Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
??ш
?
?
ЕННОЛОША
ИВ.Березин
Н.Л.Кляико
А.ВЛевашов
К.Мартинек
ВВ.Можаев
ЮЛ.Хмельницкий
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ
ФЕРМЕНТЫ
/
HHgomHHHgomH
HHgomH
HHgomH
в8-ми книгах
DUIOTEHHOnorUIFI
Под редакцией КС. ЕгороваВДСамуилова
ИКБерезиу НЛКляико АВ.Левашов К.Мартинек ВВ.Можаев ЮЛ.Хмельницкий
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ
画
Москва «Высшая школа» 1987
ББК 30.6 Б63
УДК 574.6
Рецензенты：
кафедра биотехнологии микробного синтеза Московского технологического института пищевой промышленности (зав. кафедрой проф. Кантере В. М.) и д-р техн, наук Попов В. Г. (ПО «Биопрепарат»)
Допущено Министерством высшего и среднего специального образования СССР в качестве учебного пособия для студентов биологических специальностей высших учебных заведений.
Биотехнология: Учеб, пособие для вузов. В 8 кн./Под Б63 ред. Н. С. Егорова Д_ Самуилова. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты/|И. В ВврезЕн|, Н. Л. Клячко, А. В. Левашов и др. — М.: Высш, шк., 1Й87. 159— с.: ил.
Рассмотрены неорганические и органические носители (подложки), химические и физические способы связывания белков (ферментов). Проанализированы кинетико-термодинамические особенности катализа иммобилизованными ферментами, их стабильность и другие физико-химические свойства.
5 2010000000(4309000000)—510
001(01)—87
КБ—53—9—86
ББК 30.6 十 28.07
© Издательство «Высшая школа», 1987
ПРЕДИСЛОВИЕ
В последние 10—15 лет на стыке ряда химических и биологических дисциплин сформировалось новое научно-инженерное направление —химическая энзимология. Стремительное развитие химической энзимологии обусловлено созданием нового типа гетерогенных биоорганических катализаторов :— иммобилизованных ферментов. Целесообразность исследований в этом направлении и важность внедрения иммобилизованных ферментов в практику подчеркнуты постановлением ЦК КПСС и Совета Министров СССР《О дальнейшем развитии физико-химической биологии н биотехнологии и использовании их достижений в медицине, сельском хозяйстве и промышленности» (1981), а также в последующих постановлениях.
Проблема создания промышленных образцов иммобилизованных ферментов объединяет необычайно широкий круг специалистов самого разного профиля. Это, в свою очередь, ставит перед высшей школой задачу подготовки таких специалистов.
К настоящему времени в мировой и советской научной литературе имеются десятки обзоров, сборников н монографий, посвященных получению, свойствам и использованию иммобилизованных ферментов. Однако, как правило, эти издания рассчитаны на узкий круг специалистов, имеющих соответствующее образование в области физической химии ферментов или инженерной энзимологии. Учебных пособий для более широкой аудитории в отечественной литературе нет.
Цель настоящего учебного издания состоит в том, чтобы по возможности в общедоступной форме рассмотреть современное состояние проблемы иммобилизованных ферментов, наметить пути решения ее ключевых вопросов и дать верную ориентацию в этой области.
В составлении настоящего учебного пособия принимали участие И. В. Березин (предисловие, введение, заключение)., Н. Л. Клячко (гл. I, VI), А. В. Левашов (гл. III), К. Мартинек (предисловие, введение, заключение), В. В. Можаев (гл. IV, V, VI), Ю. <П. Хмельницкий (гл. II). Редактирование этой книги проведено И. В. Березиным и А. В. Левашовым.
Авторы выражают глубокую благодарность рецензентам: д-ру техн, наук В. Г. Попову н кафедре биотехнологии микробного синтеза Московского ордена Трудового Красного знамени технологического института пищевой промышленности (зав. кафедрой проф. В. М. Кантере) за ценные замечания и советы.
Авторы
ВВЕДЕНИЕ
Ферменты и ферментативные системы традиционно применяются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой, фармацевтической, текстильной, кожевенной и другнх отраслях промышленности, в медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, химическом анализе и т. д. Тем не менее развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной или полным отсутствием на мировом рынке нужных ферментов, особенно их чистых препаратов. Очевидно, можно ожидать в недалеком будущем благодаря успехам микробиологии коренного решения вопроса производства соответствующих ферментов в достаточном количестве.
Возможности применения ферментов осложнены, кроме того» еще, по крайней мере, двумя причинами. Во-первых, ферменты неустойчивы при хранении, а также при различных воздействиях, особенно тепловых. Во-вторых, многократное использование ферментов затруднено из-за сложности их отделения от реагентов и продуктов реакции. По этим причинам практическое использование ферментов могло быть ограничено, но уже на сегодняшний день найдены пути решения и этих проблем.
Принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией в результате создания иммобилизованных ферментов. Дж. Нельсон и Е. Гриффин еще в 1916 г. показали, что инвертаза, адсорбированная на угле (т. е. иммобилизованная), сохраняет каталитическую активность. В 20——30-х годах работы по изучению адсорбции белков и ферментов были продолжены, однако исследования этого периода представляли главным образом академический интерес и не преследовали практических целей. В 1939 г. Дж. Пфанмюллер и Г. Шлейх получили первый патент на применение адсорбированных на древесных опилках протеолитических ферментов для обработки шкур. Принципиально важный шаг в направлении создания прочных конъюгатов ферментов с носителями был сделан в 1953 г. Н. Груб- хофером и Д. Шлейтом, впервые применившими метод ковалентного связывания.
Для исследований 50—60-х годов характерна уже достаточно четкая осознанность практической значимости развиваемого направления. Немалая заслуга в этом принадлежит группам
Г. Манеке и 3. Качальского. В результате связывания фермента на носителе были созданы гетерогенные катализаторы, для которых сравнительно недавно, на первой конференции по инженерной энзимологии в Хенникере (США) в 1971 г., был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». В литературе все еще встречаются и другие термины, например «нерастворимые ферменты», «матрицированные ферменты» н т. п., смысл которых достаточно конкретен: ими обозначают препараты ферментов, связанных на нерастворимых носителях. Однако понятие «иммобилизация» можно и нужно понимать шире, а именно, как любое ограничение свободы движения белковых молекул (или их фрагментов!) в пространстве. Помимо связывания с нерастворимым носителем этого можно также достичь, например, путем внутримолекулярной или межмолекулярной «сшивки» белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными реагентами или же присоединением фермента к растворимому полимеру. Такие препараты иногда называют ферментами, модифицированными «сшивающими* или, соответственно, полимерными реагентами.
Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными предшественниками. Во-первых» гетерогенный катализатор легко отделить от реакционной среды, что дает возможность: а) остановить в нужный момент реакцию; б) использовать катализатор повторно; в) получать продукт, не загрязненный ферментом. Последнее особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств.
Во-вторых» использование гетерогенных катализаторов позволяет проводить ферментативный процесс непрерывно, например в проточных колоннах, и регулировать скорость катализируемой реакции, а также выход продукта путем изменения скорости потока.
В-третьих, иммобилизация или модификация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности (особенно в отношении к макромолекулярным субстратам), зависимости каталитической активности от pH, ионного состава и других параметров среды и, что очень важно, его стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям. Отметим, что крупный вклад в разработку общих принципов стабилизации ферментов был сделан советскими исследователями.
В-четвертых, иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под действием некоторых физических факторов, таких, как свет или звук. На этой основе создаются механо- и звукочувствительные датчики, усилители слабых сигналов н бессеребряные фотографические процессы. .
В результате внедрения нового класса биоорганических катализаторов ——иммобилизованных ферментов, перед прикладной энзимологией открылись новые, ранее недоступные пути разви-
тия. Одно лишь перечисление областей, в которых находят применение иммобилизованные ферменты, могло бы занять немало места. Однако в этом нет необходи мости, поскольку прикладным аспектам и достижениям инженерной энзимологии целиком посвящена книга 8 серии «Биотехнология». Здесь важно лишь отметить, что успех практического использования препаратов иммобилизованных ферментов в значительной степени определяется подготовительным этапом работы ——выбором подходящего носителя и метода иммобилизации, а также знанием кинетико-термодинамических особенностей катализа иммобилизованными ферментами. Именно рассмотрению этого круга вопросов посвящено данное учебное пособие. Кроме того, уделено внимание проблемам стабильности ферментов вообще и иммобилизованных в частности, а также сформулированы общие принципы стабилизации. Специальная глава отведена способам регенерации компонентов систем с иммобилизованными ферментами.
ГлаваГлава
Глава
Глава
НОСИТЕЛИ
ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ
① ЕРМЕНТОВ
Для получения иммобилизованных ферментов используется эгромное число носителей, как органических, так н неорганических. Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут быть применены для иммобилизации ферментов, следующие (Дж. Порат, 1974): 1 — высокая химическая и бнологн- ческая стойкость; 2 — высокая механическая прочность (в первую очередь, по отношению к истиранию); 3 — достаточная проницаемость для фермента и субстратов, большая удельная поверхность, высокая вместимость, пористость; 4 — возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран, труб, листов и т. д.); 5 ——легкое переведение в реакционноспособную форму (активация); 6——высокая гидрофильность, обеспечивающая возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной среде; 7 ——невысокая стоимость. Отсутствие носителей, удовлетворяющих одновременно всем этим требованиям, и разнообразие задач, стоящих перед экс пери ментаторами, обусловливают широкий набор применяемых для иммобилизации материалов.
ОРГАНИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРНЫЕ НОСИТЕЛИ
Существующие в настоящее время органические полимерные носители можно разделить на два класса: 1 — природные полимеры, 2 — синтетические полимерные носители. В свою очередь класс природных полимеров можно подразделить на группы в соответствии с их биохимйческой классификацией: полисахаридные, белковые и липидные носители. Синтетические полимеры также могут быть подразделены на группы, например, в соответствии с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные носители.
К рассматриваемым носителям предъявляется ряд дополнительных требований, обусловленных методом иммобилизации, свойствами иммобилизуемого фермента и способом дальнейшего
использования препарата: 1 — при ковалентной иммобилизации носитель должен связываться только с теми функциональными группами на белке, которые не являются ответственными за катализ, н 2 — они не должны оказывать ингибирующего действия на фермент. При проведении иммобилизацин необходимо также учитывать, что наличие противоположных знаков заряда на носителе и ферменте облегчает связывание фермента, одноименных ——затрудняет; уменьшение размера частиц носителя способствует увеличению количества связанного препарата.
Наиболее широко используются для иммобилизации ферментов природные полисахариды и синтетические носители полиметиленового типа. Остальные типы носителей применяются значительно реже.
Рассмотрим основные классы полимерных носителей.
§ 1. Природные носители
Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционно-способных функциональных групп (в исходном или модифицированном препарате), легко вступающих в различные химические реакции, а также высокой гидрофильностью. К недостаткам природных носителей можно отнести неустойчивость к воздействию микроорганизмов и относительно высокую стоимость многих из них.
Полисахариды. Наиболее часто для иммобилизации используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные.
Целлюлоза представляет собой поли-1,4-Р-£)-глюкопиранозил- D-глюкопиранозу
Целлюлоза отличается высокой степенью гидрофильности, а наличие большого числа гидроксильных групп дает возможность ее легко модифицировать путем введения различных заместителей. Препараты целлюлозы для придания им химической устойчивости «сшивают» эпихлоргидрином. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются ее аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллически ми участками вводят химические сшивки. Гранулироваиная целлюлоза благодаря простоте получения, сравнительно низкой стоимости относится к удобным носителям для иммобилизации ферментов и аффинной хроматографии.
Гранулированную целлюлозу довольно легко превращают в
Таблица 1. Целлюлоза и некоторые ее производные
Заместитель по ОН-группе
Название препарата
Фирма
—
Целлюлоза
«Whatman* (Англия)
O(CH2)2NH2
Ам иноэтял целлюлоза
То же
ОРОзН
Фосфо р ил целл юлоза (РЮ)
—
Целлюлоза
«Sigma> (США)
一»—
«Bio-Rad-Labs>
O(CH2)2N(C2H5)2
Диэтил аминоэтил целлюлоза
(США)
ОСН2СООН
Карбокснметил целлюлоза
一»—
O(CH2)2NH2
Амнноэтилцеллюлоза
—»—
ОСО^^—NH*
п - Ам и нобензоил целлюлоза
—»-
—»-
- »-
«Serva» (ФРГ)
«Reanab (ВНР)
OCOCH2Br
Бромацетилцеллюлоза
То же
|o(CHa)2N (СгН5)2
Бензонлдиэтнламино- этнл целл юлоза
—»—
怎 со—^^
OCH2CONHNH2
Гидр азидка рбоксн метил -
«Miles Labs»
целлюлоза
(Англия)
OCOCHsBr
Брома цетил целлюлоза
To же
ОСН2ОСНг~>^^
лс-Амннобензилокснме- тилцеллюлоза
To же
nh2
O(CH2)2N(C2H5)2
ДЭАЭ -целлюлоз а
НПО «Биохим- реактнв*
OCH2COOH
КМ-целл юлоза
То же
ОС%—^^—NH2
n-Амннобензнл целлюлоза
—»-
O(CH2)2S.O3H
Сульфоэтил целлюлоза
—»-
O(CH2)2N(C2H5)3
Триэтил а ммонийэтил- целл юлоза
—»-
различные ионообменные производные. В табл. 1 приведены основные промышленные марки целлюлозы, выпускаемые различными фирмами.
Недостатком целлюлозы как носителя можно считать ее неустойчивость к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей.
Хитин—природный аминополисахарид. Его можно рассматривать как целлюлозу, в которой СНгОН-группа заменена ацетамидным остатком:
И
Хитин — основной компонент наружного скелета ракообразных, насекомых, а также клеточных оболочек некоторых грибов. Это соединение является отходом промышленной переработки креветок и крабов, поэтому доступно в больших количествах при относительно низкой стоимости.
Хитин обладает пористой структурой, не растворяется в воде, разбавленных кислотах и щелочах, а также в органических растворителях. Для переведения в реакционноспособную форму он может быть модифицирован глутаровым альдегидом, а также солями тяжелых металлов [например, Ti(IV)].
Обработка хитина концентрированными растворами щелочей (деацилирование) приводит к образованию хитозана. Хитозан, имеющий свободные аминогруппы, может использоваться для ковалентной иммобилизации ферментов с помощью таких бифункциональных реагентов, как диальдегиды, диизоцианаты (см. гл. III). В отличие от хитина хитозан растворяется в минеральных н органических кислотах, поэтому для иммобилизации он часто применяется в виде растворов (pH 3—7).
Употребление хитозана в качестве носителя дает хорошие результаты, так как полученные препараты иммобилизованных ферментов обладают высокой каталитической активностью и устойчивостью к микробному воздействию; наблюдается также существенное повышение те р моста б ил ьности белков, иммобилизованных на хитозане.
Декстран —— поли-1,6-а-^-глюкопиранозил-£)-глюкопирано- за ——разветвленный полисахарид из бактериальных источников, содержащий остатки глюкозы, связанные, в основном, 1,6-глюко- зидными связями (а также, 1,2-, 1,3- и 1,4-связямн):
Гели на основе декстрана, сшитые эпихлоргидрином, выпускаются фирмой «Pharmacia» (Швеция) под названием «сефадекс» и 《Reanal》 (ВНР) под названием «молселект». При высушивании се фадексы легко сжимаются, а в водных растворах сильно набухают. Эти качества выражены тем сильнее, чем меньше процентное содержание сшивки. Изменением доли сшивки регулируется средний размер пор, образуемых пространственной сеткой геля.
Следует отметить, что продажные препараты сефадексов содержат небольшое количество карбоксильных групп, что придает им некоторое сродство к катионам. Этот факт необходимо учитывать при иммобилизации металлозависимых ферментов.
Обращают на себя внимание такие свойства гелей на основе декстрана, как высокая химическая стойкость н гидрофильность (из-за наличия большого количества гидроксильных групп). Сефадексы G-типов различаются по степени сшитости и, следовательно, по степени набухания и по пористости. Существуют разновидности модифицированных сефадексов для использования в органических растворителях (LH-20 н LH-60).
Фирмы《Pharmacia》и «Reanal» выпускают также ряд производных декстрана, содержащих различные функциональные группы (табл. 2).
К группе декстранов можно отнести крахмал, являющийся смесью полисахаридов, основным компонентом которой является амилоза ——по』н-1,4-а-О-глюкопнранознл-О-гл1ОКОПНраноза и амилопектин ——разветвленный полисахарид, состоящий из остатков D-глюкозы, связанной 1,4-а-глюкозидными связями, а в местах разветвлений— 1,6-а-глюкозидными связями.
Химической модификацией крахмала сшивающими агентами, такими, как формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид, получен новый носитель ——губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизую
Т а б л н ц а 2. Коммерческие препараты производных декстрана
Функциональная группа
Названне и марка
Фирма
ОСН2СООН
Карбо кси метил сефадекс (СМ)
«Pharmacia» (Швеция)
O(CH2)3SO3H
Сульфопропнлсефадекс (SP)
--》——
O(CH2)2N(C2H5)2
Диэтил аминоэтилсефа- декс (DEAE)
--》--
OCH2CH2N (С2H%СН2 —
—СН(ОН)СН3
Д；5этил- (2-окси пропил) а м и ноэтилсеф аде кс (QAE)
ОСНгСООН
Мол се ле кт (СМ)
《Reanal» (ВНР)
O(CH2)2SO3H
Молселект (SE)
——»——
О (СН2) 2N (С2H5)2
Мол се ле кт (DEAE)
--》--
щим полисахариды. Введение диэтанол- и триэтаноламинных групп дает возможность применять губчатый крахмал для иммобилизации различных ферментов.
На основе декстранов могут быть получены водорастворимые препараты с различными функциональными группами, применяемые в медицине как носители лекарственных веществ. Выбор носителей иа основе декстрана для медицинских целей обусловлен, в частности, тем, что они легко подвергаются биодеградации.
Агароза ——поли-р-галактопиранозил-3,6-ангидро-а-Л-галакто- пираноза:
Она широко используется как носитель для иммобилизации. Однако стоимость агарозы довольна высока, поэтому разрабатываются различные методы ее модификации с целью получения легко регенерируемых форм. При охлаждении горячего 2—6%- ного водного раствора агарозы до температуры ниже 45℃ образуются прочные крупнопористые гели, представляющие собой сложную смесь из заряженных и нейтральных полисахаридов. В процессе образования геля индивидуальные полисахаридные цепи образуют двойные спирали, которые далее агрегируют с образованием «узлов». При температуре около 100℃ гель агарозы плавится, поэтому в отличие от сефадексов его нельзя автоклавировать. Высушивание агарозы приводит к необратимой деструкции геля, поэтому его необходимо хранить в виде водной суспензии.
Гели на основе агарозы производятся фирмами «Pharmacia》 (Швеция) и «Bio-Rad Labs》(США) и выпускаются под названиями «сефароза» и «биогель А> соответственно (табл. 3), а также «LK®》(Швеция) и <IBF> (Франция) — под названием «ультрогель А>. При производстве сефарозы агароза подвергается специальной обработке, в частности, из нее удаляются заряженные полисахариды. Различают 3 типа сефарозы и 6 типов биогеля А в зависимости от концентрации агарозы (табл. 3).
Для придания большей химической и термической стабильности препараты сефарозы обрабатывают 2,3-дибромпропанолом в сильно щелочных условиях. В результате такой обработки получается поперечносшитый гель агарозы —— сефароза CL (препарат фирмы «Pharmacia»).
Агар выделяют из клеточных мембран некоторых красных морских водорослей. Точный состав его не известен. Однако установлено, что он содержит, по крайней мере, два полисаха-
Функциональная группа (заместитель по ОН-группе)
Названне и марка
Концентрация агарозы, %
Фирма
—
Сефароза 6В
6
«Pharmacia» (Швеция)
—
Сефароза 4В
4
То же
+
Сефароза 2В
2
—»-
-О (СН2) 2NH (С2H5)2СГ
ДЭАЭ-сефароза
CL-6B
6
—>-•
—ОСН2co ОН
КМ—сефароза
CL 6В
6
-~>-~
-OCN
Бромциансефароза
4В
4
—»—
—ОСН2—СН—СН2—О—
он
—(СНг)?—СНз
Октилсефароза
CL4B
4
->—
—ОСН2—СНОН—СН2—о—
-о
Фенилсефароза
CL-4B
4
—»-
Биогель А-0,5
10
«Bio-Rad
Labs> (США)
Биогель А-1,5
8
->-
Бногель А-5
6
->-
Бногель А-15
4
->
Биогель А-50
2
—»-
Биогель А-150
1
—»—
—C(CH2)2N(C2H5)2
ДЭАЭ-бногель А
—-
—»—
—NH— (СН2) 5—СОО—
Активированная
СН—сефароза 4В
4
■Pharmacia» (Швеция)
cr^
—0—СН2СН—СНг—
—О (СНг)ч—О—СНг— ~сн—сн2
Эпоксиактнвиро- ваиная сефарозц 6В
6
То же
ри да: агарозу и агаропектин. Гели агара образуются аналогично агарбзным при охлаждении горячего водного раствора до температуры 38℃. После высушивания гель агара превращается в прозрачную пленку, что позволяет использовать для изучения иммобилизованного в геле фермента оптические методы исследования. К преимуществам агара следует отнести его низкую стоимость и нетоксичность. Отличительной особенностью этого носителя является способность формировать механически прочные гели даже при малых концентрациях в растворе.
Существенного улучшения свойств агара можно достичь сшиванием эпихлоргидрином, ди эпоксидным и соединениями и т. д. Сшитый агар с регулируемой проницаемостью устойчив к нагреванию даже в щелочной среде, обладает высокой механической прочностью, а наличие большого количества оксигрупп позволяет легко модифицировать носитель. Это дало основания Дж. Порату (1976) считать агар почти идеальным носителем.
Альгиновые кислоты и 〃х соли — это полисахариды бурых морских водорослей, состоящие из связанных р- 1,4-связями остатков D-маннуроновой кислоты:
Характерным свойством этих носителей является резкая зависимость их растворимости от температуры и pH раствора. Так, альгиновые кислоты хорошо растворимы в горячей воде и плохо ——в холодной. Альгинаты кальция обладают способностью образовывать гели, поэтому они используются для иммобилизации ферментов, клеток и органелл путем включения.
Гепарин представляет собой кислый полисахарид, содержащий чередующиеся звенья сульфатированной D-глюкуроно вой кислоты (или L-идуроновой) и сульфатированного глюкозамина (или ^-aцeтил-rлюкoзaминa):
Гепарин успешно применяется для получения водорастворимых препаратов иммобилизованных ферментов, используемых в медицине для введения /п vivo.
Белки. Использование белков в качестве носителей для им-
мобилизации ферментов представляет интерес как для фундаментальных биохимических исследований, так и для практических целей, в частности для медицины. Этот интерес обусловлен тем, что многие ферменты в клетке функционируют в тесном контакте с другими ее компонентами, в частности с липидами и белками. Поэтому полагают, что изучение поведения ферментов. иммобилизованных на белковых матрицах, позволит понять закономерности функционирования ферментов in vivo. С точки зрения практической значимости важными свойствами этих носителей являются высокая вместимость по отношению к ферментам и способность к биодеградации, а также возможность применения большинства из них (благодаря фибриллярной природе) в виде тонкой толщиной 80 мкм пленки (мембраны). Иммобилизацию на белковых носителях можно проводить как в отсутствие, так и в присутствии сшивающих агентов.
К недостаткам белков как носителей медицинских препаратов для использования in vivo следует отнести высокую иммуногенность (исключение составляют коллаген и фибрин).
Наиболее часто в качестве носителей применяются структурные белки, такие, как кератин, фиброин, коллаген; двигательные белки, в частности миозин, а также транспортные белки, например сывороточный альбумин.
Коллаген ——фибриллярный белок группы склеропротеидо в, основной компонент хрящей и сухожилий, обладает высокой прочностью на разрыв. Особенностью этого белка является его высокая гидрофильность. Так, коллаген способен сорбировать от 1 до 5 г воды на 1 г белка, оставаясь в нерастворенном виде н сохраняя волокнистую структуру.
Коллаген ——самый распространенный белок высших животных. Легкость выделения коллагена из ряда биологических источников в сочетании со свойственным белкам наличием большого числа групп ——участков для связывания ферментов — привлекает внимание к коллагену как к носителю для иммобилизации ферментов. Коллаген используют и в виде модифицированных производных, придавая матрице широкий набор желаемый свойств. Та к, блокированием амино- или карбоксильных групп можно изменить поверхностный заряд носителя н, соответственно, гидрофильно — гидрофобный баланс; с помощью сшивающих агентов можно получить сжатую микроструктуру. Наиболее часто коллаген употребляется в азидной форме. Для этого карбоксильные группы коллагена (н) этерифицируют с последующей обработкой гидразином и азотистой кислотой:
®-СООН 弋匸 ®-СООСН3 -«^ *ONHNH2 N噥на. @_^
Продуктом переработки коллагена является желатина. Способ ее получения весьма прост ——коллаген длительно обрабаты-
вается кипящей водой, в ходе чего гидролизуются некоторые ковалентные связи коллагена. В результате волокнистый, нерастворимый коллаген превращается в растворимую смесь полипептидов, называемую желатиной. Ценность этого носителя, обладающего гелевой структурой, заключается в его нетоксичности, легкости биодегра да ции, что позволяет применять желатину в фармацевтической и пищевой промышленностях.
■ Другим весьма распространенным фибриллярным белком группы склеропротеидов является кератин. Из кератина почти полностью состоят шерсть, волосы, роговые покровы, шелк и т. д. Как правило, кератин получают при переработке перьев (побочный продукт лтицеперерабатывающих фабрик). Таким образом, кератин дешев и доступен в больших количествах, что нем ало- важно при использовании белков в качестве носителей.
Существуют две формы кератина — аир. Важной особенностью а-кератина является высокое содержание цистеина, что представляет особый интерес для иммобилизации ферментов, содержащих свободные SH-группы. p-Кератннн, в частности фиброин (белок шелка и паутины), не содержат остатков цистеина, но в них очень высокое содержание глицина и аланина, что необходимо для образования вытянутой зигзагообразной конформации полипептидной цепи. Для p-конформации характерны межцепочечные водородные связи, в образовании которых участвуют все пептидные группы p-кератина, что придает значительную устойчивость p-структуре. Молекулярные отличия влияют на механические свойства. Так, нити p-кератина обладают мягкостью, гибкостью и нерастворимостью, однако уступают по прочности а-кератину. Выбор той или иной формы кератина для иммобилизации определяется конкретной задачей, стоящей перед исследователем.
При иммобилизации ферментов на носителях белковой природы нельзя не считаться с появлением диффузионных ограничений, определяемых гелевой структурой матрицы. Интересное решение проблемы диффузионных ограничений было найдено в случае использования в качестве носителей бел ков- гл обул инов хлопчатника. Так как комплекс фермент-носитель способен находиться как в растворимой, так и в нерастворимой форме в зависимости от ионной силы раствора, то, изменяя последнюю, можно переводить комплекс в растворимую форму и облегчать, например, переработку нерастворимых в воде субстратов. Здесь укажем также, что подобным свойством обладают и некоторые синтетические полимеры, в частности полиэлектролиты и их комплексы, находящие все более широкое применение для иммобилизации ^ферментов.
Синтетические полимерные носители
Огромное разнообразие доступных синтетических полимеров обеспечило их широкое использование в качестве носителей для иммобилизации ферментов. Вводя в полимерные молекулы раз-
личные функциональные группы, можно в широких пределах варьировать физические свойства носителя и создаваемое им микроокружение для иммобилизованных молекул фермента. Синтетические полимеры применяются как для ковалентной иммобилизации ферментов, так и для сорбционной, для получения гелей, микрокапсул.
Полимеры на основе стирола. Они являются основой многих промышленных марок ионообменных материалов. Для сорбционной иммобилизации применяются как микропористые, так и макропористые (размер пор 10—1000 нм) материалы. Сополимеры стирола в виде сферических частиц с различными сшивающими агентами можно получить гранульной полимеризацией. Наиболее часто в качестве сшивающего агента используется дивинилбен- зол. Структурный фрагмент с дивинил бензолом можно представить так:
Геометрическая структура таких макропористых носителей (размер пор, удельная поверхность) варьируется в широких пределах при изменении количества сшивающего агента и концентрации растворителя мономеров в реакционной среде. Пористость сополимеров стирола регулируют также тем, что проводят полимеризацию в присутствии порообразователей, например добавок, разлагающихся при нагревании с выделением газообразных веществ (NH4C1).
Носители на основе сополимеров стирола и дивинилбензола выпускаются в промышленном масштабе в виде ионообменников марок Дауэкс и Амберлит.
В последние годы стали применяться также носители, имеющие макросетчатую, изопористую и гетеропористую структуры. Макросетчатые полистиролы подобны стеклам, они имеют стабильную структуру пор, не набухают в воде, отличаются повышенной механической прочностью. Получают их эмульсионной сополимеризацией стирола с дивинилбензолом в присутствии осадителя.
Изопористый макросетчатый полистирол не обладает пористостью в сухом виде, образуется он при сшивании стирола в дихлорэтане, содержащем и-ксилилендихлорид.
Под действием монохлордиметилового эфира н порообразо- вателя можно получить гетеропористый полистирол с диаметром пор 〜1 мкм. Применение гетероиористых носителей обеспечивает для различных по размерам ферментов сохранение высокой
остаточной активности, по-видимому, за счет структурного соответствия молекулы белка и матрицы.
Немодифицированные полистирольные носители гидрофобны. Присоединением ионогенных групп в параположение бензольных радикалов можно придать ему некоторую гидрофильность, хотя, в целом, сохраняется склонность полимера к гидрофобным взаимодействиям. Это свойство может оказаться полезным при хроматографии гидрофобных белков мембран.
Широкие возможности для разработки новых видов носителей открывает введение реакционноспособных ангидридных групп в состав синтетических полимеров. В этой связи отметим новый тип носителя, полученного сополимеризацией эквимолярных количеств стирола и малеинового ангидрида：
产
~сн—сн2—сн—сн~оААо
Как правило, используют сополимер, сшитый гексаметилендиамином. В присутствии избыточного количества диметилендиамина получают носитель, содержащий аминогруппы:
Такие носители обладают довольно высокой вместимостью по отношению к белкам, могут применяться как для нековалентной, так и ковалентной иммобилизации ферментов：
Другие способы активации носителей, в том числе модификация бензольного ядра матрицы» будут рассмотрены ниже-
Полимеры на основе производных акриловой кислоты. Одним из многочисленных производных акриловой кислоты, широко применяющихся для получения полимерных гидрофильных носителей, является акриламид. Широкое распространение получил метод включения ферментов и клеток в полиакриламидный гель (ПААГ), получающийся при сополимеризации акриламида со сшивающим агентом N, Ы^-метилен-бис-акриламидом (МБАА).
Нити линейного полимера акриламида, сшитые МБАА, образуют п ростр а н стве н ную сетку геля, относительно жесткую, стойкую к химическим воздействиям. Процентное содержание полимера определяет пористость и жесткость геля.
ПААГ выпускается рядом фирм, например, «Bio-Rad Labs》 (США) производит ПААГ и его производные под названием «биогели» типа Р, «Koch-Light》 (Англия)——«энзакрилы», «Reanal» (ВНР) — «акрилексы». Ниже приведены функциональные производные на основе энзакрила:
Название
Функциональная группаФункциональная группа—CONHNhb-^^ —со№—CONHCH(OCH3)2—CONHNhb-^^ —со№—CONHCH(OCH3)2—conhch2sh—CONH=O—conhch2sh—CONH=OЭизакрнл ААЭизакрнл ААЭнзакрил АН
Функциональная группа
Функциональная группа
—CONHNhb-^^ —со№
—CONHCH(OCH3)2
—CONHNhb-^^ —со№
—CONHCH(OCH3)2
—conhch2sh
—CONH=O
—conhch2sh
—CONH=O
Эизакрнл АА
Эизакрнл АА
Энзакрилпол и ацеталь (сополимер N-акри- лонламиноацетальдегиддиметилацетал я и МБАА)
Энзакрилполитиол (сополимер акриламида и акрилоил цистеи на)
Энзакрилполитиолактон
Фирмы《LKB》(Швеция) и《IBF» (Франция) выпускают также носители смешанного типа на основе ПААГ н агарозы под названием «ультрогели» типа АсА. Они представляют собой жесткую матрицу, создаваемую агарозой, с контролируемой пористостью, обеспечиваемой ПААГ. Носители выпускаются в виде водной суспензии сферических гранул, применяются для синтеза аффинных сорбентов и нековалентной иммобилизации ферментов.
Для целей ковалентной иммобилизации ферментов полиакриламидный носитель активируют одним из способов: либо в готовый полимер вводят функциональные группы методом химической модификации, либо полимеризуют соответствующее функциональное производное мономера.
сн?=снI +CONHaсн?=снI +CONHaВ качестве примера приведем реакцию сополимеризации акриламида н п-нитрофенилакрилата:
сн?=сн
I +
CONHa
сн?=сн
I +
CONHa
Способ полимеризации соединений, содержащих реакционноспособные группы, более удобен, так как позволяет избежать нежелательного изменения свойств (набухаемости, проницаемости) геля, возможного при модификации готового полимера.
В настоящее время создано большое число носителей на основе сополимеров акриламида с различными функциональными
Таблица 4. Мономеры, применяемые для получения сополимеров акриламида
Мономеры
Активирующий агент
Функциональная группа активированного носителя
2-Оксиэтил метакрилат
сн 胃 С—С?
1^ОСНг—СН2
BrCN
〉C=NH
СНз1
он
Акриловая кислота
/NH—R'
о
R'^N=C=
—соо—с/
CH«F=CH—сг 'он
=N—R"
、N Н—R〃 +
Метакриловая кислота
СН2=С—С^
1 'он
СНз
п-Амн нофенилакриламид
СН2=СН—《
'nhY >-nh2
hno2
—CONH—
Xz
+ -
—N=NC1
№ Акрилоксисукцинимид
СН2=СН—《>с—сн2
/-СН?
Глицидилакрилат или метакрилат
СН2=СН—с^°/°\
—
У—СНг—СН—С®
Малеиновый ангидрид
НС—с《
II >О
—
НС—с<
1-Акрилоиламиио-2- (4-нитробен-
1. Na2S2O4, KOH
зоиламино)этаи
2. HNO2
СН2=СН~-С<о、
、СН—СН—С—
+ 一
—N三NCI
nh2 nh2
-^—no2
реакционноспособными группами. Некоторые примеры представлены в табл. 4.
Из других производных акриловой кислоты, применяющихся для получения полимерных носителей, следует назвать хлоран- гидрид метакриловой кислоты. При его взаимодействии, например, с ванилином образуется мономер, дающий при полимеризации соединение с высокореакционноспособными альдегидными группами (так называемый «ванакрил»):
полимеризацияполимеризация
полимеризация
полимеризация
Большинство полимеров на основе акриловой кислоты не отличаются устойчивостью к воздействию многих химических реагентов, а также сильно набухают в воде и органических растворителях. Поэтому в некоторых случаях возникает необходимость в полимерных материалах, имеющих более жесткую структуру. Примером жесткого носителя смешанного типа на основе синтетического и природного полимеров является ультрогель типа АсА; к синтетическим полимерам с жесткой структурой относятся сополимеры производных акриловой кислоты, в частности
О-СН2—С%I^ он2-окснэтнлметакрилата
СН2=С—》С—С=СН2I\О—СН2—СН2—СУI
СНзСНз
этилендиметакрилата
Макропористые полимерные гели на основе мономеров такого типа получаются обычно в виде сферических гранул. Важными характеристиками этих материалов служат их гидрофильность, механическая прочность, химическая и биологическая стойкость, возможность использования органических растворителей. Такие носители под названием «сферон» выпускаются фирмами «Lachema» (ЧССР) и «Realco Chem. Со》(США). Сфероны можно получить гетерогенной суспензионной сополимеризацией мономеров акрилата или метакрилата, содержащих гидроксильные группы, с диакрилатами и диметилметакрилатами в присутствии инертного растворителя. Схематически фрагмент структуры сополимера 2-оксиэтил метакрилата, сшитого этилен ди метакрилатом, можно представить следующим образом:
СН3 СООСН2СН3ОНСНз
~с—СН2—С—СН2—С(СНз)—сн2—с~
С=О СНз СООСН2СН2ОН 4s4f=ооо
II
сн2сн2
СН2СН2
Оо
С=ОСООСН2СН2ОН СН3С=О
~c-ch2-е-eh2ееh2у ~
СН3СНзСООСН2СН2ОН СНз
Изменяя соотношение концентраций исходных мономеров, можно в широких пределах изменять пористость, удельную поверхность и число активных гидроксильных групп сферона. Структура твердого макросетчатого геля сферона похожа на структуру силикагеля (гидрофобные углеводородные группы обращены внутрь полимера) .В то же время наличие гидроксильных групп на поверхности придает матрице сходство с сефарозой и позволяет использовать разработанные для сефарозы методы активации носителя. Типы гелей «сферон», содержащих различные функциональные группы, выпускаемые фирмой «Lachema» (ЧССР), приведены ниже:
Функциональная группаФункциональная группаСферон АгА 1000Сферон АгА 1000соосооСферон CNPСферон CNPНазвание(тип геля)Название(тип геля)Функц иональнаяНазвание
Функциональная группа
Функциональная группа
Сферон АгА 1000
Сферон АгА 1000
соо
соо
Сферон CNP
Сферон CNP
Название(тип геля)
Название(тип геля)
группа(тип геля)
ОН Сферон 40, 100, 300,1000, 100 000
СООН Сферон С 1000
(CH2)2N (С2Н5)2 Сферон ДЭАЭ 1000
OSO2OH
OPO(OH)2
conhnh2
Сферон S 1000Сферон Fostat 1000Сферой CHСферон S 1000Сферон Fostat 1000Сферой CHСферон Salicyl 1000Сферон Salicyl 1000Сферон Oxin 1000Сферон Oxin 1000Полиамидные носители. Это группа различных гетероцепных полимеров с повторяющейся амидной группой ——С (О)——NH——. Один из способов их получения основан на гомополиконденсации аминокарбоновых кислот, например е-аминокапроновой кислоты или ее лактама (найлон-6, капрон):
Сферон S 1000
Сферон Fostat 1000
Сферой CH
Сферон S 1000
Сферон Fostat 1000
Сферой CH
Сферон Salicyl 1000
Сферон Salicyl 1000
Сферон Oxin 1000
Сферон Oxin 1000
Помимо найлона-6 для иммобилизации используются поли- изонитрилнайлон, полиаминоарилнайлон и др. Амидные группы придают полимерам гидрофильность.
Для использования в качестве носителей полиамиды активируют, частично гидролизуя, с последующей обработкой, например глутаровым альдегидом:
(g^『 1r г @(^「2ohc-(chq з-сно . (g)^N=CH~^СНа)з-CHO
Главным5 достоинством носителей этого типа является то, что они могут быть созданы в различной физической форме: в виде гранул, порошков, волокон, мембран, трубок и т. д.
К группе полиамидных носителей следует отнести полимеры иа основе N-винилпирролидона:
СН2=СН
NN
N
N
Широкое применение этих носителей, прежде всего для медицинских целей, обусловлено их биологической инертностью н стойкостью к воздействию биологической среды. При использовании поливинилпирролидона и сополимеров на его основе получаются препараты иммобилизованных ферментов, способные
медленно распадаться в организме, причем скорость распада зависит от природы второго мономера н концентрации сшивающего агента в смеси. Например, радикальная сополимеризация винилпирролидона с акриловой кислотой в присутствии азо- бисизобутиронитрила дает водорастворимый полимер, содержащий карбоксильные группы, а сополимеризация с глицидилакри- латом ——водорастворимый полимер с альдегидными группами.
Носители на основе поливинилового спирта. Эти носители, предложенные Г. Манеке и Г. Фогтом (1980), обладают высокой реакционной способностью. Соответствующая обработка позволяет вводить в них различные функциональные группы: диазо-, изотиоцианатные, альдегидные, хлоротриазиновые, дисульфидные и др. Для получения гидрофильных гелей носители могут быть сшиты глутаровым альдегидом в кислой среде, а в щелочной —— эпихлоргидрином или п-ксилилендихлоридом：
К достоинствам носителей на основе поливинилового спирта следует отнести, помимо высокого содержания реакционноспособных групп, большую вместимость по отношению к белкам.
Полиуретаны. Гидрофильные полиуретановые полимеры, содержащие группировку ——NH—С——О——,——достаточно удобные II
О материалы для включения ферментов в гель; процедура иммо* билизации в этом случае заключается в простом смешении компонентов.
Полиуретаны образуются при взаимодействии изоцианатов (например, 2, 4- и 2, 6-толуилен-, гекса метилен- или дифенил- метандиизоцианатов) с полиолами (гликолями, триолами, простыми или сложными олигоэфирами, содержащими ОН-группы). Структуру одного из полимеров для получения полиуретанового геля можно представить в следующем виде:
При полимеризации может происходить частичный гидролиз изоцианатных групп с выделением диоксида углерода. Образующиеся аминогруппы взаимодействуют с изоцианатными группами, поперечно сшивая полимер. Суммарную реакцию можно представить следующим образом:
2R—NCO + Н2О ~R—NHCONH—R + СО2
Полиуретаны обладают большей стойкостью по отношению к воде и окислителям, чем полиамиды.
Активация полимерных носителей
—СН—СН2—СН—СН2'J'J—СН—СН2、/NH—СН—СН2、/NHАктивация гидроксильных и аминогрупп носителя. Под активацией матрицы понимают проведение химической реакции с активатором, в результате которой на ее поверхности образуются электрофильные группы, обладающие высокой реакционной способностью по отношению к нуклеофильным группам на белке (напрнмер, амино- и SH-группам). В числе наиболее эффективных электрофильных групп можно назвать следующие (Дж. Порат, 1976):
—СН—СН2
—СН—СН2
'J
'J
—СН—СН2
、/NH
—СН—СН2
、/NH
имидокарбонаты
карбонаты
эпоксиды
азиридины
активированные двойные связи, напри- СНг=СН——SO2——
мер—С=СН—С(О)—
активированные атомы галогена, на- Вг—CHs—С (О)——
примерС1—С—NH
Вг—С(О)—СНг—
Реакции взаимодействия электрофильных групп носителя с нуклеофильными группами белка будут рассмотрены в гл. 1П. Здесь остановимся на способах получения самих активированных полимерных матриц.
Имидокарбонаты. Получение этих производных основано иа реакции полимеров с циангалогенами. Взаимодействие BrCN в водной или смешанной водно-органической среде с двумя соседними гидроксильными группами носителя приводит к образованию через неустойчивый цианат активного имидокарбоната (I) и неактивного карбамата (II)：
Как правило, этот прием используется для активации полисахаридов. Синтетические полимеры активируют этим способом значительно реже.
При температуре &20°С оптимальное значение pH этой реакции 11,0——12,5. Реакция в этих условиях крайне нерациональна. Дело в том, что создание сильно щелочной среды обусловлено необходимостью повышения нуклеофильности носителя, например полисахарида (за счет частичной ионизации ОН-группы). Однако здесь неустойчив как сам BrCN, так и образующийся эфир, который гидролизуется с образованием неактивного карбамата. Поэтому более 80% эфира цианата трансформируется по пути (II). Эффективность этой реакции можно повысить, увеличив электрофильность циановой группировки. Такая возможность была реализована путем промежуточного переноса этой группировки на триэтиламин:
N(Et)3+BrCN—— №С—N*(Et)3Br~
®—ОН + №С—N* (Et)3Br~ ——(Н)—О—C=N + HN(Et)3Br
Реакция активации идет при pH 7——8 через образование очень реакционноспособного комплекса триэтиламмонийнитрила (более реакционноспособного, чем BrCN), который атакует неионизо- ванные ОН-группы полисахарида. При снижении pH с 12 до 7 в 20 раз снижается расход BrCN, вместо 4 включается до 24% от внесенного азота (причем 98% оказывается в составе активных групп матрицы вместо 10% по старой методике). Эффективность включения повышается до 50%, а токсичность снижается практически до нуля, если вместо BrCN использовать 1-циан-4-диметиламинопиридинтетрафторборат.
Эпоксиды (оксираны). Например, 1,4-бис (2,З^эпокси пропокси) бутан часто используют для модификации и активации
гидроксил содержа щих полимеров:
®—ОН + СН2—JCH—СН2—О—(СН2 )4—о—сн2—сн—сн2 —
-^- ®~о—сн2(j：H—СН2—О-ЧСН2)4—О—СН2—СН--€Н2 он
Реакция протекает в щелочной среде (pH 8,5—11,0), реакционная способность образующегося эфира в отношении нуклеофиль-
иых групп белков проявляется в обычном порядке: SH > NH2 > > ОН. Попутно может протекать реакция сшивки матрицы：
В результате матрица становится нерастворимой в кипящей воде и более устойчивой к кислотам.
Для получения эпоксиактивированной матрицы вместо бисоксирана можно употреблять эпихлоргидрин. Преимущество носителей, эпоксидированных длянноцепочечными соединениями типа диглицилового эфира 1,4-к~бутандиола, по сравнению с носителями, обработанными эпихлоргидрином, и в целом преимущества метода эпоксидирования перед другими, в частности, бромциановым, заключаются в том, что он дает возможность получать длинную «иожку», отделяющую фермент от носителя. Это обстоятельство может иметь значение для уменьшения потери ферментативной активности из-за стерических затруднений, возникающих в процессе иммобилизации.
Соединения с активированными двойными связями. В полимеры, содержащие гидроксильные или аминогруппы, можно ввести винилсульфонильные группы. Для этого матрицу обрабатывают дивинилсульфоном в сильнощелочной среде:
(н)—он + сн2=сн—so2—сн=сн2 —— ®—о—сн2—сн2—so2—сн=сн2
Этот метод активации используется редко ввиду токсичности дивинилсульфона.
Весьма эффективными агентами для активации полисахаридов оказались ароматы чес кие хиноны, в частности бензохинон:
Реакция протекает легко с высоким выходом, в широком интервале pH (от 3 до 10).
Соединения с активным атомом галогена. Хлортриазины (например, цианурхлорид) легко реагирует с гидроксильной и аминогруппой полимера в щелочной водно-органической среде:
(где R = —Cl; —NH2; —NHR，)
Наиболее часто этим способом активируют полисахариды и их аминопроизводные, хотя используются и белковые носители (коллаген, кератин, фиброин). Среди синтетических полимеров аминированный полистирол и поливиниловый спирт также могут быть успешно активированы хлортриазинами.
Эффективным реагентом, позволяющим проводить реакцию в мягких условиях (pH 7,5), является трезилхлорид (трифтор- этилсульфонилхлорид):
^)—СНзОН + Cl—SOj—CH?—CF3 亠(H)—CH?—О—SO2—CH2—CF3 + HC1
Альдегидные группы. Введение реакционноспособных альдегидных групп может быть осуществлено несколькими путями. Полимеры, имеющие гидроксильные группы, например полисахариды, могут быть окислены под действием перйодата натрия. В качестве примера можно привести структуру звена диальде- гидцеллюлозы:
Применение альдегидных производных полисахаридов часто обеспечивает меньшую потерю активности фермента, чем, например, хлортриазильных производных.
Введение альдегидных групп в полимеры, содержащие аминогруппы, можно проводить с помощью ди альдегидов, например глутарового альдегида. Таким способом можно активировать аминоэтил целлюлозу, аминополистирол, ПААГ, полиамиды, белковые носители и т. д. Реакцию активации аминогрупп можно представить так:
®—NH2 + HOC—(СН2)3—СНО ―— @-N=CH—(СН2)3—CHO
И наконец, введение альдегидной группы можно осуществить при полимеризации, подбирая соответствующий мономер, например аддукты полиакролеина и гидросульфита натрия, сополимеры ненасыщенных альдегидов и винил пирролидона и т. д. Один из процессов разобран выше (получение ванакрила).
+
Имидоэфирные группы (—С = NH—-). Введение этих групп I
OR применяется как один из способов активации полиамидных носителей. Схему реакции с диметилсульфатом можно представить следующим образом:
—C—NH(色必 §2s_ —C=NH—
III
ООСНз
Полимерные нитрилы обработкой хлор водородом в среде метанола также можно активировать до имидопроизводных:
—Н2С—CH ^L-^^^—н2с—СН—
gNC=NH
ОСНз
+-
Диазогруппы (—NsNCl). Их введение—весьма широко применяемый способ активации носителей, содержащих аминогруппы в ароматических радикалах. В качестве примера можно назвать n-аминобензилцеллюлозу, поли-п-аминостирол, наиболее часто активируемые этим путем. К аминопроизводным также относятся ароматические аминопроизводные шелка, шерсти, хитина, частично гидролизеванный полиамид и др.
Довольно сложная схема активации сефарозы с целью введения реакционноспособных диазогрупп предложена С. Ике до й и С. Фукуи (1973):
—№M^-no,
(Н>—ОН + HaN(CHa).NHa -- * ®—NH(CH3)eNH3 ^•-
®—№i(CHa).NH8®—№i(CHa).NH8®—NH(CHa).®—NH(CHa).(Н)—NH(CH3)eNHCOCeH4NOa ^^(Н)—NH(CH3)eNHCOCeH4NOa ^^Аминогруппы. Введение этих групп (с последующим диазотированием) в носители, содержащие ОН-группы, может осуществляться различными способами. Полисахариды, как правило, обрабатывают хлорангидридом n-нитробензойной кислоты, далее МОг-группы восстанавливают до КНг-групп:Аминогруппы. Введение этих групп (с последующим диазотированием) в носители, содержащие ОН-группы, может осуществляться различными способами. Полисахариды, как правило, обрабатывают хлорангидридом n-нитробензойной кислоты, далее МОг-группы восстанавливают до КНг-групп:
®—№i(CHa).NH8
®—№i(CHa).NH8
®—NH(CHa).
®—NH(CHa).
(Н)—NH(CH3)eNHCOCeH4NOa ^^
(Н)—NH(CH3)eNHCOCeH4NOa ^^
Аминогруппы. Введение этих групп (с последующим диазотированием) в носители, содержащие ОН-группы, может осуществляться различными способами. Полисахариды, как правило, обрабатывают хлорангидридом n-нитробензойной кислоты, далее МОг-группы восстанавливают до КНг-групп:
Аминогруппы. Введение этих групп (с последующим диазотированием) в носители, содержащие ОН-группы, может осуществляться различными способами. Полисахариды, как правило, обрабатывают хлорангидридом n-нитробензойной кислоты, далее МОг-группы восстанавливают до КНг-групп:
ОН-группы поливинилового спирта активируют взаимодействием с 2- (л-аминофенил) -1,3-диоксол а ном (а) или л-нитрофе- нилхлорметаном (б):
Активация карбоксильных групп носителя. Введение азидной группы ——это один из наиболее старых способов активации носителей. Чаще всего для этой цели используют карбоксильные производные полисахаридов ——целлюлозы, декстрана. Модифицированный препарат этерифицируют, переводят в гидразид, а затем в азид:
GHQH, на* ^^ОСН2 СООС2 Н5GHQH, на* ^^ОСН2 СООС2 Н5NHjNHj • НаОNHjNHj • НаО
GHQH, на* ^^ОСН2 СООС2 Н5
GHQH, на* ^^ОСН2 СООС2 Н5
NHjNHj • НаО
NHjNHj • НаО
/OCH2CON3 ^^он/OCH2CON3 ^^он^xOCH2CONHNH2 N1NOa/HCi ^^он
/OCH2CON3 ^^он
/OCH2CON3 ^^он
В качестве источника для получения азида можно применять и полимеры, не имеющие карбоксильных групп. Например, полиакриламид, обработанный гидразином («энзакрил АН》)，легко превращается в азид непосредственно перед иммобилизацией фермента:
(н)—CONH2 1一、@—€ONHNH2 宀°"“° А @—€ON3
В последнее время азидный метод применяется редко из-за одновременного протекания ряда побочных реакций, приводящих к образованию неактивных амидных и карбамидных групп на носителе.
Широкое распространение получил метод ацилирования в присутствии карбодиимидов. В качестве карбоксилсодержащих полимеров могут быть использованы производные полисахаридов, различные полимеры на основе акриловой кислоты, сополимеры N-винилпирролидона и ненасыщенных кислот и др.:
NH—RNH—R
NH—R
NH—R
И наконец, весьма эффективным методом активации носителей, содержащих карбоксильные группы, является ацилирование, в присутствии реактива Вудворда (К-этил-5-фенилоксазо- лий-3,-сульфоната):
Этот процесс характеризуется такими положительными качествами, как быстрота, мягкие условия протекания и, что очень важно, возможностью легко контролировать количество введенных активированных групп.
Модификация амидных групп (на примере полиакриламида). Как правило, первая стадия активации полимера, содержащего амидную группу, — это проведение реакции переамидирования：
H2C
HzN— (CHa) г—NH：HzN— (CHa) г—NH：NH-—(CH.2)2—NHgNH-—(CH.2)2—NHg
HzN— (CHa) г—NH：
HzN— (CHa) г—NH：
NH-—(CH.2)2—NHg
NH-—(CH.2)2—NHg
、NH—(CH2 )2—NH2、NH—(CH2 )2—NH2сна—CH—c<I I 、HNaBH«сна—CH—c<I I 、HNaBH«Образовавшаяся функциональная группа требует дополнительного активирования. Оно может быть проведено различными путями. Один из них ——формирование стабильного диоксипроизводного с последующим окислением до альдегида непосредственно перед взаимодействием с ферментом:
、NH—(CH2 )2—NH2
、NH—(CH2 )2—NH2
сна—CH—c<
I I 、H
NaBH«
сна—CH—c<
I I 、H
NaBH«
®-с(°-
№10,№10,XNH—(СН1)!—NHCH2CH—сна он
№10,
№10,
Ф>-с</О
XNH—(СН2)2—NHCH2
Другой путь последующей активации полнакриламида ——это введение диазогруппы:
@—CONH(CH2)6—nh2 —」/「№" (h)—conh(ch2)6—nhco—c6H4—no2
NaNO2/HCl
—•- @—CONH(CHa)6—NHCO—C6H4—NH3*^
—1 (hJ—CONHCCH,)^—NHCO—C6H4—№NC1
Модификация бензольного ядра (на примере полистирола). Наиболее распространенными из реакций модификации поли- стирольных матриц являются хлорметилирование и нитрование. Хлорметилирование может быть проведено различными способами, например под действием монохлордиметилового эфира в присутствии SnC<4：
—с— н—с— н噜辭 “Y>-CH2a噜辭 “Y>-CH2a
—с— н
—с— н
噜辭 “Y>-CH2a
噜辭 “Y>-CH2a
Хлорметильное производное может быть промодифицировано дальше избытком амина по отношению к хлорметильным группам (для предотвращения сшивания поли стирольных цепей):
C&NHRC&NHR(R=—(CH2)2NH2; —(CH2)2NH(CH2)2NH2)(R=—(CH2)2NH2; —(CH2)2NH(CH2)2NH2)
C&NHR
C&NHR
(R=—(CH2)2NH2; —(CH2)2NH(CH2)2NH2)
(R=—(CH2)2NH2; —(CH2)2NH(CH2)2NH2)
Схема процесса нитрования с последующим восстановлением нитрогруппы может быть представлена так:
Н2СН2cН2С
н8~О 躋 H«^^-NO噴計 HG^^NH一
H2C
l^ HC—^^-N=N(C1)
Кроме этих, наиболее известных способов модификации бензольного ядра полимера используют также методы, основанные на введении альдегидных и карбоксильных групп:
§ 4. Биодеградация полимерных носителей§ 4. Биодеградация полимерных носителей
§ 4. Биодеградация полимерных носителей
§ 4. Биодеградация полимерных носителей
Проблема биодеградации полимерных носителей приобретает серьезное значение в связи с применением иммобилизованных ферментов в медицине. Полимеры, имеющие высокую молекулярную массу, могут накапливаться в организме, поэтому возникает необходимость создания таких синтетических полимеров (или выбора природных), которые будут расщепляться с образованием нетоксичных продуктов обмена. В этом отношении предпочтение отдается природным полимерам, которые гидролизуются в организме ферментами. Так, например, в качестве носителя лекарственных препаратов наиболее широко применяют декстран ―■ нетоксичный, с малой иммуногенностью, способный к биодеструкции полисахарид. В свою очередь отметим, что химическая модификация природных полимеров может существенно сннзнть скорость их деструкции.
Среди синтетических полимерных материалов наибольшее применение в качестве носителей лекарственных препаратов имеют полимеры на основе N-вииилпиppoлидoнai Проводятся также попытки целенаправленного синтеза биодеградируемых полимеров, в частности полиуретанов, содержащих в основной цепи дипептидные фрагменты; поливинилпирролидоиа со звеньями эфиров щавелевой кислоты и др.
Дополнительными факторами, играющими существенную роль в длительности действия препаратов и в снижении их токсичности, являются молекулярная масса и степень неоднородности полимера. Так» молекулярная масса полимера не должна быть слишком высокой. Например, установлено, что материалы на основе поли-Ы-винилпирролидона, имеющие молекулярную массу более 20 000, не способны рыводиться нз организма. Важную роль здесь играет и молекул яр но - м ассовое распределение; повышение неоднородности по молекулярной массе приводит к увеличению токсичности материала.
ОРГАНИЧЕСКИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ НОСИТЕЛИ
§ 5・ Природные носители (липиды)
Вопросы белок-липидных взаимодействий давно привлекают внимание исследователей, так как in vivo большинство ферментативных реакций протекает вблизи или на поверхности оиомем- бран. Поэтому иммобилизация ферментов на природных липидных носителях (конструирование ансамблей белок-липид) может рассматриваться как наиболее близкое приближение к условиям функционирования ферментативных систем в живой клетке.
Для целей такой иммобилизации, как правило, используются природные липиды — компоненты биомембран. Структуры наиболее распространенных природных липидов изображены на рис. 1.
Обычно липидные носители применяются в виде монослоев на различных поверхностях или бислоев (как правило, сферической формы).
Монослои липидов на поверхности воды. Липиды, имеющие в своем составе хотя бы небольшую полярную «голову», способны образовывать мономолекулярные пленки на границе раздела фаз (вода и воздух или вода и неполярный растворитель) .Липидные молекулы в монослое расположены таким образом, что их полярные головные группы погружены в водную фазу, а углеводородные части направлены в воздух или погружены в органический растворитель. Такая пленка способна сорбировать белковые молекулы. Изучение монослоев липидов, содержащих белок, помогает понять природу взаимодействия липидов и белков в биологической мембране (сорбцию белка на липидной поверхности, электростатические и гидрофобные
VWQXWOJ 工言。 口 Hgd9 ① d3 хт^хх
^ .产.* T-* F . -0-0-0-0-0-0-0-0-00-0 4 O- ■*.工!5u^ 。 工^3：gQ^,
0-0-0-0-0'U-O-U-O-O-Q !«»»•• >■••
3.一蜘 * _*・…4(^ 5 U
' ・畔1 ,f ； 「， , 1Г .
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o 4 o-
二 T* "・ <"'.二屮废4 i ' V P。
-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-q
、:…「" , З о
I
O-o. о
-О Л 0-6-
0-^.0Q
工xuxuoxqdex
-0-00-0-0-0-0-0 0*0-0 q Q-O 0--O-O-O-Z -OH
. I ・・・，・・■，•丁
t 奇,V', T и? , ^\'f p-о工
-O-O-OO-O-O-O-O-O-O-V
ТИ1ИП ① S 工,0X1
•/二± u •、мк 工 6 o-q т
*"• . •■»■ I 汐* J,.贈 ■ Q ，
*0-0-0-0-0-0-0-0-00-0 4 Q-O-n- O 0-0
:,，4 ; 一06:7产户<)
-О-О-О-О'О-О-О-О о-о-Ъ
，工
lxeo 工XI 工 Mdgl-ииошееооб
ssw^oo I
-CQOBH 二 M>Y3HHEd9wew 3CXH elqHBOHUO •一 dx^
工工sel/OHcale—
(』J) BonMUML。MwemoqQ」MWIqHdKIrcLJ X (/) м WEbUOQX SS3=^K§EOX alqwaesMHEEMf-JOH关 AdxoAirou -eHod ОМОН 2SOH^ 丨 MxhoHdah -HMdatalfox 丨 в 二 qHMUMIfoJHMCb0— 9 -2^XEXe.0^0^s5 I a
взаимодействия этих соединений, влияние поверхности на конформацию белка).
Получение монослоев липидов на поверхности воды требует специальной техники и является весьма трудоемкой процедурой, что ограничивает их применение.
Монослои липида на твердой поверхности. Эти системы в качестве носителей были предложены О. М. Полтор а ком и Е. С. Чухрай (1966). Суть метода состоит в нанесении липидного монослоя на твердую подложку (силикагель, сажа, аэросил) с последующей адсорбцией белка из водного раствора. В качестве липидной матрицы используют обычно лецитин, фосфатидил- этаноламин и холестерин. Разработан также метод получения искусственных смешанных лецитин-холестериновых слоев.
Возможность варьировать структуру и ориентацию молекул в липидных слоях достигается подбором полярности носителя и природы используемого растворителя липида. Если липид с молекулами дифильной природы, растворенный в неполярном органическом растворителе (бензол, гептан), адсорбировать на полярном силикагеле, то в монослое липида углеводородные цепи будут ориентированы наружу. При адсорбции липида из полярного растворителя на неполярной графитовой саже можно получить гидрофильный монослой, в котором полярные головные группы ориентированы в сторону растворителя.
Липосомы. Впервые липосомы были описаны А. Бэнгэмом в 1964 г. Для их приготовления наиболее часто используются фосфатидилхолины (лецитины), фосфатидилэтаноламин, фосфат- идилсерин, кардиолипин, сфингомиелин, причем они образуются как из чистых липидов, так и смесей.
Существует три различных типа липосом: мультиламелляр- ные, моноламеллярные и макровезикулярные. Мультиламелляр- ные липосомы представляют собой замкнутые упорядоченные структуры, состоящие из нескольких концентрических липидных бислоев, отделенных один от другого водной средой. Расстояние между соседними липидными бислоями равно 7,5 нм, диаметр центрального водного ядра равен приблизительно 0,15 мкм, а суммарный диаметр мультиламеллярных липосом колеблется* от 1—2 до 50 мкм.
Ультразвуковая обработка мультиламеллярных липосом приводит к трансформации их в простые, или моноламеллярные. При такой обработке размеры частиц уменьшаются; диаметр моноламеллярных липосом составляет от 20,0 до 50,0 нм.
Третий тип липосом ——макровезикулярные липосомы, образующиеся, например, путем слияния малых липосом, индуцируемого ионами С/+, а также присутствием фосфолипидов с отрицательно заряженными головными группами. Такие липосомы состоят из одного бислоя и могут иметь диаметр от 60,0 нм до 100 мкм.
Размер и форма липосом зависят от способа их приготовления, а также от таких факторов, как кислотность среды, при-
сутствие неорганических солей и природы используемого липида.
Широкое применение липосом как носителей для ферментов и лекарственных препаратов обусловлено простотой получения, легкостью регенерации иммобилизованного материала, а также возможностью использования in vivo благодаря близости свойств этих липидов носителей и природных биомембран.
Синтетические аналоги лнпидов (поверхностно-активные вещества)
Поверхностно-активные вещества (ПАВ) состоят из молекул дифильной природы, имеющих в своем составе как полярную головную группу, так и неполярную углеводородную часть. В принципе уже рассмотренные природные липиды также относятся к ПАВ. Синтетические ПАВ —— это соединения, многие из которых являются продуктами крупнотоннажного производства.
В зависимости от того, какие группы присутствуют в головной части молекулы, все ПАВ можно разделить на четыре основных типа: анионные, катионные, неионные н цвиттерионные. В качестве примеров можно назвать следующие:
ОО
IIII
Н3С—(Н2С) 3—СН—СН?—О—С—CH—СН2—С—
НзС—СН2SO3 Na
—О—СН2—CH— (CH2) з—СНз
I
Н2С—СНз
био-2-этил гекс иловый эфир натриевой соли сульфоянтарной кислоты — анионное ПАВ СНз
I
НзС-iN—(СН2) is—СНзВг-
I
СНз
цетилтриметнламмонийбромид — катионное ПАВ
но— [СН2—СН2—0]9不《^>— (СН2) 7—СНз
поли (9—10) оксиэтнлеиа октилфениловый эфир (тритон Х-100 ——неионное ПАВ)
С„Н2„+1+N (СНз) 2СН2СОО-,
алкилдиметилкарбоксибетаин ——цвиттерионное ПАВ,
где 几=10—18,
Приведенные примеры не исчерпывают всего многообразия промышленных ПАВ. Так, например, фирмой «Serva» выпускается более 30 наименований только неионных ПАВ различного
ТаблицаТаблицаТипы структур ПАВТипы структур ПАВ5. Неиоииые ПАВ, выпускаемые фирмой «Serva>
Таблица
Таблица
Типы структур ПАВ
Типы структур ПАВ
"У г леводородныйНазвание
фрагмент
НО—[Et—О]-(простые эфиры полиоксиэтилена)НО—[Et—О]-(простые эфиры полиоксиэтилена)(сложные эфиры полиоксиэтилена)(сложные эфиры полиоксиэтилена)Гекса децил3 ДодецилГекса децил20Гекса децил20 Додецил8 Стеароил40 Стеароил100 СтеароилГекса децил3 ДодецилГекса децил20Гекса децил20 Додецил8 Стеароил40 Стеароил100 СтеароилМирдж 45Мирдж 52Мирдж 59Мирдж 45Мирдж 52Мирдж 59
НО—[Et—О]-
(простые эфиры полиоксиэтилена)
НО—[Et—О]-
(простые эфиры полиоксиэтилена)
(сложные эфиры полиоксиэтилена)
(сложные эфиры полиоксиэтилена)
Гекса децил
3 Додецил
Гекса децил
20Гекса децил
20 Додецил
8 Стеароил
40 Стеароил
100 Стеароил
Гекса децил
3 Додецил
Гекса децил
20Гекса децил
20 Додецил
8 Стеароил
40 Стеароил
100 Стеароил
Мирдж 45
Мирдж 52
Мирдж 59
Мирдж 45
Мирдж 52
Мирдж 59
снонсн2—о~со-снонсн2—о~со-(окснэтилироваиные эфиры ангидросорбита и жирных кислот)(окснэтилироваиные эфиры ангидросорбита и жирных кислот)0ТриолеоилСпан 850ТристеароилСпаи 650ОлеоилСпан 800СтеароилСпан 600ПальмитоилСпаи 400ЛауроилСпан 205СтеароилТвин 6120ТристеароилТвин 6520ТриолеоилТвин 8520СтеароилТвии 6020ОлеоилТвии 8020ПальмитоилТвин 4020ЛауроилТвин 200ТриолеоилСпан 850ТристеароилСпаи 650ОлеоилСпан 800СтеароилСпан 600ПальмитоилСпаи 400ЛауроилСпан 205СтеароилТвин 6120ТристеароилТвин 6520ТриолеоилТвин 8520СтеароилТвии 6020ОлеоилТвии 8020ПальмитоилТвин 4020ЛауроилТвин 20
снон
сн2—о~со-
снон
сн2—о~со-
(окснэтилироваиные эфиры ангидросорбита и жирных кислот)
(окснэтилироваиные эфиры ангидросорбита и жирных кислот)
0
Триолеоил
Спан 85
0
Тристеароил
Спаи 65
0
Олеоил
Спан 80
0
Стеароил
Спан 60
0
Пальмитоил
Спаи 40
0
Лауроил
Спан 20
5
Стеароил
Твин 61
20
Тристеароил
Твин 65
20
Триолеоил
Твин 85
20
Стеароил
Твии 60
20
Олеоил
Твии 80
20
Пальмитоил
Твин 40
20
Лауроил
Твин 20
0
Триолеоил
Спан 85
0
Тристеароил
Спаи 65
0
Олеоил
Спан 80
0
Стеароил
Спан 60
0
Пальмитоил
Спаи 40
0
Лауроил
Спан 20
5
Стеароил
Твин 61
20
Тристеароил
Твин 65
20
Триолеоил
Твин 85
20
Стеароил
Твии 60
20
Олеоил
Твии 80
20
Пальмитоил
Твин 40
20
Лауроил
Твин 20
(полиоксиэтиленалкилфениловые эфиры)(полиоксиэтиленалкилфениловые эфиры)355ТТТ163040355ТТТ163040Октил Октил Нонил Октил Октил Октил Октил Октил Октил ОктилОктил Октил Нонил Октил Октил Октил Октил Октил Октил ОктилТритон Х-15Тритон Х-35Тритон N-57Тритон Х-45Тритон Х-114Тритон Х-100Тритон Х-102Тритон Х-165Тритон Х-305 Тритон Х-405Тритон Х-15Тритон Х-35Тритон N-57Тритон Х-45Тритон Х-114Тритон Х-100Тритон Х-102Тритон Х-165Тритон Х-305 Тритон Х-405
(полиоксиэтиленалкилфениловые эфиры)
(полиоксиэтиленалкилфениловые эфиры)
355ТТТ163040
355ТТТ163040
Октил Октил Нонил Октил Октил Октил Октил Октил Октил Октил
Октил Октил Нонил Октил Октил Октил Октил Октил Октил Октил
Тритон Х-15
Тритон Х-35
Тритон N-57
Тритон Х-45
Тритон Х-114
Тритон Х-100
Тритон Х-102
Тритон Х-165
Тритон Х-305 Тритон Х-405
Тритон Х-15
Тритон Х-35
Тритон N-57
Тритон Х-45
Тритон Х-114
Тритон Х-100
Тритон Х-102
Тритон Х-165
Тритон Х-305 Тритон Х-405
строения (табл. 5). Список промышленных ПАВ с обсуждением их свойств можно найти в справочнике «Поверхностные явления и поверхностно-активные вещества> (под ред. А. А. Абрам- зона и Е. Д. Щукина, 1984).
Рассмотрим некоторые примеры использования ПАВ в качестве носителей для ферментов.
Обращенные мицеллы ПАВ в органических растворителях. Они представляют собой ассоциаты, в которых полярные головные группы молекул ПАВ образуют ядро мицеллы, а углеводородные остатки этих молекул направлены в органический растворитель. В полярную внутреннюю полость обращенной мицеллы может быть включено (солюбилизовано) значительное количество воды (до нескольких десятков молекул воды на каждую молекулу ПАВ) и других полярных веществ. Размеры внутренней полости обращенных мицелл можно целенаправленно
и в широких пределах варьировать (от 1 до 20 нм), изменяя содержание воды в системе.
Обращенные мицеллы образуются ПАВ различного типа, как синтетическими, так и природными. Наиболее полно изученным по физико-химическим параметрам и представляющим большой интерес для целей иммобилизации ферментов является бис-2- этилгексиловый эфир натриевой соли сульфоянтарной кислоты (аэрозоль ОТ) —- продукт, выпускаемый фирмами 《Merck》 (ФРГ),《Sigma》(США), «Serva» (ФРГ). Обращенные мицеллы аэрозоля ОТ в органическом растворителе (например, октане) характеризуются весьма узким распределением по размерам, т. е. каждому значению содержания воды в системе соответствует определенный диаметр агрегатов аэрозоля ОТ.
Синтетические моющие средства с био добавками. Синтетические моющие средства (СМС) на основе ПАВ используются в практике очень давно. В последние годы все шире начинают применяться СМС с биодобавками —— ферментами. В качестве ПАВ в таких композициях применяются обычно смеси синтетических жирных кислот (Ci?—С20), оксиэтилированных жирных спиртов, алкиларилсульфонаты и др. Такие ПАВ входят в порошкообразные моющие средства《Ока》и «Био», содержащие в своем составе протеолитические ферменты. Средство для чистки ковров н удаления различных пятен включает смесь натриевых солей производных сульфоянтарной кислоты в качестве носителей для высокоактивных биодобавок на основе смеси липолитических, п ротеолитических и а милолитических ферментов.
Носители из полимеризованных ПАВ. Г. Рингсдорфом (1977—1978) был предложен метод модификации сферических липидных агрегатов, заключающийся в их полимеризации. В этом случае для получения липосом используются липиды, молекулы' которых модифицированы путем введения групп, содержащих кратные углерод-углеродные связи. В результате полимеризации происходит ковалентная сшивка липосомальной оболочки, приводящая к ее ужестчению. Помимо модифицированных природных липидов для приготовления полимерных липосом применяются также синтетические мономерные ПАВ.
Основные типы функциональных групп, вводимых в молекулы синтетических ПАВ и липидов, и способы их полимеризации приведены в табл. 6.
В зависимости от вида функциональной группы полимеризацию проводят различными способами. В большинстве случаев полимеризация представляет собой радикальную реакцию, инициируемую химически и (или) облучением ультрафиолетовым светом. Наиболее широко в качестве инициатора радикальной полимеризации используют азо-бис-изобутиронитрил. Эффективность полимеризации увеличивается при переходе от моноламел- лярных липосом к мультиламеллярным. Легкость и глубина протекания полимеризации зависят также от положения кратной связи в молекуле мономерного ПАВ (липида). Чем ближе
Таблица типа мономераТаблица типа мономера6. Способы6. СпособыФункциональная группа
Таблица типа мономера
Таблица типа мономера
6. Способы
6. Способы
Сопряженные тройные связи
R1—С ^=С —С=С—R2
Сопряженные двойные связи
Ri—СН=СН—СН=СН—R2
Двойные связиRj—СНКН—R】Двойные связиRj—СНКН—R】Тройная связьТройная связьR—N=CR—N=CSH -группаSH -группаАмидная и эфириая группы (поликондецсация)
Двойные связи
Rj—СНКН—R】
Двойные связи
Rj—СНКН—R】
Тройная связь
Тройная связь
R—N=C
R—N=C
SH -группа
SH -группа
получения полимерных липосом в зависимости отполучения полимерных липосом в зависимости отСхема реакцииСхема реакции* Ri, R2 — фрагменты молекулы липида или ПАВ, не принимающие участия в полимеризации
получения полимерных липосом в зависимости от
получения полимерных липосом в зависимости от
Схема реакции
Схема реакции
двойная связь к полярной «голове» молекулы, тем «труднее» проходит полимеризация.
По сравнению с обычными полимерные липосомы гораздо более стабильны по отношению к механическим и химическим воздействиям и сохраняют форму и размеры в течение нескольких месяцев.
В настоящее время усилия исследователей направлены на создание с использованием полимерных липосом носителей для лекарственных препаратов.
НЕОРГАНИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ —
НОСИТЕЛИ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ
Для иммобилизации ферментов используются различные типы неорганических носителей, такие, как матрицы на основе силикагеля, глины, керамика, природные минералы, графитирован-
ная сажа, металлы и их оксиды. Основными качествами, обусловливающими широкое внедрение неорганических материалов в промышленные процессы, являются легкость их регенерации, возможность придания им любой конфигурации. Носители применяются как в виде порошков, шариков, так и монолита. Неорганические носители могут быть как пористыми, так и непористыми.
Макропористые кремнеземы
К носителям этого типа относятся силикагели, силохромы и макропористые стекла. К достоинствам кремнеземных носителей следует отнести механическую прочность, химическую инертность ко многим растворителям, наличие жесткого скелета с заданным размером пор, устойчивость к воздействию микроорганизмов.
Силикагель ——аморфное вещество с общей химической формулой xSiCh^gHzO. Получают его в процессе «старения» (поликонденсации) ортокремниевой кислоты (S1O2-2H2O). Схематически процесс поликонденсации выглядит следующим образом:
I I
ОН—О—Si—О—Si—О—...
II
НО—Si—ОН—-►ОО
III
ОН—о—S i—О—S i—О—...
II
Поверхность частиц силикагеля и других кремнеземов покрыта гидрофильными гидроксильными группами, обладающими сла- бовыраженными кислотными свойствами. В щелочной среде силикагель постепенно разрушается:
〉Si—О—Si^^ + H2O ^^，SiOH + HO—Si^^
Недостатки кремнеземных носителей связаны с использованием их в ограниченном диапазоне pH, с некоторой неспецифической сорбцией иа их поверхности. Последнюю можно устранить путем модификации поверхности кремнеземов. Модификацию обычно проводят одним из двух способов. Для снижения растворимости и повышения стабильности носителей их покрывают различными материалами, например пленкой оксида металла (алюминия, циркония, титана), полимеров (полиэтиленимина), или обрабатывают солями переходных металлов.
Можно химически модифицировать кремнеземы путем введения различных реакционноспособных групп (—CN; —NOg, —NH2 и др.) или гидрофобизовать поверхность, например хлорангидри- дамн замещенных бензойных кислот или стеароилхлоридом.
Среди методов химической модификации кремнеземов наибо-
Лее распространенным является обработка носителя кремний- Органическими веществами. Так, взаимодействие с у-амнно- йропилтриэтоксисиланом приводит к появлению на поверхности носителя аминогрупп
OH (QaHbOlsSiJCHdiNlUOH (QaHbOlsSiJCHdiNlUО—Si(CH5)3NH2О—Si(CH5)3NH2
OH (QaHbOlsSiJCHdiNlU
OH (QaHbOlsSiJCHdiNlU
О—Si(CH5)3NH2
О—Si(CH5)3NH2
что позволяет использовать такие носители для иммобилизации, а также модифицировать аминопропилкремнеземы различными реакцибнноспособными производными кислот (хлорангидридами, ангидридами, азидами и т. д.). Другие силанольные производные, применяемые для модификации кремнеземов, приведены ниже:
(CH3O)3Si(CH2)3CN(СН3О) 3Si (СН2) 3ОСН2СН——СН2
у-цианопропилтримето-^Xq/^
ксисилан-у-глицидоксипропилтриметоксисилаи
(CH3O)3Si(CH2)r-SH
7-меркаитолропилТриметоксисилаи
Широко распространен метод обработки кремнеземов гало- генал кил силанами, например хлор метилтриэтоксисила ном, приводящий к образованию реакционноспособных галогеналкильных групп:
он дьо^&шон дьо^&шО—Si—СН2С1О—Si—СН2С1
он дьо^&ш
он дьо^&ш
О—Si—СН2С1
О—Si—СН2С1
>i—ОН ^ОЪ^±-со^![Сн^>i—ОН ^ОЪ^±-со^![Сн^О—Si—RCO2Si(CH3)3 ^О—Si—RCO2Si(CH3)3 ^О—Si—R——CON3О—Si—R——CON3К другим модификаторам, позволяющим получать .активированные производные кремнеземов, относятся сложные эфиры силилкарбоновых кислот. Сложноэфирные производные кремнеземов легко могут быть переведены в реакционноспособную гидразидную или азидную формы:
>i—ОН ^ОЪ^±-со^![Сн^
>i—ОН ^ОЪ^±-со^![Сн^
О—Si—RCO2Si(CH3)3 ^
О—Si—RCO2Si(CH3)3 ^
О—Si—R——CON3
О—Si—R——CON3
n曲、siOSi—RYONH—NH2 ^^ / IHCI
Таким образом, применение различных модифицирующих агентов дает возможность целенаправленного изменения свойств поверхности кремнеземных носителей. Однако стоимость кремнеземных носителей относительно высока, а модификация еще выше поднимает их цену, что является существенным ограничением во внедрение кремнеземов в промышленности.
§ 8・ Другие неорганические носители
Более пригодными для промышленного использования могут оказаться природные алюмосиликаты —— глины, цеолиты, а также пористая керамика, в состав которой, помимо алюмосиликатов,
входят оксиды титана, циркония, или другие добавки. Поверхность таких носителей аналогично кремнеземным может быть модифицирована различными органическими веществами, например замещенными силанами (у-аминопропилтриэтоксисиланом).
Важной характеристикой силикатных и алюмосиликатных носителей является высокая плотность поверхностных групп, связывание белковых молекул на которых может осуществляться как за счет электростатических взаимодействий, так и водородных связей. Это имеет немаловажное значение для эффективной иммобилизации ферментов.
Следует также отметить широко распространенные носители—уголь и графитированную сажу. Уголь может быть использован в качестве носителя как для адсорбционной, так и для ковалентной иммобилизации (после предварительной активации поверхностных оксидных групп).
К достоинствам графитированной сажи можно отнести высокую однородность и электрическую проводимость ее поверхности. Последнее свойство важно при создании биоэлектрокаталитиче- ских систем на основе иммобилизованных ферментов. Серьезным недостатком этого носителя является низкая механическая прочность, что ограничивает его применение. Отложением углерода на гранулированной саже был создан новый носитель —— карбохром, в котором высокая механическая прочность сочетается с достоинствами графитированной сажи.
Весьма перспективными представляются носители на основе металлов н их оксидов. Эти носители характеризуются высокой механической прочностью, относительной дешевизной, стабильностью, хорошими гидродинамическими свойствами. На практике чаще всего употребляются носители на основе оксида алюминия и титана. В промышленном масштабе их получают обычно в виде макропористых порошков, однородных по форме и размеру. Применение матриц этого типа позволяет проводить иммобилизацию ферментов как ковалентным связыванием с носителем, так н адсорбцией на нем. Для ковалентной иммобилизации носитель предварительно активируют у-аминопропилтриэтоксиси- ланом.
Металлические поверхности, используемые в качестве носителей (Al, Ni, Ti), как правило, модифицируют, либо создавая оксидную пленку на поверхности матрицы, либо покрывая их слоем полимера (производные полистирола, целлюлозы и т. д.). Это позволяет значительно повысить сорбционную вместимость носителя.
Таким образом, рассмотрение основных типов носителей свидетельствует о широких возможностях, предоставляемых химией инженерной энзимологии. Наиболее полный перечень неорганических и органических носителей для иммобилизации, вырабатываемых промышленностью многих стран мира, приведен в справочнике А. А. Лурье «Хроматографические материалы» (1978).
[Ьава
МЕТОДЫ ФИЗИЧЕСКОЙ
ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ
Согласно одному из принятых определений, которое вытекает из более общего определения иммобилизации, сформулированного во Введении, под иммобилизацией фермента понимается его включение в какую-либо изолированную фазу, которая отделена от фазы свободного раствора, но способна обменивать ся с находящимися s последней молекулами субстрата или эффектора. Иными словами, иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. На основаннн этого определения все существующие методн физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединен с носителем ковалентными связями) можно разделить на четыре группы: 1) адсорбция на нерастворимых носителях; 2) включение в поры геля; 3) пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны); 4) включение в двухфазную реакционную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.
Сущность перечисленных подходов иллюстрируется рис. 2.
Приведенная классификация условна, поскольку не всегда возможно провести четкую границу между различными способами иммобилизации. Например, при иммобилизации путем включения в гель последний можно рассматривать как полупроницаемую мембрану, отделяющую фермент от раствора субстрата. Тем не менее использование такой классификации полезно в том отношении, что она позволяет систематизировать существующие методы физической иммобилизации и помогает ориентироваться в их огромном многообразии.
В задачу настоящей главы не входит подробное описание носителей, применяющихся для иммобилизации, и рассмотрение конкретных примеров иммобилизации различных ферментов. Сведения такого рода содержатся, соответственно, в первой гла-
полупроницаемая мембрана ВТполупроницаемая мембрана ВТполимерная сетка геляполимерная сетка геляббРис. 2. Способы физической иммобилизации ферментов:а — адсорбция иа нерастворимых носителях; б - включение в поры геля； в — отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны; г — ис пользование двухфазной реакционной средыРис. 2. Способы физической иммобилизации ферментов:а — адсорбция иа нерастворимых носителях; б - включение в поры геля； в — отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны; г — ис пользование двухфазной реакционной средыве этой книги и в работав, включенных в список рекомендуемой литературы. В последующем изложении конкретные даннйе привлекаются лишь в тф< случаях, когда это необходимо для более ясного понимания общих принципов н закономерностей.
полупроницаемая мембрана ВТ
полупроницаемая мембрана ВТ
полимерная сетка геля
полимерная сетка геля
б
б
Рис. 2. Способы физической иммобилизации ферментов:
а — адсорбция иа нерастворимых носителях; б - включение в поры геля； в — отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны; г — ис пользование двухфазной реакционной среды
Рис. 2. Способы физической иммобилизации ферментов:
а — адсорбция иа нерастворимых носителях; б - включение в поры геля； в — отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны; г — ис пользование двухфазной реакционной среды
Ниже более подробно рассмотрены четыре подхода к физической иммобилизации ферментов, составляющие основу классификации.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
ПУТЕМ АДСОРБЦИИ^ НА НЕРАСТВОРИМЫХ
НОСИТЕЛЯХ
Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех существующих сейчас способов иммобилизации ферментов. Еще в 1916 г.
Дж. Нельсон и Э. Гриффин провели успешную иммобилизацию
инвертазы путем адсорбции на активированном угле и геле гидроксида алюминия. Этот же метод был использован для получения первого технологического иммобилизованного ферментного препарата в 1969 г., когда И. Шибата с сотрудниками осуществили гидролиз Н-ацетил-Р,£-аминокислот под действием адсорбци- онно иммобилизованной £»аминоацилазы. В настоящее время адсорбционная иммобилизация благодаря целому ряду преимуществ является наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментных препаратов промыш
ленного значения.
Носители для адсорбционной иммобилизации
Носители для адсорбционной иммобилизации можно разделить на два основных класса ——неорганические и органические. В качестве неорганических носителей главным образом используются кремнезем, оксиды алюминия, титана н других металлов, различные природные алюмосиликаты (глины), пористое стекло, керамика, активированный уголь и др. Среди органических носителей наибольшее распространение получили различные полисахариды и полимерные ионообменные смолы, коллаген.
Обычно носители применяются в виде порошков, мелких Дариков и гранул. Иногда для снижения гидродинамического сопротивления носители изготавливают в форме монолитов, про- 上〃занннх большим числом узких параллельных каналов, раз- ;елейных тонкими стенками. Важнейшими характеристиками I осителей являются удельная поверхность, размер пор, механиче- (кая прочность и химическая стойкость.
} 2. Методика адсорбционной )иммобилизацни
Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях отличается исключительной простотой и достигается при .контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшетося фермента препарат иммобилизованного биокатализатора готов к использованию. На практике для получения адсорбционно-иммобилизованных ферментов применяются следующие методические подходы (рис. 3).
Статический способ (рис. 3, а) наиболее прост н состоит в том, что носитель вносят в водный раствор фермента и полученную смесь оставляют на некоторое время без перемешивания. Иммобилизация достигается за счет самопроизвольной диффузии фермента к поверхности носителя с последующей адсорбцией. Недостатком метода является то, что для получения препарата с высоким содержанием адсорбированного фермента и равномерного заполнения поверхности носителя последний приходится выдерживать в контакте с раствором фермента в течение длительного времени (несколько суток).
В лабораторной практике чаще всего применяется способ С перемешиванием (рис. 3,6), при котором носитель суспендируется в растворе фермента и полученная смесь непрерывно перемешивается с помощью магнитной или механической мешалки или на лабораторной качалке. Этот способ гораздо эффективнее статического и обеспечивает более равномерное заполнение поверхности носителя адсорбированным ферментом.
Иногда для проведения адсорбционной иммобилизации применяют цеход^а^ктроосаждения ,(рис. 3,в). В этом случае в раствор фермента нс而糸読Адва электрода, на поверхность одного из которых помещают слой носителя. При включении электрического тока молекулы фермента благодаря имеющимся на их поверхности заряженным группам начинают перемещаться в растворе в направлении соответствующего электрода и осаждаются на поверхности носителя.
Для технологического использования наиболее удобещ^т^к нанесениявко^онке^ Существует две модификации этого метода.
колонку, заполненную носителем, с помощью насоса прокачивают в направлении сверху вниз раствор
Рис. 3. Способы адсорбционной иммобилизации ферментовРис. 3. Способы адсорбционной иммобилизации ферментов
Рис. 3. Способы адсорбционной иммобилизации ферментов
Рис. 3. Способы адсорбционной иммобилизации ферментов
фермента в режиме непрерывной циркуляции (рис. 3,2), В другом варианте метода направление потока изменено на противоположное, т. е. раствор фермента подается в нижнюю часть колонки (рис. 3,д), причем скорость потока подбирается так, чтобы частицы носителя оставались во взвешенном состоянии, образуя «кипящий слой». Метод нанесения в колонке обладает тем преимуществом, что позволяет проводить нанесение фермента, промывку, а затем и сам ферментативный процесс в одной н той же колонке без дополнительных манипуляций с носителем .
§言3・ Природа адсорбционных взаимодействий фермента с носителем
Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий, электростатических взаимодействий, водородных связей и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Относительный вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента. В большинстве случаев основную роль в связывании фермента играют электростатические взаимодействия и водородные связи. Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что сорбция биокатализатора будет сопровождаться разрушением его структуры. Например, при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности частиц носителя.
Влияние различных факторов на адсорбцию ферментов на носителе
Протекание процесса адсорбции и прочность связывания фермента с носителем в значительной степени зависят от условий проведения иммобилизации. Основными факторами, влияющими на адсорбцию фермента, являются удельная поверхность и пористость носителя, значения pH и ионной силы раствора фермента, его концентрация и температура проведения процесса адсорбции.
Удельная поверхность и пористость носителя. Сорбционная емкость носителя пропорциональна его удельной поверхности. В приложении к белкам (ферментам) эта закономерность, однако, действует только в том случае, когда носитель непористый или когда диаметр пор намного превосходит размер белковых молекул. Если же поры настолько малы, что не могут вместить молекулу фермента, то для белка оказывается доступной только часть общей поверхности, т. е. сорбционная емкость носителя по отношению к ферменту небольшая, несмотря на очень большую общую удельную поверхность. Критерий для определения оптимального размера пор носителя для адсорбционной иммобилизации ферментов был предложен Р. Мессингом (1976), который изучал адсорбцию различных ферментов на пористом стекле и керамических носителях с калиброванным размером пор. В соответствии с этим критерием диаметр пор должен приблизительно в два раза превосходить размер молекулы белка в направлении ее максимального удлинения. При этом предполагается' что молекулярные размеры субстрата намного меньше, чем фермента, так что молекула субстрата заведомо способна проникнуть в пору, где находится сорбирован-
ный фермент. В том случае, если субстратом является вещество с очень большой молекулярной массой, выбор диаметра пор носителя может диктоваться уже размерами молекулы субстрата. Более того, высокомолекулярный субстрат сам может служить носителем для иммобилизации фермента. Например, для адсорбционной иммобилизации ферментов целлюлазного комплекса был успешно использован его субстрат ——целлюлоза.
Значение pH. Реакция среды оказывает очень сильное влияние на эффективность сорбции фермента на поверхности носителя, особенно, если сорбция осу тест вл яется главным образом за счет электростатических взаимодействий. Причина этого влияния состоит в том, что при изменении pH меняется состояние ионизации ионогенных групп носителя и белка, ответственных за связывание. При использовании носителей, не являю* щихся ионообменниками, максимальная адсорбция обычно дости* гается в изоэлектрической точке белка. Иными словами, рН-за- висимость адсорбции должна иметь вид кривой с одним макси* мумом, соответствующим значению изоэлектрической точки. Однако известны случаи, когда это правило нарушается. Например, pH-зависимость эффективности адсорбции альбумина на латексе имеет вид W-образной кривой, а значение pH, при котором достигается максимальная адсорбция этого белка на угле, изменяется от 3 до 6 в зависимости от типа последнего.
Ионная сила. Значение этой величины оказывает влияние на прочность связывания фермента с носителем. При высокой концентрации солей присутствующие в растворе ионы вытесняют с поверхности носителя связанные за счет электростатических взаимодействий белковые молекулы. Иными словами, возрастание ионной силы вызывает десорбцию фермента. Однако иногда эта закономерность не действует, и увеличение концентрации соли, наоборот, способствует адсорбции фермента на носителе. В таких случаях принято говорить об эффекте «высаливаниям белка из раствора. .*
Концентрация фермента. При возрастании концентрации фермента в растворе, из которого происходит адсорбция, количество сорбировавшегося на носителе фермента увеличивается и соответственно растет удельная каталитическая активность иммобилизованного препарата. Зависимость удельной каталитической активности от исходной концентрации фермента, как правило, имеет вид крнво員 с насыщением, что свидетельствует о существовании лишь ограниченного числа центров связывания фермента на поверхности носителя, которые к тому же обладают неодинаковым сродством по отношению к белку. При дальнейшем повышении концентрации фермента в растворе может происходить образование поверх первого слоя адсорбированного фермента второго и последующих слоев. Наибольшей каталитической активностью обладают верхние слои адсорбированного фермента, где ограничения, накладываемые на скорость реакции диффузией субстрата, минимальны. Поэтому излишняя
«перегрузка» носителя ферментом приводит к тому, что более глубоко расположенные слои адсорбированного биокатализатора исключаются из сферы реакции, и в результате общая эффективность использования фермента снижается.
Температура. Повышение температуры оказывает двоякое воздействие на процесс адсорбционной иммобилизации. С одной стороны, сильное нагревание приводит к потере ферментативной активности вследствие тепловой денатурации белковой глобулы. С другой стороны, рост температуры обычно обеспечивает ускорение процесса благодаря повышению скорости диффузии молекул фермента в порах носителя. Следовательно, должна существовать некоторая оптимальная температура для проведения адсорбционной иммобилизации. Точное значение оптимальной температуры зависит от природы адсорбируемого фермента и поверхности носителя.
Таким образом, эффективность адсорбционной иммобилизации ферментов определяется тонким балансом целого ряда факторов. Нарушение этого баланса вследствие изменения (порой незначительного) какого-либо из внешних условий может привести к резкому ослаблению взаимодействия фермента с носителем и, следовательно, к его десорбции. Чтобы избежать этого нежелательного явления, на практике используется ряд методических приемов, некоторые、из которых рассмотрены в следующем разделе.
Способы увеличения эффективности связывания фермента с носителем
Иммобилизация на предварительно модифицированных носителях. Предварительная модификация носителя во многих случаях позволяет существенно повысить прочность связывания адсорбционно-иммобилизованного фермента. Следует подчеркнуть, что помимо увеличения эффективности сорбции модификация носителя нередко обеспечивает также улучшение каталитических свойств иммобилизованного фермента благодаря созданию для его молекул благоприятного микроокружения. Более того, без предварительной модификации носителя иногда вообще не удается сохранить каталитическую активность фермента при адсорбционной иммобилизации. Например, если фермент обладает низкой стабильностью в кислой области pH, то при его адсорбции на силикагеле может произойти потеря каталитической активности, поскольку поверхность этого носителя имеет кислый характер (pH 〜4). Для предотвращения инактивации фермента силикагель перед проведением иммобилизации необходимо выдержать некоторое время в буферном растворе с таким значением pH, которое является оптимальным для данного фермента. Аналогичная проблема часто возникает при адсорбционной иммобилизации ферментов, которым для нормального функционирования необходимо присутствие в активном центре иона ме-
талла. Дело в том, что большинство носителей способны селективно и прочно сорбировать ионы металлов, поэтому при адсорбционной иммобилизации металлозависимых ферментов может происходить частичная или полная потеря каталитической активности, обусловленная выходом иона металла из активного центра фермента и его связыванием на поверхности носителя. Это нежелательное явление можно устранить, если до проведения иммобилизации обработать носитель избытком раствора, содержащего ионы соответствующего металла, и тем самым насытить центры сорбции ионов металла на носителе.
Предварительная обработка носителя ионами металлов применяется также и для повышения прочности связывания адсорбционно-иммобилизованных ферментов. Увеличение эффективности сорбции достигается в этом случае за счет образования комплекса белка с ионами переходных металлов (таких, как Ti, Sn, Zr, V, Fe), которые, в свою очередь, прочно связаны с поверхностью носителя (рис. 4,а). Иными словами, иои металла выступает в роли мостика, соединяющего молекулу фермента с носителем. Этот метод дает хорошие результаты при иммобилизации различных ферментов на таких носителях, как, например, целлюлоза, найлон, стекло, фильтровальная бумага и т. д.
Способ, основанный на обработке носителя ионами металлов, может служить хорошей иллюстрацией одного из главных принципов, лежащих в основе применения модифицированных носителей: модификация должна придавать носителю такие свойства, благодаря которым усиливается его способность к связыванию ферментов.
Один из возможных путей достижения этой цели состоит, помимо использования ионов металлов, в обработке носителя веществами, молекулы которых содержат большое число функциональных групп, способных взаимодействовать с группами на поверхности ферментной глобулы за счет электростатических н водородных связей (рис. 4,б). Например, полимеризация на поверхности силохрома акриловой кислоты, винилацетата и т. п. с последующей химической модификацией полимера приводит к образованию носителя, характеризующегося высокой поверхностной концентрацией функциональных групп (гидроксильных, аминоалкильных, аминоарильных н гидразидных). В качестве модификатора часто используется также альбумин, который наносится на носитель путем адсорбции, а затем подвергается денатурации нагреванием. Слой денатурированного альбумина образует на поверхности носителя 《мягкую» подложку с большим числом функциональных групп, способную прочно связывать молекулы фермента, одновременно обеспечивая для них благоприятное микроокружение. В результате во многих случаях при обработке альбумином удается добиться повышения эффективности сорбции и улучшения каталитических характеристик иммобилизованного фермента.
ферментферментзаряженная группазаряженная группагидрофобная ножкагидрофобная ножкаРис. 4. Адсорбционная иммобилизация ферментов на предварительно модифицированных носителяхРис. 4. Адсорбционная иммобилизация ферментов на предварительно модифицированных носителях
фермент
фермент
заряженная группа
заряженная группа
гидрофобная ножка
гидрофобная ножка
Рис. 4. Адсорбционная иммобилизация ферментов на предварительно модифицированных носителях
Рис. 4. Адсорбционная иммобилизация ферментов на предварительно модифицированных носителях
Для повышения эффективности сорбции может быть также использована модификация носителя гидрофобными соединениями. Связывание фермента с такими носителями обеспечивается за счет гидрофобных взаимодействий между модификатором и неполярными участками на поверхности белковой глобулы. При этом способе иммобилизации применяются те же носители, которые используются при гидрофобной хроматографии белков. В первую очередь к ним относятся различные агарозы, ковалентно модифицированные гидрофобными группами (алкильными, фенильными н т. п.). На конце такой гидрофобной《ножки》может присутствовать также и заряженная группа, благодаря чему обеспечивается взаимодействие с ферментом одновременно за счет электростатических н гидрофобных сил (рис. 4, в). При таком «многоточечном» связывании сорбция многих ферментов протекает практически необратимо. Эффект многоточечного связывания достигается также при использовании полисахаридных носителей, модифицированных танином — природным дубящим веществом, содержащим большое число фенольных групп. Танин может быть ли^о адсорбирован на носителе, либо связан с ним химически. Удерживание фермента на
поверхности обработанных танином носителей обеспечивается за счет электростатических, водородных и гидрофобных взаимодействий.
Эффективность сорбции фермента может быть увеличена также при использовании носителей, предварительно модифицированных путем адсорбции монослоя липида (см. гл. 1). Используя носители с той или иной ориентацией липидных молекул в адсорбированном монослое, можно добиться максимальной эффективности сорбции как гидрофильных (рис. 4,г), так и гидрофобных (рис. 4,d) ферментов.
Модификацию носителя иногда проводят путем ковалентной пришивки к его поверхности молекул, являющихся специфическими лигандами иммобилизуемого фермента. Иммобилизация с использованием таких носителей достигается за счет образования прочного нековалентного комплекса между ферментом и связанным с носителем лигандом. Этот метод иммобилизации, получивший название аффинной сорбции, широко используется в лабораторной практике, например, для избирательного выделения ферментов из сложных смесей (аффинная хроматография).
Иммобилизация предварительно модифицированных ферментов. При адсорбционной иммобилизации на ионообменниках час
то возникают затруднения, связанные с тем, что для многих ферментов изоэлектрическая точка и pH-оптимум каталитической активности очень близки. Поэтому прочная сорбция наб-
Рис. 5. Адсорбцион на я иммобилизация предва р ительномоди финн рова н ны хферментовРис. 5. Адсорбцион на я иммобилизация предва р ительномоди финн рова н ны хферментовлюдается лишь в областях pH, далеких от изоэлектрической точки, где каталитическая активность мала. Чтобы преодолеть это препятствие, был разработай метод иммобилизации, ферментов, предва р ительно модифицированных введением ио но генных групп (поликислоты, карбоксиметилцел- люлоза, остатки янтарной кислоты и т. п.). Например, при модификации а-химо- трипсина хлортриазиновым красителем (активным яркооранжевым КХ) изоэлектрическая точка фермента сдвигается в щелочную область. В результате этого модифицированный а-химо- трипсин достаточно хорошо сорбируется на многих ионообменниках с сохранением
Рис. 5. Адсорбцион на я иммобилизация предва р ительномоди финн рова н ны х
ферментов
Рис. 5. Адсорбцион на я иммобилизация предва р ительномоди финн рова н ны х
ферментов
каталитической активности. Другой пример ——модификация а-химотрипсина растворимой карбоксиметилцеллюлозой, в результате которой он приобретает способность прочно связываться с ДЭАЭ- цел л юлоэо й и ДЭАЭ-сефадексом при нейтральных значениях pH. Принцип, лежащий в основе этого способа иммобилизации, иллюстрируется схематическим рис. 5, а.
При иммобилизации на гидрофобных носителях эффективность связывания можно увеличить, если промодиф»ицировать молекулу фермента гидрофобными группами (рис. 5,6).
Другие способы увеличения прочности связывания фермента с носителем. Для предотвращения смывания иммобилизованного фермента с носителя часто используют прием, при котором слой адсорбированного фермента обрабатывают бифункциональным сшивающим агентом. В результате на поверхности носителя образуется как бы сплошная пленка из сшитых между собой молекул фермента. В качестве сшивающего агента чаще всего применяется глутаровый альдегид.
Оригинальный способ, позволяющий существенно повысить количество сорбционно им мобилизова иного фермента был предложен К. Мартинеком с сотр. (1976), которые использовали для иммобилизации найлоновые волокна, подвергнутые частичной химической деструкции. Волокна помещают в раствор фермента (рис. 6, а) и подвергают механическому растяжению,
е ©° ©/ычи
© © © 。
г
урастягивающее
©©
Рис. 6. Иммобилизация ферментов путем механического захвата в порах найлоновой нити при ее растяженииРис. 6. Иммобилизация ферментов путем механического захвата в порах найлоновой нити при ее растяжении
Рис. 6. Иммобилизация ферментов путем механического захвата в порах найлоновой нити при ее растяжении
Рис. 6. Иммобилизация ферментов путем механического захвата в порах найлоновой нити при ее растяжении
в результате чего размер пор на их поверхности увеличивается. Молекулы фермента получают благодаря этому возможность проникнуть внутрь пор и там адсорбироваться (рис. 6, б). Через некоторое время растягивающее усилие снимают, волокно сжимается н размер пор возвращается к исходному значению. При - этом молекулы фермента, оказавшиеся внутри пор при растяжении волокна, уже не могут покинуть их. Иными словами, происходит механический захват молекул фермента порами носителя (рис. 6, в).
Сравнительно новым методом является электроудерживание, при котором и м мобилиза ни я ферментов, осуществляется под действием электрического поля на коллекторах, отделенных от электродов мембранами. В качестве коллектора могут использоваться силикагель, ионообменники, минералы и другие носители. Фермент удерживается на коллекторе за счет электростатических и диполь-дипольных взаимодействий между поляризованными частицами коллектора и молекулами белка. Недостаток этого метода состоит в том, что система должна постоянно находиться под напряжением, поскольку в противном случае фермент будет смываться с носителя.
Преимущества и недостатки адсорбционной иммобилизации
К числу основных преимуществ метода адсорбционной иммобилизации следует отнести доступность и дешевизну сорбентов, выступающих в роли носителей, которым к тому же можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. Не менее важным фактором является также простота применяемых методик. Кроме того, при адсорбционной иммобилизации нередко удается одновременно решить и проблему очистки фермента, поскольку связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. Действительно, многие из носителей для адсорбционной иммобилизации применяются также и при очистке ферментов.
Применение метода ограничивается недостаточно высокой прочностью связывания фермента с носителем. Как уже указывалось, при изменении внешних условий может происходить десорбция фермента с носителя, что ведет к потерям дорогостоящего биокатализатора и загрязнению конечного продукта. К недостаткам метода адсорбционной иммобилизации следует отнести также отсутствие общих рекомендаций, позволяющих заранее сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий проведения иммобилизации конкретного фермента. Эту задачу приходится каждый раз решать заново, используя метод проб и ошибок.
Некоторых из перечисленных затруднений удается избежать при иммобилизации ферментов путем включения в гели.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ПУТЕМ ВКЛЮЧЕНИЯ В ГЕЛИ
Суть этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель (см. рис. 2,6). Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в окружающий раствор, т. е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями.
Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть общего объема геля. Например, широко применяемые гели полимеров производных акриловой кислоты в зависимости от концентрации полимера и его химической природы содержат от 50 до 90% воды.
Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (т. е. содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки (рис. 7,а).
Рис. 7. Иммобилизация ферментов путем включения в гель, полученный путем полимеризации низкомолекулярного мономера (а) и готового полимера (б)Рис. 7. Иммобилизация ферментов путем включения в гель, полученный путем полимеризации низкомолекулярного мономера (а) и готового полимера (б)
Рис. 7. Иммобилизация ферментов путем включения в гель, полученный путем полимеризации низкомолекулярного мономера (а) и готового полимера (б)
Рис. 7. Иммобилизация ферментов путем включения в гель, полученный путем полимеризации низкомолекулярного мономера (а) и готового полимера (б)
Впервые этот способ был использован П. Берифельдом и Дж. Уэном (1963), которые осуществляли иммобилизацию ряда ферментов (таких, как трипсин, рибонуклеаза и р-амилаза) в геле, полученном радикальной полимеризацией К,М,-метилен-бис-акриламида.
Альтернативный способ состоит в том, что фермент вносят в раствор уже готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние (рис. 7,6). Рассмотрим эти подходы подробнее.
Иммобилизация ферментов в гелях, полученных полимеризацией мономеров
Органические гели. Суть методики. Для проведения иммобилизации готовят реакционную смесь, главными компонентами которой являются фермент, мономер, сшивающий агент (если это необходимо) и водный буферный раствор. Иногда в смесь для полимеризации вводят также добавки, предохраняющие фермент от инактивации при гелеобразовании. Для получения геля готовую смесь подвергают воздействию какого-либо фактора, инициирующего процесс полимеризации мономера.
Полимеризация. При проведении полимеризации обычно используемые концентрации мономера и сшивки составляют, соответственно, 30——60% н приблизительно 5% от общей массы реакционной смеси. Полимеризация протекает по радикальному механизму. Источниками радикалов, являющихся инициаторами процесса полимеризации, могут служить некоторые окислительно-восстановительные и фотохимические реакции, в ходе которых в качестве промежуточного продукта образуются свободные радикалы. Наиболее широко применяется окислительно-восстановительная пара персульфат калия (или аммония) — N,N,N',N，・ тетра метилэтиленд и а м йн. Инициирование полимеризации достигается при внесении этих веществ в раствор мономера. В качестве фотохимического инициатора обычно используется рибофлавин; в этом случае полимеризация происходит при облучении реакционной смеси мощным источником света. Свободные радикалы, необходимые для начала полимеризации, могут генерироваться также при воздействии на раствор мономера у-нз- лучения или потока электронов. Преимущество этого способа состоит в том, что он не требует введения инициаторов в исходную смесь.
При проведении иммобилизации могут возникать затруднения, обусловлеиные некоторыми особенностями протекания реакции полимеризации. Так, например, полимеризация ингибируется присутствующим в растворе молекулярным кислородом, и во многих случаях для его удаления рабочий раствор предварительно насыщают инертным газом — азотом или аргоном. Кроме того, в ходе полимеризации выделяется значительное количество теплоты, что приводит к повышению температуры внутри образующегося полимерного блока до 75℃. Такое сильное нагревание вызывает инактивацию ферментов, поэтому полимеризующийся раствор необходимо охлаждать так, чтобы его температура ие превышала 20—25℃.
Осложнений, связанных с ингибирующим действием кислорода и нагреванием, можно избежать, если проводить полимеризацию путем V-облучения замороженного и охлажденного до —80℃ рабочего раствора.、 •
После окончания полимеризации, которая в зависимости от условий (природа мономеров, количество инициатора, температура и т. п.) может продолжаться от нескольких минут до нескольких часов, образуется блок полимерного геля, содержащий иммобилизованный фермент. Следует учитывать, что в геле могут оставаться примеси неизрасходованных при полимеризации мономеров и инициаторов. Чтобы избавиться от них, гель обычно механически измельчают и тщательно промывают буферным раствором. При необходимости длительного хранения измельченные частицы подвергают лиофильной сушке.
Инактивация фермента при полимеризации. В процессе образования полимерного геля фермент подвергается различным денатурирующим воздействиям, в результате чего может происходить его инактивация, вплоть до полной потери каталитической активности. Помимо уже упоминавшегося возможного разогрева при полимеризации денатурацию фермента могут вызывать компоненты реакционной смеси, в первую очередь мономер. Например, акриламид по своему денатурирующему воздействию на ферменты близок к мочевине. С другой стороны, полиакриламид этим свойством не обладает. Именно поэтому обязательной стадией иммобилизации является тщательная промывка полимерного геля от оставшихся примесей мономера н инициатора.
Инактивация фермента может происходить под действием свободных радикалов, образующихся при радикальной полимеризации. Для защиты фермента от неблагоприятных воздействий в реакционную смесь иногда вводят стабилизирующие добавки, В роли таких добавок могут выступать, например, инертные белки (обычно альбумин) или вещества, являющиеся субстратами или продуктами реакции, катализируемой данным ферментом.
Неорганические гели. Для иммобилизации ферментов может быть использован гель поликремниевой кислоты (силикагель), который представляет собой продукт поликонденсации монокрем-
ниевой кислоты Si(OH)4- Методика иммобилизации состоит в том, что в золь кремниевой кислоты (полученный, например, путем гидролиза кремнийорганического соединения) добавляют раствор фермента. Через несколько часов в результате самопроизвольной полимеризации образуется гель, представляющий собой трехмерную сетку из атомов кремния, сое ди ненных кислородными мостиками. Полученный гель высушивают, измельчают и отмывают от невключившегося фермента-
Иногда для иммобилизации ферментов применяют гель фосфата кальция. В этом случае образование пространственной сетки обусловлено не ковалентными, а ионными связями.
Иммобилизация ферментов в гелях, полученных из готовых полимеров
Несшитые полимерные гели. Этот способ иммобилизации основан на свойстве природных полисахаридов, таких, как крахмал, агар-агар, каррагинан н агароза, образовывать гели при охлаждении их горячих водных растворов. Методика состоит в том, что водную суспензию полисахарида нагревают до температуры 80—90℃, добиваясь его полного растворения, и полученный горячий раствор медленно охлаждают. Непосредственно перед началом гелеобразования (обычно между 30 н 50℃) в систему добавляют водный раствор фермента. При дальнейшем охлаждении образуется гель, содержащий иммобилизованный фермент. Для улучшения механических свойств иммобилизованного препарата процесс гелеобразования иногда проводят в порах вспененного полиуретана.
Другим природным полимером, широко применяемым для иммобилизации ферментов, является коллаген ——фибриллярный белок соединительной ткани животных. Существует три основных способа иммобилизации ферментов с помощью коллагена: макромолекулярное комплексообразование, импрегнирование и электроосаждение. При макромолекулярном комплексообразовании коллаген диспергирует в водном растворе при низких (2,0— 4,5) или высоких (8,5—12,0) значениях pH, вносят фермент н инкубируют смесь в течение 15—20 ч. Затем раствор выливают тонким слоем на инертную подложку и высушивают. В результате получается ферментсодержащая белковая мембрана, имеющая структуру трехмерной сетки из переплетенных фибрилл коллагена. Способ макромолекулярного комплексообразования неприменим для иммобилизации ферментов, неустойчивых в кислых или щелочных растворах, поскольку он требует длительной инкубации фермента в среде с экстремальными значениями pH. Этого затруднения можно избежать, если проводить иммобилизацию методом импрегнирования, при котором раствором фермента пропитывают уже готовую коллагеновую мембрану.
При иммобилизации методом электроосаждения смесь дисперсии коллагена и раствора фермента помещают между элект-
родами и включают электрический ток. Под действием электрического поля молекулы коллагена н фермента мигрируют в направлении одного из электродов (в зависимости от pH раствора) н осаждаются на его поверхности в виде мембраны. Этот способ удобен тем, что позволяет получать мембраны заданной толщины и конфигурации при высокой общей скорости процесса. Последнее обстоятельство особенно важно, поскольку снижает вероятность инактивации фермента под действием неблагоприятных значений pH.
Сшитые полимерные гели. Введение ковалентных сшивок позволяет добиться повышения механической прочности полимерных матриц и более прочного удерживания включенного в них фермента. Образование сшивок между полимерными цепями достигается, например, при обработке бифункциональными реагентами, способными взаимодействовать с функциональными группами полимера. Так, для обработки коллагеновых мембран применяется глутаровый альдегид, который используется также при получении сшитых матриц для иммобилизации на основе других белков. Обработке бифункциональными сшивающими реагентами могут подвергаться и полисахаридные гели, рассмотренные ранее.
Существует также способ включения ферментов в сшитую белковую матрицу, основанный на использовании системы фиб- риноген-тромбин. При этом способе иммобилизации к раствору фибриногена и фермента в водном буфере добавляют белок тромбин, под действием которого фибриноген превращается в фибрин ——полимерный белок, образующий трехмерную пространственную сетку. Стоимость иммобилизованного таким образом препарата фермента слишком высока, чтобы его можно было рекомендовать для технологических целей, однако он представляет значительный интерес для медицины из-за отсутствия токсичности и антигенности.
Образование прочных связей между полимерными цепями геля может достигаться также за счет электростатических взаимодействий. Например, в присутствии ионов кальция альгинат натрия дает прочный гель, который широко применяется для иммобилизации ферментов. В этом случае в роли «мостиков» между полимерными цепями выступают ионы кальция, формирующие ионные связи с карбоксильными группами альгината. На способности полиэлектролитов образовывать гели в присутствии поливалентных катионов основан также метод иммобилизации с использованием синтетического полиэлектролита ——сополимера малеинового ангидрида н метилового эфира винилового спирта.
Интересный способ иммобилизации, основанный на употреблении полиэлектролитных комплексов, был предложен в 1980 г. В этом случае фермент модифицируют путем ковалентной пришивки положительно заряженного N-алкилированного поливинил- пиридина н вносят в водный раствор полиметакриловой кислоты, несущей отрицательный заряд. В зависимости от ионной силы
и pH среды противоположно заряженные полиэлектролиты могут либо сосуществовать в растворе, либо образовывать прочный нерастворимый комплекс, увлекающий фермент в осадок, причем переход между растворимым н нерастворимым состояниями является обратным н осуществляется в очень узком диапазоне ионной силы или pH. После завершения ферментативной реакции, протекающей в гомогенном растворе, фермент переводят в осадок путем изменения ионной силы или pH и отделяют маточный раствор, содержащий продукты реакции. Затем осадок вновь переводят в раствор и повторяют весь процесс сначала.
Сшитые гели для иммобилизации могут быть получены на основе других синтетических полимеров. Например, при воздействии на водные растворы поливинилового спирта или поливинил- пирролидона у-излучением или потоком электронов на полимерных цепях возникают свободные радикалы, при последующем взаимодействии которых между цепями образуются ковалентные сшивки. Сшитая полимерная матрица для иммобилизации может быть получена на основе кремнийорганического полимера поли- диметилсилоксана. Образование твердого геля происходит в этом случае при введении в систему, содержащую полимер н фермент, вулканизирующего агента, в качестве которого применяется октаноат двухвалентного олова.
В последнее время все более широкое распространение находит новый метод иммобилизации ферментов путем их включения в полимерную матрицу из фотополимеризующихся смол, которые представляют собой олигомеры или полимеры (макромономеры), содержащие фоточувствительные функциональные группы. При проведении иммобилизации раствор, содержащий смолу, фермент н инициатор, в течение нескольких минут облучают ультрафиолетовым светом. Активированные облучением фоточувствительные группы образуют между собой ковалентные связи, в результате чего возникает сшитая трехмерная полимерная сетка с включенными в нее молекулами фермента. Этот способ иммобилизации обладает тем преимуществом, что свойства получаемых полимерных гелей можно целенаправленно н в широких пределах варьировать, подбирая соответствующие макромономеры.
Влияние различных факторов на каталитическую активность ферментов, иммобилизованных путем включения в гель
Содержание фермента в геле. Каталитическая активность иммобилизованного препарата возрастает с увеличением количества включенного фермента. Такого увеличения можно добиться, очевидно, повышая концентрацию фермента в исходной смеси, используемой для приготовления геля. Следует, однако, иметь в виду, что растворимость белков в гелеобразующих системах может быть существенно ниже растворимости в водном буферном растворе.
Другой важный фактор, определяющий содержание фермента в геле, — это структура самого геля, точнее, размер имеющихся в нем пор. Чем меньше диаметр пор, тем более эффективно фермент удерживается в матрице геля, а значит, тем выше будет каталитическая активность иммобилизованного препарата. Пористость геля можно регулировать, изменяя состав исходной смеси для его получения. Например, плотность гелей, получаемых полимеризацией производных акриловой кислоты, возрастает с увеличением исходной концентрации мономера. (Следует помнить, однако, что слишком высокая концентрация мономера может вызывать денатурацию фермента, поэтому зависимость удельной каталитической активности иммобилизованного препарата от исходной концентрации мономера часто проходит через максимум, Который обычно лежит в интервале концентраций мономера 30—60%.) Размер пор сильно зависит также от концентрации добавляемого в раствор мономера сшивающего агента. В случае акриловых полимеров эта зависимость имеет вид кривой с минимумом при концентрации сшивки около 5%. При этой же концентрации сшивки достигается максимальная активность включенного фермента.
Эффективность включения повышается не только при уменьшении диаметра пор геля, но и при увеличении размеров ферментной глобулы. Поэтому для предотвращения вымывания из геля ферменты с небольшой молекулярной массой иногда перед проведением иммобилизации подвергают обработке глутаровым альде* гидом, в результате которой получаются крупные ковалентно сшитые белковые агрегаты, прочно удерживаемые полимерной матрицей.
■ Размеры гелевых частиц. Увеличение концентрации фермента в геле не всегда приводит к соответствующему повышению каталитической активности иммобилизованного препарата. Дело в том, что при высокой концентрации фермента весь субстрат перерабатывается уже в поверхностном слое гелевой частицы, не достигая молекул фермента, расположенных в ее глубине. В результате каталитический потенциал системы используется не полностью и общая наблюдаемая удельная активность фермента снижается. (Более подробное обсуждение этого вопроса см. в гл. IV.) Очевидно, что влияние этого неблагоприятного эффекта можно ослабить, если использовать мелкоизмельченный препарат иммобилизованного в геле фермента. Действительно, скорость реакции, катализируемой р-галактозидазой, иммобилизованной в геле полиоксиэтил метакрилата, возрастает при измельчении геля н достигает максимального значения при уменьшении диаметра гелевых частиц до 120 мкм, оставаясь затем неизменной. Рассмотрим некоторые способы получения иммобилизованных в геле ферментов в ф°Рме мелких частиц. -
Наиболее простой метод заключается в механическом измельчении блока полимерного геля путем растирания, продавливания через мелкое сито, а также гомогенизации (рнс 8, а). Этот метод,
гелевый блок
средний > диаметр 'частиц
1-1000 мнм
эмульсия вода/масло
средний диаметр частиц 0Q1-0Q5 мнмсредний диаметр частиц 0Q1-0Q5 мнмРис. 8. Способы получения иммобилизованных в геле ферментов в форме мелких частицРис. 8. Способы получения иммобилизованных в геле ферментов в форме мелких частиц
средний диаметр частиц 0Q1-0Q5 мнм
средний диаметр частиц 0Q1-0Q5 мнм
Рис. 8. Способы получения иммобилизованных в геле ферментов в форме мелких частиц
Рис. 8. Способы получения иммобилизованных в геле ферментов в форме мелких частиц
однако, имеет ряд существенных недостатков. Получаемые частицы обладают низкой механической прочностью, являются крайне неоднородными по форме и размерам. Кроме того, молекулы фермента, оказавшиеся при измельчении геля на поверхности частиц, легко с нее смываются, что приводит к потерям биокатализатора.
Перечисленные недостатки в значительной степени удается
преодолеть при использовании эмульсионного способа получения гелевых частиц (рис. 8,6). В этом случае водный раствор, содер жащий фермент, мономер и инициатор полимеризации, немедленно после приготовления вносят в неполярный органический растворитель (например, смесь толуола с хлороформом), содержащий поверхностно-активное вещество (ПАВ), и полученную смесь интенсивно перемешивают. В результате образуется эмульсия, состоящая из диспергированных в органической среде капель водного полимеризующегося раствора, стабилизированных ПАВ. После окончания полимеризации полученные частицы геля сферической формы отфильтровывают н отмывают водой от непрореагировавшего мономера и ПАВ. В зависимости от условий проведения процесса (концентрация мономера» скорость перемешивания и т. д.) размер получаемых частиц колеблется от нескольких единиц до сотен микрометров. Одно из преимуществ эмульсионного способа состоит в том, что благодаря интенсивному тепло- переиосу в мелкодисперсной системе устраняется опасность инактивации фермента под действием теплоты, выделяющейся при полимеризации. Сферические гелевые частицы характеризуются узким распределением по размерам (отклонение от среднего диаметра составляет ±10%) и высокой механической прочностью, которая может быть в 10 раз выше, чем в случае частиц, полученных путем механического измельчения гелевого блока. При использовании эмульсионного способа необходимо иметь в виду, что некоторые ПАВ, применяемые для получения стабильных эмульсий, могут вызывать денатурацию фермента.
Полимерные частицы геля еще более мелких размеров (наночастицы) ,могут быть изготовлены путем полимеризации в так называемых микроэмульсиях (рис. 8, в). Здесь используется свойство некоторых ПАВ образовывать в неполярных органических растворителях обращенные мицеллы, способные солюбилизовать (растворять) водные растворы мономера н фермента. В результате солюбилизации формируется микроэмульсия, состоящая из мельчайших капелек водного раствора, стабилизированных ПАВ. Размер этих капелек и, соответствен но, размер наночастиц, образующихся в процессе полимеризации, инициируемой облучением ультрафиолетовым светом, изменяется в зависимости от количества добавленной воды в пределах от нескольких единиц до нескольких десятков нанометров. Полученные наночастицы осаждают из органического растворителя ацетоном, отделяют центрифугированием и высушивают. .
Однако применение в технологических реакторах мелких частиц иммобилизованного биокатализатора не всегда рационально. Например, излишне мелкие частицы оказывают сильное гидродинамическое сопротивление потоку при эксплуатации реакторов проточного типа, а в реакторах периодического действия их трудно отделить от реакционной смеси. Поэтому в каждом конкретном случае оптимальный размер частиц определяется с учетом таких
факторов, как количество и активность включенного фермента, скорость диффузии субстрата в геле н конструкция реактора.
С практической точки зрения удобен метод так называемой двойной иммобилизации, при котором в гель включается фермент, предварительно иммобилизованный путем адсорбции на твердом носителе, или же получение полимерного геля с включением фермента проводится в присутствии такого носителя. Приготовленный таким образом иммобилизованный препарат состоит из частиц твердого носителя, покрытых слоем ферментсодержащего геля. Метод двойной иммобилизации сочетает преимущества твердой матрицы (большая удельная поверхность, механическая прочность, пористость, заданная текстура н форма частиц) н полимерных гелей.
Природа полимерной матрицы. Полимерные гели, применяемые для иммобилизации, способствуют созданию оптимального микроокружения включенного фермента, что позволяет добиться высокой каталитической активности иммобилизованных препаратов. Оптимизация микроокружения достигается за счет подбора соответствующей гелеобразующей системы. Особенно удобными с этой точки зрения являются гели на основе сополимеров производных акриловой кислоты. Варьируя химическую природу исходных мономеров н их соотношение, можно получать полимерные матрицы с наиболее подходящими для данной ферментативной реакции характеристиками. В частности, при введении в состав полимера мономерных звеньев, несущих электрический заряд, повышается каталитическая эффективность иммобилизованного препарата в реакциях с участием заряженных субстратов. Например, скорость реакции гидролиза положительно заряженного субстрата этилового эфира a-N-бен- зоил-£-аргинина под действием трипсина, иммобилизованного в геле полиакриламида, возрастает при введении в полимерную цепь путем сополимеризации отрицательно заряженных мономерных звеньев акриловой кислоты. Увеличение скорости ферментативной реакции объясняется повышенным сродством положительно заряженного субстрата к отрицательно заряженной полимерной матрице.
Аналогичный эффект влияния полимерной матрицы на распределение субстрата между гелем н окружающим его раствором наблюдается также в реакциях с участием гидрофобных субстратов. В этом случае увеличение каталитической эффективности иммобилизованного фермента достигается при использовании геля, полученного путем сополимеризации с участием неполярных мономеров. Более того, применение гелей на основе полимеров, обладающих высокой гидрофобностью, позволяет получать иммобилизованные ферментные препараты, способные работать в среде неполярных органических растворителей.
Введение в полимерные цепи геля ионных групп создает вокруг включенных молекул фермента среду, обладающую буферными свойствами. В результате значение pH, при котором
функционирует иммобилизованный фермент» может отличаться от pH окружающего частицу геля раствора, что на опыте проявляется в виде сдвига наблюдаемого pH-оптимума ферментативной реакции. Таким образом, варьируя содержание в геле заряженных групп, можно создать вблизи фермента наиболее благоприятное для него значение pH, не меняя pH внешнего раствора.
Более подробно эффекты микросреды (влияние заряда, гидрофобности носителя н т. п.) в катализе иммобилизованными ферментами рассмотрены в гл. IV.
Преимущества и недостатки иммобилизации ферментов путем включения в гель
Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель отличается простотой применяемых методик, позволяет создавать иммобилизованные препараты любой геометрической конфигурации (сферические частицы, пленки н т. п.), обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Многие полимерные гели обладают высокой химической, механической н тепловой стойкостью, что дает возможность многократного использования иммобилизованных препаратов на их основе. Метод универсален, поскольку применим для иммобилизации практически любых ферментов, а также полиферментных систем, клеточных фрагментов н даже клеток. Важное преимущество метода состоит в том, что во многих случаях иммобилизация в геле приводит к значительной стабилизации ферментов. Наконец, фермент, включенный в гель, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, поскольку крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу.
Основным недостатком этого метода является то, что полимерная матрица создает значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата. Если в роли субстрата выступает высоко молекул ярное соединение, то этот способ иммобилизации вообще неприменим.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛУПРОНИЦАЕМЫХ ОБОЛОЧЕК (МЕМБРАН)
Общий принцип, лежащий в основе этого способа иммобилизации, состоит в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой мембраной, которая легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но представляет собой непреодолимый барьер для крупных молекул фермента (см. рис. 2,8). Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны н ее природой.
Микрокапсулирование
Этот способ иммобилизации ферментов разработан Т. Чангом (1964). Суть его состоит в том, что водный раствор фермента включают внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (мембраной) (рис. 9, а). В зависимости от условий получения размер микрокапсул изменяется от нескольких десятков до нескольких сотен микрометров, а толщина мембраны составляет сотые — десятые доли микрометра при диаметре пор порядка нескольких нанометров. Существует два основных способа получения микрокапсул. В первом из них водный раствор фермента сначала диспергируется при энергичном перемешивании в диэтиловом эфире, содержащем ПАВ, которое выступает в роли эмульгатора. К полученной эмульсии, не прекращая перемешивания, добавляют эфирный раствор полимера, обычно нитрата целлюлозы. При соприкосновении с поверхностью эмульсионных капель этот полимер, будучи нерастворимым в воде» образует тонкую оболочку-микрокапсулу. Готовые микрокапсулы отделяют центрифугированием или фильтрованием н промывают.
При втором способе микрокапсулирования образование мембраны на поверхности водных микрокапель достигается за счет реакции межфазной поликонденсации двух компонентов, один из которых растворен в водных каплях эмульсии, а другой — в объеме органической фазы. Наиболее распространенными являются полиамидные микрокапсулы, получаемые, например, путем поликонденсации 1,6-гексаметилендиамина (водная фаза) н хлорангидрида себациновой кислоты (органическая фаза). Этот способ применим только для тех ферментов, которые не инактивируются при высоких значениях pH, су шествую щи х в водных растворах диамина.
Водный раствор фермента, использующийся для получения микрокапсул, должен содержать инертный белок (обычно гемоглобин) в концентрации около 10%, который обеспечивает в микрокапсулах необходимое внутреннее давление н стабилизирует фермент. Для повышения стабильности микрокапсулированного фермента его нередко подвергают также обработке глутаровым альдегидом, приводящей к образованию внутри микрокапсул белковых полимеров. Кроме того, более высокой стабильности можно добиться, если перед микрокапсулированием фермент предварительно иммобилизовать путем адсорбции на носителе, включения в гель или другим способом. }
В некоторых случаях для иммобилизации применяются микрокапсулы, мембрана которых образована ковалентно сшитыми между собой молекулами инертного белка. Такие микрокапсулы можно получить, если в методе с применением поликонденсации в систему не вводить диамин. Тогда хлорангидрид дикарбоновой кислоты (или другой используемый органораство-
Рис. 9. Иммобилизация ферментов с использованием полу-проницаемых оболочек (мембран):
а ——микрокапсулирование; б ——двойное эмульгирование; в ——включение в волокна; г—включение в полые волокна с полу-проницаемыми стенками; д—включение в липосомы; точкамиобозначены молекулы фермента； символами S и Р — субстрати продукт ферментативной реакции соответственно
римый бифункциональный сшивающий агент) будет образовывать ковалентные сшивки между молекулами инертного белка, располагающимися на поверхности водной микрокапли.
Двойное эмульгирование
При иммобилизации методом двойного эмульгирования (Т. Чанг, 1965) сначала готовят эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе полимера, точно так же, как было описано для случая получения микрокапсул первым способом. Готовую эмульсию вновь диспергируют, на этот раз в воде. В результате получается водная эмульсиая из капель органического раствора полимера, содержащих» в свою очередь, еще более мелкие включенные капли водного раствора фермента (рис. 9, б). Через некоторое время органический раствор затвердевает, образуя полимерные сферические частицы с иммобилизованным в них ферментом.
С. Мэй н Н. Ли (1972) предложили модификацию этого способа иммобилизации, в котором в качестве материала для образования мембраны вместо водонерастворимого отверждающегося полимера используются жидкие углеводороды с большой молекулярной массой. Этот метод получил название иммобилизации путем включения в жидкие мембраны.
Включение в волокна
От микрокапсулирования этот способ иммобилизации, предложенный Д. Динелли (1972), отличается главным образом формой получаемых препаратов: в первом случае образуются сферические микрокапсулы, а во втором — нити. Суть состоит в том, что Эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе волокнообразующего полимера (производные целлюлозы, поливинилхлорид, поли-£-метилглутамат) продавливают через фильеры в жидкость (например, толуол), вызывающую коагуляцию полимера. Полученные волокна представляют собой пористые полимерные гели, содержащие гомогенную дисперсию небольших капель водного раствора фермента размером около 1 мкм (рис. 9,6). Ферментсодержащие волокна обладают высокой механической прочностью; например, из них можно изготовить ткань, которая будет обладать ферментативной активностью. Для дополнительного повышения механической прочности волокна иногда заключают в тонкую полиамидную оболочку.
Для иммобилизации ферментов можно использовать также производимые промышленностью готовые полимерные полые волокна, которые применяют для очистки белков методом диализа (рис. 9, г). Полые волокна изготавливают из природных или синтетических полимеров (целлюлоза, поливинилхлорид, полисульфон, полиакриламид); они имеют внешний и внутрен-
ний диаметр порядка нескольких сотен микрометров при толщине мембраны в несколько десятых микрометра. Для проведения ферментативной реакции волокна, по которым циркулирует раствор фермента» погружают в сосуд с раствором субстрата, диффундирующим через мембрану внутрь волокон.
Включение в липосомы
Впервые липосомы были использованы для включения ферментов Дж. Сесса и Дж. Вайсманом (1970). Значительный вклад в развитие этого направления принадлежит также Г. Гре- гориадису. Существует несколько способов получения липосом, содержащих включенный фермент (рис. 9, д). В одном из иих раствор липида (обычно лецитина) в органическом растворителе (например, в хлороформе) упаривается в вакууме, и липид остается на стенках колбы в виде тонкой пленки. Затем в колбу вносят водный раствор фермента, встряхивают до полного удаления пленки липида со стенок колбы и оставляют на некоторое время. В полученной таким образом дисперсии липида происходит самопроизвольное образование (самосборка) мультила- меллярных липосом, содержащих включенный фермент. Во избежание окисления липида все операции необходимо проводить в атмосфере инертного газа.
В другом варианте метода раствор липида в органическом растворителе наслаивают на поверхность водного раствора фермента, после чего органический растворитель удаляют путем испарения в токе инертного газа, а образовавшуюся липидную пленку диспергируют в водном растворе. Недостаток этого способа состоит в том, что контакт с органическим растворителем может вызвать инактивацию фермента.
Для удаления невключившегося фермента липосомы отделяют центрифугированием и ресуспендируют в водном буферном растворе. В случае моноламеллярных липосом, получаемых путем ультразвуковой обработки, разделение проводят методом гельфильтрации на колонке.
Ферменты, иммобилизованные путем включения в липосомы, применяются главным образом в медицинских целях, а также при проведении фундаментальных исследований, поскольку такие системы близки к природным мембранам и их изучение может дать полезную информацию о ферментативных процессах в клетках.
Недавно был предложен новый способ иммобилизации ферментов путем включения их в полимерные липосомы. Для получения липосом в этом случае используются липиды, модифицированные путем введения в их молекулу кратной связи (см. гл. 1). После включения фермента в липосомы, приготовленные из модифицированного липида обычным способом, их подвергают облучению ультрафиолетовым светом в присутствии инициатора. При этом происходит полимеризация мономерных молекул липи-
да с образованием ковалентно сшитой замкнутой липидной бислойной мембраны. Полимерные липосомы обладают гораздо более высокой стабильностью по сравнению с обычными.
Преимущества и недостатки иммобилизации с использованием полупроницаемых оболочек
К числу основных достоинств этого метода иммобилизации можно отнести его простоту и универсальность (возможность включения не только индивидуальных ферментов, но и поли- ферментных систем, клеток и клеточных фрагментов, ферментов, предварительно иммобилизованных каким-либо иным способом, и т.п.). Применение систем мембранного типа позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким содержанием включенного фермента; например, в каждый грамм волокон, изготовляемых методом влажного прядения, можно включить свыше 200 мг фермента. Иммобилизованные в мембранных системах ферменты в значительной степени сохраняют свою каталитическую активность, а их стабильность часто существенно возрастает. Эффект стабилизации обеспечивается, в частности, за счет исключения деградации ферментов под действием микроорганизмов, которые не могут проникнуть сквозь мембрану. Кроме того, благодаря высокому отношению поверхности к объему н малой толщине мембраны удается избежать значительных диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций.
Основным недостатком мембранных систем, как и систем на основе полимерных гелей, является невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов, для которых мембрана создает непреодолимый диффузионный барьер.
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМ ДВУХФАЗНОГО ТИПА
Отличительная черта этого способа иммобилизации состоит в том, что ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается не за счет его взаимодействия с жестким носителем (адсорбентом, гелем или мембраной), а вследствие его способности растворяться только в одной из фаз двухфазной системы. Что касается субстрата и продукта ферментативной реакции, то они распределены между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного цикла процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор.
Двухфазные системы типа
«вода ——несмешивающийся с водой органический растворитель»
В таких системах фермент присутствует только в водной фазе, поскольку белки, как правило, нерастворимы в неполярных органических растворителях, выступающих в роли второй фазы. Субстрат, введенный в двухфазную систему, перерабатывается под действием фермента в водной фазе, а образующийся про дукт экстрагируется в фазу органического растворителя (рис. 10, а). Объем водной фазы составляет обычно I——2% от общего объема системы. В ходе процесса реакционную смесь осторожно перемешивают, чтобы ускорить диффузию субстрата и продукта через границу раздела фаз.
Основные недостатки этого способа иммобилизации — низкая скорость процесса вследствие небольшой площади поверхности раздела фаз, через которую осуществляется перенос субстрата и продукта, и возможность инактивации фермента при его адсорбции на границе раздела фаз. Именно последнее обстоятельство не позволяет применять интенсивное перемешивание системы для увеличения скорости процесса за счет возрастания поверхности раздела, поскольку в образующейся эмульсии фермент быстро теряет активность. Чтобы преодолеть это затруднение и добиться увеличения поверхности раздела, в качестве ферменте。держагце員 фазы часто применяется крупнопористый неорганический носитель (например, пористое стекло), частицы которого пропитаны водным раствором фермента (рис. 10, б)..
$ 17. Микроэмульсим
Проблема увеличения поверхности раздела фаз может быть решена при использовании в качестве среды для ферментативных реакций уже упоминавшихся выше микроэмульсий типа «вода в масле» (см. рис. 8, в), введенных в арсенал энзимологии К. Мартинеком с сотр. (1977). Методика получения фермент- содержащих микроэмульсий состоит в том, что фермент в виде водного раствора (в количестве нескольких объемных процентов от общего объема системы) или лиофилизованного порошка вносят в раствор ПАВ в неполярном органическом растворителе и энергично перемешивают в течение нескольких минут (при введении фермента в сухом виде для обеспечения его солюбилизации в систему необходимо заранее добавить нужное количество водного буферного раствора). В результате образуется полностью прозрачный гомогенный раствор, в котором молекулы фермента включены внутрь гидратированных обращенных мицелл ПАВ, или микроэмульсионных капель, причем в каждой белоксодер- жащей мицелле присутствует обычно только одна молекула фермента (рис. 10, в). Диаметр сферических капель в зависимости от ряда факторов (природа органического растворителя и ПАВ, количество добавленной воды и т. п.) колеблется от нескольких единиц до 20 нм.
辞6 'пав辞6 'павРис. 10. Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа:а ——двухфазная система типа 《вода ——несмешивающийся с во дой органический растворитель», б ——частица крупнопористого неорганического носителя, пропитанная водным раствором фермента, в органическом растворителе; 6 ——фермент, включенный в гидратироваииую обращенную мицеллу ПАВ в органическом растворителе, а ——фермент, включенный в водную микрокаплю бездетергентной микроэмульсииРис. 10. Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа:а ——двухфазная система типа 《вода ——несмешивающийся с во дой органический растворитель», б ——частица крупнопористого неорганического носителя, пропитанная водным раствором фермента, в органическом растворителе; 6 ——фермент, включенный в гидратироваииую обращенную мицеллу ПАВ в органическом растворителе, а ——фермент, включенный в водную микрокаплю бездетергентной микроэмульсии
辞
6 'пав
辞
6 'пав
Рис. 10. Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа:
а ——двухфазная система типа 《вода ——несмешивающийся с во дой органический растворитель», б ——частица крупнопористого неорганического носителя, пропитанная водным раствором фермента, в органическом растворителе; 6 ——фермент, включенный в гидратироваииую обращенную мицеллу ПАВ в органическом растворителе, а ——фермент, включенный в водную микрокаплю бездетергентной микроэмульсии
Рис. 10. Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного типа:
а ——двухфазная система типа 《вода ——несмешивающийся с во дой органический растворитель», б ——частица крупнопористого неорганического носителя, пропитанная водным раствором фермента, в органическом растворителе; 6 ——фермент, включенный в гидратироваииую обращенную мицеллу ПАВ в органическом растворителе, а ——фермент, включенный в водную микрокаплю бездетергентной микроэмульсии
Ограничения, накладываемые на скорость ферментативной реакции диффузией субстрата и продукта, в микроэмульсиях практически отсутствуют из-за огромной удельной поверхности раздела между водными микрокаплями и органическим растворителем. Дополнительное преимущество таких систем состоит в том, что фермент, находящийся внутри м и кроэмул ьсион ной капли, защищен от денатурирующего воздействия органического растворителя слоем молекул ПАВ, как это показано на рис. 10, в. Микроэмульсии представляют собой универсальную микрогетеро- генную среду для ферментативных реакций: практически все из нескольких десятков ферментов различных классов, изученных в микроэмульсионных системах, полностью сохраняют, а иногда
даже приобретают более высокую каталитическую активность по сравнению с водным раствором.
После завершения ферментативной реакции в микроэмульсии фермент можно регенерировать для повторного использования, например, путем добавления в систему избытка ацетона. Фермент при этом выпадает в осадок в виде так называемого ацетонового порошка, сохраняя каталитическую активность, тогда как основная доля ПАВ вместе с продуктом реакции остается в растворе. Последнее обстоятельство является одним из основных недостатков микроэмульсий как среды для проведения ферментативных реакций, поскольку отделение продукта от примеси ПАВ нередко представляет собой весьма трудную задачу.
Затруднений такого рода можно избежать, если использовать так называемые бездетеррентные микроэмульсии, для образования которых вообще не требуется введения ПАВ. Бездетеррентные микроэмульсии образуются в тройных системах типа гексан —изопропиловый спирт — вода или толуол ——изопропиловый спирт ——вода. При определенном соотношении компонентов вода в таких системах существует в виде сферических капель размером от 5 до 30 нм, стабилизированных адсорбированными на их поверхности молекулами изопропилового спирта. При растворении в бездетергентной микроэмульсии молекулы фермента оказываются включенными в водные микрокапли, как это показано на рис. 10, г, причем их каталитическая активность сохраняется. Для отделения фермента от реакционной смеси после завершения реакции можно просто изменить состав системы путем добавления одного из компонентов, в результате чего произойдет ее расслоение на водную и органическую фазы, содержащие, соответственно, фермент и продукт реакций.
Важнейшим преимуществом системы двухфазного типа на основе воды и неполярного органического растворителя является то, что они дают возможность легко осуществлять ферментативные превращения соединений, нерастворимых в воде, но растворяющихся в органической фазе. Кроме того, благодаря низкому содержанию воды в таких системах удается проводить реакции, равновесие которых в водном растворе по термодинамическим причинам почти полностью сдвинуто в сторону исходных веществ. Речь идет прежде всего о реакциях, протекающих с образованием воды в качестве одного из продуктов, таких, как синтез пептидов, сложных эфиров и т. п；
§ 18. Двухфазные водные системы
В основе этого способа иммобилизации, предложенного Б. Ма- тиассоном (1982), лежит тот факт, что водные растворы некоторых полимеров (полиэтиленгликоля, декстрана, поливинилового спирта и других) обладают свойством не смешиваться между собой или с концентрированным водным раствором электролита, образуя системы двухфазного типа. Обычно используемые кон-
центрации полимеров в обеих фазах лежат в интервале от 5 до 15%. Наибольшее распространение получили системы, состоящие из несмешивающихся между собой водных растворов полиэтиленгликоля и декстрана, один из которых диспергирован в другом в виде мелких капель. Варьируя природу входящих в систему компонентов и объемное соотношение фаз, можно подобрать условия, при которых фермент и продукты реакции находятся преимущественно в разных фазах, что позволяет отделять продукты реакции от биокатализатора. Примером использования этого подхода может служить гидролиз крахмала под действием смеси а-амилазы и амилоглюкозидазы в двухфазной системе, состоящей из несмешивающихся друг с другом водных растворов крахмала и пол и этиле н гл и кол я.
Наряду с рядом важных достоинств, к числу которых можно отнести почти полное отсутствие диффузионных ограничений при протекании реакции, простоту приготовления и доступность необходимых компонентов, двухфазные водные системы имеют однагко, серьезные недостатки. Главный из них — это то, что вследствие эффектов распределения часть фермента, хотя и небольшая, всегда переносится в фазу, содержащую продукты реакции. Это приводит к загрязнению продуктов и потерям дорогостоящего катализатора. Чтобы избежать этого нежелательного явления, приходится применять дополнительные устройства, например мембранные ультрафильтры, что приводит к замедлению н удорожанию всего процесса.
Глава
3
ХИМИЧЕСКИЕ МЕТСЛЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ ①ЕРМЕНТОВ
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что ^дууем хнминескогд воздействия^ на структуру фермента в его молекуле создаются новые кова- Л£ятнне^ееяз44ув частности между текогПГ нисстелем^- '
Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинства ми. Во-первых,^ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. Иными словами,宁而工Бй:5:МтйЗ*ТШТ^5sbM варьировании условий, таких, как pH и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, Химическая модификация ферментов способна приводить существенным 用吧？眸Hj^n нх свойств, таких, как Q^qjftauia巫白迦四)暝空抜ть, @7否而這吗糸財 активность и стабильность. Именно химическими методами, путем многото^чногоковалентно го закрепления белковой структуры удается достигнуть наибольших эффектов стабилизации ферментов.
Основные принципы конструирования препаратов ковалентно иммобилизованных ферментов
Для целей иммобилизации существует буквально неограниченный набор различных материалов: неорганических (стекла, керамика, оксиды металлов и т. д.), природных полимеров (целлюлоза, хитин, агароза, крахмал и другие полисахариды) и, конечно, синтетических полимеров и сополимеров (см. гл. 1). Одни из этих веществ могут быть использованы непосредственно в качестве носителей, другие предварительно должны быть под-
вер гнуты специальной химической обработке активаторами или модифицирующими агентами. Иными словами, «химическая методология» иммобилизации не испытывает недостатка ни в выборе исходных материалов, ни в способах их трансформации. Однако все это составляет предмет и задачи тактики. Что же касается стратегической линии, то она базируется на принципах конструкции конечного препарата, а таких принципов всего три.
Дело в том, что независимо от числ^ и химической природы компонентов, вовлеченных в процесс иммобилизации, числа и сложности отдельных стадий этого процесса, принципиально различающихся элементов-блоков химических конструкций не более трех: собственно молекула фермента (Ф), носитель (Н) и сшивающий би- или полифункциональный реагент (С), называемый также «сшивка», «вставка»,《ножка», «спенсер» и т. п.
• Таким образом, ковалентная иммобилизация ферментов под разумевает создание конструкций из связанных химическими связями трех элементов: Н ——С —— Ф (как максимум) н (или) двух, Н — Ф и С — Ф (как минимум). В свою очередь принципы конструирования соответствующих конъюгатов можно наглядно обозначить терминами «пришивка» (для Н ——Ф), «сшивка» (для Н ——С ——Ф) и «вшивка» (для С ——Ф).
Рассмотрим эти принципы более подробно. При наличии на поверхности носителя функциональных групп, способных вступать в химические реакции с функциональными группами фермента с образованием ковалентных связей: получение иммобилизованного фермента сводится к исключительно простой процедуре, аналогичной используемой для физической адсорбции фермента на носителе. Методических различий здесь действительно нет: в раствор фермента вводится носитель и фермент на нем адсорбируется, однако адсорбция при химической иммобилизации необратимая ——фермент пришивается к носителю одной или несколькими ковалентными связями (рис, 11, а). Тесный контакт белка с носителем может оказаться нежелательным, например, из-за неб л а го п ри ятного изменения микросреды фермента, стерических и диффузионных ограничений. Выходом из такой ситуации становится отдаление молекулы иммобилизованного фермента от поверхности носителя на некоторое расстояние. Для этой цели применяются сшивающие реагенты различной длины. Они могут быть как простыми бифункциональными (т. е. с двумя одинаковыми или различными по химической природе реакционноспособными группировками), так и весьма сложными полифункциональными реагентами, в том числе построенными из отличающихся по химической природе звеньев с различными по прочности связями между ними. Тем не менее здёсь используется один общий принцип ковалентной иммобилизации —сшивка фермента с носителем посредством сшивающего агента (рис. 11,6).
По разнообразию методических приемов, по крайней мере 78
I* +心—|*~<i
(Н)(ф)
Рис. 11. Блок-схемы ковалентной иммобилизации ферментов
за счет сшивающегося агента, этот способ несравнимо богаче и гибче предыдущего. Во-первых, подбором длины сшивающего агента (или подбором оптимальной смеси сшивающих агентов различной длины) можно изменять каталитические характеристики иммобилизованного фермента. Во-вторых, можно специально конструировать сшивку так, чтобы она содержала связь, лабильную в определенных условиях или специфически расщепляемую определенными реагентами (в частности, ферментативно) .Это дает ключ к контролируемому отделению иммобилизованного фермента от носителя, например, при решении проблем направленного транспорта ферментов в живом организме.
Целый ряд разнообразных решений задачи ковалентной иммобилизации ферментов дает использование систем, изначально не содержащих носителя, а только фермент и сшивающие агенты, где носитель (как твердое тело) формируется непосредственно в процессе иммобилизации или же сам фермент служит одновременно и носителем. Речь, таким образом, пойдет здесь о ковалентном вшивании молекулы фермента в различные типы сеток (рис. 11,6). Идея конструирования ферментных сеток (ретикуляция ферментов) вытекает из полифункциональной природы самой молекулы фермента, имеющей на поверхности по-
мимо активного центра достаточно большое количество реакционноспособных групп. При введении в раствор фермента бифункционального сшивающего агента отдельные молекулы фермента сшиваются друг с другом и образуют более или менее сложные агрегаты сетчатой структуры, в которой узлами служат сами молекулы фермента. В зависимости от природы и количества сшивающего агента можно получить как водорастворимые, так и водонерастворимые препараты.
Другой прием ретикуляции основан на использовании ферментов, предварительно ковалентно модифицированных реагентом, содержащим двойную связь, например акрилоил хлоридом. В этом случае при сополимеризации белкового макромономера с низкомолекулярными мономерами (например, с акриламидом) образуются сетчатые полимерные гели, сшитые белком или дополнительным сшивающим мономером (например, N, N-мети- лен-бис-акриламидом). В рассматриваемой системе исходное состояние ——жидкий раствор, а конечное (после полимеризации) —твердое теш (гель), причем, естественно, оно приобретает форму того сосуда (реактора), в котором проводится полимеризация. Целенаправленное использование этого явления положено в основу целого ряда оригинальных способов иммобилизации. Сшивкой белка в объеме растворителя (сополимеризацией) получают трехмерный гель (рис. 12, а) в виде крупного однородного блока, который можно механически измельчать и использовать в виде более или менее мелких частиц в суспензиях. Трехмерный гель можно готовить и непосредственно в виде мелких частиц сферической формы путем эмульсионной полимеризации. Эмульсии получают диспергированием водного раствора, содержащего мономеры, в несмешивающемся с водой органическом растворителе. Предельный вариант таких систем — микроэмульсии, или гидратированные обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ (ПАВ) в органических растворителях. В мицеллярных системах размеры《капелек», содержащих модифицированный фермент и мономеры, можно варьировать н даже получать их близкими к собственным размерам молекул ферментов. Это новое качество иммобилизации —— молекулярный уровень. Иными словами, при использовании систем обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях, можно обшивать отдельные молекулы фермента полимерной оболочкой заданной толщины, т. е. в полном смысле одеть фермент в «рубашку, сшитую по мерке》(рис. 12, б).
Процесс ретикуляции может быть реализован не только в растворе фермента, но и при использовании его иммобилизованных препаратов. Так, в случае фермента, предварительно иммобилизованного на химически инертном носителе путем физической адсорбции, дополнительная обработка сшивающим агентом приведет к повышению прочности (задубливанию) препарата. Носитель здесь непосредственно не принимает участия в химической реакции ——он служит лишь матрицей для организации
сополимеризация в однородном растворесополимеризация в однородном растворесополимеризация в м икроэмульсионной системесополимеризация в м икроэмульсионной системе
сополимеризация в однородном растворе
сополимеризация в однородном растворе
сополимеризация в м икроэмульсионной системе
сополимеризация в м икроэмульсионной системе
введение в молекулу фермента „химических скобок*1
Рис. 12. Типы ретикуляции ферментов:
а - межмолекулярная трехмерная сетка; 6 — сетчатая оболочка вокругмолекулы фермента (молекулярно им мобилизованный фермент); в —межмолекулярная двумерная сетка; 2 ——внутримолекулярная сетка изполипептидвых цепей белка и химических «скобок»
слоя (монослоя) адсорбированного фермента и обусловливает двумерную направленность ретикуляции. Более того, носитель может быть вообще удален (например, нитроцеллюлозу раство ряют в метаноле) и, таким образом, получится сшитая ферментная пленка (рис. 12,6).
В принципе можно представить себе «нульмерную» ретикуля-
цию, поскольку являющаяся узлом ферментной сетки молекула фермента ——это не условная точка, а довольно-таки крупный объект. Иными словами, от сеток межмолекулярых перейдем к внутримолекулярным, составленным из полимерных цепей белка н химических сшивок. Один из примеров такого рода был уже рассмотрен (рис. 12,6), Добавим, что препараты молекулярно иммобилизованных ферментов могут быть получены, если обе группы бифункионального сшивающего реагента провзаимо- действуют с одной и той же молекулой белка. В таком случае (рис. 12, г) речь идет о наложении «химических скобок», внутримолекулярно закрепляющих структуру фермента. Практическая реализация этого подхода в гомогенном растворе затруднена из-за образования наряду с внутримолекулярными межмолекулярных сшивок. Исключить межмолекулярные взаимодействия можно путем перехода от гомогенных к микрогетерогениым системам с пространственно изолированными молекулами фермента, например солюбилизацией ферментов в органических растворителях с помощью гидратированных обращенных мицелл ПАВ.
Химическая структура ферментов и их функциональные группы
Основой любого фермента является белок, представляющий собой компактную конструкцию из одной или нескольких поли- пептидных цепей, ковалентно связанных (сшитых) дисульфидными мостиками. Помимо белка ферменты иногда могут содержать и небелковые компоненты: простетические группы неорганической и органической природы, липиды (в липопротеидах) и углеводы (в гликопротеидах). Конечно, в общем случае химические методы иммобилизации нацелены на модификацию функциональных групп в белковой части молекулы фермента. Однако при выборе процедуры иммобилизации для конкретного фермента целесообразно учитывать и специфические особенности строения его молекулы. В этой связи укажем на хорошо известный и яркий пример ковалентной иммобилизации гликопротеидов. Относительно простым методом — окислением перйодатом натрия в мягких условиях ——в полисахаридную часть фермента вводятся альдегидные группы, посредством которых на следующем этапе и осуществляется химическое взаимодействие с носителями или сшивающими агентами» содержащими аминогруппы (образованием азометиновых связей, оснований Шиффа).
Белковые части ферментов построены (рис. 13) из ~20 аминокислот, соединенных между собой пептидной связью. Количество аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков составляет от нескольких десятков до тысяч. Однако качественный состав белков (содержание тех или иных аминокислотных остатков) оказывается весьма сходным. Почти половину всех аминокислотных остатков белка составляют аминокислоты с неполярными нли слабополярными боковыми группами. В резуль-
apnoom (3-5)apnoom (3-5)：=O：=OНС—СН(СН.)一онНС—СН(СН.)一онтреонин (5-7)треонин (5-7)：—СИ：—СИхцюмнG-0хцюмнG-0шн(5-8)шн(5-8)NH с=оNH с=оглутаминглутаминНС—(CHj),—C(O)NHjНС—(CHj),—C(O)NHjгруппагруппан|>"СН,—^^~0H NHн|>"СН,—^^~0H NHаспцмпааспцмпаглацин, алжнин, валяв, лейцп, ■эолейцп, февилаланан ■ пр. (40-50)глацин, алжнин, валяв, лейцп, ■эолейцп, февилаланан ■ пр. (40-50)с==о■*+"NHс==о■*+"NHНС—СНа—C(O)NH*Н~NHНС—СНа—C(O)NH*Н~NHНС—RНС—R，00Н，00Нконцеваякарбоксш1>ныГуппаконцеваякарбоксш1>ныГуппа
apnoom (3-5)
apnoom (3-5)
：=O
：=O
НС—СН(СН.)一он
НС—СН(СН.)一он
треонин (5-7)
треонин (5-7)
：—СИ
：—СИ
хцюмн
G-0
хцюмн
G-0
шн
(5-8)
шн
(5-8)
NH с=о
NH с=о
глутамин
глутамин
НС—(CHj),—C(O)NHj
НС—(CHj),—C(O)NHj
группа
группа
н|>"СН,—^^~0H NH
н|>"СН,—^^~0H NH
аспцмпа
аспцмпа
глацин, алжнин, валяв, лейцп, ■эолейцп, февилаланан ■ пр. (40-50)
глацин, алжнин, валяв, лейцп, ■эолейцп, февилаланан ■ пр. (40-50)
с==о
■*+"NH
с==о
■*+"NH
НС—СНа—C(O)NH*
Н~
NH
НС—СНа—C(O)NH*
Н~
NH
НС—R
НС—R
，00Н
，00Н
концеваякарбоксш1>ныГуппа
концеваякарбоксш1>ныГуппа
Рис. 13. Полипептидная цепь. Условно составлена из аминокислот в порядке убывания числа химических реакций, в которых способны принимать участие функциональные группы их боковых радикалов; в скобках при названиях аминокислот указано среднее процентное содержание в белках
тате этого за счет гидрофобных взаимодействий полипептидные цепи сворачиваются в глобулярные структуры, ядро которых и составляют неполярные фрагменты полипептидных цепей, а наружный слой образуют звенья с полярными и ионогенными группами, такими, как —SH, —ОН, —СООН, —NH2. Конечно, некоторое количество гидрофобных группировок также может оказываться на поверхности; из них на глобуле формируются контактные участки для связывания субстратов н(нлм) для межсубъединичных взаимодействий. Ароматические аминокислотные остатки (тирозина' и триптофана) распределены между внутренними областями и наружным слоем так, что лишь часть из них оказывается доступной растворителю и, следовательно, растворенным в нем химическим реагентам.
Таким образом, с точки зрения возможностей ковалентной иммобилизации ферментов белковые молекулы удобно представить в виде своеобразных шариков с экспонированными наружу функциональными группами: тиольными (цистеина), гидроксильными (алифатическими — серина н треонина, ароматическими — тирозина), карбоксильными (глутаминовой и аспарагиновой кислот» а также С-концевыми), гуанидиновыми (аргинина), имидазольными (гистидина) и аминогруппами (Е-лизина и a-, N-koh- цевыми). Оценку количества тех или иных групп в различных белках в первом приближении можно сделать по данным, приведенным на рис. 13. Например, в таком небольшом белке, как трипсин или химотрипсин, с молекулярной массой около 25 000, должно быть до 10 остатков цистеина, около 30 алифатических ОН-групп, 3—7 остатков тирозина, 7—12 остатков аргинина, свыше 10 аминогрупп и 40 карбоксильных групп. Результаты такой оценки соответствуют известным экспериментальным данным.
Но, конечно, нет правил без исключений. - В природе встречаются белкивообще не содержащие некоторых из приведенных на рис. 13 аминокислотных остатков, например цистеина. В пепсине, протеолитическом ферменте с молекулярной массой около 35 000 имеются не два десятка, как этого можно было бы ожидать, а всего лишь две аминогруппы: одна Е-лизина и одна ^-кoнцeвaя. Но недостаток одних групп на поверхности бел ко- вой молекулы компенсируется другими. В общем, количество функциональных групп в белках, доступных модифицирующим агентам, достаточно велико и, казалось бы, нет особых проблем для ковалентной иммобилизации белковой молекулы с использованием хотя бы одной из этих групп. Тем не менее проблемы существуют и не малые. Дело в том, что в процессе ковалентной иммобилизации должны участвовать только те группы молекулы белка, которые не существенны для его функции (в нашем случае — катализа). С этой позиции попытаемся выявить в белке группы-мишени, наиболее предпочтительные для целей ковалентной иммобилизации. Для этого используем следующие критерии. Во-первых, группы-мишени должны быть высокореакциоиноспо- собными, чтобы по возможности обеспечить избирательность реакции модификации, а также ее протекание в мягких неденатурирующих условиях. Во-вторых, таких групп в белке должно быть достаточно много, чтобы обеспечить широкие возможности для введения новых химических связей в белковую молекулу с регуляцией их числа и локализации и снизить таким образом вероятность модификации активных центров ферментов. Данные о сравнительной реакционной способности и относительному содержанию аминокислотных остатков приведены на рис. 13.,
Самыми реакционноспособными группами в белках являются SN-группы цистеина. Они способны принимать участие в разнообразных химических реакциях: окисления, ацилирования, алкилирования и т. д. Однако собственные тиольные группы бел-
ка не очень подходят на роль мишеней для ковалентной иммобилизации. Дело не только в том, что содержание цистеина в белках в общем-то невелико. Очень часто в белках вообще нет сво二 бодных SH -групп: они участвуют в образовании дисульфидных мостиков, стабилизирующих структуру ферментов. В тех же случаях, когда такие группы в белке есть, они, как правило, необхо димы для каталитической активности. Тогда при иммобилизации возникает задача защитить SH-группы. Решить ее можно различными приемами, например обработкой белка и-оксимерку- рибензоатом: после окончания иммобилизации защитная группа отщепляется в слабокислой среде. Несмотря на указанные осложняющие обстоятельства использование SH-групп для ковалентной иммобилизации ферментов остается привлекательным и в ряде случаев может быть осуществимо. Разработаны также методы, позволяющие вводить в молекулу белка экзогенные SH-группы, например, модификацией аминогрупп белка подходящими реагентами, в частности ацилирование1^ Тнолактоном гомоцистеина.
Аминогруппы белка наиболее часто используют для различного рода химических модификаций и для целей ковалентной иммобилизации ферментов. Это обусловлено рядом причин. Во-первых, их в белке достаточно много (см. рис. 13). Во-вторых, аминогруппы высокореакционноспособны и уступают лишь SH-группам по числу и разнообразию реакций, в которых они могут принимать участие. В-третьих, в большинстве своем аминогруппы играют второстепенную роль в поддержании структуры и функции ферментов. Важное свойство аминогрупп — способность протонироваться (рК 9——10), обеспечивает в физиологических условиях наличие на поверхности белков положительных зарядов, которые взаимодействуют с противоионами из раствора или с отрицательно заряженными карбоксильными группами белка, образуя в последнем случае солевые мостики. Если для нормального функционирования фермента важно сохранение положительного заряда, то этого можно достичь при химической модификации аминогрупп, переводя их (алкилированием) из первичных во вторичные. В-четвер- т&火，если некоторые аминогруппы, а не только их заряд, окажутся существенными для структуры и функции фермента, то их при необходимости нетрудно защитить, например, ацилированием ангидридом три фторуксусной кислоты или малеиновым ангидридом (первая из указанных защитных групп снимается в щелочной среде, а вторая ——в кислой). В-пятых, для ковалентной иммобилизации ферментов посредством их аминогрупп разработано большое количество подходящих носителей и сшивающих реагентов.
Таким образом, наиболее удобной группой ——мишенью, следует считать аминогруппу. Однако, чтобы не сложилось впечатление об уникальности использования аминогрупп белков для целей ковалентной иммобилизации, необходимо отметить, что (как правило) обычные химические реагенты являются неспецифи-
чески ми и, помимо аминогрупп, в реакциях модификации могут принимать участие и другие функциональные группы белка» такие, как тиольные (цистеина), имидазольные (гистидина)» гуанидиновые (аргинина), гидроксильные (тирозина, серина и треонина), а также небелковые компоненты фермента или же реакционной системы, в частности вода. Реакционная способность тех или иных групп белка существенным образом зависит от условий: макро и микро. Группу макроусловий составляют такие, как природа растворителя, pH среды, температура — эти условия могут и должны быть строго контролируемыми. Микроусловия, микросреда функциональной группы определяются структурой фермента, ее трудно изменять в нативном белке» но важно учитывать при выборе метода и внешних условий модификации.
В заключение этого раздела необходимо подчеркнуть, что в целом белковые структуры весьма лабильны н существует огромное количество факторов, в том числе химических, вызывающих денатурацию и инактивацию ферментов. Поэтому исключительную значимость при операциях с белками приобретает выбор реакции и условий ее проведения: желательно, чтобы эти условия были мягкими и неденатурирующими. Что же касается получения, трансформации и химической активации носителей и сшивающих агентов, то здесь практически нет ограничений в выборе условий реакции. Без особого преувеличения можно сказать, что любой твердый материал (природный или синтетический) может быть использован при необходимости в качестве носителя ковалентно иммобилизованных ферментов (см. гл. 1).
Приемы химической (ковалентной) иммобилнзацин белков
'"еакцмн образования амидной связи [——С(О)——NH——].Присоединить белок (Ф) к носителю (Н) или сшивающему агенту (С) посредством амидной связи можно многими путями и при участии различных функциональных групп. Наиболее часто применяется реакция ацилирования аминогрупп фермента. В качестве ацилирующих агентов широко используются ангидриды：
鲁声 + H?Nf ^S鲁声 + H?Nf ^SHg) (1)Hg) (1)
鲁声 + H?Nf ^S
鲁声 + H?Nf ^S
Hg) (1)
Hg) (1)
⑵⑵
⑵
⑵
и хлорангидриды карбоновых кислот:
Оо
@J—а + HzN—© 受察JQhS—NH—©
В случае ангидридного метода в непосредственной близости от возникшей амидной связи в препарате иммобилизованного фермента оказывается карбоксильная группа, образующаяся в ходе
реакции (1). Это обстоятельство следует учитывать как с точки зрения ее возможного влияния на баланс электростатических взаимодействий в белке и направления локального смещения pH, так и с точки зрения химической стабильности иммобилизованного препарата: в кислой среде карбоксильная группа может катализировать гидролиз амидной связи в конъюгате.
В качестве ацилирующих агентов также могут выступать активированные эфиры (или другие производные карбоновых кислот с хорошими уходящими группами), например п-ннтрофеннло- вые эфиры:
NOa + HaN—(Ф)喘.嚷 @—S—NH—@ ♦ -О~^^-N6 + Н+
(3)
Реакция (3) замечательна тем, что в процессе модификации белка высвобождается нитрофенолят-ион (р/Са = 7), удобная хромофорная метка для строгого контроля за ходом реакции спектрофотометрическим методом.
Реакционная способность активированных производных карбоновых кислот падает по мере уменьшения кислотности уходящей группы (от хлорангидридов до эфиров).
Перечисление ацилирующих агентов можно было бы продолжить и рассмотреть, например, реакции с ацилазидами, образующимися из гидразидов карбоновых кислот при их обработке азотистой кислотой. Однако новыми здесь будут лишь методы (более сложные) подготовки носителей и сшивающих агентов, тогда как суть проведения самого процесса иммобилизации и тип образуемой связи в конъюгате будут аналогичны тем, которые характерны реакциям (1) — (3).
Принципиально иные реагенты и реакции могут быть заимствованы, например, из такой хорошо разработанной области органической химии, как пептидный синтез, центральной задачей которого является образование амидных связей. В качестве удобных ацилирующих агентов в пептидном синтезе используют производные О-ацилизомочевины:
@J-@J--С—NH—R + Н, N-© -^^ +ЙН—R*-С—NH—R + Н, N-© -^^ +ЙН—R*О^^—{—NH—@ + R^NH*О^^—{—NH—@ + R^NH*■NH—R* (4)■NH—R* (4)
@J-
@J-
-С—NH—R + Н, N-© -^^ +ЙН—R*
-С—NH—R + Н, N-© -^^ +ЙН—R*
О
^^—{—NH—@ + R^NH*
О
^^—{—NH—@ + R^NH*
■NH—R* (4)
■NH—R* (4)
Реакция (4) отражает взаимодействие аминогрупп фермента с носителем или сшивающим агентом, содержащими карбоксильные группы активированные карбо диимидом, R — N=C=N—R. Иными словами, карбодиимид служит конденсирующим агентом н равным образом осуществляет реакцию образования амидной связи за счет активированных карбоксильных групп белка н аминогрупп носителя или сшиваюшего реагента. Низкомолекулярные карбодиимиды сами по себе могут рассматриваться как своеобразные сшивающие агенты. Дело в том, что обработка
бел ков такими карбо диимидами может приводить к образованию меж молеку ляр ных и внутримолекулярных амидных связей между карбоксильными и аминогруппами белковых молекул: при этом исходный карбоди им ид превращается в соответствующее производное мочевины и не входит в состав возникшего белкового конъюгата. В пептидном синтезе главным образом находит применение дициклогексилкарбодиимид, при трансформации которого образуется ди циклогексил мочевина — труднорастворимое в воде вещество и поэтому легко отделяемое от водорастворимых целевых продуктов. Это обстоятельство создаёт определенные неудобства при необходимости иммобилизации ферментов на твердых носителях. Указанный недостаток устраняется при использовании растворимых карбодиимидов, имеющих гидрофильные и (или) заряженные группы в боковых радикалах R и R', например, 1 -циклогексил-3- [2-морфолино-(4)-этил) -карбодиимид - ме- то-п-толуолсульфонат CHCILSO?
о/\нз+ NICо/\нз+ NIC
о
/\нз+ NIC
о
/\нз+ NIC
Другой пример конденсирующего агента, достаточно широко употребляемого для ковалентной иммобилизации ферментов путем образования амидной связи, также заимствован из пептидного синтеза ——это изоксазолиевая соль, реактив Вудворда:
сн—>conh~c2hs
Условия проведения реакции (5) с реактивом Вудворда в общем близки к условиям проведения реакции (4) с кар боди имидами, разница лишь в том, что в случае реакции (5) применимы и слабощелочные среды. Добавим также, что реакция (5) протекает весьма энергично и в ряде случаев при использовании реактива Вудворда, особенно при его избытке, обнаруживается инактивация ферментов (например, креатинкиназы н гексокиназы).
\j Реакции образования карбамидных связей (производных мочевины: —(NH, О)—С(О, S)—NH—). Химия мочевины, ее предшественником и производных чрезвычайно богата и разно
образна по реакциям. Именно синтезом мочевины из циановокислого аммония, осуществленным Ф. Велером в 1828 г., было положено начало современной препаративной органниеско員 химии. Приведенный пример вполне здесь уместен, поскольку аналогичная реакция может быть с успехом использована для ковалентной иммобилизации ферментов.
Изоцианаты, RNCO, способны эффективно взаимодействовать с различными функциональными группами белков с образованием производных мочевины, таких, как диалкил мочевины, уретаны и уреиды. Наиболее реакционноспособными группами белков по отношению к изоцианатам являются аминогруппы:
@—N=c=o + H2N—<ф)用覧^@—N=c=o + H2N—<ф)用覧^^)~NH—NH—(Ф)^)~NH—NH—(Ф)⑹⑹
@—N=c=o + H2N—<ф)用覧^
@—N=c=o + H2N—<ф)用覧^
^)~NH—NH—(Ф)
^)~NH—NH—(Ф)
⑹
⑹
Аналогичным образом могут быть применены изотиоцианаты. При этом, соответственно, образуются производные тиомочевины.
Одним из самых распространенных методов активации природных полисахаридных носителей (или синтетических полиолов) является бромциановый метод. При обработке бромцианом на таких носителях формируются исключительно реакционноспособные, цианатные, —О—C^N, и имидокарбонатные,
.,группы. При взаимодействии белка с таким обра
зом активированным носителем образуются изомочевины (7) и уретаны (8):
⑺(8)⑺(8)
⑺
(8)
⑺
(8)
Полиольные носители (в том числе полисахариды) активи руют также алкйлхлорформиатами, при этом получают циклические карбонаты, эффективно взаимодействующие с аминогруппами белков:
時iHf _!!^時iHf _!!^
時iHf _!!^
時iHf _!!^
При обработке нитрилов, например полиакрил нитрила, хлорводо- родом и спиртами в безводной среде получают хлоргидраты ими- доэфиров:
Имидоэфиры могут быть также синтезированы при алкилировании (диметилсульфатом) амидной группы, например, в полиамидах. В свою очередь они легко реагируют с аминогруппами белков с образованием амидинов:
(10)(10)®~С^* H,N-(®) -牢孫畳》(g>-公Н-@
(10)
(10)
ХКСЯТКМЧЖ8Е
о+ @—NH—LnH—@> (11)о+ @—NH—LnH—@> (11)В случае реакции с имидоэфирами (10) образующаяся в конъюгате связь химически более прочная, чем в (7) — (9). Дело в том, что характерная особенность конъюгатов, получаемых по реакциям (7)——(9), заключается в возникновении соединительной группировки уретанового типа, т. е. содержащей сложноэфирную связь. Эта связь может расщепляться под действием нуклеофильных реагентов, в том числе под действием аминогрупп белков:
о
+ @—NH—LnH—@> (11)
о
+ @—NH—LnH—@> (11)
(^^-g—NH—@ + HaN—@ —А (Щ-ЧЭН
Эта реакция может быть положена в основу получения сшитых димеров белков или их субъединиц (одинаковых или разных) либо ею можно воспользоваться для удаления иммобилизованного фермента с носителя. В том же случае, когда отщепление иммобилизованного белка от носителя крайне нежелательно, следует исходить из других типов носителей, например носителей, содержащих вместо гидроксильных групп аминогруппы.
jРеакции образования вторичных аминов (связи —NH—). Первичные а- и е-аминогруппы белков могут быть трансформиро* ваны во вторичные в реакциях алкилирования и арилирования^ а также путем восстановления азометиновых связей (оснований Шиффа). Если в качестве алкилирующих или арилирующих агентов использовать соответствующие носители и сшивающие агенты, то образуются конъюгаты, в которых белковая часть фермента закреплена прочной, негидролизуемой азот-углеродной связью, причем вторичный амин легко протонируется и, таким образом, может нести на себе положительный заряд так же, как исходная аминогруппа.
Хорошо известными алкилирующими и арилирующими агентами служат га логен произ водн ые алифатических н ароматических углеводородов, а также мети л кетонов. Взаимодействие носителей и сшивающих агентов, содержащих активный атом галогена при атоме углерода, с ферментами протекает по схеме (12)
⑱一CHz—Cl + НК—® ―— Qb"CH2—NH—@ + HC1 (12)
в щелочной среде, требующейся для депротоннрования аминогруппы и связывания образующегося хлорида водорода. В этих условиях алкилируются также тиольные группы цистеина, имидазольные ——гистидина, гидроксильные — тирозина и, в меньшей степени, алифатические гидроксильные группы белка. В качестве арилирующих агентов, помимо галогенпроизводных, могут быть применены и сульфопроизводные. Однако в последнем случае наряду с реакцией алкилирования может протекать н реакция сульфирования аминогрупп белка с образованием сульфамидной связи.
В общем число алкилирующих н ацилирующих агентов очень большое. Но особого упоминания заслуживает метод, использующий хлорпроизводные 1,3,5-триазина, в частности цианурхло- рид, из-за его простоты и надежности. В цианурхлориде три атома хлора связаны с атомами углерода. В присутствии соединений с HS-, H2N- и НО-группами происходит быстрое расщепление одной из трех С——Cl-связей, затем (более медленно) подвергается расщеплению и вторая группа, а третья обычно в реакции арили- рования участия не принимает (время иммобилизации около суток при 4℃). Цианурхлорид может быть с успехом применен для активации носителей, например полисахаридов, а также как бифункциональный сшивающий или вшиваемый агент.
Исключительно эффективными алкилирующими агентами являются такие производные олефинов, как имины, оксиды и тио* оксиды (оксираны и тиираны):
0—СН—СНа + HaN—<ф)——•- (н)—CH—СН2—NH—@(13)
、х/ (НО- HS-)М (-O-.-S-)
где X = >NH,>O,>S
Реакцию (13) можно проводить в средах с различными зиа- чениями pH, причем от выбора pH существенно зависит направление реакции: по амино- или оксигруппам белка.
Реакции как алкилирования, так н арилирования можно провести путем присоединения фермента (посредством его тиольных, амино- и гидроксильных групп) по активированным двойным связям. Для этой цели используют гидрокси л со держащие носители, предварительно активированные дивинилсульфоном или бензохиноном. Процесс иммобилизации можно представить, соответственно» схемами (14) и (15):
@—О—сн2—СН2—SO—СН=СН2 + HtN—@『“А
(hs—,ho-)
—^(Н>-О(СН2)2—SOa(СН2)2—NH—©(14)
pH》8pH》8。5)。5)
pH》8
pH》8
。5)
。5)
Реакции активации носителей бензохиноном и последующего присоединения к таким носителям фермента правильнее было бы называть окислительным арилированием, поскольку в качестве промежуточных группировок в них образуются- гидрохиноновые, которые, в свою очередь, окисляются хиноном или растворенным кислородом воздуха (среда щелочная» что благоприятствует процессу окисления).
Если теперь вернуться к рассмотренным реакциям (I)——(15), то можно констатировать, что все эти реакции в об тем-то неспецифические и помимо аминогрупп в них могут принимать участие, как это уже отмечалось, другие функциональные группы: тиольные, имидазольные, гидроксильные. Одним нз наиболее распространенных методов специфической модификации аминогрупп белков является образование азометиновых связей, —CH=N—, в реакциях белков с альдегидами (16):
@—с<н +h2n—@@—с<н +h2n—@Ц^ @-сн=уЦ^ @-сн=у(16)(16)
@—с<н +h2n—@
@—с<н +h2n—@
Ц^ @-сн=у
Ц^ @-сн=у
(16)
(16)
Продукты конденсации амино- н альдегадсодержащих соединений ——основания Шиффа ——образуются легко н быстро в щелочных средах н в этих условиях весьма стабильны. Особенно широкое распространекие в методах иммобилизации получили диальдегиды, такие, как глутаровый альдегид, используемый в качестве сшивающего агента. При применении низкомолекулярных альдегидов, в том числе глутарового, необходимо учитывать возможность образования разнообразных побочных продуктов полимеризации и поликонденсации уже в исходных реагентах. В результате при действии глутарового альдегида на фермент помимо оснований Шиффа могут возникать и другие конъюгаты, в том числе связанные через вторичные амины.
Характерной особенностью азометиновой связи является то, что она легко разрушается в кислых средах с регенерацией исходных веществ реакции (16). Это ее свойство может использоваться для удаления с носителя ковалентно иммобилизованного фермента путем простого изменения pH среды. Очевидно также, что азоме- тиновая связь непригодна для ковалентной иммобилизации ферментов, предназначенных для работы в кислых средах. Однако устойчивости конъюгатов с азометиновой связью к кислотам можно добиться путем восстановления этой группировки:
@-CH=N-@ -謂 а @~СН2—NH-©@-CH=N-@ -謂 а @~СН2—NH-©(17)(17)
@-CH=N-@ -謂 а @~СН2—NH-©
@-CH=N-@ -謂 а @~СН2—NH-©
(17)
(17)
Реакция (17) приводит к образованию вторичного амина, прочной ковалентной связующей группировки между белком н носителем или сшивающим агентом.
Взаимодействие альдегидных н аминогрупп можно осуществить н таким образом, чтобы сразу (в один прием) получить прочный конъюгат. Примером такого процесса служит метод Уги, который схематически может быть представлен реакцией (18):
R】一C《 + R2—NH2 + R3—C《 + R4—NC->、OH、H
f Ri—С (O)—N (R2)—CH (R3)—C (O)—NH—R4(18)
Как видно из схемы, помимо альдегидных и аминных групп в реакцию (18) вступают соединения с карбоксильной группой и изонитрилы с образованием амидной связи между белком н носителем .Иными словами, по методу Уги ферменты можно ковалентно иммобилизовать на носителях, содержащих альдегидные группы, в присутствии изоцианатов как по амино-, так н карбоксильным группам. Равным образом иммобилизация может быть осуществлена на носителях, содержащих изонитрильные группировки в присутствии низкомолекулярных альдегидов.
\ЛРеакции азосочетания (образование азосоединеиий со связью —^I=N—). Соли диазония [Аг—N=N]+ С1~ способны вступать в различные реакции сочетания, скорость которых н направление существенно зависят от pH среды и природы ароматического субстрата. В реакциях азосочетания могут, в принципе, участвовать аминные, гуанидиновые, тиольные, имидазольные и фенольные группы белков, причем в ряде случаев с одной функциональной группой могут реагировать две диазогруппы.
В слабощелочной среде основной группой-мишенью в белке является фенольный радикал тирозина (атаке ионом диазония в этих условиях может также подвергаться незащищенный незаряженный имидазол гистидина):
®"~^2^~』N + НОY^^Hg)-11Hl^15 cA. 0_^~^_N=口^)L©(19)
В результате реакции (19) быстро образуется прочный конъюгат белка с носителем, связанный через диазогруппу. Важно отметить простоту процедуры иммобилизации этим методом, несложным также является получение соли диазоння при работе с носителем (или сшивающим агентом), содержащим n-аминофенильные функциональные группы. Добавим, что комбинацией различных химических приемов можно вводить аминофенильные группы в разнообразные носители, например в полистирол н даже в полнакрн- ла少血
Х/Феакцни тиол-дисульфидного обмена (образование дисульфидной связи,——S —S——)・ В предыдущем разделе было отмечено, что свободные сульфгидрильные группы в белках встречаются
доволно-таки редко из-за ярко выраженной способности к окислению н образованию в нативных условиях дисульфидных мостиков —сшивок, которые, однако, в белках нетрудно восстановить до исходных сульфгидрильных групп. Способность к созданию дисульфидных мостиков может быть использована для ковалентной иммобилизации 申ерментон путем формирования межмолекулярных дисульфидных связей по реакции (20):
^HSH . HS—@」” А (^у—s—S—<ф) (20)
Окисление сульфгидрильных групп до дисульфидных протекает спонтанно под действием растворенного кислорода воздуха. С целью увеличения содержания тиольных групп в исходном белке проводят восстановление дисульфидных связей подходящим восстановителем, например боргидридом натрия, меркаптоэтанолом, дитиот реитоло м, цистеином или его производными. Однако реоки с- ление тиольных групп при проведении реакции (20) может приводить к образованию «неправильных» внутримолекулярных дисульфидных мостиков в белке и, таким образом, сопровождаться существенной потерей каталитической активности нммобнлнзо- ванного фермента. Содержание сульфгидрильных групп в белке можно увеличить за счет введения эндогенных групп, т. е. тиол и- рованием. Для этого, избрав в качестве групп-мишеней аминогруппы белка, обрабатывают их подходящими ацилирующими или алкилирующими реагентами, содержащими защищенную сульфгидрильную группу» например тиолактоном гомоцистеина. Пример указанного реагента интересен тем, что при его использовании в белке увеличивается содержание сульфгидрильных групп, тогда как число аминогрупп не изменяется (а- и е-амино- группы белка образуют с реагентом амидную связь, однако реагент несет на себе собственную а-аминогруппу, а также сульфгидрильную, формируемую при раскрытии лактонного кольца).
В общем случае удобным приемом ковалентной иммобилизации ферментов путем образования дисульфидных мостиков является использование реакций тиол-дисульфидного обмена (при этом резко уменьшается вероятность закрепления «неправильных» дисульфидных внутримолекулярных мостиков в белке). Суть этого процесса можно выразить реакцией (21):
Ri—S—S—R2 + HS—R3=Ri—S—S—R3 + HS —R2 (21)
где Ri, R2 н R3 могут представлять собой белок, носитель, сшивающий агент и (или) радикал низкомолекулярного тиола. Реакции тиол-дисульфидного обмена обычно происходят в сильнокислой среде, но могут катализироваться тиольными анионами в нейтральных и щелочных растворах. Примером иммобилизации ферментов по реакции (21) может служить взаимодействие белка с носителем, содержащим дитионитробеизойную группу:
уСОО-
+ HS-@ —+ HS-@ —®—S—S—(ф) + ^\^-NO? + Н+ (22)
+ HS-@ —
+ HS-@ —
В этом методе присоединение фермента к носителю удобно контролировать спектрофотометрически (X = 412 нм, е = 13 600) по количеству освобождающегося тионитробензоат^.
Важным достоинством методов иммобилизации, основанных на реакции тиол-дисульфидиого обмена, является простота процедуры как присоединения фермента к носителю, так и отщепления (под действием низкомолекулярного тиола).
Радикальные реакции (графт-сополимеризация). Одним из распространенных приемов получения синтетических полимерных
осуществляем а я,осуществляем а я,материалов служит графт-сополимеризация,
осуществляем а я,
осуществляем а я,
например, путем химической прививки одного полимера к другому. Эта цель достигается при рекомбинации макро ради калов.
при воздействиипри воздействииобразующихся в исходной смеси полимеров
при воздействии
при воздействии
мощного источника у-излучения. Нетрудно представить себе аналогичную ситуацию, когда в роли одного из компонентов смеси выступает биополимер» фермент. Однако жесткое облучение ферментов сопровождается, как правило, их необратимой инактивацией. Потери ферментативной активности могут быть существенно снижены при переходе к фотоинициируемым реакциям. Примером фотореактивных агентов являются алкил- и арила- зиды, которые, в свою очередь, могут входить в состав носителей или сшивающих агентов. При фотохимическом распаде таких соединений образуются молекулы азота и короткоживущие (0,1 —10 мс) высокореакционноспособные радикалы — нитрены:
R—№ 生 R—N ч- Н2
взаимодействующие практически с любыми группами белка с образованием прочных ковалентных связей.
Недостатки и преимущества получения и использования ковалентно иммобилизованных ферментов
При описании методов ковалентной иммобилизации после рассмотрения основных химических приемов для их иллюстрации обычно приводят конкретные практические методики. Дело в том, что объективный общий сравнительный анализ различных методов крайне затруднителен, если вообще возможен, поскольку ни одному из указанных в предыдущем разделе приемов не может быть отдано абсолютное предпочтение. Накопленный экспериментальный материал свидетельствует, например, о том, что использование одного и того же метода в качестве стандартной процедуры приводит в случае различных ферментов к резко отличающимся конечным результатам [уровню остаточной актив-
ности н (или) стабильности]. Более того, характеристики получаемых методами ковалентной иммобилизации ферментных препаратов существенным образом зависят от исходного образца фермента (в частности, от процедуры его выделения и очистки), природы носителя, чистоты используемых реагентов и т. д. Не последнее место в этом перечне занимают личный опыт н квалификация экспериментатора. В этой связи отметим, что те условия реакций, которые были указаны в предыдущем разделе, ориен- тировочны^Сороче говоря, химическая иммобилизация ферментов в целом является искусством, уровень которого определяется, в первую очередь, умением экспериментатора (уровнем его научного мышления, способностью к целенаправленному поиску оптимальных условий для реализуемого процесса). Тем не менее одну общую рекомендацию к разработке процедуры химической иммобилизации можно дать.
Напомним, что основная задача экспериментатора заключается в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании функциональных групп, не существенных для проявления его каталитической активности. Следовательно, при химической модификации фермента его активный центр желательно защищать — ковалентно или нековалентно. Для этого можно употреблять обратимые ингибиторы, субстраты, различные защитные реагенты. В ряде случаев для иммобилизации могут быть применены каталитически неактивные предшественники ферментов, зимогены, превращаемые в соответствующие ферменты после завершения стадии ковалентной фиксации.
При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для крупномасштабных процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности н дороговизны. Действительно, сегодня нельзя с достоверностью назвать нн одного промышленного процесса с ковалентно иммобилизованными ферментами ——обычно в них используются те или иные методы физической иммобилизации.
Иная ситуация сложилась в лабораторной практике, где химические методы иммобилизации занимают доминирующее положение. Без них немыслимы аффинная хроматография, нмму- ноферментный анализ, тонкий органический синтез особо чистых препаратов н многие другие процедуры. Кроме того, в химической сложности и гибкости методов ковалентной иммобилизации заложены широкие возможности создания препаратов иммобилизованных ферментов со строго определенными н контролируемыми свойствами, что особенно важно для целей медицины и высокочувствительных методов анализа (детекции)
Глава КИНЕТИЮ -
^q ТЕРМСДИНАМИЧЕСКИЕ
> I ЗАКОНОМЕРНОСТИ КАТАЛИЗА
ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ
I ФЕРМЕНТАМИ
Кинетика действия ферментов в растворе является одним из наиболее хорошо изученных разделов химической энзимологии. Кинетические закономерности катализа простыми ферментами подчиняются уравнению Михаэлиса——Ментен, предложенному еще в начале века. Кооперативные н аллостерические эффекты в катализе более сложными ферментами (в частности, олигомерными) описываются на основе модели Моно——Уаймена—— Шанже, сформулированной в 60-х годах. Хорошо разработана теория влияния на кинетику ферментативных процессов таких факторов, как pH, присутствие ингибиторов и активаторов и т. п. Несколько более сложными закономерностями характеризуется кинетика действия ферментов на высокомолекулярные, в том числе, нерастворимые субстраты (белки, ДНК и РНК, целлюлозу) .Однако н в этой обл асти достигну г очевидный прогресс.
Закрепление катализатора на носителе создает целый ряд принципиальных трудностей для описания кинетических закономерностей. Не ^случайно общая теория гетерогенного катализа до сих пор не создана. В дальнейшем изложении будет сделана попытка выявить те основные факторы, которые определяют кинетические закономерности катализа иммобилизованными ферментами, и выяснить, как изменяются каталитические характеристики иммобилизованных ферментов по сравнению с нативными ферментами в растворе.
Кинетические параметры ферментативных реакций
В простейшем случае скорость (и) катализируемой ферментом реакции анализируется в рамках уравнения Михаэлиса—— Ментен:
анат ［初。旧
° = кm …+岡。' ()
где [£]о и [S]o — концентрация фермента и субстрата в системе соответственно; 々кат — каталитическая константа ферментативной реакции; Км.ка* ——определяемое эффективное (кажущееся) значение константы Михаэлиса.
Параметр Км.ка* служит характеристикой сродства фермента к субстрату и, следовательно, является мерой той концентрации субстрата, которая необходима для насыщения фермента. При катализе иммобилизованными ферментами концентрация субстрата вблизи фермента (локальная) может отличаться от концентрации субстрата во всем объеме системы. В этом случае наблюдаемая на опыте Км,ка* должна зависеть от распределения субстрата между свободным раствором н носителем, где сосредоточен фермент. Что касается параметра ^кат, то он характеризует реакционную способность уже образовавшегося фермент—субстратного комплекса, поэтому не зависит от распределения субстрата в системе, а определяется состоянием, в первую очередь, конформацией самого фермента.
Каталитические параметры ферментативной реакции (feRaT и Хм.каж) могут зависеть от наличия в реакционной системе различных эффекторов, таких, как ингибиторы н активаторы, ионы водорода и т. п. В таких случаях необходимо учитывать распределение также этих эффекторов между раствором н фермент- содержащей матрицей.
Таким образом, все кинетические эффекты, наблюдаемые при катализе иммобилизованными ферментами, можно разделить на две группы. К первой нз них относятся эффекты, связанные с влиянием иммобилизации на состояние (конформацию) фермента, а ко второй —— эффекты^ обусловленные распределением реагентов в системе.
Влияние иммобилизации на состояние фермента
Конформационные свойства иммобилизованных ферментов. При иммобилизации существует опасность, что белок присоединится к носителю в конформации, отличной от нативной. В этом случае каталитическая активность фермента может существенно измениться или вообще исчезнуть.
Вопрос о том, произошли ли в белке конформационные изменения при иммобилизации, решается исследованием структуры иммобилизованных ферментов физическими методами. Для этой цели с успехом использовали оптические методы (спектрофотометрический, флуоресцентный), метод спиновых меток н др. Анализируя данные этих исследований, можно сделать следующие выводы.
В результате иммобилизации пространственная структура фермента может либо существенно измениться, либо измениться незначительно, либо остаться неизменной (что наблюдается чаще всего).
В тех случаях, когда конформация нативного и иммобилизо-
ванного ферментов различается, это обусловлено одной из трех причин. Во-первых, конформационные различия могут быть обусловлены химической модификацией каких-либо важных д^я структуры функциональных групп белка и не связаны с самим процессом иммобилизации фермента (т. е. его присоединением к носителю). Чтобы устранить действие этого фактора, необходимо выбрать соответствующий метод иммобилизации не затрагивающий этих функциональных групп в белке. Кроме того, часто фермент удается защитить от инактивации на стадии иммобилизации простым добавлением субстрата или другого специфического лиганда в насыщающей концентрации, что позволяет получать препараты с более высокой удельной каталитической активностью (т. е. активностью, отнесенной к 1 г носителя).
Во-вторых, причиной искажения структуры фермента могут быть неспецифические взаимодействия (электроста ти чес кие, гидрофобные, водородные связи) между ферментом и носителем, приводящие к денатурации. Чтобы избежать этих взаимодействий, иногда достаточно заменить носитель на инертный по отношению к белку. Такой инертностью обычно обладают полисахаридные носители, полиакриламид н некоторые другие. Если замена носителя по какой-либо причине нежелательна, то используют следующий методический прием: отдаляют белковые молекулы от поверхности носителя за счет увеличения длины «ножки» (сшивающего агента). При этом, как правило, удается ослабить неблагоприятное для фермента воздействие носителя.
И наконец, третьей возможной причиной различия структур нативного и иммобилизованного ферментов может быть большое число связей между ферментом и носителем.
В принципе может реализоваться такая ситуация, когда в результате иммобилизации конформация фермента практически не изменяется, но нарушается динамика конформационных изменений в белке. Так, у белков, связанных с носителями, могут замедляться необходимые для катализа конформационные переходы, уменьшаться число конформационных стадий и глубина их протекания. Причиной этого являются неспецифические взаимодействия функциональных групп белка с носителем. Чтобы избежать их, необходимо, как показывает практика, проводить иммобилизацию на инертных носителях.
Фиксация «напряженных» состояний фермента. Иногда исследователи целенаправленно стремятся «закрепить» с помощью иммобилизации конформацию фермента, отличающуюся от нативной. Это, в частности, оказывается важным для детекции конформационных изменений в ферментах, индуцированных субстратами, кофакторами н другими специфическими лигандами.
Рассмотрим, как это делается (рис. 14). Комплекс фермента с субстратом или другим специфическим лигандом, образующийся в присутствии насыщающих концентраций этого лиганда,
E*SE*E*SE*Рис. 14. Схематическое изображение фиксации с помощью иммобилизации «напряженной» конформации белкаРис. 14. Схематическое изображение фиксации с помощью иммобилизации «напряженной» конформации белка
E*SE*
E*SE*
Рис. 14. Схематическое изображение фиксации с помощью иммобилизации «напряженной» конформации белка
Рис. 14. Схематическое изображение фиксации с помощью иммобилизации «напряженной» конформации белка
сшивают бифунциональными агентами (стадия а на рис. 14) или присоединяют к предварительно активированному носителю (стадия б на рис. 14). После удаления лиганда фермент остается зафиксированным в «напряженной» конформации.
Как показали многочисленные исследования, «замороженные» конформации фермента могут отличаться от обычных, ненапряженных состояний, реализуемых в тех случаях, когда иммобилизацию проводят в отсутствие специфических лигандов, по целому ряду свойств: стабильности, доступности к действию модифицирующих агентов, сродству к субстрату и специфическим лигандам, а также каталитическим свойствам. Этот фактор необходимо учитывать, поскольку иммобилизацию фермента иногда рекомендуют проводить в присутствии специфических лигандов с целью большей сохранности ферментативной активности.
Эффекты распределения реагентов в катализе иммобилизованными ферментами
Распределение субстрата. В условиях равновесного распределения субстрата между раствором и фер ментсодержа щей матрицей км,ка*, входящая в уравнение (1), определяется следующим выражением:
Лм.каж — КмР, (2) где Км — значение константы Михаэлиса реакции, катализируемой свободным (неиммобилизованным) ферментом; Р ——коэффициент распределения субстрата, который задается формулой
⑶
где [S]p и [5]и — концентрации субстрата в растворе и в матрице носителя соответственно.
Из уравнения (1) следует, что при высоких концентрациях субстрата (15|》Км.каж) эффекты распределения не играют существенной роли, поскольку в этом случае скорость ферментативной реакции V = йкат [£], т. е. не зависит от концентрации субстрата. Если же концентрация субстрата невелика ([5]《Км,ка*), то анализ уравнений (1) — (3) показывает, что концентрирование субстрата в матрице (PV1) приводит к уменьшению значения км,ка*, т. е. к возрастанию скорости ферментативной реакции. В тех же случаях, когда Р>1, скорость ферментативной реакции падает вследствие возрастания Км.ка*.
Неравномерность распределения субстрата в системе обусловлена его взаимодействием с матрицей за счет, например, электростатических сил. водородных связей, гидрофобных взаимодействий и т. п. В случае электростатических взаимодействий установлена количественная взаимосвязь между коэффициентом распределения Р и характеристиками субстрата и матрицы:
p = eXр (一簪)， (4)
где е — единичный заряд электрона; Z — заряд субстрата, кратный заряду электрона;屮 一 электростатический потенциал носителя; k — константа Больцмана; Т — абсолютная температура.
В заключение отметим, что в случае тех ферментов, которые характеризуются низким сродством к субстрату (высокое значение Ам) или действуют на плохо растворимые субстраты (предел растворимости субстрата ниже значения Км/, выбор носителя для иммобилизации приобретает первостепенное значение. В этих случаях, подобрав носитель, для которого коэффициент Р》1, можно добиться существенного увеличения скорости ферментативной реакции [см. уравнения (1)——(3)|.
Диффузионные ограничения в катализе иммобилизованными ферментами. Если молекула фермента находится на поверхности (или внутри) частицы носителя, то для протекания ферментативной реакции необходимо, во-первых, чтобы молекула субстрата подошла к поверхности частицы, и, во-вторых, продиффундиро- вала внутрь нее. В зависимости от того, как соотносятся скорости диффузионных стадий н непосредственно ферментативной реакции, может реализоваться одна из трех нижеперечисленных ситуаций.
Если ферментативная реакция в поверхностных слоях частицы протекает быстрее, чем субстрат из раствора подходит к поверхности, то через непродолжительное время вокруг частицы образуется зона, обедненная субстратом. В результате наблюдаемая скорость ферментативной реакции будет определяться скоростью массопереноса субстрата к частице. В этом случае говорят, что процесс контролируется внешней диффузией.
Если массоперенос субстрата проходит быстрее, чем идет ферментативная реакция на поверхности частицы, то может возникнуть другой тип диффузионных затруднений. А именно, если размер частицы носителя велик, а фермент очень активен (или велика его плотность внутри частицы), то практически весь субстрат израсходуется уже в приповерхностных слоях носителя, а глубинные области будут обеднены субстратом. В таком случае говорят» что процесс контролируется внутренней диффузией. ,
И наконец, когда диффузия субстрата как к поверхностному слою, так и во внутренние области частицы проходит достаточно быстро» общая скорость превращения субстрата определяется непосредственно ферментативной реакцией. В этом случае говорят о кинетически контролируемом процессе.
Учет диффузионных факторов является одним из наиболее сложных вопросов в катализе иммобилизованными ферментами. В рамках уравнения Михаэлиса——Ментен [уравнение (1)] будет проанализировано влияние диффузионных факторов на эффективные кинетические параметры ферментативной реакции.
Внешнедиффузионное торможение. К поверхности частицы носителя примыкает неперемешиваемый слой жидкости, в пределах которого перенос молекул происходит исключительно за счет молекулярной диффузии. Поскольку молекулярная диффузия в жидкостях проходит очень медленно (с коэффициентом диффузии 10~5——10~6 см2/с), массоперенос может стать лимитирующей стадией процесса, катализируемого иммобилизованным ферментом.
Согласно первому закону Фика диффузионная скорость подачи субстрата /, отнесенная к единице площади поверхности частицы носителя, пропорциональна градиенту концентрации субстрата.. При наиболее часто распространенном случае линейного градиента концентрации
j = B[So — S], (5)
где В — коэффициент массопереноса; So и S — концентрации субстрата в растворе и в частице с иммобилизованным ферментом соответственно.
При достижении стационарного состояния в системе, т. е. когда скорость диффузионного потока субстрата равна скорости его расходования в ферментативной реакции, справедливо следующее уравнение:
B[S。一习=訳需， ⑹
где буквенные символы обозначают те же параметры системы, что и в уравнениях (1) — (5).
Проанализируем частные случаи уравнения (6). В условиях насыщения фермента субстратом (Км.ка*《[5]) кинетика ферментативной реакции описывается нулевым порядком по кои-
цеитрации субстрата и ферментативный процесс не может лимитироваться диффузией, т. е. всегда протекает в кинетическом режиме.
В случае, когда Км.ка*》[5], т. е. когда кинетика ферментативной реакции подчиняется уравнению первого порядка, имеем следующее выражение для стационарной скорости ферментативной реакции:
и — Км.ка*!1■(7)
Р々кат[司 / Км, каж
Анализ выражения (7) показывает, что возможны два крайних случая. Если р》左кат[£*]/Км. каж, т. е. массоперенос осуществляется намного быстрее, чем идет ферментативная реакция, то с = ?吁」二[So]. В этом случае реакция проходит в киЛМ. каж
нетическом режиме. Если же ферментативная реакция идет намного быстрее массопереноса, т. е. р с feKaT [ £] /Км, каж, то с = = P[S] и ферментативный процесс протекает в диффузионном режиме.
В общем случае, когда Км, ка* 〜[S], т. е. кинетика ферментативной реакции характеризуется дробным порядком по субстрату, несмотря иа существенно более громоздкие выражения, по-прежнему справедлив вывод о двух режимах протекания ферментативного процесса — кинетическом и диффузионном.
Можно ли решить заранее, в каком режиме, кинетическом или диффузионном, будет протекать ферментативная реакция? Для этого прежде всего необходимо оценить параметр р. Сравнив его со значением 々кат[£*]/Км,ка*, можно, в принципе, сделать вывод о режиме (кинетическом или диффузионном) протекания ферментативной реакции [см. уравнение (6)].
Этот путь, однако, дает слишком приближенные оценки, поэтому им относительно редко пользуются на практике. Чаще используют экспериментальные критерии. Рассмотрим основные из них.
Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Как уже отмечалось, в условиях насыщения иммобилизованного фермента субстратом, т. е. при достаточно высоких его концентрациях, ферментативный процесс, в принципе, не может контролироваться диффузией субстрата, и, следовательно, реакция протекает в кинетической области. Однако по мере уменьшения концентрации субстрата повышается вероятность перехода реакционной системы в диффузионную область. Поэтому по экспериментальной зависимости с от S в координатах Лайнуивера —— Берка (рис. 15) наблюдается четко выраженный излом: при концентрациях субстрата выше значения в точке излома (т. е. при низких значениях 1 /[ 5]) реакция проходит в кинетическом режиме —— прямая /, а при низких концентрациях субстрата (высоких значениях 1/[S]) в диффузионном режиме——прямая 2. Таким
Рис. 15. Гипотетическая зависимость скорости реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом, от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера—Берка, осложненная внешнеднффузионными ограничениямиРис. 15. Гипотетическая зависимость скорости реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом, от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера—Берка, осложненная внешнеднффузионными ограничениямиобразом, если для иммобилизованного фермента в координатах Лайнуивера — Берка получена зависимость, аналогичная представленной на рис. 15, это является существенным указанием на то, что диффузия играет в процессе важную роль.
Рис. 15. Гипотетическая зависимость скорости реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом, от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера—Берка, осложненная внешнеднффузионными ограничениями
Рис. 15. Гипотетическая зависимость скорости реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом, от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера—Берка, осложненная внешнеднффузионными ограничениями
Температурные зависимости. Ферментативные реакции характеризуются обычно энергиями активации порядка 40— 120 кДж/моль. В то же время скорость процессов, протекающих в диффузионной области, должна слабо зависеть от
температуры； поскольку единственный чувствительный к температуре параметр D характеризуется энергией активации порядка 15—20 кДж/моль. Следовательно, слабая зависимость скорости реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом^ от температуры может
служить указанием на то, что процесс протекает в диффузионном режиме. Однако с повышением температуры реакция может переходить из кинетической области в диффузионную^ поскольку Р н М/Км в уравнении (7) по-разному зависят от температуры.
Зависимость скорости реакции от удельной концентрации иммобилизованного фермента (количества активного фермента на 1 г носителя). Как видно из анализа уравнения (7), скорость реакции в диффузионной области не должна изменяться при возрастании удельной концентрации иммобилизованного фермента. Кроме того, скорость диффузионно-контролируемых реакций не должна также зависеть от таких факторов, как изменение pH, ионной силы, добавление ингибиторов и активаторов, которые оказывают специфическое влияние исключительно на ферментативные стадии (что легко проследить в случае нативного фермента). Следует, однако, учитывать, что для одного и того же препарата иммобилизованного фермента реакция со специфическим (высокореакционноспособным) субстратом может быть диффузионно контро лируемой, а с неспецифическим субстратом (менее реакционноспособным) протекать в кинетической области.
Зависимость скорости реакции от степени измельчения частиц с иммобилизованным ферментом. Скорость реакции в кинетической области не
должна зависеть от степени измельчения частиц, содержащих катализатор (если, конечно, нет внутридиффузионных затруднений для субстрата, см. ниже). С другой стороны, скорость диффузионно-контролируемых реакций будет возрастать по мере уменьшения размера частиц с иммобилизованным ферментом, поскольку такое уменьшение приводит к увеличению диффузионного параметра В в уравнении (7).
Зависимость от скорости перемешивания. Влияние диффузионных факторов ослабляется по мере ускорения массопереноса путем более интенсивного перемешивания. Этот вывод становится особенно очевидным, если встать на позиции представлений о неперемешиваемом слое (слое Нернста) как о физической реальности, для которой применим первый закон Фика. Из гидродинамики следует, что толщина неперемеши- ваемого слоя уменьшается при увеличении скорости потока жидкости вокруг частицы. Таким образом, зависимость наблюдаемой скорости ферментативной реакции от скорости перемешивания или скорости протока субстрата указывает на существенную роль диффузии в процессе. Увеличение скорости протока субстрата через колоночный реактор н повышение числа оборотов мешалки в реакторе перемешивания должно ослабить диффузионные ограничения. Существенное ускорение перемешивания может, в принципе, перевести реакцию из диффузионной области в кинетическую.
Внутридиффузионное торможение. Реакция, катализируемая ферментом, иммобилизованным внутри частицы (например, включенным в полимерный гель), может оказаться чувствительной к торможению за счет внутренней диффузии. Иными словами, скорость ферментативной реакции может лимитироваться скоростью проникновения субстрата внутрь частицы. Внутридиффузионное торможение ферментативных реакций зависит от формы частицы с иммобилизованным ферментом.
Рассмотрим следующую модель. Имеется плоская мембрана толщиной /, содержащая иммобилизованный фермент с концентрацией в мембране [£]. Мембрана погружена в раствор субстрата, концентрация которого равна [S]. Коэффициент распределения субстрата между раствором н мембраной равен Р. Требуется найти зависимость между скоростью появления продукта в растворе и кинетическими параметрами (feKaT и Км**) ферментативной реакции.
В соответствии со вторым законом Фика скорость диффузии субстрата в мембрану (в направлении х, перпендикулярном ее поверхности — см. рис. 16) равна。-^^-, Где。— коэффициент диффузии субстрата. В стационарном состоянии системы скорости ферментативной реакции, задаваемой уравнением Михаэлиса——Ментен [уравнение (1)], н диффузии субстрата равны. Этому условию соответствует следующее равенство:
О —[S] __ —ат[Е] [5]о /X)
工户—1 Км.каж+[5]о
Рис. 16. Схематическое изображение диффузии субстрата в плоскую мембрану толщиной IПрямая / описывает распределение субстрата в начальный момент времени (2 = 0)； прямвя 2—равновесное распределение субстрата в отсутствие ферментативной реакции в мембране: кривая 3 — распределение субстрата при наличии ферментативного процессаРис. 16. Схематическое изображение диффузии субстрата в плоскую мембрану толщиной IПрямая / описывает распределение субстрата в начальный момент времени (2 = 0)； прямвя 2—равновесное распределение субстрата в отсутствие ферментативной реакции в мембране: кривая 3 — распределение субстрата при наличии ферментативного процессав мембране после установления ционарного состоянияв мембране после установления ционарного состояниядующий вид:С =鼠 ат[Е],дующий вид:С =鼠 ат[Е],(9)(9)а выражение (10) отличается от обычного уравнения Михаэлиса —— отсутствие внутридиффузионныха выражение (10) отличается от обычного уравнения Михаэлиса —— отсутствие внутридиффузионныхз. [S]o ~ Км, каж жение:з. [S]o ~ Км, каж жение:^кат[£1 [5]ок 號露к+М '^кат[£1 [5]ок 號露к+М '(11)(11)皿疗曦=~^^皿疗曦=~^^
Рис. 16. Схематическое изображение диффузии субстрата в плоскую мембрану толщиной I
Прямая / описывает распределение субстрата в начальный момент времени (2 = 0)； прямвя 2—равновесное распределение субстрата в отсутствие ферментативной реакции в мембране: кривая 3 — распределение субстрата при наличии ферментативного процесса
Рис. 16. Схематическое изображение диффузии субстрата в плоскую мембрану толщиной I
Прямая / описывает распределение субстрата в начальный момент времени (2 = 0)； прямвя 2—равновесное распределение субстрата в отсутствие ферментативной реакции в мембране: кривая 3 — распределение субстрата при наличии ферментативного процесса
в мембране после установления ционарного состояния
в мембране после установления ционарного состояния
дующий вид:
С =鼠 ат[Е],
дующий вид:
С =鼠 ат[Е],
(9)
(9)
а выражение (10) отличается от обычного уравнения Михаэлиса —— отсутствие внутридиффузионных
а выражение (10) отличается от обычного уравнения Михаэлиса —— отсутствие внутридиффузионных
з. [S]o ~ Км, каж жение:
з. [S]o ~ Км, каж жение:
^кат[£1 [5]о
к 號露к+М '
^кат[£1 [5]о
к 號露к+М '
(11)
(11)
皿疗曦=~^^
皿疗曦=~^^
При анализе уравнения (8) возможны три частных случая.
[S]o》Km. каж・ Тогда выражение скорости ферментативной реакции, отнесенной к единице объема матрицы (и), примет сле-
Очевидно, что в этом случае диффузия не влияет на скорость ферментативной реакции.
[S]o《^м.кaж- Тогда справедливо выражение
△кат[司[5]о 2 cosha/—1 и = —jr-т—：— , (1U)
Км, кажsin
где а =俨s'z，/ — толщина
*\М. на*。
мембраны.
Видно, что вклад диффузии учитывается фактором 尸
尸—2 cos ha/ — I a/ sinha/ '
ввМентен, справедливого一
в
в
ограничений, лишь множителем F, который называют фактором
эффективности и который отражает влияние внутридиффузионных ограничений на ферментативный процесс. На рис. 17 приведена зависимость F от а厶 При аЕ《1 F отличается от единицы не более чем на 10%, т. е. влиянием диффузии на кинетику ферментативной реакции можно пренебречь. Прн а/>1 尸 заметно меньше единицы. Иными словами, отличие а/ от единицы может служить критерием влияния диффузии на скорость реакции, катализируемой иммобилизованным ферментом.
.В этих условиях получаем следующее выра-
Таким образом, роль внутридиффузионных ограничений в кинетике реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами, сводится к увеличению кажущейся константы Михаэлиса.
При выводе уравнений для рассмотренных систем делалось допущение, что частицы носителя с и м мобилизов а иным ферментом представляют собой плоские мембраны. Однако в общем случае форма частиц может быть иной ——сферической, цилиндрической, неправильной. Решение задачи в случае частиц носителя произвольной формы приводит к следующему выражению для наблюда- 106
Рис. 17. Вид зависимости 巾актора эффективности (F) ферментативной реакции от а/: а ——параметр, определяемый кинетическими и диффузионными характеристиками системы с иммобилизованным ферментом; I — толщина мембраныРис. 17. Вид зависимости 巾актора эффективности (F) ферментативной реакции от а/: а ——параметр, определяемый кинетическими и диффузионными характеристиками системы с иммобилизованным ферментом; I — толщина мембраныV = 2РСо )/ 飽囱 D .V = 2РСо )/ 飽囱 D .(12)(12)
Рис. 17. Вид зависимости 巾актора эффективности (F) ферментативной реакции от а/: а ——параметр, определяемый кинетическими и диффузионными характеристиками системы с иммобилизованным ферментом; I — толщина мембраны
Рис. 17. Вид зависимости 巾актора эффективности (F) ферментативной реакции от а/: а ——параметр, определяемый кинетическими и диффузионными характеристиками системы с иммобилизованным ферментом; I — толщина мембраны
V = 2РСо )/ 飽囱 D .
V = 2РСо )/ 飽囱 D .
(12)
(12)
емок скорости ферментативной реакции, контролируемой диффузией: Унабл- = П。，「"В С — скорость реакции в отсутствие диффузионных ограничений; п — фактор эффективности, который зависит от параметра 0, называемого модулем Тиле. Хотя конкретный вид функции п (Ф) зависит от формы частицы и по
рядка реакции по субстрату, но очень часто описывается кривой, аналогичной виду зависимости F от а/ (рис. 17). Таким образом параметр
а/, характеризующий внутреннюю диффузию в плоской мембране, является частным случаем модуля Тнле. Для оценки роли внутренней диффузии в конкретной системе с иммобилизованным ферментом в принципе необходимо вычислить модуль Тиле Ф и, основываясь на рис. 17, сравнить соответствующее значение п с еди
ницей.
Способы различия внутридиффузионных 〃 внешнедиффузионных ограничений. Существует два основных экспериментальных
критерия, по которым можно определить, протекает ли реакция, катализируемая иммобилизованным ферментом, во внутридиффу- зионном или внешнедиффузионном режиме. Они основаны на различной чувствительности кинетических параметров ферментативных процессов, контролируемых внешней и внутренней диффузией субстрата, к действию специфических лигандов и температуры.
Для внутридиффузионно-контролируемых реакций при очень больших значениях а/, когда F《1, т. е. ферментативная реакция существенно замедлена диффузией, имеем Км, каж》[S]o. В этом случае для общей скорости ферментативной реакции, отнесенной к объему носителя, справедливо выражение
Видно, что скорость реакции пропорциональна квадратному корню из концентрации фермента н его активности (feKaT). Эта ситуация существенно отличается от случая внешнедиффузионных ограничений, когда скорость реакции в диффузионной области не зависит от каталитических свойств фермента. В частности, ферментативные реакции, контролируемые внутренней диффузией, «чувствуют* эффекты ингибирования, pH-зависимость активности и т. п.
Как было отмечено выше, температурные зависимости реакций,
контролируемых внешнедиффузионными ограничениями, целиком определяются чувствительностью к температуре коэффициента диффузии D (энергии активации порядка 15——20 кДж/моль). Иная ситуация реализуется для процессов, контролируемых внут- ридиффузионными ограничениями. Здесь кажущееся значение энергии активации зависит от температурного хода как кинетического (/^ТК'^ЙТ и диффузионного параметров, так и коэффициента распределения Р субстрата между раствором и фазой носителя [уравнение (12)] и, как правило, характеризуется более высокими численными значениями (больше 40 кДж/моль).
Стерические ограничения в катализе иммобилизованными ферментами. Пространственная сетка матрицы, в которой иммобилизован фермент, может препятствовать продвижению молекул субстрата, например, в силу чисто механических причин. В результате активные центры части ферментных молекул оказываются недоступными для субстрата. Фактически это означает снижение концентрации активного фермента и приводит к уменьшению наблюдаемой скорости ферментативной реакции. Следовательно, хотя истинные каталитические параметры и не изменились, фермент не может полностью проявить свою потенциальную активность. =
Уменьшение каталитической активности фермента за счет стерических факторов проявляется особенно часто в случае высокомолекулярных субстратов. Поэтому при создании биокатализаторов, действующих на белки, нуклеиновые кислоты н другие природные биополимеры, предпочтительнее иммобилизовать ферменты на водорастворимых носителях с небольшой молекулярной массой. Стерические ограничения иногда удается уменьшить или даже полностью устранить путем деградации носителей под действием химических реагентов (мягкой обработкой окислителями, кислотами и т. п.) или специальными ферментами (декстраназой, целлюлазой и др.). При этом важно, чтобы такая обработка не затронула первичную структуру и не нарушила пространственную организацию ферментов, пришитых к носителю.
pH-Эффекты в катализе иммобилизованными ферментами. Из ферментативной кинетики хорошо известно, что скорости реакций с участием ферментов в гомогенном растворе сильно зависят от значения pH. Это обусловлено тем, что в катализе участвуют функциональные группы белка, способные протонироваться или депротониров аться в зависимости от pH в растворе, а реакционноспособной является, как правило, только одна из форм.
В принципе pH-эффекты в катализе иммобилизованными ферментами описываются теми же закономерностями, которые были рассмотрены при анализе распределения субстрата. Однако ионы Н+ н ОН~ относятся к числу наиболее общих эффекторов ферментативной активности, поэтому вопрос о влиянии их распределения и диффузии на кинетику действия гетерогенных биокатализаторов необходимо рассмотреть отдельно.
Распределение протонов. В качестве примера рассмотрим
Рис. 18. Гипотетические рН-завйсимости каталитической активности свободного (неиммобилизован- ного) фермента (кривая 2), иммобилизованного на поликатионном (кривая /), полианионном (кривая 3) носителях.
фермент, иммобилизованный на полиэлектролитиом носителе. Пусть для определенности оптимум действия фермента в гомогенном растворе наблюдается при pH 8, а кривая зависимости активности от pH имеет колоколообразный вид (кривая 2 на рис. 18). Если для работы с иммобилизованным ферментом значение pH во внешнем растворе выбрать равным 8, то из-за эффекта распределения протонов внутри полиэлектролитной матрицы оно будет другим. Так, если фермент иммобилизован на полианионном носителе, то внутри него концентрация протонов выше, чем во внешнем растворе (сдвиг в сторону более кислых значений pH); обратная картина имеет место в случае пол и катионного носителя. Это приведет к тому, что фермент, иммобилизованный как на поликатион- ном (кривая / на рис. 18), так и на полианионном (кривая 3 на рис. 18) носителе, будет работать не с полной эффективностью, хотя значение pH во внешнем растворе соответствуюет оптимуму его каталитической активности.
Подобные изменения pH-зависимости ферментативной активности часто наблюдаются в реальных системах. Они целиком обу~ словлены присутствием на полиэлектролитиом носителе заряженных групп. Добавление в систему с.иммобилизованным ферментом высококонцентрированных растворов солей или буферных систем вызывает экранирование зарядов групп носителя и, следовательно, уменьшение сдвигов рН-оптимумов активности. Иными словами, сдвиг pH-зависимостей активности иммобилизованных ферментов, обусловленный распределением протонов, наблюдается только в разбавленных буферных растворах с низкой ионной сн~ лой. С другой стороны, зависимость сдвига pH-оптимума активности от ионной силы служит серьезным указанием на то, что распределение протонов между раствором и носителем играет
важную роль в катализе иммобилизованным препаратом фермента.
Ограничение диффузии протонов. Полимерный носитель, на котором иммобилизован фермент, может препятствовать свободной диффузии протонов внутри частицы носителя. Это связано с тем, что внутри частицы носителя существенно заторможена диффузия протонов по механизму, характерному для гомогенного раствора. Поскольку концентрация протонов в системе обычно мала (10~7 моль/л или ниже)» то даже небольшой избыток (или, наоборот, дефицит), обусловленный торможением диффузии, может вызвать заметное изменение pH внутри частицы. Это, в свою очередь, приведет к существенному изменению рН- зависимости каталитической активности, особенно для тех ферментативных реакций, в которых протоны являются субстратом или продуктом (как, например, при действии гидролаз, дегидрогеназ, киназ и некоторых других ферментов).
Пусть, например, фермент, иммобилизованный на носителе, катализирует реакцию, сопровождающуюся образованием протонов, в отсутствие буферного раствора. После начала реакции в матрице начинают накапливаться протоны, что приводит к появлению градиента концентрации протонов н последующей их диффузии из частицы во внешний раствор. Однако если диффузия заторможена, то протоны накапливаются внутри частицы и вызывают уменьшение pH в микроокружении фермента. Это, в свою очередь, влияет на скорость ферментативной реакции, а значит, и на скорость выделения протонов — продукта рермента- тивной реакции. Если pH внутри частицы до начала реакции выше pH-оптимума фермента, то образующиеся в ходе реакции протоны снижают pH, повышая тем самым скорость ферментативной реакции, т. е. скорость выделения протонов. В результате значение pH частицы уменьшается еще сильнее, а скорость ферментативной реакции еще больше возрастает. Иными словами, в такой системе будет наблюдаться явление автокатализа. Окончательно стационарное состояние будет достигнуто только тогда, когда значительное повышение концентрации протонов будет оказывать лишь незначительное влияние на скорость ферментативной реакции.
Если значение pH начала реакции ниже pH-оптимума активности, то по мере выделения протонов в ходе ферментативной реакции pH уменьшается еще сильнее и реакция замедляется. На графике pH-зависимости относительной ферментативной активности (рис. 19) это отразится следующим образом: ветви кривой, соответствующие низким значениям pH для иммобилизованного н нативного ферментов, практически совпадут, а «щелочная» ветвь кривой (выше pH-оптимума активности) в случае иммобилизованного фермента существенно расширится (сравни
кривые / и 2), причем до такой степени, что может превратиться ь плато (кривая 3)・ В предельном случае, когда иммобилизованный фермент работает при pH ниже значения pH оптимальной активности, рН-за- висимость активности может трансформироваться к виду (кривая 4), т. е. с достижением плато. Чем существеннее диффузионные ограничения протонов в носителе и чем выше активность иммобилизованного фермента, тем ниже будет высота плато на кривой 4. Если в ходе реакции происходит поглощение протонов, то будут наблюдаться обратные явления.
Таким образом, если в эксперименте наблюдаются pH-зависимости активности, аналогичные тем, что приведены на рис. 19, то это ука-
рНрНРис. 19. Изменение pH-профилей активности иммобилизованного фермента в результате ограничения диффузии протоновРис. 19. Изменение pH-профилей активности иммобилизованного фермента в результате ограничения диффузии протоновв частицах носителя.Кривая / ——свободный (неиммобилизован- ный) фермент в растворе; кривая 2 —иммобилизованный фермент при слабых ограничениях в диффузии протонов; кривые 3 и 4 — иммобилизованный фермент по мере усиления ограничений в диффузии протоновв частицах носителя.Кривая / ——свободный (неиммобилизован- ный) фермент в растворе; кривая 2 —иммобилизованный фермент при слабых ограничениях в диффузии протонов; кривые 3 и 4 — иммобилизованный фермент по мере усиления ограничений в диффузии протоновзывает на ограничения диффузии протонов в системе с иммобилизованным ферментом.
рН
рН
Рис. 19. Изменение pH-профилей активности иммобилизованного фермента в результате ограничения диффузии протонов
Рис. 19. Изменение pH-профилей активности иммобилизованного фермента в результате ограничения диффузии протонов
в частицах носителя.
Кривая / ——свободный (неиммобилизован- ный) фермент в растворе; кривая 2 —иммобилизованный фермент при слабых ограничениях в диффузии протонов; кривые 3 и 4 — иммобилизованный фермент по мере усиления ограничений в диффузии протонов
в частицах носителя.
Кривая / ——свободный (неиммобилизован- ный) фермент в растворе; кривая 2 —иммобилизованный фермент при слабых ограничениях в диффузии протонов; кривые 3 и 4 — иммобилизованный фермент по мере усиления ограничений в диффузии протонов
Рис. 20. Схематическое изображение процесса переноса протонов компонентами буферного раствора в системе с иммобилизованным ферментомРис. 20. Схематическое изображение процесса переноса протонов компонентами буферного раствора в системе с иммобилизованным ферментомУскорение диффузии протонов в присутствии буферных растворов. Если система с иммобилизованным ферментом (подобная той, что была описана в конце предыдущего раздела)
Рис. 20. Схематическое изображение процесса переноса протонов компонентами буферного раствора в системе с иммобилизованным ферментом
Рис. 20. Схематическое изображение процесса переноса протонов компонентами буферного раствора в системе с иммобилизованным ферментом
Рис. 21. Влияние буферной системы, ускоряющей перенос протонов в системе с иммобилизованным ферментом, на вид pH-за виси мости его каталитической активностиКривая / —свободный (неиммобилизованный) фермент в растворе; кривая 2 — иммобилизованный фермент при значительных ограничениях в диффузии протонов: кривые 3 н 4 ——иммобилизованный фермент по мере снятия ограничений в диффузии протоиов увеличивающимися концентрациями буферного раствораРис. 21. Влияние буферной системы, ускоряющей перенос протонов в системе с иммобилизованным ферментом, на вид pH-за виси мости его каталитической активностиКривая / —свободный (неиммобилизованный) фермент в растворе; кривая 2 — иммобилизованный фермент при значительных ограничениях в диффузии протонов: кривые 3 н 4 ——иммобилизованный фермент по мере снятия ограничений в диффузии протоиов увеличивающимися концентрациями буферного раствораработает в присутствии компонентов буферного раствора, то они, связывая образующиеся в ходе реакции протоны, могут переносить их, удалять из микроокружения фермента. Обусловлено это тем, что на границе раздела частица носителя/ /раствор создается градиент концентрации протонированной формы основной компоненты буферного раствора (ВН+). Это приведет к диффузии формы ВН+ в свободный раствор, где за счет более высокого значения pH она продиссоци- ирует с высвобождением свободной формы В, которая, в свою очередь, будет диффундировать по градиенту коицент- рации в частицу носителя (см. рис. 20). В системе, где свободная диффузия протонов сильно ограничена (кривая 2 на рис. 21), добавление буферного раствора может привести к смещению плато в сторону более высоких значений актив
Рис. 21. Влияние буферной системы, ускоряющей перенос протонов в системе с иммобилизованным ферментом, на вид pH-за виси мости его каталитической активности
Кривая / —свободный (неиммобилизованный) фермент в растворе; кривая 2 — иммобилизованный фермент при значительных ограничениях в диффузии протонов: кривые 3 н 4 ——иммобилизованный фермент по мере снятия ограничений в диффузии протоиов увеличивающимися концентрациями буферного раствора
Рис. 21. Влияние буферной системы, ускоряющей перенос протонов в системе с иммобилизованным ферментом, на вид pH-за виси мости его каталитической активности
Кривая / —свободный (неиммобилизованный) фермент в растворе; кривая 2 — иммобилизованный фермент при значительных ограничениях в диффузии протонов: кривые 3 н 4 ——иммобилизованный фермент по мере снятия ограничений в диффузии протоиов увеличивающимися концентрациями буферного раствора
ности и к появлению S-образного характера у «кислой»
ветви pH-зависимости (см. кривые 3, 4 на рис. 21).
Таким образом, добавление буферных растворов в систему с иммобилизованным ферментом может «снимать» ограничения в диффузии протонов н приводить к увеличению ферментативной активности в области некоторых значений pH.
Сочетание эффектов распределения и диффузии протонов. Если в системе с иммобилизованным ферментом одновременно имеют место эффекты распределения протонов и ограничения их диффузии, то заранее трудно предсказать вид рН-зависи- мости активности. Оба этих фактора могут действовать взаимосогласованно: либо как синергисты (т. е. усиливать друг друга), либо как антагонисты (ослаблять действие друг друга). Возможно несколько различных вариантов: фермент иммобилизован на полианионном, поликатионном или нейтральном носителе,
н катализируемая им реакция протекает с выделением или поглощением протонов, либо вообще не сопровождается изменением их концентрации. Здесь не будут рассмотрены все эти возможные варианты. Отметим, что только для фермента, иммобилизованного на электронейтральном носителе н катал изи рую те го процесс.
не сопровождающийся изменением концентрации протонов, не должно наблюдаться изменений pH-зависимости активности. Но даже в такой системе вид кривой зависимости активности фермента от pH может измениться, если лимитирующей стадией реакции является диффузия субстрата.
Эффекты ингибирования и активации в катализе иммобилизованными ферментами. Полимерный носитель может вносить свою специфику и в действие таких регуляторов ферментативной активности, как ингибиторы и активаторы.
Низкомолекулярные ингибиторы и активаторы. Влияние низкомолекулярного ингибитора на фермент определяется, в основном, распределением молекул ингибитора между фазой носителя и раствором. Диффузионные ограничения, как правило, не изменяют характер ингибирования фермента после достижения стационарного состояния.
Наиболее прост для анализа тот случай, когда носитель не накладывает ограничения на диффузию субстрата и характер ингибирования целиком определяется распределением субстрата н ингибитора между матрицей и раствором. Если ингибитор и полимерный носитель одноименно заряжены, то степень ингибирования снижается (по сравнению с ситуацией в гомогенном растворе), а если они несут на себе заряды противоположного знака, то степень ингибирования возрастает. Если в последнем случае субстрат имеет одинаковый заряд с носителем, то степень ингибирования еще более увеличивается. В данном изложении не будут рассмотрены конкретные примеры: случаи конкурентного н неконкурентного ингибирования, ингибирования продуктом реакции н т. п. Читатель может это проделать сам в качестве упражнения н вывести соответствующие математические выражения. Анализ этих систем показывает, что во всех случаях кинетика действия иммобилизованных ферментов, осложненная ингибированием, описывается уравнением Михаэлиса —Ментен.
Несколько более сложную задачу представляет описание ингибирования при наличии диффузионных ограничений для субстрата. Можно показать, что при очень сильном ограничении диффузии субстрата иммобилизованный фермент может вообще не реагировать на добавление ингибитора, н скорость реакции определяется скоростью диффузии субстрата. При достаточно высоких концентрацих субстрата процесс может перейти в кинетическую область н присутствие ингибитора становится заметным. Если же диффузия субстрата ограничена незначительно, то ингибитор будет подавлять активность иммобилизованного фермента. В промежуточных случаях степень ингибирования фермента постепенно снижается по мере того, как повышается уровень ограничений в диффузии субстрата.
Высокомолекулярные ингибиторы. Активность некоторых ферментов ，几 vivo, в первую очередь протеаз, регулируется ингибиторами белковой природы с молекулярными массами
около 10 000 и выше. Естественно, их действие на иммобилизованные ферменты может осложняться как диффузионными ограничениями, так н стерическими затруднениями. Оба этих эффекта будут препятствовать контакту молекулы ингибитора с ферментом и тем самым уменьшать эффективность ингибирования.
Ингибирование продуктом реакции. Все рассмотренные соображения справедливы н для этого частного случая ингибирования. Однако при ограничении диффузии продукта не может быть справедливым допущение о равномерном распределении ингибитора в фазах свободного раствора и носителя. Проанализируем, к каким кинетическим последствиям может привести этот фактор. ，
Во-первых, концентрация продукта-ингибитора в микроокружении фермента должна быть существенно выше, чем в свободном растворе. Следовательно, иммобилизованный фермент может заметно ингибироваться даже тогда, когда концентрация продукта во внешнем растворе мала. Во-вторых, в случае внутри- диффузионных ограничений продукта концентрация субстрата будет убывать по направлению к центру частицы, а концентрация продукта будет увеличиваться в том же направлении. Иными словами, степень ингибирования иммобилизованного фермента, находящегося в глубине частицы носителя, будет существенно выше, чем на границе раздела с внешним раствором.
В зависимости от того, по какому- механизму происходит ингибирование продуктом, изменяется потенциально достижимое значение максимальной скорости ферментативной реакции V. Если продукт ——конкурентный ингибитор, то при высоких концентрациях субстрата удается преодолеть н ограничение диффузии, н ингибирование продуктом (т. е. достичь значения V в отсутствие ингибирования). В случае неконкурентного ингибирования продуктом оптимальное значение скорости реакции (в условиях насыщения фермента субстратом) никогда не достигнет значения V. Чем эффективнее носитель препятствует свободной диффузии, тем более существенные различия в этих значениях будут наблюдаться.
Резюмируя, можно сказать, что диффузионные ограничения играют роль своеобразного кинетического буфера по отношению к экзогенному эффектору (ингибитору или активатору).
Гистерезисные и колебательные явления в катализе иммобилизованными ферментами. Диффузные ограничения в катализе иммобилизованными ферментами могут приводить к принципиально новым явлениям, не наблюдаемым ранее для ферментов в гомогенных растворах. Это гистерезисные и колебательные процессы, обнаруженные Д. Тома с сотрудниками в начале 70-х годов. Причины возникновения этих необычных явлений удобно проследить на одном частном примере — ингибировании фермента субстратом.
Зависимость ферментативной активности от концентрации
субстрата определяется двумя взаимосвязанными факторами: степенью диффузионных ограничений субстрата и его концентрацией в свободном растворе. При этом- чем выше концентрация субстрата и чем ниже исходная активность фермента, тем больше вероятность, что ферментативная реакция будет протекать в кинетическом режиме. Поэтому по
нятно, что увеличение концентрации субстрата, сопровождаемое снижением ферментативной активности (за счет ингибирования фермента) , может вызвать резкий переход реакции из диффузионного режима в кинетический.
Рассмотрим этот вывод подробнее. Согласно первому закону Фика скорость переноса субстрата к фер
Рис. 22. Влияние ограничения диффузии субстрата на кинетику действия иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом: прямые /, 2 и 3 — зависимости скорости диффузии субстрата к ферменту от [S]o； кривая 4 — зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие диффузионных ограничений; точки (Л, В, С, D、Е) — стационарные состояния, когда скорость диффузии субстрата к ферменту равна скорости реакции для иммобилизованного ферментаРис. 22. Влияние ограничения диффузии субстрата на кинетику действия иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом: прямые /, 2 и 3 — зависимости скорости диффузии субстрата к ферменту от [S]o； кривая 4 — зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие диффузионных ограничений; точки (Л, В, С, D、Е) — стационарные состояния, когда скорость диффузии субстрата к ферменту равна скорости реакции для иммобилизованного ферментаменту прямо пропорциональна концентрации субстрата у поверхности носителя. Катализируемая иммобилизованным ферментом реакция достигает стационарного со-
Рис. 22. Влияние ограничения диффузии субстрата на кинетику действия иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом: прямые /, 2 и 3 — зависимости скорости диффузии субстрата к ферменту от [S]o； кривая 4 — зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие диффузионных ограничений; точки (Л, В, С, D、Е) — стационарные состояния, когда скорость диффузии субстрата к ферменту равна скорости реакции для иммобилизованного фермента
Рис. 22. Влияние ограничения диффузии субстрата на кинетику действия иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом: прямые /, 2 и 3 — зависимости скорости диффузии субстрата к ферменту от [S]o； кривая 4 — зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие диффузионных ограничений; точки (Л, В, С, D、Е) — стационарные состояния, когда скорость диффузии субстрата к ферменту равна скорости реакции для иммобилизованного фермента
стояния, когда скорость переноса субстрата к ферменту становится равной скорости его ферментативной трансформации. На рис. 22 стационарные состояния задаются точками пересечения кривой зависимости ферментативной активности от концентрации субстрата с прямой скорости диффузии субстрата к ферменту. При высоких скоростях диффузии, т. е. незначительных диффузионных ограничениях (прямая /), так н при низких скоростях диффузии, т. е. весьма больших диффузионных ограничениях (прямая 3), на рис. 22 наблюдается лишь одна точка пересечения — одно стационарное состояние. При промежуточных скоростях диффузии (прямая 2) имеется три точки Пересе-
чения, т. е. допустимы три различных стационарных состояния. Если построить график зависимости реальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата, то при высоких и низких значениях ксшцентрации субстрата возможно только одно стационарное состояние, а при промежуточных значениях — три состояния: А, В и С. Таким образом, получаем гистерезисную
Рис. 23. Гистерезисная зависимость реальной скорости реакции для иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом, при диффузионных ограничениях субстрата от его концентрации; стрел - ки — обозначено направление изменения концентрации субстрата [S]o в системеРис. 23. Гистерезисная зависимость реальной скорости реакции для иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом, при диффузионных ограничениях субстрата от его концентрации; стрел - ки — обозначено направление изменения концентрации субстрата [S]o в системекривую (рис. 23). Она означает, что скорость ферментативной реакции определяется не только концентрацией субстрата во внешнем растворе, но н зависит от направления изменения концентрации субстрата. Так, при повышении концентрации субстрата во внешнем растворе скорость ферментативной реакции увеличивается. Однако при дости жен ии некоторой критической концентрации субстрата система переходит из диффузионной области в кинетическую и скорость реакции существенно падает (рис. 23). При понижении концен
Рис. 23. Гистерезисная зависимость реальной скорости реакции для иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом, при диффузионных ограничениях субстрата от его концентрации; стрел - ки — обозначено направление изменения концентрации субстрата [S]o в системе
Рис. 23. Гистерезисная зависимость реальной скорости реакции для иммобилизованного фермента, подверженного ингибированию субстратом, при диффузионных ограничениях субстрата от его концентрации; стрел - ки — обозначено направление изменения концентрации субстрата [S]o в системе
трации субстрата скорость реакции остается низкой до тех пор пока не произойдет обратный переход из кинетической области в диффузионную. При дальнейшем уменьшении концентрации субстрата скорость ферментативной реакции снова нач
нет падать.
Причины того же характера приводят к появлению внутри- мембранных колебательных процессов. В качестве одного из примеров приведем катализируемый папаином, иммобилизованным в искусственной мембране, гидролиз этилового эфира N-бензоил-Ь-аргинина. Один из продуктов ферментативной реакции —аминокислота, накапливается в мембране (за счет ограничения диффузии) и тем самым сдвигает pH внутри мембраны в сторону более кислых значений. Это неизбежно уменьшает гидролитическую активность папаина, так как фермент «выходит» из своего pH-оптимума активности. В дальнейшем за счет более быстрой диффузии Н+ по сравнению с ОН^возрастает значение pH внутри мембраны н активность папаина снова увеличивается. Таким образом, был получен микрореактор с периодом колебания 20 с. Изменением концентрации фермента в мембране, толщины мембраны и других параметров системы удается варьировать продолжительность одного колебания.
Анализ условий, при которых могут наблюдаться гистерезисные н колебательные явления, показал, что для их возникновения необходимо, чтобы, во-первых, на зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата имелся максимум или точка перегиба, т. е. фермент активируется или ингибируется
субстратом или продуктом, и, во-вторых, процесс должен быть диффузионно-контролируемым.
Аллостерические и кооперативные свойства иммобилизованных олигомерных ферментов. Выше были рассмотрены в основном те ферменты, кинетика действия которых подчиняется уравнению Михаэлиса — Ментен. Однако в природе наиболее распространенными являются аллостерические ферменты. Основная особенность этих ферментов состоит в том, что регуляция их активности под действием субстратов, продуктов и других метаболитов клетки осуществляется по кооперативному механизму (подробно об этом явлении н его кинетическом описании см. в монографии Б. И. Курганова « Ал л остерические ферменты》, 1978).
В настоящее время не вызывает сомнения, что решающая роль в механизме кооперативной регуляции активности принадлежит конформационной подвижности белков. Поскольку иммобилизация иногда существенно ограничивает ее, то кооперативные н аллостерические свойства олигомерных ферментов в иммобилизованном состояния часто отличаются от свойств этих ферментов в гомогенном растворе. При этом иногда уменьшается или даже совсем исчезает S-образный характер зависимости скорости реакции от концентрации субстрата или аллостерического лиганда. Эти зависимости могут трансформироваться в сигмоидальные, которые характерны для ферментов, действующих в соответствии с кинетическим уравнением Михаэлиса — Ментен.
Иммобилизованные полиферментные системы. В последние годы получено немало доказательств того, что многие ферменты в клетках работают в виде структурно н кинетически единых комплексов. В них проходит цепь последовательных процессов, когда продукт первого (рермеита является субстратом для второго фермента и т. д. В полиферментных комплексах активность каждой компоненты, как правило, превышает активность изолированного фермента в гомогенном растворе. Основная причина этого заключается в том, что в комплексе за счет пространственного сближения и диффузионных ограничений могут локально концентрироваться промежуточные соединения: субстраты, активаторы, ингибиторы. Эффекта локального концентрирования удается добиться при иммобилизации нескольких ферментов вместе на одном носителе.
Первая искусственная биферментная система, основанная на иммобилизованных ферментах, была создана К. Мосбахом (1970). Гексокиназу и гл юкозо-6-фосфатде гидроген азу ковалентно присоединяли к носителю; они поеледо вате л ь но перерабатывали глюкозу в глюкозо-б-лактон-6-фосфат. По сравнению с системой двух ферментов в растворе эффективность возросла на 40——140%; при этом исчезал индукционный период в активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (второго фермента в последовательности).
К настоящему времени описано несколько десятков иммоби- лизационных систем, в которых согласованно действуют два, три, четыре н большее число ферментов. Все они выигрывают в эффективности по сравнению с ферментами в растворе за счет того, что вблизи активного центра второго (третьего и т. д.) фермента очень быстро достигается стационарная концентрация его субстрата.
Иммобилизованные органеллы и клетки. Иногда ферменты используют, не выделяя их из нативного микроокружения in vivo, а в виде целых клеток или субклеточных структур — митохондрий, хлоропластов и т. п. Такая форма биокатализаторов имеет целый ряд преимуществ. Перечислим наиболее важные из них: сохранность природного микроокружения (которое, как правило, обеспечивает ферментам повышенную стабильность) и способность воспроизводить ферменты природным путем при использовании варианта растущих клеток.
Для придания органеллам или клеткам большей технологичности их иммобилизуют. Кинетическое описание катализа под действием иммобилизованных клеток представляет очень сложную проблему. Здесь необходимо учитывать последовательную цепь диффузионных н кинетических процессов, осложненных эффектами распределения метаболитов н их активного транспорта (например, через биологическую мембрану). Для растущих клеток требуется также учет процессов биосинтеза и биодеградации макромолекул. В настоящее время еще не созданы математические модели, которые бы исчерпывающе описывали кинетику действия иммобилизованных клеток, — это задача ближайшего будущего.
лава
5
СТАБИЛЬНОСЬ
ИММОБИЛИЗОВАННЫХ
ФЕРМЕНТОВ
Во Введении отмечалось, что главное преимущество иммобилизованных ферментов перед свободными (несвязанными) заключается в их большей технологичности. Одним из проявлений этого является более высокая стабильность иммобилизованных ферментов по сравнению с нативными. Дело в том, что ферменты, как класс биологических молекул, обладают очень низкой стабильностью: стандартная свободная энергия нативной конформации при обычных условиях (комнатная температура, физиологические значения pH, нормальное давление, определенный состав среды), как правило, лишь на 20—60 кДж/моль меньше свободной энергии денатурированной формы. Это соответствует энергии всего лишь нескольких водородных связей или одного- двух солевых мостиков н намного меньше энергии обычных ковалентных связей, составляющих сотни кДж/моль. Поэтому даже небольших отклонений внешних условий от тех, которые характерны для микроокружения ферментов в клетке, может оказаться достаточно, чтобы нарушить структуру и функцию ферментов, т. е. инактивировать их.
У Для практических целей, однако, часто требуется, чтобы ферменты работали при повышенных температурах, экстремальных значениях pH, в присутствии высоких концентраций органических растворителей или по верх ностно - а кти в н ы х веществ и т. п. В связи с этим возникает проблема существенного увеличения стабильности ферментов.
Воздействия и вещества, вызывающие инактивацию ферментов
Все воздействия, приводящие к инактивации ферментов, иногда условно подразделяют на физические и химические. К физическим относят нагревание или переохлаждение, облучение (у- н рентгеновское излучение), ультразвук, сорбцию на
границах раздела фаз (типа вода —— воздух или жидкость —— жидкость). Химическая инактивация может быть вызвана, например, щелочами и кислотами, поверхностно активными веществами, органическими растворителями, мочевиной и гуанидин- хлоридом, некоторыми окислителями (например, кислородом или пероксидом водорода) и вое ста повителям и (например, тиолами, ионами металлов), а также некоторыми ферментами (например, протеазами или протеинкиназами). Однако попытка классифицировать инактивационные процессы, основываясь на условном разделении инактивирующих воздействий на физические и химические, практически ничего не дает для понимания сути этих процессов. Так, например, под действием физического фактора (нагревания) в молекуле белка часто происходят химические изменения: окисление функциональных групп, гидролиз пептидных связей. С другой стороны, действие таких химических денатурантов, как мочевина или гуанидин хлорид, как правило, вызывает изменения только физического состояния белка (конформационные перестройки), но не меняет его химическую структуру.
Более информативной, с точки зрения решения стабилизационной задачи, является классификация инактивационных процессов по молекулярным механизмам.
Молекулярные механизмы инактивации ферментов
Еще в 40-х — начале 50-х годов сложились основные представления о механизмах инактивации. В наиболее общем случае ин актив анионный процесс можно представить в виде двух стадийной схемы:
N=D—I, (О
где N, D и I — соответственно нативная, обратимо денатурированная и необратимо инактивированная формы белка. Первая стадия на схеме (1) чаще всего представляет собой обратимое конформационное изменение; в случае олигомерных ферментов эта стадия состоит в обратимой диссоциации на субъединицы. Вслед за обратимыми процессами протекают необратимые стадии (D—I). Механизмы инактивации ферментов, как правило, классифицируют, исходя из природы процессов, происходящих именно на второй, необратимой стадии, Кратко рассмотрим основные инактивационные механизмы.
Агрегация. Очень часто при длительной инкубации в растворе при повышенной температуре, при экстремальных значениях pH,
в присутствии химических денатурантов белки агрегируют. На возможность такой инактивации оказывает влияние целый ряд факторов: температура, pH и т. п.; однако решающим среди них является концентрация белка. Поскольку кинетический порядок уравнения, описывающего стадию агрегации, равен или даже больше двух, то, естественно, увеличение концентрации белка приводит к увеличению скорости агрегации н размеров образующихся агрегатов, а также ускорению инактивации в целом. По этому характерному признаку (сильная зависимость скорости инактивации от концентрации фермента в растворе) можно кинетически отличить агрегацию от мономолекулярных инактивационных механизмов.
Как правило, белковые агрегаты образуются за счет слабых нековалентных взаимодействий, таких, как гидрофобные взаимодействия, водородные связи. Однако если в молекулах белков имеются SH-группы или дополнительно к ним еще S——S-связи, то отдельные молекулы внутри агрегатов могут сшиваться ковалентными дисульфидными мостиками. Размер и форма нековалентных или ковалентно-сшитых агрегатов могут изменяться в широких пределах вплоть до образования отдельной фазы — белковых осадков.
Изменение первичной структуры. Все химические процессы, приводящие к инактивации белков, можно подразделить на две группы. К первой относятся реакции разрыва полипептидной цепочки, ко второй ―• химическая модификация отдельных функциональных групп белка.
Гидролиз пептидных связей, протеолиз и автолиз. Некаталитическое расщепление пептидных связей проходит в очень^ жестких условиях. Так, полного расщепления полипептидной цепи на отдельные составляющие аминокислоты добиваются лишь путем длительного (многочасового) кипячения раствора белка в концентрированной соляной кислоте. В несколько более «мягких» условиях, при нагревании белковых растворов при нейтральных или слабощелочных pH и температуре 80・100°С, гидролиз пептидных связей либо проходит лишь незначительно, либо его вообще не наблюдается. Из всех пептидных связей наиболее лабильными к высокотемпературному гидролизу, как правило, оказываются те, которые образованы остатками аспарагиновой кислоты.
Однако гидролиз пептидных связей в белках может происходить и при нормальных условиях — комнатной температуре, нейтральных значениях pH. Это является результатом работы протеаз — ферментов, созданных природой для деградации других белков в мягких условиях. Поскольку в любых (даже высоко- очищенных) препаратах белков могут находиться протеазы в качестве сопутствующих примесей, при изучении механизмов инактивации необходимо учитывать и возможность протеолиза.
.Другим примером протеолитической инактивации может служить бактериальное заражение реакторов, содержащих ферменты. Случайно попавшие в реактор клетки микроорганизмов
секретируют протеазы, которые расщепляют молекулы фермента- биокатализатора, находящегося в растворе. Используя «осколки» протеолитической деградации в качестве питательной среды для роста, микроорганизмы размножаются; тем самым они, с одной стороны,《засоряют» реактор, с другой — уменьшают активность биокатализатора в растворе, т. е. инактивируют его.
Сами протеолитические ферменты способны расщеплять не только молекулы других белков, но н себе подобные. Этот процесс «саморасщепления» протеаз получил название автшш^^ От большинства других инактивационных механизмов (за исключением агрегации) автолиз можно отличить кинетически. Дело в том, что существенной стадией при автолизе является образование комплекса между двумя молекулами протеазы; эта бимолекулярная стадия часто определяет общую скорость инактивации. Поэтому, если при изменении начальной концентрации протеазы наблюдается изменение скорости инактивации, то изучаемый инактивационный процесс с большой вероятностью представляет собой автолиз.
Окисление функциональных групп фермента. При повышенных температурах некоторые функциональные группы в белках, и в первую очередь SH-группы цистеина и индольные фрагменты триптофана, окисляются. В результате окисления образуются модифицированные производные аминокислот: сульфоксисоединения цистеина (SOH, SO2H и т. д.), продукты раскрытия индольного кольца триптофана и др. В некоторых ферментах сульфгидрильные группы, входящие в состав активного центра, обладают повышенной реакционной способностью и окисляются даже при комнатной температуре.
Расщепление S—S-связей в белках. Расщепление может происходить либо в восста но вите л ьно й среде (в присутствии тиолов, других восстановленных соединений серы, например Na2soз, Na2s2О3), либо в щелочной среде при повышенной температуре. В первом случае продуктом восстановления S—S-связи является ее тиольная форма (белок ——SH) либо смешанный дисульфид тиольной формы белка с восстанавливающим реагентом (белок —S——S——R; белок ——S—SO3" и т. п.). При щелочном расщеплении S—S-связей происходит более сложная цепь химических реакций. Сначала цистин гидролизуется с образованием дегидроаланина:
который, как нуклеофил, взаимодействует с аминогруппами остатков лизина, сул ьф гидр ильными группами остатков цистеина, гуанидиниевыми группами остатков аргинина, образуя новые аминокислоты, соответственно, лизиноаланин, лантионин и орни- тииоаланин:
соонnh2соонnh2、/СООН
соон
nh2
соон
nh2
XHCH2NH(CH2)4CH<
/、NH2
лизиноаланин
соонnh2соонnh2CHCH2SCHлантионинCHCH2SCHлантионин/СООН
соон
nh2
соон
nh2
CHCH2SCH
лантионин
CHCH2SCH
лантионин
2СН〈
、NH2
СООН、/СООН
>CHCH2NH(CH2) зСН<
NH2/xNH2
орнитиноаланин
Для того чтобы в белке произошло расщепление всех S——S- связей, требуются достаточно жесткие условия. Так, их восстановление происходит при очень высоких концентрациях тиолов; в случае многих белков действие тиолов необходимо сочетать с одновременным разворачиванием белковой глобулы денатурантами, например концентрированными растворами мочевины или гуанидин хлорида. Полная щелочная деструкция S—S-связей в белке происходит только в 0,1 ——1 М растворе щелочи при температурах, близких к 100℃. Однако в белках, как правило, одна- две S——S-связи более реакционноспособны, чем остальные, и их деструкция (как восстановительная, так и щелочная) проходит с заметными скоростями в существенно менее жестких условиях: например, при температурах 60—80℃ и слабощелочных значениях pH. Поэтому, работая с ферментами в этих условиях, необходимо учитывать возможность такого инактивационного механизма, как щелочное растепление S——S-связей
Следует также отметить, что иногда в литературе обсуждается механизм внутримолекулярного перераспределения S——S- связей. Его можно представить следующим образом: под действием гидроксид-ионов в белке расщепляются некоторые <иатив- ные» S——S-связи и образуются SH-группы. Они, в свою очередь, могут атаковать другиё*8—S-связи в молекуле белка, что должно приводить к образованию новых «ненативных» дисульфидных мостиков. Однако этот гипотетический инактивационный механизм представляется маловероятным и до сих пор не нашел экспериментальных подтверждений.
Химическая модификация участвующих в катализе SH-групп. в ферментах (например, входящих в состав активных центров). Подобная модификация часто приводит к инактивации ферментов. Один из примеров такой модификации — высокотемпературное окисление SH-групп был рассмотрен выше. В качестве другого примера можно привести «отравление» белков катионами тяжелых металлов: Hg, Pb, Си и другими, следовые качества которых всегда присутствуют в воде. Механизм такой инактивации состоит в модификации SH-групп белков, проходящей до образования соответствующих меркаптидов.
Фосфорилирование белков £〃 vivo. Этот процесс играет важную регуляторную роль и иногда вызывает инактивацию ферментов. Происходящие при этом молекулярные процессы до конца не ясны. По-видимому, в большинстве случаев потеря ферментом активности вызвана не непосредственно ковалентным вве деннем в белок фосфатных групп (через остатки серина, треонина, тирозина), а происходящими вслед за этим конформационными изменениями. С этим механизмом инактивации также приходится считаться in vitro, поскольку фосфорилазы и фосфатазы (ферменты, осуществляющие фосфорилирование) иногда содержатся в препаратах белков в качестве примесей.
«Самоубийственная» (суицидная) инактивация. Так принято называть группу механизмов, при которых в ходе каталитического акта ферментативной реакции образуется реакционноспособная частица (чаще всего свободнорадикальной природы), способная химически модифицировать функциональную группу активного центра и тем самым нарушать активность фермента. В качестве примера приведем инактивацию простагландинсин- тетазы свободным радикалом пероксидной природы, образующимся из арахидоновой кислоты под действием самого же фермента. Механизм «самоубийственной» инактивации обнаружен для ферментов различных классов (гидролаз, оксидоредуктаз). /м vivo, по-видимому, он играет важную регуляторную роль, контролируя в клетке содержание некоторых «ключевых» ферментов, обладающих особенно высокой каталитической активностью. Однако при практическом использовании ферментов для синтеза или_ модификации физиологически важных соединений с такой инактивацией необходимо бороться.
Радиационная инактивация ферментов (под действием рентгеновского и у излучения, УФ света и т. п.) является сложным многостадийным процессом. В нем выделяют фотофизические, фотохимические стадии (химические реакции под действием облучения в хромофорах ——триптофане, цистеине и др.), а также темновые химические реакции. Возможность радиационной инактивации необходимо учитывать в тех случаях, когда иммобилизация ферментов (например, при образовании гелей) инициируется у излучением, УФ светом и др.
Рацемизация аминокислот в белках. Этот процесс проходит в «сверхжестких» условиях —— при экстремальных значениях pH (ниже 2,0 и выше 12,0) н температуре выше 100℃. Поскольку в настоящее время в таких условиях ферменты не применяют, то далее этот инактивационный механизм рассматриваться не будет.
Дезаминирование остатков аспарагина. Этот процесс происходит в белках с заметными скоростями при высоких температурах (порядка 100℃) и слабокислых значениях pH (порядка 4,0—5,0). Такое изменение первичной структуры ферментов также приводит к их инактивации.
Десорбция кофактора из активного центра фермента. Известен большой класс ферментов, в состав активных центров
которых входят атомы металлов, металлосерные кластеры и другие не ков але нтнСГ св язашше^ТтрбстетичетКПЕ^рупды^ рйуТПрТПтигр^й而nf^^EjS?^ некотер^Гхимических реагентов (например, хелатирующих), равновесном диализе и других процедурах равновесие между связанной с белком и свободной, несвязанной формами кофакторов может сдвигаться в сторону последней и кофакторы диссоциируют из активных центров ферментов в раствор. Если удаление кофактора из активного центра не сопровождалось последующими значительными изменениями конформации белка, то при добавлении избытка кофактора к денатурированному ферменту он самопроизвольно реактивируется. Однако если диссоциация кофактора привела к большим конформационным изменениям или вслед за ней произошла химическая модификация существенных для структуры функциональных групп, то инактивация фермента становится необратимой.
Диссоциация олигомерных белков на субъединицы. При действии многих денатурантов (мочевины, детергентов, кислот, нагревании и т. п.) на олигомерные белки происходит их диссоциация на отдельные субъединицы. Процесс этот, в принципе, обратимый. Однако, как правило, вслед за стадией диссоциации происходят другие процессы: конформационные изменения в отдельных субъединицах, диссоциация кофакторов из активных центров, модификация (например, окисление) тех функциональных групп, которые в олигомерном белке были экранированы от контакта с растворителем, агрегация субъединиц. Эти процессы часто являются необратимыми； в результате и сама диссоциа- 艮ня приобретает кажущийся необратимый характер. В связи с этим необходимо отметить, что установление механизмов инактивации (кинетических н особенно молекулярных) олигомерных белков является одной из наиболее сложных задач в современной энзимологии.
Сорбция белка на стенках реакционного сосуда. В общем случае поверхность реакционного сосуда не является абсолютно инертной по отношению к белку. Так, например, на поверхности стекла имеются нескомпенсированные заряженные группы и потенциальные доноры и акцепторы водородных связей. Поэтому некоторые материалы, из которых изготовляют реакторы (в частности, стекло), способны сорбировать на своей поверхности ферменты за счет образования слабых нековалентных взаимодействий. Это приводит к уменьшению концентрации фермента в растворе, т. е. к кажущейся инактивации.
Сорбционная способность поверхности ограничена и определяется число имеющихся на ней сорбционных центров. Поэтому при работе с концентрированными растворами белков практически не чувствуется уменьшение ферментативной активности из раствора за счет сорбции. Однако «сорбционная инактивация» становится весьма заметной в разбавленных белковых растворах (концентрация 10一 ‘一10~10 моль/л).
Если в растворе произошло частичное или полное разворачивание белковой молекулы, например, в результате нагревания, то на ее поверхности появляются новые дополнительные центры взаимодействия с поверхностью реакционного сосуда. За счет этого усиливается сорбционная способность белков и, как следствие, «сорбционная инактивация» начинает чувствоваться в несколько более концентрированных растворах белка.
Инактивация в потоке. Этот тип инактивации особенно важен при проведении ферментативных процессов в проточных реакторах. По-видимому, это связано с тем, что в потоке происходит механическая деформация белковых молекул.
Необратимые конформационные изменения (необратимая денатурация). Причиной необратимой инактивации могут быть также необратимо прошедшие в белковой макромолекуле конформационные изменения, т. е. необратимая денатурация. Механизм необратимой денатурации состоит в следующем. При денатура- циоином воздействии, например при повышенной температуре, в белке разрушаются «правильные» нековалентные взаимодействия, которые поддерживают нативную структуру, и образуются «иенативные» нековалентные взаимодействия, термодинамически выгодные при повышенной температуре. При охлаждении эти «неправильные» нековалентные взаимодействия сохраняются по чисто кинетическим причинам, поскольку молекулярная подвижность существенно уменьшается при понижении температуры. Иными словами, в результате охлаждения белок оказывается «замороженным» в метастабильном «необратимо денатурированном» состоянии и не может самопроизвольно ренатурироваться, т. е. перейти в нативную конформацию.
Влияние иммобилизации на инактивацию ферментов
Для иммобилизованных ферментов число возможных мнактн- вационных механизмов существенно меньше, чем в случае растворимых ферментов.
Иммобилизация подавляет такие полимолекулярные инакти- вационные процессы, как агрегация и автолиз. Дело в том, что в иммобилизованном состоянии подвижность белков, как правило, резко ограничена, в то время как существенной стадией обоих механизмов является перемещение двух (или нескольких) молекул ферментов друг к другу с их последующим взаимодействием. По этой же причине для многих форм иммобилизованных белков исключен механизм инактивации путем сорбции на стенках реакционного сосуда и часто удается существенно затормозить необратимую диссоциацию олигомерных белков на субъединицы.
Иммобилизация на (или в) носителе, как правило, создает
вокруг молекул фермента стерические ограничения, т. е. как бы экранирует их от внешнего раствора. Это приводит к существенному ограничению диффузии молекул других, не связанных с носителем ферментов, в частности протеаз, фосфорилаз, фосфатаз. Поэтому для иммобилизованных ферментов практически сведены на нет такие инактивационные процессы, как протеолиз, микробное заражение н фосфорилирование.
Иммобилизованные белки стабильнее нативных по отношению к инактивации в потоке. Причина заключается в том, что носитель механически защищает молекулы ферментов от деформаций в потоке, выполняя роль своеобразного демпфера.
В последние годы активно развиваются методы иммобилизации, позволяющие ковалентно пришивать молекулу кофактора в районе активного центра фермента или совместно иммобилизовать молекулы кофактора и фермента на одном носителе в непосредственной близости друг от друга. С помощью таких методических приемов становится возможным подавить такой инак- тивационный механизм, как десорбция кофактора из активного центра фермента.
Наиболее сложная задача — затормозить химические изменения в белке, приводящие к инактивации. Однако и в этой области имеются положительные примеры использования иммобилизации.
В тех случаях, когда инактивация происходит под действием пероксида водорода или супероксидных радикалов, хорошо зарекомендовал себя следующий прием. Подвергающийся инактивации белок иммобилизуют совместно с каталазой или супероксид- дисмутазой ——ферментами, катализирующими разложение, соответствен но, Н2О2 и О2Т
Как уже говорилось, некоторые ферменты инактивируются вследствие окисления кислородом воздуха высокореакционноспособных функциональных групп их активного центра и в первую очередь SH-групп. Такую инактивацию также удается подавить методами иммобилизации. Для этого фермент иммобилизуют в полиэлектролитной матрице, обладающей способностью «высаливать» кислород. В результате фермент экранирован от контакта с инактиватором и стабильность его по отношению к окислению становится существенно выше, чем у неиммоби- лизованного. .
Кроме того, можно создать условия для конкуренции за вещество-инактиватор. Например, многие ферменты, имеющие SH-группы, необходимые для катализа, инактивируются в результате их «отравления» катионами тяжелых металлов по механизму образования меркаптидов. Иммобилизуя такой фермент с другим белком с высоким содержанием реакционноспособных SH-групп или пришивая к матрице носителя низкомолекулярные тиолы, добиваются того» что основная часть катионов металлов расходуется не на «отравление» фермента, а на модификацию SH-групп «несущественного» белка или тиола.
§ 4・ Подавление с помощью иммобилизации первичных обратимых стадий денатурации и диссоциации нативных белков
Как уже отмечалось, практически любой инактивационный процесс начинается с обратимой стадии [N甘D на схеме (1)]. Ее молекулярный механизм сводится либо к обратимому конформационному изменению (обратимая денатурация), либо, в случае олигомерных белков, к обратимой диссоциации на субъединицы. В этом случае стабилизация ферментов состоит в том, чтобы подавить первую стадию.
На основе подобных представлений разработан ряд общих принципов, следуя которым можно в сотни и тысячи раз замедлить необратимую инактивацию большого числа различающихся по структуре и функции ферментов. В результате стало возможным проводить целенаправленный поиск конкретных путей стабилизации как мономерных белков, так и ферментов с четвертичной структурой, используемых в биотехнологии.
Наибольшие успехи в стабилизации ферментов связаны с применением метода иммобилизации. В общем случае можно указать по крайней мере три причины изменения стабильности в результате иммобилизации: 1) изменение конформации иммобилизованного фермента по сравнению с нативной структурой; 2) изменение микроокружения ферментной молекулы； 3) ужест- чение нативной конформации белковой глобулы. Первые два фактора, по-видимому, нельзя положить в основу разработки общих методов стабилизации ферментов. Дело в том, что вопрос о связи стабильности белков с изменением их конформации и микроокружения является малоизученным. Более того, такая связь (даже если ее удастся установить) индивидуальна для каждого фермента. Поэтому для целенаправленной стабилизации ферментов гораздо более перспективным представляется третий путь ——ужестчение (закрепление) нативной конформации фермента с целью воспрепятствовать ее разворачиванию. Следует отметить, что этот подход (увеличение жесткости белков) широко используется природой при создании стабильных белков термофильных микроорганизмов, живущих при повышенных температурах (50℃ и выше).
Многоточечное нековалентное взаимодействие фермента с носителем. В принципе белковые молекулы могут связываться с теми носителями, на поверхности которых имеются заряженные, гидрофобные, полярные группы, за счет относительно слабых электростатических и гидрофобных взаимодействий, водородных связей. Однако, поскольку эти связи слабые, они практически не обрузуются в разбавленных растворах полимерных носителей. Дело в том, что большие потери энтропии, происходящие при образовании комплекса белок — носитель вследствие «замораживания» поступательного и вращательного движения моле-
кул белка, не могут быть скомпенсированы за счет энергии образования слабых нековалентных взаимодействий.
Ситуация существенно изменяется при включении ферментов в концентрированные полимерные гели. Здесь в силу стерических препятствий, вносимых частой пространственной сеткой полимера, поступательное и, возможно, вращательное движение белковых молекул существенно заторможено. В результате в таких системах образование комплекса белок — матрица становится термодинамически гораздо более выгодным, поскольку здесь уже не требуется затрат свободной энергии для погашения потерь поступательной н вращательной энтропии ферментной глобулы при ее сорбции на полимерной матрице. Благодаря этому в концентрированных полимерных гелях становится возможным многоточечное взаимодействие (за счет слабых нековалентных сил) фермента с носителем, поскольку в таких геляХииюли мерные цепи со всех сторон окружают ферментную глобулу. Такое многоточечное взаимодействие в гелевых системах действительно имеет место; оно приводит к существенной стабилизации ферментов. Так, а-химотрипсин, нековалентно включенный в заряженный гель полиметакриловой кислоты, в 105 раз более термостабилен, чем нативный фермент, если концентрация полимерных цепей в геле составляет 50%.
Говоря о практическом применении гелевых систем, необходимо отметить один их существенный недостаток. Частички геля склонны к набуханию в воде, что приводит к снижению концентрации полимерных цепей в геле. В результате эффект стабилизации включенного в гель фермента может уменьшаться и даже вовсе исчезать, поскольку, как обсуждалось, для реалиазации многоточечного нековалентного взаимодействия фермента с носителем необходимо, чтобы гель был достаточно концентрированным. Поэтому практическую ценность с точки зрения повышенной стабильности препарата биокатализатора в суспензии имеют только те системы, в которых молекулы фермента включены в «сильносшитые», не на бухающие в воде гелевые частицы.
Многоточечное ковалентное присоединение фермента к поверхности носителя (рис. 24,а). Другой путь ужестчения структуры фермента заключается в его иммобилизации на носителе с образованием большого числа ковалентных связей. Для реализации многоточечного взаимодействия необходимо, чтобы размеры ферментной глобулы н поры носителя соответствовали друг другу. Если проводить иммобилизацию белка на произвольно взятом носителе, то такое соответствие можно получить лишь случайно, поскольку поверхность носителя и поверхность белка имеют свои индивидуальные рельефы, в общем случае не комплементарные друг другу.
Этого недостатка лишен сополимеризационный метод иммобилизации, позволяющий создать полимерной носитель, комплементарный молекуле фермента. Фермент химически модифицируют (например, по аминогруппам) аналогом мономера, т. е.
Рис. 24. Схематическое изображение иммоби-Рис. 24. Схематическое изображение иммоби-лизационных подходов к стабилизации ферментовлизационных подходов к стабилизации ферментов
Рис. 24. Схематическое изображение иммоби-
Рис. 24. Схематическое изображение иммоби-
лизационных подходов к стабилизации ферментов
лизационных подходов к стабилизации ферментов
соединением, содержащим ненасыщенные связи (например, хло- рангидридом акриловой кислоты или акролеином). При последующей сополимеризации с мономером (например, с акриламидом или метакрилатом натрия) белковая глобула формирует вокруг себя поверхность носителя, комплементарную собственной, ковалентно к ней присоединяясь. Сополимеризационный метод дает уникальную возможность получать препараты ферментов, пришитых различным числом ковалентных связей к поверхности носителя, за счет варьирования степени модификации на стадии обработки фермента аналогом мономера.
Ферменты, иммобилизованные по сополимеризационной методике, обладают гораздо более высокой устойчивостью против инактивации при повышенных температурах, чем соответствующие нативные ферменты. Эффект стабилизации, определяемый как отношение констант скоростей необратимой инактивации нативного и им мобил изова иного препаратов, возрастает с увеличением числа связей между ферментом и носителем и достигает больших величин. Например, для а-химотрипсина, пришитого к носителю 15 связями, стабилизационный эффект составляет более 1000 раз. Такие ферментные препараты сохраняют каталитическую активность при существенно более высоких температурах. Так, например, оптимум эстеразной активности трипсина, ковалентно вшитого в пол и а крил а мидный гель 15 связями, наблюдается при температуре 75℃, что на 25° выше оптимума активности нативного фермента. Это указывает на резкое подавление быстрых обратимых денатура ционных процессов в иммобилизованном препарате.
Следует отметить, что эффект стабилизации для иммобилизованного по сополимеризационной методике фермента зависит только от числа ковалентных связей с носителем, но не зависит ни от плотности гелевого носителя (т. е. от концентрации полимера в геле), ни от степени его набухания. Более того, проводя сополимеризационную иммобилизацию в отсутствие бифункционального сшивающего агента, удается получить водор а створим ые
ферментные препараты, также обладающие повышенной термостабильностью.
Внутримолекулярное сшивание фермента бифункциональными реагентами (рис. 24,6). Модификация фермента бифункциональными агентами в принципе может привести к наложению на белковую глобулу внутримолекулярных ковалентных сшивок. Следует ожидать, что сшивание увеличит кон фор м а цион ную жесткость белка и, следовательно, его стабильность. Этот подход (внутримолекулярное сшивание белка) активно используется в природе для увеличения стабильности белковых структур. К числу «природных сшнвок» относятся как ковалентные S——S-связи, так и нековалентные «солевые мостики》，ионы Са2+ и других металлов, связанные с молекулой белка, и т. п.
Успех или неудача при попытке повысить стабильность фермента обработкой бифункциональными реагентами в основном определяется соответствием длины реагента расстоянию между возможными центрами пришивки на белковой глобуле. Очевидно, что для каждого конкретного белка существует оптимальный размер сшивающих агентов. Единственно надежный путь определения размера подходящего реагента ——эмпирический поиск. Для этого изучаемый фермент модифицируют соединениями гомологического ряда бифункциональных реагентов, например алифатических диаминов или имидоэфиров алифатических дикарбоновых кислот, в условиях, когда не происходит межмолекулярного сшивания белковых молекул. Далее изучают зависимость ста бил и за цион но го эффекта от длины бифункционального реагента. Обычно такие зависимости имеют вид кривой с максимумом. Дело в том, что при модификации бифункциональным реагентом наряду с образованием «сшивок» происходит одноточечная модификация функциональных групп белка. Соотношение этих двух процессов тем сильнее сдвинуто в сторону реакции сшивания> чем больше на поверхности белковой глобулы пар функциональных групп, расстояние между которыми примерно равно длине сшивающего агента. Именно в этом случае наблюдаются максимальные стабилизационные эффекты.
Следует отметить, что эмпирический характер поиска оптимального сшивающего агента несколько снижает ценность метода внутримолекулярного сшивания белков для практических целей. Действительно, для каждого вновь взятого белка или при использовании нового гомологического ряда бифункциональных реагентов работу по подбору наилучшего сшивающего агента надо проводить заново.
Тем не менее метод сшивок весьма полезен, поскольку позволяет получать водор а створи м ые стабилизированные производные ферментов с относительно низкой молекулярной массой (сравнимой с молекулярной массой самого фермента). Такие препараты п редпочтите л ьн ы в некоторых прикладных областях, в частности в медицине.
Механическое включение ферментов в «тесные» поры носите-
ля (рис. 24,8). Разворачиванию белковой глобулы можно также воспрепятствовать» если поместить молекулу фермента в ячейку носителя, не взаимодействующую с ней ни химически, ни сорб- ционно, но столь《тесную》，чтобы развернутая конформация не могла образоваться по стерическим причинам. В этом случае нативная конформация белка могла бы поддерживаться чисто механическим путем. *
Стабилизацию фермента в «тесных» ячейках методически проще всего осуществить включением белков в полимерные гели, например при проведении процесса полимеризации мономеров в присутствии фермента. Известно (см. гл. 1), что поперечно сшитые полимерные гели (полиакриламидный, полисахаридные и др.) имеют пористую структуру. В геле, как правило, наблюдается относительно узкое распределение пор по размерам; размер пор задается концентрацией полимерных цепей. Он тем меньше, чем выше концентрация полимера в геле. Поэтому, включая фермент в гели различной концентрации, можно реализовать ситуацию, когда белковая глобула окажется «зажатой» полимерными цепями носителя и благодаря этому «клеточному эффекту» не сможет развернуться. В таких случаях достигаются существенные стабилизационные эффекты: включенные в гель ферменты в тысячи раз стабильнее своих нативных (неиммобилизованных) предшественников, причем стабилизация проявляется тем сильнее, чем выше концентрация полимера.
Практическое применение гелевых препаратов тормозится, однако, тем, что в водных растворах гидрофильные гели сильно набухают. При этом значительно уменьшается концентрация полимера в гелевой фазе и, следовательно, нарушается соответствие размеров пор геля н белковой глобулы. Один из способов устранения этого нежелательного эффекта заключается в том, что при получении гелей увеличивают концентрацию сшивающего агента; за счет этого макроструктура образовавшихся гелей получается более жесткой и они набухают в гораздо меньшей степени.
Пути стабилизации ферментов, не основанные на методе иммобилизации
Стабильные препараты иммобилизованных ферментов можно получать не только методами иммобилизации, но и другими путями. Иммобилизации подвергают ферменты, которые сами по себе обладают высокой стабильностью. Это прежде всего высокостабильные биокатализаторы, встречающиеся в природе. Для этого проводят поиск ферментов, обладающих высокой термостабильностью, как в мезофильных организмах, живущих при обычных температурах, так и в термофильных микроорганизмах, которые самой природой приспособлены для существования в высокотемпературном режиме. Кроме того, стабильные
ферментные препараты можно создавать искусственным путем, например методами химической модификации и белковой инженерии.
Химическая модификация белков. Со времени появления первых сообщений об изменении стабильности ферментов в результате модификации их функциональных групп химическими реагентами (середина 50-х годов) предпринимались неоднократные попытки стабилизировать ферменты методом химической модификации. Анализируя эти попытки, удается выделить следующие основные молекулярные причины повышения стабильности белков при их ковалентной модификации:
в результате химической модификации белок может перейти в отличную от нативной, например, более стабильную конформацию;
при химической модификации в белок зачастую вводятся новые функциональные группы, способные завязать дополнительные стабилизирующие белок водородные связи или солевые мостики;
химическая модификация неполярными соединениями иногда усиливает в белках гидрофобные взаимодействия;
в результате модификации гидрофильными соединениями поверхностных гидрофобных областей в белке уменьшается площадь неблагоприятного контакта внешних неполярных остатков с водой, что должно стабилизовать белок.
Белковая инженерия. В начале 80-х годов в генетической инженерии был разработан метод, позволяющий получать измененные белки, отличающиеся от бел ков - прототи пов заменой всего лишь одного аминокислотного остатка в строго заданном положении. Для биотехнологии этот метод, названный сайт- специфическим мутагенезом, или белковой *您ене^£^ интересен тем, что позволяет целёййтгр^節геннЬ Т^ёнятьструктуру ферментов, а значит, их каталитические свойства и стабильность.
Рассмотрим вкратце суть метода. Для белка с установленной первичной н третичной структурой (известно более сотни таких белков) выбирают так называемый сайт (или центр) мутации, т. е. тот а минокислотный остаток, который подлежит замене. Поскольку in vivo мутация всегда осуществляется при биосинтезе путем замены отдельных нуклеотидов в гене, то необходимо перейти с языка структуры белка (аминокислотной последе в ател ьности) на язык генетического кода. Для этого, во- первых, ищут (или создают искусственным путем) кольцевую генетическую структуру ——плазмиду, в состав которой входит _Х£н, крщ^д^тн* нужный белок. Во-вторых, химическим путем си^тезируют^^л^Гго^^зоксир!^^ длиной 12——18 оснований. Его химический состав должен быть таков, чтобы соответствовать небольшому участку первичной структуры выбранного белка (длиной 4——6 аминокислотных остатков), включающего сайт мутации. Однако в процессе химического синтеза
вместо нуклеотидного триШ1£1^ кодирующего «нативную аминокислоту», в состав нуклеотидной последовательности вводят другой триплет, который кодирует новый аминокислотный остаток^ Па^бснове однонитевой плазмиды и синтезированного ол и гон уклеотида ферментативным путем создают гетеродуп- лексную двунитевую плазмиду, в состав которой входит «мутантный ген», несущий информацию о структуре белка с заменой аминокислотного остатка в определенном положении. Далее путем генетико-инженерных манипуляций и клонирования гена получают клетки-трансформаторы, которые осуществляют биосинтез мутантного запрограммированного исследователем белка.
Использование метода белковой инженерии уже дало первые успехи в стабилизации ферментов. Оценивая перспективы метода, следует помнить, что он является и в течение некоторого времени будет оставаться довольно дорогостоящим. Поэтому наиболее эффективным будет его использование в случае тех ферментов, которые, во-первых, сами достаточно дорого стоят, и, во-вторых, инактивация которых связана с химической модификацией какой-то «ключевой» группы, существенной для инактивации белка (например, окислением SH-группн вблизи активного центра или дезамидированием остатков аспарагина).
Глава
Б
регенешия
ОППОНЕНТОВ СИСТЕМ
С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ
ФЕРМЕНТАМИ
Системы с иммобилизованными ферментами имеют относительно высокую стоимость, поэтому крайне желательно добиться многократного их использования. Иными словами, возникает проблема регенерации систем с иммобилизованными ферментами или, по крайней мере, их отдельных, наиболее дорогостоящих компонентов. К основным компонентам таких систем относятся носители, ферменты и кофакторы. Как правило, не возникает необходимости регенерировать носитель, так как используемые в промышленности носители либо дешевы, либо стабильны. В то же время достаточно остро стоит вопрос регенерации ферментов и кофакторов.
Реактивация инактивированных ферментов
С точки зрения эффективности применения биокатализаторов было бы крайне заманчиво не только повысить стабильность ферментов, но и научиться возвращать активность отработанным в ходе технологического процесса ферментативным препаратам.
Практически одновременно с обнаружением феномена инактивации ферментов (начало XX в.) исследователи стали предпринимать попытки их реактивации. К настоящему времени накоплено довольно много положительных примеров в этом направлении. Их удобно классифицировать согласно причинам, вызывающим инактивацию.
Реактивация агрегированных белков. Ее часто удается осуществить, разрушив межмолекулярные нековалентные контакты (гидрофобные, электростатические, водородные связи). Для этого используют те же денатуранты, которые разрушают нековалентные взаимодействия в нативных белках, вызывая их обратимую денатурацию: концентрироваиные растворы мочевины и гуанидинхлорида, экстремальные значения pH и т. п.
Если образование агрегатов сопровождалось ковалентным сшиванием отдельных глобул между собой S——S-связями, то эти связи необходимо разрушить. Это достигается при действии относительно невысоких концентраций (порядка мкмоль/л) тиолсодержащих реагентов: цистеина или дитиотреитола; в этих условиях, как правило, не затрагиваются внутримолекулярные S—S-связи в белке. Если при образовании ковалентных агрегатов большую роль сыграли и нековалентные взаимодействия, то действие тиолов дополняется высокими концентрациями денатурантов типа мочевины.
Реактивация белков с измененной первичной структурой. Если белок потерял активность в результате химической модификации функциональных групп, то можно попытаться реактивировать его с помощью обратной химической реакции. Ферменты, инактивированные путем модификации SH-групп (например, их окислением), иногда удается реактивировать, добавляя избыток низкомолекулярного тиола или другого восстановителя.
Если под действием тиола в белке были разрушены S——S- связи, что привело к его инактивации, а образовавшиеся SH-группы провзаимодействовали с получением смешанных с тиолом дисульфидов, то такие ферменты иногда можно реактивировать, добавляя другие тиолы или ионы металлов. Механизм реактивации заключается в расщеплении смешанного дисульфида и последующем образовании «правильной» S—S- связи.
В литературе пока практически отсутствуют примеры удачной реактивации белков, инактивация которых явилась следствием таких химических процессов, как гидролиз пептидных связей, фосфорилирование, дезамидирование остатков аспарагина.
Десорбция инактивированного белка со стенок реакционного сосуда. Как уже отмечалось, «сорбционная инактивация» бёл- ков обусловлена слабыми нековалентными взаимодействиями (электрическими, гидрофобными, водородными связями) между белком и поверхностью реакционной ячейки. Реактивация в этом случае достигается за счет разрушения неспецифических взаимодействий при экстремальных значениях pH, под действием концентрированных растворов мочевины или гуанидин- хлорида и других реагентов, являющихся «обратимыми денатурантами» для большинства белков.
Реактивация «необратимо денатурированных» ферментов. Реактивацию удается провести, руководствуясь следующей двухстадийной схемой (рис. 25): сначала в инактивированном белке следует разрушить все, в том числе ненативные нековалентные взаимодействия, т. е. перевести белок в развернутое состояние и уже из этого состояния попытаться свернуть его в нативную конформацию. Таким образом, в общем случае задача о реактивации какого-либо «необратимо денатурированного» фер-
Рис. 25. Схематическое изображение цикла: термоинактивация — реактивация фермента; q — разворачивание термоинактивированного фермента с одновременным расщеплением S—S-связей; 6 — последующее сворачивание фермента в каталитически активную конформацию, сопровождающееся реокислением S——S-связей
мента, по существу, сводится к решению двух задач. Во-первых, поиску условий, при которых инактивированный белок удается развернуть. Для разворачивания инактивированных белков обычно используют те же реагенты, с помощью которых нативные (неинактивированные) белки можно перевести в состояние статистического клубка. Это концентрированные растворы обратимых денатурантов (мочевины или гуанидинхлорида); если в белке имеются S——S-связи, то действие денатурантов усиливают добавлением тиолов — реагентов, расщепляющих S—S-связи. Во-вторых, экспериментальному подбору условий, в которых развернутый белок успешно сворачивается в нативную (каталитически активную) конформацию. Для этой цели часто полезными оказываются эффекторы ферментативной активности (субстраты, ингибиторы, кофакторы и т. п.), которые одновременно являются и эффекторами сворачивания, т. е. повышают выход реактивации фермента.
К настоящему времени, основываясь на описанной двухстадийной процедуре, удалось реактивировать около десятка различных ферментов. По-видимому, число примеров удачной реактивации «необратимо денатурированных» ферментов будет увеличиваться по мере накопления знаний об особенностях процессов денатурации и ренатурации (разворачивания и сворачивания) белков.
Возможность реактивации ферментов, инактивированных по другим, более сложным механизмам. В гл. 5 было отмечено, что такие процессы в белках, как диссоциация кофактора из
активного центра фермента, диссоциация олигомерного белка на субъединицы, в принципе „являются обратимыми. Иными словами, эти процессы сами по себе не приводят к необратимому характеру инактивации, а лишь «запускают» другие, истинно необратимые процессы: агрегацию, ковалентные изменения в структуре белка, «необратимые» конформационные изменения. Таким образом, вопрос о реактивации в таких более сложных случаях, по существу, сводится к одной из трех вышеперечисленных ситуаций: реактивации агрегированных белков, реактивации белков с измененной первичной структурой и реактивации «необратимо денатурированных» ферментов или к различным комбинациям этих трех случаев.
Регенерация кофакторов (коферментов)
К категории кофакторов относятся коферменты, простети- ческие группы и ионы металлов. С технологической точки зрения наибольший интерес представляет регенерация коферментов. Коферменты ——это низкомолекулярные органические соеди- нения歹 которые играют роль дополнительного субстрата в функционировании многих ферментов. Примеры наиболее распространенных коферментов приведены ниже.
Формула Название
Неокислительно-в осстановительные системы
X
Кофермент Е (витамин В12)
нз
Асжорбиноваякислота
Ферредоксин (фрагмент молекулы)
оо
о
о
П иридо ксальфосфат(витамин Вб)
Тетрагидрофапат
~0—рно
■'°
о
Пиримидиновыефосфагы,например УДФ
При использовании систем иммобилизованных ферментов с коферментами приходится решать две задачи: собственно регенерацию кофермента и его удержание в реакционной системе. Последнее обычно осуществляется путем ковалентной иммобилизации коферментов на полимерных носителях. Для регенерации разработано несколько подходов, суть которых отражается следующей схемой:
субстратсубстраткофакторкофакторфермент продукт-*^ ^^фермент продукт-*^ ^^(кофактор)(кофактор)система регенерациисистема регенерации
субстрат
субстрат
кофактор
кофактор
фермент продукт-*^ ^^
фермент продукт-*^ ^^
(кофактор)
(кофактор)
система регенерации
система регенерации
побочный продуктпобочный продукт—основной продукткофактор (восстановленной или окисленный)—основной продукткофактор (восстановленной или окисленный)сопряженный субстратсопряженный субстрат
побочный продукт
побочный продукт
—основной продукт
кофактор (восстановленной или окисленный)
—основной продукт
кофактор (восстановленной или окисленный)
сопряженный субстрат
сопряженный субстрат
Согласно этой схеме кофермент, изменяющийся в реакции с участием одного из ферментов, благодаря системе сопряженных реакций регенерирует, т, е. принимает свое первоначальное состояние. В зависимости от типа сопряженной реакции все способы регенерации коферментов можно разделить на две группы: ферментативные и неферментативные. К ферментативным относятся способы регенерации с использованием сопряженных субстратов или сопряженных ферментов. Неферментативные пути можно подразделить на химические и электрохимические. В качестве примера подробно остановимся на пиридиндинуклеотидных коферментах НАД(Н) и НАДФ(Н), способы регенерации которых разработаны наиболее полно.
Ферментативные способы регенерации НАД(Н) и НАДФ(Н). Использование сопряженных субстратов.
Регенерация коферментов может быть проведена, если в систему ввести избыточное количество сопряженного субстрата того же фермента, катализирующего реакцию в обратном направлении. Схематически принцип метода выглядит следующим образом:
основной субстрат
кофактор(окисленный иливосстановленный)
Системы регенерации НАД на основе алкогольдегидрогеназы из печени лошади впервые были предложены Дж. Ван Ей- сом. Один из применяемых процессов — это процесс восстановления лактальдегида в пропан-1,2-диол:
н+ + СНзСН(ОН)СНО + НАДН и СН3СН(ОН)СН2ОН + НАД+
В присутствии сопряженного субстрата, этанола, число циклов НАД может достигать 800.
Разработаны также методы регенерации, основанные на других парах сопряженных субстратов, в частности циклогексанол и n-HHTpo3o-N,N,-диметил анилин. Преимущество использования этой пары заключается в возможности непрерывного слежения за реакцией восстановления и-нитрозо-К^,-диметил- анилина.
Недостатки использования сопряженных субстратов в процессах регенерации НАД связаны с тем, что, во-первых, равновесие реакции альдегид = спирт сильно сдвинуто в сторону спирта (что *гребует высоких концентраций сопряженного субстрата) и, во-вторых, выделение основного продукта из смеси затруднено. Применение известных методов иммобилизации ферментов и коферментов будет способствовать преодолению возникшей проблемы.
Использование сопряженных ферментативных реакций. Суть этого способа регенерации заключается в том, что в реакцию, катализируемую ферментом А, дополнительно вводится фермент В, в функционировании которого участвует сопряженная форма кофермента:
основной продукткофактор(окисленный или восстановленный)вспомогательный субстратосновной продукткофактор(окисленный или восстановленный)вспомогательный субстрат
основной продукт
кофактор
(окисленный или восстановленный)
вспомогательный субстрат
основной продукт
кофактор
(окисленный или восстановленный)
вспомогательный субстрат
Существенным для данного способа регенерации кофермента является различие в специфичности используемых ферментов для исключения возможной конкуренции основных и побочных субстратов и продуктов.
В числе удачных систем регенерации НАД могут быть названы системы л а ктатдегидр о ге наз а — глутаматдегидрогеназа и лактатдегидрогеназа — алкогольдегидрогеназа. Так. включение последней системы позволяет провести десятки тысяч циклов регенерации НАД.
В последние годы системы сопряженных ферментативных реакций находят все большее применение в тонком органическом синтезе. В качестве примера назовем реакцию окисления стероидов в присутствии 17-р-оксистероиддегидрогеназы.
Для регенерации окисленной формы НАД используется катализируемое лактатдегидрогеназой восстановление пирувата.
Для придания большей технологичности промышленным про- цессам разрабатываются процессы регенерации, основанные на применении иммобилизоваиных ферментов и (или) коферментов. Так, процесс регенерации НАД был осуществлен при использовании иммобилизованных в полупроницаемых микрокапсулах алкогольдегидрогеназы и малатдегидрогеназы. Наряду с иммобилизованными ферментами употребляется и иммобилизованный НАД, например, связанный с растворимыми производными декстрана.
Для того чтобы система регенерации коферментов была экономически выгодной, необходимо понизить стоимость вспомогательного субстрата. Это было сделано с применением процесса на основе формиатдегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы (А. М. Егоров, А. П. Осипов, 1978).
НСОО'НСОО'дихлорфенолиндофенол(восстановленный)дихлорфенолиндофенол(восстановленный)формиагдепццюгеназаформиагдепццюгеназадихлорфенолицдофенол(окисленный)дихлорфенолицдофенол(окисленный)
НСОО'
НСОО'
дихлорфенолиндофенол(восстановленный)
дихлорфенолиндофенол(восстановленный)
формиагдепццюгеназа
формиагдепццюгеназа
дихлорфенолицдофенол(окисленный)
дихлорфенолицдофенол(окисленный)
Неферментативные способы регенераци НАД(Н) и НАДФ(Н). К неферментативным методам регенерации кофакторов относятся химические и электрохим ические способы. Ввиду своей низкой специфичности они меньше распространены, чем ферментативные.
Химические методы. В качестве химических реагентов для регенерации НАДН находят применение дитионит натрия и некоторые соли пиридиния. Преимущество проведения регенерации в присутствии этих веществ заключается в их относительно невысокой стоимости. Однако следует отметить, что и дитионит натрия, и пиридиниевые толи могут являться ингибиторами ряда ферментов. и
В последнее время в качестве реагента для химической регенерации НАД применяется сравнительно дешевый флавинмононуклеотид (ФМН). Использование этого вещества обусловлено тем, что флавиновые коферменты участвуют в процессах регенерации НАД in vivo. Иммобилизация ФМН на полиэти- ленимине приводит к существенному увеличению скорости окисления НАДН.
Удобным оказалось применять для регенерации пиридинди- нуклеотидных коферментов различные красители, которые дают возможность определять малые количества коферментов. Среди красителей наиболее употреби мы метиленовый голубой, тиазолил
голубой, акрифлавин, феназинметосульфат. Так, при использовании последнего достигается до 10 000 циклов восстановления кофермента.
Электрохимические методы регенерации коферментов только начинают развиваться. При проведении прямого электрохимического восстановления или окисления кофермента могут возникать трудности, связанные с появлением ферментативно неактивных форм в результате,, например, его димеризации. Для преодоления этих трудностей проводят электрохимическое восстановление иммобилизованного НАД. В качестве носителя используют водорастворимую альгиновую кислоту.
Регенерация АТФ. АТФ — один из важных коферментов, участвующих в ферментативных процессах образования новых химических связей. Для регенерации АТФ применяют следующие методы: 1 — прямой химический синтез из АМФ или АДФ и фосфорной кислоты; 2 —— получение АТФ in vivo с использованием дрожжей, бактерий, клеточных органелл; 3 ——ферментативный синтез in vitro.
Химический синтез АТФ. Осуществляется путем фосфорилирования аденозина или АМФ. В качестве фосфорилирующих агентов употребляются фосфорилхлорид, фосфорная кислота и др. Реакция протекает в органическом растворителе. Химический метод регенерации АТФ не очень удобен из-за образования побочных продуктов, необходимости применения большого избытка фосфорилирующего агента, а также из-за необходимости дальнейшей очистки АТФ.
Регенерация АТФ с использованием целых клеток и органелл. Многие клетки и клеточные органеллы содержат ферменты, катализирующие синтез АТФ из аденозина, АМФ и неорганического фосфата. Так, для регенерации АТФ используются дрожжи, а также субклеточные органеллы, такие, как митохондрии, хлоропласты н хроматофоры. В последние годы для регенерации АТФ начали применять им мобил изованные клетки.
Процесс регенерацит АТФ, происходящий с участием митохондрий, может быть в сумме представлен следующим образом:
2НАДН + 2Н+ + 6АДФ + 6R 十 О? f 2НАД+ + 8H2O + 6АТФ
2 пируват + ЗОАДФ + 30R + 5О2 f 6СО2 + 34Н2О + 30АТФ
К недостаткам этого процесса относятся: 1 ——низкая стабильность систем; 2 ——необходимость создания дополнительной системы регенерации НАД, участвующего в первой реакции.
Значительно более перспективным в регенерации АТФ является использование хроматофоров, способных осуществлять реакцию циклического фосфорилирования. Преимуществом хро- матофоров по сравнению с митохондриями и хлоропластами 144
является их высокая механическая и химическая стойкость, которая может быть еще увеличена путем иммобилизации хро- матофоров в полиакриламидном геле.
Методы ферментативной регенерации АТФ in vitro. Они получили наибольшее развитие. Среди более чем 100 ферментов, катализирующих перенос фосфатсодержащих групп, наиболее часто применяют полифосфаткиназы (реакция 1) и фосфотрансферазы (киназы) (реакция 2):
АДФ + (РО£)〃 ^ АТФ + (POr)n-i (1)
АДФ + BPZ = АТФ + В (2) где ВР — ацилфосфат, фосфоенолпируват, L-фосфоаргинин И т. д.
В качестве доноров фосфатной группы ВР в реакции (2) могут принимать участие такие соединения, как ацетилфосфат, £-фосфоаргннин, 4 фосфо-£-аспартат, карбамилфосфат, креатинфосфат, 1,3-дифосфо-£)-гл ицерат, фосфоенолпируват, фосфорам идат.
При использовании систем регенерации АТФ с участием фосфотрансфераз удается осуществить практически полную регенерацию этого кофермента (с выходом более 95%).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Идеи иммобилизации биокатализаторов инициировали н стимулировали бурное развитие одного из важнейших направлений современной биотехнологии ——инженерной энзимологии. Текущая (тактическая) задача инженерной энзимологии — это разработка (конструирование) биоорганических катализаторов с заданными свойствами на основе ферментов (в том числе с использованием полиферментных комплексов и даже целых клеток). Говоря о «заданных» свойствах, следует понимать, что они продиктованы потребностями практики; это, например, необходимое время службы катализатора при определенных уело- виях реакции (что зависит от его термостабильности, чувствительности к тем или иным факторам среды) т избирательность (специфичность) действия, производительность (каталитическая активность), иммуногенность, токсичность, геометрическая форма препарата катализатора, его механические свойства и т. д.
Однако рамки инженерной энзимологии гораздо шире, чем создание катализаторов нового типа. Цель этой дисциплины, ее стратегическая задача состоит в том, чтобы разработать научные основы применения ферментативных катализаторов для создания новых биотехнологических процессов в промышленности, новых методов в терапии н медицинской диагностике, анализе, органическом синтезе и в других областях практической деятельности.
В качестве примера, наглядно иллюстрирующего разработку новых подходов к решению практических задач инженерной энзимологии с привлечением методов иммобилизации, может служить проблема применения биокатализаторов для проведения реакций органического синтеза в среде органических растворителей с низким содержанием воды. Дело в том, что широкое применение ферментов в органическом синтезе существенно ограничивается тем, что ферменты, как принято считать, способны эффективно функционировать лишь в среде с высоким содержанием воды. В то же время в классическом органическом синтезе в качестве реакционной среды нашли применение самые разнообразные органические растворители. Имеется несколько кардинальных причин, которые делают необходимым использование органических растворителей как среды также и для фермента-
тивных реакций. Во-первых, при использовании органических растворителей решается проблема растворения гидрофобных реагентов, которая часто представляет трудно преодолимый барьер при про ведении реакции в воде. Во-вторых, благодаря использованию органических растворителей термодинамическое равновесие многих ферментативных реакций сдвигается в сторону требуемых продуктов. Прежде всего это относится к тем реакциям, одним из продуктов которых является вода, в частности, к реакциям синтеза сложноэфирных, пептидных и амидных связей. В-третьих, применение органических растворителей снимает проблему бактериального заражения технологических установок, которая весьма остро стоит при использовании водных растворов.
Благодаря этим очевидным преимуществам в последние годы обозначился резко возросший интерес к проблемам биокатализа в неводных средах. Были предложены многочисленные н разнообразные подходы, направленные на конструирование биоката- литических систем, способных функционировать с исключительно малым содержанием воды. С точки зрения круга проблем, обсуждающихся в данном пособии, важным является то, что эти подходы в подавляющем большинстве случаев основаны в той или иной степени на различных способах иммобилизации (физической или химической) биологических катализаторов.
Методические аспекты инженерной энзимологии во многом определены иммобилизационными подходами. В этой книге были рассмотрены лишь основные принципы получения иммобилизованных ферментов и влияние иммобилизации на свойства получаемых препаратов. Поэтому главная цель пособия будет достигнута, если у читателя пробудится интерес к этому разделу биотехнологии н появится желание дальнейшего изучения затро* нутых вопросов.
В заключение отметим, что в целом иммобилизация (как инструмент биотехнологии) сама по себе является достаточно развитой в методическом отношении, в будущем здесь следует ожидать лишь детализации отдельных приемов, а наибольший интерес и перспективы связаны с ее практическим использованием. И в этой связи хотелось обратить внимание, что идеи иммобилизации и ее методология приложимы не только к ферментам, но и многим другим соединениям, как высоко-, так и низкомолекулярным (гормонам, витаминам, лекарственным веществам и т. п.).
ПРИЛОЖЕНИЕ
ПРИМЕРЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДИК
Иммобилизация трипсина на целлюлозе. 10 мл 6%-ного раствора перйодата натрия смешивают с 0,5 г целлюлозы. Перемешивают смесь в течение 3 ч, затем осадок отделяют н промывают водой. Промытый осадок помещают в 10 мл 0,1 М трисового буфера, pH 8,0, содержащего 10 мМ СаС12 для уменьшения автолиза, и добавляют фермент. Количество добавляемого трипсина зависит от его удельной активности и, как правило, это 100 мг. Смесь инкубируют при перемешивании в течение 1—3 ч. Точное время инкубации устанавливают экспериментально, определяя удельную активность нативного трипсина и активность в супернатанте для расчета количества фермента, связавшегося с носителем. Пробы для измерения активности супернатанта следует отбирать в процессе иммобилизации через каждые 20—30 мин. Полученный препарат иммобилизованного фермента отделяют фильтрованием, промывают буферным раствором и насыщенным раствором мочевины для удаления не связавшегося с носителем фермента. Высушенный на фильтре препарат иммобилизованного трипсина может храниться в течение нескольких месяцев при 4℃ практически без потери активности.
Определение ферментативной активности иммобилизованного трипсина. Определение проводят, измеряя скорость ферментативного гидролиза этилового эфира N-бензоил-Ь-аргинина, потенциометрически на pH-стате. Для этого из инкубационной смеси отбирают пробы по 0,5——1,0 мл и помещают в ячейку pH-стата, содержащую 10-3 М субстрата (pH около 7), 0,1 М KCI и 10 мМ СаСА Измеряют активность отобранных проб, учитывая фоновую реакцию гидролиза субстрата в отсутствие фермента.
Ковалентная иммобилизация а-химотрипсина в полиакриламидном геле. Процедура иммобилизации включает две стадии: модификацию хлорангидридом акриловой кислоты и включение в гель.
К раствору 5——20 мг химотрипсина в 10 мл 0,2 М фосфатного буфера, pH 8,0, при 0℃ добавляют 10—100 мкл хлорангид- рида акриловой кислоты порциями по 10 мкл при интенсивном
перемешивании. После добавления каждой новой порции хлор- ангидрида акриловой кислоты инкубируют раствор в течение 5 мин, доводят pH до 8,0, добавляя концентрированный раствор КОН; затем вносят новую порцию модификатора. После завершения модификации раствор инкубируют при 0℃ без перемешивания в течение 30 мин.
К раствору модифицированного фермента (10 мл) последовательно добавляют 3,33 г акриламида, 0,2 г N,Nz-мeтилeн- бис-акриламида и 0,1 мл 10%-ного водного раствора N,N,N',N'- тетраметилэтилендиамина, доводят pH до -8,0 концентрированной НС1 и далее добавляют 20 мг персульфата аммония в виде 20 %-но го раствора. Раствор быстро (в течение нескольких секунд) перемешивают, разливают в тонкостенные стеклянные пробирки диаметром 5 мм и инкубируют в течение суток при 4℃. Полученный гель извлекают из пробирок, измельчают, растирая в ступке, н инкубируют в течение суток в 0,1 М. трисовом буфере, pH 8,0. при 20℃. Суспензию переносят на стеклянный фильтр G-2 (пор-100), промывают несколькими объемами дистиллированной воды, высушивают гель на фильтре в течение нескольких минут. Удельная активность иммобилизованного а-химотрипсина составляет 0,1—0,3 мг фермента на 1 г геля.
Определение активности иммобилизованного а-химотрипси- на. Определение проводят потенциометрически, измеряя скорость ферментативного гидролиза специфического субстрата этилового эфира N ацетил-Ь-тирозина на pH-стате. Для этого навеску иммобилизованного фермента (0,05—1,0 г) помещают в ячейку pH-стата с 5—10 мл 5 мМ раствора субстрата в 0,1 М КС1 (pH 8,0) и измеряют активность препарата фермента, учитывая фоновую реакцию гидролиза субстрата в отсутствие фермента.
Реактивация термоинактивированного иммобилизованного трипсина. Препарат и м мобилизова иного трипсина (0,2—1 г) после термоинактивации (остаточная активность 5——15% от уровня активности препарата фермента до термоинактивации) вносят в 4 мл раствора 10 М мочевины (pH 3) и инкубируют в течение 30 мин. Затем доводят pH до 8,5 концентрированным раствором КОН и в суспензию добавляют 1 мл 0,1 М раствора трисового буфера (pH 8,5), содержащего 10 мг дитиотреитола — реагента, рас тепл яю щего S—S-связи в белках. Суспензию инкубируют в течение 3 ч при 20℃ в атмосфере инертного газа (азота или аргона). После инкубации препарат иммобилизованного трипсина переносят на стеклянный фильтр G-3 (пор-40) и промывают 1 мМ раствором HCI н 5%-ным раствором уксусной кислоты несколько раз порциями по 10——20 мл до исчезновения запаха дитиотреитола. Промывание препарата проводят в токе инертного газа, ее продолжительность не превышает 10——15 мин. Затем препарат помещают в 10 м/ 0,1 М раствора трисового буфера (pH 8,0), содержащего 10 мг ЭД ТА и смесь глутатионов: 12 мг восстановленной формы и 2,4 мг окисленной формы. Инкубацию иммобилизованного препарата в этих условиях проводят
в течение 1—2 сут при 20℃. При этом происходит реактивация иммобилизованного трипсина на 70——100% от уровня исходной (до иммобилизации) активности фермента.
Микрокапсулирование ферментов в полупроницаемые най- лоновые оболочки методом межфазной полимеризации. К 0,75 мл 10%-ного раствора полиэтиленимина, pH которого доведен до 9,8, добавляют 0,75 мл 0,38 М раствора 1,6-гексаметилендиамина в 0,8 М карбонатном буфере, pH 9,8. Раствор перемешивают, охлаждают до 0℃, растворяют в нем 15 мг а-химотрипсина. К полученному 1 %-ному водному раствору фермента в тефлоновом стаканчике объемом 100 мл, помещенном в ледяную баню, добавляют 7,5 мл охлажденной смеси хлороформа и циклогексана (1 : 5 по объему), содержащей 1 % по объему эмульгирующего агента Спан-85. Эмульгируют водный раствор фермента в органическом растворителе на магнитной мешалке при 0℃ в течение 1 мин. Размер капсул определяется скоростью перемешивания и концентрацией Спан-85 —— стабилизатора эмульсии.
К полученной эмульсии типа «вода в масле», не прекращая перемешивания, добавляют 7,5 мл охлажденного 18 мМ раствора себацилхлорида в вышеназванной смеси органических растворителей. Раствор себя цил хлорида готовят непосредствен но перед употреблением путем растворения 0,03 мл дихлорида в 7,5 мл смеси растворителей. В результате диффузии 1,6-гексаметилендиамина из водной в органическую фазу на поверхности раздела фаз образуется полимерная мембрана. Реакцию образования полимерной мембраны на поверхности эмульсионных капелек проводят в течение 3—5 мин при перемешивании. Для прекращения реакции полимеризации к суспензии микрокапсул добавляют 15 мл вышеназванной смеси органических растворителей.
Полученную суспензию микрокапсул разливают в две центрифужные пробирки и добавляют в каждую по 10 мл 15%-ного раствора Спан-85 в смеси хлороформа и циклогексана в объемном соотношении 1 :3. Суспензию перемешивают палочкой и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 1—2 мин, супернатант удаляют.
Микрокапсулы диспергируют в 15 мл 50%-ного водного раствора Твин-20 на магнитной мешалке в течение 1 мин при максимальной скорости перемешивания. К полученной суспензии порциями добавляют 130 мл воды при перемешивании на магнитной мешалке в 0,5 л стеклянном стакане (по мере добавления воды постепенно снижают скорость перемешивания).
Суспензию центрифугируют при 8000 об/мин в течение 2— 3 мин. Супернатант удаляют, микрокапсулы промывают раствором НС1, pH 3,0, до исчезновения ферментативной активности в фильтратах. Полученные микрокапсулы хранят в виде суспензии в 1 мМ НС1 при 4℃. Размеры полученных микрокапсул 10— 15 мкм.
Микрокапсулирование ферментов в поликарбонатные оболочки методом двойного эмульгирования. К 10 мл 10%-ного
раствора поликарбоната в метилен хлориде при интенсивном перемешивании быстро по каплям добавляют 2 мл 1 %-ного водного раствора фермента (pH 3,0), содержащего 5% полиэтилен- амина. Эмульгирование проводят в течение 1 мин. К полученной первичной эмульсии, не прекращая перемешивания, постепенно приливают 50 мл 2%-ного раствора поливинилового спирта — стабилизатора эмульсии в 0,5 М ацетатном буфере, pH 4,7. Продолжают перемешивание в течение 2,5—3 ч при комнатной температуре. За это время метилен хлорид полностью испаряется, и на поверхности водных капелек фермента образуется твердая полупроницаемая полимерная оболочка. Микрокапсулы отделяют и промывают 1 мМ раствором НС1 на воронке со стеклянным пористым фильтром.
Солюбилизация ферментов в обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в органических растворителях. К 2 мл 0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане добавляют 5—150 мкл 10—50 мМ водного буферного раствора, pH 3—11 (концентрация не должна превышать 50 мМ, при наличии высокой ионной силы следует использовать буферный раствор с более низкой концентрацией) .Смесь интенсивно встряхивают до образования оптически прозрачного раствора. Для ускорения процесса образования прозрачного раствора, содержащего большие количества буферного раствора, добавляют буферный раствор порциями по 2—3% (40—60 мкл). Далее добавляют 5—20 мкл водного раствора фермента и опять интенсивно встряхивают до образования оптически прозрачного раствора. Фермент можно вносить и в виде навески сухого обессоленного порошка, однако время растворения фермента в этом случае в системе обращенных мицелл с низким содержанием воды (меньше 2%) существенно увеличивается (от нескольких десятков секунд при внесении водного раствора белка до десятков минут и даже часов при внесении сухого белка). Для солюбилизации белка и определения активности включенного фермента наиболее широко используются растворы Аэрозоля ОТ в октане в концентрациях от 30 до 300 мМ.
Получение наногранулированного а-химотрипсина. К 5 мл 0,235 М раствора Аэрозоля ОТ в толуоле добавляют 100 мг акриламида и 25 мг К^,-метилен-бис-акриламида в 200 мкл воды и инициатор радикальной полимеризации, азо-бис-изобу- тиронитрил, из расчета 0,1 мг/мл. Смесь встряхивают в течение 15——30 мин до полной солюбилизации. Затем к полученному раствору добавляют 100 мкл концентрированного (0,5 мМ) водного раствора акрилоилированного а-химотрипсина (см. его получение в примере 3) и после встряхивания получают однородный прозрачный раствор обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в толуоле, содержащий солюбилизованные мономеры.
Полимеризацию инициируют облучением деаэрированного мицеллярного раствора УФ-светом (ксеноновая лампа ХВО-200, расстояние от источника 33 см, толщина слоя раствора 1 см).
Для завершения полимеризации облучение продолжают в течение 10 мин.
После проведения полимеризации мицеллярную систему разрушают добавлением 10-кратного избытка ацетона. При этом полимерные наногранулы (размер менее 100 нм в диаметре) выпадают в осадок, а растворимые в ацетоне непрореагировавшие мономеры и Аэрозоль ОТ удаляют с супернатантом. Полученный сухой порошок наногранулированного а-химотрипсина обладает до 40——60% ферментативной активности (от исходной), может храниться практически без потери активности в течение полугода при 4℃, растворим как в воде, так и в мицеллярных растворах в органических растворителях.
Гидрофобизация белков (на примере а-химотрипсина) для целей нековалентной иммобилизации на гидрофобных носителях (биомембранах). К 10 мл 0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане добавляют 450 мкл 33 мМ боратного буфера, pH 9,0. Раствор интенсйвно встряхивают в течение 1——2 мин, солюбилизуют в нем 20—50 мг препарата лиофилизованного фермента, затем добавляют 〜100 мкл раствора стеароил хлорида в 0,1 М Аэрозоле ОТ в октане (соотношение стеароилхлорид — белок составляет 2:1). Раствор перемешивают в течение 20—30 мин.
Из реакционной системы белок осаждают на холоду добавлением двойного объема ацетона, выпавший осадок белка отделяют и встряхивают с 20 мл холодного ацетона для отмывки от примесей октана и Аэрозоля ОТ. Эту операцию повторяют 2—3 раза. Остаток ацетона удаляют на роторном испарителе (18℃) или током воздуха. Выход по белку контролируют по массе и спектрофотометрически (280 нм).
Фракционирование стеароилированного химотрипсина проводят на колонке (объем 210 мл) с сефадексом G-50, уравновешенным 1 мМ НС1. На колонку наносят 10—20 мл 20 мкМ раствора белка, pH 3,0. Гидрофильную фракцию элюируют 1 мМ НС1, гидрофобную — 0,5%-ным раствором Бридж 35, pH 3,0. Выход модифицированного белка составляет ~85%.
ЛИТЕВ^У 耿
Основная:
Введение в прикладную энзимологию/Под ред. И. В. Березина и К- Марти- нека. —М.: Изд-во МГУ, 1982. 384 с.
Иммобилизованные ферменты//Современное состояние и перспектнвы/Под ред. И. В. Березина, В. К- Антонова и К- Мартннека. — М.: Изд-во МГУ, 1976. Т. 1, 2. 296 с.; 358 с.
Тривен М. Иммобилизованные ферменты.—М.: Мир, 1983. 213 с.
Лурье А. А. Хроматографические материалы. — М.: Химия, 1978.
Коршак В. В., Штильман М. И. Полимеры в процессах иммобилизации модификации природных соединений. — М.: Наука, 1984. 261 с.
Handbook of Enzyme Biotechnology Ed by A. Wiseman 2-nd edition — Chichester: John Wiley and Sons, 1985. 437 p.
Methods in Ensymology//Immobilized Enzymes/Ed by K- Mosbch,— New York: Academic Press, 1976. Vol. 44. 999 p.
Rosevear A. Immobilized biocatalysts — a critical review//J. Chem. Technol. Biotechnol. 1984. 34 В. P. 127—150. ~
Glazer A. N. The chemical modification of proteins by groupspecific and site-specific reagents//In: The Protein. (H. Neurath, R. L, Hill, Eds). — New-York. Academic Press, 1976. Vol. 2. P. 1—103.
Дополнительная:
Березин Я. В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа.——М.: Высшая школа, 1977. 280 с.
Курганов Б. И. Аллостерические ферменты.—М-： Наука, 1978. 248 с.
Остерман 〃. Д. Хроматография белков и нуклеиновых кислот.——М.: Наука, 1985. 536 с.
Поверхностные явления и поверхностно-активные вещества/Под ред. А. А. Абрамзона и Е. Д. Щукина.—• М.: Химия, 1984. 392 с.
Мартинек К., Березин И. В. Стабилизация ферментов — ключевой фактор при внедрении биокатализа в практику//Успехи химнн. 1980. Т. 49. С. 737—770.
Можаев В. В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению фундаментальных проблем энзимологии//Успехи биологической химии, 1983. Т. 24. С. 99—134.
Хмельницкий Ю. Л., Левашов А. В., Клячко Н. Л., Мартинек К Микро- гетерогенная среда для химических (ферментативных) реакций на основе коллоидного раствора воды в органическом растворителе//Успехи химии. 1984. Т. 53. С. 545—565.
Мартинек К・,Левашов А. 8” Клячко Н. Л.» Хмельницкий Ю. «Я., Березин И. В. Мицеллярная энзимология. Биол. мембраны. Т. 2. 1985. С. 669—696.
Исторический очерк
Биокатал нз/ /История моделирования опыта живой при роды /Березин И. В., Кузнецов В. И.» Варфоломеев С. Д. и др. М.: Наука, 1981. 344 с.
ПРЕДМЕТНЫЙ
УКАЗАТЕЛЬ
Автолиз 121, 122
Агар 14, 16
Агароза 14
Адсорбция ферментов на
но-
сителях 46—56; 60, 61;
80
78
—влияние ионной силы
50
——концентрация фермен-
та 50, 51
— — модификация носителя
51—54
一 ——фермента 54
——пористости носителя
49
pH 50
— — температура 51
—— ——удельной поверхности носителя 49
—способ нанесения в колонке 47, 48
——с перемешиванием 47
——статический 47
—электроосаждение 48, 60, 61
—электроудерживание 56
Акриламид 20, 22
Акролеин 130
Акрилекс 21
Активация носителей, гидроксильных и аминогрупп 27— 31, 42, 43
—амидных групп 33
—карбоксильных групп 32, 33
—путем введения функциональных групп, альдегидных 17, 30, 33, 34
—————диазо- 31, 33
--- --имид0эфирных
30
Активация ферментов 113, 114
Альгинаты 16, 61
Амберлит 19
Амины вторичные, образование с использованием галоген- производных алифатических и ароматических углеводородов 90
— оксиранов 91
—оснований Шиффа 92
—соединений с активированными двойными связями 91
—тииранов 91
Ангидриды карбоновых кислот 86
Бактериальное заражение реакторов
Белковая инженерия 133
Биогель А 14, 15
—Р 21
Бромциан 27, 28, 89
N-винилпирролидон 25, 26, 30, 32, 35
Влажное прядение 70
Вудворда реактив 32, 88 .
Гели для иммобилизации, органические 13, 14, 16, 21, 26, 58—62, 80, 132
— —— из готовых полимеров
14, 16 26, 60—62, 132
— —из мономеров 21, 58—59.
80, 132
—неорганические 59—60
Гепарин 16
Гидрофобные взаимодействия
49 53, 83, 136
Гистерезис 114—116
Дау экс 19
Двойная иммобилизация 66
Дегидроаланин 122
Декстран 12—13, 32, 34
Денатурация 99
—необратимая 126, 136
—обратимая 128
Диазония соли 93
Диссоциация фермента на субъединицы 125, 128
Диффузионные ограничения 18, 50, 63, 67, 72, 78, 101, 107, 112—115, 117
Диффузия, внешняя 101 —103
—внутренняя 102, 105—107
II мидокарбонаты 27, 28, 89
Имидоэфиры 89, 90
Имины 91
Иммобилизация сополимериза- ционная 129, 130
Инактивация, «самоубийственная» (суицидная) 124
—ферментов 113, 114
——при иммобилизации 51, 59, 60
Ингибирование ферментов 113,
114
Карбодиимиды 32, 87
Карбонаты циклические 89
Карбохром 44
Кератин 18
Кинетически контролируемый процесс 102
Колебания кинетические 114, 116
Коллаген 17, 60
Комплексы полиэлектрол итные 61, 62
Конформация иммобилизованного фермента 98, 99
Концентрация удельная иммобилизованного фермента 104
Коферменты 138—141
Лайнуивера-Берка координаты
103, 104
Лантионин 122, 123
Лизиноаланин 122, 123
Мембраны жидкие 70
Микрокапсулы 68, 69
— белковые 69
—нитроцеллюлозные 69
—полиамидные 69
Микроорганизмы термофильные 132
Микросреда иммобилизованного фермента 51, 52, 66, 67, 78
Микроэмульсии 73—75, 80
—бездетергентные 75
Мицеллы обращенные 39, 40, 65, 73, 80
Михаэлиса — Ментен уравнение 97, 102, 105, 106, 113, 117
Модификация носителя 42, 44, 51—54
——альбумином 52
——гидрофобными группами 53
——ионами металлов 42, 52
——лигандами фермента 54
——липидами 44, 54
——полимерами 52
——танином 53, 54
Модификация фермента 54, 129
——аналогом мономера 80, 129
——гидрофобными группами 54
————полиэлектролитами 54
Молселект 13
Мочевина, производные 88—
90
Найлон-6, 25, 52
Наночастицы 65
Нернста слой 105
Нитрены 95
Нитрилы 89
Носители алюмосиликатные 43
—белковые 16—18, 30
—кремнеземные 42—43
—полиакриламидные 20, 30, 32, 33, 99
—полиамидные 25, 27, 30, 31
— полисахаридные 10—16, 28, 30, 32, 99, 132
— полистирольные 19, 30, 33, 99
—на основе： липосом 37—38, 40—41, 71
————металлов и их оксидов 44
——一монослоев липидов 35—— 37
——поверхностно - активных веществ 38—40
——пористой керамики 43
——一поливинилового спирта 26, 30, 31, 62
——一угля н графитированной сажи 44
Оксираны 28—29, 91
Определение иммобилизации 7, 45
Орнитиноаланин 122, 123
Плазмида 133
Плиакриламидный гель 20—— 21, 30, 33, 59, 130, 152
Полимеризация эмульсионная 19, 65, 80
Полиуретаны 26
Полиферментные системы 117
Полые волокна 70
Пористость носителей 10, 13, 19, 21, 24
Превращение высокомолекулярных субстратов 50, 67, 72
Пришивка 78
Протеолиз 121, 127
Размер частиц носителя 63— 66, 80, 105
Распределение субстрата 100,
105, 108, 112, 118
Рацемизация аминокислот 124
Реакция азосочетания 93
—алкилирования 90, 91
—арилирования 90, 91
—ацилирования 85, 86
—конденсации 92
—тиол-дисульфидного обмена 93
Ретикуляция 79——82
Регенерация НАД(Н) и
НАДФ(Н) 141 — 143
—АТФ 143—144
Сайт-специфический мутагенез 133
Связь азометннован, образование 92
———восстановление
—амидная, образование с использованием активированных эфиров 87
———ангидридов 86
———карбодиимидов 87
———реактива Вудворда 88
———хлорангидридов 86
——дисульфидная, образование 93, 137
Сефадекс 13, 54
Сефароза 14, 31
Силикагель 42, 51, 59, 60
Сорбция аффинная 54
Стерические ограничения 108
114
Сополимеризация 20, 21, 24, 26, 80, 130
Сферон 24—25
Сшивка 10, 13. 29, 78, 131
Тиираны 91
Тилемодуль 107
Тиолактон гомоцистеина 85, 94
Тиолы 94, 95, 120, 136, 137
Ультрогель 21, 23
Ферментативные пленки, получение 81
Фика закон, первый 102, 105,
115
————второй IU5
Фильтровальная бумага 52
Форма носителей 21, 24, 25, 37, 41, 42, 44, 47, 79, 80
Фосфорилирование 124, 127
Хитин 11—12
Хитозан 12
Хлорангидридыкарбоновых
кислот 86, 130
Хлортриазины 29, 54, 91
Хлорметилирование 33
Шиффа основания 82, 90, 92
Энзакрил 21, 32
Эфиры активированные 87
Эффекты в катализе, кооперативные и аллостерические 97, 117
—pH 108, 109, 111
МикрокапсулированиеДвойное эмульгирование .Включение в волокна .Включение в липосомыПреимущества н недостатки иммобилизации с использованием полупроницаемых оболочек МикрокапсулированиеДвойное эмульгирование .Включение в волокна .Включение в липосомыПреимущества н недостатки иммобилизации с использованием полупроницаемых оболочек 5 6 9 91018273435353841424345464647494951565750606267^^^топ ^^7373755 6 9 91018273435353841424345464647494951565750606267^^^топ ^^737375
Микрокапсулирование
Двойное эмульгирование .
Включение в волокна .
Включение в липосомы
Преимущества н недостатки иммобилизации с использованием полупроницаемых оболочек
Микрокапсулирование
Двойное эмульгирование .
Включение в волокна .
Включение в липосомы
Преимущества н недостатки иммобилизации с использованием полупроницаемых оболочек
5 6 9 91018273435353841424345464647494951565750606267^^^топ ^^737375
5 6 9 91018273435353841424345464647494951565750606267^^^топ ^^737375
ОПЛАВЛЕНИЕ
Предисловие
Введение
Глава 1. Носители для иммобилизации ферментов .....
Органические полимерные носители § 1. Природные носители ..
j 2. Синтетические полимерные носители У^ЛСктивация полимерных носителей .
Биодеградация полимерных носителей ...
Органические низкомолекулярные носители
Природные носители (липиды) .....
§_^< Синтетические аналоги липидов (поверхностно-активные вещества) "тТОРганические материалы — носители для иммобилизации ферментов . § 7. Макропористые кремнеземы ......
Другие неорганические носители .
Глава II. Методы физической иммобилизации ферментов .
Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях § 1. Носители для адсорбционной иммобилизации ь%%^етоднка адсорбционной иммобилизации f 3/11 ри рода адсорбционных взаимодействий фермента с носителем . ，.
Влияние различных факторов на адсорбцию ферментов на носителе 1$ 5. Способы увеличения эффективности связывания фермента с носителем
Преимущества и недостатки адсорбционной иммобилизации ... Иммобилизация ферментов путем включения в гели ^Г^Иммобилизация ферментов в гелях, полученных полимеризацией мономеров
Иммобилизация ферментов в гелях, полученных из готовых полимеров Влияние различных факторов на каталитическую активность ферментов, иммобилизованных путем включения в гель ^ПВ\ Преимущества н недостатки иммобилизации ферментов путем вклю- чения в гель ..
Ч^ммобилизация ферментов с использованием полупроницаемых оболочек (мембран) ....
Иммобилизация ферментов с использованием систем двуфазного типа .
§ 16. Двухфазные системы типа <вода ——несмец1ивающнйся с водой ор ганический растворитель» ..
Микроэмульсии . . . -. .■...
Двухфазные водные системы
J л а в a III. Химические методы иммобилизации ферментов .. . . .77
Основные принципы конструирования препаратов ковалентно иммобилизованных ферментов 77
Химическая структура ферментов и их функциональные группы .82
Приемы химической (ковалентной) иммобилизации белков . . . .86
Недостатки и преимущества получения и использования ковалентно иммобилизованных ферментов . . , . . .. . . ,95
Глава IV. Кинетико*термодинамические закономерности катализа иммобилизованными ферментами . . . .97
Кинетические параметры ферментативных реакций .. . ..97
Влияние иммобилизации на состояние фермента 98
Эффекты распределения реагентов в катализе иммобилизованными ферментами 100
Глава V. Стабильность иммобилизованных ферментов
Воздействия и вещества, вызывающие инактивацию ферментов .
Молекулярные механизмы инактивации ферментов ....,.
Влияние иммобилизации на инактивацию ферментов
Подавление с помощью иммобилизации первичных обратимых стадий денатурации и диссоциации нативных белков
Пути стабилизации ферментов, не основанные на методе иммобилизации
Глава VI. Регенерация компонентов систем с иммобилизованными фер
ментами 135
Реактивация инактивированных ферментов . .135
Регенерация кофакторов (коферментов) ...138
Заключение .. . . .. .,146
Приложение ....148
Литература • • • - • • ■153
Предметный указатель 154
Учебное издание
БИОТЕХНОЛОГИЯ. В 8 кн.
Илья Васильевич Березин,
Наталья Львовна Клячко,
Андрей Вадимович Левашов,
Карел Мартинек,
Вадим Всеволодович Можаев, Юрий Ленорович Хмельницкий
Книга 7
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ
Заведующий редакцией А. Г. Гаврилов. Редактор М. М. Пенкина. Младшие редакторы И. М. Павлова, Е. И. Попова. Художественный редактор Т. А. Колен- кова. Художник С. Ю. Вериченко. Технический редактор Н. А. Битюкова. Корректор С: К- Завьялова
ИБ № 6703
Изд. № Е-536. Сдано в набор 17.02.87. Подп. в печать 06.10.87. Т—19013. Формат 60Х9(У/[б， Бум. кн.-журн. Гарнитура литературная. Печать офсетная. Объем 10 усл. печ. л. 20,5 усл. кр.-отт. 9,76 уч.-изд. л. Тираж 30 000 экз. Заказ № 133. Цена 35 коп.
Издательство «Высшая школа», 101430, Москва, ГСП-4, Неглинная ул., д. 29/14. ярославский полиграфкомбинат Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. 150014, Ярославль, уп. Свободы, 97.
35 коп.
ПРОБЛЕМЫ
И ПЕРСПЕКТИВЫ
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯКЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
СОВРЕМЕННЫЕ МЕЮЫ СОЗДАНИЯ ПЮМЫШЛЕННЫХ Ш1АММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
44ИНЖЕНЕРНАЯЭНЗИМОЛОГИЯИНЖЕНЕРНАЯЭНЗИМОЛОГИЯ
4
4
ИНЖЕНЕРНАЯ
ЭНЗИМОЛОГИЯ
ИНЖЕНЕРНАЯ
ЭНЗИМОЛОГИЯ
АВТОМАТИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
ПЮИЗВСДСТВО
БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСЮЕ
ПРОИЗВСДСТВО БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПРЕПА1Ж)В
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ
① ЕРМЕНЫ