Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
Предисловие
Книга продолжает серию учебных пособий по современным проблемам биохимии мембран и дает основные сведения об эн- доцитозе и экзоцитозе веществ клетками. Здесь рассмотрены проблемы, которые ранее изучались в разделе физиологии и цитологии клетки. Лишь за последнее время эндоцитоз и экзоцитоз закономерно стали считаться одной из проблем мембранологии.
Предлагаемая книга, как и выпускаемые пособия из серии «Биохимия мембран», предназначена для фундаментальной подготовки студентов в области мембранологии. Ее изучение необходимо и для более глубокого проникновения в область биохимии и молекулярной биологии клетки, и для овладения методами биотехнологии и медицинской биохимии. Производство биологически активных веществ биологическим способом, их использование для стимуляции или модификации метаболизма, понимание молекулярных основ патологических изменений в тканях и выработка рекомендаций для профилактики и лечения, выяснение закономерностей осуществления и регуляции клеточного цикла ——все эти теоретические или практические задачи требуют подготовки специалистов в области мембранологии.
Эндоцитоз и экзоцитоз исключительно важны для функционирования практически любых клеток; оба процесса вовлечены б разнообразные проявления метаболизма, физиологического ответа клеток на внешние воздействия. Они связаны с работой клеточных и внутриклеточных мембранных структур. Поиск универсализации заставил автора выя лять то общее, что объединяет оба процесса — эндо- и экзоцитоз.
Изложение многих вопросов, связанных с захватом и секрецией тех или иных веществ клетками, имеет не только общебиологический интерес. Существующие научные знания об эндо- и экзоцитозе играют немаловажную роль в решении задач народного хозяйства и практической медицины.
При изложении материала автор испытывал определенные трудности, поскольку подобный систематический анализ вышеуказанных проблем ранее практически никем не проводился. Автор надеется, что книга послужит стимулом для дальнейшего углубленного изучения проблем мембранологии.
Автор
Введение
Цель настоящего учебного пособия — изложить современные представления о механизмах и регуляции процесса поглощения различных веществ клетками — эндоцитоз — и процесса выделения тех или иных веществ клетками ——экзоцитоз.
Первый путь эндоцитоза — фагоцитоз был открыт И. И. Мечниковым в 1883 г., второй путь — пиноцитоз — В. Льюисом (США) в 1931 г., третий путь — рецептор-индуцируемый эндоцитоз—К. Портером и Т. Ротом (США) в 1964 г. В 60—70-е годы были сформулированы основные представления о механизмах экзоцитоз а.
В 70—80-е годы стало ясно сходство явлений эндо- и экзоцитоз а на мембранном уровне, поскольку оба феномена связаны с изменением не только структуры, но и формы и размеров плаз- малеммы.
Процессы эндо- и экзоцитоза объединяет общность механизмов межмембранного взаимодействия, слипания и слияния мембран. Рассмотрение на мембранном уровне процессов эндо- и экзоцитоза закономерно приводит ко многим глобальным закономерностям функциональной биохимии мембран: контейнерный транспорт разнообразных веществ нутри клетки от центра к периферии и обратно; обновление (рециклизация) мембран и их компонентов (например, рецепторов); межклеточный обмен информационными макромолекулами; особенности синтеза секретируемых белков и пути их встраивания в мембрану; функционирование сократительных белков цитоскелета и многие другие проблемы. Изучение механизмов н регуляции эндо- и экзоцитоза является перспективным направлением в мембранологии, уже сейчас имеющим практическую значимость для медицины.
Монографии и обзорные работы, рассматривающие эндо- и экзоцитоз с единых позиций, практически отсутствуют в отечественной научной литературе. Вследствие важности этого раздела мембранологии мы считаем целесообразным посвятить этому вопросу настоящий выпуск продолжающейся серии «Биохимия мембран».
Неспецифический ЭНДОЦ51ТОЗ (пиноцитоз и фагоцитоз)
Общая характеристика
Цитоз — уникальный способ поглощения клеткой крупных веществ и частиц и их выделения с помощью изменения структуры, формы и размеров плазмалеммы (клеточной мембраны). Этот способ отличен от диффузии, пассивного и активного транспорта индивидуальных низкомолекулярных веществ через мембраны. Во внеклеточной среде (в большинстве случаев в низкой концентрации) содержится масса веществ; среди них строительный материал для клеток, питательные вещества, физиологически активные соединения, «отходы» метаболизма, а также токсины, бактерии, вирусы и пр. Каждая клетка при помощи плазма леммы захватывает из среды «нужные» ей компоненты. Такой захват осуществляется при помощи эндоцитоза.
Эндоцитоз ——универсальное явление, характерное для любых клеток. Наиболее выраженно эндоцитоз проявляется в клетках простейших, в клетках печени, мозга (чаще всего глии), эпителия, форменных элементов крови, макрофагов, в клетках злокачественных опухолей, в эмбриональных клетках и в меньшей степени ——миоцитов. При эндоцитозе определенный участок плазмалеммы захватывает, обволакивает внеклеточный материал, который таким образом попадает внутрь клетки. Сначала этот материал заключается в везикулу — сфероидную органеллу, образованную из.фрагментов плазмалеммы; внутри клетки содержимое везикулы постепенно трансформируется. Благодаря постоянно осуществляющемуся эндоцитозу происходит обновление клеточной мембраны.
Эндоцитоз ——это борьба с инфекцией; это поддержание клеточного гомеостаза путем захвата питательных веществ; это ограничение времени действия сигнальной информации (гормонов, медиаторов, иммунных стимулов).
Существует три варианта эндоцитоза (термин предложен в 1963 г.): фагоцитоз, пиноцитоз и специфический эндоцитоз (рис.
1，табл. 1). Первые два явления (исходя из свойств захватываемого материала) могут быть названы неспецифическим эндоци- тозом. Неспецифичность фагоцитоза и пиноцитоза наглядно про- является в поглощении клеткой не нужных ей веществ (напри- мер, частичек сажи) или вредных веществ (красителей). Механизмы фагоцитоза и пиноцитоза во многом сходны и различают- ся『° объему и массе захватываемого материала. Видимо, лю- 6°й участок пл азмалем мы участвует в неспецифическом эндоци- тозе. Предполагают, что при эндоцитозе контактный участок мембраны отличается от других участков обилием элементов цитоскелета на внутренней поверхности плазмалеммы и наличи- ем микроворсинок, ресничек в зоне внешней поверхности мембраны.
Рис. 1. Три типа эндоцитоза. А — фагоцитоз; Б — пиноцитоз; 8 — специфический эндоцитоз:Рис. 1. Три типа эндоцитоза. А — фагоцитоз; Б — пиноцитоз; 8 — специфический эндоцитоз:/ -* последовательные фазы фагоцитоза (образование псевдоподий или «ловчих парусов»); 2—4 — последовательные фазы пиноцитоза (2 *- инвагинация плазмалеммы, 3 — эндоцитоз реснитчатой поверхности, 4 — пнно・ цитоз с образованием удлиненного узкого канала с захваченным материалом); стрелками указана промежуточная стадия образования пино- цитозных каналов; черными точками — адсорбционный пиноцитоз/ -* последовательные фазы фагоцитоза (образование псевдоподий или «ловчих парусов»); 2—4 — последовательные фазы пиноцитоза (2 *- инвагинация плазмалеммы, 3 — эндоцитоз реснитчатой поверхности, 4 — пнно・ цитоз с образованием удлиненного узкого канала с захваченным материалом); стрелками указана промежуточная стадия образования пино- цитозных каналов; черными точками — адсорбционный пиноцитоз
Рис. 1. Три типа эндоцитоза. А — фагоцитоз; Б — пиноцитоз; 8 — специфический эндоцитоз:
Рис. 1. Три типа эндоцитоза. А — фагоцитоз; Б — пиноцитоз; 8 — специфический эндоцитоз:
/ -* последовательные фазы фагоцитоза (образование псевдоподий или «ловчих парусов»); 2—4 — последовательные фазы пиноцитоза (2 *- инвагинация плазмалеммы, 3 — эндоцитоз реснитчатой поверхности, 4 — пнно・ цитоз с образованием удлиненного узкого канала с захваченным материалом); стрелками указана промежуточная стадия образования пино- цитозных каналов; черными точками — адсорбционный пиноцитоз
/ -* последовательные фазы фагоцитоза (образование псевдоподий или «ловчих парусов»); 2—4 — последовательные фазы пиноцитоза (2 *- инвагинация плазмалеммы, 3 — эндоцитоз реснитчатой поверхности, 4 — пнно・ цитоз с образованием удлиненного узкого канала с захваченным материалом); стрелками указана промежуточная стадия образования пино- цитозных каналов; черными точками — адсорбционный пиноцитоз
Проникновение в клетку частиц, биополимеров, макромолекул включает три основных этапа: эндоцитоз; трансформацию захваченного материала (разложение субстратов до низкомолекулярных фрагментов); удаление неперевариваемых остатков за пределы клетки (секреция). Сам процесс эндоцитоза имеет 8
Таблица 1. Характеристики эндоцитоза
Исследуемые процессы
Характеристические параметры
фагоцитоз
пиноцитоз
специфический эндоцитоз
Природа захватываемого материала
Название эндосомы Диаметр эндосом, мкм Характер поглощения
Длительность процесса
Трансформация захваченного материала
Энергия активации, кДж/моль
Зависимость от биоэнергетики, чувствительность к блокаторам дыхания, гликолиза
Температура, ℃
Действие цитохалазина В
Инородные частицы, бактерии, клетки, липосомы, вирусы, молекулярные комплексы
Фагосома
1—>10
Аде (кривая с насыщением)
Дискретно
В лизосомах
227
++
17—20
Торможение
Малая капля жидкости, белки, гликопротеины, макромолекулы
Пиносома
<0,1 (иногда до 1,0)
Аде (кривая с насыщением); жф (линейная зависимость)
Жф (постоянно)
В лизосомах
Жф： 76
Аде (+); жф (зависит слабо)
Жф(2->38)
Аде (торможение); жф (не влияет)
Мелкая капля жидкости, гормоны, белки, лектины, токсины, вирусы, гликопротеины
Одетая везикула
0,1-0,2
Аде (кривая с насыщением)
Дискретно
В системе ГЭРЛ
++
Торможение
Продолжение табл. /
Характеристические параметры
・Исследуемые процессы
фагоцитоз
ПИНОЦИТОЗ
специфический эндоцитоз
Какая часть плазмалеммы участвует в процессе?
Любая; чаще всего там, где больше элементов цитоскелета на внутренней поверхности плазмалеммы
Любая; иногда на внешней поверхности плазмалеммы обилие микроворсинок, ресничек
Специализированный участок: на внешней поверхности плазмалеммы — рецепторы, на внутренней — окаймленные ямки с клатрином, там же скопление цитоскелета
Какая поверхность плазмалеммы составляет внешнюю поверхность эндосом?
Внутренняя
Внутренняя
Внутренняя
Слияние эндосом руется Кон А
ингиби-
Нет
Жф (Да)
—
Слияние эндосом руется макроанионами
ингиби-
Да
Жф (Нет)
—
Примечание, Аде — адсорбционный; жф — жидкофазный, Кон А — конканавалин А; Адс-фагоцитоз н пиноцитоз крупных частиц и капель жидкости нередко обозначают макроэндоцитозоМ, в отлнчие от жф-пиноцитоза, т. е. микроэидоцитоза; (+ и + + ) означают интенсивность ответа.
четыре фазы: 1) адсорбция захватываемого материала плазма- лемглой; 2) волнообразные движения (ундуляция) мембраны, инвагинация участка плазмалеммы в зоне контакта; 3) везику- ляризация, т. е. слипание и слияние контактирующих мембран вследствие прямой (углубление) или обратной (впячивание) инвагинации с образованием эндоцитозного пузырька — эндосомы (фагосомы или пиносомы); 4) отрыв везикулы от мембраны. Последние три фазы называют интернализацией.
Образованию эндосом предшествует формирование так называемых удлиненных эндоцитозных каналов. Сорбция поглощаемых молекул и частиц на поверхности клеточной мембраны определяется не столько самой поверхностной мембраной, сколько гликокаликсом ——мукополисахаридным волокнистым слоем, примыкающим непосредственно к наружной поверхности мембраны. Гликокаликс представляет собой примембранный рыхлый слой густо разветвленных олигосахаридных цепей гликолипидов и гликопротеинов, входящих в состав плазмалеммы. При физиологическом значении pH среды этот слой содержит отрицательно заряженные группы. Толщина гликокаликса для клеток животных колеблется в диапазоне 3—6, нередко до 10 нм. Кислые мукополисахариды также входят в состав гликокаликса. Углеводные компоненты мембран составляют почти 10% от их сухой массы. Гликокаликс сильно гидратирован, имеет желепо- добную структуру, в нем локализованы ферменты, секретированные клеткой; они связаны с зоной гликокаликса с помощью Са2+ или Mg2+ Эти ферменты участвуют в обмене компонентов гликокаликса. Продукты этого обмена непосредственно усваиваются клеткой. Таким образом, эти ферменты «на месте» осуществляют регенерацию клеточной поверхности.
Гликокаликс обнаружен практически у всех клеток животных; он довольно вариабелен по своей химической структуре и размерам. Этот слой важен для рецепции, эндоцитоза, фильтрации, внеклеточного пищеварения, создания околоклеточной среды. В гликокаликсе скорость диффузии различных веществ снижается.
Гликокаликс хорошо выявляется рутениевым красным и Кон А. В опухолевых клетках структура гликокаликса резко нарушена, изменяется знак заряда на внешней поверхности плазмалеммы.
Гликокаликс считают маркером нешней поверхности плазмалеммы, в то время как маркером ее внутренней поверхности является эктоплазма (рис. 2). Эктоплазма в отличие от эндоплазмы обладает более вязкой структурой, обеднена органеллами, насыщена цитоскелетом, который регулирует эластичность мембраны, кластеризацию белков в ней, волнообразные движения плазмалеммы и другие свойства примембранной области, которые важно учитывать при рассмотрении эндо- и экзоцитоза.
Процесс сорбции прослеживается при помощи специальных маркеров эндоцитоза — окрашенных или флуоресцирующих сое-
динений. Чаще всего — это конъюгаты декстрана, различных белков (ферритина, пероксидазы хрена и др.) с флуоресцирующими красителями.
КлеткаКлеткаСредаСредаЭнтоплаз^а ^.шлоплазпа^>50 ""I МепЬрахаJ 7-8 кмЕлик 口 капикс/》3一4h"Энтоплаз^а ^.шлоплазпа^>50 ""I МепЬрахаJ 7-8 кмЕлик 口 капикс/》3一4h"Рис. 2. Периферические зоны клеточной мембраныРис. 2. Периферические зоны клеточной мембраныЭндоплазма (цитоплазма)Эндоплазма (цитоплазма)
Клетка
Клетка
Среда
Среда
Энтоплаз^а ^.шлоплазпа^
>50 ""
I МепЬраха
J 7-8 км
Елик 口 капикс
/》3一4h"
Энтоплаз^а ^.шлоплазпа^
>50 ""
I МепЬраха
J 7-8 км
Елик 口 капикс
/》3一4h"
Рис. 2. Периферические зоны клеточной мембраны
Рис. 2. Периферические зоны клеточной мембраны
Эндоплазма (цитоплазма)
Эндоплазма (цитоплазма)
Эндоцитоз активируется в присутствии поврежденных, отмерших клеток или в случае повреждения органа. Например, частичная гепатэктомия вызывает резкое усиление эндоцитоза у гепатоцитов (эти клетки в норме не отличаются активным эндо- цитозом). Таким образом, эндоцитоз направлен не только против патогенных микроорганизмов, но и против собственных нежизнеспособных клеток.
Эндоцитоз — один из способов питания клетки. Например, клетка эпителия тонкого кишечника млекопитающих образует до 1000 пиносом за 1 с. Пероксидаза хрена через 5 мин после добавления к макрофагам уже обнаруживается в их пиносомах, а через 1 ч полностью подвергается гидролизу в лизосомах. Макрофаги образуют 125 пиносом за 1 мин. Скорость пиноцито- за для макрофагов — 30—50, для амебы — 1600—2400 нл/106 клеток за 1 ч. «Эндоцитозное питание» особенно характерно для одноклеточных. Амеба может с помощью пиноцитоза поглощать белки в количестве до 20—25% от своей собственной массы (за 1 ч), объем клетки за этот период увеличивается в 50 раз.
Пиноцитоз может быть жидкофазным и адсорбционным. В первом случае поглощаются растворимые макро- и микромолекулы, жидкая среда; во втором — макромолекулы и малые частицы (кислые белки, ферритин, липопротеины, лектины, антитела, вирионы, коллоидные частицы, иммунные комплексы). В первом случае процесс не зависит от температуры и линейно зависит от концентрации поглощаемых соединений; во втором — он чувствителен к температуре, захват веществ происходит с насыщением. В первом случае растворимые вещества не адсорбируются плазмалеммой, во втором ——процесс более специфичен:
сначала происходит адсорбция вещества, затем непосредственно пиноиитоз.
Хорошими маркерами жидкофазного пиноцитоза являются ,98Аи, 1251-пероксидаза, 1251-сывороточный альбумин, поливинил- пирролидон. Длительность пиноцитоза зависит от типа клеток и характера субстрата. Многие клетки (макрофаги, фибробласты, клетки эпителия, почек, семявыносящих протоков и др.) в случае жидкофазного пиноцитоза образуют пиносомы постоянно, в течение длительного времени, хотя и с различной скоростью. Клетки, обладающие высокой скоростью обновления макромолекул, характеризуются высокой степенью фагоцитоза. Например, клетки эпителия почечных канальцев, молочных желез после лактации, остеокласты. Нейтрофилы или макрофаги в процессе фагоцитоза не снижают способности транспортировать нуклеотиды и аминокислоты, даже при условии, когда 30—50% клеточной поверхности интернированы внутрь клетки.
Индукторы эндоцитоза
Первичным актом эндоцитоза является сорбция молекул внешней поверхностью плазмалеммы. На примере изучения пиноцитоза у амеб было замечено, что внесение в среду инкубации белков индуцирует эндоцитоз. Эти исследования показали, что индукторами эндоцитоза являются растворимые (главным образом основные) белки. Эти белки содержат положительно заряженные группы, связывающиеся с отрицательно заряженными груп- ламн гликокаликса или самой поверхностью мембраны (электрически нейтральные вещества — углеводы, нуклеиновые кислоты не стимулируют пиноцитоз). Эндоцитозу способствуют не только электростатическое, но также и гидрофобные взаимодействия, возникающие между неполярными участками мукополисахаридного слоя гликокаликса и захватываемого материала.
Все эти данные, полученные на амебах, указывали, что эндоцитоз —процесс неспецифический, поскольку его могут вызывать •самые разнообразные вещества независимо от размера их молекул. Предварительное голодание амеб значительно облегчало ■индукцию пиноцитоза при помощи сывороточных белков, АТФ, глюкозы и Кон А. На тканевых клетках получены аналогичные результаты. Во всех случаях типичные индукторы эндоцитоза одни и те же — это основные белки и ферменты (сывороточный альбумин, у-глобулнн, протамин, пероксидаза, РНКаза, ферритин, цитохром с).
Индукторами эндоцитоза в тканевых клетках могут быть витамины, антибиотики, различные физиологически активные вещества. В макрофагах пиноцитоз индуцируется макроанионами: альбумином, L-полиглутаматом, мукополисахаридами, нуклеиновыми кислотами, нуклеотидами. Окисление экзогенных или эндогенных жирных кислот — свободных или в составе фосфолипидов —способствует фагоцитозу.
Слабополярные или неполярные гидрофобные вещества в тканевых клетках являются малоэффективными индукторами. Сорбция такого рода веществ гликокаликсом и (или) пиазма- леммой будет определяться наличием в них положительно заряженных гидрофильных групп (например, кислые фосфолипиды). Нейтральные (сахара) или кислые (нуклеиновые кислоты, красители) соединения на тканевых клетках, как правило, не индуцируют эндоцитоз, однако эти вещества могут пассивно захватываться клетками в присутствии различных кофакторов.
Вопрос о захвате клеткой смеси различных веществ пока остается неясным. Так, эндоцитоз нейтральных белков тормозится в присутствии кислых полипептидов, тогда как основные полипептиды усиливают эндоцитоз. Некоторые микромолекулы могут поглощаться клетками за счет их комплексирования с хорошо поглощаемыми макромолекулами. Пиноцитоз альбумина ускоряется в присутствии поликатионов и ослабляется в присутствии полианионов.
Замечено, что белок тем легче подвергается эндоцитозу, чем* легче он связывается с мембранами. Кроме того, белки, обладающие высокой скоростью обновления, эндоцитируются клетками интенсивнее, чем медленно обновляющиеся белки. Эндоцитоз веществ, связывающихся на поверхности клеток, протекает в 3—4 раза быстрее, чем эндоцитоз веществ в растворе. В первом случае скорость эндоцитоза определяется типом молекулы, ее структурой, структурой гликокаликса, степенью связывания вещества с мембраной; во втором случае эндоцитоз лишен избирательности, а вещества из раствора поглощаются с одинаковой скоростью.
В отличие от адсорбционного пиноцитоза жидкофазный пиноцитоз в большинстве клеток протекает непрерывно в течение 2 ч — 4 сут даже в отсутствие белков в среде. В момент инициации митоза пиноцитоз прекращается. Жидкофазный пиноцитоз в макрофагах индуцируется Кон А, форболмиристатацетатом, в эпителии мочевого пузыря ——антидиуретическим гормоном,氏 фибробластах и миоцитах гладких мышц — фактором роста тромбоцитов, эпидермальным фактором роста. Факторы, снижающие адсорбционный захват веществ, также способны подавлять и жидкофазный пиноцитоз.
Фагоцитоз в отличие от пиноцитоза представляется более- сложным процессом. Основные этапы фагоцитоза таковы: поверхность определенных частиц узнается фагоцитом, при этом фагоцит получает сигнал для узнавания; клетка каким-то образом передает в цитоплазму сигнал о захвате частиц; затем происходит сорбция частицы плазмалеммой; формирование псевдоподий и обволакивание ими этой частицы; наконец, осуществляется слияние верхушек псевдоподии, в основе которого лежит межмембранное взаимодействие.
Фагоцитозу нередко предшествует взаимодействие частиц с опсонинами. Опсонины — белки сыворотки крови: иммуногло- 14
<5улины (IgG), комплемент (СЗЬ), фибронектин. Опсонины абсорбируются на частице (бактерии), которая при этом лучше связывается с плазмалеммой. Опсонины связываются либо с частицей и рецепторами плазмалеммы, либо только с частицами. Опсонизация частиц не всегда делает их окончательно готовыми для фагоцитоза. Например, перитонеальные макрофаги не фагоцитируют комплемент (фагоцитоз индуцируется лишь в присутствии лимфокинов — белков, секретируемых Т-лимфоцитами), но поглощают комплекс лимфоцитов с антителами к мембранным IgG. Лимфокины, связываясь с рецепторами мембран макрофагов, дополнительно облегчают фагоцитоз опсонированных частиц. Фагоцит тем лучше поглощает частицы, чем они гидро- ■фобнее, и хуже поглощает частицы, поверхность которых гидро- «фильнее, чем поверхность фагоцита.
Лимфокины снижают гидрофобность макрофагов и облегчают фагоцитоз опсонированных эритроцитов. Опсонизация макрофагов видонеспецифичными альбуминами делает эти клетки неспособными различать при пиноцитозе аутологичный и чужеродный материал.
В выделенных фаголизосомах макрофагов, которые захватывали эритроциты, опсонированные IgG или комплементом, состав мембран специфичен и резко отличается от состава плазма- леммы (по данным йодирования белков). По другим данным, -белковый спектр внешней поверхности мембран фаголизосом и внешней поверхности плазмалеммы не идентичен. Состав мембран фаголизосом зависит от природы фагоцитирующего материала. Макрофаги, захватывающие IgG-опсонированные липосомы, теряют на своей клеточной поверхности Fc-, но не СЗЬ-ре- депторы. Макрофаги фагоцитируют белковые антигены, процесс усиливается в присутствии Кон А, но при этом образовавшиеся «фагосомы не сливаются с лизосомами. Однако при добавлении маннозы, которая конкурирует за связывание с некоторыми рецепторами Кон А, наблюдается быстрое слияние фагосом с лизосомами. Эти опыты моделируют события, которые происходят при некоторых инфекционных заболеваниях. -
Если макрофаги инкубировать с частицами, связывающимися с мембраной, но не захватывающимися клеткой, в этом же районе связывается вторая частица, которая приобретает способность захватываться клеткой. Отсюда следует, что фагоцитоз включает в себя локальные изменения плазмалеммы, передающей сигнал для инициации фагоцитоза.
Таким образом, фагоцитоз в целом — активный процесс. Активный фагоцитоз — это чаще всего индуцируемый рецепторами захват клеток, бактерий, макромолекул, который зависит от метаболизма, от температуры. Пассивный фагоцитоз — это, как правило, захват нейтральных частиц, он проходит без участия рецепторов и не зависит от метаболизма и температуры.
Ионы Са во внеклеточной среде также необходимы для инициации фагоцитоза, например, как это показано для сорбции
макрофагами эритроцитов, опсонированных при помощи IgG. Замена Са2+ на Mg2+ устраняет фагоцитоз. Ионы Са увеличивают скорость поглощения сывороточного альбумина лейкоцитами. Максимальная активность фагоцитоза проявляется тогда, когда процесс идет с определенной частотой, после каждого акта наступает рефрактерный период.
Трансформация эндоцитозного материала
В процессе трансформации захваченного материала особую роль играет система: аппарат Гольджи — эндоплазматический ретикулум (ЭПР)——лизосомы, именуемая системой ГЭРЛ. Аппарат Гольджи и частично цистерны ЭПР в ходе везикуляризации поставляют клетке набор везикул с различными свойствами (рис. 3).
Для большинства клеток механизм утилизации эндоцитозно-
Рис. 3. Система ГЭРЛ и формирование разнообразных везикул и вакуолей:
АГ — аппарат Гольджи (пластинчатый комплекс), АЛ — аутолизосома (аутофагосома, цитосегресома), ОВ — одетая везикула, ОТ — остаточное тельце (телолизосома), ПЛ — первичная лизосома, ПС — пероксисома. ПТ — плотное тельце, СГ — секреторная гранула, ЭПРа — агранулярный (гладкий) эндоплазматический ретикулум, ЭПРГ — гранулярный (шероховатый) ЭПР
го материала в принципе универсален (рис. 4), хотя и может отличаться в деталях.
Транспорт эндосом от плазмалеммы к центру клетки, где происходит их трансформация, протекает быстро, в течение короткого времени. Образовавшиеся эндосомы как в случае фагоцитоза, так и пиноцитоза, сливаясь друг с другом или с некоторыми лизосомами, преобразуются в эндоцитозные вакуоли. В эндосомах и вакуолях начинается первичное разложение захваченного материала.
Гистохимически во многих клетках обнаружено, что в эндосомах и вакуолях локализованы кислая и щелочная фосфатазы, АТФаза<-^глицерофосфатаза. По-видимому, эндосомы и вакуо- 16
ли в одной и той же клетке гетерогенны (по размерам и химическому составу).
Биохимический состав эндосом и вакуолей зависит в одной и той же клетке от природы захватываемого материала. Например, фагоцитозные вакуоли амеб, содержащие неусвояемые час-
片"крополекуль г片"крополекуль гЭндсцитозЭндсцитоз丿丿Рецинлизаии^ меткахРецинлизаии^ меткахХ/иитог^аз^ \— % 72£ \g)Х/иитог^аз^ \— % 72£ \g)Ианрополенульц частица З^зоцшлсзИанрополенульц частица З^зоцшлсзРис. 4. Трансформация материала, захваченного клеткой при неспецифическом эндоцитозе:Рис. 4. Трансформация материала, захваченного клеткой при неспецифическом эндоцитозе:"епаЬализн"епаЬализнНикрополенцмь)Никрополенцмь)‘%门切热6、"е"‘%门切热6、"е"
片"крополекуль г
片"крополекуль г
Эндсцитоз
Эндсцитоз
丿
丿
Рецинлизаии^ метках
Рецинлизаии^ метках
Х/иитог^аз^ \— % 72£ \g)
Х/иитог^аз^ \— % 72£ \g)
Ианрополенульц частица З^зоцшлсз
Ианрополенульц частица З^зоцшлсз
Рис. 4. Трансформация материала, захваченного клеткой при неспецифическом эндоцитозе:
Рис. 4. Трансформация материала, захваченного клеткой при неспецифическом эндоцитозе:
"епаЬализн
"епаЬализн
Никрополенцмь)
Никрополенцмь)
‘%门切热6、"е"
‘%门切热6、"е"
И — прямая или обратная инвагинация, ВЛ — вторичная лизсюома, МВТ — мульти- везикулярные тела (гетерогенные органеллы, содержащие кислые гидролазы, к которым относятся АЛ), ПР — пероксисома, ЭВ一эндоцитозная вакуоль, ЭП — эндо- цитозный пузырек (эндосома); остальные обозначения, как на рис. 3. Сплошными линиями обозначены главные пути, пунктиром — побочные. Знак ( + ) означает слияние органелл друг с другом.
ЭП, ЭВ, ПЛ, ОТ сливаются с плазмалеммой и экзоцитируют свое содержимое. Не в каждой клетке полностью протекают все изображенные процессы. ПЛ, ВЛ и другие органеллы связаны друг с другом через механизм слияния. В нейронах, рядом с плазмалеммой нередко выявляются мелкие везикулы ——кавеолы (dv60 нм), расположенные гексагонально на расстоянии 110——130 нм. Кавеолы участвуют в рециклизации мембран
тицы латекса, лишены литических ферментов. Однако если амебу содержали в культуральной среде с питательным веществом, в ее вакуолях присутствовала кислая фосфатаза. При добавлении в такую среду ингибиторов синтеза белка наблюдалось исчезновение в вакуолях литического фермента. Эти факты указывают на то, что в зависимости от природы захватываемого материала клеточная мембрана осуществляет различный эндоцитоз- ный процесс; сама клетка определяет характер своего «питания».
Эндоцитозные вакуоли способны к агрегации либо, наоборот, разделяются на несколько мелких везикул за счет осмотического давления. Осмотическое давление содержимого клеток выше, чем содержимого вакуоли. При диссоциации крупных эндосом, и вакуолей на более мелкие в каждой из них остаются опреде-
ленные типы субстратов, т. е. происходит дифференциация мелких эндосом по типу перевариваемых веществ. При фагоцитозе каждая мелкая эндосома содержит только один компонент захваченной смеси веществ.
В большинстве случаев вакуоли сливаются с первичными лизосомами, в которых содержится набор различных гидролаз, обеспечивающих распад большинства поглощенных клеткой экзогенных и эндогенных веществ. При слиянии образуются вторичные лизосомы, где и продолжается гидролиз. Это процесс называется гетерофагией. Утилизация в тех же лизосомах внутриклеточных компонентов называется аутофагией. Последний процесс протекает при участии мультивезикулярных телец, возникающих в результате сегрегации отдельных поврежденных органелл или участков цитоплазмы, в образование которых вовлекаются различные клетки. Отходы, неперевариваемые вещества, пигменты клетка секретирует в виде остаточных телец, которые выбрасываются целиком из клетки при контакте везикул, их содержащих, с плазмалеммой.
Из эндосом захваченные микромолекулы (ионы, моносахариды, аминокислоты и др.) легко могут проникать в цитоплазму клетки и включаться в обмен. При отсутствии в среде инкубации аминокислот синтез белка в макрофагах снижается на 30%, но в присутствии в среде 2% альбумина процесс нормализуется за счет пиноцитоза этого белка и его дальнейшей трансформа- ■ ции.
При некоторых патологических процессах обнаружено, что лизосомы, сливаясь с плазмалеммой, секретируют свои ферменты за пределы клетки (см. разд. 3.4). Стабилизация лизосомных мембран стероидными гормонами приводит к полному нарушению взаимодействия и слияния фагосом и их вакуолей с лизосомами. Обработка кортизоном резко снижает адсорбцию индуктора пиноцитоза плазмалеммой. У полиморфноядерных лейкоцитов в условиях разборки микротрубочек (обработка цитостатиком) подавляется образование фаголизосом. На этих лейкоцитах показано, что цАМФ и адреналин ингибируют фагоцитоз, разрушают микротрубочки, стабилизируют мембраны лизосом； цГМФ, наоборот, стимулирует фагоцитоз и вызывает сборку микротрубочек.
При терапии специфических «лизосомных» болезней эндоци- тоз оказывает положительную роль, способствуя избирательному накоплению в лизосомах ряда экзогенных ферментов и ле- ， карственных препаратов. Такую же функцию эндоцитоз выполняет при использовании в лечении ряда заболеваний липосом, содержащих ферменты или лекарства, хотя липосомы могут слипаться с клеткой-мишенью и секретировать свое содержимое в цитоплазму клетки. На последних стадиях эндоцитоза могут возникать вещества с высокой биологической активностью, которые регулируют синтез антител н активируют иммунитет.
Судьба эндоцитируемой ДНК в клетке не совсем ясна. Счи-
тают, что большая ее часть разрушается в лизосомах, а некоторая, малая, может вызывать трансформацию в клетке, включаясь в ее геном.
Из рис. 4 следует, что при эндоцитозе эндосомы вовлекаются в лизосомную трансформацию, в то время как при феномене усиленного пиноцитоза после экзоцитоза (см. разд. 2.6) мелкие н крупные эндосомы способны помимо лизосом также слипаться с цистернами аппарата Гольджи. В некоторых клетках (например, в эпителии) описан трансклеточный транспорт веществ, при этом крупные эндосомы переносят вещества от одной части клетки к другой (противоположно!!), минуя систему ГЭРЛ (см. разд. 1.6).
Таким образом, при эндоцитозе наблюдаются разнообразные процессы слияния мембран в системе эндосома — эндосома, эндосома—лизосома, эндосома — аппарат Гольджи, эндосома (а также лизосома)—плазмалемма. При нейтрализации полиморфноядерными лейкоцитами бактерий молекулярное содержимое последних переваривается в течение нескольких часов. Лизосомы этих лейкоцитов гетерогенны по составу и форме, клетки содержат также специфические гранулы, в которых локализованы щелочная фосфатаза, лизоцим, лактоферрин. При этом фагосомы и вакуоли сливаются сначала со специфическими гранулами и только затем с лизосомами. Все это происходит в течение нескольких минут, в этот период в клетках отмечено значительное усиление окислительных процессов.
Показано, что в макрофагах кинетика слияния фагосом с лизосомами не зависит от числа этих органелл в клетке и не изменяется при обработке клеток колхицином или цитохалазином В. Введение в состав мембран экзогенных жирных кислот (19:0 и 18:1) значительно снижает скорость эндоцитоза в макрофагах, но мало влияет на процесс слн只нн只 мембран. Слияние мембран эндосом и лизосом усиливает форболмиристатацетат, а также активация макрофагов иммунолигандами, тормозят — полианионы, снижение температуры, обработка веществами, устраняющими А pH в кислых компартментах, моненсином. Процесс слияния протекает очень быстро, наступает спустя 5 мин после начала эндоцитоза. Для большинства клеток стадия переваривания веществ в лизосомах протекает спустя 30——60 мин после инициации эндоцитоза.
Эндоцитозные вакуоли у простейших можно назвать прелизосомами, поскольку они содержат некоторые лизосомные ферменты и имеют низкое значение pH. Эндосомы и вакуоли клеток животных (например, фибробласты), как правило, также имеют рН6 в матриксе везикул. Обработка клеток NH4cl блокирует указанные стадии пиноцитоза, в том числе пиноцитоз некоторых вирусов. Однако если клетки обрабатывать NH4C1, то спустя 3—4 мин после начала пиноцитоза вирусная инфекция не тормозится, поскольку после слияния эндосом и вакуолей с лизосомами происходит секреция нуклеокапсид в цитоплазму клеток.
Известно, что спектр флуоресценции гистонов резко изменяется в кислой среде. Если митотические клетки обрабатывать раствором гистонов при 37℃, то спустя 5——10 мин наблюдается изменение спектра флуоресценции, что указывает на слияние эндосом и (или) вакуолей с лизосомами. Тот факт, что содержимое эндосом и вакуолей имеет кислую реакцию, приводит к важному предположению: при интернализации из плазмалеммы в состав указанных органелл «отделяется» микродомен, содержащий либо Н-насос, либо Na/H-ионообменник.
Эндосомы и вакуоли трудно дифференцировать по морфологическим критериям. Они практически не содержат гидролитических лизосомных ферментов и имеют короткий период жизни (минуты — часы), в то время как лизосомы живут более длительный период (30—60 сут). Эндосомы и вакуоли обладают более низкой плавучей плотностью (1,0—1,12 г/см3), чем лизосомы (〜1,20 г/см3); значение pH внутри эндосом более высокое, чем в лизосомах (pH 4,5—5,0); первые менее чувствительны к ацидотропным веществам. При 16—20℃ трансформация эндосом в лизосомы не происходит, поэтому клетки обогащаются эндосомами. Показано, что в одном перитонеальном макрофаге содержится 240 эндосом и 1000 вторичных лизосом. При этом площадь мембран эндосом составляет 10——15% площади плаз- малеммн.
Ацидотропные (лизосомотропные) вещества — это, как правило, слабые основания (NH4C1, хлорохин, метиламин и др.). Они в недиссоциированной форме проникают через мембраны, внутри везикул в кислой среде протонируются, чем устраняют градиент pH и диссипируют Н-насос в эндосомах, вакуолях, лизосомах, одетых везикулах, секреторных гранулах. Ацидотропные агенты имеют рК 〜8,0 (если рК>8,0, то они плохо проникают в кислые компартменты клетки). Эти вещества вызывают снижение активности лизосомных ферментов, что необходимо учитывать при использовании катионных амфифильных лекарств (имипрамин, трифтазин, хлорохин и др.) при лечении так называемых лизосомных болезней накопления.
Слияние эндосом и вакуолей с лизосомами играет решающую роль в осуществлении защитной функции эндоцитоза. Ряд возбудителей тяжелых заболеваний (туберкулез и др.), проникая путем фагоцитоза в эндосомы, меняет свойства их мембраны, которые утрачивают способность сливаться с лизосомами. Патогенные вирусы способны размножаться в эндосомах и инфицировать клетку. Mycobacterium tuberculosis выделяют сульфа- 7нды, модифицирующие мембрану эндосом и снижающие ее жидкостность. Причиной торможения слияния может быть также действие NH4+, полиглутамата, продуцируемых М tuberculosis. Торможение слияния эндосом с лизосомами встречается при фагоцитозе не только бактерий, но и риккетсий, хламидомонад и грибов.
Все вещества, захватываемые в процессе эндоцитоза, сегрегируются в клетках в форме эндосом, вакуолей и других органелл в ходе их трансформации. Сегрегация необходима для последующего выведения токсических веществ из клетки, для ограничения их действия на метаболизм в клетке.
Механизмы эндоцитоза
Первая фаза эндоцитоза представляет собой адсорбцию веществ на гл и ко кал икс плазмалеммы; она не зависит от метаболизма. В основе ее может лежать взаимодействие с фиксированными отрицательными зарядами (фосфатные группы кислых фосфолипидов и СООН-группы белков) самой плазмалеммы. В обычных условиях оба типа отрицательных групп, как правило, связаны с внеклеточным Са2+. При сорбции определенных веществ этими группами происходит вытеснение Са2+
«Выключение» гликокаликса различных клеток путем блокировки анионных групп катионами металлов или обработкой нейраминидазой, проназой или гиалуронидазой не всегда приводит к однозначным результатам. Это указывает на гетерогенность и полифункциональность ионных групп гликокаликса. В тканевых клетках на поверхности нередко располагаются микро вор синки (цилиндрические структуры длиной 10—20 мкм и шириной 0,2—— 2,0 мкм), которые расположены либо регулярно, образуя щеточные каемки (клетки кишечника, почек), либо хаотично. Внешний слой мембран микроворсинок тоньше и менее плотен, чем внутренний, содержащий большее количество белков. Микроворсинки—район, где наиболее активно проявляется эндоцитоз путем адсорбции. Образование микроворсинок, псевдоподий отлично от формирования инвагинаций.
Более плотная упаковка белковых субъединиц мембраны при лонижении гидрофильности способствует образованию псевдоподий (наружных выростов цитоплазмы). Если же плотность упаковки понижается, а гидрофильность увеличивается, то мембрана впячивается и образуются складки. Осмотическое давле- ■ние в клетке значительно выше, чем снаружи. Поэтому легко понять образование цитоплазматических выростов, труднее понять образование впячиваний.
В определенных точках плазмалеммы прочность мембраны может уменьшаться либо в связи со структурными перестройками, либо в результате изменения поверхностного натяжения мембраны. В таком случае образующиеся выросты замыкаются и происходит слияние мембран — возникают эндосомы. Выросты и впячивания ——динамические структуры, быстро образующиеся (меньше чем за 1 с), но недолго существующие. Псевдоподии морфологически разделяются на лопастные или пальцевидные (толщина от 50 до 200 нм); пластинчатые (в виде вуалей); пузырьковидные или четкообразные; нитевидные или филоподии, иногда образующие микрошипы.
Нитевидные псевдоподии — своеобразные «органы чувств», распознающие состав внеклеточной среды, прикасаясь и прилипая к0 всем препятствиям (веществам или к обломкам клеток)- Они могут служить средством прикрепления клеток к различным поверхностям.
Псевдоподии образуются из эктоплазмы. Пузырьковидные псевдоподии представляют собой мелкие пузырьки на коротенькой ножке или без нее. Они очень быстро образуются и так же быстро исчезают, при этом создается впечатление «вскипания» определенного участка плазмалеммы. Это явление часто наблюдается при митозе в области перегородки между двумя дочерними клетками. Иногда пузырьки насаживаются друг на друга в виде четок (почкование). Пузырьковидные псевдоподии в отличие от остальных псевдоподий состоят из эндоплазмы. Четкообразные пузырьки не всегда возвращаются в клетку в отличие от одиночных, маленьких «вскипающих» пузырьков. Микрошипы подвижны, движения их волнообразны, длина невелика (< 1 мкм). Некоторые из них содержат твердый центральный стержень. Микрошипы могут втягиваться обратно в клетку, в этом случае происходит разборка стержня.
Образование инвагинаций, т. е. углублений, впячиваннй шириной до 20 нм, глубиной до 50—80 нм, и втягивание их в цитоплазму в случае фагоцитоза и макропиноцитоза чувствительно к ингибиторам метаболизма и низкой температуре, т. е. представляет собой активный энергозависимый процесс. В частности, ингибиторы гликолиза (NaF, моноиодацетат), дыхания (KCN» Na№), разобщители окислительного фосфорилирования (2,4-динитрофенол) эффективно блокируют указанные процессы. В связи с этим эндоцитоз можно рассматривать как своеобразный аналог активного транспорта веществ через мембрану. При гипоксии клеток, создаваемой с помощью 2-дезоксиглюкозы, также снижается эндоцитоз. Наиболее чувствителен к снижению АТФ в клетках фагоцитоз, затем адсорбционный и менее жидкофазный пиноцитоз.
Возле эндоцитирующих участков плазмалеммы отмечают скопление митохондрий. Действительно, макроэндоцитоз (в большей степени фагоцитоз) сопровождается усилением биоэнергетических процессов, ресинтезом мембранного материала” который «тратится» на образование эндосом вакуолей.
Процессу слияния мембран при эндоцитозе (как, впрочем, и экзоцитозе) может предшествовать увеличение обновления фосфолипидов, при этом мембрана в зоне слияния становится более «текучей». Известно, что мембраны только что сформировавшихся фагосом обладают большей текучестью, чем участки плазма- леммы, из которых они образованы.
Специфический фагоцитоз в фагоцитах, лейкоцитах в отлн- чие от факультативного в фибробластах, нейронах, эпителии сопровождается резким увеличением дыхания (в 2——3 раза), продукции Н2О2, активацией перекисного окисления липидов, окис- 22
лением глюкозы в пентозном цикле (в 2—10 раз). Лейкоциты, инкубированные в присутствии колхицина или в отсутствие О2, фагоцитируют нормально, но фагосомы двигаются хаотично и увеличение гликолиза не наблюдается. Усиление окислительной активности при фагоцитозе объясняется активацией НАДН- и НАДФН-завнснмых оксидаз плазмалеммн, которые превращают Ог в Н2О2 и супероксидный анион.
Фагоцитоз сопровождается увеличением включения лизоформ фосфолипидов в лецитин и фосфатидилэтаноламин, 32Р в фосфатидную кислоту и фосфатидилинозит; увеличением свободных жирных кислот; некоторым увеличением содержания лецитина в плазмалемме (за счет активации синтеза лецитина). Спустя 6—10 ч после начала фагоцитоза в клетках отмечено увеличение содержания холестерина и фосфолипидов,
В 70-е годы широкое распространение получила механо-химическая гипотеза эндоцитоза (рис. 5). Она опиралась на факты локализации в эктоплазме (см. рис. 2) цитоскелетных фибриллярных структур (микротрубочек, промежуточных филаментов, актиновых микрофиламентов и миозиновых фибрилл), состав-
Рис. 5. Механо-химическая схема фагоцитоза. А—Г — последовательные стадии фагоцитоза:
/ — лиганд, субстрат, сорбент; 2 — неактивный избирательный (или неизбирательный) рецептор плазмалеммы; § — активный рецептор в комплексе с лигандом (в этом случае изменяется как конформация самого рецептора, так и его ми кроокруж ен и я), 4 — элементы цитоскелета, связанные с рецептором (находятся в состоянии расслабления). 5 ——элементы цитоскелета, связанные с рецептором (находятся в состоянии сокращения)
ляющих примембранный слой (до 100 нм) внутренней поверхности практически всех плазматических мембран. Данный слой Ьостоит из сети нитей, пучков фибрилл цитоскелета. Эти структуры, ассоциированные с мембраной, определяют гибкость, эластичность, ундуляцию некоторых участков мембраны, степень погруженности, интернализации различных белков в липидный бислой, кластеризацию определенных белков, рецепторов. Эндо- цитоз наиболее выражен у тех клеток, в составе эктоплазмы которых содержится больше всего элементов цитоскелета. Эндоци- тоз наиболее выражен у клеток с высокой подвижностью, которая проявляется не только в амебоидном движении, но и в образовании псевдоподий и пр.
Согласно контрактильной гипотезе эндоцитоза процесс протекает по схеме: энергонезависимая сорбция поглощаемого материала плазмалеммойтизменение под влиянием сорбированно-
го индуктора физико-химических свойств отдельных участков мембраны-^-АТФ-зависимое сокращение элементов цитоскелета в данном участке плазмалеммнтобразование инвагинации (в том числе и псевдоподий). С помощью электронного микроскопа в районе инвагинации выявляется особое сгущение разнообразных элементов цитоскелета. Стабилизирующим и цементирующим элементом в данном случае являются микротрубочки, динамичным — система актиновых микрофиламентов и миозиновых фибрилл. Гистохимически в эндосомах и в районе образования инвагинаций выявляется АТФаза. Образование псевдоподий коррелирует с образованием агрегатов актиновых микрофиламентов. Пиносомы (диаметр d — 0,1—0,3 мкм) макрофагов, фибробластов, которые быстро захватывают растворимую пероксидазу, содержат «одежду» из филаментозных, сократительных белков.
Обработка клеток цитохалазином В и в меньшей степени колхицином приводит к значительному торможению фагоцитоза и макропиноцитоза. Такого рода эксперименты выявили еще одну интересную особенность. Миграция эндосом от периферии к центру клетки зависит от функционирования цитоскелета, в частности, микротрубочек.
Жидкофазный пиноцитоз в культуре гладких миоцитов артерий тормозится колхицином. Эндоцитозные вакуоли мигрируют к перинуклеарному району. Колхицин ингибирует миграцию вакуолей и приводит к хаотическому движению органелл в цитоплазме. Образование пиносом в макрофагах зависит от температуры, угнетается цианидом, динитрофенолом, олигомицином и антимицином А. Пиноцитоз в этом случае нуждается в аэробном дыхании и окислительном фосфорилировании, тогда как миграция пиносом в цитоплазме при этих воздействиях не изменяется.
Действие цитостатиков на эндоцитоз не всегда приводит к однозначному результату. Так, цитохалазин В, вызывающий разборку актиновых микрофиламентов, желатинизацию актина, тормозит жидкофазный пиноцитоз сахарозы гепатоцитами, пероксидазы——макрофагами, но не влияет на адсорбционный пиноцитоз ферритина или коллоидного золота макрофагами.
Регуляторами контрактильной системы являются АТФ и Са2+ В связи с этим интересно проследить корреляцию между их действием на эндоцитоз и модельные сократительные системы.* Большая серия опытов выполнена на амебах. Обнаружено, что индукторы пиноцитоза вызывают резкое снижение сопротивления поверхностного натяжения мембраны, снижение трансмембранного потенциала, набухание мембран. В период индукции пиноцитоза прекращается амебоидное движение цитоплазмы, обусловленное функционированием сократительных белков. Аналогичный эффект обнаруживается при добавлении АТФ и ЭДТА. Отсюда становится ясно, что возможной причиной остановки движения может быть высвобождение ионов Са под влиянием индукторов из плазмалеммы, так как кальций при участии
AT① способствует переходу контрактильной системы в цитоплазме из состояния золя в состояние геля. В условиях повышенного давления пиноцитоз подавляется, очевидно, вследствие превращения золь—гель в примембранной области.
Ионы Са при увеличении концентрации от 0,01 до 1,0 мМ усиливают пиноцитоз у амеб, а начиная с концентрации выше 1 мМ ингибируют этот процесс. Ионы Mg с повышением концентрации выше 1 мМ прогрессивно индуцируют пиноцитоз. Замечено, что индукторы пиноцитоза вытесняют Са2+ из плазма- леммы и, возможно, дают сигнал к входу Са2+ из внеклеточной среды в клетку и (или) высвобождению Са2+ из внутриклеточного депо хранения. Облегчают индукцию пиноцитоза ионы К, Ru, UO2, декаметоний, рутениевый красный, тетраметил аммоний.
Таким образом, схема событий при пиноцитозе у амеб такова. Индуктор взаимодействует с отрицательно фиксированными группами гликокаликса или плазмалеммы. В результате снижа- ■ется поверхностный потенциал, содержание Са2+, связанного с гликокаликсом, усиливается пассивный вход Са2+ в клетку. Возможно,, что конкурентное вытеснение мембранно-связанного Са2+ индукторами пиноцитоза приводит к дестабилизации мембраны, изменению ее конформации, открытию Са-каналов, т. е. к каскадному усилению процессов, ведущих к инвагинации и ве- зикуляризации. Накопление Са2+ в цитоплазме запускает сократительную систему, регулирующую образование инвагинаций и везикуляризации.
Клеточная мембрана может спонтанно осциллировать, т. е. постоянно, хаотично изменять профиль своей поверхности, унду- лировать, изгибаться, образовывать разнообразные инвагинации. Центр осцилляции (он может быть «блуждающим») создается та”， где на определенном участке внутренней поверхности плазмалеммы больше всего элементов цитоскелета, где в определенный момент времени больше всего локальная концентрация АТФ (1—5 мМ) и Са2+ (1—5 мкМ)—регуляторов сократительной системы белков. Волна осцилляции может распространяться (за счет генерализованного структурного сдвига в мембране) и самоусиливаться или ослабляться. При спонтанной осцилляции мембран может происходить случайный захват внеклеточного материала. При индуцированном эндоцитозе создается новый, мощный центр осцилляции мембран со всеми вытекающими последствиями.
В процессе везикуляризации большую роль играет слияние контактируют их гомологичных мембран. Предполагают, что на этой стадии активируется Са-зависимая фосфолипаза Аг плазмалеммы. Лизоформы фосфолипидов, возникшие при активации фермента, образуют мелкие сферические мицеллы, дестабилизирующие липидный бислой. В этих участках мембрана становится более подвижной и лабильной, доступной для слияния (см. гл. 4). Для образования замкнутой эндосомы вновь необходима стабильность бислоя и активация ацилтрансфераз фосфолипидов.
Поскольку холестерин также является модификатором мембранного бислоя, изменение его содержания в мембране сильно влияет на скорость протекания эндоцитоза.
Из некоторых клеток (макрофаги, фибробласты, лейкоциты^ простейшие и др.) можно выделить фракции пиносом или фагосом. Эти фракции содержат различные вакуоли и везикулы как структурные элементы трансформации захваченных веществ» Показано, что белковый и липидный состав эндосом и плазма- леммы имеет много общего; интегральные белки плазмалеммы не участвуют в формировании инвагинаций и образовании эндосом.
Микропиноцитоз обнаружен для многих тканевых клеток. Нижний предел диаметра пиносом (60—130 нм) в данном случае обусловлен минимально возможной кривизной плазмалем- мы при ее инвагинации. Особенно характерен микропиноцитоз для клеток эпителия и эндотелия. Многие клетки могут поглощать вещества с помощью как макро-, так и микропиноцитоза. На долю микропиноцитоза у макрофагов приходится около 80% общей величины эндоцитоза. Микропиноцитоз различных веществ и частиц неспецифичен и нечувствителен к низкой температуре и ингибиторам биоэнергетических процессов. Возможными эффективными индукторами микропиноцитоза являются факторы, вызывающие перекисное окисление липидов: ионизирующая радиация, ультрафиолет.
Увеличение перекисного окисления липидов в мембранах приводит к искажению ориентации упорядоченного липидного бислоя и изгибанию отдельных участков мембраны. На липосомах показано, что оксиданты индуцируют игвагинацию, везику- ляризацию и агрегацию искусственных фосфолипидных мембран, а антиоксиданты устраняют эффект оксидантов. Феномен перекисного окисления липидов в эндоцитозе не является исключительным. Он вносит свой вклад также в индукцию энергозависимого макроэндоцитоза, облегчая образование инвагинаций и слияние мембран за счет ее дестабилизации. Фагоцитоз полиморфноядерных лейкоцитов сопровождается усилением перекисного окисления липидов и свободнорадикальных процессов, снижением эндогенной антиоксидантной активности плазмалеммы (снижением активности супероксиддисмутазы).
Рециклизация мембран
Новообразование мембран, кругооборот материала плазмалеммы в ходе цикла эндо- и экзоцитоза, в транспорте макромолекул (везикул) от плазмалеммы к центру, к системе ГЭРЛ и обратно принято называть рециклизацией мембран. Значение нре- менн полужизни для мембранных структур (15。) определяется в диапазоне 10—100 ч, хотя известны быстрообновляющиеся компоненты с тбо в несколько часов. Рециклпзацпя ——основной путь обновления плазмалеммы. В этом случае для большей час- 26
Рис. 6. Пути рециклизации мембран. /—безлизосомной рециклизации； 〃一 лизосомный рециклизации; /// — рециклизации через аппарат Гольджи с последующим экзоцитозом секреторных гранул:/ — эндосома, 2 — эндоцитозная вакуоль (крупная эндосома), 3 — рециклизирующие мелкие пузырьки. 4 — вторичная лизосома, 5 — аппарат Гольджи, 6 — секреторная гранулаРис. 6. Пути рециклизации мембран. /—безлизосомной рециклизации； 〃一 лизосомный рециклизации; /// — рециклизации через аппарат Гольджи с последующим экзоцитозом секреторных гранул:/ — эндосома, 2 — эндоцитозная вакуоль (крупная эндосома), 3 — рециклизирующие мелкие пузырьки. 4 — вторичная лизосома, 5 — аппарат Гольджи, 6 — секреторная гранула
Рис. 6. Пути рециклизации мембран. /—безлизосомной рециклизации； 〃一 лизосомный рециклизации; /// — рециклизации через аппарат Гольджи с последующим экзоцитозом секреторных гранул:
/ — эндосома, 2 — эндоцитозная вакуоль (крупная эндосома), 3 — рециклизирующие мелкие пузырьки. 4 — вторичная лизосома, 5 — аппарат Гольджи, 6 — секреторная гранула
Рис. 6. Пути рециклизации мембран. /—безлизосомной рециклизации； 〃一 лизосомный рециклизации; /// — рециклизации через аппарат Гольджи с последующим экзоцитозом секреторных гранул:
/ — эндосома, 2 — эндоцитозная вакуоль (крупная эндосома), 3 — рециклизирующие мелкие пузырьки. 4 — вторичная лизосома, 5 — аппарат Гольджи, 6 — секреторная гранула
ти мембранных белков и других компонентов мембран характер
ны практически одинаковые значения Т50.
* Часть клеточной мембраны интернализируется, т. е. подвергается эндоцитозу, с гораздо большей скоростью (почти в 10 раз), чем претерпевает полный распад. Не вся эндоцитирован- ная мембрана разрушается под действием лизосомных ферментов. Значительная часть компонентов повторно включается в состав плазмалеммы, т. е. рециклизируется. В одном случае от эндосомы или вакуоли отделяется небольшой пузырек, который вновь сливается с плазмалеммой; в другом случае то же самое происходит с первичной и вторичной лизосомами (см. рис. 4, 6).
В обоих случаях восстанавливается исходная площадь клеточной мембраны и снижается скорость деградации последней. Установлено, что матрикс эндосом при рециклизации практически не меняется, т. е. избирательно удерживается внутри оставшихся эндосом.
У макрофагов плазмалемма заменяется за 33 мин, у опухолевых фибробластов ——каждые 2 ч периода эндоцитозной активности, при этом обновляется 10—20% объема клеток. Цито- скелетные структуры эктоплазмы обеспечивают рециклизацию мембран, подтягивая к внутренней стороне плазмалем- мы различные везикулы, после чего происходит слипание н слияние (как п в случае экзо- цитоза).
Если плазмодий миксомице- та проткнуть стеклянным капилляром, то «дырка» в мембране «залечивается» в тече-
ние нескольких секунд. Многочисленные везикулы плазмы собираются возле «дырки», образуя
уплощенные вакуоли, которые располагаются параллельно наружной поверхности обнаженного участка. После слияния этих микровезикул образуется новая плазмалемма.
Обновление плазмалеммы происходит постоянно как при эк- зоцитозе, так и при эндоцитозе после экзоцитоза (см. разд. 2.6), при повреждении клеток. Мембранная система ГЭРЛ регулирует постоянный кругооборот мембранных структур от цитоплаз
мы к поверхности клеток при экзоцитозе, от плазмалеммы внутрь цитоплазмы при эндоцитозе. При делении клеток митоти-
ческое веретено оттесняет от системы ГЭРЛ к периферии клетки образовавшиеся при митозе многочисленные мелкие везикулы. Видимо, эти везикулы сливаются с плазмалеммой, резко увеличивая ее поверхность при делении исходной клетки надвое. Таким образом, кругооборот мембранных структур сопряжен с про* цессами экзоцитоза и эндоцитоза и связывает воедино мембранную систему ГЭРЛ с секреторными гранулами и плазмалеммой. Это сопряжение обеспечивает относительное постоянство площади общей поверхности мембран клеток в течение определенного времени.
В ходе фагоцитоза макрофаги быстро теряют (до 50%) плаз- малемму за счет везикуляризации, так что спустя некоторое время эти клетки больше не способны к фагоцитозу. Напрнмер* Т50 интернализации для 5,-нуклеотидазы плазмалеммы равно 2 ч. Содержание холестерина и фосфолипидов в ходе фагоцитоза не изменяется. В последующие 5——10 ч после фагоцитоза наблюдаются рециклизация мембран и восстановление фагоцитоз- вой активности.
Макрофаги и фибробласты содержат два типа включения меченых соединений. Первый тип характеризует малые пиносомы с очень быстрым обменом вещества, т. е. с последующим его выведением из клетки путем экзоцитоза (для макрофагов 飞一 5 мин, для фибробластов — 6——8 мин). Второй тип ——это крупные пиносомы с медленным обменом (для макрофагов 加 180 мин, для фибробластов 430——620 мин). Эти клетки захватывают вещество нелинейно во времени. Данный факт объясняется тем, что часть пиносом, слипаясь с плазмалеммой, секретирует вещество обратно во внешнюю среду.
При пиноцитозе площадь плазмалеммы уменьшается, это установлено при помощи электронной микроскопии. У макрофагов за 1 ч жидкофазного пиноцитоза пероксидазы объем клеток снижается на 25%, а площадь мембран — на 186%; при этом объем клеток и площадь мембран пиносом и вторичных лизосом составляет 2—3 и 15—20%, соответственно, от величин, характерных для контрольной клетки (до пиноцитоза). Эффект сохраняется в течение 3 ч пиноцитоза, что указывает на синхронный процесс восстановления плазмалеммы на стабильном уровне.
Расход плазмалеммы при эндоцитозе довольно быстро компенсируется за счет встраивания (слияния) в клеточную мембрану различных везикул и вакуолей, «опустошенных» эндосом, «отработанных» лизосом, секреторных гранул. У амебы нет вы- 'раженной вызванной секреции, поскольку за 20—30 мин интенсивного индуцированного пиноцитоза этой клетке необходимо не менее 4 ч для восстановления израсходованной поверхности, н в этот период никакие индукторы не вызывают пиноцитоз. В то же время «покоящейся» амебе, т. е. при спонтанном пиноцитозе, для полной регенерации плазмалеммы без изменения своего объема требуется 8—12 ч. При индуцированном пиноцитозе амеба приобретает округлую форму, движение ее прекращается и на по- 28
верхности во многих местах возникают псевдоподии. В ходе спонтанного пиноцитоза амеба двигается и имеет типичную вытянутую форму: передняя часть ——гладкая, задняя ——волннстая， с псевдоподиями; при этом расходуется до 0,2% плазмалеммы за 1 мин и столько же восстанавливается за счет обратного процесса ——экзоцитоза.
Таким образом, с одного конца амеба спонтанным эндоцито- зом непрерывно «поедает» свою мембрану, а с другого (в переднем конце) — непрерывно ее «наращивает» за счет экзоцитоза вакуолей, продуцируемых аппаратом Гольджи. Амебоидное движение регулирует восстановление мембран. Главное, что обновление плазмалеммы любых клеток происходит путем одновременного функционирования двух противоположно направленных процессов ——эндоцитоза и экзоцитоза.
В основе спонтанного и индуцированного пиноцитоза, вероятно, лежат одинаковые механизмы, поскольку спонтанный пи- ноцитоз может своеобразным образом индуцироваться как «включением» механо-химических факторов внутри клетки, так н «выключением» внешних факторов —■ за счет способности гли- кокаликса концентрировать катионы из окружающей среды. При спонтанном эндоцитозе клетка поглощает любые вещества из внешней среды. Клетки могут поглощать значительную часть своей плазмалеммы (до 50% поверхности за 1 ч) благодаря всем трем типам эндоцитоза.
Пока остается неясным механизм рециклизации мембран. Объяснить его одним лишь механизмом обратного слияния мембран на различных стадиях эндоцитоза затруднительно, главное найти пути регуляции этих процессов.
Слияние контактирующих мембран при эндо- и экзоцитозе — фактор обновления, роста и дифференцировки плазмалеммы. Так, при увеличении содержания соли (NaCl) в пище объем мембран некоторых железистых клеток птиц за короткое время увеличивается в 100 раз. В этих опытах было показано, как происходит встраивание Na, К-АТФазы в плазмалемму: сначала субъединицы фермента синтезируются в мембранах ЭПР, затем олигомер формируется в аппарате Гольджи, от цистерн которых отделяются маленькие везикулы, содержащие Na, К-АТФазу, эти микровезикулы затем сливаются с плазмалеммой, пополняя ее запасы Na, К-АТФазой.
Различные компоненты нейрональных мембран, и особенно синаптических, поступают в нервные окончания из тела нейрона по аксону (или дендриту) с аксональным током. Эти компоненты формируются в системе ЭПР — аппарат Гольджи. Раздельная доставка веществ, различные размеры везикул, различие из физико-химических свойств объясняют большую вариабельность объема и скорости быстрого компонента аксотока (400— 500 мм/сут и выше).
Таким образом, можно различить три пути рециклизации мембран. Первый путь ——безлизосомная рециклизация. Она про-
7екает быстро, в течение нескольких минут после начала эндоци- тоза за счет слияния с плазмалеммой эндосом и вакуолей или отпочковавшихся от вакуолей мелких везикул. Процесс сопровождается «возвратом» во внешнюю среду части захваченного материала. Данный путь убедительно доказан у простейших. Второй путь ——лизосомная рециклизация, при этом .вторичная лизосома или отделившиеся от нее мелкие везикулы сливаются с плазмалеммой. Такой тип, например, показан для макрофагов, которые фагоцитировали комплекс латекса с 1311-лактоперокси- дазой: спустя 5—10 мин после эндоцитоза 80% метки возвращалось в плазмалемму из вакуолей (первый тип рециклизации) л лишь спустя 30 мин часть метки рециклизировалась из лизосом ного фонда. Третий путь — сочетание эндо- 〃 экзоцитоза через аппарат Гольджи. Данный путь также сопряжен с рециклизацией секреторных гранул.
Рециклизация мембран — фактор устойчивости и стабильности эндоцитоза в течение жизненного цикла клеток. Рециклизация эффективнее происходит в ходе пиноцитоза и специфического эндоцитоза, чем при фагоцитозе.
Перитонеальные макрофаги мышей и клетки амеб каждый час обновляют 20—25% своего клеточного объема. Фибробласты в культуре ткани обменивают 25% клеточного объема каждые 3—6 ч. Учитывая, что объем лизосом в этих клетках мал и гкорость жидкофазного пиноцитоза сравнительно постоянна для этих культуральных клеток, скорость рециклизации мембран оказывается высокой и возвращение внеклеточного материала (иногда в преформированном виде) возможно в ходе рециклизации путем экзоцитоза. Макрофаги и L-кпеткн фибробластов восстанавливают плазмалемму каждые 33 и 120 мин соответственно.
На макрофагах был поставлен эксперимент по изучению жидкофазного пиноцитоза пероксидазы (в течение 2 ч). При этом при помощи стереологической электронно-микроскопической техники измеряли объем и площадь мембран клеток, пино- сом и вторичных лизосом. Оказалось, что изменение соотношений объема или площади мембран органелл с соответствующим и параметрами клетки в процентах отчетливо делится на две фазы. В первую фазу (3—5 мин после начала пиноцитоза) наблюдали резкое увеличение относительного объема (до 2,5%) и площади мембран (до 12—13%) эндосом, вторичные лизосомы практически не возникали. В эту фазу образовывались пиносо- мы, часть их сливалась с плазмалеммой, но деградация их не наблюдалась. Процесс рециклизации плазмалеммы происходит быстрее, чем процессы деградации эндосом. Повторный пиноци- 】。3 с другим маркером в этот период сразу после введения пероксидазы приводит к образованию новых пиносом с «новым» маркером; пиносомы, содержащие «старый» маркер, не нагружается «новым». Таким образом, рециклизация начинается до стадии слияния эндосом с лизосомами.
Вторая фаза (через 5—45 мин) характеризуется тем, что указанные показатели для пиносом, достигнув максимального в первой фазе значения, далее почти не изменяются, а параметры для вторичных лизосом, медленно, но значительно увеличиваются до 2,5 и 17—18% соответственно. Эта фаза характеризуется резким усилением процессов деградации захваченного материала, образованием вторичных лизосом, однако и процессы рециклизации не прекращаются, а иногда и возрастают за счет слияния вновь образующихся эндосом и вторичных лизосом в этот период с плазмалеммой. Вторая фаза далее стабилизируется на описанном уровне в течение 2 ч.
Белки плазмалеммы, участвующие в образовании мембран эндосом, сами не подвергаются быстрой деградации, а значение Т5о составляет 10——80 ч, в то время как Т50 для содержимого эндосом С2—3 ч.
Плазмалемму и мембрану эндосом клеток яичников китайского хомячка (типичный объект исследований такого рода) метили 1311-лактопероксидазой, при этом обработка клеток протеиназой способствовала распаду меченых белков плазмалем- мы, но не мембран эндосом. Однако если промытые меченые клетки возвратить в культуральную среду, преинкубировать 10 мин и затем снова обработать протеиназой, то значительная часть метки солюбилизируется. Эти факты можно интерпретировать так, что протеиназа подействовала на меченые белки плазмалеммы в результате рециклизации, т. е. за счет возврата части мембранных структур из эндосом в плазмалемму. При рециклизации в принципе возможна секреция содержимого эндосом, вторичных лизосом и других везикул. Однако при этом содержимое не должно «перевариваться» внутри клетки.
Таким образом, процесс рециклизации клеточных мембран можно охарактеризовать как феномен экзоцитоза после эндоцитоза. Эндоцитоз усиливает формирование в аппарате Гольджи мелких везикул, которые сливаются с вновь образованными эндосомами, после чего происходит экзоцитоз с частичным выбросом захваченного материала. Кроме того, в ходе пйноцитоза в системе эндосомы — вакуоли происходит неспецифическая сортировка материала. Прн рециклизации мембран около 30—50% захваченного материала из эндосом, вакуолей уже в ходе экзоцитоза выбрасывается за пределы клетки.
Трансцитоз (межклеточный транспорт веществ)
Некоторые клетки, захватывая вещества путем эндоцитоза, переносят их в эндосомах без трансформации в цитоплазме или с небольшой модификацией к другой стороне (части) клетки. Там эндосома сливается с плазмалеммой и секретирует это вещество во внеклеточную среду рядом с другой клеткой (или слоем клеток), которая захватывает его путем эндоцитоза.
Такой феномен получил название трансцитоз, он имеет отношение к межклеточному транспорту веществ, к обмену макромолекул между клетками. Таким образом, трансцитоз представляет собой сочетание эндоцитоза (чаще всего пиноцитоза) и экзоцитоза одного и того же вещества в одной и той же клетке. Благодаря этому вещества могут поступать в определенные ткани, преодолевая тканевые барьеры.
Явление трансцитоза обнаружено при движении белков плазмы через эндотелий капилляра (кровь ——эндотелий ——клетка или межклеточная среда), транспорте IgG через эпителиальный слой печени и молочной железы. В ходе трансцитоза также наблюдается рециклизация плазмалеммн. Эндотелий капилляров способен в обоих направлениях между плазмой крови и внеклеточной жидкостью осуществлять быстрый обмен макромолекулами путем пиноцитоза или путем диффузии через межклеточные щелевидные контакты. Клетки эндотелия образуют гладкие эндосомы для системы трансцитоза и обычные эндосомы с трансформацией в лизосомах. По одним данным, клетки эндотелия содержат 104 гладких эндосом (J = 500— 1000 нм), которые занимают 10% клеточного объема и обеспечивают трансцитоз, по другим ——многочисленные мелкие гладкие эндосомы (d=60—70 нм) составляют 30—40% клеточного объема эндотелия и осуществляют быстрый транспорт веществ менее чем за 1 мин.
В кишечном эпителии транспорт IgG происходит путем ■специфического эндоцитоза через Fc-рецепторы и образование одетых везикул. IgG захватывается ресничками на апикальной поверхности и переносится на базолатеральную поверхность клеток, рецепторы рециклизируются в виде везикул, т. е. возвращаются на апикальную поверхность. Если клетки эпителия инкубировать с пероксидазой и лигандом (комплекс ферритина и IgG), то оба вещества включались в апикальную часть клеток. Пероксидаза в составе эндосом включалась в лизосомы, но не мигрировала через всю клетку, а второе вещество, минуя лизосомы, достигало базолатеральной поверхности. Сам ферритин, как и пероксидаза, неспецифически адсорбировался клеткой жидкофазным пиноцитозом, часть его разрушалась в лизосомах, а другая — передвигалась в составе эндосом через всю клетку.
Для многих гетерологичных клеточных систем (кровь — чэпителий ——другая клетка, кровь — глия ——нейрон, среда ——ней- poHi ——нейрон2 и др.) доказан межклеточный перенос различных макромолекул. Как уже отмечалось, это путь для преодоления различных гистогематических барьеров. Например, клетки астроцитов синтезируют нейроспецифический белок S-100, который затем поступает в нейрон, где он осуществляет свои функции. Также известно, что сателлитные клетки глии адренергических нервов синтезируют фактор роста нерва, который далее поступает в аксон и тело нейрона, где и регулирует рост
нервов. Известно, что нейроны могут секретировать ацетил- холинэстеразу, которая далее попадает в капилляры, особенно в зоне с полным или частичным отсутствием гематоэнцефалического барьера (ядра шва, area postrema, синее пятно, черная субстанция).
Существуют доказательства транснейронного переноса макромолекул в зрительных путях и гиппокампе мозга как в синаптических, так и в несинаптических участках контактирующих нейронов, а также доказательства нейротканевого и гл ио- нейронного переноса макромолекул путем эндоцитоза.
В опытах с перевязкой аксона показано, что везикулы, вакуоли, тубулярные структуры ЭПР транспортируются вдоль по нейрону в прямом и обратном направлениях и без включения внутрь экзогенных маркеров. Это указывает на контейнерный (в форме везикул) путь переноса макромолекул от центра к периферии и, наоборот, без трансформации веществ. Например, пероксидаза, захваченная перикарионом нейрона, попадает эндосомы и, минуя систему ГЭРЛ, с прямым медленным аксо- током (1,5 мм/сут) переносится в терминали. Другой пример: ацетилхолинэстераза, синтезируясь как белок в теле нейрона, мигрирует в терминаль с медленным аксотоком как растворимая форма фермента и с быстрым аксотоком в везикулах.
В терминалях ацетилхолинэстераза поступает в состав ак- солеммы и пресинаптической мембраны холинергических нейронов и может далее путем экзоцитоза секретироваться в синаптическую щель и затем встраиваться в постсинаптическую мембрану.
В связи с трансцитозом необходимо кратко упомянуть идею о межтканевом транспорте генетического материала (ДНК), которая возникла в 60—70-е годы. Клетки костного мозга секретируют фрагменты ДНК в кровоток, далее ДНК может поступать путем эндоцитоза в быстро регенерирующие клетки (например, в печень). После инъекции животным экзогенной ДНК в кровь она встраивается каким-то образом в ДНК реципиента, причем, очевидно, это путь эндоцитоза, так как этот процесс происходит и на фоне ингибитора синтеза ДНК — оксимочевины. Клетки захватывают экзогенную ДНК (как низ- комолеку\пяркую, так и высокополимерную), но захват нативной ДНК происходит эффективнее по сравнению с денатурированной. Не только гомологичная, но и гетерологичная ДНК, инъецированная животным, может встраиваться в геном реципиентов, что сопровождается появлением генетических признаков донора. Предполагают, что встраивание экзогенных фрагментов в ДНК клеток-реципиентов может происходить лишь при наличии предсуществующих разрывов полинуклеотидной цепи. Индукция дополнительных разрывов, очевидно, может обеспечить еще большую эффективность эндоцитоза фрагментов ДНК из плазмы крови в клетки-мишени и затем в ДНК клеток-реципиентов. В 1984 г. появились работы, свидетель-
ствующие о том, что вышеописанный феномен может быть новым способом репарации ДНК.
Эндоцитоз и межклеточные контакты
В синапсах с электрической передачей возбуждения в области щелевидных контактов по обе стороны мембран встречаются везикулы, крупные вакуоли пиноцитозного характера. При возбуждении нервов эти везикулы динамично изменяют свой объем, форму. Предполагают, что в районе щелевидных контактов происходит регулярный, взаимный межклеточный транспорт веществ.
Щелевидные контакты включают агрегаты из рецепторов пептидных гормонов и аденилатциклазы, эти контакты регулируют прямой обмен между клетками с низким сопротивлением и транспорт ионов и малых молекул (&1,2 кД). Щелевидные контакты в клетках зернистого слоя преовуляторных фолликулов часто вовлекаются внутрь посредством процесса, включающего инвагинацию одной клетки в другую вблизи контакта, с последующим формированием сложной эндосомы с двойной мембраной; в них выявляются кольцевые щелевидные мостики (рис. 7). Такие сложные эндосомы обнаруживаются чаще всего в тканях, которые используют в качестве мишени гормоны, опосредующие свое действие в клетке через систему цАМФ.
Рис. 7. Трансформация щелевидных контактов (Л) и образование спинул в аксо-дендритном синапсе (5):
/ — щелевидные контакты между контактирующими мембранами, 2 — внеси- наптические филаментозные нити в синаптической щели; а — исходное состояние, б ——микрофагоцитоз и образование спинул, в — образование сложных эндосом с двойной мембраной; и S2 — ширина активной зоны синапсов
Щелевидные мостики между соседними клетками могут быть местом взаимного микрофагоцитоза. Это также путь для прямых и обратных трофических влияний между клетками. 34
В некоторых клетках (например, для соседствующих нейронов и глии спинно-мозговых ганглиев) даже при отсутствии щелевидных контактов описан взаимный микропиноцитоз.
В последнее время установлено, что фагоцитоз в нервной ткани протекает и в норме. Возможны четыре варианта фагоцитоза: 1) нормальный нейрон отторгает куски патологической клетки при дегенерации; 2) патологическая клетка поглощает «здорового соседа»; 3) нормальный нейрон фагоцитирует здоровую клетку (например, в раннем онтогенезе, в зрелом мозге); 4) патологическая клетка фагоцитирует поврежденную гипоксией, интоксикацией, дегенерацией клетку. Фагоцитоз в норме .адожет осуществлять обмен информационными макромолекула- ■ми между клетками. Возможно, что захваченные денатурированные белки «мертвых» дегенерирующих фрагментов могут вызывать аутоиммунные реакции. Трофический обмен макромолекулами и интенсивный фагоцитоз в системе нейрон — глия яосят двусторонний характер. Известны многочисленные факты «фагоцитарной роли глии при дегенерации нервов, в раннем отногенезе. Однако описан н микрофагоцптоз нейронами участков глии, например, при аноксии.
Рост отростков нейрона и их ветвлений, как правило, сопровождается усилением эндоцитоза в этой зоне. В данном случае эндоцитоз обеспечивает возросший уровень метаболизма и прямые трофические связи между нейронами. В раннем си- иаптогенезе нервно-мышечных синапсов отмечен феномен фагоцитоза аксона миобластами и миотрубками. Это могло бы быть начальным сигналом (после получения трофического материала) для образования синапсов, для образования специфической постсинаптической мембраны. В зоне контакта прорастающих нервов с постсинаптическими клетками часто находят как б пре-, так и в постсинаптической области эндосомы, одетые везикулы. Это показано в ходе «созревания» синапсов в зрительной коре, коре мозжечка, спинном мозге, симпатических ганглиях. Отмечены гипертрофия аппарата Гольджи и последующее новообразование одетых везикул, сопутствующих синаптическому контакту клеток ганглия с мотонейронами.
Глия, дендриты могут фагоцитировать дегенерирующие аксоны, а нейроны — небольшие выросты глиоцитов. Микрофагоцитоз как своеобразная форма клеточного каннибализма обнаружена в синапсах типа аксон ——дендрит, дендрит ——дендрит, дендрит ——аксон, аксон ——аксон, аксон ——мышца, в контактах •между нейроном и глией; при этом в цитоплазме «хозяина» «обнаруживаются микрошипики, спинулы (см. рис. 7, 6), сложные эндосомы с двойной мембраной, а также одетые везикулы ■с двойной мембраной, причем в обоих случаях между двойными мембранами находятся филаментозные мостики «бывшей» синаптической щели. В этих условиях также существует реальная возможность переноса минифрагментов мембран, макромолекул от одной клетки к другой. Обнаружено, что описанные
структуры и микрофагоцитоз особенно характерны в период синаптогенеза.
При дегенерации синапсов в ходе аноксии наблюдается фагоцитоз в системах нейрон ——нейрон, нейрон ——мышца, нейрон—глия, в том числе и феномен «самопоедания». Так, в последнем случае речь идет о том, что при ретроградной дегенерации на теле нейрона образуются псевдоподии, фагоцитирующие окружающие отростки клетки. При дегенерации нервов нередко наблюдается «самопоедание» такого рода, что постсинаптическая мембрана вместе с субсинаптической зоной втягивается внутрь постсинаптической клетки, иногда даже вместе с остатком дегенерирующей терминали. Далее постсинаптический нейрон постепенно атрофируется, т. е. дегенерация передается от пре- к постсинаптическому участку (транснейронная дегенерация). В любой ситуации в синапсах сохраняется в жизнеспособном состоянии постсинаптический участок, который, как правило, ближе к своему трофическому центру, чем нервное окончание — к перикариону пресинаптиче- ского нейрона. Постсинаптический участок раньше созревает в онтогенезе, дольше сохраняется при деафферентации и при патологических состояниях (денервация, аноксия) стремится за счет фагоцитоза поддержать свой гомеостаз.
В нейронах эндоцитоз наиболее эффективен в активной зоне синапсов, особенно в области постсинаптических мембран” где формируются эндосомы, в том числе и одетые везикулы. Как правило, эндосомы и одетые везикулы по размеру больше синаптических пузырьков, кроме того, первые вариабельны по своим размерам.
В онтогенезе при реализации генетической программы протекает квантованный микрофагоцитоз клеточных отростков, зон взаимного притяжения, взаимный обмен микрофрагментами. В этих условиях происходит клеточное узнавание, имеющее информационное и иммунологическое значение. Процессы фагоцитоза резко усиливаются при ряде патологических состояний нервной системы (острая аноксия, гиперактивность нейронов, дегенерация нервов, травма, глиомы). При аноксии дендриты фагоцитируют окружающие их нервные окончания. Астроциты, которые при аноксии набухают, становятся «жертвой» фагоцитоза дендритов.
В раннем онтогенезе в мозге, когда нейрон сохраняет в 、себе черты малодифференцированной клетки, когда еще не завершился синаптогенез, когда его отростки способны к интенсивному амебоидному движению, он характеризуется интенсивным фагоцитозом. В зрелом возрасте в мозге феномен «само- поедания» путем фагоцитоза замедляется. Соответственно, у более молодых животных резче выражены явления гибели нейринов. У взрослых животных синаптические структуры элиминируются не «самопоеданием», а за счет отторжения их от тела нейронов отростками глии с последующим фагоцитозом.
Специфический или рецептор- индуцируемый эндоцитоз
22Феноменология специфического эндоцитоза
2
2
В 1964 г. был обнаружен высокоспецифический адсорбционный эндоцитоз, или рецептор-индуцируемый эндоцитоз (см. табл. 1)> отличающийся от фагоцитоза и пиноцитоза. В этом случае клетки захватывают специфические крупные молекулы (лиганды) или небольшие частицы при помощи соответствующих рецепторов плазмалеммы. Связывание лиганда с рецептором вызывает микроинвагипации мембраны, которая углубляется, округляется, слипается, так что лиганд оказывается в составе специфической эндосомы, называемой одетой везикулой (табл. 2). Затем в клетке происходит трансформация этих везикул, что будет далее рассмотрено специально.
Впервые такой эндоцитоз был описан при изучении захвата яйцеклетками птиц и насекомых большого количества белков, которые запасаются в желтке для питания зародышей. Эти белки синтезируются в различных тканях организма и затем: переносятся в развивающийся ооцит. Например, у самок комаров такой белок-предшественник вителлогенин синтезируется в печени, секретируется в кровь и с током крови попадает в яИчникн. В этих железах молекулы вителлогенина связываются с клеточными рецепторами, которые расположены в примерно 300 000 микроинвагинациях на поверхности ооцита. Постепенно образуются одетые везикулы, которые сливаются и образуют желток. Под действием протеиназ вителлогенин превращается в два важных желточных белка — липовителлин и фосвитин.
Специфический эндоцитоз у млекопитающих передает иммунитет от материнского организма к развивающемуся плоду. Антитела из крови матери связываются с клетками плода, окружающими желточный мешок. На поверхности этих клеток имеются рецепторы, чувствительные к IgG. Связавшиеся антитела затем захватываются клетками и переносятся в кровоток плода.
Таблица 2. Некоторые характеристики специфического эндоцитоза
Лиганд
Клетки
Деградация в лизосомах
Молекулярная масса рецептора; т^ интернализации лиганда, мин; Tw рецептора, ч
лнп
Фибробласты, гепатоциты, лимфоциты и др.
Да
ГП,1; 160 кД; 5 мин; 25 ч; холестерин остается в клетке
Фактор роста
Эпителий
Возможно
ГП; 180 кД (59 и 42 кД — димер)
Транскобаламин II
Почки, гепатоциты, фибробласты
Да
ГП; 50 кД; 60 мин; 8 ч; витамин В12 остается в клетке
Трансферрин
Эритробласты, ретикулоциты, фибробласты
Возможно
ГП; 180 кД (90 кД — димер); 3 мин
Фосфитип, липовителлин
Ооциты
Нет
—
Реовирус
Фибробласты
Да
—
Вирус лихорадки Семлики
》》
—
Вирус стоматита
Л1£)С/(-клетки
Вирус гриппа
Многие
Возможно ГП
Дифтерийный вирус
Фибробласты, почки
—
Холерный токсин
Многие
Да (и в АГ)1
Ганглиозиды
Столбнячный токсин
Нервные окончания нейронов
—
Инсулин
Гепатоциты, адипоциты,лимфоциты, фибробласты
Да
ГП; 130—135 и 49—90 кД
Хорионный гонадотропин
Опухоль Лейдига, яичники
А
—
Пептиды хемотаксиса
Лейкоциты, нейтрофилы, макрофаги
»
Связь с цитоскелетом; 0,5— 4 мин
Комплемент (СЗЬ)
Лейкоциты
Возможно
ГП; 205 кД; трипсин чувствительные
Лиганд
Клетки
Деградация в лизосомах
Молекулярная масса рецептора; т% интернализации лиганда, мин； Тю рецептора, ч
Эпидермальный фактор роста
Фибробласты, гепатоциты
Да, есть специфика
ГП; 150 кД; <5 мин
IgGi, IgG2b мышей
Макрофаги, лимфоциты
Да
ГП; 47—60 кД; 10 ч; трипсин- резистентные Fc-рецепторы
IgG2a мышей
То же
Возможно
ГП; 65 кД
IgG3 мышей
》
*—
IgG
IgG
Эпителий
》
—
Лейкоциты
ГП; трипсинчувствительные Fc- рецепторы
IgA
Лейкоциты, эпителий
Нет
ГП; 90 кД
IgE
Базофилы, тучные клетки
—i
ГП; 45—55 кД
Р-Глюкуронидаза
Фибробласты
Нет (в АГ)
2,5 мин
а-Идуронидаза
》
»А
2,5 мин
Асиало-ГП
Гепатоциты
Да
2,2 мин; 20 ч
Галактоза-терминальный ГП
》
ГП; 42—59 кД
Манпоза-фукоза-терминаль- ный ГП
Макрофаги, эндотелий
<5 мин
Манноза-6-фосфат, содержащий ГП
Фибробласты
ГП; 150 кД
Ацетилированные ЛНП
Макрофаги
—
а2-Макроглобулин-протеаза
>
2—4 мин; 3,3 q
Фактор роста нерва
Адренергические нервы
—
—
р-Меланотропин
Меланома
(В АГ)
—
Пролактин
Гепатоциты, клетки Бреста
Да
—
1 АГ — аппарат Гольджи(「「 мнрованне одетых везнкум
—гликопротерн, В большинстве случаев доказано фор^
Специфический эндоцитоз способствует встраиванию холестерина в плазмалемму любых клеток млекопитающих. Холестерин синтезируется в печени и запасается там в составе липопротеинов низкой плотности (ЛНП). Каждая частица ЛНП содержит «ядро», состоящее примерно из 1500 молекул холе- 忙тернна, связанного ковалентно с остатками жирных кислот. Это ядро покрыто однослойной фосфолипидной мембраной, в состав которой также входит холестерин, а в мембрану ЛНП погружен апо-белок (апо-6). Частицы ЛНП секретируются клетками печени в кровяное русло, и в форме ЛНП холестерин разносится по всему телу. Частицы ЛНП связываются со специфическими рецепторами плазмалеммы, узнающими апо-6, л затем попадают в клетку вышеописанными способами. После преобразования одетых везикул в гладкие везикулы последние сливаются друг с другом, а затем макровезикулы сливаются с лизосомами, где происходит разделение ЛНП до отдельных .молекул. Высвободившиеся холестерин и жирные кислоты при- шгмают участие в восстановлении плазмалеммы. Отсутствие в мембранах фибробластов рецепторов для апо-6 является причиной гиперхолестеринемии, которая характеризуется очень высокой концентрацией холестерина в крови и приводит к раннему атеросклерозу у людей. Некоторые клетки при данной наследственной патологии имеют специфические рецепторы к апо-6, но не способны формировать одетые везикулы, что приводит к дефекту захвата ЛНП.
В фибробластах содержится гликопротеиновый рецептор плазменных ЛНП (160 кД). Один из продуктов распада ЛНП — холестерин ——тормозит в клетке синтез этого рецептора, предотвращая его гиперпрод)гкцию. Количество рецепторов ЛНП в фибробластах зависит от концентрации ЛНП в крови. Если в крови создается высокая концентрация ЛНП, то число рецепторов снижается на 90% по сравнению с нормой, когда содержание ЛНП в крови мало.
Таким образом, потребление ЛНП строго соответствует потребности клеток в холестерине. Следовательно, система снабжения клеток холестерином регулируется по принципу обратной связи — регуляцией синтеза молекул рецепторов ЛНП. Если клетки хорошо снабжаются холестерином, то экспрессия гена, кодирующего рецептор ЛНП, ослабляется. Благодаря уменьшению количества этих рецепторов клетки в меньшей степени извлекают ЛНП из крови. Общее снижение количества рецепторов (особенно в печени) приводит к увеличению содержания ЛНП в крови, а затем и к атеросклерозу.
Эта закономерность продемонстрирована при изучении наследственной гиперхолестеринемии ——заболевания, развивающегося в результате мутации в гене рецептора ЛНП. У людей, гетерозиготных по зтому гену, в клетках синтезируется половина необходимого количества полноценных рецепторов. В гомозиготных клетках (оба гена мутантные) вообще не обра-
зуются нормальные рецепторы. В .первом случае у людей уровень ЛНП в плазме крови увеличен в 2 раза, а вероятность инфаркта до 60 лет у них в 25 раз выше средней. Во втором! случае уровень ЛНП выше нормы более чем в 6 раз, и люди, как правило, умирают от инфаркта в возрасте до 20 лет. Эти исследования привели к химиотерапии данного заболевания; лекарственные препараты снижают синтез холестерина и тем самым включают синтез новых молекул рецепторов ЛНП.
На ранних стадиях атеросклероза в эндотелии резко активизируется неспецифический эндоцитоз ЛНП, которые попадают в крупные эндосомы и кавеолы. Процесс интернализации ЛНП увеличивается в этом случае за счет обогащения аргинином апо-белка Е, т. е. активация эндоцитоза происходит благодаря повышению электростатического взаимодействия положительных зарядов ЛНП с отрицательно заряженной мембраной эндотелия. Длительная активация неспецифического эн.- доцитоза вызывает патологические изменения в клетках.
Можно привести несколько примеров специфического эндо цитоза, имеющих место при поглощении некоторых гормонов*, лекарств и пр. Например, молекулы инсулина связываются со» специфическими рецепторами клеток-мишеней, далее комплекс рецептора с инсулином попадает внутрь клетки и инсулин гидролизуется в лизосомах. Предполагают, что именно после образования одетых везикул прекращается специфический ответ клетки на данный «метаболический» гормон — резкое увеличение входа в клетку глюкозы. Таким же путем захватываются лекарственные вещества, как, впрочем и «вредные»,— вирусы, токсины. Например, если в крови появляются аномальные гликопротеины, в которых углеводная цепочка оканчивается не сиаловой кислотой, как обычно, а галактазой, то рецепторы плазмалеммы печени «узнают» и захватывают такие гликопротеины, которые затем разрушаются в лизосомах. Специфический эндоцитоз более всего характерен для иммунокомпетентных клеток, рецепторы которых связывают антитела строгсв избирательно. Индуктором такого рода эндоцитоза IgG лейкоцитами или макрофагами является тетрапептид тафцин^
Еще один пример специфического эндоцитоза — захват ионов железа различными клетками в форме специального транспортного белка — трансферрина. Этот белок аккумулирует ионы Fe в кишечнике (где эти ионы освобождаются из пищи) и в печени (где железо запасается). Молекула трансферрина связывает два иона Fe. Эта молекула взаимодействует с особым рецептором плазмалеммы, и далее образовавшийся комплекс путем эндоцитоза втягивается внутрь клетки, снабжая железом те или иные клетки. Данный рецептор является, как и все практические известные рецепторы, интегративным белком, а точнее гликопротеином (180 кД), состоящим из двух одинаковых субъединиц, которые связаны между собой дисульфидным мостиком. Большая часть молекулы рецептора экспо-
иирована во внеклеточную среду (эта особенность не уникальна, она является характерной для многих рецепторов). Каждая полипептидная цепь содержит, по крайней мере, три углевод- иых остатка и остаток пальмитиновой кислоты, который, как якорь, удерживает рецептор в мембране. На внутренней поверхности мембран клеток в составе данного рецептора содержатся два фосфорилированных остатка, очевидно, серина. Рецептор связывает две молекулы трансферрина, скорее всего по одной молекуле в каждой полипептидной цепи. При физиологических условиях образовавшийся комплекс сразу переходит внутрь клетки. В эксперименте удается разобщить связывание трансферрина и интернализацию комплексов, поскольку для связывания лиганда с рецептором энергия не нужна, а для втягивания комплекса внутрь клетки она необходима; следовательно, второй процесс можно подавить снижением температуры или ингибиторами метаболизма. Полумаксимальное насыщение рецепторов трансферрином равно 5 нМ.
Макрофаги при помощи специфического эндоцитоза фагоцитируют клетки-мишени, связанные с 1g и комплементом, этот процесс подавляется ингибитором метаболизма 2-дезокси-О- глюкозой, не влияющей на неспецифический фагоцитоз. Макрофаги при помощи специфического эндоцитоза поглощают эритроциты, опсонированные IgG.
Эндоцитоз может регулировать количество антител во внеклеточной среде. Например, на поверхности В-лимфоцитов иммуноглобулины распределяются не диффузно, а в виде отдельных скоплений (пэтчей ——от англ, patching), которые могут латерально мигрировать по мембране в латеральном направлении, концентрируясь на одном из полюсов клетки (рис. 8). Часть
Рис. 8. Форма распределения рецепторо и антигенов в плазмалемме
пэтчей интернализируется, благодаря чему регулируется количество антител. Миграция, образование пэтчей иммуноглобулинов совместно с гликопротеиновыми рецепторами для многих клеток ингибируются цитохалазином В, индуцируется Кон А, облегчается при обработке клеток колхицином. Другими словами, латеральное движение рецепторов в плазмалемме регулируется дитоскелетом, ассоциированным с мембраной.
Интернализация рецепторов
Процесс специфического эндоцитоза включает образование комплекса лиганд — рецептор и кластеризацию комплексов при помощи латеральной диффузии и с участием цитоскелета. Кластеры располагаются в определенных участках возле окаймленных ямок (пор). Эти ямки есть почти у всех клеток животных, занимая, как правило, около 2% клеточной поверхности. Например, фибробласты на образование фонда одетых везикул за 1 мин 《тратят» 2% плазмалеммы. Под каждой ямкой на внутренней поверхности плазмалеммы расположен тонкий фибриллярный слои, построенный из белка клатрина. При кластеризации рецепторов в зоне ямок происходит вытеснение «ненужных» белков со стороны внешней поверхности плазмалеммы. Зона окаймленных ямок — участок сортировки молекул, избирательного накопления рецепторов, а затем и комплексов лиганд-рецептор. Взаимодействие лиганда с рецептором вызывает быстрое, почти трехкратное увеличение количества ямок. Далее зона ямок с участками ли- гандрецепторного комплекса увеличивается до критических размеров в течение 1 мин, т. е. идет процесс инвагинации.
Затем образуются одетые везикулы, которые отрываются от мембраны и далее двигаются в цитоплазме клеток. Процесс погружения комплекса лиганд — рецептор внутрь клетки и образование одетых везикул принято называть интернализацией. Образование одетых везикул происходит с большой скоростью, почти непрерывно: окаймленные ямки втягиваются внутрь клеток,, формируются одетые везикулы, а на клеточной мембране постепенно снова возникают новые ямки. Процесс впячивания ямок в цитоплазму, очевидно, обеспечивается механическими силами, создаваемыми клатриновым слоем и цитоскелетом. Иногда одетые везикулы формируются путем отделения от более крупных инвагинаций, не имеющих изначально окаймления.
Является ли стадия кластеризации универсальной? Видимо, нет. Все зависит от типа рецепторов. В фибробластах кластеры рецепторов ЛНП располагаются преимущественно в участках окаймленных ямок даже в отсутствие лиганда. Напротив, рецепторы трансферрина, инсулина и гликопротеинов с терминальной галактозой исходно распределены по клеточной поверхности бог лее или менее равномерно и образуют кластеры в местах окаймленных ямок только' после связывания лиганда и при температуре не ниже 37℃. Фибробласты специфически связывают ЛНП или асиалогликопротеины и образуют одетые везикулы даже при 4℃ или после обработки клеток формальдегидом.
Фагоцитоз и жидкофазный пиноцитоз могут также инициироваться областью плазмалеммы, покрытой изнутри клатриновой решеткой. Так, показано, что некоторые фагосомы макрофагов, захвативших латекс, частично покрыты клатриновой《тубой»: В этом случае полипептидный состав мембран таких фагосом и плазмалеммы практически сходен. Некоторые вирусы связыва-
ются клетками при помощи микроворсинок, затем при помощи латеральной диффузии вирус переносится в ту область плазмалеммы, где изнутри имеется клатриновая《шуба» н только после этого образуются одетые везикулы, содержащие вирус. Часть вирусов может захватываться жидкофазным пиноцитозом, но «при частичном участии окаймленных ямок, содержащих клатри- ловую «шубу».
Очевидно, структура некоторых рецепторов «запрограммирована» на миграцию вдоль поверхности мембраны и их кластеризацию, т. е. на миграцию к окаймленным ямкам и дальнейшую фиксацию в этой области. По-видимому, существует высокое сродство какого-то участка рецептора к компоненту области окаймленной ямки, т. е. сродство «внутреннего» участка рецептора, выступающего в цитоплазму клетки. У других рецепторов это сродство появляется лишь при взаимодействии с лнган工ом благодаря изменению конформации в молекуле рецептора.
Механизм специфического эндоцитоза во многом остается неясным. Так, например, непонятно, почему одетые везикулы быстро превращаются в гладкие обыкновенные везикулы — рецепто- сомы, ведь природа не терпит убыточной экономики.
Недавно предложена следующая альтернативная схема последовательности событий. Покрытые клатрином окаймленные ямки являются стабильными элементами; они постоянно связаны с плазмалеммой и лишь претерпевают морфологические изменения в ходе эндоцитоза. После связывания и кластеризации лигандов в открытых ямках (инвагинациях,《ловушках») начинается температурно- и энергозависимый процесс закрытия горловины «одетых» ямок. Предполагают, что слияние мембран в области горловины не происходит.，На этой стадии «одетые» ямки функционально изолированы.
Далее довольно необычным способом образуется рецептосо- ма. При закрытой горловине активный транспорт ионов может вызвать повышение гидростатического давления внутри «скрытых» одетых везикул, что заставляет горловину удлиняться. Образованная таким образом в районе горловины область «одетых» ямок, не покрытая клатрином, замыкает в себе перешедшие в нее комплексы лиганд — рецептор, образуя тем самым рецептосому. Затем рецептосома отрывается от《одетых» ямок и направляется к аппарату Гольджи. Оставшаяся на клеточной мембране «одетая» ямка открывается и готова для повторного использования. Пока трудно комментировать эту довольно противоречивую схему, однако главное, что привлекает к ней внимание, — высокая степень рециклизации «окантован- ностн» плазмалеммы.
Специфический эндоцитоз, инициируемый добавлением лигандов, индуцирует жидкофазный пиноцитоз в том же участке плазмалеммы. Кластеризация лигандов и рецепторов в плазмалемме индуцирует специфический эндоцитоз. Если рецепторы В-лимфо- цитов или СЗЬ-рецепторы нейтрофилов обрабатывать монова- /4
лентными Fab-антител а ми, то эндоцитоз не происходит. Однако обработка интактными антителами или бивалентными F(ab)2‘， фрагментами запускает как кластеризацию рецепторов, так и специфический эндоцитоз. В макрофагах комплекс Fab-рецептор интернализируется, а рецептор рециклизируется; комплекс Р(аЬ)2,-рецептор не рециклизируется после внутриклеточной аккумуляции.
Клатрнновая《туба» располагается в плазмалемме не случайно, однако механизм узнавания мембранами клатрина неизвестен. Неясно, что является триггером формирования клатри- новой «шубы» и интернализации. Известны мутанты фнброблас, тов с дефектом интернализации, которые связывают ЛНП в «неодетой» области плазмалеммы, однако интернализация происходит с низкой скоростью. Клетки карциномы А-431 человека имеют большое число рецепторов для ЛНП, но в плазмалемме зоны рецепторов мембраны изнутри не покрыты клатриновой -«шубой», поэтому интернализация протекает довольно медленно. В некоторых случаях связавшиеся с мембраной вирусы далее мигрируют по мембране к «окантованному» участку и только после этого интернализируются.
Свойства одетых везикул. Клатрин
•Одетые (окаймленные, окантованные) везикулы и их основной белковый компонент — клатрин впервые выделены (1975) сначала из мозга, а потом из других тканей. Они содержат на внешней поверхности клатриновую 《шубу», которая представляет •собой корзинчатое структуры (J« 1,2 нм) с пента- и гексагональными ячейками (ширина 6,5 нм, длина 16,5 нм), образованные 専 результате полимеризации клатрина. Эти органеллы вариабельны по своим размерам (J« 50——250 нм) даже в одной и той >же клетке. Одетая везикула диаметром 200 нм содержит около •сотни молекул клатрина. Клатрнновая сеть, как правило, состоит из 12 пента- и 4 (или 8) гексагонов. Клатрнновая решетка локально разупорядочивает липидный бислой мембран одетых •везикул. Помимо основного филаментозного кислого белка клатрина (180 кД) в составе одетых везикул определяется несколько минорных белков — 32 и 36 кД (легкие цепи клатрина), 55 и 100—150 кД. Клатриновую сеть и сам клатрин можно отделить от мембран одетых везикул, при этом образуются похожие на трилистник структуры — трискелионы. При определенных условиях наблюдается агрегация трискелионов в своего рода корзинчатые структуры, которыми окружены одетые везикулы.
Трискелион (630 кД; 8,4S) состоит из трех молекул клатрина и трех молекул низкомолекулярного минорного белка. Предполагают, что эти минорные белки крепят полигональную вершину трнмера клатрина в составе трискелионов. С мембранами одетых везикул клатрин связывают высокомолекулярные минорные белки (50 и (или) 100—150 кД) ?*'Считают, что сборка клатрина в
решетчатые структуры происходит на внутренней поверхности плазмалеммы. Образование такой решетки — сигнал для образования инвагинации (окаймленной ямки) с комплексом лиганд — рецептор и формирования одетых везикул. Трискелион связывается с одетыми везикулами, из которых удалена клатриновая сеть, но не связывается с везикулами из эритроцитов; эти везикулы не способны образовывать одетые везикулы. Очевидно, на поверхности одетых везикул есть белок, ответственный за прикрепление клатриновой сети.
В опытах i〃 vitro детально изучен процесс разборки одетых везикул и обратный процесс сборки клатриновой сети из клатри- на и построение «каркаса» на《раздетых» гладких везнку」ах_ Разборка одетых везикул протекает при рН^8,0, при этом ионы Mg (10 мМ) стабилизируют одетые везикулы от разборки и ускоряют сборку. Для сборки нативных одетых везикул необходимы как клатрин, так и минорные компоненты. Ионы Mg незаменимы на Са+2, Mn2+, Zn2+. Если одетые везикулы обработать 2М мочевиной, то разборка приводит к появлению в среде инкубации гладких везикул, клатриновой сети (полимеры клатрнна〉 и легких цепей клатрина. Если же далее среду довести до pH 8,3. то образуются трискелионы, которые при pH 6,5 преобразуются в корзинчатые структуры диаметром 80 нм, похожие на нативные- одетые везикулы.
Итак, разборка одетых везикул протекает при щелочных значениях pH, сборка же происходит при pH<7,0; последний процесс тормозится ацидотропными веществами. В мембранах одетых везикул локализована протонная АТФаза немитохондриаль* ного типа, т. е. гидролиз АТФ протекает на внешней поверхности везикул, при этом происходит подкисление матрикса везикул.
В среде с высокой ионной силой (0,5—0,6 М KI; ^0,25М MgCl2) из одетых везикул экстрагируется клатрин. Последующий диализ этой суспензии против буфера с низкой ионной силой приводит к сборке корзинчатых структур, не идентичных полностью одетым везикулам; для нормальной сборки необходимы минорные белки. Очищенный клатрин в этих условиях не полимеризуется. Клатрин (8,2S) при рН&7,0 в присутствии К+ и Mg2+ образует решетчатые структуры; в отсутствие Mg2+—агрегаты диаметром 16 нм, а при pH 7,5 в отсутствие солей образует прозрачные растворы, содержащие линейные волокна; в присутствии 0,2 М CH3COONa образует крупные полимеры с К& 150 и 300S. Ограниченный протеолиз способствует разборке одетых везикул и появлению в среде инкубации клатриновой сети без легких цепей.
В 1984 г. в цитозоле клеток была обнаружена особая «раздевающая» АТФаза, которая, связываясь с легкими цепями клат- рина, осуществляет разборку одетых везикул. Важное условие — легкие цепи при этом обязательно должны быть ассоциированы со связанными в сеть трискелионами; свободные трискелионы или свободные легкие цепи не активируют эту АТФазу. Указан- 46
ная АТФаза зыполняет функцию переносчика клатрина в цитоплазме.
Липидный состав одетых везикул изучен слабо. Во фракции «детых везикул мозга соотношение холестерин/фосфолипиды равно 0,1—0,3 (для сравнения: плазмалемма — 0,3—1,2, мито- .хондрии — 0,03—0,09, ЭПР — 0,03—0,08).
Большинство исследователей предполагают, что мембраны «каймленных ямок содержат довольно мало холестерина, который, как известно, регулирует жидкостные свойства мембран (чем больше содержание холестерина, тем больше ригидность ыембран). Снижение жидкостных свойств мембран в зоне окаймленных ямок может способствовать инвагинации ямок и их отделению от мембран, т. е. образованию одетых везикул.
Биологический смысл формирования одетых везикул остается неясным. Может быть, клатриновая 《шуба» необходима как «форма самосохранения одетых везикул (и их содержимого) от лизиса, а возможно, что《шуба» необходима для сцепления этих органелл с цитоскелетом и последующего их транспорта в клетке.
Трансформация одетых везикул.
Рециклизация рецепторов
В последние годы выяснены пути трансформации одетых везикул в ходе специфического эндоцитоза (рис. 9). По мере того как одетые везикулы проникают в глубь цитоплазмы, они быстро (в течение нескольких секунд) теряют клатриновую оболочку и сливаются друг с другом или с везикулами иного типа (например, возникающими после жидкофазного пиноцитоза), так что образуются более крупные пузырьки с гладкой поверхностью, т. е. эндосомы (их иногда называют гладкими везикулами или ре- цептосомами). Этот процесс протекает быстро, в течение нескольких секунд—минут. Содержание рецепторов (и лигандов) в рецептосомах в 2—4 раза (по другим данным, в 4——10 раз) больше, чем в плазмалемме. При низкой температуре гепатоциты способны специфически захватывать гликопротеины, но про- десс слияния эндосом с лизосомами резко тормозится. Указанный процесс слияния тормозится и при обработке макрофагов Кон А.
Априорно трудно допускать, что простое связывание лигандов с плазмалеммой- обязательно приведет к захвату его клеткой, поскольку адсорбированный лиганд должен быть оккупирован сегментами мембраны с образованием инвагинации и только после этого интернализирован внутрь клетки. Отмечается высокая скорость связывания лигандов с плазмалеммой и относительно низкая скорость интернализации. Интернализация тормозится при 4℃, действии ЭДТА, протеиназ, конкурентных антагонистов лигандного связывания, при низком значении pH.
Расчеты показывают, что клетки интернализируют лиганды в 5—30 раз выше, чем максимальное число адсорбированных моле-
Кул, при этом число связывающих мест на мембране (т. е. активных центров молекул рецепторов) в ходе эндоцитоза остается постоянным. Следует учесть, что большая часть лигандов может связываться с рецепторами и с низким сродством. Кроме того» часть лигандов попадает в одетые везикулы «по совместительству», по типу жидкофазного пиноцитоза. Показано, что связавшие-
Рецептор .・.Лиганд
Рис. 9. Трансформация одетых везикул (ОВ), рециклизация рецепторов:
J — одетая ямка, 2 — ОВ, 3 — гладкая везикула, 4 — рециклизация клатрина в плазмалемму, 5 — слияние гладких везикул в эндосому (рецептосому), 6 — частичная диссоциация комплекса лиганд — рецептор в рецептосоме, 7 — частица CURL, 8 — отделение тубулярной части от CURL, содержащей рецепторы, 9 — рециклизация рецепторов, 10 — слияние рецептосом (5, 6), с плазмалеммой, //— отделение везикулярной части с лигандами от CURL, /2 — лизосома, 13 — слияние 11 и 12 (деградация лигандов), 14 — возможная трансформация везикул 6» 11 в системе ГЭРЛ
ся лиганды сравнительно быстро интернализируются (в течение 2—5 мин; см. табл. 2). По-видимому, не существует большого фонда рецепторов, способных замещать те рецепторы, которые- вместе с лигандами вовлечены в образование рецептосом. В большинстве случаев число связавшихся лигандов превышает число рецепторов, т. е. связывание — поливалентно. Лиганды и рецепторы в виде комплекса интернализируются совместно и одновременно. То же самое было показано при адсорбционном неспеци-
фическом пиноцитозе с образованием эндосом без клатриновой <шубы».
Процесс интернализации, т. е. образования одетых везнкул, не ингибируется циклогексимидом. В первые минуты после инициации специфического эндоцитоза часть одетых везикул и гладких эндосом может слипаться с плазмалеммой. Этот процесс рециклизации мембран рецепторами и лигандами не чувствителен к циклогексимиду. Некоторые рецепторы (Fc-рецепторы макрофагов) даже в отсутствие экзогенных лигандов могут интернализироваться и попадать в эндосомы, что свидетельствует о спонтанной рециклизации рецепторов, обусловленной эндогенными лигандами.
Макрофаги при 0℃ обрабатывали (30 мин) трипсином, после этого резко тормозилось (на 70%) связывание маннозил-гликопротеинов с рецепторами. Однако спустя 1 мин после инкубации клеток при 37℃ лигандрецепторное связывание нормализовалось. Эти данные интерпретируют как косвенное доказательство рециклизации рецепторов в плазмалемме. На это же указывают данные о том, что сами белковые рецепторы обмениваются медленно, как и большинство белков плазмалеммы (см. табл. 2).
Все механизмы рециклизации рецепторов, как, впрочем, и рециклизация плазмалеммы, пока имеют качественную характеристику. Некоторые рецепторы при определенных условиях не рециклизируются совсем или плохо восстанавливаются в составе плазмалеммы. Например, макрофаги в качестве лиганда захватывали IgG-опсонированные эритроциты на фоне добавления моноклональных антител против Fc-рецепторов. Обнаружен но, что интернализация рецепторов в ходе эндоцитоза составила 70%. Однако оставшееся количество рецепторов сохранялось на постоянно низком уровне более чем 24 ч. Этот факт расценивался так, что деградация этих рецепторов гораздо выше, чем их рециклизация. Оказалось, что тбо для Fc-рецепторов в отсутствие лиганда равно 10 ч, а в присутствии лиганда около 50% рецепторов разрушалось довольно быстро (т50V2 ч). Таким образом, антигенобработанные лиганды запускают интернализацию и деградацию Fc-рецепторов.
В макрофагах 7500 молекул рецепторов для маннозилиро- ванных белков способны эндоцитировать 2-106 молекул лигандов за 1 ч, что указьтвает на высокую скорость рециклизации рецепторов (в течение нескольких минут). Печень перфузировали раствором, содержащим асиалогликопротеины, при 16℃. Лиганд попадает в рецептосомы, но не в лизосомный фонд. Отмечено, что число рецепторов для лиганда в плазмалемме в этих условиях остается постоянным, что также указывало на возможность рециклизации рецепторов.
Некоторые лиганды (комплекс аг-макроглобулин — протеиназа, некоторые гормоны и гликопротеины) оказывают первичный эффект на клетку-мишень только на внешней поверхности мемб-
ран и последующий их захват клеткой вместе с рецепторами。3~ лачает путь устранения длительности биологического эффекта этих лигандов. Другие лиганды (ЛНП, комплекс витамина В12 с транскобаламином II, полипептидные токсины, вирионы, эпидермальный фактор роста), захватываясь клеткой, далее из эндосом я других везикул высвобождаются в цитоплазму клеток и оказывают свое действие на метаболизм. Если в первом случае лиганды радикально изменяют метаболизм через внутриклеточные регуляторы (система циклических нуклеотидов, Са2+ и кальмодулин и др.), то во втором случае пока неясно взаимоотношение эндоцитоза и универсальных внутриклеточных регуляторов.
Один фибробласт каждые 2 ч интернализирует внутрь клетки сбласть, эквивалентную всей клеточной поверхности. Для компенсации быстрой потери участков плазмалеммы необходима столь же быстрая рециклизация мембран. Одна часть рецепторов, попадая в клетку, разрушается в лизосомах, например рецепторы фактора роста эпидермиса, инсулина. В этом случае необходимо определенное время для ресинтеза белка и его встраивания в мембрану. Другая часть рецепторов, попадая в клетку, остается сохранной и постепенно снова возвращается в плазмалем- му, например рецепторы аг-макроглобулина — ингибитора плазматической протеиназы.
В результате сложного цикла эндоцитоза и рециклизации мембран и их компонентов (рецепторов) мембраны одетых везикул, эндосом, вакуолей и плазмалеммы не выравниваются по своему составу. Очевидно, существует специфический отбор белков плазмалеммы в ходе образования одетых везикул, тот же строгий отбор происходит и в ходе рециклизации, поэтому мембраны «не смешиваются».
Судьба проникших в клетку лигандов неодинакова, но большинство из них «проходят испытания» в лизосомах. Лизосомные гидролазы разрушают попавшие в лизосомы лиганды, а продукты их деградации удаляются из клетки либо, как в случае ЛНП, переносятся в цитоплазму и используются там в качестве строительного материала. Было бы слишком расточительным уничто* жать в лизосомах и рецепторы. С помощью ингибиторов синтеза белка можно блокировать образование и синтез новых рецепторов, а рециклизация рецепторов будет продолжаться.
Время жизни большинства рецепторов намного выше времени жизни соответствующих лигандов. Каждая молекула рецептора связывает лиганд один раз в 10—15 мин и сохраняет активность в течение многих часов. Непрерывная циркуляция рецепторов свойственна тем из них, которые локализованы в окаймленных ямках постоянно (даже в отсутствие лиганда), так как указанные ямки затем впячиваются. Другие рецепторы вступают в цикл кругооборота только после связывания лиганда, поскольку только в такой форме они мигрируют в мембране к окаймленным ямкам. ,
Для изучения каким образом и когда рецептор освобожда-
ется от лиганда был использован оригинальный метод. Были получены антитела к гликопротеину с терминальной галактозой и к соответствующему рецептору. Эти антитела пометили коллоидными частицами золота различного размера. Крысам вводили гликопротеины с терминальной галактозой и через различное время после инъекции животных декапитировали. Печень фиксировали, делали срезы и обрабатывали их антителами против лиганда и против рецептора. Благодаря частицам золота связавшиеся антитела были видны на электронных микрофотографиях как темные точки. Оказалось, что в срезах, полученных, на ранних стадиях специфического эндоцитоза, и лиганды и их рецепторы находятся в тесной связи с мембранами одетых везикул, располагаясь непосредственно под клеточной поверхностью. В матриксе одетых везикул свободных лигандов не было. На этой стадии молекулы лиганда еще соединены с рецепторами» погруженными в мембрану одетых везикул. По мере удаления от поверхности клеток размер одетых везикул увеличивается и внутри образованных эндосом появляется все больше свободного лиганда, хотя основная часть по-прежнему находится в в и декомплекса лиганд—рецептор на внутренней поверхности эндосом.
Эндосомы затем преобразуются в новую органеллу CURL (от англ. — место разделения рецептора и лиганда; см. рис. 9). В этой везикулярно-тубулярной органелле происходит диссоциация рецептора и лиганда и их перераспределение, в результате которого лиганды накапливаются в свободной форме в везикулярной части органеллы, а рецепторы ——в тубулярной части. Молекулы рецептора остаются погруженными в мембрану органеллы: рецепторы либо образуют кластер на одном из полюсов везикулярной части органеллы, которым она примыкает к тонким, окруженным мембранами трубочкам (или сливается с ними), либо оказывается нутри самих трубочек. Диссоциация комплекса лиганд ——рецептор в CURL происходит из-за низкого значения pH внутри этой органеллы.
Анализ срезов печени, полученных на более поздних этапах эндоцитоза, показал, что везикулярная часть CURL (эндоцитозная вакуоль) сливается с лизосомами, где происходит деградация лиганда. Прежде чем произойдет слияние, тубулярные участки, нагруженные рецепторами, отсоединяются от везикул CURL, так что рецепторы избегают воздействия лизосомных ферментов. Тубулярные структуры, вероятно, обеспечивают возврат рецепторов в пл азмалем му. Каким образом это происходит, пока неясно; возможны два варианта: либо с помощью цитоске- летной системы, либо тубулярная система неподвижна и простирается от плазмалеммы до центра клетки подобно ЭПР.
Повторную утилизацию рецепторов можно подавить ацидо- тропными агентами. Значение pH внутри эндосом и CURL равно примерно 5,0. Опыты с очищенными рецепторами и лигандами показали, что, хотя при нейтральных значениях pH рецепторы прочно связывают лиганды, образующиеся комплексы легко
диссоциируют при pH ниже 5,5. Из этих модельных опытов стало ясно, что как только комплекс рецептора с лигандом попада- ег в кислую среду внутри эндосом или CURL, лиганд отделяет- <я от рецептора и растворяется в содержимом везикул, а рецептор остается связанным с мембраной везикул и впоследствии реутилизируется. В мембранах эндосом существует Н-насос, который регулирует механизм закисления внутренней среды органеллы.
Многие рецепторы, как в составе мембран, так и изолированные, не связывают «свои» лиганды при pH 5,0 (исключение составляет Fc-рецептор мембран эпителия, связывающий IgG). Ре- цептосомы с флуоресцеинмеченым аг-макроглобулином быстро закисляются спустя 20 мин после начала эндоцитоза. При слиянии эндоцитозной вакуоли с первичными лизосомами наблюда- •ется в случае захвата ферротрансферрина появление свободно- то Fe3+, а из ЛНП высвобождается холестерин. Эти вещества затем переносятся через мембрану вторичной лизосомы r цито- Блазму и поступают в определенные компартменты клеток.
В отличие от других лигандов ферротрансферрин, попав внутрь клетки, не разрушается и не запасается. Он освобождается от связанных с ним ионов Fe и быстро секретируется наружу клетки в форме не содержащего железа апотрансферрина. Аналогичный процесс характерен и для витамин В12-связываю- щего белка. В данном случае ферротрансферрин благодаря кислой среде в CURL диссоциирует на свободное железо и апотрансферрин, который остается связанным со своими рецепторами даже при pH 5,0, чем резко отличается от других лигандов. У лишенного железа апотрансферрина сродство к рецептору при pH 5,0 такое же, как у ферротрансферрина при pH 7,0, а при нейтральном pH апотрансферрин практически не связывается с рецептором. Если комплекс апотрансферрина с рецептором быстро перенести из кислой среды в нейтральную, то он в течение нескольких секунд диссоциирует.
Свободные ионы Fe переносятся на молекулы ферритина, который в цитоплазме играет роль депо железа. Апотрансферрин, отделившись на внешней поверхности плазмалеммы от рецептора при физиологическом значении pH, увлекается током крови, готовый опять связать Fe3+, а рецепторы вновь участвуют в эндоцитозе.
Опухолевые клетки печени содержат 150 000 участков связьь вания трансферрина на 1 клетку, они способны захватывать трансферрин в течение нескольких часов со скоростью 19 000 ионов Fe/мин; около 16 мин проходит от момента связывания лиганда с рецептором до секреции апотрансферрина, в среднем рецептор находится на поверхности клетки 4 мин и за это время он успевает связать две молекулы ферротрансферрина. Переход образовавшегося комплекса внутрь клетки занимает около 5 мин. За оставшиеся 7 мин происходит высвобождение Fe?+ из ферротрансферрина и возвращение комплекса рецептора с
зпотрансферрнном на поверхность клетки; диссоциация этого комплекса и отделение апотрансферрина протекает за 16 с.
Рецептосомы переносят некоторые гормоны в ядро клеток и таким образом инициируют процесс транскрипции. В этом про- дессе принимают участие и лизосомы, которые могут при некоторых обстоятельствах секретировать лизосомные ферменты в ядро. Описана возможность слияния одетых везикул с мульти- везикулярными тельцами (при этом образовавшиеся крупные вакуоли секретируют содержимое в цитоплазму), а также вовлечение рецептосом в трансформацию в системе ГЭРЛ.
Интересна трансформация вируса лихорадки Семлики, состоящего из нуклеокапсиды, которая окружена мембраной, содержащей гликопротеин. Гладкая везикула, образованная из одетых везикул, сливается с лизосомой, где при pH 5,0 происходит высвобождение вируса в матрикс лизосом, после чего мембрана вируса сливается с внутренней мембраной лизосом и путем экзоцитоза в цитоплазму клетки секретируется свободный нуклеокап- сид. Данную вирусную инфекцию предотвращают ацидотропные вещества. Они тормозят диссоциацию комплекса лиганд—рецептор, рециклизацию рецепторов, блокируют патогенное действие токсинов , (дифтерийного и столбнячного), репликацию реовирусов. Рециклизация рецепторов не тормозится на фоне действия циклогексимида, блокирующего синтез новых молекул рецепторов, на фоне снижения температуры до 4℃, при обработке клеток глутаральдегидом.
Особые функции одетых везикул
Одетые везикулы, образующиеся из плазмалеммы в ходе специфического эндоцитоза, транспортируют от периферии к центру клетки лиганды, рецепторы и мембранный материал. В цистернах ЭПР и аппарата Гольджи также формируются одетые везикулы (d<0,l мкм), которые могут иметь отношение либо к образованию первичных лизосом, либо к внутриклеточному транспорту макромолекул. Показано, что одетые везикулы печени н мозга транспортируют вновь синтезированные лизосомные ферменты в форме высокомолекулярных «пробелков» в первичные лизосомы. Иммунохимически выявлена локализация клатрина в плаз- малемме, одетых везикулах н системе ГЭРЛ. Отсюда следует, что выделяемая фракция одетых везикул из различных тканей представляет собой популяцию одетых везикул различного происхождения.
Внутриклеточные одетые везикулы отличаются от плазмалем- мальных наличием щелочной фосфатазы, кислых гидролаз, тиаминпирофосфатазы, гликопротеинов; они транспортируют вещества от центра к периферии. Эти одетые везикулы поставляют материал для обновления клеточных мембран, для встраивания в них специфических компонентов, в частности гликопротеинов. В нейронах такие одетые везикулы мигрируют с быстрым аксо-
током (хотя сам клатрин как растворимая молекула движется совместно с элементами цитоскелета с медленным аксотоком) из тела клетки до конуса роста нервов, т. е. поставляют пластический материал для прорастания нерва в ходе постнатального развития или при регенерации. В некоторых клетках, пораженных инфекцией, одетые везикулы транспортируют вновь синтезированные «вирусные» белки от ЭПР к аппарату Гольджи и далее к плазмалемме. Очевидно, приближаясь к плазмалемме, данные одетые везикулы «раздеваются», а образовавшиеся гладкие везикулы слипаются с плазмалеммой, вливая «свое» содержимое в состав плазмалеммы.
Индивидуальные компоненты встраиваются в мембраны независимо друг от друга. Селективным переносом с помощью одетых везикул различных типов можно объяснить: каким образом поддерживается индивидуальность многих мембранных компарт- ментов, несмотря на непрерывный обмен материалом между ними. В течение цикла эндоцитоза топология и асимметрия мембран всегда сохраняются.
В некоторых железистых клетках (поджелудочная, молочная и околоушная железы) одетые везикулы, образованные в аппарате Гольджи, вовлекаются далее в процесс экзоцитоза гормонов. Предполагают участие одетых везикул в секреции растворимых липопротеинов в гепатоцитах. Одетые везикулы способны также участвовать в тpaнcэпитev^иaльнoм транспорте иммуноглобулинов. Так, обнаружена ассоциация казеинсодержащих одетых везикул с микротрубочками в системе молочные железы — эпителий. Для обеспечения внутриклеточного транспорта одетых везикул служат белки цитоскелета, способные ассоциироваться с одетыми везикулами. В составе одетых везикул мозга и печени выявлены минорные компоненты: а- и р-тубулин (54—56 кД), а также т-белок микротрубочек (50 кД), который способен фосфо- лироваться эндогенной цАМФ-зависимой протеинкиназой. Считают, что эти белки связывают трискел ион с мембраной одетых везикул. Сам клатрин и одетые везикулы связываются с «ручками» микротрубочек——периодическими ответвлениями от продольной оси, содержащими динеиновую АТФазу. Клатрин также способен связываться с фибриллярным актином ——Ф-актином и а-актинином. Таким образом, одетые везикулы совершают челночные рейсы от центра клетки к периферии и обратно, осуществляя как «контейнеровозы» внутриклеточный транспорт макромолекул.
Как следует из рис. 8, рецепторы или антигены на клеточной поверхности располагаются хаотически (более или менее равномерно), в форме кластеров (агрегатов), в форме так называемых пэтчей, или пятен (более упорядоченная форма кластеров), и нередко (чаще всего при патологии) в форме колпачков (принудительная концентрация в определенной зоне). В клетках, образующих синапсы, рецепторы концентрируются в зоне контакта. Отмечено, что колпачки рецепторов или антигенов собираются 54
над тем полюсом клетки, в котором находятся центриоли, вакуоли и аппарат Гольджи. Предполагают, что зоны, не содержащие антигенов или рецепторов, могут возникать благодаря постоянной рециклизации рецепторов и обновлению мембран, причем взаимосвязанные молекулы антигенов (или рецепторов) остаются на месте и объединяются в колпачок. Далее комплекс антитело—антиген или лиганд — рецептор самофагоцитируется, клеточная поверхность освобождается от антител и лигандов, как и от избытка антигенов и рецепторов, и наступает обратный процесс — рециклизация.
Феномен увеличения эндоцитоза после экзоцитоза
Феномен значительного усиления эндоцитоза (всех типов и, в частности, специфического эндоцитоза) после экзоцитоза привлек общее внимание исследователей, начиная с 70-х годов. Он был описан для железистых клеток и нейронов, в последнем случае для синаптических структур. Данный феномен — убедительный пример взаимосвязи эндо- и экзоцитоза.
При интенсивной стимуляции изолированных нервов, а также при деполяризации мембран клеток срезов или синаптосом мозга помимо морфологической картины экзоцитоза, Са-зависимой секреции медиаторов наблюдается значительное снижение количества синаптических пузырьков и их диаметра; увеличение объема (набухание) терминали; увеличение поверхности аксолеммы и пресинаптических мембран, т. е. увеличение площади мембран, их набухание; резкое усиление спустя некоторый период (несколько минут) после экзоцитоза микропиноцитоза и специфического эндоцитоза во внесинаптических участках нервного окончания, новообразование одетых везикул, вакуолей, цистерн, мультивезикулярных телец в синаптоплазме. Увеличение пиноцитоза и специфического эндоцитоза в синапсах происходит чаще всего в районе, примыкающем к клеткам глии, инкапсулирующим нервное окончание. Общая закономерность — снижение количества секреторных гранул в ходе экзоцитоза, более или менее эквивалентное увеличение количества одетых везикул в ходе последующего компенсаторного эндоцитоза. Компенсаторный эндоцитоз включает в себя образование одетых везикул и эндосом из мембранного материала «бывших» секреторных гранул, растворившихся везикул в плазмалемме (хотя и полного смешения мембран не происходит).
Увеличение эндоцитоза после периода синаптической активности наблюдается и в постсинаптической клетке. Нередко происходит внедрение пресинаптической части в постсинаптическую мембрану и наоборот (см. рис. 7, Б). Предполагают, что отмеченное явление играет важную роль в синаптогенезе. Эндоцитоз в нервной системе наблюдается главным образом между кон-
макромолекулами.макромолекулами.Рис. 10. Рециклизация синаптических пузырьков (феномен усиления эндо- цитоза после экзоцитоза):Рис. 10. Рециклизация синаптических пузырьков (феномен усиления эндо- цитоза после экзоцитоза):ЭС — эндосома (гладкая везикула); Ц — цистерны, вакуоли. Пре- и Пост-СМ — Пре- и постсинаптические мембраныЭС — эндосома (гладкая везикула); Ц — цистерны, вакуоли. Пре- и Пост-СМ — Пре- и постсинаптические мембраны
макромолекулами.
макромолекулами.
Рис. 10. Рециклизация синаптических пузырьков (феномен усиления эндо- цитоза после экзоцитоза):
Рис. 10. Рециклизация синаптических пузырьков (феномен усиления эндо- цитоза после экзоцитоза):
ЭС — эндосома (гладкая везикула); Ц — цистерны, вакуоли. Пре- и Пост-СМ — Пре- и постсинаптические мембраны
ЭС — эндосома (гладкая везикула); Ц — цистерны, вакуоли. Пре- и Пост-СМ — Пре- и постсинаптические мембраны
тактирующими нейронами, он обеспечивает взаимное проникновение мембранного материала и цитоплазмы нейронов. Обнаружено, что в аксо-дендритных синапсах нервные окончания аксона даже в норме фагоцитируют фрагменты мембран и цитоплазму постсинаптического дендрита, при этом поверхность синаптического контакта увеличивается (феномен образования спинул). Таким образом, в синапсах происходит не только секреция медиаторов, но и взаимный обмен информационными
Формирование постсинаптической мембраны в зоне синапсов может быть обусловлено трансцитозом в постсинаптической клетке в ходе «пробной» секреции медиаторов «зарождающихся» синапсов. Одетые везикулы и вакуоли из системы ГЭРЛ поступают из центра на периферию в область «будущего» контакта, поставляя туда необходимый материал. Недаром при синаптической активности в области постсинаптических мембран наблюдается множество вакуолей и цитоскелетных структур, а в клетке — пролиферация аппарата Гольджи.
Усиление эндоцитоза после
экзоцитоза, с одной стороны, компенсаторная, пластическая реакция клетки в ответ на повышенную функциональную нагрузку, с другой — это путь рециклизации мембран и секреторных гранул, которые далее могут формироваться из одетых везикул, гладких везикул и цистерн в синаптоплазме (рис. 10). Иммунологически показано, что клатрин отсутствует в мембранах синаптических пузырьков и в постсинаптических мембранах. Важно подчеркнуть, что описанный феномен преходящ: все вышеперечисленные показатели нормализуются, часть новообразованных структур постепенно исчезает, часть мембран плазмалеммы (в том числе и избыточная) возвращается в цитоплазму, нет не в районе экзоцитоза, а в другом участке плазмалеммы. Эффект длится от нескольких минут до 1 ч.
Если ввести меченую пероксидазу в область нервно-мышечных синапсов, то постепенно метка накапливается в терминалях, а при синаптической активности пиноцитоз пероксидазы усиливается. Метка далее постепенно «перекочевывает» из одетых везикул в крупные эндосомы (d=60—90 нм), вакуоли (d=250 нм) и синаптические пузырьки. Отмечено, что часть пероксидазы, попавшей в синаптические пузырьки вследствие их рециклизации.
в ходе дальнейшей синаптической активности секретируется Са- зависимым образом в синаптическую щель как спутник медиатора, пусть и «случайный». Например, синаптосомы «загружают» пероксидазой при калиевой деполяризации мембран нервных окончаний. После отмывки и смены раствора повторная К-депо- ляризация мембран синаптосом приводит к секреции пероксидазы в среду инкубации.
Показано, что в условиях чрезмерной секреции ацетилхолина из нервно-мышечных синапсов в присутствии латротоксина н пероксидазы последняя постепенно накапливалась в холинергических синаптических пузырьках, которые содержали сниженное количество медиатора. Более того, длительная (до 30 мнн) электростимуляция адренергических нервов приводит к резкому (до 60%) снижению мелких гранулярных синаптических пузырьков, в то время как содержание крупных гранулярных синаптических пузырьков, концентрирующих также катехоламины, но далеко отстоящих от района экзоцитоза, не изменяется. Через 2 ч уровень мелких синаптических пузырьков нормализуется. Если пероксидаза присутствовала в среде инкубации во время стимуляции, то большое число мелких гранулярных синаптических пузырьков содержало маркер после восстановительного периода. Отмечен также диффузный транспорт экзогенной пероксидазы в составе везикул при помощи обратного аксотока к аппарату Гольджи. Итак, часть материала, захваченного нервными окончаниями :：ходе синаптической активности, поступает в тело клетки, где происходит его трансформация.
Описанный феномен усиления эндоцитоза после экзоцитоза, сопровождающийся ярко выраженной рециклизацией мембран и секреторных гранул после увеличения поверхности плазмалеммы, в большей степени проявляется в нейронах и надпочечниках, т. е. здесь наблюдается последовательность процессов — экзоцитоз предшествует эндоцитозу и рециклизации. В некоторых железистых клетках (тучные клетки, околоушная и слезная железы) процессы экзоцитоза и рециклизации протекают достаточно синхронно и коррелируют друг с другом по скорости, в других клетках (поджелудочная железа, гипофиз) процессы экзоцитоза протекают гораздо выраженнее, чем рециклизация мембран на фоне небольшого увеличения площади плазмалеммы в ходе экзоцитоза.
Рециклизация секреторных гранул может протекать тремя способами. Первый способ — быстрое формирование секреторных гранул в последовательности: одетые зезикулы> эндосомы^цистерны^синаптические пузырьки (см. рис. 10). Этот путь, очевидно, осуществляется в синаптоплазме нейронов. Мембранн секреторных гранул в ходе экзоцитоза встраиваются в плазмалемму и затем используются в ходе рециклизацпи как плазмалеммы, так и самих секреторных гранул. Образующиеся цистерны в синаптоплазме весьма напоминают частицы CURL (см. разд. 2.4). Через 1—2 ч популяция синаптических пузырьков
восстанавливается, а мембранные цистерны, эндосомы исчезают,, количество одетых везикул снижается до минимума.
□асть исследователей подвергают сомнению этот путь новообразования синаптических пузырьков в синапсах. Действительно, если после охлаждения до 4℃ сетчатку глаза черепах снова нагревать до 22℃, то спустя 30—45 мин в синапсах отмечается накопление новых органелл — одетых везикул, вакуолей и цистерн, а спустя 60—90 мин эти органеллы исчезают и структура синапсов нормализуется. Если опыты проводить на фоне преинкубации с пероксидазой, то спустя 30——45 мин после сеанса охлаждение——нагревание сетчатки маркер содержался в вакуолях и цистернах, но не в синаптических пузырьках, а спустя 2 ч после исчезновения новообразованных органелл маркер обнаруживался в синаптических пузырьках.
Иногда рециклизация синаптических пузырьков (d七 40— 60 нм), проходя через стадию формирования одетых везикул 3^7。нм) и эндосом ®=100—150 нм), лучше всего проявляется после того, как срезы мозга переносят из калиевой среды деполяризации в обычную среду. При деполяризации нервномышечного синапса лягушек секреция ацетилхолина сопровождается утолщением пресинаптической мембраны; через 20 мин — новообразование лабильных короткоживущих одетых везикул, вакуолей и цистерн; через 60 мин — ультраструктура синапсов нормализуется.
Очень важно, что наблюдаемый процесс рециклизации синаптических пузырьков происходит и в децентрализованных терминалях, т. е. в условиях прекращения доставки в нервные окончания из тела нейронов новых синаптических пузырьков. При электростимуляции холинергических нервов электрического органа ската в терминалях появляются плотные синаптические пузырьки, у которых диаметр на 20—30% меньше, чем у обычных синаптических пузырьков в состоянии покоя. Плотные синаптические пузырьки при стимуляции захватывают частицы декстрана, добавленного ■ перфузат, что указывает на участие этих синаптических пузырьков в одном и более циклах экзо- и эндоцитоза. Эти новообразованные синаптические пузырьки метаболически активны и захватывают преимущественно вновь синтезированный медиатор — ацетилхолин.
В нервно-мышечных синапсах при умеренной пресинаптической стимуляции (2Гц, 4 ч) описан быстрый вариант рециклизации, при котором образуется очень мало одетых везикул. В этом случае сразу после слипания синаптических пузырьков с плазма- леммой без смешения мембран происходит последующее их разделение. Экзоцитоз уравновешивается протекающим эндоцито- зом без стадии новообразования одетых везикул рядом с районом экзоцитоза, в таком случае в ходе пресинаптической стимуляции не отмечается снижения количества синаптических пузырьков :〔терминалях и увеличения площади плазмалеммы.
Второй способ рециклизации — сравнительно быстрое форми-
рование новых секреторных гранул без трансформации в лизосомах. В этом случае усиленный эндоцитоз после экзоцитоза сопровождается образованием одетых везикул, эндосом, которые поступают в аппарат Гольджи, где они сливаются с мембранами и далее секреторные гранулы образуются здесь (см. рис. 3) и мигрируют к периферии ——к району экзоцитоза. Такой способ описан для гранул поджелудочной и околоушной желез.
Наконец третий способ — медленное формирование секреторных гранул в системе ГЭРЛ, т. е. при участии лизосом ной трансформации. В этом случае образовавшиеся эндосомы в ходе усиленного эндоцитоза после экзоцитоза поступают в лизосомы, сливаются с их мембранами, далее вторичные лизосомы и аппарат Гольджи участвуют в «новом» формировании популяции секреторных гранул. Эти способы хорошо демонстрируются в опытах с использованием специфических меток (пероксидаза, ферритин и др.). Второй и третий способы характерны и для нейронов.
Описанный в этом разделе феномен обнаружен и в тех секреторных клетках, которые путем экзоцитоза секретируют вещества постоянно. Это клетки, секретирующие коллаген и гликопротеины, макрофаги, секретирующие лизосомные ферменты, н клетки миеломы, секретирующие иммуноглобулины. В этом случае ускоренный пиноцитоз используется для доставки мембранного материала в аппарат Гольджи, где затем вновь формируются секреторные гранулы.
Факторы, стимулирующие компенсаторный эндоцитоз после экзоцитоза, пока неизвестны. Участки плазмалеммы, где происходит экзоцитоз и эндоцитоз, пространственно разобщены. Главное——повышенный уровень экзоцитоза, выражающийся в полном слиянии секреторных гранул с плазмалеммой и увеличении поверхности клеточной мембраны, спустя некоторое время индуцирует удаление избыточного мембранного материала путем эндоцитоза для постепенного восстановления плазмалеммы.
Процесс рециклизации синаптических пузырьков, видимо, зависит от ионов Са. а-Латротоксин (см. разд. 3,5) в безкальцие- вой среде вызывает в нервно-мышечном препарате лягушек в течение 45——60 мин массивный, асинхронный выброс ацетилхолина, при этом количество синаптических пузырьков снижается, терминали становятся набухшими, что указывает на отсутствие рециклизации синаптических пузырьков. В среде, содержащей ионы Са, а-латротоксин приводит к еще большему выбросу медиатора, чем в безкальциевой среде. Морфологические изменения в терминалях при этом отсутствуют, что указывает на сбалансированность экзо- и эндоцитоза, рециклизации синаптических пузырьков. В этих условиях добавление пероксидазы приводило к появлению этой метки в синаптических пузырьках.
ЭкзоцитозЭкзоцитоз3
Экзоцитоз
Экзоцитоз
Типы секреции веществ
Каждая клетка потенциально является или гормональной, или секреторной. Клетки секретируют вещества главным образом путем экзоцитоза, т. е. путем слипания и слияния с плазмалеммой везикул (гранул), содержащих секретируемые вещества в высокой концентрации. В результате везикулы сливаются с плазмалеммой, а во внеклеточную среду секретируются вещества (табл. 3).
Экзоцитоз содержимого без выброса самих секреторных гранул можно представить как обратный эндоцитоз. Клетки освобождаются от ненужных, токсических, непереваривающихся продуктов либо высвобождают вещества, необходимые сообществу клеток, различным клеткам-мишеням. Именно в последнем случае клетки называют секреторными.
Клетки могут секретировать вещества путем экзоцитоза, при этом секретируется только содержимое секреторных гранул. Это мерокриновый (основной) тип секреции, при этом клетка теряет небольшую часть своего общего содержимого. Редкий вариант такого рода секреции — секреция веществ вместе с гранулами, при этом секретируется сложная гранула с двойной мембраной (например, секреция карбоангидразы пищеварительными железами или секреция токсических, непереваривающихся веществ разными клетками). Опухолевые клетки способны секретировать во внеклеточную среду гибнущие лимфоидные нуклеосомы.
Некоторые клетки секретируют содержимое части безъядерной цитоплазмы, при этом фрагмент цитоплазмы, окруженный пл азмалем мой, дезинтегрируется в межклеточной среде, а продукты распада затем используются сообществом соседних клеток. Такая апокриновая секреция характерна для гепатоцитов^ секретирующих липиды; для молочных желез, секретирующих жировые капли; для фибробластов, секретирующих коллагеновые волокна; для клеток, секретирующих нуклеокапсулы из 60
Таблица 3. Экзоцитоз различных веществ
Объект
Секретируемые вещества из секреторных гранул
Внешний стимул секреции
Синапсы
Нейромедиаторы (ацетилхолин» биогенные амины, медиаторные аминокислоты» нейропептиды и др.)
Нервный импульс
Околоушная слюнная
а-Амилаза и Са2+,
Нервный импульс, нор-
железа
РНКаза, ДНКаза, перо ксидаза
адреналин (а2-АР, р-
АР)1, ацетилхолин (М- ХР), полипептид Р
Кора почек
Ренин
Гипотония
Ацинарные клетки под-
Проферменты: трипси-
Панкреозимин, нерв-
желудочной железы
ноген, химотрипсиноген, прокарбоксипептидазы А и В, проэластаза, зимо- ген фосфолипазы А; ферменты: липаза, РНКаза, ДНКаза, амилаза, ингибитор трипсина
ный импульс
Бокаловидные клетки сл изистой кишечн нка
Слизь, муцины (гликопротеины)
Непрерывно
Передняя доля гипофиза
Островки Лангерганса (поджелудочная желе- ва):
Рилизинг-факторы
Гормоны гипоталамуса
Р-клетки
Инсулин,С-пептид,
ZM+
Высокая концентрация глюкозы в плазме
а-клетки
Глюкагон
Низкая концентрации глюкозы в плазме
Плазматические клетки
Иммуноглобулины (антитела)
Непрерывно
Тучные клетки
Гистамин с гепарином, белками, Zn2+
С пециф ическиеа нт и*
гены
Делящиеся клетки
Пектиновые вещества, гемицеллюлоза
Индукторы деления
Желудочно - кишечный тракт
НС1
Гастрин
I АР — адренорецепторы,
ХР — холинорецепторы.
цитоплазмы после вирусной инфекции; так происходит отрыв： длинных псевдоподий от некоторых клеток. Наконец, встречается третий тип секреции ——голокриновый. В этом случае вся совокупность необратимо дегенерирующей клетки превращается в секрет и выводится наружу (например, эпидермис, сальные железы, слизь, сетчатая зона надпочечников). При такой секреции плазмалемма гиперполяризуется.
Пути выведения различных веществ даже в одной и той же клетке разнообразны. Молочные железы секретируют казеин,
фосфорилируемый в аппарате Гольджи, путем экзоцитоза; а жировые капли, содержащие триацилглицерин, при контакте с плазмалеммой обволакиваются ею и отрываются во внешнюю •среду. Пока неизвестно, как секретируются лактоза (сннтезнру- «мая в аппарате Гольджи) и а-лактоальбумин молочными :железами. Гепатоциты путем экзоцитоза секретируют альбумин, гликопротеины и липопротеины очень низкой плотности, но каким образом секретируется желчь, неясно, может быть, через особые канальцы.
Различают четыре системы гормональной секреции путем экзоцитоза. Первая система ——нейроэндокринная, это секреция гормонов типичными железистыми клетками. В этом случае гормоны через кровь и лимфу оказывают влияние на клетки- мишени на значительном расстоянии.
Вторая система — тканевая. Например, Т-лимфоциты в культуре ткани при действии антител или митогенов секретируют А КТ Г, соматотропин, пролактин. Жировая ткань секретирует женский половой гормон; сердечные мышцы и стенки крупных артерий — пептидный гормон, снижающий содержание Na+ в клетках, поддерживающий в норме артериальное давление; слюнные железы — эпидермальный фактор роста; печень — ин- <улиноподобные соматомедины, стимулирующие обмен в мышцах, хряще и жировой ткани; клетки мозга ——фактор роста фибробластов.
Третья система — аутокринная секреция гормонов, ускоряющая деление эмбриональных опухолевых клеток. Этот тип секреции встречается и в синапсах благодаря наличию пресинапти- ческих ауторецепторов, ослабляющих чрезмерную секрецию медиаторов или, наоборот, усиливающих секрецию.
Четвертая система — паракринная секреция веществ из клетки——для обеспечения функционирования небольшого числа соседних, «рабочих» клеток (эпителий кишечника, легкие, желудок). Нередко секрецию медиаторов нервными окончаниями, т. е. экзоцитоз медиаторов и синаптическую передачу информации, выделяют в особую систему секреции.
Механизмы экзоцитоза в целом одинаковы (см. разд. 3.5). Медиаторы в отличие от гормонов секретируются в высокоспециализированном районе экзоцитоза и действуют на клеткн-мн- тени на очень коротком расстоянии. Некоторые нейромедиаторы могут выполнять функции нейрогормона. Например, норадреналин, секретируемый нервными окончаниями (варикозами) гипоталамических адренергических нейронов, которые ничего не иннервируют, выступает как нейрогормон. В то же время норадреналин, секретируемый варикозами этого же нейрона, обеспечивающими иннервацию другого нейрона, выполняет функцию нейромедиатора. Вазопрессин как медиатор быстро {в течение нескольких миллисекунд) влияет на процесс синхронизации нейронов, а как гормон, секретируемый клетками задней доли гипофиза, медленно (в течение нескольких часов) при-
водит к увеличению артериального давления, т. е. сужению кровеносных сосудов, к увеличению реадсорбции воды в почках (проявляет свойства антидиуретика).
Свойства секреторных клеток
Секреторные клетки выделяют низкомолекулярные соединения (ацетилхолин, биогенные амины, аминокислоты, АТФ и др.), а также в большинстве случаев макромолекулы (пептиды, 6е〃кн> липопротеины, муцины и др.). Секреторные клетки обладают рядом особенностей. Секреция в большинстве случаев происходит в ответ на высокоспециализированный внешний стимул (нервный импульс, действие химических лигандов — гормонов, медиаторов и др.).
Как правило, секреторные клетки имеют асимметричное строение. В базальной части клеток расположена основная масса цистерн двух типов: ЭПР и аппарат Гольджи. Материал, предназначенный на «экспорт», синтезируется и далее хранится в особых везикулах — секреторных гранулах с мембранной оболочкой. Секретируемые молекулы, согласно сегрегационнной модели секреции, постоянно находятся в специализированных компартментах (секреторных гранулах), они изолированы от цитоплазмы. Бокаловидная форма апикальной части клеток объясняется слиянием части гранул между собой и их обводнением, что далее приводит к набуханию этой части клетки. Секреция в ответ на внешний стимул происходит в основном по типу экзоцитоза. Невезикулярная секреция в отличие от экзоцитоза может происходить путем диффузии веществ из цитоплазмы через плазмалемму во внеклеточное пространство (табл. 4).. Некоторые иммуноглобулины, NaCl (солевые железы морских во-
Таблниа 4. Везикулярная и невезикулярная секреция веществ
Исследуемые параметры
Везикулярная секреция
Невезикулярная секреция
Хранение веще-
В секреторных гранулах» в
В цитоплазме, в низ*
ства
высокой концентрации. Например, концентрация катехоламинов в хромаффинных гранулах надпочечников или в адренергических синаптические пузырьках, ацетилхолина в холинергических синаптических пузырьках электрического органа ската составляет 0,6— 0,8 М
кой концентрации. Например» концентрация катехоламинов или ацетилхолина в цитоплазме составляет <0,1 мМ
Тип секреции
Экзоцитоз, т. е. контакт гранул с внутренней поверхностью плазмалеммы, слияние мембран
Диффузия, пассивный транспорт
Район секреции
Высокоспециализированный, в апикальном конце клетки, в синапсах
В любом месте плаз- малеммы клеток
Продолжение табл. 4
Исследуемые параметры
Везикулярная секреция
Невезикулярная секреция
Зависимость от
Са2+
Да
Нет
Внутриклеточные
Са?+, Mg-АТФ, кальмодулин,
Блокаторывезику-
индукторы
цАМФ
лярного захвата, например резерпин для катехоламинов
Запуск
Внешний стимул, сопряжение «стимул — секреция», «деполяризация —секреция»
В ответ на чрезмерное накопление в цитоплазме свободных секретируемых веществ
Чувствительность к цитостатикам
Да
Нет
Функция
Физиологическая секреция, основной фонд секреции
Секреция при экстре* мальных ситуациях, в состоянии покоя, побочный и малый фонд се-
Дискретность
Дискретная, квантовая, син-
креции
Непрерывная, некван-
ял и непрерывность
хронизированная секреция из
товая, постоянная утеч-
секреции
многих гранул
ка из цитоплазмы
доплавающих птиц), коллаген могут секретироваться отличным •от экзоцитоза способом.
Секреторные клетки имеют хорошо развитую сеть ЭПР с системой полисом — рибосом и хорошо развитый аппарат Гольджи с толстыми мембранами, имеющими диаметр 7—8 нм. Существует общий механизм образования, хранения и экзоцитоза секретируемого материала. Синтез белковых секретируемых макромолекул протекает в гранулярном ЭПР, затем материал поступает через мембраны в ЭПР, затем в агранулярный ЭПР и далее в цистерны аппарата Гольджи, в котором происходит посттрансляционная модификация белков, формирование секреторных гранул. После некоторого периода «созревания» гранул (максимальная упаковка содержимого) они сосредоточиваются возле будущего района экзоцитоза, т. е. недалеко от плазмалем- мы. Например, в клетках поджелудочной железы синтезируется около 90% белков, которые затем секретируются клеткой (рис. 11),
Процесс секреции состоит из цикла сменяющих друг друга конвейерных процессов, которые при мерокриновой секреции чаще всего накладываются друг на друга. Синтез секретируемого белка в клетке происходит с постоянной скоростью почти на всех стадиях секреторного цикла. После стадии экзоцитоза пептидных гормонов железистыми клетками (стадия экструзии) может происходить, хотя и с низкой эффективностью, диффузия новь синтезированных пептидов, не успевших «попасть» в 64
микровезикулы и гранулыл Лиганды, блокирующие экзоцитоз.
рецепторов и обратнаяГа Часы-суткирецепторов и обратнаяГа Часы-суткикак правило, вызывают через систему клеточных торможение синтеза белка в клетке; справедлива
рецепторов и обратная
Г
а Часы-сутки
рецепторов и обратная
Г
а Часы-сутки
зависимость:стимул-> 「
—^усиление экзоцитоза-»- >^иин
*33-120 тн*33-120 тн23 мин10-20 мин23 мин10-20 минРис. 11. Секреторный цикл в клетках поджелудочной железы:Рис. 11. Секреторный цикл в клетках поджелудочной железы:—^-активация синтеза пептидных гормонов. Из всех стадий секреторного цикла лишь стадия экзоцито- ""”
*33-120 тн
*33-120 тн
23 мин
10-20 мин
23 мин
10-20 мин
Рис. 11. Секреторный цикл в клетках поджелудочной железы:
Рис. 11. Секреторный цикл в клетках поджелудочной железы:
за протекает периодически, обусловленная как экзогенными стимулами, так и эндогенными рит-20-чОпин мамн созревания секреторных гранул.3-5 мин
стоит из следующих стадий: синтез, сегрегация белка в ЭПР, внутриклеточный везикулярный транспорт, концентрирование, созревание секреторных гранул, экзоцитоз, рециклизация мембран и гранул. Экзоцитоз протекает различно в клетках со спонтанной и постоян-стоит из следующих стадий: синтез, сегрегация белка в ЭПР, внутриклеточный везикулярный транспорт, концентрирование, созревание секреторных гранул, экзоцитоз, рециклизация мембран и гранул. Экзоцитоз протекает различно в клетках со спонтанной и постоян-—Секреторный цикл со-
стоит из следующих стадий: синтез, сегрегация белка в ЭПР, внутриклеточный везикулярный транспорт, концентрирование, созревание секреторных гранул, экзоцитоз, рециклизация мембран и гранул. Экзоцитоз протекает различно в клетках со спонтанной и постоян-
стоит из следующих стадий: синтез, сегрегация белка в ЭПР, внутриклеточный везикулярный транспорт, концентрирование, созревание секреторных гранул, экзоцитоз, рециклизация мембран и гранул. Экзоцитоз протекает различно в клетках со спонтанной и постоян-
/—гранулярный ЭПР (синтез белка и его накопление в цистернах ЭПР); 2 — микропузырьки, образованные из ЭПР (энергозависимый и ци- тоскелетзависимый процесс); 3 ——аппарат Гольджи (накопление и трансформация белка, формирование секреторных гранул, СГ); 4 — несозревшие СГ; 5 — созревание СГ, возможное слия* ние с лизосонами. образование конденсирующих вакуолей; 6 — созревшие СГ； 7 — экзоцитоз;
/ ——временная последовательность обмена зимогенных гранул, содержащих пищеварительные ферменты, ацинарных клеток; // — то же для обмена инсулиновых СГ в 3-клетках; стрелками указана временная последовательность процессов
ной секрецией и в клетках с регулируемой внешниминой секрецией и в клетках с регулируемой внешнимипосле введения меченых аминокислот в клетки (сам акт секреции совершается за очень короткий период времени ^1 мс)
ной секрецией и в клетках с регулируемой внешними
ной секрецией и в клетках с регулируемой внешними
стимулами секреций
(табл. 5). В некоторых клетках оба пути секреции могут сосу
ществовать.
Секреторные гранулы происходят из цистерн аппарата Гольджи (см. рис. 3). В случае нейронов образовавшиеся синаптические пузырьки далее транспортируются с быстрым аксотоком из тела клетки по аксону в область нервных окончаний, где происходит синтез медиаторов, везикулярный захват медиаторов мз синаптоплазмы и их упаковка в синаптические пузырьки. Все секреторные гранулы имеют уникальный биохимический состав. Они содержат медиаторы или гормоны в очень высокой концентрации (см. табл. 4). В эндокринных клетках концентрация пептидных гормонов в гранулах в 200 раз выше, чем в цистернах
аппарата Гольджи; в экзокринных клетках это соотношение равно 9. Секреторные гранулы имеют необычно высокое соотношение липид/белок, равное 5: 1. На внутренней поверхности мембран гранул нередко локализованы гликолипиды; мембраны богаты холестерином, сфингомиелином. Во всех случаях показана идентичность содержимого гранул и секретируемых из клетки веществ.
Таблица 5. Постоянная и стнмулрегулируемая секреция по типу вкзоцитоза
Исследуемые параметры
Постоянная секреция
Стнмулрегулируемая секреция
Асимметричные, поляризованные клетки
Гепатоциты, миоциты
Нейроны, эндокринные и экзокринные клет* ки, сперматоциты
Нейтрофилы, лаброци-
Округлые, неполяризо-
Фибробласты, хондро-
ванные клетки
циты, макрофаги, В-лим- фоциты, дрожжи
ты, базофилы, тромбонн- ты, яйцеклетки
Много гранул; они содержат много секретн- руемых веществ; T50N 》10 ч
Секреторные гранулы
Мало гранул; они содержат мало секретируемых веществ; T50Q 右 10 мин
Время транспорта от системы ГЭРЛ до плаз- “алеммн
Быстрое, несколько минут
Медленное
Чувств ительн ость к
Са2+
Нет доказательств
Да (стимуляция)
Чувствительность к ацидотропным веществам
Нет
Да (торможение}
Роль цитоскелета в транспорте гранул к району экзоцитоза
Минимальная
Максимальная
Специализация района экзоцитоза
Нет (?)
Да
Важным обстоятельством является установление принципиального факта: секреторные гранулы содержат целый набор секретируемых веществ, так называемых спутников секреции (табл. 6). В связи с этим возможность передачи информации от клетки к клетке резко возрастает. Нередко спутники локализованы в особых популяциях секреторных гранул одного и того же нервного окончания. Эти границы отличны от тех гранул, в которых локализован лишь классический медиатор с ограниченным количеством спутников; они, как правило, больше по размерам и расположены дальше от района экзоцитоза, чем вышеописанные вторые. Это как бы запасные гранулы. Например, в нервных окончаниях нисходящих путей спинного мозга серотонин выявляется в синаптических пузырьках небольших размеров, а его спутники — полипептид 尸 и тиролиберии — в больших везикулах. Предполагают, что в обычных условиях мотонейроны секретируют главным образом серотонин, а при избыточной пресинаптической стимуляции наряду с серотонином секретируются спутники из больших синаптических пузырьков, которые модифицируют как пре-, так и постсинаптические эффекты серотонина, в данном случае усиливая эффект серотонина. Интересен следующий факт: избыточная секреция серотонина самовыключается благодаря наличию в пресинаптических мембранах серотониновых ауторецепторов, если же из серотонинергических нервных окончаний секретируется также и полипептид 66
Таблица 6. Экзоцитоз спутников секреции «лассических медиаторов (и гормонов)
Объект
Классические медиаторы
Спутники
Хромаффинные клетки надпочечников, адренергические нервы
Катехоламины
АТФ, хромогранин, до- фамин-р-гидроксилаза, мет-энкефалин
Холинергические нейроны нервно-мышечных синапсов
Ацетилхолин
АТФ, неидентифициро- ванные белки
Продолговатый мозг
Серотонин
Нейротензин, полипептид Р тиролиберин, энкефалины
Кора головного мозга, холинергические нейроны, иннервирующие слюнные железы
Ацетилхолин
Вазоактивный кишечный пептид
Таламус мозга
Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК)
Соматостатин
Адренергические нейлоны, иннервирующие •слюнную железу
Норадреналин
Нейропептид У
Стриатум мозга
Дофамин
Холецистокинин
Преганглионарные холинергические нервы
Ацетилхолин
Энкефалины
Симпатический ганглии
Норадреналин
Соматостатин, гомо* лог панкреатического пептида
Нейроны подслизистого сплетения
Норадреналин
Соматостатин, холецистокинин
Постганглионарные «летки
Норадреналин
Полипептид Р, соматостатин, мет-энкефалин
Р, то он отключает такого рода отрицательную обратную связь.
Хромаффинные гранулы надпочечников содержат помимо катехоламинов (0,6—0,8 М) также спутники секреции — АТФ {180 мМ), мет-энкефалины, хромогранин, растворимую дофа- мин-р-гидроксилазу, а также содержат ионы Са (18 мМ), Mg (5 м51), С1~ (18—40 мМ), аскорбат (24 мМ). Катехоламины упакованы в матриксе гранул в форме тройного комплекса с АТФ и хромогранином (кислым белком-димером, 80 кД). Мембраны гранул содержат системы Na/Ca-обмена и АТФ/АДФ-об- мена. Матрикс гранул имеет pH 5,0—5,3. На внешней поверхности гранул происходит гидролиз АТФ при помощи особой Н-АТФазы немитохондриального типа, сопряженной с АТФ-ин- дуцированным активным захватом катехоламинов из цитоплазмы (везикулярный захват). Н-Насос и сопряженный с ним Cl-канал локализованы в мембранах синаптических пузырьков мозга. Этот насос регулирует везикулярный захват медиаторов или гормонов, их аккумуляцию в везикулах, а также, возможно, участвует и в регуляции экзоцитоза.
Сигнальная гипотеза
Согласно сигнальной гипотезе (1971), необходимая информация о секреции белковых макромолекул находится в молекуле матричной РНК, содержащей сразу вслед за инициирующим кодоном несколько (30—40) триплетов, кодирующих сигнальную (лидерную) аминокислотную последовательность белка. Это своеобразный опознавательный знак белка. Новообразованные полипептидные цепи секретируемых белков, лизосомных ферментов и некоторых интегральных мембранных белков содержат на N-конце сигнальный пептид. Как известно, для многих таких пептидов характерна высокая гидрофобность и наличие 1—2 положительных зарядов на N-конце пептида, т. е. гидрофобному участку предшествует основная аминокислота. Все это облегчает взаимодействие с полярными группами фосфолипидов и прохождение через гидрофобный слой мембран ЭПР.
Синтез белка происходит на свободных рибосомах до тех пор, пока сигнальная последовательность, участвующая в прикреплении рибосом к мембранам ЭПР, не вышла из рибосомы. После этого рибосомы прикрепляются к мембране и синтез белка продолжается. Сигнальный пептид, вероятно, удерживает, как якорь, рибосому и новообразованную пептидную цепь на мембране, его вторая функция — сигнал для транслокации пептидной цепи через мембрану внутрь цистерн ЭПР. Сигнальный пептид не способен связываться с мембранами после того как уже синтезировалась длинная цепь белка, вероятно, из-за того, что при скручивании растущей цепи экранируется участок цепи, служащий для узнавания мембраны. Еще до окончания синтеза белка сигнальный пептид отщепляется с помощью фермента сигналазы (пептидазы), находящегося на внутренней поверхности мембран ЭПР. После окончания синтеза белка рибосомы отделяются от мембран и начинается новый цикл.
Сигнальные пептиды обнаружены во многих секретируемых белках различных клеток. Так, кишечные бактерии типа E.coli секретируют в периплазму животных клеток щелочную фосфатазу. Этот фермент существует в бактериальной клетке в виде предшественника, от которого ассоциированная с мембраной протеиназа отщепляет сигнальную последовательность, после чего фермент секретируется в периплазму.
В 1982 г. было установлено, что рибосомы связываются с гранулярным ЭПР лишь в том случае, если между ними и мембранами оказываются последовательно встроенными два белка: белок SRP, распознающий сигнальный участок синтезируемого белка (250 кД), и белок, рецептирующий сигнальный участок с мембраной (72 кД). Белок SRP—РНК-протеин; состоит из 6 субъединиц; при нахождении в цитоплазме вызывает блок трансляции. Этот белок связывается с рибосомами, в которых начался синтез секретируемого белка, и приостанавливает его до тех пор, пока комплекс SRP — большая субъединица рибо- 68
сом не приблизится к рецепторному белку мембраны. В этом случае сигнальный участок узнает центр связывания и «ааяко- ривается» на мембране. Синтез секреторного белка начинается, на свободных рибосомах еще до их контакта с мембранами：- После того как на свободной рибосоме образовался пептид из* 70—80 аминокислотных остатков, имеющих сигнальную последовательность, синтез приостанавливается с помощью SRP. 40 аминокислотных остатков находится при этом внутри рибосомы, а сигнальный участок выходит из большой субъединицы рибосомы. Если SRP нет, то трансляция не прекращается и белок, появившись в цитоплазме, может быть даже опасным дл5Г клетки, если это лизосомный фермент. Сигналаза отщепляет' сигнальный пептид раньше, чем закончилась трансляция, но не ранее, чем возникла последовате; ьность из 70—80 аминокислотных остатков. «Запрет» трансляции сохраняется до тех пор, пока не наступит контакт с рецепторным белком мембраны 5ПР， (72 кД). Затем трансляция возобновляется, при этом она соче> тается с транслокацией полипептидной цепи через мембрану..
Предполагают, что секреторные гранулы могут формироваться и на стадии везикуляризации мембран гладкого ЭПР с последующим транспортом мелких, транзитных везикул к аппарату Гольджи и слиянием этих везикул с цистернами аппарата Голь^ джи. Мелкие везикулы совершают челночные рейсы от ЭПР к аппарату Гольджи и обратно (опустошаются и возвращаются за новой порцией секреторного материала). Так же вероятен транспорт вновь синтезируемых белков по особым каналам, соединяющим ЭПР и аппарат Гольджи. Надо признать, что оиа механизма равновероятны, и ни один из них экспериментальна не обоснован. Затем процесс протекает так: везикуляризация мембран цистерн аппарата Гольджи — слипание мелких везикул в вакуоли, преобразование вакуолей в протосекреторные («зимогенные») гранулы, которые по пути к району экзоцитоза„ т. е. к апикальной части клеток, «созревают» (см. рис. 11).
Большинство секретируемых белков синтезируется в форм佳 предшественников с большой молекулярной массой (напрнмер*. препроинсулин 七 11,5кД). Эти предшественники секретируемых белков, белков-гормонов претерпевают ограниченный про、 теолиз уже при везикуляризации мембран аппарата Гольджи и особенно эффективно в ходе «созревания», конденсации секреторных гранул, т. е. при слиянии первичных везикул с лизосомами. Другими словами, «зрелые» секреторные гранулы, по сути дела, специфические вторичные лизосомы, содержащие большой спектр лизосомных ферментов, главным образом, кислые протеиназы.
Вновь синтезированный прогормон в цистернах ЭПР и аппарата Гольджи претерпевает следующие посттрансляционные модификации: удаление сигнального пептида, ферментативное присоединение к N-концу гетеросахаридных цепей и образование дисульфидных мостиков, последующий ограниченный протеолиз.
Последние три процесса протекают в различных компартментах системы ГЭРЛ.
Рассмотрение сигнальной гипотезы приводит к интересным обобщениям, касающимся эволюции процессов секреции. Прн- :мнтнвная клетка не имела органелл, а мембрана состояла лишь из липидного бислоя. Вновь синтезированные белки с гидрофобными участками постепенно встраивались N-концом в мембрану, оставаясь соединенными с рибосомами, при этом внутри мембраны задерживалась гидрофобная часть молекулы пептида. В ходе эволюции рибосомы более часто контактировали с мембранами и все более «засоряли» мембрану пептидами, часть из них оказывалась и снаружи мембраны.
Важным этапом эволюции мембран было отщепление сигнального участка пептидной цепи, в результате чего мембрана приобрела липопротеиновые комплексы. Дальнейшая эволюция секреции и транспортного механизма была связана с появлением углублений плазмалеммы, что создавало условия для посттрансляционных модификаций и конденсации секреторного материала. Вокруг углублений рибосомы располагались более густо. Инвагинации замыкались и обособлялись от плазмалеммы, образовывался примитивный ЭПР, а каналы связи ЭПР с плазмалеммой преобразовывались в аппарат Гольджи и лизосомы —возникновение системы ГЭРЛ. i
На высших ступенях эволюции первоначальный способ цитозольной секреции — путем транспорта через клеточную мембрану —перестал быть основным способом секреции, так как возник экзоцитозный секреторный цикл. Спонтанная периодичность секреторной активности, а также вызванная периодичность экзоцитоза являются проявлением экономной формы жизнедеятельности клеток. Секреция «полезных», биологически ак- тигных веществ возникла из неспецифической экскреции, которая существовала на ранних стадиях эволюции клеток как элемент обмена веществ между клеткой и средой, как удаление из клетки ненужных, вредных продуктов метаболизма.
Секреция ферментов и белков
Клетки некоторых типов (особенно, лейкоциты и макрофаги) способны секретировать по типу экзоцитоза лизосомные ферменты (см. рис. 4, 6), причем у макрофагов этот процесс длителен и может перейти в патологическую реакцию (при воспалении). Секреция лизосомных ферментов объясняется разными причинами; она может быть сопряжена с фагоцитозом, например первичные лизосомы слипаются с плазмалеммой, или с фагосомой, которая еще не отделилась от плазмалеммы (особенно это характерно для «незавершенного» фагоцитоза). Накопление в клетке плохо перевариваемого фагоцитированного вещества мо- *ет стимулировать высвобождение нейтральных протеиназ из гранул нелизосомного происхождения. Секреция ферментов мо- 70
жет индуцироваться лигандрецепторным взаимодействием, при этом одновременный эндоцитоз лиганда не обязателен.
Секреция лизосомных ферментов не является исключительным свойством специализированных фагоцитирующих клеток^ Например, данная секреция в ответ на гормональные стимулып наблюдается при резорбции кости, при накоплении сахарозы в лизосомах клеток хряща или при стимуляции этих клеток витамином А. Секретируемые ферменты могут сорбироваться в слое гликокаликса. В зоне щеточной каемки кишечного эпителия млекопитающих (а эта зона богата гликокаликсом) обнаруживается масса различных ферментов собственного и панкреатического происхождения, необходимых для внеклеточного пищеварения. Опухолевые клетки секретируют лизосомные ферменты, которые устраняют межклеточные контакты, например, щелевидные контакты. Таким образом, раковое клетки в тканях высших организмов расчищают себе путь благодаря секреции лизосомных ферментов.
Сложным путем происходит секреция сывороточных бел^шв печени. Проальбумин синтезируется в гранулярном ЭПР, транспортируется в агранулярный ЭПР, затем в аппарат Гольджи и далее запасается в пресекреторных гранулах (пре-СГ). Последние сливаются со специализированными первичными лизосомами с образованием секреторных гранул, в которых происходит ограниченный протеолиз и образование альбумина. В итоге секреторная гранула слипается с плазмалеммой и путем экзоцитоза белок секретируется во внеклеточную среду. Протеиназы остаются в связанном виде с плазмалеммой и в дальнейшем могут вновь попасть в клетку в ходе эндоцитоза. Таким путем секретируются многие полипептидные гормоны и медиаторы, образование которых в клетке связано с ограниченным протеолизом, например инсулин, ангиотензин, глюкагон, гастрин, энкефалины и др.
Макрофаги являются полисекреторными клетками: в зависимости от условий секретируют различные вещества. Они секретируют лизосомные гидролазы при действии иммунолигандов； и других индукторов фагоцитоза, активатор плазминогена при действии тиогликолата, коллагеназу и пироген при действии эндотоксина, лизоцим, простагландины при действии иммунолигандов. Макрофаги постоянно секретируют лизоцим, секретируют также компонентЬ! комплемента и аг-макроглобул ин, причем природа стимулов неизвестна.
Фибробласты при стимуляции секретируют нейтральные протеиназы. Секреция двух типов гидролаз (кислых и нейтральных) инициирует разнообразные каскадные процессы в крови. В этом разделе еще раз уместно отметить, что эндоцитоз и экзоцитоз —— взаиморегулируемые н взаимосвязанные процессы. Иногда эн- доцитозу предшествует экзоцитоз ферментов, Например, в состав соединительной ткани входит коллаген — волокнистая, полимерная структура. Секретируемая коллагеназа сначала рас-
тцепляет интактные фибриллы, а образованные отдельные макромолекулы подвергаются эндоцитозу.
Процесс стимуляции секреции лизосомных ферментов может саморегулироваться в течение определенного времени. Некоторые из активных компонентов каскадной системы комплемента являются индукторами секреции лизосомных ферментов из мак- -рофагов и нейтрофилов.
Макрофаги и фибробласты в очагах воспаления секретируют комплемент СЗ н нейтральные протеиназы, которые расщепляют СЗ до СЗЬ, последний, в свою очередь, усиливает секрецию комплемента СЗ и лизосомных ферментов. Таким образом поддерживается непрерывное высвобождение ферментов. Иной спо- .соб секреции лизосомных ферментов фагоцитами предполагают iB случае гибели опухолевых клеток «неиммунологическим путем». При этом допускают, что лизосомные ферменты не секретируются в среду, а прямо высвобождаются в цитоплазму клеток-мишеней. Таким же способом лимфоциты «убивают» клетки.
Экзоцитоз лизосомных ферментов в различных клетках индуцируется эндоцитозом. Другими словами, наряду с феноменом усиленного эндоцитоза после экзоцитоза (см. разд. 2.6) существует и феномен усиленного экзоцитоза после эндоцитоза. Снижение эндоцитоза в лейкоцитах при помощи увеличения уровня дГМФ или торможения выхода Са2+ из клетки приводит к снижению секреции лизосомных ферментов из этих клеток. ।
Своеобразен механизм секреции тиреоидного гормона. Сначала гормон в коллоидной форме в комплексе с крупным белком (тиреоглобулин) высвобождается в просвет фолликула щитовидной железы. Далее под влиянием тиреотропного гормона происходит быстрый эндоцитоз тиреоглобулина эпителиальными клеткамн. После слияния эндосом с первичными лизосомами с помощью ограниченного протеолиза образуется ннзкомолекуляр- мый гормон тироксин, который диффундирует из вторичной лизосомы и далее путем диффузии проникает в ближайший крове- иосный капилляр.
Экзоцитоз важен в процессе оплодотворения клеток. Сперматозоиды содержат особые секреторные гранулы — акросомы. Они располагаются над ядром в переднем конце сперматозоида в ожидании контакта с оболочками яйца. В момент оплодотворения акросома сливается с плазмалеммой сперматозоида, при этом секретируются пищеварительные ферменты, которые разрушают оболочки яйцеклетки, помогая сперматозоиду добраться до плазмалеммы яйцеклетки.
Экзоцитоз необходим для внеклеточного пищеварения. Так, гетеротрофные бактерии и грибы секретируют пищеварительные ферменты в окружающую примембранную среду и затем усваивают продукты распада. Это свойство дрожжей используется в биотехнологии. Клетки «научили» синтезировать гормон роста человека. В одной серии опытов использовали лидерную последовательность самого человеческого гормона, в другой — «мест- •72
ную» лидерную последовательность аминокислот, присущую。斤 ному из секретируемых белков дрожжевой клетки. Оказалось, что «местный» лидер лучше секретирует человеческий гормон в клетках дрожжей.
Механизмы экзоцитоза
Экзоцитоз медиаторов нервными окончаниями и гормонов же лезистыми клетками наиболее изучен. Процесс этот многостадиен. Первый этап—сопряжение деполяризации и секреции. Со прягающим фактором является накопление с ободных явим Са с 10-7—IO— до ^ 10-6 М при возбуждении клеток. Дополнительными факторами сопряжения могут быть обратимая инактивация электрогенного Na, К-насоса плазмалеммы и активация системы цАМФ, точнее, цАМФ-зависимого фосфорилирования субстратов, участ ующих в реализации на определенных стадиях процесса секреции.
Многочисленные морфологические исследования обнаружили существенные изменения ультраструктуры синапсов при интенсивной пресинаптической стимуляции наряду с Са-зависимой секрецией медиаторов. Обнаружено просветление гранулярных синаптических пузырьков; скопление их близ пресинаптической мембраны; частичная агрегация и увеличение ассоциации синаптических пузырьков вблизи активной зоны синапсов; снижение количества синаптических пузырьков н уменьшение их диаметра (сморщивание); увеличение размеров терминалей (набухание нервных окончаний); увеличение размеров активной зоны пре- синаптической мембраны (увеличение площади контакта); увеличение количества асимметричных синапсов, т. е. увеличение7 утолщений постсинаптических мембран; нередкий контакт с пресинаптической мембраной сдвоенных синаптических пузырьков: когда первая слипшаяся езикула является триггером для последующего слипания с ней другой везикулы и именно после этого инициируется слипание «двойной» везикулы («восьмерки») с плазмалеммой; увеличение числа экзоцитозных синаптических пузырьков, т. е. структур типа《омега»; появление округлых вдавливаний в пресинаптической мембране (пунктов слияния); перемещение митохондрий к району секреции; образование глубоких складок в участках аксолеммы между активными зонами синапсов; формирование зоны состыковки, т. е. увеличение конических выступов с кратероподобными отверстиями на, вершине. Все вышеописанные изменения обратимы.
При деполяризации мембран нейронов или железистых кле ток открываются в течение миллисекунд ионные каналы. Сначала открываются Na-каналы, по которым в клетки, в основном в нервные окончания, может входить некоторое количество ионов Са. Последние не инициируют в цитоплазме секреторный процесс, но могут индуцировать изнутри дополнительное открытие собственных Са-каналов. Затем открываются Са-каналы, по ко-
торым в цитоплазму поступает основное количество ионов Са, их накопление до определенного предела индуцирует, запускает секреторный процесс. В последнюю очередь открываются потенциалзависимые К-каналы, выход ионов К по которым само- останавлнвает процесс деполяризации, способствует реполяризации мембран. При возбуждении клеток промежуточной доли гипофиза Са2+ поступает внутрь в основном через Na-канал, а при возбуждении клеток передней доли гипофиза, опухолевых кл£ток ионы Са поступают внутрь исключительно через Са-ка- вал.
Известен ряд веществ, которые специфически блокируют или открывают ионные каналы и тем самым влияют на процесс эк- зоцитоза (табл. 7).
Таблица 7. Ингибиторы и активаторы ионных каналов
Тип канала
Ингибиторы
Активаторы
Потенциалзависимый
Извне: тетродотоксин
Извне: вератридин, ба*
Na-канал
(10-8—10一7 М)» сакситоксин, анестетики
трахотоксин, аконитищ граянотоксин
Извне (модификация воротного устройства): пептидные яды скорпиона, актиний
Изнутри: Са-кальмо- дулинзависимое фосфорилирование
Потенциалзависимый
Извне: ионы Mg (15—
Извне: 1,4-дегидроп и-
Са-канал
20 мМ), Cd (0,1—
ридины(Вау 山8644,
1,0 мМ), верапамил, ни-
CGP 28392)
федипин,фелодипин,
Изнутри: цАМФ-зави-
риоцидил, дилтиазем, анестетики. В бескальциевой среде трансформация в Na-канал
Изнутри: избыток Са2+
симое фосфорилирование
■ Потенциалзависимый К-канал (быстро инактивирующийся)
Извне: тетраэтилам- моний (5 мМ); 1,4-Ди- аминопиридин (<0,1 мМ)
Потенциалзависимый К-канап (медленно инактивирующийся)
Извне: фенциклидин
Изнутри: альдостерон
Потенциалнеза в исимый вход Na+ (может быть, Ма/Н-обмен)
Извне: амилорид (0,1 мМ); 2, 4, 6・трн・ аминопиридин, тетра- зтнламмонн£ 4-амино- пиридин
Са-нндуцируемый К-
Извне: апамин, хинин.
Извне: 4-аминопири-
^канал
тетраэтиламмоний
дин
Изнутри: Са?+, возможно Са-кальмодулин- зависимое фосфорилирование
Инактивация Na, К-АТФазы плазмалеммьг при возбуждении приводит к снижению трансмембранного потенциала, а значит, к триггерному эффекту: к еще большему открытию ионных каналов или к удлинению временных сроков «открытого» состояния ионных каналов, к увеличению входа ионов Са и к запуску процесса экзоцитоза. Многочисленными опытами установлено, что уабаин — блокатор Na, К-насоса — индуцирует секрецию различных медиаторов и гормонов. Инактивация Na, К-АТФазы при возбуждении может происходить либо вследствие структурных перестроек, фазовых переходов в мембранах, либо путем воздействия изнутри на плазмалемму внутриклеточных регуляторных систем (цАМФ, ионы Са — кальмодулин и др.), «включающихся» на ранних этапах процесса возбуждения, деполяризации мембран.
Многочисленными опытами доказана исключительная зависимость экзоцитоза от ионов Са во внешней среде. Удаление Са?+ из среды или добавление в среду Са-комплексона — ЭГТА или ингибиторов Са-каналов (см. табл. 7) приводит к резкому торможению или практически полному прекращению Са- зависимой секреции медиаторов нервными окончаниями и гормонов железистыми клетками. Ионофоретическое введение Са?+ в гигантский аксон кальмара в концентрации 1—10 мкМ при отсутствии деполяризующих воздействий индуцирует процесс секреции ацетилхолина путем экзоцитоза. Электрофизиологический анализ секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах показал, что в состоянии покоя (без деполяризации мембран) также происходит Са-зависимая секреция медиатора путем экзоцитоза, а секретируемый ацетилхолин генерирует в постсинаптической мембране мышц так называемый миниатюрный потенциал. В этом случае экзоцитоз индуцируется случайным (по типу броуновского столкновения частиц) контактом синаптических пузырьков с пресинаптической мембраной, а кроме того, и достаточно «закономерным» контактом, индуцируемым локальным накоплением Са?+ в примембранной области за счет постоянного, хотя и небольшого входа Са2+ в клетку из внешней среды, и локального высвобождения Са2+ из внутриклеточных депо хранения.
При стимуляции клеток химическими агентами (медиаторы; гормоны), т. е. при взаимодействии лиганда с рецепторами могут открываться химически возбудимые Са-каналы, которые далее способствуют накоплению ионов Са в клетке и запуску секреторного процесса. Указанные Са-каналы контролируются циклом фосфатидной кислоты в мембране. При лигандрецепторном взаимодействии активируется обмен фосфоинозитидов плазма- леммы, при этом образующаяся фосфатидная кислота может выступать в роли Са-ионофора.
Может ли быть достаточным фактором индукции секреторного процесса лишь накопление Са2+ в клетке при возбуждении? Исследования последних лет указывают, что этого условия не-
'достаточно для запуска экзоцитоза. Уже ранние исследования •€0—70-х годов указывали на биохимическую основу многостадийного секреторного процесса: зависимость от температуры, биоэнергетических процессов. Главным достижением этой серии работ явилось строгое доказательство необходимости еще одного индуктора экзоцитоза помимо микромолярных концентраций Са2+ — миллимолярных концентраций Mg-АТФ. Блокаторы окислительного фосфорилирования, ингибиторы гликолиза и дыхания прекращают экзоцитоз во многих клетках.
Ясно, что необходимость Mg-АТФ для многих стадий экзоци- тоза диктуется двумя обстоятельовами: либо тратой Mg-АТФ как субстрата некоей АТ Фазы, либо тратой Mg-АТФ как косуб- •страта протеинкиназы, фосфорилирующей определенные белки и ферменты в цепи стадии экзоцитоза. Данная трата АТФ после возбуждения нервных окончаний восполняется компенсаторной реакцией — значительным усилением дыхания, окислительного фосфорилирования и гликолиза. Таким образом, процесс деполяризации мембран терминалей наряду с тратой АТФ на экзо- дитоз синхронно включает и компенсаторный процесс — синтез АТФ в митохондриях и цитоплазме за счет гликолиза.
Более подробный анализ работ последних лет указывает на то, что химическими индукторами экзоцитоза являются ионы <а, Mg-АТФ, кальмодулин и цАМФ. Интересные опыты проведены с изолированными клетками мозгового слоя надпочечников. При помощи краткосрочной электростимуляции суспензии ■или краткосрочной обработки клеток детергентами в низкой •концентрации (сапонин, дигитонин) осуществляли «электрический» или «химический»- пробой мембран, т. е. создавали в мембранах «поры», благодаря которым можно регулировать внутриклеточный состав и регулировать экзоцитоз катехоламиног и их спутников секреции. Данный пробой мембран не повреждал аппарат секреции, не опустошал хромаффинные гранулы, но способствовал цитоплазматической утечке содержимого клеток во внешнюю среду (например, лактатдегидрогеназа как цитозольный растворимый фермент вытекала во внешнюю среду). Оказалось, что действительно Са2+ (1—10 мкМ), кальмодулин (1—10 мкМ), Mg-АТФ (1—5 мМ) индуцируют экзоцитоз кате- лоламинов, АТФ, хромогранина, дофамин-р-гидроксилазы и энкефалинов в среду инкубации.
В последнее время показано, что нервные окончания содержат пресинаптическое гетеро- и ауторецепторы, модулирующие секрецию медиаторов.
На сегодня из всех гипотез наиболее разработана и представляется перспективной и конструктивной — механо-химическая концепция экзоцитоза.
Вторым этапом, экзоцитоза является транспорт секреторных гранул по нитям цитоскелета к району экзоцитоза, к активной зоне синапсог в случае нейронов (в нервных окончаниях сннап- ннческне пузырьки всегда мигрируют при возбуждении в опреде- V6
ленном направлении — к пресинаптической мембране). О связи цитоскелетной сети, состоящей из микротрубочек, нейрофила- :ментов и актиновых микрофиламентов (и миозиновых фибрилл), с пресинаптическими мембранами свидетельствуют электронно-микроскопические и биохимические исследования. Здесь необходимо напомнить важную аксиому в биологии: если цитостатики (митотические алкалоиды) выключают какую-либо двигательную функцию в клетке, то в реализации этой функции участвует тот или иной элемент цитоскелета. Эта аксиома «срабатывает» и в данном случае. Многочисленными опытами установлено, что цитостатики (колхицин, винбластин, цитохалазины) блокируют вызванную Са-зависимую секрецию медиаторов или гормонов.
Что происходит с цитоскелетными структурами при возбуждении клеток и как они осуществляют двигательные функции? При возбуждении нейронов микротрубочки разбираются за счет дАМФ-зависимого фосфорилирования высокомолекулярных белков, ассоциированных с микротрубочками, и в； некоторой степени тубулина, а также за счет Са-зависимого (при участии кальмодулина —СаМ) фосфорилирования тубулина, причем в пер- зом случае фактором, предотвращающим разборку, служит 4>осфодиэстераза циклических нуклеотидов, во втором — белок р, инактивирующий СаМ. Оба типа протеинкиназ, белок т и, возможно, фосфодиэстераза являются интегральными минорными компонентами микротрубочек. В физиологических условиях разборка нейрофиламентов при возбуждении нейронов происходит за счет Са (СаМ)-зависимой протеинкиназы и Са-зависи- мой цитозольной протеиназы. Видимо Са-зависимая разборка микротрубочек и нейрофиламентов стратегически оправдана для реализации двигательных функций.
Образование комплекса актомиозина в нейронах, что важно для реализации двигательных функций, зависит от многих факторов: от белковых эндогенных факторов, усиливающих сборку микрофиламентов из глобулярного актина, т. е. Г-актина; от ■Са(САМ)- и цАМФ-зависимого фосфорилирования легких цепей миозина в цитозоле; от Са (СаМ) -зависимого фосфорилирования Г-актина и тропонина С в синаптических мембранах; от связывания Са?+ с тропонином С.
Источником энергии для механической работы во всех цито- скелетных структурах является гидролиз АТФ, осуществляемый актомиозин-подобной АТФазой, тубулин-динеиновой АТФазой в ■составе микротрубочек или АТФазой в составе нейрофиламентов. Существует точка зрения, что активная роль в генерации движения принадлежит системе актин ——миозин, а пассивная —— микротрубочкам и нейрофиламентам, по которым как «по рельсам» скользят, двигаются различные органеллы и везикулы.
Все элементы цитоскелета взаимосвязаны и ассоциируются <с мембранами. Однако для всех трех сократительных структур характерны, очевидно, универсальные принципы генерации дви-
жения. Во-первых, генерация движения происходит вследствие скольжения одной цитоскелетной нити относительно другой, при этом длина нити не изменяется. Контактным участком в этом случае могут быть пара актин — миозин, актин — динеин, тубулин ——миозин данных структур, т. е. гомологичные и гетерологичные контакты. Если одна цитоскелетыая нить ассоциирована с клеточной мембраной, а другая — с мембранами каких-либо* органелл или везикул, то при скольжении нитей частицы будут двигаться в ту или иную сторону пульсами (толчками) с определенной скоростью. Различие в скорости движения может определяться как типом частицы, так и типом скользящей нити. Направление движения зависит от того, каким концом полярно организованная цитоскелетная нить связана с плазмалеммой, с какой полярной структурой связана та или иная органелла.
Во-вторых, генерация движения может происходить путем? управляемой сборки — разборки цитоскелетных нитей, при зтом длина нити изменяется. Изменение длины нити модифицирует внутриклеточный транспорт органелл и везикул; разборка нитей вплоть до потери контакта с плазмалеммой может модифицировать подвижность и кластеризацию интегральных белков мем* бран. При возбуждении нейронов и железистых клеток увелнчн- вается уровень Ф-актина, т. е. ускоряется сборка актиновых микрофила меню из Г-актина. Например, цепь актиновых микрофиламентов удлиняется преимущественно с одного конца » деполимеризуется, укорачивается с другого. Во втором предполагаемом типе генерации движения не совсем ясна роль Mg-АТФ, хотя и известно, что нуклеотиды (АТФ, ГТФ) принимают участие в сборке — разборке непосредственно и опосредованно через систему фосфорилирования белковых субъединиц цитоскелета. Возможно также сочетание двух вышеописанных форм генерации движения.
В 1985 г. появилась серия работ о выделении из аксоплазмы гигантских аксонов кальмара белка кинезина, который обладает АТФазной активностью иной, чем у миозина и диненина. В опытах zn vitro кинезин в присутствии АТФ индуцировал транспорт искусственных органелл (шарики латекса) вдоль изолированных микротрубочек мозга (шарики предварительно смачивали в растворе кинезина). В присутствии негидролизуемого аналога АТФ этот транспорт прекращался, а органеллы оставались прикрепленными к микротрубочкам. Данная двигательная система отлична по способу подвижности от той, что осуществляется1 в мышцах и ресничках. Возможно, что кинезин имеет отношение к АТФазе нейрофиламентов.
Третьим этапом процесса экзоцитоза является «состыковка» секреторных гранул с комплементарными, особыми участками, внутренней поверхности плазмалеммы в районе экзоцитоза. На- этом этапе также возможно участие цитоскелета как для состыковки, так и для формирования состыковочного центра, места удержания секреторных гранул с плазмалеммой. Это удержание 78
необходимо, так как обилие отрицательно заряженных групп внешне員 поверхности мембран гранул н внутренней поверхности плазмалеммы не позволяет гранулам состыковаться, хотя бы из-за электростатического отталкивания.
В пресинаптических мембранах синапсов центральной н вегетативной нервной системы находятся гексагональные, плотные еыступы, обращенные внутрь синаптоплазмы (высота 50— 60 нм, расстояние между вершинами 80—100 нм), они состоят, видимо, из филаментозных структур. Участок между выступами (выростами) является комплементарным участком взаимодействия синаптических пузырьков с пресинаптической мембраной.
В нервно-мышечных синапсах, в некоторых железистых клетках (нейрогипофиз, р-клетки поджелудочной железы) и других секретирующих клетках (лейкоциты, тучные клетки) район экзоцитоза имеет свою специфику. Плазмалемма в районе экзоцитоза содержит крупные конусообразные белковые внутримембранные частицы (7—12 нм), которые нередко в форме правильного двойного кольца обрамляют место слипания секреторных гранул. Морфологические исследования экзоцитоза в нейронах нейрогипофиза, мотонейронах спинного мозга, тучных клетках, в электрическом органе электрического ската показали, что в мембране, окружающей некоторые из экзоцитозных отверстий, резко снижено число малых белковых внутримембранных час- т'иц (ВМЧ) диаметром 5—8 нм, которые в других участках мембраны более многочисленны н равномерно распределены. В зоне слияния с мембраной гранул плазмалемма свободна от ВМЧ. На мембране синаптических пузырьков плотность больших ВМЧ (^9—13 нм) совпадает с плотностью этих частиц на внутренней поверхности пресинаптической мембраны, а плотность малых частиц на мембране синаптических пузырьков в зоне контакта также снижается. В безкальциевой среде двойной ряд больших ВМЧ 。нервно-мышечных синапсах исчезает. Этот •факт указывает на то, что эти структуры преходящи, они пре- ©ормнруютсн в ходе деполяризации мембран терминалей.
Наличие агрегатов ВМЧ на мембране секреторных гранул в ■области контакта с плазмалеммой было показано также в нейрогипофизе и в поджелудочной железе. Таким образом, кластеризация интегральных белков и удаление их из зоны слияния (см. гл. 4) является необходимым условием контактирующих мембран при экзоцитозе.
В синаптических мембранах на внутренней стороне локализуется спектрин ——регуляторный белок системы актин ——миозин. •Функция этого белка связана с регуляцией встраивания актнно- ^ых микрофиламентов в клеточные мембраны. В покое спектрин в мембранах существует в форме димера (а—240, В — 235 кД), лри возбуждении спектрин в присутствии Са2+ превращается в тетрамер (агРг с размерами—196X4—6 нм). Тетрамер спектрина стимулирует полимеризацию Г-актина в Ф-актин; связывает-
ся с Ф-актнном, образуя с актиновыми микрофиламентами сетевидные структуры.
Таким образом, спектрин в синаптических мембранах является стабилизатором, регулятором ассоциации с мембранами сети активных микрофиламентов. Эта спектрино-актиновая сеть» формируемая при возбуждении нейронов, может быть составной частью состыковочного центра в ходе экзоцитоза. Приведенные факты указывают, что при возбуждении нейронов увеличивается количество микрофиламентов, связанных с синаптическими мембранами, а также то, что эктоплазма — это динамическая и пластичная структура, меняющаяся при смене состояний покой ——возбуждение. Состыковочный центр при деполяризации мембран может кластеризоваться (при участии Са?+, спекгрина и сократительных структур), образуя ансамбли, которые обусловливают периодичность вызванной секреции, синхронность выброса больших количеств медиаторов из множества синаптических пузырьков.
Как уже упоминалось, при возбуждении нейронов и железистых клеток часть цитоскелетных структур (микротрубочки н промежуточные филаменты) разбирается, т. е. в покое секреторные гранулы не подходят к плазмалемме, поскольку она окружена сетью цитоскелета. Разборка указанных цитоскелетных нитей необходима для транспорта гранул к району экзоцитоза. Например, при экзоцитозе в клетках корневых апексов ячменя состыковочный центр устроен так, что в плазмалемме и мембране секреторных везикул имеются «свои» Са-связывающие белки. После образования кальциевого мостика между мембранами указанные белки вытесняются на периферию контакта, далее индуцируется слияние мембран.
Четвертая стадия экзоцитоза включает в себя Са-зависимое слипание и возможное последующее слияние секреторных гранул с плазмалеммой (рис. 12).
I 。加
Рис. 12. Последовательность процессов (/—〃/) при контакте синаптических пузырьков (СП) с пресинаптической мембраной (пре-СМ):Рис. 12. Последовательность процессов (/—〃/) при контакте синаптических пузырьков (СП) с пресинаптической мембраной (пре-СМ):
Рис. 12. Последовательность процессов (/—〃/) при контакте синаптических пузырьков (СП) с пресинаптической мембраной (пре-СМ):
Рис. 12. Последовательность процессов (/—〃/) при контакте синаптических пузырьков (СП) с пресинаптической мембраной (пре-СМ):
/ — актиновые микрофиламеитьи 2 — тетрамер спектрина. 3 — гликопротеин (или?? гликолипид); стрелка указывает направление движения СП (при участии системы, актин — миозин) к комплементарному участку пре-СМ; актин и тубулин находятся в синаптических мембранах в форме комплексов с гликопротеинами или гликолипидами, что указывает на «глубокое» погружение в лнпидяый бислой микрофиламентов и микротрубочек
На микрофотографиях часто удается зафиксировать секреторные гранулы в тот момент, когда их мембрана слипается с плазмалеммой, при этом образуются поры (так называемые омега-подобные структуры, напоминающие по своей форме греческую букву), через которые содержимое гранул секретируется во внешнюю среду.
Техникой замораживания ——скалывания экзоцитоза гистамина при стимуляции молочной железы хемотаксическим пептидом показано, что слипание начинается с образования точечных контактов между плазмалеммой и мембраной секреторных гранул, далее формируются многочисленные точечные контакты диаметром 0,05—0,08 мкм. Затем в области контакта при возрастании экзоцитозного «кармана» (поры) отмечено изменение формы слипшихся гранул. Гетерологичное межмембранное слипание, чаще всего, приводит к образованию поры (фаза открытия, образования экзоцитозного кармана). Предполагают, что на внешней стороне плазмалеммы будущей поры находятся гликопротеины (рис. 12). По цитохимическим данным, район, где в ходе экзоцитоза наблюдается увеличение площади плазмалеммы, отличается усилением включения лектинов. Фаза открытия пор происходит между большими белковыми ВМЧ, конусы этих частиц, обращенные в цитоплазму, могут быть центром связывания элементов цитоскелета. Для некоторых клеток при экзоцитозе нет фазы открытия поры, а наблюдается лишь просвет между внутримембранными частицами.
Существует два альтернативных варианта экзоцитоза. В первом случае секреторная гранула после слипания (контакта) и последующей секреции полностью не сливается с плазмалеммой, а каким-то образом отделяется от мембран и используется повторно в ходе последующего возбуждения нейронов или железистых клеток. Отделение гранул от мембран можно представить по аналогии с диссоциацией актомиозинового комплекса после снижения концентрации свободных ионов Са в цитоплазме клетки, при этом элементы системы актин ——миозин связаны соответственно с гранулами и плазмалеммой.
Во втором случае (более общепринятом) происходит полное слияние мембран гранул с плазмалеммой, при этом контакт гранул с плазмалеммой заканчивается «гибелью» гранул. И в первом, и во втором случаях на последних стадиях экзоцитоза выдавливание содержимого во внеклеточную среду через экзоцитозный «карман» может происходить как хемиосмотически, так и за счет двигательных реакций системы актин — миозин. Гиперосмотичность «цитоплазмы» секреторных гранул при образовании экзоцитозного просвета способствует дальнейшему выдавливанию содержимого в окружающую среду.
Анализ данных электронной микроскопии при замораживании сколов препаратов нервно-мышечных синапсов показал, что слияние является временным и встроившийся в плазмалемму «новый» мембранный материал удаляется при помощи латеральной
8)
диффузии из района экзоцитоза, а затем происходят усиление эндоцитоза после экзоцитоза и рециклизация секреторных гранул (см. разд. 2.6). Стадии слияния предшествует стадия межмембранного узнавания (состыковка и слипание). Для некоторых секреторных клеток (мотонейроны, околоушная железа) доказано, что мембраны гранул и плазмалемма не перемешиваются, а остаются в сегрегированном состоянии. Феномен сегре- гируемости мембран объясняет парадокс, почему при полном •слиянии мембран гранул и плазмалеммы не унифицируется «белково-липидный состав этих мембран (белково-липидный состав мембран, участвующих в цикле экзоцитоз — эндоцитоз: ЭПР, секреторные гранулы, лизосомы, эндосомы, плазмалемма —отличается друг от друга).
После полного слияния синаптических пузырьков с пресинап- тической мембраной нервно-мышечных синапсов лягушки отмечено наличие ВМЧ, характерных для пузырьков, на внешней стороне двойных рядов ВМЧ, обнаруженных для плазмалеммы. В нервных окончаниях и железистых клетках всегда содержится избыточное количество секреторных гранул. Удаление избытка гранул происходит при экзоцитозе, а также благодаря их слиянию с лизосомами. Последний процесс может усиливаться при подавлении секреции. Это явление описано для клеток гипофиза, фибробластов и печени. .
По данным морфологических исследований, действие блокаторов Са-канала и цитостатиков приводит к однотипному ответу: прекращению экзоцитоза и скоплению синаптических пузырьков близ активной зоны. Ионы Са, накопившись в цитоплазме после возбуждения клеток, способны активировать фосфолипазу А2, приводя к увеличению лизолецитина и свободных жирных кислот, или фосфолипазу D, приводя к удалению полярных головок фосфолипидов. Все это может способствовать контакту гидрофобных областей бислоев мембран.
Известны исследования, моделирующие экзоцитоз. Из клеточных мембран мозгового слоя надпочечников выделен Са-свя- зывающий белок синексин (47 кД), находящийся на внутренней поверхности мембран. Для изолированных хромаффинных гранул агрегация индуцируется высокими концентрациями Са?+ (1 мМ), в присутствии же синексина агрегация хромаффинных гранул запускается низкими концентрациями Са2+ (6 мкМ). Предполагают, что синексин входит в состыковочный центр в места экзоцитоза и регулирует продолжительность контакта хромаффинных гранул с плазмалеммой. Состыковка может протекать следующим путем: синексин плазмалеммы ->Са2+-^фос- фолипиды или белки мембран хромаффинных гранул, т. е. путем образования комплекса Са2+ с СООН-группами синексина и анионными группами фосфолипидов (или белков) мембран хромаффинных гранул. Синексин в присутствии Са2+ способен к са- моагрегации, полимеризации, вызывая модификации элементов цитоскелета в состыковочном центре.
Са-Индуцируемая агрегация и слипание изолированных синаптических пузырьков мозга протекают в присутствии Са?+ (1—10 мкМ), Mg-АТФ (1 мМ) и СаМ (1—10 мкМ). В отсутствие двух последних факторов ионы Са вызывают агрегацию синаптических пузырьков лишь в миллимолярных концентрациях. При оптимальных условиях наблюдается также Са-зависимое фосфорилирование двух белков мембран синаптических пузырьков при участии везикулярной протеинкиназы и высвобождение медиаторов ； среду инкубации. Не ясно, протекает ли последнее благодаря фосфорилированию и изменению конформации мембран либо за счет агрегации, слипания синаптических пузырьков, а значит, и высвобождения части содержимого органелл. Недавно показано, что на внешней поверхности мембран секреторных гранул действительно находятся белки, связывающиеся с кальмодулином.
Вышеперечисленные опыты «страдали» одним недостатком, в них процесс секреции моделировался за счет гомологичного межмембранного взаимодействия, хотя и запускался внешними факторами — Са-связывающими белками. При взаимодействии изолированных хромаффинных гранул надпочечников с микросомами этих же клеток или изолированных синаптических пузырьков мозга с фракцией синаптических мембран (или фракцией синаптических контактов) показано, что в присутствии Са2+ (1—5 мкМ), Mg-АТФ и кальмодулина наблюдается образование гетерологичного контакта (о чем судили по электронномикроскопическим исследованиям или методом седиментации); Са-зависимое фосфорилирование белков мембран органелл, а также белков плазмалеммы; Са-зависимая секреция медиаторов и их спутников в среду инкубации. Так, модельные исследования по изучению экзоцитоза in vitro подтвердили факты об индукторах секреции. Быстрое связывание в присутствии Са2+ белка кальмодулина с синаптическими пузырьками может служить триггером их слияния с плазмалеммой при экзоцитозе.
Пятая стадия экзоцитоза — прекращение возбуждения, реполяризация мембран. По времени она совпадает с концом четвертой стадии——латеральной диффузией мембранного материала секреторных гранул из района экзоцитоза в плазмалемме для подготовки состыковочного центра к контакту со следующей секреторной гранулой. Этот процесс совпадает по времени с началом рециклизации плазмалеммы и самих секреторных гранул. Прекращение экзоцитоза, т. е. реполяризация мембран, инициируется как запаздывающим выходом К+ по потенциалзависимому К-каналу, так и накоплением Са2+ в цитоплазме до критического уровня. Ионы Са включают функционирование Са-насоса и переносчика в системе Na/Ca-обмена, т. е. запускают системы выхода самих же себя из клетки. В этот период происходят диссоциация актомиозинового комплекса, изменения в других цитоскелетных структурах.
Общая
44теория слипания и слияния мембран
4
4
Слипание и слияние мембран ——универсальный и нормальный процесс, важная стадия гетерологичного и гомологичного межмембранного взаимодействия в ходе эндоцитоза и экзоцитоза; оплодотворения клеток, митоза; дифференцировки тканей? например, при биогенезе мышечных волокон; при обмене информационными макромолекулами между клетками; в процессе приобретения клетками новых антигенных свойств; в ходе аутоиммунных реакций (например, при слиянии макрофагов с лим- фоцитами); при липосомной химиотерапии; при секреции ядер- ного содержимого в цитоплазму; при слиянии макрофагов во время воспаления тканей.
Механизмы слияния клеточных и модельных (искусственных) мембран включают в себя одни и те же стадии, что указывает на универсальный механизм взаимодействия мембран. Эти же механизмы распространяются и на слияние мембран внутриклеточных органелл, везикул с плазмалеммой, где важно учитывать специфические подготовительные стадии, ведущие к слиянию. Так, механизмы слияния в системах клетка — клетка, клетка—везикула (чаще всего, секреторные гранулы), везикула — везикула, везикула — плазмалемма, везикула — плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ), БЛМ—БЛМ. Слияние, вероятно, происходит только в специфических участках липидного бислоя мембран. При сближении мембран возникающий скачок потенциала может инициировать образование промежуточных структур (дестабилизация мембраны), необходимых для процесса слияния. Основной эндогенный фактор слияния ——ионы Са ——резко снижает гидратационный барьер при слиянии мембран. Кроме того, ионы Са снижают (или нейтрализуют отрицательный поверхностный заряд, непосредственно модифицируют структуру липидного бислоя, вызывают разделение фаз липидов в бислоях, дестабилизируя их; создают кальциевые мос- тнкн между двумя контактирующими мембранами, индуцируя слияние.
На моделях клетка — клетка, везикула — везикула, везику-
ла—БЛМ, БЛМ—БЛМ показано, что ионы Са более эффективны, чем ионы Mg, хотя н их эффект проявляется в миллимоляр- ных концентрациях. Пороговая концентрация Са2+ существенно •снижается в присутствии Mg2+. Слияние миобластов зависит исключительно от Са?+, но не от Mg2+, который ингибирует Са- .индуцируемое слияние. Замена Са2+ на Zn?+ или ММ* вызывает агрегацию, но не слияние эритроцитов. Ионы Mg в липосомах чаще всего вызывают агрегацию, но не слияние. Са-индуциру- емое слияние клеток сопровождается их набуханием. Для получения оптимальных эффектов слияния необходимо присутствие в мембранах кислых липидов, которые при физиологических значениях pH остаются заряженными. Липосомы из фосфатидили- нозита под действием Са2+ (1 мМ) не сливаются, а только агрегируют. Однако липосомы из фосфатидной кислоты хорошо подвергаются Са-индуцируемой агрегации и слиянию. Полагают, что при экзоцитозе в плазмалемме может происходить ферментативное превращение фосфатидилинозита в фосфатидную кислоту. Липосомы, не имеющие поверхностный заряд, фагоцитируются, тогда как липосомы, состоящие из заряженных лнпн- д*в, сливаются с плазмалеммой. Возможно, что фагоцитоз инициируется сорбцией липосом независимо от их заряда, но завершается лишь при задержке слияния.
Липосомы из нейтрального липида фосфатидилхолина не сливаются. Наличие в мембранах наряду с кислыми липидами лецитина увеличивает необходимую для слияния концентрацию двухвалентных катионов и уменьшает скорость этого процесса»
Свойствами факторов слияния обладают липиды (фосфати- дилэтаноламин, кардиолипин), имеющие форму обратного клина. Клиновидность проявляется в том, что эти липиды в системах липид — вода образуют гексагональную фазу. Чем больше кривизна контактирующих мембран, тем быстрее они сливаются. Маленькие везикулы лучше сливаются друг с другом, чем большие. Полярные амфифильные молекулы (ненасыщенные жирные кислоты, моноацилглицерин), поликатионы (полилизин), углеводороды (декан), продукты перекисного окисления липидов, диметилсульфоксид являются индукторами слияния. Уменьшение микровязкости мембран данными факторами слияния способствует взаимодействию клеток.
Процессы слияния предваряются агрегацией везикул, слипанием (адгезией) мембран. Процессам слияния сопутствуют высвобождение содержимого везикул в наружный раствор, иногда тепловыделение, дестабилизация мембран: образование кохлеарных структур, появление обратных мицелл, содержащих «конические» липиды. Лимитирующей по времени стадией является агрегация везикул, а сам акт слияния происходит очень быстро. Фазовый переход ——необходимый этап в процессе слияния мембран. Процесс высвобождения, утечки содержимого из везикул заметно отделен во времени от слияния, при этом в модель-
ных экспериментах их везикул высвобождается небольшая (<5—10%) часть содержимого.
Сам акт слияния включает несколько стадий: частичное (полуслияние) и полное слияние, сопровождающееся на последних этапах стабилизацией переходных структур, появлением особых кохлеарных внутримембранных частиц н самое главное, объединением внутренних объемов клеток или везикул. Снижение плотности поверхностного заряда, увеличение ионной концентрации среды, снижение pH среды и введение поликатионов способствует сближению и контакту мембран. Повышение вязкости среды мешает сближению, но облегчает образование контакта уже сближенных мембран. Деформация клеточной поверхности — важный фактор слипания и слияния мембран.
При рассмотрении экзоцитоза (см. разд. 3.5) было указано на определяющую роль в секреторном процессе устройства состыковочного центра плазмалеммы при его контакте с мембраной секреторных гранул. Выступы в плазмалемме, обращенные в цитоплазму, при экзоцитозе должны иметь значительно меньший радиус кривизны, чем секреторная гранула. При контакте сперматозоида с яйцеклеткой их слияние облегчается микроворсинками. Первоначальное сцепление мембран на малой площади распространяется далее на большую площадь.
Сближение мембран до критического расстояния (W2 нм» когда уже произошел непосредственный контакт) приводит к агрегации и латеральной диффузии белков из области контакта» т. е. в зоне слипания контактируют безбелковые липидные домены, бислои мембран (рис. 13). Белки в случае экзоцитоза (см. разд. 3.5) могут удаляться в сторону состыковочного центра (и даже за его пределы) и, кроме того, преформировать пункты удерживания мембран в этом центре. Белки могут удаляться активным путем с затратой энергии, например, при функционировании спектрин-актиновой сети; и пассивным способом за счет геометрической асимметрии молекул белка и отличия кривизны мембраны в различных ее участках, а также за счет перемещения полярных белков при электростатическом взаимодействии сблизившихся мембран.
В зоне контакта происходит практически полная дегидрата* ция мембран. Двухвалентные катионы способны дегидратиро* вать полярные головки липидов. Известно, что полиэтиленгли* коль индуцирует слияние различных везикул, а декстран — лишь агрегацию, но не слияние. Оба реагента связывают структурированную воду у поверхности бислоев. В отличие от декстрана, полиэтиленгликоль вызывает структурные дефекты в липидном бислое.
Плотный контакт обеих мембран сначала приводит к образованию пенталаминарной, а затем триламинарной структуры (диафрагмы). Последняя образуется после постепенного вытеснения двух лишних слоев мембран на периферию области контакта. 'Триламинарная структура ——это новый одинарный би- 86
слой в зоне контакта, образованный из двух сблизившихся и
контактирующих бислоев. Образование триламинарной структуры——универсальный процесс межмембранного взаимодей- <твия. Гидрофильная поверхность триламинарной структуры не является результатом взаимопроникновения двух бислоев.
66
6
6
fiFHTT Т Т ? Т ? Тишх —?????? 亠А厶J丄厶厶1<!)」丄<j>」」12fiFHTT Т Т ? Т ? Тишх —?????? 亠А厶J丄厶厶1<!)」丄<j>」」12
fi
FHTT Т Т ? Т ? Тишх —
?????? 亠А
厶J丄厶厶1<!)」丄<j>」」
12
fi
FHTT Т Т ? Т ? Тишх —
?????? 亠А
厶J丄厶厶1<!)」丄<j>」」
12
Рис. 13. Механизмы Са-зависимого слияния мембран (А—Г):Рис. 13. Механизмы Са-зависимого слияния мембран (А—Г):
Рис. 13. Механизмы Са-зависимого слияния мембран (А—Г):
Рис. 13. Механизмы Са-зависимого слияния мембран (А—Г):
Л г / — до слияния, 2 — частичное слияние (полуслияиие) с образованием триламинарной структуры, 3 — полное слияние и образование «поры»; Б : 1 — до слияния, 2 — готовность к слиянию (наблюдается агрегация внутримембранных белковых глобул, их латеральная диффузия из зоны слияния, липидная фаза становится более жидкой, за счет дестабилизации мембраны в липидном бислое образуются кластеры — мицеллярные глобулы в кристаллическом ^состоянии); В: / — пеиталаминарная структура, 2 — первичный акт слияния, образование мицелл, S — образование триламинарной структуры; Г : / ——образование зоны контакта, 2——ее увеличение, 3—кристаллизация липидных бислоев. При переходе от 2 к 3 (8Г) — разрыв внешних слоев контактирующих мембран, частичное удаление материала из области контакта
Са-Зависимая дестабилизация структуры мембран при их контакте друг с другом приводит к тому, что в липидных доменах пенталаминарной структуры, большая часть которых находится в жидком состоянии, появляются кластеры из мицеллярных глобул в кристаллическом состоянии (рис. 13). Границы кластеров дестабилизируют бислой.
Для слияния требуется, чтобы липидные бислои в зоне кон-
87
такта мембран находились в более подвижном, жидком состоянии. Например, липиды мембран сперматозоидов по мере созревания становятся более жидкими. Холестерин снижает подвижность липидных молекул и тормозит слияние. Липосомы стимулируют слияние клеток только при температуре около или. выше температуры фазового перехода составляющих их липидов.
Добавление ионов Са в малой концентрации суспензию мембранных везикул вызывает агрегацию, но не слияние последних. При достижении пороговой концентрации Са2+ происходит изотермический фазовый переход фосфолипидов из жидкого состояния в кристаллическое и индуцируется слияние. В везикулах из смеси различных фосфолипидов надпороговые концентрации Са2+ вызывают латеральное разделение липидов» при этом кластеры, содержащие кислые липиды, переходят в кристаллическое состояние. Ионы Mg повышают температуру фазового перехода фосфолипидов в меньшей степени, чем Са?+. Отсюда следует, что когда Са?+ вызывает слияние везикул, фосфолипиды в присутствии Mg2+ остаются в жидком состоянии, и наблюдается агрегация везикул. Эти опыты указывают на то, что дестабилизация бислоев при слиянии обусловлена образованием кластеров твердых липидов в жидком бислое.
Структурные перестройки и образование триламинарной структуры могут происходить двумя путями: локально, в зоне «точечного» контакта, в этом случае образуется сталк (перемычка) ; в зоне п отного дегидратированного контакта (адгезия) на значительной площади мембраны. Сталкерный механизм предусматривает, что в зоне точечного контакта присутствуют асимметричные молекулы липидов, участки нестабильности. При контакте эти молекулы хаотически двигаются до тех пор, пока не образуется энергетически выгодная триламинарная структура. Адгезионный механизм предусматривает образование в зоне контакта обратных мицелл, сходных гексагональной фазе, в зоне контакта нарушается устойчивость плоской упаковки монослоев, последние преобразуются на обратные мицеллы, которые затем удаляются на периферию зоны контакта (см. рис. 13). Движущей силой слияния мембран, т. е. «распада» триламинарной структуры, в первом случае является упругость изгиба, во втором — упругость растяжения и сжатия монослоев. Во втором случае переход из жидкого в кристаллическое состояние сопровождается уменьшением площади, приходящейся на одну молекулу, что соответствует конденсации молекул. Дестабилизация мембраны в обоих вариантах слипания может вызываться «транс»-комп〃ексом одного иона Са с двумя молекулами кислого фосфолипида, принадлежащими контактирующим мембранам. ,
Головки липидных молекул сильно притягиваются друг к Другу в условиях дегидратированного контакта мембран; в зоне контакта происходит «кристаллизация» молекул. Мембраны, 88
полярные группы которых образуют решетку чередующихся зарядов, электрически притягиваются друг к другу. Внутренние объемы двух контактирующих мембранных структур в случае монослойного слияния, т. е. образования триламинарной структуры, разделены не двумя, а лишь одним бислоем (см. рис. 13). Первичная кристаллизация действует далее как застежка <молния», пристегивающая соседние контактирующиеся участки мембран. Триламинарная структура разрывается за счет избытка площади внутренних монослоев и искажения формы контактирующих мембранных структур или на поздних этапах «застегивания молннн».
При сталкерном механизме слияния мембран сталк может образоваться как из одного монослоя, так и из целого бислоя; в первом случае формируется промежуточная триламинарная структура, во втором ——перемычка сразу же ведет к полному слиянию. Сталк возникает за счет локальных «вспучиваний» (выростов) некоторых участков (монослоев) контактирующих мембран, растущих навстречу друг другу. Эти выросты либо замыкаются друг на друга, либо замыкаются через внемембран- ные цитозольные липидные мицеллы. Возможной причиной быстрого разрушения сталка в физиологических условиях является электрический пробой сильным внутримембранным полем в области контакта мембран.
Триламинарная структура имеет ряд особенностей: специфическая удельная электрическая емкость, электромеханическая стабильность, высокая ионная проницаемость. В области контакта в липидных доменах возникает либо локальная разупорядоченность структур/ при которой молекулы липидов ориентированы хаотично, либо, что более вероятно, образуется лабильная триламинарная структура. Затем как в первом, так и во втором случае раньше, чем произойдет восстановление нативной мембранной структуры, липидные молекулы в зоне контакта образуют своеобразные мостики между слоями, при этом образуется открытый водный канал (пора). Пора растет в размерах. Из-за высокой поверхностной кривизны в поре образованные структуры неустойчивы, мембраны разделяются.
Следует еще раз подчеркнуть, что Са-индуцируемое фазовое разделение фосфолипидов при слиянии происходит либо в бислое, либо только в наружном монослое мембранных везикул. Это может привести к образованию дефектов структуры бислоев и к прямому контакту гидрофобных хвостов фосфолипидов с водной фазой. Нестабильность таких участков способствует слиянию везикул на этих участках. Центры нестабильности локализуются на границах твердых доменов (мицелл) в жидком бислое. Слияние индуцируется либо за счет взаимодействия липидных мицелл, либо за счет локальных изгибов бислоев, либо за счет электрического пробоя бислоев.
Можно рассмотреть вариант нефизиологической секреции ацетилхолина нервно-мышечными синапсами, препараты кото-
рых инкубировали в среде, содержащей 90—110 мМ СаС12 (или MgCl2). В этом случае в терминалях наблюдается скопление» агглютинация, сотообразование синаптических пузырьков возле пресинаптической мембраны и, наконец, дегенерация нервных окончаний. В синаптоплазме накапливается очень высокая концентрация ионов Са, которые индуцируют агрегацию синаптических пузырьков, при этом медиатор части слипшихся синаптических пузырьков высвобождается в цитоплазму и далее происходит нефизиологическая, невезикулярная секреция.
В нормальных условиях слипание и слияние клеток происходит сравнительно редко (в зависимости от функционального состояния клеток). В связи с практическими проблемами соматической гибридизации клеток, реконструкции клеток (слияние кариопласта с цитопластом), получения гибридом из лимфоцитов и клеток миеломы для выработки моноклональных антител необходимо создание универсальных методов слияния клеток и органелл i〃 vitro. Используемые индукторы слияния на фоне Са2+ (1—10 мМ) клеток животных — вирус Сендай (в оболочке которого присутствует нейраминидаза), клеток растительных протопластов —полиэтиленгликоль ——приводят к низкому выходу гибридных клеток. В 1979 г. был разработан универсальный метод слияния любых клеток (в суспензии) —метод электрического пробоя. Этот метод основан на резком увеличении проводимости и проницаемости мембран в сильном электрическом поле (40 мкс, 4—6 кВ/см). При этом среди способов приведения клеток в контакт перед электростимуляцией используют диэлектрофорез —перемещение клеток в неоднородном переменном электрическом поле в растворе диэлектрика в сторону увеличения напряженности (в этом случае формируется большое число контактирующих друг с другом параллельных цепочек клеток). Увеличение образования гибридных клеток (химер) или гигантских клеток описанным способом* достигается ферментативной обработкой клеток до слипания и слияния, главным образом направленной на удаление гликокаликса.
Заключение
Несмотря на то что феномен фагоцитоза описан сравнительно давно, в его механизме есть много неясного, а полнота описания биохимических и биофизических процессов явно не достигла целостности и законченности. Выяснено многое: роль гли- кокаликса плазмалеммы в эндоцитозе; значение цитоскелетных сократительных структур для инвагинации плазмалеммы и образования эндосом; трансформация захваченных веществ при участии системы ГЭРЛ; рециклизация рецепторов и репарация плазмалеммы после утраты ее части в ходе эндоцитоза; вовлечение эндоцитоза в межклеточный и внутриклеточный транспорт информационных молекул. Тем не менее единой «концепции цитоза» не существует.
В то же время становится все более ясным, что для понимания многих процессов жизнедеятельности клеток, регуляции биохимических процессов в мембранах следует рассматривать эндо- и экзоцитоз в интегральном, целостном виде, поскольку механизмы обоих процессов имеют много общего. Изучение эндо- и экзоцитоза выявляет универсальность этих процессов практически во всех клетках. Все это требует сочетания различных методов исследования в разработке комплексного подхода к изучению конкретных механизмов и специфики регуляции эндо- и экзоцитоза.
При рассмотрении эндо- и экзоцитоза необходимо учитывать обеспечение обоих процессов кислыми компартментами клетки: эндосомы, одетые везикулы, секреторные гранулы, лизосомы, формирующиеся из цистерн аппарата Гольджи. Особенностью этих везикулярных компартментов является наличие в их мембранах малоизученного Н-насоса немитохондриального типа. Рассмотрение специфического эндоцитоза, открытого в последние годы, уже сейчас обогатило исследователей принципиально новой информацией, а самое главное, уже сейчас многое дало для понимания природы патологических процессов. Проясняется судьба поглощенных клеткой различных лигандов ——от физиологически активных веществ до «токсических» частиц и соединений, проясняется роль специфической ассоциации рецепторов в плазмалемме и их рециклизации.
Рекомендуемая литература
Биологическая химия. Т. 17//Итоги науки и техники. М., 1982.
Биохимия мембран/Под ред. А. А. Болдырева. Кн. 4. А. Я. Кульберг. Рецепторы клеточных мембран. М., 1987.
Булычев А. 「• Сегрегационная функция клетки и ее молекулярные ме- ханизмы//Цитология. 1986. Т. 28. № 4. С. 387—402.
Взаимодействие и слияние мембран//Итоги науки и техники/Биофизика мембран. Т. 3. М., 1984.
Глебов Р・ //., Крыжановский 「• Н・ Функциональная биохимия синапсов. М., 1978.
Дин Р. Процессы распада к клетке. М., 1981.
Саляев Р・ К., Романенко 4 С Эндоцитоз. Новосибирск, 1979.
Ультрастру кт ура нейрона (транспортные процессы) //Итоги науки н тех- ники/Морфология человека и животных. Антропология. Т. 10. М., 1983.
Финеан 〃” Колмэн Р., Мичелл Р・ Мембраны и их функции в клетке. М., 1977.
Шубникова Е А., Коротько Г. Ф. Секреция желез. М., 1986.
Wileman Т., Harding С., Ftahl Ph. Receptor-mediated endocytosis // Bio^ chem. J. 1985. V. 232. P. 1—14.
Предметный указатель
Апо-6е』ок 40
Апотрансферрин 52-
АТФаза 24, 77
—«раздевающая» 46 Н-АТФаза См. Н-Насос Na, К-АТФаза 29, 75
Аутофагия 18
Лцетилхолинэстераза 33
Ацидотропные вещества 20, 46, 53, 66
Вакуоль эндоцитозная 16, 17*—24, 26*, 31, 51, 52
Везикулы гладкие 44, 47, 53
—одетые 9*, 16*, 20, 32, 35, 44, 45
особые функции 53
трансформация 47» 48*
Везикуляризация 9*, 11, 16, 25
Вителлогенин 37, 38*
Вн}*тримембранные частицы белковые 79, 81, 82
Гетерофагия 18
Гиперхолестеринемия 40
Гипотеза сигнальная 68
Гликокаликс 11, 12*, 14, 21, 25, 29, 71, 90, 91
Глия 7, 32, 34—36
ДНК, эндоиитоз 18
— межтканевый транспорт генетического материала 33
—новый способ репарации 34
Иммуноглобулины 15, 32, 37, 39*, 41, 42, 49, 54, 59
Инвагинация 11, 17*, 22, 24—26, 34, 43, 47
Интернализация 11, 20, 23, 27, 41, 42, 47, 49
—рецепторов 38二 39*, 43—45
Ионные каналы 74*, 75, 83
Ионы кальция 11, 15, 16, 21, 24, 25, 46, 50, 59, 64*, 67, 72—76, 79, 80, 82—90
Кавеолы 17*, 41
Кальмодулин 74。76, 77, 83
Кластеризация рецепторов 23, 42—45A 54
Кластеры 42*, 54
Клатрин 10*, 43, 45, 53, 54, 56
Колпачки 42*, 54
Колхицин 19, 22, 24, 42
Конкавалин А 10*, 13, 15, 42, 47
Контакты межклеточные 34
—щелевидные 34*, 71
а-Латротоксин 59
Лейкоциты 16, 18, 19, 22, 23, 26, 38二
39*, 70, 72
Лизосомные болезни 18, 20
Лизосомы 15—20, 27—31, 38*, 41»
50—53, 59, 71
Лимфокины 15
Липиды 23, 25, 26, 82, 85, 88—90
Липовителлин 37, 38*
Липопротеины низкой плотности 38*, 40, 43, 45, 50, 52
Макрофаги 7, 12, 13, 15, 16, 19, 20, 24, 26—28, 30, 42, 43, 49, 70—72, 84
Макроэндоцитоз 22, 24
Межклеточный обмен информационными макромолекулами 6,18,19,56
—транспорт веществ 19, 31—35
Межмембранное взаимодействие 6, 14
Мембраны бислойные липидные
(БЛМ) 84
—индукторы слияния 85
—Са-зависимые 87*
—контактный участок 8
—слипание и слияние 84
Микроворсинки 21
Микропиноцитоз 26
Мнкротрубоикн 18, 24, 54, 77, 80*
Микрофагоцитоз 34
АТикрофиламенты 24, 77, 80*
Микрошипы 21, 22
Н-Насос 20, 46, 52, 67
Нуклеосомы 60
на которых помещены рисунки или таб*
Окаймленные ямки плазмалеммы 43, 44, 46—48, 50
Опсонины 14
Органелла CURL 48*, 51, 52, 57
Перекисное окисление липидов 22, 26, 85
Пероксидаза 12, 13, 28, 30—33, 59
Пиносомы 9*, 11
Пиноцитоз 6, 7, 8*, 13, 14
—абсорбционный 9*, 10*, 12, 14, 22, 24
—жидкофазный 9*, 10*, 12, 24, 43, 48
—индукторы 24
Плазмалемма 7, 13—15, 26, 28, 29
—форма распределения рецепторов и антигенов 42*
Прелизосомы 19
Псевдоподии 8*, 14, 21, 22, 24, 29, 36, 61
Пэтчи 42*, 54
Рецептосомы См. Везикулы гладкие
Рециклизация мембран 6, 17*, 26—31, 49, 50
—пути 27*, 29
—рецепторов 6, 47, 48*
—секреторных гранул 56—59
Секреторные клетки, свойства 63
•Секреция апокриновая 60
—аутокринная 62
—везикулярная 63*
—голокриновая 61
—гормональная, системы 62
—мерокриновая 60, 64
—невезикулярная 63*
—паракринная 62
—по типу экзоцитоза 66*
—спутников 66, 67*
—сывороточных белков печени 71
—тиреоидного гормона 72
— эволюция процессов 70
—ферментов и белков 70
•Сигналаза 68
Синаптогенез 55, 56
Синексин 82
•Синтез секреторных белков 6, 68—70
Система ГЭРЛ 16*, 19, 26
Состыковочный центр 78
Спектрин 79, 80, 86
Спинулы 34*, 35, 56
Тафцин 41
Токсины 7, 9*, 41, 50, 53
Транспорт контейнерный 6
Трансферрин 38。41—43
Трансцитоз 31, 32, 56
Триламинарная структура 86
адгезионный механизм 88
сталкерный механизм 88
Трискелионы 45
Фагосома 9*
Фагоцитоз 6—8*, 9*, 13, 35, 43
—активный 15
—механо-химическая схема 23*
—пассивный 15
— этапы основные 14
Ферритин 12, 13, 24, 32
Ферротрансферрин 52
Фибробласты 13, 14, 26—28, 30, 38—
43, 45, 50
Холестерин 23, 26, 40, 41, 47, 52, 88
Циклические нуклеотиды 18, 34, 54, 64*, 72, 73
Цитоз 7
Цитоскелет 6, 10*, 11, 23, 24, 42, 43.
51, 54, 77
Цитостатики 24
Цитохалазин В 19, 24, 42
Экзоцитоз, альтернативные Варна* ты 81
—механо-химическая концепция 76
—механизмы 73, 80*
—после эндоцитоза 31, 72
— различных веществ 61*
—секреторный цикл 65*
—типы секреции 60
Эктоплазма 11, 12。22, 23
Эндоплазма 12*
Эндосомы 9, 11, 17, 25, 32, 47
Эндотелий 32, 41
Эндоцитоз, активный транспорт ве* ществ 22
—гипотеза контрактильная 23
механо-химическая 23
—защитная функция 20
—индукторы 13
—механизмы 21
—неспецифический 8, 17*, 48
обратный 60
—первичный акт 13
—после экзоцитоза 19, 27, 31» 55. 56*, 59, 82
—рецептор-индуцируемый 6, 7, 37
—специфический 7, 8*, 9*, 44, 47
феноменология 37
характеристики 38*
—типы 8*
—трансформация материала 16, 17・
—фазы 21
характеристики 9*
Эндоцитозные каналы удлиненные II
Эпителий 7, 12—14, 19, 22, 26, 32, 52t
54, 71, 72
5 6 7 71316212631343737434547535560606368707S84919293-5 6 7 71316212631343737434547535560606368707S84919293-
5 6 7 71316212631343737434547535560606368707S84919293-
5 6 7 71316212631343737434547535560606368707S84919293-
Оглавление
Предисловие
Введение
Глава 1・ Неспецифический эндоцитоз (пиноцитоз и фагоцитоз) •
Общая характеристика
Индукторы эндоцитоза
Трансформация эндоцитозного материала ...
Механизмы эндоцитоза
Рециклизация мембран
Трансцитоз (межклеточный транспорт веществ) .
Эндоцитоз и межклеточные контакты •・・ ・
Глава 2. Специфический или рецептор-индуцируемый эндоцитоз ・
Феноменология специфического эндоцитоза ・.•
Интернализация рецепторов
Свойства одетых везикул. Клатрин
Трансформация одетых везикул. Рециклизация рецеп торов
Особые функции одетых везикул
Феномен увеличения эндоцитоза после экзоцитоза .
Глава 3. Экзоцитоз
Типы секреции веществ
Свойства секреторных клеток
Сигнальная гипотеза
Секреция ферментов и белков
Механизмы экзоцитоза
Глава 4. Общая теория слипания и слияния мембран •・・.
Заключение
Рекомендуемая литература
Предметный указатель •・・
Учебное издание
Рудольф Николаевич Глебов
Эндоцитоз и экзоцитоз
Зав. редакцией А. Г・ Гаврилов. Редактор А. С. Орлова* Мл. редакторИ. М・ Павлова, Художественный редактор Т. А. Коленкова. ХудожникВ. Н・ Хомяков, Технический редактор Т. Н. Полунина, КорректорС. К. Завьялова.
ИБ № 644!
Изд. № Е—530. Сдано в набор 26.02.87, Подп. в печать 05.06.87. Т—10186.
■Формат 60X90Vte. Бум. тип. № 1. Гарнитура литературная. Печать высокая* Объем 6,0 усл. печ. л. 6,25 усл. кр.-отт. 6,22 уч. изд. л. Тираж 8700 экз. Зак. № 1040.
Цена 20 коп.
Издательство «Высшая школа», 101430. Москва, ГСП-4, Неглинная ул.» д. 29/14.
Московская типография № 8 Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли, 101898, Москва, Центр.
Хохловский пер., 7.
МЕМБРАН
ооК НИ и，，〕■—.Q1 匸匕 у чес и !ы 11сс<*сч|й !!• •' -г. ?М： Ж,.；М IT
о
о
к у.пирных Sb
帥q •帥q •ооЗНД1КН1〔什за м〕х
帥q •
帥q •
о
о
ндоцитозндоцитозR Н. DIEBOBR Н. DIEBOBБИОХИМИЯБИОХИМИЯ
ндоцитоз
ндоцитоз
R Н. DIEBOB
R Н. DIEBOB
БИОХИМИЯ
БИОХИМИЯ
БИОХИМИЯ МЕМБРАН
БИОХИМИЯ МЕМБРАН
Под редакцией А.А, Болдырева^
Книга 2
R H. ГЛЕБОВ
Эндоцитоз и экзоцитоз
Допущено Министерством высшего н среднего специального образования СССР в качестве учебного пособия для студентов биологических и медицинских специальностей высших учебных заведений
МОСКВА
«ВЫСШАЯ ШКОЛА» 1987
ББК 28.05
Б 63
УДК 577.1
Рецензенты:
кафедра биохимии медико-биологического факультета 2-го Московского государственного медицинского института имени Н. И. Пирогова (зав. кафедрой проф. А. И. Арчаков);
Д-р хим. наук, проф. В. И. Швец (Московский институт тонкой химической технологии имени М. В. Ломоносова)
Биохимия мембран: Учеб, пособие для биолог. Б63 и мед. спец. вузов/Под ред. А. А. Болдырева. Кн. 2, Р. Н. Глебов. Эндоцитоз и экзоцитоз.— М.: Высш, шк., 1987.— 95 с.: ил.
Кннга посвящена актуальной проблеме мембранологии ——изложению современных представлений о молекулярных механизмах эндоци- гоза (захвата макромолекул и частиц внутрь клеток) и экзоцитоза (выброса веществ из клеток); описаны механизмы сопряжения возбуждения и секреции, слипания н слияния мембран, рециклизации мембран и их компонентов н т. д. В пособии учтены последние достижения биологии и медицины.
ББК 28.0557.04ББК 28.0557.04「2007020000(4309000000)—363
ББК 28.05
57.04
ББК 28.05
57.04
Б18—87
001(01)—87
© Издательство <Высшая школа》, 1987