Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
Предисловие
Фундаментальная подготовка студентов-биохимиков обязательно подразумевает овладение методами ферментативной кинетики. Измерение скоростей реакций, катализируемых ферментами, позволяет определить, как быстро происходит превращение данного субстрата в продукт или образование и исчезновение того или иного промежуточного соединения. Вместе с тем кинетические методы широко используются для установления молекулярного механизма ферментативных реакций.
С середины 70-х годов за рубежом почти одновременно было издано несколько книг по ферментативной кинетике: J. T.-F. Wog. Kinetics of enzyme mechanisms (1975); H. J. Fromm. Initial rate enzyme kinetics (1975); /. H. Segel. Enzyme kinetics (1975); A. Cornish-Bowden. Principles of enzyme kinetics (1976); D. V. Ro- beits. Enzyme kinetics (1977); L. Endrenyi. Kinetic data analysis (1981). В этот же период на русском языке вышли в свет монография Б. И. Курганова «Аллостерические ферменты» (1978) и перевод книги Э. Корниш-Боуден «Основы ферментативной кинетики» (1979). Большие разделы посвящены ферментативной кинетике в трехтомном издании «Ферменты» М. Диксона и Э. Уэбба (1982).
В этих книгах отражены успехи в изучении кинетических механизмов сложных ферментативных процессов, в разработке правил вывода уравнений стационарной скорости, в анализе кинетики действия аллостерических и многокомпонентных ферментных систем. В последние годы особенно большое внимание стали уделять отклонениям от линейности различных графиков — двойных обратных величин, и от v/S, S/v от S и других, в которых обычно принято представлять кинетические данные для определения параметров Кт и Vmax. Все больше наблюдается случаев, когда в уравнение скорости реакции необходимо вводить концентрационные члены в квадрате и высших степенях. Однако даже в одном из самых поздних изданий («Ферменты» М. Диксона и Э. Уэбба) подобные примеры рассмотрены в разделе «Особые случаи стационарной кинетики», хотя есть основания считать, что отклонения от кинетики Михаэлиса — Ментен являются скорее правилом, чем исключением. В данной книге авторы попытались изложить основные прин-
ципы анализа дробно-рациональных функций п-го порядка, условно объединяя эти методы под названием «Нелинейная кинетика».
Введение и гл. 1 и 2 являются как бы вступлением к основному материалу, они помогут читателю вспомнить основные сведения о мембранном транспорте, кинетических схемах ферментативных реакций и традиционных способах анализа уравнений скорости. При этом предполагается, что читатель уже знаком с некоторым материалом по энзимологии, в частности с книгой Э. Корниш-Боуден «Основы ферментативной кинетики». По этой причине многие понятия вводятся без детального обсуждения. В гл. 3 более подробно представлен анализ дробно-рациональных функций в координатах, обычно применяемых в кинетике. В основу этой главы положены работы У. Бэрдсли и его коллег из Манчестерского университета, поэтому в тексте сохранены оригинальные символы и обозначения, чтобы заинтересованный читатель мог разобраться в исходных публикациях.
В гл. 4 вводится новая система координат, основанная на степенном преобразовании переменных. И хотя многие ранее применяющиеся координаты также являются частным случаем степенного преобразования, исследование системы преобразования в общем виде оказалось полезным для разработки нового метода определения степенных параметров уравнения скорости. Применение этого метода показано на примере Na, К-АТФазы в гл. 5 и 6. Авторы максимально сократили количество специальных экспериментальных данных по Na, К-АТФазе и привели только материал, необходимый для иллюстрации логики построения кинетической схемы работы фермента. Насколько это удалось — судить читателю. Авторы надеются, что недостатки изложения не помешают получить представление о возможностях ферментативной кинетики в расшифровке механизма действия мембранных транспортных ферментов, и заранее благодарны за все критические замечания и пожелания.
Авторы
Введение
Классификация биологических мембран и их функций
Все клетки окружены мембранами. Кроме того, во многих из них, и прежде всего в эукариотических клетках, существует обширная сеть внутриклеточных мембранных систем. Согласованная работа мембранных механизмов клетки — рецепторов, ферментных комплексов и каналообразователей в значительной мере определяет способность клетки поддерживать свой гомеостаз и вместе с тем тонко реагировать как на факторы внешней среды, так и на изменения в других системах данного организма.
Биологические мембраны представляют собой строго организованные структуры, которые разделяют две различные фазы и одновременно определяют условия их взаимосуществования. Они не являются статическими барьерами, а активно взаимодействуют с окружающей средой, Даже простое перечисление функций мембран показывает, насколько разнообразна работа этих структур. К основным функциям мембраны можно отнести следующие.
Реагирование на изменение внешней среды и передача информации в клетку, осуществляющиеся через активацию специальных рецепторов, что, со своей стороны, приводит к повышению концентрации внутриклеточных сигнальных веществ, регулирующих метаболизм клетки.
Разделение клеточного объема на отдельные отсеки — ком* партментализация, что позволяет протекать одновременно в клетке реакциям, противоположным по направлению; при этом работа разных компартментов тонко регулируется.
Обеспечение межклеточных контактов с помощью специальных структур и механизмов; мембраны играют важную роль в подвижности микроорганизмов.
Контроль за внутриклеточным содержимым с использованием специальных транспортных систем. При этом происходит выброс из клетки некоторых веществ (в основном продуктов метаболизма) и накопление других, в том числе субстратов метаболизма. К этой функции обеспечения метаболизма клетки нужными веще-
ствами примыкает и барьерная функция мембран, позволяющая клетке сохранять свое содержимое и защищаться от проникновения посторонних или вредных реагентов.
Превращение одного вида энергии в другой, например энергии электрохимического градиента в химическую (синтез АТФ), механическую (движение ресничек и жгутиков) или осмотическую. Правомерно поэтому рассматривать мембраны как биологические машины, причем коэффициент полезного действия таких систем бывает поразительно высоким.
Классифицируя мембраны по их основным функциям, следует отметить их большое разнообразие и по таким признакам, как происхождение и структура. Принято рассматривать в отдельности плазматические мембраны, ядерные мембраны, мембраны миелиновых оболочек, мембраны вирусов и бактерий, эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи, мембраны митохондрий, возбудимые мембраны и др. Основные функции мембран реализуются в этих структурах со специфическими особенностями. Исследование обширного круга вопросов по структуре и функции различных биологических мембран составляет предмет нового направления биологической науки — мембранологии, которая интенсивно развивается в последние десятилетия. В предлагаемой книге основное внимание уделено транспортной функции плазматических мембран и, в частности, кинетическому исследованию мембранных транспортных ферментов.
Транспорт веществ через биомембраны
Транспортные процессы в мембране принято характеризовать в первую очередь по признаку энергозависимости. Поэтому выделяют пассивный транспорт, т. е. перенос вещества по градиенту электрохимического потенциала, не связанный с затратой энергии, и активный транспорт — против градиента электрохимического потенциала, сопряженный с потреблением энергии. Отдельно рассматривают процесс цитоза, т. е. механизм переноса, связанный с изменением структурной целостности мембраны *.
Наличие трансмембранного градиента концентрации молекул различных веществ является движущей силой пассивного транспорта. Различают два типа пассивного транспорта — диффузию через каналы и диффузию, связанную с наличием специальных переносчиков в мембране. ■ ■
В процессе пассивного переноса веществ через каналы следует выделить: простую диффузию молекул, подчиняющуюся закону Фика (например, для молекул воды), и диффузию, ограниченную растворимостью веществ в липидах, зарядом и размерами молекул. Для ряда ионов существуют специфические каналы проницаемости,
См.: Глебов Р. Н. Эндоцитоз и экзоцитоз. — Сер. «Биохимия мембран»/Под ред. А. А. Болдырева. М., 1987.
8
обусловливающие их быстрое селективное проникновение через мембрану.
При описании процесса транспорта ионов через мембрану по специальному каналу, необходимо учитывать нелинейное изменение профиля потенциальной энергии переноса ионов. На отдельных участках внутри мембраны происходит изменение коэффициентов диффузии и коэффициентов распределения. Максимум свободной энергии соответствует удалению гидратных оболочек, окружающих ионы, а минимум — связыванию ионов с атомами кислорода в селективном фильтре и образованию относительно стабильного состояния. Перенос иона по каналу отличается такими особенностями, как взаимная конкуренция потоков различных ионов и рН-за- вйенмосты
Вместе с канальным механизмом транспорт различных молекул через мембрану может осуществляться и с помощью переносчика за счет диффузии переносчика вместе с веществом в мембране (подвижные переносчики). Примером такого действия являются ионофоры — валиномицин, нонактин, нигерицин, монензин, соединение Х-537А и др., повышающие проницаемость мембраны для ионов К+, Rb+, Cs+, Н+, Са2+. Перенос за счет «вращения» молекулы переносчика вокруг собственной оси (так называемый механизм карусели) в биологических мембранах, по-видимому, не реализуется, поскольку он предполагает вращение больших молекул белка в мембране, которая имеет достаточно высокую вязкость и сложную структурную организацию.
При активном транспорте молекулы растворенных веществ, перемещаются против электрохимического потенциала. Известно, что для переноса вещества из области низкой концентрации в область большей концентрации необходима энергия АТФ. Процессы активного транспорта, связанные с протеканием ферментативной реакции, в которых энергия АТФ непосредственно используется для переноса вещества против градиента, называют первично-активным транспортом. Этот процесс отличается от переноса веществ против градиента с помощью переносчиков, использующих при этом энергию уже существующего градиента другого вещества, чаще всего ионов Na. Такой процесс принято называть вторично-активным транспортом.
Описываемый сопряженный обменный перенос осуществляется с помощью белков-переносчиков, которые связывают одновременно субстрат и ионы Na и переносят вещество против градиента его концентрации за счет движения Na+ по градиенту. Некоторые переносчики сахаров выделены из плазматических мембран эритроцитов, бактерий, из слизистой кишечника. Переносчики обладают различными сродством и специфичностью. Некоторые аминокисло- сы могут переноситься разными (несколькими) переносчиками, а иногда один переносчик может переносить два-три разных соединения. Во всех случаях перенос зависит от величины ионного градиента.
К вторично-активному транспорту относят и процесс переноса
сахаров при участии фосфотрансферазной системы, которая широко распространена среди бактерий, но отсутствует у эукариот. Хорошо изучена у-глутамилтранспептидаза из клеток коркового вещества почки, одним субстратом которой является внутриклеточный глутатион, а другим — внеклеточные аминокислоты. Перенос сахарозы через мембрану щеточной каемки кишечного эпителия осуществляет ферментная система, расщепляющая сахарозу в процессе транспорта на составляющие моносахариды и др.
Типичным примером первично-активного транспорта является активный транспорт ионов, осуществляемый специальными пон- транспортирующими системами — транспортными АТФазами. Транспортные АТФазы классифицируют по переносимым ионам; это — Na, К-АТФаза, Са-АТФаза, анионная АТФаза и К, Н-АТФ- аза.
Na, К-АТФаза. Это — ферментная система, служащая созданию градиента Na+ и К+ путем выведения Na+ из клетки в среду и перемещения К+ из среды внутрь за счет энергии гидролиза АТФ. Na, К-АТФаза широко распространена у многих видов животных и во всех животных тканях, но активность фермента в разных органах Сильно варьирует. Наибольшая активность Na, К-АТФазы обнару- Зкивается в возбудимых и секреторных тканях: мозге, электрическом органе, почках, солевых железах и др.
• Гидролиз АТФ — сложная реакция, она состоит из различных этапов, в которых фермент претерпевает переход из одной формы в другую во время фосфорилирования и дефосфорилирования, образуя фосфорилированные интермедиаты с различными свойствами. В реакции необходимо участие ионов Mg, Na и К. Na, К-АТФаза специфически ингибируется сердечными гликозидами и в первую очередь уабаином (строфантином G). Ингибиторами являются также сульфгидрильные реагенты N-этилмалеимид, динитробен- зойная кислота, тимерозал, а также олигомицин и ванадат.
' Большое значение для нормального функционирования фермен- ta имеет липидное окружение Na, К-АТФазы. Делипидирование вызывает торможение его работы, в то время как добавление фосфолипидов восстанавливает активность. Микровязкость клеточных Мембран из-за изменений ионной силы, действия метаболитов и других факторов не является постоянной и может влиять на конформационное состояние фермента.
<;: Na, К-АТФаза представляет собой олигомерный комплекс, построенный в основном из субъединиц двух типов: а-липопротеина с молекулярной массой 90 000—130 000 и р-гликопротеина с молекулярной массой 35 000—57 000. Ряд исследователей отмечают присутствие низкомолекулярного протеолипида с молекулярной массой 10 000—15 000, называемого у-субъединицей, однако эта субъединица обнаруживается не во всех активных препаратах фермента. Для функциональной активности необходимо по меньшей мере наличие димера (ар)2, но каталитическую активность проявляет и белок в форме тетрамера (ар)4.
Са-АТФаза. Этот фермент создает градиент кальция на мембра-
не, осуществляя выброс Са+ из клетки в межклеточную среду . (Са-насос плазматических мембран), либо аккумулирует Са2+ из клеточного содержимого во внутриклеточное депо (Са-насос внутриклеточных мембран). Наиболее полно изучена Са-АТФаза из саркоплазматического ретикулума, а также сарколеммы и эритроцитов. Субстратом реакции является комплекс MgATФ, ионы Са2+ при малых концентрациях (0,1—10 мкМ) активируют, а при больших концентрациях ингибируют реакцию. Са-АТФаза не имеет такого специфического ингибитора, как уабаин, и не ингибируется олигомицином. Ее ингибируют рутениевый красный, SH-реагенты, ванадат. Мономер Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума состоит из одного полипептида с молекулярной массой 100000, а эритроцитов — из полипептида с молекулярной массой 150 000. Фермент может образовывать олигомерные структуры (по крайней мере, димеры), однако для осуществления транспортной функции достаточно наличия мономера. Фосфолипиды также необходимы для функционирования фермента, однако природа полярной головки фосфолипидов для Са-АТФазы более существенный фактор, чем для Na, К-АТФазы.
АТФазная активность, активируется двумя анионами — бикар-, бонатом и хлоридом, впервые была обнаружена в слизистой же», лудка; но она встречается и в других объектах: печени, почках, мозгу, эритроцитах, поджелудочной железе и др. В клетке аниончувствительная активность в основном локализована в митохондриях. Предполагают, что анионная АТФаза митохондрий идентична АТФазе, участвующей в окислительном фосфорилировании. АТФаза, обнаруживаемая во фракции плазматических мембран, отлична от митохондриальной по чувствительности к олигомицину, кверцетину, ауровертину D. Однако утверждать, что она транспортирует анионы через мембрану, пока нет оснований, так как показано, что анионы не активируют, а неспецифически ингибируют фермент, связываясь с анионным участком. Стехиометрическое отношение анионов к АТФ не установлено, и нельзя исключить загрязнений митохондриями фракций плазматических мембран.
Исследование аниончувствительной АТФазной активности в тенях эритроцитов, где исключено загрязнение митохондриями, показало, что эта активность сильно отличается от митохондриальной, не ингибируется тиоцианатом и почти нечувствительна к олигомицину. Однако оказалось также, что SITS-чувствительный перенос анионов ’, обнаруженный впервые в эритроцитах, а затем и в других объектах, не связан с АТФазной активностью и, по-видимому, является процессом вторично-активного транспорта, движимого градиентом Na+. Предполагают, что в плазматической мембране чувствительность к анионам проявляет Са-АТФаза.
К, Н-АТФаза. В микросомальных препаратах слизистой желудка животных обнаружен фермент — К, Н-АТФаза. Фермент высоко
специфичен по отношению к субстрату. Он гидролизует АТФ с высокой скоростью, причем этот процесс стимулируется ионами к+, ускоряющими распад фосфорилированного интермедиата реакции. К, Н-АТФаза нечувствительна к уабаину, ионам Na+ или бикарбонату и ингибируется сульфгидрильными реагентами. Предполагают, что фермент служит созданию высокой кислотности желудочного сока, транспортируя Н+ и К+ со стехиометрией 3,5 К+:4 Н+: I АТФ. В очищенных препаратах фермента обнаружены два полипептида с молекулярной массой 100 000 и 84 000. Для осуществления транспортной функции необходимо наличие, по крайней мере, их димера с молекулярной массой ~ 200 000. Как и для других транспортных АТФаз, для К, Н-АТФазы большое значение имеет липидное окружение и физико-химическое состояние бислоя.
Наряду с транспортом органических веществ и ионов (посредством специальных переносчиков и каналов) в клетке существует совершенно особый механизм — цитоз. С его помощью клетка может поглощать высокомолекулярные вещества типа белков, целые бактерии, а также выделять в среду синтезированные ферменты, нейромедиаторы и различные продукты метаболизма. Процесс ци- тоза является сложным и многоступенчатым. Его обычно рассматривают обособленно от других видов транспорта.
11
1
1
Как выводить уравнения стационарной скорости
Уравнение стационарной скорости
Исследование механизма ферментативной реакции кинетическими методами основано на изучении функциональной зависимости скорости реакции от различных факторов. Скорость реакции представляет собой функцию многих переменных: концентрации фермента и субстрата, pH, температуры, воздействия модификаторов и др. Обычно уравнение стационарной скорости вводят для случая, когда скорость можно считать функцией одного переменного. В самом деле, подобрав специальным образом условия протекания реакции, можно пренебречь влиянием различных факторов и параметров реакции (агрегация белковых молекул фермента, значительное накопление продуктов и т. д.).
В таких условиях начальную стационарную скорость для любого механизма ферментативной реакции всегда можно выразить как дробно-рациональную функцию одного переменного. Вышесказанное формулирует так называемая теорема стационарной кинетики; если в строго постоянных условиях изменяется только концентрация одного из субстратов (при полном отсутствии продуктов и концентрации фермента, много меньшей х), то после некоторого периода времени (в течение которого система настраивается) обязательно наступит стационарная фаза. Зависимость скорости реакции, катализируемой данным ферментом от концентрации субстрата, в этой фазе будет описываться дробно-рациональной функцией вида:
®-е„-^ .(1.1)
2М' 1-0
где х, at, pt, s и р— положительные величины, е0 — суммарная концентрация фермента.
Следует отметить, что теорема не применима к случаю, когда фермент претерпевает ассоциацию.
В теоретических исследованиях по кинетике сложных ферментных систем главным образом рассматривают зависимость скорости от концентрации субстрата. Однако значительный интерес вызывает изучение зависимости скорости реакции от концентрации других лигандов — активаторов и ингибиторов. По аналогии с вышеприведенной основной теоремой стационарной кинетики можно вывести уравнение зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации любого лиганда.
Действительно, используя метод Кинга — Альтмана (Е. King, С. Altmann, 1956), концентрацию любой формы фермента в стационарном состоянии всегда можно выразить в виде дроби, где числитель равен сумме произведений определенных констант реакции и концентраций соответствующих реагентов, а знаменатель — сумме всех возможных числителей, деленной на сумму концентраций всей форм фермента во. Следовательно, стационарную скорость, представляющую собой линейную комбинацию реакционно- п
способных форм фермента (2^а), всегда можно выразить через /=1
дробно-рациональную функцию следующего вида:
хп 2 ^^
v=eQ—/"°— ,(1.2)
i о
где s=n-Vm-VPt at и р, — постоянные коэффициенты, представляющие сумму произведений констант скорости при элементарных превращениях е^е,- слагаемые и множители в этих суммах определяются молекулярным механизмом ферментативной реакции. В отсутствие продуктов реакции эти коэффициенты всегда положительны, независимо от того, концентрация какого лиганда выбрана аргументом функции: субстрата, активатора или ингибитора.
Параметры уравнения п, т, р и s являются целыми числами, которые определенным образом (в зависимости от молекулярного механизма) отображают количество различных форм фермента и участков связывания лигандов. Параметры п, т и р могут принимать нулевое значение (но не одновременно), а максимальная степень числителя не может быть больше максимальной степени знаменателя: п-Vp^s, т. е. т^О.
Уравнение стационарной скорости в дальнейшем изложении будет характеризоваться степенными показателями, определяющими минимальную и максимальную степени числителя и знаменателя функции (1.2). Из четырех параметров п, т, р п s достаточно указать любые три, поскольку минимальная степень знаменателя всегда равна нулю. Следовательно, набор параметров п, р и т полностью может описать «вид» уравнения стационарной скорости и, как будет показано в следующих главах, во многом определяет форму соответствующих кинетических кривых. Следовательно, оп- 14
ределение степенных параметров и интерпретация их физического смысла имеет первостепенное значение для расшифровки молекулярного механизма ферментативной реакции.
Следует отметить, что если все формы фермента находятся в равновесии, то формула зависимости скорости от концентрации лиганда, выведенная методом быстрого равновесия, будет иметь аналогичный вид дробно-рациональной функции. Однако между уравнениями скорости, полученными на основе принципа стационарности или быстрого равновесия, несмотря на схожую математическую форму, существует принципиальное различие. Оно заключается в интерпретации физического смысла коэффициентов и показателей степени уравнения.
К интерпретации физического смысла параметров следует подходить с осторожностью. Только в случае параметра п в уравнении 1.2 это можно сделать относительно уверенно. Действительно, рассмотрим стационарную скорость ферментативной реакции, которую можно выразить через определители графа следующим образом:
2*А
где Di — определитель i-ro узла, ki— константы скорости образования продукта в i-м узле. Суммирование в знаменателе проводят по всем узлам основного графа, в числителе — по узлам, отвечающим формам фермента, из которых выделяется продукт. Определитель i-ro узла равен сумме всех деревьев (подграфов), направленных в этот узел.
Каждое дерево данного i-ro узла — один из вариантов совокупности ветвей, соединяющих все узлы без образования замкнутых циклов и направленных в i-й узел. Дерево представляет произведение тех констант скорости и концентраций лиганда, которые составляют ветви данного дерева.
*г/
А=2 V- k—nt
Допустим, что форма фермента, отображенная : i-м узле, имеет q связанных лигандов. Ясно, что минимальная степень определителя узла щ равна q, так как любой путь к i-му узлу должен содержать q ветвей связывания лиганда с данным i-м узлом. Параметр п представляет наименьшее значение среди наименьших степеней nt определителей узлов, представленных в числителе. Следовательно, его можно определить как число участков связывания лиганда, являющегося необходимым активатором, т. е. число участков, занятие которых необходимо для начала реакции. Заметим, что если лиганд не является необходимым активатором, то п=0. Если лиганд является субстратом, то для любого молекулярного механизма в зависимости o=f(s) параметр п равен единице и
уравнение (1.2) сводится к виду (1.1). В подавляющем большинстве случаев степенному параметру т можно дать физическую интерпретацию. Это сумма количества участков, которые в лиганд- связанном состоянии или образуют «тупиковые» отверстия, или характеризуются ингибицией типа «продукт — торможение».
Остальные степенные параметры не представляют количества участков связывания. Они имеют более сложный физический смысл. Так, например, s зависит от количества участков (но не равно ему); оно увеличивается по мере увеличения числа деревьев, ведущих в i-й узел; р и т представляют каталитически активные и неактивные формы фермента.
Некоторые приемы, облегчающие вывод уравнения стационарной скорости
Вывод уравнения стационарной скорости методом Кинга — Альтмана для сложных механизмов очень трудоемок, так как связан с отысканием большого числа деревьев. С целью упрощения вывода уравнения М. В. Волькенштейном и Б. Н. Гольдштейном (1966) был предложен ряд правил, основанных на теории графов. Ниже приведены некоторые из них.
Если для одной и той же пары форм фермента существует две или более стадий взаимопревращений, то, сложив константы скорости параллельных реакций, эти стадии можно объединить в одну.
В случае, если механизм реакции содержит различные формы фермента, обладающие идентичными свойствами, метод существенно упрощается (если рассматривать такие формы как одну). Это удобно, например, когда молекула содержит два идентичных активных центра.
Если основной граф состоит из обособленных частей, соприкасающихся в точках, соответствующих одной, общей для всех частей форме, то удобно анализировать эти части по отдельности.
Вывод уравнения стационарной скорости облегчается для механизмов, содержащих равновесные стадии. Для таких механизмов, согласно методу Ча (S. Cha, 1968), каждую группу форм фермента, находящихся в равновесии, можно рассматривать как единую форму; при этом каждая константа скорости kt снижается до величины fiki, где fi — доля реакционноспособных молекул в равновесной смеси.
Существование еще нескольких схематических методов для получения уравнения стационарной скорости (D. Fisher, A. Schulze, 1969; Fromm, 1970; В. Orsi, 1972) отражает тот большой интерес, который вызывает среди энзимологое решение проблем стационарной кинетики. Ниже приведено описание алгоритма, предложенного для вывода уравнения стационарной скорости и удобного для вывода как ручным способом, так и с помощью компьютера (К. Indge, R. Childs, 1976). Этот алгоритм можно считать распространением
метода Лэма и Приста (С. Lam, D. Priest, 1972), представляющих ферментативный механизм в виде ненаправленного связанного графа и получающих правильные выражения по Кингу — Альтману на основе применения алгебры Уонга (R. Duffin, 1959) и альфануме- рического умножения. Авторы прибегают к аналогичным манипуляциям, но с направленными графами (S. Seshu, М. Reed, 1961), т. е. для ферментативного механизма, как он обычно пишется.
В алгебре Уонга утверждается, что сумма или произведение идентичных констант равно нулю:
ххх=О для всех х
х4-х=0 для всех х
Альфанумерическое умножение предполагает просто соединение последовательно умножаемых элементов, например:
(12+34) (56 4- 78) =.1256 +1278 4- 3456 -j- 3478.
Для вывода уравнения стационарной скорости необходимо провести следующие операции: 1. Записать в графической форме механизм реакции, включая все константы скорости и обозначая все направления; 2. Выделить (очертить кругом) (п—1) узел, т. е. форм фермента, где п— число узлов в механизме. Конечный результат не зависит от пропускаемого узла, хотя правильный выбор такого узла может облегчить решение, исключая возможность возникновения циклов; 3. Выписать отдельно все константы, пересе-
кающие каждый из (п—1) узлов; 4. Выписать все комбинации пар констант, которые покидают каждый отдельный узел графа. Эти пары являются запрещенными комбинациями констант скорости; 5. Применяя алгебру Уонга и исключая запрещенные комбинации, перечисленные в п. 4, перемножим альфанумерически перечень, полученный в п. 3; 6. Результат операции п. 5 является знаменателем уравнения скорости, который рассортирован по каждому узлу, т. е. по выражению или определителю для каждой формы фермента; 7. Группирование по узлам, например для формы фермента ЕХ, заканчивается отбором тех членов в знаменателе, которые не содержат константы скорости, выходящие из формы ЕХ.
Для сравнения авторы рекомендуют получить уравнение скорости и обычным путем 1956; М. Volkenstein, В. Goldstein, 1966).
СхематическийСхематическийРис. 1.Рис. 1.механизм ферментативной реакции:механизм ферментативной реакции:/—5 — формы фермента (узлы); остальные объяснения см. в тексте/—5 — формы фермента (узлы); остальные объяснения см. в тексте(Е. King, С. Altman,(Е. King, С. Altman,Авторы рассматриваемого алгоритма предлагают несколько правил, облегчающих вывод. Например, отделять элементы ряда запятыми, понимая, что завершенное выражение знаменателя является суммой этих элементов. Удобно выражать константы скоро-
Схематический
Схематический
Рис. 1.
Рис. 1.
механизм ферментативной реакции:
механизм ферментативной реакции:
/—5 — формы фермента (узлы); остальные объяснения см. в тексте
/—5 — формы фермента (узлы); остальные объяснения см. в тексте
(Е. King, С. Altman,
(Е. King, С. Altman,
2(1')2(1')4'(2')5(2')4'(2')5(2')3(1)3(1)3'(4)3'(4)444'(2',5)4'(2',5)5 (2',4') 5'5 (2',4') 5'6(5')6(5')6'(1,3)6'(1,3)1212' 1'2'14,'1'4, 24, 2'414', 1'4', 24'15, 1'5, 2515', 1'5', 25', 2'5'1'2'3, 1'34, 234, 2'34, 1'34, 234', 1'35, 235, 1'35, 235', 2'35' 123', 12'3', 1'2'3', 13'4', 1'3'4', 23'4', 13'5, 1'3'5, 23'5, 13'5', 1'3'5', 23'5', 23'5', 2'3'5'124', 12'4, 1'2'4, 145, 1'45, 245, 145', 1'45, 245', 2'45'124', 14'5', 1'4'5', 25'5'1'345, 2345, 123'5, 12451'2'35', 1'345', 2345', 2'345, 1'34'5', 234'5', 123'5', 12'3'5', Г2'3'5', ГЗ'4'5', ГЗ'4'5', 23'4'5, 1245' 1'2'45', 124'5' 1'236, 1'346, 2346, 2'346, 1'34'6, 234'6, 1'356, 2356, 123'6, 12'3'6, Г2'3'6, 13'4'6, 1'3'4'6, 23'4'6, 13'56, 1'3'56, 23'56, 1246, 12'46, 1'2'46, 1456, 1'456, 2456, 124'61'2'3'6', 1'3'4'6', 23'4'6', 1'3'56', 23'56', 1'3'5'6', 23'5'6', 2'3'5'6, 1'2'46', 1'456', 2456', 1'45'6', 245'6, 2'45'6', 1'4'5'6, 24'5'6'1212' 1'2'14,'1'4, 24, 2'414', 1'4', 24'15, 1'5, 2515', 1'5', 25', 2'5'1'2'3, 1'34, 234, 2'34, 1'34, 234', 1'35, 235, 1'35, 235', 2'35' 123', 12'3', 1'2'3', 13'4', 1'3'4', 23'4', 13'5, 1'3'5, 23'5, 13'5', 1'3'5', 23'5', 23'5', 2'3'5'124', 12'4, 1'2'4, 145, 1'45, 245, 145', 1'45, 245', 2'45'124', 14'5', 1'4'5', 25'5'1'345, 2345, 123'5, 12451'2'35', 1'345', 2345', 2'345, 1'34'5', 234'5', 123'5', 12'3'5', Г2'3'5', ГЗ'4'5', ГЗ'4'5', 23'4'5, 1245' 1'2'45', 124'5' 1'236, 1'346, 2346, 2'346, 1'34'6, 234'6, 1'356, 2356, 123'6, 12'3'6, Г2'3'6, 13'4'6, 1'3'4'6, 23'4'6, 13'56, 1'3'56, 23'56, 1246, 12'46, 1'2'46, 1456, 1'456, 2456, 124'61'2'3'6', 1'3'4'6', 23'4'6', 1'3'56', 23'56', 1'3'5'6', 23'5'6', 2'3'5'6, 1'2'46', 1'456', 2456', 1'45'6', 245'6, 2'45'6', 1'4'5'6, 24'5'6'
2(1')
2(1')
4'(2')
5(2')
4'(2')
5(2')
3(1)
3(1)
3'(4)
3'(4)
4
4
4'(2',5)
4'(2',5)
5 (2',4') 5'
5 (2',4') 5'
6(5')
6(5')
6'(1,3)
6'(1,3)
12
12' 1'2'
14,'1'4, 24, 2'4
14', 1'4', 24'
15, 1'5, 25
15', 1'5', 25', 2'5'
1'2'3, 1'34, 234, 2'34, 1'34, 234', 1'35, 235, 1'35, 235', 2'35' 123', 12'3', 1'2'3', 13'4', 1'3'4', 23'4', 13'5, 1'3'5, 23'5, 13'5', 1'3'5', 23'5', 23'5', 2'3'5'
124', 12'4, 1'2'4, 145, 1'45, 245, 145', 1'45, 245', 2'45'
124', 14'5', 1'4'5', 25'5'
1'345, 2345, 123'5, 1245
1'2'35', 1'345', 2345', 2'345, 1'34'5', 234'5', 123'5', 12'3'5', Г2'3'5', ГЗ'4'5', ГЗ'4'5', 23'4'5, 1245' 1'2'45', 124'5' 1'236, 1'346, 2346, 2'346, 1'34'6, 234'6, 1'356, 2356, 123'6, 12'3'6, Г2'3'6, 13'4'6, 1'3'4'6, 23'4'6, 13'56, 1'3'56, 23'56, 1246, 12'46, 1'2'46, 1456, 1'456, 2456, 124'6
1'2'3'6', 1'3'4'6', 23'4'6', 1'3'56', 23'56', 1'3'5'6', 23'5'6', 2'3'5'6, 1'2'46', 1'456', 2456', 1'45'6', 245'6, 2'45'6', 1'4'5'6, 24'5'6'
12
12' 1'2'
14,'1'4, 24, 2'4
14', 1'4', 24'
15, 1'5, 25
15', 1'5', 25', 2'5'
1'2'3, 1'34, 234, 2'34, 1'34, 234', 1'35, 235, 1'35, 235', 2'35' 123', 12'3', 1'2'3', 13'4', 1'3'4', 23'4', 13'5, 1'3'5, 23'5, 13'5', 1'3'5', 23'5', 23'5', 2'3'5'
124', 12'4, 1'2'4, 145, 1'45, 245, 145', 1'45, 245', 2'45'
124', 14'5', 1'4'5', 25'5'
1'345, 2345, 123'5, 1245
1'2'35', 1'345', 2345', 2'345, 1'34'5', 234'5', 123'5', 12'3'5', Г2'3'5', ГЗ'4'5', ГЗ'4'5', 23'4'5, 1245' 1'2'45', 124'5' 1'236, 1'346, 2346, 2'346, 1'34'6, 234'6, 1'356, 2356, 123'6, 12'3'6, Г2'3'6, 13'4'6, 1'3'4'6, 23'4'6, 13'56, 1'3'56, 23'56, 1246, 12'46, 1'2'46, 1456, 1'456, 2456, 124'6
1'2'3'6', 1'3'4'6', 23'4'6', 1'3'56', 23'56', 1'3'5'6', 23'5'6', 2'3'5'6, 1'2'46', 1'456', 2456', 1'45'6', 245'6, 2'45'6', 1'4'5'6, 24'5'6'
сти типа h-x через V. Такие комбинации как хх' будут исключаться из решения по правилу сложения Уонга, так как они отражают циклы; но их легче узнавать и отбрасывать в п. 5, если использовать соглашение, что хх'=0 для всех х. Иллюстрацией может послужить вывод уравнения для схематического механизма, представленного на рис. 1, который доведен до п. 6.
Выбор узла 1 как пропускаемого предотвращает возникновение циклов при расчете, поэтому отдельно выписываются все константы, пересекающие каждый из (и—I) узлов:
(2,2', 4,4' 5,5') (1,Г, 2,2') (3,3', 4,4') (5,5', 6,6').
Затем составляются запрещенные комбинации констант скорости:
1 3, 1'2, 2'4, 4'5, 2'5, 3'4, 1 6', 3 6', 5'6.
Перечень констант перемножают альфанумерически (запрещенные комбинации при этом отбрасывают). Введем обозначения: М.— множитель (в скобках указаны константы, которые при умножении дают запрещенные комбинации); Р — результат умножения по алгебре Уонга.
ММР
М
М
Как пример сортирования по узлам подчеркнуты те члены, которые соответствуют определителю узла 2 (не содержат 2 или I').
Для сложных механизмов может оказаться невозможным избежать появления недействительных циклов тоаько правильным выбором пропускаемого графа. Рассмотрение вопроса, однако, показывает, что такие циклы возникают вначале при «ручном выво- 18
де» уравнения и могут быть устранены на раннем этапе. Если этого не сделать, то недействительные циклы будут присутствовать конечном выражении знаменателя на этапе 5. В таких случаях рекомендуется сначала провести сортировку по узлам, так как удвоенные члены определенных циклов собираются в один узел, где их легко идентифицировать.
Точное доказательство метода, как это сделано для процедуры алгебры Уонга с ненаправленным графом (М. Maxwell, J. Cline, 1966),'авторы считают невозможным, но они проверили его примерно на двадцати кинетических механизмах, содержащих до де-1 вяти узлов и состоящих как из неразветвленных последовательностей ступеней, так и неупорядоченных и разветвленных механизмов. Рассматриваемый метод был успешно применен в ряде работ (W. Bardsley, 1980; F. Solano-Munoz et al., 1981; J. Wardell et al., 1982) и даже позволил обнаружить небольшие ошибки в ранее полученных уравнениях. Относительная простота и возможность компьютеризации вывода уравнения делают предложенный метод привлекательным.
Кинетические схемы активного транспорта
При рассмотрении в предыдущей главе активного транспорта ионов и неэлектролитов было отмечено, что энергия для переноса против градиента концентрации поступает в основном за счет гидролиза АТФ. И в тех случаях, когда движущей силой транспорта является градиент pH или мембранный потенциал, работа специальной АТФазы имеет первостепенное значение, так как она создает протондвижущую силу. С этой точки зрения целесообразно рассматривать транспортные АТФазы как самую важную группу транспортных ферментов и анализ кинетических схем транспорта иллюстрировать материалом именно по транспортным АТФазам.
В кинетических исследованиях транспортных АТФаз при построении кинетической схемы большие сложности возникают из-за необходимости сопряжения переноса ионов с реакцией гидролиза АТФ. При этом следует учитывать, что оба процесса являются многоступенчатыми. В транспортном процессе, например, необходимо допустить следующие этапы: присоединение переносимого вещества с одной стороны мембраны, транслокацию на другую сторону, изменение сродства и высвобождение.
П XП XЕ г^* Ч ^пЕ г^* Ч ^п
П X
П X
Е г^* Ч ^п
Е г^* Ч ^п
На схеме Е и Е'— это формы с разным сродством; стрелкой ■ о<*-
обозначена транслокация,обозначена транслокация,— изменение сродства (эти две
обозначена транслокация,
обозначена транслокация,
ступени могут быть и объединены).
В реакции гидролиза можно выделить следующие ступени: присоединение субстрата, фосфорилирование, высвобождение АДФ и дефосфорилирование (порядок последних двух ступеней может быть и обратным).
Даже для этих несложных схем возможны различные способы сопряжения. Нашей целью является установление истинной схемы путем постепенного усложнения простых вариантов с учетом экспериментального материала. Для Na, К-АТФазы, например, известно, что транспорт натрия сопряжен с фосфорилированием, а транспорт калия с дефосфорилированием. Вероятно допустить, что ассоциация— диссоциация ионов с обеих сторон мембраны происходит в равновесных условиях, энергия потребляется в процессе транслокации и изменения сродства, а эти стадии являются сравнительно медленными и лимитирующими скорость реакции. При построении схемы удобно использовать также допущение, что продукты реакции отсутствуют, т. е. рассматривать начальные скорости. В этом случае некоторые ступени можно считать необратимыми, что также облегчает вывод уравнения.
Когда в транспортном процессе участвует два вещества, возникает дополнительная сложность из-за того, что возможны разные варианты сопряжения. Для транспорта Na+ и К+, например, возможен как одновременный, так и последовательный перенос. К тому же механизм переноса может быть унитарным (т. е. в процессе участвуют одни и те же участки (Na-участки переходят в К-участ- ки и наоборот) или бинарным (для Na+ и К+ существуют отдельные системы переноса). При этом в бинарном механизме перенос может быть и одновременным, и последовательным, а в унитарном механизме одновременное связывание ионов Na+ и К+ исключается. Последнее эквивалентно двухсубстратному пинг-понг-механизму.
Na+ Na*к4\к4"
1
1
1
2d
Бинарный механизм можно описывать схемой:
Оказалось, что обнаружить различия между этими схемами только на основе классической кинетики не удается (J. Robinson, М. Flashner, 1979), так что необходимы какие-то новые приемы. В последующих главах будут изложены основные принципы анализа кинетических кривых и показано применение этих методов для исследования зависимости Na, К-АТФазной активности от субстрата и ионов К+ и Na+ Принципы построения минимальной модели Na, К-АТФазы могут быть успешно применены при исследовании других транспортных АТФаз и вообще для систем мембранного транспорта.
Линейная кинетика
Уравнение Михаэлиса — Ментен
Во многих учебниках, в том числе таких популярных, как «Основы ферментативной кинетики» А. Корниш-Боуден и «Ферменты» М. Диксона и Э. Уэбба, высказана мысль о том, что основное количество ферментов подчиняется кинетике Михаэлиса — Ментен. Несмотря на то что в настоящее время такое представление является спорным (С. Hill et al., 1977) и данная книга посвящена изучению ферментов, не подчиняющихся линейной кинетике, все же целесообразно коротко рассмотреть теорию Михаэлиса.
Центральной идеей всех концепций о механизме действия ферментов является представление о фермент-субстратном комплексе. Теория Михаэлиса и Ментен, предложенная еще в 1913 г., основана на двух предпосылках.
Взаимодействие между ферментом и субстратом является равновесным:
*+1*+2
£-\-S^ES; ES—*E-^-P.(2.1)
*-1*" '*
Реакция распада комплекса практически не влияет на равновесие. Это условие выполняется, если скорость распада комплекса ES на свободный фермент и субстрат значительно больше скорости его распада до свободного фермента и продуктов Р(^_1^Л+2).
Концентрация свободного субстрата остается практически постоянной в течение начального периода реакции, так что концентрацию субстрата (S) можно считать равной полной концентрации субстрата (S/). Это условие обычно выполняется, если полная концентрация субстрата значительно превышает концентрацию свободного фермента.
Определяя скорость реакции через скорость распада фермент- субстратного комплекса, нетрудно получить следующее уравнение:
(2.2)(2.2)*и=
(2.2)
(2.2)
1+Ks/S ’
где Ks=k-}/k+} — константа диссоциации фермент-субстратного
комплекса, величина ^+2б=УШах— максимальная скорость реакции, достигаемой в условиях, когда S становится большим по сравнению с Ks-
Учитывая, что каталитическая активность ферментов может быть достаточно большой, Дж. Бриггс и Дж. Холдейн (1925) предложили анализ кинетики реакций, в которых скорости образования и распада комплекса ES практически равны, поэтому концентрация комплекса ES остается’постоянной в течение определенного промежутка времени, т. е. d[ES]/d/=0 (принцип стационарности). При таком допущении для реакции:
E+S;££S+P',(2.3)
можно получить:
о^.(2.4)
А-1 + А+2 , А+1
Если ввести обозначения: Утах=&+2С, Km = (^-1+^+2) Д+ь тогда
у=—,(2.5)
+ kmlS.
Это уравнение идентично уравнению Михаэлиса с той разницей, что Кт заменено на Ks. При k+a<Ck-i константа Кт приближается к Ks и, таким образом, является мерой сродства фермента к субстрату. В стационарных условиях, однако, не следует судить о сродстве по величине Кт. Несмотря на это, величины Кт и Утах представляют собой важные кинетические параметры, так как они полностью определяют зависимость скорости от концентрации субстрата для данного фермента.
Для определения величин Кт и Утах предложено несколько методов, основанных на преобразовании уравнения (2.5). К наиболее распространенным графическим методам относятся следующие.
Метод Лайнуивера— Берка, согласно которому анализируется зависимость 1/у от 1/S. Уравнение (2.5) в обратных координатах представляет собой уравнение прямой с наклоном Кт/Утах и пересечениями: на оси ординат в точке 1/Утах и на оси абсцисс в точке (—\/Кт) (рис. 2, а\
Уравнение (2.5) описывает прямолинейную зависимость в координатах S/u от S (график Диксона). В этом случае наклон прямой равен 1/Утах и она пересекает ось ординат в точке Кт/Утах, а ось абсцисс в точке (—Кт) (рис. 2, б).
Построение графика в координатах Утах от Кт также позволяет определить величины Утах и Кт, так как наклон прямой в этом случае равен (—Кт), пересечение с осью ординат равно Утах, а с ОСЬЮ абсцисс— Утах/Km (рис. 2, в).
Метод, предложенный Р. Эйзенталем и Э. Корниш-Боуден не предусматривает построения графика по экспериментальным точкам. Значения у и S откладывают па вертикальной и горизонталь-
23
ной осях соответственно и через каждую пару точек проводят прямую. Все прямые должны пересекаться в точке с координатами (Кт, Vmax). Если не все прямые пересекаются строго в одной точке, то авторы предлагают получить оптимальное значение Кт по среднему значению (рис. 2, г).
Рис. 2. Способы графического определения величин Кт и Vm8> по зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (объяснение см. в тексте)Рис. 2. Способы графического определения величин Кт и Vm8> по зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (объяснение см. в тексте)
Рис. 2. Способы графического определения величин Кт и Vm8> по зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (объяснение см. в тексте)
Рис. 2. Способы графического определения величин Кт и Vm8> по зависимости скорости реакции от концентрации субстрата (объяснение см. в тексте)
Для определения параметров Кт и Утах можно использовать график хода реакции. Для этого уравнения Михаэлиса записывают в интегральной форме:
^-У+К,»!" S° ,(2.6)
So — У
где So— начальная концентрация субстрата, a (So—у^— концентрация в момент времени L Преобразуя (2.6), получим:
2*303 । Sp У^х 1 у_ <So — у Кт Кт t
Измерение у через определенные промежутки времени и построение графика зависимости (2,303//) lg(S0/(S0—у)) от y/t позволяет получить прямую с наклоном (—1/Кт) и пересечением с осью абсцисс Vmax/Km.
В последние годы предложен метод для определения констант Кт и Ушах, основанный на анализе кривых хода реакции и определения той концентрации субстрата, при которой вторая производная скорости по времени достигает минимума. Эта концентрация равна S=Km/^. Для получения этой величины необходимо наблюдать за ходом реакции не до конца, а лишь до того момента, когда вторая производная пройдет минимум (В. Hasinoff, 1985). Предложен также метод определения Кт и Утах на основе измерений начальных скоростей для случаев, когда субстрат нестабилен и может распадаться не только в ходе ферментативной реакции, но и другим путем (Т. Keleti, 1986).
Кинетический анализ реакций с участием нескольких субстратов и продуктов
Большинство ферментов не подчиняются таким простым схемам реакций, как (2.1) или (2.3), тем более если в реакции участвует несколько субстратов и продуктов. В общем случае для получения уравнения скорости для сложных механизмов используют метод Кинга — Альтмана и его модификации (см. гл. 1), но анализ дробно-рациональной функции при этом связан с трудностями, и определение кинетических констант Кт и Утах при нелинейных графиках 1/и от 1/S необосновано. Необходимость изучения многосубстратных реакций, однако, остается, и поэтому ряд авторов проанализировали многочисленные частные случаи, которые в силу различных допущений можно описать, используя методы линейной кинетики. В данном разделе приведен подход У. Клеланда, представляющий собой попытку привести уравнения скорости к форме, которая содержит параметры с определенным физическим смыслом и поддающиеся экспериментальному определению.
Для механизмов с более чем одним субстратом и продуктом необходимо вначале написать полное уравнение скорости в терминах индивидуальных констант скорости и затем преобразовать его, введя для каждого реактанта константы Михаэлиса и константы ингибирования. Рассмотрим метод на примере упорядоченной «уни- би» реакции, т. е. реакции с упорядоченным присоединением одного субстрата и выделением двух продуктов:
EA/EPQ
Уравнение скорости получим методом Кинга — Альтмана: (А1А3А5А — k^k^PQ^ Е<
(Ад + А3) *5 + Ai (Аз + As) А + А2А4Р 4- (А2 + A3) k^Q 4- k\ktAP 4- k^k^PQ
(2.8)
Для последующего анализа удобно записать уравнение (2 8) в следующем виде:
(Числитель)! А — (Числитель^ Р
Ч)=————• •
(Постоянный член) 4- (Коэффициент А) А 4- (Коэффициент В) В 4- ...
(2.9)
Максимальную скорость в любом направлении определяют как отношение коэффициента числителя в соответствующем направлении к коэффициенту того члена знаменателя, который умножают на такой же концентрационный член. Для (2.9) это будет выглядеть так:
; V2=; V2=(Числитель)2(Коэффициент Р)(Числитель)2(Коэффициент Р) (Числитель)!
; V2=
; V2=
(Числитель)2(Коэффициент Р)
(Числитель)2(Коэффициент Р)
(Коэффициент А)
Константы Михаэлиса и константы ингибирования определяют как отношение членов, входящих в знаменатель. Берут такое отношение, чтобы после исключения одинаковых членов в знаменателе оставался реактант, соответствующий данной константе, например для констант, ассоциированных с А, имеем:
Постоянный член , Коэффициент В е Коэффициент ВР
Коэффициент А * Коэффициент АВ ’ Коэффициент АВР ' '
Константы Михаэлиса, записанные как Ка, Кв, Кр и т. д., для упорядоченного «уни-би» механизма имеют вид:
Постоянный членПостоянный член ,
А д — ■■ • - {Ар—— ,
Коэффициент АКоэффициент Р
v Коэффициент Р
А, "-" е
Коэффициент PQ
Константы ингибирования, обозначаемые как Kia, Kip; KiQ, определяют с помощью оставшихся членов знаменателя:
Коэффициент А , Коэффициент АВ ’Коэффициент А , Коэффициент АВ ’Коэффициент Р Аг .
Коэффициент А , Коэффициент АВ ’
Коэффициент А , Коэффициент АВ ’
Коэффициент АРк\
Постоянный член А5
Коэффициент QАд
Вводя эти обозначения и умножая уравнение на фактор
(Числитель)а
(Коэффициент А) (Коэффициент PQ) *
26
1/^21/^2Ф =KAV^ 1М +Ф =KAV^ 1М +получим уравнение скорости в терминах новых констант:
1/^2
1/^2
Ф =
KAV^ 1М +
Ф =
KAV^ 1М +
KqVxP л KpViQV\PQУгАР
Кед ‘КедKeqKiP
где введена еще одна константа, называемая термодинамической константой равновесия:
^ (Числитель)1,
eq (Числитель)2*
После того как уравнение записано в терминах кинетических констант ^Ка, Кр, Kq, Кед, Kip и др.), последние можно вычислить на основе экспериментальных данных. Константы Михаэлиса, максимальные скорости и константы ингибирования можно рассчитать измеряя начальные скорости реакций. В некоторых случаях для определения констант ингибирования необходимо исследование ингибирования продуктом. Анализ начальных скоростей обычно подразумевает варьирование одного из субстратов при фиксированных концентрациях других субстратов и вычисление наклонов и пересечений с осями на графиках обратных величин или других способах представления данных, например на графиках v/S от и или S/u от S. В работах У. Клеланда (W. Cleland, 1963) и ряда других авторов (J. Wong, С. Hanes; 1962; Н. Fromm, 1967; G. Petterson, 1970 и др.) рассмотрены различные механизмы: упорядоченное связывание субстратов (с образованием тройного комплекса или без него), пинг-понг механизм (когда один или более продуктов ыделяются до связывания ферментом всех субстратов), механизмы с неупорядоченным связыванием субстратов в равновесных или стационарных условиях и другие случаи.
Детальный анализ отдельных механизмов здесь не приводится (см.: М. Диксон, Э. Уэбб. «Ферменты», 1982). Однако следует отметить, что рассмотренный подход, а именно определение кинетических констант на основе анализа наклонов и пересечений с осями, применим только в том случае, когда уравнение скорости можно привести к линейному виду. Для уравнений типа. Михаэлиса — Ментен это сделать несложно. Для многосубстратных реакций специально подбирают условия, когда концентрации ряда субстратов постоянны и являются насыщающими, поэтому можно пренебречь некоторыми членами уравнения. Для неупорядоченных механизмов с альтернативным связыванием субстратов в стационарных условиях устранить квадратичные члены в уравнениях скорости не удается, поэтому для исследования таких случаев требуется применение каких-то других методов.
Исследование действия модификаторов
Анализ действия модификаторов на ферментативные реакции не только имеет первостепенное значение для понимания сложных
27
взаимосвязей и путей регуляции в метаболизме клетки, но и позволяет выявлять детали механизма действия самих ферментов. В зависимости от того, увеличивают ли различные вещества скорость реакции или уменьшают ее, их принято делить на активаторы и ингибиторы. В последнем случае отдельно рассматривают обратимые и необратимые ингибиторы. Необратимым считают ингибирование, когда вещество инактивирует фермент, связываясь с ним столь прочно, что его нельзя удалить ни диализом, ни каким-то иным способом.
Обратимое ингибирование характеризуется равновесием между ферментом и ингибитором, причем константа равновесия служит мерой их сродства. Эффективность действия ингибитора обычно выражают константой Ki — величиной, обратной сродству фермента к ингибитору.
Подобно другим факторам, влияющим на скорость ферментативной реакции, обратимые ингибиторы могут изменять величину либо константы Ктп, либо Утах, либо обеих констант. По этому принципу принято делить ингибиторы на конкурентные (увеличивающие Кт), неконкурентные (не влияющие на Кт, но уменьшающие Утах), бесконкурентные (в одинаковой степени уменьшающие Кт и Утах) И СМСШаННЫв (ПРОИЗВОЛЬНО меняющие Кт и Утах)* Активаторы разделяют на обычные и необходимые.
Как было указано выше, анализ наклонов и пересечений кине
тических кривых с осями позволяет в ряде случаев определить кинетические константы. В табл. 1 приведены выражения этих вели
Рис. 3. Схема неупорядоченного связывания с ферментом (Е) суб* страта (S) и модификатора (М)Рис. 3. Схема неупорядоченного связывания с ферментом (Е) суб* страта (S) и модификатора (М)чин для основных типов ингибирования. Подобный анализ не дает должных результатов, когда зависимость скорости от концентрации не является гиперболической, и поэтому график обратных величин нелинеен. Отклонения от линейности наблюдаются, например, при частичном конкурентном ингибировании или неконкурентном ингибировании в стационарных условиях, ■ ряде случаев смешанного ингибиро-
Рис. 3. Схема неупорядоченного связывания с ферментом (Е) суб* страта (S) и модификатора (М)
Рис. 3. Схема неупорядоченного связывания с ферментом (Е) суб* страта (S) и модификатора (М)
вания и др.
В таких системах в стационарных условиях получаются уравнения, содержащие как S2, так и i2;
возможно возникновение членов и с более высокими степенями (S— концентрация субстрата, i — концентрация ингибитора). Подобная ситуация возникает и тогда,
когда с одной и той же молекулой фермента может связываться более одной молекулы ингибитора.
Попытки анализа нелинейных эффектов ингибирования были предприняты еще в 50-х годах, когда Дж. Боттс и М. Моралес предложили схему действия модификаторов (рис. 3). Для этой
Таблица 1. Выражения для длин отрезков, отсекаемых на осях координат, при построении графиков в двойных обратных величинах
Ингибирование
Длина отрезка, отсекаемого на оси ординат
Длина отрезка, отсекаемого на оси абсцисс
Наклон
Полное конкурентное
1
1
1
Kmd 4- l)K^
1+ «$/$)[! + (№)]
^тах
К„(1 + ЧКЙ
Утах
Частичное конкурентное ке
1
1 4- IKs/KiKs
Ksll + ЦКй
KsO+i/Kd
" " 1 4- (Ks/S) [1 4- (№)]/[! 4- (//К/)
1 ''
х (w^)]
Утах
Утах (1 + KsIKllQ
Полное неконкурентное
keW + Wit ”1 + №/S)
1 4- UKi ^тах
Ks
KsO+i/KA ^max
Частичное неконкурентное
\ке 4- к'е WKiW А-ЦК^
1 -k MKi
1
KsO-H/Kd
U1 4- Ks/S
Утах 4- WHKl
Ks
^max 4* V^Ki
Продолжение табл. 1
Ингибирование
Длина отрезка, отсекаемого на оси ординат
Длина отрезка, отсекаемого на оси абсцисс
Наклон
Смешанное v = ™х
1 + ЧК\
1 + //к;
Ks(l +1/К0
Углах
(Ks/S) (1 4- ИКЙ + (1 + ЦК'^
Ушах
KsO+HKd
Частичное смешанное
6е(| + »,'//»<;)/(! +ЦКй
1+W?
J*UK't
Ks(l +l/Ki)
He (1 + ^IkK^
и~ i+[Ks(f+//K/)]/s(i+w;)
ke (1 + к^ЧЬК^
KSa*4Ko
Бесконкурентное
У Утах
1 + 1/Ki
1 4-Z/K/
Km
Утах
" (Km/S) + (1 + //K/)
Утах
Km
Частичное бесконкурентное
^+2»_ .
\ + i/Ki
X -^i/Kt
Ks
l + №/S) + (W/)
. *±з£
X + tKilOO+KslS)
^+2^ [1 + (^+з/^+2)07^/)]
Ks
k^eV-Kk+a/k+iXifKO
схемы уравнение скорости в стационарных условиях принимает вид:
[(а + ЬМ^ S* + (c + dM + еМ^ S]
(/ + £Af)S2 + (A+M + /M2)S(Jfc + /M2 + mAf2) ’1
где а, Ь,...,т— положительные константы, S и М — концентрации субстрата и модификатора.
При постоянной концентрации фермента и модификатора или фермента и субстрата уравнение в общем виде является дробнорациональной функцией второго порядка:
У^-Оо + агг + о^2 п
fo+PK + fe-r2
где х — концентрация лиганда..
Графики зависимости и от х, отвечающие уравнению (2.П), могут иметь различный вид в зависимости от значений отдельных констант. В работе Дж. Боттс (J. Botts, 1958) показано, что кривые могут иметь только один максимум и не более двух точек перегиба. Всего для такого случая возможно существо ание десяти типов кривых. Соответствующие графики в двойных обратных координатах рассмотрены У. Фердинандом (W. Ferdinand, 1966), проанализировавшим условия, при которых уравнению (2.11) соответствует та или иная кривая. Подход, предложенный Боттс и основанный на анализе геометрических характеристик кривых, был затем развит в работах ряда авторов (W. Bardsley, R. Childs, 1975; W. Bardsley, 1976; W. Bardsley et al., 1980; F. Solano-Munoz et al., 1981; F. Burgillo et al., 1983). Результаты этих исследований более подробно будут рассмотрены в гл. 3.
Исследование формы кинетических кривых в различных координатных системах
Основные геометрические характеристики формы кинетических кривых
При анализе дробно-рациональных функций, описывающих стационарную скорость и связывание лигандов, перед исследователями возникает ряд специфических трудностей. Из-за того что коэффициенты уравнений представляют собой сложные комбинации кинетических констант, полезная информация, получаемая при анализе наклонов и пересечений кинетических кривых с осями, весьма ограничена. Уравнения содержат концентрационные члены в высоких степенях, и определение степенных параметров по экспериментальным кривым является самостоятельной важной задачей. Детальному анализу дробно-рациональных функций вида:
(3.1)(3.1)
(3.1)
(3.1)
посвящена серия работ У. Бэрдсли и соавторов, которые, применив теорию плоских кривых, провели математический анализ возможных форм кинетических кривых. На основе изучения геометрических признаков, характеризующих форму кривых в различных системах координат, был предложен способ определения степени уравнения скорости.
Исследование любой функции, в том числе и дробно-рациональной, включает прежде всего определение количества и расположение точек экстремума и перегиба. Типичный график рациональной функции представлен на рис. 4.
Обычно в уравнениях скорости максимальные степени числителя и знаменателя равны (п=т), кроме тех случаев, когда образуются тупиковые комплексы, тогда пОп. Следует отметить, что в гл. 3 символы пит будут использованы исключительно для обозначения максимальных степеней числителя и знаменателя — так же, как они встречаются в работах У. Бэрдсли и соавторов. В по- 32
следующих главах, однако, обозначения п и т будут применяться согласно формуле (1.2), т. е. п—как минимальная степень числителя, т — как разность между максимальными степенями знаменателя и числителя. Учитывая эти сведения, обозначим как л ^-функции. те дробно-рациональные функции, для которых п=т.
Рис. 4. Типичный график дроб- но-рациональнои функции y=2a^V 2м':
о /о
/ — точка экстремума, в которой у*—0; 2 —точки перегиба, ■ которых у"—0; пунктиром обозначена горизонтальная асимптота при х-н»
2л—Iлл—1 Г л2 fKXK2 ^г*1-1 +22 (; - И ф^'-12л—Iлл—1 Г л2 fKXK2 ^г*1-1 +22 (; - И ф^'-1(3.2)(3.2)Количество точек экстремума определяется первой производной функции, которая для случая п:п имеет вид:
2л—Iлл—1 Г л
2 fKXK2 ^г*1-1 +22 (; - И ф^'-1
2л—Iлл—1 Г л
2 fKXK2 ^г*1-1 +22 (; - И ф^'-1
(3.2)
(3.2)
к+1
2(^+1 —2«$)PsaK+i-s при К < п S-0
2 ^4-1—2S)₽sa^+1_s при К>п S-K+1-л
И Ф/г=-Фн=Мг-аДг-
Согласно правилу Декарта по количеству возможных перемен знака в числителе (3.2) можно определить максимально возможное число точек экстремума. Однако в большинстве случаев функции высоких степеней могут иметь меньшее количество экстремумов, что позволяет правило знаков (W. Bardsley, R. Childs, 1975).
Вторая производная функции (3.1) имеет вид:
2л—22л—22л—12л—1
2л—2
2л—2
2л—1
2л—1
Рис. 5. Локальные свойства графика дробно-рациональной функции (по
а. Поведение при х-*0. / — a2<atPi; у/х-кривая иесигмоидальная, асимптота в (1/у)/(1/х) перегиб, асимптота (1/у)/(1/х) ~ отрицательное пересечение с осью. 3— а^О, у/х имеет к параболической асимптоте (п>2), Для функций высших степеней условие Oi = ai=0 даст проходит через начало координат. 5 — (a2/Oi)2—Р-(02/01)+ р2>а3/аг, кривая стр мится к тоте в (1/у)/(1/х) снизу.
б. Поведение при х-оо. 1 — т>п, Hm у=0, lim 1/у=оо. 2 — т—п, апРп_1>ап_1 Рп; кривая
Х-»ОО Х-*-<*
жительный градиент в начале координат. 3 — т—п, anPn_I<an_Ipn; кривая в у/х должна В (1/у)/(1/х) кривая должна иметь, по крайней мере, один минимум и отрицательный гра-
следующие члены х низшей степени для определения положения относительно асимптоты, лой, в зависимости от условия (an_,/an)Pn—pn-1 (an_1/an) + Pn_2>an_2Pn/an как в (5) в. Поведение при 0<х<оо. Горизонтальный перегиб в у/х переходит в горизонтальный пере- ветственно. Горизонтальная линия у—У» пересекает исходную yW кривую самое большее Для обозначения экстремумов и перегибов использованы те же символы, что и на рис. 4
6
W. Bardsley, R. Childs, 1975)
пересекается с осью при положительных значениях. 2 — a3>OiPi; yix имеет сигмоидальный у'-0 при х—О и должна быть сигмоидальной, (1/у)/(1 /х) — парабола (2:2) или приближается кубический график (1/у)/(1/х) и т. д. 4—a2=a,Pi; в у/х имеем у'(0)-0, асимптота (1/у)/(1/х) асимптоте в (1/у)/(1/х) сверху. 6—(a2/ai)2—pi(a2/a1) + p2<a3/ai, кривая стремится к асимп-
в у/х приближается к горизонтальной асимптоте an/Pn снизу, а в (1/у)/(1/х) имеет поло- нметь, по крайней мере, один максимум и приближаться к горизонтальной асимптоте сверху, диент в начале, 4 — m—п, anpn—I = an_1pn; у/х — неопределенная и следует рассмотреть UlyHUIx) имеет нулевой градиент в начале. 5—кривая может быть вогнутой, или 6—выпук- или <an_2Pn/an как в (6).
гиб в (1/у)/(1/х) и максимум и минимум в у/х становятся минимумом и максимумом соот- т раз, и показанный пример поэтому является функцией, по крайней мере, степени 3:3.
где gK =
к+i
2 (^ + 0(К+2 — 2г)Рга^_г+2 г-0
2 (^ + П^+2-2г)₽,ак-г+2 г-К+п-2
при К < п- — 1
при К^п — Х,
а }к имеют то же значение, что и для у'х.
Аналогично, по правилу Декарта, можно определить максимально возможное число точек перегиба, которые определяются уравнением у"хх=0. В табл. 2 показана зависимость количества точек экстремума и перегиба от порядка функции.
Таблица 2. Максимальные степени числителя у' и у" и максимально возможное число положительных корней для некоторых дробно-рациональных функций (по W. Bardsley, R. Childs, 1975)
Соотношение степеней
1:1
1:2
2:2
2:3
3:3
3:4
4:4
4:5
5:5
п:т
Степень у'
0
II
II
IV
IV
VI
VI
VII
VIII
2т — 2
Максимальное число положительных корней
0
1
1
1
3
3
5
5
7
2п — 3
т, п ^ 2
Степень у"
0
III
III
VI
VI
IX
IX
XII
XII
3/71 — 3
Максимальное число положительных корней
0
1
2
4
6
8
9
11
12
2т + п — 3 т, п ^: 3
Наряду с точками экстремума и перегиба кривую можно охарактеризовать и по ряду других признаков, например по положению относительно асимптоты при х-^-оо, по знаку градиента в точке пересечения с осью ординат, по вогнутости или выпуклости при к-+оо и к-^-0 и т. д. Эти свойства проиллюстрированы на рис. 5.
Исследование функции в координатах у от х позволяет получить некоторую количественную информацию, а именно величину градиента (/(0) =ai/Po) и вогнутости или выпуклости (z/"(0) = =2Чгц2О/Ро) в начале координат, величину горизонтальной асимптоты an/pn при х-+оо, а также приблизительное значение для градиента при х->оо(у^х^ 1)^,л-i/pn-Y2). Здесь и далее использованы обозначения:
Ф/,/—i — аД_1—az-lP/i
^ Н=°-^1 — о/Ру
Изучение локальных графических свойств кривых позволяет судить о степени соответствующего уравнения скорости. Так, напри-
мер, если график у~х асимптотически приближается к нулю, то максимальная степень знаменателя будет обязательно больше максимальной степени числителя: т>>п; если же у~х стремится к горизонтальной (ненулевой) асимптоте, то т=п. При наличии на графике у~х сигмоидального перегиба необходимо предположить наличие, как минимум, степени 2:2 и выполнения условия а2Ро2> >О1Рь Нелинейный график (1/у) ^ (1Д) или единственный максимум на графике функции у^х также предполагает минимальную степень 2:2. Наличие минимума на кривой у~х подразумевает самое меньшее степень 3:3. Многочисленные перегибы на графике у~х и хотя бы один перегиб на графике Ц/у) ~ (1Д) требуют, как минимум, наличия степени 2:3; графики у^х с горизонтальной (ненулевой) асимптотой и с горизонтальным плато подразумевают, как минимум, степень 3:3.
Перечень этих правил можно продолжить, но следует подчеркнуть, что для максимально точной оценки степени уравнения скорости полезно вместе с графиками у^х и (1/у) ~ (1Д) воспользоваться и другими формами представления данных. Каждой рациональной функции степени 2:2, 2:3, 3:3 и т. д. соответствует определенный набор возможных форм кривых с конкретными возможными геометрическими признаками и определенным их сочетанием. Хотя уравнения высшей степени могут давать все формы, возможные для низких степеней, но существуют некоторые признаки, которые невозможны для уравнений с более низкой степенью, поэтому для обнаружения таких специфических признаков нужно представить данные в разных системах координат, так как на графике эти особенности могут быть не реализованы. В следующем разделе будет рассмотрена трансформация кривых при переходе из одной системы координат в другую.
Исследование дробно-рациональных функций в различных координатах
В кинетических исследованиях сложилась традиция использовать определенные способы замены переменных. Их первоначальное введение было обусловлено желанием найти графическое решение уравнения скорости с целью определения основных кинетических параметров Кт и Vmax. Это было возможно при линеаризации гиперболической зависимости у от х. Таким путем вошли в обиход следующие традиционные зависимости: \,у от 1/х, \,у от х, х,у от х, у от у,х (см. рис. 2). Широкое распространение получили также логарифмические зависимости.
Для исследования дробно-рациональной функции в вышеназванных системах координат в первую очередь нужно проследить за трансформацией первой и второй производных, определяющих количество точек экстремума и перегиба.
Допустим, функция у^х) преобразуется в две производные функции F^x, у) и G(x, у), которые затем можно представить гра-
37
фически как F/G. Производные F'g и F"Gg нетрудно выразить через производные у'х и у"хх, применяя правила дифференцирования функций многих переменных:
/дГдР\
Iк У I
ДР \ дхду/ .
dG ~ (dGдО\
\ дхдуa )
d2F _1|
dG2 “ / dG да \з 1
(+ »»у)
. дад^р дрдчп, г2 ду дх2дудх2[
. (дОд2Р dFd2F\l , \дхду2 дхду2
/дад^Р _ дР^О\Г2/ дСд^р__ дРдЮ\ .
\dxdx2дхдх2)\ дхдхдудхдху/
Г дОд2Р _ дРд2О \ .
< дудхдудудху /
^дОд2?дРдЮ\^■(дРдОдРдО \ „\
^дуду2дуду2 /\дудхдхду /)
Применяя общие формулы к рассматриваемым графикам, можно выразить соответствующие производные через х, у, у' и у" (табл. 3).
Таблица 3. Зависимость между у(х и Р^х, у) ~С(х, у) для графических методов, используемых в ферментативной кинетике (по W. Bardsley, R. Childs, 1975)
Функция
1-я производная
2-я производная
У~х
У*
у"
(1/у) ~ X
— у*(у2
ЧуЧ^-уу")
Gly^-GW
X2
х^
— V^y’^xy'-y^-xyy-A
У6
У ~ ^fx)
Х2у*
^- XN (Ху* — у) - хуу"]
ху'-у
(х/у) ~ X
1
-9 (хуг — у)
У2
[2у' (ху’ — у) — хуу'З
У6
У ~ log х
ху’
X (у* + ху")
log у ~ log X
ху'/У
— ~" \у* {ху' -у)- хуу'З у
logy ~ х
УЧУ
-^- (уУ” — У'2)
Приведенные соотношения позволяют проследить за трансформацией экстремумов и перегибов при переходе из одной системы координат в другую. Однако, как было отмечено в предыдущем разделе, форму кривых характеризует и ряд других признаков. Локальные свойства графика F/G показаны на рис. 6.
Локальные свойства кривых удобно анализировать с помощью четырех определяющих функций, которые представляют собой ком- 38
1 — пересечение с F-осью и градиент (их анализ позволяет получить количественные параметры); 2— кривая может быть локально выпуклой или, как 3, вогнутой (это не зависит от градиента); 4—перегиб (в некоторых особых случаях может быть расположен в начале, но кривая все-таки остается выпуклой или вогнутой, как 5); 6— перегибы с положительным наклоном; 7 — максимумы; 8 — перегибы с отрицательным наклоном; 9 — локальные минимумы (6—9 могут быть полезной характеристикой при определении степени уравнения, ио не дают достоверных количественных параметров); 10— стремление к асимптоте в вогнутой форме; 11 — то же, в выпуклой форме; 12 — пересечение; 13—наклон (10—13 дают возможность определить полезные количественные параметры); 14— касательная к кривой может быть вертикальной, горизонтальной (7, 9) или исходить из начала координат (/5); /6 —кривая может пересекать свою собственную асимптоту
бинации числителя и знаменателя исходной функции и ее производных (W. Bardsley, 1976). Зависимость у^х) обозначим как отношение двух полиномов N и D;
Форму кривых в разных координатах можно полностью охарактеризовать, если проанализировать корни следующих функций: F^N'D-DN;
F2=(N"D - D"N) D - 2D' (N'D — D'N);
F^ = (N'D - D'N) x - ND;
F^=l2^' (N'D - D 'N) - N (N"D - D"N) x - 2N'D - D W).
Следует отметить, что количественную информацию можно получить только при экстремальных значениях G: G->0 и G-*-oo экстраполяцией наклонов и пересечений функций и их асимптот (рис. 7)..
Определение же экстремумов и перегибов при промежуточных значениях G имеет только «диагностическое» значение для установления степени уравнения (рис. 7).
Для вычисления количественных характеристик логарифмические графики менее пригодны, но и их можно использовать для «диагностических» целей. Например, если предполагают субстратное ингибирование, то следует построить график и/log S, и если этот график окажется симметричным относительно максимума при 1/2 lo^ (Р0/Р2), то уравнение скорости будет иметь порядок 1:2. Любое отклонение от симметричности свидетельствует о более высоком порядке уравнения скорости (W. Bardsley, 1976).
Интересным свойством обладает двойной логарифмический график log (//log х. Наклон этого графика всегда меньше чем п, а лимитирующий градиент при х->оо дает величину (я—тп^, т. е. показывает разность между максимальными степенями числителя и знаменателя. Анализ функции d log у/б log х выявляет, что график log (//log х начинается в третьем квадранте с лимитирующим наклоном, равным 1,0 (или 2,0 при коэффициенте ai=0; 3,0 при «1 = = «2=0). Функция log £//log х при бесконечно малых и бесконечно больших концентрациях аргумента имеет асимптоты, к которым она может приближаться как в выпуклой, так и вогнутой форме в зависимости от знака некоторых комбинаций коэффициентов. Величину d log у
d log х
определим как кажущийся порядок реакции.
Порядок реакции — это число, равное сумме показателей степени концентрационных членов в уравнении скорости. Полный порядок равен сумме частных порядков, рассчитанных для индивидуальных реагентов. Молекулярность реакции, имеющая прямое отношение к механизму реакции, характеризует чисто молекул, реагирующих в элементарном процессе реакции. Для любой элементарной реакции, протекающей в одном направлении, всегда можно определить порядок и молекулярность, численные значения которых совпадают. Однако для сложных ферментативных реакций это 40
Рис. 7. Наклоны и пересечения, которые можно определить из четырех основных алгебраических преобразований: / — у/х; И—(1/у)/(1/х); III — (х/у)/х; IV — yUyjx) (по W. Bardsley, 1976)
правило не выполняется. Кинетический порядок, определяемый экспериментально, не совпадает с молекулярностью. Кроме того, понятие истинного порядка реакции нельзя применять к сложным реакциям, хотя отдельные элементарные ступени имеют вполне определенный порядок. Эти осложнения обусловливают введение понятия кажущегося порядка реакции ю, который может стать полезной характеристикой при анализе кинетических кривых сложной формы.
В заключение необходимо отметить, что накопление экспериментальных данных при экстремальных концентрациях субстрата является наилучшим способом для получения кинетических констант связывания с помощью экстраполяции. Однако интерпретация этих данных остается спорной. Большей частью пересечения и наклоны кривых дают величины сложных комбинаций кинетических констант. При изучении связывания лигандов п=т (равно числу неидентичных участков связывания), поэтому перечень возможных форм кривых ограничен: например, невозможны максимумы. Для уравнения стационарной скорости возможно как п=т, так и n<m и возможно, что п больше общего числа участков связывания. Из-за этого интерпретация функций насыщения менее неопределенна, чем функций стационарной скорости (W. Bardsley, 1976).
Определение порядка дробно-рациональных функций
Детальная характеристика функций скорости реакции как при экстремальных, так и при средних концентрациях субстрата необходима для того, чтобы определить степень соответствующей дробно-рациональной функции, что в свою очередь важно знать при построении кинетической схемы. В предыдущих разделах были кратко изложены основные принципы анализа дробно-рациональных функций вида п : т. Применив этот подход к 3 : 3-функциям и анализируя определяющие функции У7!—Г4 для уравнения
У=У=о0 + ахх 4- адх2 + д3х3 60 + ^1Х + ^2-*2 + 63х3
У=
У=
удалось классифицировать кривые, соответствующие 3:3-функциям как в прямых, так и в обратных координатах (W. Bardsley, 1977, 1980).
Оказалось, что в координатах у[х 3:3-функции могут иметь пять точек перегиба, а с учетом сочетания различных признаков возможны 10 разных форм кривых. Наиболее интересна классификация в координатах \/у от 1/х; в этом случае можно выделить 27 (I—XXVII) типов кривых. Классификация основана на расположении кривой относительно асимптоты. Выделяют несколько групп кривых. Это нелинейные кривые, лежащие полностью выше асимптоты; начинающиеся выше асимптоты, но пересекающие ее свер- 42
Рис. 8. Возможные формы, кривых 3:3-функции в координатах 1/и от 1Д5] и и от оДЗ]. Кривые сгруппированы в четыре класса (Д— Г) по положению относительно асимптоты (по W. Bardsley et al., 1980)
ху вниз; полностью находящиеся ниже асимптоты и пересекающие ее снизу вверх (рис. 8).
Иметь подобную «карту» очень удобно, хотя и недостаточно. Даже если какая-то экспериментальная кривая полностью повторяет форму одной из вышеприведенных кривых и по всей совокупности признаков является функцией порядка 3:3, можно считать лишь, что 3:3 — это минимальная степень, которую необходимо допустить, и нельзя исключать, что данная кривая может соответст-
Рис. 8. Продолжение
вовать функции высшей степени. Таким образом, анализ формы кривых позволяет построить только минимальную модель ферментативной реакции.
Возникает вопрос, насколько необходимо прибегать к подобному анализу. Не являются ли отклонения от кинетики Михаэлиса исключением, особым случаем, редко встречающимся на практике? 44
в
Рис. 8. Продолжение
В ответ на этот вопрос У. Бердсли и сотрудники показали, что даже относительно простые кинетические схемы могут обеспечивать достаточно сложную форму кривых. Например, кинетической схеме с одним субстратным участком, но с двумя возможными состояниями фермента (аналогично модели Моно, Уаймена, Шанжё) в стационарных условиях соответствует уравнение типа:
у Qi [S] + g2 [SJ2
[Ео1 ™ 0о + Ms] + MSP ’
а для двух участков та же модель дает уже уравнение степени 6:6 (W. Bardsley et al., 1980).
Кинетической схеме, в которой вторая молекула субстрата может играть роль модификатора (рис. 9), соответствует уравнение степени 4:4. Интересно отметить, что включение в схему каталитической ступени влияет на степень уравнения. Для схемы, в которой объединены переходы ES^EP и SES-^SEP (рис. 9, Б), получается уравнение порядка 3:3. Это всегда важно помнить, хотя в
45
VVРис. 10. Концентрационная зависимость аце- тилхолинэстеразы (аппроксимация данных дробно-рациональными функциями с помощью компьютера (по W. Bardsley et al., 1980): кривые рассчитаны на основе программы для криволинейной регрессии; наилучшие совпадения получены при 1:1 (а), 2:2 (б) и 3:3 (в)Рис. 10. Концентрационная зависимость аце- тилхолинэстеразы (аппроксимация данных дробно-рациональными функциями с помощью компьютера (по W. Bardsley et al., 1980): кривые рассчитаны на основе программы для криволинейной регрессии; наилучшие совпадения получены при 1:1 (а), 2:2 (б) и 3:3 (в)
V
V
Рис. 10. Концентрационная зависимость аце- тилхолинэстеразы (аппроксимация данных дробно-рациональными функциями с помощью компьютера (по W. Bardsley et al., 1980): кривые рассчитаны на основе программы для криволинейной регрессии; наилучшие совпадения получены при 1:1 (а), 2:2 (б) и 3:3 (в)
Рис. 10. Концентрационная зависимость аце- тилхолинэстеразы (аппроксимация данных дробно-рациональными функциями с помощью компьютера (по W. Bardsley et al., 1980): кривые рассчитаны на основе программы для криволинейной регрессии; наилучшие совпадения получены при 1:1 (а), 2:2 (б) и 3:3 (в)
Рис. 9. Механизм ферментативной реакции с двумя участками субстрата. А—полная схема, содержащая шесть узлов и каталитических ступеней; уравнение скорости имеет порядок 4:4; Б — упрощенная схема с объединенным переходом ES->EP; она содержит только четыре узла и описывается уравнением скорости порядка 3:3 (по W. Bardsley et al., 1980): основной чертой этого механизма является то, что субстрат, в дополнение к каталитически активному центру, может связываться с модификаторным участком, изменяя связывание субстрата, высвобождение продукта и (или) катализ
классической линейной кинетике включение каталитической ступени приводит к усложнению схемы, но не изменяет формы уравнения.
О необходимости применения методов нелинейной кинетики свидетельствует и обширный экспериментальный материал. Общее число примеров отклонений от кинетики Михаэлиса насчитывает более 1000 (W. Bardsley et al., 1980. Возможно, что часть кривых проявляет нелинейность вследствие артефактов, связанных с эффектами ионной силы, неправильно подобранными экспериментальными условиями, наличием загрязнений и т. д., однако основная часть результатов ферментативной кинетики при исследовании в расширенном интервале концентраций субстрата требует описания дробно-рациональными функциями порядка 2:2, 3:3, 4:4 и т. д. Рассмотрение максимально широкого интервала концентраций очень важно, так как в большинстве случаев кривые могут асимптотически приближаться к прямой и иметь обширные линейные участки. Следовательно, существует опасность «недоглядеть» перегиб или максимум.
У. Бэрдсли и соавторы (1980) рассмотрели ряд конкретных ферментов: ацетилхолинэстеразу, кислую фосфатазу, аденозиндезами- назу, арилсульфатазу, химотрипсин, фумаразу, пероксидазу и др., для которых с помощью компьютера были построены дробно-рациональные функции разных степеней и выбраны кривые, показывающие наилучшее совпадение с экспериментальными точками (рис. 10). Этот анализ подтвердил необходимость привлечения уравнений высоких степеней и позволил в ряде случаев внести уточнения в ранее полученные уравнения.
44Исследование дробно-рациональных функций с помощью степенного преобразования
4
4
4.1. Изменения формы кривых при степенном преобразовании
В гл. 3 были рассмотрены основные принципы анализа формы кинетических кривых в наиболее распространенных координатных системах, традиционно применяемых в ферментативной кинетике. С точки зрения информации, которую можно получить о форме кривой, эти системы считаются эквивалентными, и отдать преимущество какой-либо из них затруднительно. Однако следует отметить, что для анализа дробно-рациональных функций может оказаться целесообразным введение новых координатных систем.
В гл. 1 было отмечено, что для кинетического изучения транспортных ферментов особое значение приобретает определение таких параметров уравнения скорости, как наименьший показатель степени в числителе и разность между максимальными степенями знаменателя и числителя (параметры п и пг в (1.2)). Задача определения этих параметров для Na, К-АТФазы стимулировала поиск соответствующих методов. Было обнаружено, что указанные параметры удобно определить, если к исходной зависимости и(х) применить степенное преобразование (3. П. Кометиани, 1982). Непосредственно метод определения параметров п и пг приводится ниже, а в данном разделе будет рассмотрено универсальное степенное преобразование, когда одновременно функция и аргумент подвергаются всевозможным изменениям степени: извлечению корня, возведению в степень, делению и умножению на элементарную показательную функцию.
Обозначим новую функцию и аргумент соответственно через F и G:
F=*upx\ G=*uv-x\ (4.1) где р, Z, ц и v — действительные числа. Традиционные графики, кроме логарифмических, являются частными случаями этого преобразования (табл. 4).
Анализ функции G/F требует изучения поведения производных F'g и F"gg. В гл. 3 было введено понятие кажущегося порядка ре- 48
акции со, который определяли как co = d In v/d In x. Оказалось, что производные функции F/G удобно выразить через о, а также через величину Q, формально аналогичную со. Так, если зависимости и/х соответствует <o = d In и/d Inx и to'2=dz In u/(d Inx)2, где z=lnx,
Таблица 4. Функция F/G при различных значениях параметров р, К, р, v
Функция
О
V
Л
U
и ОТ X
1
1
0
0
]/и от 1/х
—1
—1
0
0
и от и/х
1
—1
0
1
х]и от х
—1
1
1
0
то универсальному степенному преобразованию будут соответствовать:
а^дьт^^+х ;(4.2)
d In G рш 4- v
2- = 42Inf = “Дру-М)4 3
(d In G)2(рю + v)3
Нетрудно показать, что производные F'G и F"gg выражаются следующим образом:
dF _ уР+^рш + Х) .4 4
dG х"х (р<о 4- v) *
d2FуР-2*1 {(pv — рХ) tog + 1(рш 4- X) — (рш 4" V)] (рю 4- X) (рю 4- X)]
'-” ■ ■ ■— . Г- . .- - ^^^ . О /
dG2(рю 4- v)3
а также
Fo=-^Q;(4.6)
и
Fee=-^-12'+2(2-1)].(4.7)
и
Через о и Q можно выразить еще одну величину, которая является важной характеристикой для кинетической кривой. Это длина отрезка ординаты, который отсекает касательная к кривой F/G в точке G:
■t^F, а')=-т)»х'-^^к^±21_ ;(4.8)
рю 4- v
тИЛ G)=FO-^.(4-9)
На основе формул (4.4) — (4.9) можно исследовать форму любых кривых, полученных в результате степенного преобразования,
49
если проследить за изменениями to, Q и их производных. Формулы показывают, что наиболее сложные изменения формы кривой вызывают варьирование параметра р. При положительных и конечных значениях аргумента исходные зависимости с/х и 1па/1пх — непрерывные функции и во всей области имеют первые и вторые производные. При степенных преобразованиях непрерывность сохраняется. Однако при варьировании ц можно ожидать, что в некоторых точках производные будут стремиться к бесконечности. Эти точки являются корнями уравнения pto+v=0.
Исследование формы кинетических кривых можно разбить на несколько этапов, которым будут соответствовать области средних, экстремально малых и экстремально больших концентраций лиганда. Под областью средних концентраций подразумевают область положительного «х» за исключением участков, где х->0 и х->оо. Следовательно, в этой области переменные F и G представляют собой положительные и не равные нулю конечные величины без разрыва функции.
В этом разделе будет исследована лишь форма кривых в области средних концентраций. Под этим подразумевается изучение трансформации знака первой и второй производных в зависимости от параметров р, Z, ц и v и определение точек экстремума и перегиба.
Точки экстремума определяются уравнением F'G=0. Легко убедиться, что если Z=0, то при всех остальных преобразованиях точка эстремума сохраняется. Действительно, при м=0 имеем F'G=0. Это означает, что если на исходной функции в точке Xi имеется экстремум, то на новой функции F/G при любых значениях р, v и ц также будет существовать экстремум в соответствующей точке аргумента О,=иР(х,)хЛ.
Нетрудно показать, что максимально возможное количество положительных корней уравнения ю=0 (2р—1), где р определено согласно (1.2). При п=0 (или /п=0) уравнение может не иметь корней. Если п^О и т#=0, то уравнение о=0 обязательно имеет, по крайней мере, один корень. Эти правила можно распространить и на количество точек перегиба, так как F"cg также выражается через to.
В общем случае, когда 2.^0, определяющим уравнением для точек экстремума является уравнение ро+2-=0, при условии, что pro+v^O согласно (4.4). Следует отметить, что для этого уравнения максимально возможное количество действительных и положительных корней также равно ^р—1). Однако при этом точка экстремума не сохраняется. Знак функции F'G зависит от р, ц, 2., v и о. Так, например, при X=v=0 перемена знака определяется отношением р/ц.
Точка перегиба определяется уравнением F"gg = 0. В общем случае при степенном преобразовании переменных точки перегиба не сохраняются. Однако существуют исключения. Допустим, имеется исходная функция F/G, которая при двойном логарифмическом преобразовании имеет производные Q и Q' (см. (4.2)—(4.3)).
Пусть функция F/G подвергается преобразованиям классического типа:
(1/Л) от (1/G), р = м*= —1, Х=р=О;
(4.10)(4.10)F от (FJG), р = ц=1, Х = 0; v= — 1;
(4.10)
(4.10)
(GIF) от G, X=v=l, [i=0, ,р = —1,
тогда для этих функций, исходя из (4.4), вторые производные будут иметь вид:
42(1//^)_ Q2[d(l/G)P — F42(1//^)_ Q2[d(l/G)P — F[-^,+2(2-l)];[-^,+2(2-l)];
42(1//^)_ Q2
[d(l/G)P — F
42(1//^)_ Q2
[d(l/G)P — F
[-^,+2(2-l)];
[-^,+2(2-l)];
(4.11)(4.11)d2F _ G2 (-J^M^O-H)] .
(4.11)
(4.11)
[d(r/G)]2 F (2-1)3
— (G/F) = j | _ 2, _|_ Q (Q _ 1} J dG2 FG 11J
Следовательно, для всех трех преобразований определяющим уравнением точек перегиба является уравнение П(П—1)—Q'=0 и точка перегиба на этих кривых будет сохраняться при их взаимных трансформациях.
Как первая, так и вторая производные при ц=0 представляют собой непрерывные функции. Разрыв может появиться только при ц^О. Точки разрыва определяются уравнением po)+v=O. Из-за сложного вида функции не имеет смысла определять закономерность изменения знака второй производной в общем случае.
Горизонтальный перегиб занимает особое место в исследовании формы кинетических кривых. Точки горизонтального перегиба определяются решением системы уравнений F'G=0, F"gg=0. На основе формул (4.4) — (4.5) легко убедиться, что если Х=0, то при всех остальных степенных преобразованиях горизонтальный перегиб сохраняется. В этом случае точки горизонтального перегиба являются корнями системы уравнений w = 0 и о/2=О.
Рассмотрим еще одну точку, которую можно успешно использовать при классификации кинетических кривых по их форме. Это точка кривой, касательная в которой проходит через начало координат. Из (4.8) видно, что в области средних концентраций эти точки можно определить, решая уравнение: (X—v) + (p—ц)о=0. При этом должно выполняться условие po+v^O, в противном случае касательная вообще не пересечется с осью ординат (будет вертикальной линией).
В той точке кривой, касательная в которой проходит через начало координат, кажущийся порядок можно выразить через параметры степенного преобразования переменных
ш= —; 2=1. (4.12) р —р-
Эту точку для краткости условно можно назвать точкой положительного единичного порядка, в отличие от точки отрицательного единичного порядка, для которой выполняется условие:
шУ"—; S1.(4.13)
р + н-
Линия, проходящая через начало координат и точку отрицательного порядка, имеет наклон, равный наклону касательной по абсолютной величине, но обладает противоположным знаком. Следует отметить, что для возрастающих участков кривой fi>0, а для убывающих Q<0.
Если p=v =—1 и Z=p=0 (график двойных обратных величин), то точки положительного и отрицательного единичного порядка сохраняются, так как при этом условии (4.12) и (4.13) не нарушаются.
Если функция подвергается степенному преобразованию с параметрами р=—1, м=Л=1, р=0 (зависимость (х/и) от х, тогда точка экстремума функции становится точкой положительного единичного порядка, а точка положительного единичного порядка исходной зависимости — точкой экстремума.
В области средних концентраций между точками экстремума, перегиба и «единичного порядка» существует определенное взаимоотношение, которое выражается следующими правилами.
Между двумя соседними точками экстремума или горизонтального перегиба обязательно находится, по крайней мере, одна точка перегиба. Количество точек перегиба в этом интервале нечетное.
Между двумя соседними точками положительного и отрицательного единичного порядка обязательно находится, по крайней мере, одна точка перегиба. Количество точек перегиба в этом интервале нечетное.
Между двумя соседними точками перегиба могут отсутствовать точки экстремума, горизонтального перегиба, отрицательного и положительного единичных порядков.
Исследование убывающих участков дробно-рациональной функции и, в частности, основной кинетической функции и/х (см. (1.2)) наиболее удобно осуществить, произведя замену аргумента на обратную величину: /=1/х (т. е. р= 1, X=p=0, т =— 1). В этом случае получим:
рр
(4.14)(4.14)хп 2 «zxz tm 2 »p-itl V /—ОZ—О
(4.14)
(4.14)
Легко заметить, что вновь полученная функция по форме совпадает с исходной, только вместо констант at и р, имеем ap-i и Ps-t, а вместо п—параметр пт. Следовательно, способ анализа формы кривой и полученные принципиальные результаты общего характе- 62
ра будут аналогичными. Особенно четко это свойство выявляется при исследовании областей экстремально малых и экстремально больших концентраций лиганда при определении кинетических пара метроЕ п и т.
При замене аргумента на обратную величину убывающий участок кривой трансформируется в возрастающий участок и наборот. Это видно из того, что между первыми производными существует следующая зависимость:
л^=—^, (4.15)
т. е. первая производная меняет знак, но точки экстремума в и/х остаются точками экстремума в u/t.
При такой замене переменных точка перегиба не сохраняется. Между вторыми производными функции существует зависимость: /2^=x2Vxx _|_ 2xVx. (4.16)
Однако точка положительного единичного порядка превращается в точку отрицательного единичного порядка и наоборот, так как при таком преобразовании П меняет знак; Q' остается без изменения.
Таким образом, если существует способ исследования возрастающей части функции, то, используя замену аргумента на обратную величину, тем же способом можно изучать и убывающие части функции. Это означает, что если в возрастающей части *и/х используют некоторое преобразование переменных для определения кинетических параметров, то тот же способ можно применить для функции иЦ при определении аналогичных параметров, например для параметра п возрастающего участка и параметра т убывающего участка. .
При степенных преобразованиях наиболее сложным представляется исследование второй производной. В некоторых вариантах степенного преобразования с этой задачей можно успешно справиться. К таким случаям относится, например, зависимость 1/и от 1/х, рассмотренная в гл. 3.
Суммируя изложенное, можно сделать несколько общих выводов о закономерностях трансформации формы кривых при степенных преобразованиях переменных.
Для определения количества точек экстремума на основе экспериментальных данных можно использовать любые степенные преобразования за исключением варианта Х^О. Аналогичный вывод следует и для точек горизонтального перегиба.
Вариант степенного преобразования с Х^О можно использовать для определения кажущегося порядка исходной функции. При таких преобразованиях точка положительного единичного порядка исходной функции превращается в точку экстремума новой зависимости, где выполняется условие: о)=—(Х/р). Например, в точках экстремума на графиках: (х/|/%)от х, (v/xv) от х, (x^/v) от 1/х, кажущийся порядок равен параметру q. .
Как правило, при всех степенных преобразованиях основной
53
зависимости у/х происходит изменение знака второй производной и трансформация точки перегиба. Исключение представляет степенное преобразование с параметрами р=у=1, р=0 и Л^О. При этих изменениях может появиться возможность получения дополнительной информации о молекулярном механизме фермента. С другой стороны, сложность теоретического анализа ограничивает использование этой возможности. Исходя из этого, мы рекомендуем использовать несколько вариантов степенного преобразования. Это графики у/х, (1/ц)~(1/х), 1пу~1пх, 1/р *и — х и (1/}/^^О^ (1М). Использование двух последних преобразований может принести существенный результат при моделировании молекулярного механизма, так как они приближают исходные графики к линейной зависимости.
Естественно задать вопрос: какой смысл имеют исследования формы различных кинетических кривых, если заведомо известно, что при помощи анализа формы кривой в области средних концентраций лиганда невозможно количественно определить параметры уравнения стационарной скорости, а расшифровка их физического смысла также является сложной проблемой? Тем не менее это необходимо.
Во-первых, поскольку точная расшифровка сложных ферментативных механизмов невозможна и требуется использовать математическое моделирование, единственным критерием приближения модели к истинному механизму служит сравнение формы экспериментальных кривых с теоретическими кривыми соответствующей модели. Во-вторых, исследование формы кривых при различных преобразованиях переменных может дать возможность классифицировать кривые и соответственно молекулярные механизмы. Это во многом облегчит задачу расшифровки молекулярного механизма по экспериментальным данным. В-третьих, как будет показано ниже, использование степенного преобразования позволяет определить параметры уравнения стационарной скорости п и т.
Исследование формы кривых
при экстремальных концентрациях лиганда
Использование области экстремальных концентраций для определения кинетических параметров связано с серьезными затруднениями. При сверхмалых и сверхбольших концентрациях лигандов относительная ошибка измерения может возрасти до такой степени, что любые определения в этой области станут недостоверными. Следовательно, возникает необходимость применять метод экстраполяции кривых, т. е. «подогнать» к точкам соседнего рабочего интервала аппроксимирующую функцию, в первом приближении— линейную регрессию. Однако эта процедура почти всегда дает недостоверные результаты (за исключением случая, когда форма кривой области исследования однозначно определяет поведение кривой и в соседних областях).
Таким образом, для решения задачи недостаточно выяснения зависимости формы кривой от искомых параметров. Необходимо подобрать такой вариант преобразования переменных, чтобы в области экстремальной концентрации лиганда форма кривой в «рабочем интервале» однозначно определяла бы поведение кривой в предельной области. Кроме этого требования, по-видимому, необходимо и другое требование: наличие ошибок измерения вынуждает использовать статистические методы оценки параметров и формы кривой. Исходя из этого нужно учитывать, что преобразование переменных сопровождается изменением ошибки, поэтому возможно ее нежелательное увеличение. При этом предпочтительнее использовать такое преобразование, которое позволяет работать в более широком диапазоне. Границу рабочего интервала, с одной стороны, определяет относительная ошибка, но так как с увеличением ферментативной скорости относительная ошибка, как правй- ло, уменьшается, то границу, с другой стороны, будет определять вид преобразования.
На основе вышеизложенного можно выделить варианты преобразования переменных, которые характеризуются тем, что в области экстремальных концентраций лиганда форма кривых зависит от параметров п и т. При этом разделим условно область экстремальной концентрации лиганда на рабочий интервал с малой относительной ошибкой и на предельную область, где из-за большой относительной ошибки применение аналитических методов исключается. Условимся, что нижние границы рабочего интервала и области экстремальных концентраций совпадают.
Анализ дробно-рациональных функций в экстремальных областях концентрации исследуемых лигандов требует нахождения пределов функции и ее производных. Выражения для пределов получаются достаточно громоздкие, даже если ограничиться тремя первыми членами с наименьшими степенями (при х—>0) и тремя последними членами с наибольшими степенями (при х->оо). Поэтому в дальнейшем в таблицах и на рисунках приведены только конечные результаты и опущен вывод соответствующих формул. Использованы также обозначения:
^/=«гР/~аД;
Н1) = ^р—iPs—j ^р—/Ps—Z» х=ря-|-^, х=рт—К
Ра^мотрим зависимость u/x(p=v = l, Х=ц = 0). Имеем:
= -^- [о)(ш— 1)-^]= -^- [о)(ш— 1)-^]£7V•
= -^- [о)(ш— 1)-^]
= -^- [о)(ш— 1)-^]
г=*и; и = х\ ч)х =— w; *ихх х
Для функции и/х в области экстремальных концентраций лиганда можно установить зависимость от степенных параметров п и т. Результаты суммированы в табл. 5 и на рис. 11.
Нетрудно заметить, что при п=0 и т = 0 скорость имеет отличное от нуля конечное значение, а при п">0 и т>>0 у^О. Следова-
Таблица 5. Зависимость пределов функций v, г/ и у,*" от параметрон пит
Функция
х—>0
X>оо
л =0
п = 1
п >2
т = 0
т > 1
lim и
«0 00
0
0
°р
0
lim их
^10
•-ОоРо
«0
№
+0
Н1О
02^2
—0
lim ихх
2 (ОгоРоРюР) й
2D10
0о
+0
2Яю
0^3
+0
тельно, на основе экспериментальных данных легко установить нулевое значение степенных параметров п и т уравнения стационарной скорости. Однако при значениях п^1 и т^\ форма кривых оказывается в принципе одинаковой. Из этого следует, что если п и т — неизвестные величины, то экспериментальные данные, пред-
Рис. 11. Возможные формы кривой и(х при экстремальных значениях аргумента
ставленные в виде графика и/х, не дают возможности их определить. В дальнейшем, если не будет специально оговорено, будем считать, что п=/=0, и лг=/=0.
Следует подчеркнуть, что статистическими методами всегда можно «подогнать» к экспериментальной кривой аппроксимирующую функцию, которая будет иметь приемлемый для ферментативной кинетики вид и достаточно точно совпадать с ней, однако при 56
Рис. 13. Зависимость формы кривой w^lvPx^ от параметра т=ртп—Х в области экстремальных концентраций лигандаРис. 13. Зависимость формы кривой w^lvPx^ от параметра т=ртп—Х в области экстремальных концентраций лиганда
Рис. 13. Зависимость формы кривой w^lvPx^ от параметра т=ртп—Х в области экстремальных концентраций лиганда
Рис. 13. Зависимость формы кривой w^lvPx^ от параметра т=ртп—Х в области экстремальных концентраций лиганда
Рис, 12. Зависимость формы кривой и0хх/уРхх~’ от параметра х = рп+1 в области экстремальных концентраций лиганда
этом проблема точного определения степенных параметров пит, которые имеют основное значение для расшифрования молекулярного механизма фермента, остается нерешенной.
Степенное преобразование типа р = ц, X=v=— 1 является наиболее сложным и интригующим по разнообразию форм. Оно берет свое начало от классического графика у от у/х. Для определения количества центров связывания широко используют график Скэт- чарда, который фактически представляет собой вариант степенного преобразования данного типа. Рассмотрим эту зависимость более детально. После подстановки значения параметров степенного уравнения в формулы (4.4) — (4.5) получим:
Р=т»хЧ Q=t>fxx-4 f^-^^t^ ;
рю -j— X — 1
(4.18)и ее пове-(4.18)и ее пове-^,. хх+2 [(рш + X) (pw + X — 1) — Р^]
(4.18)
и ее пове-
(4.18)
и ее пове-
(р<|> 4- X — I)3
Результаты расчета предельных значений функции F/G производных суммированы в табл. 6 и 7 и на рис. 12 и 13.
На рис. 12 и 13 показано, что кривые имеют характерное
дение при изменении и и г. При этом ясно, что одновременное варь-
Таблица 6. Зависимость пределов функций F, G, Fg' и Fgg" (4.18) от параметра х=рп+Х
Условие
Х>1
Х=1
1<х<0
х=0
х<0
1=0
1
1
1
р < — п
р<0
Р=1
—1>л—1
—1=л—1
п > — Х> >п-1
—1=л
—1>л
lim F л-0
0
0
0
«0
Ро
0
lim G л-о
0
/ «о V ( к /
ОО
ОО
ОО
lim Fq л—0
—0
ДрРо
Р^ю
—0
рОю*2 «оРо
ОО
lim Fqq л—0
пГРо \
\ Oq /л=2
оо X > 2
±const
+0
JWp^a °оРо
—0
ирование параметров р и X не имеет смысла. Естественно применять преобразование при р = 1 с варьированием X или при Х=0 с варьированием р. Однако в обоих случаях возникает одинаковый вывод о том, что форма кривых зависит от параметров степенного
Таблица 7. Зависимость пределов функций F, О, F'o и F"gg (4.18) от параметров т=рт—X
Условие
T>0
t=0
—1 <t<0
T=—1
К—1
1 = 0
P>0
—
1 p> —— m
1
p = — — m
1 p< — — m
р=1
Km
X=m
m+l>X>m
‘k=m+l
X>m+1
lim F
*-*<»
0
/ «pV
OO
oo
oo
Нт G
0
0
0
/ Ct/AP
У
oo
lim Fq ДГ**>
oo
EHW apPs
—oo
apPsx2 p/Go
oo
Пт Fgq jr-*<*>
—oo
± const
oo
2
\ aP )
apPj (pG io)2
x'+2
преобразования пит (табл. 6 и 7). При этом зависимость будет иметь однозначный характер, если допустить, что величины 1/р и X могут принимать только целочисленные значения.
Обсуждаемый вариант преобразования имеет существенную отличительную черту. Все производные функции при конечных, отличных от нуля значениях аргумента могут иметь разрыв. Это обусловлено наличием в знаменателе члена (рю+Х— 1), который при pw+X=l равен 0. Кроме того, вторая производная также обнаруживает разрыв в точке G=0 при условии х>2.
Ранее было отмечено, что из рассмотрения логически исключается случай р=0 и v=0. Следовательно, график может иметь горизонтальную асимптоту (х=0) только при варьировании параметра X. Уравнение горизонтальной асимптоты можно получить при значении Х=—я(р = р=1, v—1—п). Оно имеет вид:
т=-^. (4.19)
(4.20)(4.20)Рис. 14. Зависимость формы кривой црхх/(1/х) от параметров х=рп+Х и т=рт—X в области экстремальных концентраций лигандаРис. 14. Зависимость формы кривой црхх/(1/х) от параметров х=рп+Х и т=рт—X в области экстремальных концентраций лиганда
(4.20)
(4.20)
Рис. 14. Зависимость формы кривой црхх/(1/х) от параметров х=рп+Х и т=рт—X в области экстремальных концентраций лиганда
Рис. 14. Зависимость формы кривой црхх/(1/х) от параметров х=рп+Х и т=рт—X в области экстремальных концентраций лиганда
Степенное преобразование типа р=0, v=—1(иРхк от 1/х) наиболее перспективно с точки зрения применения аналитических методов для определения кинетических параметров. Эту функцию и ее производные можно легко получить из выражений (4.4) — (4.5) после соответствующей подстановки р, ц, Л и v.
F=*ovxx; О=х~1;
Fq = — -и^х^ (pw+X);
Fgg = У Р-ХХ+2 J (рю + X) (р<о -]- X -f- 1) + рЮг)]
Конечные результаты определения предельных значений F и F'g показаны на рис. 14 и в табл. 7 и 8. Следует заметить, что наиболее простые преобразования претерпевает аргумент О=1/х. При т<0 и т>1 кривая имеет вогнутую форму; при т=0 или 1,
она может принять выпуклую форму, но не всегда. В зависимости от знака т кривая может быть возрастающей или убывающей, однако однозначного перехода в зависимости от т не наблюдается.
Более интересной является трансформация формы кривой при варьировании х, когда при значениях х =—1 и х = 0 появляются соответственно наклонные и горизонтальные асимптоты. При измерении р(Х = О) появление горизонтальной асимптоты невозможно.
Здесь не рассматривается частный случай п=0 (или ги=0), когда степенные параметры известны, так как определяются более
просто без применения сложных степенных преобразований переменных. Основным результатом исследования формы кривой в обсуждаемом случае является вывод о том, что трансформация кривой зависит от х; при этом может появиться асимптота. Следует отметить, что если изменяется только один параметр, то это условие может выполняться при различных значениях второго параметра. Поэтому в случае варьирования X наиболее простым является
вариант р=±1, а при изменении р удобнее применить вариант Х=0.
Конечная цель использования степенных преобразований заключается в получении информации о молекулярном механизме фермента. В данном разделе задачу можно конкретизировать и сформулировать как нахождение такого варианта степенного пре-
Таблица 8. Зависимость пределов функций F, F'g и F"gg (4.20) от параметров х=рл+Х
Условие
Х<1
X1
—1<х<0
х-0
х>0
х=о
р<—1/л
р=—1/л
—1/л<р<0
—
р>0 .
Р=1
Х<—(л+1)
X(л+1)
—(л+1)<
<Х<— п
Х=—л
Х>—л
р=—1
Х<л—1
Х=л—1
л—1+Х<0
Х=л
Х>л
Jim F л-^о
ОО
ОО
ОО
( Со \Р
( Ро J
0
lira Fq Л^
ОО
/ Ор у \ Ро /
+0
Р^ю / Оо у^
—«оРо \ Ро /
0
lim Fqq л-*0
„ / On \Р
\ Р0 /
X х= — 2
0
—0
2pDio(ao)x3 ао?о (?о)р
+0
образования, который в областях экстремальных концентраций после трансформации наибольшим образом приближает функцию к линейной зависимости, к асимптоте.
Рассмотрим в общем случае функцию F/G. Можно показать, что если она линейна, то величина кажущегося порядка fi стремится к единице. Поэтому нахождение условий линеаризации функции F/G эквивалентно определению условий, при которых Q=l. Исследуя поведение функций о и Q в экстремальных областях концентраций, нетрудно вычислить, что lim(o=n, limo) =—т, где со = х-**> х-*О
= dlnu/dlnx и и(х) определяется по (1.2). Функция Q выражается через со согласно (4.2):
О рсо + X
ро>V
При х->оо возможно несколько преобразований, при которых v равняется единице. Это следующие случаи:
ip =—1/л, X=p=0, v=—1.
р=1, Х=(л+1), р=0, v=—1.
р=—1, Х=п—1, р=0, v=—1.
При х->0 существует также три варианта:
р=—\/т, л=0, р=0, v=l.
р=1, Х=щ+1, р=0, v=l.
р=—1, Х=— (т—1), р=0, v= 1.
Рассмотрение этих вариантов показывает, что для приближения F/G в области экстремальных концентраций к линейной зависимости необходимо варьировать параметры р и X. Ниже будет показано, как можно использовать эти преобразования для определения п и т.
Определение степенных параметров пит
В предыдущем разделе были выделены наиболее удобные для определения степенных параметров типы преобразования, которые можно объединить в две группы.
Степенное преобразование с вариабельным Х(ц=0, v= + l, р = ±1). К этой группе относятся четыре графика:
ц=0, v =—1,р=1, X— вариабельное;
р=0, v=—1, р=—1, X— вариабельное;
р = 0, v= 1, р= 1, X— вариабельное;
ц = 0, v= 1, р=—1, X— вариабельное.
Степенное преобразование с вариабельным р(р = Х = О, v= = ±1). В эту группу объединены два графика:
ц=Х=0, v=—1, р— вариабельное;
р,=Х=О, v=l, р — вариабельное.
Все эти графики обеспечивают линеаризацию F/G в экстремальных областях аргумента.
Для определения п можно использовать графики 1а, 16 и 2а, а для определения пг— графики 1в, 1г и 26. Единственное различие между членами пар: 1а и 1в, 16 и 1г, 2а и 26 — заключается в том, что в одном из них аргумент заменен на обратную величину, при этом вид функции у этих пар идентичен, если под п подразумевать т, и наоборот. Следовательно, можно ограничиться рассмотрением вариантов 1а, 16 и 2а.
Табл. 8 и 9 и рис. 14 показывают, что при различных значениях вариабельного параметра степенного преобразования (4.20) форма кривых графиков 1а, 16 и 2а изменяется и при определенном значении принимает характерную форму. Это зависит от параметра п. Идентификация формы не требует вычисления предельных величин, так как форму кривой в области экстремальных концентраций полностью определяет форма кривой в рабочем интервале.
Свойства степенных преобразований 1а, 16 и 2а можно взять за основу метода для определения параметра п. Действительно, в области экстремально малых концентраций лиганда график 2а 62
имеет вогнутую форму, если р<—1/л, выпуклую форму при р> >>—\(п и максимально приближается к линейной функции (к асимптоте) при р=—1/л. Следовательно, максимальное приближение к линейности и смена знака второй производной (отражающая переход вогнутости в выпуклость) являются критериями определения параметров п. Аналогичная ситуация существует при ис-
Таблица 9. Зависимость пределов функций F, F'g и F"gg (4.20) от параметров т=рт—X
Условие
Т<0
т=0
0<Т<1
т=1
Т>1
х=о
Р<0
—
0<р<1/т
р=1/т
Р>1/т
Р=1
Х>л
Х=п
п>Х>п— 1
Х=п—1
Х<п—1
р=—1
Х>—п
Х=—п
—л>Х>
>-(л+1)
Х=—(л+1)
Х<
—(л+1)
lim F G-*0
ОО
/ cq V
(ь /
0
0
0
Um F'g о-т
ОО
аЯю / «р У °p?s Ар»/
ОО
/ ар \р
*■17/
+0
пользовании графиков 1а и 16 с той разницей, что параметр можно определить по двум переходам через значение X. Этими значениями являются Х=—(М-1) и Х=—п (вариант 1а) или Х=п—1 и К=п (вариант 16). При этих значениях графики наиболее приближены к линейной функции, т. е. к наклонной или горизонтальной асимптоте.
Для успешного применения метода определения пит решающее значение приобретает аналитический метод оценки формы кривой и определение границ рабочего интервала.
Оценка формы кривой. Допустим, существует функция уг= =fr(x), которая представлена экспериментальными точками ун. Будем считать, что в исследуемом интервале функция и ее производные являются непрерывными. По точкам yri проводим линию регрессии:
¥г=агД-Ьгх.
Обозначим разницу между расчетными и экспериментальными значениями функции через \ri=Yri—yri. Фактически Ап-— ошибка регрессии, которая при отсутствии ошибок измерения целиком определяется формой кривой, т. е. отклонением от линейности. Дей-
63
ствительно, если fr(x) в исследуемом интервале является линейной функцией (f"xx=0), то для всех точек выполняется условие ДГ1=0. Ясно, что кривые будут характеризоваться определенным чередованием знаков Ди. Вогнутой кривой tf"Xx>0) будут соответствовать положительные Ап- по краям и отрицательные в середине; выпуклой— наоборот. Вогнутые и выпуклые кривые будут иметь только две смены знака Ан. Если же кривая приближается к линейной, то распространение знаков будет случайным. Таким образом, при помощи регрессии можно достаточно просто оценить форму кривой: знак коэффициента регрессии Ьг показывает возрастание— убывание функции, а чередование знаков Ari указывает на выпуклость или вогнутость. Этим методом можно обнаружить и перегиб.
Экспериментальные точки, однако, имеют ошибку измерения, которая обычно накладывает серьезные ограничения на достоверность оценки формы кривой. Именно поэтому рекомендуется не оценивать форму знаком Ari в одной точке, а исследовать распределение знаков всех Ан исследуемого интервала и использовать методы статистики (законы распределения средних ошибок, коэффициент корреляции, меру линейности, взвешенную среднюю квадратичную ошибку и т. д.).
Суммируя вышеизложенное, можно предложить следующий метод оценки параметров п и т. Допустим, существует набор N экспериментальных точек в виде среднего арифметического (у,), средней квадратичной ошибки (ог) и числа параллельных измерений (if,). Обычно в экспериментах число параллельных для разных точек одинаково, поэтому будем считать, что тр = ц.
Для определения п используем степенное преобразование р= = — 1/г и Х= — 1, а для определения т: р=— 1/г и /.= 1. Соответственно для каждого значения г получим набор новых точек: СГг^^^-1^; /=1/х (или t=x);
«„=1//(^"’^'М.
Для каждого значения г рассчитываем линию регрессии и вычисляем отклонение от нее (Аг/) точек Uri. Исследуем распределение знаков Ан и, как было указано выше, определяем значение г=п (или r=m), т. е. значение г, при котором отклонение от линейности минимально.
Для каждого значения г рассчитываем взвешенную среднюю квадратичную ошибку для аппроксимирующей функции MU и MV:
По этим величинам определяем минимальное значение MU и MV и соответствующее значение гт!П, считая при этом, что rmIn=n (или ТпгМ = /и).
64
Одновременно для каждого значения г можно вычислить коэффициент корреляции и оценить линейность аппроксимирующей функции по критерию Фишера. Нужно ожидать, что для г=п или г=ш коэффициент корреляции будет иметь максимальное значение. Для оценки линейности со стандартным значением критерия Фишера (F) сравнивается величина L;
м чX ^Цг1 — иг1У
, Nr-i-i
ri i-l
степени свободы \\=N—2 и v2=A^(t]—1). Считаем, что при L<Z.F имеется удовлетворительная линейность. Обычно при г=п или г= = т величина L минимальна, как и ошибка регрессии.
Сравнительная оценка рабочего интервала концентраций. Нижняя граница рабочего интервала полностью определяется относительной ошибкой измерения, а верхняя находится в области экстремально больших концентраций и всегда стремится к бесконечности. Ясно, что при отсутствии ошибки измерения рабочий интервал для определения п совпадает с областью экстремально малых концентраций. В самом рабочем интервале ошибка измерения настолько мала, что аналитические методы дают достоверные результаты при вычислениях.
Попытаемся оценить верхнюю границу рабочего интервала для трех вариантов: 1а, 16 и 2а. В результате степенного преобразования исходная функция и/х трансформируется в функцию F/G, которая в области экстремальных концентраций максимально приближается к линейной зависимости. Соответственно величина со трансформируется в Q. Для линейной функции должно выполняться условие: O<Q<1.
Естественно допустить, что функцию F/G можно считать достаточно приближенной к линейной зависимости, если выполняется условие: 0<Q<2.
При степенных преобразованиях 1а, 16 и 2а максимальное приближение к линейной зависимости происходит при значениях ва- риабечьных параметров.
Для 1а: Х'=— (^4-1) и Х"=—п;
для 16: Х' = п—1 и Х"=п;
для 2а: р=1/п.
Подставляя эти значения в (4.2), получим, что максимальное приближение к линейности возможно, когда со изменяется в следующих пределах.
Для 1а: п—1<<в<и+1 и п—2<о)<п; для 16: п—Ксо<п-|-1 и n<G)<n4-2; для 2а: О<со<2п.
Эти неравенства показывают, что наиболее широкий рабочий интервал (по крайней мере, теоретически) присущ варианту 2а. Следовательно, именно с применением этого варианта связана максимальная вероятность линеаризации исходной зависимости и/х в области экстремально больших концентраций лиганда.
По определению, нижняя граница рабочего интервала зависит от ошибок измерения. Допустим, что исходная зависимость и/х представлена в виде средних арифметических и, параллельных измерений, средней квадратичной ошибкой среднего арифметического Ci и относительной ошибкой ei=GiVi. Будем считать, что аргумент функции не имеет ошибки измерения. Тогда для варианта р = 0, v=—1, т. е. F=vpxx и G=\/x, согласно законам распространения средних ошибок для малых выборок, можно записать: о? (Z7) = Р2 (^МУ f—Y ; ^ (F) = p2ef Со), \ «г /
где Ci^F) и £i(F) квадратичная и относительная ошибки экспериментальных точек новой зависимости F /G. Следовательно, относительная ошибка при использовании вариантов 1а и 16 не изменяется, тогда как при использовании варианта 2а (р = — 1/м) уменьшается в п раз. Вариант 2а и в этом случае имеет преимущество по сравнению с вариантами 1а и 16.
Подводя итог, можно заключить, что определение степенных параметров п и m основывается на том, что при г=п и r=m линия регрессии в рабочем интервале концентраций максимально приближается к асимптоте функции. Условием аппроксимации является стремление второй производной функции к нулевому значению на всем рабочем интервале. Основываясь на (4.4), легко показать, что при этом должно выполняться условие:
—г^4-<о(ш— l)=r(ln£7h/4-[(ln£7h]2=0,
где г=1пх; /=1/х.
Следует подчеркнуть, что это равенство должно выполняться не только в отдельных точках t, но и на всем «рабочем» отрезке, поэтому параметр г является функцией I. Перепишем условие следующим образом:
r=V?(Z)=-^—=-№11.
toz + <0— (IncZ)^
Тогда условие линеаризации участка кривой можно опредепить как требование: d/?(/)/d/~O.
Выше было показано, что границы рабочего интервала зависят от величины со и от ошибки измерения. На практике определение конкретного рабочего интервала основано на исследовании функции R^t).
Исследование субстратной зависимости транспортных АТФаз
Особенности субстратной зависимости АТФазных реакций
В гл. 5 исследование субстратной зависимости транспортных АТФаз проведено на примере Na, К-АТФазы. Этому есть две причины: во-первых, авторы располагают большим экспериментальным материалом именно по Na, К-АТФазе; во-вторых, Na, К-АТФаза представляет собой самую сложную систему средн транспортных АТФаз, так что кинетические методы, пригодные для ее исследования, вполне могут быть использованы и для других АТФаз. Авторы полагают, что многие особенности функционирования и регуляции Na, К-АТФазы, выявленные с помощью кинетических методов анализа, будут обнаружены также и при исследовании других транспортных ферментов.
При кинетическом исследовании АТФаз необходимо учитывать их специфическую особенность: АТФ образует комплекс с ионами магния. Возникает два вопроса: что является истинным субстратом для АТФаз (MgATФ, АТФ или оба лиганда вместе) и какую роль играют несубстратные компоненты системы в регуляции АТФазной активности? Для Na, К-АТФазы эти вопросы приобретают принципиальное значение.
На эти вопросы были предприняты попытки ответить двумя способами: прямым измерением связывания лигандов и кинетическим анализом зависимости скорости гидролиза и фосфорилирования от концентрации лигандов. Результаты этих исследований можно суммировать в виде следующих основных выводов.
Истинным субстратом для Na, К-АТФазы служит комплекс Mg АТФ. В исследовании Л. Плеснера и соавторов (1981) показано, что гидролизуется не только образовавшийся в растворе комплекс Mg АТФ, но и комплекс, сборка которого происходит на ферменте. Однако необходимым условием последнего является присоединение вначале АТФ, так как исходное присоединение к ферменту Mg2+ вызывает образование «тупикового» комплекса.
Не вызывает сомнения, что функциональная единица фермента может иметь несколько нуклеотидсвязывающих участков с раз- 3* 67
личным сродством (J. Robinson, М. Flashner, 1979). Различают участки с высоким сродством (порядка 100 мМ-1) и с низким сродством (порядка 1—10 мМ-1). Обычно участок с высоким сродством связывают с Na-формой фермента (FJ, а участок с низким сродством — с К-формой фермента (^з). Не уста
новлено, однако, сосуществуют ли они одновременно, или появ
ляются последовательно, т. е. их место среди этапов молекулярного механизма Na, К-АТФазы не определено. Тем не менее при расшифровке механизма Na, К-АТФазной реакции необходимо исходить из возможности существования двух или более нуклеотидсвя-
зывающих участков.
Ионы Mg2+— один из компонентов образования субстрата MgATФ, однако эффект Mg+ имеет более сложный характер. Известно, что Mg2+ влияет на определенные стадии реакции: Е\Р^Е2Р и Е{^Е2. Кроме того, в миллимолярных концентрациях Mg2+ ингибирует связывание нефосфорилирующих аналогов АТФ (р-у-имидо-АТФ); аналогично Mg АТФ ионы Mg2+ ингибируют АДФ/АТФ-обмен, увеличивают Ao,5 для Na+ (активатора фосфорилирования фермента и Na-АТФазной реакции). Этот эффект не имитируется MgATФ (J. Robinson, М. Flashner, 1979). Все
Рис. 15. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации S (мМ) в обратных координатах при различных концентрациях свободного Mg8+ (мМ, цифры около кривых)Рис. 15. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации S (мМ) в обратных координатах при различных концентрациях свободного Mg8+ (мМ, цифры около кривых)вышеизложенное невозможно объяснить занятием субстратных участков ионами Mg2+. Более вероятно, что для Mg2+ существует специальный участок связывания, где Mg2+ может проявить свое действие мощного модификатора. Следовательно, при расшифровке молекулярного механизма Na, К-АТФазы необходимо исходить из возможности существования на функциональной единице фермента участков связывания свободных ионов Mg2+.
Рис. 15. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации S (мМ) в обратных координатах при различных концентрациях свободного Mg8+ (мМ, цифры около кривых)
Рис. 15. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации S (мМ) в обратных координатах при различных концентрациях свободного Mg8+ (мМ, цифры около кривых)
Кинетические кривые обычно исследуют при фиксированны с концентрациях свободного АТФ, Mg2+ и комплекса MgATФ. Фиксирование концентрации свободных ио-
нов магния (Л1) применяли во всех кинетических исследованиях Na, К-АТФазной системы, ставящих целью идентифицировать истинный субстрат. При этом все исследователи пришли к единому мнению, что комплекс MgATФ(S) является истинным субстратом для Na, К-АТФазы, однако их выводы о роли свободных ионов Mg2+ были диаметрально противоположного характера (Т. Hexum et al., 1970; J. Robinson, 1974; L. Plesner, I. Plesner, 1981).
Все измерения были проведены при сравнительно малых концентрациях комплекса MgATФ (S^l мМ), что вполне оправданно с точки зрения классической кинетики. Наиболее тщательно эта зависимость исследована в работе JI. Плеснера и соавторов (1981). Они использовали широкий диапазон фиксированных концентраций свободного Mg2+ (0,06 мМ<М<;9 мМ) и проводили строгую статистическую обработку результатов.
Авторы данной книги проводили аналогичные эксперименты в более широком интервале концентраций S. Было получено, что в традиционной области концентрации MgATФ (5^7 мМ) результаты принципиально совпадали с результатами Плеснера и соавторов. Поэтому кинетическая модель этих авторов была использована как исходная для дальнейшего анализа. Необходимость дополнительных исследований, однако, была продиктована тем фактом, что при больших концентрациях субстрата (S>1 мМ) зависимость u=f(S) при фиксированном Mg2+ имела явно нелинейный характер (рис. 15). Это не согласуется со схемой Л. Плеснера и соавторов (схема 1), из которой следует, что при фиксированных концентрациях М в обратных координатах линейность должна сохраняться и при больших S.
Схема 1
Более тщательное исследование зависимости v=f(S, А, М)1 в различных условиях позволило сделать ряд уточнений. На рис. 16—19 приведены основные графики зависимости скорости Na,
*Л — концентрация свободных ионов АТФ, М— концентрация свободных ионов Mg2+, S — концентрация комплекса MgATO.
J
101/S
Рис. 16. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации S (мМ) в обратных координатах при различных концентрациях свободного АТФ (цифры около кривых обозначают концентрацию, мМ)
Рис. 17. Вторичный график зависимости 1/и = =f(VS) (см. рис. 16). А—зависимость наклона прямых (<р) (мг белка-ч-мМ/мкмоль Фн) от концентрации А; Б — зависимость пересечения с осью ординат (У) (мг белка-ч/мкмоль Фн) от концентрации А
Рис. 18. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации S (мМ) в обратных координатах при различных концентрациях А (цифры около кривых показывают концентрацию, мМ)Рис. 18. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации S (мМ) в обратных координатах при различных концентрациях А (цифры около кривых показывают концентрацию, мМ)Рис. 19. Зависимость обратной величины Na, К-АТФазной активности от концентрации Mg2+ (мМ) при фиксированных значениях S (мМ)Рис. 19. Зависимость обратной величины Na, К-АТФазной активности от концентрации Mg2+ (мМ) при фиксированных значениях S (мМ)
Рис. 18. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации S (мМ) в обратных координатах при различных концентрациях А (цифры около кривых показывают концентрацию, мМ)
Рис. 18. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации S (мМ) в обратных координатах при различных концентрациях А (цифры около кривых показывают концентрацию, мМ)
Рис. 19. Зависимость обратной величины Na, К-АТФазной активности от концентрации Mg2+ (мМ) при фиксированных значениях S (мМ)
Рис. 19. Зависимость обратной величины Na, К-АТФазной активности от концентрации Mg2+ (мМ) при фиксированных значениях S (мМ)
К-АТФазы (у) от концентрации А, М и S. Как видно на рис. 16, в области 0,1 mM^S^I мМ при А = const зависимость носит линейный характер. Линейность сохраняется в достаточно широком диапазоне концентрации свободного АТФ (0,02 мМ^А^2 мМ). Прямые проведены методом наименьших квадратов, и параметры прямых статистически обработаны.
В этих условиях зависимость наклона кривой от А проявляла четко выраженную линейность (рис. 17, А), а зависимость точки пересечения от А имела более сложный характер (рис. 17, Б). При малых концентрациях А (^0,2 мМ) отрезок, отсекаемый прямой, уменьшался при увеличении А, при больших концентрациях достоверных измерений не наблюдалось. Это означает, что при концентрации 0,2— 2 мМ свободный АТФ ведет себя как конкурентный ингибитор, что совпадает с ранее высказанным предположением (Т. Нех- um et al., 1970; J. Robinson, 1974).
При больших концентрациях МдАТФ, однако, происходит резкое изменение картины (рис. 18). В обратных координатах наблюдается нелинейная зависимость при S>1 мМ. Кривые имеют вогнутую форму, и первая
производная становится отрицательной. Таким образом, аномальное влияние свободного АТФ на скорость ферментативной реакции при больших значениях S указывает на более сложную роль АТФ как модификатора системы.
При фиксировании концентрации MgATO кривые имеют сложную форму (рис. 19). Например, при 5 = 0,1 мМ зависимость 1/и = =f (М) имеет четко выраженный экстремум и точку перегиба. Следует отметить, что при 5=const и стремлении одного из свободных лигандов к нулю, концентрация второго свободного лиганда возрастает. Этот процесс сопровождается уменьшением ферментативной активности. Следовательно, в отсутствие одного из свободных лигандов второй играет роль ингибитора и не может быть истинным субстратом для Na, К-АТФазы.
Отклонение от линейности при Af=const указывает, что модель, изображенная на схеме 1, не является минимальной и ее следует расширить. Это означает появление дополнительных участков связывания и новых ступеней в кинетической схеме.
Новая модель должна быть обязательно построена на основе модели Плеснера. Эта необходимость вытекает из того факта, что при малых концентрациях комплекса MgATФ, когда появляется возможность пренебречь членами уравнения скорости с квадратичными и более высокими степенями, се экспериментальные кривые с высокой точностью описываются моделью Плеснера.
На основе представленного выше экспериментального материала и литературных данных аналогичного характера можно сформулировать необходимые условия, выполнение которых будет носить обязательный характер для истинной «минимальной» модели Na, К-АТФазной системы.
Условие 1. При фиксировании концентрации ионов Mg2+ экспериментальные кривые в обратных координатах представляют собой семейство функций (7м=/(1/5) со следующими характерными признаками: кривые монотонно возрастают; кривые не имеют перегиба, причем нулевое значение функции достигается при очень больших значениях t^t=\/Sy, кривые выпуклы при малых значениях аргументов; кривые имеют асимптоты; кривые являются дробно-рациональными функциями следующего вида:
р+1 / р
Цм=4 2 кМ / 2 а'/-'’ где р> к /—О / f—О
Условие 2. Значения коэффициентов асимптоты функции UM = —f(f) зависят от величины фиксированного М. Должны выполняться следующие условия: зависимость наклона асимптоты от М монотонно возрастающая функция, выпуклая при малых значениях М и переходящая в прямую; отсекаемый асимптотой отрезок ординаты также зависит от М, это вогнутая кривая, имеющая минимум и стремящаяся к асимптоте.
Условие 3. При фиксированной концентрации свободного АТФ экспериментальные кривые в обратных координатах представляют
семейство функций UA=f(f), которые: содержат одну точку экстремума; при больших значениях А не имеют, а при малых значениях А имеют перегиб, причем перегиб имеет место при />1 мМ-1; имеют асимптоты; являются дробно-рациональными функциями следующего вида:
/>+m+l/ р+1
UA=t 2 ₽'/-' / 2 ait~1' ™ ^> 1 и ^ > !•
1—01 1-0
Условие 4. Значение коэффициентов асимптоты функции UA = =f(t) зависит от величины фиксированного А. Должны выполняться следующие условия: наклон асимптоты является линейной функцией А; отсекаемый асимптотой отрезок ординаты имеет вид гиперболической функции; при малых значениях А первая произ- одная отрицательна, при больших — равна нулю.
Условие 5. Из экспериментов с фиксированием концентрации М§АТФ вытекают следующие условия: кривые имеют точку экстремума; в зависимости от значения S кривая может иметь точку перегиба; кривая имеет асимптоту.
Условие 6. lim и = С, где С конечная, не равная нулю величина. S->oe
Это условие вытекает из экстраполяции кривых при экстремально большой концентрации лигандов. Его выполнение не вызывает сомнения при малых значениях свободного АТФ. Однако при очень больших значениях свободного АТФ из-за резкого увеличения спонтанного расщепления АТФ и одновременного уменьшения активности резко увеличивается относительная ошибка измерения, что снижает достоверность определения предела lim и при А->оо. Поэтому в дальнейшем не будет исключаться возможность, что limu=0, при S-vco и А->оо.
В самом общем случае рассмотренные условия диктуют следующую минимальную схему:
Схема 2
Эту симметричную относительно ОЕО модель можно упростить:
Схема 3
Анализ дробно-иррациональных функций
Для уточнения схемы 3 желательно исследовать кинетические кривые с фиксированным отношением Ml А. При фиксировании концентрации одного из лигандов системы S, А и М скорость формально становится функцией одного переменного. В этом случае учитывается воздействие на скорость всех трех лигандов. Правда, при достаточно больших концентрациях одного из свободных лигандов (Л или М), независимо от значения S, можно пренебречь действием второго свободного лиганда, но тогда диапазон изменения концентрации фиксированного лиганда будет резко ограничен. Этих затруднений можно избежать, если использовать способ фиксации отношения К=М/А. Тогда М=V^KtS и А = 1^KrS/X, где Кт — константа диссоциации комплекса MgATO.
Следовательно, при достаточно больших значениях X, из-за малой величины А можно пренебречь его действием на скорость, а при достаточно малых значениях X — действием М. Вышеизложенное хорошо иллюстрирует диаграмма на рис. 20. Следует отметить, что варьирование М в диапазоне А1<0,1 мМ и Л в диапазоне А-< <0,02 мМ не вызывало достоверного изменения скорости реакции. Кроме того, оказалось, что при Л1>5 мМ действием А также можно пренебречь. Поэтому удовлетворительными можно считать отношения Х = 100 и Х = 0,01.
При фиксированном отношении Х = М/А скорость реакции превращается в дробно-иррациональную функцию. При анализе формы таких кривых обнаруживаются некоторые сложности, однако возможность исключения действия одного из лигандов при широком диапазоне изменений двух остальных сильно облегчает расшифровку молекулярного механизма фермента.
0.01 —0.01 —Используя метод Кинга — Альтмана, можно легко получить уравнение стационарной скорости, которое, учитывая, что А =
0.01 —
0.01 —
1 » имеет вид:
Ро + ₽i/2^ lyf2 + 31^ 1 + Рз/2^ 3^2 + Рг^2 2е0 (а^-1 + а3/2^”3^2 + а2^-2)
Модель, введенная в предыдущем разделе (схема 3), накладывает определенные ограничения. Например, а0 и ai/2 — коэффициенты числителя дробно-иррациональной функции £70 01 =/(/), равны нулю. Тогда при больших значениях аргумента форму кривой
Рис. 20. Диаграмма зависимости AM=KtS:Рис. 20. Диаграмма зависимости AM=KtS:Кт=0,09 мМ; цифрами около кривых обозначена концентрация комплекса S (мМ); пунктирные линии соответствуют фиксированному отношению Х=М/ДКт=0,09 мМ; цифрами около кривых обозначена концентрация комплекса S (мМ); пунктирные линии соответствуют фиксированному отношению Х=М/Д
Рис. 20. Диаграмма зависимости AM=KtS:
Рис. 20. Диаграмма зависимости AM=KtS:
Кт=0,09 мМ; цифрами около кривых обозначена концентрация комплекса S (мМ); пунктирные линии соответствуют фиксированному отношению Х=М/Д
Кт=0,09 мМ; цифрами около кривых обозначена концентрация комплекса S (мМ); пунктирные линии соответствуют фиксированному отношению Х=М/Д
будет определять поведение следующих функций: dUo,o\/At и d2t/o,oi/d/3. Можно показать, что:
llmJ^=-fc_>0; 11m d2tZo01 = -0;
t-*-» d^ Gqi >«d^2
lim/-►oolim/-►oo(^-'-^-^HmjT\dr /t-*~(^-'-^-^HmjT\dr /t-*~“l?l/2 — a3/2?02gj“l?l/2 — a3/2?02gj
lim
/-►oo
lim
/-►oo
(^-'-^-^HmjT
\dr /t-*~
(^-'-^-^HmjT
\dr /t-*~
“l?l/2 — a3/2?02gj
“l?l/2 — a3/2?02gj
После подстановки значения коэффициентов получим:
(«32^0^0^1/2) =(«32^0^0^1/2) =к psк ps
(«32^0^0^1/2) =
(«32^0^0^1/2) =
к ps
к ps
где Ks и Ка — определенные комбинации констант равновесия (/G) отдельных ступеней реакции, изображенной на схеме 3. Учитывая, что а, и Pi положительные величины, получим, что при больших значениях аргумента форма расчетной зависимости (по схеме 3) в точности совпадает с формой экспериментальной кривой (монотонно возрастающая, выпуклая кривая, касательная всегда
пересекает положительную часть ординаты, не имеет асимптоты), которая показана на рис. 21.
Таким образом, исследование формы кинетических кривых позволяет определить, что ao=ai/2 = O, ai#=0, и 0з/2=/=О (или 02=7^0). Так как приходится допустить связывание с фосфорилированным ферментом свободного АТФ (Рз/г^О) или комплекса MgATO (02=/=
Рис. 21. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации А (мМ) в обратных величинах при различных фиксированных значениях Х=М[АРис. 21. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации А (мМ) в обратных величинах при различных фиксированных значениях Х=М[А
Рис. 21. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации А (мМ) в обратных величинах при различных фиксированных значениях Х=М[А
Рис. 21. Зависимость Na, К-АТФазной активности (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации А (мМ) в обратных величинах при различных фиксированных значениях Х=М[А
5^0), было бы логично предположить связывание их обоих, тем более что аналогичная ситуация имеет место в случае нефосфорили- рованного фермента.
Форма экспериментальных кривых t/o,oi=f(O при малых значениях аргумента (рис. 21) выдвигает определенные ограничения для зависимости, рассчитанной по схеме 3.
Hm^l^O, /-о d/Hm^l^O, /-о d/lim-^21t->o d<2lim-^21t->o d<20.0.Легко убедиться, что эти ограничения исключают возможность одновременного соблюдения условий: аз/2 = 0 и аг^О; тогда остается три варианта: 1) а3/2 = а2=0; 2) аз/г^О, а2=0 и 3) аз/гт^О, а2#=0. Во всех трех вариантах должно выполняться условие:Легко убедиться, что эти ограничения исключают возможность одновременного соблюдения условий: аз/2 = 0 и аг^О; тогда остается три варианта: 1) а3/2 = а2=0; 2) аз/г^О, а2=0 и 3) аз/гт^О, а2#=0. Во всех трех вариантах должно выполняться условие:Выполнение этих условий возможно, если допустить, что k°ps=0 (ао=О) или к%5— сравнительно малая величина (!//?%$ >^Выполнение этих условий возможно, если допустить, что k°ps=0 (ао=О) или к%5— сравнительно малая величина (!//?%$ >^
Hm^l^O, /-о d/
Hm^l^O, /-о d/
lim-^21
t->o d<2
lim-^21
t->o d<2
0.
0.
Легко убедиться, что эти ограничения исключают возможность одновременного соблюдения условий: аз/2 = 0 и аг^О; тогда остается три варианта: 1) а3/2 = а2=0; 2) аз/г^О, а2=0 и 3) аз/гт^О, а2#=0. Во всех трех вариантах должно выполняться условие:
Легко убедиться, что эти ограничения исключают возможность одновременного соблюдения условий: аз/2 = 0 и аг^О; тогда остается три варианта: 1) а3/2 = а2=0; 2) аз/г^О, а2=0 и 3) аз/гт^О, а2#=0. Во всех трех вариантах должно выполняться условие:
Выполнение этих условий возможно, если допустить, что k°ps=0 (ао=О) или к%5— сравнительно малая величина (!//?%$ >^
Выполнение этих условий возможно, если допустить, что k°ps=0 (ао=О) или к%5— сравнительно малая величина (!//?%$ >^
>[(1/^-г+(!/£<)+ (1/&₽а)]. Таким образом, можно заключить, что схема 3 хорошо описывает экспериментальную кривую и, следовательно, на ее основе может быть построена минимальная модель.
При фиксированном отношении Х=100 экспериментальная кривая (рис. 21) содержит две четко выраженные точки перегиба. При малых и больших значениях аргумента кривая выпуклой формы, тогда как при средних значениях она вогнута. Зависимость не имеет точки экстремума, при /->0 стремится к конечному, не равному нулю пределу. Учитывая, что Л = 0 и беря за основу схему 3, необходимо попытаться согласовать с экспериментом следующую модель:
^ps
рз
MES
Схема 4
В этой модели учтены наиболее важные экспериментальные факты, полученные ранее. Например, согласно схеме 4 фермент не может фосфорилироваться, если он предварительно присоединил ион магния, соответственно отсутствует путь МЕ-+ЕР-, фосфорилированный фермент может быть связан с двумя ионами магния (R. Post et al., 1972; С. Pedemonte, L. Beauge, 1983).
Используя метод Кинга — Альтмана, можно получить уравнение стационарной скорости для схемы 4, учитывая, что М==У\КтМ*х- у гРо + Pi/2^"1^ + •»* 4- Ps/^-5^
®°2бо (a^-l + аз/2^3 2 4" O-it™2... + «5/2^ 5^2)
Эта дробно-иррациональная функция £7юо=/(О при больших значениях аргумента должна иметь такую же форму, как и функция Uo,o\=f(ty Действительно, ao=ai/2 = O и (аз/2—aiPi/2)<0. Проведя анализ функции Utoo п ее производных, можно получить, что если кРо=/=О и k'pSZ>kQps, то зависимость, рассчитанная по схеме 4, может иметь форму монотонно возрастающей, выпуклой функции. Для полного доказательства идентичности форм расчетной и экспериментальной кривых необходимо исследовать знаки коэффициентов уравнения (£/юо)"н=О. В результате такого исследования 77
был сделан вывод, что наличие точки перегиба не является обязательным.
Таким образом, модели, изображенные на схемах 3 и 4, могут объяснить форму экспериментальных кривых, полученных при фиксированном отношении M/А (Х=100 и л = 0,01).
Принципиальное отличие экспериментальных кривых, получаемых автором и сотрудниками, от экспериментальных кривых, встречающихся в литературе, заключается в том, что в обратных координатах при малых значениях аргумента первые имеют нелинейный характер. Как правило, в литературе редко рассматривают область больших концентраций субстрата [MgATO]>l мМ; видимо, подразумевая, что при этих концентрациях существует линейная зависимость. Проверка формы кривых при фиксированном отношении X—1 показала, что в обратных координатах в области 5=1 мМ наблюдается четко выраженное изменение наклона (U"!!^^, тогда как в соседних областях экспериментальные точки хорошо аппроксимируются прямыми линиями. Таким образом, при любых соотношениях M/S, М/А и A/S при достаточно малых значениях аргумента наблюдается отклонение кривых от линейности.
В заключение сформулируем условия, которые продиктованы формой экспериментальных кривых при Х=const и которые следует учитывать при построении общей схемы вместе с условиями, перечисленными в предыдущем разделе.
Условие 7. При фиксировании ь=М/А в обратных координатах зависимость Ux=fU) является дробно-иррациональной функцией, которая не имеет асимптоты и при больших значениях аргумента является монотонно возрастающей, выпуклой функцией, стремящейся к бесконечности.
Условие 8. Форма кривых Ux=f(t) при малых значениях аргумента зависит от отношения Л. При Л^ 1 кривая имеет форму монотонно возрастающей, выпуклой функции, тогда как при малых значениях X превращается в монотонно убывающую, вогнутую функцию.
Минимальная модель субстратной зависимости Na, К-АТФазы
В предыдущих разделах была описана форма различных экспериментальных кривых, получаемых при фиксировании концентраций лигандов и их отношения. Из этих данных следует, что минимальная модель Плеснера и соавторов может объяснить форму кривых только при малых концентрациях субстрата (5<1 мМ). Следовательно, модель следует расширить и согласовать с формой экспериментальных кривых при больших концентрациях субстрата (5>1 мМ).
Расширение модели нужно начать с формы ОЕР (см. схему 1). Это продиктовано следующими соображениями.
Существование формы SES и AES экспериментально не показано. Их введение в схему существенно не изменит форму кри-
вых в области экстремально больших концентраций субстрата, так как имеются каталитически активные формы МЕР, АЕР и SEP; однако их наличие радикально изменит форму кривых при экстремально малых концентрациях субстрата.
Существование фосфорилированной формы и ее функциональное значение как интермедиата Na, К-АТФазной реакции нельзя не учитывать при построении кинетической схемы.
При замене последовательности необратимых ступеней ...ES-+EP-+EX... на одну необратимую ступень ...ES—^ЕР.„ форма кривых не изменяется. Они кинетически не отличимы (L. Plesner, I. Plesner, 1981). Следовательно, необходимо добавить формы МЕР, SEP и АЕР. По аналогии необходимо также рассмотреть добавление форм SMEP и МАЕР. Такой расширенный вариант приведен на схеме 5.
Схема 5 представляет половину димерной системы, которая симметрична относительно формы ОНО. Используя метод Кинга — Альтмана, для этого варианта можно вывести расчетную зависимость U=Kt, А, М), где и=е0/^, t= 1/S, е0 — суммарная кон-
центрация фермента. Введя обозначения для различных комбинаций кинетических констант, уравнение скорости запишем в виде:
и=
Следующим этапом является согласование экспериментальных и рассчитанных по (5.1) кривых и «минимизация» модели. Для этого необходимо преобразовать зависимость U=^t, А, М) в функцию одного переменного и сравнить ее с соответствующими экспериментальными кривыми, т. е. необходимо исследовать формы расчетных зависимостей UM=!^W иА=Ц£), Us=f(M) и UK=f(t), которые получаются при фиксировании М, A, S и X.
Рассмотрим вначале область малых концентраций субстрата (S<1 мМ). "
При фиксировании концентрации свободных лигандов, М= =const и Л=сопз1, зависимость U=f(t, А, М) превращается в дробно-рациональную функцию одного переменного, порядок которой выше единицы:
U _ %+W~‘+W~2 .
м «V-* + <W~2'
и .._ ^o + W^ + W^ + '-'+PAr5
А ' ам‘-'*аЮ‘-2* •■■+аЛ^5"
Эти обе функции имеют асимптоты и, следовательно, при достаточно малых концентрациях субстрата будут представ 1ены пря- 80
мой линией. В первом приближении наклон аппроксимирующих прямых можно оценить следующими выражениями:
/ М у 1 М ^
^лг ^Л1о _ s \ + Kim А 2 + Кмо / .
At а.мхki(\+Ч + М1 Кил)
Um ^L=3yLк^_Г±+^.
t— dt aM kid+q) \2 * Ka)
Эти расчетные зависимости хорошо согласуются с данными эксперимента (см. рис. 17) и литературными данными (L. Plesner, I. Plesner, 1981).
Без детального анализа числовых значений коэффициентов можно утверждать, что при малых концентрациях субстрата модель, изображенная на схеме 5, соответствует экспериментальным данным. Для окончательного утверждения рассмотрим соотношение коэффициентов при фиксированном отношении Х=М/А в области малых концентраций.
При фиксировании отношения М/А зависимость U—f(t, А, М) превращается в дробно-иррациональную функцию одного переменного:
U PxgjHiM/^Z^ljlJ^^
Х “х/”1 + ®ХЗ/2^—3^ + • • • + “х?^""7^ ’
которая согласно экспериментальным данным при больших значениях аргумента должна иметь вид монотонно возрастающей, выпуклой кривой при любых значениях X (см. рис. 21). Для проверки необходимо исследовать предельные значения производных (/->-оо) и возможность существования асимптоты. Оказалось, что при любых значениях X можно иметь точное согласование форм расчетных и экспериментальных кривых, если при йро^О выполняется неравенство: k%sIK0s<^k4lKs.
При фиксировании концентрации субстрата (S=const) зависимость U=f(t, А, М) превращается в дробно-рациональную функцию следующего вида:
s —al^-i + «о + a?M + а^2 + “з^3*
Первая производная этой функции имеет пределы:
цт dUs Ks.
ЛЫ d(l/Al)ЫИ-?)Ка$ *
„ aus _ "pmVKsIKm^ + i5^AfS^
Hm = , , „;;.
«-►* dzU S&4 (kpsS/K$ + крд^
Сравнивая эту зависимость с экспериментальными кривыми (см. рис. 19), легко убедиться в согласованности форм кривых. 4—54181
При этом необходимым условием являются неравенства: Ьра^0 и kpM=0. При кРо=О форма расчетной зависимости Us=f ^М) не изменяется. Заметим, что при увеличении S наклоны lim U'm 2И->* и lim £7^ уменьшаются. Это также совпадает с экспериментом (см.
Л1-0 рис. 19).
Рассмотрим область средних и больших концентраций субстрата (S^l мМ). Здесь наблюдается разнообразие форм экспериментальных кривых, однако четко прослеживается определенная закономерность: при изменении соотношения М/А от нуля до бесконечности форма экспериментальных кривых при любых способах фиксирования меняется от монотонно убывающих, вогнутых кривых до монотонно возрастающих, выпуклых кривых (см. рис. 15, 18, 21). Соответственно кривые е одной точкой экстремума переходят в кривые без точек экстремума. При наличии точки экстремума кривая может иметь один четко выраженный перегиб. В остальных случаях ввиду малой кривизны идентификация перегибов является недостоверной, хотя нельзя исключить наличия четного числа перегибов (см. рис. 21). Теоретически можно оценить, насколько расчетные зависимости соответствуют форме экспериментальных кривых.
В области малых значений аргумента (при достаточно больших значениях фиксированного А) второй лиганд (М) изменяется в диапазоне настолько малых значений (см. рис. 20), что можно считать условия эксперимента аналогичными ситуации фиксирования больших величин Х= 100.
Аналогично этому при малых значениях аргумента в больших значениях фиксированного М мы приближаемся к экспериментальным условиям фиксирования малых значений Х=0,01. Следовательно, в области малых значений аргумента для согласования формы расчетной зависимости U=f(t, А, М) с экспериментальными кривыми, достаточно исследовать форму зависимости Ux~f(tt X) при разных Z, т. е. достаточно показать, что пределы первой производной функции ^xlim(dt7x/d0 имеют противоположный знак t->o при Х->0 и л->оо.
Действительно, как показало исследование формы зависимости Ux=f^t)1 пределы удовлетворяют этому условию.
Суммируя все вышеизложенное, можно сделать заключение, что восемь экспериментальных условий могут быть выполнены, если минимальной моделью зависимости v—f (MgATO, АТФ, Mg2+) считать вариант, изображенный на схеме 5. Малое количество ограничений (неравенств), которые удалось выявить, не являются препятствием для этого. Однако следует подчеркнуть следующее обстоятельство. Согласование форм экспериментальных кривых и расчетной зависимости U=^t, А, М) не нарушится, если допустить, что kpo = O и [AL4EP] —0 (V'Ps=0, K"iM = °° или Q = 0). Исходя из определения минимальной модели, нужно было бы считать, что ^ро = О и Q = 0. Однако допустив существование SEP-форм, ло- 82
гично было допустить существование и ЛМЕР-формы, тем более что прецедент «сборки» комплекса MgATФ на ферменте известен. Для допущения кРо#=О авторы исходили из экспериментального факта существования К-зависимого дефосфорилирования ЕР, а также уабаин-чувствительной Mg-АТФазы (3. П. Кометиани и др. 1975).
Здесь не будет обсуждаться физическая сторона модели, так как это требует привлечения обширного экспериментального материала по Na, К-АТФазе, включая данные, полученные различными методами: использованием меченых соединений, флуоресцентных меток и др. В данной главе была сделана попытка относительно подробно описать процесс построения кинетической схемы для субстратной зависимости Na, К-АТФазы как пример использования принципов анализа сложных кинетических кривых, изложенных в предыдущих главах. С этой же целью в гл. 6 будет рассмотрена зависимость скорости реакции от концентрации ионов Na+ и К+, для анализа которой особое значение преобретает применение степенного преобразования.
66
6
6
Кинетика действия модификаторов на транспортные АТФазы
Регуляция Na, К-АТФазной активности ионами натрия и калия
Из определения Na, К-АТФазы как ферментной системы, осуществляющей транспорт ионов натрия и калия, следует, что Na+ и К+ одновременно должны выступать в роли активаторов ([Na+]{n и [А+]ои* и ингибиторов (торможение продуктом — [Na+]out И[Л+]in) этой системы в целом. Ясно, что фермент должен иметь транспортные участки, обладающие высоким сродством и селективностью с одной стороны мембраны и высоким коэффициентом диссоциации— с противоположной стороны. Это положение о транспортных участках независимо от физического механизма транслокации не исключает возможности существования дополнительных, не транспортных участков связывания Na+ и К+, где они могут играть роль обычных модификаторов фермента.
Исследования потоков ионов в «тенях» эритроцитов, проведенные рядом авторов (I. Glynn, S. Karlish, 1975; J. Robinson, M. Flashner, 1979), показали, что стехиометрия переноса Na+:K+= = 3:2. К этим работам следует добавить исследования активных потоков Na+:K+ в ганглиях улиток (J. Lambert et al., 1974; R. Thomas, 1969), омара (D. Livengod, 1983) и в аксонах кальмара (A. Hobbs, 1982; L. Mullins, I. Brinley, 1969), где также было показано, что в условиях, близких к физиологическим, соотношение Na+:K+=3:2.
Следовательно, Na, К-АТФазная система обязательно должна иметь транспортные участки следующих четырех типов: с внутренней стороны — три активируемых натрием х,-участка и два ^-участка калиевого ингибирования; с внешней стороны — два активируемых калием f/o-участка и три ингибируемых натрием хо-участка. Так как Na, К-АТФаза может осуществлять Na/Na- и К/К-обмен, связывание катионов с транспортными участками должно иметь обратимый характер.
Большинство авторов считают, что х,-участки не взаимодействуют друг с другом и являются идентичными (J. Robinson, М. Flashner, 1979). Их Ка для Na+ составляет порядка 0,2—1,4 мМ; хо-
участки имеют Кд для Na+ порядка 30 мМ. Предполагают, что ^о-участки обладают различным сродством к ионам калия (Ка^ ~1—100 мкМ и Кдс^0,2—0,4 мМ). В случае ^-участков КддляК* составляет величину порядка 10 мМ и выше. Однако все эти величины нужно считать условными, так как неизвестен механизм торможения внутриклеточными ионами К+ и внеклеточными ионами Na+ Уменьшение активности может быть вызвано не только образованием продуктов [\Na+]OUf и [K+]in, но и «тупиковыми» ответвлениями в результате образования комплексов [E-Nao«r] и [Kin].
Определение количества ионных участков посредством прямого измерения связывания Na+ и К+ также не дает однозначного ответа. Показано, что на один участок связывания фосфата, уабаина и ванадата (или на одну а-субъединицу) Na, К-АТФаза содержит три Na+-ueHTpa (К. Kaniike et al., 1976; Н. Matsui, Н. Homareda, 1982); два, три или четыре К-центра (L. Cantley et al., 1978; I. Glynn, D. Richard, 1982; D. Hastings, J. Skou, 1980), а также пять участков для Na+4-K+ (М. Yamaguchi, Y. Tonomura, 1979). Такое разнообразие результатов можно объяснить нелинейностью графика Скэтчарда и высоким фоном неспецифического связывания катионов. Йенсен и сотрудники посредством связывания АДФ определили, что каждая функциональная единица (димер) Na, К-АТФазы содержит до пяти идентичных, не взаимодействующих Na- и К-участков (J. Jensen et al., 1984).
При исследовании зависимости u=f(Na+, К+) необходимо учесть существование нескольких экспериментальных фактов, требующих особого внимания.
При стабилизации ErNa- или Е2*К-форм фермента ионы Na+ и К+ конкурируют между собой (S. Karlisk, 1980).
Для фосфорилирования обязательно связывание, по крайней мере, одного иона натрия (Ко.5=8 мМ), тогда как в Na, К-АТФаз- ной реакции участвует два (Ко,б=О,2 и Ко 5 = 8 мМ) иона Na* (S. Mardh, R. Post, 1977).
Отсутствие ионов Na+ во внешней среде резко меняет коэффициент сопряжения потоков, и стехиометрия становится равной 2:1 (D. Livengood, 1983).
Форма кривых, отображающих активацию ионных потоков натрием и калием в фосфолипидных везикулах с реконструированной Na, К-АТФазой, зависит от природы катионов, находящихся на противоположной стороне мембраны (S. Karlish, Е. Kempner, 1984). Наблюдается трансмембранное действие эффектора, который не участвует непосредственно в транспорте. Следовательно, можно допустить существование нетранспортного, регуляторного участка.
Внутриклеточный К* стимулирует Na/Na-обмен (R. Garay, R. Garrahan, 1973; A. Knight, L. Welt, 1974; J. Sachs, 1974).
При высоких концентрациях [Na+] стимулирует Na, К-АТФазную активность, действуя с внешней стороны мембраны (Р. Drapeau, R. Blostein, 1980; I. Glynn, S. Karlish, 1976; J. Hara, M. Nakao, 1981). Так как участие хо-участка исключается, нужно
допустить или существование регуляторного участка, или возможность действия Na+ через один из #о-участков, исходно предназначенных для транспорта К+.
Таким образом, можно заключить, что молекулярный механизм регуляции Na, К-АТФазной активности ионами Na+ и К+ до конца не расшифрован. Для окончательного решения проблемы необходимо уточнение котичества и функционального назначения различных участков связывания ионов Na+ и К+, а также возможности взаимопревращения этих участков. Видимо, с точки зрения получения новой информации, исследования ионных потоков в «тенях» эритроцитов и реконструированных везикулах, а также исследования прямого связывания катионов себя исчерпали, тогда как анализ зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации ионов Na+ и К+ может дать дополнительную информацию для окончательного решения вопроса.
Кинетические кривые, представляющие эти зависимости, обычно имеют сложную геометрическую форму. Для их эффективного исследования необходимо использовать новые методы анализа формы кривых (см. гл. 3 и 4). Методы классической кинетики, направленные в основном на определение кинетических параметров, которые отражают константы скорости (Vmax, Кт, Ki и т. д.), дают только косвенную информацию о количестве участков связывания лигандов. В отличие от первых, методы анализа формы кривых направлены на определение степенных параметров уравнения скорости, что дает возможность непосредственной оценки количества участков связывания и вида модификатора. Это обстоятельство наиболее важно для расшифрования молекулярного механизма регуляции Na, К-АТФазной активности ионами Na+ и К+.
Определение числа Na-центров Na, К-АТ Фазы
Рассмотрим Na, К-АТФазную активность как функцию одного переменного — концентрации Na+(x). Тогда при постоянстве всех прочих параметров и переменных реакции в самом общем случае зависимость u=f(x) будет иметь вид дробно-рациональной функции:
хп V atx1
s*
2 fcV /=о
где и — стационарная скорость или скорость, рассчитанная в условиях быстрого равновесия, s=n-Vp-Vm. В обратных координатах это выражение примет вид:
tn У, p^-' i. о
/—о
где U=\/v и t=\jx.
Заметим, что независимо от способа определения скорости в условиях стационарного или быстрого равновесия степендой параметр п этих выражений всегда можно интерпретировать как количество лигандсвязывающих участков, предназначенных для необходимого активатора (см. гл. 1). Однозначная интерпретация остальных параметров уравнения скорости затруднена, так как их
Рис. 22. Зависимость Na, К-АТФазной активности (у, мкмоль Фн/ч на 1 мг белка) от концентрации натрия (А) и та же зависимость в координатах In и от l/[Na+] (Б): реакционная среда: 40 мМ трис-HCl, 1АТФ]=3 мМ, [MgCti=3 мМ, [К 1]=130 мМ, pH 7,8
физический смысл зависит от молекулярного механизма фермента. Однако их определение может сыграть существенную роль в расшифровке последнего.
В дальнейшем будут использованы следующие обозначения: пх — количество Na-участков, для которых Na+ — необходимый активатор; пу — количество К+-участков, для которых К+—необходимый активатор; sx, рх и тх—степенные параметры для функ-
ции u=f(.v), ^=const; su, pu, mu— степенные параметры зависимости v=f(^), x=const.
Требуется определить nx и mx. Для этого можно использовать описанный выше метод, сущность которого заключается в исследовании формы кинетических кривых в области экстремальных концентраций лиганда при помощи степенного преобразования. Как было показано, при степенном преобразовании (и)-1/г=/(1/х) у области достаточно малых концентраций лиганда новая зависи- ■мость будет иметь асимптоту и максимально приближаться к линейной функции только при значении г=пх. Аналогично при степенном преобразовании (и)~1/г=/(х) в области достаточно больших концентраций лиганда новая зависимость будет иметь асимптоту и максимально приближаться к линейной функции только при значении г=тх. Приведенный ниже пример иллюстрирует описываемый метод.
Определим пх для зависимости u=f(x) при фиксированных значениях [КС1] = 130 мМ; [М§АТФ]=2,5; [АТФсв]=0,5 и [MgCB2+]=0,5 мМ. (рис. 22). Анализ удобно проводить с помощью ЭВМ. Введем исходные данные в виде Xi, Ui, о^ и Ki, где Xi — концентрация натрия, мМ; Ki — количество параллельных измерений для определения активности; Ui — средняя арифметическая Ki определений активности для данного Xi (мкмоль Фн/ч на 1 мг белка); Oi — средняя квадратичная ошибка среднего арифметического. Как правило, в описываемых экспериментах ^=const. Результаты вычислений при помощи ЭВМ показаны в табл. 10.
Таблица 10. Пример обработки на ЭВМ данных по активации Na, К-АТФазы ионами натрия
Х= 6.000Vi= 4.270а*=1.130
5=0.777
11.000
16.000
21.000
31.000
51.000
96.000
13.0600,470
21.0400.500
28.6900.240
40.6401.700
53.1301.060
65.7600.870
£=0.056
t= 0.166667
In U=—1.451614
ST ЕР =1.0
0.090909
—2.569554
max (r) =8.0
0.062500
—3.046425
GRAF—MU= 7.1! 5864
0.047619
—3.356549
6.126006
0 032258
—3.704753
4.774965
0.019608
—3.972742
2.871983
0.010417
—4.186012
1.520443
7.005121
22.503998
120.746481
STEP = 1.0
r=1.0
r=2.0
max (г) =80
Д(/=(Л+ВХ)—У
Д[/= (Л+ВХ)—У
GRAF—MV=7A 19844
—0.022798
—0.014167
6.133933
0.029112
0.017654
4.790183
0.018511
0.010581
2.890645
0.010419
0.007442
1.524962
—0.000766
0.001709
7.243639
—0.012634
—0.007908
25.942676
270.755771
—0021844
—0.015312
г=3.0
AU= (A-VBX^—Y
—0.005299
—0.007201
—0.002388
0.002752
0.002202
—0.002875
—0.006369
г=4.0r=5.0
bU=(A+BX)—УДи=(А+ВХ^—У
—0.000536—0.001956
0.001717—0.001144
—0.001926—0.004096
0.000031—0.001443
0.0021170.001919
—0.0001640.001250
—0.0012380.001557
г=4.0
г=6.0
&U=<A + BX)-Y 0003277
—0.002676
—0.005170
—0.002233
0.001718
0.004 996
0.003092
У (ЕХР) =0.695654г» 4.0
0.526034А = 0.326912
0.466916S (Л) = 0.000968
0.432083В=2.209231
0.3960615(B) =0.012242
0.370395В(УХ)=0001612
0.351164
г= 4.0
У= 4.283187 12.890858 21.390849 28.681348 39.782429 53.224361 66.995872
г= 1.0г = 2.0
КК= 0.965499КК—0.994771
пи= 120.746481MU-22 503998
MV= 270.755771MV=25.942676
L= 0.007193L=0.002669
г- 3.0
КК= 0.999271
MU= 7.005121
MV= 7.243639
L= 0.000552
r= 4.0r= 5.0
KK= 0.999923KK=0:999776
MU- 1.520443MU- 2 871983
MV= 1.524962MV=2.890645
■£=0.000063£= 0.000222
Обработка данных на ЭВМ разделена на несколько этапов. На первом этапе вычисляют значения In Ui и tu строят зависимость ln^=f(O и на рабочем интервале определяют знак второй производной (In U)"tt (и соответственно знак функции R^, см. гл. 4). В рассматриваемом случае получают выпуклую кривую (рис. 22, Б; рис. 23, Д); следовательно, нет необходимости ограничивать рабочий интервал сверху. Нижняя граница рабочего интервала также подобрана корректно. Об этом можно судить по сигмоидальной форме кривой u=f(x), которая имеет в рабочем интервале только один перегиб и не имеет точки экстремума. На втором этапе для каждого заданного значения степенного параметра производят степенное преобразование Uri= (ViVA,T и рассчитывают соответствующую линии регрессии
Ur^A,-YBrt.
На третьем этапе для каждого заданного г необходимо произвести следующие действия.
Вычислить отклонения экспериментальных точек щ от линейной регрессии (Auri=Uri—Uri) и определить их знак (рис. 23, Б; табл. 10).
Вычислить Дг и Вг, их ошибку 5(Д) и 5(B), а также ошибку регрессии S^yx).
Вычислить коэффициент корреляции (/(/С) и величину L (табл. 10) и оценить линейность зависимости.
Вычислить взвешенную квадратичную ошибку для U:MU (табл. 10 и рис. 23, В).
Вычислить взвешенную квадратичную ошибку для V:MV.
Из этих результатов видно, что для данной зависимости и = =/(х) имеем пх=4. Действительно, при г = 4 происходит перестройка распределения знаков Дщ- (вогнутая кривая превращается
Рис. 23. Пример расчета параметра пя. А— зависимость In 1/п и Б— VAh> от обратной величины концентрации Na+; В — зависимость взвешенной квадратичной ошибки ^MU) от значений параметра г
в выпуклую кривую); L<_F (F— критерий для 1%-ного уровня значимости 9,55; vi = 21, тг=5); MU, MV и L — минимальны. Заметим, что для определения параметра т в ЭВМ вместо величины Xi вводят его обратную величину \/х. В этом случае программу ЭВМ, рассчитанную для определения п, можно без изменений использовать для определения т.
Для успешного определения параметра и. необходимо подобрать условия эксперимента, позволяющие добиться по возможности медленного нарастания функции. В этом случае возможности метода исследования формы кривой резко возрастают. Поэтому целесообразно проводить исследования при больших концентрациях конкурентного лиганда, уменьшая этим вероятность образования участков, связанных с лигандом, что, со своей стороны, должно вызвать 90
уменьшение градиента зависимости ^ =/(%). Наоборот, для полного выявления тормозных участков (образующих «тупиковые» ответвления и т. д.) следует максимально уменьшить концентрацию конкурентного лиганда. Учитывая эти условия, параметры пх и тх для зависимости и=/(х) определяли соответственно при [КС1] = = 130 и [КС1] = 1 мМ.
Таким образом, при эквимолярном соотношении ATO/MgCl2 и больших концентрациях ионов К+ Na, К-АТФазная система содержит четыре Na-участка, предназначенных для необходимого активатора. Этот результат оказался неожиданным, так как на основе многочисленных литературных данных следовало ожидать, что число необходимых активаторов не будет превышать числа транспортных участков для Na+. Эксперимент был многократно повторен на различных препаратах фермента (нативные микросомы; микросомы, обработанные дезоксихолатом, йодистым натрием и т. д.), но результат оставался неизменным. Также неэффективным было уменьшение концентрации КС1 до 12—24 мМ. Оказалось, однако, что количество Na-участков, предназначенных для необходимых активаторов, зависит от соотношения ATO/MgCl2. При избытке свободного АТФ или при малых значениях концентрации Л^АТФ пх оказалось равным трем, тогда как во всех остальных случаях пх = 4 (рис. 24).
На рис. 25 представлены результаты определения параметра зависимости и=Цх) при различном соотношении свободных лигандов М и Л, но при сравнительно больших концентрациях субстрата [MgATФ]>>l мМ. Эти условия были подобраны на основе результатов, полученных в предыдущей серии опытов. Легко убедиться, что во всех случаях тх^3.
Определение пит было проведено в условиях, которые отражают различные режимы работы Na, К-АТФазной системы, выявляемые при исследовании зависимости скорости от концентрации MgATФ и свободных ионов АТФ и Mg2+. Эти режимы классифицировали по величине отношения свободного АТФ и Mg2+ (К=М/А) и по концентрации комплекса MgATФ (S<1 мМ или S>1 мМ). Соответственно можно выделить несколько режимов (/—/V): / — избыток свободного АТФ (Х<^ 1, S> 1); II — избыток свободного Mg2+ (X^l, S>1); III—малые концентрации субстрата (S<1, Z<1); IV—малые концентрации субстрата (5<1, Х^1).
Тогда на основе определения параметров пит зависимости у = =/(%) при различных соотношениях S, А и М можно придать дробно-рациональной функции и(х) более конкретный вид. Для режимов I и III (Х<С 1):
i
<+6 , ,
1-0
S
А
М
pH
а
1,61
1,99
0,07
7,73
б
2,92
3,09
0 01
6,2
в
0.41
0,39
0 9
7,70
г
),41
0,39
0,39
7,8
д
2.92
0,03
0,31
6,2
е
1.61
0,07
1,99
7,73
w
2,53
0,48
0,48
6,2
Рис. 24. Зависимость (о)~1/г от х-1 при различных фиксированных концентрациях 5, А и М, мМ (ГКС1] = = 130 мМ):Рис. 24. Зависимость (о)~1/г от х-1 при различных фиксированных концентрациях 5, А и М, мМ (ГКС1] = = 130 мМ):Рис. 25. Зависимость (ц)~,/3
Рис. 24. Зависимость (о)~1/г от х-1 при различных фиксированных концентрациях 5, А и М, мМ (ГКС1] = = 130 мМ):
Рис. 24. Зависимость (о)~1/г от х-1 при различных фиксированных концентрациях 5, А и М, мМ (ГКС1] = = 130 мМ):
от х при различных фиксированных концентрациях S, А и М, (мМ), ([КС1]= = 1 мМ):
S А А! pH
а1.91,01.06.2
б2.50.53.56.2
в2.50.50.57.8
Для режиме II и IV (Х^1):
/-*0
Определение числа К-центров
Na, К-АТФазы
Рассмотрим Na, К-АТФазную активность как функцию от концентрации калия. Обозначим концентрацию ионов через у и попытаемся определить для зависимости и=^у^
Ру
у”» 5 аШ1
2 W i-0
параметры nti и ти ^5у=пы-^-Шу-^ру'). Условия реакционной среды подобраны согласно соображениям, высказанным в предыдущем разделе. Это означает, что определение пы нужно проводить при высоких концентрациях Na+ (140 мМ), а определение ту— при [NaCl] = 10 мМ. Использовать более низкие концентрации не удалось из-за резкого возрастания относительной ошибки измерения. Соотношение MgATO, Mg2+ и АТФ было подобрано таким образом, чтобы Na, К-АТФаза могла работать в одном из трех режимов: 1) Х<1, S>1 мМ; 2) Х>1, S>1 мМ; 3) А=Л1<5.
На рис. 26 показаны результаты экспериментов, проводившихся при сравнительно малых концентрациях свободного АТФ, но при различных значениях pH, S и М. Характерной чертой этих опытов является то, что в отсутствие К+ в реакционной среде, независимо от других параметров, Na, К-АТФазная активность достоверно отличается от нуля, ио^О. Это означает, что для зависимости v=f(y) параметр пу=0.
Определим новую зависимость и—Vo=f(y), которая в обратных координатах будет иметь вид:
sy
У У M/V-/
1/То
V — Vo РуSy
У DiQy~l — «0 5 ^У-1 /-1/-Р+1
где D,o = aipo—аоРг- Для этой зависимости пд=\. Действительно, как видно из рис. 26, во всех случаях при [К+]^5 мМ. зависимость имеет строго линейный характер. Следует подчеркнуть, что все пря-
мые пересекаются приблизительно в одной точке при отрицательных значениях функции и аргумента (1/^~0,6 мМ-1). Аналогичные результаты получены при уменьшении фиксированной концентрации NaCl до 36 и 48 мМ, с той разницей, что прямые пересекались при положительных значениях функции и аргумента.
Рис. 26. Зависимость 1/(и—и0) от 1/у(ио~3,5±О,7 мкмоль Фн/ч на 1 мг белка); при различных фиксированных концентрациях S, А, М (мМ) ([NaCl]=142—146 мМ):
S
А
М
pH
а
2,5
0,5
3,5
6,2
б
2,5
0,5
0,5
8,4
в
2,5
0.5
0,5
7,7
г
1.6
0,08
2,0
7,6
д
0,4
0,2
0,2
7,8
е
0,6
0,3
0,3
7,8
ж
1.6
0,4
0,4
7,8
Иная картина наблюдается при исследовании зависимости и = =Цу) при наличии в реакционной среде избытка свободного АТФ или нефосфорилирующих аналогов АТФ. Во-первых, в отсутствие ионов калия Na, К-АТФазная активность достоверно не отличается от нуля. Во-вторых, для зависимости v=j (у) получаем пу = 2 (рис. 27).
В одной серии экспериментов в реакционную среду, содержавшую эквимолярные концентрации АТФ и MgCh и высокие концентрации NaCl (pH 7,78), добавляли 0,17 мМ аденилилпмидодифос- фат или 0,2 мМ аденилилметилендифосфат (рис. 27, а и б). При этом предполагали, что свободный нефосфорилирующий аналог и его магниевый комплекс могут конкурировать со свободным АТФ и MgATФ за нуклеотидные участки и одновременно сдвигать равновесие в сторону образования избытка свободного АТФ. В результате этого сложного перераспределения ожидали, что увеличится содержание JEA-формы (фермент — свободный нуклеотид)
при одновременном уменьшении концентрации fS-формы, т. е. увеличится вероятность «режима свободного АТФ» (ХС1). Оказалось что в этих условиях Пу =2.
ван чеиван чеиРис.Рис.Рис. 27. Зависимость (l/v)-1/2 от \'уРис. 27. Зависимость (l/v)-1/2 от \'уванных концентрациях S, А 150 мМ):ванных концентрациях S, А 150 мМ):а бв г д ежа бв г д ежS1,60,60,911,612,49 2.51,9S1,60,60,911,612,49 2.51,9А0,40,2 0,89 1,59 2,49 2,5А0,40,2 0,89 1,59 2,49 2,5иипри М,при М,различных фиксиро-мМ ([NaCl] = 144—различных фиксиро-мМ ([NaCl] = 144—м0,40,2 0,09 0,09 0.09 0,1м0,40,2 0,09 0,09 0.09 0,1pH 7,7 7,7 7,62 7,62 7,62 7,7pH 7,7 7,7 7,62 7,62 7,62 7,728. Расчет28. Расчетстепенного параметра ту. I — зависимость и от у(К+) при раз-степенного параметра ту. I — зависимость и от у(К+) при раз-личных фиксированных концентрациях S, А, М (мМ), [NaCl]=10 мМ, pH 6,2; // — зависимость взвешеннойличных фиксированных концентрациях S, А, М (мМ), [NaCl]=10 мМ, pH 6,2; // — зависимость взвешеннойквадратичной ошибки от параметра г:квадратичной ошибки от параметра г:кмщкмща ба б£1.92.5£1.92.5А1.0 0,5А1.0 0,5М1.0 3.5М1.0 3.5у, ММОЛЬу, ММОЛЬВо второй серии опытов избыток свободного АТФ был образо- 1 в результате подбора отношения АТФ/М§С1г и pH. Был полу- идентичный результат: пд = 2 (рис. 27).
ван чеи
ван чеи
Рис.
Рис.
Рис. 27. Зависимость (l/v)-1/2 от \'у
Рис. 27. Зависимость (l/v)-1/2 от \'у
ванных концентрациях S, А 150 мМ):
ванных концентрациях S, А 150 мМ):
а б
в г д е
ж
а б
в г д е
ж
S
1,6
0,6
0,91
1,61
2,49 2.5
1,9
S
1,6
0,6
0,91
1,61
2,49 2.5
1,9
А
0,4
0,2 0,89 1,59 2,49 2,5
А
0,4
0,2 0,89 1,59 2,49 2,5
и
и
при М,
при М,
различных фиксиро-мМ ([NaCl] = 144—
различных фиксиро-мМ ([NaCl] = 144—
м
0,4
0,2 0,09 0,09 0.09 0,1
м
0,4
0,2 0,09 0,09 0.09 0,1
pH 7,7 7,7 7,62 7,62 7,62 7,7
pH 7,7 7,7 7,62 7,62 7,62 7,7
28. Расчет
28. Расчет
степенного параметра ту. I — зависимость и от у(К+) при раз-
степенного параметра ту. I — зависимость и от у(К+) при раз-
личных фиксированных концентрациях S, А, М (мМ), [NaCl]=10 мМ, pH 6,2; // — зависимость взвешенной
личных фиксированных концентрациях S, А, М (мМ), [NaCl]=10 мМ, pH 6,2; // — зависимость взвешенной
квадратичной ошибки от параметра г:
квадратичной ошибки от параметра г:
кмщ
кмщ
а б
а б
£
1.9
2.5
£
1.9
2.5
А
1.0 0,5
А
1.0 0,5
М
1.0 3.5
М
1.0 3.5
у, ММОЛЬ
у, ММОЛЬ
Авторы попытались также определить параметр mv для зависимости и=1^уу Оказалось, однако, что начиная со значения г= =/иу=2 взвешенная квадратичная ошибка MU практически не изменилась (рис. 28). При этом увеличить рабочую область концентрации К+ или уменьшить содержание Na+ не удалось, так как резко возрастала относительная ошибка измерения (около 20—40%). Таким образом, точно параметр ту не определен, но несмотря на это можно утверждать, что для функции v=f (^) ту^2. Это хорошо видно из рис. 28, где приведены результаты опытов в двух режимах: с избытком свободного Mg2+ и с избытком обоих свободных лигандов А и М. Аналогичный результат был получен и в других условиях реакционной среды.
Если условно принять, что ту=2, тогда, суммируя вышеизложенное, можно считать, что зависимость 0=1^ имеет следующий вид:
р*
прих>1 f=-^;
1-0
у2 2 а"»' приХ<1 v= .
W
i-0
Минимальная модель Na, К-АТФазы
Прежде чем приступить к построению кинетической схемы фермента, необходимо обратить внимание на некоторые важные факты, которые требуется учитывать при создании модели.
После того как непосредственно было показано существование окклюдированных форм фермента, т. е. форм, связываясь с которыми ионы Mg2+ и К+ уже не могут свободно обмениваться с ионами из внутри- или внеклеточной среды (М. Esmann, J. Skou, 1985; I. Glunn et al., 1984), стало ясно, что транслокацию ионов Na и К+ обеспечивают следующие последовательности ступеней:
Na+0
(N^E^ -^- NaE^P ^ ' Ег Р
8
(К)Е20 ., k ^.КЕ^ ’^У.". KiS
где S — концентрация MgATO комплекса, (Na)EiP и (К)ЕгР— окклюдированные формы фермента. EiS-форма фермента должна
иметь высокое сродство к Na+ и относительно низкое сродство к К+ (с внутренней стороны), тогда как Е2Р-форма должна иметь высокое сродство к К+ и относительно низкое сродство к Na+. Ясно, что принципиальная схема должна отражать именно такие циклы транслокации катионов, включающих смену окклюдированных состояний и резкое изменение сродства к транспортируемым катионам. Следует заметить, что ступени (Na)fiP-*-*- (Na)E2P и (KJE^-*-*- (K)EiS сопровождаются конформационными изменениями фермента и, по-видимому, лимитируют суммарную скорость реакции.
При разработке принципиальной схемы необходимо исходить из экспериментально установленного правила, что связывание фермента с физиологическими лигандами (Na+, К+, Mg2+, АТФ, MgATФ, АДФ и Фн) индуцирует определенные конформационные изменения (Р. Jorgensen, 1982; Karlish et al., 1984; J. Robinson, 1974). Существуют «гибридные» формы с различными комбинациями связанных лигандов. Все эти формы четко отличаются друг от друга своими свойствами и функциональным назначением в Na, К-АТФазном цикле. Среди них следует выделить несколько групп, которые, видимо, являются интермедиатами Na, К-АТФазной системы.
Первую группу составляют Na-формы дефосфорилированного фермента. Их принято обозначать через Е\. К этой группе относятся формы (Na+)EiO, Е1АТФ, ElMgATФ, (Na+)E1MgATФ и т. д. Эта группа характеризуется высоким сродством к нуклеотидам и Na+ и сравнительно низким сродством к К+.
Вторую группу представляют К-формы дефосфорилированного фермента. Их принято обозначать через Е2. К этой группе относятся форма (Km )Е20, Е2АТФ, (Кт )E2MgATФ, E2MgATФ и т. д. Эта группа характеризуется сравнительно низким сродством к нуклеотидам и Na+ и высоким сродством к К+. Показано, что в Е20-фор- ме ионы калия окклюдированы.
Между формами Ех и Е2 существует равновесие:
Na*, АТФ , МдАТФ
К третьей группе относятся фосфорилированные формы фермента ЕХР, которые отличаются от других АДФ-чувствительным дефосфорилированием. Показано, что в этой форме ионы Na+ окклюдированы.
К четвертой группе относятся фосфорилированные формы фермента Е2Р, которые характеризуются К+-чувствительным дефосфорилированием и высоким сродством к ионам К+ с внешней стороны.
Кроме вышеперечисленных форм фермента без всякого сомнения должна существовать свободная, не связанная с лигандами форма. Эта форма прямым способом не идентифицирована, но имеются веские, хотя и косвенные доказательства ее существования (J. Jensen et al., 1984).
При разработке принципиальной схемы работы Na, К-АТФаз- нон системы необходимо определить роль ионов Mg2+ как мощного модификатора системы. Не вызывает сомнения, что существует Mg-форма фермента, которая отличается от Na- и К-форм и является интермедиатом системы. Необходимо объяснить, почему свободные ионы Mg2+: а) тормозят связывание негидролизуемых аналогов АТФ; б) увеличивают Ко,5 для натрия как активатора фосфорилирования и Na, К-АТФазной реакции; в) тормозят АДФ/АТФ-обмен; г) необходимы для фосфорилирования посредством АТФ и Фн, а также для К-зависимой фосфатазной реакции; д) образуют «тупиковые* ответвления — £iMg и Mg£lMgATФ (С. Pedemonte, L. Beauge, 1983; L. Plesner, I. Plesner, 1981).
Особенно важное значение приобретает тот факт, что фермент имеет специальный участок связывания магния, отличный от нуклеотидных участков связывания (J. Robinson, М. Flashner, 1979). Существует указание, что Mg-форма фермента может находиться в конформационном состоянии Е\ (Р. Jorgensen, 1982), но не исключена возможность ее нахождения в £2-форме.
Принципиальная схема работы Na, К-АТФазной системы должна объяснить четыре экспериментальных факта, которые касаются аномального трансмембранного действия катионов на процессы, индуцируемые катионами с противоположной стороны мембраны.
Форма кривых зависимости потока от концентрации активирующего катиона определяется катионным составом на противоположной стороне, а не способом транспорта (S. Karlish et al., 1984). 2. Для получения максимального фосфорилирования фермента в дополнение к внутриклеточному натрию необходимо наличие внеклеточного натрия (J. Robinson, М. Flashner, 1979; М. Walter, М. Bader, 1978). 3. Внутриклеточный калий стимулирует Na/K- и Na/Na-обмен, кроме того, К+ стимулирует АДФ/АДФ-обмен. 4. Внеклеточный натрий может активировать дефосфорилирование Е^Р и переход Е^Р-^Е^Р. В присутствии ионов Mg2+ высокие концентрации натрия активируют Na-АТФазную активность. Показано, что Na-диссоциирующие участки (торможение «продуктом»), Na-ассоциирующие участки (активация дефосфорилирования) и Mg2b-CBH3biBaromne участки сосуществуют одновременно (J. Нага, М. Nakao, 1981; J. Robinson, 1983).
Все эти факты не нашли объяснения в литературе и, как правило, игнорируются при составлении моделей работы Na, К-АТФазной системы, так как они противоречат общепринятым свойствам Е{Р- и £2Р-форм.
Кинетическую схему Na, К-АТФазы можно построить, объединив субстратную и катионные модели. Для этого необходимо опре-
делить лигандный состав основных форм фермента по минимальной схеме зависимости u = f(s, А, Л4) (см. схему 5).делить лигандный состав основных форм фермента по минимальной схеме зависимости u = f(s, А, Л4) (см. схему 5).Рассмотрим вначале малые концентрации субстрата S<1 мМ Этому случаю соответствует левая часть схемы 5, отдельно приведенная па схеме 6.Рассмотрим вначале малые концентрации субстрата S<1 мМ Этому случаю соответствует левая часть схемы 5, отдельно приведенная па схеме 6.3x53x5(х3)^5(х3)^5- м^у)ОЕО- м^у)ОЕО(^у) ОЕР(^у) ОЕРМ(хо) 0Е0-«М(хо) 0Е0-«(ко) ОЕР-—(ко) ОЕР-—ЛЛOEDЛЛOED(У2) ОЕР(У2) ОЕР» Дм’ ХхСхД ОЕР—-» Дм’ ХхСхД ОЕР—-(У2) аео(У2) аео(УА 0Е0(УА 0Е0Схема 6Схема 62у АЗх2у АЗхСу^АЕР—-Су^АЕР—-Выделим три варианта: 1) М">А (верхний путь на схеме 5, к^рмУ, 2) Л~Л1~0 (средний путь, ^ро) и 3) А*>М (нижний путь к^крдУ Будем считать, что фермент находится в равновесии с х (ионами натрия) и у (ионами калия). Тогда, используя метод Ча (S. Cha, 1968), во всех трех вариантах получим простой граф, легко решаемый методом Книга—Альтмана.Выделим три варианта: 1) М">А (верхний путь на схеме 5, к^рмУ, 2) Л~Л1~0 (средний путь, ^ро) и 3) А*>М (нижний путь к^крдУ Будем считать, что фермент находится в равновесии с х (ионами натрия) и у (ионами калия). Тогда, используя метод Ча (S. Cha, 1968), во всех трех вариантах получим простой граф, легко решаемый методом Книга—Альтмана.
делить лигандный состав основных форм фермента по минимальной схеме зависимости u = f(s, А, Л4) (см. схему 5).
делить лигандный состав основных форм фермента по минимальной схеме зависимости u = f(s, А, Л4) (см. схему 5).
Рассмотрим вначале малые концентрации субстрата S<1 мМ Этому случаю соответствует левая часть схемы 5, отдельно приведенная па схеме 6.
Рассмотрим вначале малые концентрации субстрата S<1 мМ Этому случаю соответствует левая часть схемы 5, отдельно приведенная па схеме 6.
3x5
3x5
(х3)^5
(х3)^5
- м
^у)ОЕО
- м
^у)ОЕО
(^у) ОЕР
(^у) ОЕР
М
(хо) 0Е0-«
М
(хо) 0Е0-«
(ко) ОЕР-—
(ко) ОЕР-—
ЛЛ
OED
ЛЛ
OED
(У2) ОЕР
(У2) ОЕР
» Дм
’ ХхСхД ОЕР—-
» Дм
’ ХхСхД ОЕР—-
(У2) аео
(У2) аео
(УА 0Е0
(УА 0Е0
Схема 6
Схема 6
2у А
Зх
2у А
Зх
Су^АЕР—-
Су^АЕР—-
Выделим три варианта: 1) М">А (верхний путь на схеме 5, к^рмУ, 2) Л~Л1~0 (средний путь, ^ро) и 3) А*>М (нижний путь к^крдУ Будем считать, что фермент находится в равновесии с х (ионами натрия) и у (ионами калия). Тогда, используя метод Ча (S. Cha, 1968), во всех трех вариантах получим простой граф, легко решаемый методом Книга—Альтмана.
Выделим три варианта: 1) М">А (верхний путь на схеме 5, к^рмУ, 2) Л~Л1~0 (средний путь, ^ро) и 3) А*>М (нижний путь к^крдУ Будем считать, что фермент находится в равновесии с х (ионами натрия) и у (ионами калия). Тогда, используя метод Ча (S. Cha, 1968), во всех трех вариантах получим простой граф, легко решаемый методом Книга—Альтмана.
Для определения минимальной модели необходимо выбрать минимально возможное значение степенных параметров р и т.
Для случая М">А получим:
^ (а3р + а32</)
62
V V k)Xl,f
/=0 /=0
где пх = 3, Px = 0, т*=3, пу = 0, ру=\ и ту=\.
Для ариантов А"^>М и А~М~0 получим:
у «зг^3#2
6 4 ’
2 2’f^V
где пх—3, рх—0, тх—3, Пу—2, ру=0, Шу=2.
Значение этих параметров определяют экспериментально. Действительно, в специально поставленных экспериментах (см. рис. 24—27) было получено, что при 5=0,41 мМ, А=0,39, Л1=0,09 пх=3, а при Л!=0,09 мМ и различных значениях 5 и А—nv=2. При малых значениях 5 и при М^>А пу=0 и ри=1. Кроме того, было сделано заключение, что при любых значениях 5, А и М можно считать тх^3 и Шу^ 1.
Таким образом, предположение авторов о катионном составе форм OES, ОЕР и АЕР имеет экспериментальное подтверждение. Следовательно, форму OES можно представить в виде x^OES, форму АЕР в виде у^АЕР, а форма ОЕРМ представляет сумму форм хОЕРМ и ухОЕРМ. Соответственно, согласно закону сохранения массы, в результате дефосфорилирования должны получиться формы у2АЕО, хОЕРМ и хуОЕРМ, а в результате фосфорилиро а- ния — форма х^ОЕР.
Исходя из этого материала, можно считать, что на схеме 6 изображена минимальная модель той части Na, К-АТФазной системы, которая работает при малых концентрациях субстрата. Она состоит из двух основных циклов. Назовем циклом ОРМ. ту часть, в которой дефосфорилируется форма МЕР, а циклом ОРА — форма АЕР. Допускается возможность существования третьего цикла ОРО, в котором происходит дефосфорилирование формы ОЕР.
Для завершения минимальной модели Na, К-АТФазной системы необходимо исследовать правую часть схемы 5, которая работает при больших концентрациях субстрата 5>1 мМ и образует два самостоятельных цикла. При избытке свободных ионо: Mg2+ (Л4^>Л) получаем цикл SPM, а при малых концентрациях свободных лигандов (14~7И~О) — цикл SPO.
Цикл SPM осуществляет превращение формы SEPM, а цикл SPO— формы SEP (и, возможно, формы МАЕРу Нетрудно показать, что в условиях преимущественного образования формы SEP (или МАЕР) каталитической активностью обладает форма x^y^SEP (или х^МАЕРу а при преимущественном образовании SEPM- формы— x^SEPM и x^ySEPM.
SPM- и SPO-циклы легко объединить с остальными циклами, при этом получится последовательность этапов, изображенная на схеме 7.
Для завершения принципиальной схемы необходимо сформулировать правила, которые будут определять закономерность чередования основных функциональных состояний фермента. Для этого исходным положением был выбран факт существования трансмембранного транспорта катионов и существование окклюдированных 100
Схема 7
(внутримембранных) состояний катионов. Схематически это можно представить следующим образом:
Здесь индекс i и открытый слева квадрат означают внутриклеточную ориентацию катионных участков системы, индекс о и открытый справа квадрат — внутриклеточную ориентацию, а индекс т и закрытый квадрат — окклюдированное состояние. На основе этой последовательности становится возможным отдельные ступени Na, К-АТФазного цикла объединить в единую логическую последовательность, используя для этого достоверные экспериментальные факты. Сетка правил, приведенная на схеме 8, позволяет составить с использованием минимальной модели принципиальную схему работы Na, К-АТФазной системы.
На схеме 8 ^ и mt означают число занятых катионами
участков, по и то — число свободных катионных участков. Для сравнения по краям схемы приведены традиционные обозначения Ей Е[Р (Na-форма) и Е^ Е2Р (К-форма). Легко заметить, что внешне схема 8 мало отличается от принципиальной схемы Поста— Альберса и различных ее вариантов (J. Robinson, М. Flashner, 1979), однако между ними существует принципиальная разница.
Схема 8 представляет набор правил чередования определенных состояний фермента, которые индуцируются лигандами и, возможно, конформационными переходами. Схема допускает связывание других лигандов (например, Mg2+, свободного АТФ и т. д.), если при этом соблюдается закономерность чередования. Схема не уточ-
Схема 8Схема 8
Схема 8
Схема 8
няет число и вид транспортируемых катионов. Под п и пг можно подразумевать любое целое число и нуль, а под х и у противотранс- портируемые катионы, например ионы Na+ и К+, Na+ и Rb+, Н+ и К+ и даже обмен катионов одного вида. Согласно схеме, Na, К- АТФазная система может катализировать гидролиз АТФ в отсутствие иона Na+ и К+. Эти переходы были включены в схему, так как существование уабиан-чувствительной Mg-АТФазы не вызывает сомнения. Особо следует подчеркнуть, что эти правила касаются чередования состояний одной субъединицы и допускают ее сопряжение с переходами другой субъединицы димера. Следовательно, схема допускает существование и последовательного и одновременного транспорта катионов, а также существование как «бинарной» (различные катионные участки осуществляют разнонаправленный транспорт), так и «унитарной» (транспорт в обоих направлениях осуществляют одни и те же участки) системы участков.
На заключительном этапе из схемы 7 можно получить полную кинетическую схему Na, К-АТФазы, используя схему 8 и определяя состояние субъединиц димера, ориентацию их катионных участков и согласуя полученную последовательность с рядом экспериментально полученных условий, перечисленных выше. Однако здесь не приводятся эти рассуждения; заинтересованный читатель может ознакомиться с обширным материалом по Na, К-АТФазе по специальным публикациям L Авторы полагают, что приведенные выше этапы построения кинетической схемы Na, К-АТФазы хорошо иллюстрируют применение новых кинетических методов для анализа сложных кривых.
1 См.: Кометиани 3. П. Молекулярный механизм Na, К-АТФазной системы// Биол. науки. 1987. № 10. С. 89—99.
102
О некоторых аспектах математической обработки данных
В настоящем разделе будут рассмотрены некоторые вопросы, которые обязательно возникают при математическом анализе экспериментальных кривых. В первую очередь это относится к правильному определению ошибки эксперимента. Когда в практике стали широко применять линейные анаморфозы уравнения Михаэлиса—Ментен, началось обсуждение вопроса о том, равноценны ли с точки зрения статистики эти графики. Ведь при преобразовании начального уравнения ошибка измерения переменных всегда изменяется определенным образом. Оказалось, что наименее пригодным для определения параметров Vmax и Кт является именно график двойных обратных величин, чаще других применяемый в линейной кинетике (появились рекомендации применять большей частью график о от u/S или прямой график, введенный Э. Корниш-Боуден и Р. Эйзентелем (Э. Корниш-Боуден, 1979; М. Walter, 1974; В. Мап- nervick, 1975).
В нелинейной кинетике корректное определение статистической ошибки не менее важно. Надо, однако, обратить внимание на следующее: в гл. 3 и 4 было показано, что основной информацией, которую реально можно получить из графиков дробно-рациональных функций, являются, в первую очередь, степенные показатели, а конкретные значения величин пересечений с осями, будучи сложными комбинациями кинетических констант, с трудом поддаются интерпретации. В определении степенных показателей уравнения большое значение имеет установление наличия на кривых определенных геометрических признаков: максимумов и минимумов, перегибов, их положения относительно асимптоты, вогнутости, выпуклости и др. Поэтому очень важно достоверно знать форму кривой в широком интервале концентраций лиганда, а не только вблизи пересечения с осями. Предложенный в гл. 4 метод степенного преобразования основан на анализе таких свойств кривых, как вогнутость и выпуклость. Применяя этот метод для определения степенных параметров уравнения скорости Na, К-АТФазной реакции при каждом значении параметра г, авторы тщательно проверяли, как изменялась ошибка экспериментальных точек в процессе линеаризации. Если каждой экспериментальной точке t>i соответствовала средняя квадратичная ошибка ои то после степенного преобразования получали новое множество точек
&=(11^дХ!г; °2 (Уд = (УJr) (aj-u^.
Линеаризация кривой подразумевает определение того значения параметра г, при котором отклонение функции yt от регрессионной линии У, минимально. Используя метод наименьших квадратов, минимизируют взвешенную среднюю квадратичную ошибку:
N
М = ^ ад. (у. —у.у,
где Wi= (l/o;(z/))2— заданные положительные веса. Линейность регрессионной линии оценивали путем сравнения величины
N
Nr2 25 (yi - W
(W-2) S ji^l№
i=i
со стандартным значением критерия Фишера при степенях свободы xx = N—2 и v2=N (т—1), где т— число идентичных измерений.
В подобных расчетах обычно используют ряд допущений, о которых всегда следует помнить. В первую очередь это касается выбора концепции ошибки. Изучение природы экспериментальной ошибки показало, что начальные скорости ферментативных реакций, измеренные в постоянных условиях, не всегда распределены с постоянной дисперсией, как обычно предполагают (т. е. не гомоске- дастичны). Не всегда выполнимо также предположение о постоянстве относительной ошибки. Изучение структуры ошибки для реакционной системы глутатион-5-трансферазы, глутатиона и 3,4-ди- хлор-1-нитробензола, например, показало, что экспериментальная ошибка возрастала вместе с начальной скоростью и дисперсия (определенная по одинаковым измерениям) описывалась полиномом от у (Р. Askelof et al., 1976):
зЧ^-К.+К.т+К,®1
или степенной функцией: оЧ^=Кй-^-К<ик'.
Для Na, К-АТФазы также специально была изучена зависимость экспериментальной ошибки от скорости реакции. На основе анализа 1600 экспериментальных точек было обнаружено, что абсолютная величина среднего значения отклонения возрастает с увеличением удельной активности линейно, т. е. относительная ошибка постоянна. Величина относительной ошибки не превышала 3% от удельной активности Na, К-АТФазы (Г. А. Зурабишвили и др., 1986).
С осторожностью следует подходить к процедуре взвешивания. Сравнивая различные способы расчета весов, А. Сторер и сотрудники пришли к выводу, что следует избегать каких-либо обобщений и не выбирать метод взвешивания a priori, а решать проблему для каждой серии экспериментов отдельно. Авторы подчеркивают, что если использовать метод определения весов с помощью измерений идентичных образцов, считая весом средней величины обратную дисперсию, то для каждой точки следует иметь по меньшей мере пять идентичных измерений (A. Storer et al., 1975). В рассмотренных выше случаях Na, К-АТФазы это условие было соблюдено.
Статистический анализ данных в ферментативной кинетике всегда привлекал большое внимание ученых (В. Mannervick, 1975; С. Lam et al, 1977; М. Feraudi et al., 1977). Особо следует отметить 104
работу Дж. и И. Петтерсенов (G. Pettersen, I. Pettersen, 1970), в которой впервые был предложен метод оценки корректности аппроксимации кинетических кривых дробно-рациональными функциями. В работе была развита идея о том, что если варьировать концентрацию одного субстрата в условиях, когда фермент не претерпевает агрегации и [5]»[£о], то уравнение скорости имеет вид:
п In
1=1 I 1=0
Аппроксимацию следует проводить последовательно функциями 1: 1, 2 :2, 3: 3, 4 :4 и т. д., проверяя на каждой ступени с помощью £-теста, оправдано ли увеличение числа параметров уменьшением суммы квадратов, а с помощью /-теста оценивать значимость определяемых параметров. Хотя такой подход является стандартным и широко используется в других областях, применение этого метода в ферментативной кинетике вызывает ряд вопросов. Например, каким образом зависит успешное применение теста от числа экспериментальных точек, от ширины области концентраций субстрата, от структуры ошибки? Нужно ли брать взвешенные или невзвешенные суммы квадратов? Можно ли вообще отличить степень 4:4 от 3:3?
Попытки ответить на эти вопросы содержатся в работе Ф. Бур- гилло и сотрудников (1983), авторы которой исследовали зависимость u(S) для ряда ферментативных механизмов. Они имитировали кривые для 13 механизмов, используя несколько распределений констант скорости и варьируя при этом ширину интервала концентрации субстрата (на 2, 3 или 4 порядка), количество экспериментальных точек (10, 15 или 20), ошибку по и (5—10%) и стандартное отклонение по и (5—9%). Полученные кривые аппроксимировали функциями 1:1, 2:2, ..., 5:5 до тех пор, пока не получили статистически значимое уменьшение суммы взвешенных квадратичных разностей по F-тесту.
Затем изучали вопрос: давала ли программа расчета криволинейной регрессии хороший минимум для суммы квадратов, если за начальные оценки принимать корректные значения параметров. Было установлено, что из 530 случаев имитирования F-тест давал правильную оценку для порядка уравнения с вероятностью 0,62. Эта вероятность уменьшалась вместе с увеличением степени следующим образом: 1:1 (0,98), 2:2 (0,71), 3:3 (0,43), 4:4 (0,34). Оказалось, однако, что вероятность обнаружения отклонений от кинетики Михаэлиса—Ментен с помощью £-теста, т. е. обнаружения в уравнениях порядка п:п членов, по крайней мере второй степени, равна приблизительно 0,8.
Очень важен также полученный авторами результат: вероятность обнаружить увеличение степени уравнения, связанное с включением в реакцию ступени ES-+EP, является хоть и малой, но ко-
нечной величиной, и такое увеличение может быть обнаружено с помощью F-теста. Определение этой вероятности стало возможным благодаря разработке способов расчета и вычисления вероятности появления различных форм кинетических кривых (F. So- lano-Munor et al., 1981; J. Wardell et al., 1982). В гл. 3 было указа- зано, что наличие на кривых определенных геометрических признаков: экстремумов, перегибов, вогнутости, выпуклости и других определяется поведением ряда характеристических функций. Изучение этих функций может стать основой для классификации всевозможных форм кривых, соответствующих уравнению данного порядка.
Такая классификация была проведена для дробно-рациональных функций порядка 2:2 и 3:3. Так как коэффициенты си и р/ взаимосвязаны и, будучи комбинациями констант скорости, зависят от конкретного механизма реакции, возникает вопрос: нельзя ли использовать это свойство для распознавания различных механизмов? Иными словами, можно ли связать с каждой возможной формой кривой определенную вероятность (intrinsic probability) и нельзя ли ее вычислить? Оказалось, что если достигнута классификация сложных кинетических кривых, то с каждой возможной геометрической формой связана внутренняя вероятность при данном распределении коэффициентов at и pz-. Эти вероятности выражаются через кратные интегралы, если известна функция распределения коэффициентов az и pt и показано, что необходимые и достаточные условия наличия определенных геометрических признаков зависят от знаков функции а; и р,.
На практике оценка этих кратных интегралов может оказаться невозможной или, по крайней мере, очень сложной. Однако удалось вычислить их приближенные значения с помощью компьютера. Вследствие этого были определены вероятности различных форм кривых для дробно-рациональных функций порядка 2:2 и 3:3 в общем случае, а также для некоторых конкретных механизмов, дающих уравнения этих степеней (F. Solano-Munoz et al., 1981; J. Wardell et al., 1982). В данном изложении нет возможности рассматривать многие частные детали этого подхода, но хотелось бы подчеркнуть, что при наступающей всеобщей компьютеризации использование таких, казалось бы, сложных и требующих специальных знаний по информатике методов перспективно и принесет несомненную пользу исследователям, изучающим нелинейную кинетику сложных ферментных систем.
Заключение
Выяснение механизма регуляции клеточного метаболизма является одной из ключевых проблем современной биологической химии. Решение этой проблемы требует всестороннего изучения способов контроля метаболизма на разных уро нях организации: на уровне функционирования отдельных ферментов, мультифермент- ных комплексов, субклеточных структур и клетки в целом. Математическое моделирование биохимических процессов па всех уровнях представляет большой интерес. В настоящем учебном пособии предпринята попытка описать новые методы ферментативной кинетики, применение которых способствовало бы установлению кинетической схемы отдельной ферментативной реакции. Эта проблема очень существенна. Ведь даже очень простые ферментативные реакции проявляют сложное динамическое поведение: фермент может связывать различные лиганды и переходить из одного устойчивого режима функционирования в другой; причем могут иметь как колебательный, так и неколебательный характер.
Выбор адекватного математического описания процесса необходим для понимания его сути. Разумеется, правильный подбор уравнения стационарной скорости для ферментативной реакции еще не решает всей проблемы, но и пренебрегать этим этапом во время исследования ферментной системы не следует. Изучение кинетики ферментных систем, в том числе транспортных ферментов, включает также исследование пространственной организации интегральных ферментов и возможности образования единых мембранотранспортных систем. Примером такой системы может служить комплекс гликолитических ферментов, адсорбированный на мембране, ключевую роль в котором играет белок полосы ///—анион-транс- портная система (Б. И. Курганов, 1986). Для понимания явлений, происходящих на уровне мультиферментного комплекса, необходимы наиболее адекватные «исходные данные» о каждом ферменте. В настоящей книге авторы хотели показать, что использование для этих целей таких параметров, как Кт, Vmax, пн (коэффициент Хилла), нецелесообразно во многих случаях и кинетические характеристики фермента невозможно получить без исследования дробнорациональных функций, описывающих стационарную скорость.
Рекомендуемая литература
Болдырев А. А. Биологические мембраны и транспорт ионов. М., 1985.
Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М., 1982.
Кагава Я. Биомембраны. М., 1985.
Кометиани 3. П. Метод анализа формы кривой для решения задач кинетики ферментов//Сообщения АН ГССР, 1982. Т. 105. № 2. С. 401—404.
Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М., 1979.
Котык А.» Яначек К. Мембранный транспорт. М., 1980.
Курганов Б. И. Аллостерические ферменты. М., 1978.
Bardsley W. G. The quantitative analysis of ligand binding and initial-rate data for allosteric and other complex enzyme mechanisms//Biochem. J. 1975. Vol. 153. P. 101—117.
Bardsley W. G., Childs R. E. Sigmoid curves, non-linear double-reciprocal plots and allosterism//Biochem. J. 1975. Vol. 149. P. 313—328.
Indge K., Childs R. E. A new method for deriving steady-state rate equations suitable for manual or computer use//Biochem. J. 1976. Vol. 155. P. 567—570.
Solano-Munoz G., McGinley P. B., Woolfson R., Bardsley W. G. Deviations from Michaelis—Menten kinetics//Biochem. J. 1981. Vol. 193. P. 339—352.
Предметный указатель
АДФ высвобождение 20
Активаторы 14
— необходимые 28
— обычные 28
Альфанумерическое умножение 17
Аппроксимирующая функция 54
Аргумент, экстремальные значения
56*
АТФазы транспортные 10, 19
субстратная зависимость 67
Ауровертин D 11
Боттса и Моралеса схема 28
Быстрого равновесия метод 15
Валиномицин 9
Ванадат 11, 85
Гамма-глутамилтранспептидаза 10
Гидролиза реакция, ступени 20
Гомоскедастичность 104
Граф 15
— направленный 17
— ненаправленный 17, 19
Декарта правило 33
Дефосфорилирование 20
Диксона график 23
Дисперсия 104
Диффузия молекул простая 8
Дробно-иррациональная функция 74
Дробно-рациональная функция 13, 31, 32, 33 *, 34 *, 36 *, 48, 86
в различных координатах 37
определение порядка 42
Знаков правило 33
Ингибирование, константа 26
— продуктом 27
— субстратное 40
Ингибиторы 14, 28, 29*
— бесконкурентные 28
— конкурентные 28
— неконкурентные 28
— необратимые 28
— обратимые 28
— смешанные 28
Ионофоры 9
Каналы 8
Карусели механизм 9
Квертицин 11
Кинга — Альтмана метод 14, 16, 25, 74, 79, 99
Кинетическая реакция, график хода 24 с участием нескольких субстратов и продуктов 25
Кинетические константы 27
Компартментализация 7
Концентрации, сравнительная оценка рабочего интервала 65
Координатные системы 48
Лайнуивера — Берка метод 23
Лиганда концентрации 14 экстремальные 54, 57 *
Линеаризация 103
Лэма и Пристли метод 17
Межклеточные контакты 7
Мембранология 8
Мембраны биологические, барьерная функция 8 классификация 7 основные функции 7
Михаэлиса кинетика 22, 47
— константа 26
Михаэлиса — Ментен уравнение 22
Модификаторы 27, 28 *, 45, 46 *, 68 — АТФ 72
— действие на транспортные АТФазы
Молекулярность реакции 40
Монензин 9
Наименьших квадратов метод 103
Нигерицин 9
Нонактин 9
Область больших концентраций 82
— средних концентраций 50, 82
— двойных величин, график 10
Олигомицин 11
Отрицательного единичного порядка точка 52
Определяющие функции 38, 41 *
Ошибка, выбор концепции 104
— измерения 66
— квадратичная 66, 88, 90, 95
— относительная 66
— эксперимента 102
Параметры, критерий определения
63. 64
Перегиб горизонтальный 51
Перегиба точка 32, 36, 50
Переносчики 8
— подвижные 9
Плеснера схема 69
Плоских кривых теория 32
Положительного единичного порядка точка 52
Порядок реакции 40
Предел функции 58 ♦, 59 *, 61 *, 63 *
Регрессия криволинейная 105
— линейная 54, 89
— ошибка 89
Рецептор 7
Рутениевый красный 11
Скорость, константа 25, 27
— реакции начальная 27
ферментативная 14
Скэтчарда график 58, 85
Сродство фермента к субстрату, мера 23
Стационарная фаза 13
Стационарной скорости уравнение 13,
16, 31, 74
Стационарности принцип 23
Степенное преобразование 48, 53, 62
Степенные параметры 62, 87
— показатели 14
Термодинамическая константа равновесия 27
Тиоционат 11
Транспорт активный 8
кинетические схемы 19
— вторично-активный 9, 11
— пассивный 8
— первично-активный 9
Транспортные системы 7
Транспортный процесс, этапы 19
Трансформация кривой 60 — производных 37
Уабаин 11. 85
Уабаин-чувствительная Mg-АТФаза 102
«Уни-би» реакция 25
Уонга алгебра 17
Фермент дефосфорилированный 97 — закономерность чередования основных функциональных состояний 100 — окклюдированные формы 96 — транспортные участки 84 — фосфорилированный 97
Ферментативной реакции механизм 17*
Фермент-субстратный комплекс 22
Фишера критерий 65
Форма кривой 63
Фосфорилирование 20
Фосфотрансферазная система 10
Хилла коэффициент 107
Цитоз 12
Ча метод 16
Эйзенталя и Корниш-Боуден метод 23, 24 *, 103
Экстраполяция 40, 41 *
Экстремума точка 32, 36, 50
Энергозависимость 8
Са-АТФаза 10
Са-Насос 11
К. Н-АТФаза 11
Na, К-АТФаза 67
— интермедиаты 97
— кинетическая схема 98
— «минимальная» модель 72, 78, 96
— определение числа Na-центров 86 S/rS-Чувствительный перенос анионов 11
Оглавление
Предисловие 5
Введение 7
Классификация биологическихмембран и их функций 7
Транспорт веществ черезбиомембраны 8
Глава 1.Как выводить уравнения стационарнойскорости 13
Уравнение стационарной скорости 13
Некоторые приемы, облегчающие вывод уравнения стационарной скорости 16
Кинетические схемы активного транспорта 19
Глава 2.Линейная кинетика 22
Уравнение Михаэлиса — Ментен 22
Кинетический анализ реакций с участием нескольких субстратов и продуктов 25
Исследование действия модификаторов 27
Глава 3. Исследование формы кинетических кривых в различных координатных системах 32
Основные геометрические характеристики формы кинетических кривых 32
Исследование дробно-рациональных функций в различных координатах 37
Определениепорядка дробно-рациональных функций . . . .42
Глава 4. Исследование дробно-рациональных функций с помощью степенного преобразования 48
Изменения формы кривых при степенном преобразовании . .48
Исследование формы кривых при экстремальных концентрациях лиганда 54
Определение степенных параметров п и т 62
Глава 5. Исследование субстратной зависимости транспортных АТФаз . .67
Особенности субстратной зависимости АТФазных реакций 67
Анализ дробно-иррациональных функций 74
Минимальная модель субстратной зависимости Na, К-АТФазы 78
Глава 6. Кинетика действия модификаторов на транспортные АТФазы 84
Регуляция Na, К-АТФазной активности ионами натрия и калия 84
Определение числа Na-центров Na, К-АТФазы 86
Определение числа К-нентров Na, К-АТФазы 93
Минимальная модель Na, К-АТфазы 96
О некоторых аспектах математической обработки данных . .103
Заключение 107
Рекомендуемая литература 108
Предметный указатель 109
Учебное издание
Кометиани Зураб Петрович,Векуа Мзия Георгиевна
Кинетика мембранных транспортных ферментов
Редактор А. С. Орлова
Младший редактор Е. И. ПоповаХудожник В. Н. ХомяковХудожественный редактор Т. А. КоленковаТехнический редактор Ю. А. Хорева, Е. И. ГерасимоваКорректор О. М. Пахомова
ИБ Ns 8088
Изд. № Е-570. Сдано в набор 18.07.88. Подп. в печать 22.11.88. Т—21905.Формат 60X90V16- Бум. тип. № 1. Гарнитура литературная. Печатьвысокая. Объем 7 усл. печ. л. 7,25 усл. кр.-отт. 6,76 уч.-изд. л.Тираж 6000 экз. Зак. № 541. Цена 20 коп.
Издательство «Высшая школа»,101430, Москва, ГСП-4, Неглинная ул., д. 29/14.
Московская типография № 8 Союзполиграфпромапри Государственном комитете СССР по делам издательств,полиграфии и книжной торговли,101898, Москва, Центр, Хохловский пер., 7
-О коп.
Книга продолжает серию учебных пособий по современным проблемам биохимии мембран и дает основные сведения о кинетике мембранных транспортных ферментных систем.
1 SITS — сложное химическое соединение, применяемое для торможения ани
БИОХИМИЯ МЕМБРАН
З.П.КОМЕТИАНИ М.Г.ВЕКУА
Кинетика мембранных транспортных ферментов
БИОХИМИЯ МЕМБРАН
БИОХИМИЯМЕМБРАН
Под редакцией
А.А. Болдырева
Книга 5
З.П.КОМЕТИАНИ М.Г.ВЕКУА
Кинетика мемб ранных транспортных ферментов
Допущено
Государственным комитетом СССР по народному образованию в качестве учебного пособия для студентов биологических специальностей высших учебных заведений
МОСКВА «ВЫСШАЯ ШКОЛА» 1988
ББК 28.05 Б63
УДК 577.1
Рецензенты:
кафедра биохимии и биотехнологии Тбилисского государственного университета (зав. кафедрой д-р биол. наук, проф. Н. Г. Алексидзе); д-р хим. наук, проф. Б. И. Курганов (Научно-производственное объединение «Витамины»)
Биохимия мембран: Учеб, пособие для биол. и мед. спец. Б63 вузов/Под ред. А. А. Болдырева. Кн. 5. 3. П. Кометиани, М. Г. Векуа. Кинетика мембранных транспортных ферментов.— М.: Высш, шк., 1988.— 111 с.: ил.
ISBN 5—06—001355—3
Книга продолжает серию, посвященную изложению современного состояния биохимии мембран. В ней в обобщенном виде освещается теория стационарной кинетики сложных ферментных систем и метод анализа формы кривых, включая статистическую обработку экспериментальных данных. Большое внимание уделено особенностям кинетики активного транспорта, определению минимальных моделей и регуляторных механизмов транспортных ферментов.
1903010000(4309000000)—541 001(01)—88
ISBN 5—06—001355—3
КБ—51—21—87
ББК 28.05
67.04
© Издательство «Высшая школа», 1988