-Меркап то бензо тиазол
Морфолин
Морфолин
Тиофен-2-карбоновая кислотаТиофен-2-карбоновая кислотаНООСHSC —СОСоАНООСHSC —СОСоАСложный эфир Со/\-2 меркапто- Д2- пентендиоевой кислотыСложный эфир Со/\-2 меркапто- Д2- пентендиоевой кислоты5 Гидрокситиофен-2-карбоксил-СоА5 Гидрокситиофен-2-карбоксил-СоА
Тиофен-2-карбоновая кислота
Тиофен-2-карбоновая кислота
НООСHSC —СОСоА
НООСHSC —СОСоА
Сложный эфир Со/\-2 меркапто- Д2- пентендиоевой кислоты
Сложный эфир Со/\-2 меркапто- Д2- пентендиоевой кислоты
5 Гидрокситиофен-2-карбоксил-СоА
5 Гидрокситиофен-2-карбоксил-СоА
Рис. 6.4. Основные группы соединений, которые обнаруживаются в отходах производства лекарственных препаратов, синтетических гербицидов и других нефтехимических продуктов и подвержены биодеградации.
Тиофен-2-карбоксил-СоА
НООС О=С —СОСоА а -Оксоглутарил-СоА
Рнс. 6.5. Промежуточный метаболизм аналога тиофена в одном из видов Fla- vobacterium.
в последующем использовании этого ила (разд. 6.5), или в разобщении анаболической и катаболической активности для неполного превращения субстрата в биомассу (этого можно достичь, создав условия постоянной нехватки микроэлементов или делая перерывы в подпитке).
17—1344
622* Анаэробное разложение (см. также гл. 2 и 9)
Все возрастающая стоимость переработки отходов с помощью аэробного разложения и энергетический кризис, с одной стороны, и новые достижения микробиологии и технологии — с другой, возродили интерес к анаэробной переработке. Самая распространенная технология анаэробной переработки——разложение ила сточных вод. Эта хорошо разработанная технология с успехом используется с 1901 г. Однако здесь существует ряд проблем, обусловленных малой скоростью роста облигатных анаэробных метанобразующих бактерий, которые используются в данной системе. К ним относятся также чувствительность к различным воздействиям и неприспособленность к из- менениям нагрузки. Конверсия субстрата также происходит довольно медленно и поэтому обходится дорого. Некоторые- проблемы связаны с неудачными инженерными решениями. Тем не менее этот подход представляется перспективным с точки, зрения биотехнологии； например, можно добавить к отходам ферменты для повышения эффективности процесса или попытаться усилить контроль за переработкой путем изменения тех или иных биологических параметров (разд. 6.3).
Анаэробная ферментация отходов или растительных культур, специально выращиваемых для получения энергии, очень перспективна для экономичного получения газообразного топлива при умеренных температурах (30——35℃). Эта новая отрасль биотехнологии была развита микробиологами в сотрудничестве с инженерами-химиками и механиками, работниками： сельского хозяйства и экономистами.
При выращивании сообщества различных бактерий на смеси органических соединений происходят сложные биохимические- реакции (рис. 6.6) Метанобразующие бактерии способны к синтезу энергоносителя непосредственно из водорода и углекислого газа. Микроорганизмы, расщепляющие целлюлозу, синтезируют жирные кислоты, которые могут подвергаться восстановительному расщеплению до метана и углекислого газа; некоторые бактерии способны даже образовывать молекулярный водород. Описано сложное, взаимозависимое микробное сообщество, в котором можно выделить три группы бактерий: бактерии, осуществляющие гидролиз и брожение, бактерии, образующие водород и уксусную кислоту, а также водородотрофные,： метанобразующие бактерии. Метанобразующие бактерии растут медленно и очень чувствительны к резким изменениям загрузки реактора и накоплению водорода. Можно надеяться,, что усовершенствование конструкции реактора и контроль за§ процессом помогут уменьшить колебания загрузки реактора и« позволят контролировать ее, определяя содержание водорода 质
ЛипидыЛигниныБелкиЛипидыЛигниныБелкиМЕТАН + УГЛЕКИСЛЫЙ ГАЗМЕТАН + УГЛЕКИСЛЫЙ ГАЗРне. 6.6. Биохимическое расщепление отдельных соединений до метана и углекислого газа при анаэробном разложении отходов.Рне. 6.6. Биохимическое расщепление отдельных соединений до метана и углекислого газа при анаэробном разложении отходов.
ЛипидыЛигниныБелки
ЛипидыЛигниныБелки
МЕТАН + УГЛЕКИСЛЫЙ ГАЗ
МЕТАН + УГЛЕКИСЛЫЙ ГАЗ
Рне. 6.6. Биохимическое расщепление отдельных соединений до метана и углекислого газа при анаэробном разложении отходов.
Рне. 6.6. Биохимическое расщепление отдельных соединений до метана и углекислого газа при анаэробном разложении отходов.
промежуточных продуктов типа пропионовой и масляной кислот. Проблемы перегрузки, особенно существенные в случае промышленных стоков, можно обойти, увеличивая скорости ■оборота и применяя в качестве буферных систем сточные воды химических предприятий и бытовые сточные воды. Для увеличения метаногенной активности бактерий можно использовать обычные методы отбора или методы генетической инженерии. Оценить возможность использования данного процесса при переработке смешанных отходов, а также охарактеризовать потребности в питательных веществах и усовершенствовать начальный этап процесса за счет уменьшения количества необходимого микробного посевного материала поможет дальнейшее изучение физиологии и экологии участвующих в процессе микроорганизмов.
Для получения энергии и полезных побочных продуктов можно использовать самые разнообразные отходы и сырье. 17*
К культурам, выращиваемым специально в целях конверсии, энергии в газообразное топливо, относится кассава; конечными продуктами служат метанол или этанол. Некоторые страны^ например Бразилия, Австралия и Новая Зеландия, намерены к 2000-му году использовать подобные вещества, получаемые биологическим путем, в качестве основного источника топлива. Сходные проекты обсуждаются и в некоторых европейских странах, например в Финляндии, Швеции и Ирландии.
В Англии работа по биоконверсии энергии проводится в рамках Программы по использованию солнечной энергии (министерства энергетики); за счет этой программы финансируются и проекты ЕЭС по получению энергии биологическими способами. В США используется множество подходов; так, одно очистное сооружение за счет биологической конверсии бытового мусора позволяет получить газ в количестве, достаточном для обеспечения им 12 тыс. домов. Основные микробиологические и технологические проблемы этой технологии и перспективы ее применения в развивающихся странах были рассмотрены на Первой международной конференции по анаэробному разложению, состоявшейся в Кардиффе в 1979 г. Анаэробные ферментеры могут применяться также в целях получения промежуточных продуктов для химической промышленности (например, уксусной, молочной и акриловой кислот в качестве химического сырья, идущего на переработку; гл. 4).
Однако широкое использование анаэробных реакторов в целях получения газообразного топлива сдерживается рядом причин. Традиционно в конструкцию реакторов входили тэнки с мешалками, рассчитанные на длительное пребывание перерабатываемого материала. В целях сокращения этого времени были созданы реакторы, в которых переработанные отходы отделяются от биомассы, используемой повторно. Чтобы процесс был экономически выгодным, должны быть разработаны недорогие конструкции, которые не засоряются и включают простые в эксплуатации устройства для отвода тепла. Основные усилия в области анаэробной ферментации должны быть направлены на изучение этапов, лимитирующих скорость процес- са. На первом из них происходит гидролиз целлюлозы и крахмала с образованием растворимых органических кислот и спирта. Вторым лимитирующим этапом может быть образование метана из этих жирных кислот с. короткой цепью. Моделирование процесса разложения осложняется тем, что трудно сказать, какие микроорганизмы доминируют на том или ином этапе, и установить, какие именно этапы лимитируют скорость процесса. Возможно, в условиях реактора лимитирующими окажутся другие стадии. Крайне важно определить количество образуемых микроорганизмами газов, особенно водорода, уг-
8Углекислый газ8Углекислый газВыходВыход66Вход жидкости
8
Углекислый газ
8
Углекислый газ
Выход
Выход
6
6
—* Выход жидкости—* Выход жидкостиРадиальная опорная балкаРадиальная опорная балкаЕмкость из полимерной пленкиЕмкость из полимерной пленкиИзолирующая панельСтальная сеткаИзолирующая панельСтальная сеткаВыхэд теплоносителяВыхэд теплоносителяАрматураБетонный кольцевойФундаментАрматураБетонный кольцевойФундаментИзолирующая пленка Теплообменник
—* Выход жидкости
—* Выход жидкости
Радиальная опорная балка
Радиальная опорная балка
Емкость из полимерной пленки
Емкость из полимерной пленки
Изолирующая панель
Стальная сетка
Изолирующая панель
Стальная сетка
Выхэд теплоносителя
Выхэд теплоносителя
Арматура
Бетонный кольцевой
Фундамент
Арматура
Бетонный кольцевой
Фундамент
Рис. 6.7. Три типа установок, использующихся при очистке сточных вод пище- в°й промышленности. А. Анаэробный фильтр. 5. Упрощенная схема установки, в которой используется перемешивание с помощью винтового насоса и вытяж- н°й трубы. Образование пены контролируется диспергированием содержимого реактора над поверхностью. В. Высокоскоростной реактор Коулзэрда.
лекислого газа и сероводорода, который ингибирует активность метанобразующих бактерий. Недавно было проведено исследование анаэробного превращения ряда субстратов культурами известных микроорганизмов. Это очень сложный процесс; из
природных систем было выделено много новых участвующих в нем типов бактерий.
Промышленное применение систем анаэробного разложения неуклонно возрастает; они используются при переработке отходов животноводческих ферм и промышленных, в том числе пищевых, отходов, а также для переработки культур, специально выращиваемых для получения энергии. На рис. 6.7, 6.8 и 6.9
ВыходВыход
Выход
Выход
Анаэробный реактор с перегородками (дефлекторами)
Рис. 6.8. Типы реакторов для переработки отходов ж ивотнов одческих ферм (Л) и различных стоков (Б).Рис. 6.8. Типы реакторов для переработки отходов ж ивотнов одческих ферм (Л) и различных стоков (Б).
Рис. 6.8. Типы реакторов для переработки отходов ж ивотнов одческих ферм (Л) и различных стоков (Б).
Рис. 6.8. Типы реакторов для переработки отходов ж ивотнов одческих ферм (Л) и различных стоков (Б).
схематически представлены некоторые из имеющихся в продаже установок. Конструкция реакторов была существенно усовершенствована, что увеличило их эффективность на 300%.Многие новые модели еще не вышли из стен лабораторий или находятся на стадии производственных испытаний, однако некоторые
полномасштабные системы уже работают и имеются в продаже.
Получение энергии из отходов представляет несомненный интерес для развивающихся стран, поскольку эту энергию можно извлекать и из природных продуктов. Сотрудничество между развитыми и развивающимися странами постоянно возрастает. В развивающихся странах созданы учерждения для
Сточные воды протекают только черезседиментационные камеры
5
Реактор поршневого типа
Рис. 6.9. Анаэробное разложение ила, образовавшегося в сточных водах (Л), и отходов животноводческих ферм (Б).
практического использования технологий, разработанных главным образом в Европе и Америке. Некоторые развивающиеся страны ведут самостоятельные исследования в этой сфере и сегодня лидируют в области фундаментальных разработок по возобновляемым источникам энергии.
Биологический контроль
за системами микробиологической переработки отходов
Основным условием применения биологической переработки сточных вод является постоянный контроль за возможным токсическим действием на установку со стороны поступающих стоков, с тем чтобы предотвратить серьезные повреждения системы или даже выход ее из строя. При эксплуатации установок по переработке отходов и промышленных сточных вод важно следить за тем, чтобы не возникали перегрузки. Обычные методы проведения анализов (например, измерение потребности в кислороде или определение pH) часто и недостаточно быстры, и малочувствительны. Однако в метаболической активности микроорганизмов существуют ключевые моменты, анализ которых дает возможность улавливать малейшие изменения в их состоянии. Например, благодаря внутриклеточному контролю метаболизма содержание АТР в популяции микроорганизмов сохраняется на относительно постоянном уровне, около 2 мкг на 1 мг сухой массы клеток. Изменения доступности субстрата или введение токсических веществ быстро сказываются на концентрации АТР внутри клеток. Мгновенная гибель клеток ведет к полной потере АТР за счет автолиза. Время оборота для АТР обычно не превышает 1 с.
Следовательно, о состоянии популяции (наступление стресса или периода покоя) можно судить по изменению уровня внутриклеточного АТР. Измерение концентрации АТР в активном иле нормально функционирующей системы позволяет определить «активную биомассу》данной системы. В процессе производства клеткой энергии участвует кислород, и при его недостатке отношение между его поступлением и потребностью в нем отразится на уровне АТР (рис. 6.10).
По технологии, основанной на применении активного ила, большая его часть используется повторно, поступая из последнего седиментационного тэнка в аэрационный тэнк, а некоторая его часть поступает в реактор аэробного или анаэробного разложения. Доля повторно используемого ила и скорость его кругооборота определяют время контакта между поступающими сточными водами и микроорганизмами ила, а следовательно, и скорость очистки сточных вод. Эти факторы влияют на возраст ила, который в свою очередь определяет его способность к оседанию (рис. 6.11). Производительность активного ила в значительной степени зависит от скорости нарастания новой биомассы в аэрационном тэнке, которая в свою очередь зависит от изменений скорости поступления сточных вод и их состава. Поэтому контроль за процессом с целью его нормализации и получения на выходе конечного продукта, отвечающего
определенным критериям, сопряжен с трудностями. Такой контроль можно проводить, определяя уровень АТР, регулируемый по принципу обратной связи. Действительно, измеряя концентрацию АТР, удалось заметно улучшить контроль за переработкой сточных вод с применением активного ила. Содержание АТР можно определять вручную; однако для постоянного контроля за процессом требуются автоматические измерительные устройства. Пробы жидкости, обработка которой закончена, отбирают через определенные промежутки времени на протяжении суток. Анализ уровня АТР в этих пробах позволяет найти отношение количества суспендированных в жидкой смеси твердых частиц к содержанию АТР, что в свою очередь показывает, какое количество активного ила, содержащего АТР, нужно использовать повторно и какова подходящая скорость.
-qgodu uxw l е工 ^R< UI qoJBWOHg ^OIMSHV-ra OBloahsuoY-qgodu uxw l е工 ^R< UI qoJBWOHg ^OIMSHV-ra OBloahsuoYо о о о о о о8 7 6 5 4 3 2о о о о о о о8 7 6 5 4 3 2Время, на которое вводится токсичное веществоВремя, на которое вводится токсичное веществон^ 5- бии sor-s qljodox。н^ 5- бии sor-s qljodox。
-qgodu uxw l е工 ^R< UI qoJBWOHg ^OIMSHV-ra OBloahsuoY
-qgodu uxw l е工 ^R< UI qoJBWOHg ^OIMSHV-ra OBloahsuoY
о о о о о о о
8 7 6 5 4 3 2
о о о о о о о
8 7 6 5 4 3 2
Время, на которое вводится токсичное вещество
Время, на которое вводится токсичное вещество
н^ 5- бии sor-s qljodox。
н^ 5- бии sor-s qljodox。
10
ОО0
О
О
Рнс. 6.10. Влияние введения в отходы токсичного вещества на активную био- массу (по результатам определения АТР), Показаны также изменения активности возвращаем ого активного ила (/) и содержания суспендированных твердых частиц в смешанной жидкости (//).
сброса. Содержание АТР определяется в течение 10 мин после отбора пробы, следовательно, контрольные измерения можно проводить каждые 15 мин. Использование микропроцессоров позволяет автоматически поддерживать скорость сброса с по- мощью клапанов или насосов, направляющих избыток активно- г。ила в тэнк для разложения, а также менять скорость сброса ила в течение суток в ответ на изменение внешних условий.
При таком методе контроля получают гораздо более освет- ленный конечный продукт с меньшим содержанием суспенди-
Рис. 6.11. Изменение количества активной биомассы (///), объема ила (//) и перемешиваемого удельного объема (/) для отходов, перерабатываемых в аэрационном тэнке, в зависимости от возраста ила.Рис. 6.11. Изменение количества активной биомассы (///), объема ила (//) и перемешиваемого удельного объема (/) для отходов, перерабатываемых в аэрационном тэнке, в зависимости от возраста ила.du」5二工 dKNW 二 quoewong SOUSHI*™osloahnlro*du」5二工 dKNW 二 quoewong SOUSHI*™osloahnlro*
Рис. 6.11. Изменение количества активной биомассы (///), объема ила (//) и перемешиваемого удельного объема (/) для отходов, перерабатываемых в аэрационном тэнке, в зависимости от возраста ила.
Рис. 6.11. Изменение количества активной биомассы (///), объема ила (//) и перемешиваемого удельного объема (/) для отходов, перерабатываемых в аэрационном тэнке, в зависимости от возраста ила.
du」5二工 dKNW 二 quoewong SOUSHI*™osloahnlro*
du」5二工 dKNW 二 quoewong SOUSHI*™osloahnlro*
рованных твердых частиц и меньшей величиной БПК. Преимущества данного метода огромны. В сочетании с системой контроля за поступлением кислорода он позволяет существенно повысить экономичность процесса переработки.
Контроль за патогенностью^
Одно из основных достоинств процесса микробного анаэробного разложения состоит в элиминации с его помощью патогенных микроорганизмов, в особенности агентов, вызывающих порчу пищи (главные образом Salmonella). Для анализа выживаемости этих организмов, а также микробов группы Е* coll в системах лабораторного масштаба использовали чувствительный метод наиболее вероятных чисел (НВЧ). К числу ко-. 扌 нечных продуктов неметаногенного разложения относятся на- 3 сыщенные жирные кислоты, и есть данные, что к молекуле : жирной кислоты ——перед деградацией за счет р-окисления —— \ присоединяется водород. Образующаяся октановая кислота особенно эффективно убивает патогенные микроорганизмы. На рис. 6.12 представлены данные о выживаемости Salmonella в
Рис. 6.12. Кривые выживаемости Salmonella в отстое, образующемся в реакторе при анаэробном разложении.Рис. 6.12. Кривые выживаемости Salmonella в отстое, образующемся в реакторе при анаэробном разложении.Lm-auoLU-es XO13U*。匚unhLm-auoLU-es XO13U*。匚unh
Рис. 6.12. Кривые выживаемости Salmonella в отстое, образующемся в реакторе при анаэробном разложении.
Рис. 6.12. Кривые выживаемости Salmonella в отстое, образующемся в реакторе при анаэробном разложении.
Lm-auoLU-es XO13U*。匚unh
Lm-auoLU-es XO13U*。匚unh
супернатанте, образующемся при анаэробном разложении. Видно, что жирные кислоты подавляют рост этих бактерий и приводят к их гибели.
Процессы анаэробного разложения оказывают ингибирующее действие и на микроорганизмы, патогенные для растений.
Недавние исследования показали, что численность вида Fusa~ rium, Corynebacterium и Globodera в ходе разложения уменьшается и падает почти до нуля через 10 сут после начала очистки сточных вод (рис. 6.13 — 6.15). Это позволяет надеяться на возможность использования процессов анаэробного разложения для переработки растительного сырья, пораженного возбудителями различных заболеваний (Fusarium oxysporum — дикариотическим грибом ——возбудителем вилта и корневой гнили томатов, гвоздики и риса; Corynebacterium michiganese ——
е工 H0S3 S хнз^фвзш >чонга5_фх O5S7 «oxsaoе工 H0S3 S хнз^фвзш >чонга5_фх O5S7 «oxsao
е工 H0S3 S хнз^фвзш >чонга5_фх O5S7 «oxsao
е工 H0S3 S хнз^фвзш >чонга5_фх O5S7 «oxsao
Время, сут
Рис, 6.13. Среднее число нематод Globodera pallida, вышедших из цист, на 100 цист в зависимости от времени воздействия на них содержимого анаэробного реактора при 35 ℃. Контрольная величина (7 сут в воде) —8739±444.
возбудителем сосудистого вилта, рака и листовой пятнистости томатов, картофеля и табака; Globodera pallida — широко известной корневой нематодой картофеля, разрушающей корни растения-хозяина).
В сточных водах, образующихся в других условиях, например в регионах с тропическим климатом, могут присутствовать и другие патогенные микроорганизмы, например Entamoeba hystolytica, вызывающая амебную дизентерию. Это необходимо учитывать при разработке способов очистки отходов. Все биотехнологические подходы, столь полезные с точки зрения здравоохранения, следует развивать в самых широких масштабах.
180000180000Время, сутВремя, сутРис. 6.14. Численность популяции введения ее в анаэробный реактор.Рис. 6.14. Численность популяции введения ее в анаэробный реактор.FusariumFusariumoxysporum до (•) иoxysporum до (•) ипосле (О)после (О)хипниАиои ин°онн№хипниАиои ин°онн№
180000
180000
Время, сут
Время, сут
Рис. 6.14. Численность популяции введения ее в анаэробный реактор.
Рис. 6.14. Численность популяции введения ее в анаэробный реактор.
Fusarium
Fusarium
oxysporum до (•) и
oxysporum до (•) и
после (О)
после (О)
хипниАиои ин°онн№
хипниАиои ин°онн№
Рнс. 6.15. Изменение численности популяции Corynebacterium michiganese при 35 ℃ в течение 5 сут нахождения в анаэробном реакторе. Приведены результаты трех экспериментов.
Извлечение полезных веществ
Одна из главных задач технологии, связанной с окружающей средой, — это сохранение природных ресурсов путем повторного использования полезных веществ, содержащихся в отходах. Некоторые разработки в этой сфере получили финансовую поддержку со стороны правительств и это принесло свои плоды,, но все же пока выход конечных продуктов и стоимость повторного использования биомассы в широких масштабах таковы, что эта технология оказывается экономически невыгодной. Тек не менее она может найти применение при получении таких, ценных продуктов, как масла, металлы, витамины и пептиды.
Получение полезных материалов из отходов имеет два аспекта: 1) извлечение и/или концентрирование полезных веществ из отходов; 2) превращение отходов в полезные материалы.
Вода
Воду можно рассматривать как возобновляемый ресурс. Однако, сравнивая стоимость необходимого для очистки оборудования со стоимостью водопроводной воды, очистку загрязненной органическими веществами воды обычно считают неэкономичной. Повторное использование промышленных сточных вод экономично только в тяжелой промышленности (энергетика,, сталелитейное производство и угледобывающая промышленность), где можно применять не такую чистую воду, как питьевая, и поэтому свести к минимуму обработку сточных вод. Основные трудности здесь связаны с наличием соединений, не поддающихся переработке. Возможно, эту проблему удастся решить, используя микроорганизмы, которые приобрели способность разрушать такие соединения (разд. 6.7).
652 Удобрения ”
Потребность в более дешевых высококачественных белках животного происхождения непрерывно возрастает, а число работников сельского хозяйства, призванных удовлетворять эту растущую потребность, все время уменьшается. Для разрешения этого противоречия нужно было бы применять более интенсивные методы землепользования, и тогда мы будем получать все больше концентрированных отходов, которые в принципе можно применять как удобрения. Однако за последние 100 лет масштабы использования отходов животноводства в качестве удобрений уменьшились; на смену им пришли фосфорные и азотные удобрения, при получении которых используется ис*
копаемое топливо. В Англии значительную часть сельскохозяйственной продукции (до 40% от общей стоимости) получают именно за счет применения химических удобрений. Однако цены на такие удобрения все время растут, и становится экономически выгодным использование отходов животноводства в качестве органических удобрений.
Табл. 6.1 иллюстрирует возможность получения удобрений на основе навоза сельскохозяйственных животных. Результаты анализа каждого типа удобрений приведены в табл. 6.2. Цен-
Таблица 6.1. Получение удобрений на основе навоза сельскохозяйственных животных
Параметры
Птицы
Свиньи
Молочные коровы
Кг/сут
0,1
4,5
45
% от живого веса
5-6
8—9
9—11
Сухое вещество, %
20—30
15-20
10—11
Средний сухой вес, кг/сут
0,03
0,7
4,5
Таблица 6.2. Содержание питательных веществ в навозе
Животные
Сухое вещество, %'
Содержание различных компонент (кг/т свежего навоза)
N
Р
К
Mg
Крупный рогатый скот
•Свиньи Птицы
4—23
5—25
23—68
2,4—6,5 1—6—6,8 9,6—23
0,4-1,8 0,6—2,1 2,4-12
2,0—5,8 1,7—3,6 3,8—11,6
0,2-0,6 0,3—0,7
1,2-2,2
ность отходов как удобрений и пути их использования определяются составом. Кроме того, перед внесением навоза в почву из него путем анаэробного разложения можно получать энергию (разд. 6.2.2). Определить изменение стоимости удобрения в результате такого разложения трудно; тем не менее ясно, что удобрения на основе переработанного навоза достаточно дешевы.
Корма для животных
В Англии в результате человеческой деятельности образуется 25-109 кг отходов в год. Если учесть, что при интенсивном животноводстве образуется еще 180-109 кг отходов, то становит-
Рис. 6.16. Получение белка из активного ила, образующегося в сточных водах.
ся ясно, что при переработке всех этих отходов мы можем получить многие тонны активного ила. В процессе переработки отходов при участии микроорганизмов образуется много микробного белка, который можно повторно использовать как корм для скота, поскольку 30——40% сухой массы выросших клеток ——это неочищенный белок. На рис. 6.16 описан метод экстракции белка из активного ила, а в табл. 6.3 приведен состав белка одноклеточных организмов (БОО) из того же источника. Тяжелые металлы, обнаруженные в отстое сточных вод (например, медь из отходов свиноводства, где ее присутствие обусловлено применением концентратов меди для корм-
Таблица 6.3. Состав белка одноклеточных организмов, обитающих в активном иле
Компонент
Вес, %
Вода
7,85
Общий белок (NX6,25)
37,80
Истинный белок
31,25
Жиры
1,73
Зола
25,16
Кислотонерастворимая зола
12,33
Углеводы (в пересчете на глюкозу)
9,80
Волокнистые вещества
10,30
Валовое содержание энергии (ккал/г)
16,20
ления животных), необходимо удалять. Идеальным результатом такого повышения качества ила сточных вод путем экстракции белка должен быть безвредный, чистый, экономичный корм для скота. Кроме того, в иле образуются и другие ценные биологические соединения, например аминокислоты и ви- тамины. В табл. 6.4 представлена концентрация аминокислот
Таблица 6.4. Концентрация аминокислот в белковом продукте из активного ила
Аминокислота
г/100 г пробы
Аспарагиновая кислота
2,86
Серин
1,4
Глутаминовая кислота
3,62
Пролин
1,28
Глицин
2,26
Аланин
2,95
Цистеин
0,25
Тирозин
0,72
Треонин
1,86
Валин
2,19
Метионин
0,25
Изолейцин
1,42
Фенилаланин
2,07
Гистидин
0,69
Лизин
1,68
Аргинин
1,59
Триптофан!)
—
')Разрушается при кислотном гидролизе.
в белковом продукте из активного ила, применяемом в качестве корма для рыб. Однако бытовые и сельскохозяйственные отходы, по-видимому, непригодны для промышленного получения БОО. Это связано с их низкой пищевой ценностью и с необходимостью получения продукта, свободного от токсичных ве- ацеств и патогенных микроорганизмов. Существуют и экономические проблемы, определяемые расходами на ферментацию и оборудование, необходимое для высушивания. Незараженные отходы производства пищевых продуктов и напитков, а также бродильной промышленности можно использовать в качестве добавок к корму. Однако экономическая целесообразность их применения еще не доказана.
Министерство сельского хозяйства, рыболовства и пищевой промышленности опубликовало инструкцию 《О порядке переработки белка» от 1981 г., касающуюся использования белковых продуктов, получаемых из ила, в качестве корма. В ней правительство ограничилось предложениями по ужесточению •стандартов, указанных в Актах о болезнях животных от 1950 紀 1975 гг. В них особое внимание уделено контролю за такими возбудителями заболеваний, как Salmonella.
Биологическая переработка промышленных отходов
Промышленные отходы можно в первом приближении разделить на две категории: 1) отходы производств, основанных на использовании биологических процессов (производство пищевых продуктов, напитков, ферментация); 2) отходы химической промышленности. В первом случае отходы имеют различный состав и обычно перерабатываются путем биологического окисления, как это делалось традиционно в случае бытового мусора. Однако такой способ экономически невыгоден, и в настоящее время широко обсуждается вопрос о возможности уменьшения объема разбавленных сточных вод либо их непосредственного использования — трансформации (для получения биомассы или других ценных продуктов) или же путем извлечения из них ценных соединений.
В многочисленных и разнообразных отраслях химической промышленности образуется большое количество отходов, причем многие из них с трудом поддаются разрушению и длительное время присутствуют в среде. Поэтому часто перед обычной биологической переработкой отходов бывает необходимо провести их предварительную химическую или физическую обработку. Использование специфических микроорганизмов для расщепления ксенобиотиков при переработке отходов еще не нашло широкого применения в промышленности, и тем не менее подобный подход представляется весьма перспективным.
Это может быть: 1) деградация отдельных видов отходов in situ с помощью специализированных культур микроорганизмов- или их сообществ; 2) введение специально подобранных культур в обычные системы переработки отходов; 3) ликвидация и Обезвреживание разливов нефти; 4) извлечение металлов (гл. 5); 5) биологическая очистка газов от пахучих и вредных соединений (меркаптанов, сероводорода, цианида, хлорзаме- щенных углеводородов и т. д.); 6) получение биомассы из отходов; 7) превращение отходов в метан (гл. 2).
В результате широкого применения человеком продукции химической промышленности в окружающую среду попадают различные типы ксенобиотиков: пластмассы (пластификаторы) взрывоопасные вещества, добавки, полимеры, красители, поверхностно-активные вещества, пестициды и органические соединения —производные нефти. Что касается бытового мусо^ ра； то для его переработки созданы широко применяемые системы, использующие активный ил и оросительные фильтры.. Сточные же воды химической промышленности, как правило*、 не соответствуют возможностям подобных систем. Интенсивность переноса кислорода в ходе процессов, обычно протекающих в таких системах, бывает недостаточна для поддержания: максимальной скорости окисления при участии микрофлоры. Эти процессы чувствительны также к колебаниям в загрузке- реактора, особенно если токсичные вещества и ингибиторы поступают в систему в высоких и непостоянных концентрациях.
Проблему недостатка кислорода, возникающую при переработке отходов химической промышленности в обычно используемых системах на основе' активного ила, пытались решить- несколькими способами. В двух случаях (распределитель с пробулькиванием и система «Аноке») для увеличения скорости переноса газа использовали чистый кислород. В одной иа новых систем переработки отходов ——колонном эрлифтном ферментере, разработанном фирмой ICI,——пошли по пути уве* личения количества растворенного кислорода (рис. 6.2). В центральной части колонны имеется не доходящая до дна' вертикальная секция, в которую сверху поступают отходы 堡 повторно используемый активный ил; туда же вводится воздух. Когда смесь выходит из ферментера вверх по наружной секции колонны, давление в системе падает, что вызывает про- булькивание пузырьков воздуха. Благодаря высокому содержанию растворенного кислорода и турбулентности биомасса поддерживается в высокоактивном состоянии и становится более устойчивой по отношению к перегрузкам, а также к уменьшению аэрации и времени нахождения отходов в ферментере^ особенно в случаях высоко концентрированных отходов.
-Такие процессы с повышенной аэрацией устойчивы к рез-
ким перегрузкам отходами, не оказывающими токсического -или ингибирующего действия. В случае же токсичных отходов более пригодными оказываются системы, в которых используются микроорганизмы, растущие в пленках. Такие популяции микробов не вымываются из системы, даже если на их рост «и метаболизм оказывают неблагоприятное воздействие поступающие сточные воды. Кроме того, внутри пленки из-за ограничения диффузии создаются градиенты концентрации. Это приводит к понижению концентраций токсичных продуктов внутри пленки, а следовательно, к повышению скорости их усвоения и окисления. Пленка создает также экологическую нишу для организмов, рост которых в присутствии высоких концентраций отходов при перегрузках существенно замедляется. Самая простая форма пленочной системы — это перколяционный фильтр (разд. 6.2.1), однако подобного рода пленки разрушаются, если они становятся очень тонкими, при уменьшении концентрации субстрата на поверхности подложки. В таком случае клетки погибают и пленка отпадает, засоряя фильтры внутри системы переработки отходов. При слишком высоких концентрациях субстрата происходит быстрый рост микроорганизмов, что приводит к образованию толстой пленки и к ее периодическому отслоению. Интенсивность подобных процессов можно снизить, разбавив поступающий раствор с питательными веществами осветленными сточными водами. Разработка новых методов сохранения толщины пленки представляет безусловный интерес. Так, при помощи медленного вращения диска из полистирола внутри протекающих сточных вод толщина пленки поддерживается постоянной за ■счет гидродинамических сил и аэрации при выходе пленки из воды. Такая эффективная и простая система была предложена для очистки стоков с низкой величиной ВПК. Еще один эффективный метод переработки токсичных отходов in situ может •быть основан на использовании реакторов с ожиженной подложкой, где микроорганизмы растут на поверхности небольших инертных частиц (песок, стекло, антрацит), через слой которых пропускают с контролируемой скоростью сточные воды и воздух.
Отходы, не содержащие азота или фосфора, не способны поддерживать рост микроорганизмов. В подобных случаях для окисления токсичных соединений до двуокиси углерода можно использовать покоящиеся клетки при условии, что активность 阻х гидролитических и окислительных ферментов не подавляется. Поскольку среда при переработке отходов в колонных реакторах периодически меняется, микроорганизмы оказываются в условиях голодания и в это время их рост прекращается. При поступлении источника углерода на короткое время включает-
ся несопряженный метаболизм, когда организмы дышат, но не растут. Это дает то преимущество, что уменьшается общий выход биомассы (ила).
Рассмотрим методы биологической переработки промышленных отходов на примерах молочной, бумажной промышленности л производства красителей.
/. Отходы молочной промышленности; сыворотка (см. также гл. 3)
Сыворотка является побочным продуктом сыроварения. Ее состав зависит от типа используемого молока и вырабатываемого сыра. В высушенном или концентрированном виде сыворотка применялась в качестве корма для животных; однако ее недостатком является то, что она несбалансирована с точки зрения содержания питательных веществ: в ней слишком высока концентрация минеральных веществ и лактозы. Разработаны способы извлечения из сыворотки белков путем ультрафильтра- дии, осаждения или выделения с помощью ионного обмена. Из таких белков можно получать белковые гидролизаты, используя для этого ферментеры. После извлечения белков получают большие объемы фильтратов с высокими концентрациями лактозы (35—50 г/л), минеральных веществ, витаминов ,и молочной кислоты, и встает проблема дальнейшего их использования. Если превратить лактозу в молочную кислоту при участии мо* лочнокислых бактерий, то мы получим источник углерода, который может сбраживаться дрожжами (например, смешанными культурами Lactobacillus bulgaricus и Candida krusei). Возможно и прямое сбраживание лактозы дрожжами Kluyveromyces fragilis или Candida intermedia. После подобного сбраживания не обязательно отделять микроорганизмы от среды, объем которой можно уменьшить и получить обогащенную белком сыворотку.
Из сыворотки получают не толко белковые продукты, но 弘一путем ферментации — сырье для химической промышленности (например, этанол). Путем химического гидролиза лактозы с последующим удалением глюкозы из раствора с помощью ферментации можно получать галактозу. Альтернативный биологический путь — использование мутантных дрожжей, лишенных ip-галактозидазы. Такие мутанты сохраняют способность к гидролизу лактозы и используют образующуюся глюкозу в качестве источника углерода. В результате гидролиза лактозы фильтрат становится более сладким; на опытных установках такой гидролиз осуществляют с помощью иммобилизованной .р-галактозидазы (гл. 4). Гидролизованный фильтрат не только находит применение в пищевой промышленности, но
может оказаться полезным и при решении проблем, связанных с недостатком ферментов у некоторых животных-отъемышей и с непереносимостью лактозы у человека. Из сыворотки получают и другие химические соединения: лактозу, лактулозу» лактитол и лактобионовую кислоту.
6.62 Отходы целлюлозно-бумажной промышленности
Волокнистый материал, применяющийся при производстве бумаги и других продуктов, получают как из древесных, так и: из травянистых растений после химического расщепления лигнина. Однако этот процесс сопровождается потерей большого количества древесины и образованием огромного количества- отходов. Все это должно стимулировать разработку альтернативной химической технологии.
В настоящее время применяют два процесса получения древесной пульпы. Основной из них ——это щелочная варка (сульфатный процесс), в результате которой образуется темная сульфатная варочная жидкость. Эти отходы содержат трудна перерабатываемые ароматические продукты расщепления лигнина и низкомолекулярные органические кислоты (глюкоизосахариновую, молочную, уксусную и муравьиную). При получении пульпы из смолистой древесины сосны образуются талловое масло и терпены, широко использующиеся в промышленности. Сульфатную варочную жидкость не удается перерабатывать биологическими способами, которые могли бы применяться в промышленном масштабе; гораздо экономичнее упаривать- эту жидкость и сжигать ее, получая таким образом энергию из- отходов.
Сульфатная варка целлюлозы применяется реже; она дает отходы следующего состава： лигносульфонаты с ароматическими элементами (60%), сахара (манноза, галактоза, глюкоза,, ксилоза, арабиноза; 36%), уксусная кислота, метанол и фурфураль. Эти жидкие отходы ——хорошее сырье для ферментации благодаря высокому содержанию в них углеводов. Их ферментация в широких масштабах начата в 1909 г. В настоящее время традиционным методом удаления пентоз, гексоз и уксусной кислоты из таких отходов служит их ферментация при- участии дрожжей. Помимо этих традиционных методов вскоре будут использоваться и новые процессы превращения отходов в грибной белок с помощью Paecilomyces variotii, Sporotrichum pulverulentum и Chaetomicum cellulolyticum. Неподдающиеся переработке соединения можно концентрировать и сжигать. Лигносульфонаты применяют в качестве связывающих ве“ ществ и вспомогательных средств при бурении; щелочным окислением при повышенном давлении их можно превращать в ва*
нилин. Вообще говоря, главное в переработке отходов целлюлозно-бумажной промышленности — это понижение энергоза- нрат, а какой химический принцип при этом используется — менее существенно.
Основная экологическая проблема, порождаемая целлюлозно-бумажной промышленностью, — это очистка сточных вод, а также обработка конденсатов, образующихся в испарителях и реакторах. Сточные воды осветляют путем нейтрализации и от- станванпя, окисления в одно- и двухстадийных установках с активным илом, в аэрируемых отстойниках или путем сочетания ■биологических и химических способов окисления. Эти методы пригодны для эффективного удаления соединений, подвержен- НЬ1Х биодеградации, а также токсичных производных фенола, однако они оказываются дорогими и неэффективными в слу- пае производных лигнина, с трудом поддающихся переработке- Отбеливатели, содержащие хлорпроизводные бифенилов, можно обесцвечивать с помощью грибов — возбудителей белой гнили.
Среди побочных продуктов сульфитного процесса получения целлюлозы преобладают химически модифицированные лигнины, образующиеся во многих реакциях между активным сульфитом и каким-либо сложным природным полимером. Структура лигносульфонатов в деталях неизвестна. Они представляют собой гетерогенную смесь соединений с широким спектром молекулярных масс (300—100 000); состав смесей определяется природой перерабатываемой древесины. Образование сульфо- натов приводит к частичной солюбилизации лигниновых фрагментов. Сложность структуры лигносульфонатов затрудняет изучение их биодеградации. Для упрощения задачи обычно используют модельные соединения, например дегидрополимеры кониферилового спирта или другие низкомолекулярные продук- тн. Низкомолекулярные лигносульфонаты чувствительнее к биодеградации, чем высокомолекулярные; с другой стороны, производные лигнина, видимо, устойчивее к разрушению, чем сам лигнин. Следовательно, образование сульфопроизводных затрудняет переработку. В таких сопряженных окислительно- деградативных процессах почвенные грибы и бактерии более эффективны, чем гнилостные грибы; для осуществления этих процессов требуется также дополнительный источник углерода. Распад лигносульфонатов нередко сопровождается полимери- зацией, в результате чего наблюдается сдвиг в распределении полимеров по молекулярным массам. Эти изменения могут коррелировать с присутствием внеклеточных фенолоксидаз (например, лакказы), физиологическая роль которых остается неизвестной. Фенолы превращаются в соответствующие хиноны и фенокси-радикалы, которые спонтанно полимеризуются. Таким
образом, полимеризация и деградация происходят одновременно. Однако в случае некоторых грибов реакции полимеризации не протекают в присутствии целлюлозы. Целлюлоза распадается до целлобиозы, являющейся субстратом для целлобиоза :хинон оксидоредуктазы, которая одновременно окисляет целлобиозу и восстанавливает хиноны и фенокси-радикалы. Может существовать и другая оксидоредуктазная система, в которой легко доступные источники углерода используются для восстановления хинонов. Возможная роль подобной биологической полимеризации состоит в облегчении осаждения лигносульфонатов. Лигносульфонаты применяются как связывающие вещества при производстве отдельных видов картона, где в качестве катализатора полимеризации используют содержащие лакказу культуральные фильтраты. Фенолоксидазы могут играть важную роль в определении судьбы многих ксенобиотиков в окружающей среде, участвуя в полимеризации фенолов и в образовании органических полимеров почвы.
Чувствительность лигносульфонатов к биодеградации увеличивается после их химической или физической модификации. Под действием УФ-облучения и озонирования происходит фрагментация этих молекул, а удаление остатков сульфоновой кислоты, хотя и снижает растворимость лигносульфонатов, одновременно уменьшает их устойчивость к биодеградации. Предпринимались попытки использовать для микробного десульфирования анаэробные сульфатредуцирующие бактерии и некоторые виды Pseudomonas. Большими потенциальными возмож* ностями в этом смысле обладают смешанные культуры. Использование таких культур для разрушения лигносульфонатов может оказаться более эффективным, чем применение отдельных штаммов, поскольку при этом могут быть созданы сообщества с широким спектром активностей, например способные к десульфированию, расщеплению прочных связей, метилированик> и деполимеризации. В результате может быть получена высокоэффективная биоокислительная система. В одной из опытных установок для получения БОО из углеводов, содержащихся в отходах целлюлозно-бумажной промышленности, используют Candida utilis, а для разрушения остаточных лигносульфонатов——смешанную культуру. Биомасса, образующаяся на второй стадии этого процесса, не находит сбыта, поэтому ее повторно используют после термообработки для ускорения роста Candida.
Отходы от производства красителей
Текстильная промышленность и производство красителей отправляют в отходы устрашающее количество красителей 及 лигментов, единственным общим структурным свойством ко-
горых является наличие хромофорной группировки. Они поступают в окружающую, среду со сточными водами; с количественной точки зрения эти соединения не относятся к числу основных ее загрязнителей. Кроме того, эти отходы обычно не рассматриваются как токсичные или канцерогенные для рыб или млекопитающих (за исключением бензидина и катионных красителей).
Для очистки окрашенных сточных вод применяют химические методы; удаление красителей и пигментов с помощью микробов весьма ограничено. Устранение этих продуктов из отходов с помощью активного ила заключается в основном в адсорбции, а не в деградации. Степень их разложения микроорганизмами определяется растворимостью, ионными свойствами, а также природой заместителей и их числом. Оказалось, что микроорганизмы способны разлагать красители, но только после адаптации к значительно более высоким концентрациям, чем те, которые обычно обнаруживаются в сточных водах. Поскольку микроорганизмы могут использоваться для контроля за загрязнением окружающей среды этими соединениями, был проведен скрининг, направленный на выявление тех микроорганизмов, которые способны к расщеплению модельных веществ типа n-аминобензолов, а также скрининг и селекция организмов из дренажных канав предприятий по производству красителей. Были сделаны попытки найти взаимосвязь между лодверженностью соединения биодеградации и его химической структурой.
Компоненты азокрасителей могут разлагаться в аэробных или анаэробных условиях. Анаэробная биодеградация осуществляется относительно легко, поскольку многие организмы синтезируют неспецифические ферменты, катализирующие восстановительное расщепление азогруппы (рис. 6.17). Однако для дальнейшей деградации необходим двухстадийный процесс, продукты которого ——амины — могут быть потенциально вредными и их ' подвергают окислительному расщеплению. Азоредуктазы, выделенные из аэробных систем, видимо, обладают большей субстратной специфичностью и не находят широкого лрименения при переработке отходов. Процесс разложения азокрасителей изучался на примере простого модельного соединения М^дикарбоксиазобензола (ДКАБ). Выделены организмы, использующие это соединение в качестве единственного источника углерода, азота и энергии. Ранее считалось, что азосвязь в природе не образуется. Однако среди продуктов, синтезируемых одним из грибов — патогеном насекомых — было идентифицировано азосоединение, так что бактериям приходилось встречаться с этим типом связей in vivo. Был выделен один из видов Flavobacterium, разрушающий только
Рис. 6.17. Анаэробное восстановительное расщепление модельных азокрасителей.Рис. 6.17. Анаэробное восстановительное расщепление модельных азокрасителей.транс-ДКАВ; если использовать ингибиторы ферментов,, раскрывающие кольцо, то это приводит к накоплению аминобензоата. Тем не менее данный организм не расщепляет промышленные красители, а попытки ввести его в непрерывную культуру для длительной адаптации оказались- безуспешными. Flavobacterium не выдерживала конкуренции со стороны другого организма ——одной из псевдомонад^ способной расти при высоких концентрациях (750 мг/л) используемого ею синтетического красителя и, следовательно, эффективно разрушать его. При повышенной температуре эта способность утрачивалась^
Рис. 6.17. Анаэробное восстановительное расщепление модельных азокрасителей.
Рис. 6.17. Анаэробное восстановительное расщепление модельных азокрасителей.
Возможно это связано с тем, что упомянутая функция кодируется плазмидой. Следует отметить, что полученные штаммы обладают высокой субстратной специфичностью и едва ли выжи- вут в установках для очистки сточных вод.
. Биологическая очистка газов
Очистка отходов от вредных, токсичных и пахучих газов — это серьезная экологическая проблема. Во многих промышленных производствах (в фотопромышленности, при перегонке нефтах очистке природного газа и в целлюлозно-бумажной промышленности) образуются восстановленные соединения серы (тиосульфат, сероводород, метилмеркаптаны, диметил сульфид) Эти соединения являются также побочными продуктами ана- эробного разложения отходов животноводства с высоким содержанием органических веществ. Большинство неорганических восстановленных соединений серы служат источником энергии для целого ряда микроорганизмов, растущих в аэробных илтг анаэробных условиях (рис. 6.18). Могут быть созданы очист- ные системы, основанные, например, на использовании тйоба- цилл: в таких системах анаэробное десульфурирование сопря^ жено с денитрификацией. Один из методов очистки от сероводорода состоит в пропускании газа через солевой раствор, на、 пример раствор сульфата меди. В результате происходит осаждение нерастворимого сульфида металла, который затем
может быть окислен при участии микроорганизмов (см. также тл. 5, где рассматривается переработка отходов горнодобывающей промышленности). Количество отходов с неприятным запахом увеличивается и в результате интенсификации животноводства. Для устранения этого запаха из отходов удаляют, в частности, восстановленные соединения серы; такое удаление происходит с потерей азота или без потери (путем образования аммиака) в зависимости от того, какие микроорганизмы при этом используются. Органические сульфиды часто бывают токсичными для микроорганизмов. Например, обогащение от-
Аэробный процесс
H2S + 2О2 ► H2SO4
(CH3)2S + 5O2 ——► 2CO2 + H2SO4 + 2H2O
Анаэробный процесс
5H2S + 8NaNO3 ► 4Na2so4 + H2SO4 + 4H2O + 4N2
(CH3)2S + 4NaNO3 ——► 2CO2 + Na2SO4 + 2NaOH + 2H2O + 2N2
Рис. 6.18. Разрушение восстановленных соединений серы.
ходов микроорганизмами, способными использовать диметил- сульфид, затруднено, хотя в принципе можно выделить сообщество микробов, растущее на очень близком по структуре суб- <трате диметил сульфоксиде. Преобладающий в таком сообществе организм Hyphomicrobium spp. быстро окисляет диметил- сульфид, так что есть основания надеяться на создание относительно простого микробиологического способа переработки таких ядовитых отходов.
Для детоксикации цианида в промышленных отходах были предложены различные биологические методы: от использования активного ила до применения специфических ферментов, разрушающих цианид. Так, роданаза, обнаружена у Bacillus stearothermophilus, катализирует превращение цианида в тиоцианат. Альтернативная иммобилизованная система основана на гидролизе цианида до формамида, катализируемом инду- дибельным ферментом цианидгидратазой. Этот фермент был обнаружен в грибах, паразитирующих на растениях-цианогенах. Таким образом, мы имеем ряд микробиологических методов очистки промышленных стоков, однако нам еще предстоит определить их эффективность по степени очистки на выходе.
6.7. Биодеградация ксенобиотиков в окружающей среде
Биодеградация органических соединений, загрязняющих окру， жающую среду, оправдана только в том случае, если в результате происходит их полная минерализация, разрушение и детоксикация; если же биохимическая модификация этих соединений приводит к повышению их токсичности или увеличивает время нахождения в среде, она становится не только нецелесообразной, но даже вредной. Детоксикация загрязняющих среду веществ может быть достигнута путем всего одной модификации структуры. Судьба ксенобиотика зависит от ряда слож- ным образом взаимосвязанных факторов как внутреннего характера (устойчивость ксенобиотика к различным воздействиям, растворимость его в воде, размер и заряд молекулы, летучесть), так и внешнего (pH, фотоокисление, выветривание). Все эти факторы будут определять скорость и глубину его пре* вращения. Скорость биодеградации ксенобиотика данным со- обществом микроорганизмов зависит от его способности прони- кать в клетки, а также от структурного сходства этого синтети- ческого продукта и природного соединения, который подвергается естественной биодеградации. В удалении ксенобиотиков из окружающей среды важную роль играют различные механизмы метаболизма.
В большинстве случаев при исследовании биодеградации использовался традиционный подход, основанный на ^выдеЛенин и анализе свойств чистых изолятов из окружающей среды. С другой стороны, из-за гетерогенности среды в ней формируются местообитания для множества разных микроорганизмов с самыми разнообразными метаболическими свойствами. Эти местообитания не могут не быть взаимосвязанными друг с другом. Ксенобиотики подвергаются действию смешанных популяций микроорганизмов, т. е. сообществ, для которых характерны отношения кооперации, комменсализма и взаимопомощи.
Участие микробных сообществ в биодеградации ксенобиотиков
Можно выделить стабильные сообщества, в которых взаимо* действия между отдельными его членами дает им ряд преимуществ, в результате чего такая ассоциация становится более эффективной, чем отдельно взятые виды. Классификация микробных сообществ основана на характере взаимосвязей между отдельными видами.
Сообщества, в которых один или несколько членов не способны к синтезу тех или иных компонентов, необходимых
для роста; этот дефицит покрывается за счет метаболической активности других членов сообщества. Сложность различных взаимоотношений в подобных сообществах может варьировать^ но в любом случае взаимосвязи такого типа, по всей видимости» играют роль в деградации многих соединений. Например^ сообщество из двух микроорганизмов, растущее на циклогексане, включает один из видов Nocardia, способный окислять циклогексан, но не способный к росту на нем одном, а также один из видов Pseudomonas, который поставляет другим видам необходимые для роста соединения, возможно биотин. Такие- взаимосвязи могут быть облигатными для роста определенных видов или поставлять дополнительные питательные вещества, способствующие росту первично окисляющего организма и увеличению скорости деградации. Это со всей очевидностью- показывает, что истинную скорость деградации ксенобиотиков： в окружающей среде можно оценить, только учитывая возможности микробных сообществ, а не отдельных видов микроорганизмов.
Сообщества, в которых метаболиты, в какой-то мере подавляющие рост организма-продуцента или других организмов в том же местообитании, удаляются остальными членами сообщества.
Сообщества, в которых параметры роста одного или не〜 скольких его членов изменяются так, что получается более конкурентоспособное сообщество, устойчивое к изменениям среды. Такое сообщество может стать менее чувствительным к ингибированию субстратом и приобрести способность справляться с перегрузками, возникающими в очистных системах.
Крайне важная роль микробных сообществ в деградации ксенобиотиков состоит в том, что они способны осуществлять- совместную «метаболическую атаку» на субстрат. Отдельные члены такого сообщества в отличие от сообщества в целом не обладают метаболической активностью, необходимой для полной деградации данного соединения. Так, в лаборатории иногда не удается добиться минерализации какого-либо вещества^ но происходит это потому, что деградацию тщетно пытаются осуществить с помощью одного вида микроорганизмов. Отмечалось также, что такого рода комбинированная метаболическая система может возникать в результате синтеза отдельными видами разных компонентов ферментного комплекса, с проявлением ферментативной активности только у целого сообщества (например, синтез активной лецитиназы двумя видами Pseudomonas).
Ранее подчеркивалась важность сопряженного метаболизма для расщепления ксенобиотиков. Микроорганизмы, растущие на одном субстрате, превращают другой в ходе одной илв
нескольких ферментативных реакций. Эти реакции не связайы с ростом микроорганизма в том смысле, что в них не образуются промежуточные продукты, которые данный организм использовал бы для роста. Однако эти промежуточные продукты могут служить источником углерода для других членов сообщества. Выделение или создание подобных сообществ для решения проблем загрязнений среды ксенобиотиками вполне реально, хотя о стабильности таких ассоциатов в условиях переработки отходов известно немного.
Были выявлены сообщества, в которых осуществляется передача восстановительных эквивалентов от одной популяции другой. В анаэробных условиях классическим ферментативным способом получения избытка восстановительных эквивалентов было восстановление конечных продуктов обмена. Однако в упомянутых сообществах используется второй, акцепторный ор- танизм. На сегодняшний день уже выделено немало таких со- обществ. Анаэробное разрушение подобными сообществами ароматических соединений может иметь экономическое значение.
При изучении непрерывных культур были обнаружены сообщества, в которых к полному использованию лимитирующего рост субстрата способна не одна, а несколько первичных популяций, хотя можно было бы ожидать, что наиболее конкурентоспособный организм окажется доминирующим. Следовательно, существующие в сообществе взаимодействия должны стабилизировать свободную конкуренцию между его членами.
В стабильных сообществах микроорганизмов создаются ус- -ловия для свободного обмена генетической информацией между популяциями. Важным эволюционным механизмом появления новых штаммов in vivo, способных взаимодействовать с новыми компонентами окружающей среды, может служить перенос плазмид между сообществами микроорганизмов (гл. 7). Частота таких событий для природных сообществ неизвестна, ■однако в условиях лаборатории они действительно происходят. Так, в одном из опытов в течение многих поколений выращива- ,ли смешанные непрерывные культуры разных видов Pseudomonas. Один из видов мог расти на хлоркатехолах, а другой об- .ладал плазмидой TOL, несущей ген фермента бензолдиоксигеназы. На 4-хлорбензоате не мог расти ни один из штаммов, ■однако, использовав принцип обогащения, удалось выделить мутант, способный к росту на этой хлорсодержащей ароматической кислоте. По всей видимости, здесь произошел перенос плазмиды, в результате которого мутантный штамм приобрел ■способность к окислительному декарбоксилированию 4-хлор- бензойной кислоты с помощью приобретенной диоксигеназы с широкой специфичностью, а следовательно, и способность к ро- £ту на образующемся хлоркатехоле.
В свете взаимодействий подобного рода, существенных для окружающей среды, мы рассмотрим еще несколько специфических примеров деградации ксенобиотиков. Потенциальная' возможность использования микроорганизмов при биотехнологической переработке промышленных отходов обсуждается в разд. 6.6. Мы знаем, что в промышленных сточных водах содержатся стабильные побочные продукты реакций, часто известного состава. Вполне понятно, что технология контроля за ними хорошо разработана. Однако в окружающую среду могут попадать и сложные смеси промышленных продуктов, например при разнообразных неспецифических выбросах на любом нз этапов технологического процесса (утечки и т. п.). Деградация ксенобиотиков будет рассмотрена именно в этом контексте.
Хлорпроизводные углеводородов
С-1- и C-2-хлорпроизводные углеводородов широко используются в качестве растворителей и представляют собой важный фактор загрязнения окружающей среды. Тем не менее о микробной деградации этих соединений известно немного. Были, выделены организмы, способные к использованию дихлорме- тана, однако механизм его деградации до конца не выяснен.- По-видимому, в результате первичного дегалогенирования, катализируемого какой-то галоидгидролазой, образуется хлорметанол, спонтанно разлагающийся до формальдегида.
Дегалогенирование галогензамещенных ароматических соединений происходит в основном после расщепления ароматических групп системы под действием диоксигеназ. Связь углерод——галоген становится лабильной после присоединения атома, кислорода к углероду, связанному с галогеном, с образованием галогензамещенных катехолов. Относительно широкая специфичность ферментов начальных этапов катаболизма может обусловливать довольно быстрое превращение разных галогензамещенных ароматических соединений, хотя работа ферментов и осложняется стерическими и негативными индуктивными эффектами боковых групп-заместителей. Это пример участия обычных катаболических ферментов в первичной атаке на ксенобиотики. Галогензамещенные катехолы представляют собой ключевые метаболиты в деградации арилгалогенов. Они разрушаются путем орто-расщепления, поскольку ферменты мета- расщепления необратимо инактивируются веществами, образующимися в ходе реакции. Обычные пирокатехазы расщепляют галоген-замещенные катехолы с относительно низкой эффективностью, поэтому основное значение в деградации этих соединений приобретает раскрытие кольца. На последующих этапах, метаболизма, включая циклоизомеризацию, происходит от-
тцепление оставшихся замещающих групп кольца. На работе обычно применяемых очистных сооружений плохо сказываются перегрузки их отходами, содержащими хлорзамещенные ароматические соединения: путь л!ета-расщепления нарушается, а неэффективность орто-пути приводит к накоплению токсичных фенолов и темноокрашенных продуктов их самоокисления.
Другие замещенные простые ароматические соединения
При деградации арилгалогенов замещающие группы часто отщепляются на последних этапах катаболизма после разрушения ароматических колец системы. В случае сульфонированных ■ароматических соединений связь углерод ——заместитель высо- кополярна и должна стать лабильной на первых же этапах, в противном случае всем последовательно работающим ферментам придется «иметь дело》с этой замещающей группой. Сульфонированные нафталины широко используются в качестве эмульгаторов и смачивающих агентов, а также при производстве азокрасителей; в обычных очистных сооружениях эти соединения не разлагаются микроорганизмами. Однако в непрерывной культуре одно из использующих нафталин микробных сообществ, выделенное из сточных вод, приобрело способность к расщеплению нафталинсульфоновых кислот. Первые этапы катаболизма включают диоксигенацию, удаление замещающей группировки и реароматизацию ——ключевой этап, для которото необходима диоксигеназа с широкой специфичностью, способная к специфическому гидроксилированию по положению 1,2 кольца (рис. 6.19).
Спонтанная 丿 элиминация
Рис. 6.19. Элиминация остатка сульфоновой кислоты из молекулы нафталинсульфоновой кислоты.
Иитротолуолы представляют собой токсичные компоненты сточных вод военных заводов, которые в природе быстро разрушаются. Однако они минерализуются не полностью, поскольку продукты их деградации (ароматические амины) конденсируются с карбоксильными группами биологических макромолекул, образуя полиамиды, которые, по-видимому, устойчивы к последующему действию микробов.
Полиароматические углеводороды
Полихлорбифенилы (ПХБ)——это очень устойчивые соединения, которые долго остаются в окружающей среде и прочно адсорбируются биологическими и осадочными материалами. В почвах они практически не мигрируют, а микроорганизмы не могут их глубоко деградировать. ПХБ в пробах из окружающей среды отличаются по составу от ПХБ, получаемых в промышленности, поскольку они модифицируются природными системами. Микробная деградация бифенила осуществляется при участии систем катаболизма, сходных с известными для других ароматических углеводородов. С увеличением степени хлорирования скорость метаболизма падает. Сообщалось, что смешанные культуры микроорганизмов осуществляют деградацию промышленных ПХБ до неохарактеризованных углеводорО' дов, при этом расщепляются преимущественно молекулы с бО' лее низкой степенью хлорирования. Если замещающих группировок больше, чем в тетрахлор-ПХБ, то молекула становится полностью резистентной. В большинстве работ исследовали превращения чистых изомеров ПХБ.
Бензпирен представляет собой устойчивое полиароматиче- ское соединение, при деградации которого образуются канцерогенные гидрокси- и эпоксипроизводные. Он не минерализуется в системах активного ила, хотя было описано несколько культур микроорганизмов, способных частично метаболизировать этот продукт с помощью индуцибельных и неиндуцибель- ных гидроксилазных систем. При этом образуется сложная смесь конъюгированных производных.
Полистирол очень устойчив к биодеградации. Был описан процесс, в котором тонко измельченные автомобильные шины, изготовленные из стирол-бутадиеновой резины, частично разлагались микроорганизмами после добавления какого-либо по~ верхностно-активного вещества. Содержащиеся в шинах анти- озонаты, антиоксиданты и ускорители вулканизации замедляют этот процесс; конечный продукт можно использовать для улучшения почвы. Имеются сообщения о росте сообщества микроорганизмов на стироле, в результате чего удаляется ингибитор полимеризации 4-трвт-бутилкатехол. В результате свобод' 19—1344
норадикальноя полимеризации стирола происходит осаждение полистирола. Впоследствии этот полимер исчезает, что свидетельствует о способности данного микробного сообщества к разрушению полистирола.
： Биодеградация нефтяных загрязнений
Рассмотрим теперь процессы биодеградации сложных смесей углеводородов и их производных в средах, загрязненных нефтью. Речь пойдет как о сточных водах нефтяной промышленности, так и о загрязнении нефтью окружающей среды. Источники таких загрязнений могут быть самые разнообразные: промывка корабельных бункеров для горючего, аварии на тан~ керах в открытом море (основная причина нефтяных загрязнений окружающей среды), утечки в нефтехранилищах и сброс отработанных нефтепродуктов. '
\ Сточные воды нефтяной промышленности обычно очищают биологическим способов после удаления большей части нефти физическими способами или с помощью коагулянтов. Токсическое воздёйствие¥ компонентов таких сточных вод на системы активного ила можно свести к минимуму путем постепенной «акклиматизации» очистной системы к повышенной скорости поступления стоков и последующего поддержания скорости потока и его состава на одном уровне. Однако загрузка атнх，си・ стем1 моЯ<е^ значительно варьировать и, видимо, лучше использовать более совершенные технологии, например системы с илом, аэрированным чистым кислородом, или же колонные биореакторы. .
Самые большие утечки нефти в окружающую среду проис* ходят в море, где она затем подвергается различным физическим превращениям, известным как выветривание. В ходе этих абиотических процессов, включающих растворение, испарение и фотоокисление, разлагается — в зависимости от качества нефти и от метеорологических условий — 25—40% нефти. На этой стадии разрушаются многие низкомолекулярные алканы. Степень микробиологической деградации выветрившихся нефтя- нУх разливов определяется рядом факторов. Весьма важен со* став нефти: относительное содержание насыщенных, ароматических, содержащих азот, серу и кислород соединений, а также асфальтенов в различных типах нефти различно. Определенную устойчивость нефти придают разветвленные алканы» серу содержащие ароматические соединения и асфальтены. -Кроме того, скорость роста бактерий, а следовательно, и Скорость биодеградации определяются доступностью питательных веществ, в частности азота и фосфора. Оказалось, что добавление таких веществ увеличивает скорость биодеградации.
Количество разных организмов, способных расти на компонентах нефти, зависит от степени загрязненности углеводородами. Например, больше всего их находят поблизости от крупных портов или нефтяных платформ, где среда постоянно загряз-* мена нефтью. Полная деградация нефти зачастую не происходит даже при участии богатых по видовому составу микроб-， iHbix сообществ. Наиболее биологически инертные компоненты, например асфальтены, содержатся в осадочных породах и нефтяных залежах. Основные физические факторы, влияющие на скорость разложения нефти,—это температура, концентрация жислорода, гидростатическое давление и степень дисперсности (нефти. Наиболее эффективная биодеградация осуществляется ； "тогда, когда нефть эмульгирована в воде.
Особую проблему представляют выбросы или . ^случайные фазлйвы нефти на поверхности почвы, поскольку они могут привести к загрязнёйию почвенных вод н источников питьевой воды. В почве[ содержится очень много микроорганизмов, способных разрушать углеводороды. Однако даже их активность не •всегда достаточна, если образуются растворимые производные 」 (или поверхностно-активные соединения, увеличивающие распространение остаточной нефти.
. Пестициды■
©лив отходов производства пестицидов сегодня строго контро-- лируется; технология очистки сточных вод или их детоксика- 'Ции хорошо разработана, хотя остается сложной и многообразной. Она включает сначала экстракцию пестицидов растворите-k лямн, а затем обычную биологическую обработку. Для ликвидации непредусмотренных выбросов, происходящих при утечках ^или при промывке и замене контейнеров с пестицидами, подхо- 一 дящая технология пока отсутствует. Пестициды попадают в окружающую среду и в результате использования их для обработки сельскохозяйственных культур. Большинство пестицидов расщепляется бактериями и грибами. Превращение исходного пестицида в менее сложные соединения нередко осуществ- -ляётся при участии сообществ микроорганизмов. Были описаны различные стадии и промежуточные -продукты - процессов .деградации-ДДТ, идущей, например," в ходе сопряженного метаболизма и приводящей к полной минерализации этого стой- 一 мого пестицида. Часто из среды, содержащей ксенобиотик, м°жно выделить сообщества такого рода, в которых он служит не основным источником углерода, а источником фосфора, се- рьт или азота. Чрезвычайно высокая токсичность пестицидов， зачастую утрачивается на первой же стадии их модификации. Зто позволяет разработать относительно несложные микробио-
d9*
логические способы их детоксикации. Например, в результате гидролиза мо氷ет значительно уменьшиться токсичность пестицида или увеличиться вероятность биодеградации. Для этого хорошо было бы использовать внеклеточные ферменты, способные функционировать в отсутствие коферментов или специфических факторов н осуществлять детоксикацию разнообразных пестицидов. Это могут быть такие гидролазы, как эстеразы,, ацмламндазы и фосфоэстеразы. Чтобы выбранный фермент можно было применять in situ, он должен обладать подходящей кинетикой в широком диапазоне температур и pH, быть нечувствительным к небольшим количествам растворителей или тяжелых металлов, не ингибироваться субстратом при концентрациях, характерных для содержимого очистных системг а также хорошо храниться. В ряде случаев в качестве биологического агента детоксикации была испробована паратионгид- ролаза, выделенная из Pseudomonas sp. С ее помощью удалось удалить 94—98% остаточного паратиона (около 75 г) из контейнера с пестицидом за 16 ч при концентрации субстрата 1% (по весу). Забуференные растворы паратионгидролазы использовали также для детоксикации паратиона в разливах на почве, где его концентрация, по~видимому, была весьма высока. Скорость разложения паратиона в этом случае зависела от типа почвы, влажности, буферной емкости раствора и концентрации фермента. При этом значительные количества пестицида были обезврежены всего за 8 ч. Как показали лабораторные эксперименты, еще одна возможная сфера применения иммобилизованных ферментов — это очистка сточных вод. Были описаны гидролазы для детоксикации других пестицидов. Многие из них обладают широкой субстратной специфичностью, что открывает большие возможности для создания других простых систем детоксикации пестицидов. В будущем подобные системы смогут применяться при промывке промышленных химических установок и реакторов, ферменты в виде аэрозолей ——для удаления пестицидов с поверхностей, а ферменты в сочетании с пестицидами — для быстрого разрушения пестицидов после их использования.
Биодеградация поверхностно-активных веществ
По чувствительности к биодеградации синтетические поверх- ностно-активные соединения, применяемые в быту и в промышленности как моющие средства, можно разделить на «жест* кие》и 《мягкие》. Анионные соединения этой группы, такие как алкилбензолсульфонаты, в конце 50-х гг. привлекли к себе внимание тем, что они загрязняют окружающую среду: это проявлялось в образовании пены в водоемах. Сначала в прода-
жу поступали «жесткие» детергенты, устойчивость которым придавали их разветвленные алкильные боковые цепи. Чтобы предотвратить их накопление в природе, промышленность добровольно перешла к производству подверженных биодеградации, линейных неразветвленных алкилбензолсульфонатов. Разрушение этих поверхностно-активных соединений начинается с окисления концевых метильных групп, после чего за счет Д-окисления идет расщепление линейных боковых цепей. Кольцевые структуры молекул обычно разрушаются только после полной деградации боковой цепи. Данный процесс осуществляется только в аэробных условиях, поскольку для начального окислительного этапа требуется кислород. Разветвленные молекулы не всегда оказываются устойчивыми, хотя процесс их 0-окислення и затруднен. Механизм разрушения разветвленной цепи до конца не установлен. Связь углерод ——сера является очень прочной, и это увеличивает биологическую инертность молекулы детергента. Реакции десульфирования детально не изучены, но скорее всего в них участвуют гидроксилазы или монооксигеназы. По-видимому, далее сульфонатный остаток превращается в сульфат, возможно, с образованием сульфита в качестве промежуточного продукта. Метаболизм арил- сульфонатов уже был рассмотрен нами в разд. 6.7.3. Есть основания считать, что десульфирование и л^ета-расщепление ароматического кольца детерминируются плазмидами.
.Алкилсульфаты все еще используются как моющие средства на фабриках-прачечных и в косметической промышленности; основную их массу составляют первичные алкилсульфаты. Линейные сульфаты легко разрушаются, но этот процесс замедляется из-за наличия разветвленных участков. В первичной атаке этих молекул участвуют сульфатазы, образующие соответствующие спирты, которые подвергаются затем дальнейшему метаболизму. Для этого процесса кислород не нужен, и он может идти в анаэробных условиях. Необычность алкилсульфатаз по сравнению с сульфатазами вообще состоит в том, что они атакуют связь С—О в группах С—О—S. Первичные и вторичные алкилсульфаты индуцируют образование сложного комплекса сульфатаз.
Неионные детергенты применяются в быту; поскольку они облегчают смачивание и способствуют образованию эмульсий, их с успехом используют при производстве аэрозолей для сельского хозяйства и в косметической промышленности. Линейные первичные алкогольэтоксилаты минерализуются быстро и до конца, но более высокомолекулярные гомологи более устойчивы. Деградация осуществляется путем окисления концевых метильных групп и последующего р~окисления с образованием низкомолекулярных алканоатэтоксилатов, лишенных ио*
нерхностно-активных свойств. У вторичных алкогольэтоксила-， tqb . гидрофобная алкильная цепь разрушается с обоих концов 3^' счет (о- и р-окисления. Имеющиеся в этих соединениях - эфирные связи увеличивают их устойчивость к биодеградации. ■ Был^ предложены возможные способы расщепления этих сва- зей, ,.^ частности монооксигеназное расщепление, гидролиз, уча* стие углерод： кислород——лиазы и окисление а-атома угле・т рода эфирной связи с последующим гидролизом сложного эфира.1
Имеющиеся в продаже детергенты редко содержат по весу более 30% поверхностно-активного соединения. К числу остальных компонентов относятся оптические отбеливатели, отбели^ “ ватели-окислители, вспомогательные пенообразователи, антикоррозийные добавки и (в ряде случаев) ферменты. Основную массу составляет носитель (наполнитель). Наполнители нужны для: 1) уменьшения концентрации свободного кальция и маг-- ния с целью предотвращения образования неорганических осадков; в противном случае выпадут в осадок соли щелочноземельных металлов и аниона детергента; 2) диспергирования агрегатов почвенных частиц и стабилизации почвенных суспен-
СООН.СН2.О.СН(СООН).СН2СООН
КМС
СООН.СН2.О.СН2.СООН
ОДА
СООН.СН2.О.СН2.СН2.О.СН2.СООН
ЭГТА
N(CH2COOH)3
НГА
Рис. 6.20. Структура некоторых органических； соедицений, .пригодных.для_ пол ； вышения эффективности детергентов.
зий. Наполнители должны иметь хорошую буферную емкость и не вступать в нежелательные реакции с другими компонентами смеси. В течение многих лет для этих целей использовали тринатрийфосфат, но ой ускоряет зарастание внутренних водоемов. Процесс эвтрофикации водоемов может ускоряться в результате биодеградации и минерализации любого азотистого или фосфорного соединения. В поисках кандидатов на • роль свободных от азота и фосфора наполнителей были выбраны синтетические карбоксиэфиры (КМС, карбоксиметилсукци- нат; ОДА, окисидиацетат; ЭГДА, этиленгликольдиацетат; рис. 6,20). Изучение метаболизма КМС и его аналогов позволило понять, каким путем микроорганизмы приобретают способность к деградации новых ксенобиотиков. Сам КМС быстро разрушается в природе; в начальной реакции участвует индуцибельная^ -лиаза, расщепляющая молекулу КМС с образованием гликоле-.
та и фумарата. Аналоги КМС оказались более стойкими, видимо, вследствие субстратной специфичности индуцируемых лиаз. Устойчивость этих аналогов не связана с процессом их поглощения клетками, поскольку было доказано, что они поступают в них при участии конститутивной системы транспорта цитрата. КМС-лиаза оказалась удивительно сходной с по- лигалактуронатлиазой; организмы, развивающиеся на КМС, так же хорошо раетут нА полигалактуронате. Это весьма показательный пример появления способности к деградации путем приобретения новой функции уже сущвствующими ферментами. Возможно, что эта лиаза кодируется плазмидой. В качестве наполнителя широко использовался нитрилтриацетат (НТА), по* скольку он подвержен быстрой биодеградации в системах активного 'ила и в речной воде.
ЛИТЕРАТУРА
Callely 4 G.,■ Forster С Е, Stafford D 4 (eds.), 197-7. Treatment of Industrial Surfactants, pp. 283—327, Hodder ans Stoughton,. London.
Chater 及 收 A.,' Somerwille M. J. (eds.), 1978. The Oil Industry and Microbial Ecosystems, Heyden and Son Ltd. (on behalf of the Institute of Petroleum), London.
Gibson D. T. (ed.), 1984. Microbial Degradation of Organic Compounds, Microbiology Series, Vol. 13, Marcel Dekker, New York.
Higgins /. /., Burns R. G., 1975. The Chemistry and Microbiology of Pollution, "Academic Press, London.，
Leisinger T, Cook A. M., Hutter R” Nuesch 工，1981. Microbial Degradation of Xenobiotics and Recalcitrant Compounds, FEMS Symp., 12, Academic Press (on behalf of the Federation of European Microbiological Societies), London.
Monlin G., Galzy P, 1984. Whey, a Potential Substrate for Biotechnology. In: Biotechnology and Engineering Reviews, Vol. I, (ed. Russel G. E.), pp. 347— 374, Intercept Ltd., Newcastle-upon-Tyne； ，' 1
Stafford D. A., 1982. Biological Treatment.of Organic .Compounds and Solvents. In: Safe Use of Solvents (eds. Collings A. J., Luxton S. G.), pp. 293—304, Academic Press, London.
Stafford D. 4, Etheridge S. P., 1982. Farm Wastes, Energy Production and the Economics of Farm Anaerobic Digesters. In: Anaerobic Digestion, pp. 255— 268, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam.
Stafford D. Л., Hawkes D. L., Horton R., 1980. Methane Production from Waste Organic Matter, CRC Press, Boca Raton, Florida.
Turner Stafford D. A., Hughes D.邑 Clarkson J. (1983). The Reduction of 一 Three Plant Pathogens (Fusarium, Corynebacterium and Globodera) in
Anaerobic Digestion, Agric, Wastes, 6, 1—11.'-
Wheatley A. D., 1984. Biotechnology and Effluent Treatment. In: Biotechnology
and Genetic Engineering Reviews, Vol. I (ed. Russel G. E.), pp. 261—310» Intercept Ltd., Newcastle-upon-Tyne.
Глава 7
Генетика и биотехнология
К. Харди, С. Оливер
7.1. Введение
При оптимизации любого промышленного процесса, протекающего с участием живых организмов, основные усилия бывают направлены на улучшение их генетически обусловленных свойств. Традиционно для повышения продуктивности штаммов использовали мутагенез с последующим скринингом и отбором подходящих вариантов. В «допастеровский период» отбор при проведении наиболее 《древних》 процессов ферментации (например, в пивоварении или сыроделии) осуществлялся, очевидно, бессознательно. В последнее время для объединения желаемых свойств разных штаммов в одном организме стали использовать гибридизацию.
Необходимой предпосылкой создания более продуктивных штаммов путем отбора мутантов и рекомбинации является глубокое знание биохимии и физиологии процесса ферментации. Нам нужна также информация о том, какие стадии метаболизма являются лимитирующими, каковы термодинамические пределы повышения выхода продукта. Обычно эффективность процесса удается поднять, используя приемы как физиологии, так и генетики: при этом возможности двух наук дополняют друг друга, а не противопоставляются.
Сегодня в этой области произошли явные перемены: если раньше единственным используемым генетическим методом был отбор улучшенных штаммов, то сегодня предлагаются совсем новые подходы, основанные на технологии рекомбинантных ДНК (генетическая инженерия), С их помощью путем ферментации можно получать новые виды продукции: белки и пептиды человека, антигены вирусов. Надо сказать, что большой интерес к биотехнологии в значительной мере обусловлен именно появлением генетической инженерии. В этой главе мы рассмотрим, какое применение могут найти методы модификации генетического материала как in vivo, так и in vitro для разработки новых и модернизации существующих биотехнологических процессов.
72 Способы увеличения продуктивности штаммов
72/. Мутагенез и отбор
В прошлом для увеличения продуктивности штаммов обычно использовали мутагенез и отбор: именно таким путем удалось повысить выход антибиотиков, синтезируемых грибами и акти- номицетами. Рис. 7.1 иллюстрирует применение этих методов для повышения выхода пенициллина. Было последовательно отобрано свыше двадцати штаммов, продуцирующих все больше пенициллина, и в конечном счете продуктивность увеличилась в 55 раз. Как в этом случае, так и во многих других прямого отбора не происходило, поскольку не удавалось создать условия, при которых росли бы только искомые штаммы. Вместо этого пришлось применять метод скрининга: клетки, выжившие после воздействия больших доз мутагенов, размножали в колбах на качалках, после чего в фильтратах культуральной среды определяли количество антибиотика.
Скрининг требует много времени и напряженного труда. Часто штаммы, для которых был получен большой выход при выращивании в колбах, оказывались непродуктивными в условиях роста в ферментере большого объема. Нередко успеху способствовало знание «секретов мастерства»: так, оказывается, что большая продуктивность обычно свойственна особым морфологическим вариантам.
Скрининг с использованием чашек с агаром вместо колб на качалках позволяет обследовать гораздо больше мутантов. Образование антибиотиков или метаболитов нередко оцейивается методом биопроб, когда в агар вводят индикаторные организмы. Разработаны устройства для автоматического скрининга чашек. В них используются механические приспособления для инокуляции и производится периодическое фотографирование и последующий компьютерный анализ изображений.
Можно создать особые условия, при которых мутанты с нужными свойствами не растут. В этом случае применяется так называемый метод обогащения, когда активно растущие клетки дикого типа погибают, а нерастущие мутантные выживают. Так, например, пенициллин или нистатин вызывает гибель растущих клеток бактерий или грибов соответственно. При работе с грибами недостаток в среде инозитола приводит к автолизу растущих, но не покоящихся клеток.
Наиболее подходящим способом является, конечно, прямой отбор, когда создаются условия для роста только мутантных клеток. Этот подход применялся для выделения штаммов —— сверхпродуцентов некоторых метаболитов, например аминокислот или цитрата. Обработанную мутагеном культуру выращи-
----fynic卅iunTtbrysegemtm ---NRRL-1951 cantaloupe isolate,Peoria, IL----fynic卅iunTtbrysegemtm ---NRRL-1951 cantaloupe isolate,Peoria, ILПервый новый мутантный штаммПервый новый мутантный штаммNRRL-1951-B25NRRL-1951-B25Х-1612Х-1612Universityof WisconsinUniversityof Wisconsin|UV E-1E-3|NM一 E:4I NM史6j NME-8{ NME9j NM £-10|nm£-12 •|UV E-1E-3|NM一 E:4I NM史6j NME-8{ NME9j NM £-10|nm£-12 •
----fynic卅iunTtbrysegemtm ---
NRRL-1951 cantaloupe isolate,
Peoria, IL
----fynic卅iunTtbrysegemtm ---
NRRL-1951 cantaloupe isolate,
Peoria, IL
Первый новый мутантный штамм
Первый новый мутантный штамм
NRRL-1951-B25
NRRL-1951-B25
Х-1612
Х-1612
Universityof Wisconsin
Universityof Wisconsin
|UV E-1
E-3
|NM
一 E:4
I NM
史6
j NM
E-8
{ NM
E9
j NM £-10
|nm
£-12 •
|UV E-1
E-3
|NM
一 E:4
I NM
史6
j NM
E-8
{ NM
E9
j NM £-10
|nm
£-12 •
Исходный штамм / USDA Laboratory - Peoria, IL
Carnegie Institute, NY, and
University
of Minnesota
I UV 'Wis. QM76
Wis. B13-D10 (не пнеент/- । рованный) Is
■Wis. 47-638
is
Wis. 47-1564
Wis. 48-701
I NM
Wis' 49-133 ；
&S，
Wis. 51-20
Обозначения
При получении каждого последующего штамма были использованы следующие методы:
S - естественный отбор;
UV ■ ультрафиолетовое облучение;
X - рентгеновское облучение;
(NM - обработка азотистым ипритом [метил-бис-(^-хлорэтил) -амином]
SA -обработка сарколизином
[п-ди- (2-хлорэтил) -аминофенилаланином]
А
5
100000 г
Годы
Рис. 7.1. 4 Последовательный отбор штаммов, образующих все большее количество пенициллина, с помощью генетических методов (Impacts of Applied Genetics, Office of Technology Assessment, US Government Printing Office, Washington DC, USA), 5. Иллюстрация тех изменений, которые произошли в производстве пенициллина. Показано, как росла конечная концентрация пенициллина в культуральной среде при его промышленном производстве в период с 1940 по 1975 г. '
вают в присутствии ингибитора (например, аналога аминокислоты) ,в результате Rero отбираютсй мутанты, преодолевающие нарушение обмена за счет образования избытка желаемого соединения.
Отбор на чашках с агаром основан на том, что часть организмов отвечает на- воздействие по принципу «всё или ничего». Колонии мутантов растут, а диких клеток — нет. Однако при получении промышленных штаммов, особенно предназначенных для использования в длительных процессах ферментации, нередко стремятся получить для конкретных условий относительно небольшие различия в скорости роста. В этом случае отбор происходит при непрерывном культивировании. В хемостатах при длительном выращивании культура все время находится в экспоненциальной фазе роста, и это позволяет выделять даже те мутанты, у которых сродство к субстрату, удельная скорость роста или устойчивость к токсическому действию высоких концентраций субстрата или. продукта лишь ,немного превышает исходный уровень.
7.2.2. Гибридизация путем скрещивания
Наиболее простой путь создания организмов с желаемым комплексом генетически обусловленных признаков — это скрещивание штаммов, принадлежащих к противоположным половым типам. Как про-, так и эукариотические микроорганизмы скрещиваются при контакте клеток, и этот процесс используется для получения рекомбинантов.
Конъюгация у бактерий
У бактерий половой процесс называют конъюгацией. Контакт между двумя клетками осуществляется за счет образования длинного конъюгационного мостика, который служит для переноса ДНК из одной клетки в другую. Способность к формированию мостика закодирована во многих плазмидах (см. далее); по нему они переносят свои гены, а в некоторых случаях и гены клетки-хозяина в клетку-реципиент. Плазмиды, осуществляющие перенос генов клетки-хозяина, обладают, таким образом, способностью к мобилизации хромосом. У Escherichia coli такие F-плазмиды выступают в роли фактора пола. Они способны мобилизовать хромосому не только Е. coli, но и родственных энтеробактерий (Shigella, Klebsiella, Salmonella, Erwinia) и поэтому могут использоваться для переноса генов между бактериями разных родов. Некоторые плазмиды, выделенные из Pseudomonas aeruginosa^ еще более «неразборчивы». Так, плазмида R68.45 может переносить хромосомные гены между видами Pseudomonas, в том числе и Pseudomonas putida, но кроме этого, обладает способностью к мобилизации хромосом и таких родов, как Rhizobium, Rhodopseudomonas, Azospiril- lum. Agrobacterium и Escherichia.
К числу наиболее широко используемых в промышленности микроорганизмов относятся разнообразные виды Streptomy- ces: с их помощью получают более 60% разновидностей применяющихся сегодня антибиотиков. У этих организмов хорошо развиты системы скрещивания, которые обнаружены и у их близких родственников, видов Nocardia (они синтезируют антибиотики рифамицины). Способность к конъюгации была открыта при изучении Streptomyces coelicolor (этот вид применения в промышленности не нашел и используется в лабораториях). В клетках этого организма было найдено два типа плазмид, SCP1 и SCP2, несущих фактор пола. SCP2 продуцирует рекомбинантные формы с очень высокой частотой. SCP1 по своим свойствам близка к F-плазмиде £• coli. Она может встраиваться в хромосому Streptomyces, а также включать фрагменты хромосомной ДНК. Это довольно крупная плазмида (М「=
=18-106), несущая все шестнадцать генов, нужных для образования антибиотика метиленомицина.
Многие используемые в промышленности виды Streptomy- ccs, видимо, не обладают собственной системой скрещивания, ?но у Streptomyces rimosus, продуцента окситетрациклина, найдена плазмида SRP1, которая несет активный фактор пола, и при скрещивании SRP1+XSRP1" рекомбинантные формы образуются с частотой 10-4——10~3.
У других грамотрицательных бактерий (помимо Streptomy- ces) конъюгационные плазмиды встречаются относительно редко. Отметим, что недавно система скрещивания была обнаружена у бактерий такого важного в промышленном отношении рода, как Bacillus. Существенно, что эти бактерии способны .легко акцептировать《голую》ДНК, и поэтому рекомбинантные формы несложно получить путем трансформации. Такая .возможность была использована при создании штаммов Bacillus, у которых около 50% синтезируемого ими белка составляет гидролизующий крахмал фермент а-амилаза. При этом были отобраны несколько мутантов по разным генам с повышенной способностью к образованию фермента. Эти разные мутации были затем сведены воедино у одного штамма путем последовательной трансформации хромосомной ДНК и отбора на ловышенную способность гидролизовать крахмал.
Системы скрещивания у грибов
У грибов существуют разнообразные типы скрещивания, которые используются в генетических исследованиях. Многие гри- бы-аскомицеты и базидиомицеты обладают сложноорганизованными системами скрещивания, препятствующими самооплодотворению и другими формами инбридинга. Половой процесс контролируется системой несовместимости. У некоторых грибов «система несовместимости биполярна; при этом процесс скрещивания контролируется всего одним локусом, который существу* ет в двух альтернативных аллельных формах. Это дает два типа спаривания, например а и а у Saccharomyces cerevisiae, причем разрешена лишь комбинация а/а. У других грибов (например, Schizophyllum commune) система несовместимости тетраполярна. У них тип спаривания определяется двумя гена- ■ми, каждый из которых имеет множество аллельных форм. Для успешного скрещивания два партнера должны обладать разны- ■ми аллелями каждого из двух локусов типа спаривания (на・ .'пример, АхВуХАуВх— это полностью совместимое спаривание, а комбинации АхВуХАхВх или же АхВуХАуВу и АхВуХ ХАхВу невозможны, так как приводят к гибели клеток на разных стадиях процесса скрещивания).
Парасексуальный цикл у грибов
Многие мицелиальные формы грибов, применяющиеся в пр。， мь^шленйости, не имеют истинного полового цикла, во времж которого можно было бы провести скрещивание с целью конструирования более продуктивных штаммов. Однако в этом случае для осуществления рекомбинации можно использовать- парасексуальный цикл. Именно этот подход применялся при- работе с1 грибами таких промышленно важных родов, как Aspergillus, Penicillium, Cephalosporium и Fusarium. Суть，пара- сексуального цикла отражена на рис. 7.2.
Гаплоид а
J I>. Гаплоид
Родители-гаплоидыПлазмогамия
и рекомбинантныеГетерокарион,
гаплоиды
Рис. 7.2. Обычный парасексуальный цикл. [С. Е. Caten (1981) Parasexual processes in. fungi. In： The Fungal Nucleus (eds. K. Gull, S. G. Oliver), pp. 191— 214. Cambridge University Press.1 Тонкие линии——гаплоидные или анеуплоид* ные ядра; жирные линии — диплоидные ядра.
Гетерокарионы, у которых в одной клетке сосуществуют генетически разные ядра, могут быть получены либо путем слияния (анастомоза) гиф разных мицелиев, либо в результате* образования мутантного ядра в мицелии. Слияние ядер в гетерокарионе происходит с низкой частотой (10~5—10~4), но этот процесс1 ускоряется под действием (+)-камфоры или УФ-све- та. Митотическую рекомбинацию в диплоидном ядре можно индуцировать с помощью химических и физических воздействий, которые либо вызывают мутации, либо ингибируют синтез ДНК. Возврат к гаплоидному состоянию после рекомбинации,, видимо, происходит в результате постепенной утраты отдельных хромосом. Этому способствуют такие вещества, как п-фтор- фенилаланин и карбаматы бензимидазола, препятствующие образованию микротрубочек.
По сравнению с истинными системами пола парасексуаль- ^ьш цикл ——это малоэффективный механизм образования рекомбинантов. Впрочем, его эффективность можно повысить, применяя интенсивный отбор и разнообразные вещества. Эта система была использована для повышения выхода антибиотиков, синтезируемых Penicillum и Cephalosporium.
7.3. Генетические перестройки in vivo
Плазмиды
.Многие свойства бактерий, интересные с точки зрения биотехнологии, кодируются плазмидами. Плазмиды — это кольцевые молекулы ДНК, которые стабильно передаются потомству бактериальных клеток независимо от хромосомной ДНК- В генетической инженерии плазмиды используются для клонирования нужных генов. Мы опишем в этом разделе некоторые важнейшие свойства,плазмид и обсудим те из них, которые особенно ценны для биотехнологии.
Структура 〃 репликация
■Мрл. масса плазмид составляет от 1 • 106 до 200-106. Таким образом, самые мелкие плазмиды кодируют один-два белка среднего размера, тогда как более крупные — 300 или более белков. Крупные плазмиды могут кодировать множество фермен： тов, необходимых для работы целой последовательности биохимических реакций, например для превращения толуола в катехол. Плазмиды с мол. массой более 100-106 обнаружены только у грамотрицательных бактерий, в частности у видов Pseudo- monas и Agrobacterium. Мол. масса плазмид грамположитель- яых бактерий лишь в отдельных случаях превышает 40- 10б.
В бактериальных клетках плазмиды существуют в виде кольцевых двухцепочечных ДНК, которые, кроме того, находятся в сверхспиральном состоянии. Некоторые из плазмид могут существовать лишь в клетках одного или двух близких видов. К числу плазмид с широким кругом хозяев относятся RP4, R68.45, RK2 и сходные с ними плазмиды, несущие маркер устойчивости к лекарственным препаратам (R-плазмиды), которые принадлежат P-группе несовместимости (члены одной и той же группы несовместимости не могут сосуществовать в бактериальной клетке). Эти плазмиды были перенесены во многие виды грамотрицательных бактерий; создается впечатление, что ■мх хозяевами могут быть все штаммы грамотрицательных бактерий.
Таким образом, R-плазмиды, относящиеся к группе Р, особенно подходят для генетических экспериментов с грамотрица-
тельными бактериями, используемыми в промышленности. При помощи этих плазмад мы можем осуществлять перенос хромосомных генов между неродственными видами. Небольшие по размеру производные плазмид RP4 и RK2 используются как векторы для клонирования молекул ДНК, которая затем может быть перенесена в клетки самых разных видов.
Рис. 7.3. Плазмиду pBR322 получают путем объединения плазмид ТпЗ, pSClOl и pMBl. [J. G. Sutcliffe (1979) Cold Spring Harbor Simposia on Quantitative Biology, 43, 77—90.] Плазмида pMBl сходна с плазмидой ColEl. Устойчивость к ампициллину определяется геном ^-лактамазы. Указано направление транскрипции этого гена. Стрелками отмечены уникальные сайты расщепления pBR322 некоторыми ферментами.
Репликация некоторых типов плазмид тщательно изучена, и нам известны сегодня многие детали этого процесса, особенно для небольшой плазмиды ColEl. Эта информация помогает при использовании плазмид для клонирования генов. Чаще всего применяют производные плазмиды pBR322 длиной 4362 пар нуклеотидов, несущей гены устойчивости к пенициллину и тетрациклину. Эти гены были перенесены из R-плазмид (рис. 7.3)
в фрагмент небольшой плазмиды рМВ1, которая близка к очень хорошо изученной небольшой плазмиде ColEl.
Плазмиды pBR322 и ColEl могут реплицироваться в Е. со- li и близких видах Enterobacteriaceae. В бактериальных клетках они представлены несколькими копиями; так, для ColEl число плазмидных копий на хромосому равно примерно 20, а для pBR322 ——40. Это обстоятельство очень важно для клонирования. Чем больше число копий клонированного гена, тем выш& выход кодируемого белка. Кроме того, многокопийные плазмиды не так легко утрачиваются при культивировании. С другой стороны, малое число копий плазмиды иногда имеет свои преимущества, например при клонировании таких генов, продукты которых гибельны для бактериальной клетки в большом количестве.
Изучению механизмов контроля репликации и числа копий бактериальных плазмид посвящено множество работ. Было обнаружено, что число копий плазмид примерно одинаково ® клетках, размножающихся с разной скоростью. Из этого следует, что репликация плазмид как-то связана с ростом бактерий. Такая координация достигается при участии механизмов^ контролирующих начало репликации. Если уж репликация на* чалась, то она идет с относительно постоянной скоростью при любом темпе размножения бактерий. При высокой скорости: размножения репликация индуцируется чаще в случае много- копийных плазмед, чем малокопийных.
Начало репликации ColEl и pBR322 контролируется небольшими молекулами РНК, которые взаимодействуют с особьм участком плазмиды, расположенным поблизости от точки инициации репликации. Начавшись, репликация идет в одном направлении и заканчивается вблизи точки инициации. Генетики^ стремящиеся максимально увеличить выход белков, кодируемых клонированными в pBR322 генами, получали мутанты с модифицированными РНК. У некоторых таких мутантов число копий плазмиды составляет более 100, что приводит к существенному увеличению выхода продуктов, кодируемых клонированными генами. Интересная особенность репликации ColE 1 и pBR322 заключается в том, что она полностью обеспечивается ферментами хозяина. Сами плазмиды не несут информации, нужной для кодирования ферментов репликации.
Процессы репликации pBR322 и ColEl, с одной стороны, и хромосомы £. coli ——с другой, различаются тем, что первый не подавляется хлорамфениколом, который блокирует синтез белка. В присутствии этого соединения репликация хромосом прекращается по завершении уже начавшегося раунда репликации. Такого подавления репликации pBR322 не происходит, н плазмиды накапливаются в обработанных хлорамфениколов 20-1344
клетках, так что в конечном счете они составляют до 50% всей ДНК. При выделении плазмид для увеличения выхода плаз- мидной ДНК к культуре за несколько часов до сбора клеток иногда добавляют хлорамфеникол.
Инициация репликации плазмиды RI Е. coli регулируется белком-репрессором, кодируемым одним из генов R1. Были получены мутантные плазмиды, которые кодируют аномальный репрессор или же имеют несовершенный механизм регуляции его образования. Некоторые из этих мутантов т— температурочувствительные (репрессор неактивен при 43℃). При 30 ℃ репликация идет нормально, и на клетку образуется 1—2 плаз- мидные копии, а при 43 ℃ репликация инициируется гораздо чаще, так что в клетке накапливается по нескольку сот плазмид. Небольшой сегмент R1, содержащий участок начала репликации и связанные с ними регулирующие элементы, был использован для создания плазмид-векторов, применяемых при клонировании разнообразных генов. Преимущество таких векторов заключается в том, что при повышенной температуре с их помощью можно получать множества копий клонируемого гена, а следовательно, и много белка, кодируемого этим геном.
Важнейшие гены плазмид
Для биотехнологии особенно интересны те гены плазмид, в которых закодирована способность к фиксации азота и деградации органических соединений, а также факторы вирулентности патогенных бактерий. 、 一 … 一
"По-видимому, одним из крупных достижений генной инженерии может оказаться использование бактерий или их генов для передачи растениям способности фиксировать азот. На корнях бобовых растений при участии бактерии Rhizobium образуются клубеньки, в которых и происходит фиксация азота — перевод его в форму, доступную растениям. Недавно было установлено, что по крайней мере некоторые гены бактерий, детерминирующие образование клубеньков и фиксацию азота, локализованы в плазмидах. Впервые указания на это были получены в опытах по передаче плазмид ирн конъюгации от одного штамма Rhizobium другому. Каждый конкретный вид из рода Rhizobium обычно вступает в симбиотические отношения только с одним определенным бобовым растением. Так, R. phaseoli участвует в образовании клубеньков у фасоли, a R. legumino- sarum ——у гороха. Было найдено, что варианты R. leguminosa- гшп, утратившие способность индуцировать образование клубеньков у гороха, вновь ее обретали, если путем конъюгации им передавалась плазмида от штамма, обладающего такой способностью. Более тога, если подобная конъюгативная плазмида
передавалась от R. legutninosarum к R. phaseoli, то эти бактерии с большей эффективностью индуцировали образование клу- бсну^а у гороха, чем у фасоли. Крупные плазмиды с мол. массой более 90-106, которые имеются у Rhizobium trifolii и R. те- -liloti, также несут по меньшей мере часть генов, нужных для! образования клубеньков и фиксации азота.
Плазмиды могут обусловливать увеличение вирулентности патогенных бактерий. В некоторых случаях идентификация свя- * занных с плазмидами факторов вирулентности помогает в борьбе с патогенными микроорганизмами. К числу наиболее изученных в этом отношении плазмид- принадлежат плазмиды ви- 二 рулентности патогенных «штаммов £., colL Энтеротоксигенные- штаммы £. coli часто вызывают острую диарею у молодняка животных, а у людей — «диарею путешественников». Плазмиды этих штаммов нередко- несут ген температурочувствительно*- го токсина, близкого к токсину холеры, и ген температуроус- стойчивого токсина. - Энтеротоксигенные штаммы обычно содержат и плазмиды с генами фимбрий- (pili), которые называют также «факторами колонизации». Эти факторы находятся； на поверхности бактериальных, клеток, которые с их помощыо прикрепляются к стенке тонкого кишечника. Штаммы, инфицирующие определенный вид животных, обладают обычно одинаковым фактором колонизации. Так, у штаммов Е. со", вызы- ， вающих.диарею у свиней, в состав этих липких выростов обычно входит антиген К88 или 987Р, в то время как у штаммрв,. выделенных от телят, образуется антиген К89. Потеря энт^ро^ токсигенными штаммами плазмид, кодирующих антигены —— факторы колонизации, сильно снижает их вирулентность, хот% - штаммы и продолжают образовывать токсины.
Одним из способов борьбы с заболеванием свиней, вызывае- -мым энтеротокоигенными штаммами, была вакцинация живот- ■ ных препаратом, содержащим .антиген К88. Предпринимаются попытки повысить выход применяемого в вакцинах антигена К88, используя технологию рекомбинантных ДНК，Эти методы нашли применение также и в производстве некоего токсоида,, который можно не опасаясь вводить животным для образова- - ния у них антител к токсинам, продуцируемым энтеротоксиген- ными бактериями. Другой подход в борьбе с диареей в животноводстве состоит в выведении пород, устойчивых к кодируе- -мым плазмидами антигенам — факторам колонизации.
Транспозоны
. Транспозоны и вставочные последовательности — это сходные- - элементы в хро-мосомных ДНК бактерий, ДНК бактериофагов.
и плазмид. В опытах с бактериями транспозоны используются»
иля получения мутантов и для клонирования нужных бактериальных генов. Открыты они были Хеджесом и Жакобом, которые показали, что небольшой фрагмент плазмиды RP4, определяющий устойчивость к пенициллину, может встраиваться ® другие плазмиды, последовательность которых не гомологична RP4. Обычный механизм рекомбинации в клетках бактерий, основанный на взаимодействии гомологичных молекул ДНК и зависимый от продукта бактериального гена rec А+, в переносе этого гена устойчивости к антибиотику не используется. В последующие годы было описано множество других транспозонов. Большинство из них было обнаружено в R-плазмидах грамот- рицательных бактерий; обычно они придают им устойчивость к антибиотикам. Лучше всего изучен транспозон ТпЗ длиною 4957 пар нуклеотидов, обеспечивающий устойчивость к пенициллину. Последовательности из 38 пар нуклеотидов на концах ТпЗ одинаковы, но противоположно направлены. В транспозоне закодирована информация о ферменте транспозазе, играющем важную роль в его перемещениях (транспозициях). Этот транс- шозон может встраиваться во множество сегментов молекулы ДНК, но предпочитает АТ-богатые участки.
Транспозоны могут служить маркером гена, предназначенного для клонирования. Как известно, при клонировании хромосомных генов бактерий иногда возникают сложности, связанные с тем, что нет простого метода, позволяющего выявить, какая из плазмид, несущих встроенный фрагмент хромосомной ДНК, содержит интересующий исследователя ген. Иногда эту проблему удается решить, выделив сначала мутант по этому ■гену с включенным в него или расположенным поблизости транспозоном.
Слияние протопластов
С целью преодоления преград для генетического обмена, существующих в обычных системах скрещивания, был разработан метод слияния протопластов (клеток с удаленными клеточными оболочками). Этот метод пригоден для получения межвидовых и даже межродовых гибридов. Его можно использовать при гибридизации клеток одного вида, которые принадлежат к несовместимым труппам спаривания или же когда природная система скрещивания малоэффективна в плане образования генетических рекомбинантов.
Слияние протопластов бактерий
Метод слияния протопластов был впервые использован в опытах с бактериями для получения межвидовых гибридов Bacillus imegaterium%Bacillus subtilis, В природе эти бактерии не
конъюгируют, но легко трансформируются изолированной ДНК. Путем слияния протопластов, индуцируемого либо полиэтиленгликолем, либо СаСЬ, получить их гибриды несложно. При этом частота рекомбинации может достигать 10~5—10~4; процесс нечувствителен к ДНКазе, следовательно, он осуществляется без трансформации.
Этот метод нашел широкое применение при гибридизации видов Streptomyces. Так, Streptomyces coelicolor обладает плазмидозависимой системой фертильности или скрещивания (с. 300), однако эта система малоэффективна, а многие исполь- .зуемые в промышленности виды Streptomyces вообще не сп。- -собны к обычному скрещиванию. Если же применить метод слияния протопластов, индуцируемого полиэтиленгликолем, то частоту рекомбинации удается повысить примерно на четыре порядка по сравнению с наблюдаемой при обычном скрещивании. Максимальная частота рекомбинации, достижимая при работе этим методом, составляет 10——20%. Штаммы не обязательно должны нести селективные генетические маркеры, поскольку при использовании этого метода возможен прямой отбор гибридов с нужным свойством. Это дает большие преимущества при конструировании промышленно важных штаммов, поскольку работа по введению подходящих маркеров нередко превращается в утомительное трудоемкое занятие.
Слияние протопластов грибов
Образование гибридов грибов с помощью слияния протопластов изучалось очень активно; этот метод нашел применение в промышленности при создании штаммов Cephalosporium acremo- nium, для которых характерны высокая скорость роста и большой выход цефалоспорина. Первые опыты по слиянию были выполнены с ауксотрофными мутантами Geotrichum candidum, у которых не обнаружено ни половой, ни парасексуальной систем. Слияние протопластов осуществляли путем центрифугирования, причем прототрофные гетерокарионы образовывались с низкой частотой. Впоследствии слияние обычно осуществляли, добавляя ионы Са2++ или ПЭГ.
Межвидовые слияния удалось провести как в опытах с различными мицелиальными грибами, так и с дрожжами, среди которых были и такие промышленно важные организмы, как Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Candida tropicalis, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis и Saccharomyces ce- revisiae. Слияние обычно происходит с частотой 0,2—2%. Be- роятность слияния ядер, приводящего после елияния клеток к образованию диплоидов, зависит от вида организма. Здесь вскрыта определенная закономерность: мицелиальные грибы
дают гетерокарионы, диморфные дрожжи — нестабильные диплоиды, а истинные дрожжи — стабильные диплоиды (рис. 7.4).
Межвидовые слияния также происходят с достаточно высокой частотой, особенно у относительно близкородственных видов Aspergillus или Penicillium. Если сливаются ядра, то за этим обычно следует потеря хромосом. Нередко после выра-
Гетерокарионы
Geotrichum candidum
Phy соту ces blakesleeanus
Mucor racemosus
Гетерокарионы нечасто образующиеся нестабильные диплоиды
Cephalosporium acremonium
Гетерокарионы и редкие стабильные диплоиды
Aspergillus
Penicillum
Гетерокарионы и часто образующиеся стабильные диплоидь»
Candida tropicalis
Нестабильные диплоиды
Yanowia lipolytics
Стабильные днпноиаь)
Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces /actis
Рис. 7.4. Результаты внутривидовых слияний протопластов.
щивания в неселективных условиях образуются споры с гаплоидными ядрами лишь одного из двух родительских видов.
Предпринимались попытки осуществить слияние протопластов дрожжей разных родов (например, CandidaXSaccharomy- copsis, Yarrowia X Pichi% YarrowiaX Kluyveromyces, Saccharo- mycesKSchizosaccharomyces). Однако такие гибриды оказались нестабильными, а частота их образования очень низкой (Ю-5—10-4). В последнем варианте обычно формировались многоядерные клетки. Сообщалось об успешном слиянии протопластов мицелиальных грибов (цел люлолитический организм
Trichoderma reesii) и дрожжей (S. cerevisiae) t но эти наблюдения нуждаются в подтверждении.
При многих слияниях образуются нестабильные гетерокарионы, в которых обычно доминирует ядро одной из родительских форм. Впрочем, далеко не всегда это препятствует генетическому обмену. . Так, убедительно показана возможность межъядерных генетических обменов в гетерокарионах Schizop- hilum commune и Saccharomyces cerevisiae. Таким образом, слияние протопластов может быть полезным методом установления гетерокариотического состояния, при котором возможен в ограниченном объеме перенос генов.
Образование гибридов растений путем слияния протопластов
Протопласты растений можно получить путем механического или ферментативного разрушения клеточных стенок. Такие протопласты—ценный инструмент в' руках генетика растений. Они довольно быстро и эффективно регенерируют1 Клеточную стенку, у них легко индуцировать деление с образованием каллус- ной ткани. Из каллуса можно вырастить растения, способные цвести и давать всхожие семена. Доступность жизнеспособных протопластов позволила генетикам растений проводить опыты по мутагенезу и селекции на уровне единичной клетки, т. е. примерно так, как это делают микробиологи. В результате, например, были получены растения табака, устойчивые к болезни «wild-fire»: мутации у протопластов вызывали этилметансуль- фонатом, а затем отбирали мутанты, устойчивые к действию метионинсульфоксима. Дело в том, что токсин, образуемый Pseudomonas (abaci (организмом, вызывающим упомянутое заболевание),一 это тоже аналог метионина.
Слияние протопластов растений осуществляют с помощью ряда агентов, включая азотнокислый натрий, гидроксид кальция и ПЭГ. Наибольшая частота слияния наблюдается при действии ПЭГ, но гибриды, полученные в присутствии кальция, проще регенерировать в целое растение. Таким путем удалось получить межсортовые внутривидовые гибриды, гибриды между видами одного рода и даже разных родов. Опыты эти проводились на таких важных культурах, как картофель, табак и спаржа.
Результатом слияния может быть простое сращение клеток одной и той же родительской линии или образование гибридов двух типов клеток. Как и для большинства других разновидностей скрещивания, основная трудность здесь состоит в выборе метода отбора гибридов; кроме того, работа с растениями сильно осложняется недостатком подходящих генетических маркеров. В большинстве тех случаев, когда гибриды удавалось по-
лучить путем слияния протопластов, гибридизация уже была осуществлена обычными генетическими методами. Таким об- разом, фенотип гибрида был уже известен, и его можно было принять за стандарт при отборе. В этой новой области селекции растений предстоит еще большая работа, и успех ее определяется тем, сможем ли мы использовать обширный набор* маркеров (например, устойчивости к химическим веществам 圧 токсинам) или ауксотрофных мутантов растений.
Слияние клеток животных
Осуществить слияние клеток и получить внутри- или межви- довые гибриды клеток млекопитающих методически проще, чей в случае микроорганизмов или растений, так как клетки млекопитающих не имеют клеточной стенки, которую необходимо удалять перед слиянием. Первый метод контролируемого слия* ния клеток млекопитающих был основан на использовании инактивированного вируса Сендай. Этот вирус относится к группе： парамиксовирусов; его вирион покрыт липидсодержащей оболочкой, сливающейся с мембраной клетки-хозяина и обеспечивающей проникновение вируса в клетку. Вирус способствует слиянию, связываясь одновременно с мембранами двух клеток. В опытах по слиянию клеток млекопитающих используются также некоторые химические вещества (ионы кальция, лизоле- цитин, ПЭГ).
Отбор гибридов из смеси продуктов слияния лучше всего вести в селективных условиях, хотя для этого можно использовать и трудоемкий метод скрининга. Так, отбор может происхо* дить в результате комплементации ауксотрофных и температур рочувствительных мутаций, но чаще всего для этого использу* ются маркеры устойчивости к химическим веществам. Последний метод был предложен Литтлфилдом, который провел опыты по слиянию устойчивой к бромдезоксиуридину линии (BUdRr) L-клеток мыши и еще одной линии, устойчивой к азагуанину (AGr). В клетках BUdRr отсутствует фермент тимидин- киназа (ТК), а в клетках AGr — инозинпирофосфорилаза- (IPP). Ни клетки ТКГРР+, ни клетки ТК+1РР_ не растут на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Ами- ноптерин ингибирует биосинтез нуклеотидов; трифосфаты пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов могут синтезироваться только клетками, способными использовать и тимидин, и гипоксантин. Для жизнедеятельности этим клеткам необходимы активные ферменты ТК и IPP. Таким образом, среди продуктов слияния TK+IPP-, TkTPP+ и TK+IPP+ способностью к росту будут обладать лишь клетки, у которых активны оба фермента』
Использование таких приемов отбора позволило получить гибриды не только путем слияния линий клеток одного вида, но и межродовые гибриды клеток человека с клетками мыши ъ крысы. Эти линии клеток грызунов/человека нестабильны, гпричем легче они теряют хромосомы человека, так что после тридцати делений в процессе выращивания у них остается все- то семь из 24 хромосом человека, изначально присутствовавших в гибридной клетке. Этот процесс элиминации хромосом был применен при картировании генома человека, поскольку таким путем удается быстро локализовать определенные гены на хромосомах.
Моноклональные антитела
Юдин из результатов использования метода слияния клеток млекопитающих чрезвычайно быстро нашел применение в биотехнологии: это линии клеток, полученных при гибридизации с участием клеток миеломы (так называемые «гибридомы»), с помощью которых могут вырабатываться моноклональные антитела. Этот метод, разработанный в Кембридже Мильштейном и его сотр., основан на создании «бессмертных» клеток, производящих антитела, за счет слияния их с клетками миеломы.
Большинство антигенов вызывает в организме образование целого набора антител, но каждый отдельно взятый лимфоцит продуцирует лишь одно из них. Миеломы — это злокачественные новообразования иммунной системы; они развиваются в результате неконтролируемой пролиферации одной линии лимфоцитов. При этом в больших количествах синтезируется один тип белков-антител. Иными словами, миеломы являются природными продуцентами моноклональных антител. По методу Миль- аптейна проводят слияние нормальных (неопухолевых) лимфоцитов и клеток миеломы. Вначале полученные гибриды синтезируют смесь антител, включающую два типа антител родительских клеток, а также гибридные их формы, образующиеся путем ассоциации тяжелых и легких цепей антител двух родительских форм. Впоследствии в результате элиминации хромосом образуются клетки, способные к синтезу антител лишь одного типа. Это могут быть либо антитела, закодированные в геноме лимфоцита, либо антитела, характерные для клеток миеломы. (Скрининг и обнаружение клона, синтезирующего искомое антитело, ведут при помощи биохимических и иммунохими- 'ческих методов. Схема этого метода дана на рис. 7.5.
Область возможного применения моноклональных антител весьма обширна. Их используют в диагностике, например для быстрого и точного типирования тканей и органов, предназначенных для пересадки. Они находят применение при очистке белков и других биологических соединений методом иммуноад-
Культура клеток миеломыКультура клеток миеломыСлияние6 полиэтиленгликолеСлияние6 полиэтиленгликолеКлетки о 。 ° О селезенки о。。。。Клетки о 。 ° О селезенки о。。。。Клетки миеломы.Клетки миеломы.
Культура клеток миеломы
Культура клеток миеломы
Слияние
6 полиэтиленгликоле
Слияние
6 полиэтиленгликоле
Клетки о 。 ° О селезенки о。。。。
Клетки о 。 ° О селезенки о。。。。
Клетки миеломы.
Клетки миеломы.
Введение антигенав организм мыши
Скрининг для отбора клонов, образующих специфические антитела против введенного антигена
Размножение нужных клонов
Крупномасштабное производство моноклональных- антител с помощью：
выращивания большого количества клеюк ил«
индукции опухопаи.мышей путем инъекции
Рнс： 7.5. Метод Мильштейна；
сорбции. Секер и Берке использовали моноклональные антитела для очистки больших количеств интерферона из лимфоцитов человека (гл. 8). Очевидно, что такой подход пригоден и для очистки интерферона, синтезируемого бактериями-рекомбинантами. Возможности применения моноклональных антител для пассивной йммунизации ограничены, во всяком случае, у больных людей, поскольку пока не удалось получить стабильные клоны на основе клеток человека.
Опыты по генетической инженерии in vitro
乙4.7. Технология
Для получения разнообразных белков эукариот и вирусов животных широко применяются бактерии и дрожжи Saccharo- myces cerevisiae. При этом используются самые разные методы, но наиболее широко, те из 幵耳芯，которые описаны ниже.
二 Прежде всего необходимо изолировать нужный ген. Если г^н животного должен экспрессироваться в клетках бактерий или дрожжей, то обычно внлчале выделяют^ соответствующую мРНК. Как правило, осуществить прямую экспрессию генов животных в бактериальных клетках не удается, поскольку эти гены содержат интроны. Ицтронн ——это вдкр^ирующие участки гена; вся информация об аминокислотной последовательности белка содержится, в других участках -г- экзонах. Зрелые молекулы мРНК клеток млекопитаюш；их не содержат последовательностей, комплементарных интронам: они удаляются ферментами в процессе, называемом сплайсингом. Следовательно, такие молекулы можно транскрибировать с помощью ферментов ревертазы , (обратной транскриптазы) и ДНК-полимеразы с образованием ДНК. >Некоторые гены животных, например кодирующие а-лейкоцитарные интерфероны, не содержат интронов и могут прямо экспрессироваться в бактериальных или дрожжевых клетках. Если в качестве исходного объекта приходится использовать мРНК, то прежде всего следует найти ее источник — ткань, в которой этот продукт образуется в наибольшем количестве. Иногда таким источником служат опухолевые ткани или же клетки в культуре, образующие необходимую мРНК.
После транскрипции данной мРНК； л получения комплементарной ДНК (кДНК)* необходимо определить, какие из множества молекул этой кДНК содержат ген, подлежащий выделению и экспрессии. На этом этапе работы молекулы кДНК обычно вводят в состав плазмид или генома бактериофагов, которые служат( векторами. Затем рекомбинантные плазмиды со встроенными молекулами кДНК переносят в клетки подходящих бактерий-хозяев.
Идентификация искомых клонов занимает иногда много времени. Если же клонирование гена проведено, выявить сходные гены в банках кДНК относительно несложно, если применить метод Грюнштейна и Хогнесса. В этом случае колонии бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды, выращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на поверх- ность питательной среды. Затем бактериальные клетки разрушают, а высвободившуюся ДНК денатурируют. При этом она остается связанной с фильтром. Далее на фильтр наносят радиоактивный зонд ——денатурированную ДНК или РНК, которая связывается с гомологичной или частично гомологичной бактериальной ДНК. Избыток радиоактивных молекул зонда,, которые не связались специфически с гомологичной ДНК, удаляют промыванием и выявляют лизированные колонии, связавшие зонд, методом радиоавтографии. Бактерии, для которых наблюдалась положительная реакция в этом тесте, можно выделить из дубликата ——реплики набора колоний.
Если специфический зонд отсутствует, то его можно синтезировать химическими методами, если известна полностью или частично аминокислотная последовательность белка — продукта интересующего нас гена. Конечно, определить точную нуклеотидную последовательность, исходя из аминокислотной последовательности, нельзя, поскольку каждая аминокислота может кодироваться разными триплетами (от 1 до 4). Однако, зная аминокислотную последовательность, можно синтезировать набор зондов и идентифицировать с их помощью плазмиды с частично гомологичными последовательностями.
Другие методы идентификации рекомбинантных плазмид основаны на экспрессии включенного в них гена. При этом идентифицируется белковый продукт, для чего используются иммунологические методы или методы определения его специфической активности. Для обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга, на основе специфического их взаимодействия с антителами, часто используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизированных бактерий связываются с антителами на диске. Положение антигенов, адсорбированных на диске, определяют с помощью радиоавтографии.
Включение ДНК s плазмидные и фаговые векторы
Обычно выбор вектора определяется штаммом хозяина, который используется для экспрессии клонированной ДНК. Если в роли хозяина выступает £. coli, плазмидный вектор скорее все*
го представляет собой производное pBR322, а если хозяином является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cerevisiae кон- струируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосомы дрожжей, способных реплицироваться подобно плазмидам. Нередко используются челночные векторы, которые могут реплицироваться в одном или нескольких организмах- хозяевах. Применение таких векторов оказывается весьмаго представляет собой производное pBR322, а если хозяином является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cerevisiae кон- струируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосомы дрожжей, способных реплицироваться подобно плазмидам. Нередко используются челночные векторы, которые могут реплицироваться в одном или нескольких организмах- хозяевах. Применение таких векторов оказывается весьма•. .AGCT •..• ♦•TCGA.•..•. .AGCT •..• ♦•TCGA.•... • .GGATCC..... ».CCTAGG. •... • .GGATCC..... ».CCTAGG. •..Рис. 7.6. Нуклеотидные последовательности, узнаваемые и расщепляемые эндонуклеазами рестрикции А1и\ (вверху) и BamHI (внизу).Рис. 7.6. Нуклеотидные последовательности, узнаваемые и расщепляемые эндонуклеазами рестрикции А1и\ (вверху) и BamHI (внизу).
го представляет собой производное pBR322, а если хозяином является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cerevisiae кон- струируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосомы дрожжей, способных реплицироваться подобно плазмидам. Нередко используются челночные векторы, которые могут реплицироваться в одном или нескольких организмах- хозяевах. Применение таких векторов оказывается весьма
го представляет собой производное pBR322, а если хозяином является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cerevisiae кон- струируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосомы дрожжей, способных реплицироваться подобно плазмидам. Нередко используются челночные векторы, которые могут реплицироваться в одном или нескольких организмах- хозяевах. Применение таких векторов оказывается весьма
•. .AGCT •..
• ♦•TCGA.•..
•. .AGCT •..
• ♦•TCGA.•..
. • .GGATCC....
. ».CCTAGG. •..
. • .GGATCC....
. ».CCTAGG. •..
Рис. 7.6. Нуклеотидные последовательности, узнаваемые и расщепляемые эндонуклеазами рестрикции А1и\ (вверху) и BamHI (внизу).
Рис. 7.6. Нуклеотидные последовательности, узнаваемые и расщепляемые эндонуклеазами рестрикции А1и\ (вверху) и BamHI (внизу).
перспективным в связи с тем, что нередко для наработки большого количества плазмид и для трансформации ДНК удобнее в роли хозяина использовать Е. coli. Строение плазмиды pBR322 показано на рис. 7.3. Она несет гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину. На- карте указаны места расщепления этой молекулы эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами).
Используемые при клонировании рестриктазы выделяют их различных прокариот. Всего было получено более ста пятидесяти их разновидностей. Они отличаются друг от друга тем, что узнают и расщепляют разные нуклеотидные последовательности. Сайты узнавания для большинства ферментов, используемых в генетической инженерии, представляют собой палиндромы из 4, 5 или 6 нуклеотидов. Расщепление происходит с образованием либо «тупых» (как в случае Alul), либо липких (способных к комплементарному связыванию) концов (как в случае- ВатШ\ см. рис. 7.6). Неспаренные нуклеотиды липкого конца оканчиваются З^гидроксильной или б^монофосфатной группировкой в зависимости от фермента.
Обычный метод клонирования ДНК основан на расщеплении плазмидной и встраиваемой ДНК одной и той же рестрик- тазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, которые затем отжигают, получают кольцевую рекомбинантную1 молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т4. В случае плазмиды pBR322 встраивание обычно осуществляют по генам устойчивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные молекулы легко распознать по их неспособности обеспечить устойг
чивость.
ДНК-лигазу фага Т4 можно применять и для сшивания《ту- шых» концов молекул ДНК, хотя этот процесс осуществляется •труднее, чем в случае липких концов. Липкие концы можно .превратить в тупые путем отщепления одноцепочёчных выступающих участков специфичными только к- таким участкам нук- .леазами. Альтернативный способ основан на использовании .ДНК-полимеразы： она присоединяет к короткой Цепи недостающие нуклеотиды, комплементарные б^оДй'оцепо^ечной выступающей части молекулы. Лигаза применяется также для встраивания в плазмиды синтезированных фрагментов ДНК с целью получения на стыке ДНК-вставки и вектора нужной последовательности. Комплементарные одно1хе'почечные концы у вектора и встраиваемой ДНК могут быть образованы при по- :моЩн концевой ДНК—"нуклеотидйЛтрансферазы:曲@ присоединяет нуклеотиды к З^концам молекул ДНК.'С ?её помощью к З'-концам вектора ；могут быть добавлены «хвосты» из нескольких остатков дезоксигуаниловой кислоты [oligo(dG)], а к концам встраиваемой молекулы ——комплементарная последовательность oligo(dC). Смысл этой процедуры состоит в том, что ^повторное лигирование вектора становится невозможным.
, Трансформация
Полученные in vitro рекомбинантные ^плазмиды необходимо перенести в подходящую клетку-хозяина, Природа которой и определяет особенности способа трансформации. Так, клетки .£. coli становятся компетентными (т. е. способными захватывать очищенную ДНК) после обработки их на холоду СаСЬ, а клетки Bacillus siibtilis, приобретают компетентность на определенной фазе клеточного цикла при их разовом культивирова- гнии в условиях дефицита питательных веществ. Многие другие бактерии, включая виды Streptomyces, можно трансформировать только в форме протопластов, когда удалены клеточные ■стенки. Для облегчения проникновения ДНК в дрожжевые клетки после обработки их СаС12 или ПЭГ из этих клеток также часто получают протопласту.,Интактные,, дрожжевые клетки становятся компетентными после обработки ионами щелочных металлов, например Li+., .'
Экспрессия клонированных генов
Дель многих опытов по клонированию состоит в наработке в большом количестве какого-либо белка эукариот. Именно для этого и встраивают ге网母 эукариот, в цлазмидь! бактерий. Чтобы достичь высокого уровня экспрессии гена, эукариотическую ДНК нужно встроить вблизи от активного промотора транск-
рипции; образующаяся мРНК при этом должна эффективно транслироваться. Промоторы, использующиеся для обеспечения активной экспрессии, обычно не принадлежат к числу изначально присутствующих в плазмидах. Как правило, это бывают промоторы фаговых или хромосомных генов, включаемые а цлазмидные векторы. Типичным примером такого рода служит промотор Pl бактериофага X. ДНК с таким промотором эффективно транскрибируется, и образуется большое количества мРНК・ Контроль за работой Pl осуществляется белком-репрессором, продуктом гена Ci этого бактериофага. Ген С]857 кодирует температурочувствительный белок-репрессор, который активен при 30℃, но не работает при 42℃. Если внести, этот ген в составе плазмиды или фага в ту же клетку, что и промотор Pl, то экспрессию клонированных генов, контролируемую Pl, можно регулировать, изменяя температуру.
У дрожжей Saccharotnyces cerevisiae векторы с высоким уровнем экспрессии конструируют на основе промоторов генов, которые кодируют важнейшие клеточные белки (например, алкогольдегидрогеназу и фосфоглицераткиназу). Так, с помощыо промотора алкогбльдегидрогеназы С1 удалось добиться прямой транскрипции в дрожжах гена инсулина человека, а в опытах с использованием промотора фосфоглицераткиназы получен высокий уровень экспрессии генов интерферонов.
С помощью бактерий были получены с высоким выходом некоторые белки — продукты генов животных и их вирусов. Так. были созданы штаммы Е, со〃，у которых 20% всего клеточного белка составляли коровый антиген вируса гепатита В, гормон роста человека или главный капсидный антиген вируса ящура. У одного из сконструированных штаммов В. subtilis- последний составлял около 1% синтезируемого этой бактерией белка. Однако добиться экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их вирусов совсем непросто, даже если эти гены сопряжены с сигналами инициации транскрипции и трансляции, которые обеспечивают в норме высокий уровень экспрессии генов прокариот. Причины такой неэффективной экспрессии не всегда ясны, но в некоторых случаях удалось установить, что протеазы бактерий быстро разрушают белки животных и вирусов. В подобных ситуациях можно повысить выход, применяя несодержащие протеаз мутанты. При выработке проинсулина, предшественника инсулина, некоторая защита от протеаз обеспечивается тем, что полипептид, секрётируетсй в периплазматичёское пространство у клеточной стенки Е. coli. На N-конце молекулы препроинсулина находится последовательность гидрофобных аминокислот, с по мощью которой (с одновременным ее опцеплением) осуществляется транспорт этой' молекулы через мембрану в- периплаз-
^атическое пространство. Время полужизни проинсулина в клетке 2 мин, а в периплазматическом пространстве 20 мин.
Другой способ получения чувствительных к протеазам белков основан на выделении их бактериями Bacillus в окружающую среду. Эти бациллы в отличие от Е. coli способны экскретировать некоторые белки. Так, получены штаммы Bacillus, осуществляющие экскрецию проинсулина. Выделенный в среду белок обычно проще очищать, чем внутриклеточный. Помимо этого, использование штаммов Bacillus имеет то преимущество, что они не образуют эндотоксинов. Выяснилось, однако, что клетки Bacillus эффективно экскретируют, видимо, лишь некоторые типы полипептидов. В опытах с дрожжами проблема секреции была решена путем создания векторов, содержащих сигнальные последовательности генов a-фактора гормона спаривания или токсина-«убийцы».
Прикладные аспекты генетической инженерии
Не вызывает сомнения, что методы генетической инженерии будут играть ведущую роль в развитии биотехнологии и найдут в ней самое широкое применение. Уже сегодня с помощью бактерий и дрожжей мы получаем в больших количествах белки эукариот и вирусов, которые применяются в медицине и ветеринарии. В табл. 7.1 перечислены некоторые белки, для синте-
Таблица 7.1. Белки эукариот и вирусов, получаемые методом клонирования генов в микроорганизмах
Инсулин человека
а-, 0・ и『интерфероны
Коровый антиген вируса гепатита В Поверхностный антиген вируса гепатита В Гормон роста человека
Капсидный белок вируса ящура
Реннин теленка
за которых используется этот подход. Образование больших количеств ненужного бактериальной клетке белка ставит ее в неблагоприятное положение при отборе, так что приходится решать сложные проблемы стабилизации таких штаммов. Их удается решить ——по крайней мере в случае выработки очень денных продуктов ——путем создания жестких условий отбора, направленных на сохранение плазмидного вектора, а иногда и клонируемого в нем гена. Использование индуцибельных промоторов типа 入Pl препятствует постоянному синтезу продукта, .и он образуется лишь в результате индукции в определенное ■время клеточного цикла.
Проблема стабилизации не возникает, если вместе с клонируемым геном клетка-хозяин получает определенные преимущества при отборе. Так, методы генетической инженерий позволяют расширить спектр используемых микроорганизмом субстратов. Пивоварение, например, заинтересовано в создании штаммов дрожжей, способных к секреции ферментов, разрушающих крахмал и белки. Появление у организма ряда новых ферментативных активностей может увеличить эффективность его обмена веществ. Так, фирме ICI удалось повысить эффективность усвоения азота клетками Methylophilus methylotrop- 力〃 s, продуцента Б ОО, введя в них ген фермента глутаматдегидрогеназы Е. coll (рис. 7.7). Это позволило увеличить выход БОО примерно на 7% при росте бактерий на метаноле и аммиаке. Сегодня мы можем уже конструировать искусственные линейные хромосомы дрожжей Saccharomyces cerevisiae^ что в принципе позволяет осуществлять стабильную модификацию клеток путем формирования в них новых путей метаболизма.
Введение чужеродного гена в клетки организма-продуцента —это отнюдь не единственный генно-инженерный способ конструирования новых штаммов. Иногда оказывается полезным клонирование собственных генов организма. Так, если известно, что определенная ферментативная реакция лимитирует скорость какого-то метаболитического процесса, то введение многих копий соответствующего гена в рекомбинантные плазмиды может ликвидировать это 《узкое место》благодаря образованию большего числа молекул фермента. Главной областью применения «самоклонирования», видимо, может стать направленный мутагенез. При обычном методе получения новых штаммов с помощью мутагенеза и отбора действию мутагена подвергается весь геном организма-продуцента. При этом, естественно, не гарантируется, что полезные мутации произойдут именно в интересующих нас генах. Мутируют также и другие гены, и некоторые из таких мутаций неблагоприятно повлияют на жизнеспособность организма-продуцента. Если же провести клонирование нужных генов, то их обработку мутагеном можно провести in vitro, а затем вернуть эти гены в организм. Это гарантирует получение только желаемых мутаций.
Основой развития фармацевтической промышленности до недавнего времени был скрининг микроорганизмов и синтетических химических веществ. Появление новейших методов химического синтеза генов, возможно, позволит пойти другим путем: конструирования случайных нуклеотидных последовательностей, их клонирования и оценки биологической активности соответствующих белков и пептидов. Хотя занятие это можно уподобить написанию сонета Шекспира группой печатающих 21—1344
(a}GDH. nvTb-£ coli2-Оксоглутарат + NH； +NAD(P)H(a}GDH. nvTb-£ coli2-Оксоглутарат + NH； +NAD(P)HГлутаматАе「2「ен啤 Глутамат + NAD(P)+ГлутаматАе「2「ен啤 Глутамат + NAD(P)+(6) GOGAT -путь- Methylophi/us(6) GOGAT -путь- Methylophi/us
(a}GDH. nvTb-£ coli
2-Оксоглутарат + NH； +NAD(P)H
(a}GDH. nvTb-£ coli
2-Оксоглутарат + NH； +NAD(P)H
Глутамат
Ае「2「ен啤 Глутамат + NAD(P)+
Глутамат
Ае「2「ен啤 Глутамат + NAD(P)+
(6) GOGAT -путь- Methylophi/us
(6) GOGAT -путь- Methylophi/us
Лизогенизация донорного штамма gdh+ Е. coli транспозоном RP4.Mu
Скрещивание с реципиентным штаммом gdh~ Е. со〃 и отбор gdh*
Выделение плазмид RP4gdh
Субклонирование гена gdh в рТВ70-плазмидном векторе,способном экспрессироваться и реплицироваться в Methylophilus
Перенос рТВ70 gdh в Methylophilus с помощью конъюгации при участииНР4
Выключение GOGAT -пути у Methylophilus с помощью мутагенеза；при этом весь аммиак ассимилируется при участии ферментаглутаматдегидрогеназы, кодируемого геном gdh Е. coh
Рнс. 7.7. Увеличение эффективности ассимиляции азота бактериями Methylo- philus methylotrophus, используемыми для получения БОО. А. Пути ассимиляции аммиака у бактерий. Путь (а) эффективнее, чем (б), так как в нем не потребляется АТР. Б. Клонирование гена gd九 Е. coli (гена глутаматдегидрогеназы) и его введение в Methylophilus.
на машинке обезьян, случайная крупная находка поможет убедиться, что и такой стратегией поиска не следует пренебрегать.
Итоги и перспективы
Новые разработки в области генетической теории и технологии послужили основой для создания целого арсенала методов получения новых штаммов и путей модернизации технологических процессов. Хорошо освоенные мутагенез и отбор будут использоваться и далее, но специфичность этого метода станет гораздо выше благодаря введению мутаций в клонированные гены in vitro. Усовершенствования оборудования и способов контроля за работой ферментеров существенно облегчат постоянный отбор, нацеленный на улучшение количественных характеристик организма-продуцента.
Определяющую роль в развитии генетики клеток растений и млекопитающих должно сыграть внедрение метода слияния клеток. Уже сегодня важные средства диагностики — моноклональные антитела ——получают с помощью линий клеток-гибри- дом; возможно, они внесут свой вклад и в развитие терапии. Обычным способом скрещивания у видов Streptomyces стало слияние протопластов, но при работе с грибами этот метод имеет пока второстепенное значение. Открытие межъядерного переноса генов у грибов позволит более сознательно использовать метод слияния протопластов. Есть основания считать, что генетическая инженерия привнесет важные изменения в медицину и сельское хозяйство, и в немалой степени потому, что технология рекомбинантных ДНК позволит нам глубже понять главные молекулярно-биологические особенности клеток растений и животных. Этот подход уже позволяет получать информацию о процессах, лежащих в основе таких сложных для .лечения болезней, как малярия и болезнь Чагаса.
С помощью методов генетической инженерии можно будет получать продукты, которые не могли ранее применяться из- за того, что выделять их из тканей животных было сложно и дорого. К числу их относятся интерфероны. В клиниках сейчас очень широко изучается эффективность синтезируемых бактериями интерферонов при лечении вирусных заболеваний и разных форм рака. С внедрением биотехнологических подходов существенно снизится стоимость уже используемых медицинских средств, а инсулин человека, образуемм访 бактериями или дрожжами, со временем, вероятно, заменит инсулин свиньи (гл. 8).
Генетические свойства многих промышленных микроорганизмов изучены еще очень слабо. Нередко тому есть объективные причины, например отсутствие у них пола. Новые методы генетики позволят быстрее и на более рациональной основе улучшать такие штаммы.
ЛИТЕРАТУРА
Beggs J. D., 1981. Gene cloning in yeast. In: Genetic Engineering, Vol. 2 (ed= Williamson R.), pp. 175—203, Academic Press, London.
Bolivar E, Rodriguez R L, Greene P.几 Betlach M C, Heynecker H. L., Boyer H.历.(1977). Construction of new cloning vehicles II. A multipurpose cloning system, Gene, 2, 95—113.
Broda Л, 1979. Plasmids, W. H. Freeman and Co., Oxford.
Broome S., Gilbert W. (1978). Immunological screening method to detect specific translation products, Proc. natn. Acad. Sci. USA, 75, 2746—2749.
Brown S.取.，Oliver S. G. (1982). Isolation of ethanol-tolerant mutants of yeast by continuous selection, Eur. J. appl. Microbiol. Biotechnol., 16, 119—122.
Caten C. £., 1981. Parasexual processes in fungi. In: The Fungal Nucleus (eds” Gull K., Oliver S. G.), pp. 191—214, Cambridge University Press, Cambridge.
Ferenczy L., 1981. Microbial protoplast fusion. In: Genetics as. a Tool in Microbiology (21st Symposium of the Society for General Microbiology; (eds. Glover S. W. and Hopwood D. A.), pp. 187—218, Cambridge University Press, Cambridge.
Fincham J. R S., Day P. R., Radford 4, 1979. Fungal Genetics, 4th edn.. Black- well Scientific Publications, Oxford.
Grunstein M., Hogness D. S. (1975). Colony hybridisation: A method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene, Proc. natn. Acad. Sci. USA, 72, 3961—3965.
Hardy K. G・，1981. Bacterial Plasmids, Van Nostrand Reinhold, London.
Holloway A W. (1979). Plasmids that mobilise the bacterial chromosome, Plasmid, 2, 1—19.
Hopwood D Д., 1981. Genetic studies of antibiotics and other secondary metabolites. In: Genetics as a Tool In Microbiology (21st Symposium of the Society for General Microbiology; eds. Glover S. W. and Hopwood D. A.), pp. 187— 218, Cambridge University Press, Cambridge.
Klechner M (1981). Transposable elements in prokaryotes, Ann. Rev. Genet., 15, 341—404.
Kohler E, Milstein C. (1975). Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256, 495—497.
Kubitschek H. E, 1970. Introduction to Research with Continuous Culture, Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New Jersey..
Maxam A., Gilbert W. (1980). Sequencing end-labelled DNA with base-specific chemical cleavages, Meth. Enzym., 65, 499—560.
Milstein C. (1980). Monoclonal antibodies, Scient. Am., 243, no. 4, 56—64.
Old R 取.，Primrose S. M., 1985. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, Blackwell Scientific Publications, Oxford.
Sanger E, Coulson A. R*, Barrell B. G., Smith A. J. H., Roe B. A. (1980). Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing, J. Mol. Biol., 143, 161—178.
Shortle D, DiMaio D・，Nathans D (1981). Directed mutagenesis, Ann. Rev. Genet., 15, 265—294.
Struhl K. (1983). The new yeast genetics. Nature, 305, 391—397.
Vasil 7. K” Ahuja Mt R., Vasil R. (1978). Plant tissue cultures in genetics and plant breeding, Adv. Genet., 20, 127—215.
Windass 丄 D., Worse у M. J., Piolt E. M., Pioli D., Barth P. T., Atherton К. T., Dart E. C, Byrom D, Powell K., Senior P. J. (1980). Improved conversion of methanol to single-cell protein by Methylophilus methylotrophus, Nature, 287, 396—401.
Williams A G, Blatiner F. & 1980. Bacteriophage lambda vectors for DNA cloning. In: Genetic Engineering, Principles and Methods, Vol. 2 (eds. Set- low J. K. and Hollaender A.), Plenum Press, New York.
Медицина и биотехнология
Дж. Пикап
Введение
Особенно ярко новейшие успехи биотехнологии проявляются в практической медицине главным образом потому, что их распространение из лабораторий в промышленность, а затем и в клинику происходит в последние годы удивительно быстро. Так, первые публикации об экспрессии гена инсулина человека в Е. coli появились в 1979 г. Полученный на основе рекомбинантных ДНК инсулин человека был испытан на добровольцах, не страдающих диабетом, в 1980 г., а уже в 1981 г. велись развернутые клинические испытания.
Крупные открытия в науке обычно делаются при разработке фундаментальных проблем. Мы разделяем мнение большинства врачей о том, что последние достижения биотехнологии, нашедшие применение в самых важных отраслях медицины, оказывают и будут оказывать революционизирующее воздействие на диагностику, лечение и понимание основ патологии многих тяжелых заболеваний. Ориентируясь на читателей, не имеющих медицинской подготовки, мы расскажем о том, какую важную роль играют в клинической практике некоторые новые подходы, а также широко используемые методы диагностики. Мы по необходимости ограничимся лишь немногими примерами, но читатель может без труда дополнить их множеством других: использованием в терапии белков, которые можно синтезировать при помощи видоизмененных методами генетической инженерии микроорганизмов, применением моноклональных антител, ферментов и т. д. Мы не обсуждаем использующиеся при этом технологические процессы сколько-нибудь подробно (о них речь идет в других главах); исключение составляет лишь раздел о синтезе инсулина человека: дело в том, что инсулин был первым белком, полученным с помощью технологии рекомбинантных ДНК и испытанным на людях, а также первым (или одним из первых) препаратом такого рода, нашедшим применение в клинике.
Немодифицированные и мутантные клетки и синтезируемые ими соединения (см. также гл. 7)
Антибиотики
Можно считать, что клиническая биотехнология зародилась с началом промышленного производства пенициллина в 40-х гг. и его использования в терапии. По-видимому, применение этого первого природного пенициллина повлияло на снижение заболеваемости и смертности больше, чем какого-либо другого препарата, но, с другой стороны, поставило ряд новых проблем, которые удалось решить опять-таки с помощью биотехнологии. Во-первых, успешное применение пенициллина вызвало большую потребность в этом лекарственном препарате, и для ее удовлетворения нужно было резко повысить выход пенициллина при его производстве. Во-вторых, первый пенициллин —G (бензилпенициллин)——действовал главным образом на грампо- ложительные бактерии (например, Streptococci и Staphylococci}, а нужно было получить антибиотики с более широким спектром действия и/или активностью, поражающие и грамот- рицательные бактерии типа Е. coli и Pseudomonas. В-третьих, поскольку антибиотики вызывали аллергические реакции (чаще всего незначительные, вроде сыпи на коже, но иногда и тяжелые, угрожающие жизни проявления анафилаксии), необходимо было иметь целый набор антибактериальных средств, с тем чтобы можно было выбрать из равноэффективных препаратов такой, который не вызывал бы у больного аллергию. В-четвертых, пенициллин нестабилен в кислой среде желудка и его нельзя назначать для приема внутрь. Наконец, многие бактерии приобретают устойчивость к антибиотикам. Классический пример тому — образование стафилококками фермента пенициллиназы (правильнее, р-лактамазы), который гидролизует амидную связь в р-лактамном кольце пенициллина с образованием фармакологически неактивной пенициллоиновой кислоты (рис. 8.1).
Увеличить выход пенициллина при его производстве удалось в основном благодаря последовательному использованию серии мутантов исходного штамма PenicilUum chrysogenum (полученных в результате воздействия УФ- и рентгеновского облучения, азотистого иприта и в результате спонтанного мутагенеза), а также путем изменения условий выращивания. Были выделены новые антибиотики, эффективные в случае грамотрицатель- них бактерий: стрептомицин, синтезируемый нитчатыми бактериями (Actinomycetes) рода Streptomycetes, и цефалоспорин, продуцируемый плесневым грибом Cephalosporium. Хотя цефалоспорины и относятся к р-лактамным антибиотикам, содержащим р-лактамное ядро, аналогичное таковому у пенициллинов,
Бензилпенициллин
5
NH2
Ампициллин
H2N Н
\ /
С
/ \
НООС СН2.СН2.СН2.СО — NH — СН—CHCH2
I I I co —< ^c —CH2.O.CO.CH3
COOH
Цефалоспорин C
Рнс. 8.1. Структурные формулы природного бензилпенициллина и сопоставле- ние с полусинтетическими пенициллинами (ампициллином и клоксациллином) и Другим природным 0-лактамннм антибиотиком — цефалоспорином. А. Бен- зилпеиициллии; (а)—место отщепления боковой цепи от 6-аминопеницилла- новой кислоты, (б) —место расщепления Р-лактамного кольца пенициллиназа- ми- 6 Боковая цепь ампициллина. А Боковая цепь клоксациллина. Г. Цефалоспорин С.
по своему строению они существенно отличаются от последних, что позволяет назначать их больным, у которых пенициллин вызывает аллергию (рис. 8.1).
Путем замещения боковой цепи природной р-лактамной молекулы получено множество полусинтетических антибиотиков с новыми свойствами: с другим спектром действия, чувстви-
тельностью к пенициллиназе и содержимому желудочно-кишечного тракта и т. д. Вначале бензильную группу пенициллина G удаляли химическими методами с образованием G-аминопени- циллановой кислоты, но если в культуральную среду ввести бактерии, образующие амидазы, то это превращение можно осуществить и биологическим путем. Так, ампициллин (рис. 8.1) является полусинтетическим производным бензилпенициллина, отличающимся от него всего лишь наличием добавочной аминогруппы в боковой цепи. Тем не менее он активен при пероральном введении и действует на широкий круг бактерий, в том числе на некоторые грамотрицательные, вызывающие заболеза- ния органов дыхания (Haemophilus influenzae), пищеварения {Schigella и Salmonella) и выделения (Е. coli, Proteus). Устойчив к кислоте и клоксациллин (рис. 8.1), и к тому же он не разрушается р-лактамазами. Его часто назначают вместе с ампициллином тем больным, у которых обнаружены стафилококки, синтезирующие пенициллиназу, или же при «госпитальных инфекциях», когда наличие таких ферментов весьма вероятно.
Культуры других клеток
Другими примерами использования интактных клеток с неизмененным геномом для производства лекарственных препаратов могут быть синтез интерферона культивируемыми клетками лимфобластомы (процесс Wellcome Foundation, см. разд. 8.3.2) и вирусных антигенов для выработки вакцин при выращивании клеточных культур на инертных микроносителях.
Различные варианты биоконверсии (см. ал. 4)
Микроорганизмы используются и на отдельных стадиях синтеза лекарственных веществ, который ранее осуществлялся путем многоступенчатых и дорогостоящих химических реакций. Так, один из штаммов хлебной плесени, Rhizopus arrhizus, на начальном этапе синтеза производного стероида, кортизона, может гидроксилировать прогестерон по 11-му положению. Применение подобной стратегии биоконверсии наряду с традиционными химическими превращениями позволило получать многие стероиды более простыми и дешевыми способами на основе стеролсодержащего растительного сырья. Именно благодаря этому такие стероиды, как преднизон, дексаметазон, тестостерон и эстрадиол, могут сегодня широко применяться в клинике. Некоторое представление об исключительной важности этих веществ в терапии можно получить, ознакомившись с табл. 8.1, где перечислены основные области применения стероидов.
Таблица 8.1. Примеры использования в клинике стероидных препаратов
Стероид
Заболевание
Глюкокортикоиды кортизон гидрокортизон преднизон преднизолон дексаметазон
Заболевания крови: гемолитическая анемия, острый лейкоз, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, угнетение костного мозга
Замещение: аддисонова болезнь
Аллергии: астма, экзема (очаговая), анафилаксия Иммуносупрессия: последствия пересадки органов Аутоиммунные заболевания: системная красная волчанка, узелковый полиартериит, ревматоидный артрит, височный артериит
Прочие: язвенный колит, саркоидоз, нефротиче-
Половые стероидные гормоны
тестостерон эстрадиол прогестерон
ский синдром
Замещение: гипогонадизм
Гинекологические заболеваниям симптомы мено* паузы, дисменорея, эндометриоз, избыточное кровотечение при менструации (менорагня), оральные контрацептивы
Прочие: рак молочной железы, остеопороз
Модифицированные клетки и образуемые ими вещества
Моноклональные антитела
Еще до разработки технологии гибридом, позволившей получать гомогенные антитела, большое влияние на развитие клинической медицины оказали «обычные» антитела. Отметим, что наработка подходящих антител всегда осложнялась непредсказуемостью иммунного ответа, и их титр, как и перекрестные реакции, варьировали от животного к животному и от одной партии сыворотки к другой. Это определялось тем, что данный антиген вызывает образование целого набора антител. В основу метода получения практически неограниченного количества гомогенных антител, которые находят самое широкое применение, легла фундаментальная работа Кёлера и Мильштейна, выполненная в начале 70-х г. Рассмотрим несколько примеров.
Иммунологический анализ
Разработка Ялоу и Берсоном метода радиоиммунологического анализа (РИА) оказала глубочайшее влияние на многие области клинической медицины и науку вообще. Он позволяет определять очень небольшие количества вещества путем внтес-
нения меченного радиоактивным изотопом антигена из комплекса со специфическим антителом при добавлений все возрастающего количества немеченого испытуемого или стандартного антигена. Особенно ярко достоинства метода проявились в эндокринологии, так как «рабочая» концентрация гормонов обычно очень невелика, а определение их при помощи биологических методов анализа—долгая, утомительная, иногда попросту неосуществимая процедура. Анализируемые вещества бывают нестабильны даже вне условий анализа, а при анализе их нередко приходится концентрировать; кроме того, они содержат примеси, которые могут обладать биологической активностью, сходной с таковой у изучаемого гормона. Так, ин- сулиноподобаые факторы роста, соматомедины, можно определять биологическими методами, но они не инактивируются ан・ тис ыво ротка лги против инсулина. Приведем лишь один пример гормона, определение которого с помощью радиоиммунологиче- ского анализа открыло принципиально новые возможности： это пролактин. Применяя быстрый и относительно простой способ его определения при помощи РИА в плазме большого числа пациентов и здоровых добровольцев, удалось установить, что повышенное содержание пролактина в плазме ассоциировано с наличием наиболее распространенного типа опухолей переднего отдела гипофиза (пролактиномы), а нередко и с индуцируемыми пролактином галактореей и аменореей (отсутствием менструаций), а также иными нарушениями менструального цикла. Сегодня определение содержания пролактина стало важной частью исследований бесплодия и аменореи. Приблизительно у 20% женщин с аменореей обнаруживается повышенное содержание пролактина в плазме, причиной которого мо- жеть быть опухоль гипофиза, прием лекарств, вызывающих повышение уровня пролактина, и т. д.
Моноклональные антитела уже используются в коммерчес- ских наборах для проведения радиоиммунологического анализа, и их доступность позволила предложить альтернативные методы анализа, когда используется избыток меченых антител (иммунорадиометрический анализ). Эти методы иногда обладают большей чувствительностью.
Иммуногистохимия
Меченые антитела могут использоваться для изучения распределения антигенов в срезах тканей с помощью как светового, так и электронного микроскопа. При работе по общепринятому «сэндвич-методу» на срез наносят немеченые специфические антитела, отмывают их избыток, а затем добавляют антитело против иммуноглобулина (обычно несущее флуоресцентную
метку или связанное с ферментом). Таким образом осуществляется непрямое мечение изучаемого антигена. В биологических исследованиях и в медицине применение этого метода оказалось исключительно плодотворным. Одним из примеров использования обычных поликлональных антисывороток может быть топографическое картирование различных типов клеток в тканях, например островков Лангерганса. Иммуногистохимические опыты с применением различных антисывороток показали, что содержащие инсулин В-клетки располагаются в центральной части островков, а секретирующие глюкагон А-клетки —на их периферии. На стыке двух слоев располагаются D-клетки, образующие соматостатин. Возможно, такое взаиморасположение клеток имеет функциональное значение.
Примером современного метода использования моноклональных антител для гистопатологической диагностики заболеваний человека может быть анализ биоптатов (образцов ткани) лимфатических узлов как способ определения типа опухолей лимфатической системы (например, болезни Ходжкина, различных лимфом и др.).
Методы иммуногистохимии находят также применение в диагностике для определения природы клеток, давших начало опухоли, по типу содержащегося в них антигена.
Типирование подлежащих пересадке тканей
Гуморальные и клеточные реакции, ответственные за отторжение тканей и органов при межвидовой их пересадке или же при пересадке пациенту, не состоящему в родстве с донором, направлены в основном против так называемых антигенов гистосовместимости, расположенных на поверхности клеток. Впервые эти белки были открыты при изучении антигенов лейкоцитов человека (HLA). Кодирующие их гены расположены на 6-й хромосоме. Эти поверхностные маркеры играют ключевую роль в узнавании организмом «своих» и «чужих» клеток. Предварительный подбор HLA-гаплотипов донора и реципиента существенно улучшил результаты операций по пересадке органов. Четыре из пяти главных локусов (А, В, С и Dr) комплекса генов HLA (рис. 8.2) кодируют серологически определенные
x444 гены )г?
Рис. 8.2. Основные локусы HLA (А, В, С, D и Dr) на 6-й хромосоме. Гипотетический ген иммунного ответа Dr, видимо, близок к локусу D, Связь между HLA и подверженностью определенным заболеваниям может опосредоваться именно этим локусом.
антигены, т. е. типируемые при помощи антител. В отличие от них локус D отвечает за пролиферативный ответ культуры при смешивании лимфоцитов, хотя он может быть таким же, как в случае локуса Dr. Гены каждого локуса исключительно полиморфны: одному антигену соответствует до тридцати аллелей. Типирование HLA-комплекса у пациентов можно существенно улучшить путем применения моноклональных антител против различных антигенов комплекса HLA, так как это повышает надежность и воспроизводимость результатов.
Антигены HLA связаны также с некоторыми заболеваниями. Изучение частоты встречаемости их у населения позволило выявить, что некоторые болезни возникают чаще в группах с определенными специфическими гаплотипами HLA. Так, степень риска возникновения целиакии составляет около 73 для гаплотипа D3, а ревматоидного артрита — 4 для D4, т. е. эти заболевания встречаются соответственно в 73 или 4 раза чаще у лиц, обладающих этими антигенами, чем у тех, кто этих антигенов не имеет. Таким образом, HLA-типирование позволяет оценить вероятность возникновения определенного заболевания в конкретной популяции и способствует осуществлению мер по идентификации и предотвращению болезней (там, где такие меры предпринимаются).
Диагностика злокачественных новообразований〃 наблюдение за ними
Известны несколько специфических опухолевых маркеров, которые с успехом используются в диагностике, прогнозировании и выявлении распространения опухолей (т. е. метастазов). Некоторые из них обнаруживаются в крови (обычно с помощью метода радиоиммунологического анализа), а другие находят в препаратах опухолей. Так, а-фетопротеин является главным белком сыворотки плода; его содержание уменьшается в течение первого года жизни. Определяя содержание а-фетопро- теина в плазме при помощи метода РИА, удалось установить, что оно повышается у многих больных с гепатомой (рак печени) и при раке семенников (тератоме). У многих больных, страдающих раком прямой кишки, в плазме отмечается повышенное содержание карциноэмбрионального антигена. Дальнейшее его увеличение может служить указанием на неэффективность химио- или лучевой терапии.
Помимо того что моноклональные антитела применяются как специфические реагенты в стандартных тестах, они могут использоваться и для идентификации новых, более специфических маркеров опухоле访.Так, Ритсу и его сотр. (Ritz et al., 1980) удалось получить моноклональные антитела к антигену клеток при остром лимфолейкозе человека. Были также вы де-
лены гомопеггные антитела к клеткам злокачественной мелано- мьг человека (одна из разновидностей рака кожи), которые не ,давали перекрестной реакции с нормальными клетками кожи. Введение радиоактивных и флуоресцентных меток в опухоле- специфичные антитела, вероятно, облегчит выявление метастазов и оценку первичных реакций опухолей в ходе лечения как in vivo, так и при анализе препаратов, полученных при биопсии. Развитию новых способов лечения (см. далее) может способствовать направленное введение лекарственных препаратов, присоединенных к антителам против данных опухолей.
Направленное введение лекарственных препаратов
Моноклональные антитела могут найти применение для вве- дения лекарственных веществ и токсинов в определенную часть тела (например, опухоль) либо путем их непосредственного присоединения к таким веществам, либо путем связывания с поверхностью липосом, содержащих внутри такие вещества.
Были получены комплексы антител к поверхностным антн- тенам раковых клеток со многими неспецифичными противораковыми средствами, но далеко не всегда они оказывались эффективными. Вероятно, наиболее многообещающим является использование сильнодействующих растительных и бактериальных токсинов, одна молекула которых, как принято считать, ^ожет вызвать гибель клетки. Молекулы токсина дифтерии и рицина образованы двумя полипептидными цепями, связанными дисульфидными мостиками. Цепь В связывается с клеточкой поверхностью, а цепь А, обладающая ферментативной активностью, проникает внутрь клетки и нарушает работу механизма биосинтеза белка. Были предприняты попытки заменить В-цепь токсинов специфическими антителами, преимущественно гомогенными. Недавно был получен препарат моноклональных антител к антигену раковых клеток прямой кишки, ■ассоциированных с A-цепью токсина, который избирательно действует на эти клетки в культуре.
Получен ассоциат липосом, содержащих метатрексат (ингибитор дигидрофолатредуктазы, противораковое средство), и моноклональных антител к антигенам гистосовместимости мышей* Было показано, что он оказывает специфическое влияние на клетки селезенки. Надо сказать, что исследования по направленному введению лекарственных веществ, содержащихся в липосомах, только начинаются.
Передозировка лекарств
Антитела против лекарственных препаратов, например дигокси- ага, могут оказаться полезными для снятия последствий его
передозировки, хотя сегодня и не ясно, нужно ли применять их экстракорпорально, связанными с твердым носителем, через； который циркулирует кровь, или же вводить в кровоток.
Получение важных для медицины веществ
Примером использования моноклональных антител для очистки и крупномасштабного производства важных для медицины веществ может быть работа Секера и Берке (Secher, Burke,. 1980). Им удалось ковалентно пришить мышиное моноклональное антитело против лейкоцитарного интерферона человека к. твердому носителю — сефарозе. С помощью полученного таким образом специфического иммуноадсорбента удалось за один цикл очистить в 5000 раз лимфобластоидный интерферон. Важное преимущество этого способа заключается в том, что для производстэа антител требуется очень немного частично очищенного антигена, поскольку разработаны методы отбора hi клонирования искомого гибрида.
8.32 Технология рекомбинантных ДНК (см, также гл. 7)
Общеизвестно, что разработка методов изменения генетического аппарата клеток, позволяющих вводить в них чужеродные гены, клонировать их, экспрессировать и получать нужные продукты, совершила настоящую революцию в биологии. Эти достижения находят самое широкое применение и в медицине. Белки и пептиды, доступные совсем недавно лишь в очень небольшом количестве, сегодня предполагается производить в ； массовом масштабе и использовать для лечения многих больных. Вот несколько тому примеров.
Инсулин
Сегодня 1—2% населения Англии, Европы и США страдают диабетом, и приблизительно 20% этих больных не могут существовать без инъекций инсулина. Со времени проведения первых опытов по использованию инсулина для лечения диабета в 1922 г. этот гормон выделяли из поджелудочной железы животных (коров или свиней). Существует несколько причин, по которым целесообразна разработка методов крупномасштабного производства и выпуск на рынок инсулина человека: среди них и коммерческие соображения, и эмоциональные факторы, и потребности развития науки, и возможные преимущества при лечении.
Инсулин как коров, так и свиней немного отличается па- аминокислотной последовательности от инсулина человека. Осо-
бенно близки инсулины человека и свиньи: у последнего лишь С-концевой треонин В-цепи заменен на аланин. Инсулины коровы и человека различаются по трем аминокислотным остаткам, и именно этими различиями определяется повышенная иммуногенная активность инсулина коровы по сравнению с инсулином свиньи. Почти у всех больных, которых лечат обычным методом, т. е. вводят им инсулин коровы, в крови появляются антитела к инсулину. Антигенные свойства инсулина частично определяются и примесями в его препаратах. Скорее всего именно образованием антител к инсулину объясняются некоторые незначительные побочные эффекты при инъекциях инсулина коровы, например атрофия подкожной жировой прослойки в месте повторного введения. В случае высокоочищенного инсулина свиньи эти эффекты отсутствуют. Далее, антитела к инсулину инактивируют его в кровотоке, так что больному приходится вводить большие дозы, чем это необходимо. Антитела, вероятно, влияют и на продолжительность биологического действия введенного инсулина. Надежных данных о том, что антитела способны вызвать более долгосрочные и серьезные нарушения, нет. Можно думать, что инсулин человека будет еще менее иммуногенным, чем инсулин свиньи (это естественно, поскольку он не является чужеродным белком).
Так как число больных диабетом и соответственно потребность в инсулине растут, то вполне возможно, что Доступность его в будущем уменьшится из-за нехватки исходного сырья — поджелудочной железы животных. Столь же очевидно, что из・ •за чисто эмоциональных факторов лучше использовать инсулин человека, чем каких-либо животных.
Ряд производителей инсулина во главе с фирмой Eli Lilly 2nd Со. использовали как основу для производства инсулина человека технологию рекомбинатных ДНК. Согласно схеме процесса, разработанного Eli Lilly в сотрудничестве с фирмой Genenetech Inc. (рис. 8.3), на первом этапе воссоздают последовательность ДНК по аминокислотной последовательности инсулина, раздельно синтезируя искусственные гены его А- и В-це- пей. На 5'-конце каждого из них располагается кодон метионина (который в синтезированном белке оказывается N-конце- ■вым), а на 37-конце ——терминирующие последовательности. Каждый из генов встраивают затем в ген р-галактозидазы плазмид, а их в свою очередь вводят в клетки Е. coll. Поскольку бактерии растят на среде с галактозой, а не с глюкозой, то в них индуцируется синтез р-галактозидазы, а вместе с ней — А- и В-цепей инсулина, присоединенных через остаток метионина. После лизиса бактерий и обработки бромцианом, который специфически расщепляет белки по остатку метионина, цепи инсулина отделяют от р-галактозидазы (инсулин метионина не
Синтез гена А-цепиВстраивание в плазмидуСинтез гена А-цепиВстраивание в плазмидуВведение в Е. coliВведение в Е. coli00С| I6-Gal00С| I6-GalСинтез гена В-цепиВстраивание в плазмидуСинтез гена В-цепиВстраивание в плазмидуЛизис клеток Расщепление бромцианом ОчисткаЛизис клеток Расщепление бромцианом ОчисткаA-цепь инсулинаA-цепь инсулинаВ-цепь инсулина'В-цепь инсулина'ИнсулинИнсулинРис. 8.3. Получение инсулина человека на основе технологии рекомбинантных ДНК (Miller, Baxter, 1980).Рис. 8.3. Получение инсулина человека на основе технологии рекомбинантных ДНК (Miller, Baxter, 1980).
Синтез гена А-цепи
Встраивание в плазмиду
Синтез гена А-цепи
Встраивание в плазмиду
Введение в Е. coli
Введение в Е. coli
00С| I
6-Gal
00С| I
6-Gal
Синтез гена В-цепи
Встраивание в плазмиду
Синтез гена В-цепи
Встраивание в плазмиду
Лизис клеток Расщепление бромцианом Очистка
Лизис клеток Расщепление бромцианом Очистка
A-цепь инсулина
A-цепь инсулина
В-цепь инсулина'
В-цепь инсулина'
Инсулин
Инсулин
Рис. 8.3. Получение инсулина человека на основе технологии рекомбинантных ДНК (Miller, Baxter, 1980).
Рис. 8.3. Получение инсулина человека на основе технологии рекомбинантных ДНК (Miller, Baxter, 1980).
содержит). Затем проводят очистку цепей и их объединение (с низким выходом), в результате чего образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков Е. colt, эндотоксинов и пирогенных веществ, по физическим свойствам неотличим от инсулина из поджелудочной железы человека и в тест-системе (гипогликемия у животных) проявляет полную биологическую активность.
Рис. 8.4. Изменение содержания глюкозы в плазме здоровых добровольцев под действием малых и больших доз инсулина человека, полученного на основе технологии рекомбинантных ДНК, и инсулина из поджелудочной железы свиньи (Keen et aL, 1980). Вверху — биологический ответ при подкожном введении, внизу — при внутривенном введении в течение 1 ч.
Впоследствии был испытан альтернативный метод: синтезировали ген молекулы-предшественника, проинсулина, который и вводили в Е. coli. После очистки проинсулина его расщепляли трипсином и p-карбоксипептидазой и получали нативный инсулин.
Инсулин человека, полученный с помощью Е. coli, оказался первым «генно-инженерным» белком, испытанным на людях. В опытах со здоровыми добровольцами было установлено, что он безопасен, во всяком случае при краткосрочном применении (не вызывает аллергических и иных нежелательных реакций) и обладает практически одинаковой с инсулином свиньи способностью снижать уровень глюкозы в крови при введении его под кожу или внутривенно (рис. 8.4). В настоящее время такой
инсулин человека получают множество диабетиков во всем мифе. Этому предшествовали клинические испытания, в ходе которых изучались изменения метаболизма и иммунологические эффекты. Сегодня это уже обычный метод лечения.
Интерферон
Интерфероны — это группа белков, открытых в ходе изучения веществ, в ыр а б атыва ем ых клетками, зараженными вирусами. Они индуцируют как локальные, так и системные противовирусные реакции в других клетках. Кроме того, интерфероны обладают еще двумя важными свойствами: подавляют пролиферацию клеток (и, таким образом, потенциально являются противоопухолевым средством) и модулируют иммунную систему. Недавно была упорядочена классификация интерферонов. Их делят на группы, включающие по нескольку белков: а (ранее — лейкоцитарные интерфероны), р (интерфероны фибробластов) и у (иммунные интерфероны).
До недавнего времени интерфероны .были доступны лишь •в небольшом количестве. Частично очищенные препараты получали главным образом из лейкоцитов человека. Из-за высокой видоспецифичности для клинического применения необходимо было синтезировать именно интерферон человека, но его нельзя было всесторонне исследовать в опытах на животных. Проведение должным образом спланированных и широкомасштабных испытаний интерферона на больных вирусными заболеваниями и раковых больных было затруднено, но мы уже имеем какое-то представление о потенциальных возможностях этого препарата. Так, лейкоцитарный интерферон существенно уменьшает распространение пузырьков и продолжительность их формирования, а также снимает боль у больных с одной из -форм герпеса (herpes zoster, опоясывающий лишай). Гепатит В также поддается лечению интерфероном (см. ниже). Среди онкологических больных были проведены испытания на пациентах с метастазирующим раком молочной железы, и у двенадцати из сорока трех диаметр опухоли уменьшился по меньшей мере на 50%. Изучалось его действие на лимфомы (иные, чем лимфома Ходжкина), остеосаркомы и злокачественные меланомы. Однако здесь нужно проделать большую работу по подбору оптимальных доз, частоты и способа введения интерферона и выяснению эффективности комплексного лечения с применением других противоопухолевых средств. Неоднократно сообщалось о побочных эффектах (лихорадка, общее недомогание, потеря веса) при применении интерферона.
Понятно, что в изучении, клинических испытаниях и внедрении интерферона в практику будет достигнут большой про-
гресс, если удастся получать в большом количестве чистый препарат на основе технологии рекомбинатных ДНК. Уже синтезирован ген лейкоцитарного интерферона человека длиной： 514 пар нуклеотидов; его включали в плазмиду и клоннрова- ли затем в Е, coli. Удалось достичь экспрессии гена интерферона человека в клетках дрожжей, а ген фибробластного интерферона был включен в Е. coli. За его экспрессией можно было проследить по образованию продукта с противовирусной активностью. Интересен сам факт проявления биологической активности, так как этот природный интерферон гликозилирован,, а получаемый по технологии рекомбинантных ДНК ——нет. Производство интерферона на основе рекомбинантных ДНК освоили уже по меньшей мере две фармацевтические компании. Начались и клинические испытания этих препаратов.
Гормон роста
Гормон роста человека ——это белок, состоящий из 191 аминокислотного остатка и имеющий мол. массу 22 000. Он образуется и секретируется передней долей гипофиза и необходим “ля роста костей. Выяснено, что у 7—10 людей на 1 млн. этот гормон образуется в недостаточном количестве, что приводит к задержке роста (карликовости). Хотя это заболевание обычна врожденное, задержка роста становится заметной лишь в более позднем, детском возрасте, так как гормон не нужен для внутриутробного развития. Строение гормона роста видоспецифично, и в клинике можно применять лишь гормон роста человека. До недавнего времени его получали из гипофиза трупов, но по вполне понятным причинам этот способ имеет свои ограничения. Фармацевтическая компания Kabi Vitrum в сотрудничестве с Genentech Inc. предприняла попытки наладить производство гормона роста на основе технологии рекомбинантных ДНК с использованием Е. coli. Можно надеяться, что с помощью такого подхода мы вскоре не будем испытывать в нем недостатка. Очищенный препарат гормона из бактерий по биологической активности подобен гормону из гипофиза. Сейчас ведутся клинические испытания: гормон роста вводят детям,, страдающим от его недостатка.
Вакцины
Гепатит В—заболевание, при котором трудно получить подходящий антиген для иммунизации. Исход этой вирусной болезни печени трудно прогнозировать, особенно у пожилых и ослабленных больных. Заражение происходит при переливании крови и плазмы, при использовании плохо стерилизованных
шприцев, игл и других медицинских инструментов, а также при половых сношениях. К числу групп с высокой степенью риска, тде может помочь вакцинация, относятся больные с синдромом ^приобретенного иммунодефицита, раковые больные, которым необходимо переливать кровь в большом количестве, а также .лица, проводящие гемодиализ, осуществляющие трансплантации, персонал онкологических учреждений, наркоманы, умственно отсталые и обслуживающие их, проститутки и гомосексуалисты.
Вирус гепатита В не размножается в культуре тканей. Вакцины против него получали путем тепловой обработки сыворотки бессимптомных носителей. Впоследствии была предложена вакцина на основе инактивированных сферических частичек его поверхностного антигена (HBsAg), присутствовавших в сыворотке носителей. Эти вакцины эффективны и безопасны, однако для их получения необходимо большое количество смешанной сыворотки, осуществление дорогостоящих защитных мер и крупные затраты на оборудование.
Альтернативным способом получения антигена может быть наработка белков вируса гепатита В клетками прокариот, который и был разработан Эдманом и др. (Edman et al., 1981). Другой подход заключается в инокуляции пептидов синтетического поверхностного антигена. Исходя из нуклеотидной последовательности вирусного генома была реконструирована аминокислотная последовательность HBsAg, и многие исследователи попытались с помощью ЭВМ выявить в ней антигенные последовательности. Так, Дрисману и др. (Dreesman et al., 1982) удалось синтезировать два циклических пептида, которые при одноразовом введении вызывали образование антител у мышей.
Ферменты
Ферменты составляют основу многих тестов, используемых в клинической медицине. Они все чаще применяются при автоматизированном анализе и биохимическом скрининге жидкостей тела, которые ведутся в биохимических лабораториях современных клиник. Примером таких ферментов могут быть глю- козооксидаза, гексокиназа, холестеролоксидаза и эстераза, уреаза, уриказа, лактатдегидрогеназа и алкогольдегидрогеназа. Иногда ферменты применяют и в терапии (например, стрептокиназу или урокиназу; они оказывают мощное фибринолитическое действие при тяжелом тромбозе сосудов).
В будущем ферменты (скорее всего иммобилизованные) найдут, вероятно, значительно более широкое применение в составе фермент-содержащих электродов, используемых для
мониторинга in vivo и in vitro. Много подобных устройств уже сконструировано, но в клинике не применяется. Так, многими учеными был разработан электрод с глюкозооксидазой. В уст- ро访стве Апдайка и Хикса глюкозооксидаза наслоена непосредственно на поверхность обычного платинового электрода (рис. 8.5). Чем больше кислорода потребляется в реакции
Г люконовая
глюкоза о2 电。2
Платиновый катод
Рис. 8.5. Устройство ферментного электрода с глюкозооксидазой (Updike, Hicks, 1967).
Глюкоза+Кислород = Глюконовая кислота+Перекись водорода, тем меньше количество его регистрируется внутренней частью электрода. К сожалению, это устройство все еще работает недостаточно надежно, что не позволяет использовать его как имплантируемый аппарат для постоянной регистрации содержания глюкозы. Возникающие здесь проблемы связаны с наличием конкурентных отношений между глюкозой и кислородом в жидкостях тела, инактивацией фермента in vivo, сложностью калибровки и дрейфом характеристик электрода. Ведущиеся интенсивные исследования позволяют надеяться, что, усовершенствовав такие электроды с ферментами, удастся со временем создать датчик глюкозы для автономно работающего, полностью автоматического и небольшого по размеру протеза поджелудочной железы, нужного для лечения больных диабетом. В этой связи особенно интересны последние достижения в области разработки фермент-содержащих электродов. Исследователи, работающие в Крэнфилдском технологическом институте Оксфордского университета и в госпитале Гая в Лондоне, разрабатывают глюкозный электрод, в котором для переноса
электронов от простетической группы (ФАД) глюкозооксидазы на графитовый электрод используется органи^ескн访 медиатор (например, ферроцен), т. е. процесс идет без участия кислорода, который обычно выступает в роли конечного акцептора электронов. Работа этого электрода, таким образом, не связана с кислородом. Он может оказаться особенно полезным при создании имплантируемого, способного работать in vivo устройства для больных диабетом.
По-видимому, основные усилия в ближайшие несколько лет будут направлены на развитие технологии биодатчиков.. Ферменты (и другие лиганды, например антитела; см. разд.. 8.5) могут оказаться весьма полезными для контроля за концентрацией (мониторинга) разнообразных веществ, интересующих клиницистов: промежуточных метаболитов, лекарственных: препаратов и гормонов. Свою роль сыграет здесь биотехнология: она предоставит и обычные, и редкие ферменты микробов,, полученные как путем крупномасштабного их выращивания,, так и, возможно, с помощью технологии рекомбинантных ДНК.
В качестве примера возможного применения ферментов в терапии укажем на предложение вводить инкапсулированные- в липосомах ферменты для лечения некоторых болезней, связанных с накоплением лизосом. Такой способ был испытан на нескольких больных болезнью Гоше, с врожденной недостаточностью по глюкоцереброзид : р-глюкозидазе. Полученные результаты не позволяют сделать однозначных выводов.
Применение методов молекулярной генетики
и технологии рекомбинантных ДНК в медицинской диагностике и патологии
Пренатальная диагностика наследственных болезней
Многие методы молекулярно访 генетики начинают широко применяться в пренатальной диагностике наследственных болезней», например гемоглобинопатий. Так, в 1978 г. Кен и Доузи разработали метод диагностики серповидноклеточной анемии путем анализа ДНК из клеток околоплодно访 жидкости. Это несравненно более безопасный метод, чем взятие для анализа кров坏 плода, когда вероятность аборта доходит до 7%. Серповидноклеточная анемия — это одно из наиболее часто встречающихся нарушений синтеза гемоглобина. Она развивается в результате замены глутаминовой кислоты в 6-м положении P-цепи гемоглобина на валин. При дезоксигенации эритроциты, содержащие- аномальный HbS (две обычные а- и две аномальные р-цепи), приобретают форму полумесяца (серповидную). Такие негибкие
серповидные клетки затрудняют кровообращение в капиллярах л быстро разрушаются. Клиническими проявлениями болезни являются анемия, прекращение роста, приступы острой боли (кризы), а также острые или хронические заболевания органов вследствие закупорки сосудов (например, инсульт).
В работе Кена и Доузи (рис. 8.6) ДНК выделяли из лейко-
Рйс. 8.6. Схема, иллюстрирующая использование генных зондов и анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов в пренатальной диагностике темоглобииопатий, например серпов иди ок леточн ой анемии (Emery, 1981).
цитов крови двух родителей, их ребенка, страдающего серповидноклеточной анемией, и здорового добровольца (контроль), ДНК была выделена также из клеток околоплодной жидкости, отобранной в ходе третьей беременности матери. Вошедший недавно в практику метод картирования с помощью эндонуклеаз рестрикции (гл. 7) позволяет сопоставлять разные ДНК; меченую Р32-кДНК, комплементарную глобиновому гену, можно по- -лучить путем выделения глобиновой мРНК из ретикулоцитов ；и использования обратной транскриптазы, с помощью которой ：из Р32-нуклеотидов синтезируется кДНК. При расщеплении со- шоставляемых ДНК эндонуклеазой (в данном случае ——Hpal)
образуются фрагменты разной длины, которые разделяют методом гель-электрофореза. Затем фрагменты переносят на нитроцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию с радиоактив* но 访 кДНК-зондом (метод саузерн-блотинг). Нуклеотидные последовательности, связавшие зонд, локализуют методом радиоавтографии. Именно они содержат гены глобина. У здорового человека ген р-глобина локализован во фрагменте длиной 7,6 kbp. У больного ребенка он был обнаружен во фрагменте длиной 13,0 kbp, а анализ распределения фрагментов расщепленной ДНК у обоих родителей и в клетках плода выявил участки длиной как 7,6, так и 13,0 kbp (т. е. они являются гетерозиготами и несут локус серповидноклеточности). Полиморфизм определяется вариациями в локализации сайта узнавания эндонуклеазой, расположенном приблизительно на расстояний 5000 нуклеотидов от З'-конна гена.
Сходный метод был применен для пренатальной диагностики: Р-талассемии. При этой гемоглобинопатии p-цепь гемоглобина синтезируется либо в недостаточном количестве, либо не синтезируется вообще. При использовании метода определения полиморфизма рестрикционных фрагментов по длине (RFLP) глубоких знаний о молекулярных основах патологических изменений при данном заболевании не требуется. Это по сути《метол, отпечатков пальцев», при помощи которого выявляются аномалии, сопутствующие клиническим симптомам, и поэтому он мо- 水ет применяться при лечении многих наследственных болезней.,
842 Роль генетических факторов в патологии
Примером генетически обусловленного заболевания может быть и диабет, но механизм наследования и молекулярная основа его остаются неясными. У пациентов группы 1, страдающих юношеским диабетом, наблюдается полная или почти полная гибель р-клеток островков Лангерганса, и инсулин у них не образуется. Такая разновидность диабета чаще всего встречается у гаплотипов Dr3 и Dr4 HLA. В группе 2 (диабет взрослых) уровень инсулина в крови больных близок к норме или повышен; аномалии у них иные, и среди них — нечувствительность рецепторов к инсулину. Они и приводят к недостатку инсулина.. У больных диабетом группы 2 взаимосвязи с определенными типами HLA не выявлено. Ротвейн и др. (Rotwein et al., 1981) использовали метод RFLP для анализа ДНК 35 здоровых людей, 17 больных диабетом из группы 1 и 35 — из группы 2.. У 26% здоровых людей в последовательности ДНК, прилегающей к 57-концу гена инсулина, были обнаружены вставки длиной 1,5—3,4 kbp. Такие же вставки присутствуют и в ДНК 35% больных группы 1 и 66% — группы 2 (рис. 8.7). Была
определена полная нуклеотидная последовательность этого полиморфного участка, прилегающего к гену инсулина, и показано, что различия определяются числом и расположением повторяющихся последовательностей. Из ряда опытов следует, что последовательность прилежащего к 57-концу гена участка может •сказываться на экспрессии гена. В этой связи существенно более высокий полиморфизм этого участка при диабете типа 2 представляет особый интерес (следует, впрочем, отметить, что некоторым исследователям не удалось подтвердить наличия такой взаимосвязи). Сегодня мы еще не можем утверждать, что эти изменения достаточны или обязательны для развития бо-
Рис. 8.7. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов б^фланкирующего участка гена инсулина человека. Указано место вставок длиной 1,5 и 3,4 kbp. Pre — участок, кодирующий аминокислотную последовательность, примыкающую к N-концу проинсулина, которая, видимо, способствует его секреции в эндоплазматический ретикулум; В, С и А — последовательности, кодирующие В-цепь, кониекторный пептид и А-цепь инсулина. Заштрихованный участок — «нтрон (гл. 7).
лезни, и трактовку результатов нельзя считать однозначной.
Еще два наследственных заболевания, точная генетическая основа которых нам не известна, но для которых недавно была установлена взаимосвязь между особым типом полиморфизма ДНК и наличием 《больного》 гена — это мышечная дистрофия Дюшена и хорея Хантингтона. Последнее заболевание неизлечимо, наследуется по аутосомному доминантному механизму и выражается в прогрессирующем слабоумии и параличе, наступающем на тридцатом ——сороковом году жизни. К сожалению, до недавнего времени мы не располагали методом выявления носителей такого гена. Поскольку здесь налицо определенная связь с маркерами ДНК, ее следует иметь в виду при генетическом консультировании, и возможно, что со временем на этой основе будут идентифицированы и сам ген хореи Хантингтона, и соответствующий продукт.
Перспективы развития
Развитие новых направлений биосенсометрии, видимо, будет зависеть от успехов микроэлектроники, основанной на применении продуктов биотехнологии, например ферментов и антител. Недавно были созданы ион-селективные транзисторы на основе- полевого эффекта (FETh): в таких устройствах на изолирующий слой транзистора помещается мембрана с избирательной проницаемостью. На поверхность транзистора можно было бы нанести ферменты и антитела так, чтобы он «чувствовал» связывание белка и/или возможные его конформационные изменения и/или реакцию с субстратом. Первым шагом здесь является разработка чувствительного к пенициллину FET'a, в котором применен фермент пенициллиназа (Caras, Janata, 1980).
Зададимся теперь вопросом, можно ли лечить болезни человека путем трансплантации нормальных и измененных генетическими методами культивируемых клеток либо тканей организма-хозяина, видоизмененных методами клеточной инженерии? Напомним, что интерес к лечению наследственных аномалий обмена веществ методом трансплантации недавно вновь возрос в результате изучения эпителиальных клеток амниона человека. Эти клетки легко получить из плаценты и культивировать. Они синтезируют и выделяют в среду ферменты, отсутствующие при некоторых заболеваниях, связанных с накоплением лизосом,, а кроме того, по-видимому, не образуют поверхностных антиге* нов и поэтому не будут отторгаться реципиентом.
Надо сказать, что лечение заболеваний, развивающихся из-за недостатка соединений, образуемых в норме определенным типом клеток (например, гормонов, синтезируемых эндокринными железами, или молекул глобинов, формируемых клетками костного мозга),——задача архисложная. Несингенные клетки человека (взятые от трупа, плода или от неидентичного донора)^ образующие нужное вещество, будут неизменно отторгнуты, если только поверхностные антигены HLA или иммунологический ответ на них не модифицировать или подавить каким-то образом. Можно также попытаться изменить геном одной из клеточных линий самого пациента (например, фибробластов) путем встраивания генов (с использованием ДНК-трансформации или рекомбинантных вирусных векторов), дерепрессии или же методом слияния клеток. Здесь сразу же возникают опасения, связанные с возможностью реимплантации людям генетически неполноценных, зараженных вирусами клеток, риском неопролиферации. Следует учитывать, что вместе с синтетическим геном клетке, видимо, должна быть передана способность и к осуществлению других необходимых функций. Например, для лечения диабета клетку нужно «научить» не только вырабатывать ин-
сулин, но и упаковывать его в секреторные гранулы, регулировать его синтез и экзоцитоз в соответствии с содержанием глюкозы в крови (т. е. нужен еще и некий датчик глюкозы). Механизм генетического контроля этого процесса, видимо, очень сложен, и сегодня мы о нем ничего не знаем.
Высказывалось мнение, что методы цитогенетической моди- 4)икации в первую очередь следовало бы применить для лечения таких потенциально летальных болезней, как серповидноклеточная анемия или талассемия. В этих случаях болезнь возникает из-за аномалн访 в одном гене или комплексе генов, а экспрессия происходит в одном типе тканей. Плюрипотентные кроветворные стволовые клетки костного мозга продолжают реплицироваться всю жизнь, и, если модифицировать их генетическими методами я реимплактировать в костный мозг, они смогут стать важным компонентом синтнзнрующе访 гемоглобин ткани. Впрочем, если ■сегодня такие исследователи, как Меркола и Клайн, уже ставят вопрос о том, не пришло ли время экспериментов по трансплантации генов человека, то многие в противовес им указывают, 14Tо, прежде чем двигаться дальше, нам нужно провести множество опытов на животных, оценить степень риска и т. д. Нет •сомнения, что в будущем, кроме того, придется решать проблему совмещения научных и медицинских возможностей биотехнологии и связанных с их использованием вопросов этики.
ЛИТЕРАТУРА
Антибиотики и биоконверсия
Aharonowitz К, Cohen G. (1981). The microbiological production of pharmaceuticals, Scient. Am., 245, 106—118.
Finter M A, Fantes K. //., 1980. The purity and safety of interferons prepared for clinical use: the case for lymphoblastoid interferon. In: Interferon 2 (ed. Gresser I.), pp. 65—80, Academic Press, London, New York.
Van Wesel A. L, van Steenis G., Hannick С. Л., Cohen H. (1978). New approach to the production of concentrated and purified inactivated polio and rabies tissue culture vaccines, Devi Biol. Standard, 41, 159—168.
Моноклональные антитела
Belchetz P. E., Braidman 7. R, Cralwy 丄 C.取.，Gregoriadis G. (1977). Treatment of Gaucher's disease with liposome-entrapped glucocerebroside: p-glucosi- dase, Lancet, ii, 116—117.
Buckman R. (1982). Tumour markers in clinical practice, Br. J. Hosp. Med., 27, ^—20.
Coons A. H., Kaplan M. H. (1950). Localisation of antigen in tissue cells. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody, J. exp. Med., 91, 1—13.
Dausset J., Svejgaard A. (1977). HLA and Disease, pp. 316, Munksgaard, Co* .penhagen.
Diamond B. 4, Yelton D E.t Scharff M. D. (1981). Monoclonal antibodies. A new technology for producing serological reagents, New Engl. J. Med., 304, 1344—
Gilliland D. G, Streplewski Z., Collier R. /., Mitchell 及凡 Chang T. Я., Koprow- ski Я. (1980). Antibody directed cytotoxic agents: use of monoclonal antibody to direct the action of toxin A chains to colorectal carcinoma cells. Proc. natn. Acad. Sci. USA, 77, 4539.
Gregoriadis G. (1981). Targeting of drugs: implications in medicine, Lancet, il, 241—246.
Kohler G., Milstein C. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, 256, 495—497.
Koprowski H., Steplewski Z., Herlyn D, Herlin M. (1978). Study of antibodies against human melanoma produced by somatic cell hybrids, Proc. natn. Acad. Sci. USA, 75, 3405—3409.
Leserman L. D., Machy R, Barbet J. (1981). Cell-specific drug transfer from liposomes bearing monoclonal antibodies, Nature, 293, 226—228.
Nairn R. C. (1976). Fluorescent Protein Tracing, 4th edn., pp. 648, Livingstone, Edinburgh.
Olsnes S. (1981). Directing toxins to cancer cells, Nature, 290, 84.
Ritz J., Pesando /. M., Notis-McConarty /., Lasarus H., Schlosstnan S. E (1980). A monoclonal antibody to human acute lymphoblastic leukaemia antigen. Nature, 283, 583—585.
Secher D. S., Burke D. C (1980). A monoclonal antibody for large-scale purification of human leukocyte interferon, Nature, 285, 446—450.
Yalow R. S., Berson S. (I960). Immunoassay of endogenous insulin in man, J. clin. Invest., 39, 1157—1175.
Уе/i M. У., Hellstr dmBrown /. P” Warner G. 4, Hansen J. 4, Hellstom К. E.
. Cell surface antigens of human melanoma identified by monoclonal antibody, Proc. natn. Acad. Sci. USA, 76, 2927—2931.
^^*ственные препараты, получаемые с помощью технологии рекомбинатных
В^＞谭 В. R. (1980). Interferons and the immune system, Nature, 284, 593— Crea R., Kraszewski 4, Hirose「，Itakura K. (1978). Chemical synthesis of genes for human insulin, Proc. natn. Acad. Sci. USA, 75, 5764—5769.
Derynck R, Remant E., Saman 邑 Stanssens P., Qe Clerq E, Content J., Fiers 取. (1980). Expression of human fibroblast interferon gene in Escherichia coli Nature, 287, 193—197.
Dreesman G. R., Sancheq У., lonescu-Matia /., Sparrow 丄 Z, Six H. R, Peterson D L, Hollinger E B” Melnick J. L. (1982). Antibody to hepatitis В surface antigen after a single inoculation of uncoupled synthetic HBsAg peptides. Nature, 295, 158—160.
Edge M. D, Greene A. R., Heathcliffe G. R., Meacock P. A., Schuch 步.，Scan- Ion D. A, Atkinson T. C, Newton C. R, Markham A.尸.(1981). Total synthesis of a human leukocyte interferon gene, Nature, 292, 756—762.
Edman J. C, Hallewell R. 4, Valenzuela P., Goodman H. M, Rutter /.丄 (1981). Synthesis of hepatitis В surface and core antigens in E. coli Nature 291, 503—506.*'
Goeddel D. V., Kleid D. G., Bolivar E, Heyneker H. L., Yansura D. G., Crea R: nirose Z, Kraszewski A., Itakua K, Riggs A. D. (1979). Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc natn Acad Sci. USA, 76, 106—110.'
Goeddel D, V. et al. (1979). Direct expression in Escherichia coli of a DNA sequence coding for human growth hormone, Nature, 281, 544—548.
Hitzeman R. A., Hagie F. E, Levine H.L” Goeddel D. V„ Ammerer G., Hall A D (1981). Expression of a human gene for interferon in yeast. Nature 293 717—722.'”
Keen Н” Glynne 4, Pickup 丄 C.t Viberti G. C., Bilous R % Jarrett R. L Marsden R. (1980). Human insulin produced by recombinant DNA technology: safety and hypoglycaemic potency in healthy men, Lancet, ii, 398—401.
Olson K., Fenno /., Lin M, Harkins R. M, Snider C” Kohr 旣 H., Ross M. J., Fodge D., Prender G„ Stebbing N. (1981). Purified human growth hormone from E. coli is biologically active, Nature, 293, 408—411.
Miller W. L, Baxter /. D (1980). Recombinant DNA —A new source of insulin, Diabetologia, 18, 431—436.
Southern E. M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments- separated by gel electrophoresis, J. Mol. Biol., 98, 503—517.
Stiehm R., Kronenberg L. H., Rosenblatt H, M., Bryson У., Merigan T. C. Interferon： immunobiology and clinical significance, Ann. Intern. Med.( 96, 80—93.
Turner A. P. F., Pickup J. C. (1985). Diabetes mellitus: biosensors for research and management, Biosensors, 1, 85—115.
Updike S.丄，Hicks G. P. (1967). The enzyme electrode, Nature, 214, 986—98& Zuckerman A, /. (1982). Developing synthetic vaccines, Nature, 295, 98—99.
Молекулярная генетика болезней человека
Anonymous (1984). Molecular genetics for the clinician, Lancet, i, 257—259.
Bell G. /., Selby M. L, Rutter W. J. (1982). The highly polymorphic region near the human insulin gene is composed of simple randomly repeating sequences. Nature, 295, 31—35.
Davies К. E., Pearson P. £., Harper P. S, Murray J. M.f O'Brien /., Sarfarazi M> Williamson R. (1983). Linkage analysis of two cloned DNA franking the Duchenne muscular dystrophy locus on the short arm of the human X chromosome, Nucleic Acids Res., 11, 2303—2312.
Emery A. E. H. (1981). Recombinant DNA technology, Lancet, ii, 1406—1409.
Gusella Z. A, Wexler № M・，Conneally P. M. et al. (1983). A polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington's disease, Nature, 306, 234—238.
Кар У.历.，Dozy A. M. (1978). Antenatal diagnosis of sickle-cell anaemia by DNA analysis of amniotic cells. Lancet, ii, 910—912.
Little P. E R” Annison &, Darling S., Williamson R., Camba L., Model B： (1980). Model for antenatal diagnosis of B-thalassaemia and other monogenic disorders by molecular analysis of linked DNA polymorphisms, Nature, 285» 144—147.
Rotwein 尸.，Chyn R., Chlrgwln J., Cordell 民，Goodman H. M. (1981). Polymorphism to the 5' flanking region of the human insulin gene and its possible relation to type 2 diabetes, Science, 213, 1117—1120.
Weatherall D. J. (1979). Mapping haemoglobin genes, Br. med. J., 2, 352—354.
Перспективы развития: биосенсоры, трансплантация и генная терапия
Adinolphi М, Ackle С. 4, McColl /., Fenson А. Н., Tansley L, Connolly Р» Hsi В. L., Faulk W. R, Traves P., Bodmer W.尸.(1982). Expression of HLA antigens, Rz-microgiobulin and enzymes by human amniotic epithelial cells,. Nature, 295, 325—327.
Caras S., Janata J. (1980). Field effect transistor sensitive to penicillin, Analyt. Chern., 52, 1935—1937.
Mercola К. E., Cline M. J. (1980). The potentials of inserting new genetic information, New Engl. J. Med., 303, 1297—1300.
Turner A. P. F., Pickup /. C. (1985). Diabetes mellitus: biosensors for research and treatment, Biosensors, 1, 85—115.
Сельское хозяйство и биотехнология
Ф. Скиннер
Введение
Зрелище возделанных полей стало для нас настолько привычно, ■что мы не замечаем искусственности такого пейзажа. Между тем очевидно, что деятельность живущих на Земле людей очень сильно сказывается на ее облике, ибо с незапамятных времен они выращивают на ней растения и содержат домашних животных. Фермеров можно считать предшественниками современных биотехнологов, так как они постоянно занимались улучшением пород животных. Впрочем, поскольку делалось это в основном эмпирически, называть фермеров биотехнологами было бы все же неправильно. Ведь биотехнология — это целенаправленное и научно обоснованное использование биологических процессов при производстве, переработке и использовании сырья. На практике многие из таких процессов идут при участии микроорганизмов.
Сегодня ферма — это центр по производству пищевого сырья за счет земельных ресурсов, но ранее ее функции были шире, так как на ней осуществлялась и его переработка. Навыки хле・ Попечения, пивоварения, сыроделия и производства сброженных продуктов были естественным дополнением к умению выращивать зерно, получать мясо и молоко. Всем этим нужно было заниматься на месте, чтобы не допустить порчи продуктов под действием микробов. Сегодня многие из этих вторичных производств, в которых ведущую роль играет жизнедеятельность соответствующих микроорганизмов, перенесены с ферм на заводы (так, во всяком случае, обстоит дело в развитых странах). Здесь они были усовершенствованы с целью повышения качества продукции и эффективности процесса.
Нередко на заводах осуществляется и более глубокая переработка пищевых продуктов, обычно путем ферментации, когда из них производится сырье для химической промышленности. Хорошо известным примером может быть выработка технического спирта из избытков низкокачественного вина; менее известно, что спирт в больших количествах получают из специаль-
но выращиваемых для этих целей культур (гл. 2). Промышленная биотехнология оказывает фермеру и прямую помощь» снабжая его вакцинами и антибиотиками, а также добавками к кормам. Таким образом, взаимосвязь между сельским хозяйством и биотехнологией весьма многообразна, и поэтому описать в одной статье все ее аспекты просто невозможно. Быть может, имеет смысл остановиться лишь на том, какое содействие может она оказать фермеру-земледельцу и садоводу в деле повышения урожайности и улучшения сортовых особенностей растений. @
Необходимость увеличения объема сельскохозяйственной' продукции и ее качества (питательной ценности, вкусовых достоинств и рыночных качеств) общеизвестна. При этом оно” должно осуществляться экономически приемлемыми способами,., а также с учетом влияния на окружающую среду.
Развитые страны могут позволить себе в больших масштабах применять химические удобрения, но многим другим странам это недоступно, и они вынуждены искать иные пути. Основным необходимым для роста элементом является азот. Он отнюдь не принадлежит к числу редких, но чтобы перевести азот в форму, доступную растениям, его надо фиксировать. К счастью,, в ходе эволюции выработался и закрепился биологический механизм фиксации азота при симбиозе — весьма эффективный^ процесс, на котором мы остановимся подробнее. Сходен с ним- и процесс несимбиотической фиксации азота, который сейчас активно изучается, но на практике применяется пока в ограниченном масштабе.
Большое внимание привлекают к себе биологические способы* снабжения растений фосфором, а также контроля за вредителями и болезнями растений. В этой области намечается переход от лабораторных экспериментов к практике. Разрабатываются способы выращивания ценных культур в контролируемых условиях—это новый и многообещающий подход. Быть может, самый большой вклад, который может внести биотехнология в- сельское хозяйство,——это улучшение сортов растений; существенный прогресс здесь будет достигнут благодаря использованию методов генетической инженерии и технологии слияния протопластов.
92 Метод питательной пленки
Основы метода
Для полноценного роста растения нуждаются в воде и кислороде, но эти жизненно важные вещества редко имеются в оптимальном количестве при выращивании растений в почве или： других твердых средах. Излишняя вода заполняет промежутка
между частицами почвы и лишает корни кислорода. С другой стороны, хорошая аэрация обычно достигается лишь при недостатке воды. При использовании метода питательной пленки эти недостатки удается преодолеть.
У растений, выращиваемых таким способом, корни развиваются в тонком слое постоянно возобновляемого питательного раствора, содержащего все необходимые вещества. Уровень раствора поддерживается на строго определенной высоте, так что нижняя часть развивающейся подушки корней постоянно находится в растворе, а верхняя выступает над ним, но оказывается покрытой тонкой пленкой жидкости. Очень важно, чтобы эта пленка постоянно существовала, так как, если бы все корни оказались погруженными в раствор, им недоставало бы кислорода.
Рнс. 9.1. Подушки корней кукурузы, выращенной по методу питательной пленки (Elmes, Mosse, 1984). В лоток (емкость) или в мешочек из муслина, расположенный ниже выходного патрубка, была помещена фосфатсодержащая порода (вид сверху). Слева — вид на подушку из корней сбоку. Корневые системы так сильно переплетаются, что растения не нуждаются в опоре.
Основной отличительной особенностью метода питательной пленки является то, что корневая система каждого растения развивается настолько интенсивно и так тесно переплетается с корнями соседей, что растения не нуждаются в опоре (рис. 9.1).
Таким образом, метод питательной пленки существенно отличается от метода водных культур (гидропоники), когда вода и питательные вещества имеются в избытке, но аэрация корне-
вой системы обычно недостаточна. Трудности закрепления растений при выращивании по этому методу остаются и в том случае, когда корни развиваются не в водной среде, а в толще инертного материала (например, песка, гравия или пемзы), смачиваемого питательным раствором за счет капиллярных сил. При таком культивировании условия выращивания очень близки к таковым для почв и обладают всеми свойственными им недостатками.
Установки, использующиеся в методе питательной пленки, их эксплуатация и применение метода подробно описаны в книге Купера (Cooper, 1979), откуда мы и взяли большинство приводимых в данной главе сведений.
Основные требования к оборудованию
Прямоугольная выровненная поверхность, на которой предполагается выращивать растения, должна иметь двухсторонний уклон. По всей длине самой низкой ее части проходит канавка- ловушка. Ее выстилают непромокаемой полимерной пленкой и закрывают крышкой, чтобы туда не попадал свет и не происходило испарение. Если питательный раствор подогревается, то и желобок, и крышка должны быть изолированы. В наиболее низкой части установки помещаются отсто访ник и насос для перекачки раствора. Жесткие емкости (ячейки), в которых будут выращиваться растения, можно помещать прямо на выровненную поверхность, начиная с верхней части установки и вплоть до канавки-ловушки, в которую из них стекают излишки раствора. Друго访 способ — покрыть всю поверхность бетоном или же сделать цементную полоску вокруг каждой емкости (ячейки) ,а затем поместить на поверхность с небольшим ровным наклоном гибкие емкости с плоским дном.
Питательный раствор подается насосом через полиэтиленовую трубку в самую верхнюю часть установки, откуда через узкие полиэтиленовые же трубочки распределяется по емкостям. Под действием силы тяжести раствор стекает по ним очень тонким слоем к канавке-ловушке и возвращается к насосу. Около насоса к трубке подачи подсоединена возвратная трубка с регулируемым клапаном, так что часть раствора перекачивается прямо в канавку и не протекает через емкости.
При этом можно, регулируя клапан, легко контролировать скорость протекания раствора через емкости; для перемешивания и аэрации подаваемый в систему раствор можно разбрызгивать в воздухе; при обслуживании установки можно опорожнять кюветы-желобки, не прерывая циркуляции раствора в емкостях: для этого следует просто переключить возвратный канал на слив. При этом в отстойнике будет достаточно раствора для
23—1344
обеспечения потребносте访 растений. На случай аварии нужно иметь запасной насос, а при отключении электричества может понадобиться аварийный генератор.
Рис. 9.2. Небольшая экспериментальная установка, применяющаяся для выращивания фасоли (Phaseolus vulgaris) по методу питательной пленки. Питательный раствор подается с помощью насоса по пластмассовой трубке к дальнему краю лотка и затем стекает из передней части лотка через широкую трубку в пластмассовую емкость (на переднем плане).
По размерам установки, использующиеся в методе питатель- ной пленки, сильно различаются: от очень больших, промышленных, для массового выращивания, например, помидоров или салата до небольших установок для научных целей. На рис. 9.2 показана опытная установка.
Фитотоксичность
Ясно, что контактирующие с питательным раствором части установки не должны выделять токсичные вещества, которые могли бы замедлить рост растений или даже вызвать их гибель. Без опаски можно использовать полиэтилен и, по-видимому, такие материалы, как полипропилен и акрилонитрилбутадиенстирол. Твердый поливинилхлорид фитотоксического действия не оказывает, но гибкий поливинилхлорид лучше не применять, так как иногда он оказывается фитотоксичным. В установках не следует использовать металлы, которые относятся к числу мик・
роэлементов, поскольку в питательном растворе они могут накапливаться до токсических концентрацн访.Так, не нужно применять трубки с гальваническим покрытием: цинк с их поверхности постепенно выщелачивается. Если о токсичности конструкционных материалов ничего не известно, то их следует предварительно выдерживать в аэрируемом питательном растворе, на котором выращиваются проростки.
Устройство емкостей, используемых 8 методе - питательной пленки ”
Ширина емкосте访 варьирует от 10 до 23 см в зависимости от вида выращиваемых растений. Устройство их может существенно различаться, но основной принцип, которого необходимо придерживаться, состоит в том, что конструкция должна быть плоской и жесткой. Если поверхность, на которую помещают ■емкости, неровная, они должны быть жесткими, если же основание твердое и плоское, можно применять более дешевые гибкие емкости. Емкость из темного полиэтилена, которую при необходимости помещают в твердый каркас, должна быть достаточно глубоко访，чтобы у нее можно было загнуть внутрь края, что уменьшает испарение и укрывает корни от света, но не препятствует росту стебля. При другой конструкции в основании при его изготовлении заранее делают углубления, но такой способ годится только для выращивания растений с раскидистыми листьями, например салата. Они закрывают емкость и предотвращают испарение. Известны многие варианты таких конструкций.
5. Опора для молодых растений
Для молодых растений, пересаженных в емкости устройства метода питательной пленки, нужна опора, так чтобы листья их находились на свету, а корни ——в питательном растворе. Обычно проростки еще до образования корне访 высаживают в кубик из адсорбента, например из торфа, или же помещают в сосуды, содержащие среду для роста корней. За счет капиллярных сил :корнн в достатке получают и воду и питательные вещества из тонкого слоя протекающего раствора.
Болезни
Конструкция установки, использующейся в методе питательной пленки, как нельзя лучше способствует быстрому распространению в не访 патогенных микроорганизмов, однако связанные с этим проблемы оказались не столь серьезными, как представ-
23*
лялось вначале. Возможно, устойчивость выращиваемых по методу питательно访 пленки растенн访 к возбудителям различных заболеваний, распространяемым вместе с питательной средой, обусловлена тем, что корни их не повреждаются механическим или иным способом, как это бывает при выращивании растений в почве, и тем самым отсутствуют «ворота инфекции».
. Перспективы
Метод питательной пленки уже применяется для выращивания растений как в открытом грунте, так и в теплицах в Англии и ряде других стран. Кроме того, он может получить широкое распространение как метод исследования, поскольку позволяет легко контролировать условия выращивания. Можно поддерживать температуру питательной среды с помощью термостата, осуществлять постоянный контроль за pH как вручную, так и автоматически, оптимизировать концентрацию питательных веществ. Для борьбы с заболеваниями и подавления нежелательной микрофлоры в систему можно добавлять фунгициды, пестициды и антибиотики. В опытных теплицах можно развертывать небольшие установки. Сделаны первые попытки создать устро访- ство для работы в стерильных условиях. В работе Купера (Cooper, 1979) обсуждаются интересные проекты использования метода питательной пленки в растениеводстве закрытого грунта, а также для получения дерна, кормов для скота и каучука. В целом направление это представляется весьма перспективным.
Бобовые культуры и фиксация азота при симбиозе
L Из истории вопроса
Семейство Leguminoseae включает около 625 родов и 18 000 видов. Это одно из самых многочисленных и наиболее важных с зкономинеско访 то^кн зрения семе访ств цветковых растений. Семена многих видов бобовых богаты белком. Они являются ценным сырьем для производства кормов и пищевых продуктов. Из растени访 умеренного климата можно назвать горох и фасоль. В тропических и субтропических зонах возделываются самые разнообразные культуры, включая сою, вигну кита访скую, чечевицу и арахис. Многие бобовые — ценные пастбищные культуры (например, различные виды клевера, Stylosanthes и др.). Они могут служить зеленым удобрением (например, люцерна), дают нам лесоматериалы, фрукты, овощи, клеящие вещества, волокна, лекарства и пряности. Роль бобовых определяется еще и тем, что они способны фиксировать азот атмосферы в корневых клубеньках, которые формируются при участии почвенных бак*
терн访 из рода Rhizobium. Образующиеся в них азотистые вещества необходимы для роста растенн访.
Если об участии клубеньковых бактери访 в симбиогенной фиксации атмосферного азота стало известно сравнительно недавно (менее 100 лет назад), то о многих преимуществах выращивания бобовых люди узнали гораздо раньше (по меньшей мере две тысячи лет тому назад). Культура, из которой можно получать богатые белком пищевые продукты и которая не требует (или требует очень мало) азотных удобрений, несомненно, выгодна, и неудивительно, что образующие клубеньки бобовые стали важной сельскохозяйственной культурой в Европе, Северной Америке и на других континентах.
Установлено, что среди бобовых, играющих важную роль в сельском хозяйстве (в основном из Papilionoideae), приблизительно 98% видов могут образовывать клубеньки. У диких видов они чаще всего формируются при участии особых разновидностей бактерн访-рнзобиумов, существующих в их природном местообитании. Если како访-то вид бобовых (дикий или культивируемый) долго растет на одном месте, это приводит к постепенному накоплению в почве сожительствующей с ним разновидности ризобиумов. Урожай, особенно если в почве недостает азотистых соединени访，нередко зависит от того, образовалась ли в данном месте эффективная (т. е. способная к фиксации азота) ассоциация из растения-хозяина и соответствующе访 разновидности (штамма) Rhizobium. Нужный штамм не всегда присутствует в том месте, где предполагается выращивать данную культуру, и в таком случае его приходится вносить в почву.
Как только стала ясна роль симбиоза бактерий рода Rhizobium и бобовых, были разработаны способы внесения этих бак- тери访 в почву для улучшения условн访 культивирования. Их стали добавлять также и к семенам. Затраты на внедрение этого способа инокуляции невелики, транспортные расходы незначительны, а сами методы достаточно несложны, чтобы их можно было внедрить в сельское хозяйство развивающихся стран, где высокая стоимость удобрений ложится тяжелым грузом на плечи фермеров. Выращивание бобовых с применением метода инокуляции семян нередко благоприятно сказывается на состоянии окружающей среды: оно помогает бороться с наступающей пустыней, облегчает борьбу с эрозией почв, уменьшает перенос почвы ветрами и позволяет с большим успехом восстанавливать истощенные земли. Большинство образующих клубеньки бобовых способны полностью удовлетворить свои потребности в азоте. Это, конечно, бывает только тогда, когда и прочие условия благоприятствуют росту растений, т. е. растения получают достаточно воды и других питательных веществ.
Инокуляция бактериями Rhizobium
Наиболее просто访 способ инокуляции основан на использовании почвы, взято访 с полей, где выбранная для выращивания культура бобовых растет хорошо. Этот способ вполне пригоден и широко применялся в конце XIX в.
Недостаток его заключается в том, что при этом приходится перемещать много почвы, так как Rhizobium составляют лишь малую часть микрофлоры и ничтожную часть самой почвы. В Америке обычно вносили 100—1000 кг почвы на 1 га. Брали эту почву с расположенного где-нибудь недалеко поля, где был получен хороший урожай нужно访 бобовой культуры. Еще один недостаток этого метода ——возможность распространения с почвой болезней растений.
Гораздо меньше почвы необходимо вносить при помощи сеялок, когда бактерии попадают прямо к семенам, где они нужнее всего. На основе этого простого способа был разработан метод прямой инокуляции семян. Сначала применяли измельченную почву (всего около 0,5 кг почвы на 1 кг семян), а затем стали использовать методы, основанные на введении чистых культур бактерий.
Первая разновидность коммерческой культуры для инокуляции была запатентована Ноббе и Хилтнером в 1896 г. Она поступала на рынок под названием《Nitragin》. Для разных бобовых выпускалось 17 ее вариантов. Уже в 20-х гг. на рынок поступало много других разновидностей инокулятов. Некоторые из них представляли собой чистые культуры бактерий, смешанные с тютво访，песком, торфом, навозом или измельченной породой, другие ——культуры, выращенные на агаре или в жидкой среде. Далеко не в каждом случае качество таких инокулятов было высоким, не каждый раз их правильно применяли, так что и высокие урожаи получали не всегда.
Инокуляция семян
Суть этого метода заключается в том, что на семена наносят большое число клеток Rizobium^ соответствующих определенному виду растения-хозяина, что увеличивает вероятность быстрого образования клубеньков у проростков при участии данных микроорганизмов. Для этого нужно достаточно много бактери访, которые должны сохранять жизнеспособность до тех пор, пока в почве они не проникнут в корневые волоски.
Культуры на агаре
Для прямой инокуляции семян пригодны культуры Rhizobium, выращенные в пробирках или колбах на среде с агаром. Обычно для наращивания бактери访 применяют агаровую среду с ман-
нитолом и дрожжевым экстрактом следующего состава: 0,5 г К2НРО4, 0,2 г MgSO4*7H2O, 0,1 г NaCl, 10 г маннитола, 0,4 г дрожжевого экстракта (например, Difco, Oxoid), 15 г агара, до 1 л дистиллированной воды, pH 6,8—7,0; среду автоклавируют при 121 ℃ 15 мин. В 10 мл тако访 среды может содержаться 〜1Ф。клеток ризобиумов. На холоде их можно хранить несколько недель.
В промышленном масштабе пробирочные культуры Rhizobi- 〃m meliloti для инокуляции люцерны (альфальфы, Medicago sativa) производились в Англии с 1929 по 1963 г. За их качеством следил отдел микробиологии почвы Ротамстедской экспериментальной станции. Для инокуляции семян бактерии соскабливали с поверхности косяка и суспендировали в снятом молоке, к которому добавляли немного фосфата кальция. Эту смесь выливали на кучу зерна и хорошо все перемешивали, а затем давали просохнуть в тени. При этом бактерии прилипали к поверхности семян, а пленка высохшего молока надежно их защищала. В идеальном случае семена вскоре высевали. Этот метод пригоден для выработки небольших партий инокулята и соответствовал потребностям потребителе访，выращивающих люцерну в Англии, но сегодня такие культуры здесь больше не производят. В каждо访 пробирке содержалось достаточно клеток Rhizobium^ чтобы обработать семена для ~0,5 га посевов люцерны. К середине 40-х г. ежегодно продавалось около 40 000 таких препаратов, но к концу 50-х г. число их упало до 9000—10 000, а к 1964 г. до 1000—2000. Это было связано, по крайней мере частично, с уменьшением площадей, засеваемых люцерной. Сегодня в Англии коммерческие препараты-инокуляты не производятся, но из Австралии и США импортируются высококачественные препараты на торфяной основе.
Современные инокуляты на твердых носителях
Rhizobium, выращенные на агаре или в жидкой среде, после высушивания на поверхности семян быстро погибают, да и сами культуры их нежизнестойки. Этих недостатков лишены инокуляты на тор4)яно访 основе, которые были созданы в США, а сегодня применяются повсеместно.
При получении культуру нужного штамма Rhizobium выращивают обычным способом в ферментере объемом в несколько литров в жидкой среде (например, содержащей маннитол и дрожжевой экстракт). Установка может быть очень несложно访, лишь бы ее устройство обеспечивало защиту от микробного загрязнения. Температуру среды поддерживают в интервале 25—28 ℃, и осуществляют интенсивную аэрацию, продувая через среду стерильный воздух. Контроль за pH осуществлять не
нужно, особенно если в среду добавлено немного СаСОз. К моменту смешивания с торфом (носителем)——стерильным или нестерильным —плотность культуры должна быть достаточно высокой, 5* 10s—4-109 клетка/мл. В случае медленно растущих штаммов (например, R. lupini) со средним временем удвоения числа клеток около 10 ч обычно бывает сложно получить культуру с высокой плотностью, и нередко даже размножение более быстро растущих штаммов (со средним временем удвоения 3 ч) подавляется видами-загрязнителями. Для обеспечения быстрого роста культуры на жидкой среде полезно вносить сразу много бактерий.
Культуры на торфяном носителе
Торф высушивают либо при обычной температуре, либо при осторожном нагревании до влажности около 10% (на сухую массу), а затем измельчают при помощи молотковой мельницы до порошка, который просеивают через сито (200 меш) и доводят pH до 6,5——7,0, добавляя тонко измельченный СаСОз. Такой торф можно использовать как стерильный или нестерильна访 носитель. О пригодности партии торфа для получения инокулятов Rhizobium нельзя судить по общим его свойствам, и на каждой из них проводят пробные выращивания именно тех штаммов, которые предполагается использовать. Рост и выживаемость бактерий в торфе зависят от многих факторов.
Нестерильные инокуляты на торфе
К подготовленному измельченному торфу добавляют до 40% (по массе) жидкой культуры, тщательно перемешивают смесь и оставляют ее для созревания в неглубоких лотках. Через несколько суток смесь опять перемешивают, а затем фасуют, обычно в заплавленные мешочки из полиэтиленовой пленки (толщиной 0,0375 мм). За первые несколько недель после приготовления смеси число жизнеспособных клеток Rhizobium обычно увеличивается в 2—5 раз. Если держать фасовки при низкой температуре, бактерии обычно долгое время сохраняют жизнеспособность. Возможное время хранения оценивают исходя из продолжительности периода, за который погибает 90% клеток (время уменьшения численности до 7ю от первоначальной). Это время варьирует от 90 недель (при 5℃) до 8 (при 25℃). При благоприятных условиях культуры можно хранить до года (время уменьшения численности до Ую >16 недель), но срок этот заметно меньше, когда они содержатся при комнатной температуре. Точно предсказать возможную продолжительность хранения нельзя, и ее приходится определять для каждой партии отдельно.
Стерильные инокуляты на торфе
Заплавленные полиэтиленовые или полиамидные мешочки с подготовленным измельченным влажным торфом стерилизуют в автоклавах (например, при 115 ℃ в течение 4 ч) или же путем у-облучения (примерно 4,5* 106 рад). Затем при помощи шприца для ннъекцн访 в них вводят нужный объем 尔идко访 культуры (порядка 10 мл). Прокол запаивают и мешочки ставят на инкубацию, в ходе которой происходит существенное размножение бактерий.
Носители для Rhizobium
Твердый инокулят состоит из бактерий и носителя, роль которого заключается в поддержании жизнеспособности клеток, поскольку он частично защищает их от пересыхания. Кроме того, носитель способствует более равномерному распределению бактерий в массе семян и помогает им прикрепиться к их поверхности. Хотя в случае бактериальных суспензий нередко получались хорошие результаты, считается, что применение торфа как носителя более эффективно: при использовании жидких культур или же суспензий' клетки Rhizobium после инокуляции и прикреплении их к поверхности семян оказываются практически беззащитными. Поэтому при производстве коммерческих инокулятов вначале чаще всего использовали именно торф. Однако торф есть далеко не везде, а если он и имеется, то сказать заранее, пригоден ли он как носитель, невозможно. В связи с этим были предприняты поиски альтернативных носителей с такими же защитными свойствами, как у торфа.
С неодинаковым успехом для этой цели были испробованы всевозможные композиции: разнообразные смеси почвы и торфа» в которые были добавлены молотая люцерна, измельченная со- лома, дрожжи или сахар; нильский ил с добавками питательных веществ; почва, смешанная с кокосовыми охлопьями или древесным углем. Опробованы также вермикулит, перегнившие опилки, бентонит, кизельгур и каменнн访 уголь. В Африке yqaq— ный носитель был получен путем компостирования кукурузных кочерыжек в течение 30 недель вместе с молотым известняком,, суперфосфатом и азотнокислым аммонием. Полученный ком- ност высушивали на воздухе, измельчали, просеивали, развешивали по 100 г в плотные полиэтиленовые мешочки и автоклавировали.
Сегодня для поддержания жизнеспособности Rhizobium получают носители из самых разнообразных веществ, но лучшим носителем все же является торф. В некоторых регионах, напри- мер в развивающихся странах, определенную ценность могут представлять дешевые местные заменители торфа.
Методьь ияоку儿яции
Самый простой, но, наверное, наименее эффективный метод инокуляции——смешивание сухого инокулята и семян перед посевом. При этом к семенам прикрепляется мало бактериальных клеток, большая их часть теряется, и необходимое условие нанесения достаточного числа клеток Rhizobium на семена не выполняется. Поэтому лучше вносить инокулят в виде водной кашицы. Хорошо прилипает к семенам инокулят на торфе, особенно если добавить к нему водорастворимый клей (карбокси- метилцеллюлозу или гуммиарабик). К тому же при этом повышается выживаемость бактерий после высушивания семян.
Дражирование семян
Цель этой обработки состоит в интенсификации образования клубеньков; при этом вместе с бактериями к семенам бобовых добавляют относительно малорастворимые неорганические по* рошкообразные вещества (фосфат кальция, измельченный известняк и т. п.). Хороший эффект при внедрении культуры клевера (Trifolium subterraneum) на кислых почвах Австралии дало дражирование известью. Сначала семена дражировали в тонко измельченном известняке, а затем непосредственно перед высевом смешивали с влажным инокулятом на торфе. Такой способ позволяет нанести больше инокулята и увеличивает выживаемость бактерий на семенах. К инокуляту на торфе при этом добавляют раствор гуммиарабика (〜40%), и все это тщательно перемешивают с семенами (например, в небольшой, чистой бетономешалке), добиваясь равномерного их покрытая. Затем за один прием добавляют необходимое количество карбоната кальция (но не гидроокиси кальция, которая является слишком сильной щелочью) и продолжают перемешивание до тех пор, пока инокулированные семена не покроются ровным слоем известковой муки. Количество добавок и время обработки нужно строго контролировать, так чтобы образовались плотные гранулы, содержащие большое число жизнеспособных бактериальных клеток. Семена после дражирования следует высевать как можно быстрее, пока число жизнеспособных клеток на них максимально.
Используемые s настоящее время инокулятына основе почвы.
Хотя сегодня в нашем распоряжении есть хорошие инокуляты семян, их не всегда удается использовать с полной эффективностью. Дело в том, что часто семена бывает необходимо об-
рабатывать фунгицидами и пестицидами, а некоторые из них либо легальны для Rhizobium^ либо оказывают на них неблагоприятное воздействие. Кроме того, в оболочке семян ряда бобовых содержатся природные антибиотики. Проблемы возникают и при высеве семян в нагретую сухую почву: при этом бактерии могут погибнуть до того, как пройдет дождь и семена прорастут.Поэтому разумно было бы вносить Rhizobium в почву так, чтобы они находились поблизости от семян, в пределах досягаемости для развивающихся корней, но все же на некотором расстоянии, чтобы свести к минимуму влияние токсинов, содержащихся в семянах. Сегодня вновь привлекает к себе внимание инокуляция почвы, а не семян, с использованием улучшенных инокулятов.
Так, очень удобен инокулят на основе пористых гранул; даже после нескольких месяцев хранения в нем остается достаточно много жизнеспособных бактерий. Такие гранулы можно изготовить из увлажненного гипса с добавлением 0,2% натриевой карбоксиметилцеллюлозы, замедляющей схватывание. Бак* терии выращивают в жидкой питательно访 среде, к которой добавляют сформированные гранулы, затем их высушивают на воздухе, фасуют и в таком виде хранят.
Можно приготовить и гранулированный инокулят на основе торфа, в котором создаются условия для размножения Rhizo- bium. Его, как и гипсовые гранулы, можно высевать вместе с семенами или же помещать в почву под ними, если нужно защитить бактерии от вредного воздействия жары и сухости.
Улучшение симбиоза между бобовыми u Rhizobium
Симбиотические отношения, приводящие к фиксации азота,— это наиболее эффективный способ биологического образования аммиака, потребляемого сельскохозяйственными культурами. Влияя на них, мы сможем достичь значительного прогресса в использовании биологической фиксации азота для производства пищевых продуктов. Для расширения масштабов и эффективности систем фиксации азота необходимо глубже понять генетику бактерий Rhizobium, чтобы не зависеть столь сильно от природных систем симбиоза, а формировать их с участием любого желаемого вида растений, употребляемых в пищу.
Генетические экспериментыс азотфиксирующими организмами
В последние десять лет для изучения биологической азотфикса- ции стали применять методы генетики микробов и молекулярной биологии. После того как в 1971 г. Штейхер и др. (Steicher et
al., 1971) показали, что колифаг Pi можно размножать в Klebsiella pneumoniae М5 (свободноживущая азотфиксирующая бактерия) и трансдуцировать с ее помощью nff-гены (гены азот- фиксации), появилась надежда, что генетическими методами удастся повысить способность к азотфиксации и получать более высокие урожаи.
До недавнего времени мы не знали достаточно определенно, какой из партнеров в симбиотической системе Rhizobium — бобовое несет nif-гены, ответственные за фиксацию азота, но в 1975 г. несколько групп ученых обнаружили, что чистым культурам некоторых медленно растущих видов Rhizobium присуща нитрогеназная активность. Из этих опытов следовало, что nif-гены содержатся в геноме бактерий, а не растения-хозяина. В подтверждение этого было показано, что с помощью плазмиды возможен перенос ш/-генов от R. trifolii к неспособному фиксировать азот штамму Klebsiella aerogenes. Было установлено, что некоторые из плазмид, несущих гены, ответственные за формирование клубеньков и фиксацию азота, относительно легко передаются от штамма к штамму Rhizobium при конъюгации.
Везикулярно-арбускулярная микориза
Роль везикулярно-арбуокулярной микоризы
Корни растений в природных условиях никогда не бывают стерильными. На их поверхности всегда присутствует типичная для данного местообитания микрофлора, причем нередко корни бывают заражены почвенными патогенными микробами. Под действием некоторых непатогенных грибов формируются особые структуры; одни грибы, размножаясь, образуют вокруг мелких корешков чехол ——эктомикоризу, другие, проникая в кортикальную ткань корней, образуют эндомикоризу. В результате устанавливаются симбиотические отношения, выгодные растениям-хозяевам. Эктомикоризы, образованные грибами-ба- зидиомицетами и аскомицетами, обнаружены у некоторых де- девьев и кустарников, в частности тех, которые произрастают в умеренном поясе северного полушария, а две из трех известных разновидностей эндомикоризы встречаются только в пределах семейств Ericaceae и Orchidaceae. Третья из них известна под названием «везикулярно-арбускулярная микориза» (ВА): при ее образовании в покровных тканях формируются характерные структуры. Эта разновидность микориз особенно важна для сельского хозяйства (рис. 9.3——9.5). Микориза ВА, образуемая грибом-фикомицетом из семейства Endogonaceae, встречается особенно часто в большинстве почв всех климатических
Рис. 93. Интактные корни -лука, инфицированные вези- .кулярно-арбускулярным микоризным грибом (Phillips, Hayman, 1970). После осветления препарат был окрашен КОН-трипановым синим. Корни инокулированы штаммом Endogone с желтыми вакуолярными спорами. Видны выходящие наружу гифы и несколько зон ^проникновения, но инфекция ® глубине ткани слабая.
Рис. 9.4. Корень лука (см. рис. 9.3) с везикулами и гифами, располагающимися в коре продольно (Phillips, Hayman, 1970).
зон: она присуща большей части покрытосеменных, многим голосеменным, а также некоторым папоротникам и печеночникам. Микориза ВА найдена у большинства важнейших видов сельскохозяйственных растений, она обычно встречается у важнейших культур из семейств Gramineae и Leguminoseae, но не найдена, у видов семейства Cruciferae и сахарной свеклы.
Значение BA-микоризы в сельском хозяйстве определяется тем, что она помогает растениям поглощать из почвы фосфаты. Фосфат-ионы в почве не очень подвижны, и поэтому вокруг корней их часто недостает. Гифы микоризы, вырастающие из
Рис. 9.5. Корень лука (см. рис. 9.3) (Phillips, Hayman, 1970). Видны арбуску- лы, ответвляющиеся от расположенных продольно гиф.
корневого мицелия и распространяющиеся за пределы области^ где недостает фосфата, переносят его прямо в клетки хозяина. Растения со слабо развитой корневой системой, имеющие короткие торчащие корни с небольшим числом волосков (например, лук и цитрусовые), обычно не очень успешно поглощают фосфаты из почвы и《полагаются》в этом на В-А-микоризу.
Благодаря микоризам нередко существенно улучшается рост растений на почвах, бедных фосфором. При этом также увеличивается поступление микроэлементов, например цинка и меди. Выявлено, что концентрация гормонов роста в растениях с микоризой бывает выше, чем в ее отсутствие. Есть и другие преимущества; когда образование микоризы происходит в присутствии подходящих видов Rhizobium, у бобовых усиливаются образование клубеньков и азотфиксация.
Поскольку фосфатные удобрения приходится расходовать экономно, большое внимание сегодня уделяется тому, как эф- *фективнее использовать преимущества BA-микоризы в растениеводстве. Хотя микоризные грибы встречаются повсеместно, в почве, на которой предполагается выращивать новую культуру, может и не быть нужных их разновидностей. Они наверняка отсутствуют в стерилизованной почве теплиц и средах для выращивания растений в горшках. Частичная стерилизация, необходимая для уничтожения патогенов и вредителей растений, убивает и полезные грибы-эндофиты. Чтобы размножить в почве эндофиты или ввести их туда заново, нужна инокуляция, £0 здесь возникает немало сложностей, поскольку гриб не развивается без растения-хозяина. Осыпающиеся с корней крупные покоящиеся споры гриба-эндофита (около 0,15 мм в диаметре) можно отсеять от почвы и поместить на среду с агаром. Они
прорастут, но в отсутствие растения-хозяина, в которое прони
Единственный способ это выращивание егоЕдинственный способ это выращивание егокает мицелий, вскоре перестанут расти, получения больших количеств эндофита —
Единственный способ это выращивание его
Единственный способ это выращивание его
на подходящей линии растений. На самом деле инокулятом должна служить смесь корней мицелия и спор. На рис. 9.6 по
казано, какое благотворное действие на растения оказывает внесение в почву грибов, вызывающих образование ВА-мико-
ризы.
Инокуляция эндофитом
Выделение спор эндофита из почвы
Почву, содержащую тонкие корешки, замачивают в воде и размешивают до разделения почвенных частиц, а затем процеживают через сито с отверстиями диаметром 500——600 мкм. Прошедшую сквозь сито киселеобразную массу перемешивают, встряхивают и дают постоять, чтобы осели грубые минеральные частицы, после чего пропускают через другое сито, с диаметром отверстий 70——1D0 мкм. Осадок на сите изучают под микроскопом. Такой способ отсеивания дает вполне хорошие результаты, поскольку покоящиеся споры эндофита диаметром 100—200 мкм превышают по размеру крупнейшие среди грибов. Этот метод
Рис. 9.6. Проростки белого клевера, растущие на нестерильном торфе, взятом с горного луга в среднем Уэльсе. Обе группы растений были инфицированы одним и тем же местным микоризным грибом, но росли плохо (слева) до тех пор, пока не была проведена инокуляция микоризным грибом, взятым с ближайшего горного луга той же местности (справа). Во все горшки был добавлен суперфосфат (40 кг/га).
особенно хорош для легких песчаных почв, так как при избытке органики в почве обнаружить споры бывает сложно. Морфологические признаки таких спор весьма своеобразны, и на них основана систематика этих грибов.
Другой метод заключается в выделении спор из обогатительной культуры, которую получают путем инокуляции определенных сортов растений, выращиваемых в горшках, кусочками корней с микоризой. В результате заражения в пересчете на горшок образуется гораздо больше спор (несколько тысяч), чем в полевых условиях (несколько сот на 100 г почвы), поэтому выделить их намного проще.
Получение одноразовых культур
Для получения одноразовой культуры на растениях определенного сорта для инокуляции корней проростков в стерильной почве берут 10—20 идентичных спор. В случае успешного заражения через 3——4 мес в горшке развивается гомогенная популяция спор. Их можно выделить одним из описанных выше способов и использовать для заражения новых партий опытных растений.
Крупномасштабное производство инокулятов 「
Технология, предложенная Менге и др. (Menge et al., 1977)； представляет собой по сути дела модификацию только что описанного маломасштабного способа культивирования в горшках₽
Корни растения с BA-микоризой или же инфицированную почву используют для инокуляции растения-хозяина. При этом у растения-донора и растения-хозяина, для которого предназначен вырабатываемый инокулят, не должно быть общих заболеваний корневой системы. Так, инокулят для цитрусовых можно получать, размножая эндофит на суданской траве; использовать для этого цитрусовые не следует.
Споры, полученные при таком способе культивирования, можно подвегнуть поверхностной стерилизации и использовать для инокуляции других линий растений той же разновидности. Убедившись, что горшечные растения свободны от болезней и вредителей, которые могли бы поразить выбранные для инокуляции растения-хозяева, можно провести инокуляцию последних содержимым горшков. При получении инокулята рекомендуется использовать подходящие пестициды и фунгициды, не действующие на BA-микоризу. Методы, подобные описанному, позволяют получать инокуляты в количестве, достаточном для промышленного выращивания растений с хорошо развитой' BA-микоризой в горшечной культуре. И все же метод горшечной культуры малоэффективен, и таким путем трудно получить инокуляты в количестве, необходимом для полевых опытов. Не удивительно поэтому, что наряду с ним изучаются и другие методы. Кроме того, есть надежда, что исследование физиологии эндофита позволит разработать метод его выращивания в чистой культуре, без растения-хозяина, в лабораториях. Это существенно упростило бы производство инокулята, позволило； бы получать более гомогенный, свободный от патогенов препарат. Сегодня же основой для производства инокулята остаются несущие микоризу растения.
Получение чистых инфицированных корней
В настоящее время изучается возможность получения чистых корней, инфицированных эндофитом ВА (с помощью метода питательной пленки; разд. 9.2). Опубликованы результаты первых опытов, в которых при производстве инокулята использовали фасоль (Phaseolus vulgaris) и кукурузу (Zea mays). Споры или корешки с микоризой, завернутые в небольшие кусочки гигроскопичного материала, помещали между корнями, где циркулировал питательный раствор, и получали гораздо более чистые инфицированные корни, чем при выращивании в почвег но эндофит распространялся е корневой массе медленно. Когда такие корни с микоризой применяли для инокуляции в опытах с проростками салата, лука, фасоли и кукурузы, наблюдалось нормальное образование BA-микориз. При инфицировании проростков фасоли и салата культурами трех разных в-идов эндо- 24—1344
@итов рода Glomus, полученными с помощью метода питательной пленки, во всех случаях образовывались видоспецифичные микоризы. Каждый препарат данного инокулята был не менее эффективен, чем препарат такой же массы, полученный методом горшечной культуры. При высушивании на воздухе инфекцион- бость уменьшалась, но инактивации препарата не происходило (Elmes, Mosse, 1980).
Метод питательной пленки хорош тем, что можно строго контролировать условия роста и видоизменять их так, чтобы микориза развивалась успешно, без помех со стороны коллоидов почвы. Так, опыты, о которых речь шла выше, показали, что для хорошего развития проростков кукурузы и микоризы необходимо (присутствие 5,6 мг/л железа в форме NaFe-ЭДТА; при концентрации азота в циркулирующем растворе 11 мг/л (95% в форме ЫОз~ и 5% в виде NH4+) наблюдалось подавление заражения эндофитом, но если концентрация азота в растворе была 1 мг/л, то заражение протекало нормально. Таким образом, этот метод весьма перспективен как для изучения микоризных заражений, так и при крупномасштабном производстве инокулятов для полевых опытов и на продажу.
Методы инокуляции
Инокулировать BA-эндофитами молодые многолетние растения, например сеянцы деревьев или черенки, относительно просто, особенно если выращивать их в контейнерах. Несколько граммов неочищенного инокулята, полученного из горшечной культуры растения-хозяина, либо добавляют в среду, либо помещают его поблизости от молодых корней так, чтобы до пересадки при участии эндофита успела образоваться мощная микориза. Те, кто занимается разведением лесов и цитрусовых, все более убеждаются, что это очень эффективный метод.
В практику сельского хозяйства инокуляция полевых культур BA-эндофитами не внедрена, но в опытах используется широко. Этот метод хорош для выращивания многолетних культур ；в контейнерах, но не нашел применения для инокуляции в полевых условиях, так как препарата нужно очень много. На гектар приходится вносить около 2—3 т неочищенного инокулята, а получить такие количества методом горшечной культуры растения-хозяина практически невозможно. Даже при работе на небольших опытных делянках для получения хорошего результата следует вносить ценный инокулят очень аккуратно. Рассмотрим один лример такого рода.
В опытах с красным клевером (Trifolium pratense) на Ротам- стедской станции в 1979 г. было проведено сопоставление четырех способов инокуляции. Для заражения использовали не-
очищенные препараты (растение-хозяин с почвой), содержащие эндофиты двух типов. Инокулят вносили: 1) под семена в борозды; 2) разбрасыванием, с заделкой граблями вместе с семенами； 3) в форме многосеменных гранул объемом около 1 см3. По четвертому методу, называемому «мокрым высевом», неочищенный инокулят обогащали, отмывая его на сите, суспендировали в 4 %-ном растворе метилцеллюлозы вместе с пророщенными семенами и вносили эту кашицу в борозды. Через девять месяцев выяснилось, что второй метод дает плохие результаты, так как BA-микориза образовывалась всего у 5—10% растений——примерно у такого же их числа, как и в контроле без инокуляции, когда она формировалась при участии природных эндофитов почвы. При внесении гранул микориза образовывалась чаще, приблизительно в 25% случаев, но наилучшие результаты были получены при внесении инокулята в борозды пли при《мокром высеве». И в том и в другом случае микориза формировалась у большинства растений (65—70%).
Мокрый высев, по-видимому, наиболее удобен для проведения инокуляции в полевых условиях, так как при этом нужно- меньше препарата, чем при его внесении другими способами. Кроме того, в метилцеллюлозный гель можно добавлять и другие микроорганизмы, например Rhizobium. Использование гранул также имеет свои преимущества, поскольку с семенами и： инокулятом можно вносить одновременно большие количества1 малорастворимых веществ, например извести (Hayman et al» 1981).
Биологический контроль
Основы биологического контроля
Уже в самом начале развития микробиологии стало известно» что одни микроорганизмы могут подавлять рост других. Наиболее важным результатом интенсивных исследований в этой области было, наверное, открытие антибиотиков и разработка способов их применения в клинике. Большое внимание привлекла к себе и сама возможность использования одних микроорганизмов для регуляции численности популяции других благодаря действию антагонистических или конкурентных механизмов. К сожалению, в ходе этих исследований почти ничего важного для сельского хозяйства открыто не было. Тем не менее сама идея такого биологического широкомасштабного контроля про- должает привлекать внимание ученых.
Биологический контроль осуществляется в природе и помогает предотвращать болезни растений, но мы далеко не всегда понимаем, каков его механизм и как им можно управлять с
пользой для сельского хозяйства. Успехи в этой прикладной области исследований весьма незначительны, вне всякого сомнения потому, что слишком мало усилий предпринималось для изучения поведения смешанных популяций микроорганизмов в почве и на поверхности растений. Есть, однако, и примеры систем биологического контроля, которые разработаны до такого уровня, что их не без основания можно считать биотехнологическими.
Примеры биологического контроля
Антагонистическое действие Trichoderma
Об антагонистической активности гриба Trichoderma известно давно. Если внести во влажную почву значительное количество Trichoderma lignorum^ то он подавит выпревание проростков (болезнь «черная ножка》), главным образом благодаря действию токсина, который можно выделить из фильтратов культур гриба. Было показано, что к этому эффекту причастен и прямой паразитизм гриба. Известно, что другие виды Trichoderma вступают в антагонизм или прямо паразитируют на многих грибах и способны существенно снижать заболеваемость, вызываемую рядом почвенных патогенов растений. Некоторые виды Trichoderma вполне могут использоваться в системах биологического контроля. В работе Уэлса и др. (Wells et al., 1972) сообщалось, что в полевых условиях Trichoderma harzianum подавляет заболевания стеблей и корней, вызываемые Sclerotium rolfsiif если вносить его в почву в больших количествах (1 : 10, по объему). Бэкмен и Родригес-Кабана (Backman, Rodriguez-Kabana, 1975) предложили использовать для инокуляции гранулированный носитель из диатомовой земли, пропитанный 10%-ным раствором мелассы: он способствовал росту Trichoderma harzianum и его было легко рассеивать. Применение этого инокулята позволяет бороться с болезнями, вызываемыми Sclerotium rolfsii в полевых условиях. На 1 га вносили 140 кг гранул, и это было выгодней, чем обработка пестицадами.
В условиях теплиц Trichoderma harzianum сдерживает выпревание проростков фасоли и редьки, но целесообразность его применения в этом качестве в полевых условиях не установлена. Trichoderma harzianum оказывает ингибирующее действие на Rhizoctonia solani и защищает проростки инокулированных .им семян гороха и редьки от выпревания, вызываемого Rhizoc- donia solani .или .Pythium spp.
Грибная гниль
В Европе базидиомицет Forties annosus является основным возбудителем сердцевинной гнили хвойных, особенно ели Picea ubies. Он поражает также лиственные породы и лесоматериалы. Заражение этим грибом сосновых пней тоже нежелательно, так как инфекция распростр аняется на их корни, а затем и на корни соседних, здоровых деревьев. Заселение пней этим грибом можно предотвратить, засеяв их спорами другого гриба-бази- диомицета, Peniophora gigantea. Гриб разрастается на пнях, и, конкурируя с Forties annosus, подавляет развитие сердцевинной гнили. Этот способ применяется в Англии и США, где нужный инокулят имеется в продаже.
Скорее всего любой организм, избранный в будущем для осуществления биологического контроля, будет действовать на патогены двояким способом: либо образуя вещества-ингибиторы, либо конкурируя за питательные вещества, либо проявляя к тот и другой эффект. Многие сообщения на эту тему представляют сегодня лишь научный интерес; оценить значение их для практики нет возможности.
Корончатые галлы а борьба с ними
Природа заболевания
Некоторые разновидности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens способны внедряться в ткани двудольных растений через раневые поверхности и вызывать образование опухолей —— корончатых галлов. Хотя об этом явлении известно с 1907 г., механизм патогенности удалось установить совсем недавно. Было показано, что клетки патогенных штаммов этой бактерии содержат крупную плазмиду (Ti) с мол. массой от 90-106 до 150- 10б, зависящей от того, какие иные свойства, кроме патогенности, в ней закодированы. Имеются данные, что превращение нормальных клеток растения в опухолевые обусловлено переносом в них плазмиды Ti и включением ее в хромосомную ДНК хозяина.
Клетки опухоли растений могут расти на питательной среде в форме недифференцированной массы, но иногда из них образуются тератомы, которые порождают внешне нормальные растения. Эти тератомы все еще содержат плазмидную ДНК и синтезируют опины, но обычно опухоли у них отсутствуют и могут развиваться либо спонтанно, либо после повреждений.
Было показано, что плазмиду Ti методами генетической инженерии можно модифицировать, в результате чего она приоб-
ретает способность переносить чужеродную ДНК в растение- хозяина. Существование жизнеспособных тератом позволяет надеяться, что на основе такого плазмидного переноса ДНК можно получить стабильно трансформированные растения.
Любопытно, что хотя тератомы могут цвести и образовывать семена, выращенные из таких семян растения не несут плазмиды Ti. Видимо, она каким-то образом утрачивается при мейозе. Сегодня содержащие ДНК Ti-плазмид растения размножают только вегетативно.
Agrobacterium tumefaciens не инфицирует однодольные растения, и поэтому векторы на основе плазмиды Ti нельзя использовать в генетических экспериментах с культивируемыми злаками.
Биологический контроль
В Австралии корончатые галлы очень часто встречаются у миндаля, персиков и роз, и в 1973 г. садоводы-профессионалы разработали метод защиты этих культур, состоящий в том, что саженцы (проростки, трансплантаты и черенки) смачивают в суспензии бактерий, которые подавляют рост патогена. Такая обработка почти полностью предотвращает заболевание и является первым примером практического использования бактерий для борьбы с корончатыми галлами.
Не все агробактерии являются патогенами. Многие их штаммы, выделенные из почвы питомников, где выращивали косточковые культуры, были непатогенными, но отличить их от патогенных по какому-либо иному, чем степень патогенности, признаку было невозможно. Для почвы вокруг больных растений отношение патогенных штаммов к непатогенным было высоким, а для почвы вокруг здоровых растений — низким.
Изучение взаимоотношений между двумя формами в лаборатории, когда в качестве типичной непатогенной формы был взят штамм 84, показало, что если в опытах с проростками помидоров или персиков отношение числа патогенных штаммов к непатогенным было меньше или равно 1, то галлы не развивались. Конечная цель этих экспериментов заключалась в создании условий, при которых указанное отношение для поверхности корней не превышало бы единицы, для чего предпринимались попытки повысить содержание непатогенных форм на семенах или корнях молодых деревьев при пересадке. В опытах с персиками путем инокуляции корней удалось защитить около 95% растений, росших год на почве без патогенов, и около 99%, когда инокулировались и семена, и корни.
Способ обработки
Сама обработка крайне проста: семена, черенки или корни молодых растений погружают в суспензию бактерий, а затем немедленно высаживают. Хорошие результаты получают при плотности суспензии порядка 107——108 бактерий/мл; при этом заболеваний практически не наблюдается. В Австралии, Новой Зеландии и США такие инокуляты имеются в продаже; некоторые из них делают на основе торфа, как и в случае Rhizobium, а другие представляют собой культуры, выращенные на агаре.
Механизм контроля
Штамм 84 синтезирует высокоспецифичный антибиотик, который подавляет рост большинства патогенных агробактерий. Это нуклеотидный бактериоцин, известный под названием агро- дин 84. В клетках этого штамма содержится небольшая плазмида с мол. массой 30-106, детерминирующая синтез агроцина, и крупная плазмида с мол. массой 124-106, в которой закодирована способность использовать нопалин — необычную аминокислоту типа опина, присутствующую только в тканях корончатых галлов. Крупная плазмида Ti, которая несет гены патогенности и чувствительности к агроцину, в этих клетках отсутствует. Когда патогенный штамм выращивают в присутствии агроцина 84, образуется небольшое количество устойчивых к нему колоний, как правило непатогенных. При этом, видимо, либо теряется плазмида Ti, либо происходит мутация (делеция), которая проявляется не только в форме устойчивости к агроци- ну 84, но и в потере патогенности.
Проблемы борьбы с корончатыми галлами
К сожалению, метод борьбы с корончатыми галлами с помощью штамма 84 не удается распространить на все подверженные этой болезни культуры, так как некоторые из них, например винный виноград, инфицируются штаммами, устойчивыми к аг- роцину 84. Кроме того, в некоторых полевых опытах из галлов были выделены патогенные, образующие агроцин 84, штаммы. Все известные синтезирующие агроцин 84 штаммы устойчивы к этому бактериоцину, так что бороться с ними с помощью штамма 84 невозможно.
Опыты показали, что такие устойчивые патогенные штаммы могут появляться в результате конъюгации между штаммом 84 и патогенными штаммами. В ходе конъюгации две плазмиды штамма 84 передаются независимо друг от друга, в то время как плазмида Ti патогена не обязательно проникает в клетку-
реципиент. Из шести возможных трансконъюгатов три содержат Ti-плазмиду, а два из них к тому же и небольшую плазмиду^ в которой закодирована способность к синтезу агроцина 84. В лаборатории конъюгация происходит только в присутствии нопалина, а в природе, по-видимому, непосредственно в самой ткани корончатого галла либо вблизи него. Можно предположить, что иногда при этом появляются патогенные штаммы, образующие агроцин. Ясность в этот вопрос будет внесена лишь тогда, когда будет обнаружен или создан методами генетической инженерии мутант штамма 84, неспособный к конъюгации с патогеном или же к переносу плазмиды с маркером агроцин 84.
Аэробная переработка отходов в сельском хозяйстве
(см. также гл. 6)
Проблема хранения и переработки отходов
Если сельское хозяйство ведется традиционными способами, то отходов животноводства образуется немного, и их несложно использовать для удобрения ^расположенных поблизости пахотных земель. Сегодня, когда 右 животноводстве применяется интенсивная технология, жидкие и твердые отходы образуются в большом количестве, и площадь близлежащих земель может оказаться недостаточной для их использования. Хранить и перерабатывать такие отходы весьма непросто. Кроме того, в последнее время проблемы использования отходов животноводства привлекают пристальное внимание специалистов по охране окружающей среды и органов здравоохранения, которых тревожит возможность проникновения загрязнений в водоемы и распространения таким путем возбудителей заболеваний. Необходимо научиться наиболее полно и экономично использовать ту часть отходов, которую можно применять как удобрения, и в то же время решить проблемы, связанные с возможным загрязнением среды из-за большого объема таких отходов. Важность задачи потребовала разработки и внедрения различных систем переработки отходов.
Отличительной особенностью аэробной биологической системы, которая столь успешно применяется для переработки бытовых сточных вод, является свободный доступ воздуха к аэробным микроорганизмам, участвующим в превращении различных веществ, содержащихся в отходах, в относительно стабильные конечные продукты. Было показано, что контролируемая переработка отходов сельского хозяйства в аэробных условиях вполне возможна. Ряд научных центров в Европе и Северной Америке приняли участие в исследованиях и разработке программ использования различных систем переработки. Главными?
■особенностями системы, используемой на фермах, должны быть долговечность, простота в эксплуатации и желательно автоматизация всех процессов. Сегодня уже предложено несколько таких маломасштабных систем.
962 Системы переработки отходов в аэробных условиях
Для переработки твердых отходов необходимо много времени и средств, поэтому на фермах с интенсивной технологией для их удаления стали широко использовать воду. Образующуюся взвесь закачивают в хранилища или в системы переработки.
Водоем для окисления
Это наиболее простая установка, представляющая собой неглубокую (не более 150 см) емкость, наполненную отходами и имеющую достаточную площадь поверхности для обеспечения аэрации. На поверхности этого водоема растут фотосинтезирующие водоросли, которые повышают эффективность системы благодаря выделению кислорода. Скорость поступления отходов не должна быть слишком высокой. Недостатки таких установок состоят в том, что 1) переработка отходов требует много времени； если объем отходов велик, необходимы водоемы большой площади; 2) накапливаются твердые отходы, которые разлагаются в анаэробных условиях; 3) создаются условия для размножения насекомых. Но есть и два преимущества: не нужна механизация и обслуживающий персонал.
Аэрируемый водоем сходен с водоемом для окисления и отличается лишь тем, что в нем установлено механическое устройство для усиления аэрации, перемешивания и сохранения твер； дых частиц в суспендированном состоянии. При одинаковой загрузке такой водоем может быть меньше по площади и глубже, чем водоем для окисления. Для него проще оценить время переработки и качество стоков.
Такие системы особенно удобны для сбора и переработки отходов, когда жидкость нельзя сливать в природные водоемы, а также для сохранения воды для целей ирригации.
Каскадные бассейны
Каскадные бассейны ——это тоже простая немеханизированная система, применяемая в Англии. В отличие от водоемов для окисления отходы поступают в нее постоянно, и время удержания их в системе невелико. Они включают первичный отстойник (желательно с дефлекторами, позволяющими контролировать скорость протекания), в котором осаждаются крупные частицы.
а также каскад мелких бассейнов, разделенных перегородками или плотинами, через которые перетекает вода. Переливаясь из бассейна в бассейн, вода аэрируется. Если время удержания подобрано правильно, то глубина переработки оказывается не меньше, чем в водоеме для окисления. Как и в неаэрируемых водоемах, перемешивание осадка идет плохо, а активность микроорганизмов может подавляться из-за недостатка кислорода или же слишком медленн-ой диффузии конечных продуктов обмена.
Канава Пасвира (Pasveer ditch)
Эта система для окисления отходов является модификацией установки с активным илом и представляет собой одну непрерывную, вытянутую в длину емкость, которую часто располагают под полом хлева, откуда поступают отходы; в ней они и окисляются. Жидкость (толщина слоя 0,3—0,6 м) аэрируют и перемешивают с помощью ротора, помещенного в емкость. Имеются приспособления для добавки новой порции отходов и удаления отработанной жидкости. Эта и ряд других систем, основанных на принудительной аэрации, во многом сходны с реакторами непрерывного действия, в которых развивается особая микрофлора (аналогичная таковой в хлопьях активного ила), метаболизирующая субстрат. Сходство заключается в том, что отходы (субстрат) поступают в объеме, небольшом по сравнению с общим их объемом, перерабатываемым в реакторе. Этот тип перерабатывающего устройства активно изучался для выяснения его пригодности для переработки отходов животноводства в контролируемых условиях.
Основной недостаток всех этих систем — невозможность увязать поступление кислорода с его потреблением. Их эффективность можно будет повысить, если удастся точнее оценить скорость расщепления разных субстратов и лучше изучить микро* организмы, участвующие в процессе.
Переработка отходов сельского хозяйства в анаэробных условиях (см. также гл. 6)
Главные особенности процесса
При переработке органических отходов в анаэробных условиях образуется горючий газ, на 60% состоящий из метана, и твердый остаток, содержащий весь или почти весь азот и все другие питательные вещества, содержащиеся в исходном растительном материале. В природе такой процесс развивается при недостатке кислорода в местах скопления веществ растительного или
животного происхождения: в болотах, осадках на дне озер, а также в желудке травоядных. Он может протекать и в закрытой емкости, наполненной подходящим органическим веществом, куда не поступает воздух. Метанобразующие бактерии и некоторые другие микроорганизмы, продуцирующие нужные этим ■бактериям субстраты, формируют в таких условиях систему прочных симбиотических отношений, которая может функционировать неопределенно долгое время, если в нее в подходящем количестве поступают все новые порции отходов.
Температурный оптимум лежит в интервале 30——35 ℃, и для его поддержания нужен подогрев. Этот процесс начали изучать еще во времена Пастера; ему посвящено множество работ, а сам процесс был значительно модифицирован, в частности применительно к очистке сточных вод. Это весьма удачный пример действующей биотехнологии, поскольку она может применяться в больших масштабах, оправдывающих капиталовложения и текущие расходы по внедрению. Переработка отходов при участии метанобразующего ила применяется на ряде крупных установок в Англии и других странах, что существенно уменьшает ее стоимость. Она осуществляется, например, на Магденской станции по переработке сточных вод в западной части Лондона (Thames Water Authority). Там установлено двадцать тэнков для переработки жидких отходов, диаметр каждого из них составляет 21,3 м, а глубина—10,4—16,0 м, с общим объемом 79 000 м3. Эта станция продолжает действовать, хотя переработка отходов непрерывно производилась на ней в течение почти пятидесяти лет, и вырабатывает метан в количестве, достаточном для работы двухтопливных машин, постоянно подающих сжатый воздух для перемешивания содержимого тэнков и вырабатывающих электроэнергию, потребляемую всей станцией.
Переработка отходов сельского хоз兄貝ства
Еще в начале века было выявлено, что из навоза можно получать горючий газ, а отходы использовать как удобрение. Предпринимались попытки найти практическое применение этому про- дессу, но в целом интерес к нему был невелик до тех пор, пока нехватка горючего во время войны не заставила обратить на него внимание. С тех пор было сконструировано множество установок для производства метана, но все они имели две основные части: 1) герметичный тэнк или реактор, в котором осуществлялась ферментация; 2) емкость для газа, обычно накопительный плавающий колокол с емкостью, близкой к таковой у реактора.
В 40-х г. простейшие установки этого типа с реакторами емкостью около 10 м3 использовались французами в Северной
Африке, и многие из них продолжали работать как там, так и во Франции до начала 50-х г. В это время в Англии тоже стали выпускать такие небольшие установки для продажи фермерам, но, по-видимому, лишь немногие из них нашли применение.
Простейшие установки периодического действия имеют ряд серьезных недостатков. Основной из них — трудность загрузки реактора полутвердыми отходами и его опорожнение, которые- обычно проводят вручную. Неудобство заключается и в том, что надо иметь несколько реакторов, процесс в которых находится на разных стадиях, чтобы сгладить неравномерность в интенсивности образования газа, а также иметь возможность подогревать реакторы до 30—35℃. Все это, без сомнения, препятствовало широкому использованию генераторов метана на фермах, и от них практически отказались, когда в 60-х годах было налажено снабжение баллонами с пропаном и бутаном;
Совсем иначе обстояло дело в послевоенной Германии, где были предприняты разработки крупных высокомеханизированных установок. Классическим примером может быть установка1. 《Bihugas》，построенная Ф. Шмидтом в Аллерхопе на ферме площадью 220 акров, где в 1950 г. содержалось 55 голов крупного рогатого скота, 180 свиней и 650 кур. По расчетам навоза от этих животных, если смешать его с соломой, было достаточно для производства 4,5-104 м3 газа в год. Установка включала несколько цилиндрических подогреваемых наземных реакторов, в которые насосами подавалась взвесь из навоза и резаной соломы. Ферментацию проводили непродолжительное время, в течение 5—21 сут, когда газ образовывался наиболее интенсивно. Увеличить выход газа путем продолжительной неэкономичной переработки не пытались. Безусловно, работа такой установки была весьма эффективной, но ее размеры и стоимость были таковы, что она могла работать только на самых крупных животноводческих фермах. Такие крупные установки, несмотря на их эффективность, нередко не выдерживали конкуренции с более обычными и дешевыми источниками энергии, и ими пере* ставали пользоваться.
Резкий подъем цен на нефть в 70-х гг. вынудил фермеров к экономии, и неудивительно, что при этом вновь пробудился интерес к генераторам метана и эффективным методам переработки навоза. Нефтяной кризис послужил толчком к публикации в общедоступной прессе множества статей и заметок, которые призывали наладить производство метана в масштабах всей страны, на каждой ферме, в каждом доме и даже машине. Такие предложения нередко были сущей чепухой и свидетельствовали о неправильном понимании сути дела. Интерес к про* блеме сохраняется до сих пор, и в области метаногенной ферментации были достигнуты серьезные успехи.
Микробиологические основы процесса
Метанобразующие бактерии являются строгими анаэробамиг и при их исследовании ученые столкнулись с рядом проблем. Это касалось прежде всего их выделения, но сегодня эта задача облегчается тем, что сконструированы удобные установки,, где созданы анаэробные условия. В настоящее время изучено- множество таких бактерий, и мы многое узнали об особенностях их метаболизма.
На первой стадии процесса ферментации из растительной и фекальной массы, образуются летучие жирные кислоты (уксусная, масляная). Важную роль при этом играют клостридии. Кислоты (за исключением уксусной) служат далее субстратом для группы уксуснокислых бактерий. В конечном счете в результате совместного действия этих групп бактерий образуются уксусная кислота, водород и углекислый газ, которые являются подходящим субстратом для метанобразующих бактерий. Эти бактерии относятся либо к ацетокластикам (например, Metha- nosarcina barker^ которая превращает уксусную кислоту в метан и СО2), либо к группе бактерий, использующих водород (например, Methanospirillum hungatei^ которая синтезирует метан из водорода и СО2). Взаимоотношения бактерий этих двух групп, а также способы регуляции самого процесса переработки подробно рассматриваются Мозеем (Mosey, 1982).
Современные разработки
Основная проблема, которая возникает на фермах, где содержится много животных, заключается в хранении навоза и использовании его наиболее выгодным образом. Если при этом в качестве побочного продукта будет образовываться метан и затраты на хранение навоза не увеличатся, то фермеры, безусловно, отнесутся к такой возможности положительно. Однако осуществить эту возможность на практике вряд ли удастся, поскольку эффективные механизированные установки, предназначенные для использования в развитом сельском хозяйстве, весьма дороги. В Англии сегодня выпускают реакторы улучшенной конструкции для переработки отходов ферм, но затраты на них едва ли можно компенсировать доходами от производства метана. Для переработки разбавленных промышленных отходов также сконструировано несколько интересных новых типов анаэробных реакторов, в которых используется принцип псевдоожиженного слоя, но здесь основная цель состоит в очистке стоков, а не в получении горючего газа.
Многие тысячи простейших реакторов были построены в Индии, Африке, на Дальнем Востоке и в Китаем. Здесь есть кому
их обслуживать из-за избытка рабочих рук. Очень трудно, од* нако, оценить, насколько они на самом деле полезны и как долго прослужат.
Использование протопластов в селекции растений
/. Вегетативное размножение
Изменчивость высших растений определяется в основном перераспределением генов при половом размножении. Хотя такая изменчивость и важна с эволюционной точки зрения, она служит помехой при разведении сортов растений с желаемым набором признаков. К счастью, не все цветковые растения размножаются только половым путем. У многих из них образуются особые органы вегетативного размножения, например видоизмененные стебли — известные всем усы земляники и клубни картофеля. Многие растения обладают ценной особенностью: они ■способны к полной регенерации из небольшого отрезка стебля, черенка. Эта особенность широко используется для разведения растений с ценными сортовыми признаками. Только таким способом можно разводить растения, неспособные давать потомство половым путем. Некоторые растения полностью регенерируют из целых листьев (многие суккуленты) или их частей (например, бегонии).
Полноценное растение может развиться и из каллусной ткани, выращенной из меристемы in vitro. Этот метод позволил получить безвирусные сорта картофеля. Вот уже несколько лет метод культуры тканей используется для выведения оздоровленных и устойчивых к болезням растений, для создания сортов с определенным генотипом, а также для сохранения и разведения сортов ценных растений.
Сегодня мы знаем, что многие изолированные клетки, если их культивировать в соответствующих условиях, могут регенерировать в целое растение. Клетка, обладающая такой способностью к росту и формированию ткани, из которой затем развивается полноценное растение, называется тотипотентной. В середине 60-х гг. тотипотентность клеток была обнаружена у многих видов растений.
Из тотипотентных клеток легко получить лишенные клеточной стенки протопласты. Разработаны методы их культивирования для получения каллусной ткани и затем ——небольших растеньиц, которых можно размножать обычными способами.
Протопласты получены из тканей большинства органов растений, в том числе из корней, листьев, лепестков, плодов, коле- юптил, запасающих органов, тетрад микроспор (из пыльников), корневых клубеньков бобовых и каллусных тканей. Чаще всего
для этого берут мезофильную ткань листа: из нее образуется много единообразных протопластов. Нередко из протопластов получают каллусные культуры, из которых можно регенерировать целое растение. К сожалению, до последнего времени не удавалось вырастить целые растения из изолированных протопластов бобовых и злаков ——двух важнейших групп культивируемых растений. Нередко в относительно простых условиях выращивания и с высоким выходом была осуществлена регенерация в целое растение протопластов Medicago sativa (люцерна, альфальфа). Это позволяет надеяться, что подобрав соответствующие условия, удастся регенерировать из протопластов и бобовые. Сегодня мы еще не умеем регенерировать растения из протопластов хлебных злаков и пищевых бобовых, но в 1980 г. Вернике и Бреттел (Werniche, Brettell, 1980) добились образования каллуса и регенерации растений из листьев злаков, так что можно ожидать, что и в случае протопластов злаков будет достигнут прогресс.
Особая ценность протопластов для селекции растений определяется целым рядом их свойств. Во-первых, протопласты можно получать в большом количестве и отбирать из них разновидности с полезными свойствами. Хотя сами протопласты генетически единообразны, формирующиеся из них каллусы дают растения, существенно различающиеся по внешним признакам. Во-вторых, отсутствие клеточной стенки облегчает слияние протопластов и образование гибридов. Поскольку при этом сливаются соматические, как минимум диплоидные, клетки, селекционер растений получает в свои руки мощный инструмент для отбора. В-третьих, в отсутствие клеточной стенки облегчается захват чужеродной ДНК — фрагментов молекул или же бактериальных плазмид, в результате чего формируются растения с совершенно новым набором признаков.
Изменчивость
Хотя растения, полученные в результате размножения вегетативным путем (клоны), обычно похожи на родительское растение, из этого вовсе не следует, что все эти клоны генетически одинаковы. Иногда возникают клоны, которые существенно отличаются от исходной формы. Их называют соматическими вариантами или депортами», и появляются они в результате генетических изменений в клетках меристемы, которые дают начало всему новому растению или его части. В ряде случаен такие спорты были размножены и привели к созданию новых сортов. Примером могут быть апельсины《Навель》и персики- нектарины. В основе соматической изменчивости лежит ряд генетических механизмов: изменение числа хромосом в ядре, му・
тация отдельных генов, модификация внеядерных генов клеточных органелл (хлоропластов и митохондрий). Хотя изменчивость растений картофеля, полученных из протопластов, обычно невелика, для протоклонов тетраплоидного сорта Russet Burbank она оказалась существенной. Изучение изменчивости у регенерированных растений картофеля сорта Maris Bard показало, что она возникает при росте каллусов из генетически единообразных протопластов и не является следствием экспериментов с самими протопластами.
Изменчивость прото клонов, наблюдающаяся в отсутствие мутагенов, весьма важна для растениеводства: благодаря ей селекционер растений получает богатый исходный материал. Так, среди регенерантов картофеля были выявлены растения с потенциально полезными признаками: низкорослые, с измененными клубнями и с разными сроками созревания.
Регенерация растений из протопластов
Шеферд и Тоттен (Shephard, Totten, 1977 г.) в опытах с картофелем, у которого регенерация растений из культуры тканей затруднена, разработали метод, позволяющий достаточно успешно регенерировать растения из протопластов. Их способ был несколько необычным, поскольку предусматривал особые условия выращивания растений, из которых потом получали протопласты. Кроме того, на каждой стадии развития растений-регенерантов они применяли особую среду.
Выращивание растений для опытов
Растения картофеля (американский сорт Russet Burbank) выращивали из клубней, свободных от Х-вируса, при высокой освещенности (продолжительность светового дня 12 ч), при 24 ℃ и относительной влажности 70—75%. Перед началом опыта растения выдерживали 4——10 сут при той же температуре и влажности, но более слабом (7000 люкс) и менее продолжительном освещении (6 ч в сутки). Содержание растений в условиях слабого и непродолжительного освещения приводило к существенному увеличению выхода жизнеспособных протопластов из тканей листьев (до 2—3-106 на 1 г ткани).
Среды для выделения и размножения
При выделении и размножении протопластов применяли среды пяти типов (А — Е), которые представляли собой варианты среды, предложенной Лэмом (Lam, 1975). В их состав входили основные питательные вещества растений, микроэлементы, ами-
нокислоты, факторы роста, фитогормоны и регуляторы осмотического давления. Содержание веществ подбиралось так, чтобы обеспечить оптимальный рост на каждом этапе регенерации. Все среды содержали 1,5—2,0% агара, кроме полужидкой среды А, где его концентрация составляла только 0,5%. Среды D и Е, использованные на заключительном этапе, содержали 1650 мг/л NH4NO3.
Выделение протопластов
4 г ткани, вырезанной из стерилизованных с поверхности молодых листьев, инкубировали в 200 мл среды А (без сахарозы и агара) в темноте при 4℃ в течение 16—24 ч. Затем среду заменяли на 100 мл забуференного (pH 5,6) раствора с ферментами, чтобы отделить мезофильные клетки и удалить их клеточные оболочки. При встряхивании смеси процесс заканчивался за 4 ч при 28 ℃. Жизнеспособные протопласты после процеживания смеси собирали центрифугированием, промывали средой А, снова осаждали и хранили в жидкой среде А при концентрации 6-105 клетка/мл.
Рост каллуса
При инкубации протопластов на твердой среде В или на модифицированной твердой среде происходит регенерация клеточных стенок и ограниченное деление клеток, в результате чего образуются микрокаллусы. После переноса в среду С они растут далее до стадии, когда становится возможным перенос в среду D, где индуцируется образование (морфогенез) побегов. На заключительной стадии каллусы с побегами длиной около 1 мм переносят на среду Е для завершения образования побегов и формирования корней. Укорененные растения пересаживают в небольшие горшочки с вермикулитом, где они и растут далее.
Здесь изложена суть метода, который следует использовать для регенерации целых растений из одиночных протопластов, и проиллюстрировано, как экспериментатору приходится варьировать условия на разных стадиях развития, чтобы добиться успеха. На рис. 9.7——9.10 показано, как выглядят свежевыделенные протопласты, молодые каллусы и крошечные растения, регенерированные из ткани каллуса. Особенно важно в этой работе строго выдерживать надлежащие условия, однако почти наверняка их придется специально подбирать для каждого изучаемого вида растений.
Томасу (Thomas, 1981) удалось получить культуры побегов тетраплоидного картофеля сорта Maris Bard, которые использовались как исходный материал для выделения протопластов^ 25—1344
Рис. 9.7. Свежевыделенные протопласты Solarium brevidens.
Пазушные почки стерилизовали с поверхности раствором гипохлорида натрия и культивировали затем на среде Мурасиге и Скуга (Alurashige, Skoog, 1962), содержащей, кроме того, сахарозу (30 г/л), агар (6 г/л) и 6-бензил аминопурин (6-БАП, 0,5 мг/л), pH 5,8. В ходе инкубации при 26 ℃ при освещенности ~400 люкс (16 ч днем, 8 ч ночью) за 3—5 нед образовывались ростки длиной около 3 см. Их можно было использовать для дальнейшего размножения на той же среде, но без 6-БАП, для чего брали короткие (3—8 мм) отрезки стебля с листом и пазушной почкой. Рост продолжался три недели, после чего побеги можно было опять использовать для размножения или же выделения протопластов. Цельные проростки (но не взятые отдельно листья) давали жизнеспособные протопласты, которые могли длительное время делиться в культуре.
Методы слияния протопластов
Хотя о возможности слияния протопластов растений было известно уже давно, метод контролируемого слияния с воспроизводимыми результатами был разработан лишь в 1970 г. (Power et al., 1970). Тем самым был сделан первый шаг к соматической гибридизации растений. При суспендировании протопластов в 0,25 М растворе азотнокислого натрия слияние происходило очень быстро. Впоследствии для индукции слияния протопластов Parthenocissus tricuspidata и Petunia hybrida использовали 10,2%-ный раствор сахарозы, содержащий 5,5% азотнокислого натрия. Для той же цели применяли хлористый кальций.
Рис. 9.8. Каллусы, образовавшиеся из протопластов Solarium brevidens на агаре. Снимок сделан примерно через месяц после получения протопластов. Для выращивания использована чашка Петри диаметром 9 см.
Было показано (Као, Michayluk, 1974), что полиэтиленгликоль с большой молекулярной массой также вызывает неспецифическое слипание, а затем и слияние протопластов растений. При инкубации в самом полиэтиленгликоле слияний почти не происходило, но при его разведении гибриды образовывали до 10% протопластов. ПЭГ способствовал также захвату хлоропластов водоросли Vaucheria dichotoma протопластами моркови. Методы слияния протопластов подробно описаны в руководстве Пауэра и Дэйви (Power, Davey, 1979).
Получение соматических гибридов
Для осуществления гибридизации соматических клеток методом слияния протопластов необходимо выполнить следующие операции: 1) выделить протопласты; 2) осуществить слияние; 3) регенерировать клеточные стенки; 4) осуществить слияние ядер так, чтобы получить полноценное гибридное ядро; 5) размножить гибридные клетки; 6) регенерировать целое растение.
Осуществить, слияние протопластов растений, вообще гово-
25*
Рис. 9.9. Регенерация мини-растений Solanum tuberosum из каллусной ткани, полученной из протопластов (снимок сделан примерно через 100 сут после пе- ренесения на агаровую среду, способствующую регенерации).
ря, несложно, но из этого не следует, что столь же просто размножить гибридные клетки или же регенерировать гибридное растение. Прежде всего нужно отобрать гибридные протопласты, которые составляют лишь малую часть всех клеток, а затем создать им условия для развития. Примером работы такого рода может быть эксперимент по соматической гибридизации Petunia hybrida и Petunia parodii. Здесь отбор был основан на различиях в способности к росту протопластов из листьев этих двух видов растений. Дело в том, что протопласты Petunia parodii в использованной в этом опыте среде могли формировать лишь микрокаллусы, состоящие не более чем из пятидесяти клеток, в то время как из протопластов Petunia hybrida можно получать растущие каллусы. Было использовано также и то обстоятельство, что протопласты Petunia hybrida более чувствительны к актиномицину D, чем протопласты Petunia parodii.
Гетерокарион, образующийся в результате слияния двух разных протопластов, может после слияния ядер превратиться в гибридную клетку. Имеется в виду, что происходит объединение всех несущих гены, самореплицирующихся органелл обоих про-
Рис. 9.10. Регенерация мини-растений Solarium brevidens из каллусной ткани, полученной из протопластов (снимок сделан приблизительно через 100 сут после перенесения на агаровую среду, способствующую регенерации).
топластов, в то время как при обычном половом скрещивании от каждой родительской клетки поступает по ядру, несущему хромосомные гены (кариомы), но гены, передаваемые с пластидами (пластидомы) и митохондриями (хондриомы), передаются обычно лишь от женской клетки. Таким образом, методы на основе слияния протопластов позволяют получать комбинации двух полных родительских геномов. Слияние протопластов двух скрещивающихся половым путем видов нередко приводит к образованию стабильных амфиплоидных гибридных клеток, из которых могут быть регенерированы растения — соматические гибриды. Надо сказать, что метод слияния протопластов пригоден для работы не только со столь близкими видами или гибридными клетками.
Томас и др. (Thomas et al., 1979) перечисляет ряд работ, в которых была осуществлена регенерация в экспериментах по слиянию протопластов растений, принадлежащих к одному и тому же (7 случаев) и разным (14 случаев) видам. В четырех экспериментах по межвидовому слиянию были получены линии клеток, а в четырех других — осуществлен захват клеточных
органелл протопластами. В двух опытах в протопласты растений была введена чужеродная ДНК, которая экспрессировалась, а в трех из протоклонов были получены мутантные растения. Способы применения метода слияния протопластов весьма многообразны.
Возможность образования соматических гибридов создает предпосылки для изменений внеядерного генного компонента гибридных клеток. Для этого, например, можно использовать протопласты-альбиносы, в которых нет хлоропластных генов, или же протопласты, у которых во время слияния проводится инактивация ядерного генома одного из родителей. Донорами цитоплазматических генов, вводимых путем слияния в полноценные протопласты, могут быть безъядерные субпротопласты или микропласты.
Захват протопластами микроорганизмов и ДНК
Дэйви и Пауэр (Davey, Power, 1975) обнаружили, что ПЭГ способствует захвату клеток и протопластов дрожжей и клеток сине-зеленых водорослей протопластами Parthenocissus tricuspi- data. При этом микроорганизмы локализуются в ограниченных мембранами пузырьках (везикулах) цитоплазмы протопластов. Значительный интерес представляет возможность введения в протопласты интактных микроорганизмов с полезными свойствами, например таких, которые способны фиксировать азот. Другой вариант ——это введение в высшие растения генетического материала микробов с последующей его экспрессией. В принципе методы слияния протопластов вполне могут использоваться для этой цели, но пока успехи и в этой области весьма скромны (Thomas et al., 1979).
При введении в протопласты нового генетического материала в виде чистой ДНК последняя не всегда сохраняется и экспрессируется в хозяйских клетках. Весьма перспективным представляется использование в качестве векторов Ti-плазмид Agro- bacterium tumefaciens (раздел 9.5.3), так как они непосредственно включаются в ДНК хозяина и легко экспрессируются при образовании опухолей. Ti-плазмиды, содержащие или не содержащие чужеродной ДНК, могут вызвать трансформацию протопластов растений. По-видимому, такие исследования будут проводиться все более интенсивно.
ЛИТЕРАТУРА
Allen AL 尸” Moore T. S. jun.} Christensen M. (1980). Phytohormone changes in Bouteloua gracilis infected by vesicular-arbuscular mycorrizae. I. Cytokinin increases in the host plant, Canad. J. Bot., 58, 371—374.
Aviv D., Fluhr R., Edelman M., Galun E. (1980). Progeny analysis of the interspecific hybrids： Nicotiana tabacum (CKS)+Nicotiana sylvestris with respect to nuclear and chloroplast markers, Theor. appl. Genet., 56, 145—150.
Backman P. A., Rodriguez-Kabana R. (1975). A system for the growth and delivery of biological control agents to the soil, Phytopathology, 65, 819—821.
Beringer J. £, 1982. Microbial genetics and biological nitrogen fixation. In: Advances in Agricultural Microbiology (ed. Subba Rao N. S.), pp. 2—23, Oxford and IBM Publishing Co., New Delhi.
В tike у P. C, Cocking E. C. (1980). Isolation and properties of plant microplasts： newly identified subcellular units capable of wall synthesis and division into separate microcells, Eur. J. Cell Biol., 22, 502.
Bonnett H. T., Eriksson T, (1974). Transfer of algal chloroplasts of higher plants. Planta, 120, 71—79.
Brown M. E., 1982. Nitrogen fixation by free-living bacteria associated with plants — fact or fiction? In: Bacteria and Plants (eds. Rhodes-Roberts M. E. and Skinner F. A.), pp. 25—41, Academic Press, London.
Burton J. C. (1980). New developments in inoculating legumens. In: Recent Advances in Biological Nitrogen Fixation (ed. Subba Rao N. S.), pp. 380— 405, Edward Arnold, London.
Burton 丄 C., Curley R. L, (1965). Comparative efficiency of liquid and peatbase inoculants of field-grown soybeans {Glycine max), Agron. J., 57, 379— 381.,
Carr 丄 G. (1982). The production of foods and beverages from plant materials by micro-organisms. In： Bacteria and Plants (ed. Rhodes-Roberts M. E. and Skinner F. A.), pp. 155—167, Academic Press, London.
Cocking £". C. (1981). Opportunities from the use of protoplasts, Phil. Trans. Roy* Soc. Lond., B292, 557—568.
Coombs J. (1981). Biogas and power alcohol, Chemy Ind. 4 April, 223—229.
Cooper 4, 1979. The ABC of NET, Grower Books, London.
Corby H. D. £., 1975. A method of making a pure-culture, peat-type, legume inoculant, using a substitute for peat. In: Symbiotic Nitrogen Fixation in Plants (ed. Nutman P. S.), pp. 169—173, Cambridge University Press, Cambridge.
Corby H. D. £., 1980. The systematic value of leguminous root nodules. In: Advances in Legume Systematics, Part 2 (eds. Polhill R. M. and Raven P. H.), pp. 657—669, Royal Botanic Gardens, Kew.
Davey R. AL, Power J. B. (1975). Polyethylene glycol-induced uptake of microorganisms into higher plant protoplasts. An ultrastructural study, Plant Sci. Lett., 5, 269—274.
Deacon J. W.y 1983. Microbial Control of Plant Pests and Diseases, Aspects of Microbiology 7, Van Nostrand Reinhold (UK) Co., Ltd., Nottingham, England.
Dunican L. K., O'Gara E, Tierney A. A, 1976. Plasmid control of effectiveness in Rhizobium. Transfer of nitrogen fixing genes on a plasmid from Rhizobium trifolii to Klebsiella aerogenes. In: Symbiotic Nitrogen Fixation in Plants (ed. Nutman P. S.), pp. 77—90, Cambridge University Press, Cambridge.
Dye M.. 1979. The Rothamsted Rhizobium culture collection and inoculant use in the UK, Rothamsted Report for 1978, Part 2, 119—130.
Elmes R. P., Mosse B., 1980. Nutrient film technique, Rothamsted Report for 1979, Part I, 188.
Elmes R. P., Mosse B. (1984). Vesicular-arbuscular endomycorrhizal inoculum production. II. Experiments with maize (Zea mays} and other hosts in nutrient flow culture, Canad. J. Bot, 62, 1531—1536.
Fraser M. E. (1966). Pre-inoculation of lucerne seed, J. appl. Bacterio!., 29, 587—595.
Fraser M. E (1975). A method of culturing Rhizobium meliloti on porous granules to form a pre-inoculant for lucerne seed, J. appl. Bacteriol., 39, 345—351.
Fred Е R, Baldwin 丄 L., McCoy E, 1932. Root Nodule_ Bacteria and Leguminous Plants, University of Wisconsin Press, Madison, Wisconsin.
Hadar У., Chet /., Henis У. (1979). Biological control of Rhizoctonia solani damping-off with wheat bran culture of Trichoderma harzianumt Phytopatho* logy, 69, 64—68.
Hayman D. S. (1977). Mycorrhizal effects on white clover in relation to hill land improvement, ARC Res. Rev., 3, 82—85.
Hayman D. S. (1980). Mycorrhiza and crop production, Nature, 287, 487—488.
Hayman D. S” Mosse B. (1979). Improved growth of white clover in hill grasslands by mycorrhizal inoculation, Ann. appl. Biol., 93, 141—148.
Hayman D. S., Morris E 丄，Page R. /. (1981). Methods for inoculating field crops with mycorrhizal fungi, Ann. appl. Biol., 99, 241—253.
Hepburn A. G., 1982. The biology of the crown gall — a plant tumour induced by Agrobacterium tumefaciens. In： Bacteria and Plants (eds. Rhodes-Roberts M. E. and Skinner F. A.), pp. 101—113, Academic Press, London.
Hobson P. M, Feilden N. E. H. (1982). Production and use of biogas in agriculture, Prog. Energy Combust. Sci., 8, 135—158.
Kao K・ M, Michayluk M. R. (1974). A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts, Planta, 115, 355—367.
Kerr A. (1972). Biological control of crown gall: seed inoculation, J. appl. Bac- teriol., 35, 493—497.
Ke” A. (1980). Biological control of crown gall through production of agro- cin 84, Pl. Disease, 64, 25—30.
Khin Htay., Kerr A. (1974). Biological control of crown gall: seed and root inoculation, J. appl. Bacteriol., 37, 525—530.
Kumar A., Wilson D., Cocking £. S. (1981). Polypeptide composition of Fraction 1 protein of the somatic hybrid between Petunia parodii and Petunia par- vtflora, Biochem. Genet., 19, 255—261.
Lam S. (1975). Shoot formation in potato tuber discs in tissue culture, Am. Potato J., 52, 103—106.
Lawrie J. (1961). Natural Gas and Methane Sources, pp. 82—88, Chapman and Hall, London.
Liu S., Baker R. (1980). Mechanism of biological control in soil suppressive to Rhizoctonia solani, Phytopathology, 70, 404—412.
Menge 丄 A. (1983). Utilization of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in agriculture, Canad. J. Bot., 61, 1015—1024.
Menge 丄 4, Lembright H., Johnson E. L. V. (1977). Utilization of mycorrhizal fungi in citrus nurseries, Proc. Int. Soc. Citriculture, 1, 129—132.
Mosey F. £. (1982). New developments in the anaerobic treatment of industrial wastes, Wat. Pollut. Contr., 81, 540—552.
Munns D. M, Mosse B., 1980. Mineral nutrition of legume crops. In: Advances in Legume Science (eds. Summerfield R. J. and Bunting A. H.), pp. 115—125, Royal Botanic Gardens, Kew.
Murashige T., Skoog F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures, Physiologia PL, 15, 473—497.
Nemec S. (1980). Effects of 11 fungicides on endomycorrhizal development in sour orange, Canad. J. Bot., 58, 522—526.
New P. B., Ke/т A. (1972). Biological control of crown gall: field measurements and glasshouse experiments, J. appl. Bacteriol., 35, 279—287.
Noack 取.，1955. Biogas in der Landwirtschaft, Otto Elsner Verlagsgesellschaft, Darmstadt.
Pasveer A. (1959). A contribution to the development of the activated sludge process, J. Proc. Inst. Sewage Purif., 4, 436.
Phillips 丄 〃.，Hayman D. S. (1970). Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection, Trans. Br. mycol. Soc., 55, 158—161.
Polhill R. М., Raven Р. Н. (eds.), 1980. Advances in Legume Systematics, Royal Botanic Gardens, Kew.
Power J. A, Cummins S. E, Cocking E C. (1970). Fusion of isolated plant protoplasts, Nature, 225, 1016—1018.
Power /.占.，Davey M. R., 1979. Laboratory manual: Plant Protoplasts (isolation, fusion, culture, genetic transformation), Department of Botany, University of Nottingham, Nottingham.
Power 丄 В., Frearson £. M., Hayward C., Cocking E. C. (1975). Some consequences of the fusion and selective culture of Petunia and Parthenocissus protoplasts, Plant Sci. Lett., 5, 197—207.
Power /. A, Frearson E Л1., Hayward C.t George D., Evans P. K・，Berry S. £, Cocking £. C. (1976). Somatic hybridisation of Petunia hybrida and 尸.parodii, Nature, 263, 500—502.
Rishbeth 丄(1963). Stump protection against Fames annosus. III. Inoculation with Peniophora gigantea, Ann. appl. Biol,, 52, 63—77.
Roberts W. P., Tate M. E., Kerr A. (1977). Agrocin 84 is a 6-N-phosphoramidate of an adenine nucleotide analogue, Nature, 265, 379—381,
Robinson K・，1971. Aerobic treatment of agricultural wastes. In: Microbial Aspects of Pollution (eds. Sykes G. and Skinner F. A.), pp. 91—102, Academic Press, London.
Robinson ^. (1974). The use of aerobic processes for the stabilization of animal wastes, CRC Crit. Rev. Environ. Contr., 4, 193—220.
Robinson K・(1979). Developments in aerobic stabilization of animal wastes in Northeast Scotland: a review, Environ. Protec. Eng., 5, 127—143.
Roughley R.丄(1968). Some factors influencing the growth and survival of root nodule bacteria in peat culture, J. appl. Bacteriol., 31, 259—265.
Roughley R. /. (1970). The preparation and use of legume seed inoculants, Pl Soil., 32, 675—701.
Roughley R. /., Date R. 4, Walker M. //. (1966). Inoculating and lime pelleting legume seed, Agric. Gaz. N. S. W„ March, 142—146.
Roughley R.丄，Vincent /. M. (1967). Growth and survival of Rhizobium spp. in peat culture, J. appl. Bacteriol., 30, 362—376.
Santos 4 V. P. Dos, Ouika D. E, Cocking E. C, Davey M. R. (1980). Organogenesis and somatic ebbryogenesis in tissues derived from leaf protoplasts and leaf explants of Medicago sativa, Z. Pfl Physiol., 99, 261—270.
Schroth M. M, Hancock J. G. (1981). Selected topics in biological control Ann Rev. Microbiol., 33, 453—476.
Shanmugam K・ T・，Hennecke H., 1980. Microbial genetics and nitrogen fixation. In: Recent Advances in Biological Nitrogen Fixation (ed. Subba Rao N. S.), pp. 227—256, Edward Arnold, London.
Shephard /. F., Bidney D., Shahin f. (1980). Potato protoplasts in crop improvement, Science, 208, 17—24.
Shephard J. F., Totten R. E. (1977). Mesophyll cell protoplasts of potato. Isolation, proliferation and plant regeneration, Pl. Physiol., 60, 313—316.
Steinborn /., Roughley R. /. (1974). Sodium chloride as a cause of low numbers of Rhizobium in legume inoculants, J. Appl. Bacterio!,, 37, 93—99.
Stewart W. D. P. (ed.)T 1975. Nitrogen Fixation by Free-living Microorganisms, IBP 6, Cambridge University Press, Cambridge.
Streicher S., Gurney E., Valentine R. C. (1971). Transduction of the nitrogenfixation genes in Klebsiella pneumoniae, Proc, natn, Acad. Sci USA 68 1Г4—1177.■'*
Strijdom B. W., Deschodt С. C” 1975. Carriers of rhizobia and the effects on the survival of rhizobia. In: Symbiotic Nitrogen Fixation in Plants (ed. Nut- man P. S.), pp. 151—168, IBP 7, Cambridge University Press, Cambridge.
Thomas E. (1981). Plant regeneration from shoot culture-derived protoplasts of tetrapioid potato (Solanum tuberosum cv. Maris Bard), Plant Sci. Lett 23 81—88.'
Thomas £., Bright S.呼.几 Franklin J., Lancaster V. 4, Miflin В. Л, Gib* son R. (1982). Variation amongst protoplast-derived potato plants (Solanum tuberosum cv.《Maris Bard»). Theor. appl. Genet., 62, 65—68.
Thomas E, King P.丄，Potrykus /. (1979). Improvement of crop plants via single cells in vitro — an assessment, Z. Pfl Ziicht, 82, 1—30.,,
Weindling R. (1946). Microbial antagonism and disease control. Soil. Sci., 61, 23—30.
Wells H. D„ Bell D. K・，Jaworksi C. 4 (1972). Efficacy of Trichoderma har- zianum as a biocontrol for Sclerotium rolfsu^ Phytopathology, 62, 442—447.
Wenzel G., Schieder O., Przewozny T., Sopor у £ К., Melchers G. (1979). Compa、 rison of single cell culture-derived Solarium tuberosum L. plants and a model for their application in breeding programs, Theor. appl. Genet., 55, 49—55.
Wernicke 步.，Brettell R. (1980), Somatic embryogenesis from Sorghum bicolor leaves, Nature, 287, 138—139.
Vincent 丄 M. (1970). A Manual for the Practical Study of the Rootnodule Bacteria, IBP Handbook, No. 15, Blackwell Scientific Publications, Oxford.
Zaenen /., van Larebeke M, Teuchy H.t van Montagu M, Schell J. (1974). Supercoiled circular DNA in crown gall inducing Agrobacterium strains, J. Mol. Biol, 86, 109—127.
Химическая технология и биотехнология
Г. Хамер
ЮЛ. Введение
Основные точки соприкосновения между химической технологией и биотехнологией лежат в области изучения, разработки, проектирования, создания и осуществления процессов микробиологического производства продуктов, качественно превосходящих сырье, из которого они получены. Как и всякая другая технология, биотехнология впитала в себя достижения целого ряда наук, и круг решаемых с ее помощью задач определяется относительным вкладом в нее отдельных дисциплин. Сегодня основная проблема во взаимосвязях между биотехнологией и химической технологией — это четкое определение сфер приложения. В случае микробиологических процессов мы видим две возможности: подход, основанный на биохимической технологии, и подход, основанный на физиологии микроорганизмов. Приверженцы химической технологии часто отдавали предпочтение первому из них, но надо сказать, что за последние 25 лет таким путем не удалось разработать способы коренного улучшения микробиологических процессов, которые принесли бы такой же успех, какой был достигнут химическим производством в целом или в нефтеперерабатывающей промышленности на основе принципов химической технологии. Разумеется, по крайней мере частично это можно объяснить консерватизмом ряда производств, основанных на микробиологических процессах, а также несогласованностью и непоследовательностью в их развитии. Основной же причиной является относительно небольшой масштаб упомянутых процессов. Чтобы получить право на независимое существование, биохимическая инженерия должна разработать гораздо более эффективные методы решения проблем, связанных с осуществлением микробиологических процессов и переработкой, что в свою очередь должно выразиться в значительном экономическом эффекте. Из самой сути биотехнологии, опирающейся главным образом на физиологию микроорганизмов, следует, что оптимизацией процессов микробиологического
производства должны заниматься узкие специалисты, т. е. микробиологи, изучающие именно данный процесс, и инженеры-химики. При этом последние не обязательно должны детально разбираться в микробиологической стороне проблемы. Такой подход означает, что микробиолог или биотехнолог, помимо глубоких знаний физиологических проблем, связанных с использованием различных микроорганизмов, и навыков их решения, должен обладать опытом сотрудничества с химиками-технологами. Можно надеяться, что благодаря плодотворному союзу между биологами-исследователями и химиками-технологами в ближайшее десятилетие будут созданы предпосылки как для технологических нововведений, так и для экономического прогресса в области производств, основанных на микробиологических процессах. Главная цель этой главы ——способствовать развитию более эффективных взаимосвязей между биологами и химиками-технологами, и следовательно, повышению экономичности как уже существующих, так и новых биотехнологических производств.
Многие из биотехнологических производств по природе своей строго традиционны и служат человечеству уже много столетий. К их числу относятся производство спиртных напитков, ферментированных молочных, соевых и рыбных продуктов. В этих отраслях промышленности качество и ценность продукта чаще оцениваются по тонким различиям во вкусе и запахе, чем по какому-либо иному легче поддающемуся определению критерию. Для многих традиционных продуктов подобные критерии качества останутся важными и в будущем, однако маловероятно, чтобы так же оценивались и новые продукты. Спрос на какой- либо продукт будет зависеть главным образом от его функциональных качеств, общей стоимости его производства и ее возможных неконтролируемых колебаний (например, из-за изменений стоимости сырья и энергии).
Обычно расширение сферы применения биотехнологии происходит в ответ на неотложные запросы практики, а не в результате открытия нового способа синтеза некоего нового соединения при участии какого-то вновь выделенного микроорганизма. Вот ряд проблем, необходимость решения которых привела к развитию исследований основных микробиологических процессов и к созданию программ технических разработок.
Начиная с конца 60-х гг. Европа и Америка столкнулись бы с катастрофическим уменьшением содержания белковых компонентов в кормах для животных, если бы не были найдены альтернативные способы их получения.
Начиная с середины 70-х гг. истощение запасов или сокращение добычи жидкого ископаемого топлива привели к повышению цен на него. Эта цены так возросли, что в большинстве
развитых и развивающихся стран пришлось получать жидкое топливо из альтернативных местных источников.
В будущем возможность максимального извлечения нефти из разведанных месторождений сырой нефти будет зависеть от синтеза новых химических соединений, позволяющих увеличить нефтедобычу.
Попытки решения тех проблем, которые указаны в первом примере, привели к интенсивному развитию исследований и разработке методов получения белка одноклеточных организмов. Для решения второй задачи потребовалось создание эффективных способов превращения возобновляемых местных источников биомассы в этанол и/или метан. Для решения третьей из упомянутых проблем сначала попытались использовать синтетические полимеры, но не получили желаемого результата; тогда основные усилия были направлены на поиски и производство биополимеров, по своим свойствам пригодных для повышения нефтедобычи.
Экономический эффект любой из этих программ определялся и продолжает определяться тем, как долго будет существовать спрос на тот или иной продукт, а также тем, не изменится ли политическая ситуация и, следовательно, те предпосылки, которые использовались для оценки спроса.
Приведем три примера микробиологических производств, появившихся в результате открытия нового пути синтеза новых продуктов и никак не связанных с проблемами спроса. Речь идет о предложениях по использованию для производства пластмасс поли-р-гидроксимасляной кислоты, синтезируемой Alcali- genes eatrophus; о получении эмульгаторов при участии многих бактерий, окисляющих углеводороды; об инсектицидах, продуцируемых Bacillus thuringiensis.
Взаимоотношения между биотехнологами и химиками-технологами лучше всего прослеживаются на примере производства основных продуктов промышленных микробиологических процессов. В химической промышленности различают продукты тонкого химического синтеза, продукты маломасштабного и валового синтеза. При создании производственных установок для получения продуктов, относящихся к каждой из этих трех категорий, используются совершенно разные подходы. Продукты тонкого химического синтеза получают обычно в реакторах 哈 риодического действия, используемых также и для производства многих сходных веществ. Чаще всего производительность одной установки лежит в интервале 100 кг/г.— 100 т/г. ЗначИ' тельную часть стоимости продукта составляют затраты на очистку и анализы, направленные на то, чтобы по своему качеству продукт соответствовал предъявляемым к нему требованиям. Согласно принятой классификации, к продуктам тон-
кого химического синтеза микробного происхождения относятся вакцины, витамины, б^нуклеотиды, некоторые аминокислоты^ антибиотики и ряд ферментов, предназначенных для использования в медицине. Химические продукты маломасштабного синтеза обычно производятся в количестве 100 т/г.——20 000 т/г. Чаще всего к их качеству предъявляются менее строгие требова* ния, чем к качеству продуктов тонкого химического синтеза. Обычно их получают на установках, предназначенных только для данного продукта, однако непрерывный процесс при этом используется не всегда. К продуктам данной категории, производимым микробиологическим способом, относятся глутаминовая кислота, широко использующаяся как усилитель вкуса, антибиотики, применяющиеся для защиты сельскохозяйственных культур, ферменты, предназначенные для использования в про- мышленности, органические кислоты, в частности лимонная, молочная и глюконовая; раньше сюда же относили такие раство* рители, как ацетон и бутанол. В эту же категорию можно включить многие пищевые продукты и напитки, полученные путем ферментации. И наконец, продукты третьей категории производят обычно на установках непрерывного действия, производительность которых превышает 20000 т/г. В этом случае рыночная стоимость продукта определяется простотой его получения и общей производительностью установки, а не жесткими требованиями к качеству. К этой категории продуктов микробного происхождения принадлежат БОО, различные виды топлива, например биогаз (метан), спирт, использующийся как горючее (этанол), и биополимеры, применяющиеся для более полного извлечения нефти. Кроме того, валовым продуктом можно, конечно, считать и воду, сбрасываемую из установок для биологической очистки сточных вод и отходов, где идут самые крупномасштабные непрерывные микробиологические процессы. В этих случаях конечный продукт не имеет обычно прямой экономической ценности, но крайне важен для благополучия и процветания общества. С увеличением масштабов производства расширяются и взаимосвязи между биотехнологией и химической технологией. Однако даже при получении продуктов тонкого химического синтеза эти взаимосвязи должны стать еще более глубокими, если мы хотим разработать особо эффективные технологии.
Основная задача практической химической технологии состоит в создании производственных систем, с помощью которых, используя достижения науки и техники, из сырья и материалов можно экономичным путем получать продукты, пользующиеся спросом. В биотехнологических процессах применяется' специальное оборудование для превращения сырья в готовую продук-
цию с помощью биохимических реакций, фазовых переходов, агломерации, разделения, экстракции, высушивания и т. д.
Предприниматель, вкладывая капитал в какую-либо отрасль, ставит своей целью получить максимальную прибыль. Если для производства какого-то продукта предполагается использовать микробиологический процесс, то прежде всего необходимо сравнить его с альтернативными процессами, а в некоторых случаях—и с другими источниками получения этого продукта (например, если речь идет о белковых ингредиентах кормов, то это может быть сельское хозяйство).
Экономическая оценка промышленного производства и производственных взаимосвязей, имеющая важнейшее значение, сопряжена со многими трудностями. Методика при этом, как правило, такова, что оценки занижаются по сравнению с требованиями, выдвигаемыми лицами, которые желают оценить то или иное производство или каналы перемещения капиталов. Однако излишняя жесткость в оценке перспективности нового производства может привести к тому, что эта сфера деятельности перестанет представлять для конкурентов коммерческий интерес.
В зависимости от степени финансового риска общую сумму капиталовложений в любое производство можно разделить на три части: 1) основной капитал в сфере непосредственной обработки сырья, т. е. капиталовложения внутри отрасли; 2) капиталовложения во вспомогательные подразделения, т. е. инвестиции за пределами отрасли; 3) оборотный капитал.
Взятые вместе, эти капиталовложения составляют сумму, которой рискует предприниматель, осваивающий новую сферу производства. Наибольшая степень риска соответствует основному капиталу, наименьшая — оборотному.
Накладными расходами называются затраты, связанные с бесперебойным функционированием производственного процесса. Их тоже можно разделить на три части: 1) расходы, пропорциональные основным капиталовложениям, т. е. затраты на эксплуатацию, страхование и управление; они не зависят от производительности труда и могут быть выражены в процентах от основного капитала； 2) расходы на сырье, коммунальные службы, химические реактивы и прочие материалы; расходы, связанные с контролем за качеством, финансовыми операциями, покупкой патентов, лицензий и технологий; эти затраты зависят от производительности; 3) прямые затраты на содержание управленческого персонала, включающие помимо выплаты жалования административные накладные расходы и расходы на надзор.
Валовая прибыль, получаемая в результате функционирования конкретного предприятия, исчисляется как разность между чистым годовым доходом (за вычетом издержек обращения.
премий и издержек сбыта продукции) и годовой суммой себестоимости. Чистая прибыль ——это ожидаемая выручка за год за вычетом амортизации и налогов. Амортизационный регламент порой очень сложен, его условия оговариваются государственными инстанциями и зависят от местоположения предприятия; зачастую налоговые стимулы требуют оптимизации разрешенного амортизационного регламента.
Оценивая возможность увеличения рентабельности производства путем интеграции и оптимизации производственного процесса, необходимо отчетливо понимать, какие технологические факторы наиболее важны с точки зрения экономики. В случае микробиологического производства это могут быть либо собственно микробиологические, либо производственно-технологические факторы. Прежде чем мы перейдем к их рассмотрению, попытаемся вначале пояснить, что понимается под интеграцией производства.
В рамках традиционной практики проектирования производства при разработке путей оптимизации отдельных процессов почти не уделяется внимание их интеграции в единое производство. За последнее десятилетие во многих странах несколько раз резко повышались цены на сырую нефть — главный источник энергии для промышленности — и нефтепродукты. До этих акций — в значительной степени политических — в основе стратегии нефтеперерабатывающей промышленности лежала предпосылка, согласно которой стоимость продукта должна снижаться с увеличением масштабов производства. Рост цен на топливо и сырье, а также связанное с этим удорожание строительства предприятий привели к тому, что этот принцип едва не рухнул; становилась все более очевидной необходимость интеграции производства для снижения капиталовложений и экономии энергии и сырья. Интеграция производства может охватывать как выпуск изделий в рамках внутриотраслевой технологии, так и взаимосвязь между производствами внутри отрасли и вне ее. Мы остановимся подробнее на первом варианте. Однако вначале сделаем несколько замечаний по поводу взаимосвязей второго типа, особенно характерных для промышленного микробиологического производства: в чем трудность развития таких взаимосвязей на предприятиях, первоначально созданных для валового химического производства, на основе обычной технологии?
Промышленные микробиологические процессы протекают в основном при низких температурах, обычно ниже 40 ℃. Для этого необходимо много воды (как в качестве хладагента, так и в качестве высокочистого рабочего тела), а также значительные количества высокочистого рабочего пара и воздуха. Сырье и готовые продукты должны храниться в условиях, при которых
их загрязнение было бы минимальным. На предприятиях микробиологической промышленности предъявляются повышенные требования к гигиене производства. Необходимо особым способом перерабатывать отходы и осуществлять серьезный контроль за качеством продуктов. Все эти условия очень трудно выполнить на типовых предприятиях для валового химического синтеза, в частности на нефтехимических заводах. Для этого приходится—в основном в пределах отрасли — проводить существенную перестройку производства, что требует новых капиталовложений и приводит к увеличению финансового риска. В целом экономика микробиологического производства явно улучшается, когда несколько таких производств обслуживаются централизованными мощностями, должным образом оптимизированными и ориентированными не только на узкие внутриотраслевые нужды.
Наиболее важными для промышленного микробиологического производства являются следующие микробиологические факторы: 1) коэффициенты выхода продукта или продуктов; 2) скорости роста и/или скорости получения конечного продукта; 3) сродство культуры-продуцента к углеродным энергетическим субстратам; 4) стабильность и неприхотливость культуры продуцента.
К наиболее важным технологическим факторам относятся: 1) конверсия сырья и степень конверсии; 2) производительность; 3) концентрации продукта.
В высокотехнологичных и рентабельных процессах эти микробиологические технологические факторы тесно взаимосвязаны.
Принципы и методология изучения рентабельности химических предприятий обсуждались Раддом и Уотсоном (Rudd, Watson, 1968).
Микробиологические факторы, влияющие на производительность и экономичность процесса
В любом микробиологическом процессе ключевую роль играет культура используемых микроорганизмов. В промышленной микробиологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты, бактерии и водоросли в виде чистых или смешанных культур. В традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдается смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных процессов — монокультурам, выращиваемым в асептических условиях. Говорить об идеальных культурах можно лишь в самых общих чертах. Следует отдавать себе отчет в том, что идеального микроорганизма не существует, а разнообразие продуктов, которые можно получать
2G-1344
с помощью микроорганизмов, определяется разнообразием самих микроорганизмов и их субстратов. Впрочем, возможно, когда-нибудь мы и сумеем создавать такие идеальные микроорганизмы с помощью генетической инженерии и тем самым опровергнем высказанное выше утверждение. Большинство используемых сегодня культур получено из природных источников; однако эти культуры были затем улучшены или путем выращивания в условиях, характерных для данного процесса (для повышения выхода биомассы и первичных метаболитов), или с помощью мутагенеза (для производства вторичных метаболитов).
Приведем основные уравнения, описывающие рост микроорганизмов, в частности одноклеточных, в ферментерах и в других микробиологических реакторах. Для выращивания любой культуры необходимы: 1) жизнеспособный посевной материал; 2) источники энергии и углерода; 3) питательные вещества для синтеза биомассы; 4) отсутствие ингибиторов роста; 5) соответствующие физико-химические условия.
Если все эти требования выполнены, то скорость роста (увеличения биомассы) одноклеточных микроорганизмов с бинарным делением, размножающихся в условиях хорошо перемешиваемой периодической культуры, будет пропорциональна концентрации микробной биомассы, т. е.
где dx/dt — скорость роста,科一коэффициент пропорциональности, обычно называемый удельной скоростью роста, х — концентрация биомассы (на сухой вес). Если ц ——постоянная величина, уравнение (1) можно преобразовать и проинтегрировать:
1пх = 1пх0 + р./,(2)
где %о — концентрация микробной биомассы в момент времени / = 0, / — время. Уравнение (2) можно переписать в виде
In (х/х0) = ^,(3)
откуда
х = х0 е^.(4)
Если построить график зависимости In% от времени, то мы получим прямую с наклоном 氏 Такой рост называют экспоненциальным или логарифмическим; он имеет место тогда, когда состав микробной биомассы и условия окружающей среды остаются постоянными. Приведенные выше уравнения применимы и к смешанным культурам, в которых одноклеточные организмы равномерно распределены в культуральной среде.
При описании роста микроорганизмов с бинарным делением в периодических культурах широко используется величина, характеризующая время удвоения биомассы. Связь между удельной скоростью роста а и временем удвоения биомассы % можно найти из уравнения (3), заменив % на 2х0, a f — на /у:
Эффективность роста: коэффициент выхода биомассы
При любой количественной оценке роста микроорганизмов и/или синтеза конечного продукта необходимо связать образование микробной биомассы и продуктов с расходованием субстратов и питательных веществ. Для описания соотношения между ростом микроорганизмов (в расчете на сухой вес) и потреблением углеродного энергетического субстрата были введены понятия урожая бактериальной культуры и выхода биомассы (Monody 1942). В математической форме коэффициент выхода микробной биомассы Yx/s можно представить следующим образом:
где ds — бесконечно малое уменьшение концентрации субстрата^ соответствующее бесконечно малому увеличению концентрации микробной биомассы dx. Знак минус указывает, что знаки изменения х и s противоположны. При постоянных условиях роста коэффициент выхода остается постоянным, т. е. если х。 и So — концентрации субстрата и биомассы в момент времени /о, а к и s — в момент I, то
(尤一％) = Kc/s (s()—$)•(7)
В общем случае коэффициент выхода биомассы является переменной величиной, зависящей от условий культивирования. Вариабельность этого коэффициента очень важна с точки зрения оптимизации процесса. Понятие коэффициента выхода можно распространить на все разнообразие питательных веществ, используемых растущими микроорганизмами, и на все получающиеся продукты. Кроме того, при оценке относительной эффективности биохимических путей, лежащих в основе роста и метаболизма микроорганизмов, широко применяют понятия молярного урожая биомассы и выхода, когда учитывается число электронов, поступающих от субстратов, и суммарное количество потребляемой энергии.
Когда микроорганизмы растут на хорошо растворимых субстратах, коэффициент выхода и коэффициент конверсии совпа-
дают; однако при росте на плохо растворимых и несмешиваю- Щихся субстратах они могут заметно различаться. Коэффициент конверсии можно определить как количество микробной биомассы, образующейся на единицу массы субстрата.
Для описания процесса образования какого-либо продукта микроорганизмом, растущим на данном субстрате, можно воспользоваться уравнениями, аналогичными (6) и (7):
> (8)
(Р — Ро) = Fр/з (Sq — 5), (9) где Yp/s — коэффициент выхода продукта, dp — бесконечно ма- лое увеличение концентрации продукта, ро и р — соответственно исходная концентрация продукта и концентрация его в момент времени /.
Поток углерода
а Поток энеогии
Рис. 10.1. Потоки углерода и энергии при гетеротрофном росте микробов и образовании продукта.
Для роста любого микроорганизма необходимы источники углерода и энергии. В случае гетеротрофных микроорганизмов это одно соединение или смесь углеродсодержащих соединений, которые удовлетворяют обе эти потребности. У автотрофных микроорганизмов углеродные и энергетические субстраты различаются. Для гетеротрофных микроорганизмов и коэффициент выхода биомассы, и коэффициент выхода продукта зависят от распределения энергии и углерода между процессами анаболиз- ма и катаболизма. На рис. 10.1 представлена диаграмма распределения потоков энергии и углерода при росте гетеротрофных микроорганизмов и образовании ими соответствующего
продукта. Коэффициенты выходов зависят от природы источника углерода и энергии, а также от биохимических особенностей данного микроорганизма; когда источник энергии и углерода подавляет рост, коэффициенты выхода зависят также и от его концентрации. В случае источника углерода и энергии с относительно высоким содержанием углерода (по сравнению с другими элементами) и, следовательно, с высокой энергетической константой при аэробном окислении наблюдается нарушение равновесия между высвобождением энергии и потреблением углерода; это ограничивает максимальный коэффициент выхода биомассы.
К этой категории углеродных энергетических субстратов относятся углеводороды. Избыточная энергия, высвобождаемая при их использовании, рассеивается в виде тепла и приводит к необходимости охлаждения микробиологических реакторов.
Скорость потребления определенного субстрата растущими культурами часто представляют в виде
=(10)
dt
где q — метаболический коэффициент, который очень широко используется в микробиологии, особенно для кислорода и углеродных энергетических субстратов. Подставив в это уравнение выражение для х из уравнения (1), получим
一丄=上，(11)
ds q
откуда с помощью уравнения (6) имеем
4=(12) У K/S
Кинетика роста и образования продукта
Экспоненциальная модель, описываемая уравнением (1), представляет собой лишь одну из нескольких относительно широко распространенных моделей роста микроорганизмов； каждая из таких моделей применима к специфическим физическим условиям или той или иной морфологии биомассы. Другими альтернативными моделями роста являются линейная модель и модель кубического корня. Первая из них относится к случаю, когда рост лимитируется диффузией субстрата или какого-либо питательного вещества. Вторая модель часто применяется при описании образования осадков (в случае плесневых грибов) или бактериальных хлопьев, которые разрастаются только по периферии. На самом деле она представляет собой комбинацию
модели экспоненциального роста и модели, в которой лимита* рующим фактором является перенос вещества. Модель кубического корня адекватно описывает образование мицелиальных осадков в периодической культуре, однако малопригодна для случая непрерывной культуры, поскольку не учитывает разрушение хлопьев в биореакторе под действием гидродинамических сил.
Если для периодической культуры наблюдается экспоненци* альный рост, то это означает, что для широкого круга субстратов и в широком диапазоне их концентраций скорость роста фактически не зависит от концентрации субстрата. В этом случае процесс роста следует кинетике нулевого порядка и можно ожидать, что потребление субстрата будет подчиняться следующему уравнению ферментативной кинетики:
где «т — максимальный метаболический коэффициент при s》Ks> Ks — константа насыщения, эквивалентная константе А1ихаэли- са — Ментен в ферментативной кинетике. Подставив вместо q и «т выражения, полученные из (12), мы придем к хорошо известному соотношению Моно:
График этой функции представлен на рис. 10.2. Соотношение Моно широко используется не только потому, что дает универ-График этой функции представлен на рис. 10.2. Соотношение Моно широко используется не только потому, что дает универ-Рис. 10.2. Графическое представление соотношения Моно, описывающего зависимость удельной константы скорости роста от концентрации лимитирующего субстрата.Рис. 10.2. Графическое представление соотношения Моно, описывающего зависимость удельной константы скорости роста от концентрации лимитирующего субстрата.=■Piood s^uo--oi^ в匸己一。工0工TPHq 二an”=■Piood s^uo--oi^ в匸己一。工0工TPHq 二an”
График этой функции представлен на рис. 10.2. Соотношение Моно широко используется не только потому, что дает универ-
График этой функции представлен на рис. 10.2. Соотношение Моно широко используется не только потому, что дает универ-
Рис. 10.2. Графическое представление соотношения Моно, описывающего зависимость удельной константы скорости роста от концентрации лимитирующего субстрата.
Рис. 10.2. Графическое представление соотношения Моно, описывающего зависимость удельной константы скорости роста от концентрации лимитирующего субстрата.
=■Piood s^uo--oi^ в匸己一。工0工TPHq 二an”
=■Piood s^uo--oi^ в匸己一。工0工TPHq 二an”
сальное описание кинетики роста микроорганизмов, но и благодаря своей простоте. Для оценки цт и К§ (последняя из этих величин обратно пропорциональна сродству микроорганизмов к определенному субстрату) уравнение (14) можно преобразовать следующим образом:
—=. (15) 卩 S卩m 卩m
Таким образом, график зависимосоти l/科 от 1/s (т. е. график Лайнуивера — Бэрка) является прямой и пересекает ось абсцисс в точке —1/К§, а ось ординат — в точке 1/цт. Данных о значениях константы насыщения К§ очень немного. Для углеродных энергетических субстратов и для минеральных питательных веществ значение Ks обычно составляют 〜IL М, а для кислорода ~10一6一ю~5 М.
Рост микроорганизмов (прирост биомассы) в промышленной установке можно описать с помощью уравнений (1), (14) и (7), к которым нужно еще добавить уравнения, описывающие потоки в реакторе:
dxdtdxdt卩％卩％(1)(1)Km SKm S(S + Ks)(S + Ks)(% — %Q)=匕/s(S() — S)・(% — %Q)=匕/s(S() — S)・(14)(7)(14)(7)
dx
dt
dx
dt
卩％
卩％
(1)
(1)
Km S
Km S
(S + Ks)
(S + Ks)
(% — %Q)=匕/s(S() — S)・
(% — %Q)=匕/s(S() — S)・
(14)
(7)
(14)
(7)
Если при этом происходит образование какого-то продукта, то нужно использовать еще и уравнение (9):
(Р—%) = Fp/s(Sq—s)・ (9)
Однако образование микробных продуктов отнюдь не обязательно связано с ростом. Поэтому, прежде чем применять те или иные кинетические уравнения для анализа процессов в реакторе, необходимо установить, какая именно взаимосвязь существует между образованием продукта и ростом микроорганизмов.
Пожалуй, наиболее полезная классификация процессов образования продукта в периодических культурах была предложена более двадцати пяти лет назад Гэйденом (Gaden, 1959). Согласно этой классификации, все процессы можно разделить на три основные группы, которые обозначают как процессы типа I, II, III.
В процессах типа I основной продукт образуется в ходе реакций первичного энергетического метаболизма, когда между потреблением субстрата и образованием продукта существует постоянное стехиометрическое соотношение, метаболические пути представляют собой цепь последовательных реакций, а ско-
рость любого процесса имеет один максимум, обычно совпадающий с максимумом для других процессов. Типичными примерами процессов типа 1 служат образование этанола, глюконовой и молочной кислот из глюкозы, а также, разумеется, образование микробной биомассы.
В процессах типа II основной продукт образуется в ходе реакций энергетического метаболизма непрямым путем: либо в ходе побочных реакций, либо в результате последующего взаимодействия между прямыми продуктами метаболизма. Кинетические кривые имеют сложный вид, причем максимумы скоростей различных процессов не совпадают. Типичными примерами процессов типа II являются образование лимонной и итаконовой кислот, а также некоторых аминокислот.
К процессам типа III относятся те, в которых основной продукт образуется не в результате энергетического метаболизма^ а независимым путем. В таких процессах рост и метаболическая активность достигают максимума на ранних этапах периодического процесса, а максимум образования интересующего нас продукта приходится на более поздние стадии, когда окислительная активность снижается. Продукты, образующиеся в ходе таких процессов, называются вторичными метаболитами； это, например, антибиотики пенициллин и стрептомицин.
Три этих типа процессов схематически представлены на рис. 10.3. Совершенно очевидно, что подобная классификация была принята только из соображений удобства и не является ни совершенной, ни всеобъемлющей. Существуют процессы с совсем иными характеристиками, протекающие в средах разного состава и при разных условиях. Отметим, что замена штамма мало сказывается на общем характере кинетических кривых. Впрочем, известны и исключения, особенно в процессах типа III. Это наводит на мысль, что по мере усложнения биосинтетических реакций, в ходе которых образуется данный продукт, данный тип процессов можно подразделить на более мелкие классы.
Обратимся теперь к непрерывным микробиологическим процессам. Чтобы обеспечить протекание процесса в оптимальных условиях стационарного состояния, необходимо располагать соответствующими кинетическими данными. Если в условиях периодической культуры процесс -относился к типу I, то необходимые условия для непрерывного культивирования можно теоретически определить прямо из данных для периодического процесса. В целом процессы такого типа лучше всего протекают в стационарных условиях в одностадийном биореакторе с полным перемешиванием. Те процессы, для которых в условиях периодической культуры характерны кинетики типа II или III, при непрерывном культивировании, по всей видимости, лучше всего осуществлять в многостадийных последовательных биореакто-
Время
рис юз Кинетические кривые для периодического процесса ферментации, приложенные Гэйденом (Gaden, 1959). Штриховые кривые-рост, пунктирные—использование субстрата, сплошные—« образование продукта.
pax. В этом случае можно так подобрать условия, чтобы скорость роста и связанный с ним энергетический метаболизм достигали максимума на одной стадии, а образование продукта —— на другой. Прежде чем переводить такие процессы из периодических в непрерывные, очень важно выяснить соотношения между скоростями отдельных процессов и основными контролируемыми переменными.
В настоящее время некоторые процессы, характеризующиеся кинетикой типа I в условиях периодической культуры, осуществляются как непрерывные; для процессов же с кинетикой ти* па II и III известны лишь единичные примеры такого рода. Впрочем, эти процессы находят в последнее время все более широкое применение именно при периодическом поступлении питательных веществ.
Сродство к субстрату и рост микроорганизмов
При анализе роста культур в биотехнологических процессах необходимо учитывать остаточную концентрацию питательных веществ (субстратов), конкурентоспособность микроорганизмов и особенности их роста на смешанных углеродных энергетических субстратах. Первый из этих факторов имеет два важных аспекта. Один из них экономический, связанный с полнотой использования субстрата; второй касается качества продукта, его чистоты и нетоксичности, поскольку остатки субстрата попадают в конечный продукт. Полнота использования субстрата, ко- торый является лимитирующим в периодической или непрерывной культуре, определяется сродством к нему данных микроорганизмов.
По-видимому, наиболее известной кинетической моделью ферментативных процессов является модель Михаэлиса — Ментен. Реакция фермента с субстратом описывается следующим уравнением:
E + S^E—S 厶 Е+Р, (16)
где Е — фермент, S — субстрат, Е—S — фермент-субстратный комплекс, Р ——продукт,方内——константа скорости первой реакции в прямом направлении, k~\ — константа скорости первой реакции в обратном направлении,々2 一константа скорости второй реакции, которая считается необратимой. Изменение концентрации фермент-субстратного комплекса описывается следующим уравнением:
-^- = %i (е—с) s—й-1 с—电 с, (17)
где е — концентрация фермента, с ——концентрация фермент-суб- ^тратного комплекса, s — концентрация субстрата. Если s3>e, то для стационарного состояния
——.(18)
Для ферментативной реакции, описываемой уравнением (16), скорость образования продукта и равна
О =々 С =自 es°max S UmaxS Л g\
一 2 一 [(& + 局)/储11 十 5工+ 电/砧)+ 5кm+S )
где Umax—максимальная скорость образования продукта, т. е. скорость, при которой весь фермент входит в состав фермент- субстратного комплекса, К$ — константа равновесия для реакции диссоциации фермент-субстратного комплекса, Км=К$ + +々2/々+1 — константа Михаэлиса. Когда скорость образования продукта определяется константой 々2, т. е.右2之左+i, то
Km = G(20)
При выполнении условия (20) величина Км обратно пропорциональна сродству фермента к субстрату: чем меньше Км, тем выше сродство. Если мы заменим величины о, итах и Км в (19) на 卩，цт и Ks соответственно, то получим соотношение Моно (14), которое уже было введено нами ранее и графически представлено на рис. 10.2. Микроорганизмы, для которых кривая зависимости между р, н $ имеет большой начальный наклон, обладают высоким сродством к лимитирующему субстрату. И наоборот, микроорганизмы, для которых эта кривая пологая, обладают низким сродством, и в таких культурах будут наблюдаться более высокие остаточные концентрации субстрата.
При непрерывном культивировании в хемостате конкурен- дия между двумя видами микроорганизмов за один лимитирующий субстрат определяется обычно именно их сродством к этому ■субстрату, а не максимальной удельной константой скорости роста цт. При стационарном режиме в простом хемостате без повторного использования биомассы концентрация лимитирующего субстрата равна
三一^7， (21)
где D — скорость разбавления. Из этого соотношения видно, что концентрация лимитирующего субстрата в стационарном состоянии зависит от скорости образования клеток за счет роста, которая в точности равна скорости разбавления, и от параметров,
характеризующих рост данного микроорганизма. Ясно, что параметры, характеризующие рост разных микроорганизмов на одном и том же субстрате, вряд ли будут одинаковы. Предположим, что мы имеем культуру микроорганизмов А и В. Построив график зависимости удельной константы скорости роста 卩 от концентрации лимитирующего субстрата s, мы получим два разных случая (рис. 10.4,Л и 5). В ситуации, изображенной
Рис. 10.4. Соотношение Моно для культуры, представляющей собой смесь микроорганизмов А и В, которые растут на одном лимитирующем субстрате (Harder et al., 1977). Л. |imA>NmB, ^sA<^sв. А |ЛтА<Нтв, ^sA<^sв. В хемостате при обеих степенях разбавления Da и Рь А будет задерживаться, а В — вымываться.Рис. 10.4. Соотношение Моно для культуры, представляющей собой смесь микроорганизмов А и В, которые растут на одном лимитирующем субстрате (Harder et al., 1977). Л. |imA>NmB, ^sA<^sв. А |ЛтА<Нтв, ^sA<^sв. В хемостате при обеих степенях разбавления Da и Рь А будет задерживаться, а В — вымываться.
Рис. 10.4. Соотношение Моно для культуры, представляющей собой смесь микроорганизмов А и В, которые растут на одном лимитирующем субстрате (Harder et al., 1977). Л. |imA>NmB, ^sA<^sв. А |ЛтА<Нтв, ^sA<^sв. В хемостате при обеих степенях разбавления Da и Рь А будет задерживаться, а В — вымываться.
Рис. 10.4. Соотношение Моно для культуры, представляющей собой смесь микроорганизмов А и В, которые растут на одном лимитирующем субстрате (Harder et al., 1977). Л. |imA>NmB, ^sA<^sв. А |ЛтА<Нтв, ^sA<^sв. В хемостате при обеих степенях разбавления Da и Рь А будет задерживаться, а В — вымываться.
на рис. 10.4, Л, для микроорганизма А при любой данной скорости разбавления (скорости роста) будет наблюдаться более низкая концентрация лимитирующего субстрата, чем для микроорганизма В при той же скорости разбавления (скорости роста). Следовательно, в хемостате, где рост двух видов микроорганизмов А и В лимитируется одним и тем же субстратом, А всегда будет вытеснять В, поскольку последний не способен сохранять достаточно высокую скорость роста при той концентрации субстрата, которая наблюдается для вида А, даже если максимальная удельная скорость роста для В не была превышена. Напротив, в ситуации, изображенной на рис. 10.4,5, относительная конкурентоспособность двух видов микроорганизмов, растущих в хемостате на одном лимитирующем субстрате, будет зависеть от степени разбавления. Подобный анализ конкурентного роста в хемостатах можно распространить и на многокомпонентные смешанные микробные популяции, однако такая экстраполяция не всегда оказывается возможной, поскольку в
сложных смешанных культурах могут существовать несколько другие взаимоотношения. Кроме того, в смешанных культурах, применяющихся в биотехнологических процессах, использовать основной субстрат обычно может только один вид микроорганизмов из всех присутствующих, а другие лишь модифицируют среду с тем, чтобы оптимизировать рост основного вида, особенно если этот последний слишком прихотлив.
Вообще говоря, любой гетеротрофный микроорганизм способен расти на самых разных субстратах — источниках углерода и энергии. Большинство углеводов служат субстратом для очень широкого спектра микроорганизмов; для углеводородов этот спектр уже; на некоторых синтетических органических соединениях способны расти лишь очень немногие микроорганизмы, а большинство таких соединений вообще не могут служить субстратами. Один из основных вопросов, касающихся использования смешанных субстратов данным гетеротрофным штаммом, состоит в том, как расходуются эти субстраты — одновременно (конкурентным образом) или последовательно.
Для периодической чистой культуры микроорганизмов, растущей на смеси двух субстратов, обычно наблюдается так называемый диауксичный рост. При этом на кинетической кривой выявляются две четко различимые экспоненциальные фазы, разделенные интервалом, на котором скорость роста проходит через минимум. Такой характер роста обусловлен последова* тельным использованием субстратов. Диауксичный рост на сахарах впервые наблюдал Моно в 1942 г., однако подобная картина имеет место и для других субстратов. Диауксичный рост характеризуется тем, что микроорганизмы не способны синтезировать ферменты, необходимые для метаболизма второго углеродного субстрата, несмотря на его наличие, т. е. индукции не происходит даже в присутствии индуктора. Это явление получило название катаболитной репрессии.
При росте периодических культур на двухкомпонентном субстрате наблюдаются и другие явления. Субстраты могут использоваться независимо, так что потребление одного не сказывается на потреблении другого. В таком случае они могут метаболизироваться одновременно, и при этом иногда наблюдается даже стимуляция роста. Возможны ситуации, когда ферменты, необходимые для метаболизма второго субстрата, синтезируются, но их активность ингибируется, и тогда субстраты используются последовательно, но рост, строго говоря, не является диауксичным. В случаях двухкомпонентных смесей последовательно используемых субстратов тот субстрат, который метаболизируется быстрее, обычно расходуется первым, хотя известны и исключения. Однако в каждой конкретной двухкомпонентной смеси субстратов быстрее может использоваться
то один, то другой субстрат в зависимости от того, какой микроорганизм растет на этой смеси.
В связи со всем сказанным выше важно отметить, что многие культуральные среды, применяющиеся в промышленных биотехнологических процессах, представляют собой сложные смеси субстратов и их состав влияет на производительность процесса. Характер потребления смешанных субстратов в непрерывных проточных культурах не всегда можно предсказать исходя из результатов, полученных на экспериментальных установках с периодическими культурами, растущими на таких же смесях субстратов. В непрерывных проточных системах компоненты смеси могут потребляться одновременно, даже если в периодической культуре того же микроорганизма они использовались последовательно. Особый интерес представляет следующее наблюдение, сделанное на хемостатной культуре. Оказалось, что в двухкомпонентной смеси субстратов критическая скорость разбавления для полного использования того компонента, который обеспечивает более медленный рост периодической культуры, может значительно превышать нормальную скорость вымывания. Кроме того, применяя двухкомпонентные смеси субстратов в непрерывной культуре, можно контролировать поступление углерода в те или иные метаболические пути, изменяя состав субстратной смеси или условия протекания процесса, и регулировать тем самым количество образующейся энергии или какого-либо продукта.
1024. Стабильность культуры и требования, предъявляемые ею
Пригодность выбранной культуры для использования ее в данном промышленном микробиологическом процессе часто не оценивается и становится критическим фактором, когда дело доходит до практического ее применения. Совершенно очевидно, что, вообще говоря, самое главное — это генетическая стабильность культуры, но обсуждение вопросов этого круга выходит за рамки данной главы. Здесь в общих чертах мы рассмотрим физические, химические и пищевые факторы, а также требования, предъявляемые микроорганизмами. Основные условия, необходимые для роста микроорганизмов, были перечислены выше, но всегда остается вопрос: обеспечивают ли выбранные условия оптимальный рост и/или образование продукта? К каким последствиям могут привести изменения этих условий, в частности, как это скажется на продуктивности процесса?
Теплопередача и перенос веществ в биореакторах увеличиваются за счет диссипации энергии в системе, обычно в результате интенсивного механического перемешивания содержимого
реактора вращающимися мешалками. Такие мешалки оказывают двоякое действие: способствуют диспергированию мелких пузырьков воздуха в толще культуральной среды и обеспечивают перемешивание, необходимое для минимизации концентрационных градиентов, эффективного охлаждения реактора и уменьшения выделения пузырьков воздуха. Однако возникающие при таком перемешивании гидродинамические силы могут повреждать клетки, особенно в случае волокнистых плесневых грибов^ актиномицетов, бактерий, имеющих жгутики, фимбрии, а также хрупких клеток тканей, выращиваемых в суспензионной культуре. Образование специфического продукта может зависеть от морфологии плесневого гриба; по этой причине явно непригодны для использования в промышленных процессах те штаммы,, морфология которых значительно изменяется при изменении условий культивирования. Кроме того, следует избегать таких условий проведения процесса, когда мицелий плесневых грибов повреждается.
Ранее считалось, что вероятность повреждений бактериаль* ных клеток определяется скоростью вращения лопастей мешалки. Однако, согласно наиболее правдоподобной современной гипотезе о механизме повреждений, они обусловлены кавитационными явлениями в вихрях, возникающих сразу за лопастями мешалок. Вопрос о повреждении бактериальных клеток в интенсивно перемешиваемых культурах все еще не решен. Если анализировать свойства суспензий бактериальных клеток в потоке, используя для определения гидродинамических характеристик любой отдельной бактериальной клетки предположение, что она представляет собой сферическую частицу соответствующего диаметра, то оценить силы, вызывающие механическое повреждение клетки, не удается. Подобный подход не учитывает наличие жгутиков или фимбрий: они — особенно это касается жгутиков—могут в несколько раз превосходить по длине самые крупные несущие их бактериальные клетки. Вполне возможно, что именно разрыв этих структур и последующее вытекание клеточного содержимого ответственны за разрушение клеток при интенсивном перемешивании бактериальных культур. Заметим, что значительная часть исследований по генетической инженерии направлена на осуществление передачи специфических свойств от различных бактерий к Escherichia coli, которая не особенно пригодна для использования ее в процессах с интенсивным перемешиванием именно из-за наличия фимрий и жгутиков и, следовательно, подверженности механическим повреждениям.
Если среди плесневых грибов и бактерий, вероятно, можно отобрать выносливые микроорганизмы, более или менее пригодные для использования их в условиях, характерных для
интенсивных процессов, то культуры тканей, в частности культуры клеток млекопитающих, нуждаются в особых биореакторах, конструкция которых учитывает присущую этим клеткам хрупкость.
Если говорить о других условиях среды, то совершенно очевидно, что наиболее пригодны для использования в промышленности микроорганизмы с широкими диапазонами оптимумов pH, концентрации растворенного кислорода и температуры. Впрочем, частично эти трудности позволяют обойти техническое усовершенствование установок и улучшение контроля за условиями в них. Отметим, однако, что в некоторых новых конструкциях промышленных биореакторов, в частности в колонных аппаратах и в циклических системах под давлением, создаются значительные градиенты как физических параметров, так и концентраций питательных веществ. Если экономические преимущества подобных систем над более привычными достаточно велики, то для достижения высокой экономичности процесса в целом крайне важно, чтобы в нем принимали участие микроорганизмы, сохраняющие высокую продуктивность в быстро меняющихся условиях.
В заключение следует отметить, что в последнее время не уделялось достаточно внимания использованию в промышленных биотехнологических процессах смешанных, неприхотливых культур определенного состава. Впрочем, даже в процессах, осуществляемых при участии таких культур, значительные изменения условий могут приводить к нарушению равновесия в соотношении между разными микроорганизмами, составляющими эти смешанные популяции.
Технологические факторы, влияющие
на производительность и экономичность процесса
Любо,й процесс, в котором участвуют микроорганизмы, независимо от способа его осуществления можно отнести к одной из двух категорий, определяемой характером поставленной задачи: 1) получение нужных микроорганизмов; 2) осуществление определенных химических превращений.
Последний тип процессов можно подразделить еще на два класса: а) получение нужного конечного продукта; б) переработка сырья.
Все процессы, осуществляемые с целью химического превращения, обладают одной общей особенностью, резко отличающей их от процессов, цель которых — получение микробной биомассы: микроорганизмы, осуществляющие данное превращение, не обязательно должны при этом находиться в состоянии роста. Этот аспект нередко недооценивается, хотя общеизвестно, что
химические превращения могут осуществляться даже микроорганизмами, уже потерявшими жизнеспособность. За такие превращения ответственны клеточные ферменты. Совершенно очевидно, что для контролируемого осуществления многих превращений с самым высоким выходом лучше всего использовать иммобилизованные покоящиеся клетки или иммобилизованные ферменты, выделенные из этих клеток. Роль таких систем при проведении некоторых превращений в промышленных масштабах становится все больше, однако при этом возникают проблемы, связанные со стабильностью подобных биокаталитиче- ских систем, регенерацией кофакторов и с диффузией. Наиболее широко применяемой в промышленных масштабах технологией остается химическое превращение, осуществляемое растущими культурами микроорганизмов. С биохимической точки зрения микробиологические процессы можно подразделить на две основные категории: катаболические, в ходе которых сложные соединения расщепляются до более простых, и биосинтетические, в ходе которых сложные соединения образуются из более простых.
В основе любого процесса, протекающего при участии микроорганизмов, лежит та или иная реакция или последовательность реакций. Тем не менее при реализации этого процесса в промышленном масштабе лимитирующим фактором, как правило, оказывается не кинетика этой реакции или последовательности реакций, а другой, на первый взгляд менее существенный фактор, который и определяет возможности использования данного процесса в промышленности.
Ключевыми факторами, влияющими на экономичность процесса в биореакторе, являются производительность и степень превращения, а они в свою очередь определяются теми физическими факторами, от которых зависит теплопередача и перенос массы. К этим факторам относятся: 1) гидродинамические свойства суспендированных микроорганизмов; 2) реологические свойства культуральных сред; 3) электрокинетические свойства микроорганизмов; 4) давление; 5) поверхностные и пристеночные эффекты, а также эффекты, возникающие на границе раздела фаз; 6) эффекты, связаные с наличием нескольких фаз в потоке; 7) флотационные, седиментационные и сегрегационные эффекты.
Интересно было бы обсудить, какую же реальную информацию о любом из этих факторов и/или их влиянии на рост микроорганизмов или на образование продукта могут дать микробиологические исследования процессов, протекающих с участием микроорганизмов.
Классификация биореакторов и их производительность
Химические реакции можно классифицировать по-разному. Если иметь в виду выбор конструкции реактора, то, вероятно, наиболее полезной будет классификация, основанная на том» в однофазной или в многофазной среде протекает данная реакция. Реакции, идущие в однофазной среде, называются гомогенными, а в многофазных — гетерогенными. Для большинства ферментативных реакций и многих реакций, протекающих при? участии микроорганизмов, подобная классификация не являет* ся однозначной, поскольку они занимают весьма обширную область между гомогенными и гетерогенными реакциями. Чтобы упростить классификацию биохимических реакций, условились считать реакционные системы, в которых существуют только микроградиенты концентраций, гомогенными, а системы с макроградиентами—гетерогенными. Следовательно, для биохимических реакций понятия гомогенности и гетерогенности не совпадают с таковыми для химических реакций.
Любую систему, у которой существует ограничивающая ее поверхность и в которой протекают биохимические реакции, можно назвать биореактором. Промышленный биореактор — это емкость, в которой осуществляются рост микроорганизмов и/или различные химические превращения.
Промышленные биореакторы могут работать в периодическом режиме, периодическом режиме с доливом субстрата» полунепрерывном (полупериодическом) и непрерывном проточном режимах. Исторически в промышленности утвердился периодический способ работы при осуществлении химических превращений и полунепрерывный ——при получении микробной биомассы. В последнее время для химических превращений стали применять реакторы с периодическим режимом и с доливом субстрата, а для получения микробной биомассы — реакторы, работающие в непрерывном проточном режиме. Традиционно ' биореакторы, работающие в непрерывном проточном режиме, использовались в промышленном масштабе только для аэробной переработки сточных вод и отходов (т. е. в процессах с самой большой пропускной способностью среди всех технологических операций), а также при производстве уксуса. За исключением/ этих двух случаев, биологическая промышленность проявляла исключительный консерватизм в том, что касалось перехода на непрерывную проточную технологию, причем без достаточных на то оснований.
Детальный анализ некоторых потенциальных режимов работы биореакторов указывает на превосходство проточного непре-1 рывного режима. При работе по периодическому режиму в ре-1 актор загружают все необходимые компоненты (за исключени-
€М кислорода для аэробных процессов), ведут процесс до конца и собирают конечный продукт. Периодический режим с добавлением субстрата предусматривает периодическое или непрерывное введение субстрата без удаления конечного продукта, который собирают только по завершении процесса. При полунепрерывном ведении процесса, который называют также полупериодическим, по завершении начальной стадии в периодическом режиме реактор наполовину опорожняют, чтобы частично собрать продукт, а затем снова заполняют таким же объемом свежей среды и доводят процесс до конца; затем снова осуществляют ту же последовательность операций. Подобный подход направлен на лучшее использование производственной установки.
Сравним производительность реактора, работающего в периодическом и непрерывном проточном, с идеальным перемешиванием, режимах. Периодический процесс включает несколько этапов: подготовительный, лаг-период, фазу экспоненциального роста и период удаления продукта; с точки зрения производительности реактора важен только период экспоненциального роста. Время, необходимое для завершения цикла /ц, можно представить как сумму продуктивного времени 方 и общего непродуктивного времени 必 т. е.
%=/ + &• (22)
Из уравнения (3), имея в виду, что для экспоненциального роста 卩=pim, получаем
Для периодического процесса общая продуктивность равна •суммарной продукции, деленной на полное время цикла. Суммарная продукция задается соотношением (7), но для таких периодических процессов, которые мы рассматриваем, остаточная концентрация субстрата s фактически равна нулю. Следовательно, суммарная продукция равна
(x—x0) = Yx/sso(25)
и производительность периодического процесса Рп составляет Рп =——У */'° 卩胆—•(26)
По определению производительность реактора (выход биомассы), работающего в непрерывном проточном режиме с идеальным перемешиванием, равна
% =D元(27>
где х — концентрация биомассы в реакторе в стационарном состоянии. Если принять, что коэффициент выхода биомассы Уа：/$ и концентрация субстрата в свежей среде so для периодического и непрерывного процессов одинаковы, а § — остаточная концентрация лимитирующего субстрата, то уравнение (27> имеет вид
PB^DYx/s(s0-7),(28>
откуда при §《So получаем
Pa^DYx/ss0.(29)
Следовательно, отношение производительностей равно 奈=2un(%/%°)+m・(30》
В реакторе, работающем в проточном непрерывном режиме с полным перемешиванием, максимальная скорость разбавления равна D = [i^ Однако во избежание нестабильности на самом деле поддерживают скорость разбавления на уровне 0,8 am, и тогда
* = 0,8 [In (%//) + & %].(31)
Графическое сопоставление продуктивности реактора в периодическом и непрерывном режимах приводится на рис. 10.5.
Рабочие характеристики проточных биореакторов непрерывного действия лучше всего оценивать исходя из расчета материального баланса по биомассе, лимитирующему субстрату и продукту. Используя самую приближенную классификацию проточных биореакторов непрерывного действия с суспензионными культурами, можно выделить два типа реакторов: реакторы с идеальным перемешиванием и проточные биореакторы в режиме полного вытеснения (реакторы поршневого типа). Биореакторы с идеальным перемешиванием могут работать как хемостаты или как турбидостаты. В хемостате поддерживается постоянная плотность микробной культуры за счет потребления лимитирующего субстрата или какого-либо иного питательного вещества, а в систему турбидостата входит светочувствительное устройство, которое измеряет оптическую плотность культуры и обеспечивает ее постоянство. В промышленности, как правило»
Рис. 10.5. СоотношениеРис. 10.5. СоотношениемеждумеждуработающемработающемUQ/ Q OS^SVXQa 5-oyooys40sa^c s ql。。工qualsbosEnodu -awHXBdO 工B-qdadLla工 Ш JKOOZJG«b5ommsoacUQ/ Q OS^SVXQa 5-oyooys40sa^c s ql。。工qualsbosEnodu -awHXBdO 工B-qdadLla工 Ш JKOOZJG«b5ommsoacA、工j s^§ оиоуиотхчохафс nwads 30Н8И.一工AaoduBHA、工j s^§ оиоуиотхчохафс nwads 30Н8И.一工AaoduBHв непрерывном ив непрерывном ичеств посевого материала.честв посевого материала.образованием микробной биомассы в реакторе, периодическом режимах, для различных коли- 一 .максимальных удельных констант скорости роста и продолжительностей непродуктивного этапа периодического цикла; D=0,8 для непрерывной системы (Aiba et al., 1973).
Рис. 10.5. Соотношение
Рис. 10.5. Соотношение
между
между
работающем
работающем
UQ/ Q OS^SVXQa 5-oyooys40sa^c s ql。。工qualsbosEnodu -awHXBdO 工B-qdadLla工 Ш JKOOZJG«b5ommsoac
UQ/ Q OS^SVXQa 5-oyooys40sa^c s ql。。工qualsbosEnodu -awHXBdO 工B-qdadLla工 Ш JKOOZJG«b5ommsoac
A、工j s^§ оиоуиотхчохафс nwads 30Н8И.一工AaoduBH
A、工j s^§ оиоуиотхчохафс nwads 30Н8И.一工AaoduBH
в непрерывном и
в непрерывном и
честв посевого материала.
честв посевого материала.
применяются реакторы, работающие в режиме хемостата, поэтому о турбидостатах мы далее говорить не будем.
Любой анализ производственных характеристик биореактора включает изучение свойств существующих в нем потоков, а также кинетики роста микроорганизмов и осуществляемых с их участием превращений. Для описания потока в проточном реакторе непрерывного действия удобнее всего использовать
распределение частиц, проходящих через реактор, по времени 1их пребывания в реакторе. В случае проточного реактора полного вытеснения все элементы жидкости проходят через реактор строго упорядоченно, так что любой данный элемент никак не перемешивается с элементами, поступающими в реактор до или после него, т. е. отсутствует осевое перемещение. Следовательно, для стационарного состояния проточного реактора с полным вытеснением все порции жидкости, поступающие в реактор, находятся в нем одинаковое время. Среднее время пребывания задается соотношением
(32)(32)И 1т = —•=—
(32)
(32)
где V — объем реактора, F — объемный поток жидкости, поступающий в реактор и вытекающий из него. Напротив, содержимое проточного реактора непрерывного действия с идеальным перемешиванием является полностью однородным, а потому его состав идентичен составу вытекающей из реактора жидкости. Питательные вещества, поступающие в реактор, немедленно перемешиваются с его содержимым и находятся в реакторе разное время. Тем не менее среднее время пребывания для такого реактора тоже определяется соотношением (32), хотя кривые распределения времени пребывания для этих двух типов реакторов совершенно различны.
(33)(33)Кривые вымывания для данных реакторов также сильно различаются. Представим себе, что реактор каждого типа наполнен жидкостью, в которой до начала поступления новых ее порций дискретно и равномерно распределены инертные, несегрегирующие частицы, причем объемные потоки, выходящие из каждого реактора, одинаковы. Тогда число частиц в каждом реакторе будет равно
(33)
(33)
Qo=У%,
где V—объем жидкости, х0 — начальная концентрация. При поступлении в реактор новых порций чистой жидкости из него будет вытекать поток (обеспечивающий постоянство объема содержимого реактора), концентрация твердых частиц в котором будет неодинакова для разных типов реакторов. При этом число частиц, остающихся в реакторах, будет непрерывна уменьшаться.
Для идеального проточного реактора с полным вытеснением концентрация частиц в вытекающей жидкости будет равна %о до тех пор, пока время вытекания t не станет равно времени пребывания т; в этот момент 尤 станет равным нулю. Число частиц, остающихся в реакторе, будет линейно уменьшаться во времени и при t—r станет равным нулю. Для реальных проточ-
Рис. 10.6. Проточный биореактор непрерывного действия с полным перемешиванием (см. текст).Рис. 10.6. Проточный биореактор непрерывного действия с полным перемешиванием (см. текст).ных реакторов с полным вытеснением наблюдает- so ся несколько иная карта- F на из-за осевого перемешивания и диффузии.
Рис. 10.6. Проточный биореактор непрерывного действия с полным перемешиванием (см. текст).
Рис. 10.6. Проточный биореактор непрерывного действия с полным перемешиванием (см. текст).
Для реакторов с полным перемешиванием концентрация частиц в вытекающей жидкости всегда будет равна концентрации частиц в содержимом реактора. Кривая вымывания для таких реакторов, как и кривая распределения времени пребывания, будет представлять собой отри-
dxdx~=Dx. at~=Dx. at(34)(34)цательную экспоненту. Изменение концентрации частиц и их числа в реакторе описываются уравнением
dx
dx
~=Dx. at
~=Dx. at
(34)
(34)
Используя соотношения для скорости вымывания, уравнения роста микроорганизмов и образования продукта, а также вы^ ражение для коэффициентов выхода биомассы, можно получить уравнения материального баланса, которые описывают работу идеального проточного реактора непрерывного действия. Для этого нужно найти соотношение, в котором накопление какого- либо продукта выражено через увеличение его количества благодаря входящему потоку, уменьшение из-за вытекающего потока, увеличение за счет роста или образования продукта в реакторе, уменьшение за счет использования в реакторе н увеличение за счет рециркуляции потока.
Уравнение материального баланса для биореактора, работающего в проточном режиме с идеальным перемешиванием без рецикла, т. е. обычного хемостата (рис. 10.6), где продуктом служит только микробная биомасса, выглядят следующим образом.
Для микробной биомассы
Накопление = Рост — Удаление или для бесконечно малого интервала времени
(35)(35)Vdx^V)xxdt—Fxdt.
(35)
(35)
Для лимитирующего субстрата
Накопление = Поступление—Удаление—Использование
или для бесконечно малого интервала времени dt
Vds = Fs0 dt—Fsdt—-^- di,(36)
匕c/s
где V—постоянный объем жидкости в биореакторе, F ——объемный поток жидкости, втекающий в биореактор и вытекающий из него, У“/б — коэффициент выхода микробной биомассы при росте на лимитирующем субстрате, % — концентрация биомассы в реакторе, s0 и s — соответственно концентрации лимитирующего субстрата в поступающем в биореактор растворе и в реакторе, 卩——удельная константа скорости роста.
Разделив (35) и (36) на Vdtt получим
穿=(m一D)*(37)
и
穿= D(So—s)—*.(38)
dfYx/s
В стационарном состоянии dx/dt=0 и ds/dt=Q. Следовательно,
(卩一Z>) х= 0,(39)
откуда
卩=D(40)
и, таким образом,
D(So-§— 戸=0,(41)
Y X/s
где 而 и s — соответственно концентрации микробной биомассы и лимитирующего субстрата в стационарном состоянии.
Соотношение Моно можно переписать следующим образом:
卩卩Рта SРта S(不+ k5)(不+ k5)(42)(42)
卩
卩
Рта S
Рта S
(不+ k5)
(不+ k5)
(42)
(42)
Отсюда можно получить выражение для концентрации лимитирующего субстрата в стационарном состоянии, заменив ц на D:
(21)(21)3一:儿0
(21)
(21)
(Rm — °)
Концентрацию бактеральной биомассы в стационарном состоянии получим, заменив сначала в уравнении (41)卩 на Q, а затем подставив выражение (21) для s
不=%/」无一,旦.(43)
L(卩 m一0)
Производительность такой системы (выход микробной биомассы) в стационарном состоянии равна
Pl。云(27)
или, после подстановки выражения для х,
& =4sL 飞器г]・(44>
Графики зависимости х} s и Рп от скорости разбавления D, построенные в соответствии с соотношениями (43), (21) и (27), приведены на рис. 10.7.
Скорость разбавления D, чСкорость разбавления D, ч7匚・」l4'ss工 Hol。。。WOHde工 ОИТ1Е1О87匚・」l4'ss工 Hol。。。WOHde工 ОИТ1Е1О8g MMHHOl。。。wo工deHOMYlel。s Bj.edJ.09A。аипЕСЦНЗТ!工。乂 о1 8 6 4 2 0g MMHHOl。。。wo工deHOMYlel。s Bj.edJ.09A。аипЕСЦНЗТ!工。乂 о1 8 6 4 2 01'41'4и-」* -qgp2。-Box-qg 3 2 10и-」* -qgp2。-Box-qg 3 2 10
Скорость разбавления D, ч
Скорость разбавления D, ч
7匚・」l4'ss工 Hol。。。WOHde工 ОИТ1Е1О8
7匚・」l4'ss工 Hol。。。WOHde工 ОИТ1Е1О8
g MMHHOl。。。wo工deHOMYlel。s Bj.edJ.09A。аипЕСЦНЗТ!工。乂 о
1 8 6 4 2 0
g MMHHOl。。。wo工deHOMYlel。s Bj.edJ.09A。аипЕСЦНЗТ!工。乂 о
1 8 6 4 2 0
1'
4
1'
4
и-」* -qgp2。-Box-qg 3 2 10
и-」* -qgp2。-Box-qg 3 2 10
Рис. 10.7. Теоретическая зависимость концентрации биомассы, концентрации лимитирующего субстрата в стационарном состоянии, выхода микробной биомассы от скорости разбавления для простого хемостата (цт= 1,0 ч-1,穴$= =0,1 г・л-* У*/$=0,5, 5о=Ю г-л-1)-
Найдем уравнения материального баланса для другой системы—проточного реактора непрерывного действия с полным перемешиванием, единственным продуктом которого является
микробная биомасса; в таком реакторе для интенсификации процесса часть концентрированной микробной биомассы используется повторно, поступая из сепаратора, расположенного на выходе из реактора (это может быть седиментационный тэнк, применяемый при очистке сточных вод; центрифуга или система ультрафильтрации). В подобной системе, изображенной на рис. 10.8, скорость разбавления D равна F/Vt где 尸—по-
SSF7F7Рис. 10.8. Проточный реактор непрерывного действия с полным перемешиванием и повторным использованием концентрированной микробной биомассы (см. текст).Рис. 10.8. Проточный реактор непрерывного действия с полным перемешиванием и повторным использованием концентрированной микробной биомассы (см. текст).
S
S
F7
F7
Рис. 10.8. Проточный реактор непрерывного действия с полным перемешиванием и повторным использованием концентрированной микробной биомассы (см. текст).
Рис. 10.8. Проточный реактор непрерывного действия с полным перемешиванием и повторным использованием концентрированной микробной биомассы (см. текст).
ток жидкости через систему в целом, V — постоянный объем жидкости в биореакторе. Поток, выходящий из биореактора (но не из системы в целом), можно представить в виде
(45)(45)(46)(46)爲=尸+a&,
(45)
(45)
(46)
(46)
или
где а — доля вытекающего из реактора содержимого, которая используется повторно. Если принять, что микробная биомасса становится более концентрированной в g раз, то количество биомассы, повторно используемой в биореакторе, будет равно aFsgx,
Уравнение материального баланса по биомассе будет в этом случае иметь вид
Накопление = Рост—Удаление + Повторное использование9 или для бесконечно малого интервала времени dt
Vdx = V 卩尤成一冗 xdt+aF8 gxdtt(47)
а соответствующее уравнение по лимитирующему субстрату — Накопление = Поступление+Повторное использование — Удаление—
—Расходование,
или для малого интервала времени
Vds = Fs0 dt + Q居 sdt—Fssdt ——匕竺"df.(48)
Y司s
Подставив в (47) выражение для Fs и разделив на Vdt, мы получим для стационарного состояния (при котором d%/df = °):
［岑Wg=o,(49)
L (1 —а)
или
(1-^)д_ _(50)
”(1 —а)
В предположении, что выполняется соотношение Моно, полу-
чаем
Ит s 一 (1 — ag)Q⑸)
(1-a)'
или
7=DKM】-砲.(52)
卩m (1 —。)一 0(1— ag)
Подставив в (48) выражение для Fs и разделив на Vdt, мы получим для стационарного состояния (при котором ds/dt=O) уравнение, которое представляет собой уравнение для обычного хемостата (41). Подставив в него выражение для s, будем иметь
彳一 (M — S)(1—а)(1 一 殖)彳一 (M — S)(1—а)(1 一 殖)(53)(53)
彳一 (M — S)(1—а)
(1 一 殖)
彳一 (M — S)(1—а)
(1 一 殖)
(53)
(53)
Для определения концентрации микробной биомассы hx в осветленном потоке, вытекающем из сепаратора, нужно найти уравнение материального баланса по биомассе в сепараторе. В предположении, что сепаратор работает в стационарном режиме, т. е. биомасса в нем не накапливается, уравнение ма-
териального баланса для биомассы можно записать следующим образом:
Поступление = Повторное использование + Концентрированные отходы + Осветленные отходы или'
F/= a% gx+cFgx + (\—c)Fhx,(54)
где с — доля потока 尸，вытекающего из системы в виде концентрированных отходов, й — концентрационный коэффициент по биомассе в осветленном потоке, вытекающем из сепаратора.
Подставив сюда выражение для Fs [соотношение (46)], получим
(55)(55)九=(1 -ag) 一空(1 -0)(1-а)(1-с)
(55)
(55)
Если реактор работает в стационарном режиме, то его производительность (но не производительность системы в целом) по биомассе будет равна
p =区(1 -ag) н— (1—а)p =区(1 -ag) н— (1—а)(56)(56)или, после замены F8,или, после замены F8,(57)(57)
p =区(1 -ag) н— (1—а)
p =区(1 -ag) н— (1—а)
(56)
(56)
или, после замены F8,
или, после замены F8,
(57)
(57)
Зависимость между производительностью Рн, концентрацией микробной биомассы в стационарном состоянии х, концентрацией лимитирующего субстрата в стационарном состоянии s и скоростью разбавления представлена на рис. 10.9. Из этих соотношений с очевидностью следует потенциальная возможность увеличения рабочей скорости разбавления или благодаря повторному использованию биомассы, как в рассматриваемом нами случае, или путем удержания активной биомассы.
Вернемся теперь к анализу работы проточного биореактора с полным вытеснением. В этом случае в каждом малом элементе жидкости du, проходящем через биореактор, имеет место в основном экспоненциальный рост(N = Wm), если только концентрация первого лимитирующего субстрата значительно превышает константу насыщения К$・ Рост биомассы в таком биореакторе без рецикла описывается следующим уравнением:
1пх=1пх0 + Нт^ (58)
где хо ——концентрация биомассы в среде, поступающей в биореактор, 尤一концентрация в момент времени 力 Если и — объ-
Lc-」心 Иинно1ио°2о 工 deHOHYlelus гаьгаано^>и xs^roaHXO^TOV-Lc-」心 Иинно1ио°2о 工 deHOHYlelus гаьгаано^>и xs^roaHXO^TOV-0 5 0 5 0 53 2 2 1 1L 匚SSI^OHOOQ 5-OTaroIos^raHO 8-qzewosg ^^(二工当工OY0 5 0 5 0 53 2 2 1 1L 匚SSI^OHOOQ 5-OTaroIos^raHO 8-qzewosg ^^(二工当工OY116114112心 8 6 4116114112心 8 6 4Скорость разбавления D, ч-1Скорость разбавления D, ч-12。2。Рис. 10.9. Теоретическая зависимость концентрации биомассы и лимитирующего субстрата в стационарном состоянии, а также выхода микробной биомассы в биореакторе от скорости разбавления для хемостата с концентрированием микробной биомассы и ее повторным использованием (“т=1,0 ч~\ Xs = = 0,1 г-л-1, Уд7$=0,5, so=1O г-л-1, а=0,2, g=4).Рис. 10.9. Теоретическая зависимость концентрации биомассы и лимитирующего субстрата в стационарном состоянии, а также выхода микробной биомассы в биореакторе от скорости разбавления для хемостата с концентрированием микробной биомассы и ее повторным использованием (“т=1,0 ч~\ Xs = = 0,1 г-л-1, Уд7$=0,5, so=1O г-л-1, а=0,2, g=4).00
Lc-」心 Иинно1ио°2о 工 deHOHYlelus гаьгаано^>и xs^roaHXO^TOV-
Lc-」心 Иинно1ио°2о 工 deHOHYlelus гаьгаано^>и xs^roaHXO^TOV-
0 5 0 5 0 5
3 2 2 1 1
L 匚SSI^OHOOQ 5-OTaroIos^raHO 8
-qzewosg ^^(二工当工OY
0 5 0 5 0 5
3 2 2 1 1
L 匚SSI^OHOOQ 5-OTaroIos^raHO 8
-qzewosg ^^(二工当工OY
116114112心 8 6 4
116114112心 8 6 4
Скорость разбавления D, ч-1
Скорость разбавления D, ч-1
2。
2。
Рис. 10.9. Теоретическая зависимость концентрации биомассы и лимитирующего субстрата в стационарном состоянии, а также выхода микробной биомассы в биореакторе от скорости разбавления для хемостата с концентрированием микробной биомассы и ее повторным использованием (“т=1,0 ч~\ Xs = = 0,1 г-л-1, Уд7$=0,5, so=1O г-л-1, а=0,2, g=4).
Рис. 10.9. Теоретическая зависимость концентрации биомассы и лимитирующего субстрата в стационарном состоянии, а также выхода микробной биомассы в биореакторе от скорости разбавления для хемостата с концентрированием микробной биомассы и ее повторным использованием (“т=1,0 ч~\ Xs = = 0,1 г-л-1, Уд7$=0,5, so=1O г-л-1, а=0,2, g=4).
0
0
ем культуральной среды, вышедшей из биореактора за время 力 -го t = v/F = v/Vd. Подставив это выражение для / в уравнение {58), получаем
1пх=1п 的 +1пх=1п 的 +叩m叩mDVDV(59)(59)
1пх=1п 的 +
1пх=1п 的 +
叩m
叩m
DV
DV
(59)
(59)
При рециркуляции микробной биомассы в проточном биореакторе с полным вытеснением никакой внешней инокуляции не требуется. В подобной системе общий поток, вытекающий из биореактора (но не из всей системы), описывается уравнением (46), как и в случае рассмотренного выше реактора с рециркуляцией. Если биомасса концентрируется в сепараторе в g раз, то доля ее, повторно используемая в биореакторе, будет равна 齊 Если %w — концентрация биомассы в потоке, вытекающем из биореактора, то в стационарном состоянии х0 = ctgxw. Время /, за которое из реактора вытечет объем и, равно
z= °^-?L . (60)
Приняв и = 14 — объему, при котором происходит исчерпание лимитирующего субстрата, и заменив х и / в уравнении (59), для стационарного состояния получим
%=尸(In丄).(61»
(1 — a) Rm \ ag /
При 几=У (объем жидкости в биореакторе) это соотношение принимает вид
—=————丄)•(62方
D(1 — a) |lm \ аё /
Максимальная величина xw, %m, равна
%m=ySo + %o.(63》
В случае суспензионных культур проточные реакторы с полным вытеснением используются редко. Как правило, реакторы работают в режиме, близком к режиму полного перемешивания» разумеется, применительно к жидкой фазе. Тем не менее не следует считать, что в системе действительно осуществляется идеальное перемешивание, пока не проанализированы все возможные причины появления неоднородности (например, из-за пристеночного роста и т. п.). Вероятно, самым лучшим приближением к реактору с полным вытеснением был бы каскад последовательных реакторов с идеальным перемешиванием бе* дополнительных поступлений питательных веществ, однако для этого число биореакторов, составляющих такой каскад, должно быть бесконечным. Неидеальный поток с полным вытеснением можно получить, лишь когда работает более шести последовательных биореакторов.
10.32 Анализ размерностей и масштабирование
Анализ размерностей и моделирование с помощью безразмерных величин широко применяются в химической технологии и не менее важны для конструирования биореакторов и их масштабирования. С анализом размерностей и с безразмерными величинами хорошо знакомы лишь немногие микробиологи. Это прежде всего метод, с помощью которого можно получить какую-то информацию о взаимосвязях между переменными^ характеризующими определенные физические системы. Ценность такого подхода состоит в том, что его можно применять в тех случаях, когда мы располагаем неполной информацией о системе, и тогда получаемая частичная информация нередко имеет большую ценность, позволяя уменьшить число экспериментов, необходимых для получения полной информации.
Рассмотрим, например, физическую абсорбцию кислорода- в аэрируемом биореакторе. Очевидно, что для полного описания системы с физической точки зрения необходимо вывести сложные гидродинамические уравнения, описывающие перемен
Шение газообразной и жидкой фаз и диффузию в жидкой фазе. Количество поглощенного кислорода будет сложным образом зависеть от скорости поступления газа и от всех других переменных, входящих в уравнения, которые описывают перемещение фаз. Определить точный вид зависимости между скоростью подачи газа и другими переменными практически невозможно; однако анализ размерностей позволяет установить ряд важных соотношений, которые должны выполняться для любой такой зависимости. Это связано с тем, что корректные способы измерений удовлетворяют требованию, согласно которому число, равное отношению между результатами измерений двух объектов, не зависит от того, какая единица используется для измерений, а корректные системы уравнений имеют такой вид, который не зависит от системы единиц.
Решение той или иной технологической проблемы обычно начинают с очень приближенного анализа, учитывая как мож- но меньше деталей. В результате исходные характеристики процессов, протекающих в реакторе, могут быть представлены в виде простого соотношения между двумя или тремя безразмерными величинами и соответствующими эмпирическими константами. Существует около трехсот безразмерных величин, представляющих интерес с точки зрения технологии, но на самом деле большинство биотехнологов имеют дело только с двумя десятками.
Наиболее широко используемая безразмерная величина — это число Рейнольдса N^e, которое применяется при описании потока жидкости:
NRe = & , (64)
где L ——характеристический размер, и ——скорость потока, р —— плотность жидкости, п — ее вязкость. При конструировании биореакторов числа Рейнольдса используются при описании потока жидкости в трубопроводах, движения капель, частиц и пузырьков газа, а также вращающихся мешалок. Для потока жидкости в трубопроводе
Nr$ = » (65)
где d ——диаметр трубопровода, и — скорость потока. Для ча- стин, пузырьков или капель, погружающихся в жидкости или всплывающих в ней,
(66)
Где d3 — эквивалентный диаметр частиц, пузырька или капли.
т. е. диаметр сферы, равной по объему частице, пузырьку или капле, U — скорость частицы, всплывающей или погружающейся в жидкость, рс — плотность среды, т]с — ее вязкость. Для вращающихся мешалок
(67}
где D — диаметр перемешивающего устройства, N — скорость вращения.
Перечислим некоторые другие безразмерные величины» обычно используемые химиками-технологами: число Нуссельта Nn» число Прандтля Npr, число Гразгофа Ng门 число Фруда Nf「, число Пекле Npe, число Стэнтона Nst, число Шмидта NSc> число Шервуда №h, число Вебера Nwe・ Как и число Рейнольдса, некоторые из этих величин имеют по нескольку определен ний, а, например, числа Пекле, Прандтля и Нуссельта записываются в одинаковом виде в случае теплопередачи и переноса массы. Кроме того, одни из этих безразмерных величин, например число Стэнтона, представляют собой комбинации других величин, а некоторые имеют более одного названия.
В качестве примера использования безразмерных величин можно рассмотреть процесс теплопередачи. Когда имеет место только естественная конвекция, теплопередача зависит исключительно от структуры потока, определяемой числом Гразгофа> а число Рейнольдса может быть исключено из безразмерных уравнений, описывающих этот процесс. В условиях же принудительной конвекции эффектами структуры потока обычно можно пренебречь и исключить из уравнений число Гразгофа. Следовательно, уравнение, использующееся в случае естественной конвекции, имеет вид
Nnu = / (№с №) (68) а в случае принудительной конвекции ——
Nnu = f (№е，Np). (69)
При увеличении масштаба возникают проблемы, связанные с экстраполяцией данных, полученных в лаборатории или на по- лупроизводственной установке, на случай промышленной установки. Оборудование для биотехнологической промышленности можно успешно создавать и эксплуатировать только при условии правильного масштабирования. Ясно, что с проблемой увеличения масштаба мы сталкиваемся при конструировании всех установок, используемых в биотехнологических процессах, включая теплообменники, центрифуги, испарители, сушилки и т. д., но здесь мы рассмотрим в основном биореакторы.
Любой материальный объект или физическая система характеризуются тремя параметрами: размером, формой и составом. Все эти параметры меняются независимо друг от друга, так что два объекта могут различаться по размеру, но иметь одинаковую форму и состав или быть одинаковыми только по форме, но существенно различаться по размерам н составу. Принцип подобия устанавливает взаимосвязь между физическими системами разных размеров; на нем основано увеличение или уменьшение масштабов процессов и оборудования. Согласно этому принципу, пространственная и временная конфигурации системы определяются отношением между соответствующими величинами внутри систем и не зависят от того, в каких единицах эти величины измеряются. Принцип подобия нередко путают с методом анализа размерностей, хотя логически они совершенно различны. Первый из них — это общий принцип природы, тогда как второй — всего лишь один не методов его реализации.
Биотехнолог имеет дело со сложными системами, включаю^ щими твердые тела и жидкости, в которых происходит пеоенос- энергии и вещества и протекают различные реакции; для таких систем принцип подобия связан в основном с понятием формы.. Когда понятие формы применяется к сложным биотехнологическим системам, оно включает помимо геометрических пропорций и такие факторы, как структура потока жидкости, температурные градиенты, зависимость концентрации от времени и т. д. Системы, обладающие одинаковой конфигурацией по одному или более из этих параметров, можно рассматривать- как подобные.
Подобие можно определить двумя способами: устанавливая? отношение результатов различных измерений для одного и того же объекта, т. е. внутренние пропорции, или отношения между результатами соответствующих измерений разных объектов», т. е. масштаб. Геометрическое подобие лучше всего определяется через масштабные соотношения, а подобие по таким переменным, как скорость, сила или температура, — через внутренние соотношения для каждой системы. Эти внутренние со* отношения представляют собой безразмерные величины, характеризующие подобие в различных условиях.
Для систем, в которых протекают биотехнологические процессы, существуют четыре тапа подобия: 1) геометрическое,. 2) механическое, 3) тепловое и 4) химическое, причем каждый из этих типов подобия связан со всеми остальными. Для полного химического подобия необходимо наличие геометрического» механического и теплового подобия, но часто приходится ограничиваться приближенным химическим подобием, например„ когда имеет место лишь приближенное механическое подобие.
На самом деле такой элемент приближения имеется всегда, поскольку в реальных системах обязательно существуют возмущения и идеальное подобие становится недостижимым. Так, рассматривая потоки жидкости в геометрически подобных сн- •стемах, мы не можем считать их идентичными, поскольку нет гарантии, что все неровности поверхностей геометрически подобны.
Из рассмотрения четырех типов подобия, перечисленных выше, следует, что геометрическое подобие между двумя объектами имеет место тогда, когда каждой точке одного из них соответствует определенная точка другого. Однако каждой точке первого объекта может соответствовать более одной точки второго; кроме того, масштаб может быть одинаковым не по всем осям. О подобии объектов с такими различиями в масштабе говорят как об искаженном.
Механическое подобие включает подобие статическое, кинематическое и динамическое; каждое из них можно рассматривать как распространение понятия геометрического подобия ：на стационарные или движущиеся системы, на которые действуют силы. Статическое подобие относится прежде всего к деформации структур и представляет для биотехнологов лишь небольшой интерес. Напротив, кинематическое и динамическое подобие очень важны и касаются систем, для которых характерно движение. В случае геометрического подобия используется декартова система координат, при кинематическом подобии вводится дополнительная переменная — время. О геометрически подобных движущихся системах говорят как о кинематически подобных в тех случаях, когда соответственные частицы описывают за соответственные интервалы времени подобные траектории. Когда две геометрически подобные жидкие системы подобны кинематически, свойства потоков геометрически подобны, а процессы переноса массы и тепла в этих двух системах связаны друг с другом простыми соотношениями. Кинематическое подобие в жидкостях влечет за собой геометрическое подобие как турбулентных систем, так и пограничных (пристеночных) слоев жидкости. Динамически подобны силы (гравитационные, центробежные и т. п.), под действием которых осуществляется ускоренное или замедленное движение тел в динамических системах. В жидких и дисперсионных системах кинематическое подобие предусматривает и динамическое подобие, поскольку характер движения в таких системах определяется приложенными силами. Динамически подобные системы —— это геометрически подобные движущиеся системы, в которых соотношения между всеми соответственными силами одинаковы. Динамическое подобие в потоке жидкости очень важно .для предсказания изменения давления или потребления энер-
гии; в случае переноса массы и теплопередачи оно имеет только косвенное значение как способ установления кинематического подобия.
Понятие теплового подобия применяется в случае технологических систем, в которых происходит теплопередача; в этом; случае к единицам длины, силы и времени добавляется температура. Тепло может передаваться от одной точки системы к другой с помощью разных механизмов: излучения, теплопровод- ности, конвекции или переноса вещества под действием градиента давления. Первые три процесса осуществляются за счет разницы в температурах, а четвертый определяется характером потока в системе. Тепловое подобие имеет место в геометрически подобных системах, когда отношения соответственных разностей температур постоянны, а когда такие системы находятся в движении, они также и кинематически подобны. Тепловое подобие должно учитываться при разработке режима стерилизации биореакторов, особенно в плане теплового повреждения материала, а также при охлаждении биореакторов.
Понятие химического подобия относится к системам, в которых протекают различные реакции и состав которых меняете屁 от точки к точке либо ——в случае периодических или цикличе- ских процессов — во времени. При этом никаких новых фундаментальных единиц не вводится, однака должны быть заданы один или более концентрационных параметров в зависимости от числа независимо изменяющихся химических компонентов, по которым должно быть установлено подобие. Химическое подобие имеет место в геометрически подобных системах и систе- мах с тепловым подобием, когда отношение между соответственными разностями концентрации остается постоянным и ког^ да эти системы, если они находятся в движении, кинематически подобны. Внутренним критерием, который характеризуег химическое подобие, в дополнение к тем критериям, которые* необходимы для кинематического и теплового подобия, является отношение скорости образования продукта к скорое™ всего потока или к скорости молекулярной диффузии.
Механическое, тепловое или химическое подобие между геометрически подобными системами определяется такими критериями, как соотношения размеров, сил или скоростей внутри* этих систем. Поскольку эти критерии представляют собой отношение между одинаковыми величинами, они безразмерны иг могут быть получены с помощью анализа размерностей.
Безразмерные критерии подобия представляют собой отношения физических величин, являющихся функциями или раз-^ личных движущих сил, или сил сопротивления, которые лимитируют процесс. В реальных системах часто существуют множественные лимитирующие факторы. Например, сопротивле- 28*
ние движению жидкости может быть обусловлено вязкостью, гравитационными силами или силами поверхностного натяжения, для которых соответствующими безразмерными величинами являются числа Рейнольдса, Фруда и Вебера. Для самого простого случая гомологичных систем с разными абсолютными размерами эти три критерия несовместимы, поскольку для них имеет место разная функциональная зависимость скорости движения жидкости от линейных размеров; так, для одинаковых чисел Рейнольдса скоростью длине-1, для одинаковых чисел Фруда скорость ос длине0,5, для одинаковых чисел Вебера скорость»： дли не~0*5. При увеличении масштаба сложного биотехнологического процесса лучше всего было бы найти такие условия, при которых скорость процесса в целом определялась в основном каким-то одним безразмерным критерием, но, как правило, приходится использовать как минимум два критерия.
Для биореакторов с вращающимися мешалками, благодаря которым воздух диспергируется в толще культуральной среды, очень часто основным экономическим фактором при масштабировании является потребление энергии при перемешивании. В общем виде безразмерное уравнение для двухфазного потока жидкости в емкости с вращающейся мешалкой выглядит «следующим образом:
Np=/(N良№с Nw)(70)
или
р _ f / D2 №н D№ А№рн\
Рн №05 - / ( n，G * оУ *()
где Р ——потребляемая энергия, рн — плотность жидкой (непрерывной) фазы, N — скорость вращения мешалки, D — диаметр мешалки, 小一вязкость жидкой (непрерывной) фазы, С — гравитационная постоянная, о — поверхностное натяжение.
Для систем газ ——жидкость зависимость от чисел Ройнольд- са и Вебера в уравнении потока жидкости можно с достаточной точностью представить как степенные функции этих чисел, хотя показатели степени и не являются постоянными для всех условий. Далее, зависимость от числа Фруда возникает только при наличии вихрей на поверхности жидкости, а в биореакторах с вращающимися мешалками образование вихрей предотвращается с помощью перегородок. Следовательно, для аэрируемых биореакторов с вращающимися мешалками
' №=/(NRe)a(Nwe)V,(72)
тде показатели степени а и у зависят от условий процесса, в 'частности от структуры потока.
Анализ размерностей массопередачи в аэрируемых геометрически подобных биореакторах с мешалками дает
Nsh = /(NRe)-(NSc)v,(73)
или
然(74)
где 阮 ——коэффициент массопередачи, 勿一коэффициент молекулярной диффузии кислорода в жидкой (непрерывной) фазе. Хотя у нас нет оснований сомневаться в применимости уравнений (72) и (73) к случаю биореакторов с вращающимися мешалками, следует помнить о тех трудностях, которые возникают при оценке влияния перемешивания на биологическую активность; эти трудности вполне могут привести к несостоятельности обсуждаемого подхода. Скорость вращения лопастей мешалки nND задает максимальную скорость сдвига в аэрируемых биореакторах, от которой зависит вероятность повреждения жизнеспособных клеток, особенно нитевидных бактерий или образующих хлопья микробов. При увеличении размеров биотехнологических установок необходимо уделять особое внимание связям между механическими и физическими факторами, с одной стороны, и биологическими — с другой. В противном случае задача увеличения масштаба вряд ли будет решена корректно.
Перенос кислорода
Одна из основных задач, которые приходится решать химикам- технологам при конструировании биореакторов, — это обеспечение эффективного переноса кислорода в промышленных биореакторах, где осуществляются аэробные микробиологические процессы. Независимо от того, в каком режиме осуществляется аэробный микробиологический процесс — периодическом, полунепрерывном или непрерывном,——в установку должен непрерывно подаваться кислород для достижения достаточно высокой производительности. Потребность аэробной культуры в кислороде зависит от концентрации микроорганизмов в реакторе, скорости их роста и соответствующего коэффициента выхода. В некоторых случаях могут играть роль и другие факторы, например необходимость удаления из культуры двуокиси углерода, особенно для процессов, в которых в качестве источника кислорода используется воздух, который как раз и служит источником кислорода в подавляющем большинстве аэроб- ных микробиологических процессов. При тех температурах, при которых обычно протекают микробиологические процессы (10—
40 ℃), и при атмосферном давлении равновесная концентрация растворенного кислорода крайне мала по сравнению с концентрациями в растворе почти всех основных питательных веществ- или субстратов, хотя именно концентрация последних лимитирует рост микроорганизмов в непрерывном проточном хемоста， те. Такой недостаток кислорода приводит к снижению производительности, к ухудшению качества продукта или к образованию побочных продуктов. При реализации большинства аэробных микробиологических процессов расходы на снабжение- кислородом составляют значительную часть общей стоимости, производства.
В равновесии растворимость газа в жидкости представляет собой весьма небольшую, вполне определенную величину, зависящую от природы этих газа и жидкости, от температуры и давления в системе. В случае газовых смесей, например воздуха, растворимость компонентов зависит от парциального давления каждого из них. При прочих равных условиях, чем выше температура, тем меньше растворимость, и чем выше давление (или парциальное давление), тем растворимость выше. Зависимость между растворимостью газа и давлением известно как закон Генри, согласно которому при постоянной температуре масса газа, растворенного в данном объеме жидкости, про* порциональна давлению газа, с которым эта жидкость находится в равновесии. Большинство культуральных сред представляют собой разбавленные водные растворы, и для простоты их можно считать сходными с водой. Концентрация кислорода, растворенного в воде, находящейся в равновесии с воздухом., Т. е. в состоянии насыщения, при постоянной температуре и постоянном суммарном давлении равна
где ро2 一парциальное давление кислорода в воздухе, Но2 —— постоянная Генри для данной системы при соответствующей температуре. Значения этих постоянных приводятся в физических и химических справочниках, и нужно только правильно выбрать единицы измерения.
Для описания переноса (абсорбции) газов в жидкостях обычно используются три гидродинамические модели: I) модель двух пленок Льюиса — Уитмена; 2) модель проницаемости с систематически обновляемой поверхностью (модель Хигби) ;3) модель проницаемости со случайно возобновляемой поверхностью (модель Данквертса).
Для описания физической абсорбции газов системами азроб- нмх микробных культур обычно применяют модель Льюиса ——
Уитмена, поэтому только ее мы здесь и рассмотрим. Перенос кислорода из жидкой фазы в бактериальную клетку также часто рассматривают с позиций, аналогичных модели двух пленок.
Согласно модели Льюиса — Уитмена, на поверхности разде^ л.а фаз газ ——жидкость образуются две тонкие пленки, тесно прилегающие к этой поверхности. Пленки являются в основном неподвижными, а в толще газовой и жидкой фаз происходит турбулентное движение. Абсорбция газа осуществляется в ходе стационарных процессов молекулярной диффузии в этих двух неподвижных пленках. Считается, что на поверхности раздела фаз газ — жидкость мгновенно устанавливается равновесие, а
Направление транспорта кислорода
Рис. 10.10. Модель двух (ламинарных) пленок, предложенная Уитменом для процесса физической абсорбции (транспорта) кислорода из воздуха в водную среду (обозначения см. в тексте).
скорость абсорбции определяется относительными скоростями диффузии в пленках. Предположим, что абсорбция осуществляется из пузырьков воздуха, диспергированных в жидкости; радиус кривизны пузырьков на несколько порядков превышает толщину гипотетической пленки, и транспорт кислорода из пузырьков воздуха в жидкость можно представить так, как это сделано на рис. 10.10. В газовой пленке йарциальное давление кислорода меняется от /?о2 — парциального давления во всем объеме газовой фазы до ро2 i ——парциального давления в газо-
вой пленке непосредственно у границы раздела фаз; соответственно в жидкой пленке концентрация растворенного кислорода： меняется от co2i — равновесной концентрации при насыщении^ соответствующей ро2 h до Со2 — концентрации во всем объеме* жидкости.
Поскольку кислород на поверхности раздела не накапливается, скорость переноса кислорода на единицу площади в газо- вой и жидкой пленках будет одинакова и равна
%。2 = % (Ро2 —Po2i) =闕(Со21—%), (76》
где 々g н 々l — коэффициенты массопереноса соответственно для газовой и жидкой пленок. Для воздуха и других газовых смесей, содержащих кислород, po^i и ，о2 f определить нельзя; в этих случаях используются коэффициенты переноса Kg для газа и 鼠 для жидкости:
% = Kg (Ро2-Р*о2)=凡(с*%-%), (77)
где pF — равновесное парциальное давление, соответствующее fo2, a f*o2 —равновесная концентрация, соответствующая парциальному давлению ро2. Тогда, согласно закону Генри, получаем
Ро2 = НО2с*о2, Р*о3 = но2 со2» Ро*1 = Н。2 co2r
(7分
(79)
(80>
(81》(82>(81》(82>Сделав подстановку в уравнения (75) и (76), имеем
(81》
(82>
(81》
(82>
Величины, обратные коэффициентам массопереноса, называют* ся коэффициентами сопротивления транспорту, т. е. 1/^g и 1/^l ——соответственно коэффициенты сопротивления в газовой и жидкой пленках, a 1/Kg и 1/Kl ——соответственно коэффициенты сопротивления для всего объема газа и всего объема жидкости. Их относительные значения зависят от растворимости газа. При абсорбции очень хорошо растворимого газа, например аммиака в воде, постоянная Генри Hnh3 очень мала* и последним членом в уравнении, аналогичном (81), можно, пренебречь, так что коэффициент массопереноса для газовой
4)азы Kg практически равен коэффициенту для газовой пленки £g； абсорбция лимитируется процессами, происходящими в газовой пленке. При абсорбции (транспорте) кислорода, который растворяется в воде слабо, постоянная Но2 очень велика, так что в уравнении (82) член 1/Ho2^g очень мал и им можно пренебречь. Коэффициент массопереноса для жидкой фазы Kl практически равен коэффициенту массопереноса для жидкой пленки 々l； абсорбция кислорода лимитируется процессами, протекающими в пленке жидкости. Когда газовая фаза содержит кислород, po2 i=Po2 и 融一бесконечно большая величина, так что абсорбция в этом случае также лимитируется процессами в жидкой пленке.
В большинстве аэробных биореакторов кислород поступает ：в культуральную среду из пузырьков воздуха, диспергированных в ней; в этом случае необходимо оценить скорость массо- передачи кислорода в единице объема, и уравнение (77) принимает следующий вид:
Ro2=勺 а (е*o2-(83)
где /?о2 一 скорость переноса кислорода на единицу объема жидкости, а — удельная площадь поверхности раздела фаз газ — жидкость, т. е. площадь поверхности раздела фаз на единицу объема жидкости. При насыщении ^。产。％ и перенос кислорода не происходит. Однако находящиеся в среде микроорганизмы будут потреблять кислород в процессе своей жизнедеятельности, так что с*°2 станет больше го2 и начнется перенос. В случае модели двух пленок Kl определяется следующим образом:
Kl=冬， (84)
где 25 — коэффициент диффузии, б — толщина пленки жидкости. Для другой модели поглощения газа Kl определяется иным способом. В модели Хигби
Kl = 2J 丽呼 (85) а в модели Данквертса
KL=V^>, (86)
где 力一это время нахождения элементарного объема жидкости на поверхности раздела, a tD—эквивалентное время диф- •фузии.
Транспорт кислорода из пузырька в жидкую среду — это •лишь часть общего процесса переноса кислорода к бактериаль-
ным клеткам. Как было показано для переноса кислорода из： пузырьков в жидкость, транспорту препятствуют разного рода факторы, один из которых является лимитирующим. Понятие сопротивления переносу можно распространить и на последующие стадии процесса. Кислород, поступив в культуральную сре* ду, должен затем транспортироваться к месту его использования в микроорганизме. Сопротивление переносу складывается
Длина пути переноса (масштаб не соблюден)Рис. 10.11. Различные типы сопротивления транспорту кислорода из пузырька газа к месту его использования микроорганизмом (обобщение модели Уитме- на; обозначения см. в тексте).Длина пути переноса (масштаб не соблюден)Рис. 10.11. Различные типы сопротивления транспорту кислорода из пузырька газа к месту его использования микроорганизмом (обобщение модели Уитме- на; обозначения см. в тексте).5otto5sy Зинаиде4 «оглслх^агас5otto5sy Зинаиде4 «оглслх^агасro^o^ocosv- asrledlHa3工。*ro^o^ocosv- asrledlHa3工。*
Длина пути переноса (масштаб не соблюден)
Рис. 10.11. Различные типы сопротивления транспорту кислорода из пузырька газа к месту его использования микроорганизмом (обобщение модели Уитме- на; обозначения см. в тексте).
Длина пути переноса (масштаб не соблюден)
Рис. 10.11. Различные типы сопротивления транспорту кислорода из пузырька газа к месту его использования микроорганизмом (обобщение модели Уитме- на; обозначения см. в тексте).
5otto5sy Зинаиде4 «оглслх^агас
5otto5sy Зинаиде4 «оглслх^агас
ro^o^ocosv- asrledlHa3工。*
ro^o^ocosv- asrledlHa3工。*
из сопротивления со стороны жидкой фазы (1/^в), которым для невязких, ньютоновских жидкостей в условиях полной турбулентности можно пренебречь, из сопротивления со стороны жидкой пленки, прилегающей к поверхности бактериальной клетки, хлопьям, осадку или к поверхности мицелия (1/^м) и либо внутриклеточного сопротивления в случае дисперсионных культур, либо межклеточного (включая и внутриклеточное) в случае хлопьев, осадков и мицелия (1/^с). Все типы сопротивления переносу кислорода представлены на рис. 10.11. В слу-
■чае дисперсионных культур перенос кислорода лимитируется •■сопротивлением в жидкой пленке пузырька (1/^l). Когда же микроорганизмы растут в виде хлопьев, осадков или мицели- .альной массы, в некоторых случаях роль лимитирующего фактора играет не сопротивление в жидкой пленке газового пузырька, а внутри-/межклеточное сопротивление или сопротивление (Конгломерата.
В связи с очевидностью роли переноса кислорода из пузырьков газа в жидкость попытаемся с помощью уравнения (83) оценить возможности увеличения скорости транспорта кислорода. В принципе можно варьировать все три члена этого уравнения: Kl, а и (с*оа——соа) (последний член характеризует движущую силу процесса). Однако Kl является характеристикой ■системы в целом и не может изменяться независимо, поэтому обычно ее считают константой, хотя под действием поверхностно-активных веществ, присутствующих в микробиологических установках, она все-таки изменяется. Удельную площадь поверхности раздела фаз газ — жидкость и член, характеризующий движущую силу, легко увеличить, изменяя контролируемым образом условия проведения процесса. Обычно первая из этих величин возрастает при интенсификации перемешивания, а вторая ——при увеличении суммарного или парциального давления.
Удельная площадь поверхности раздела фаз газ ——жидкость определяется следующим образом:
a =普，(87)
где е — задержка газа на единицу диспергируемого объема, D — средний диаметр пузырьков (в случае пузырьков неодинакового размера). Обычно для определения среднего диаметра пузырька используют формулу Саутера:
万=」一，(88)
2 «о21
где п — число пузырьков, D — диаметр эквивалентной сферы. Ясно, что для интенсификации транспорта кислорода путем увеличения а необходимо либо повысить содержание газа в диспергируемой среде (т. е. е) , либо уменьшить средний диаметр пузырьков.)。
Диспергирование пузырьков газов в жидкостях — сложный процесс. Независимо от способа получения пузырьков для них
всегда наблюдается некое распределение по размерам. Размер любого диспергированного пузырька определяется равновесием между двумя основными типами напряжений: напряжением сдвига и поверхностным натяжением. На размер пузырьков заметно влияет присутствие в среде растворенных неорганических и органических веществ, при этом изменяется либо коалесценция, либо поверхностное натяжение.
В биореакторах коалесценция и поверхностное натяжение* не могут изменяться независимо друг от друга и произвольным образом, однако несомненно они изменяются в ходе процесса или в результате добавления соединений, контролирующих пе- нообразование. Теоретически уменьшение среднего размера пузырьков при диспергировании газов в жидкостях может проис- ходить при интенсификации перемешивания. Однако на самом5 деле при обычных удельных мощностях перемешивания средний размер пузырьков остается примерно постоянным, зато заметно увеличивается содержание газа, т. е. другой компонент величины а; это связано с рециркуляцией жидкости, благодаря которой в свою очередь снижается потеря пузырьков газа. Механизм разрушения пузырьков в изотопическом турбулентном потоке мы обсуждать не будем. Отметим лишь, что в результате рассмотрения этих механизмов для случая отсутствия коалесценции было получено уравнение, удовлетворяющее множеству имеющихся экспериментальных данных для систем с очень высокой энергоемкостью:
D = JD = Jо°>6рМ (Р/У)%4о°>6рМ (Р/У)%4(89>(89>
D = J
D = J
о°>6
рМ (Р/У)%4
о°>6
рМ (Р/У)%4
(89>
(89>
где 丿一константа, о — поверхностное натяжение, р — плотность жидкости, P/V — энергоемкость на единицу объема в условиях насыщения газом. При наличии коалесценции уравнение (89) принимает вид
D = JD = JрУ(р“)%4рУ(р“)%4(90>(90>
D = J
D = J
рУ(р“)%4
рУ(р“)%4
(90>
(90>
Здесь показатель степени а, в который возводится величина % характеризует степень коалесценции.
Итак, очевидно, что задержка газа и средний размер пузырьков прямо связаны между собой; при этом задержка газа, зависит от интенсивности перемешивания и от объемной скорости потока газа. Соответствующее эмпирическое уравнение для жидкости с постоянными реологическими характеристиками имеет вид
(91>(91>£ =/仍/修6(p口户,
(91>
(91>
где /', § и т — константы, зависящие от системы и оборудова-
ния, а 丿口 一 поверхностная скорость газа, т. е. отношение объемной скорости газового потока к площади поперечного сечения биореактора. В биореакторах с вращающимися мешалками и высокой энергоемкостью происходит рециркуляция значительной части газовой фазы и соответственно уменьшается влияние поверхностной скорости газа на величину е. В то же время в барботажных биореакторах относительная роль % сильно возрастает.
Оценивая транспорт кислорода из газовой фазы в жидкость в микробиологических реакторах, Эндрью (Andrew, 1982} высказал мнение, что при конструировании любых промышленных аэробных биореакторов, в том числе больших тэнков с мешалками, их можно рассматривать как аппараты колонного типа со свободным прохождением пузырьков газа по высоте аппарата. Крупные биореакторы-тэнки с мешалками относят к категории вышеупомянутых биореакторов, основываясь на явлении массопереноса, а также в связи с тем, что при обычной промышленной энергоемкости мешалка не способна создавать рециркуляцию жидкости, достаточную для возврата пузырьков,, стремящихся выйти на поверхность жидкости.
Рассмотрим теперь вопрос о возможности изменения скорости транспорта кислорода путем изменения того члена уравнения (83), который характеризует движущую силу процесса,, т. е. (c*Og ——Со2). Здесь имеется несколько возможностей.. В первую очередь уменьшение до минимума рабочей концентрации растворенного кислорода в среде, т. е. Со2. Однако, когда эта величина приближается к нулю, дальнейшее увеличение Движущей силы становится невозможным. Максимально достижимая, постоянная скорость транспорта кислорода Ro2m равна
Ro2m Kl aC*O2* (92>
Уменьшать содержание растворенного кислорода в культуральной среде следует с осторожностью, поскольку микроорганизмы при этом вынуждены будут расти в условиях недостатка кислорода, что может отрицательно сказаться на их росте и/или образовании продукта. Если микроорганизмы растут в виде хлопьев, образуют осадок или мицелий и величина 1/йс становится фактором, лимитирующим весь процесс транспорта кислорода, концентрация Со2 должна поддерживаться на уровне значительно выше нуля, если мы хотим, чтобы во всем объеме микробной биомассы, находящейся в реакторе, поддерживался аэробный метаболизм.
Прежде чем говорить об изменении с*о2, следует сначала определить, какое именно парциальное давление кислорода со* ответствует с*о2 в тех или иных типах, биореакторов. Для би.о-
реакторов с высокой интенсивностью перемешивания, т. е. реакторов, которые обычно используются в лаборатории, было показано, что газовая и жидкая фазы полностью перемешивается. Следовательно, парциальное давление кислорода в диспергированных пузырьках равно парциальному давлению кис- .лорода в газе, выходящем из жидкости, т. е. в свободном пространстве биореактора. Для биореакторов колонного типа со свободным прохождением пузырьков по высоте биореактора, в том числе и для промышленных биореакторов с перемешивани- •ем, работающих в условиях обычной энергоемкости, в первом приближении можно считать, что жидкая фаза перемешивается полностью, а газовая находится в режиме идеального вытеснения, т. е. существует градиент парциального давления кислорода в направлении от дна биореактора к его верху. Для этих двух крайних случаев уравнение (83) можно переписать следующим образом:
R。= " “Р •例一％)(93)
Но2
《для случая полного перемешивания) и
п = Kl аРср「 (勿—》2)](94)
丄 \ У2~ Уз J
(для случая полного вытеснения). Здесь Р — давление в сво- •бодном пространстве, Рср — среднее рабочее давление в реакторе (давление в рабочем пространстве+гидростатическое давление) у】，у2 и уз — мольные доли кислорода во входящем и выходящем газе и в газовой смеси, соответствующей равновесной концентрации растворенного кислорода.
Из уравнений (93) и (94) с очевидностью следует, что с ■увеличением давления в свободном пространстве биореактора повышается скорость транспорта кислорода в обоих рассмотренных случаях, а с увеличением парциального давления кис- -лорода путем обогащения им газовой смеси, продуваемой через биореактор, или полной замены ее кислородом повышается скорость транспорта кислорода в случае полного вытеснения. В реакторах с идеальным перемешиванием парциальное давление кислорода в пузырьках, а следовательно, и скорость транспорта кислорода должны увеличиваться с уменьшением кон- гверсии кислорода; однако это вряд ли можно считать экономически целесообразным.
Поскольку микроорганизмы имеют тенденцию скапливаться ■у поверхности раздела между воздухом и жидкостью, видимо,
правильнее было бы записать уравнение (82) следующим образом:
Ro「Ef 凡仪(c*q「с” (95》
Ясно, что в отсутствие такого накопления Е'=1, однако обычно,, особенно в случае бактерий значительно меньшего размера,, чем толщина пленки (〜20 мкм), концентрация их у поверхности раздела фаз будет гораздо, больше, чем в толще жидкости. Влияние этого явления на транспорт кислорода, вероятно, в> какой-то степени сходно с эффектами, наблюдаемыми при поглощении газа в условиях одновременного протекания химической реакции; тем не менее прямая аналогия здесь вряд ли возможна, поскольку концентрация, бактерий внутри пленки меняется нелинейно, а текучесть пленки уменьшается из-за присутствия в ней бактериальных клеток.
Теплопередача и охлаждение биореактора
К числу наименее разработанных проблем биотехнологии отно сятся разнообразные проблемы осуществления процессов теплопередачи, которые обеспечивают поддержание тетмяер_атуры( аэрируемой культуральной среды на уровне, соответствующем оптимуму анаболической и катаболической активности данных микроорганизмов. Для большинства из них диапазон температур, оптимальных для роста или образования продукта, очень узок, нередко всего несколько градусов. При температурах ниже оптимальной скорость роста любого микроорганизма повышается в ответ на повышение температуры относительно медленно, а при температурах, лишь на несколько градусов превы* шающих этот оптимум, происходит резкое снижение скорости роста до нуля. Подавляющее большинство микроорганизмов^ используемых в биотехнологических процессах, — мезофилы：. температурный оптимум для них лежит между 15 и 40 ℃. Температурный оптимум термофильных микроорганизмов значительно превышает 40*℃, а у облигатных психрофильных микроорганизмов он лежит ниже 10℃.
При производстве любого валового микробиологического- продукта аэробным способом охлаждение биореактора представляет собой серьезную технологическую проблему. Если температурный оптимум, при котором достигается максимальный-' выход продукта и производительность, лежит ниже 40 ℃, на* охлаждение приходится основная часть производственных расходов. Обычно в практике биотехнологических процессов промышленного масштаба используют в качестве охлаждающей среды воду, а не какой-либо хладагент. При определении размеров：
охлаждающей поверхности, необходимой для поддержания температуры любого процесса, особое значение имеет макси- -мальная температура охлаждающей воды, а производственные расходы на системы охлаждения определяются средней температурой охлаждающей воды, используемой на разных этапах процесса. Следует подчеркнуть, что при очистке валового продукта требуется значительно меньшее охлаждение, чем при осуществлении обычных биологических процессов. Однако некоторые из недавно разработанных физических методов разде- .ления протекают при температурах, близких к обычным, и представляются весьма перспективными в плане использования их в биотехнологии.
Температура охлаждающей воды зависит от многих факторов. К ним относятся происхождение этой воды, климатические условия и различия в местоположении установки, а также тип используемой системы охлаждения: это может быть проточная ■система или система с рециркуляцией. В будущем для охлаждения, вероятно, все больше будут применяться замкнутые си- -стемы (с рециркуляцией), с тем чтобы исключить тепловое и возможное химическое загрязнение окружающей среды в ре- .зультате сброса воды из проточных систем охлаждения. В условиях умеренного климата и при использовании мезофильных организмов в крупных, интегрированных производствах оптимальная температура процесса будет лишь немного отличаться ют температуры охлаждающей воды.
Хотя калориметрические методы измерения количества тепла, выделяющегося при росте и дыхании микроорганизмов, разработаны уже давно, использованию этого процесса посвящено сравнительно немного работ. Измерения количества выделяющегося тепла производили обычно для оценки интенсивности роста микроорганизмов. В аэробных микробиологических лроцессах количество тепла, выделяющегося в единицу времени, прямо пропорционально скорости потребления кислорода, которая в свою очередь связана с ростом с помощью соответствующего коэффициента выхода. Считается, что это эмпирическое соотношение между скоростью потребления кислорода и .количеством выделяющегося тепла можно применять для оценки последней величины, и прямые ее измерения проводят только в редких случаях. Это соотношение имеет вид
Q = %・ (96)
Здесь Q — количество тепла, выделяющегося при росте аэробных микробов в единицу времени на единицу объема, ^о2 一 скорость потребления кислорода на единицу объема (равная скорости транспорта кислорода), k—константа, равная 124, если Q выражено в ккал-м~3-ч-1, a Ro 纟—в моль-м~3-ч-1. Оцен-
ки, получаемые с помощью этого уравнения, близки к таковым при расчете количества тепла исходя из теплоты сжигания субстратов и микробной биомассы соответствующего состава.
Большинство промышленных биореакторов снабжено охлаждающим кожухом и/или внутренними охлаждающими змеевиками. В последнее время для интенсификации процессов в биореакторах как обычной конструкции, так и новых конфигураций стали использовать наружные охлаждающие контуры. В некоторых реакторах новых конфигураций внутренняя охлаждающая система настолько нарушает основные гидродинамические рабочие характеристики, что исключает такое охлаждение. При увеличении размера реактора создание необходимой внутренней охлаждающей поверхности становится все более трудной задачей. Для геометрически подобных емкостей увеличение объема пропорционально кубу линейных размеров, при этом площадь увеличивается только пропорционально квадрату линейных размеров. Эффективность охлаждения аэробных биореакторов зависит от следующих факторов: 1) переноса тепла от отдельных клеток в культуральную среду; 2) переноса тепла от культуральной среды, содержащей диспергированные пузырьки газа и микроорганизмы, к охлаждающим поверхностям; 3) поступления тепла за счет рассеяния ^Гсхакине"-- ской энергии, затрачиваемой на перемешивание среды с целью ее аэрации; 4) охлаждения при испарении, выравнивания температур и работы при расширении, связанной с прохождением воздуха через среду; 5) изменения коэффициента теплопередачи вследствие загрязнения охлаждающих поверхностей накапливающимися на них микроорганизмами. Потенциальную значимость этих факторов необходимо рассматривать отдельно для каждой технологической системы.
Когда микроорганизмы диспергированы в толще водной среды, как бывает обычно в процессах, где культивируют бактерии и дрожжи, скорость теплопередачи лимитируется переносом тепла от культуральной среды к охлаждающим поверхностям.
Содержимое аэробного биореактора, работающего в условиях интенсивного перемешивания, можно представить как массу пузырьков, но нужно еще учесть, что жидкая фаза содержит суспендированные микроорганизмы, оказывающие влияние на ее вязкость. Эта последняя зависит от размера микроорганизма, его морфологии и концентрации, а также от способности синтезировать внеклеточные полимерные продукты.
Одна из основных задач аэрации содержимого биореактора——это получение мелких пузырьков газа и тем самым максимальное увеличение площади поверхности, через которую происходит перенос газа в среду. Во многом благодаря свойст-
вам культуральной среды образующиеся в ней пузырьки имеют сферическую форму и относительно слабо деформируются. Фактически они представляют собой упругие сферы, гидродинамические свойства которых сходны со свойствами твердых сферических частиц. Хотя плотность и теплопроводность твердых частиц, с одной стороны, и пузырьков — с другой, явно различны,, поведение пузырьков в некоторых аспектах сходно с поведением частиц в псевдоожиженном слое, хотя в последнем случае- содержание диспергированных частиц обычно выше.
Плотность клеток микроорганизмов очень близка к плотности водной среды, в которой они растут, и при анализе теплопередачи в дисперсионных культурах бактерий и дрожжей^ обычно имеющих диаметр эквивалентной сферы меньше 10 мкм, культуральную среду можно рассматривать как однородную водную фазу. В аэрируемых биореакторах перенос тепла от культуральной среды к охлаждающим поверхностям осуществляется путем принудительной конвекции. Чтобы судить о потенциальной эффективности охлаждения, необходимо оценить соответствие характеристик водно-газовых смесей, образующихся при оптимальном транспорте кислорода, факторам, способствующим увеличению теплопередачи от этой смеси к поверхности.
Благодаря хорошим характеристикам теплопередачи реакторы с псевдоожиженным слоем применяются для проведения реакций, которые требуют тщательного контроля температуры. Из-за ожижения частиц увеличивается коэффициент теплопередачи между образуемым ими слоем и теплопередающими поверхностями. Это увеличение определяется в основном тремя* факторами: 1) высокой теплоемкостью на единицу объема частиц, благодаря чему они выполняют функцию теплопереносящих агентов; 2) разрушением частицами ламинарного слоя на теплопередающей поверхности и вследствие этого уменьшением эффективной толщины этого слоя; 3) нестационарностью процесса теплопередачи, обусловленной тем, что частицы движутся к теплопередаюхцей поверхности и от нее в виде 《пакетов》.
Проанализируем значимость этих факторов в применении к процессу диспергирования газа в жидкости. Если главную* роль играет первый фактор, то коэффициент теплопередачи между пузырьками и теплопередающей поверхностью будет существенно меньше из-за низкой теплоемкости пузырьков. Если основным является второй фактор, то коэффициент теплопередачи будет больше, а если третий, то может наблюдаться повышенная коалесценция и образование сгустков. В псевдоожиженных системах задержка твердых частиц нередко достигает 0,4, тогда как в реакторах с обычным потреблением энер^
тн задержка газа вряд ли превышает 0,12. При задержке вь『 те 0,2 начинается образование газовых «пробок》.
В барботажных колоннах пробулькивание газа через жидкость приводит к двум типам перемещений: 1) циркуляции всего содержимого, вызываемой всей массой пузырьков; 2) л。- 弘альннм микроперемещениям, вызываемым отдельными пузырьками. Экспериментальные данные для суммарного коэффициента теплопередачи в условиях охлаждения жидкости, в которой диспергированы пузырьки газа, за счет теплопередачи 咏 стенке колонны описываются уравнением
/1 = В^(-^-)°，33 №产(％/%尸个(97)
丑 за счет теплопередачи к охлаждающему змеевику — уравнением
九=b' ％ (^^y33NpJ，33 (%/ь产‘4(小心)。，33,(98)
где А — суммарный коэффициент теплопередачи, В и В' — константы для системы, ^ж — теплопроводность жидкости, g ——гравитационная постоянная, е — задержка газа, рж — плотность жидкости, рж — вязкость жидкости, Npr ——число Прандтля, Ww ——вязкость жидкости при температуре теплопередающей поверхности, dK — диаметр колонны, dT — диаметр трубки охлаждающего змеевика. Ни одно из этих уравнений нельзя прямо использовать в случае биореактора с интенсивным перемешиванием с помощью мешалки. Из-за значительной рециркуляции в реакторах подобного типа показатели степеней этих уравнений должны быть другими.
Для интенсификации переноса кислорода в биореакторах системы аэрации должны обеспечивать образование как можно более мелких пузырьков. Однако при уменьшении размера пузырьков уменьшается теплопередача. С другой стороны, теплопередача увеличивается при увеличении задержки газа. Из этого следует, что в биореакторах с высокой скоростью переноса кислорода будет, при прочих равных условиях, наблюдаться :и более интенсивная теплопередача.
Конверсия и рециркуляция
Как мы уже говорили, основным технологическим фактором, от которого зависит экономичность любого микробиологического процесса, является производительность биореактора. Однако в случае нерастворимых или несмешивающихся с водой субстратов и нелимитирующих рост питательных веществ существенную роль начинает играть и величина конверсии. Удельную
конверсию субстрата или какого-либо питательного вещества можно определить как отношение массы использованного субстрата к массе субстрата, исходно введенного в систему. Для микробиологических процессов удельная конверсия полностью растворимого, лимитирующего рост субстрата практически равна единице, т. е. остаточная концентрация субстрата, завися- щая от сродства участвующих в процессе микроорганизмов к лимитирующему субстрату, близка к нулю. Для нерастворимых или несмешивающихся с водой субстратов и для нелимитирующих рост питательных веществ удельная конверсия часто бывает значительно меньше единицы. Для таких систем коэффициент конверсии, определяемый как вес сухой микробной биомассы или продукта, получаемых на единицу веса введенного субстрата или питательного вещества, будет меньше соответствующего коэффициента выхода. В одних случаях величина конверсии кислорода и газообразных углеродных энергетических субстратов, несмешивающихся с водой и нерастворимых в ней углеродных энергетических субстратов, а также растворимых нелимитирующих рост питательных веществ определяется режимом работы биореактора, в других более важными факторами являются массоперенос, геометрия биореактора и технологические параметры.
Хотя стоимость сырья при аэробной переработке и не повышается из-за использования воздуха в качестве источника кислорода, капитальные и эксплуатационные расходы значительно возрастают в связи с необходимостью получения сжатого воздуха и его стерилизации. В процессах промышленного масштаба важно снизить такие расходы до минимума, максимально увеличивая степень конверсии кислорода, при условии, что расходы на это не приведут к снижению экономичности процесса в целом.
Если в качестве источника кислорода используется воздух, то удельная конверсия кислорода в высокоэффективных лабораторных биореакторах редко превышает 0,2, а в обычных промышленных биореакторах она обычно составляет 〜0,1. Даже при таких низких величинах конверсии кислород нередко является лимитирующим рост фактором, поскольку скорость его транспорта не соответствует скорости потребления. Из рассмотрения уравнения (83), описывающего физическую абсорбцию кислорода культуральной средой, следует, что в системах с полностью перемешиваемой газовой фазой высокие значения удельной конверсии кислорода несовместимы с увеличением скорости транспорта кислорода до максимума. Очевидно, при решении этой проблемы следует учитывать технические и экономические факторы. Что касается биореакторов, в которых газовая фаза перемещается в режиме полного вытеснения, то по
сравнению с полностью перемешиваемыми системами для них следует ожидать значительно более высоких величин конверсии кислорода при данной скорости транспорта.
Для увеличения удельной конверсии в технологических системах чаще всего используют рециркуляцию. В случае микробиологических процессов такой подход применим в равной мере и к газовой, и к жидкой фазам, впрочем, с некоторыми модификациями. В случае повторного использования газовой фазы их можно рассмотреть на примере двух схем потоков, приведенных на рис. 10.12, — работы в однократном проточном
<ozz 八 ％
Без повторного использованиеБез повторного использованиеQ'Q'С павторнъшисполъзовссниел；С павторнъшисполъзовссниел；GG
Без повторного использование
Без повторного использование
Q'
Q'
С павторнъш
исполъзовссниел；
С павторнъш
исполъзовссниел；
G
G
рис. 10.12. Повторное использование газовой фазы для увеличения удельной конверсии кислорода при низких степенях конверсии (обозначения см. в тексте).
режиме и при рециркуляции газовой фазы в предположении, что переносимый компонент газовой фазы (например, кислород воздуха) является минорным и поэтому газовые потоки, направленные внутрь биореактора и из него, практически одинаковы. Без рециркуляции удельная конверсия кислорода в возду-
Q°2Q°2(99)(99)Хо2 может быть представлена в виде Y Со21-Сог2
Q°2
Q°2
(99)
(99)
GC^
В условиях рециркуляции соответствующая величина Х'с^ равна
(ЮО)(ЮО)X，= “2】— С’О” — Q'O2
(ЮО)
(ЮО)
°2^= (G-G，)C°2i
где Со21 —концентрация кислорода в потоке газа, поступающе' го в обе системы, Соз2 и Сго^ —концентрации кислорода в потоке газа, выходящем из систем без рециркуляции и с рециркуляцией соответственно, Qo2 и Qzo2 — скорости утилизации кислорода в системе без рециркуляции и с рециркуляцией соответственно, G н G’ — скорости газового потока, проходящего через биореактор и используемого повторно. Когда кислород не является фактором, лимитирующим рост, т. е. Qo2 = Q/o2( отношение величин удельной конверсии при рециркуляции и без нее задается уравнением
(Ю1)(Ю1)Х“ 一 G
(Ю1)
(Ю1)
(102)(102)Если же кислород служит лимитирующим фактором, то из-за изменения в движущей силе транспорта кислорода Qo2>Q,o2> и для полностью перемешиваемой газовой фазы уравнение (101) принимает вид
(102)
(102)
х°2 - Q(G — O)
Как бы мы ни увеличивали удельную конверсию кислорода, при условии постоянства режима работы при рециркуляции газовой фазы производительность биореактора будет неизбежно уменьшаться в результате снижения движущей силы транспорта кислорода. Ясно, что конверсию нельзя оптимизировать независимо от производительности.
Когда в биореакторы добавляют газообразные или летучие углеродные энергетические субстраты, конверсия рассматривается с совершенно иных позиций. В отличие от кислорода воздуха подобные субстраты представляют собой дорогостоящее сырье, и процессы, в которых они используются, должны быть направлены на достижение очень высокой конверсии либо на полное их использование в системах безотходной технологии с привлечением других процессов. По-видимому, из газообразных углеродных энергетических субстратов наиболее известен метан, хотя в качестве промышленных субстратов можно использовать и другие газообразные алканы. При условии, что метан как сырье для микробиологических процессов можно
использовать непосредственно в виде природного газа и вернуть стоимость неутилизованного метана, используя его в таких энергоемких процессах, как сушка, в биореакторе могут быть достигнуты относительно высокие значения удельной конверсии—0,7—0,8. При этом необходимы реакторы с полным вытеснением газовой фазы и высоким давлением, а также, воз- можно, с повторным использованием газовой фазы. В качестве альтернативы можно использовать несколько последовательных реакторов высокого давления с полным перемешиванием.
Обратимся теперь к жидкой фазе и рассмотрим потенциальные возможности ее повторного использования. Следует подчеркнуть, что все микробиологические процессы протекают при относительно низких концентрациях микроорганизмов, субстратов, питательных веществ и продуктов в культуральной среде. В них расходуется большое количество воды, в которой эти микроорганизмы, субстраты, питательные вещества и продукты диспергированы или растворены. Концентрация микробов обычно лимитируется такими факторами, как ингибирование субстратом, питательными веществами или продуктами, а в аэробных процессах — скоростью транспорта кислорода. Однако в технологических системах с рециркуляцией биомассы могут иметь место и очень высокие концентрации микроорганизмов.
При микробиологическом получении продуктов с высокой или средней стоимостью имеет смысл повторное использование или регенерация среды только для процессов, в которых задействовано уже частично использованное очень дорогостоящее сырье. В случае крупномасштабного производства повторное использование среды очень выгодно как в плане экономии большого количества высококачественной воды и питательных веществ, так и уменьшения объема сточных вод.
В любой технологической схеме рециркуляции воды/среды ключевым моментом является установление механизма взаимодействия между различными элементарными операциями, образующими данный цикл. При повторном использовании среды возникают следующие проблемы: 1) накопление в среде ингибиторов из-за метаболической активности, сопровождающейся образованием побочных продуктов, или за счет лизиса в процессе рециркуляции; 2) накопление ингибиторов за счет метаболической активности, лизиса или разрушения клеток в биореакторе; 3) накопление в сырье нежелательных, неиспользуемых примесей; 4) рециркуляция неиспользованных субстратов или питательных веществ, вызывающих нарушение физического и химического равновесия и динамическую неустойчивость в биореакторе.
В случае смешанных культур рециркуляция может приводить к избирательному возвращению в биореактор микроорганизмов, составляющих эту смешанную культуру, с неизбежным нарушением популяционного равновесия в биореакторе.
Повторное использование микробной биомассы — это скорее способ интенсификации микробиологических процессов, чем средство увеличения конверсии. В отличие от немногих примеров повторного использования газовой или жидкой фазы в промышленных микробиологических процессах повторное использование микробной биомассы представляет собой хорошо разработанную процедуру, применяемую уже около 70 лет при очистке сточных вод с помощью активного ила.
В математическом представлении непрерывный микробиологический процесс с повторным использованием микроорганизмов эквивалентен непрерывному микробиологическому процессу, в котором происходит преднамеренная или случайная задержка микробов в реакторе. Возможно, такая операция найдет широкое применение в промышленности. Повторное использование и задержка микроорганизмов дают существенное преимущество в тех случаях, когда участвующие в процессе микроорганизмы медленно растут или синтезируют не связанный с ростом продукт. Отметим, что при использовании такого способа интенсификации процесса производительность реактора нельзя будет повысить до тех пор, пока его характеристики, относящиеся к теплопередаче и массопереносу, не будут соответствовать рассчитываемому повышению производительности. Если теплопередача или массоперенос в биореакторе в рабочем режиме без рециркуляции или задержки микробов являются лимитирующими факторами, то производительность реактора можно повысить, только улучшив тем или иным способом эти параметры.
Характеристики микробных и мицелиальных суспензий
Состав микробов обычно выражают в виде процентного содержания углерода, водорода, кислорода, азота и золы в расчете hw сухую массу. На самом деле жизнеспособные микроорганизмы состоят в основном из воды: на ее долю приходится примерно 70% массы клеток.
Форма и размеры разных микроорганизмов описаны в таксономической литературе, однако следует помнить, что они могут изменяться в зависимости от условий культивирования. При анализе массопереноса и теплопередачи в биореакторах, а также процессов отделения микроорганизмов от конечного продукта часто пользуются понятием «эквивалентный размер» («диаметр эквивалентной сферы»). Этот термин применяется для
культур, в которых клетки растут в виде дискретно диспергированных суспензий. Понятие эквивалентного размера является полезным упрощением, позволяющим в более простой форме описывать динамическое поведение клеток в суспензии. Кроме того, следует принимать во внимание и плотность суспензии. Обычно она составляет 1,07—1,09 г-см-3, хотя иногда бывает и ниже—1,03 г-см-3. Таким образом, плотность водных культуральных жидкостей обычно несколько выше, чем плотность воды.
Единственный случай, для которого было получено выражение для силы сопротивления движению сферических частиц в жидкости, — это погружение частицы с малой скоростью в жидкость бесконечного объема. Для такой частицы Стокс получил уравнение
f=3(叫必)， (103)
где F — сила сопротивления,刀——вязкость жидкости, d —— диаметр сферической частицы, и — скорость жидкости относительно частицы. На самом деле условия, в которых выполняется закон Стокса, реализуются редко. В большинстве систем частицы непрерывно испытывают ускорение или замедление; кроме того, даже в условиях ламинарного потока частицы редко бывают изолированы друг от друга, обычно они взаимодействуют между собой.
Конечную скорость погружения частицы 加 можно получить, приравняв силу сопротивления к эффективной силе тяжести, т. е.
3(rni%d) = ^(p4—pQg, (104)
где рч и рж — соответственно плотности частицы и жидкости. Отсюда
“ ^2 (Рч—Рж) g/1g
Закон Стокса для скорости оседания 〃с суспензий мелких частиц одинакового размера имеет вид
“ ^2(Рч — Pc) g/1
где рс — средняя плотность суспензии, т)с ——кажущаяся вяз- кость. Это уравнение учитывает влияние концентрации частиц как на вязкость, так и на плотность жидкости. В случае неоднородных частиц в уравнение (106) можно ввести член, учитьь вающий изменение их формы и размера.
Что касается биологических процессов, то для них наиболее важным параметром является вязкость соответствующих жидкостей. Она определяется как мера внутреннего трения в жидкости, и в условиях ламинарного потока, т. е. потока с низкими числами Рейнольдса, равна отношению напряжения сдвига к соответствующей скорости сдвига, т. е.
Т = (107) dy
где Т — напряжение сдвига, т] — вязкость жидкости, du/dy — скорость сдвига, выраженная через градиент скорости в жидкости.
Вязкость можно представить либо как произведение силы на время и на величину, обратную квадрату длины, либо как произведение массы на величины, обратные времени и длине. Во всех системах единиц численные значения абсолютной вязкости одинаковы. В технической литературе нередко используется термин «кинематическая вязкость», которая представляет собой произведение абсолютной вязкости на величину, обратную плотности жидкости.
Любую жидкость, вязкость которой при постоянных давлении и температуре постоянна и не зависит от скорости сдвига, называют ньютоновской. Свойствами ньютоновской жидкости обладают все газы и многие гомогенные жидкости. Однако большинство жидкостей не являются гомогенными; так, у многих культуральных жидкостей вязкость меняется с изменением скорости сдвига. Подобные жидкости называют неньютоновскими. Для них отношение напряжения сдвига к скорости ■сдвига равно кажущейся вязкости, которая, разумеется, зависит от скорости сдвига. Неньютоновские жидкости можно классифицировать по форме соотношения между напряжением сдвига и скоростью сдвига.
Очень многие культуральные среды для выращивания бактерий и дрожжей по существу являются ньютоновскими жидкостями даже при очень высокой плотности клеток, если только в среду не экскретируются в значительном количестве синтезируемые этими микроорганизмами биополимеры. Напротив, культуральные жидкости, в которых растут плесневые грибы или актиномицеты, часто являются неньютоновскими, причем степень отклонения их от поведения ньютоновских жидкостей зависит как от концентрации мицелия, так и от его морфологии. При удалении мицелия из большинства культуральных жидкостей плесневых грибов и актиномицетов они становятся ньютоновскими.
Многие культуральные среды для выращивания плесневых грибов и актиномицетов ведут себя как псевдопластические
жидкости, т. е. с увеличением скорости сдвига их кажущаяся вязкость сначала уменьшается. График зависимости напряжения сдвига от скорости сдвига для псевдопластиче- ской жидкости сначала имеет форму выпуклой кривой, а затем становится линейным. При экстраполяции линейного участка до пересечения с осью напряжений сдвига мы получим точку, отвечающую предельному напряжению сдвига. Для пластических жидкостей предельное напряжение сдвига соответствует предельной точке. На рис. 10.13 приведены
Рис. 10.13. Связь между напряжением сдвига и скоростью сдвига для жидкостей с разными реологическимиРис. 10.13. Связь между напряжением сдвига и скоростью сдвига для жидкостей с разными реологическимисвойствами.свойствами.типы зависимостей между напряжением сдвига и скоростью сдвига. Иногда мицелиальные культуральные жидкости оказываются тиксотропными, т. е. кажущаяся вязкость уменьшается не только с увеличением скорости сдвига, но и по мере перемешивания при данной скорости сдвига.
Рис. 10.13. Связь между напряжением сдвига и скоростью сдвига для жидкостей с разными реологическими
Рис. 10.13. Связь между напряжением сдвига и скоростью сдвига для жидкостей с разными реологическими
свойствами.
свойствами.
В общем виде зависимость между напряжением сдвига и скоростью сдвига для неньютоновских жидкостей имеет вид
(Ю8)(Ю8)где К и п — константы. Псевдопластическую жидкость можно в первом приближении охарактеризовать величиной предельного напряжения сдвига и пластической вязкости, т. е. наклоном прямолинейного участка зависимости между напряжением сдвига и скоростью сдвига в линейных координатах. Однако, если построить зависимость напряжения сдвига от скорости сдвига в логарифмических координатах, то линейный участок с наклоном 〃 и точка пересечения К будут определяться начальным участком графика. В истинных бингхэмовских пластических жидкостях движение начинается только после того, как напряжение сдвига превышает предельное значение. В псевдопласти- ческих жидкостях некоторое движение возникает даже при низких напряжениях сдвига. При одинаковой энергоемкости и одинаковой геометрии реакторы с псевдопластической жидкостью заметно отличаются от реакторов с ньютоновской средой по задержке газа, распределению пузырьков по размеру и времени перемешивания.
(Ю8)
(Ю8)
Вспомогательное оборудование, использующееся в биотехнологических процессах
Основное внимание в предыдущей части этой главы было уделено вопросам, связанным с центральным звеном любого биотехнологического процесса — биореактором. Однако, каким бы ни был процесс, это основное звено не может существовать изолированно. При получении высокоценных продуктов тонкого химического синтеза в биореакторах периодического действия иногда удается осуществлять некоторые дополнительные процессы, например приготовление и стерилизация сред, концентрирование и экстрагирование продуктов, хотя и не обязательно в оптимальных условиях. Несмотря на то, что концепция использования одного и того же элемента технологической установки для осуществления нескольких процессов представляет значительную ценность при получении некоторых продуктов, в целом она изжила себя. Исключение составляют приготовление и стерилизация сред. Все чаще, несмотря на возможное увеличение капитальных затрат, для каждой стадии технологического процесса применяется специально созданное оборудование. Это облегчает осуществление процесса в целом и повышает его эффективность.
При получении продуктов валового синтеза биотехнологическими методами из экономических соображений независимо от сырья или технологической схемы в промышленном масштабе обычно реализуют непрерывный процесс производства. Такие производства включают ряд последовательных или параллельных элементарных процессов, обеспечивающих надежное получение продукта на протяжении 300—330 дней в году. Основная задача состоит в оптимальном использовании ресурсов. К сожалению, подобный путь параллельного проведения элементарных процессов обычно затрудняет управление производством в целом и поддержание больших скоростей потребления сырья и образования продукта. Перечислим стадии, обычно составляющие полный непрерывный биотехнологический процесс: 1) хранение сырья, его предварительная обработка и смешивание; 2) проверка степени загрязнения; 3) переработка сырья с целью получения продукта; 4) концентрирование продукта; 5) отделение продукта; 6) конечная обработка продукта; 7) хранение продукта. Если говорить о капитальных затратах и эксплуатационных расходах, то на долю ключевого этапа производства приходится не более 30—40% от общего их количества. Отсюда сразу становится ясно, насколько значимы вспомогательные технологические этапы.
Разумеется, не все перечисленные выше стадии присущи исключительно биотехнологическим процессам. Некоторые из них
часто встречаются и в других технологиях. Однако есть операции, характерные только для биотехнологии: это, например, стерилизация сред и воздуха. При осуществлении некоторых других операций (например, концентрирование, сушка и хранение) должны учитываться особенности биологических материалов.
Стерилизация среды и воздуха
Обязательным условием осуществления многих биотехнологических процессов является работа в асептических условиях, поэтому решающее значение имеет стерилизация среды, а в •случае аэробных процессов — и воздуха. Тем не менее для разработки и оптимизации эффективных методов стерилизации сред и воздуха было сделано удивительно мало. В случае биотехнологических процессов жидкие среды стерилизуют исключительно нагреванием до высоких температур, а воздух, как лравило, лишь фильтрованием; мы обсудим только эти два метода стерилизации.
Рациональное конструирование стерилизаторов культуральных сред основывается на данных о кинетике гибели микроорганизмов. Нагревание вызывает потерю их жизнеспособности, но не физическое разрушение. Скорость инактивации микроорганизмов при данной температуре описывается уравнением
囲=ТМ (109) dt
где 々——зависящая от температуры константа скорости реакции, N — число потенциально жизнеспособных микробных клеток, / — время. Важно отметить, что в это уравнение входит число клеток или спор, а не их масса, фигурировавшая раньше в уравнениях роста. При стерилизации ключевую роль играет именно число клеток и спор как потенциальных центров инфекции.
Для вегетативных клеток кинетика гибели первого порядка [уравнение (109)] является хорошим приближением, хотя на нее может влиять и множество дополнительных факторов. Однако в случае спор наблюдаются отклонения от этого уравнения. И для вегетативных клеток, и для спор влияние температуры на константу скорости реакции К, входящую в уравнение (109), описывается формулой Аррениуса:
Jfe = ae-E/RT, (ПО)
где а ——эмпирическая константа, Е ——энергия активации, R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура. Преобразо-
вав уравнение (109) и подставив в него выражение для k, получим
~ = ае~Е^тdt,(111).
или в интегральной форме, приняв, что ^=^0 при /=0, t
In= —a) e-E/RT成.(112》
о
Цель всех процессов стерилизации состоит в уменьшении числа выживших потенциально жизнеспособных клеток и спор до- величины, меньшей единицы. Поэтому такие процессы лучше- всего рассматривать с вероятностной точки зрения. Стерилизацию среды можно проводить как в периодическом, так и в непрерывном режимах. В периодическом режиме тепловая обработка среды обычно бывает излишне продолжительной, что приводит к ухудшению качества среды. При непрерывном ре- жиме эти недостатки можно устранить.
Цикл периодической стерилизации состоит из трех стадий? нагревание, выдерживание (обычно при 121 ℃) и охлаждение. Инактивация клеток и спор происходит на всех трех стадиях;, поэтому, если время нагревания равно 力, время выдерживания—— 厶,время охлаждения —— 匕，а общая продолжительность цикла — /, то
m#自吟+］脸+ 1专
「4依收
(113>
где № и N2 — общее число выживших клеток и спор после нагревания и выдерживания соответственно.
При стерилизации в периодическом режиме стадии нагревания и охлаждения нередко бывают весьма продолжительными, а время выдерживания обычно составляет 0,3—0,5 ч при* температуре 121 °C.
Существует два разных типа систем для стерилизации среды в непрерывном режиме: системы с прямой инжекцией пара,, требующие сверхчистого пара, и системы с косвенным нагреванием с помощью теплообменников. Ясно, что системы обоих типов работают при повышенном давлении. Системы с прямой инжекцией включают инжектор пара, секцию для выдерживания, расширительный клапан и секцию для быстрого охлаждения. В установках с косвенным' нагревом среда обычно подвер-
гается предварительному нагреванию уже стерилизованной средой для возврата отработанного тепла. В систему входят 丁акже: безьшжекционный теплообменник, в котором среда менее чем за 1 мин нагревается до 135 ℃; секция, в которой среду выдерживают 3——5 мин при 135'℃; секция для быстрого ■охлаждения, где стерилизованную среду сначала охлаждают вновь поступающей средой, а затем — охлаждающей водой. Можно применять плоские теплообменники либо змеевики, однако предпочтение часто отдается первым: у них легче очищать поверхности теплообмена, которые быстро загрязняются при стерилизации многих сред.
При проведении непрерывной стерилизации следует помнить, что в среде, протекающей через теплообменники, всегда существуют градиенты скорости, и режим полного вытеснения не достигается. Поэтому при оценке вероятности выживания клеток и спор необходимо учитывать зависимость распределения времени пребывания среды в теплообменниках от режима потока в них.
Стерилизация среды имеет ключевое значение во многих биотехнологических процессах; не менее важна и стерилизация воздуха, используемого для аэрации. При этом из огромных •объемов воздуха, часто необходимых для осуществления аэробных процессов, следует удалить микроорганизмы размером до 0,5 мкм. Хотя выделяющееся при сжатии воздуха тепло способствует эффективному уничтожению содержащихся в нем ■микробов, воздух обычно необходимо также фильтровать через волокнистые спеченные или ацетилированные плоские фильтры из поливинилового спирта (ПВС). Удаление микроорганизмов с помсщью воздушных фильтров (кроме фильтров из ПВС) происходит не благодаря малому размеру пор, а вследствие того, что воздух проходит через фильтр очень сложным путем, из-за чего увеличивается вероятность соударения увлекаемых им микроорганизмов с фильтром. В подобных системах часто происходит значительное падение давления. Материал, из которого изготавливают фильтры и подводящие устройства, не должны разрушаться при стерилизации. Для обеспечения высокой производительности фильтры следует держать сухими.
Выделение продукта и завершающие операции
В биотехнологической промышленности применяют множество способов выделения конечного продукта и его завершающей обработки. Те же способы, за исключением предназначенных для разрушения клеток, широко используются и в других отраслях промышленности, поэтому здесь мы не будем рассматривать отдельные элементарные технологические приемы. Обсуждая
применение этих методов в биотехнологических производственных процессах, всегда следует помнить два момента: во-первых, необходимо предотвратить денатурацию продукта, которая может происходить из-за недостаточного охлаждения в ходе процесса, химического или биологического загрязнения, а также из-за разного рода биологических воздействий, если продукт получен в нестабильном состоянии. Во-вторых, всегда нужно учитывать потенциальную взрывоопасность и опасность для здоровья пыли белковой природы, которая скапливается после высушивания биологических продуктов. Обе эти проблемы должны учитываться при разработке эффективной технологии.
Перспективы развития промышленных биотехнологических процессов
В предыдущих разделах данной главы относительно подробно обсуждались ключевые аспекты применения химической технологии к биотехнологическим, преимущественно микробиологическим, процессам, а также теория и экономика промышленных технологических систем. К сожалению, данных, необходимых для дальнейшего развития биотехнологии, удручающе мало. Так, нам практически ничего не известно о физических свойствах микроорганизмов. Вместе с тем за последние сто лет огромных успехов достигли гидродинамика, химия поверхностей и процессов на границе раздела фаз, а также молекулярная биология, имеющие решающее значение для разработки биотехнологических процессов. Такое несоответствие совершенно недопустимо, особенно если учесть, что существует много методов, позволяющих получить необходимые физические данные о микроорганизмах, но ими просто не пользуются.
Напротив, кинетика биотехнологических процессов в большинстве случаев хорошо изучена и в последние годы широко использовалась для развития технологии. Но даже в этом случае еще не решены проблемы, возникающие при использовании полученных в лаборатории данных для анализа промышленных процессов и создания технологических схем. Остаются спорными вопросы, связанные с вариабельностью данных и с теми предельными значениями величин, которые можно использовать для систем, отличных от тех, для которых эти величины были получены. Например, вариация в коэффициентах выхода или конверсии в 15% может привести как к значительным коммерческим выгодам, так и к полному краху. Однако лишь немногие микробиологи, занимающиеся биотехнологией, могут дать более точные оценки этих коэффициентов, особенно если анализ процесса или разработка технологии должны быть осуществлены за короткие сроки. Другие типичные примеры того
же рода ——это влияние давления и количества растворенного углекислого газа, а также условий роста на размер микробов.
Что касается таксономических аспектов, то слишком многие микробиологические данные получены при условиях, весьма далеких от тех, при которых протекают интересующие нас процессы. Экстраполяция подобных данных нередко приводит к таким результатам, которые можно назвать мистикой или фольклором в микробиологии. Для разработки эффективных биотехнологических процессов крайне важны два момента： построение как умозрительных, так и основанных на реальных данных гипотез, их тщательная проверка в соответствующих условиях с целью их подтверждения или опровержения и одновременная разработка строгих теорий и установление законов, которым подчиняется поведение микробов в той среде, в которой их предполагается использовать. Только при таких условиях можно надеяться на успешное применение биотехнологии во многих областях промышленности в ближайшие десятилетия.
ЛИТЕРАТУРА
Aiba S., Humphrey А. Е„ Millis М F., 1973. Biochemical Engineering (2nd edn.), р. 434, Academic Press, New York.
Andrew S. P. S. (1982). Gas-liquid mass-transfer in microbiological reactors, Trans. Inst. Chem. Engrs, 60, 3—13.
Atkinson B.t Sainter P. (1982). Development of downstream processing, J. Chem. Tech. Biotechnol., 32, 100—108.
Bailey J. E.t Ollis D. F., 1977. Biochemical Engineering Fundamentals, p. 753V McGraw-Hill, Kogakusha, Tokyo.
Calderbank P. H. (1967). Gas absorption from bubbles, Chem. Engr. Lond., No. 212, Oct., 209—233.
Cooney C. L., Wang D /. C., Mateles R. /. (1968). Measurement of heat evolu- tion and correlation with oxygen consumption during microbial growth, Bio- technol. Bioengng, 11, 269—281.
Gaden E. L. (1959). Fermentation process kinetics, J. biochem. microbial. Technot. Engng, 1, 413—429.
Harder 诊.，Kuenen J. G., Matin A. (1977). Microbial selection in continuous culture, J. appl. Bacteriol, 43, 1 —24.
Herbert D.( 1961. A theoretical analysis of continuous culture systems. In： Continuous Culture of Micro-organisms, S.C.L, Monograph No. 12, pp. 21—53, Soc. Chem. Industry, London.
Johnstone R. E., Thring M. IT., 1957. Pilot Plants, Models, and Sea Те-up Methods in Chemical Engineering, p. 307, mcGraw-Hill, New York.
Monod /., 1958. Recherches sur la croissance des cultures bacteriennes 2nd edrr» p. 210, Herman, Paris.
Payne W.丄(1970), Energy yields and growth of heterotrophs, Ann. Rev. Microbiol., 24, 17—52.
Pirt S.丄，1975. Principles of Microbe and Cell Cultivation, p. 274, BlackwelT Scientific Publication, Oxford.
R〃dd D. F., Watson С. C, 1968. Strategy of Process Engineering, p. 466, John Wiley and Sons, New York.
Richards /.历(1961). Studies in aeration and agitation, Prog. ind. Microbiol., 3, 141 — 172.
Предметный указатель
Лгроцин 375
Азокрасители, биодеградация 281, 282
.Азотные удобрения 62
Актиномицины 157
DL-аланин 148
Алкилсульфаты 293
.Алкогольные напитки, производство 104— 114
Альгинат 225
Амидазы 170
а-Амнлаза (такадиастаза) нз Aspergillus oryzae 164
.Амилазы 167—169
чх-Амнлазы термостабильные из Bacillus 167
Амилоглюкозидазы 167—169
—из Aspergillus 103
„Амилопектин 169
Аминокислоты 14—15, 122—123, 147—155
—в качестве пищевых добавок 154—Г55
—образование у бактерий 147—150
— применение 154—155
—производство из биосинтетических .предшественников 151
— рацемические смеси 169—170
—синтез с помощью ферментов 151—154
Ампициллин 327
-Анаэробное разложение, образованне метана 65—66, 73—78
Анаэробные реакторы 260, .261, .262, 263
Антагонистическое действие гриба Trichoderma на патогенные организмы 372
Антибиотики 13, 155—161, 326—328
—аминогликозидные 159
—и конъюгация у Streptomyces 300—301
—получение с помощью Streptomyces 156—157
Антигены лейкоцитов человека (HLA)
331—332, 344, 346
Лнтитела моноклональные 16, 313—315,
329—333
Аргинин, биосинтез 148—149
Арилгалогены 288
Аскомицеты 301, 362
L-аспартат 149
Ацетон 133—135
Ацидогермофилы крайние 193—194
АТР, концентрация в активном иле 264
Базидиомицеты 301, 364
Бактерии, механические повреждения в биореакторах 415—416
—слияние протопластов 308—309
—характеристики суспензий 457—459
—экспрессия генов животных 315—316
^Безразмерные величины 430,431—432,
435—436
Белковые продукты 115—122
Еелок одноклеточных организмов (БОО)
15, 116—119, 397
из активного ила, концентрации аминокислот 273
состав 272, 273
отходов целлюлозно-бумажной промышленности 280
получение при участии
Candida 280
Бензилпенициллин 156, 158, 326, 327
Бензохинон 180, 181
Бензпирен 289
Бесклеточные системы 79—83
Биллирубнноксидаза иммобилизованная 171
Биогаз см. Метан
Биодатчики полупроводниковые 25
Биодеградация нефтяных загрязнений
—поверхностно-активных веществ 292—295 Биокатализаторы, оптимизация 185—186 Биологическая очистка газов 282—283 Биологический катализ в неводных средах 184—185
Биомасса 12, 20, 21, 22, 35—42, 47—52, 54
—коэффициент выхода 403—405
—получение химических веществ 172—177 Биопов!；еждеиия, авиационное топливо 243 —зерно 239
—камни 244
—клен 240
—масла нефтяные 243
—материалы 26, 236—244
—металлы 243—244
—определение и классификация 437—438
—пищевые продукты 239
—пластмассы 241—242
—.поверхностные покрытия (краскн, лаки)
一 шолиуретаны 242
—продукты животного происхождения -240—241
—резнна и пластмассы 241
—целлюлоза 239—240
—шерсть 240
Биополимеры 216—236
Биореактор вращающийся 250
Биореакторы, анализ размерностей и масштабирование 430—437
—классификация и производительность 418—430
—конверсия газовой и жидкой фаз 451— 454
—перенос кислорода 437—447
—(Периодического действия 418, 419, 421
—с доливом субстрата 418
— полунепрерывного (полупериодического) действия 418, 419
—проточные непрерывного действия с пол*
ным вытеснением (реакторы поршневого типа) 263, 420, 422, 428-430, 452, 4SS
—(идеальным) перемешивание
ем 260. 419, 420, 422, 423, 425—426, 453
—рециркуляция газовой и жидкой фаэ 453—455
—с вращающимися мешалками 436
—теплопередача и охлаждение 4474S1
Бнотопливные элементы 21, 83—86
деполяризующие 84—85
на основе неэлектроактивных веществ 84
—ферментов 85
Escherichia coli 84
регенерируемые 85—86
Бнофотолиз 22
Блеомицины 156
Бобовые культуры 28, 356—364
Болезни растений, биологический контроль 371—376
и Trichoderma 372
Болезнь Гоше 342
Брожение, образование полисахаридов 219—222
Бумажная масса, промышленное производство 176
Бутанол 133—136
Бутиленгликоль 136
Вакуумное брожение 72
Вакцины 339—340
Вещество S Рейхштейна 162, 163
Винибластин 174
Винкристии 174
Вино 109—111
Виноделие, использование Botrytis cinerea 111
Hansenula saturnus ПО
Вирус гепатита В, антиген 319, 320, 340
—ящура, капсидный белок 819, 320
Витамины 123
Водные растения как источник биомассы 39, 54-57'
Водород, получение путем биофотолиза 22, 80—82
Водоросли 22, 54—57, 250, 251
Водяной гиацинт, получение биогаза 54
Восстановительный пентозофосфатный цикл
(ВП-цикл) 42—43, 45, 46
Восстановленные соединения серы в отходах, разложение 282—283
Вредители сельскохозяйственных культур, борьба с помощью Bacillus 28, 397
Выщелачивание кучное 200
—чановое 200
—in situ 198—199, 203—204
Галакюзооксидаза 180
Галофилы ацидофильные 186
Геллан 226
Гемоглобинопатии, диагностика 342—344
Генетическая инженерия, опыты in vitro 315—322
——прикладные аспекты 320—321
Генри закон 438
Геи тирозил-тРНК—синтетазы нз stearoihermophilus 183—184
Гетерокарионы 302, 310, 388—389 Гибридизация путем скрещивания —соматических клеток 387—390
BacillusBacillus300—303300—303путемпутемГибриды растений, образованиеслияния протопластов 311—312
Bacillus
Bacillus
300—303
300—303
путем
путем
Гндроколлоиды как пищевые добавки 124
Гидролазы 151
Гидрохинон 180, 181
Гликоген, синтез 229, 233, 234
Глицин 123, 155
Глутамат, ATP-зависимое аминирование
154
L-глутамнн 148
Глутаминовая кислота 123
Глюкоамилазы из Aspergillus niger 168
Глюкозооксидаза, ферментный электрод 341
Глюконовая кислота 122, 141—143
——натриевая соль 142
D-глюконовая кислота, производство пр» участии Aspergillus niger Ml
Говядина и микопротенн, сравнение среднего состава 122
Гормоны половые стероидные 163, 328—329*
Грибная гниль 373
Грибы, парасексуальный цикл 302—303
—плесневые, механические повреждения в，биореакторах 415—416
—системы скрещивания 301
типы спаривания у Saccharomyces cerevisiae 301
—слияние протопластов 309—311
—характеристика суспензий 457—459
Датчики 19, 25, 340—342
—контролирующие содержание глюкозы 19, 29
ДДТ, биодеградация 291
Декстран 124, 223—225
Декстрозный эквивалент (ДЭ) 103, 169，
Детергенты, разложение 293—294
Диабет 19, 334—338, 344—345
Диарея 307
Дигоксин 174, 333
Диплонды 309—310
ДНК. включение в векторные плазмиды- Bacillus 317
Saccharomyces 317
—химический синтез 182
ДНК-лигаза фага Т4 317, 318
Древесина 39—40, 53—54
Древесная пульпа 278
щелочная варка (сульфатный про- цесс) 278
Дрожжи Torula 94
L-DOPA 153
Железо, окисление 191, 192, 194
—трехвалентное 192, 194
Жирные кислоты полинен асыщенные 123
Жиры и масла 123
Загустители 26, 124, 225
Занфло 226
Зерновые как продуценты крахмала 40, 41
Изменчивость 383—384
Изоглюкоза, получение с помощью Strep- tomyce^ 104
L-изолейцин 149
Иммуногистохимия 330—331
Инвертаза 169
Ингибирование по принципу обратной связи в биосинтезе аминокислот 148—150
Инженерия белка 182—184
Инокуляция растений везикулярно-арбу- скулярной микоризой 367——371
—семям бобовых бактериями Rhizobtarn 358—363
Инсулин 320, 334—338
、猊^嚼±3翳У“енне с помощью 国混一 Интерферон 18, 29, 315, 334, 338-339 Ион-селекгивный транзистор на основе по
левого эффекта 346
Итаконовая кислота, получение при участии Aspergillus 122, 144у
Йогурт 101
^^осУС, образование из протопластов 385—
Капуста, квашение 124—125
Карбоангидраза 171 Карбоксиметнлсукцинат (КМС) 294—204 Карденолиды 174 ^-Каротин 123
Каучук 58—59, 60
Кинетика образования продукта в перио- 瑞咒眾 * кУльтурах микроорганизмов
Г" Роста микроорганизмов 405—407 ахислород, перенос в биореакторах 437—447 нз воздуха в жидкость, модель Дан- квертса 438, 4414 H
Льюиса—Уитмена 438—Льюиса—Уитмена 438—447447Хигби 438, 441Хигби 438, 441Клен 123—124Клен 123—124Клокациллин 327
Льюиса—Уитмена 438—
Льюиса—Уитмена 438—
447
447
Хигби 438, 441
Хигби 438, 441
Клен 123—124
Клен 123—124
К 専写，поглощение микроорганизмами Кожевенная промышленность 166 240 Конверсия в биореакторах 451—454
К：驚РвнР°ванне мясных продуктов, роль микроорганизмов 116?
Конъюгация у бактерий 300—301 ррм для животных 15, 271—274 Корончатые галлы 373—376
Кортизон 16
К°62НКОСТеР°Н (вещество S Рейхштейна) Кофакторы, повторное использование 186— Коэффициент выхода биомассы 403—405 продукта 404—405
Крахмал, продукты гидролиза 103—104 105 ~ Уровень производства 40—42，
§сантан 22, 222-223, 232-233
Ксантиноксидаза 180
* 曝1° 嘰ЕИкИ‘биодеградация 274—275,
工-РОЛЬ Pseudomonas 285, 286, 292
Кукурузный сироп с высоким содержанием фрук7озы 104, 167А р иием
Культуры тканей 172-174, 4Г5, 416
Курдлан 228'
<Пайнуивера—Бэрка график 407
Лактоза, сбраживание дрожжами 277
-Латекс, образование в растениях 59
』嚣額黑^н 廟^ препараты, направленное ~ — передозировка 333—334
器鬻目黑已謬ва^е в реакциях дезами-
Лнгннн 63, 64, 175—177
Лигносульфонаты 278, 279—280
—盟汲曬7°ванне при участии Pseudo-
Лигноцеллюлоза 175—177
—разложение 63—65
•^нзнн 15, 23, 149, 150, 151, 154
Лимонная кислота 122, 129, 137—141
образование дрожжами Candida 139
получение из целлюлозы 139
"Г — процесс Коджи НО
Лимоннокислое брожение 94
Лишаиники, разрушение камней 244
facna растительные 57—58 60 61
Масличные растения 57—61，，
耀蹴湍體не спеииальннх штам， Медицина 14, 17-19, 325-347 総跣奩記哈产анне 195—197, 200 ”北皆對i с избирательной проницаемо*
、丄口 OMU
Мембраны хлоропластов 80—81Металлопротеазы 166 Металль!. бактериальное 191—204Мембраны хлоропластов 80—81Металлопротеазы 166 Металль!. бактериальное 191—204выщелачиваниевыщелачивание，^^产睜 комплексообразование 206,
Мембраны хлоропластов 80—81
Металлопротеазы 166 Металль!. бактериальное 191—204
Мембраны хлоропластов 80—81
Металлопротеазы 166 Металль!. бактериальное 191—204
выщелачивание
выщелачивание
осаждение 206, 207—209
—внутриклеточное накопление низмами 206, 210—216
мякроорга-мякроорга-—перевод в летучую форму 206 207
мякроорга-
мякроорга-
一2潔第駐 с клеточной поверхностью ~ма^^512Гб ^створов микроорганиз- М6ба173-78ЭР°бНаЯ переработка сырья 65— -2 鼠嚟嗨 13f 65-66, 73-78, 258- 讎 тноннн 123, 149-151, 153, 154
352-353В°ДНЬ1Х кУЕур (гидропоника)
—Мильштейна, получение ных антител 313, 314
моноклональ-моноклональ-一 питательной пленки 351—356, 369—370 ~ слияния протопластов 386—390 Микропротеин (грибной белок), получение
моноклональ-
моноклональ-
^помощью Fusarium grammearum ^ М凱op玄за везнкулярно-арбускулярная 364— Микробиологическая переработка отходов —биологический контроль 264—266 ，具， м„~ 73 контроль за патогенностью 267—268 雌噜肾「веское производство, выделе- нне конечного продукта 463—464
культуры микроорганизмов 401—403 :2〕記嚼宓40?跄鍔Ом*н℃тЬ 12—纵 丝農識謎嚣甯。一體叫誤ме爲爲6 Молоко с гидролизованной лактозой 99 —сквашивание 93—95°"”
° низким содержанием лактозы in?
Точная кислота, образовав 137 277
при участии Lactobacillus 137 一般概党芻％喘^睜上吟吵 Молочные продукты 93—102 169 !7i 也0丝 соотношение 406, 412’ 424 427 Морфолин 257%4〃
Мутагенез 183—184, 297—299 —сайт-специфический 183—184
Н弱产 содержание питательных веществ 叱需駕Г1蹈彳产М в салициловую Нафталинсульфоновая кислота 288
Нейтраза, ее роль в созревании сыров 99
Нервные газы фосфоорганическне, обезвреживание 171
Нефть, биодеградация загрязнений 290— 291
Никотин 257
Нитрилтриацетат (НТА) 294—295
Ннтротолуолы 289
•Окисление и оксигенация 178—179
Окислитель и ускоритель вулканизации 257
Окружающая среда, влияние биотехнологии 14. 17, 26—27, 202, 246—295
Оксигенатор Дорра—Оливера 256
Оксидиацетат (ОДА) 294
2-оксоглутаровая кислота, получение при участии Candida 144
Оливки 125
Опухолевые маркеры 332
Органические кислоты, производство 136—— 147
—растворители, бродильное производство (ферментация) 133—136
Осахаривание 103, 105
Отходы, извлечение полезных веществ 270—274
—переработка анаэробная 13, 14, 27, 258— 263, 378—382
получение метана из навоза 27, 379—380, 381
аэробная 249—257, 376—378
с помощью активного ила 250—256
—превращение в микопротеин (грибной белок) 278
—промышленные, переработка биологическими методами 13—14, 26, 274—283
—использование пленок микро
организмов 276
Папаин 182
Парасексуальный цикл у грибов 302—303
Паратионгидролаза из Pseudomonas sp., детоксикация паратиона 292
Патогенные микроорганизмы при анаэробном разложении отходов 267—268
Пектины, расщепление ферментами 114, 127
ТТенициллин 155—158, 326—328
—мутагенез и отбор 297, 298, 299
Пенициллин азы (р-лактамазы), их ингибиторы 160
Пенициллиновая кислота 158, 160
Пепсин 166, 171
Периодическая культура микроорганизмов, днауксичный рост 413
образование продукта 407—408, 409
Перколяционные фильтры 249—250, 276
Пестициды, детоксикация 291—292
Пивоварение П, 106—108
Пигменты 123, 280—281
Пикули 125
■Пиридоксальфосфат 152—154
Пирит, окисление 192, 194
Пищевые добавки 122—124, 223
—продукты и напитки, промышленное производство 14, 15, 23, 91—127
использование дрожжей Candida 15, 119
Плазма крови, заменители 224
Плазмида RI Escherichia coli 306
—Ti 373—374, 390
Плазмидные гены Rhizobium, участие в фиксации азота 305—307
Плазмиды вирулентности патогенных
штаммов Escherichia coli 307
—включение ДНК 316—318
—генетические перестройки in vivo 300— 301, 303—308
—генм устойчивости к лекарственным препаратам 304—305
—перенос генов из клеткн-хозяина 300, 303
—репликация в клетках Escherichia coll 304—306
Пластмассы 26, 236
Подкислители 122
Подсолнечник, выход масла 57—58
Поли-р-гидроксибутират (ПГБ) 26, 234—236
Полисахариды 124, 217—234
—биосинтез 229—232
—образование при брожении 219—222
у Pseudomonas 226, 234
Rhizobium 234
Полистирол 289
Политран (склероглюкан) 227
Полифенилен 236
Полихлорбифеннлы (ПХБ) 289
Полиэтиленглнколь (ПЭГ) 309, 311, 312, 387, 390
Половые гормоны 163
Преднизолон 162, 163
Предшественники аминокислот 151
—антибиотиков 157—158
Пренатальная диагностика наследственных болезней 342—344
Прогестерон 16, 161, 162
Проинсулин, синтез в клетках Escherichia coli 319—320
L-пролин 148
Протеазы 165—166
■—■ BaciHus 165— 166
Протопласты, использование в селекции растений 382—390
— методы слияния 386—390
——слияние у бактерий и грибов 308—311
Прутин 15, 118
«Псевдоожиженный слой», переработка отходов 256—257
Пуллулан 228
Пуллуланаза 169
Радионммунологический анализ 329—330
Размножение вегетативное 382—386
Рак 332, 338
Реакторы см. Биореакторы
Регенерация растений из протопластов
384—386
Редокс-меднаторы 85
Рестрнктазы 317
Рестрикционные фрагменты, полиморфизм по длине 344, 345
Рециркуляция газовой и жидкой фаз в биореакторах 453—455
Рибофлавин 123
Рибулозобифосфат-карбоксилаза (РВФК)
42, 45. 46
Рифамицнны 157—158
Рост микроорганизмйв, модели 405—407
сродство к субстрату 410—414
Салициловая кислота 144—147
образование у Pseudomonas 144
Самоклонирование 321
Сахар, получение этилового спирта 58, 61, 62—63, 66—72
—уровень производства 40—42
Сахара, образование прн сульфатной варке целлюлозы 278
Селен в составе аминокислот 153, 154
Сельскохозяйственные культуры, производство сахара и крахмала 40—42
Семена бобовых, дражирование 362
Сера, окисление 192, 193, 194
Серповидноклеточная анемия, диагностика н лечение 342—344, 347
Сидр 113—114
Симбиоз бактерий Rhtzobtum и бобовых 356, 357, 363, 364
Слияние клеток животных 312—313, 314
маркеры устойчивости к химическим веществам 312
—протопластов, гибридизация соматических клеток 387—390
грибов 309—311
межвидовое 309, 310
——образование гибридов растений 311— 312, 386-390
——у Bacillus 308
Saccharomyces 309, 310
Streptomyces 309
Сметана, использование культуры бактерий 102
Соевые бобы, получение белковых продуктов 115, 125—127, 166
Соевый соус, нспользоваиие Aspergillus oryzae 126
Солнечная энергия, использование в бесклеточных системах 79—82
——технология получения биомассы 35— 42
Солод 106—107
Соя, выход масла 57—58
Стокса закон 457
Сточные воды 54, 56, 247, 249, 252, 264
——анаэробное разложение в реакторах различных типов 261, 262, 263
ила в тэнке Имхоффа 263
——очистка 205, 247, 255, 261, 279, 290— 291
повторное использование
Стерилизация воздуха 463
—сред 460, 461—463
Стероиды 16, 161—164, 328—329
—андростаны 163
—эстраны 163
Стрептомицин 156
Субтилизин Carlsberg 165
Сукциьоглюкан 234
Суспензии клеток, их характеристики 457— 459
Сыворотка 100, 169, 277—278
Сыроварение, использование протеаз Еп- thothia parasitica 166
——протеиназы (нейтразы) Bacillus 99
Aspergillus oryzae 100
——Brevibacterium linens 99
——Propionibacterium 95
一 получение заменителей сычуга нз Мисог miehei 97—98
Сыры, производство 95—100, 116, 165, 166
—созревание при участии Pseudomonas 100
Сычуг и его заменители 97—98, 165, 166
p-Талассемия, пренатальная диагностика 344
Термофилы умеренные 193
Терпены 170
Тетрациклин 155, 156
Техника безопасности и контроль продукции 32—33
Технология рекомбинантных ДНК, применение в медицине 334—347
Тиофен-2-карбоновая кислота 257
Тнпирование тканей человека 331—332
L-тирозин—феиол-лиаза(р-тирозиназа>
152—153
Топливный элемент кнслород-водородныЛ 83, 84
Топливо, использование биологических источников 21—22. 61—78, 258—263, 378—382
Тотипотентность растительных клеток 382
Трансглюкозилаза 168
Транспозоны 307—308
Трансформация бактерий 318
Треонин 149, 150, 151
L-триптофан—индол-лиаза (триптофаназа> 152—153
Углеводороды, образование в растениях 58. 59—61
—полиароматические 289—290
—получение из водорослей 56
—хлорпроизводные 287—288
Углекислый газ, образование в анаэробных условиях 258, 259
Удобрения 270-—271
Уксус 115, 136—137
—получение прн участии культур Aceto~ bacter 115
Уксусная кислота 136—137
образование при получении метана 77
Уран, выщелачивание 197—198, 200
—накопление в микроорганизмах 213—214, 216, 217
Усилители вкуса 123
Фаговые векторы, включение ДНК 316
Фенилглицин 159
Ферментация, получение белковых продуктов 115—116 этанола 65—70
Ферментер колонный эрлифтный 251, 252, 275
Ферменты 9, 16
—гидролитические (гидролазы) 151—152
—использование в коммерческих целях 164—171
медицине 340—342
—производство фруктовых соков 127
—синтез аминокислот 151—154
Ферменты, созревание сыров ЮЭ а-Фетог;ротеин 332
Фиксация азота 28
и плазмидиые гены 306—307
плазмиды Rhizobiutn 306—307
при участии клубеньковых бактерий и бобовых 356—364
симбиоз Rhtzobtum и бобовых 357, 363, 364
Фотосинтез 42—51
—интенсификация 48—51
—эффективность 47—48
Фотосинтезирующие бактерии 79
Фотосинтетически активная радиация (ФАР) 45, 47
Фруктовые соки 127
Фруктозные сиропы 167
Фрукты и овощи 124—127
Халькопирит 193
Химические соединения 23—25, 132—164, 173, 175-177
определение токсичности 171
получение с помощью биокатализаторов 133, 134
Химотрипсин 185
Хинин 257
Хитин 177 Хлебопечение 102—103..
—использование Saccharomyces cerevLSiae
102
Холинэстераза 171
Хорея Хантингтона 345
Целлюлоза 63Т4, 175—176
_ образование у Acetobacier xyltnum 177
——一 Trichoderma 64
—сульфатная варка 278
Цефалоспорин 309, 326
— С 160, 327
Цианид, детоксикация 283
с помощью родоназы Bacillus 2оЗ
Цистеин 151, 152, 154
Сграстения 46, 47
Шиконин 173
Экзоамилазы 168
Экспрессия генов животных у Saccharomyces cerevisiae 315
—клонированных генов 319—320
у Bacillus 319, 320
Электроэнергия 21, 82—83
Эмбдена—Мейергофа—Парнаса м ета боличе- ский путь 106
Эмульгаторы 25, 26, 397
Эндоамилазы 167—168
Этнленгликольдиацетат (ЭГДА) 294
Этиловый спирт, образование из глюкозы 105
一 —перегонка 112—113
——периодический способ получения 69 Этиловый спирт, производство 58, 61, 62— 63, 66—72, 112—113
использование Saccharomyces 68, 72, 105, 107, ПО, 112, ИЗ
Челночные векторы 317
Яблочная кислота 114, 122, 144
Указатель латинских названий
Klebsiella 64, 300
—aerogenes 364
—pneummoniae 136, 364
Kloeckera 110, 114
Kluyveromyces 68
—fragilis 277
—lacUs 309, 310
—fluorescens 100
—putida 236, 300
Aceiobacter curvim 115
—orleanense 115
—schuetzenbachii 115
—xylinum 177
Achromobacter 254
Actinoplanes missouriensis 104
Aerobacter 148
Aeromonas 64
Agrobacterium 300, 303
—radiobacter 324
—tumefaciens 373, 374, 390
Alcaligenes 227—228, 235
——eutrophus 397
—faecalis 137
Arthrobacter 104, 139, 228
—globiformis 151
—oxydans 137
—simplex 163
Ashbya gossypii 123
Aspergillus 144, 302, 310
—flavus 122
—Mger 103, 122, 139, 141, 168, 309
—oryzae 103, 126, 164
—tatnarii 126
Aureobasidium pullulans 228
Azospirillum 300
Azotobacter beijerinckii 235
—vinelandii 220, 233
Chorophyceae 250
Cladosporium resinae 243
Clostridium 136
—acetobutylicum 134
—saccharobutyricum 113
—thermocellum 64, 176
Cor у neb act er turn 139, 144
—glutamicum 123, 148, 150
—michiganese 268
Cruclfarae 365
Cunninghamella blakesleeana 162
Curvularia lunata 163
Cyanophyseae 250
lactobacillus bulgaricus 95, 96, 101, 277
—casei 95
—helveticus 95, 96
—Zactis 95, 96
Leguminoseae 365
Leptospir让turn ferrooxidans 192
Leuconostoc citrovorum 95, 101
—dextranicum 95, 101
—mesenteroides 124, 223, 224
Litho&permum erythrorhlzan 173
RhizobSm 30Q 357—362, 364
—leguminosarutn 306, 307
—meliloti 307, 359
一 phaseoli 306, 307
一 trifolii 234, 307, 364
RMzopus 122, 168
—aerhizus 16
Debaryomyees phaffU 110
Dunaliella bardawil 56
Medtcago saliva 359, 383
Metazoa 250
Meth ar.osarcina barkeri 381
Methanospircllum hungaiei 381
Methylophilus methylotrophus 15, 321, 322
Microbacterium 148
Micrococcus 212
—gluiamicus 133
Mucor miehei §7—98
—racemosus 310
Mycobacterium globiforme 163
Saccharotnyces 112, 113, 177,
213
—carlsbergensis 105, J07, 110
107,
110,
—cerevisiae 15, 68, 72, 102,
105,
115, 213, 214, 217, 301, 309,
—diastaticus 68
—uvarum 68, 110
Salmonella 267, 274, 300
310,
315,
317
Schizophyllum commune 144, 301,
Sclerotium glucanicutn 227
—rolfsii 372
Serratia marcescens 151
Sporotr:chum 65
—pulterulentum 278
Streptococcus 95, 96. 101. 224
Streptomyces 104, 300, 301, 318
—coelicolor 300, 309
—parvulus 157
—rimosus 301
—verticillus 156
311
Endogonaceae 364—365
Endotnycopsis lindneri 110
Entamoeba hystolitica 268
Enterobacter aerogenes 136
Enterobacteriaceae 305
Enthothia parisiiica 166
Epistylis 253
Eremothecium ashbyii 123
Ericaceae 364
Nitrobacter- 254
Nitrosotnonas 254
Kocardla 144, 185, 300
—mediterranei 157
Orchidaceae 364
Erwinia 300
Bacillus 148, 235, 301, 317, 320
—amyloliquefaciens 166, 167
—lichenifonnis 165, 167
—megaterium 213, 318
—polymyxa 213
—stearothermophilus 183, 283
—subtilis 99, 113, 126, 165, 308, 318
—ihermoproteolyticus 166
—thuringiensis 28, 397
Beijerinckia 228
Boiryococcus braunii 56
Botrytis cinerea 111
Brevibacterium 139, 148
—flat urn 123, 150
—linens 98
—herbicola 152—153
—tahitica 226
Escherichia 148
鳶ХЖ 紀5俨母 322, 335, 337. 415
Euphorbia 59
Ferrobccillus 254
Ferrovibrio 192
Flavobacterium 254, 257, 281, 282
Fontes annosus 373
Fusarium 268, 269, 302
—graminearum 119—121
—oxysporum 268, 269
—solani 137
Paecilctnyces variotii 278
Paracolobactrum 144
Parthenocissus tricuspidata 386, 390
Penicillium 139, 302, 310
—chrysogenum 156, 298, 309, 326
—citrinum 123
Peniophora gigantea 373
Petunia hybrida 386, 388
—parodii 388
Phanerochaete chrysosporium 177
Phaseolus vulgaris 369
Phycomyces blakesleeanus 310
Plchia 310
—fermentans 110
Pinus radiata 54
Propionibacterlum 95
Pseudomonas 144, 213, 234, 254, 280, 286, 292,
300, 303
—aeruginosa 216, 234, 300
—elodea 226
Thieghemella orchidis 162
Thiobacillus 254
—acidophilus 192
—ferrooxidans 191, 192, 195, 197
—orgaroparus 192
—thiooxidans 192, 197
Torula 94
Torulopsis 110
Trichodertna 372
—reesei 64, 311
—piride 64, 139
Trichospora fermentans 64
Triiolium subterraneum 362
Vaginocolidae 253
Vancheria dichotoma 387
Vitis viniferci 109
Varticella 253
Xanthamonas 220—222. 233
Yarrowia 309, 310
Zea mays 369
Zoogloea 250, 251
Zymomonas mobiUs 69
Candida 119, 139, 280
—arborea 15
—hydrocarbofumarica 144
—intermedia 277
—krusei 277
—pulcherrima 110
—scottii 110
—tropicalis 309, 310
—util is 15, 280
Catharanius roseus 174
Cephalosporiutn 303, 326
—acremoniutn 309, 310
Chaeiomicum cellulolyticum 278
Geotrichum candidum 309, 310
Globodero 268
Gluconobacter 144
— suboxydans 154
Gramineae 365
Halobacterium 82
Hansenula saturnus llo
Hevea 58, 60
Hyphomicrobium 283
5 75 78 8n1417172023232526272829313233338 8n14171720232325262728293132333335355 珍927811347113 3344455555665 珍927811347113 334445555566
5 7
5 7
8 8n141717202323252627282931323333
8 8n141717202323252627282931323333
35
35
5 珍92781134711
3 334445555566
5 珍92781134711
3 334445555566
Предисловие редактора перевода .
Предисловие
Глава 1. Что такое биотехнология? 〃. Хиггинс
Введение
Исторические перспективы
Развитие биотехнологической промышленности после второй мировой войны
Перспективы развития биотехнологии
Медицина
Энергетика
Пищевые продукты и напитки
Химические соединения
Материалы
Окружающая среда
Сельское хозяйство
Экономические и коммерческие аспекты биотехнологии . . .
Логика развития биотехнологии
Защита авторских прав в биотехнологии
Правила техники безопасности в биотехнологической промышленности и контроль продукции
Заключительные замечания .
Литература
Глава 2. Энергия и биотехнология. Д. Холл, Дж. Кумбс, И. Хиггинс
Введение
Получение биомассы: технология, основанная на солнечной энергии
Ресурсы
Фотосинтез
Эффективность фотосинтеза
Интенсификация фотосинтеза методами биотехнологии
Сельское и лесное хозяйство
Соотношение видов энергии
Древесина как сырье для производства биотоплива ..
Водоросли и водные растения
Масличные растения
Переработка и различные виды топлива
Производство исходного сырья
Ферментация
Этиловый спирт
Энергобаланс
5. Получение метана в анаэробных условиях ....
26 Бесклеточные системы .
Комбинированные системы, образующие водород ...
2. Электроэнергия
Биотопливные элементы и другие биоэлектрохимические устройства Литература
Глава 3. Пищевые продукты, напитки и биотехнология. Г. Бич, М. Мелвин, Дж. Таггарт
Введение
Микроорганизмы и пищевые продукты
Две разновидности биотехнологии
Границы применения биотехнологии в пищевой промышленности
-3.2. Молочные продукты
Общие сведения
Сыр
Йогурт
Масло
Сброженная пахта
Сметана
Новые продукты
Хлебопродукты
Хлеб и другие продукты
Продукты гидролиза крахмала
Бродильные производства
Производство алкогольных напитков
Пиво
Вино
Спирт
Сидр
Уксус
Белковые продукты
Традиционные белковые продукты, получаемые путем ферментации .
Белок одноклеточных организмов
Грибной белок (микопротеин)
Пищевые добавки и ингредиенты
Подкислители
Аминокислоты
Витамины и пигменты
Усилители вкуса
Жиры и масла .
Растительные клеи и загустители
Фрукты и овощи
Консервированные овощи
Продукты из сои
Применение ферментов при выработке фруктовых соков
Заключение
Ближайшие перспективы .
Отдаленные перспективы
需^2^3 黑 ^ 8^ 罂器101101101102102102102103104104106109112璃115^^^^^^^m^^^^^^^^^需^2^3 黑 ^ 8^ 罂器101101101102102102102103104104106109112璃115^^^^^^^m^^^^^^^^^Литература
需^2^3 黑 ^ 8^ 罂器101101101102102102102103104104106109112璃115^^^^^^^m^^^^^^^^^
需^2^3 黑 ^ 8^ 罂器101101101102102102102103104104106109112璃115^^^^^^^m^^^^^^^^^
32^^^^^^^м^^^пте^878811 11 IX 1 11 11 11 11 и »1 11 11 1* 1 «1 1i 1132^^^^^^^м^^^пте^878811 11 IX 1 11 11 11 11 и »1 11 11 1* 1 «1 1i 11Глава 4. Химия и технология. Д. Бест
32^^^^^^^м^^^пте^8788
11 11 IX 1 11 11 11 11 и »1 11 11 1* 1 «1 1i 11
32^^^^^^^м^^^пте^8788
11 11 IX 1 11 11 11 11 и »1 11 11 1* 1 «1 1i 11
Введение
Развитие современной химической биотехнологии .
Бродильное производство растворителей
Производство органических кислот
Другие органические кислоты
Аминокислоты
Антибиотики и стероиды .
Коммерческие аспекты применения ферментов...
Получение химических веществ из биомассы .
Биотехнология на основе растительных клеток...
Химические вещества, получаемые из биомассы...
Перспективы развития
Тип реакции
Конфигурация реактора
Будущий вклад биотехнологии в химическую промышленность
Литература
о 01248 576919ш^^^ю адмммо 01248 576919ш^^^ю адмммГлава 5. Материалы и биотехнология. К. Брайерли, Д. Келли、К. Сил, Д. Бест
о 01248 576919ш^^^ю адммм
о 01248 576919ш^^^ю адммм
Введение
Микробное выщелачивание
Выщелачивающие микроорганизмы ...
Промышленное применение биоэкстрактивной металлургии
Возможности применения бактериального выщелачивания
Превращение, накопление и иммобилизация металлов микроорганизмами
Перевод в летучую форму
Внеклеточное осаждение
Внеклеточное комплексообразование
210216216217219222229232234236236236237238244210216216217219222229232234236236236237238244Внутри- и внеклеточное накопление металлов микроорганизмами *.*..
210216216217219222229232234236236236237238244
210216216217219222229232234236236236237238244
Биополимеры
Введение
Полисахариды
Образование полисахаридов при брожении .
Микробные полисахариды: свойства, применение и коммерческая ценность
Биосинтез полисахаридов
Подходы к усовершенствованию производства микробных полисахаридов
Поли-р-гидроксибутират
Другие полимеры, образуемые микроорганизмами ..
Биоповреждение материалов
Введение
Определение биоповреждений
Классификация процессов биопо вр еж дени я.
Материалы, подверженные биоповреждениям . Литература
6 6 7 9242424246 6 7 924242424Глава 6. Окружающая среда и биотехнология. Д. Бест, Дж. Джонс^ Д. Стаффорд
6 6 7 9
24242424
6 6 7 9
24242424
Введение
Переработка отходов
Аэробная переработка отходов
6.3.
6.4.
6.5.
Анаэробное разложение•-••■ „ ■
Биологический контроль за системами микробиологической переработки отходов Контроль за патогенностью Извлечение полезных веществ
Вода
Удобрения
Корма для животных
6.6. Биологическая переработка промышленных отходов 661. Отходы молочной промышленности; сыворотка 662. Отходы целлюлозно-бумажной промышленности
Отходы от производства красителей ..•
Биологическая очистка газов .
6 7. Биодеградация ксенобиотиков в окружающей среде .
* 6.7.1. Участие микробных сообществ в биодеградации
ксенобио
тиков
Хлорпроизводные углеводородов .
Другие замещенные простые ароматические(
Полиароматические углеводороды .•-•
Биодеградация нефтяных загрязнений ••
Пестициды .
Биодеградация поверхностно-активных веществ Литература
Глава 7. Генетика и биотехнология. К. Харди, С. Оливер
7.1.
72
7.3.
Введение
Традиционные способы увеличения продуктивности- 7.2.1. Мутагенез и отбор 7.2.2. Гибридизация путем, скрещивания• •
Генетические перестройки in vivo 7.3.1. Плазмиды . 7.3.2. Слияние протопластов-•
штаммов
7.3.3. Слияние клеток животных
74 Опыты по генетической инженерии in vitro .•
' 7.4.1. Технология
7.4.2. Экспрессия клонированных генов ..-
743. Прикладные аспекты генетической инженерии
7.5. Итоги и перспективы . Литература
Глава 8. Медицина и биотехнология.Д^* Пикап
&2： Немодифицированные и мутантные клетки и синтезируемые имисоединения
Антибиотики
Культуры других клеток
Различные варианты биоконверсии
8.3. Модифицированные клетки и образуемые ими вещества .
.1. Моноклональные антитела ..
Технология рекомбинантных ДНК
4 Применение методов молекулярной генетики и технологии реком
'бинантных ДНК в медицинской диагностике и патологии .
Пренатальная диагностика наследственных болезней .
Роль генетических факторов в патологии .
.5. Перспективы развития Литература*
258體翁訳銷裔g翳霑2902nli幾^體粼懇霑霏31g魏3g.
325痂歌魏侬魏黑344t翳
о 11 и 3 43535353535о 11 и 3 435353535355556668892344701123667 8891122460555555^^56666677777777 767888888905333333333333333333333 ззззз&зззз5556668892344701123667 8891122460555555^^56666677777777 767888888905333333333333333333333 ззззз&зззз5 59 93 35 59 93 313504 о о о 114 4 4 4 413504 о о о 114 4 4 4 46 8 0 7 7113 3 44 4 4 4 ф6 8 0 7 7113 3 44 4 4 4 ф
о 11 и 3 4
3535353535
о 11 и 3 4
3535353535
5556668892344701123667 8891122460
555555^^56666677777777 7678888889
05333333333333333333333 ззззз&зззз
5556668892344701123667 8891122460
555555^^56666677777777 7678888889
05333333333333333333333 ззззз&зззз
5 5
9 9
3 3
5 5
9 9
3 3
13504 о о о 11
4 4 4 4 4
13504 о о о 11
4 4 4 4 4
6 8 0 7 7
113 3 4
4 4 4 4 ф
6 8 0 7 7
113 3 4
4 4 4 4 ф
Глава 9. Сельское хозяйство и биотехнология. Ф. Скиннер •...
Введение
Метод питательной пленки
Основы метода
Основные требования к оборудованию ....
Фитотоксичность
Устройство емкостей, используемых в методе питательной пленки
Опора для молодых растений
Болезни
927. Перспективы
Бобовые культуры и фиксация ,азота при симбиозе ...
Из истории вопроса
Инокуляция бактериями .^hizobium
.Инокуляция семян
Современные инокуляты на твердых носителях ..
Методы инокуляции
Улучшение симбиоза между бобовыми и Rhizobium .
Везикулярно-арбускулярная микориза
Роль везикулярно-арбускулярной микоризы ...
Инокуляция эндофитом
Методы инокуляции
Биологический контроль
Основы биологического контроля .
Примеры биологического контроля
Корончатые галлы и борьба с ними
Аэробная переработка отходов в сельском хозяйстве..
Проблема хранения и переработки отходов ...
Системы переработки отходов в аэробных условиях .
‘9.7. Переработка отходов сельского хозяйства в анаэробных у словиях (см. также .гл, 6)
Главные особенности процесса
Переработка отходов сельского хозяйства .
Микробиологические основы процесса
Современные разработки
9.8. Использование протопластов в селекции растений ...
Вегетативное размножение
Регенерация растений из протопластов .
Методы слияния протопластов Литература
Глава 10. Химическая технология и биотехнология. Г. Хамер ..
ЮЛ. Введение
Микробиологические факторы, влияющие на производительность и экономичность процесса
Эффективность роста: коэффициент выхода биомассы
Кинетика роста и образования продукта .
Сродство к субстрату и рост микроорганизмов ..
Стабильность культуры
Технологические факторы, влияющие на производительность экономичность процесса
Классификация биореакторов и их производительность
Анализ размерностей и масштабирование.. .
Перенос кислорода
,10.3.4. Теплопередаиа и охлаждение биореактора...
Конверсия и рециркуляция；451
Характеристики микробных и мицелиальных, суспензий456'
Вспомогательное оборудование, использующееся в- биотехнологических процессах466
Стерилизация среды и воздуха .461
Выделение продукта и завершающие, операции ..463；
Перспективы развития промышленных биотехнологических процессов 464
Литература 465,
Предметный указатель466
Указатель латинских названий47公
УВАЖАЕМЫЙ ЧИТАТЕЛЬ!
Ваши замечания о содержании книги, ее оформле-кнк, качестве перевода и другие просим присы-лать по адресу；
129820, Москва,1-й Рижский пер., д. 2,издательство《Мнр》
Учебное издание
Г. Бич, Д. Бест., К. Брайерли и др.
БИОТЕХНОЛОГИЯ. ПРИНЦИПЫ И ПРИМЕНЕНИЕПод редакцией И. Хиггинса, Д. Беста и Дж. Джонса
Заведующий редакцией чл-корр. АН СССР Т. М. ТурпаевЗам. зав. редакцией М. Д. Гроздова
Ст. научный редактор Н. Н. Шафрановская
Мл. научный редактор 3. В. СоллертинскаяХудожник В. Е. КарповХудожественный редактор А. Я. МусинТехнический редактор Е. В. АлехинаКорректор Л. Д. Панова
ИБ № 6351
Сдано в набор 14.10.87. Подписано к печати 8.04.88.
-Формат 60Х90%б. бумага книжно-журнальная. Печать высокая. Гарнитура литературная. Объем 15,00 бум. л. Усл. печ. л. 30,00. Усл. кр.-отт. 30,00. Уч.-изд. л. 30,76. Изд.
№ 4/5325. Тираж 10.000 экз. Зак. 1344. Цена 2 р. 80 к.
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР».
129820, ГСП, Москва, И-110, 1-й Рижский пер., 2.
Московская типография № 11 Союзполиграфпрома приГосударственном комитете СССР по делам издательств,полиграфии и книжной торговли. 113105, Москва, Нага-тинская ул., д. 1.
Edited by I. J. Higgins, D. J. Best and J. Jones、BIOTECHNOLOGYPRINCIPLESAND APPLICATIONSEdited by I. J. Higgins, D. J. Best and J. Jones、BIOTECHNOLOGYPRINCIPLESAND APPLICATIONSБИОТЕХНОЛОГИЯБИОТЕХНОЛОГИЯ
Edited by I. J. Higgins, D. J. Best and J. Jones、
BIOTECHNOLOGY
PRINCIPLES
AND APPLICATIONS
Edited by I. J. Higgins, D. J. Best and J. Jones、
BIOTECHNOLOGY
PRINCIPLES
AND APPLICATIONS
БИОТЕХНОЛОГИЯ
БИОТЕХНОЛОГИЯ
Принципы и применение
Под редакцией И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса
Перевод с английского д-ра биол. наук
А. С. Антонова
под редакцией акад. А. А. Баева
Blackwell Scientific Publications Oxford London Edinburgh Boston Palo Alto Melbourne
Москва «Мир» 1988
ББК 30.16
Б63
УДК 573.6
Бич Г., Бест Д., Брайерли К., Кумбс Дж., Холл Д., Хамер Г., Харди К・,Хиггинс И., Джонс Дж., Келли Д., Мел- вин М., Оливер С., Пикап Дж., Сил К-, Скиннер Ф., Стаффорд Д., Таггарт Дж.
Б63 Биотехнология. Принципы и применение： Пер. с англ./ Под. ред. И. Хиггинса, Д. Беста и Дж. Джонса. — М.: Мир, 1988. — 480 с., ил.
ISBN 5—03—000058—5
пн-пн-Книга, написанная коллективом авторов (Англия, США, Швейцария), представляет собой учебник по биотехнологии, освещающий как новые, так и традиционные отрасли промышленности, основанные на применении микроорганизмов. Рассмотрено использование микроорганизмов для получения биотоплива, щевых продуктов и биоматериалов, а также применение биотехнологии в химической промышленности, медицине, сельском хозяйстве и для переработки отходов. Особое внимание уделено связи биотехнологии и химической технологии.
пн-
пн-
Для студентов вузов и специалистов, занимающихся исследованиями и разработками в области биотехнологии.
ББ2003000000—285 041(01)-882003000000—285 041(01)-881988,1988,ч. 1ч. 1ББК 30.16ББК 30.16
Б
Б
2003000000—285
041(01)-88
2003000000—285
041(01)-88
1988,
1988,
ч. 1
ч. 1
ББК 30.16
ББК 30.16
Редакция литературы по биологии
ISBN 5—03—000058—5 (русск.) © 1985 by Blackwell Scientific Publications
ISBN 0—623—01029—0 (англ.) © перевод на русский язык, 1988