Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
ПРЕДИСЛОВИЕ
Традиционные биотехнологии, существующие тысячелетиями, используют для получения продуктов, необходимых человеку, организмы животных, растений, микроорганизмы.
Новый этап биотехнологии, развитие которого происходит в настоящее время, связан не только с интенсификацией и улучшением традиционных технологий, но и с появлением принципиально новых. Объектами этой новой биотехнологии стали культивируемые ткани и клетки высших многоклеточных организмов — животных и растений, а также микроорганизмы, созданные методами генной инженерии.
Данное учебное пособие содержит главы, посвященные клеточной инженерии. Этот термин применяется либо в очень узком смысле, предполагая только генетическое конструирование новых форм жизни при помощи гибридизации клеток (животных, растений), либо в очень широком, включая сюда как использование самих культивируемых клеток, так и различные манипуляции с ними, с целью создания технологий, позволяющих решать важные для хозяйственной деятельности человека задачи. Авторы, участвующие в создании данного пособия, использовали термин «клеточная инженерия» в его широком значении.
В первой главе разбираются проблемы получения клеточных культур, их отличия от исходных тканевых клеток целого растения и различия при разных способах культивирования. Вторая глава посвящена протопластам растительных клеток, их выделению и культивированию. Изолированные протопласты являются удобным объектом для биологического конструирования. Гибридизация и цибридизация соматических клеток на основе слияния изолированных протопластов, введение органелл и бактериальных клеток, хромосом и чужой ДНК — основа технологии полученная генетически измененных клеток и растений.
В третьей главе понятие клеточная инженерия распространено на совсем новую и очень перспективную область исследования, а именно — создание экспериментальных эндо- и экзо- ассоциативных систем между культивируемыми клетками высших растений и микроорганизмами. Основное содержание этой главы составляют новые данные, полученные коллективом авторов
на кафедре клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова, касающиеся разработки и изучения экспериментальных ассоциативных систем между растительными клетками, а также растениями, регенерированными из них, и цианобактериями.
В последней, четвертой главе описана одна из самых интересных и важных для многих областей науки и практики технологий, а именно технология получения моноклональных антител с помощью гибридомной техники. Глава имеет введение, где кратко изложены те основы иммунологии и иммунохимии, которые раскрывают суть проблемы, а также описаны организация лаборатории, необходимое оборудование, компоненты питательных сред, выбор экспериментального животного.
Главы данной книги отличаются своеобразием по целям, содержанию и форме, однако если сравнить отправные положения, лежащие в основе манипулирования с клетками и изолированными протопластами растений и клетками животных, то несомненно, здесь можно обнаружить как общность биологических основ, так и методических приемов, используемых для создания конкретных клеточных технологий.
Настоящая работа представляет собой первую попытку суммировать достижения клеточной физиологии и клеточной инженерии в учебной литературе. Она написана коллективом авторов биологического факультета МГУ: гл. 1 — чл.-кор. АН СССР Р. Г. Бутенко, гл. 2 — доц. Е. Н. Маркаровой, гл. 3 — ст. науч. сотр. Т. Г. Корженевской и проф. М. В. Гусевым, гл. 4 — ст. науч. сотр. А. Ф. Киркиным.
Авторы выражают искреннюю благодарность рецензентам проф. Б. В. Громову и проф. А. В. Капле за критический разбор работы. Они будут признательны читателям за все замечания и пожелания, которые просим присылать по адресу: Москва 119899, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра клеточной физиологии и иммунологии.
Авторы
ВВЕДЕНИЕ
В отличие от микроорганизмов, которые издавна используются в традиционных технологиях (хлебопечение, производство кис- ло-молочных продуктов и др.), культуры клеток высших организмов являются сравнительно новым объектом биотехнологии. На их жизнедеятельности может быть основано производство биологически активных веществ, вакцин, моноклональных антител.
Идея о возможности культивирования клеток вне организма была высказана еще в конце прошлого века в отношении клеток растений. Однако впервые удалось ввести в культуры клетки животных, что было осуществлено в начале нашего века. Культивировать растительные клетки на искусственных питательных средах исследователям долго не удавалось. Первые успехи в этой области относятся к 30-м годам, и бурное развитие нового направления работ с клетками растений и животных происходит в 60—70-е годы.
Этапным периодом для развития метода культуры клеток можно считать 70-е годы, когда были сделаны успехи в разработке способа получения изолированных протопластов растений, а также открытие гибридизации соматических клеток. Изолированные протопласты высших растений и культивируемые клетки животных стали объектом клеточного конструирования путем гибридизации или введения в них чужеродного генетического материала (клеточных органелл, бактерий). Применение методов клеточного конструирования служит задачам улучшения свойств клеток-продуцентов в культуре, а в случае растительных клеток также получению растений с новыми свойствами (в силу тотипотентности растительной клетки).
Большая роль в развитии методов работы с культурами клеток и, в частности, по конструированию новых клеточных систем принадлежит советским ученым. Работы по соматической гибридизации изолированных протопластов с получением новых сортов растений ведутся в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР, Институте ботаники им. Н. Г. Холодного АН УССР, Институтах картофельного хозяйства РСФСР и УССР, за что в 1984 г. авторский коллектив во главе с чл.-кор. АН СССР Р. Г. Бутенко был удостоен Государственной премии СССР. Работы по введению бактерий в культуры растительных клеток начинались в разных лабораториях страны и в настоящее время систематически ведутся в МГУ им. М. В. Ломоносова. На основе гибридомной техники в ряде научно-исследовательских институ-
тов налажено получение моноклональных антител ко многим антигенам; некоторые из этих препаратов нашли применение в медицинской практике.
Сравнительная молодость и быстрое развитие данного направления исследования определили некоторую произвольность терминологии. Ниже приводится перечень основных терминов, которые часто используются при культивировании клеток растений и животных, а также при манипулировании с ними. Определения основываются на списке терминов, принятых при культивировании животных и растительных клеток Комиссией по клеточным культурам при Межведомственном совете по физико-химической биологии и биотехнологии при ГКНТ Совета Министров СССР и АН СССР.
Время генерации клетки — интервал времени между двумя последовательными клеточными делениями.
Время удвоения популяции — интервал времени, за который число клеток в популяциях увеличивается вдвое.
Дедифференциация — переход специализированных, неделя- щихся клеток к пролиферации.
Дифференциация — комплекс процессов, приводящих к различиям между дочерними клетками, а также между материнскими и дочерними клетками.
Дифференцировка — состояние специализации клеток, отличающее их от других.
Изолированный протопласт — растительная клетка, лишенная клеточной стенки с помощью ферментативного разрушения или механическим способом.
Инокулюм (трансплант) — часть суспензионной (каллусной) культуры, используемая для пересадки в свежую среду.
Каллус — ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток органов растений.
Клеточная селекция — метод выделения мутантных клеток и сомаклональных вариаций с помощью селективных условий.
Клон — культура, возникшая из одной клетки.
Культура каллусных тканей — выращивание в длительной пересадочной культуре тканей, возникших путем пролиферации клеток изолированных сегментов разных органов или самих органов (пыльники, семяпочки и т. д.) растений.
Культивирование изолированных протопластов — выращивание клеток, лишенных стенок, в жидкой или на агаризованной среде, содержащей в качестве дополнительного компонента осмотически активное вещество (стабилизатор) в оптимальной для данного вида концентрации. При регенерации стенок у изолированных протопластов культура превращается в культуру клеток..
Культура клеток (суспензионная культура) — выращивание отдельных клеток или небольших групп их во взвешенном состоянии в жидкой среде при использовании аппаратуры, обеспечивающей их аэрацию и перемешивание.
Культура опухолевых тканей — выращивание в длительной культуре сегментов, изолированных из растительных опухолей разного происхождения и освобожденных от патогенов, индуцировавших развитие опухоли.
Культура отдельных клеток — выращивание одиночных клеток при низкой плотности высева: 1) на очень богатых питательных средах, 2) с помощью культуры «няньки» или 3) питающего слоя.
Культура эксплантов — инкубация в стерильных условиях на питательных средах, либо вызывающих, либо не вызывающих пролиферацию сегментов, изолированных из разных органов растений.
Линия — культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая маркерные признаки.
Популяция клеток — совокупность культивируемых клеток.
Редифференциация — переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими делениями или непосредственно.
Ростовой цикл — рост популяции клеток в цикле периодического выращивания, характеризуется S-образной кривой. Фазы ростового цикла: латентная, экспоненциальная, замедления роста, стационарная, деградации.
Слияние изолированных протопластов — формирование одной клетки из двух и более объединением их поверхностных мембран.
Сомаклональные вариации и варианты — фенотипическое выражение непостоянства ядерного и органельных геномов растительных клеток. От истинных генных мутаций отличаются большей частотой возникновения и комплексностью изменений (изменение в структуре генов, хромосом, геномов).
Соматическая (парасексуальная) гибридизация — система, вовлекающая в генетическую рекомбинацию хромосомы и гены ядра и органелл вне сексуального цикла, например, путем слияния изолированных протопластов. Приводит к появлению соматических гибридов-растений и гибридных клеточных линий.
Субкультивирование — перенос клеток в другой культуральный сосуд на свежую питательную среду.
Тотипотентность — свойство соматических клеток растений полностью реализовать свой потенциал развития, т. е. реализовать омнипотентность ядра с образованием целого организма.
Цикл выращивания — период от помещения инокулюма или трансплантата в свежую среду до последующего субкультивирования.
Штамм — культура, возникшая после первого субкультивирования. Состоит из многих клеточных линий, возникших из клеток, присутствующих в первичной культуре.
Эксплант — фрагмент ткани или органа, инкубируемый самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса.
In vitro — выращивание живого материала «в стекле», на искусственных питательных средах, в асептических условиях.
Глава
КУЛЬТУРА КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
Метод культуры клеток высших растений лежит в основе изучения биологии клетки, существующей вне организма. Популяциям растительных клеток, выращиваемым в искусственных условиях, присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференциальной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции наблюдается преимущественное размножение клеток, фенотип которых наиболее соответствует данным условиям 1ыращивания, и популяция эволюционирует. Изменчивость, наследуемость возникших изменений, адаптивный отбор и эволюция, свойственные культивируемым клеткам растений, позволяют считать, что они являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока еще мало изучены. Однако знать их очень важно, потому что культивируемые клетки высших растений широко используются в фундаментальных исследованиях и в практике. Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения. Отличия культивируемых клеток от клеток организма, часто специально усиленные созданием биохимических мутантов, гибдидных или трансформированных клетокг помогают глубже проникнутьвмеха низм процессов, происходящих в растениях. Простота клеточных моделей, возможность быстро получать достаточную массу в асеп тических, контролируемых по многим параметрам условиях выращивания являются преимуществами такого моделирования.
На основе культивируемых клеток и тканей растений созданы технологии для промышленности и сельского хозяйства. Углубление знаний биологии культивируемых растительных клеток обязательно для дальнейшего прогресса в разработках принципиально новых, перспективных для практики технологий.
Возникший немногим более 50 лет назад метод культуры
ю
клеток и тканей растений развивался и продолжает развиваться очень интенсивно. Совершенствуются и возникают новые методические приемы, углубляются знания биологии самих объектов и понимание механизмов их поведения, множатся технологии, созданные для практического применения.
Задача этой главы — самое общее введение читателя в область культивирования клеток растений и ознакомление с наиболее характерными особенностями их биологии.
5 1. Об мстормм развития метода культуры клеток, тканей и органов растений
Период с 1892 по 1902 г. можно считать предысторией развития метода культуры клеток и тканей растений. В конце прошлого, самом начале нашего века немецкие ученые X. Фехтинг (Н. Vochting, 1892), К. Рехингер (С, Rechinger, 1893), Г. Габер- ландт (G. Haberlandt, 1902) пытались выращивать изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Длительно растущих in vitro культур они не получили. Однако Рехингер наблюдал процесс образования каллуса сегментами стебля тополя, корня одуванчика и других и определил минимальней размер фрагмента, способного образовать каллус. Не достигнув экспериментальных успехов, эти первые исследователи высказали ряд идей и гипотез, реализованных значительно позже. Фехтинг считал, что полярность присуща не только органам растения, но и отдельной клетке. Габерландт выдвинул гипотезу о тотипотентности любой живой клетки растения.
Период с 1902 по 1922 г. не принес удач ботаникам, работающим над созданием оптимальных питательных сред, способных обеспечить существование и длительное размножение in vitro изолированных тканей и клеток растений. Были получены первые результаты по культивированию тканей животных на питательных средах с добавлением сывороток. Однако попытки ботаников вырастить изолированные ткани растений на средах с добавлением экстрактов растительной ткани (по аналогии с применением сывороток крови и эмбриональной для клеток животных) были неудачны.
В 1922 г, Роббинс и независимо от него Котте показали возможность культивирования на синтетической питательной среде меристемы кончика корня томатов и кукурузы. Эти опыты можно считать началом применения метода культуры изолированных органов растений.
1932—1939 гг. — совершенствование метода культуры тканей и клеток высших растений, начавшееся с работ американского исследователя Ф. Уайта и французского Р. Готре (1932—1934). Оба они повторили опыт Роббинса и Котте, показав, что изолированные корни могут расти в культуре неограниченно долго.
если их кончики периодически пересаживать на свежую питательную среду. Способность к неограниченному росту при субкультивировании была продемонстрирована позже этими авторами для каллусных тканей камбиального и паренхимного происхождения (R. Gautheret, 1934), а также для тканей растительных опухолей (Р. White, 1939).
В период 1940—1960 гг. увеличилось число видов используемых растений, ткани которых выращивали in vitro. Список, приведенный в монографии Р. Готре (R. Gautheret, 1959), включал уже 142 вида. Длительные пересадочные культуры успешно получали из разных органов и тканей растения. Были разработаны составы питательных сред, изучено значение макро- и микроэлементов для поддержания нормальной ростовой активности ткани. Выявлена потребность культур в витаминах и стимуляторах роста. Оценено значение натуральных экстрактов типа эндосперма кокосового ореха, каштана, кукурузы и других растений для поддержания неорганизованного клеточного роста и стимуляции процессов органогенеза и соматического эмбриогенеза в культуре каллусных тканей и клеточных сусдензий. В работе с культурой ткани открыт новый класс фитогормонов (цитокинины) и показано значение кинетина и других N-6-замещенных аминопуринов для пролиферации клеток in vitro и индукции стеблевого, морфогенеза (R. Heller, 1953; Z. Kulescha, 1954; I. Nitsch, 1955; C. Miller, F. Skoog, 1955; F. Steward, 1958, P. Г. Бутенко, 1958).
Разработан метод получения и выращивания больших масс клеточных суспензий (L. Nickell, W. Tulecke, 1959), а также метод культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки, деление которой индуцируется с помощью ткани-няньки (L. Jones et al., 1960; М. К- Павлова, Р. Г. Бутенко, 1965).
1960—1975 гг. — предложен метод получения изолированных протопластов из тканей корня и плодов томатов путем обработки их смесью пектолитических и целлюлитических ферментов (Е. Cocking, 1960). Найдены условия культивирования изолированных протопластов, при которых они образуют новую клеточную стенку, делятся и дают начало клеточным линиям, способным в ряде случаев к морфогенезу (I. Takebe et al., 1971). Вместе с тем изолированные протопласты, еще не образовавшие клеточную стенку, были использованы для разработки методов гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью полиэтиленгликоля (ПЕГ) и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. Первые соматические гибриды послужили моделями для изучения поведения ядерного и цитоплазматических геномов партнеров в гибридных клеточных линиях и в потомстве соматических гибридов растений, регенерировавших из гибридных клеток (Р. Г. Бутенко, 1979, Ю. Ю. Глеба, 1980).
Разработан метод культуры меристем, позволяющий получать тестированные на отсутствие вирусов и других патогенов растения. С помощью этого же метода безвирусные растения с высоким
коэффициентом размножаются. Метод широко используется для получения оздоровленного посадочного материала многих экономически важных растений.
Продолжается разработка методов и аппаратуры для глубинного культивирования клеток.
Впервые получены и изучены растения-регенеранты табака, представляющие сомаклональные варианты исходной формы (Н. Загорска и др., 1967).
Период 1976—1985 гг. — разработаны метод электрослияния изолированных протопластов (U. Zimmerman, 1983) и методы селекции гибридных клеток. С использованием изолированных протопластов и векторов, созданных на основе Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens, создан эффективный способ переноса генов для двудольных растений.
Методы мутагенеза и клеточной селекции, получения сома- клональных вариантов и экспериментальных гаплоидов применяются для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных растений.
Методы скрининга биохимических мутантов привели к появлению более продуктивных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых в промышленности. Возникли методы иммобилизации культивируемых клеток с целью биотрансформации химических соединений.
Дедифференцировка и каллусогенез как основа создания
пересадочных клеточных культур
Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Значительно реже культивируют клетки опухолей растений разного происхождения. Культуры опухолевых клеток при поверхностном и глубинном выращивании мало отличаются внешне и на уровне морфологии клеток от культур кал- лусных клеток. Значительным физиологическим различием между ними является гормононезависимость опухолевых клеток, позволяющая им делиться и расти на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Опухолевые клетки лишены также способности дать начало нормально организованным структурам — корням или побегам в процессе органогенеза и эмбриоидам в процессе соматического эмбриогенеза. В некоторых случаях они образуют тератомы (уродливые органоподобные структуры), нормальное развитие которых дальше не происходит.
Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно приобрести гормононезависимость. Природа такой гормононеза- висимости к одному или обоим гормонам (ауксину и цитокинину), применяемым при выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормононезависимость клетки). При генетической гормононезависимости
каллусные клетки ведут себя так же, как опухолевые, при эпигенетической они теряют признак гормононезависимости в ряду превращений клетка^-растение—►клетка, что и является доказательством негенетической природы такой приобретенной гормононезависимости.
Каллусная клетка,—в результате деления которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растениюГДл ffpacre- ния 'каллус является тканью, возникающей в исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей непродолжительное время Эта ткань защищает место поранения, накапливает питательные вещества для анатомической регенерации или (и) регенерации утраченного органа.
Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей разных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду in vitro в пробирки, колбы, чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требует строго стерильных условий. Для этого с помощью растворов, содержащих активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экспланты, тщательно отмывая их затем от употребляемого раствора стерильной водой. Стерилизуют в автоклаве или фильтрованием через ультрафильтры питательную среду. В автоклаве при давлении 19,6- 104 Па (2 атм) в течение 1 ч или сухим паром в шкафах при 160°С в течение 1,5 ч стерилизуют посуду, инструменты, материалы, необходимые для работы. Манипуляции с культурами проводят в боксах микробиологического типа, облучаемых перед работой ультрафиолетом, или в ламинар-боксах, где асептика достигается постоянной подачей стерильного воздуха в рабочий объем (Р. Г. Бутенко, 1964).
Особенности дедифференцировки кпе^ок чкеплянтя и каллусо- гецеза- зависят, от эпигенетических характеристик составляющих его тканей. Клетки тканей запасающей паренхимы, корня и стебля, мезофилла листа и других специализированных тканей, эксплантированных на питательную среду, содержащую минеральные соли, источники углерода, витамины и гормоноподобные вещества, должны дедифференцироваться, т. е. потерять структуры, характерные для их специфических функций в растении и вернуться к состоянию делящейся клетки. На рис. 1 изображены фазы клеточного цикла и показано, в каких из них клетки могут выйти из цикла деления (митотического цикла) и перейти в дифференцированное состояние и соответственно вернуться в цикл при дедифференцировке и индукции их к делению.
В большинстве случаев клетки переходят к. специализации из фазы 61, предшествующей 5-фазе, в которой происходит центральное событие в делении клетки — синтез ДНК, специализированные клетки возникают редко в результате выхода клеток из цикла деления после репликации ДНК, в 6г -фазе. При изуче-
Рис. 1. Схема клеточного цикла:S — фаза синтеза ДНК; Gj — пресинте- гическая; Gs — постсинтетнческая фаза; М — митоз; Ri и R2 — фазы покоя; D — дифференцировкаРис. 1. Схема клеточного цикла:S — фаза синтеза ДНК; Gj — пресинте- гическая; Gs — постсинтетнческая фаза; М — митоз; Ri и R2 — фазы покоя; D — дифференцировкавания и в зависимости от различий в физиологическом состоявания и в зависимости от различий в физиологическом состоя
Рис. 1. Схема клеточного цикла:
S — фаза синтеза ДНК; Gj — пресинте- гическая; Gs — постсинтетнческая фаза; М — митоз; Ri и R2 — фазы покоя; D — дифференцировка
Рис. 1. Схема клеточного цикла:
S — фаза синтеза ДНК; Gj — пресинте- гическая; Gs — постсинтетнческая фаза; М — митоз; Ri и R2 — фазы покоя; D — дифференцировка
вания и в зависимости от различий в физиологическом состоя
вания и в зависимости от различий в физиологическом состоя
нии молекулярных механизмов дедифференцировки, действия гормонов и других факторов, индуцирующих деление, небезразлично, в какой фазе клеточного цикла данная клетка перешла к дифференцировке, т. е. с какой фазы ей предстоит двигаться повторно по циклу. Часто эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. Так, взятый целиком фрагмент стебля имеет в своем составе клет
ки — эпидермальные, первичной коровой паренхимы, камбия и сосудистой системы, сердцевинной паренхимы. В разных условиях культивиро-
нии исходного растения можно наблюдать преимущественную пролиферацию клеток камбия и его молодых дериватов, коры и сердцевинной паренхимы. Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причин гетерогенности культуры каллусной ткани, так как некоторые функциональные особенности исходных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации
или эпигенетически наследуемые признаки.
В клетках экспланта, состоящего из неделящихся, специали
зированных клеток, в самом начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматическими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к процессу деления. Для разделения этих процессов можно рекомендовать прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в течение 3—6 сут. Это позволяет исключить не только изменения, связанные с травмой, но и возможное не контролируемое влияние эндогенных гормонов экспланта на изучаемые процессы. При соблюдении указанного условия становится ясной роль в индукции клеточного деления фитогормонов группы ауксинов и цитокининов, дедифференцировке специализированных клеток и в поддержании каллусных клеток в делящемся состоянии, приводящем к образованию первичного каллуса. При этом наблюдаются сложные взаимодействия между ауксинами и цитокининами. Присутствие в среде одного ауксина определяет переход специализированной клетки из покоящейся фазы Go к вступлению в S-фазу клеточного цикла. Однако для завершения фазы синтеза ядерной ДНК, синтеза белков, стимулирующих переход
Таблица 1. Процент делящихся клеток на 5-й день после последовательной обработки протопластов из мезофилла табака фитогормонами (Н. А. Дмитриева, 1983)
Время экспозиции
Последовательность обработки*
с первым гормоном
а-НУК — 6 БАП
6 БАП— а-НУК
0
0
0
5 мин
28
0
30 мин
30
0
5 ч
40
.0
25 ч
45
0
48 ч
10
0
* а-НУК — а-нафтил уксус на я кислота — синтетический ана лог ауксниа; 6 БАП — 6-бензиламннопурин— синтетический цитокинин.
клеток к митозу и цитокинезу, необходимо добавление к среде кинетина или другого цитокинина (табл. 1).
В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех форм РНК (рис. 2), исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменениях в активности генов и белкового аппарата клеток при дедифференцировке.
Очень своеобразно проходит процесс дедифференцировки и каллусогенеза в апикальной меристеме стебля (рис. 3). Сразу
аб
Рис. 2. Активация синтеза РНК при подготовке клеток сердцевиннойпаренхимы стебля табака к делению (Н. А. Дмитриева, 1981):
с — через 2 ч после индукции деления на среде с фитогормонамн (ИУК —0,5 мг/л; кинетин—1 мг/л); б — то же, на среде без фитогормоиов;пунктир — радиоактивность фракций РНК при включении меченого1^С-урацила. Сплошная линия — оптическая плотность при X = 260 нм;слева направо — пики, соответствующие порядковому номеру фракции приэлюции нуклеиновых кислот раствором NaCI со скоростью 0,4 мл/миис МА К-колонок
после помещения на пита
0123 5 712172430 t, сут0123 5 712172430 t, сутпроцента делящихся клеток меристеме стебля томатовпроцента делящихся клеток меристеме стебля томатовтельную среду меристемы стебля томатов наблюдалось прекращение митозов, свойственных ткани§
0123 5 712172430 t, сут
0123 5 712172430 t, сут
процента делящихся клеток меристеме стебля томатов
процента делящихся клеток меристеме стебля томатов
in vivo, клетки дедиффе-5
ренцнровались, увеличи-g
вались в объеме, терялии
характерную для мери-5
стематической клетки форму, изменялась структура ядра и цитоплазмы и только после этого в них происходило деление, приводящее к формированию
Рис. 3. Изменение в изолированнойРис. 3. Изменение в изолированнойкаллуснои ткани. .
Рис. 3. Изменение в изолированной
Рис. 3. Изменение в изолированной
на среде с индуктором каллусогенезана среде с индуктором каллусогенезаОбразование каллуса
на среде с индуктором каллусогенеза
на среде с индуктором каллусогенеза
не во._всех случаях связа
связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слоисвязи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слоино с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть в результате пролиферации внутренних-тканей экспланта без
связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слои
связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слои
ткани и развивается на поверхности. Примером каллуса, не связанного с травмой, является каллусогенез, наблюдающийся в культуре изолированного пыльника. Гаплоидная микроспора, проявившаяся в результате мейоза, при культивировании пыльника in vitro отклоняется в ряде случаев от нормального про
цесса микроспорогенеза, ее ядро индуцируется к повторным делениям, а сама клетка дедифференцируется и превращается в каллусную. Образование каллуса при эксплантировании фрагмента ткани в условиях in vitro свойственно двудольным и однодольным покрытосеменным и голосеменным растениям, папоротникам, мхам, печеночникам.
Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4—6 недель (в зависимости от темпов роста), переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Размер транспланта (переносимого кусочка) при культивировании на агаризованной питательной среде обычно колеблется от 60 до 100 мг массы ткани на 30—40 мл питательной среды.
Резюмируя, можно отметить, что техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную, пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интактного растения. Клетки различно дифференцированные (в том числе и меристематические) переходят in vitro к сложному процессу дедифференцнации, теряют присущую им структурную организацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус. .
В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями.
$ 3. Некоторые цитоморфологические и физиологические характеристики каллусных клеток, культивируемых поверхностно
Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом на полутвердой агаризованной среде (концентрация агар-агара 0,6—1%), среде с применением других желирующих полимеров либо на мостиках из фильтровальной бумаги, или дисках из пенополиуретана, полупогруженных в жидкую питательную среду. Основными компонентами питательных сред для культуры тканей и клеток растений являются минеральные соли (макро- и .макроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред велю гают комплексные органические добавки (гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, экстракты из разных органов растения). В табл. 2
Таблица 2. Состав некоторых питательных сред, применяемых для культивирования клеток растений
Компоненты
Концентрации (мг/л) в средах по прописи
Мурасиге и Скуга (MS) (1962)
Гамборга и Эвелега (В = S
(1968)
Японская среда
Као и Михайлюка*
(1975)
Уайта
(1939)
для роста массы клеток воробейника (ростовая)
для синтеза шикоиииа (продукционная)
KNO
1900
3000
80
80
1900
81
МН4МО3
1650
—
—
—
600
—
Са(МОз>2
—
—
-—
—
—
142
Ca(NO3)2-4H2O
—
—
300
694
—
—
(NH4)2SO4
—
134
—
—
—
—
MgSO4- 7Н2О
370
500
750
750
300
74
СаС1,.2Н2О
440
150
—-
—
—
—
KCI
—
—
65
65
300
65
КН2РО4
170
—
—
—
170
12
NaH2PO4-H2O
—
—
21
19
—
—
NaH2PO4 ■ 2Н,О
—
—
200-
1480
-—
—
MnSO4- Н2О
■—
10
—
.—
10,00
—
MnSO4- 4Н2О
22,3
—.
—
—
—
—
MnSO4- 2Н2О
•—
—
5
—
—
—
ZnSO4- 4Н2О
8,6
—
—
—
2,00
—
ZnSO4- 7Н2О
—
2
3
3
—.
—
Н3ВО3
6,2
3
1.5
1,8
3,60
—-
KI
0,83
0,75
0,75
4.5
0,75
—
CuSO4- 5Н2О
0,025
0,075
0,01
0,3
0,025
—
Na2MoO4
0,25
0,25
—
—
0,25
—
МоОз
-—
—
0,001
—
—
—.
СоС12. 6Н2О
0,025
0,025
—
—
0,025
—
Рб2 ( SO4).3
—
—
2.5
—
2,46
—
FeSO4-7H2O
27,8
—
1,8
500
—
Na2SO4
—
—
200
1480
—
—
Концентрации (мг/л) в средах по прописи
Компоненты
Мурасиге и Скуга (MS) (1962)
Гамборга и Эвелега (В = S) (1968)
Японская среда
Као и Михайлюка*
(1975)
Уайта (1939)
для роста массы клеток воробейника (ростовая)
для синтеза шикоиииа (продукционная)
Натриевая соль iNaEDTA) этилен диаминтетрауксус- ная кислота
37,3
1,8
500
Секвестрен 330-Fe
—
28
—
—
Сахароза
30 000
20 000
20 000
30 000
125
20 000
ТИезо-инозит
100
—
—
—
100
—
Глицин
2
—
3
—
—
—
Тиамин-НС1
0,5
—
0,1
—
0,005
—
Пиридоксин-НС1
0.5
—
0,1
—
0,005
—
Никотиновая кислота
0.5
—
0,5
—
—
—
Р-идолил-З-ук- суснаякислота
(ИУК)
1,75
1,75
Кинетин
—
—
2,15
—
—
—
* Среда Као и Михайлюка дополнительно содержит (в мг/л): фруктозы, рибозы, ксилозы, маннозы, рамнозы, целлобиозы, сорбита по 125; маннита, никотинамида, аскорбиновой кислоты по 1; витамина А 10; витамина D3 0,5; Са-пантотената 0,01; витамина В12 0,2, п-аминобензойиой кислоты 0,01; биотина 0,005; холинхлорида 0,5; рибофлавина 0,1 2,4-Д 0,2; зеатина 0,5; ИУК 1; гидролизата казеина 125; кокосового молока 10; СаС1г 30%-ного 1,5; глюкозы 68 400; пирувата Na 5; лимонной кислоты 10; яблочной кислоты 10; фумаровой кислоты 10.
представлен состав наиболее часто используемых питательных сред. Как правило, начиная работать с новым объектом, авторы модифицируют состав стандартных сред, особенно часто варьируя концентрации и набор органических компонентов. Оптимизацию состава среды по многим факторам целесообразно проводить с применением математического планирования эксперимента (В. Н. Максимов, 1980).
Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным — пигментированным антоцианами полностью или зонально.
В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают: 1) рыхлыми, сильно оводненными, легко распадающимися на отдельные клетки; 2) средней плот-
Рис. 4. Структурные особенности: а — молодой; б — растущей растяжением; в — старой клетки женьшеня (электронная микроскопия)
ности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; 3) плотными с зонами редуцированного камбия и сосудов (в основном трахеидоподобных элементов).
Как правило, в длительной пересадочной культуре, на средах, включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4 Д), каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми.
В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный для клетки растения онтогенез, они приступают к росту растяжением, затем дифференцируются как зрелые каллусные клетки и наконец деградируют. На электронно-микроскопических фотографиях (рис. 4) показана тонкая структура
Таблица 3. Химический анализ биомассы культуры ткани и корня женьшеня
Состав, %
Биомасса культуры ткани
Корень
Азот общий
4,82
2,73
Азот белковый
1,18
1,68
Липиды
1,61
2,34
Восстанавливающие сахара
2,28
—
Сахароза
1,03
3,07
Крахмал
5,40
19,5
Пектиновые вещества
7,57
15,8
Гемицеллюлозы
4,46
6,03
Целлюлоза
9,84
10,27
Панаксозиды (А — G — сум-
3,21
3,12
марно)
молодой, растущей и старой клетки каллусной ткани женьшеня.
Химический состав каллусной ткани и ткани органа, из которого она получена, как правило, различаются (табл. 3). Каллус- ные ткани, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, из них получают суспензии клеток, культивируемых в жидкой питательной среде, для регенерации растений.
Глубинное культивирование клеток растений в жидкой питательной среде (суспензионные культуры)
Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными культурами. Термин этот не является строго научным и очень точным, так как не объясняет основной особенности поведения клеток при таком выращивании.
Отдельные клетки, небольшие группы или достаточно крупные агрегаты (> 50 клеток) выращивают во взвешенном состоянии в жидкой среде. Применяют разные аппараты и способы поддержания их в таком состоянии. Начальный момент получения суспензионной, клеточной культуры является событием_рандоми- ческим. Это означает, что только клетки, которые подряду причин способны к перестройке метаболизма и размножению с высоким коэффициентом в данных конкретных условиях суспензионного культивирования, образуют «хорошие» линии. Важными характеристиками таких линий является высокая степень дезагрегации (5—10 клеток в группе), морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или слегка овальная форма, плотная цитоплазма), отсутствие трахеидоподобных элементов. На рис. 5 представлены клетки суспензионной культуры
Рис. 5. Клетки суспензионной культуры женьшеня в экспоненциальной фазе цикла выращивания (световая микроскопия) увелич. (40 X 10)Рис. 5. Клетки суспензионной культуры женьшеня в экспоненциальной фазе цикла выращивания (световая микроскопия) увелич. (40 X 10)женьшеня в экспоненциальной фазе роста, удовлетворяющие полностью требованиям к «хорошей» линии.
Рис. 5. Клетки суспензионной культуры женьшеня в экспоненциальной фазе цикла выращивания (световая микроскопия) увелич. (40 X 10)
Рис. 5. Клетки суспензионной культуры женьшеня в экспоненциальной фазе цикла выращивания (световая микроскопия) увелич. (40 X 10)
Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных тканей поверхностным способом. Здесь легче и более воспроизводимо влиять на метаболизм и рост клеточных популяций экзогенными факторами. Они удобнее для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов — изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов.
Клеточную суспензию получают, помещая кал- лусную ткань в колбу с
жидкой питательной средой. Эта суспензия перемешивается в колбах на качалке или в специальных сосудах с помощью роллеров разного типа. Для инициации суспензионной культуры необходимо 2—3 г свежей массы каллусной ткани на 60—100 мл жидкой питательной среды. Первичную суспензию получают на круговой качалке, имеющей скорость перемешивания 100— 120 об/мин.
Суспензионную культуру можно получить и из фрагмента органа растения (диски запасающей паренхимы мясистых корней моркови, петрушки, клубней картофеля и др.), однако этот путь более трудоемкий и требует большего времени. Клетки экспланта должны при этом образовать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии.
Рыхлые, оводненные культуры каллусных тканей более пригодны для перевода в суспензию, чем структурированные, плотные каллусы. Выращивание каллусов на среде с 2,4 Д, исключение из среды ионов Са24; обработка пектиназой транспланта, предназначенного для выращивания в суспензионной культуре, оп-
тимальны для получения суспензии. Первичную суспензию перед субкультивированием фильтруют через 1 — 2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных, плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов. Фильтрование рекомендуется и в нескольких последующих субкультивированиях до приобретения клеточной суспензией желательных характеристик. Однако агрегированность суспензии зависит не только от характеристик начальной линии, но и от условий культивирования. На рис. 6 показано
12-56-2021-50>50s,Jклеток, шт. в группе12-56-2021-50>50s,Jклеток, шт. в группеРис. 6. Различия в агрегированности суспензионных культур мака снотворного Papauer somnijerum при выращивании: а — в колбах на качалке; б — в пневмо- импульсном ферментереРис. 6. Различия в агрегированности суспензионных культур мака снотворного Papauer somnijerum при выращивании: а — в колбах на качалке; б — в пневмо- импульсном ферментеревлияние условий перемешиваниявлияние условий перемешиванияна состав и соотношение различных по агрегированности единиц.
12-56-2021-50>50
s,J
клеток, шт. в группе
12-56-2021-50>50
s,J
клеток, шт. в группе
Рис. 6. Различия в агрегированности суспензионных культур мака снотворного Papauer somnijerum при выращивании: а — в колбах на качалке; б — в пневмо- импульсном ферментере
Рис. 6. Различия в агрегированности суспензионных культур мака снотворного Papauer somnijerum при выращивании: а — в колбах на качалке; б — в пневмо- импульсном ферментере
влияние условий перемешивания
влияние условий перемешивания
составляющих суспензионную культуру женьшеня и мака.
Способы выращивания, разработанные в микробиологии, применяются для глубинного культивирования растительных клеток. Используются закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. В закрытой системе при периодическом режиме выращивания клеточная масса (инокулюм) помещается в определенный объем среды. До конца выращивания система остается закрытой по всем параметрам, кроме газов. В закрытой непрерывной культуре в систему периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки при этом остаются в системе в течение всего
цикла выращивания.
В открытые проточные культуры периодически (или непрерывно) поступает свежая питательная среда, однако отбирается не только старая среда, но и часть урожая клеточной массы. Регуляция этого процесса может осуществляться по принципу турби- достата или хемостата. В турбидостате подача свежей среды и отбор суспензии происходят после достижения клеточной популяцией определенной заданной плотности. Сигнал на включение протока поступает от реле, связанного с оптической системой, определяющей плотность клеток. В хемостате скорость протока задается экспериментатором и от нее зависит скорость роста клеточной массы. Для этого питательная среда лимитируется по одному из наиболее важных для роста факторов, чаще всего по фосфору, азоту или сахару. Режим хемостата позволяет с помощью фиксированной скорости разбавления поддерживать константную скорость деления и плотность клеток в популяции.
Изменяя скорость протока, можно переводить популяцию из одного стабильного состояния в другое. Отношения между размножением клеток и скоростью протока выражаются уравнениями: £=1п2/ц [где g— время генерации клеток; р— удельная скорость роста); р = (In х, — In хь) /М (где х, и хь — биомасса в определенный промежуток времени); D =^—~^^^^ [гДе ^ — ско" ростьпротока (разведение); dx/dt = р, — D> (при р > D биомасса растет; при р < D падает; при р = D (dx) jdt = 0 и биомасса — постоянная величина (стабильное состояние) ].
При глубинном выращивании растительных клеток принцип турбидостата практически не применяется. Одной из причин этого является разрушение части клеток при отводе их к оптическому прибору.
Выращивание суспензии клеток растений в установках непрерывного культивирования по принципу хемостата применяется как для изучения метаболизма клеток, стабильно поддерживающихся в разных фазах клеточного цикла, так и при промышленном выращивании клеточной биомассы с целью получения экономически важных продуктов. В Японии использовали ферментер объемом 20 000 л для непрерывного культивирования в течение 3 мес клеток табака по принципу хемостата. Продуктивность была очень высокой и составила 5,58 г/л в сутки сухой массы клеток.
Однако пока наиболее изученным и распространенным ре-
число клеток /сухая или сырая масса/
Рис. 7. Модельная кривая роста в цикле периодического выращивания
Рис. 8. Ростовые циклы клеточных популяций табака Nicotiana tabacum (голубая линия) и диоскореи делто- видной D. deltoidea (черная линия) при глубинном выращивании в колбах на качалках:
/ — число клеток; 2 — число живых клеток
жимом глубинногоIn
культивирования кле- °5
точных суспензий яв-~° «
ляется закрытая перио-°^ 54
дическая система. Ве5
этом случае для аэра- | 3 ции и перемешиванияgI 12
суспензии используют«« £
различную аппаратуру:?г- в1
роллеры, качалки•5 -
(обычно "круговые),1
ферментеры с механическими и магнитными Рис. 9. I мешалками или фЕр мёнтерьг^барбитажиего
типа, гдеПГ^аэрапият" и перемешивание осуществляются воздушным потоком.
Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы. Ростовая кривая (модельная) имеет S-образную форму. На ней различают (рис. 7) латентную (лаг) фазу, в которой видимый рост инокулюма не наблюдается ни по одному из критериев (/); экспоненциальную фазу, характеризующуюся ростом с ускорением (2); линейную, в которой скорость роста постоянна (3); фазу замедленного роста (4); стационарную фазу (5) и фазу деградации клеток (6). Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной. Это зависит как от генетической характеристики популяции (вида растения), так и от количества инокулюма и условий выращивания (рис. 8).
Состав среды, температура, начальное значение pH, состав газовой фазы, скорость перемешивания — факторы, влияющие на процессы ростового цикла. Из сравнения формы кривых для разных критериев в одном цикле выращивания вытекает, что между процессами, определяющими эти показатели, нет строгой согласованности. Особенно ясно это видно при графическом изображении ростового цикла в полулогарифмическом масштабе (рис. 9). Такая разбалансировка по скоростям между процессами клеточного размножения (число клеток), синтеза структурных элементов клетки и веществ запаса (сухая масса), а также увеличение объема и содержимого вакуолей (сырая масса) отражает не только специфику онтогенеза клетки высше
го растения, но и асинхронность популяции по времени перехода клеток из одной фазы в другую.
Первичный и вторичный метаболизм культивируемых клеток растений видоспецифичен, зависит от типа дифференцировки ис
ходных клеток растения и регулируется условиями выращивания.
Генетическая изменчивость клеток, как следствие их культивирования вне организма, исчезновение одних и|появление других стойких модификаций, передающихся в ряду клеточных поко
лений, адаптивный отбор, идущий в популяциях, приводит к возникновению из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Это позволяет отобрать или создать экспериментально (мутагенез, соматическая гибридизация, трансгенез) линии, сохраняющие биосинтезы, характерные для исходного растения, и линии, синтезирующие принципиально новые вещества.
В культуре клеток обнаружены традиционные для растений вещества вторичного метаболизма, а также выявлены новые, необычные соединения: алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, натуральные красители (пигменты), камптотецин, харрингтонин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибитор протеаз, ингибитор фитовирусов). Культивируемые в суспензии клетки могут применяться так же, как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, восстановления, гидроксилирования, метилирования, деметилирования, гликолизирования, этерификации, изомеризации). Использование активных ферментов культивируемых клеток растений важно для получения более ценного продукта из натурального или синтетического предшественника. Возможно также применять биотрансформацию для создания уникальных биологически активных продуктов на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений других видов.
Деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез вторичных продуктов возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной фазе. Исключение составляет фаза биосинтеза некоторых алкалоидов, которая совпадает по времени с фазой максимальной митотической активности или экспоненциальным ростом. Чаще механизмы и условия, блокирующие клеточную пролиферацию и активный рост, являются одновременно механизмами активации ферментов вторичного метаболизма. Неспецифические стрессовые условия, воздействующие на клетки в конце экспоненциальной фазы, могут стимулировать переход к синтезу вторичных продуктов и увеличивать их выход (А. М. Носов, 1983).
Однако вопрос взаимодействия первичного и вторичного метаболизма на самом деле значительно сложнее. Возраст иноку- люма, морфология составляющих его клеток, жизнеспособность, митотическая активность, концентрация вторичных метаболитов определяют не только рост биомассы (активный первичный метаболизм), но и синтез продукта. Важную и пока малоизученную роль играет углеродное питание. Глюкоза в ряде случаев превосходит или равна сахарозе по влиянию на рост биомассы, но количество вторичных продуктов выше при использовании сахарозы. Мало изучено влияние азотного питания (форма, концентрация) на активацию ключевых ферментов метаболизма
азотсодержащих вторичных соединений и конкурентные процессы, ведущие к синтезу белка, алкалоидов, фенолпропаноидов. Неясна роль фосфора в продукционную стадию ростового цикла. То же самое можно сказать о роли экзогенных и эндогенных гормонов и их ингибиторов. Не изучена роль синтеза предшественников вторичного метаболизма в ростовом метаболизме.
Этот перечень можно продолжить. Ясно одно, что все это предстоит изучить для успешного использования клеточных культур в промышленности при получении важных продуктов, используемых в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности.
Кроме того, медленный рост (время удвоения числа клеток 1—3 дн), длительный период выращивания (2—3 недели) в строго асептических условиях, чувствительность к механическим повреждениям, во многих случаях низкое содержание искомого продукта являются недостатками этого метода, ограничивающими его применение в промышленности. Это также предстоит преодолеть исследователям и технологам. Надо помнить, что кроме генетических подходов к созданию продуктивных, устойчивых к стрессам выращивания, быстрорастущих и быстро переходящих к синтезу продукта линий необходимо знание физиологических механизмов репрессии и активации ключевых ферментов различных путей .метаболизма. Правильное сочетание компонентов среды, двухэтапное культивирование клеток на средах для «роста» и для «продукции» (см. табл. 2) может увеличить количество продукта в клеточной культуре, полученной из растения, способного к данным синтезам.
$ 5. Культивирование отдельных клеток
Источниками отдельных (одиночных) клеток являются клеточные суспензии, растущие в жидкой питательной среде, мацерация тканей растений (например, мезофилла листа), изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки.
Культивирование отдельных клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость при выращивании кленового материала. Важной научной проблемой служит изучение условий, определяющих возникновения стимулов к делению у таких отдельных клеток, изолированных от влияния других клеток популяции или ткани.
Изолированные из тканей растения или культивируемых клеток протопласты (см. гл. 2) после образования клеточной стенки являются идеальными отдельными клетками. До образования стенки их используют для переноса в клетку и (или) растение молекул (рекомбинантные ДНК), органелл, вирусов, бактериальных клеток, несущих генетическую информацию. При этом применяют различные методы: микроинъекции, слияния с липосомами, в которые введены информационные макромолекулы, элект-
рослияния и использования электрического тока для облегчения и проникновения макромолекул через внешнюю мембрану протопластов.
Отдельные клетки (изолированные протопласты) важны для клоновой селекции мутантных, гибридных, трансформированных линий. Обычно в эти клетки вводят маркерные гены или создают маркерные признаки для обеспечения селективных условий отбора. Мацерированные клетки ткани растения являются хорошей моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и отдельной тканевой клетке. В частности, сравнение процесса фотосинтеза на уровне отдельных клеток мезофилла листа и тканевом представляет большой интерес для изучения фотодыхания.
Вместе с тем при культивировании этих клеток на среде, стимулирующей деление клеток, они дифференцируются и образуют колонии каллусных клеток. Ниже перечислены ферментные препараты и условия, позволяющие мацерировать ткань мезофилла листа с получением отдельных тканевых клеток:
Процедура изолирования клеток мезофилла листа табака
1. Поверхностная стерилизация гипохлоритом натрия (0,1%-ный раствор).
Промывка стерильной, дистиллированной водой (3 раза).
Стерильное удаление нижнего эпидермиса (в ламинар-боксе).
Нарезка фрагмента на полоски (ширина 1 мм) и помещение в раствор для мацерации предварительно на 3 с с вакуум-инфильтрацией.
Перенос в свежий мацерирующий раствор и инкубирование в течение 20 мии на качалке.
Фильтрование через слой батиста, сбор и промывка иа нейлоновом фильтре (40 мкм).
Раствор для мацерации
КомпонентыКонцентрация, г(л
[N-морфолино]-этансульфоновая кислота 19,52
Сорбит или маннит 100,00
Поливинилпирролидон(AL=40 000)20,00
K2SO4 2,20
Мацераза (полигалактуроназа)Rhizopus .10,00—30,00
Пектиназа-500 .10,00—30,00
Отдельные клетки также могут быть изолированы из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлюо- риметра с сортером или путем последовательных разбавлений. В последнем методе суспензия готовится разными способами: 1) 1—2 мл суспензии отбирают из супернатанта после оседания основной массы клеток; 2) суспензию фильтруют через фильтры с уменьшающимся размером пор (нейлоновые сетки или металлические фильтры). Для последовательных разбавлений употребляют платы для микротитрований. Это позволяет микроскопически контролировать клеточный состав при последовательных разбавлениях. Индукция делений отдельных клеток из суспензии изолированных протопластов, отдельных или высеянных при
очень низкой плотности клеток, полученных методом последовательных разбавлений, возможна при применении очень богатой питательной среды, например, среды Као и Михайлюка (см. табл. 2). При этом объем среды, в которую помещаются клетки, должен быть минимальным (микрокапли в чашке Купрака, объемом 20 мкл).
Однако при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается очень низким. Более эффективны методы «кормящего слоя» (рис. 10) или «ткани-няньки». Для создания «кормящего слоя» берут суспензию клеток того же вида растения, что и одиночная клетка, или близкого вида. Клеточная суспензия должна находиться в ранней
Рис. 10. Схема использования в качестве «кормящего слоя* суспензии клеток кукурузы для индукции делений в отдельных клетках или изолированных протопластах кукурузы:/ — фольга; 2— колба Эрлеимейера; 3— фильтровальная бумага; 4—алюминиевая сетка, 5 — пенополиуретанРис. 10. Схема использования в качестве «кормящего слоя* суспензии клеток кукурузы для индукции делений в отдельных клетках или изолированных протопластах кукурузы:/ — фольга; 2— колба Эрлеимейера; 3— фильтровальная бумага; 4—алюминиевая сетка, 5 — пенополиуретанэкспоненциальнойэкспоненциальнойцикла. Каллусная культура, служащая «тканью-нянькой», также должна быть в состоянии активного роста. При достижении колонией, возникшей из отдельной клетки, 0,5—1 мм клон может быть перенесен для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно или на фильтр, помещенный на поверхность агара. Использование «кормящего слоя», «ткани- няньки» и минимального объема среды, в которую помещается отдельная клетка, связаны с феноменом, называемым «действие фактора кондиционирования». Несмотря на многочисленные попытки определить химическую природу веществ (или вещества), индуцирующих, деление отдельной клетки, и механизм действия фактора кондиционирования, ясности здесь пока нет. Пожалуй, уверенно можно сказать только то, что фактор этот химической, а не физической природы и включает низкомолекулярные вещества (М. К- Павлова, Р. Г. Бутенко, 1965).
Рис. 10. Схема использования в качестве «кормящего слоя* суспензии клеток кукурузы для индукции делений в отдельных клетках или изолированных протопластах кукурузы:
/ — фольга; 2— колба Эрлеимейера; 3— фильтровальная бумага; 4—алюминиевая сетка, 5 — пенополиуретан
Рис. 10. Схема использования в качестве «кормящего слоя* суспензии клеток кукурузы для индукции делений в отдельных клетках или изолированных протопластах кукурузы:
/ — фольга; 2— колба Эрлеимейера; 3— фильтровальная бумага; 4—алюминиевая сетка, 5 — пенополиуретан
экспоненциальной
экспоненциальной
Изучение механизма взаимодействия клеток при размножении их в популяции — еще одна важная научная проблема, которая решается на уровне культивирования отдельных клеток.
Глава
е
ПРОТОПЛАСТЫ
РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК
КАК ОБЪЕКТ БИОЛОГИЧЕСКОГО
КОНСТРУИРОВАНИЯ
Получение протопластов
Протопласты (от греч. protos — первый и plastos -— вылепленный, образованный) — ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды и характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм, выполнять биосинтезы и трансформацию энергии. Впервые этот термин использован Д. Ханстеином (J. Hanstein, 1880). В растительной клетке протопласт выявляется как морфологически обособленное образование при плазмолизе. Плазмолиз — это отделение пристеночного слоя цитоплазмы от твердой оболочки растительной клетки. Плазмолиз можно наблюдать, если поместить кусочек растительной ткани в раствор более концентрированный, чем вакуолярный сок. В этом случае будет происходить отток воды из клетки. Клеточная стенка — образование, легко проницаемое для воды, но достаточно жесткое по структуре, мало меняет форму при оттоке воды из клетки. Протопласт же, теряя воду, сокращается в объеме, отделяется от клеточных стенок и сжимается в комок в середине клетки (рис. 11). При этом он остается жизнеспособным и может быть перенесен в подходящую среду.
Способы выделения протопластов. Впервые. выделение протопластов было осуществлено в связи с изучением плазмолиза Дж. Клеркером в 1892 г. Он плазмолизировал ткани листа водного растения телорез (Stratiotes aloid.es) и затем удалял клеточную стенку. При этом происходило выделение протопластов. Применяя подобного рода методику, протопласты можно получить,, используя тонкие полосы эпидермиса чешуи луковицы. Их выдерживают в 0,1 М растворе сахарозы до тех пор, пока протопласты не сожмутся и не отойдут от своих клеточных стенок. Если затем разрезать бритвой полоску эпидермиса, протопласты будут выходить в среду. Такого рода методы выделения протопластов называют механическими.
Плазмолиз в данном случае обеспечивает обособление про-
зо
Рис. 11. Плазмолиз в клетке (не Гэлстен и др., 1983): « — тургересцентная клетка; 6 — плаз- молизиреваниая клетка:1 — протопласт прижат к клеточной стейке давлением, создаваемым центральной вакуолью; 2 — концентрированный раствор; 3 — клеточная стейка; 4 — сжавшийся претопласт; 5 — клеточная.мембранаРис. 11. Плазмолиз в клетке (не Гэлстен и др., 1983): « — тургересцентная клетка; 6 — плаз- молизиреваниая клетка:1 — протопласт прижат к клеточной стейке давлением, создаваемым центральной вакуолью; 2 — концентрированный раствор; 3 — клеточная стейка; 4 — сжавшийся претопласт; 5 — клеточная.мембрана— 2— 2
Рис. 11. Плазмолиз в клетке (не Гэлстен и др., 1983): « — тургересцентная клетка; 6 — плаз- молизиреваниая клетка:
1 — протопласт прижат к клеточной стейке давлением, создаваемым центральной вакуолью; 2 — концентрированный раствор; 3 — клеточная стейка; 4 — сжавшийся претопласт; 5 — клеточная
.мембрана
Рис. 11. Плазмолиз в клетке (не Гэлстен и др., 1983): « — тургересцентная клетка; 6 — плаз- молизиреваниая клетка:
1 — протопласт прижат к клеточной стейке давлением, создаваемым центральной вакуолью; 2 — концентрированный раствор; 3 — клеточная стейка; 4 — сжавшийся претопласт; 5 — клеточная
.мембрана
— 2
— 2
топластов от клеточной стенки. В нативной ткани клеточная стенка с протопластом составляет довольно тесный структурно - функциональный комплекс. Клеточная стенка имеет по-
ры, через которые проходят протоплазматические тяжи—плазмодес- мы, молодые клеточные стенки пронизаны цитоплазматическими образованиями — эктодес мами. Кроме того, синтез компонентов клеточной стенки осуществляется при участии цитоплазматических структур (аппарат Гольджи, эндоплазматический ре-
тикулум, микротрубочки) и ферментных систем, связанных с плаз- малеммой. Плазмолиз разрушает эту связь; ,при этом, как считают, происходит частичная разборка поверхностной мембраны протопласта.
Развитие исследований в области изоляции растительных протопластов приводило к модификации и улучшению механического метода. Тем не менее он имеет определенные ограничения: 1) этим методом можно выделить только небольшое число протопластов; 2) используются только те ткани, в которых имеет место экстенсивный плазмолиз; 3) получить протопласты из меристематической или зрелой ткани трудно; 4) метод длительный ■ и трудоемкий.
Принципиально отличный метед пелучения изелиреванных протопластов — энзиматический; в этом случае для удаления клеточной стснки~испбльзуются ферменты. К первым рабетам относятся опыты, в которых протопласты из клеток гриба были изолированы обработкой клеточных стенок желудочным соком улитки Helix pomatia (J. Giaja, 1919).
В микробиологии для разрушения клеточных стенок бактерий был применен фермент лизоцим (М. Salton, 1952). Изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментных препаратов впервые было успешно проведено Е. Кокин- гом (Е. С. Cocking, 1960).
В сравнении с механическим методом ферментативное выделение протопластов имеет определенные преимущества: f) одновременно можно выделить большое количество протопластов; 2) протопласты не подвергаются сильному осмотическому сжа-
тию; 3) клетки более интактны и не повреждены; 4) метод сравнительно быстрый.
Для удаления клеточной стенки используются ферментные препараты трех типов — целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Действие этих ферментов направлено на разрушение основных компонентов клеточной стенки. У растений это целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества. Целлюлозные молекулы, собранные в микрофибриллы, формируют рыхлый, но прочный структурный остов. Он погружен в аморфный матрикс, состоящий из гемицеллюлоз, пектиновых веществ, белков.
В первичной клеточной стенке на долю основного структурного компонента — целлюлозы — приходится до 30% от сухой массы и столько же на пектиновые вещества, белки и липиды; 40% составляют гемицеллюлозы. В клетках разных типов ткани в зависимости от функциональных особенностей, возраста, наличия вторичных утолщений эти соотношения могут варьировать. Например, в клетках из колеоптилей овса клеточная стенка на 25% состоит из целлюлозы, а в молодых волокнах хлопка она составляет 50% от общей массы клеточной стенки (по D. Evans, J. Bravo, 1983). Поэтому комбинации ферментных препаратов и их соотношение специфичны для каждого типа клеток. Наиболее адекватная составу клеточной стенки комбинация обеспечивает успех выделения протопластов. Так, для получения протопластов из плацентарной ткани плодов пасленовых, которые, как правило, имеют высокое содержание пектина, особенно подходящ ферментный препарат пектиназа. Процедура выделения протопластов из плодов состоит из трех этапов: 1) обработка ферментом; 2) выделение протопластов из обособленных клеточных стенок; 3) отделение интактных протопластов от клеточных осколков.
Получение протопластов из листьев потребовало дальнейшего усовершенствования методики применительно к особенностям этой ткани. Главные отличия методики при работе с листьями заключаются, во-первых, в том, что листовая ткань освобождается от эпидермиса, и, во-вторых, что вместе с пектиназой используется целлюлаза — фермент, разрушающий целлюлозные компоненты клеточной стенки.
В частности, для листьев Nicotiana tabacum И. Такебе разработал следующую технику изоляции протопластов. Полностью сформировавшийся лист отделялся от здорового растения в возрасте 60—80 дн, быстро окунался в 70%-ный этанол и помещался после этого на 15—20 мин в 10%-ный раствор гипохлорита кальция. Затем лист несколько раз промывали в стерильной дистиллированной воде. Нижний эпидермис аккуратно снимался с помощью пинцета (рис. 12), и очищенные от эпидермиса листья разрезались скальпелем на небольшие кусочки площадью примерно 4 см2. Эпидермис будет сниматься сравнительно легко, если листьям после стерилизации дать немного подвинуть или если снабжение растений водой будет несколько ограниченным
перед тем, как срезать с него листья. Из очищенной от эпидермиса листовой ткани протопласты извлекались двухступенчатой энзиматической обработкой. На первом этапе использовался фермент пектиназа, который осуществляет мацерацию ткани, и затем, на втором этапе, клетки обрабатывались целлюлазой, окончательно разрушающей целлюлозные клеточные стенки.
Вместо последовательного
воздействия пектиназой и цел- рис [g Удаление эпидермиса с листа люлазой МОЖНО одновременно (по J. Reinert, М. Yeoman 1982) обрабатывать смесью этих ферментов (J. Power, Е. Cocking,
1969). Для этого листовую ткань без эпидермиса помещают непосредственно в ферментативную смесь, содержащую 0,5% фермента пектиназы и 2% целлюлазы в 0,7 М растворе сорбита или маннита. Данная смесь ферментных препаратов эффективна, однако не во всех случаях. Например, при получении протопластов из колеоптилей овса с использованием целлюлазы добавление пектиназы ингибирует их выделение. Успешно применяется в этих целях целлюлозно-пектиновый препарат — ксиланаза. Он включает эндоксиланазу, ксилози- дазу, р-1,4-эндоглюканазу, целлобиазу, эндополигалактуроназу, пектинэстеразу и протеазу. Хорошую активность имеет и целло- кондин, дополнительно содержащий С|-фермент целлюлазного комплекса. Ксиланаза эффективна при получении протопластов из листьев райграса, овсяницы, клевера, люцерны, а также для клеток культуры ткани табака, картофеля, моркови. Наиболее подходящая концентрация 2,0—5,0% (Р. Г. Бутенко, 1979).
Оптимальные условия для выделения протопластов очень индивидуальны для разных тканей. В каждом случае необходима предварительная работа по подбору состава ферментов, их концентрации и соотношения, а также временч обработки. Важна продолжительность обработки клетки и ткани ферментами. Выделяющиеся протопласты должны находиться в контакте с фер
ментом минимальное время и затем тщательно отмыты от них. Стерилизацию раствора ферментов производят через бактериальные фильтры
Очень важным фактором для успешного выделения жизнеспособных, нативных протопластов является подбор осмотического стабилизатора. С наличием клеточной стенки у растительной клетки связана регуляция ее водообмена. Сосущую силу формируют не только осмотические свойства клетки, но и тургорное давление. С увеличением количества воды в клетке тургорное
давление возрастает и, следовательно, снижается ее сосущая сила. Процесс поступления воды в клетку прекращается совсем, если тургорное давление делается равным осмотическому давлению клетки. Таким образом структурная организация клетки, включающая протопласт и жесткую клеточную стенку, формирует саморегуляторный механизм водообмена. Поэтому для изолированных протопластов, лишенных клеточной стенки, очень важны осмотические свойства среды выделения и культивирования. В качестве осмотических стабилизаторов используются сахара (глюкоза, сахароза, ксилоза, сорбит, маннит); иногда ионные осмотики — растворы солей CaClj, Na2HPO4, КС1. Осмотически активные вещества применяются в концентрации 0,3—0,8 моль/л. Точная концентрация осмотиков всегда подбирается для конкретного вида растения и его физиологического состояния. Среда должна быть несколько гипертоничной, чтобы протопласты на ходились в слегка плазмолизированном состоянии. В этих условиях тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки.
Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны и другие условия. Чаще всего протопласты изолируются в темноте или при слабом свете, pH обычно 5,4—6,2. Температурные условия могут варьировать в широких пределах, например, для пшеницы оптимальная температура + 14°С, для томатов +27ОС. Стабильности протопластов способствуют высокие концентраций СаС1г и MgCh, воздействующих на мембранную систему клетки.
Рис. 13. Отделение суспензии протопластов от листовой ткани после обработки последних смесью ферментов, разрушающих клеточные стенки (J. Reinert, М. Yeoman, 1982): / — кусочки листьев; 2 — суспензия протопластовРис. 13. Отделение суспензии протопластов от листовой ткани после обработки последних смесью ферментов, разрушающих клеточные стенки (J. Reinert, М. Yeoman, 1982): / — кусочки листьев; 2 — суспензия протопластовОбработку листовой ткани раствором ферментов удобно проводить в чашках Петри. После инкубации листья осторожно перемешивают стерильным пинцетом, передвигая кусочки листьев в одну сторону. Чашку Петри при этом держат под углом 15° (рис. 13). Энзиматическую смесь с протопластами переносят в центрифужные пробирки. После энзиматической изоляции протопласты должны быть очищены от остатков неразрушенной ткани и осколков клеток и отмыты от ферментов. Для этого используются два наиболее распространенных метода — фильтрация с центрифугированием и флотация.
Рис. 13. Отделение суспензии протопластов от листовой ткани после обработки последних смесью ферментов, разрушающих клеточные стенки (J. Reinert, М. Yeoman, 1982): / — кусочки листьев; 2 — суспензия протопластов
Рис. 13. Отделение суспензии протопластов от листовой ткани после обработки последних смесью ферментов, разрушающих клеточные стенки (J. Reinert, М. Yeoman, 1982): / — кусочки листьев; 2 — суспензия протопластов
В первом случае неочищенную смесь протопластов пропускают через фильтр с размером пор ~40 мкм. На фильтре остаются неразрушенные комки клеток и их большие осколки. Оставшаяся в водной фазе
смесь протопластов, мелких осколков клеток и ферментов центрифугируется так, чтобы оседали протопласты, а осколки оставались в супернатанте. Повторным центрифугировани-
ем протопласты отмываются от фермента и могут быть перенесены в среду культивирования. Этот метод очистки очень эффективен. Но для ослабленных протопластов этап фильтрации часто бывает слишком груб.
Метод флотации (О. Gamborg et al., 1981) используется для хрупких протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. Неочищенная фракция протопластов смешивается с раствором сахарозы (концентрацией от 0,3 до 0,6 моль/л) или сорбита и центрифугируется при соответствующей скорости. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно. Скорость центрифугирования варьирует от 40—80 до 350g.
Для получения протопластов широко используют клеточные суспении и каллусные культуры. Схема общей процедуры изоляции протопластов та же. Однако в этом случае нет необходимости в стерилизации исходного материала.
Условия получения жизнеспособных протопластов. Выделение протопластов технически — хорошо отработанная процедура, достаточно легко выполняемая. Однако получить жизнеспособные протопласты непросто. Это зависит от многих факторов — состава ферментов, их качества, pH среды и выбора осмотического раствора. Большее значение имеет физиологическое состояние растительного материала, его возраст, условия выращивания. Факторы, которые активируют рост растения, будут увеличивать вероятность получения жизнеспособных протопластов. Так, например, для успешного выделения протопластов из Nicotiana tabacum оптимальными будут следующие условия выращивания растений: температура 22°С, освещенность 10 000—20 000 лк в течение 15 ч, еженедельная подкормка азотом. Наиболее благоприятный возраст растения 40—60 сут. Растения Solarium tuberosum полезно перенести на 4—10 сут в условия низкой освещенности (7000 лк, 6 ч) и уже после этого изолировать протопласты. Для люцерны исследовался эффект возраста листа на жизнеспособность выделяемых протопластов. Старые листья требовали более высокой концентрации ферментов, протопласты были менее жизнеспособны. Обнаружено, что жизнеспособность протопластов можно увеличить, если кусочки листьев без эпидермиса предварительно инкубировать на среде для клеточных культур в течение 36—48 ч.
Для получения протопластов из суспензионных и клеточных культур наилучшей является поздняя стадия логарифмической фазы роста. В этот период клеточные <.1енки легче всего поддаются энзиматическому разрушению, а протопласты — наиболее жизнеспособны. Выход протопластов зависит от состава среды. Увеличение концентрации ауксина и снижение концентрации сахарозы за 1 сут перед изоляцией протопластов активировало их выход. Полагают, что эти условия влияют на состав клеточной стенки и облегчают ее энзиматическое разрушение.
Одно из неудобств применения культивируемых клеток как
исходного материала для выделения протопластов состоит в том, что такие культуры имеют часто нестабильное число хромосом. Большинство долго культивируемых культур содержат смесь эуплоидных и анэуплоидных клеток. Обычно последние не способны к регенерации растений. Это приводит к существенному снижению частоты регенерации растений из изолированных протопластов. И. Эванс и О. Гамборг (Evans Е., Gamborg О., 1982) разработали метод, формирующий хромосомную стабильность в используемых для изоляции протопластов клеточных культурах. Три условия являются определяющими: 1. Важен эксплантат, который используется для получения клеточной культуры. Например, ткани листа или ткани молодых побегов имеют более высокое содержание диплоидных клеток, чем ткани сердцевины. 2. На число хромосом культивируемых клеток влияет концентрация регуляторов роста. Так, высокие концентрации кинетина способствуют возникновению полиплоидии. 3. Важно для полученной диплоидной культуры поддерживать селективные условия, которые благоприятствовали бы доминированию данной популяции (по Е. Evans, J. Bravo, 1983).
Протопласты, изолированные из стабильной клеточной культуры, с большей вероятностью регенерируют растения и более полезны для исследования генетической модификации протопластов, особенно их слияния.
Культивирование протопластов
Способы культивирования протопластов. Для культивирования протопластов используются два технических приема: метод жидких капель и метод платирования. В первом случае суспензия протопластов в виде капель помещается в жидкой среде на пластиковые чашки (Као К. N. et al., 1971).
Метод обеспечивает хороший обмен газами через воздушную фазу и диффузию в раствор экскретируемых продуктов. Кроме того, легко можно добавить свежий питательный раствор в нужной концентрации. Однако при культивировании этим способом протопласты агрегируются в центре каждой капли. Накапливаясь, они образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений, что препятствует успешному культивированию. Этот метод также не удобен, если надо проследить за судьбой индивидуальной колонии протопластов.
Другой широко распространенный метод — агаровая культура (Nagata Т., Takebe I., 1971). В этом случае определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же самой среды, содержащей 1 % агар-агара. Температура не должна превышать 45°С. Чашки Петри заклеивают парафиллюмом и держат перевернутыми при температуре около 28°С. Протопласты фиксированы в одном положении и физически отдалены один от другого. Этот метод имеет важное преимущество: можно
наблюдать для одного конкретного протопласта всю последовательность его развития — формирование клеточной стенки, деление клеток, рост и развитие растения. Недостаток метода заключается в том, что возможно некоторое повреждение протопластов, когда они смешиваются с теплым агар-агаром.
Вариантом этой техники является использование «кормящих» протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или гамма-излучения, чтобы блокировать их способность к клеточному делению. Они смешиваются с жизнеспособными протопластами и платируются. Можно «кормящие» клетки пласты располагать в нижнем слое, а жизнеспособные — в верхнем. Этот метод позволяет культивировать суспензии протопластов более низкой концентрации, чем та, что обычно необходима для их роста. Доза облучения выбирается такой, чтобы клетки утратили способность к делению, но поддерживали и стимулировали рост других клеток.
Сходным с этим методом является метоп совместных культур. Он используется для эффективного культивирования некоторых протопластов. Протопласты, которые отличаются быстрым ростом, смешиваются с протопластами, трудно поддающимися культивированию. Д. Эванс отмечает, что успех культивирования такого рода связан с веществами, которые выделяются быстро растущими видами (D. Evans, 1979).
Удобным вариантом метода жидких капель является культивирование в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов (микроизоляция) (Ю. Ю. Глеба, 1978). В микрокаплях, даже если в них находится только одна клетка, соотношение объема клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре плотностью 103 кл/мл.
Условия культивирования протопластов. По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды, применяемые для культивирования протопластов, подобны таковым для клеточных культур. Наиболее употребимы среды Мурасиге и Скуга (1962), Нагата и Такебе (1971) с некоторыми модификациями, среда В 5 (О. Gam- borg et al., 1968) и среда 8 Р (К N. Као., М. Michayluk, 1978). Последняя представляет собой обогащенную витаминами, аминокислотами и сахарами среду В 5 Гамборга, иногда с более сложным составом фитогормонов (К. N. Као, 1977). Все эти среды содержат минеральные вещества, такие, как N, Р, S, К, Ga, Mg, относящиеся к макроэлементам, а также Zn, Си, Мо, В, Мп, С1, Со, составляющие группу микроэлементов.
Поскольку Центральная проблема при культивировании растительных объектов на искусственных питательных растворах — создание определенной буферной емкости смеси, то обычно используют сопряженные пары солей, в которые объединяют химически или физиологически кислые и щелочные соли. К основным сопряженным парам относятся соли, содержащие азот и фосфор. В среде Мурасиге и Скуга это слабо физиологически щелочная
соль KNO3 и слабо физиологически кислая* соль NH4NO3 в сочетании с химически кислой солью КН2РО4. В соответствии с этим реакция среды сравнительно кислая, pH 5,6—5,8. Среды содер жат железо в хелатной форме (Ге* EDTA) и сахарозу как источник углеводов, а также витамины и гормоны. Рекомендуется добавлять в среду сахара, входящие в состав клеточной стенки, а также ксилозу, рибозу и др. Это стимулирует образование клеточной стенки. Состав этих добавок может быть очень специфичным в зависимости от видовых особенностей протопластов. Для индукции деления протопластов многих видов растений эффективно добавлять в среду 2,4 Д, НУК, БАП, а также кинетин.
Температура, при которой культивируются протопласты, варьирует в значительной степени в зависимости от специфики вида. Так, например, для протопластов одного представителя семейства злаковых — росички кроваво-красной {Digitaria san- guinalis), распространенной в черноземной зоне, оптимальной является температура 30°С, а для пшеницы Triticum aestivum 22°С. Обычно протопласты не выдерживают самого незначитель ного отклонения от оптимальной температуры.
Интенсивность света — параметр, достаточно часто обсуждаемый в литературе. В общем исследователи приходят к выводу, что свет высокой интенсивности губительно действует на свежевыделенные протопласты. Оптимальные значения освещенности варьируют в широких пределах. Так, люцерна {Medicago sativa) образует колонии в абсолютной темноте, а для протопластов Nemesia strumosa оптимальный рост наблюдается при освещенности в 80 000 лк.
Существенным фактором культивирования является плотность засева протопластов. При очень низкой плотности протопласты часто не делятся. С другой стороны, при очень высокой плотности высева затруднения в культивировании возникают на более поздних стадиях, когда на рост могут оказывать влияние выделяемые продукты обмена. Оптимальная плотность протопластов в культуре 3*103—1*105 в 1 мл.
Регенерация клеток, клеточных культур и растений из протопластов. Образование клеточной стенки у протопластов в культуре происходит сразу после удаления раствора фермента. Вновь синтезируемую клеточную стенку можно наблюдать в флуоресцентный микроскоп, используя как реагент калкофлер белый (1%-ный раствор). Регенерация клеточных стенок — явление достаточно распространенное. Гораздо труднее добиться деления образующихся клеток и еще труднее получить целое растение. Однако для ряда видов имеются устойчивые яинии клеток и целые растения (см. Ю. Ю. Глеба, К. М. Сытник, и984). Возможность регенерации растений из протопластов мо»кет свидетельствовать о тотипотентности протопластов, как этоХбыло показано для клеток растений (F. Steward, 1970). I
Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфо-
Рис. 14. Эмбриогенез и образование растений в культуре протопластов моркови: А — протопласты из культуры клеток моркови; Б — протопласты после образования клеточной стенки; Б — эмбриоиды из протопластов моркови 3—4-иедельного возраста; Г — растение моркови (по Н. Grambow et al., 1972, D. Dudits et al.,1976)
генеза. Так, для моркови {Daucus carota^ получен эмбриогенез при культивировании протопластов, изолированных из суспензионной культуры (Н. Grambow et al., 1972) (рис. 14). Протопласты выращивали на среде с 2,4 Д. Через 8—10 сут они образовывали группы клеток, которые продуцировали эмбриоиды, развивавшиеся в крошечные проростки. Их переносили на среду без 2,4 Д, где и формировались целые растения.
Можно изолировать протопласты из кусочков корня моркови. Т. Камейа и X Ушимия (Т. Kameya, Н. Uchimiya, 1972) культи-
Рис. 15. Регенерация растений из протопластор, выделенных из мезофилла табака (Т. Nagata, I. Takebe, 1971):
А— В — стадия образования колоний из протопластов на среде с агаром; Г — колонии пересажены на среду для образования каллусной массы: Д — дифференциация в каллусе; Е—растение, регенерированное из единичного протопласта
вировали изолированные таким путем протопласты на среде, содержащей 1 % кокосового молока, НУК или 2,4 Д. Группы клеток, которые развивались из протопластов, выращивали на среде, содержащей гидролизат казеина, кокосовое молоко или кинетин. Через 4—8 недель развивались каллусные массы, в которых происходила дифференциация эмбриоидов.
Развитие корней, стеблей и эмбриоидов, вырастающих в целые растения, описано для протопластов Asparagus officinalis, из класса однодольных. Протопласты выращивали на среде с НУК, зеатином и глутамином. Оказалось, что глутамин — в данном случае эффективный индуктор деления изолированных протопластов. Делящиеся протопласты образовывали колонии клеток, Варьируя уровень гормонов, стимулировали корнеобразование, формирование побега или эмбриогенез. ■
Целые растения из протопластов можно получить не только через эмбриогенез, но и путем последовательного формирования побегов и корневой системы. Так впервые Т. Нагата и И. Такебе (Т. Nagata, I. Takebe, 1974) осуществили регенерацию целых растений из протопластов мезофилла листа Nicotiana tabacum (рис. 15). Свежеизолированные протопласты платировались в модифицированной среде Мурасиге и Скруга с 3 мг/л НУК и 1 мг/л БАП. Колонии формировались после 3 недель культивирования. Эффективность образования колоний зависела от плотности засева, условий освещения во время инкубации. Индивидуальные колонии извлекались и переносились на среду Сак- ристан и Мельхерса. Они давали каллусные массы и через 3 недели образовывали много дифференцированных побегов. Сформированные растения переносили в почву. Регенерацию растений осуществляли и при культивировании протопластов, полученных из гаплоидных форм табака.
Еще один представитель пасленовых Petunia обладает достаточно высоким регенерационным потенциалом и широко используется в экспериментальных исследованиях. Интересно, что состав среды, на которой происходит образование проростков и корней, сходен и у табака, и у петуньи. Формирование каллуса и регенерация растений получена из протопластов рапа Brassica napus.
Таким образом, пользуясь арсеналом способов культивирования клеток in vitro, успешно удается культивировать протопласты и выращивать целые растения из единичных протопластов. Это может свидетельствовать о тотипотентности протопластов.
Пролиферативная способность клеток, возникающих из протопластов. Формирование клеточной стенки осуществляется легче, чем дальнейшая пролиферация клеток. Р. Г. Бутенко (1979—1981) выделяет следующие факторы, которые определяют пролиферативную способность клеток, возникших из изолированных протопластов: 1. Видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растений. 2. Способ и условия выделения протопластов. 3. Плотность высева протопластов. 4. Состав пита-
тельной среды, причем это относится не только к гормональным и витаминным добавкам, но и к концентрации минеральных солей и pH.
Слияние протопластов
Изолированные протопласты за то короткое время, пока они не образовали клеточной стенки, могут сливаться между собой. Слияние может быть спонтанным. Оно происходит чаще при эдноступенчатом способе выделения протопластов и если используются протопласты, изолированные из молодых тканей или суспензионных культур. По мнению Е. Кокинга (1972), спонтанное слияние осуществляется пассивно путем расширения плазмодесм, которыми связаны клетки в растительной ткани.
Способы индукции слияния протопластов. Некоторые вещества, добавленные к выделенным протопластам, облегчают И стимулируют этот процесс. Феномен индукции слияния между протопластами различных таксонов для создания гетерокариона был впервые продемонстрирован Е. Коккингом, Д. Поува, С. Кум- минсом (J. Power et al., 1970). Они осуществили внутривидовое и межвидовое слияние протопластов, полученных из кончиков корней проростков кукурузы и овса. В качестве индуктора использовали 0,25 М раствор NaNOa, который не влиял на жизнеспособность протопластов. После слияния этим методом протопластов Nicotiana glauca и N. langsdorffii удалось регенерировать целое растение (Р. Carlson et al., 1972). Скорость слияния оказалась низкой. Однако работы эти имели значение, так как они привлекли внимание других исследователей и получили дальнейшее развитие.
Слияние индуцирова ти также кальцием в высоких концентрациях при щелочном pH. Протопласты инкубировали в течение 30—40 мин при 37°С в 50 мМ-ном глицин — NaOH буфере (pH 10,5), содержащем 50 ммоль/л СаС12 и 0,4 ммоль/л Ь- маннита (W. Keller, G. Melchers, 1973). Этот метод наиболее подходящ для получения продуктов слияния протопластов мезофилла. Протопласты клеток культуры ткани не особенно чувствительны к этой обработке.
Эффективным индуцирующим агентом для слияния протопластов оказался ПЭГ.
Удовлетворительная молекулярная масса ПЭГ 1540—6000. К смеси протопластов, нанесенной в виде отдельных капель на стеклянную поверхность, добавляют раствор ПЭГ из расчета 3 капли на 1 каплю суспензии клеток. Раствор ПЭГ готовят, добавляя 1 г его (молекулярная масса 1540) к 2 мл 0,1 М раствора глюкозы, содержащего 10,5 ммоль/л СаС12 и 0,7 ммоль/л КН2РО4(рН 5,5). Через 10—15 мин ПЭГ удаляют отмыванием либо средой культивирования, либо раствором с высоким pH (10,0—10,5) и высоким содержанием кальция (70 ммоль/л, а в ряде работ 50—100 ммоль/л) (Ю. Ю. Глеба, К- М. Сытник, 42
. В присутствии ПЭГ наблюдается сильная адгезия протопластов, а после удаления ПЭГ и добавления Са2+ — их слияние. С использованием этого метода получены гибриды разного типа, в том числе соматические гибридные клетки между протопластами растений и животными клетками, протопластами растений и водорослей.
Т. Нагата обнаружил адгезию и слияние протопластов мезофилла табака при добавлении поливинилового спирта (ПВС) (степень полимеризации приблизительно 500). ПВС отмывался затем буфером с высоким pH и высоким содержанием Са2+. Слияние происходило со сходной частотой, как и в случае ПЭГ. Адгезионная сила этого химического соединения слабее, чем ПЭГ, и оно менее вредно для протопластов. Влияние ПВС на поверхность протопласта менее понятно, чем в случае ПЭГ, хотя соединения имеют сходные химические характеристики: являются слабыми поверхностно-активными веществами и имеют высокую растворимость в воде. Их химические формулы следующие:
полиэтиленгликоль поливиниловый спирт
Недостаток этой техники слияния протопластов состоит в том, что одновременно получить большое количество слившихся клеток очень трудно. У. Циммерман с сотрудниками разработали физический метод для слияния протопластов, в котором в качестве индуктора использовались импульсы эл- ктрического тока (U. Zimmermann, Р. Scheurich, 1981). Этот метод был применен для слияния разных протопластов, животных клеток, липосом. Схематическое изображение аппаратуры дано на рис. 16. Протопласты помещают в камеру, где создается неоднородное, переменное электрическое поле (синусоидальная волна, максимальная напряженность поля 200 В-см-1, частота 0,5 МГц, расстояние между электродами 0,2 мм). В этих условиях на электродах формируются агрегаты, состоящие из 2—3 протопластов, либо между электродами образуются мосты из 5—6 протопластов. Это явление известно как диэлектрофорез. К этой системе дополнительно подается единичный импульс (квадратная волна, напряженность 750 В-см-1, продолжительность 50 мкс), вызывающий слияние протопластов в агрегате. Все физические параметры подбираются заранее. Характерной и очень важной особенностью этого метода является синхронное индуцирование. Слияние проводится при удельной электропроводимости среды ниже 10-4 См-см-1. Этому условию удовлетворяет 0,5 М раствор маннита, который относится к неэлектролитам: его удельная электропроводимость 1,4-10-5 См-см-1
Рис. 16. Схематическое изображение аппаратуры для электрической индукции слияния (пи Т. Nagata, 1984):/ — камера для слияния; 2 — электроды; 3— генератор-1; 4—генератор-2; 5 — осциллографРис. 16. Схематическое изображение аппаратуры для электрической индукции слияния (пи Т. Nagata, 1984):/ — камера для слияния; 2 — электроды; 3— генератор-1; 4—генератор-2; 5 — осциллографМеханизм слияния протопластов. Методы, используемые для слияния протопластов, экспериментально разные; тем не менее они имеют общий конечный эффект. Для изучения механизма слияния необходим анализ общих черт в действии индукторов на протопласт.
Рис. 16. Схематическое изображение аппаратуры для электрической индукции слияния (пи Т. Nagata, 1984):
/ — камера для слияния; 2 — электроды; 3— генератор-1; 4—генератор-2; 5 — осциллограф
Рис. 16. Схематическое изображение аппаратуры для электрической индукции слияния (пи Т. Nagata, 1984):
/ — камера для слияния; 2 — электроды; 3— генератор-1; 4—генератор-2; 5 — осциллограф
При слиянии протопластов можно выделить два процесса: адгезию и собственно Слияние мембран. Адгезия — следствие определенных свойств поверхности протопласта. Она редко наблюдается, если протопласты суспендированы в растворе неэлектролитического осмотика, такого, например, как маннит или сахароза, без добавления катионов или с очень низкой концентрацией последних. Этот факт свидетельствует о том, что поведение протопластов в растворе определяется элект- рокинетическими свойствами его поверхности. Заряженное состояние
клеточной поверхности экспериментально можно определить путем
электрофореза клеток. Для этого протопласты помещают в элек
трическое поле, где они движутся в соответствии с поверхностными зарядами. Зная1 скорость передвижения, можно рассчитать элек- трокинетический, или ^-потенциал клеточной поверхности.
Значения g-потенциала в мВ для протопластов Nicotiana tabacum от —25 до —35, Petunia hybrida —25, Brassica rapa —23, Vinga unguiculata от —10 до —15 (T. Nagata, 1984). Основываясь на этих данных, рассчитывают потенциальную энергию взаимодействия между протопластами. Результаты расчетов показывают, что адгезия в растворах обычных неэлектролитных осмотиков невозможна. Среды с высоким pH и высоким содержанием Са2+ вызывают снижение g-потенциала, что, вероятно, связано с нейтрализацией поверхностных зарядов. Это ослабляет силы отталкивания отрицательных зарядов поверхности протопластов и происходит агрегация. Снижение g-
потенциала показано при агрегации протопластов в присутствии раствора NaNOa.
В настоящее время нет экспериментальных данных по изменению g-потенциала протопластов при наличии ПЭГ, так как его высококонцентрированные растворы обладают большой вязкостью, что затрудняет проведение электрофореза. Однако на искусственных мембранах показано уменьшение поверхностного потенциала с увеличением концентрации ПЭГ. Это дает основание предположить, что и в случае ПЭГ агрегация протопластов
ЕЕРис. 17. Схематическое изображение образования цепочки протопластов во время диэлектрофореза (по Т. Nagata, 1984)Рис. 17. Схематическое изображение образования цепочки протопластов во время диэлектрофореза (по Т. Nagata, 1984)Рис. 18. Схематическое изображение диэлектрического разрыва двух противоположных мембран (по Т. Nagata, 1984)Рис. 18. Схематическое изображение диэлектрического разрыва двух противоположных мембран (по Т. Nagata, 1984)
Е
Е
Рис. 17. Схематическое изображение образования цепочки протопластов во время диэлектрофореза (по Т. Nagata, 1984)
Рис. 17. Схематическое изображение образования цепочки протопластов во время диэлектрофореза (по Т. Nagata, 1984)
Рис. 18. Схематическое изображение диэлектрического разрыва двух противоположных мембран (по Т. Nagata, 1984)
Рис. 18. Схематическое изображение диэлектрического разрыва двух противоположных мембран (по Т. Nagata, 1984)
связана с изменением электрокинетических свойств поверхности. Агрегация под действием ПЭГ практически необратима, чем отличается от таковой в присутствии катионов. Считают, что это связано с дегидратированием поверхности, приводящим к тесному контакту между клеточными мембранами в агрегате.
Агрегация протопластов в переменном негомогенном поле объясняется исследователями следующим образом. Отрицательные заряды на поверхности протопластов, как показано на рис. 17, «маскируются» или нейтрализуются в переменном электрическом поле. В то же время неоднородность поля индуцирует в протопласте диполь, что способствует их агрегации. Агрегаты перемещаются к участку с более высокой напряженностью и в зависимости от плотности суспензии протопластов они либо образуют небольшие скопления, либо формируют мосты между двумя электродами.
Таким образом во всех методах слияния протопластов на первом этапе происходит их агрегация, которая объясняется изменением электрических свойств поверхности. Напомним, что поверхностный потенциал, или g-потенциал, не следует путать с мембранным потенциалом. Поверхностный потенциал возникает за счет фиксированных зарядов поверхности, в то время как мембранный потенциал — результат Донановского распределения зарядов через мембрану.
Процесс слияния клеток — явление общее и может быть индуцировано у животных клеток, протопластов растений и микроорганизмов. Для животных клеток показано, что слияние мембран, следующее за адгезией клеток, является результатом увеличения текучести и тесно связано с фазовым разделением (Д. Мецлер, 1980).
Анализ экспериментальных материалов, касающихся структуры и свойств мембран при воздействии индукторов слияния, показывает, что в условиях высокого pH, под действием высоких концентраций Са2+ у растительных протопластов также происхо-
дит увеличение текучести мембран. ПЭГ не вызывает увеличения текучести мембран, а способствует агрегации протопластов. Собственно слияние мембран происходит только тогда, когда суспензию отмывают от ПЭГ раствором с высоким pH и высоким содержанием Са2+, которые существенно увеличивают текучесть мембран до фазового разделения и слияния (Т. Nagata, 1984). Электронно-микроскопические исследования с использованием метода замораживания — травления свидетельствуют о том, что слияние мембран происходит в местах, свободных от внутримем- бранных частиц. Эти участки имеют липидную природу и образовались, по-видимому, в результате фазового разделения (Н. Ro- benek, Е. Peveling, 1978).
Слияние, индуцируемое электрическими импульсами, можно объяснить следующим образом. Импульс короткой продолжительности вызывает диэлектрическое разрушение соприкасающихся мембран протопластов (рис 18). Вокруг дырки возможен обмен липидными молекулами, образование липидных мостов, что в конце концов приводит к слиянию мембран. Это энергетически более выгодное состояние, чем существование двух поврежденных мембран. Процессы, сопровождающиеся обменом липидов, отражают особенности жидкой мозаичной структуры клеточной мембраны и могут быть связаны с ее текучестью.
Гибридизация
соматических клеток
Разработка способов индукции слияния протопластов вместе с развитием экспериментальной техники культивирования клеток in vitro, дающей возможность получения изолированных протопластов, их культивирования и образования каллуса и в дальнейшем целого растения, сформировало новый очень интересный и перспективный метод гибридизации растений — парасексуаль- ную, или соматическую, гибридизацию.
Сущность этого способа гибридизации заключается в том, что в качестве родительских используются не половые клетки (гаметы), а клетки тела (сомы) растений, из которых изолируют протопласты. И в отличие от полового скрещивания, где имеет место одностороннее исключение протоплазмы, при соматической гибридизации в образовавшемся гибриде оба партнера имеют более или менее равный цитоплазматический статус. Слияние протопластов способствует объединению двух различных цитоплазм. В большинстве исследований слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, ядро — одного. Образование растения с гибридной цитоплазмой и органеллами обоих партнеров, но содержащее в своих клетках ядро только одного вида, возможно в том случае, если
после слияния протопластов не происходит соединения ядер и одно ядро дегенерирует (Е. Cocking, 1980).
Важным моментом в изучении индуцированного слияния двух неродственных протопластов является селективный маркер, используемый для идентификации продукта гетероплазматиче- ского слияния, так как эффект индуктора не специфичен и вызывает агрегацию и слияния протопластов одного и того же вида и различных видов. Для идентификации гетероплазматиче- ского продукта могут служить пластиды. Например, в случае индуцируемого ПЭГ слияния протопластов сои и капусты гетерокарион получал хлоропласты от капусты и плотную цитоплазму и неокрашенные пластиды от протопластов сои (К. К- Kartha et al., 1974). При межродовом слиянии протопластов табака и моркови как селективные маркеры использовались зеленые хлоропласты табака и красные, содержащие антоциан, протопласты моркови. Четко различимы были продукты слияния при межвидовой гибридизации между протопластами двух видов Torenia. Протопласты Т. fournieri, содержащие антоциан, комбинировались с протопластами Т. baillonii, содержащими только хромопласты или только хлоропласты (I. Potrykus, 1971). Кроме пластид могут быть использованы биохимические ит генетические маркеры, такие, как изоэнзимный состав, структура нуклеиновых кислот, устойчивость к наркотикам, число хромосом, кариотипы.
Первое сообщение об успешном получении зрелого межвидового гибридного растения методом соматической гибридизации было сделано П. Карлсоном с сотр. (Р. Carlson et al., 1972) Были использованы протопласты двух видов табака: Nicotianu glauca (2N = 24) и N. langsdorffii (2N=18). Идентификация гетероплазматического продукта проводилась по способности протопластов расти на среде Нагата и Такебе. Протопласты N. glauca и N. langsdorffii хотя и образовывали клеточные стенки, но не могли осуществить более чем одно деление, в то время как протопласты амфидиплоидного гибрида повторно делились и формировали каллусную массу. Другая характерная черта этого гибридного каллуса — его способность активно расти на среде без добавления гормонов, что дало возможность создать второй способ селекции.
В этих опытах слияние протопластов N. glauca и N. langsdorffii стимулировалось NaNO3(0,25 моль/л). После этапа слияния популяция, содержащая протопласты обоих родителей и гетерокарионы, платировалась на среду Нагата и Такебе. На ней росли только гибридные клетки. Через 6 недель роста было получено 33 каллуса. Они выращивались на среду без добавления гормонов. Каллус дифференцировал проростки. Далее было получено гибридное растение, которое цвело. Растения соматических гибридов были идентичны амфидиплоидным половым гибридам по морфологии, числу хромосом, а также изоэнзим- ному составу пероксидазы.
В успешной работе по созданию межвидового гибрида Petunia на основе соматической гибридизации Д. Поува с сотр. (J. Power et al., 1976) использовал две селективные схемы. Первая основана на различиях в условиях роста, необходимых протопластам, и на неодинаковой чувствительности к антимицину D. Во второй схеме для селекции гибридов была разработана альбиносно-комплементарная методика, которая состояла в слиянии протопластов альбиносного Р. hybrida с . протопластами из мезофилла листа Р. parodii. Отбирались зеленые формы как результат комплементации и селективного роста. Полученные в итоге растения классифицировались как соматический гибрид на основе изоэнзимных спектров пероксидазы, числа хромосом, цвета венчика, величины и общей морфологии растения. При создании соматического гибрида Daucus carota и D. capillifolius (D. Du- dits et al., 1977) протопласты изолировались из культуры клеток альбиносной моркови (О. carota^ и нормально зеленой D. capillifolius. Слияние индуцировали ПЭГ. Главным признаком для селекции соматического гибрида было восстановление фотосинтетической функции.
В ряде случаев для гибридизации используются комплементарные хлорофиллдефицитные мутанты. Г. Мелхерс и Г. Лабиб (1974) осуществили слияние протопластов двух хлорофилл- дефицитных светочувствительных разновидностей N. tabacum (гаплоид). Гибрид изолировали по чувствительности к высокой интенсивности света и по нормальной окраске листьев.
Р. Г. Бутенко, Ю. Ю. Глеба и К. М. Сытник использовали пестролистный пластомный мутант табака сорта Самсун и ядер- ный мутант серного табака сорта Дж. Вильямса. Мезофильные протопласты белых участков листа первого мутанта сливали с протопластами сеянцев второго. Сеянцы были гомозиготны по дефектному гену Su. Гибридные продукты восстанавливали способность к фотосинтезу в результате ядерно-плас- томной комплементации (Р. Г. Бутенко, 1979).
Г. Малхерс и др. (1978) получили регенерацию соматического гибрида картофеля и томатов. Протопласты мезофилла Lyco- persicon esculentum Mill var желто-зеленого мутанта и протопласты, полученные из каллусной культуры диплоидного штамма Solanum tuberosum L„ сливали на первом этапе в присутствии ПЭГ, а затем — ионов кальция в высокой концентрации. После слияния протопласты делились, образовывали каллусные массы, в некоторых из них формировались нормальные зеленые проростки. Их. либо высаживали в почву, либо прививали на ствол томата.
Исследователями предпринято много попыток парасексуаль- ной гибридизации и в ряде случаев были получены гибридные растения. Ю. Ю. Глеба и К. М. Сытник (1984) приводят подробный список внутривидовых и межвидовых соматических гибридов, а также примеры гибридов межродовых и межсемейственных.
Перенос клеточных органелл
Протопласты — очень подвижные, лабильные образования, поэтому они стали использоваться для введения в клетку чужеродного материала не только методом соматической гибридизации через слияние целых протопластов, но и введением в них ДНК или органелл других клеток. Однако работы в этом направлении находятся на начальном этапе развития. Тем не менее поглощение экзогенной ДНК отмечено для протопластов петуньи, сои, моркови (К. Ohyama et al., 1972; D. Hess et al., 1973; F. Hoffmann, D. Hess, 1977; P. Г. Бутенко, 1979). Кроме поглощения нуклеиновых кислот используется метод генетических манипуляций — перенос клеточных органелл. Так, И. Потрикус и Ф. Хоффманн (I. Potrycus, F. Hoffmann, 1973) успешно трансплантировали изолированные ядра Р. hybrida в протопласты Р. hybrida, N. glauca. Ядра изолировали также из протопластов. Их окрашивали флуоресцирующим красителем. Трансплантацию проводили в условиях- слабого деплазмолиза протопластов, используя центрифугирование для слияния клеточных компонентов и обработку лизоцимом, обладающим модифицирующим действием на мембрану. Свежеприготовленные протопласты суспендировались в изотоническом растворе маннита. Концентрация протопластов 10® на I мл-1. Изолированные и окрашенные ядра инкубировались в течение 1 ч в 0,3%-ном растворе лизоцима в манните при pH 5,8. Раствор делается несколько гипотоничным по отношению к протопластам. Далее осуществляли попеременное осаждение центрифугированием протопластов и ядер. В результате в центрифужных пробирках формировалось несколько чередующихся слоев. Затем центрифужную пробирку заполняли маннитом без лизоцима, центрифугировали 30 мин при 140g и оставляли на 2 ч при температуре 4°С. После этого
осадок ресуспендировали и просматривали под микроскопом. Ядра, идентифицированные по флуоресценции, обнаруживались и внутри цитоплазмы, и в вакуоле (рис. 19).
Чтобы изучить судьбу ядер после поглощения, использовали очень результативную модельную систему — две светочувствительные комплементарные мутантные линии N. tabacum: зеленею
Рис. 19. Введение ядра в протопласт клеток высших растений (по I. Potrykus, F. Hoffmann, 1973)Рис. 19. Введение ядра в протопласт клеток высших растений (по I. Potrykus, F. Hoffmann, 1973)щую и сублетальную. Гены, ответственные за светочувствительность в этой системе, являются ядерными генами. Это создает систему для скрининга соматических гибридов. У растений обоих видов изолировали протопласты и выделяли ядра. Изолированные ядра одной мутантной линии вводили в протопласты другой. Протопласты после введения в них ядер переносились в культуру.
Рис. 19. Введение ядра в протопласт клеток высших растений (по I. Potrykus, F. Hoffmann, 1973)
Рис. 19. Введение ядра в протопласт клеток высших растений (по I. Potrykus, F. Hoffmann, 1973)
Начальное культивирование проводилось при низкой интенсивности света. В этот период происходило деление и образование клеточных группировок обоих мутантов и гибридных протопластов. Каллусы, которые при этом развивались, подвергались селективному воздействию света высокой интенсивности. Только гибридные клетки и каллусы, образовавшиеся из них, оказались устойчивыми к условиям высокой освещенности. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что путем поглощения ядра между двумя светочувствительными мутантами образовались гибридные формы клеток (I. Potrykus et al., 1977).
Однако поглощение ядра не всегда приводит к образованию гибрида. Так, X. Биндинг (1976) наблюдал проникновение ядер Petunia в протопласты табака. Но в молодых регенерантах во время митоза хромосомы Petunia не были обнаружены. Это может свидетельствовать о потере в клеточном цикле интеграции между чужеродным ядром и ядром хозяина.
Помимо ядра показана возможность трансплантации хлоропластов. Хлоропласты относятся к группе органелл, которые имеют собственный генетический материал (ДНК) и рибосомы. Это ставит их в клетке в положение относительной независимости от ядра и позволяет осуществлять собственный синтез белков. Этим они отличаются от органелл эндомембранной системы, таких, как аппарат Гольджи или эндоплазматический ретикулум. Хлоропласты являются полуавтономными структурами клетки, они могут делиться самостоятельно, независимо от деления самой клетки. Автономность и самостоятельность хлоропластов подтверждается опытами по трансплантации хлоропластов высших растений и водорослей в цитоплазму животных клеток. Даже в этом случае наблюдается нормальное деление хлоропластов. И. Потрикус (1979) предложил два метода поглощения протопластами этих органелл. Была показана возможность использования такой же методики, как и для трансплантации ядер, т. е. последовательного центрифугирования протопластов и пластид в 0,03%-ном лизоциме. Кроме того, была продемонстрирована еще одна возможность введения хлоропластов в протопласт. В этом случае изолированные одиночные клетки инкубировали с целлюлазой, а затем, когда появлялись первые протопласты, клетки переносили в суспензию хлоропластов в 2%-ном растворе целлюлазы и 0,2 М растворе NaNOg при pH 5,4. Инкубация проводилась 15—30 мин на роторе с малой скоростью вращения. Когда примерно все клетки образовывали протопласты, суспензию отмывали от хлоропластов, и протопласты просматривали под микроскопом. В случае использования первой методики и для ядер, и для хлоропластов примерно у 0,5% протопластов обнаруживались чужеродные органеллы в цитоплазме. Второй метод давал лучшие результаты.
Существенным моментом, свидетельствующим о дальнейшем развитии в этой экспериментальной области, было успешное включение в протопласты функционально активных хлоропластов
и получение целых растений, содержащих хлоропласты чужого организма. Эти опыты выполнены П. Карлсоном. Он инкубировал протопласты из пестролистного мутанта N. tabacum с хлоропластами зеленого N. suaueolens. В результате культивирования таких протопластов образовывались зеленые каллусы. Из каллуса было регенирировано растение. Оно оказалось пестролистным. У растения-регенеранта анализировалась белковая фракция I, в которую входит рибулозодифосфаткарбоксилаза (РДФ-карбоксилаза) — главный растворимый белок хлоропластов. РДФ-карбоксилаза — ключевой фермент цикла Кальвина. Она состоит из двух типов субъединиц, больших и малых. Большие субъединицы синтезируются рибосомами хлоропласта при участии генома хлоропластов. Малые субъединицы собираются на рибосомах цитоплазмы, кодируются ядерными генами. Анализ состава белковой фракции I растения-регенеранта показал присутствие полипептидов, характерных для пластид N. tabacum и N. suaueolens.
Эти работы приводят авторов к заключению, что перенос хлоропластов может использоваться для выведения новых форм хозяйственно важных сортов растений. Включение, например, высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растения.
Таким образом, техника культуры клеток растений сформировала методы, используя которые, оказывается возможным получить своеобразный тип «разборки» клетки. На базе его может быть осуществлено конструирование клеток с новыми свойствами. Этот метод биологического конструирования на уровне клетки может оказаться очень полезным и перспективным для создания клеток, клеточных систем и целых растений, адекватных хозяйственным потребностям человека.
ГлаваГлава
Глава
Глава
СОЗДАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ АССОЦИАЦИЙ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ВЬСШИХ РАСТЕНИЙ С МИКРООРГАНИЗМАМИ
$ 1. Искусственные ассоциации с микроорганизмами как способ модификации растительной клетки и растения
В последние 15 лет в области клеточной инженерии растительной клетки выделилось направление по созданию новых клеток и клеточных систем путем введения микроорганизмов в клетку или в популяции культивируемых клеток растений. Экспериментально создаваемые клеточные системы называют ассоциациями по аналогии с ассоциациями, формирующимися в природе между организмами разных видов. При этом исследования направлены на получение ассоциаций внутриклеточного (эндосим- биотического) или межклеточного (экзосимбиотического) типа. В первом случае проводят индуцированное введение микроорганизмов в изолированные протопласты высших растений. Во втором — совместно культивируют клетки или ткани растений с микроорганизмами. Хотя, как будет видно при дальнейшем изложении, исходно задаваемая в эксперименте локализация микроорганизмов — внутри клеток или в межклетниках тканей — не всегда сохраняется в процессе создания и культивирования таких систем.
При получении ассоциаций на основе изолированных протопластов или культивируемых клеток высших растений с микроорганизмами предполагается, что клетки или популяции клеток растений должны приобретать новые свойства, обусловленные присутствием в них клеток микроорганизмов. Возможность получения из изолированного протопласта клетки, если она сохранится у протопластов и после введения в них микроорганизмов, создает предпосылку для модификации клеток. Совместное культивирование растительных клеток и микроорганизмов позволило бы получать популяции растительных клеток с новыми свойствами, приобретенными в результате их взаимодействия с клетками микроорганизмов. И наконец, способность растительной клетки in vitro дать начало целому растению открывает возможность направленного изменения растений. Очевидно, последнее осуществимо при условии, что микроорганизмы, введенные внутрь
клеток или в популяции клеток, сохранятся и в растениях, регенерированных из таких клеток.
Цели создания ассоциаций. Искусственные ассоциации клеток высших растений и микроорганизмов могут быть использованы для решения следующих фундаментальных научных проблем и практических задач.
Экспериментальная проверка теории эндосимбиотического происхождения эукариотной клетки, которое происходило, как полагают, через стадию экзосимбиоза.
Реконструирование отдельных стадий эволюционного процесса симбиогенеза. Возникновение ныне существующих симбиозов высших растений с микроорганизмами произошло в результате длительного и сложного эволюционного процесса. Воспроизведение природных симбиозов в лаборатории позволило бы понять механизмы возникновения и условия для формирования их заново в природе.
Моделирование и изучение на клеточном уровне природных симбиотических отношений (например, бобовых растений с клубеньковыми бактериями), имеющих большое практическое значение в обеспечении растений связанным азотом в природных экосистемах и в агрофитоценозах.
Повышение продуктивности растительной клетки при выращивании в культуре.
Улучшение экономически важных видов растений.
Остановимся более подробно на возможности применения в биотехнологии искусственных ассоциаций с микроорганизмами, получаемых на основе культур растительных клеток или регенерированных из них растений.
Повышение продуктивности культур растительных клеток. Растительные клетки в культуре проводят биосинтез (или биотрансформацию) важных для медицины и ряда отраслей промышленности веществ. Одним из требований рентабельности производства на основе растительных клеток является возможность культивирования на простых по составу питательных средах. Между тем культуры растительных клеток требуют присутствия в среде витаминов, фитогормонов, аминокислот, сахарозы и других веществ (см. гл. 1).
Серьезным ограничением практического использования культур растительных клеток является энергетическое обеспечение процессов биосинтеза. Растительные клетки в культурах гете- ротрофны или обладают ограниченной способностью к фотосинтезу. Представляется маловероятным совместить в культивируемой клетке способность к собственному фотосинтезу и биосинтезу видоспецифических продуктов (Р. Г. Бутенко, 1978). Одним из решений данной проблемы могло бы быть введение в эти культуры микроорганизмов, синтезирующих субстраты для роста растительных клеток или предшественники для биосинтеза. Особое значение при этом, очевидно, имеет введение в гетеротроф- но растущие клетки или культуры клеток растений фототроф-
ных микроорганизмов. Последние могли бы обеспечить растительные клетки продуктами фотосинтетической фиксации углерода, что позволило бы упростить состав среды.
В литературе отмечается недостаточное использование в биотехнологии принципов организации природных биологических систем, в частности, основанных на взаимоотношениях организмов разных видов. В микробиологии уже накоплен положительный опыт смешанного культивирования. В результате изучения смешанных культур микроорганизмов (выделенных из природы или созданных искусственно) выяснилось, что можно проводить более эффективно (по сравнению с монокультурами) накопление биомассы, кооперативный биосинтез конечных продуктов или трансформацию в нужном направлении исходного субстрата. Такие системы находят все большее применение в микробиологической промышленности и могут быть использованы для очистки сточных вод, биосинтеза белка (ферментов) и биологически активных веществ, таких, как ауксины, витамины, антибиотики (Н. С. Егоров и др., 1982). Считается, что в биотехнологии найдут применение смешанные популяции, разнообразные по своему составу, начиная от комбинаций нескольких штаммов одного вида микроорганизма и кончая сочетаниями представителей разных царств — животного и растительного (А. А. Воробьев, В. И. Коровкин, 1983).
Улучшение сельскохозяйственных растений. Другая возможность использования в биотехнологии ассоциаций клеток высших растений с микроорганизмами состоит в получении растений, способных к фиксации молекулярного азота. Повышение урожайности сельскохозяйственных растений в значительной степени зависит от обеспечения их связанным азотом. Растения получают его двумя путями. Один из них — потребление внесенных в почву химических азотных удобрений, на получение которых затрачивается огромная энергия. Растения же используют азотные удобрения частично — от 30 до 50% вносимого количества. Продукты разложения азотных удобрений в почве образуют токсичные соединения, загрязняющие окружающую среду.
Другим источником является биологическая фиксация молекулярного азота, которую осуществляют многие группы микроорганизмов. Она безвредна для человека и окружающей среды (в том объеме, в котором она осуществляется в агрофитоценозах и в естественных экосистемах). Большая часть азота в природе фиксируется симбиотическими азотфиксаторами. Они используют продукты фотосинтеза макросимбионта для покрытия энергетических затрат на фиксацию азота и передают связанный азот растению. Способность формировать азотфиксирующие симбиозы, однако, приобрели в процессе эволюции только определенные виды растений и микроорганизмов.
Все это обусловило интерес исследователей к разработке проблемы повышения доли биологического азота в питании растений. Практика сельскохозяйственного производства поста-
вила вопрос придания способности к азотфиксации экономически важным видам растений, которым это не свойственно. В решении этой задачи предлагаются разные подходы.
Растения искусственно инокулируют азотфиксирующими бактериями путем введения микроорганизмов в почву и ризосферу. Однако получаемый при этом эффект повышения урожая растений во многих случаях связан не с фиксацией бактериями азота, а с увеличением под влиянием бактерий числа корней и в результате более активным поглощением растениями ионов и воды. Кроме того, отмечается низкая выживаемость и вытеснение интродуцируемых чистых культур микроорганизмов естественной почвенной микрофлорой. Поэтому этот подход представляется бесперспективным.
Другой способ — применение методов генетической инженерии для создания растений, способных к азотфиксации. Предлагается переносить гены азотфиксации (ш^-гены) от микроорганизмов, фиксирующих азот, непосредственно в злаковые или другие экономически важные виды растений. По мнению специалистов, эта процедура методически вполне осуществима; nif-ген может быть введен в протопласты растений с помощью определенных векторов (таких, как плазмиды бактерий, патогенных для растений, или вирусы растений). Последующее культивирование протопластов и их регенерация до целых растений позволили бы получить особи, которые несли бы введенную генетическую информацию в своих клетках и, возможно, в последующих поколениях благодаря передаче через семена.
Однако, несмотря на принципиальную возможность применения такого подхода, привлечение методов генетической инженерии вряд ли позволит в ближайшее время перейти к задаче создания азотфиксирующих растений. Основные сложности состоят в следующем: требуется разработка методов введения m'f-генов в растительную клетку, их репликации и экспрессии там; у высших растений отсутствуют системы, которые осуществляли бы энергообеспечение фермента азотфиксации — нитрогеназы (процесс азотфиксации связан с затратой большого количества клеточной энергии); растительная клетка не обладает соответствующими системами транспорта и запасания в высокой концентрации ионов железа и молибдена, необходимых для синтеза нитрогеназы; наконец, она не имеет системы защиты нитрогеназы от инактивации кислородом. Последнее обстоятельство считают главным лимитирующим фактором в экспрессии nif-re- нов при введении их в аэробные организмы.
Ограничения указанных двух подходов по приданию растениям способности к фиксации молекулярного азота могут быть хотя бы частично преодолены при введении целых клеток азотфиксирующих микроорганизмов в растение. Речь идет об альтернативном способе решения обсуждаемой проблемы, связанном с конструированием новых искусственных ассоциаций. Такие системы должны быть основаны на симбиотических взаимоотношениях расти-
тельного и микробного партнеров. В этих экспериментах должны учитываться особенности организации природных азотфиксирую- щих симбиозов, а именно: 1) сохранение целостности обоих партнеров; 2) интеграция партнеров в пределах организма макросимбионта; 3) относительная обособленность микросимбионта, компартментация его в специальных структурах (например, локализация клубеньковых бактерий в клубеньках у бобовых растений, цианобактерии Anabaena azollae — в полости листа папоротника AzolldV Азотфиксация в таких искусственно создаваемых системах осуществлялась бы за счет функционирования азотфиксирующих микроорганизмов в клетках или тканях растений.
Достижение этой цели возможно с использованием техники клеточной инженерии. Введение азотфиксирующих бактерий в клетки или популяции культивируемых клеток небобовых растений позволяет испытать большое число сочетаний партнеров и выбрать устойчивые ассоциации на уровне культивируемых клеток. В процессе культивирования возможна адаптация партнеров к совместному существованию, аналогичная тем изменениям, которые приобретают компоненты природных симбиотических ассоциаций по сравнению ' со свободноживущими формами. Последующее получение растения в результате индукции органогенеза при условии сохранения клеточных взаимодействий, складывающихся в клеточных системах, позволило бы решать поставленную задачу — инкорпорирования бактериального симбионта в ткани (клетки) растения, интеграции их в клеточные ансамбли хозяина при сохранении интактности вводимого симбионта.
Очевидны преимущества введения в клетки и ткани растений целых клеток азотфиксаторов. Защита нитрогеназы от кислорода, выделяемого растением и необходимого для его роста, в таком случае будет осуществляться с помощью механизмов, которыми обладают бактериальные клетки. Особого внимания заслуживает использование в экспериментах азотфиксаторов, способных к фотосинтезу. Такие организмы могли бы обеспечить нитрогеназу энергией, получаемой в процессе собственного фотосинтеза. В случае применения гетеротрофных азотфиксаторов остро стоит вопрос о том, сможет ли растение в ассоциации с бактериями образовать достаточное количество продуктов фотосинтеза, чтобы обеспечить энергетические потребности нитрогеназы симбионта без ущерба для своего роста и ухудшения потребительских качеств растения (по содержанию углеводов, белка и т. д.).
Перечисленные возможности решения проблемы биологического азота пока имеют теоретическое значение. Они должны еще получить оценку с точки зрения экономической эффективности. Более того, требуется научное прогнозирование экологических последствий усиления на Земле азотфиксации, которое может привести к нежелательным для жизни сдвигам в азотном
балансе биосферы (пример тому — своевременно не предугаданное возрастание СОг в атмосфере, вызванное исключительно антропогенными факторами — производственной деятельностью человека).
Введение микроорганизмов в изолированные протопласты растений
Партнеры создаваемых ассоциаций. С целью получения ассоциаций внутриклеточного типа предпринимались неоднократные попытки вводить микроорганизмы в изолированные протопласты разных видов высших растений (табл. 4), среди которых представлены злаковые и другие сельскохозяйственные культуры, не имеющие естественных симбионтов. Протопласты выделяют из тканей растений или клеток суспензионных культур ферментативным способом (см. гл. 2).
В изолированные протопласты растений вводили микроорганизмы разных систематических групп: бактерии, дрожжи, цианобактерии (прежнее их название — синезеленые водоросли), органеллы (называемые цианеллами) водоросли Glaucocystis nos- tochinearum и криптомонадоподобного простейшего Cyanopho- ra paradoxa. Цианеллы представляют собой эндосимбиотические цианобактерии с отсутствующей или редуцированной клеточной стенкой. Используемые в экспериментах микроорганизмы отличались своими метаболическими возможностями. Зеленые водоросли, все цианобактерии и цианеллы осуществляют фотосинтез;
Таблица 4. Использование изолированных протопластов для получения ассоциаций с микроорганизмами
Источник протопластов
Вид микроорганизма
Литературный источник
Горох
Rhtzobium leguminosarum
VI Davey, Е. Cocking, 1972
Виноград дикий
Дрожжи (клетки, протопласты), цианобактерия Апа- cystis nidulans
М. Davey, J. Power, 1975
Кукуруза, табак
Цианобактерия Gloeocapsa
A. Burgoon, Р. Bottino, 1976: 1977
Просо, сорго
Azospirillum brasilense
I. Vasil et al., 1977
B. Hughes et al., 1978
Ячмень, табак
Цианеллы из Cyanophora paradoxa, цианобактерии Nos- toc macrozamia, Gloeocapsa
Табак
Цианобактерия Anabaena variabilis
J. Meeks et al., 1978
Лук, морковь
Цианеллы из Glaucocystis nostochinearum
P. Bradley, 1979; 1984
Лук
Одноклеточная цианобактерия
P. Bradley, A. Leith, 1979
Морковь
Зеленая водоросль Chlamy- domonas reinhardii (мутант без клеточной стенки)
L. Fowke et al., 1979
Морковь
Зеленая водоросль Stigeo- clonium (протопласты)
L. Fowke et ah, 1981
Рис. 20. Введение микроорганизмов в изолированные протопласты высших растений (по L. Fowke, О. Gamborg, 1981): а * поглощение путем инвагинации мембраны (эндоцитоз); б слияние мембран; в — слияние мембраны протопласта с липосомой
бактерии R. legutninosarum, Л. brasilense, цианобактерии Gloeo- capsa, Л. variabilis и N. macrozamia — азотфиксаторы. Цианобактерия Л. variabilis — факультативный фототроф и способна к гетеротрофному росту в темноте. Наряду с диким штаммом в протопласты вводили также ауксотрофные мутанты A.variabilis, испытывающие потребность в определенных факторах роста, которые они могли бы получать от растительной клетки. Такой прием применяют с целью установления возможной зависимости эндосимбионта от роста и метаболизма клетки хозяина.
Механизмы проникновения микроорганизмов в протопласты. Введение микроорганизмов в изолированные протопласты растений проводят при воздействии на иих специальными индуцирующими факторами. Микроорганизмы могут поглощаться протопластами или сливаться с ними. Протопласты гороха поглощали клетки Rhizobium непосредственно в процессе ферментативного разрушения клеточных стенок клеток мезофилла листа при получении изолированных протопластов. Во всех остальных случаях в качестве индуктора поглощения или слияния применяли полиэтилеигликоль (ПЭГ), который известен как агент, повышающий частоту слияния протопластов высших растений (см. гл. 2).
Поглощение растительными протопластами микроорганизмов (кроме зеленых водорослей) может происходить путем эндо-
цитоза, т. е. с помощью инвагинации плазмалеммы (рис. 20). При действии ПЭГ микроорганизмы прикрепляются к плазмалем- ме, образуется инвагинация плазмалеммы вокруг микроорганизма с последующим замыканием конца инвагинации путем слияния плазмалеммы. В результате образования таким образом везикула с микроорганизмом высвобождается в цитоплазму протопласта.
Слияние зеленых водорослей (протопластов и мутанта без клеточной стенки) с протопластами моркови индуцируется ПЭГ (рис. 20) по аналогии со слиянием протопластов высших растений (см. гл. 2). В этом случае происходит интеграция цитоплазматических мембран растительных протопластов и водорослей, а органеллы водорослей высвобождаются в цитоплазму протопластов, но не окружаются плазмалеммой протопласта.
В связи с проблемой сохранения интактности вводимых в протопласты органелл или микроорганизмов тот и другой способы имеют свои недостатки. Поглощение путем эндоцитоза приводит к изолированию вводимых в протопласт объектов в везикулах из плазмалеммы протопласта. Поскольку эти везикулы могут сливаться с лизосомальным аппаратом растительного протопласта, существует опасность, что это приведет к разрушению вводимого чужеродного материала. При слиянии происходит интеграция мембраны протопласта растения и микроорганизма, нарушение целостности микроорганизма и освобождение его органелл внутрь растительного протопласта. Обнаруженное для зеленых водорослей слияние с протопластами может рассматриваться, таким образом, как способ введения в растительную клетку не целых микроорганизмов, а интактных органелл. В качестве альтернативного пути, позволяющего преодолеть недостатки обоих рассматриваемых способов, предлагается заключать микроорганизмы в искусственные мембраны — липосомы (рис. 20). Этот прием уже был использован в опытах по введению в протопласты лука одноклеточных цианобактерий, заключенных в липидные капли. Преимущества данного методического приема видятся в том, что искусственные мембраны будут сливаться с плазмалеммой протопласта, освобождая таким образом интактные клетки микроорганизмов в цитоплазму протопласта.
Помимо использования ПЭГ в качестве индуктора поглощения протопластами микроорганизмов, можно отметить успешное применение в этих целях поливинилового спирта (ПВС), который также известен как индуктор слияния протопластов (см. гл. 2). При воздействии ПВС протопласты Vinca rosea поглощали сферопласты Agrobacterium tumefaciens (S. Hasezama et al., 1983), клетки и сферопласты Escherichia coli (C. Matsui et al., 1983) в экспериментах, проводимых с целью генетической трансформации протопластов (по этой причине данные работы не были введены в табл. 4). В этих опытах ПВС не оказывал токсического эффекта на протопласты, который был отмечен в сравнительных опытах с использованием ПЭГ. Высказывается также
предположение о возможности введения клеток азотфиксаторов в изолированные протопласты растений при индукции поглощения с помощью электрического поля. Этот метод, также успешно применяемый для слияния растительных протопластов (см. гл. 2), имеет то преимущество, что не оказывает сильного повреждающего воздействия на протопласты по сравнению с другими индукторами слияния.
Характеристика продуктов поглощения и слияния. Системы, полученные путем поглощения протопластами микроорганизмов или слияния с ними, обладали ограниченной способностью к выживанию или культивированию. В протопластах кукурузы обнаружено быстрое движение цитоплазмы через 14 ч после поглощения ими клеток цианобактерии, что служит признаком их жизнеспособности. В некоторых случаях протопласты, содержащие клетки или органеллы микроорганизмов, в процессе культивирования регенерировали клеточные стенки, и только в случае поглощения органелл С. reinhardii были способны к последующему делению. Клетки табака с внутриклеточной Д. variabilis никогда не делились и через 5 сут культивирования разрушались.
Есть отдельные данные о сохранении интактности клеток и органелл микроорганизмов внутри протопластов. В протопластах гороха в везикулах наблюдали делящиеся клетки Rhizobium, однако осталось неясным, начали они деление до или после поглощения их протопластом. Морфология бактерий свидетельствует об их интактном состоянии. Не происходило деления цианобактерии Д. variabilis в протопластах табака в процессе их культивирования, хотя цианобактерии сохраняли видимую интакт- ность. Ни один из акусотрофных мутантов этой цианобактерии не имел преимуществ в формировании внутриклеточных систем, гибель которых происходила с той же скоростью, что и систем, образуемых с диким штаммом. Органеллы зеленых водорослей в растительных протопластах в процессе культивирования деградировали, и только хлоропласты обнаруживались в цитоплазме клеток моркови через 10 сут.
Не предпринималось, к сожалению, систематических наблюдений за фотосинтетической и азотфиксирующей активностью введенных в протопласты органелл и микроорганизмов. Когда был проведен контроль за фотосинтезом изолированных цианелл, выявилась непригодность их к использованию в качестве эндосимбионтов в искусственных ассоциациях. Это связано с почти полной утратой способности к фиксации COg, которая в изолированных цианеллах составляли лишь 5% от активности при нахождении их в клетке хозяина в природном симбиозе, и неспособностью к делению экспериментальных клеток, содержащих циа- неллы (Р. Bradley, 1984). Неудачной оказалась попытка селекции азотфиксирующих ассоциаций, которые могли бы функционировать за счет азотфиксации цианобактерии Д. variabilis в протопластах табака при культивировании их в среде без связанного азота.
Таким образом, жизнеспособных внутриклеточных ассоциаций с микроорганизмами на основе изолированных протопластов получено не было. Для успешного продолжения работ этого направления требуется: подбор совместимых сочетаний партнеров; выбор адекватного способа введения микроорганизма в протопласт; подбор щадящих условий индукции поглощения (слияния) ; отработка условий культивирования получаемых продуктов.
Введение микроорганизмов в популяции культивируемых клеток растений
Партнеры ассоциаций и принципы их создания. При получении ассоциаций на основе культивируемых клеток и тканей используется разнообразный видовой набор растительных объектов и микроорганизмов (табл. 5). Культуры клеток (тканей) получали из бобовых, злаковых, овощных и других экономически важных растений, в том числе — продуцентов природных веществ. Микроорганизмы представлены в основном азотфиксирующими формами, среди которых симбиотические (клубеньковые) и свободно- живущие (Azotobacter, Azospirillum) бактерии, а также несимбиотические цианобактерии. Кроме того, для получения ассоциаций с каллусными культурами использовали зеленую водоросль Chlorella и разные виды грибов.
Цели создания ассоциаций с отдельными микроорганизмами существенно различаются так же, как и критерии, на основе которых оценивается возникновение ассоциативных взаимодействий в системах. Общим принципом для создания ассоциаций является совместное культивирование клеток и каллусных тканей растений с микроорганизмами. При этом способы введения микроорганизмов в систему для совместного выращивания могут быть разными: внесение клеток микроорганизмов непосредственно в каллусную или суспензионную культуру растения (смешанные культуры); высев на поверхность агаризованной среды рядом с каллусом таким образом, чтобы рост микроорганизмов происходил без соприкосновения (совместные культуры); разделение бактериальных клеток и клеток суспензионной или каллусной культуры специальными фильтрами (мембранами), обеспечивающими обмен продуктами метаболизма, но не допускающими контактов между клетками партнеров.
Ассоциации с клубеньковыми бактериями. Основная задача при получении ассоциаций с клубеньковыми бактериями первоначально состояла в создании упрощенных модельных систем для изучения симбиотических взаимоотношений бобового растения с клубеньковыми бактериями.
Впервые каллусная ткань сои (табл. 5) была инфицирована клетками Rhizobium, вызывающими лигнификацию и дифференцировку растительных клеток. Позже (в 1971 г.) была получена ассоциация, в которой клубеньковые бактерии формировали
Таблица 5. Искусственные ассоциации культивируемых тканей н клеток высшнх растений с микроорганизмами
Культура ткани или клеток растения
Вид микроорганизма
Литературный источник
Соя
Фасоль
Люцерна и др. бобовые (горох, донник, люпин, вика, клевер и др.)
Костер, пшеин- ца, рапс
Табак
Табак, пшеница и др. небобовые (морковь, петунья, портулак, солерос)
Rhizobium
I. Velikv, T. LaRue, 1967
R. Holsten et al., 1971
P. Арутюнян и др., 1976
Г. Хайлова и др., 1977
Rhizobium
J. Child, 1975
W. Scowcroft, A. Gibson, 1975
Г. Юркова и др., 1976
Морковь
Azotobacter vinelandii
Р. Carlson, R. Chaleff, 1974
Сахарный тростник
Azospirillum brasilense
I. Vasil et al., 1977
R. Berg et al., 1979, 1980
V. Vasil et al., 1979
1. Vasil et al., 1980
Люцерна, клевер, морковь, табак, пшеница, рис и др.
Azospirillum
J. Child, W. Kurz, 1978
W. Kurz, J. Child. 1978
Морковь
Chlorella цианобактерии:
Plectonema boryanum
Anabaena flos-aquae
P. Bradley. 198(1. 1983
P. Bradley, 1983
Табак
Цианобактерии
Nostoc, Anabaena
В. А. Труханов и др., 1983;
V. Kordyum et al., 1984
Рута
Грибы:
Rhodotorula rubra
Botrytis allii
Cochliobolus lunatis и др.
B. Wolters. U Eilert. 1982
подобие инфекционных нитей и бактероиды в каллусных клетках сои. Цитологическое изучение показало сходство процессов инфицирования в искусственной ассоциации и при формировании корневого клубенька в целом растении. Бактерии инфицировали до 10% клеток каллуса, обнаруживаясь в цитоплазме в везикулах, образованных, очевидно, плазмалеммой растительной клетки. В клетке они размножались, заполняя цитоплазму и образуя бактероиды, как и в клубеньке растения. В ассоциации с кал- лусными клетками клубеньковые бактерии проявляли нитрогеназную активность* (НГА), которая отсутствует у них в чистой
Для определения НГА обычно используют ацетиленовый метод, который основан на способности нитрогеназы восстанавливать, помимо молекулярного азота, ряд других соединений, в том числе ацетилен с образованием этилена.
культуре. Это свидетельствует об азотфиксации клубеньковыми бактериями в ассоциациях с каллусными клетками, которая составляла 1 % от активности азотфиксации в клубеньках растения.
В последующих исследованиях была подтверждена индукция НГА у клубеньковых бактерий культурами клеток (тканей) бобовых растений. Существенными для понимания взаимодействия макро- и микроорганизма в природных симбиозах бобовых оказались сообщения об индукции НГА у Rhizobium тканевыми культурами небобовых растений — костра, пшеницы, рапса, табака и других видов.
Критерием образования ассоциаций клубеньковых бактерий с культурами клеток и тканей бобовых и небобовых растений служила индукция растительным партнером НГА у клубеньковых бактерий, отсутствующая в чистых культурах. Для проявления этого эффекта не имело значения, происходили культивируемые клетки из корней или других органов растения. Причем этот эффект вызывался у Rhizobium присутствием либо растительных клеток, либо образуемых ими метаболитов. Последнее обстоятельство было выяснено при культивировании Rhizobium вне контакта с растительными клетками, для чего проводили отделение их друг от друга в процессе "культивирования специальными фильтрами (мембранами). В этих экспериментах было показано индуцирующее действие кондиционированной растительными клетками среды на проявление НГА у Rhizobium. Таким образом было выявлено, что для индукции НГА необходимы факторы, выделяющиеся клетками как бобовых, так и небобовых растений.
Создание азотфиксирующих ассоциаций Rhizobium с культурами тканей (клеток) небобовых растений послужило толчком к изучению фиксации азота клубеньковыми бактериями в чистых культурах. Оказалось возможным вызывать у них азотфиксацию добавлением в среду некоторых химических веществ, в результате чего были получены экспериментальные доказательства локализации генов азотфиксации в клетках Rhizobium.
В ассоциациях с растительными клетками и тканями происходит интенсивное размножение бактериальных клеток (при отсутствии размножения в чистых культурах на тех же средах). При этом сильный рост Rhizobium связан не с наличием живых клеток растений, а с их метаболитами. Клубеньковые бактерии локализуются, как правило, на поверхности растительных клеток, проникают в глубь каллуса по межклетникам и не попадают в здоровые, интактные клетки. Однако в некоторых случаях они обнаруживаются внутри растительных клеток. Полагают, что проникновение бактерий в растительные клетки может происходить в результате индукции клетками Rhizobium целлюлазной активности у растительных клеток, что было обнаружено в экспериментах с клетками сои (Т. Ozawa, М. Yamaguchi, 1980). Это приводит к частичной деградации микрофибрилл целлюлозы клеточных стенок растительных клеток, что, возможно, и обеспечивает про-
никновение бактериальных клеток в цитоплазму растительной клетки.
Клубеньковые бактерии сохраняют палочковидную форму как внутри растительных клеток, так и в межклетниках тканей, но в некоторых случаях отмечали переход их в бактероидную форму, характерную для клубеньков растения, при локализации их в искусственных ассоциациях как внутри клеток, так и на их поверхности.
Бактериальные клетки, как правило, угнетали рост культивируемых клеток и тканей растений и усиливали их отмирание. Ингибирующее действие клубеньковых бактерий связывают с накоплением в среде продуцируемых ими гормонов в супероптимальных концентрациях (Г. Н. Хайлова, 1983). Однако была обнаружена (J. Child, Т. J. La Rue, 1974) стимуляция роста каллуса сои, которая не зависела от проявления бактериями НГА при совместном росте с каллусом, т. е. она не была связана с бактериальной азотфиксацией. Это явление объясняют влиянием цитокининов, которые образуют бактерии. Есть единичные сообщения о положительном влиянии или об отсутствии повреждающего действия клубеньковых бактерий на растительные клетки in vitro. Так, показано (с помощью меченого азота) потребление каллус- ной тканью портулака азота, фиксированного клубеньковыми бактериями (D. Hess, В. Lustig, 1981). Кроме того, продемонстрирована способность ассоциативных культур к субкультивированию (Ю. Г. Попов и др., 1985). .
Известна единственная, оказавшаяся удачной, попытка регенерации растений табака из ассоциации каллусной культуры с Rhizobium (Г. Н. Юркова, Б. А. Левенко, 1978). К сожалению, отсутствует информация как о дальнейшей судьбе этих растений, так и об инфицировании их клубеньковыми бактериями в процессе регенерации из каллуса. ,
Таким образом, получение азотфиксирующих ассоциаций при взаимодействии клубеньковых бактерий с клетками небобовых растений приводит к выводу о принципиальной возможности распространения симбиоза с клубеньковыми бактериями на небобовые культуры. На этом основании различные комбинации эука- риотных клеток и азотфиксирующих микроорганизмов могут быть использованы в экспериментах in vitro для выяснения высокой специфичности природных симбиозов и понимания причин, по которым симбиоз в природе избирательно возник только у некоторых групп растений.
Ассоциации с азотфиксирующими свободноживущими бактериями. Эксперименты по созданию ассоциаций культур клеток (тканей) бобовых и небобовых растений с симбиотическими (клубеньковыми) бактериями послужили основой для получения ассоциаций с несимбиотическими азотфиксаторами — бактериями родов Azotobacter и Azospirillum. Эти почвенные гетеротрофные бактерии встречаются в ризосфере растений и в некоторых случаях образуют с ними ассоциации, обеспечивая
растения связанным азотом. В последние годы бактерии рода Azospirillum привлекают большое внимание исследователей, занимающихся искусственной инокуляцией злаковых культур. Во многих случаях при этом продемонстирована экономически значимая стимуляция роста инокулированных растений и содержания в них азота.
При создании искусственных ассоциаций на основе культур растительных тканей ставилась задача получить эффективные азот- фиксирующие системы, растущие на среде без связанного азота, с перспективой регенерации растений. В этих целях использовали сочетания культур растительных тканей с бактериями A. vinelan- dii и A. brasilense. Была обнаружена видовая специфичность растительных клеток в формировании ассоциаций с этими бактериями. Каллусные культуры табака, проса и Eremochloa ophiu- roides не выживали при инокуляции их Azospirillum. Каллусные культуры быстро «обрастали» бактериями, погибая через 4 недели после инокуляции. Напротив, при инокуляции той же бактерией ткани сахарного тростника была получена ассоциация, которую удалось субкультивировать на протяжении 18 мес. Стабильная ассоциация формировалась только на среде с низким содержанием связанного азота или полностью лишенной его.
Бактерии проявляли НГА независимо от того, формировали они ассоциации с растительными тканями или последние погибали. Культивируемые растительные клетки вызывают у Azospirillum, как и у Rhizobium, индукцию или стимуляцию НГА. Это было показано в сравнительных опытах по влиянию тканей 11 видов растений на НГА у Rhizobium и Azospirillum (J. Child, W. Kurz, 1978). Индукцию НГА вызывала также культуральная среда, кондиционированная клетками суспензионных культур проса (V. Pence et al., 1982). Таким образом, стимулирующий эффект на нитрогеназу Azospirillum оказывают метаболиты растительных клеток.
Несмотря на возможность длительного субкультивирования ассоциации на среде без связанного азота и наличие повышенных, по сравнению с чистыми культурами, значений НГА у бактерий, вклад бактериальной азотфиксации в обеспечение роста растительных клеток в данной системе не доказан. В ассоциации не было прироста биомассы, превышающего прирост биомассы в контроле (монокультура сахарного тростника на среде без связанного азота способна к медленному росту).
При инокуляции ткани табака культурой Azotobacter vinelandii не было получено ассоциации (V. Vasil et al., 1979). При инокуляции каллуса моркови культурой этой же бактерии была установлена взаимная метаболическая зависимость партнеров. В этих целях использовали ауксотрофный (аденинзависимый) штамм бактерии, который рос на среде без аденина только в присутствии каллуса. В свою очередь каллус рос на среде без связанного азота только в присутствии живых бактерий; убитые внесением пенициллина бактериальные клетки не поддерживали
рост каллуса в этих условиях. Очевидно, в этой ассоциации клетки моркови получали связанный азот в результате азотфиксации, осуществляемой бактериями, которые, в свою очередь, зависели от клеток моркови, получая от них необходимый для своего роста аденин. Инокулированный каллус сохранял способность расти на среде без связанного азота в течение 18 мес.
Как Azotobacter, так и Azospirillum в соответствующих ассоциациях были локализованы на поверхности или в межклетниках каллусной ткани и никогда не проникали в живые растительные клетки.
Попытка регенерации растений из ассоциации каллуса моркови с Azotobacter была неудачной. В ассоциации ткани сахарного тростника и Azospirillum при инкубации на свету были регенерированы зеленые побеги, которые не отличались от побегов, полученных в контрольной каллусной культуре. Они были способны к формированию корней и росту в почве. Однако ни в побегах, ни в корнях бактериальные клетки не обнаруживались. Невозможность проникновения бактерий в побеги в процессе органогенеза в смешанной культуре связывают с анатомическими особенностями каллуса сахарного тростника. Данная каллусная культура имеет очень уплотненные области, характеризующиеся отсутствием межклетников. Рост бактерий происходит в поверхностных участках каЬлусных агрегатов, что сопровождается отмиранием растительных клеток. Благодаря отсутствию межклетников бактерии не проникают в глубь этих агрегатов, где сохраняется жизнеспособная растительная ткань. Образование меристемоидов происходит в уплотненных участках каллуса, лишенных межклетников, что препятствует включению бактерий в формирующиеся побеги.
Ассоциация с зеленой водорослью. Инокуляция каллуса моркови одним из штаммов Chlorella и культивирование системы на дефицитной по азоту среде на свету приводила к выживанию каллуса в течение нескольких месяцев, в то время как контрольный каллус погибал. Клетки водоросли росли на поверхности каллуса и проникали в межклетники. В инокулированном каллусе обнаружен высокий процент интактных клеток, и большинство из них, очевидно, были живыми. Клетки другого штамма водоросли не росли совместно с каллусом, и в их присутствии обнаружена очень низкая доля интактных клеток моркови. На основании проведенных экспериментов сделан вывод об обеспечении клеток моркови азотистыми веществами, поступающими от водоросли, при культивировании системы на среде с дефицитом азота.
Ассоциации с грибами. Способ совместного культивирования ткани руты с различными грибами был применен в качестве нового, нетрадиционного подхода к повышению биосинтеза видоспецифических продуктов, образуемых растительными клетками in vitro (В. Wolters, U. Eilert, 1982). Совместную культуру получали таким образом, чтобы каллус и мицелий гриба не соприка-
сались, т. е. на биосинтез влияли диффундирующие через агар выделения гриба.
Различные виды грибов по-разному воздействовали на рост каллуса руты и биосинтез клетками алкалоидов акридонового типа. При этом грибы вызывали подавление или усиление роста каллуса по сравнению с контролем, сопровождающееся повышением видоспецифических биосинтезов. Стимулирующее действие на биосинтез оказывала также культуральная жидкость грибов. В зависимости от вида гриба наибольший стимулирующий эффект вызывался либо мицелием, либо культуральной жидкостью гриба. Так, в некоторых случаях мицелий Botrytis allii вызывал увеличение биосинтеза алкалоидов в 10 раз, а культуральная жидкость — более чем в 50 раз по сравнению с биосинтезом тканью руты в контроле. Напротив, мицелий Rhodotorula rubra способствовал увеличению биосинтеза по сравнению с контролем в 30 раз, а культуральная жидкость — только в 2 раза. Мицелий некоторых убитых автоклавированием грибов также может вызывать увеличение на 72% содержания стероидного соединения диосгенина в культуре ткани диоскореи по сравнению с биосинтезом в контроле (J. Rokem, 1984).
Можно выделить 3 группы фактов, полученных в результате изложенных здесь экспериментов, которые важны для развития работ по конструированию новых клеточных систем. 1. Показана возможность получения смешанных клеточных систем, растущих на среде без связанного азота, по-видимому, за счет бактериальной фиксации молекулярного азота. 2. Выявлен нормальный ход органогенеза в растительной ткани в. присутствии бактерий, хотя, к сожалению, в данных опытах бактерии и не включались в растения. 3. Установлено значительное повышение видоспецифических биосинтезов растительными клетками под влиянием микроорганизмов. Разработанные подходы могут быть, таким образом, использованы для получения систем, моделирующих природные симбиотические отношения, а также для дальнейшего экспериментирования в целях улучшения свойств растительной клетки in vitro или целого растения.
Цианобактерии в экспериментах по получению искусственных ассоциаций
Особенности цианобактерий в качестве партнера растительных клеток в искусственных ассоциациях. В исследованиях по получению ассоциаций на основе изолированных протопластов (см. табл. 4) были сделаны попытки введения цианобактерий в изолированные протопласты. Кроме того, выполнены единичные работы по совместному культивированию цианобактерий с растительными тканями (см. табл. 5). При этом было показано сох ранение интактности клеток каллуса моркови в условиях освещенности на среде, дефицитной по азоту, при совместном культивировании с азотфиксирующими цианобактериями Апа-
baenu и Plestonema В смешанной Культуре с палтусом табака выращивали также азотфиксируюшие цианоба терпи Xostoi и \nabaeni На сред1 без азота в отсутствие цианобактерий каллус табака погибал. Прове сена се секция штаммов цианобактерий, способных к совместному росту с каллусом в течение 20 мес: у цианобактерий зарегистрирована НГА
Таким образом, системагических работ по введению циано бактерий в клетки и ткани высших растении не пре принималось. В то же время цианобактерии об тидиют целым рядом особен ностей, благодаря которым они мотут быть отнесены к числу наиболее подходящих партеров растите тытых клеток в искусйТ венных ассоциациях. I. Предпблаг ется ро и, древних циаиобак терпи в формировании эукариотных клеток в процессе эволюции путем симбиоза с нефоюсинтезирующими организмами. 2 Эги микроорганизмы чаще чем другие фототрофы, кроме зеленых водорослей, вступают в симбиотические отношения с другими организмами в природе, формируя ассоциации эндосимбиоти- ческого или экзосимбиотичтского типа. 3 Ппанобак.ерии осуществляют разные метаболические функции и симбиотах с автотрофными организмами (водорослями, растениями) они выполняют роль азогфиксиреющего компонента, с гетеротрофными (простейшими, грибами) их основная функция состоят в обеспечении партнеров продуктами фоюеннт оь Цианобактерии способны выделят в срс ту разнообразные вещества: углеводы, пептиды, аминокислоты, витамины, вещества гормональной природы и др 5. Эти микроорганизмы образуют в процессе фотосинтеза кислород, который является неблчоприягным фактором для их роста; культивируемые же клетки растений, напротив, потребляют кислород в процессе дыхания. 6. Цианобактерии находят практическое применение в улучшении обеспечения рас гений связанным аинв Азотфике i рующш- цианобактерии играют существенную роль в накот тении связанного азота в почве и могут обеспечивать до 15% потребностей рас тений в нем. Симбиоз папоротника Azalia с АпиЬаепп игиНче применяется в сельском хозяйстве в качестве источника связанного азота на рисовых нолях. Кроме тою, цианобактерии повышают эффективность Применения бактериальных удобрений (азотобактерина и нитрагина).
Однако успешное приме чент* цианобактерий в искусственных ассоциациях с расти тельными к тс ками не кажется столь оче видным, если принять в । внимание еле тующие обстоитеi ства. 1. Из всею многообразия видов цианобактерий то тько некоторые из них (представители родов Xosloi и ^tmbueiuA в, тречаются в природе в ассоциациях с теш отраничепштм чистом видов высших растений, и эги асгоциании отличаются высокой с тепи- фичностью 2 Многие виды цйанобяктсрий образуют токсины, известны антаюнищичт кие нюшеиня цианобактерий и высших растений в природных биоценозах (водоемах/. 3. Цианобактерии и растительные клетки обладают с шест ценно различными ио
требностями в факторах среды: оптимумы pH кислые (5,0—5,5) у клеток высших растений и нейтрально-щелочные (7—10) у цианобактерий; оптимальные температуры для роста цианобактерий 30—40°С и выше, растительных клеток 24—27°С; концентрация минеральных солей в среде для выращивания растительных клеток выше, чем обычно используется для культивирования цианобактерий; будучи автотрофами, цианобактерии не нуждаются в органических веществах в среде, а растительные клетки требуют внесения сахарозы и других органических соединений.
В последующих разделах настоящей главы приводятся экспериментальные данные по применению цианобактерий в искусственных ассоциациях, полученных на кафедре клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета МГУ. '
Цианобактерии в качестве фототрофного компонента ассоциаций с растительными клетками. Влияние цианобактерий на рост растительных клеток. Для проверки способности к совместному росту растительных клеток и цианобактерий в суспензионных культурах была выбрана среда Мурасиге и Скуга (МС), используемая для культур растительных клеток, в которой концентрацию всех компонентов уменьшали в 2—4 раза. Для установления взаимодействия партнеров по продуктам фотосинтеза цианобактерий выращивание смешанных культур проводили на свету при низкой концентрации сахарозы, которая составляла ‘/i6 часть (1,875 г/л) от нормы, равной 30 г/л в полной среде МС. Модифицированная среда оказалась неоптимальной как для роста растительных клеток, так и цианобактерий. Рост на этой
среде разных культур растительных клеток в отсутствие цианобактерий, т. е. в монокультурах, был в 2—6 раз ниже их прироста на полной среде МС. Циа
нобактерии в монокультурах на этой среде либо не росли, либо обнаруживали очень слабый рост.
При совместном культивировании была выявлена видовая специфичность взаимодействия партнеров в парах. Она проявлялась в том, что растительные клетки и цианобактерии в разных сочетаниях оказывали различные эффекты на рост друг друга. Наблюдали взаимное подав
Рис 21. Взаимная стимуляция роста клеток табака (/) и A. nidulans (2) в смешанной культуре (синий цвет): черным обозначен рост соответствующих монокультурРис 21. Взаимная стимуляция роста клеток табака (/) и A. nidulans (2) в смешанной культуре (синий цвет): черным обозначен рост соответствующих монокультурление роста (клетки мака—Anabaena uariabUi^; в большинстве случаев выявлено отсутствие влияния
Рис 21. Взаимная стимуляция роста клеток табака (/) и A. nidulans (2) в смешанной культуре (синий цвет): черным обозначен рост соответствующих монокультур
Рис 21. Взаимная стимуляция роста клеток табака (/) и A. nidulans (2) в смешанной культуре (синий цвет): черным обозначен рост соответствующих монокультур
Рис, 22 Скопления клеток С. fritst hit на поверхности клеток агрегата женьшеня [сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)]
или слабое стимулирующее (угнетающее) воздействие одного партнера на другого; наконец, обнаружено стимулирующее влияние цианобактерий на рост растительных клеток табака (рис. 21). женьшеня и диоскореи.
Клеточные контакты. Рост растительных клеток в смешанных культурах с цианобактериями может происходить как при наличии, так и в отсутствие контактов клеток партнеров. Например, часть клеток Chloroglueopsis fritschii всегда адсорбируется на поверхности (рис 22) и проникает в глубь агрегатов женьшеня. 4. oariabilis (рис 23) и С fritschii (рис. 24) также образуют контакты с поверхностью агрегатов и одиночных живых клеток паслена и проникают в глубь агрегатов. Клетки Anacystis nidu- lans формировали смешанные агрегаты с клетками табака при низкой освещенности, проникая по межклетникам в глубь агрегатов (рис. 25), но не вступали с ними в контакт при более высокой освещенности. В случае взаимовыгодного роста клеток
Рис. 23. Контакт цианобактерий A. variabilis с клеткой паслена (световая микроскопия)
диоскореи с той же цианобактерией образования смешанных агрегатов практически не наблюдалось.
Таким образом, в большинстве суспензионных культур формируются зоны смешанного роста. В этих зонах, очевидно, складываются особые условия, обеспечивающие, с одной стороны, изоляцию партнеров от условий среды, исходно неоптимальной или даже неблагоприятной для их развития, с другой стороны, способствующие установлению метаболических взаимодействий партнеров. В некоторых случаях (клетки женьшеня — С. fritschii) в местах локализации цианобактерий на агрегатах образуется гомогенная структура в виде слоя — «маития», которая, возможно, аналогична слизям в местах контактов цианобактерий с растительными клетками в природных ассоциациях. «Мантия» обволакивает клетки цианобактерий и обеспечивает, очевидно, структурные связи компонентов ассоциации (рис. 26).
Передача продуктов фотосинтеза цианобактерий растительным клеткам. При использовании меченного по |4С бикарбоната было показано, что С. fritschii при росте на свету способна к значительному (до 16%) выделению |4С, фиксированного в процессе фотосинтеза. Инкубация клеток женьшеня в культуральной среде после выращивания в ней С. fritschii приводила к включению метки (до 74% растворенных органических веществ) из среды в клетки женьшеня. Более того, культуральная жидкость С. fritschii, добавленная к полной среде МС, лишенной сахарозы,
Рис. 24. Смешанный агрегат клеток паслена и С. fritschii (световая микроскопия) обеспечивала рост растительных клеток, который сопоставим с ростом на этой же среде с сахарозой в концентрации около 1%. Таким образом, была выявлена способность растительных клеток потреблять продукты фотосинтеза цианобактерий.
Потребление растительными клетками продуктов лизиса цианобактерий. В определенных условиях роста смешанных культур цианобактерии не размножаются, а интенсивно лизируются; прирост же растительных клеток в присутствии цианобактерий превышает их прирост в монокультуре (рис. 27). Из этих опытов следует, что прирост растительных клеток может быть обеспечен продуктами лизиса цианобактерий.
Таким образом, испытание способности к совместному росту у большого числа сочетаний партнеров позволило выбрать пары, в которых цианобактерии оказывали положительный эффект на рост растительных клеток. Образование ассоциаций происходило в условиях, не оптимальных для роста каждого из партнеров. На средах, дефицитных по источнику углерода, показана способность растительных клеток усваивать продукты фотосинтеза или
Рис. 25. Л. nidulons в межклетнике агрегата табака (просвечивающая электронная микроскопия)
лизиса цианобактерий. Последнее обстоятельство может быть важно при использовании растительных клеток в биотехнологии, которая настоятельно требует замены сахарозы, применяемой в пищевых целях, на менее дефицитные сахара.
Биосинтетическая активность растительных клеток в смешанных культурах с цианобактериями. В ассоциациях с цианобактериями была проверена способность клеток-продуцентов к видоспецифическим биосинтезам.
Клетки диоскореи в смешанных культурах с A. nidulans на модифицированной среде (1/2 МС) при дефиците сахарозы (Vie нормы) на свету синтезировали до 80% стероидных соединений, образуемых при выращивании клеток диоскореи в монокультуре на полной среде.
Ассоциации клеток женьшеня (ауксотрофный по фитогормонам штамм) и паслена с С. fritschii, помимо выращивания на свету, можно культивировать и в темноте благодаря способности данной цианобактерии к гетеротрофному росту. Куль-
Рис. 26. Гомогенная структура — «мантия», окружающая клетки С. fritschii на поверхности агрегата клеток женьшеня (СЭМ)
Рис 27 Рост клеток ди оскореи (1) и A. rudu Ians (2) в смешанной культуре (синий цвет). (Клетки диоскореи подсевали к предвари тельно растущим клеткам цианобактерии ).
черным обозначен рост соот-ветствующих монокультур
Рис. 28. Накопление стеринов и алкалоидов в культуре клеток паслена: 1 — монокультура, среда МС, 2 — монокультура с добавлением культуральной жидкости С. fritschii. среда ‘Л МС. */з сахарозы;
смешанная культура клеток паслена с С fritschii, та же среда тивирование этих систем в темноте проводили на среде МС, разбавленной в 4 раза ('/4 МС) с уменьшением концентра ции сахарозы до ‘/г нормы. Клетки женьшеня в смешанной культуре сохраняли способность к биосинтезу биологически активных веществ, которые составляли 5 7% от биомассы высушенных клеток, как и в монокультуре, выращиваемой на полной среде МС.
Совместное выращивание клеток паслена и С. fritschii на модифицированной (дефицитной) среде вызывало увеличение стеринов и алкалоидов в клетках паслена по сравнению с их накоплением в монокультуре паслена на полной среде (рис. 28)
Таким образом, при выращивании суспензионных культур растительных клеток на среде при значительном снижении концентрации всех компонентов (в 2—4 раза) и сахарозы—от 2 до 16 раз, цианобактерии не препятствуют накоплению в них видоспецифических продуктов или даже способствуют увеличению их биосинтеза в расчете на единицу биомассы растительных клеток. Отсюда возникает вопрос, не выгоднее ли смешанное культивирование по сравнению с выращиванием монокультуры на полной среде? В этих целях был вычислен суммарный биосинтез алкалоидов в единице объема среды (в 1 л) при обоих способах культивирования (в монокультуре на полной среде и в смешанной культуре на дефицитной) на 2 и 12 сут (табл Ь). Далее были определены затраты среды МС и сахарозы (в частях от нормы) на получение единицы продукции Оказалось, что получение единицы продукции алкалоидов в смешанной культуре выгоднее, чем в монокультуре Причем интересно, что практически одинаковое количество продукта можно получить в 1 л спс ды (27 мг) в монокультуре на 12 е сут и в 2 л среды (26 мг) в смешанной культуре на 2-е сут. При этом затраты на получение
Таблица 6. Расчет затрат среды МС и сахарозы на получение единицы продукции алкалоидов в культуре клеток паслена при разных способах культивирования
Вариант культивирования клеток паслена
Время культи- вирова
Био-
г/л
Содержание алкалоидов
Затраты* на получение единицы продукции алкалоидов
% ОТ сухой массы
В I л культуры
мг
усл. ед
среды МС
розы
Монокультура [среда МС, сахаро-
2
4
0,21
" 8
1
1
1
зы 30 г/л (норма)]
12
16
0,17
27
3,4
0,3
0,3
Смешанная культура [среда '/< МС. 15 г/л
2
4
0,33
13
1,6
0,16
0.31
сахарозы ('/а нормы)]
12
8
0,22
18
2,2
0,11
0,23
* В частях от нормы на полной среде.
Рис 29 \l фбция ксчк'Чки 1 <un4bilis (iv фин прмоший awr штамм) на и 1верхи'>С1 и i poioiiiacra табака (С ЭМ)
честве предварительной era чин получение каллусной смешанной культуры с последующей регенерацией побегов.
Получение t 1еишнных культур. Смешанные культуры ткани табака с разными штаммами 1 uoriabiHs были получены двумя способами. В одном случае каллусдач ассоциация была получена при использовании изолированных прогонтасгов табака. Протопласты совместно с не фиксирующей азот .1. eariabilis обрабатывали ионами кальция • - индуктором ( зияния растительных протопластов (\\ К el к г, (3 Mekims, 1973). Были подобраны условия, при которых как протопласты табака, так и цианобактерии сохраняли жизнеспособность, при этом до 60% протопластов адсорбировало кзеткп Д. uuriabiHs (рис. 29). Повышение % адсорбции с помощью ионов кальция но срНвнен#ю с другими индукторами, как следовало ожидать, повышало и частоту попадания цианобактерий в протопласты Полученную смесь протопластов и цианобактерий высевали на среду МС с осмотическим стабилизатором, что при последующем культивировании на свету приводило к образованию смешанной каллусной культуры.
В др том случае использовали каллус, непосредственно выделенный из мезофилла чиста, куда падсевали суспензию /1. ии riabtSs (азотфиксируюшнй штамм) Как в гом, гак и в друюм случае при выращивании на среде МС на свезу были получены каллусные культуры. сине зеленая окраска которых обусловлена
Рис 30. Ассоциация каллусной ткани табака с азотфиксируютей цианобактерией Anabaena yuriabitis: темные участки- места юкализации цианобактерии
присутствием цианобактерий (рис. 30). Цианобактерии растут на поверхности каллуса или проникают в глубь ткани по межклетникам. Кроме того, в каллусе, полученном из протопластов, часть цианобактерий локализуется внутриклеточно в центральных вакуолях табака (рис. 31). Это свидетельствует о попадании цианобактерий в растительные протопласты при обработке ионами кальция и сохранении их внутриклеточной локализации в процессе размножения клеток каллуса. Особенностью клеток табака является наличие крупных вакуолей и слабое развитие цитоплазмы в стационарную фазу роста культуры, когда изучали локализацию цианобактерий в образцах каллуса. Возможно, с этим связано отсутствие цианобактерий в цитоплазме клеток в отличие от локализации эндосимбиотических цианелл в цитоплазме клетки хозяина в природных ассоциациях.
Каллусные смешанные культуры стабильны и способны к росту в пересадочной культуре не менее 2 лет, причем не наблюдали подавления роста одного компонента системы другим.
Введение цианобактерий в растения-регенеранты. В смешанных культурах каллуса табака и цианобактерий на среде МС для органогенеза формировались побеги регенерантов табака длиной 2—6 см (рис. 32) с участками сине-зеленого цвета — местами локализации цианобактерий. Цианобактерии образуют-большие
Рис. 31. Скопления цианобактерий A variabilis (не фиксирующий азот штамм) в центральной вакуоли клетки каллуса табака. В клетке табака видны клеточная стенка (кс) и очень узкий слой цитоплазмы (ц) (просвечивающая электронная микроскопия)
скопления и состоят из длинных цепочек, что указывает на их размножение в побегах. Очевидно, такая анатомическая особенность каллуса табака, как наличие больших межклетников, является определяющей для проникновения цианобактерий в межклетники каллусной ткани и в область меристемоидов и впоследствии — в формирующиеся побеги.
Способность к формированию побегов в смешанных культурах сохранялась в течение длительного их субкультивирования (на протяжениии 10—11 пассажей). Более того, из регенерантов первого поколения, ассоциированных с азотфиксирующими цианобактериями, получен вторичный каллус, а из него — регене-
Рис. 32. Побеги табака, полученные при индукции органогенеза в смешанной культуре каллуса табака и Л. variabilis (здесь и далее — азотфиксирующий штамм):
темные участки — места локализации цианобактерии
ранты второго поколения. Эти побеги, пройдя через циклы растение — каллус — побег — каллус — побег, сохраняли цианобактерии на поверхности и в тканях.
Регенеранты, ассоциированные с азотфиксирующей Л. variabilis, получены также при выращивании каллуса люцерны, инокулированного цианобактериями, на среде В5 (О. Gamborg et al., 1968) для органогенеза без минерального азота.
Локализация цианобактерий в регенерантах. В регенерантах табака из каллуса, происходящего из протопластов, цианобактерии находятся в стебле и в листьях и имеют внутритканевую локализацию. В мезофилле листа они иногда встречаются внутри клеток табака, в которых отсутствует цитоплазма; это указывает на сохранение внутриклеточной локализации цианобактерий в процессе органогенеза.
В побегах табака, полученных из исходного каллуса, цианобактерии находятся как на поверхности, так и в тканях стебля
Рис. 33. Цепочки Л. variabilis в углублениях складчатой поверхности стебля побега табака (СЭМ)
Рис. 34. Скопление цианобактерий на поверхности листа побега табака: г—гетероцисты (СЭМ)
Рис. 35. A. variabilis в устьичной щели и вокруг устьица (СЭМ)
Рис. 36. A. variabilis в формирующихся элементах ксилемы у основания формирующегося побега (СЭМ)
Рис. 37. Поперечный срез стебля побега-регенеранта табака. [Зона межклетников первичной коры между перициклом и эпи ц-рмисем. заполненных скоплениями цианобактерий A. eanebtiis (i ЭМ).|
Рис 38 1. -uriabilis под слизистой птенкой-смаитией» и на се поверхности: и цианобактерии, пл - пленка (СЭМ)
Рис. 39. Поперечный срез .;иста растения регенеранта люцерны; скопления Л. variabilis в межклетниках мезофилла листа (СЭМ)
и листа. Складчатая поверхность стебля при этом заполняется цепочками Л. variabilis, покрытыми тонкоструктурированной пленкой (рис. 33); тяжи, образуемые на поверхности стебля скоплениями цианобактерий, имеют ориентацию от основания к верхушке побега. Цианобактерии образуют также скопления на поверхности листа (рис 34) и входят в глубь устьиц (рис. 35) В некоторых случаях они находятся в области проводящей сис темы. В процессе органогенеза эти микроорганизмы выявлены в сосудах ксилемы (рис. 36) у основания формирующихся по бегов табака. Цианобактерии обнаружены в межклетниках первичной коры паренхимы стебля (рис. 37). Зоны локализации микроорганизма на поверхности побегов могут покрываться слизистой пленкой — «мантией» (рис. 38). Обнаруженная в искусственной ассоциации побегов табака и Л variabilis «мантия» идентична слизистой пленке, наблюдаемой в местах локализации симбиотической цианобактерии Л. azollae в полости листа папоротника Azolla (G. Peters, 1977).
В регенерантах люцерны в редких случаях цианобактерии обнаруживались на поверхности и в ткани стебля и листа (рис. 39). В подавляющем большинстве растений-регенерантов, полученных из инокулированного цианобактериями каллуса, цианобактерии не сохранялись в побегах, но обнаруживали интенсивный рост на поверхности (рис. 40) и в ткани корня. Инокуляцию корней
Рис. 40 Поперечный срез корня растения - регенеранта люцерны; скопления .4. variabilis на поверхности корня (СЭМ)
люцерны удалось также проводить другим способом — путем введения цианобактерий в зону корней растений, размножаемых черенкованием. Цианобактерии закреплялись на поверхности достаточно прочно: их не удается удалить при энергичном встряхивании отделенных от растений корней в жидкой среде.
Рост каллусных тканей и побегов растений в ассоциации с цианобактериями в условиях дефицита связанного азота. Выявлены преимущества роста ассоциаций с азотфиксирующими цианобактериями каллусных тканей растений при дефиците или полном исключении из среды азота. Так. при 20%-ном (от нормы) содержании в среде МС азота прирост биомассы каллуса табака в смешанной культуре был на 25—30% выше, чем в монокультуре. Кроме того, при длительном культивировании без пересадок на дефицитной по азоту среде жизнеспособными оставались только участки ткани, соприкасающиеся с зонами роста цианобактерий.
При полном исключении из среды В5 связанного азота каллус люцерны в монокультуре не рос; при совместном его культивировании с цианобактериями биомасса каллуса в 2,7 раза превышала биомассу каллуса в монокультуре (рис. 41). В совместной культуре через 10 сут роста практически все клетки люцерны (94%) были живыми, тогда как в монокультуре — только 54%. В данном опыте была использована в отличие от приводимых
Рис. 41. Рост каллуса люцерны, рост и НГА A. variabilis в монокультурах и в совместной культуре на среде В5 без азота:
1 — исходный засев; 2 — монокультура; 3 — совместная культура; цифры иад столбцами соответствуют % гетероцист
ранее смешанных культур совместная культура, в которой каллус и цианобактерии выращивали на агаризованной среде на расстоянии друг от друга, т. е. вне контакта клеток партнеров.
И наконец, ассоциации растений люцерны и A. variabilis оказались способны к росту на среде В5 без азота (наблюдение за ними проводили в течение 4 мес). Неинокулированные растения в тех же условиях уже через 1 мес обнаруживали признаки деградации, а через 2 мес у них обесцвечивались и опадали листья, растения вскоре погибали. Инокулированные растения продолжали расти в песчаной культуре в отсутствие связанного азота. Цианобактерии при этом локализовались на поверхности корней преимущественно в зоне поглощения, в контакте с корневыми волосками и распространялись на те участки корней, которые образовались в ходе их роста после перенесения растений в песок. Причем инокулированные растения и контрольные (не инокулированные цианобактериями) через 10 сут роста в песчаной культуре более чем в 2 раза различались по своей высоте. Растения, ассоциированные с цианобактериями, росли и в стерильной почве, при этом через 4 мес роста цианобактерии интенсивно развивались как в непосредственном контакте с корнями, так и в прикорневой зоне почвы.
Таким образом, результаты этих опытов впервые показали, что азотфиксирующие цианобактерии в искусственных ассоциациях способны обеспечить рост каллуса и целого растения на среде или в песчаной культуре без связанного азота. Причем с помощью совместной культуры удалось продемонстрировать.
что этот эффект может обеспечиваться, очевидно, за счет продуктов азотфиксации, выделяющихся в среду и диффундирующих через агар.
Рост и НГА цианобактерий в ассоциациях с растительными тканями. На средах МС и В5 в отсутствие каллуса и растений (в монокультуре) A. variabilis не растет, имеет очень низкую долю гетероцист и уровень НГА (рис. 41) и в конечном итоге деградирует.
В ассоциациях с клетками и растениями цианобактерии интенсивно размножаются, образуют гетероцисты и проявляют НГА. Формирование гетероцист, ответственных у данной цианобактерии за фиксацию молекулярного азота, и регистрация НГА свидетельствуют об осуществлении азотфиксации. В специальных опытах, поставленных с совместной культурой ткани люцерны и A. variabilis, было показано, что стимуляция роста НГА и образование гетероцист у цианобактерии (рис. 41) происходят, очевидно, за счет метаболитов клеток люцерны, диффундирующих через агар. Интересно, что и в природных ассоциациях высшие растения вызывают стимуляцию образования гетероцист и НГА у цианобионта. Однако в полученных искусственным путем системах доля гетероцист не достигала максимально высоких значений, известных для природных симбиозов цианобактерий и высших растений (W. Stewart et al., 1983). Существенной особенностью цианобактерий в искусственных ассоциациях является ее интенсивный рост, который в природных ассоциациях с растениями, наоборот, подавлен. Таким образом, полученные в эксперименте системы представляют значительный интерес для изучения на клеточном уровне механизмов влияния растения- хозяина на симбиотические цианобактерии.
Потребление цианобактериями продуктов метаболизма растения. В природных ассоциациях с высшими растениями цианобактерии передают растению связанный азот, получая от растения соединения углерода. Одна из проблем практического использования искусственных ассоциаций состоит в обеспечении азот- фиксирующего симбионта органическими веществами без нанесения ущерба растению-хозяину. В ассоциации с растениями люцерны в песчаной культуре и в почве цианобактерии росли без доступа света, гетеротрофно, что обеспечивалось, очевидно, корневыми выделениями люцерны. Для этого штамма A. variabilis установлена способность к гетеротрофному росту в темноте в чистой культуре (Р. Wolk, Р. Shaffer, 1976). Растения при этом имели преимущества в росте по сравнению с растениями, не ассоциированными с цианобактериями, при исключении связанного азота.
Для выявления возможности передачи цианобактериям соединений углерода от растения в искусственной ассоциации были поставлены специальные опыты. Побеги табака предварительно потребляли меченный по углероду сахар (глюкозу). На поверхность листьев таких растений наносили клетки цианобакте-
рии и подвергали их совместной экспозиции в течение определенного времени. Причем в одном случае это были цианобактерии, взятые непосредственно из чистой культуры (неадаптированные), в другом случае — выделенные из каллуса, совместно с которым они выращивались в пересадочной культуре в течение 1,5 лет (адаптированные). Побеги-регенеранты передавали меченые соединения углерода цианобактериям как на свету, так и в темноте, о чем судили по уровню радиоактивности цианобактерий после смыва их с поверхности меченых побегов. Это указывает на способность цианобактерий в искусственной ассоциации с растением переходить на фотогетеро- и хемогетеротрофный тип питания, что характерно для них и в природных симбиозах. Интересно, что адаптированные цианобактерии получают от побегов в 2,5 раза больше меченых соединений углерода как на свету, так и.в темноте по сравнению с неадаптированными. Существование разницы при включении меченого органического вещества в адаптированные и неадаптированные цианобактерии указывает на то, что в условиях ассоциации с каллусной культурой табака A. variabilis проходит сложный приспособительный период, сопровождающийся метаболическими перестройками. Вероятно, это одна из причин того, что ассоциации побегов табака с цианобактериями удается получить только через стадию смешанной культуры, которая, по-видимому, является этапом адаптации цианобактерии к новым условиям существования.
Таким образом, в изложенных здесь экспериментах было продемонстрировано получение искусственных ассоциаций культивируемых тканей и растений-регенерантов с цианобактериями. Удалось получить ассоциации цианобактерий с каллусом и побегами-регенерантами, происходящими из изолированных протопластов. В ассоциациях с азотфиксирующими цианобактериями культивируемые ткани и растения имеют преимущества в росте в условиях дефицита или отсутствия связанного азота по сравнению с неинокулированными культурами и растениями, что обусловлено фиксацией азота цианобионтом. Показана высокая стабильность полученных клеточных систем при их субкультивировании и сохранение ассоциативных взаимодействий в ряду переходов каллус — побег.
Глава
44
4
4
МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
История создания метода
Для многих исследований, связанных с изучением биологических структур (низкомолекулярные биорегуляторы, гормоны, макромолекулы, дифференцировочные маркеры клеток и др.), большую ценность представляют реагенты, способные специфически взаимодействовать с данной структурой. Универсальным реагентом, обладающим указанным свойством, считается молекула иммуноглобулина. Несмотря на то что иммуноглобулины, являясь антителами, взаимодействуют только с антигеном, т. е. с молекулой, способной вызвать иммунный ответ, для большинства структур удается подобрать условия, при которых они становятся антигенами и индуцируют выработку комплементарных антител (например, при конъюгации с сильными иммуногенами). Именно этим объясняется большое распространение иммунологических методов, связанных с использованием антител, в различных областях биологии и медицины.
Иммунная система вырабатывает специфические антитела на огромное множество антигенов. В основе такой способности лежит наличие большого разнообразия клонов лимфоцитов, каждый из которых вырабатывает антитела одного типа с узкой специфичностью. Общее число клонов у мышей, по оценкам некоторых исследователей (N. Sigal, N. Klinman, 1978), равно 107— 10. В ответ на данный антиген в реакцию вовлекается множество клонов, что обусловливает высокую гетерогенность получаемых антител. Так, при иммунизации комплексом гаптен — белок образуется до 8000 различных антител (Н. Kreth, A. Williamson, 1973). Спектр вырабатываемых антител изменяется в ходе иммунного ответа, а также при использовании различных животных. Серьезную проблему при применении антисывороток для идентификации и количественного определения антигенов в различных областях исследований представляет неспецифическое связывание и перекрестная реактивность антител.
Многие'исследователи пытались отыскать способы получения
антител с узкой специфичностью. Так, при определенных условиях иммунизации бактериальными полисахаридами удается получить высокогомогенный препарат антител с узкой специфичностью (Е. Haber, 1970; R. Krause, 1970). Однако в большинстве случаев попытки были неуспешными. Интересно отметить, что высокоспецифические антитела были получены в работе (N. Klinman, J. Press, 1975), в которой антителообразующие клетки переносили в организм летально облученных животных и из селезенки извлекали локальные зоны, содержащие очаги пролиферации только одного клона иммунных лимфоцитов. Эти клоны продуцировали в сущности моноклональные (монофокальные) антитела, однако их можно было выделить лишь в очень незначительных количествах. Данные опыты имели чисто теоретическое значение для оценки числа клонов и не давали препаративного способа получения моноклональных антител.
В 1975 г. Д. Кёлер и Ц. Милстейн предложили принципиально иной метод получения гомогенных антител. Они осуществили слияние плазмацитомы (опухоли, возникшей из антителообразующей клетки или ее предшественника) с клетками селезенки иммунизированного животного, получив таким образом гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от опухолевых клеток способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки — синтезировать антитела предопределенной специфичности. Эта работа известила о наступлении нового этапа в использовании антител в различных областях биологии и медицины. Метод очень быстро получил широкое распространение во всем мире, и уже -в 1978 г. собралась представительная конференция, на которой рассматривались вопросы техники получения и области использования моноклональных антител. Вклад Кёлера и Милстейна в развитие науки был по достоинству оценен мировой общественностью, и в 1984 г. им была присуждена Нобелевская премия.
В настоящее время моноклональные антитела находят все более широкое применение, однако нужно заметить, что вопрос о выборе между моноклональными антителами и поликлональными сыворотками должен определяться конкретными задачами исследования. Например, вследствие высокой специфичности моноклональных антител они могут не обнаруживать некоторые антигенные детерминанты у родственных микроорганизмов. Кроме того, моноклональное происхождение антител фактически в б'ольшинстве случаев исключает эффекторные функции, связанные с множественными сшивками антигенов, такие, как фиксация комплемента и иммунная преципитация. Физико-химические характеристики моноклональных антител также могут ограничивать их применение вследствие большей, чем поликлональных сывороток, чувствительности к изменениям pH, температуре и концентрации солей. Кроме того, полученные моноклональные антитела могут иметь низкую аффинность, и методические приемы, позволяющие регулировать аффинность вырабатываемых
Таблица 7. Сопоставление свойств моноклональных антител и поликлональных антисывороток (М. O'Hare, 1984)
Свойство
Поликлональные антисыворотки
Моноклональные антитела
Специфичность
Потенциально ко всем антигенным детерминантам всех компонентов иммунизирующего материала
Одна антигенная детерминанта одного компонента
Воспроизводимость состава
Изменяется от животного к животному и в процессе иммунного ответа
Постоянная
Перекрестная реактив-
Частичная с антигеном.
Обычно отсутствует,
ность с другими антиге-
несущим общие детерми-
редко полная в завнеи-
нами
нанты
мости от распределения и доступности детерминант на других антигенах
Классы и подклассы
Одновременно прнсут-
Только одни из всех
присутствующих иммуноглобулинов
ствуют все илн большинство
ВОЗМОЖНЫХ
Способность преципи- тировать антигены
Обычно есть
Обычно нет
Концентрация специфических антител
0,1—1,0 мг/мл
5—500 мкг/мл (культура) ; 5 мг/мл (асцит)
Концентрация посторонних антител
10 мг/мл
Нет (культура); 1 мг/мл (асцит)
Физике - химические
Определяются пулом ан-
Крайне индивндуаль-
свойства
тнтел
ны, могут быть чувствительны к внешним условиям
моноклональных антител, до настоящего времени не разработаны. Поэтому, несмотря на несомненные преимущества моноклональных антител перед поликлональными сыворотками благодаря их высокой специфичности и воспроизводимости получения, в ряде ситуаций нецелесообразно отказываться и от поликлональных сывороток, продолжающих находить широкое применение. В табл. 7 приводится сопоставление основных свойств моноклональных антител и поликлональных сывороток.
Предпосылками для возникновения метода получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, были разработки двух методических подходов: 1) получение миелом, адаптация их к условиям культивирования вне организма и 2) метод соматической гибридизации клеток.
У мышей довольно легко можно получить миеломы (плазмацитомы) (М. Potter, 1972). Эти опухоли являются потомками одной клетки (т. е. имеют моноклональное происхождение) и секретируют уникальные иммуноглобулины, некоторые из которых могут взаимодействовать с известными антигенами. Опухоли индуцируют у животных путем внутрибрюшного введения минеральных масел или инертного твердого пластика. Для возникновения миелом большое значение имеет генетический статус жи-
вотного, и только у двух линий инбредных мышей (Balb/C и NIZB) экспериментаторам удалось получить такие опухоли.
Миеломные клетки мыши оказались чрезвычайно удобными для изучения биохимии продукции иммуноглобулинов и дали очень многое для понимания структуры, механизмов секреции и их функции. Однако миеломная система как источник антител к большинству антигенов не оправдала надежды исследователей — не удавалось иммунизировать животных, а затем получать мышиные миеломы, продуцирующие антитела к иммунизирующему антигену. Из тысяч миеломных опухолей, индуцированных у мышей, лишь единичные вырабатывали иммуноглобулины, которые реагировали с известными антигенами (М. Potter и сотр., 1977), что было обнаружено путем грубого скринирования с множеством потенциальных антигенов. Таким образом, миеломные белки оказывались с неизвестной антигенной специфичностью.
Другой предпосылкой возникновения метода получения гибридом явилась техника гибридизации соматических клеток, разработка которой широко проводилась после открытия феномена спонтанной гибридизации (G. Barski, S Sorieul F. Cornefert, 1960). При слиянии плазматических мембран клеток образуются клетки с двумя или большим числом ядер гетерокарионы. После первого деления ядра сливаются и образуется одно ядро с набором хромосом от всех слившихся партнеров — образуется гибридная клетка. Первоначально метод гибридизации соматических клеток использовали для изучения механизма регуляции дифференцировочных функций (функций «роскоши»), а также для соматических и генетических подходов к картированию генов (F. Ruddle, R. Greagan, 1975). Низкую частоту образования гибридов можно было увеличить, использовав ряд агентов, вызывающих слияние: вирус Сендай, лизолецитин, полиэтиленгликоль. Механизмы слияния клеток в значительной степени остаются неизвестными. В отношении ПЭГ, широко используемого для получения гибридов, предполагают, что он уменьшает заряд клеточной поверхности и сорбирует на себе воду, облегчая тем самым взаимный контакт плазматических мембран соседних клеток (см. гл. 2).
Даже при использовании агентов, повышающих слияние, частота образующихся гибридов крайне низка. Для их выделения необходимы селективные среды, позволяющие расти преимущественно образовавшимся гибридам. В настоящее время разработано несколько принципов селекции гибридных клеток (N. Rin- gertz, R. Savage, 1976). Одним из наиболее распространенных является метод, основанный на применении системы, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (система ГАТ) (J. Littlefield, 1964).
В системе ГАТ используется антагонист фолиевой кислоты — аминоптерин (рис. 42).
Тетрагидрофолевая кислота является коферментом, необхо-
ГилоксаьтинГилоксаьтинГуанинГуанинТимидинТимидинРис. 42 Схема работы системы ГАТ:минофосфаты инозина (ЦМФ), ксантина (КМФ), гуанина (ГМФ); дезо- кснмонофосфаты уридина (дУМФ), тимидина (дТМФ); дезоксндифосфаты гуанина (дГМФ’к гн миди на (дТДФ); дезокси трифосф а ты гуанина (дПФ), нити шна (дЦТФ). аденина (дАТФ) и тимидина (дТТФ)Рис. 42 Схема работы системы ГАТ:минофосфаты инозина (ЦМФ), ксантина (КМФ), гуанина (ГМФ); дезо- кснмонофосфаты уридина (дУМФ), тимидина (дТМФ); дезоксндифосфаты гуанина (дГМФ’к гн миди на (дТДФ); дезокси трифосф а ты гуанина (дПФ), нити шна (дЦТФ). аденина (дАТФ) и тимидина (дТТФ)
Гилоксаьтин
Гилоксаьтин
Гуанин
Гуанин
Тимидин
Тимидин
Рис. 42 Схема работы системы ГАТ:
минофосфаты инозина (ЦМФ), ксантина (КМФ), гуанина (ГМФ); дезо- кснмонофосфаты уридина (дУМФ), тимидина (дТМФ); дезоксндифосфаты гуанина (дГМФ’к гн миди на (дТДФ); дезокси трифосф а ты гуанина (дПФ), нити шна (дЦТФ). аденина (дАТФ) и тимидина (дТТФ)
Рис. 42 Схема работы системы ГАТ:
минофосфаты инозина (ЦМФ), ксантина (КМФ), гуанина (ГМФ); дезо- кснмонофосфаты уридина (дУМФ), тимидина (дТМФ); дезоксндифосфаты гуанина (дГМФ’к гн миди на (дТДФ); дезокси трифосф а ты гуанина (дПФ), нити шна (дЦТФ). аденина (дАТФ) и тимидина (дТТФ)
димым для превращения рибонуклеотида 5-аминоимидазол-4- карбоксамида (АИКР) в рибонуклеотид формамидоимидазол-4- карбоксамида (ФАИКР) в биосинтезе пуринов и превращения dHMP в dTMP в синтезе пиримидинов. Аминоптерин, аналог фолиевой кислоты, предотвращает образование тетрагидрофолята, конкурентно ингибируя гидрофолятредуктазу, и таким образом блокирует процессы биосин геза как пуринов, так и пиримидинов на стадиях, указанных на схеме. В клетках существуют обходные пути биосинтеза нуклеотидов, в которых происходит реутилизация гипоксантина и тимидина. Эти пути зависят от двух ферментов: тимидинкиназы (ТК), катализирующей трансформацию тимидина в дезокситимидинтрифосфат, и гипоксантингуанинфос- форибозилгрансферазы (ГГФРТ), катализирующей трансформацию гипоксантина в инозинмонофосфат и гуанина в гуанозинмонофосфат. При добавлении в среду гипоксантина и тимидина клетки могут нормально синтезировать ДНК в условиях, когда основной путь биосинтеза нуклеотидов блокирован аминоптери- ном. Если клетка имеет дефект по этим ферментам, то в присутствии аминоптерина она погибает, но способна выжить, если ее слить с другой клеткой, в которой эти ферменты имеются. Двойной, или полной; селективной системой является такая система, когда происходит слияние двух клеток, в одной из которых отсутствует ТК, в другой — ГГФРТ. В гибридах идет взаимная комплементация этих ферментов, и они выживают в среде ГАТ, тогда как родительские клетки погибают.
Для получения и отбора мутантных клеток, не имек?щих ТК или ГГФРТ, используют токсические аналоги пуринов и пиримидинов, добавляемые на фоне действия мутагенных агентов. Эти аналоги включаются в ДНК с помощью указанных ферментов.
В присутствии токсических аналогов выживают только те клетки, в которых отсутствует фермент, способствующий включению этого аналога в ДНК. Так, в присутствии 8-азагуанина или 6- тиогуанина выживают только клетки, не имеющие фермент ГГФРТ, а в присутствии 5-бромдезоксиуридина — клетки, не имеющие фермент ТК. Следует заметить, что у мышей получить клетки, дефектные по ГГФРТ, довольно не сложно, так как ген этого фермента расположен на Х-хромосоме. которая в соматических клетках млекопитающих присутствует в единственном числе из-за инактивации другой Х-хромосомы. В связи с этим в клетках экспрессирована только одна аллель гена ГГФРТ, и достаточно только одной мутации для его инактивации. Получить мутанты по ТК значительно труднее, так как ген этого фермента расположен не на Х-хромосоме и необходимо наличие одновременно двух одинаковых мутаций для полного исчезновения активности этого фермента
С целью изучения механизмов генерации разнообразия антител и роли в этих процессах соматических мутаций Милстейн были начаты исследования с использованием линий миеломных клеток. Из Института Солка им были получены исходные линии плазмацитом РЗК и РС5, на основе которых он получил мутанты, дефектные по ферментам ГГФРТ и ТК. С этими линиями были проделаны успешные опыты по получению гибридов этих клеток и соответствующей линии миелом крысы (S 210) (R. Cotton, С. Milstein, 1973" G. Kohler С. Milstein, 1975). Полученные в этих работах результаты привели к заключению, что иммуноглобулиновые гены в гибридах экспрессируются кодоминантно и, следовательно, растворимые репрессоры и (или) активаторы не принимают участия в регуляции активности этих генов. Если происходит слияние линии непродуцирующего варианта миелом с им- муноглобулинпродуцирующей линией, способность вырабатывать иммуноглобулины не подавляется Гибрид синтезирует иммуноглобулин только продуцирующего родителя.
Убедившись в том, что в гибридах миеломных клеток синтезируются иммуноглобулины обеих родительских линий, Келер и Милстейн предприняли попытку слить миеломные клетки (резистентные к 8-азагуанину клетки P3/X63-Ag-8) с нормальными клетками селезенки мышей, иммунизированных эритроцитами барана. Некоторые из полученных гибридов продуцировали как миеломный белок, так и антитела против эритроцитов барана. Такие гибриды длительно росли в культуре. Следовательно, удалось «обессмертить» продуцентов определенных антител, в данном случае антител против эритроцитов барана (G. Kohler, С. Milstein, 1975).
В этих экспериментах была использована так называемая полуселективная система ГАТ, когда только одна родительская линия, а именно миелома P3/X63-Ag-8, была химически маркирована. Селекция гибридов основана на том, что в ГАТ среде родительские миеломные клетки погибают, а нормальные клетки
Таблица 8. Линни миелом мыши и крысы, используемые для образования гибридом
Название
Лини я-источи и к
Фенотип
иммуноглобулины
устойчивость
Линии мыши 4TQ.2
45.6TG 1.7
1<G2(x)
6-тиогуанин,
P3/X63 — Ag - 8
РЗК
IgGI (х)
оуабаин
8-азагуанин
NSI/l.Ag4.l
P3/X63 —Ag- 8
(х), ие сек-
8-азагуанин,
FOX — NY
NS!
ретирует Нет
8-азагуанин,
SP2/0 — Agl4
Гиб ридом а(РЗ/
2, 4-диаминопури|;
8-азагуанин
P3/X63—Ag8.653
/Х63 - Ag- 8Х
Bald/C)
P3/X63—Ag—8
8-азагуанин
Линии крысы
2lO.RCY3Agl.2.3.
210.RCY3.Agl
(х)
8-азагуанин
1R938F
21O.RCY3Ag 1.2.3
Нет
8-азагуанин
селезенки не обладают способностью расти при данных условиях культивирования, так что выживают и размножаются только гибридные клетки, унаследовавшие от родительских клеток способность размножаться и синтезировать специфические иммуноглобулины.
Одним из препятствий для использования гибридомной техники являлось то, что в гибридах синтезировались не только антитела клеток иммунной селезенки, но и иммуноглобулины родительской миеломной линии, а также гибридные молекулы, состоящие из полипептидных цепей как миелом, так и селезенки. Эта проблема была преодолена путем использования миеломных клеток, в которых отсутствовала экспрессия цепей иммуноглобулинов. Подобные варианты возникают довольно часто, и разработаны методы отбора таких вариантов.
В табл. 8 приведен список основных линий миеломных клеток мыши и крысы, широко используемых для конструирования гибридом. Среди линий клеток мышей наиболее используются NSI/l.Ag4.1 (NS1), SP2/0—Agl4 (SP2/0 и P3/X63—Ag8.653 (653) (в скобках приведены сокращенные названия линий).
Следует остановиться на одном благоприятном обстоятельстве, способствующем широкому распространению гибридомной технологии. Как отмечали Кёлер и Милстейн (1975), слияние приводит как бы к обогащению в отношении антителообразующих клеток. Гибридов получается больше, чем можно ожидать, исходя из частоты слияния и доли специфических антителообра-
зующих клеток в популяции клеток селезенки. В среднем наблюдается 10-кратное обогащение. Возможно, это обусловлено избирательным слиянием миеломных клеток с размножающимися В-клетками селезенки либо связано с образованием продуцирующих антитела гибридов через слияние не образующих антитела клеток-предшественников или с какими-то другими факторами. Эта проблема еще не решена, так как в действительности не установлено, слияние с какими именно клетками, представленными в популяции клеток из иммунной селезенки, приводит к формированию нужных гибридов. Скорее всего, это не зрелые антителопродуцирующие клетки, а их быстроразмножающиеся предшественники, но какие конкретно, пока не известно.
Гибридомная техника была с успехом использована и для получения гибридов опухолевых лимфоидных клеток с Т-лимфоцитами. Получены гибридомы с сохранением дифференцированных функций Т-лимфоцитов: киллеры, супрессоры, хелперы. Эти гибридомы синтезируют разнообразные иммунорегуляторные факторы, что позволяет выделять и исследовать их структуру. Получена и макрофагальная гибридома. Исследование этих гибридом внесло неоценимый вклад в изучение закономерностей функционирования отдельных популяций Т-лимфоцитов и макрофагов, однако их использование не имеет пока биотехнологического значения.
Подготовительные этапы перед проведением слияния
Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя следующие этапы (рис. 43): иммунизация животных, подготовка клеток к слиянию, слияние, отбор продуцирующих специфические антитела клонов, клонирование и реклонирование, массовая наработка гибридомных клеток, получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела, и выделение этих антител. Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител занимает 3—4 мес.
Организация работы и оборудование. Для работы по получению гибридом желательно выделить отдельное помещение. Эксперимент можно проводить и в части большой комнаты, максимально удаленной от входной двери. Это помещение надо оснастить следующим оборудованием:
Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей стерильного воздуха. Стерильность обеспечивается наличием фильтров, задерживающих частицы крупнее 0,3 мкм.
Инкубатор, в котором автоматически поддерживаются влажность, температура и концентрация СО2(СО2-инкубатор).
Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами, желательно с охлаждением.
Обычный и инвертированный микроскопы с фазово-контрастиым устройством.
Холодильник на +4 и на —20°С.
Водяная баня на 37 и 56°С.
Рис. 43. Основные этапы получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела
Помимо этого в отдельном помещении желательно иметь мо- юзильник на —70°С и сосуд Дьюара с жидким азотом для хра- тения клеток. Для получения гибридом нужно приобрести также специальную пластиковую посуду для культуры клеток: 96-луноч- ные планшеты с плоским дном, 24-луночные планшеты, флаконы с площадью роста 25, 75 см2 и др., пластиковую посуду для проведения иммуноферментного и радиоиммунологического анали-
зов, среды для культивирования, необходимые реактивы, сыворотку плода коровы (СПК).
Приготовление отдельных компонент сред для культивирования. Одной из частых причин неудач при получении гибридом является недостаточно высокое качество сред и реактивов. Поэтому крайне важно перед началом работы обеспечить постоянное снабжение высококачественными реактивами и средами.
Основными средами, употребляемыми при получении гибридом, являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в частности среда Дульбекко в модификации Пскова (эта среда особенно часто используется при иммунизации in vitro). Среды выпускаются в виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кварцевой посуде вода.
Все среды и растворы стерилизуются путем фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.
Отдельные компоненты среды культивирования и среды селекции готовят следующим образом:
100-кратиый концентрат ГТ (гипоксантин, тимидин): 136,1 мг гнпоксаи- тииа и 38,75 мг тимидина добавить к 50 мл воды, затем по каплям при постоянном перемешивании прибавлять 0,1 М NaOH до полного растворения реагентов. Довести объем до 100 мл, профильтровать и заморозить при —20°С.
100-кратный концентрат аминоптерина: 1,76 мг аминоптерина растворить в 100 мл воды, профильтровать, разлить по порциям и хранить при —20°С. Раствор амнноптерина необходимо предохранять от света.
Выбор сыворотки. Отбору сыворотки необходимо уделять особое внимание. Сыворотки из различных источников сильно варьируют по свойствам. Надо проверять также каждую партию сывороток. Наибольшей способностью поддерживать рост гибридных клеток обладает сыворотка плода коровы (СПК). Чаще всего используют неинактивнрованную сыворотку, хотя некоторые исследователи предпочитают инактивировать ее прогреванием при 56°С в течение 30 мин для уменьшения возможной токсичности компонентов комплемента. СПК является одним из самых дорогих компонентов среды культивирования, поэтому с ней необходимо обращаться весьма экономно. Для культивирования клеток сразу после слияния, а также для клонирования используют высокую концентрацию СПК (15—20%). Как только гибридомы отобраны, их можно постепенно переводить иа рост в 10% СПК. Если клетки хорошо адаптировались, то концентрацию СПК можно снизить до 5%.
В предварительных экспериментах определяют качество нескольких партий сывороток н отбирают ту, которая дает наилучшие результаты. Проверку лучше производить на способность поддерживать рост ранее полученных гибридомных клеток при низкой плотности посева их в культуру. Если нет в распоряжении готовых гибридомных клеток, то можно использовать миеломные родительские клетки. Выполняют процедуру проверки следующим образом (G. Galfre, С. Milstein, 1981): из клеток, взятых на логарифмической фазе роста, готовят четыре суспензии, содержащие 2000, 1000, 500 и 250 клеток в 1 мл. Помещают по 150 мкл среды, .содержащей 20% тестируемой СПК, в луики I—6 96-луночного планшета с плоским дном для культивирования. В лунки >-42 вносят контрольную сыворотку для сравнения. Закапывают по 20 мкл каждой суспензии клеток в 24 лунки (2 горизонтальных ряда). Планшет помещают в СОг-инку-
батор. Через трое суток планшет просматривают и определяют наличие в лунках живых клеток, а через 7—10 сут оценивают скорость роста.
Сыворотку, обладающую наилучшей способностью поддерживать рост клеток при низкой плотности посева, употребляют только для роста клеток в критических условиях: сразу же после слияния и при клонировании. Для роста клеток при оптимальной плотности можно применять сыворотку со средней рост-поддер- живающей активностью.
Отобранные партии сыворотки разливают по 50—100 мл и хранят при —20°С.
Вместо СПК применяют и другие сыворотки: сыворотку новорожденных телят, сыворотку коров, лошадиную сыворотку, кроличью сыворотку. Каждую из этих сывороток необходимо проверить на способность поддерживать рост клеток при низкой и обычной плотностях посева и употреблять в зависимости от ее рост-поддерживающих свойств. В качестве одной нз мер экономии СПК рекомендуют использовать ее в сочетании с другой, менее дорогой сывороткой.
Следует отметить, что в последнее время уделяется большое внимание разработке бессывороточных (полностью синтетических) сред (S. Wolpe, 1984).
Раствор для слияния клеток. Агентом, ускоряющим слияние клеток, является полиэтиленгликоль. Способность ПЭГ индуцировать слияние возрастает при увеличении его концентрации, однако при тех концентрациях, которые наиболее эффективны в отношении слияния (35—50%), проявляются токсические свойства ПЭГ. Способность вызывать слияние и токсические свойства зависит от марки и партии ПЭГ, поэтому следует протестировать несколько образцов ПЭГ и выбрать наиболее подходящий. Обычно используют ПЭГ с маркой от 1000 до 4000, причем ПЭГ 1000 более оптимален для слияния в моиослое, а ПЭГ 4000 — в суспензии.
Важное значение имеет pH раствора ПЭГ. Максимальное число клонов получается при pH 8,0—8,5 (R. Westerwoundt. 1985). Некоторые авторы рекомендуют проводить последнюю отмывку клеток перед слиянием средой с pH около 8,0. Эффективность слияния повышают, добавляя в раствор ПЭГ 5—15% диметилсульфоксида (R. Westerwoundt, 1985). Для оптимизации процесса слияния из среды удаляют сыворотку, так как оиа препятствует адгезии клеток. Стерилизацию раствора ПЭГ часто производят автоклавированием, однако недавно было показано (J. Kadish, К. Wenc, 1983), что выход клонов увеличивается при использовании ПЭГ, стерилизованного фильтрацией.
Токсичность ПЭГ можно проверить в предварительных экспериментах. Для этого обрабатывают раствором ПЭГ миеломные клетки при таких условиях, в которых будет проводиться слияние, затем засевают обработанные клетки в культуру при низкой плотности и сравнивают их рост с ростом необработанных клеток.
Для приготовления раствора ПЭГ берут 2 г ПЭГ 4000, помещают в пробирку и расплавляют в водяной бане при 70°С. К расплавленному ПЭГ добавляют 0,4 мл диметилсульфоксида и 2 мл среды РРМ1 1640. Пробирку оставляют открытой иа воздухе до тех пор, пока pH раствора не станет щелочным (8,0— 8,5), о чем можно судить либо по измеиеиию окраски индикатора, присутствующего в среде, либо непосредственным измерением pH. После этого теплый раствор стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры и держат до опыта в термостате при 37°С.
Выбор экспериментального животного. Он определяется наличием родительских миеломных линий, возможностью получения гибридов клеток этих линий и иммунных лимфоцитов, а также способностью к размножению полученных гибридом в организме животного. Обычно для иммунизации используют мышей и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных. При иммунизации мышей берут линию Balb/C; это связана с тем, что все имеющиеся миеломные линии, образую-
щие гибридомы, получены от этих мышей. Однако сила иммунного ответа у различных линий мышей может отличаться, и бывают ситуации, когда необходимо иммунизировать мышей другой линии. В этом случае полученные гибридомы выращивают на гибридах Fi этой линии и линии Balb/C.
Иммунизация крыс проводится в тех случаях, когда требуется получить антитела к антигенам мыши, для которых отсутствует полиморфизм у разных линий мышей. Полученные гибридом- ные клетки можно выращивать в организме крыс, если применять миеломные клетки крыс, или в организме мышей после подавления их иммунологической реактивности (см. ниже).
Другие животные практически не используются, хотя недавно появилось сообщение о получении стабильных гибридов между лимфоцитами кролика и мышиной миеломой (Кио и сотр., 1985).
При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это значительно осложняет отбор клонов, продуцирующих антитела к интересующей антигенной детерминанте, так как их доля может быть крайне незначительной. Поэтому по возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере на последних этапах иммунизации. Однако одним из основных достоинств гибридомной технологии и является как раз то обстоятельство, что специфические антитела против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный препарат антигена, и употреблять впоследствии эти антитела для очистки антигена.
Способы иммунизации. Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки. Как отмечалось выше, до сих пор неизвестно, какие именно клетки способны гибридизироваться с образованием антителообразующих гибридом. Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимо выделять селезеночные клетки животных через 3—4 сут после последнего введения антигена, т. е. тогда, когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток.
Конкретная схема иммунизации сильно зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков — слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение получил полный адъювант Фрейнда (ПАФ). Помимо этого используют введение антигена, преципитироваиного на квасцах, и введение вместе с антигеном убитых клеток Bordetella Pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития сильного иммунного ответа, хотя чрезмерная иммунизация
может иметь обратный эффект — отмечено, что иногда у клеток гипериммунизированных животных снижается способность образовывать гибридомы. В некоторых случаях бывает достаточно и одной иммунизации.
По ходу иммунизации необходимо определять титр антител к антигену (титр антител — величина, обратная разведению сыворотки, при которой степень иммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной). Обычно это делают перед последней иммунизацией. В опыт отбирают животных с высоким титром антител. Не следует ожидать хороших результатов гибридизации, если при иммунизации животных нет образования антител или они образуются в низком титре.
Для большинства растворимых антигенов можно использовать следующую схему иммунизации (J. Kearney, 1984).
Вводят 1—100 мкг антигена в ПАФ или в виде преципитата на квасцах внутрибрюшинно. Если есть возможность, то одновременно вводят 2- 10® убитых клеток В. Pertussis.
. Через 2—3 недели вводят антиген на физиологическом растворе внутрибрюшинно или внутривенно. Эту процедуру можно повторять до появления высокого титра антител.
Последнюю иммунизацию делают внутривенно, через 3 сут животные забиваются и готовится суспензия клеток для гибридизации.
При применении в качестве иммуногена различных клеток (опухолевые клетки, чужеродные клетки крови, бактерии, паразиты и т. д.) делают несколько инъекций без адъюванта внутрибрюшинно с интервалом в 2—3 недели по (1—5) • 107 клеток. Последнюю инъекцию делают внутривенно и через три дня выделяют клетки селезенки для гибридизации.
Иногда для получения гибридов приходится прибегать к очень массированным схемам иммунизации. В качестве примера можно привести схему, предложенную Стели и сотр. (1980). Авторам не удавалось получить гибридомы против хорионного гонадотропина человека, применяя обычную схему иммунизации, несмотря на то что титр антител в сыворотках животных был высоким. Тогда авторы предположили, что для гибридизации важно, чтобы клетки находились в стадии активной бласттрансформации под действием антигена. Ими была выявлена высокая степень корреляции между числом больших бластных клеток в популяции клеток селезенки и образованием специфических антителообразующих гибридов. Максимальный выход гибридов получался при схеме иммунизации, представленной в табл.. 9.
При такой схеме иммунизации доля положительных клонов достигала 40% (для сравнения — при иммунизации «сильными» антигенами доля положительных клонов равна 1 —10%). Очевидно, что далеко не всегда можно использовать эту схему, так как для нее требуется большое количество антигена (несколько миллиграммов).
Заслуживает внимания предложенный недавно метод одно-
Номер введения антигена*
Концентрация антигена, мкг
Адъювант
Способ введения**
1
50
ПАФ + 109
Подкожно и в/бр
2
50
Неполный адъювант
Фрейнда
в/бр
3
10
То же
в/бр
4
200
Физиологический
раствор
в/в
5
400
То же
в/в и в/бр
6
400
>
в/в и в/бр
7
400
>
в/в
Таблица 9. Схема иммунизации, предложенная для получения
моноклональных антител против хорионного гонадотропина человека (С. Stahli н сотр., 1980)
* Интервалы между 1, 2, 3 и 4 введениями не менее 4 недель; интервалы между 4, 5, 6, 7 введениями и постановкой слияния — одни сутки.
** в/бр — внутрибрюшинно, в/в — внутривенно.
кр'атной иммунизации антигеном внутриселезеночно (М. Spitz и сотр., 1984), при которой расходуется всего 20 мкг белка. Несмотря на необходимость освоения техники хирургической операции на животном, этот метод можно рекомендовать в тех случаях, когда нужно быстро получить гибридомы, имея в распоряжении минимальные количества антигена.
С целью повышения доли специфических антигенреактивных клеток в популяции лимфоцитов, используемой для гибридизации, были применены методы адаптивного переноса и индукции иммунного ответа в культуре вне организма (Р. С. Рох и сотр., 1982). Постановка опытов заключается в следующем. Мышей иммунизируют антигеном в ПАФ или в виде преципитата на квасцах с месячными интервалами и отбирают животных, имеющих высокий титр антител в сыворотке. Этим мышам вводят антиген, через 10 сут забивают и извлекают селезенку. Готовят суспензию клеток селезенки и либо культивируют их вне организма, либо употоебляют в адаптивном переносе. Для культивирования 2 • 10г клеток помещают в чашку Петри диаметром 60 мм в присутствии 10 мкг антигена в среде культивирования и устанавливают на вращающуюся платформу для инкубации при 37°С в атмосфере азота (83%), СОг(10%) и Ог(7%). Через четыре дня клетки собирают и используют для гибридизации.
В адаптивном переносе (25—40) • 106 клеток вводят внутривенно сингенным реципиентам, предварительно облученным (за 24 ч) дозой 5,5 Гр. Реципиентам затем вводят внутрибрюшинно антиген (на физиологическом растворе). Через 4 сут мышей забивают и выделенные клетки селезенки употребляют для гибридизации.
Несмотря на то что выход клеток после такого культивирования в несколько раз снижается; доля антигенспецифических клонов после гибридизации возрастает до 50 раз.
В последнее время активно развиваются методы полной иммунизации вне организма с целью получения гибридом (С. Reading, 1982). Иммунизация in vitro имеет ряд существенных преимуществ: а) укорачивается период иммунизации до 4—5 сут; б) требуется существенно меньшее количество антигена; в) ко многим антигенам можно получить более выраженный иммунный ответ (частично за счет снижения вклада толерантности и супрессии); г) повышается процент отвечающих клеток; д) легко проверять факторы, влияющие на эффективность иммунизации.
Современные методы иммунизации in vitro основаны на двух системах культивирования лимфоцитов, разработанных в конце 1960-х годов. Метод суспензионного культивирования (R. Mishell, R. Dutton, 1966, 1967) был первым методом, в котором иммунизация полностью проходила вне организма. Критическими факторами в данном методе были низкая концентрация кислорода в атмосфере (7%), высокая плотность клеток, легкое покачивание культуры, ежедневное добавление свежей среды и выбор подходящей партии СПК и антигена (использовали эритроциты барана). Эта система была усовершенствована Р. Кликом (1972), который предложил добавлять в среду 2-меркаптоэтанол, предшественники нуклеиновых кислот, инсулин, глутамин, а также дополнительные аминокислоты. При таких условиях иммунный ответ наблюдали в отсутствие покачивания и в атмосфере с 5% СО2.
Другой основной системой иммунизации in vitro является метод Д. Марбрука (1967). Клетки культивируют в маленькой камере на диализной мембране, через которую идет обмен средой из большого резервуара.
Впервые иммунизацию in vitro с целью получения гибридом осуществил в 1978 г. Г. Хенгартнер с сотр. Авторы отметили возрастание частоты появления антигенспецифических гибридом на порядок. Аналогичные результаты были получены и другими исследователями. Современные направления в этой области связаны с оптимизацией условий культивирования in vitro путем подбора заменителей СПК или добавлением кондиционированной среды. С успехом были использованы кондиционированные среды от смешанной культуры тимоцитов (С. Reading, 1982), от стимулированных форболмиристатацетатом клеток лимфомы EL-4 (М. Ма и сотр., 1984). Возможно, что действующим началом в этих кондиционированных средах были различные хелперные факторы, продуцируемые Т-клетками, и которые необходимы для пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов. Выявление природы этих факторов и выделение их в чистом виде будет, несомненно, способствовать развитию этой области.
Одним из основных недостатков иммунизации in vitro является большая доля IgM-образующих Клонов. Это связано с тем.
что при иммунизации in vivo клетки берут во время вторичного иммунного ответа, при котором образуются в основном антитела IgG класса, тогда как in vitro реакция идет по первичному типу, для которого характерна продукция IgM антител. Эта проблема может быть преодолена после отработки способов получения вторичного иммунного ответа in vitro.
§ 3. Приготовление сред для культивирования и получение клеточных суспензий
Приготовление сред -для культивирования.
Полная среда с 10% СПК готовится из следующих компонентов: 1) среда RPMI 1640 или среда Игла в модификации Дульбекко, однократной концентрации— 450 мл; 2) 5 мл 100 мМ раствора пирувата натрия; 3) 5 мл 100-кратного раствора антибиотиков; 4) 5 мл 200 мМ раствора Е-глутамина; 5) 0,25 мл 0,1 М раствора 2-меркаптоэтанола; 6) 5 мл 1 М буфера HEPES; 7) 50 мл СПК.
. Эту среду используют для культивирования миеломных клеток и при массовом размножении гибридомных клеток. При начальном культивировании гибри- домных клеток (сразу после гибридизации) и их клонировании концентрацию СПК увеличивают до 15—20%. При использовании среды Дульбекко в нее добавляют еще глюкозу до конечной концентрации 4,5 г/л.
Среды ГАТ и ГТ приготавливают путем добавления 5 мл соответствующего 100-кратного раствора к 500 мл полной среды.
Подготовка миеломных клеток. При выборе миеломных клеток следует основываться на данных табл. 8. Необходимо учесть, что клеточные линии изменяются и иногда их способность к слиянию падает или же синтез антител гибридными линиями становится нестабильным. Поэтому лучше иметь не одну какую-то линию клеток, а по крайней мере три. Первые опыты по слиянию нужно провести со всеми линиями, и клетки, которые дали наилучшие результаты, заморозить в достаточном количестве.
Успех в получении гибридом в значительной мере определяется правильной подготовкой миеломных клеток. При их культивировании необходимо руководствоваться следующими требованиями:
Как только в распоряжении исследователя появились линии клеток с хорошей способностью образовывать гибридомы, необходимо размножить их и заморозить достаточное число ампул.
■ 2. Следует использовать клетки в течение не более одного месяца после разморозки, так как у них постепенно падает способность образовывать гибридомы.
Клетки для слияния берут при логарифмической фазе роста. До момента слияния клетки должны находиться в этой фазе по крайней мере одну неделю.
Целесообразно периодически культивировать клетки в присутствии токсического аналога нуклеотидов, использованного для селекции данной линии. В некоторых лабораториях клетки культивируют в его присутствии постоянно, однако это вряд ли яв-
ляется необходимым, можно добавлять реагент только на 48 ч. Для большинства линий таким аналогом является 8-азагуанин (табл. 8). Для приготовления 1000-кратного раствора взвешивают 15 мг вещества и растворяют в 1 мл диметилсульфоксида.
Клетки обычно адаптируются к одному виду среды и плохо переносят ее замену. Поэтому при получении клеток из другой лаборатории необходимо культивировать их в той же среде, которая использовалась в этой лаборатории. При отсутствии такой возможности клетки надо постепенно адаптировать к новой среде, для чего на промежуточном этапе используют смесь двух сред.
Ни в коем случае нельзя допускать дорастания культур до высокой плотности, при которой начинается массовая гибель клеток. Если превышена плотность 106/мл, то лучше такую культуру отбросить и разморозить новую партию клеток.
Клетки питающего слоя. Техника получения гибридом в сущности представляет собой выращивание клеточного потомства из одной клетки, посеянной при очень низкой плотности. Известно, что при низкой плотности рост клеток сильно замедляется и в значительной степени определяется наличием в среде в достаточном количестве различных питательных и стимулирующих факторов. В связи с этим при получении гибридом часто используют клетки питающего слоя (feeder cells), которые снабжают культуру различными жизненно необходимыми факторами. Этот эффект будет проявляться тем сильнее, чем менее оптимальной является среда культивирования. При использовании некоторых партий сывороток и сильно обогащенных сред эффект клеток питающего слоя может и не выявляться.
В качестве клеток питающего слоя используют клетки селезенки, тимоциты, перитонеальные макрофаги, мышиные фибробласты и др. В. Лонг и сотрудники (1986) получили очень хорошие результаты при использовании облученных диплоидных фибробластов легкого человека (линии IMR-90. MRC-5, WI-38).
Чаще всего в качестве клеток питающего слоя используют перитонеальные макрофаги. Желательно использовать сингенные макрофаги, так как у аллогенных и ксеногенных макрофагов величина стимулирующего эффекта обычно ниже, чем у сингенных (S. Fazekas de St. Groth, D. Scheidegger, 1980; K. Me Cullough и сотр., 1983). Обычно макрофаги получают от мышей без предварительного введения им стимулятора из-за опасений, что активированные макрофаги могут убивать гибридомные клетки. В некоторых работах тем не менее используют предварительное введение стимулятора: минерального масла (С. Reading, 1982), липополисахарида (К- McCullough и сотр., 1983).
Клетки питающего слоя можно добавлять либо вместе со смесью миеломных и селезеночных клеток, обработанных полиэтиленгликолем, либо за сутки до слияния, либо через сутки после него.
Кондиционированные среды. Использование клеток питающего слоя имеет ряд недостатков: 1) их приготовление трудоемко и накладывает определенные ограничения по времени на приготовление гибридом; 2) они представляют собой потенциальный источник бактериального загрязнения; 3) они метаболизируют питательную среду, что создает необходимость часто менять ее; 4) растущие клетки в питающем слое могут перерастать или убивать гибридомы; 5) клетки питающего слоя препятствуют визуальной идентификации растущих колоний гибридом.
Всех этих недостатков лишены кондиционированные среды, представляющие собой супернатанты культур, в которых росли клетки питательного слоя. Кондиционированные среды в культивировании клеток используются давно в качестве средства замены клеток питающего слоя. Для получения гибридом использовались среды, кондиционированные эпителием человека (G. Astaldi и сотр., 1980), клетками эндотелия (С. Pintus и сотр., 1983), перитонеальными макрофагами (R. Sugosawara, 1985) и мышинными фибробластами (К. Walker, 1986).
Приготовление среды, кондиционированной перитонеальными макрофагами, осуществляют следующим образом (R. Sugosawara, 1985). Забивают взрослых мышей и выделяют перитонеальные макрофаги промыванием брюшной полости 10 мл полной среды культивирования с 10% СПК. Клетки отмывают центрифугированием и засевают в пластиковые флаконы при плотности 3,3 • 104 кл/мл. Культуру помещают в СОг-инкубатор. Через 20 ч удаляют среду, содержащую неприкрепившиеся клетки, добавляют свежую среду и культивируют 3 сут. По окончании культивирования среду сливают, центрифугируют (1000g, 10 мин), супернатант фильтруют, разливают по порциям и хранят при —20°С до момента использования.
Приготовление суспензии клеток селезенки. Все процедуры выполняют при комнатной температуре (S. Fazekas de St. Groth, D. Scheidegger, 1980).
Забивают животных, помещая их в камеру с кусочком сужэй углекислоты на дне на 1—2 мин.
Погружают животное в 70%-ный этиловый спирт, извлекают, помещают на препаровальный столик и закрепляют. В стерильных условиях извлекают селезенку и помещают ее в чашку Петри, содержащую 5 мл среды RPMI 1640 с 2,5% СПК и слегка промывают ее. Ножницами делают несколько надрезов.
Переносят селезенку в стеклянный гомогенизатор со слабо притертым пестиком, добавляют 5 мл среды RPMI 1640 с 2,5% СПК.
Осторожными надавливаниями пестиком растирают селезенку.
Полученную суспензию переносят в пробирку, дают суспензии отстояться 10 мин, затем надосадочную жидкость переносят в другую пробирку, не взбалтывая при этом осевшие комочки ткани.
Клетки отмывают два раза центрифугированием в среде без сыворотки.
Ресуспендируют осадок после второго центрифугирования в среде без сыворотки и подсчитывают число живых лимфоцитов в камере для подсчета клеток крови с помощью метода исключения красителя трипанового синего. Жизнеспособность полученной суспензии должна быть выше 80%.
Обычно из одной селезенки мыши удается выделить около 10е ядерных клеток
Слияние
Существует два основных варианта добавления ПЭГ, используемых в настоящее время. Первый метод заключается в следующем (V. Oi, L. Herzenberg, 1980). В течение 1 мин добавляют 1 мл 50%-ного раствора ПЭГ при 37°С с постоянным перемешиванием. Затем раствор постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без сыворотки, после чего клетки центрифугируют и ресуспендируют в среде культивирования.
Во втором методе используют более длительную обработку клеток раствором ПЭГ (М. Getter и сотр., 1977). К осадку клеток добавляется 30—35% ПЭГ при комнатной температуре. Клетки центрифугируют 2 мин, затем их оставляют при комнатной температуре еще на 5—7 мин. Затем их разводят в большом объеме среды с сывороткой, отмывают и культивируют.
Иногда проводят обработку клеток полиэтиленгликолем в монослое (Т. МсКеагп, 1981). Одним из вариантов этого метода является слияние клеток на фильтре (G. Buttin и сотр., 1978).
Ниже приводится методика слияния на основе метода В. Ои и Л. Херценберга (1980).
Нагреть 80 мл среды культивирования с 15—20% СПК и 20 мл среды без сыворотки до 37°С. Нагреть раствор ПЭГ до 37°С.
Приготовить суспензию клеток селезенки, как описано выше.
Приготовить суспензию клеток миеломы, отмыть их один раз в среде без СПК
Смешать вместе 108 клеток селезенки и 107 клеток миеломы (точное количество клеток миеломы не очень важно, их отношение с клетками селезенки может колебаться от 1:10 до 1:1). Поместить клетки в центрифужную пробирку на 50 мл и смесь центрифугировать при 400g 10 мин при комнатной температуре.
Удалить всю надосадочную жидкость, поместить пробирку в водяную баню на 37°С и держать ее там в течение всего времени обработки.
Через 1 мин с помощью пипетки на 1 мл добавить в течение 1 мин 1 мл теплого (37°С) раствора ПЭГ. Во время добавления осторожно перемешивать осадок кончиком пипетки.
Продолжать перемешивать осадок еще 1 мин.
Той же пипеткой добавить 1 мл теплой среды без СПК (вначале по каплям) в течение 1 мин, постоянно перемешивая кончиком пипетки суспензию клеток.
Повторить этап 8.
С помощью пипетки на 10 мл добавить при постоянном размешивании суспензии клеток еще 7 мл среды без СПК в течение 2—3 мин.
Центрифугировать суспензию при 400g 10 мин при комнатной температуре.
Осадок ресуспендировать в 10 мл теплой среды с СПК. Избегать сильного пипетирования.
Суспензию перенести во флакон, содержащий 70 мл теплой среды с СПК-
Засеять по 0,2 мл этой суспензии в лунки четырех 96-лу- ночных планшетов для культивирования клеток. Если в лунки этих планшетов накануне были засеяны макрофаги (по 2 ■ 104) в объеме 0,10 мл, то на этапе 13 суспензию надо разводить в 40 мл и засевать в каждую лунку по 0,1 мл. Макрофаги можно добавлять и вместе со смесью миеломных клеток и клеток селезенки, объединив их до разливки суспензии по лункам планшетов. На четыре планшета необходимо приблизительно 107 макрофагов (такое количество обычно удается выделить из 4—5 мышей).
Поместить планшеты в СОг-инкубатор.
Через 24 ч с помощью пастеровской пипетки, подсоединенной к вакууму, удалить приблизительно 0,1 мл из каждой лунки, не взбалтывая при этом клетки, осевшие на дно. Добавить в каждую лунку по 0,1 мл среды ГАТ.
Повторить пункт 16 на 2, 3, 5, 8 и 11 сут и дальше через каждые 3—4 сут.
Начиная с 7—10 сут можно просматривать при помощи инвертированного микроскопа культуры и отмечать в них рост колоний гибридомных клеток.
Через 2—4 недели после слияния из лунок с растущими клетками отбирают по 0,1 мл надосадочной жидкости для выявления в ней активности антител. Это делают через 3 сут после замены культуральной среды.
Если находят культуру, представляющую интерес, то клетки ресуспендируют и переносят в лунку 24-луночного планшета. В освободившуюся лунку 96-луночного планшета добавляют свежую среду и продолжают инкубацию (запасная культура). Выращивание в 24-луночных планшетах необходимо вести в присутствии клеток питающего слоя, в качестве которых можно снова использовать макрофаги (по 105 клеток на лунку) или тимоциты (1— 2)-107 клеток на лунку) и клетки селезенки (2- 10s клеток на лунку). Начиная с этого этапа клетки культивируют в среде ГТ, а через неделю — в среде без добавления нуклеотидов.
Культуру подкармливают каждые 2—3 сут, удаляя 1 мл культуральной жидкости и добавляя 1 мл свежей среды.
После достижения клетками стадии слившегося монослоя проверяют повторно активность антител в культуральной жидкости.
Если культура продолжает продуцировать интересующие антитела, клетки клонируют (см. ниже), используя для этого небольшую часть культуры.
Оставшуюся часть культуры размножают последовательным переносом клеток в культуральные сосуды большего размера.
После получения достаточного количества клеток их замораживают (по 2 -106 клеток на ампулу).
Как отмечалось выше, вместо клеток питающего слоя можно использовать кондиционированную среду. Среду, кондиционированную перитонеальными макрофагами, добавляют к среде культивирования в соотношении 1:1.
Следует отметить, что многие исследователи предпочитают добавлять систему ГАТ сразу же после слияния, а культуры после слияния не трогать несколько дней (даже не открывать СОг-инкубатор), что объясняется тем, что клетки после слияния очень чувствительны к изменениям внешней температуры, наступающим при вынимании планшетов из СОг-инкубатора. Поскольку не проводилось сравнения этих методов в одной работе, трудно отдать предпочтение какой-либо из этих методик.
Клонирование гибридомных клеток
Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток. Для недавно образованных гибридомных клеток характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. При культивировании могут появляться клетки, потерявшие способность продуцировать антитела, и они могут перерастать антителообразующие гибридные клетки.
К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора — проточного цитофлуориметра.
Клонирование методом лимитирующих разведений. Этот метод является наиболее распространенным. Если клетки посеяны в 96-луночные планшеты очень редко, то доля лунок, в которой наблюдается рост клеток, подчиняется распределению Пуассона (I. Lefkovitz, Н. Waldmann, 1979):
f(0) = е~\
где f (0) — фракция лунок, в которых отсутствует рост; К — среднее число клеток на лунку.
При Х=1 f(0)=0,37. Другими словами, для того чтобы получить разумную вероятность только одного клона в лунке, в более 37% лунок не должно наблюдаться роста клеток. Поскольку эффективность клонирования редко бывает равной 100%, клетки необходимо засевать при плотности 10, 3 и 0,5 клеток на лунку. В тех планшетах, на которых наблюдается рост в половине лунок, содержатся изолированные клоны.
При первом клонировании активной, т. е. продуцирующей антитела, может оказаться только небольшая часть клонов.
Необходимо всегда производить повторное клонирование, при котором доля положительных клонов будет возрастать.
Для клонирования надо применять клетки питающего слоя. Используются те же виды клеток, что и для начального роста гибридом. Важно употреблять отобранные, как описано выше, партии сыворотки и добавлять ее в количестве 15—20%.
Клонирование в полужидком агар-агаре. Для клонирования гибридом можно применять полужидкий агар (Р. Coffino и сотр., 1972). Обычно берется система, состоящая из двух слоев. Нижний (твердый) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культивирования. Ему дают затвердеть. Затем добавляют второй слой — мягкий, содержащий 0,3% агар-агара, в который включаются клонируемые клетки. При использовании клеток питающего слоя их засевают в чашку Петри до заливки агар-агара, и среду культивирования удаляют непосредственно перед добавлением нижнего слоя агара.
Для приготовления агарового слоя смешивают равные части среды культивирования двойной концентрации и 0,6% агар-агара в дистиллированной воде, затем помещают в водяную баню на 43—44°С до употребления. Клетки добавляют в минимальном объеме и сразу же заливают в чашку Петри, после чего оставляют ее на некоторое время при комнатной температуре до затвердевания агара. Чашки помещают в СОг-инкубатор.
Колонии становятся видимыми через 7—14 сут. При помощи бинокулярной лупы извлекают из агара колонии, пользуясь пастеровкой пипеткой, и переносят в жидкую культуру. Разработаны методы выявления синтеза антител in situ путем наслоения на поверхность агара раствора антигена, приводящего к формированию зон преципитации вокруг положительных колоний (W. Cook, М. Scharff, 1977).
Клонирование с помощью проточного цитофлуориметра. Д. Паркс с сотр. (1979) предложили модификацию проточного цитофлуориметра, позволяющую осуществлять клонирование индивидуальных клеток. Для этого приготавливают флуоресцентные микрошарики из латекса и покрывают их антигеном. Такие шарики адсорбируются на антигенспецифических гибридомных клетках, что позволяет выделять их на этом приборе.
После выделения тем или иным способом положительных клонов клетки этих клонов размножают в достаточном количестве и образцы их замораживаются.
Замораживание и оттаивание гибридомных клеток
Замораживания клеток. 1. Готовят среду для замораживания клеток, состоящую из среды культивирования, 20% СПК и 10% диметилсульфоксида. Полученную среду стерилизуют через фильтры и хранят при 4°С.
Осаждают клетки центрифугированием при 200g, 4°С, к
осадку добавляют необходимое количество холодной серы для замораживания, исходя из количества размораживаемых ампул: 1 мл среды на (2—5) • 106 клеток. Клетки осторожно ресуспен- дируют в этой среде.
■ 3. Полученную суспензию разливают по 1 мл в стерильные пластиковые ампулы на 2 мл с завинчивающимися крышками; при этом следует избегать смачивания верхней части ампулы. Плотно завинчивают ампулу пробкой.
Замораживание можно производить двумя способами.
Помещают ампулы в штатив, который ставят в коробку из пенопласта с толщиной стенок около 1 см и с крышкой. Закрытую коробку ставят на 1 сут в морозильник на —70°С, после чего пробирки переносят в жидкий азот.
Клетки можно заморозить в парах жидкого азота. Для этого изготавливают плотно закрываемую камеру (лучше всего из пенопласта с толстыми стенками), укрепляют в ней штатив для ампул на высоте 10—15 см выше дна, а также ампулы с клетками и наливают на дно жидкий азот (в поставленную на дно металлическую посуду). Камеру плотно закрывают и оставляют на 1—2 ч, после чего ампулы переносят в жидкий азот. Очевидно, что устройство камеры (толщина стенок, герметичность) должно быть таким, чтобы за это время весь жидкий азот не успел испариться.
При отсутствии в лаборатории резервуара с жидким азотом клетки можно некоторое время (несколько месяцев) хранить при —70°С (R. Patel et. al., 1984).
Размораживание клеток. Замороженные культуры вынимают из сосуда с жидким азотом и быстро помещают в водяную баню на 37°С. Как только растают последние кусочки льда, суспензию клеток переносят пастеровской пипеткой в пробирки на 50 мл, содержащие не менее 10 мл холодной питательной среды, отмывают один раз 20—30 мл холодной среды и подсчитывают число жизнеспособных клеток. Клетки засевают в разных разведениях, так как окраска трипановым синим часто не выявляет значительную долю поврежденных клеток, которые могут погибнуть в первые сутки культивирования.
5 7. Методы выявления антител, синтезируемых гибридомными клетками
Какой бы метод детекции антител ни был выбран, его надо отработать до начала получения гибридом, так как потом на это не будет времени. Основные требования к методу детекции — надежность и быстрота. Проверке должно подвергаться сразу большое число проб. Точное количественное определение титра антител на данной стадии не требуется.
Первый этап скринирования — стерильный отбор проб, который осуществляют с помощью пастеровских пипеток. Однако при необходимости тестировать несколько сотен культуральных
АНТИГЕН
ТВИН-20, АЛЬБУМИНТВИН-20, АЛЬБУМИНДОБАВЛЕНИЕ КОНЪЮГИРОВАННЫХ С ФЕРМЕНТОМ АНТИТЕЛ ПРОТИВ 1g МЫШИДОБАВЛЕНИЕ КОНЪЮГИРОВАННЫХ С ФЕРМЕНТОМ АНТИТЕЛ ПРОТИВ 1g МЫШИРис. 44. Схема проведения основных этапов иммунофермент- ного методаРис. 44. Схема проведения основных этапов иммунофермент- ного метода
ТВИН-20, АЛЬБУМИН
ТВИН-20, АЛЬБУМИН
ДОБАВЛЕНИЕ КОНЪЮГИРОВАННЫХ С ФЕРМЕНТОМ АНТИТЕЛ ПРОТИВ 1g МЫШИ
ДОБАВЛЕНИЕ КОНЪЮГИРОВАННЫХ С ФЕРМЕНТОМ АНТИТЕЛ ПРОТИВ 1g МЫШИ
Рис. 44. Схема проведения основных этапов иммунофермент- ного метода
Рис. 44. Схема проведения основных этапов иммунофермент- ного метода
жидкостей используют многоканальные пипетки (Flow Labs, Англия) или специальные приспособления для переноса надосадочных жидкостей сразу из 96 лунок.
Основными методами скринирования культуральных жидкостей с целью выявления антител к иммунизирующему антигену
являются иммуноферментный, радиоиммунологический и иммуно- флуоресцентный методы.
Иммуноферментный метод. В данном методе используют антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные ферментом, и о результате реакции судят по появлению цветной реакции. Принцип метода следующий (рис. 44). Растворимый антиген или клетки связывают с лунками 96-луночного планшета для микротитрования, приливают культуральную жидкость, в которой могут быть антитела, и после инкубации добавляют конъюгированные с ферментом антитела против иммуноглобулинов мыши. После инкубации и отмывки в лунки наливают раствор субстрата. Если в культуральной жидкости были антитела против антигена, то они адсорбируются на антигене, на них в свою очередь адсорбируются конъюгированные с ферментом вторичные антитела и под действием фермента происходит разложение субстрата и переход его в окрашенный продукт. Таким образом, по появлению окраски судят о присутствии в культуральной жидкости антител к иммунизирующему антигену.
В ИФМ используют следующие ферменты: щелочную фосфатазу, р-галактозидазу и пероксидазу хрена.
Ниже описывается вариант ИФМ с использованием пероксидазы хрена. Конъюгат иммуноглобулинов с пероксидазой готовят следующим образом (L. Hudson, F. Нау, 1980).
Материалы:
иммуноглобулины кролика, 8 мг/мл в карбонатном буфере; 0,1 М перйодат натрия; 0,001 М натрийацетатный буфер, pH 4,4; 0,1 М натрийкарбонатиый буфер, pH 9,5; боргидрид натрия: 4 мг/мл в дистиллированной воде; глицерин.
Методика.
Растворить 4 мг пероксидазы хрена в 1 мл дистиллированной воды.
Добавить 200 мкл свежеприготовленного раствора перйодата и перемешивать осторожно 20 мин при комнатной температуре.
Диализовать против натрийацетатного буфера в течение ночи при 4°С.
Добавить 20 мкл натрийкарбонатного буфера для доведения pH приблизительно до 9,0—9,5 и сразу же добавить иммуноглобулины. Оставить при комнатной температуре на 2 ч.
Добавить 100 мкл свежеприготовленного раствора боргидрида натрия и оставить при 4°С на 2 ч.
Диализовать против боратного буфера в течение ночи при 4°С.
Добавить равный объем 60%-ного глицерина в боратном буфере и хранить при 4°С
Конъюгат можно хранить длительное время (до 2—3 лет).
Проведение анализа культуральных жидкостей на содержание в них антител к иммунизирующему антигену производят следующим образом.
Материалы;
растворимый антиген; 0,05 М карбонат-гидрокарбонатный буфер, pH 9,6 (растворить в 1 л дистиллированной воды 1,59 г карбоната натрия и 2,93 г гидрокарбоната натрия); фосфатно-солевой раствор (ФСР), pH 7,2 0,15 М, содержащий 0,1% твин-20 (по объему); пероксид водорода; 0,15 М натрийцитратный буфер: смешать 49 мл раствора лимонной кислоты (21 г/л) и 51 мл раствора
натрия фосфорнокислого однозамещенного (NaaHPO<X 2HjO, 35,6 г/л), довести pH до 5,0; серная кислота 12,5%-ная; о-фенилендиамин; конъюгат пероксидазы с IgG кролика против иммуноглобулинов мыши; специальные планшеты для ИФМ или обычные планшеты на 96 лунок с плоским дном для микротитрования нз полистирола.
Методика.
Развести антиген в карбонат-гидрокарбонатном буфере. Оптимальную концентрацию необходимо определять для каждого антигена, но диапазон концентраций 5—10 мкг/мл пригоден для большинства антигенов.
Добавить по 100 мкл растворенного антигена во все лунки и инкубировать 3 ч при 4°С в увлажненной камере (можно оставить на ночь).
Отмыть лунки от антигена и заполнить их раствором ФСР- Твин.
Инкубировать при комнатной температуре 3 мин и удалить жидкость, перевернув планшет и встряхнув его над раковиной. Твии-20 обладает способностью блокировать на пластике участки неспецифического связывания, тем самым препятствуя адсорбции на пластик белков, которые будут добавляться позднее.
Повторить этап отмывки два раза.
Добавить культуральную жидкость. Иногда ее разводят в 5—10 раз. Поставить планшет инкубироваться на 2 ч при 37°С в увлажненной атмосфере.
Повторить отмывку так же, как на этапах 3 и 4.
Добавить 100 мкл конъюгата, разведенного в ФСР-Твин. Точное разведение необходимо предварительно подобрать в эксперименте. В зависимости от титра исходной кроличьей антисыворотки разведение может колебаться от 1:200 до 1:10 000.
Инкубировать при 37°С 2 ч в увлажненной камере.
Повторить процедуру отмывки (пункты 3 и 4).
Пока планшет инкубируется во время отмывки, необходимо приготовить субстрат. Для этого добавляют 34 мг о-фени- лендиамина и 50 мкл пероксида водорода к 100 мл натрийцитратного буфера. Раствор субстрата необходимо каждый раз готовить свежим и немедленно использовать. До момента разливки держать в темном сосуде.
Добавить 100 мкл субстрата в каждую из лунок и оставить в темноте при комнатной температуре для развития окраски на 30 мин.
Реакцию останавливают добавлением 25 мкл серной кислоты .
Учесть результат по появлению окраски субстрата визуально или на фотометре с горизонтальным ходом луча при 492 нм.
Выше описан вариант постановки реакции ИФМ для растворимых белков. В случае клеток реакцию проводят аналогично, связав клетки с пластиком каким-либо способом (R. В. Effros et al., 1985).
Радиоиммунологический метод. Постановку РИМ осуществляют следующим способом. На предварительном этапе готовят препарат иммуноглобулина кролика против иммуноглобулинов мыши и метят его радиоактивным иодом. Приготовление меченых вторичных антител проводят следующим образом.
Материалы:
сефадекс G-50 тонкий: сефадексу дают набухнуть в фосфатно-солевом растворе в течение 24 ч; фосфатно-солевой раствор (ФСР), pH 7,2, 0,15 М; хлор- амин-Т: 0,2%-ный раствор в 0.3 М натрийфосфатном буфере, pH 7,3, приготовленный непосредственно перед использованием; раствор тирозина, насыщенный в воде; 1%-иый БСА-ФСР: 1%-ный раствор БСА в ФСР, pH 7,3; раствор меченого иода: иодид натрия, меченный иодом-125, 13—17 мКи/мкг иода; раствор антител (иммуноглобулинов кролика), 1 мг/мл в ФСР; одноразовая пластиковая пипетка на 5 мл; стекловата, пленка «Парафильм», стеклянные пробирки.
Методика.
Приготовить колонку из пластиковой пипетки на 5 мл, обрезав ее на несколько сантиметров выше градуировки, заполнить ее кончик небольшим количеством стекловаты и укрепить в штативе. Вместо пластиковой пипетки можно использовать пастеровскую пипетку, сделав на ней-ртметку на 5 мл.
Заполнить колонку до отметки 5 мл сефадексом G-50 в ФСР.
Пропустить через колонку 3—4 мл 1%-ной БСА-ФСР.
Промыть колонку несколькими миллилитрами ФСР, оставить около 0,5 мл ФСР над слоем сефадекса.
Закрыть с двух сторон колонку с помощью пленки «Парафильм» и оставить ее в таком виде до момента использования.
Добавить в стеклянную пробирку последовательно и быстро: 10 мкл раствора иода-125, 10 мкл хлорамина-Т, 20 мкл раствора антител.
Пробирку хорошо встряхнуть и инкубировать 15 с — 2 мин. Добавить 25 мкл тирозина, 50 мкл 1 %-ного,БСА-ФСР и 200 мкл ФСР.
С помощью пастеровской пипетки осторожно перенести полученную смесь на колонку, приготовленную согласно этапам 1—6.
Нанести три раза по 0,2 мл ФСР, затем еще 0,5 мл ФСР.
Элюат отбросить.
Нанести 1,5 мл ФСР. Собрать элюат, содержащий меченый белок.
Развести 10 мкл раствора меченых антител в 1 мл ФСР и отобрать из полученного разведения 10 мкл для просчета на •у-спектрометре. При стандартной процедуре следует ожидать счета порядка 5 • 105 импульсов в минуту на 1 мкл колоночного элюата.
Разлить по маленьким порциям и хранить при —20°С. Полученный препарат можно использовать в течение 1—2 мес.
Перед началом проведения РИМ производят сенсибилизацию'
планшетов антигеном. Для белковых антигенов процедуру выполняют следующим образом:
Материалы:
ФСР; раствор белкового антигена: 20—100 мкг/мл в ФСР, содержащий 5 мМ ЭДТА, 0,1%-ный раствор азида натрия; БСА-ФСР: 10% БСА в ФСР; планшеты для микротитрования: специальные 96-луночные планшеты для микротитрования из поливинилхлорида:
Методика.
Внести по 50 мкл раствора антигена в лунки планшет.
Инкубировать планшеты в течение ночи при 4°С.
Удалить раствор антигена. Этот раствор можно собрать и использовать повторно два-три раза, предварительно проверив его активность.
Заполнить лунки БСА-ФСР и инкубировать планшеты при комнатной температуре 3—4 ч. На этой стадии планшеты можно хранить при 4°С до одной недели.
Удалить БСА-ФСР.
Раствор БСА используется так же, как и Твин-20, для уменьшения неспецифической сорбции белков.
Проведение РИМ с целью выявления антител в культуральных жидкостях осуществляют следующим образом (G. Galfre, С. Milstein, 1981).
Материалы;
ФСР-10% СПК: ФСР, содержащий 10% СПК (или 1% БСА) и 0,1% азида натрия; меченные иодом-125 вторичные антитела (приготовленные, как описано выше, и разведенные до 5 • 104 имп/мин • 50 мкл); планшеты для микротитрования, сенсибилизированные антигеном; вставка для центрифугирования планшетов (используется для центрифугирования в охлаждаемой центрифуге антигена, плохо связывающегося с дном лунок, например клеток); резак из горячей проволоки (приспособление, содержащее вольфрамовую нить, нагреваемую электрическим током регулируемой силы. Используется для разрезания гибких планшетов на отдельные лунки).
Методика.
Сенсибилизируют планшеты как описано выше. При использовании в качестве антигена клеток их суспендируют в ФСР-СПК и вносят в каждую лунку по 50 мкл суспензии, содержащей от 5 • 103 до 6 • 104 клеток.
2. Добавляют в лунки по 50 мкл исследуемых культуральных жидкостей. Необходимо поставить отрицательный контроль, используя только среду культивирования. Желательно поставить и положительный контроль с применением либо сыворотки иммунных животных, либо ранее проверенного раствора антител.
Перемешать содержимое лунок с помощью встряхивателя планшетов (10 с).
Закрыть планшеты и поставить инкубироваться при 4°С на 45—60 мин.
Отмыть лунки: а) при использовании покрытых растворимым антигеном планшетов заполнить каждую лунку 150 мкл ФСР-10% СПК и удалить содержимое, перевернув планшет и
встряхнув его, после чего энергично потрясти его над раковиной. Повторить процедуру два раза; б) для отмывания лунок, содержащих клетки, планшеты центрифугируют при 4°С 5 мин при 400g. Жидкость удалрют отсасыванием.
Добавить 50 мкл меченых вторичных антител.
Закрыть планшет и поставить на встряхиватель на 10 с.
Инкубировать при 4ЬС 45—60 мин.
Отмыть планшеты, как описано выше, добавив по крайней мере один добавочный цикл отмывки.
Высушить планшет в суховоздушном термостате при 37°С и разрезать его на отдельные лунки, пользуясь резаком из горячей проволоки. Чтобы не перепутать лунки, целесообразно применить липкую ленту, приклеенную со стороны дна планшета.
Пользуясь пинцетом, перенести лунки во флаконы для счета радиоактивности.
$ 8. Массовая наработка моноклональных антител
После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие исследователя антитела, можно приступить к их массовому наращиванию с целью получения больших количеств моноклональных антител. В начале культивирования гибридомные клетки могут расти медленно и плохо переносить низкую плотность посева. В связи с этим при пересеве клеток их надо разводить не более чем в 3—5 раз. Ускорению роста клеток может способствовать добавление клеток питающего слоя. Гибридомные клетки необходимо поддерживать в логарифмической фазе роста и избегать превышения концентрации клеток выше 0,5 млн/мл. Клетки можно культивировать как в стационарной культуре, так и в роллерной, а также в различного рода культиваторах (ферментерах).
Для получения максимальной продукции моноклональных антител клеткам позволяют расти до предельной плотности. В такой культуре через определенное время наблюдается гибель гибридомных клеток. Надосадочная жидкость собирается, а клеточный осадок отбрасывается, т. е. не пытаются культивировать дальше оставшиеся в живых клетки.
При обычных методах культивирования концентрация антител в культуральной жидкости лежит в пределах 10—100 мкг/мл. Более высокие концентрации удается получить в ферментерах при использовании сред с низким содержанием СПК и добавлением определенных препаратов [препараты приматон RL и плу- роник F-68; (S. Reuveny et al., 1986)] —до 660 мкг/мл. Важным направлением исследований является подбор бессывороточ- ных сред, применение которых значительно облегчает последующие этапы очистки моноклональных антител.
Для получения больших количеств антител вводят гибридомные клетки в организм животных и получают от них асцитную жидкость. Предварительно животным вводят агенты, повышаю-
щие способность гибридом расти в брюшной полости. В качестве такого агента чаще всего выступает пристан (2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекан)— 0,5 мл за 10—14 сут до введения клеток, однако можно вводить и неполный адъювант Фрейнда (U. Mueller, 1986). Асцитная жидкость в этом случае содержит антитела в более высокой концентрации и ее можно собирать несколько раз начиная с 14 сут после введения неполного адъюванта Фрейнда.
Вводимые гибридомные клетки и организм реципиента должны быть идентичны по антигенам гистосовместимости. Если слияние проводили между мышиной миеломой (линия Balb/C) и клетками селезенки мышей линии С57В1/6, то реципиентом должны быть гибриды этих линий — (Balb/CxC57Bl/6)Fi.
Гетерогибридомы, полученные слиянием клеток мышиной миеломы и лимфоцитов другого вида (человек, крыса), можно вводить мышам, у которых подавлена иммунологическая реактивность. Для этого либо используют бестимусных мышей nude, либо проводят предварительную обработку животных. Д. Вейссман и сотр. (1985) предлагают следующую схему подготовки мышей: животным вводят 0,5 мл пристана за 2—10 недель до опыта. За четыре дня перед введением гибридомных клеток животные получают внутримышечно 3 мг гидрокортизонацетата, затем через два дня их облучают в дозе 6 Гр. Гибридомные клетки вводят внутрибрюшинно в дозе 10 клеток. На таких животных получается хороший рост гетерогибридом. Однако ксеногибридо- мы (например, гибриды и миеломных и селезеночных клеток крысы) на таких животных не растут. Для преодоления трансплантационного барьера авторы предложили проводить вторую гибридизацию, сливая крысиные гибридные клоны с миеломными клетками мыши. Используя уабаин-резистентный вариант клеток SP2/o, авторы смогли изолировать новые гибридные клетки на среде ГАТ + уабаин. Полученные гибридомы обладали способностью расти на иммунодепрессированных мышах.
роток, специфических к отдельным классам и подклассам антител. Эти антисыворотки производятся многими фирмами.
Выделение чистых антител лучше всего проводить на иммуносорбентах, представляющих собой ковалентно сшитый с каким- либо носителем антиген. Обычно носителем служит сефароза. Иммуносорбентом являются также и фиксированные клетки — их применяют для выделения антител к антигенам клеточной поверхности. При этом методе, однако, есть опасность, что при фиксации изменяется антигенная структура клеточной поверхности.
Если не удается выделить антитела прямым способом, то получают иммуноглобулиновую фракцию с помощью различных методов аффинной и ионообменной хроматографии. Наиболее простым методом является хроматография на сефарозе с пришитым ковалентно белком А. Белок А — продукт бактериальных клеток (Staphylococcus aureus), обладающий высоким сродством к Ес фрагменту антител. На такой колонке можно очистить IgG мыши (подклассов IgG2a, IgG2b, IgG3). Недавно предложен метод с использованием другого белка бактериального происхождения — белка G (из стрептококков группы G, штамм G-148) (В. Akerstrom et al., 1985), который имеет более широкий спектр связывания иммуноглобулинов, в том числе взаимодействует с иммуноглобулинами крысы, которые почти не образуют комплексы с белком А.
10. Моноклональные антитела человека
Моноклональные антитела находят очень широкое применение, в том числе для диагностики и терапии различных заболеваний человека. Например, антитела против опухолевых антигенов, сшитые с токсинами (иммунотоксины), могут быть применены для селективного убивания опухолевых клеток в организме человека. Такие антитела несложно получить, используя для иммунизации мышей или крыс и последующее конструирование гибридом. Однако употребление этих антител очень ограничено, так как при их введении в организм человека (особенно повторном) возникают реакции на гетерологичный белок. Поэтому крайне желательно получать моноклональные антитела человека.
Человек не может служить экспериментальной моделью, и поэтому обычные способы получения антител (т. е. с использованием активной иммунизации) невозможны. В связи с этим одним из направлений исследований является разработка способов иммунизации вне организма. Уже имеются сообщения об успешной иммунизации против ряда антигенов, проведенные полностью in vitro (N. Yamaura и сотр., 1985; М. Но и сотр., 1985).
Другой сложностью является сама техника получения стабильных антителообразующих линий человека. В настоящее время для получения моноклональных антител применяют несколь-
ко подходов: а) обработка В-лимфоцитов человека вирусом Эпштейна—Барр; б) гибридизация с миеломными клетками; в) комбинация этих двух методов.
Вирус Эпштейна—Барр является лимфоцитотропным вирусом. Он проникает в клетки, адсорбируясь на рецепторе C3d компонента комплемента. Вирус трансформирует клетки, в результате чего у них появляется способность бесконечно размножаться в культуре, при этом сохраняется продукция Ig, преимущественно IgM класса.
Гибридомы человека получают аналогично гибридомам мыши. В большинстве случаев сливают с помощью ПЭГ активированные В-клетки либо с миеломными клетками, дефективными по ГГФРТ, либо с клетками, у которых нет этого дефекта, применяя в данном случае селективную среду с диэтилпирокарбонатом. Для индукции слияния некоторые исследователи используют электрический разряд.
Гибридомы человека секретируют очень низкий уровень антител (50 нг — 10 мкг/мл) в основном IgM класса. Это может быть связано с особенностями родительских миеломных линий человека, выбранных для слияния. Имеющиеся в настоящее время линии человека не являются истинными плазматическими клетками, как в случае миелом мыши, а принадлежат скорее всего к менее дифференцированным лимфобластоидным клеткам.
Вероятно, наиболее перспективным подходом к получению моноклональных антител служит комбинация методов трансформации клеток под действием вируса Эпштейна — Барр с соматической гибридизацией клеток (см. N. Chiorazzi, 1986). В этом случае первоначально В-лимфоциты человека стимулируют вирусом Эпштейна—Барр, затем выделяются культуры, продуцирующие антитела нужной специфичности, и клетки этих культур гиб- ридизуются с родительскими линиями, имеющими два маркера: дефект по ГГФРТ и резистивность к уабаину. Полученные в результате гибридные клоны более стабильны и характеризуются более высоким уровнем продукции антител.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время создается новое биотехнологическое направление с использованием свободноживущих клеток многоклеточных организмов для получения ценных физиологически активных соединений, используемых в медицине и народном хозяйстве. Одна из задач этой новой области — разработка методов, способов, приемов клеточной инженерии, что может способствовать созданию новых форм продуцентов или формированию принципиально новых способов их культивирования.
В настоящей книге нашли отражение разные стороны исследований в области клеточной инженерии растительных и животных клеток. Одна из задач клеточной инженерии, как это следует из представленного в книге экспериментального материала, состоит в создании клеточных систем с новыми свойствами на основе клеточных взаимодействий. Были приведены примеры экспериментальных решений этих задач, известных в мировой литературе, а также полученных на кафедре клеточной физиологии и иммунологии МГУ им. М. В. Ломоносова. Так, в проводимых на кафедре работах по клеточной инженерии с растительными объектами и микроорганизмами выявлено большое число видов, способных формировать искусственные ассоциации разного типа. Во многих случаях продемонстрировано улучшение ростовых и биосинтетических параметров культивируемых клеток (тканей) в присутствии микроорганизмов и способность их к регенерации растений. Растения при этом способны включать клетки микроорганизмов в свои ткани и иногда — в клетки, получая выгоду от присутствия симбионта при дефиците источников питания. Все это представляет интерес с■точки зрения перспективы использования метода смешанного культивирования на основе растительных клеток в биотехнологии с целью, во-первых, поиска новых субстратов для промышленного получения биомассы культивируемых растительных клеток и удешевления производства на их основе экономически важных продуктов и, во-вторых, получения устойчивых ассоциаций растений-регенерантов с азот- фиксирующими организмами, обеспечивающими рост растений при дефиците минерального азота.
Выполняемая на кафедре работа по гибридомной технологии связана с совершенствованием методов иммунизации вне орга-
низма и изучением механизмов активации В-лимфоцитов. Это особенно важно для получения моноклональных антител человека.
Изложенный в книге материал не претендует на исчерпывающее описание тех технологий, которые уже созданы или могут быть созданы на основе культивируемых клеток. Более того, в ряде случаев (гл. 1—3) акценты несомненно перенесены на биологическую характеристику самих этих новых экспериментально созданных биообъектов, а также на^описание методов, применяемых для выращивания и манипулирования с ними. Такой подход представляется важным для введения читателя в эту новую область ориентированного на практику исследования. Для настоящего этапа рассматриваемого направления работ характерен эмпирический подход в постановке экспериментов по конструированию новых клеток и клеточных систем. Однако накопленный экспериментальный материал создает уже теперь хорошую основу для перехода к целенаправленному, прогнозируемому подбору объектов и способов клеточного конструирования.
Одним из условий дальнейших успехов на пути получения клеток и клеточных систем с новыми свойствами является углубление знаний, касающихся фундаментальных основ биологии: механизмов регуляции процесса клеточной дифференциации, физиологии протопластов как объекта биологической трансформации клеток, взаимоотношений клеточных органелл. Следовательно, прогресс в развитии клеточной инженерии и использовании получаемых с ее помощью новых, создаваемых искусственным путем биологических объектов будет в значительной степени определяться успехами в области клеточной биологии и клеточной физиологии.
ЛИТЕРАТУРА
Глава 1.
Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. — М.: Наука, 1964.
Бутенко Р. Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений. — М.: Наука, 1975.
Бутенко Р. Г. Выращивание клеток высших растений в суспензионной культуре // Известия АН СССР. 1977. № 5. С. 697—709.
Культура клеток растений. — М.: Наука, 1981.
Культура клеток растений и биотехнология. — М.: Наука, 1986.
Глава 2.
Бутенко Р. Г Гибридизация соматических клеток. Молекулярные механизмы генетических процессов. — М. Наука. 1979. С. 43—88.
Бутенко Р. Г Перспективы использования культивируемых клеток растений в биотехнологии. Биотехнология. — М.: Наука, 1984. С 139—147
Бутенко Р. Г„ Кучко А А. Физиологические аспекты получения, культивирования и гибридизации изолированных протопластов картофеля // Физиология растений. 1979. Т. 26. Вып. 5. С. ПО.
Глеба Ю. Ю., Сытник К. М. Клеточная инженерия растений. — Киев: Науко- ва думка, 1984. 160 с.
Cocking Е. С., Evans Р. К. The Isolation of Protoplasts. Plant Tissue and Cell Culture. Ed. Street H. E., Oxford, 1973, p. 100—120.
Nagata T. Fusion of Somaric Cells. Cell interact Berlin e a., 1984, p. 491 — 507.
Plant Protpplats. Ed Giles K. L. Intern. Rev Cytol V. 16 suppl. N-Y—L., 1983.
Rao P. S. Protoplast culture Exp. Embryol. vascular Plant Berlin e. a., 1982, p. 231—262.
Глава 3.
Бутенко P. Г. Перспективы использования культивируемых клеток растений в биотехнологии. Биотехнология. — М.: Наука. 1984. С. 239—247.
Корженевская Т. Г., Бутенко Р. Г., Гусев М. В. Ассоциации цианобактерий с культивируемыми клетками н тканями высших растений // Сб. Культура клеток растений и биотехнология. — М.: Наука, 1986. С- 225 — 242.
Юркова Г. Н„ Левенко Б. А. Искусственные симбиотические азотфиксирую- щие системы. Молекулярная биология. — Киев: Наукова думка, 1978. В. 19. С. 63—77.
Fowke L. С , Gamborg О L Applications of Protoplasts to the Study of Plant Cells. Int. Rev. Cytol , I960 V 68, p. 9—51.
Giles К- L, Vasil I. K. Nitrogen Fixation and Plant Tissue Culture. Int. Rev. Cvtol . 1980. V. suppl. 11B, p. 8199.
Stewart W. D. P., Powell P., RaiA.N. Cyanobacteria-Eukaryotic Plant Sym- bioses. Ann. Microbiol (Inst. Pasteur), 1983. V. 134 B, p. 205—228.
Глава 4.
Моноклональные антитела//Гибридомы: новый уровень биологического анализа / Под ред. Р. Г. Кеннета, Т. Дж. Мак-Керна, К. Б. Бехтол. — М.: Медицина, 1983.
Fazekas de St. Groth, S., Scheidegger, D. Production of monoclonal Antibodies: Strategy and Tactics. — J. of Immunol. Methods, 1980. V. 35, p. 1—21.
Galfre, G., Milstein C. Preparation of Monoclonal Antibodies, Strategies and Procedures. In “Methods in Enzymology”. N-Y., 1981. V. 73, p. 3—45.
Coding I. L. Antibody Production by Hybridomas. — J. of Immunol. Methods, 1980. V. 39, p. 285—308.
O’Hare M. J. Monoclonal Antibodies of Murine and Human Origin: their generation, Characterization and Use. — In “Immunogenetics". Ed. by G. S. Pa- nayi, C. S. David, Butterworth, London, 1984, p. 296—399.
Westerwoudt R. J. Improved fusion Methods. IV. Technical Aspects. — J. of Immunol. Methods, 1985. V. 77, p. 181 —196.
ПРЕДМЕТНЫЙ
УКАЗАТЕЛЬ
Антитела 6, 89, 90
— гомогенные 90
— моноклональные 6, 7, 8, 90, 91, 96, 97, 122
массовая наработка 117
получение 6
.сыворотки поликлональные, сопоставление свойств 91
человека 119
— очистка 118
Ассоциации 52, 73, 77, 85—87
— внутриклеточные 52
— искусственные 52, 53, 55, 60, 62, 65, 67, 84, 86—88
азотфиксирующие 76
и цианобактерии 67—69, 73
— межклеточные 52
— партнеры 57, 61
— с азотфиксирующими свободно- живущими бактериями 64
— с грибами 66
— с зеленой водорослью 66
— с клубеньковыми бактериями 61
— цели создания 53, 61
Биологическое конструирование 51
Биотрансформация 26
Время генерации клетки 8
— удвоения популяции 8
Выбор экспериментального животного 99
Гибрид 46, 48
— соматический 48
Гибридизация соматическая 46—48
схемы 48
Гибридомная техника 6, 7, 95, 96
— технология 121
Гибридомы 90, 92, 95, 97, 98, 100—103.
106, НО, 119, 120
— культивирование 98
приготовление компонент сред 98 методы получения 91
Гибридомные клетки 96, 100, 104, 117
клонирование 109
Дедифференцировка 13—17
— клеток экспланта 14
Дифференциация 8, 122
— эмбрионов 41
Дифференцировка 8, 25, 28, 103
Иммунизация 89
— способы 100—104
— схема 102
Иммунная система 89
Иммунный ответ 89
Инокулюм (трансплант) 8
Каллус 8, 11, 15, 38, 46, 47, 50, 62, 64, 66, 77—80, 84—86, 88
— первичный 14,15, 17
Каллусная ткань 19, 21—23, 26
Каллусогенез 13, 14
Клетки 5, 7
— биологическая трансформация 122
— гибридомные 92, 95, 100, 108, 109
— животных и растений 5
гибридизация 5
культивируемые 7
— замораживание 110
каллусные 13, 14, 18. 20. 28
характеристика 18
— культивируемые 5, 7, 10
— миеломные 92, 94, 96, 99, 108, 118
подготовка 104
питающего слоя 105
— популяция 9
— размораживание 111
—"растений культивирование 18
состав питательных сред 18
на искусственных питательных средах 7
повышение продуктивности культур 53, 54
— слияние 107
— соматические 5, 7, 42, 46
гибридизация 7, 5, 43, 46, 48
методы гибридизации 5, 12
— тканевые 5
Клеточная инженерия 5, 52, 121
— селекция 8, 13
Клеточная технология 6
Клеточное конструирование 7
путем гибридизации 7
Клеточные контакты 70
— органеллы 49
перенос 49
— системы 67, 121, 122
конструирование 67, 122
— суспензии 104
получение 104
приготовление сред для культи вироваиия 104
Клонирование 104, НО
Клоповая селекция 28
Клоны 8, 27, 29, 89, 90, 96, 101, 109, ПО
Кондиционирование среды 106
Конструирование биологическое 5
— отдельных клеток 27
— способы 5
Культура каллуса 29, 35
— клеток 5, 7, 8, 26, 76, 97
животных 7
пересадочная 13
тканей и органов растений 11
—методы И
история развития 11
13
меристем 12
опухолевых тканей 9
— отдельных клеток 9
— смешанная 73, 75, 77—79, 86, 88
биосинтетическая активность 73
— суспеизиониая 21, 65
— эксплаитов 9
Линии 9, 26, 94, 95, 104, 105
— гибридные 28
— миеломных клеток 94, 95. 99
— мутантные 28, 49
родительские 94
трансформированные 28
Метаболизм 26
первичный и вторичный 26
Метод(ы) выявления антител 111
иммунизации 121
иммунологические 89
— иммуиоферментный 112, 113
— «кормящего слоя* 29
— культуры клеток 10, 11
мутагенеза и клеточной селекции 13
радиоиммунологический 115
скрининга биохимических мутантов 13
— «ткани-ияньки* 29
Механизмы проникновения микроорганизмов в протопласты 58
Мутагенез 13
Продукты поглощения и слияния 60
характеристика 60
Пролифиративная способность клеток.
возникших из протопластов 41, 42
Протопласты 5, 7, 30, 34, 35, 36, 41, 42. 44—47, 49, 51, 52, 57—60, 122 — изолированные 5, 7, 8, 28, 57 введение микроорганизмов 58 высших растений 7 культивирование 8 — растительных клеток 5 — слияние 9, 42 механизм 44 способы индукции 42 — способы выделения 30, 35 метод флотации 35 механические 30 энзиматические 31 —— культивирования 36 — условия культивирования 37
Растения направленное изменение 52
Растения-регенеранты 121 Редиффереициация 9 Регенеранты 79, 80, 84 — первого поколения 79 Ростовой цикл 9
Селективная среда 92, 93
Системы ассоциативные 5, 6 экспериментальные 6 Слияние 107
Сомаклональные вариации и варианты 9
Соматическая гибридизация 9
Субкультивирование 9, 17, 23, 65, 79, 88
Суспензии клеток 106
приготовление 106
Суспензионная культура 23, 75 ростовой цикл 24, 25 Сыворотки поликлональные 90
Ткани-няньки 9
Тотипотентность 9
живой клетки растения 11
Фитогормоны (ауксин, цитокинин) 15
Цианобактерии 57, 67—80, 84—87 — введение в растения 76 — передача продуктов фотосинтеза 71, 72
продукты лизиса 72, 73 Цибрид 46
Цикл выращивания 9
Штамм 9
Эксплант 9, 14, 17
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие 5
Введение 7
Глава 1. Культура клетоквысших растений 10
Об истории развития метода культуры клеток тканей и органов растений 11
Дедифференцировка и каллусогенез как основа создания пересадочных клеточных культур 13
Некоторые цитоморфологические ифизиологическиехарактеристики
каллусных клеток, культивируемых поверхностно........18
Глубинное культивирование клетокрастенийвжидкойпитательной
среде (суспензионные культуры)21
Культивирование отдельных клеток27
Глава 2. Протопласты растительных клеток как объект биологического конструирования30
Получение протопластовзо
Культивирование протопластов36
Слияние протопластов42
Гибридизация соматических клеток46
Перенос клеточных органелл .49
Глава 3. Создание искусственных ассоциаций культивируемых клеток высших растений с микроорганизмами52
Искусственные ассоциации с микроорганизмами как способ модификации растительной клетки и растения52
Введение микроорганизмов в изолированные протопласты растений . .57
Введение микроорганизмов в популяции культивируемых клеток расте
ний 61
Цианобактерии в экспериментах по получению искусственных ассоциаций 67
Глава 4. Методы получения моноклональных антител89
История создания метода89
Подготовительные этапы перед проведением слияния96
Приготовление сред для культивирования и получение клеточных суспензий Ю4
Слияние107
Клонирование гибридомиых клеток109
Замораживание и оттаивание гибридомиых клеток110
Методы выявления антител, синтезируемых гибридомными клетками . Ш
Массовая наработка моноклональных антител117
Очистка антител118
Моноклональные антитела человека119
Заключение121
Литература 123
Предметный указатель125
Учебное издание
БИОТЕХНОЛОГИЯ. В 8-ми кн.
Рейсе Георгиевне Бутенко Михаил Викторович Гусев Алексей Федорович Киркин Тамара Георгиевна Корженевская Елизавета Николаевна Маркарова
КНИГА 3. КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
Зав. редакцией А. Г. Гаврилов
Редактор М. М. Пенкина
Мл. редакторы И. М. Павлова и Е. И. Попова
Художник С. Ю. Вериченко
Художественный редактор Т. А. Коленкова
Техчический редактор Н. А. Битюкова Корректор С. К- Завьялова
ИБ № 6667
Изд. № Е-544. Сдано в набор 17.01.87. Подо, в печать 31.03.87. Т-04107. Формат 60Х90‘/16. Бум. кн.-журн. Гарнитура тайме. Печать офсетная. Тираж 30 000 экз. Зак. № 44. Цена 30 коп.
Издательство «Высшая школа», 101430, Москва, ГСП-4, Неглииная ул., д. 29/14.
Ярославский полиграфкомбинат Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. 150014. Ярославль, ул. Свободы, 97.
ПРОБЛЕМЫ
И ПЕРСПЕКТИВЫ
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
АВТОМАТИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
ПРОИЗВОДСТВО БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ
ПРОИЗВОДСТВО БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПРЕПАРАТОВ
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ
ФЕРМЕНТЫ
ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ
2 л смешанной культуры будут составлять 1 /2 МС и норму сахарозы, т. е. даже будут ниже, чем на получение 1 л монокультуры на полной среде. Для получения 2 л смешанной культуры следует провести 2 цикла выращивания (т. е. 2 раза по 2 сут); в этом случае получим 3-кратную экономию во времени культивирования при несколько меньших затратах на производство такого же количества алкалоидов, что и в монокультуре (на 12-е сут).
Рассчитанная таким образом экономия сырья на производство единицы продукции, очевидно, может -иметь значение для крупномасштабных производств и давать высокий экономический эффект. С другой стороны, системы с высоким выходом продукта в ранние сроки культивирования могут быть рентабельны в непрерывном режиме культивирования, внедрение которого составляет одну из главных задач биотехнологии.
Введение цианобактерий в растения. Искусственные азот- фнксирующие ассоциации. Введение цианобактерий в побеги табака. Все попытки вводить цианобактерии непосредственно в побеги размножаемых черенками растений табака были неудачны. 1. При высаживании черенков в жидкую или агаризованную среду МС с азотфиксирующей A. variabilis цианобактерии не проникали в растение ни через поверхности среза, ни через вновь формирующуюся корневую систему. 2. Они не приживались на поверхности побегов и не проникали в ткани в местах поранения. 3. Эти микроорганизмы не распространялись по стеблю побега, если их вводили инъекцией с помощью шприца в стебель. В последних двух случаях цианобактерии на поверхности растений не выживали и спустя некоторое время деградировали. В растении в ответ на поранение образовывался каллус, причем в каллусе цианобактерии приживались. Это заставило применить другой способ введения цианобактерий в растения, включающий в ка-
5 9. Очистка антител
Для многих целей не требуется очистка антител, и они используются в виде культуральных жидкостей или асцитных
к
^женевская
Ларкарова
тт1ЕТОЧИАЯ
т
т
ушоооинэюпд^
в8-ми книгах
BUDTEHHOnorUFI
Под редакцией НС Егорова ВДСамуилова
Р Г Бутенко МВ. Гусев АФ Киркин Т. Г Корженевская ЕНМаркарова
КЛЕТОЧНАЯ
ИНЖЕНЕРИЯ
Москва «Высшая школа» 1987
BbK 30.6
Б63 УДК 574.6
Рецензенты:
кафедра микробиологии и общей иммунологии (зав. кафедрой проф. А. Е. Вершигора), кафедра физиологии растений (зав. кафедрой проф. А. В. Капля) Киевского государственного университета им. Т. Г. Шевченко и д-р биол. наук, проф. Б. В. Громов (Ленинградский государственный университет им. А. А. Жданова)
Допущено Министерством высшего и среднего специального образования СССР в качестве учебного пособия для студентов биологических специальностей высших учебных заведений.
Биотехнология. Учеб, пособие для вузов. В 8 кн./Под Б63 ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн. 3: Клеточная ин- женерия/Р. Г. Бутенко, М. В. Гусев, А. Ф. Киркин и др. — М.: Высш, шк., 1987. — 127 с.: ил.
Обсуждены разные приемы клеточно-инженерной технологии на растительных, животных и бактериальных клетках. Рассмотрены проблемы модификации протопластов и соматической гибридизации клеток растений, способы получе ния гибридов и методы идентификации и выделения ассоциаций клеток высших растений с микроорганизмами.
2910000000(4309000000) —255
001(01)—87
225—87
ББК 30.6 4-28.07
© Издательство «Высшая школа», 1987