Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
АННОТАЦИЯ
В книге собраны разрабатывавшиеся в течение 15 лет в лаборатории автором совместно с работниками производств, а также уже принятые в практике методы анализов полупродуктов и готового продукта в синтезе и производстве витаминов Описано около 300 методов анализа по всем стадиям производства витаминов A, Bi, Вз, Вз (пантотеновая кислота), Вс, Bja, Вс (фолиевая кислота), С, Р, РР, Е, D, К и каротина В книге также приведены новейшие методы определения витаминов не только в препаратах, но и в естественных продуктах, что представляется важным для лабораторий, замятых вопросами изучения сырья и витаминного состава пищевых продуктов
Книга рассчитана иа работников лабораторий витаминных и фармацевтических предприятий, аптечных работников, химиков-аналнти- ков, сотрудников контрольно аналитических лабораторий, санитарно эпидемиологических станций и др
ДЕВЯТНИН ВЛАДИМИР АЛЕКСАНДРОВИЧ
Методы химического анализав производстве витаминов
Редактор Г А Резвецова
Техи редактор Н А БуковскаяТехи редактор Н А БуковскаяКорректор Л Ф КарасеваКорректор Л Ф КарасеваПереплет художника Л С ЭрманаПереплет художника Л С Эрмана
Техи редактор Н А Буковская
Техи редактор Н А Буковская
Корректор Л Ф Карасева
Корректор Л Ф Карасева
Переплет художника Л С Эрмана
Переплет художника Л С Эрмана
Сдано в набор 11/XI 1963 г Подписано к печати 5/V 1964 г Формат бумаги84ХЮ8,/з2”И,25 печ л (условных 18,45 л ) 16,38 уч изд л
Тираж 2300 экз Т 06369 МН 79
Издательство «Медицина» Москва, Петровернгскнй пер , 6/8
Заказ 439 11-я типография Главполиграфпрома Государственного комитетаСовета Министров СССР по печати, Москва, Нагатинское шоссе, д 1
Цена 1 р 02 к
редисловиередисловие
редисловие
редисловие
За последние годы в нашей стране достигнут значи- тельный прогресс в производстве витаминов. Разработаны способы синтеза ряда витаминов, налаживается их получение в укрупненном масштабе Задачи, стоящие^ перед советскими витаминологами, огромны В ближайшие годы должен быть освоен выпуск почти всех известных витаминов в целях обеспечения потребности в них населения СССР Наибольшее количество витаминов будет использоваться для витаминизации пищевых продуктов. Немалый удельный вес имеют также использование витаминов с лечебными целями и применение их в животноводстве.
В связи с этим перед большой армией инженеров и техников, работников витаминных и фармацевтических заводов и перед научными учреждениями стоят задача по овладению контролем производства витаминных препаратов.
Производство витаминов является чрезвычайно сложной отраслью промышленности, поскольку оно основано на тонком химическом синтезе, включающем, как правило, много промежуточных стадий и большое число разнообразных продуктов. Наряду с этим получение витаминов из естественного сырья также предусматри-
вает специальные технологические приемы, поскольку речь касается выделения в чистом виде или в виде концентратов весьма лабильных веществ, каковыми являются, как правило, витамины.
В связи с этим необходим обязательный контроль технологического процесса на разных стадиях и определение качества готового продукта.
Во всех отраслях промышленности существуют методические пособия по контролю производства и лишь производство витаминов не имеет такого пособия. Это объясняется чрезвычайной трудностью разработки методов контроля в производстве витаминов, поскольку число продуктов, подлежащих контролю, чрезвычайно велико, а сами продукты в ряде случаев мало описаны или совсем неизвестны в литературе.
Следует также отметить, что в результате исследовательских работ, осуществляемых во Всесоюзном научно- исследовательском витаминном институте (ВНИВИ) и в других научных учреждениях, а также в научно-исследовательских лабораториях на витаминных заводах, вырабатывается и уточняется технология производства, нередко меняющая всю схему получения препарата. Естественно, в связи с этим изменяются и методы анализа, а кроме того, и сама аналитическая техника в результате использования современных методов физического и физико-химического анализа также в значительной мере изменяется. Тем больше возникает трудностей перед автором, который попытался бы составить соответствующее пособие по методам анализа в производстве витаминов.
Однако и при этих обстоятельствах нужда в таком лабораторном пособии несомненна. Разумеется, те методы, которые можно было бы собрать и описать, целиком не восполнят имеющегося пробела и лишь в какой- то степени смогут оказать помощь лабораторным работникам и аналитикам смежных областей производства.
Состояние вопроса получения витаминов в настоящее время очень коротко можно охарактеризовать следую; щим образом.
Из естественного сырья на витаминных заводах получают каротин, витамин А, витамин D, витамин С (в виде концентратов и препаратов), витамин Р (катехи-
ны, рутин), комплексные препараты витаминов С и Р, витамин Е (в виде концентратов), витамин В12 (как продукт биосинтеза).
Путем химического синтеза получают витамин А — ацетат, витамин Bi, В2, РР, Be, фолиевую, пантотеновую и пара-аминобензойную кислоты, витамин С и фосфорные эфиры витаминов (кокарбоксилазу, тиамин-моно- фосфат) и др.
По мере того как разрабатывались технологические процессы производства каждого из этих витаминов, разрабатывались и методы контроля этих процессов. Эта сложная и большая работа проводилась на протяжении ряда лет в химико-аналитической лаборатории и в синтетических лабораториях Всесоюзного научно-исследовательского витаминного института, в его Ленинградском филиале, а также на заводах витаминной промышленности, как, например, на 1-м Ленинградском, Экспериментальном, 2-м Ленинградском, Щелковском, 1-м Московском и других заводах. Эта работа, как правило, проводилась в тесном содружестве института с заводами.
Ряд методов, принятых в настоящее время в контроле производства витаминов, заимствован из смежных отраслей, некоторые из них разрабатывались в других научно-исследовательских учреждениях и были приспособлены с теми или иными изменениями к контролю витаминного производства. Однако и эти методы подвергались соответствующей проверке и апробации во ВНИВИ, прежде чем были использованы для этих целей.
Уместно отметить большие заслуги в части разработки методов контроля полупродуктов и готовой продукции в производстве витаминов инженеров и техников витаминного производства (Е. В. Агапова, Н. Я. Волкова, Б. И. Идельсон, А. Д. Лебедев, Е. А. Обольникова, К. И. Пальмова, Т. Г. Перлова, А. Д. Поспеев, А. Р. Татьянин, М. И. Русакова и др.), х так и сотрудников ВНИВИ (В. М. Березовский, Е. В. Богданова, В. А. Бадова, М. Я. Мойжес, Е. И. Гершкович, В. В. Зворыкина, В. М. Иосикова, В. И. Колтунова, Л. Н. Кравчина, М. А. Миропольская, В. М. Ракова, В. В. Никифорова, Л. А. Петрова, Е. П. Родионова, К. Д, Сидорчик, И. А. Солунина, Л. TI. Стрельчунас, Г. А. Федорова, Л. В. Лукьянова, О. С. Шерман и др.).
г)тому большому коллективу высококвалифицированных специалистов мы обязаны наличием методов анализа в синтезе и технологии производства витаминов из естественного сырья. Их многолетняя работа несомненно способствовала не только разработке рациональных технологических процессов, но также и внедрению в производство новых форм витаминных препаратов.
Учитывая, что настоящая книга должна служить пособием для работников заводских лабораторий и аналитиков смежных областей, автор стремился изложить в Мей те практические сведения, которые могут облегчить работу и помочь разобраться в принципе методов. В целях удобства пользования книгой методический материал в ней расположен по отдельным витаминам, что имеет известные преимущества перед другими способами его изложения (например, по классификации органических соединений).
В первой части книги излагаются некоторые общие методы, широко применяемые в лабораториях витаминных заводов; во второй части описываются методы применительно к контролю производства того или иного витаминного препарата.
Каждому методу предпосылается его теоретическое обоснование, далее приводятся техника метода и ряд расчетов, которые помогут практическим работникам дать правильную оценку полученному ими результату. В отдельных случаях для продукта приводятся два или три метода: один из них является официальным, обязательным для характеристики продукта (о чем имеется указание), другие рекомендуются автором как представляющие интерес в научно-исследовательской работе.
Перед описанием методов анализа готового препарата витамина дается краткая характеристика его свойств и значения для организма.
Особо выделен раздел приготовления некоторых реактивов, применяемых при использовании описываемых методов. В книге приведены также литературные источники, которыми могут пользоваться практические работники в своих исследованиях.
Книга не лишена известных недочетов, в частности •недостаточно подробно изложены физико-химические методы анализа, что по ряду причин не всегда удавалось осуществить. Некоторые методы, описанные в книге, в
связи с изменением технологии производства, возможно, будут меняться. Материал в книге изложен сжато, что связано с ограниченностью объема издания. Однако хочется думать, что и с учетом этих недостатков книга сможет принести некоторую пользу при решении проблемы получения и исследования витаминных препаратов.
Автор будет искренне благодарен за все критические замечания, дополнения и поправки.
Кандидату биологических наук В. М. Иосиковой, оказавшей большую помощь в подготовке книги к изданию, и всем лицам за сделанные поправки и замечания автор выражает глубокую признательность.
а ст ъ первая
КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ О НЕКОТОРЫХ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДАХ АНАЛИЗА
За последние годы в практике лабораторий витаминных заводов все шире используются современные методы анализа: спектрофотометрия, полярография и хроматография на фильтровальной бумаге и в тонком слое.
В настоящем практическом руководстве не представляется возможным подробно изложить теоретические основы этих методов; можно дать лишь самое общее представление о технике их проведения и некоторых принципах, положенных в основу этих методов. По данному вопросу существует обширная литература, широко освещающая теорию и практику спектрофотометрических, полярографических исследований и хроматографии.
Следует лишь отметить, что на современном уровне наших знаний невозможно в ряде случаев обойтись без указанных методов, а тем более в производстве таких сложных органических соединений, каковыми являются витамины. 1
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ
^^Органические и неорганические соединения, как правило, обладают способностью по
глощать часть световых лучей в определенной области спектра. Видимый спектр включает область длин волн между 700 шр красной части и около 400 тр фиолетовой. Ультрафиолетовая область спектра находится в пределах от 400 до 200 тр (за пределами 200 тр находится область так называемого-далекого ультрафиолета). Измерение характера поглощения (абсорбции) света веще
ством может служить характерным показателем для определенного вещества. Наиболее ' значительная часть витаминов и полупродуктов их синтеза характеризуется свойством поглощать свет в области от 200 до 600 тр. Очень часто вещество обладает не одной, а несколькими полосами поглощения в разных частях спектра, и это обстоятельство также может служить для идентификации соединений.
Так, например, рибофлавин обладает 4 полосами поглощения: при Z=229, 269, 372 и 445 тц, а тахистерин— при Z = 268, 280 и 294 тр.
Если измерять с помощью спектрофотометра поглощение света испытуемым раствором, начиная, допустим, с 450 шц, и откладывать на графике величину поглощения на основе показаний прибора через равные отрезки волн, измеряемые в миллимикронах, то вычерчиваемая линия будет иметь некоторый подъем и на длине волны, где происходит поглощение максимального количества светЗ, на кривой будет обозначаться «максимум абсорбции». Сопоставляя полученную спектрограмму с абсорбционной кривой для стандартного, заведомо чистого вещества, можно будет убедиться в идентичности испытуемого продукта стандарту или в наличии в продукте загрязняющих веществ. Величина поглощения, выражаемая экстинкцией 1 % раствора вещества, измеряемого в кювете толщиной 1 см (Е}%см ), является достаточно характерным показателем для взятого соединения. Эта величина, будучи сравнена с Е}^м для чистого, стандартного продукта, выраженная в процентах к стандарту, дает возможность определить с более высокой степенью точности, чем при использовании других аналитических методов, чистоту испытуемого продукта (его процентное содержание).
Приведенный пример является лишь частным случаем спектрофотометрического анализа, но он заслуженно получил в витаминологических исследованиях широкое применение.
Для спектрофотометрического анализа используются различные спектрофотометры. Наиболее часто применялся спектрофотометр типа Бекман. В СССР выпускаются спектрофотометры отличного качества, действующие по принципу спектрофотометра типа Бекмана (рис. 1). Подобные приборы охватывают область спектра от 1200 до 200 тц и имеют два фотоэлемента: оксидно- иезиевый для области от 1200 до 600 шц, и типа RCAC 7032 для области длин волн короче 620 тц.
[3 качестве источника света для ультрафиолетовой об- |.1сги используется водородная лампа низкого напряжения с подогревным катодом, для видимой области — 32-ваттная лампа автомобильного типа.
На рис. 1—2 изображена схема расположения частей и спектрофотометре типа Бекман. По этой же схеме по- проены приборы, выпускаемые в СССР, спектрофотометры СФ-4.
ваодная и вбллоЗнаяваодная и вбллоЗнаяКварцевая призмаКварцевая призмащелищелиРис. 1. Ход лучей в спектрофотометре.Рис. 1. Ход лучей в спектрофотометре.Основными частями прибора, кроме указанных источников света, являются монохроматор, камера для квар-
ваодная и вбллоЗная
ваодная и вбллоЗная
Кварцевая призма
Кварцевая призма
щели
щели
Рис. 1. Ход лучей в спектрофотометре.
Рис. 1. Ход лучей в спектрофотометре.
Конбенсорное зеркало
Источник света
новых или стеклянных кювет и фотометрическое устрой- с| во, позволяющее производить сравнительную оценку световых потоков с применением фотоэлементов. Измери- юльная шкала на спектрофотометре градуирована таким образом, что позволяет регистрировать измерения в процентах пропускания ( 7-IOO ) или в величине Д (т. е. оптической плотности, 1g -у ), длины волн на спектро- фотометре выражены в миллимикронах.
При использовании в аналитической практике спектрофотометрии пользуются законом Ламберта — Буга — Бэра, кратко выражающимся формулой:
1g -^ =Ес/,
где Jo — интенсивность падающего света;
J — интенсивность света, прошедшего через поглощающую среду (испытуемый раствор);
/—толщина слоя испытуемого раствора;
Е—молярный коэффициент погашения;
с — концентрация вещества в г/л.
Очень широко применяется символ £ым, который связан с молекулярным коэффициентом погашения £“смЬ(Е):
1см ' (о = Е, где М — молекулярный вес.
Этой величиной вначале, пользовались лишь при определении концентрации витамина А в различных образ-
ШкалаШкалаВключение фотоэлементаВключение фотоэлементаТемновой■полТемновой■полУстановка диафрагмы (микро)Установка длины волныУстановка диафрагмы (микро)Установка длины волныКрышка ячейки для кюветКрышка ячейки для кюветУстановка кюветУстановка кюветСалазки для кюветСалазки для кюветКнопка —, включения ’Кнопка —, включения ’Установка\светофильтровУстановка\светофильтров'Держатель кювет'Держатель кювет'Кюветы с крышками'Кюветы с крышкамиРис 2 Спектрофотометр типа Бекман (Beckmann bulletin, 89 А)Рис 2 Спектрофотометр типа Бекман (Beckmann bulletin, 89 А)экстинкаич
Шкала
Шкала
Включение фотоэлемента
Включение фотоэлемента
Темновой
■пол
Темновой
■пол
Установка диафрагмы (микро)
Установка длины волны
Установка диафрагмы (микро)
Установка длины волны
Крышка ячейки для кювет
Крышка ячейки для кювет
Установка кювет
Установка кювет
Салазки для кювет
Салазки для кювет
Кнопка —, включения ’
Кнопка —, включения ’
Установка
\светофильтров
Установка
\светофильтров
'Держатель кювет
'Держатель кювет
'Кюветы с крышками
'Кюветы с крышками
Рис 2 Спектрофотометр типа Бекман (Beckmann bulletin, 89 А)
Рис 2 Спектрофотометр типа Бекман (Beckmann bulletin, 89 А)
Нуль - гальванометр
Корпус монохроматора
Установка диафрагмы (макро)
Задвижка
Камера для лампыКрышка
Окошко монохроматора (выход светового потока)Окошко монохроматора (вход светового потока)Камера светофильтровСветофильтре/Окошко монохроматора (выход светового потока)Окошко монохроматора (вход светового потока)Камера светофильтровСветофильтре/Щель светового потокйЩель светового потокйцах рыбьих жиров, когда еще не был известен молекулярный вес витамина. Но эта величина оказалась очень удобной для характеристики испытуемого продукта. £1см яо сих П0Р не имеет какого-либо общепринятого наименования, им пользуются для характеристики поглощения света каким-либо соединением, независимо от того, известен его молекулярный вес или нет. Эта- величина является постоянной лишь при определенной длине волны и в определенном растворителе.
Окошко монохроматора (выход светового потока)
Окошко монохроматора (вход светового потока)
Камера светофильтров
Светофильтре/
Окошко монохроматора (выход светового потока)
Окошко монохроматора (вход светового потока)
Камера светофильтров
Светофильтре/
Щель светового потокй
Щель светового потокй
Вычисление Е}^ раствора испытуемого вещества в кювете толщиной 1 см производят по формуле:
в1%_ ^найд.У
1СМ а. 100
|Де Енайд. — экстинкция раствора, обнаруженная на спектрофотометре при заданной длине волны;
и — разведение в мл; а — навеска в г.
Здесь уместно отметить, что измерение максимума абсорбции для той или другой цветной реакции или растворов веществ, обладающих естественной окраской, позволяет выбрать светофильтр с известной длиной волны для последующего его использования при фотоколориметри- ческом измерении окраски. Так, например, цветная реакция витамина А с треххлористой сурьмой в хлороформном растворе имеет максимум абсорбции света при X = 620 тц, следовательно, для этой реакции используют красный светофильтр с максимумом пропускания света при X = 620 тц и с поглощением света в соседних областях спектра.
ПОЛЯРОГРАФИЯ
Полярографический метод анализа, детально разработанный Я. Гейровским (1951), основан на интерпретации поляризационных кривых, получающихся при восстановлении или окислении веществ в электролизере, в котором одним электродом является ртуть, падающая каплями из очень тонкого отверстия капиллярной трубки, а другим электродом — неподвижный слой ртути на дне электролизера. По характеру таких поляризационных кривых имеется возможность определить как природу, так и концентрацию восстанавливающихся и окисляющихся веществ, находящихся в растворе.
В некоторых благоприятных случаях на одной полярограмме можно одновременно открыть и определить несколько различных веществ. Метод особенно пригоден для малых концентраций (10-6— 10-2 мол/л), и так как для выполнения анализа достаточно очень малого объема
раствора, то можно определить следы вещества. Этот метод применим для определения разнообразных органических веществ и большинства обычных восстанавливающихся неорганических ионов. Это обстоятельство, а также возможность производить одновременно качественный и количественный анализ делают полярографический метод ценным дополнением к существующим химическим методам.
Рис. 3. Простейшая установка для получения кривых силы тока.
А — электролизер; В — ртутный капельный электрод (катод), С—неподвижный слой ртути (анод).
На капельном электроде восстанавливаются большое количество разнообразных органических веществ, альдегиды и кетоны, ненасыщенные кислоты, нитро- и нитрозосоединения, азо- и диазосоединения, хиноны и многие другие. Все они дают хорошо выраженные волны.
В основе полярографического метода лежит, как уже сказано, электролитический процесс. Электролитические реакции характеризуются прохождением электрического тока между раствором и электродами, и величина силы тока является мерой скорости электродных реакций. В любом электролизере на одном электроде происходит электровосстановление (катод), на другом—электроокисление (анод); оба процесса эквивалентны. Кривая зависимости получаемой силы тока от приложенной к электролизеру электродвижущей силы э. д. с. называется кривой силы тока — напряжение. Полярографический 16
анализ и сводится к получению такой кривой зависимости силы тока от напряжения.
На рис. 3 показана простейшая установка для получения кривых сил тока — напряжение (полярограммы), где Л — электролизер, содержащий исследуемый рас- тво,р, В — ртутный капельный электрод (катод), С— неподвижный слой ртути, являющийся вторым электродом (анод).
Рис. 4. Поляризационная кривая.
Измерение проходящего через электролизер тока производят включенным в цепь чувствительным зеркальным гальванометром.
Анод вследствие большой величины своей поверхности практически не поляризуется и потенциал его остается постоянным. Поверхность катода непрерывно обновляется. Благодаря этому исключается возможность осложнения картины электролиза какими-либо побочными явлениями, вызванными накоплением восстанавливающихся веществ на катоде. Это свойство ртутного капельного электрода обеспечивает воспроизводимость и обратимость электролитического процесса.
На рис. 4 представлена поляризационная кривая. Как видно, через электролизер вначале протекает только
2 В. А. Девятины 17
чрезвычайно слабый, так называемый остаточный ток до тех пор, пока не достигнут потенциал разложения испытуемого вещества. С этого момента начинается непрерывный электролиз, сила тока растет. Она не увеличивается беспрерывно, но постепенно подходит к пределу и,
V Вольты
(Е, чуВстбителблость г ВО)
Рис 5 Восстановление тиамина
наконец, становится постоянной и независимой от приложенной э. д. с. Высота предельного тока прямо пропорциональна количеству вещества, поступающего из раствора к поверхности катода (рис. 5).
Для качественной характеристики испытуемого объекта достаточно графически определить потенциал полуволны (середину полярографической волны); он завнсиг не от концентрации восстанавливаемого вещества, а только от его природы.
Одной из помех при полярографировании является растворенный кислород, восстанавливающийся раньше 18
многих других веществ; его удаляют предварительным пропусканием через испытуемый раствор азота. Подавление кислородной волны может быть также достигнуто
Рис 6 Электронный регистрирующий полярограф Центральной лаборатории автоматики Энергочермета
добавлением к поляризуемому раствору 0,1% раствора желатины.
В настоящее время имеется много систем полярогра- фов; в частности, в СССР выпускаются прецизионные ав-
ные полярограммыные полярограммы01=0,08мм01=0,08ммЛ=5ммЛ=5ммРис 7. Капилляр сприпаянной «лопа-точкой»Рис 7. Капилляр сприпаянной «лопа-точкой»
ные полярограммы
ные полярограммы
01=0,08мм
01=0,08мм
Л=5мм
Л=5мм
Рис 7. Капилляр сприпаянной «лопа-точкой»
Рис 7. Капилляр сприпаянной «лопа-точкой»
торегистрирующие полярографы центральной лабораторией автоматики Энергочермета. Эти полярографы просты в работе и позволяют получать отчетливо выражен
автоматическим путем (рис. 6).
Несмотря, однако, на различие систем полярографов, принцип работы с ними заключается лишь в том, что вначале необходимо подобрать такой раствор («фон»-), в котором испытуемое вещество при восстановлении на электроде давало бы наиболее четкую волну восстановления В качестве таких фонов применяют растворы кислот, щелочей, некоторых солей, буферные растворы с определенным значением pH, а также используются четвертичные аммонийные основания. Полученная кривая восстановления сравнивается с кривой для стандартного чистого вещества, что дает возможность не только идентифицировать данное соединение, но и определить его количество в испытуемом растворе.
Детальное описание различных методов полярографического анализа изложено многими авторами, в частности Я. Гёйровским (1937, 951).
Для правильной работы поляро- графа имеет большое значение по
стоянство массы ртути, вытекающей из капилляра, в связи с чем капилляр подбирается такого диаметра, чтобы в течение 3 секунд из него вытекало постоянное количество ртути (1 капля), что устанавливается при помощи секундомера. Для этих целей более всего подходят капилляры с внешним диаметром 0,5 см и внутренним просветом 0,08 мм.
Во избежание осцилляции часто к концу капилляра, как это показано на рис. 7, припаивается капелька стекла («лопаточка»), о которую вытекающая капля ртути разбивается, создавая равномерное напряжение в электролитической сети.
Большое значение имеет; также температура раствора, при которой снимается полярограмма. Для этой цели удобно пользоваться специальными электролитическими ячейками, снабженными рубашкой, в которую пропускается вода из термостатированной бани. Рекомендуется для этой цели применять ультратермостатные бани, позволяющие регулировать температуру воды до 0,1°.
С помощью полярографических методов удается провести определение таких веществ в смеси, как, например, альфа-ионон, бета-ионон, псевдоионон, в связи с различным потенциалом их восстановления, что при помощи других методов, даже спектрофотометрических, не всегда удается.
ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ
За последние годы хроматография на бумаге различных соединений, в том числе и витаминов, получила широкое распространение. С помощью хроматографии на бумаге удается разделить сложные смеси близких по своим свойствам или родственных соединений. При этом метод разделения настолько прост, что доступен для осуществления в любой лаборатории.
Наиболее прост и удобен метод восходящей хроматографии, который осуществляется следующим образом, в стеклянный цилиндр или какой-либо другой подходящего объема сосуд, герметически закрывающийся пробкой (можно пользоваться вегетационными сосудами с пришлифованной стеклянной пластинкой и т. п.), наливают слоем 4—5 см подходящий растворитель. Хроматографическую бумагу разрезают на полоски шириной 5—6 см и такой длины, чтобы, будучи помещены в цилиндр, они могли быть подвешены строго вертикально (рис. 8).
На полоску хроматографической бумаги наносят микропипеткой 0,01—0,001 мл испытуемого раствора (в соответствующем разведении), а рядом (на расстоянии 2—3 см) — такое же количество стандартного раствора в качестве «свидетеля» с точно известной концентрацией. Обе капли должны находиться на строго горизонтальной линии, которую обычно проводят на бумаге; каждую из них очерчивают карандашом («линия старта»). Полоски подвешивают при помощи стеклянных крючочков
или другим способом к пробке цилиндра; при этом нижний конец полоски должен быть погружен на 0,5—1 см в налитый на дно цилиндра растворитель, а нанесенные капли должны располагаться на 1—2 см выше растворителя.
Цилиндр закрывают и оставляют на несколько часов (от 3 до 20), пока растворитель не продвинется на воз-
Рис. 8. Хроматографическая камера.
можную высоту полоски. Нельзя допускать продвижение растворителя на всю длину полоски.
После этого полоски вынимают из цилиндра, просушивают (на воздухе, у открытой дверки вытяжного шкафа или в сушильном шкафу в зависимости от характера анализируемого вещества) и затем при помощи стеклянного пульверизатора обрызгивают их проявляющим реактивом. Тотчас же после высушивания на полосках проступают пятна: одно пятно — «свидетеля», другое пятно — вещества, находящегося в анализируемом растворе.
При помощи миллиметровой линейки или миллиметровой бумаги измеряют расстояние (в миллиметрах) 22
от места нанесения пятна («старт») до той линии, на которую поднялся растворитель («фронт растворителя»),— «а» и расстояние от места нанесения пятна до места его нового положения на хроматограмме («фронт вещества») — «Ь». При одних и тех же условиях (качество бумаги, растворитель, температура и время разгонки хроматограммы) высота подъема растворителя и исследуемого вещества по бумаге будет одинаковой и строго постоянной для каждого отдельного вещества. Эту высоту можно вычислить, исходя из отношения «фронта вещества» к «фронту растворителя». Эту величину принято обо* значать /?о («фронт разгонки»), она всегда меньше единицы:
Если Rt пятна испытуемого вещества в точности.совпадает с Rt пятна стандарта, то это значит, что в испытуемом растворе содержится только то вещество, что было принято аналитиком в качестве стандарта. На рис. 9 дан пример хроматографического разделения фосфорных эфиров тиамина.
В большинстве случаев исследуемая смесь на хроматограмме дает два, три или более пятен, что указывает на наличие в ней соответственно двух, трех или более соединений. Для того чтобы охарактеризовать эти соединения, необходимо в качестве свидетелей применять те соединения, наличие которых предполагается в испытуемом растворе. В последнем случае в качестве свидетеля применяют смесь этих веществ или, что более правильно, на линии старта рядом с испытуемым раствором наносят капли всех предполагаемых в растворе веществ.
Так, если анализируется раствор пентоз, в качестве свидетелей применяют рибозу, арабинозу и другие углеводы, присутствие которых подразумевается в испытуемом растворе.
Пятна испытуемого раствора на бумаге должны иметь те же значения Rf, что и «свидетели»; если же это не соблюдается, значит в растворе содержатся какие-то другие, неидентифицированные соединения.
Очень удобен также способ радиальной хроматографии, значительно сокращающий время исследования и позволяющий на одной хроматограмме размещать 6—8 и более испытуемых веществ. Для этого на дно эксикатора
ставят чашку с выбранным растворителем, на вставку эксикатора накладывают диск из фильтровальной бумаги,
в центре которого делают отверстие и через него пропускают туго скрученный фитиль из фильтровальной бумаги, опускающийся в растворитель. Капли размещают строго
Рис. 9. Пример хроматографического разделения фосфорных эфиров тиамина.
в — «свидетели*, б — исследуемый продукт
Разгонку хроматограмм можно осуществить за 3—4 часа. Этим способом удается разделить и качественно определить состав разных сложных смесей и выделить из этих смесей одно или несколько индивидуальных веществ.
Обычно не ограничиваются только качественным разделением смеси; большей частью бывает необходимо определить количество отдельных компонентов в смеси. Для этого поступают следующим образом: в цилиндр помещают в совершенно одинаковых условиях на одной и той же высоте две полоски бумаги и хроматографируют, как описано. После высушивания обеих полосок одну из них проявляют, другую не проявляют, но накладывают на первую (проявленную), очерчивают на непроявленной полоске расположение пятен проявленной полоски и очерченные места аккуратно вырезают. Вырезанные участки
с непроявленной полоски подвергают экстракции подходящим растворителем (вода, органические растворители и т. п.). Полученные растворы доводят в мерных колбах до нужного объема и подвергают анализу одним из принятых для этих веществ методом, учитывая, что концентрация вещества в них обычно составляет гаммы или десятки гамм.
Зная концентрацию исходного вещества в объеме, нанесенном на хроматограмму (обычно 0,01 мл), нетрудно рассчитать процентное содержание исследуемых веществ в смеси. Широко распространен также анализ полученных растворов при помощи спектрофотометра, что значительно сокращает сроки проведения исследования и дает точные результаты.
С помощью хроматографии на бумаге можно отделить витамин А от продуктов его распада, разделить различные формы витамина A, D, Е, К, разделить витамины группы В и их дериваты, идентифицировать витамин В12, отделить витамин С от продуктов его превращения, разделить флавоновые вещества и кахетины и т. п. Краткий обзор по этому вопросу составлен еще в 1958 г. (В. А. Девяткин).
По теории и технике хроматографического анализа на бумаге имеется обширная Литература. В частности, этот вопрос подробно освещается в ряде работ [Р. Блок, Р. Лестранж, Г. Цвейг, 1954; В. В. Рачинский, Т. Б. Га- пон, 1953; Ф. М. Шемякин, Э. С. Мицеловский^Д. В. Романов, 1955; Г. В. Самсонов, 1955; Хайс и Мацек (Hais, Ма- сек, 1958); сборник «Хроматография» под редакцией Опинского (Opiensky, 1957)].
Здесь мы не касаемся техники хроматографии в тонком слое, на стеклянных или фарфоровых пластинках. Этому разделу хроматографии посвящена специальная литература.
а с т ъ вторая
ОПИСАНИЕ СПЕЦИАЛЬНЫХ
МЕТОДОВ АНАЛИЗА
В ПРОИЗВОДСТВЕ
ВИТАМИНОВ
Материал в настоящем разделе расположен в следующем порядке: витамин А, витамины группы В, витамины С, D, Е, К, Р и т. д., что представляет известные удобства для отыскания нужных сведений.
Описываемые в настоящем разделе методы разрабатывались в химико-аналитической лаборатории и других лабораториях ВНИВИ, инженерами и техниками витаминных заводов, заимствованы из смежных отраслей промышленности. Эти методы прошли определенную проверку в производственных условиях и используются в практике контроля производства.
В этом разделе изложены методы контроля в производстве синтетических витаминов А, Bj, В2, В6, РР, пара-аминобензойной, пантотеновой и фолиевой кислот, витамина С (синтетического и естественного), а также витаминных препаратов, получаемых из естественного сырья (витамины D, Е, Р, Bi2). По ряду продуктов приводится несколько методов, которые могут быть использованы в лабораториях, и их следует рассматривать как рекомендуемые автором книги.
Описание приготовления некоторых реактивов выделено в самостоятельный раздел.
Летоды контроля в синтезе витамина А
МЕТИЛВИНИЛКЕТОН
с4н6ос4н6оеоцветная легкоподвижная жидкость, г. кип. 80—81°, м. вес 70. Уд. вес приеоцветная легкоподвижная жидкость, г. кип. 80—81°, м. вес 70. Уд. вес при( HjCOCH = сн2
с4н6о
с4н6о
еоцветная легкоподвижная жидкость, г. кип. 80—81°, м. вес 70. Уд. вес при
еоцветная легкоподвижная жидкость, г. кип. 80—81°, м. вес 70. Уд. вес при
20°—0,86. Хорошо растворим в органических растворителях, смешивается с водой. Неустойчив при хранении и легко полимеризуется, поэтому его хранят при температуре не выше 5° с добавлением небольшого количества гидрохинона. В производстве метилвинилкетон получают из винилацетилена:
Н2О
нс = с — сн = сн2 —1>СН3СОСН = сн2
По условиям технологического процесса метилвинилкетон не должен содержать более 0,5% влаги.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛАЖНОСТИ ПО ФИШЕРУ
Точную навеску метилвинилкетона в количестве 2—3 г титруют в сухой колбе реактивом Фишера до перехода окраски от желтой в красно-бурую.
Расчет содержания влаги в процентах (х) производят по формуле-
V-/C-100
где и — количество реактива Фишера, пошедшее на титрование, в мл;
К — титр реактива Фишера (должен быть от 0,003 до 0,004);
а — навеска в г.
ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯМЕТИЛВИНИЛКЕТОНА И ФОРМАЛЬДЕГИДА
Метод полярографического определения метилвинил- кетона и формальдегида (если в продуктах синтеза присутствует ацетон, он не мешает определению) разработан в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. А. Девяткиным и И. А. Солуниной,
Определение метилвинилкетона
Полярографические кривые метилвинилкетона снимают на фоне ацетатного буферного раствора (рН = 3) в водной среде с добавлением 0,1% раствора желатины. Потенциал восстановления метилвинилкетона в описанных условиях — 0,95 в. Полученные кривые оценивают по калибровочной кривой, построенной по стандартному препарату.
Присутствие формальдегида не мешает определению, так как в кислой среде формальдегид не восстанавливается.
Определение. Точную навеску испытуемого вещества в количестве 50—100 мг, взятую в колбе с притертой пробкой, в которую предварительно налито около 10 мл дистиллированной воды, переносят (дистиллированной водой) в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. Для определения в эрленмей- еровскую колбу с притертой пробкой отбирают пипеткой из полученного раствора 1—2 мл из расчета содержания 0,5—1 мг метилвинилкетона и доводят общий объем раствора дистиллированной водой до 10 мл. К содержимому колбы приливают 1 мл 0,1% раствора желатины и 9 мл ацетатного буферного раствора (pH = 3) и снимают полярографическую кривую. Для этого полученный раствор помещают в ячейку полярографа, пропускают в течение 3—5 минут ток азота и затем производят съемку полярограммы, начиная с 0,8 в.
Оценку полярограммы производят сравнением со стандартным препаратом по калибровочному графику. Расчет процентного содержания метилвинилкетона (х) производят по следующей формуле:
и-С-и2-10О
X = ,
где и — объем, в котором растворена навеска, в мл;
С — количество метилвинилкетона, найденное по калибровочному графику, в мг;
yt — объем раствора, взятый для полярографи- рования, в мл;
а — навеска в мг;
п2 — общий объем раствора, взятый для поляро- графирования, в мл;
100 — пересчет в %.
Построение калибровочного графика. В колбе с притертой пробкой, содержащей около 10 мл дистиллированной воды, взвешивают 50 мг стандартного препарата метилвинилкетона. Содержимое колбы переносят дистиллированной водой в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем водой до метки. Для построения калибровочного графика в эрленмейеровские колбы с притертыми пробками отбирают количество раствора, соответствующее 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 мг метилвинилкетона, и доводят объем каждого из них водой до 10 мл. В каждую колбу добавляют по 1 мл 0,1% раствора желатины и по 9 мл ацетатного буферного раствора (pH = 3). Полученные растворы поочередно помещают в ячейку полярографа, пропускают в течение 3—5 минут ток азота и производят съемку полярографической кривой начиная с 0,8 в.
Калибровочный график зависимости величины диффузионного тока от концентрации метилвинилкетона в растворе строят, откладывая по оси абсцисс концентрации раствора в мг/мл, а по оси ординат — соответствующие им высоты волн величины диффузионного тока в рА.
Определение формальдегида
Полярографические кривые формальдегида снимают на фоне 0,1 н. раствора LiOH в водной среде с добавлением 0,1% раствора желатины. Потенциал восстановления формальдегида в описанных условиях— 1,55—1,6 в.
Полученные полярограммы оценивают по калибровочному графику.
Определение. В мерной колбе емкостью 25 мл взвешивают 0,2—0,3 г испытуемого вещества, растворяют в воде и доводят объем раствора водой до метки. Для определения отбирают пипеткой количество раствора, соответствующее содержанию в нем 3—6 мг формальдегида, в эрленмейеровскую колбу с притертой пробкой, доводят объем раствора дистиллированной водой до 10 мл, затем добавляют 1 мл 0,1% раствбра желатины и 9 'мл 0,1 н. раствора LiOH и снимают полярографическую кривую, как описано выше.
Расчет процентного содержания формальдегида (х) производят, пользуясь калибровочным графиком, по следующей формуле:
у-С-Уу 100х«=,
а ух
где и — объем, в котором растворена навеска, в мл;
С — количество формальдегида, найденное по калибровочному графику, в мг/мл;
а — навеска вещества в мг;
Ui — объем раствора, взятый для полярографи- рования, в мл;
^2 — обн{ий объем раствора, взятый для поляро- графирования, в мл;
100 —пересчет в %.
Построение калибровочного графика. В мерной колбе емкостью 25 мл взвешивают 0,25 г формалина, содержащего 36—40% формальдегида (определенного по Госфармакопее СССР IX издания) или гидроксиламиновым методом растворяют в дистиллированной воде и объем раствора доводят до метки.
Для построения калибровочного графика отбирают пипеткой в колбы с притертыми пробками количества раствора, соответствующие 1,75; 3,5; 10,5; 14 mV формальдегида и доводят объем каждого из них дистиллированной водой до 10 мл, затем добавляют по 1 мл 0,1% раствора Желатины и по 9 мл 0,1 н. раствора LiOH и снимают для каждого раствора полярографическую кривую, как описано выше, начиная с 1,4 в.
Калибровочный график строят, откладывая по оси абсцисс концентрации раствора формальдегида в мг/мл, а по оси ординат — соответствующие им высоты волн величины диффузионного тока в цА.
МЕТИЛ-3-ПЕНТЕН-2-ИН-4-ОЛ-1
(Первичный ацетиленовый карбинол)
СН3
с6н8оМ. вес 96с6н8оМ. вес 96нс = с — <i = сн — сн2он
с6н8о
М. вес 96
с6н8о
М. вес 96
Бесцветная подвижная жидкость, т. кип. 92—95° при 45 мм, п^° = 1,4834. Уд. вес при 20° — 0,913. Растворим в эфире, хлористом метилене, ограниченно растворим в воде. При стоянии темнеет. Хранят в ампулах, запаянных под азотом.
Метод определения первичного ацетиленового карбинола разработан в синтетической лаборатории ВНИВИ Г. И. Самохваловым и М. А. Миропольской. Этот метод основан на реакции образования растворимых ацетиле- нидав с выделением свободной азотной кислоты при взаимодействии ацетилена с концентрированными растворами азотнокислого серебра
НС г CH + 8AgNO3 -> AgC = CAg-6AgNO3 + 2НМОЭ.
В аналогичную реакцию вступают также производные ацетилена.
В случае метил-3-пентен-2-ин-4-ол-1 реакция протекает по уравнению:
НС = С-С = СН — СН2ОН + 7AgNO3-» AgC = С — С = СН —с!нэ(!н3
— CH2OH-6AgNO3 + HNO3.
Выделяющуюся при этом азотную кислоту определяют титрованием.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
(по прописи Г. И. Самохвалова и М. А. Миропольской)
К 20 мл 2 м. раствора AgNOs добавляют не более 3—4 капель индикатора метилового красного, нейтрализуют 0,1 н. раствором щелочи, в раствор вносят точную
3 В А Девяткин
навеску карбинола в количестве 0,1 г и после ее растворения выделившуюся азотную кислоту оттитровывают 0,1 н. раствором-КОН до появления желтого окрашивания. Расчет процентного содержания карбинола (х) производят по формуле:
v-0,0063-1,523-100х =,
а
где а — навеска карбинола в г;
1,523 —постоянный коэффициент;
и —количество точного 0,1 н. раствора КОН, пошедшее на титрование, в мл;
0,0063 — количество HNOs, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора КОН, в г.
ФЕНОЛЯТ НАТРИЯ
^\/ONa
IC6HsONa
\/М. вес 116
Белый мелкокристаллический гигроскопический порошок.
В контроле производства с продуктом производят качественную реакцию и определяют его влажность по прописи Г. И. Самохвалова и М. А. Миропольской (синтетическая лаборатория ВНИВИ).
КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ФЕНОЛ
Растворяют 2 г продукта в 1 мл 96% этилового спирта, добавляют 2 капли 1 % спиртового раствора FeCl3. Раствор окрашивается в зеленый цвет, переходящий при разбавлении водой в фиолетовый.
Определение влажности
Точную навеску фенолята в количестве около 1 г высушивают в высушенном и взвешенном бюксе в вакуум- эксикаторе над твердым NaOH в течение суток и взвешивают. Содержание влаги вычисляют обычным путем.
ЦИТРАЛЬ
I юН16ОM вес 152,1
Существует в виде следующих изомеров:
Н3С
Цитраль а:)С = CH — СН2 — СН2 — С — СН3
Н3С/||
н - с — сон
Н3С
Цитраль Ь. )С = СН — СН2 — СН2 — С — СН3 н3с/||
нос — с — н н3с
Изоцитраль. С = CH — СН2 -СН = С — СН2 — СОН
Нз^кн3
Таким образом, природный цитраль является смесью двух или более изомерных алифатических альдегидов, обладающих одинаковой эмпирической формулой.
Цитраль представляет собой жидкость с приятным лимонным запахом, бледно-желтого цвета. Отдельные изомеры цитраля различаются по своим свойствам (табл. 1).
Таблица 1
Физико-химические свойства цитраля
Изомер
Точка кипения при 12 мм
„20
Удельный вес (при 20°)
Цитраль а
110—112°
1,4891
0,8898
» b
102—104°
1,4891
0,8888
Изоцитраль
95—97°
—
0,8860
Цитраль оказывает противогистаминное действие, в больших разведениях (1:10 000 или »1:100 000) расширяет сосуды и вызывает снижение кровяного давления (Н. А. Преображенский, Э. И. Генкин, 1953). Используется в медицинской практике
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Метод разработали М. Гернох, И. Докупил и Б. Чутки (1953). Излагается по прописи В. И. Колтуновой (химико-аналитическая лаборатория ВНИВИ).
Составление калибровочного графика. Точную навеску чистого цитраля в количестве 0,05 г переносят в мерную колбу емкостью 25 мл, растворяют в 96% этиловым спирте и доводят объем раствора спиртом до метки. Из полученного раствора после его тщательного перемешивания отбирают в ряд колб количества раствора, соответствующие 1, 2, 3, 4, 5 мг цитраля, и добавляют в каждую из колб этиловый спирт до 5 мл и по 10 мл 0,5 н. раствора НС1. Полученные растворы помещают в электролитическую' ячейку полярографа, термостатируют (25°), пропускают ток азота и снимают полярограммы начиная от — 0,6 в. Измеряют высоты волн полученных кривых и откладывают их на графике соответственно концентрации цитраля в растворах.
Потенциал восстановления полуволны цитраля Е, = — 0,9 в.
т
Техника метода. Определение содержания цитраля в испытуемом образце проводится в точности так, как описано при составлении калибровочного графика.
Содержание цитраля в испытуемом продукте в процентах (х) вычисляют по формуле:
b-y.100-v2 a-VplOOO где а — навеска в г;
в — количество цитраля, найденное по калибровочному графику, в объеме, взятом для по- лярографирования, в мг;
у— объем, в котором разведена навеска, в мл; У!—-объем раствора, взятый для полярографи- рования, в мл;
^з— общий объем, взятый для полярографиро- ванця, в мл;
100 — пересчет в %.
Примечание. В этих же условиях может быть проведено определение псевдононона (потенциал восстановления полуволны Еи = —0,7 в).
HSC CH3
ПСЕВДОИОНОН
CH — CH = CH — CO
CH-
C13H20O
M. вес 192,3
/ _ P-ионон n20 —'.5208 , 2 — ф-ионон n20 — 1,5295; 3 — а-ионои 20D
nD - 1,4390.
Желтоватая маслянистая жидкость со слабым запахом ионона. Т. кип. 115—120° при 3 мм. Уд. вес 0,9 Хорошо растворим в органических растворителях.
В химико-аналитической лаборатории ВНИВИ Л. Н. Кравчиной сняты абсорбционные кривые для псевдоионона, не описанные в литературе. Согласно полученным данным, пСевдоионон имеет максимум поглощения при X —291 тц, тогда как максимум поглощения для р-ионона лежит при Х=296 шц, а а-ионон при этих длинах волн абсорбционного максимума не имеет (рис. 10), что дало возможность предложить спектрофотометрический способ определения псевдоионона-, который в ряде случаев может явиться единственно возможным в контроле производства витаминных препаратов.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯСПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
(по прописи Л. И. Кравчиной, химико-аналитическаялаборатория ВНИВИ)
Точную навеску ф-ионона в количество около 0,05 г растворяют в 96% этиловом спирте в мерной колбе емкостью 25 мл и доводят до объема спиртом. Из полученного раствора отбирают для второго разведения 0,1 мл в мерную колбу емкостью 50 мл и доводят спиртом до метки. Поглощение света испытуемым раствором измеряют на спектрофотометре при длине волны 291 тр.
Полученное показание поглощения пересчитывают на экстинкцию 1% раствора по формуле:
£1% = E-w,1СМ а-ЮО и/
где Е—показание плотности для ф-ионона при А = 291 тц;
у — объем первого разведения в мл;
*vv— количество первого разведения, взятое для второго разведения, в мл;
■у2— объем второго разведения в мл.
а — навеска в г;
100 — пересчет на 1% раствор.
Определение величины экстинкции для испытуемого раствора и раствора стандартного образца ip-ионона производится аналогичным образом.
Зная экстинкцию стандарта и испытуемого образца, производят расчет содержания псевдоионона в испытуемом образце в процентах (л:) по формуле:
£•100
1203 ’
где Е — Е\см для испытуемого образца;
100 — пересчет в %;
1203 — Е1см для взятого в качестве стандарта образца ф-ионона.
р-ИОНОН
С13Н20ОМ. весС13Н20ОМ. вес192192
С13Н20О
М. вес
С13Н20О
М. вес
192
192
Маслянистая жидкость бледно-желтого цвета с очень сильным характерным запахом, в больших концентрациях напоминающим запах кипариса, в малых—запах фиалок. Т. кип. 114—116° при 3 мм. Уд. вес 0,94. Хорошо растворим в органических растворителях, плохо—в воде.
р-ионон может быть загрязнен а-иононом. Определение чистоты р-ионона в данном случае может быть определено измерением коэффициента преломления. Для этой цели в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ Л. Н. Кравчиной составлена таблица, позволяющая определить процентное содержание р-ионона в образце с учетом примеси а-ионона в количестве от 1 до 28%' (табл. 2).
Рефрактометрический способ может служить для ориентировочных целей. Вместе с тем для анализа р-ионона предложены и другие методы.
В инструкции по методам контроля в синтезе витамина А Пражского института биохимии и фармации описаны спектрофотометрический и полярографический
Таблица 2
Показатели преломления для смеси Р- и а-ионов при разных температурах измерения
Наименование
Процент приме си а ионона
Рефракция при температуре
19°
19 5°
20°
2i/,5°
21°
Р ионон 100%
1,5211
1,5210
1,5208
1,5205
1,5202
а ионон 100%
1,4995
1,4991
1,4989
1,4985
1,49^4
смесн
28,6
1,5148
1,5146
1,5142
1,5140
1,5138
26,2
1,5152
1,5150
1,5148
1,5146
1,5143
23,8
1,5159
1,5156
1,5153
1,5145
1,5142
19,7
1,5169
1,5169
1,5160
1,5160
1,5153
19,3
1,5168
1,5166
1,5162
1,5161
1,5158
15,0
1,5178
1,5178
1,5175
1,5173
1,5166
13,5
1,5178
1,5180
1,5178
1,5174
1,5172
11,0
1,5187
1,5184
1,5182
1,5178
1,5175
10,6
1,5187
1,5184
1,5181
1,5178
1,5175
8,4
1,5190
1,5188
1,5185
1,5183
1,5180
7,0
1,5195
1,5192
1,5190
1,5188
1,5184
4,8
1^200
1,5198
1,5196
1,5193
1,5190
3,7
1,5203
1,5202
1,5200
1,5198
1,5196
1,1
1,5207
1,5204
1,5203
1,5201
1,5198
методы определения р-ионона *; Л. Н. Кравчиной в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ эти методы подверглись проверке и дали хорошие результаты. Ниже излагаются спектрофотометрический и полярографический методы с некоторыми изменениями и уточнениями, которые были внесены в процессе работы.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯСПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
(по прописа Л Н. КрАвчиной)
Точную навеску р-ионона в количестве около 0,06 г растворяют в 96% этиловом спирте в мерной колбе емкостью 25 мл и доводят спиртом до метки. Из полученного раствора отбирают 0,1 мл в мерную колбу емкостью 25 мл и доводят спиртом до метки. Поглощение света по-
Инструкция по методам контроля Институт биохимии и фармации Прага, 1956
[ученным раствором измеряют на спектрофотометре при Л = 296 тр. Полученное показание плотности пересчитывают на Erm по формуле
1СМ а-100 v/
где Е— показание плотности, найденное при Х = 296 тр;
-и— объем первого разведения в мл;
у,— количество первого разведения, взятое для второго разведения, в мл;
-и2— объем второго разведения в мл; а— навеска р-ионона в г;
100— пересчет на 1 °/о раствор.
Определение величины экстинкции для анализируемого образца р-ионона, принятого в качестве стандартного, проводится аналогично. Величину экстинкции
Рис 11 Абсорбционные кривые альдегида Си, ₽ ионона и их смесиРис 11 Абсорбционные кривые альдегида Си, ₽ ионона и их смеси
Рис 11 Абсорбционные кривые альдегида Си, ₽ ионона и их смеси
Рис 11 Абсорбционные кривые альдегида Си, ₽ ионона и их смеси
стандарта находят предварительно повторением взятия навесок и разведений и последующих измерений для
установления настоящей величины, которая затем и принимается при всех расчетах.
Зная экстинкцию для стандарта и для испытуемого образца, производят расчет процентного содержания g-ионона (х) в испытуемом образце по формуле:
£г100
где Ег — £1смдля испытуемого, найденная;
553 — ^смДля стандартного образца р-ионона;
100 — пересчет в ’% •
АЛЬДЕГИД Си
(9-метил-7) 1, 1,5-триметилциклогексан-5-ил(-бутан-8-аль).
Н3С СН3
С]4Н22ОМ. вес 206,37С]4Н22ОМ. вес 206,37f^—СН2 — СН == С — СНО
С]4Н22О
М. вес 206,37
С]4Н22О
М. вес 206,37
СН3
Светло-желтая маслянистая жидкость. Т. кип. 50—55° при 10-3 мм, п*0—1,5113—1,5117. Хорошо растворяется в органических растворителях, плохо—в воде. На воздухе быстро разлагается, поэтому его хранят на холоду в ампулах, запаянных под азотом.
ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТРАЛЯ,Ф-, ₽-, а-ИОНОНА И АЛЬДЕГИДА Си
В Пражском институте фармации и биохимии разработаны и широко используются полярографические методы в контроле производства синтетического витамина А [Кноблох (Knobloch, 1956)]. '
В основу описанной ниже методики, используемой в нашей лаборатории, положена инструкция Пражского института биохимии и фармации с изменениями и дополнениями, предложенными В. И. Колтуновой.
Определение цитраля и псевдоионона. Полярографические кривые цитраля и псевдоионона снимают на фоне 0,5 н. НС1 в среде 45% этанола и по высоте волн сравнивают со стандартными препаратами по калибровочным
। рафикам (рис 12). Потенциал восстановления в этих \словиях при измерении с насыщенным каломельным электродом для цитраля равен—0,9 в, для псевдоионо- па—0,73 в.
Построение калибровочного графика. В мерной колбе емкостью 25 мл взвешивают-50 мг стандартного препа-
0,966мг0,966мгО 0,2 00 0,6 0,8 1,0 1,2 1,0 1,61,8 2,01/100О 0,2 00 0,6 0,8 1,0 1,2 1,0 1,61,8 2,01/1001—।1—।—।—г—!—।—।—f0 0,2 0,0 0,60,8 1.01,2 1.0 1,6 1,8 2,0 1/1001—।1—।—।—г—!—।—।—f0 0,2 0,0 0,60,8 1.01,2 1.0 1,6 1,8 2,0 1/100
0,966мг
0,966мг
О 0,2 00 0,6 0,8 1,0 1,2 1,0 1,61,8 2,0
1/100
О 0,2 00 0,6 0,8 1,0 1,2 1,0 1,61,8 2,0
1/100
1—।1—।—।—г—!—।—।—f
0 0,2 0,0 0,60,8 1.01,2 1.0 1,6 1,8 2,0 1/100
1—।1—।—।—г—!—।—।—f
0 0,2 0,0 0,60,8 1.01,2 1.0 1,6 1,8 2,0 1/100
Рис 12 Полярографические кривые стандартных растворов Р-ионона
рата, растворяют в 96% этиловом спирте, доводят им до метки и тщательно перемешивают.
Из полученного раствора отбирают количество миллилитров, соответствующее 1, 2, 3, 4, 5, 6 мг препарата, и доводят объем каждого из них до 10 мл этиловым 96% спиртом, добавляют по 10 мл 0,5 н раствора НС1 и перемешивают. Полученные растворы поочередно помещают в ячейку полярографа, в течение 5 минут пропускают ток азота и затем производят съемку полярографической кривой, начиная с —0,6 в для цитраля и с —0,4 в для псевдоионона Высоту волн наносят на график
по оси ординат соответственно взятой концентрации, отложенной по оси абсцисс.
Определение. Точную навеску вещества в количестве от 50 до 100 мг помещают в мерную колбу емкостью 25 мл, растворяют в 96% этиловом спирте и доводят спиртом до метки. Для определения отбирают количество раствора, соответствующее содержанию в дем 2—4 мг препарата, доводят объем этиловым спиртом до 10 мл и затем добавляют 10 мл 0,5 н. раствора НС1. Снимают кривую, как описано выше.
Оценку производят сравнением со стандартным препаратом по калибровочному графику.
Расчет процентного содержания (х) производят по формуле:
v-C-100-и»х _ ,
a-vt
где и —объем, в котором растворена навеска, в мл; С — количество вещества, найденное по калибровочному графику, в мг/мл;
Di — объем раствора, взятый на определение, в мл;
^2 — общий объем раствора, взятый для поля- рографирования, в мл;
а — навеска в мг;
100 — пересчет в %.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ р-ИОНОНА, а-ИОНОНА И АЛЬДЕГИДА Сц
Полярографические кривые р-ионона, а-ионона и альдегида С14 снимают на фоне ацетатного буфера (рН = 3) в среде 45% этилового спирта с добавлением 0,1% желатины; полученные кривые оценивают по соответствующим калибровочным графикам. Потенциал восстановления р-ионона в описанных условиях равен — 1,04 в, а-ионона— 1,22 в, альдегида Си—1,2 в (по отношению к НКЭ).
Построение калибровочного графика. В мерной колбе емкостью 25 мл взвешивают 50 мг стандартного препарата, растворяют в этиловом спирте, доводят спиртом до метки и тщательно перемешивают. Для построения калибровочного графика отбирают количе- 44
ства раствора, соответствующие 1, 2, 3, 4, 5 мг препарата, и доводят объем каждого из них до 10 мл этиловым спиртом, добавляют по 1 мл 0,1% раствора желатины и по 9 мл ацетатного буферного раствора (pH = 3). Полученные растворы поочередно помещают в ячейку полярогра- фа, пропускают в течение 5 минут ток азота и затем производят съемку полярографической кривой начиная с — 0,8 в для (3-ионона и «-ионона и с — 1,0 в для альде-
Рис 13. Калибровочный график для Р-ионона на фоне ацетатного буфера рН^З.
гида Си. Калибровочный график строят, откладывая по оси ординат высоты волн, а по оси абсцисс — концентрации (рис. 13).
Определение. Точную навеску вещества в количестве от 50 до 100 мг помещают в мерную колбу емкостью 25 мл, растворяют в этиловом спирте и доводят спиртом до метки. Для определения отбирают количество раствора, соответствующее содержанию в нем 2—4 мг препарата, доводят объем этиловым спиртом до 10 мл, добавляют 1 мл 0,1% раствора желатины, 9 мл ацетатного буферного раствора (рН = 3) и снимают полярографическую кривую, как описано выше.
Оценку производят сравнением со стандартным препаратом по калибровочному графику. Расчет процентного содержания вещества (х) производят по формуле, изложенной выше.
АКСЕРОФТОЛ (ВИТАМИН А)
Витамин А является ненасыщенным алкоголем. С жирными кислотами образует эфиры (пальмитат, стеарат и др.). Дает цветные реакции с растворами треххлористой сурьмы, треххлористого мышьяка, с дихлоргидрином глицерина. При пропускании через колонку с асканитом, бентонитом и другими кислыми глинами адсорбируется с образованием синей окраски. В природе встречается в виде витамина Ai, Аг, Аз как в свободном, так и в этерифицированном состоянии, а также в виде cis- и trans-изомеров. Промышленными препаратами являются синтетический витамин А— ацетат в кристаллическом виде и в масляных растворах и препараты из естественного сырья — концентраты витамина А, получаемые путем молекулярной дистилляции печеночных жиров рыб и морского зверя, выпускаемые в виде растворов, а также в драже и таблетках.
Строение витамина А:
Н3С СН3 СН3 СН3 СН2ОН/X/S/S/S/S/ Витамин А — алкоголь
х/хсн3
Н3С СНз сн3 сн3
1 /СН2ОСОСН3 Витамин А — ацетат
Х/ХСН3
За последние годы широкое распространение получили водно-дисперсные препараты витамина А, усвоение которых организмом превосходит жирорастворимые препараты. С этой точки зрения они представляют определенный интерес, чем и объясняется необходимость их широкого промышленного выпуска. Кроме того, водорастворимые препараты витамина А обладают хорошей устойчивостью при хранении, а методы их анализа предусматривают омыление навески, экстракцию неомыляемых и определение оптической плотности растворов или по ре- 46
Физико-химические свойства
Показатели
Витамин А— алкоголь
Витамин А— ацетат
Состояние вещества
Бледно-
Бледно-
желтые
желтые
иглы
иглы
Формула
С20Н30О
^22^32^2
Молекулярный вес
286,4
328,48
Температура плавле-
63—64°
53—57°
НИЯ
(в пределах 2°)i
Растворимость
Растворяется в больший-
стве органических растворителей; не рас-
творяется
в воде
Биологическая актив-
1 г=ЗЗЗООСО
1 № 2 879 580
иость
ИЕ
ИЕ
Е^см 326 (этанол)
18302
15502
Е}^ 620 (для реак-
4400
ций с треххлористой сурьмой)
Флуоресценция
Зеленая в ультрафиоле-
товом свете
Фактор пересчета
20003
1 ИЕ-0,344т
Стандарт
1 ИЕ=0,3 7
витамина А
витамина А—аце-
тата
По другим данным, 60, 4° (Boldingh. Nature, 1951, 168, 598), 57—58° (S е b г е 11, Н а г г i s Vitamins, 1954, 1).
По данным Boldingh, Е }^м при 325 тц соответственно 1830 и 1561.
Принят во ВНИВИ; также 1894 (USP Reference Standard) и 2000 (АОАС, 1947).
акции с хлоридом сурьмы, или измерением поглощения света на спектрофотометре, как это описано ниже.
Методы определения витамина А основаны либо на реакции его с хлороформным раствором SbCl3, либо на измерении поглощения ультрафиолетовой части спектра спиртовых или хлороформных растворов витамина. Принципиально эти два метода дают совпадающие между собой результаты при условии применения соответ-
ствующего коэффициента перевода экстинкции на биологическую активность в ИЕ (фактор конверсии). Во ВНИВИ этот коэффициент принят равным 2000, что совпадает с рекомендацией Ассоциации американских химиков (1947).
Рис. 14. Абсорбционная кривая витамина А — ацетата.Рис. 14. Абсорбционная кривая витамина А — ацетата.Принцип колориметрического определения витами- том, что подлежащий исследованию концентрат витамина А растворяют в хлороформе (высококонцентрированные препараты омылению не подвергают), с хлороформным раствором проводят реакцию с треххлористой сурьмой в присутствии уксусного ангидрида, образующуюся синюю окраску ввиду ее неустойчивости немедленно измеряют с помощью электрофотоколориметра, пользуясь при этом светофильтром А = 620 тц. Калибровочный график' составляется по кристаллическому
Рис. 14. Абсорбционная кривая витамина А — ацетата.
Рис. 14. Абсорбционная кривая витамина А — ацетата.
витамину А—ацетату. Пользуясь калибровочным графиком, определяют содержание витамина в испытуемом растворе.
Спектрофотометрический метод основан на свойстве витамина А поглощать часть света в ультрафиолетовой части спектра; на длине волны 325—328 гпц находится максимум этого поглощения (рис. 14). Сопоставляя величину экстинкции для испытуемого раствора с величиной экстинкции стандартного раствора (или пользуясь для этого заранее составленной абсорбционной кривой), рассчитывают обычным путем содержание витамина А в испытуемом растворе.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА А В КРИСТАЛЛИЧЕСКОМВИТАМИНЕ А —АЦЕТАТЕ
0,05 г препарата (точная навеска) растворяют в этиловом спирте в мерной колбе емкостью 100 мл (при необходимости можно слегка нагреть на водяной бане при 40—50°). Содержимое колбы охлаждают до 20° и доводят спиртом до метки. Из полученного раствора отбирают 1 мл, переносят в мерную колбу емкостью 25 мл, раствор доводят спиртом до метки и перемешивают. Из
и ого раствора отбирают 1 мл и переносят в мерную колбу емкостью 25 мл, доводят спиртом до метки, перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при Л = 326 тц в кювете с толщиной слоя 1 см.
Содержание витамина А'—ацетата в препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
D.y,.y,.y3.100a-Bj-Ba-lSSO ’
где а — навеска в г;
D —оптическая плотность раствора;
и, —объем первого разведения в мл (100);
By — количество первого раствора, взятое для второго разведения, в мл;
у2 —объем второго разведения в мл (25);
В2 — количество второго раствора, взятое для третьего разведения, в мл;
у3 — объем третьего разведения в мл (25);
1550 — Ei™ удельный показатель поглощения для 100% витамина А — ацетата при 326 пщ.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА А — АЦЕТАТАВ МАСЛЯНЫХ РАСТВОРАХ
Определение может быть проведено одним из следующих методов.
Спектрофотометрический метод
0,1 г масляного препарата (точная навеска) растворяют в абс. этаноле в мерной колбе емкостью 100 мл, доводят им до метки и перемешивают. Полученный раствор разводят абс. этанолом до получения растворов, содержащих около 4 ИЕ витамина А в 1 мл. Измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 326 тц.
Содержание витамина А — ацетата в ИЕ в 1 г (х) вычисляют по формуле:
О-у, .у2-1880
a-lOO-v ’
4949I В А Девяткин
49
49
где D— оптическая плотность раствора;
п, У1 и у2 — разведения в мл;
а — навеска в г;
1880 — коэффициент перевода в ИЕ.
Колориметрический метод
0,1 г препарата (точная навеска) омыляют 10 мл 0,5 н. спиртового раствора едкого кали в колбе с обратным холодильником при нагревании на водяной бане при 80° в течение 30 минут. Добавляют 20 мл воды и экстрагируют неомыляемую фракцию серным эфиром в делительной воронке в хорошо охлажденном растворе при осторожном перемешивании во избежание образования эмульсии 1 раз 50 мл и 2 раза по 25 мл. Соединенные эфирные вытяжки промывают 3—4 раза водой по 20 мл до отсутствия реакции на фенолфталеин, в промытую эфирную вытяжку добавляют 6—8 г безводного сульфата натрия. Оставляют на 30 минут при периодическом взбалтывании и фильтруют. Фильтр промывают .эфиром, собирая эфир в ту же колбу, эфир отгоняют в атмосфере инертного газа. Остаток растворяют в хлороформе, количественно переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят им до метки. Полученный раствор разводят хлороформом до содержания 5—10 ИЕ витамина А в 1 мл. Затем 0,6 мл последнего раствора переносят в кювету электрофотоколориметра, добавляют 2—3 капли уксусного ангидрида, 6 мл насыщенного хлороформного раствора треххлористой сурьмы и измеряют оптическую плотность, пользуясь красным светофильтром (620 тц), не позднее чем через 5—10 секунд после добавления последнего реактива.
По калибровочному графику находят содержание витамина А в ИЕ в 0,6 мл раствора, взятого на опреде1 ление.
Содержание витамина А в ИЕ (х) в 1 г препарата, вычисляют по формуле:
b-vv^х =•
s-0,6
где b — количество витамина А, найденное по калибровочному графику, в ИЕ;
щ и Уз —разведения (первое и второе) в мл; а — навеска в г;
0,6 —количество испытуемого раствора, взятое на реакцию, в мл.
Построение калибровочного графика. Точную навеску кристаллического витамина А—ацетата, или масляного концентрата, содержащего не менее 100 000 ИЕ в 1 мл, растворяют в мерной колбе в хлороформе с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалось 100 ИЕ. Из этого раствора готовят 5 последовательных разведений с таким расчетом, чтобы в 0,6 мл содержалось 2, 4, 6, 8 и 10 ИЕ. Из каждого разведения отбирают по 0,6 мл раствора, добавляют 2—3 капли уксусного ангидрида и 6 мл треххлористой сурьмы. Интенсивность образовавшейся окраски измеряют не позднее чем через 5—10 секунд после прибавления последнего реактива, используя красный светофильтр (Л = 620 шц). Для построения трафика на оси абсцисс откладывают содержание витамина А в ИЕ или в гаммах, а на оси ординат—соответствующие плотности. Полученные точки соединяют; правильно построенный график в указанных пределах должен иметь вид прямой линии.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ
Витамин А, полученный синтетическим путем, подлежит растворению в масле. Для установления пригодности масла для растворения в нем витамина А существует метод, основанный на определении перекисей, возникающих после кратковременной обработки масла в тонком слое при высокой температуре. Быстрое возникновение перекисей, определяемых йодометрическим путем, указывает на неустойчивость масла и непригодность его для получения масляных растворов витамина А, тогда как стойкое при хранении масло в этих условиях покажет лишь незначительное количество перекисей. Этот способ предложен О. К. Палладиной (1954) в Институте жировой промышленности и нашел применение в практике контроля витаминного производства.
Определение числа индукционного периода масла
1 мл испытуемого масла помещают в чашку Петри и оставляют на 15 минут в термостате при 150°. По прошествии указанного времени содержимое чашки смывают в коническую колбу с притертой пробкой с помощью 15 мл хлороформа. В колбу добавляют 15 мл концентрированной (80%) уксусной кислоты и 1 мл насыщенного водного раствора йодистого калия. Колбу закрывают пробкой, содержимое ее взбалтывают и оставляют на 20 минут в темноте. По истечении указанного времени в колбу добавляют 1 мл свежеприготовленного 1 % раствора крахмала, 70 мл дистиллированной, воды и содержимое колбы быстро оттитровывают 0,002 н. раствором Na2S2O3. Одновременно ставят контрольный опыт без прогревания.
Разница в титровании испытуемой и контрольной проб не должна составлять более 2 мл 0,002 н. раствора Na2S2O3. В противном случае масло не может быть рекомендовано для использования в качестве растворителя витамина А ввиду его недостаточной стойкости при последующем хранении с растворенным в нем витамином А.
Расчет числа индукционного периода масла ^ миллилитрах 0,002 н. раствора Na2S2O3 (х) производят по формуле:
х = а— Ь,
где а — количество 0,002 н. раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование опытной пробы, в мл;
b — количество 0,002'н. раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование контрольной пробы, в мл.
ПОДГОТОВКА К ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВИТАМИНА АВ ПРОМЫШЛЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ
И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Определение производят одним из описанных методов. Подготовка образцов для колориметрирования заключается в следующем.
Жиры рыб и млекопитающих. 0,5—1 г жира омыляют 10 мл 0,5 н. спиртового раствора едкого кали и далее поступают, как указано раньше.
Концентраты витамина А. 0,2—0,5 г концентрата омыляют 15 мл 0,5 н. едкого кали и далее поступают, как было описано выше. Концентраты, содержащие свыше 50 000 ИЕ витамина А в 1 мл, анализируют следующим образом: 0,2 г концентрата растворяют в хлороформе в мерной колбе емкостью 25 -мл. Из полученного раствора отбирают от 1 до 10 мл и производят второе разведение в мерной колбе емкостью 25 мл. Полученный раствор поступает на реакцию с SbCl3.
Сливочное и топленое масло, маргарин, комбижир. 10—20 г жира омыляют 20—40 мл 20% спиртового раствора едкого кали в течение 1—2 часов на водяной бане при -85—90°. К охлажденному раствору прибавляют двукратный объем воды и экстрагируют неомыляемую фракцию эфиром один раз 75 мл и два раза по 25 мл. Далее поступают, как было описано выше.
Молоко. 100—200 мл молока смешивают с */ю объема водного 60% раствора едкого кали и 20—40 мл этилового спирта и оставляют на 48 часов в темноте при 20—25°, время от времени помешивая. Экстракцию неомыляемой фракции производят серным эфиром 4 раза: один раз — 75 мл, последующие разы—по 30—40 мл. Далее поступают, как указано.
Печень и другие органы животных. К 3 г печени добавляют 1 мл 60% водного раствора едкого кали и 10—20 мл этилового спирта. Омыление производят на водяной бане при 85—90° в течение 2—4 часов. Дальнейший ход анализа описан выше.
Яйца. К 20 г яичного желтка добавляют 6 мл 60% водного раствора едкого кали и 10—20 мл этилового спирта. Омыление ведут на водяной бане при 85—90° в течение не менее 2 часов. Дальнейший ход анализа описан выше.
Драже и таблетки с витамином А. К 1—2 г драже или таблеток добавляют около 1 г сульфата натрия, растирают, для спектрофотометрического определения витамин А экстрагируют этиловым спиртом, а для колориметрирования — хлороформом.
Витаминизированные кондитерские изделия. Навеску 20—50 г экстрагируют 2—3 раза эфиром холодным способом, затрачивая на каждую экстракцию по 20 мл эфира. Эфирные вытяжки фильтруют,
эфир удаляют в токе инертного газа. Остаток после отгонки эфира растворяют в хлороформе и далее поступают, как описано ~ (можно экстракцию производить хлороформом).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА А В ПРОДУКТАХ,СОДЕРЖАЩИХ ВИТАМИН А И КАРОТИН
В продуктах, содержащих и витамин А, и каротин ^коровье масло, яйца, молоко, печень и др ), ход анализа изменяется следующим образом. Высушенный эфирный экстракт неомыляемой фракции делят на две части: в одной части определяют витамин А (после отгонки эфира и растворения остатка в хлороформе), в другой — после отгонки эфира и растворения остатка в петролей- ном эфире определяют каротин.
За вычетом количества каротина, выраженного в синих единицах (см. метод определения каротина, стр. 313), из количества витамина А, полученного при этом определении, получают истинное содержание витамина А в продукте.
При спектрометрическом определении остаток после отгонки эфира растворяют в абсолютном этаноле.
етоды контроля в синтезе
витамина Вг
ЭТИЛ ФОРМИАТ
Этиловый эфир муравьиной кислотыНСООС2Н5М- вес 74
■ есцвётная летучая жидкость с эфирным запахом. Уд. вес при 20°—0,9073. Т. кип.
54,5°. Легко растворим в спирте и эфире.
Методы определения качества этилформиата разрабатывались в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. М. Иосиковой, В. В. Зворыкиной и Е. Н. Че- салиной (1953) и в лаборатории Экспериментального завода ВНИВИ.
Определение процентного содержания основано на омылении этилформиата избытком титрованного раствора щелочи и определения с помощью титрованного раствора соляной кислоты количества щелочи, не вступившей® реакцию с эфиром (Торп и М. Уайтли, 1937),
НСОООД, + кон (изб) -> нсоок + с2нйон + кон.
КОН + НС1 -> КС1 + Н2О.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
В круглодонную колбу емкостью 200—250 мл, снабженную обратным холодильником, вносят 1,5 мл испытуемого раствора этилформиата, прибавляют 50 мл 0,5 н. раствора КОН, колбу закрывают пробкой с холодильни-
ком и содержимое ее нагревают в течение часа на кипящей водяной бане По охлаждении колбы внесенный в нее избыток щелочи оттитровывают 0,5 н раствором НС1 в присутствии 2—3 капель фенолфталеина в качестве индикатора
Расчет процентного содержания этилформиата'в растворе (х) производят по формуле-
(V —V;) 0,03704-100х =,
a-d
где ц — количество точного 0,5 н раствора КОН, взятое для омыления, в мл;
ч)х — количество точного 0,5 н. раствора НС1, пошедшее на обратное титрование, в мл;
0,03704 — количество этилформиата, соответствующее 1 мл точного 0,5 н. раствора КОН, в г;
а — количество испытуемого раствора этилформиата, взятое на анализ, в мл;
й—удельный вес испытуемого раствора этилформиата (при 20°);
100 — пересчете %.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ СВОБОДНОЙ МУРАВЬИНОЙКИСЛОТЫ
Определение основано на титровании примеси сво бодной муравьиной кислоты раствором спиртовой щелочи (во избежание гидролиза эфира) и освобождении связанной кислоты:
(НСООС2Н5 + НСООН) + КОН^НСООС,Н5 +
+нсоок+н2о.
10 мл испытуемого этилформиата помещают в эрлен- мейеровскую колбу емкостью 50 мл, добавляют 5 капель метилового красного в качестве индикатора и титруют 0,1 н. спиртовым раствором КОН из микробюретки до появления желтого окрашивания.
Содержание свободной муравьиной кислоты в испы туемом образце (х) вычисляют по формуле-
у-0,0046-100
a d
где у — количество точного 0,1 н. спиртового раствора КОН, пошедшее на титрование, в мл;
а—количество испытуемого этилформиата, взятое на анализ, в мл;
0,0046 — количество муравьиной кислоты, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора КОН, в г;
d — удельный вес этилформиата (при 20°);
100 — пересчет в %.
Примечания 1 При отсутствии микробюретки титрование производят с помощью 0,01 н спиртового раствора КОН из макробюретки При расчете пользуются следующей формулой
v 0,00046 100х =.
a-d
2 Титрование можно также производить с помощью 0,1 н раствора этилата натрия, что уменьшает возможность гидролиза препарата
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛАГИ В ЭТИЛФОРМИАТЕ
Смешивают в пробирке 0,5 мл этилформиата с 8,5 мл бензина (т. кип. до 100°). Появление мути свидетельствует о наличии более 0,5% влаги в продукте.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПИРТА В ЭТИЛФОРМИАТЕ *
В цилиндр емкостью 100 мл с притертой пробкой вносят 50 мл этилформиата и 50 мл насыщенного раст вора NaCI или СаСЬ Смесь взбалтывают в течение 3 ми нут, оставляют для расслаивания и по делениям цилиндра отсчитывают увеличение объема солевого раствора Увеличение объема, умноженное на 2, соответствует процентному содержанию спирта при условии отсутствия в образце влаги. Если проба этилформиата была влажной, то указанное увеличение объема равно сумме спирта и влаги. Вычитая из 100 полученное процентное содержание спирта, можно судить о качестве этилформиата в ходе технологического процесса.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУРАВЬИНОЙ КИСЛОТЫ В КУБОВЫХОСТАТКАХ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ЭТИЛФОРМИАТА
(по прописи Н. Я. Волковой, Экспериментальный заводВНИВИ)
Навеску этилформиата в количестбе 1 г, взятую на аналитических весах, растворяют в 40 мл 50% этилового спирта и титруют нормальным раствором NaOH в присутствии метилового оранжевого до появления соломенно-желтого окрашивания (определяется серная кислота), затем добавляют 4—5 капель фенолфталеина и титруют нормальным раствором NaOH до появления розового окрашивания.
Расчет количества непрореагировавшей муравьиной кислоты в процентах (х) производят по формуле:
0,046-(у — cO-lOOх =,
а
где о — количество точного н. раствора NaOH, пошедшее на первое и второе титрование, в мл;
Ui — количество точного н. раствора NaOH, пошедшее на первое титрование, в мл;
0,046 —количество муравьиной кислоты, соответствующее 1 мл точного н. раствора NaOH, в г;
а — навеска в г;
100 — пересчет в %.
ЭТИЛАТ НАТРИЯ
C2H6ONaМ. вес 68,05
Тигроскопический порошок. Растворим в спирте. В воде разлагается:
CsH6ONa + Н2О -» С2Н5ОН + NaOH.
Методы определения качества этилата натрия разработаны в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. М. Иосиковой, В. В. Зворыкиной и Е. Н. Чесалиной (1953). Поскольку в препарате могут быть примеси этилового сцирта (недостаточно высушенный продукт), а также едкого натра (как продукт гидролиза), в оценке препарата предусматривается также определение этих примесей.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
В основе метода лежит реакция окисления молекулы спирта до уксусной кислоты бихроматом калия, предложенная Никлу (Nicloux, 1906).
2К3Сг3О7 + 8H2SO4 -> 4KCr(SO4)2 + 8Н3О + ЗО3.
ЗС3Н5ОН + ЗО2 -> ЗСНдСООН + ЗН3О.
Навеску этилата натрия в количестве 2—5 г помещают в высушенный вместе с кусочком гигроскопической ваты и взвешенный высокий узкий бюкс, прикрывают ее в бюксе ватой, высушивают в вакуум-эксикаторе над серной кислотой в течение 12—18 ч.асов и снова взвешивают.
По разности весов до высушивания и после него узнают количество свободного спирта и .пересчитывают на процентное содержание.
Из высушенного, как указано, продукта отбирают навеску в количестве 0,2—0,3 г в мерную колбу емкостью 100 мл, растворяют в дистиллированной воде и раствор доводят водой до метки.
В эрленмейеровскую колбу емкостью 25—30 мл отбирают пипеткой 5 мл полученного раствора, добавляют 1 каплю раствора двухромовокислого калия, 5 мл концентрированной H2SO4 (уд. вес 1,84), колбу помещают на электроплитку и содержимое ее титруют из микробюретки раствором двухромовокислого калия при постоянном нагревании колбы (не доводя, однако, ее содержимое до кипения во избежание потерь спирта) до перехода голубой окраски раствора в зеленую.
Для облегчения ула<вливания конца титрования следует иметь цветной эталонный раствор, который готовится следующим образом: 0,1 мл абсолютного этилового спирта (уд. вес 0,791) доводят водой в мерной колбе до 100 мл. Из полученного раствора отбирают 5 мл в эрленмейеровскую колбу емкостью 25—30 мл, туда же добавляют 1 каплю двухромовокислого калия. Полученный зеленого цвета раствор является эталоном сравнения.
Расчет процентного содержания этилата натрия в испытуемом препарате (х) производят по формуле:
с-0,791-100-100
д-66,19-5 '
где у— количество раствора К2СГ2О7, пошедшее на титрование, в мл;
0,791 — уд. вес абсолютного этилового спирта;
,19—процентное содержание С2Н5ОН в C2HsONa;
5—количество испытуемого раствора, взятое на ти! трование, в мл;
разведение в мл;
а— навеска в г.
В сокращенном виде формула приобретает следующее выражение:
и-23,9х а
Определение этилата натрия реактивом Фишера
Этилат натрия в безводной среде не реагирует с системой J2 + SO2 в смеси пиридина и метанола, a NaOH и Na2CO3 с этим реактивом вступают в реакцию по уравнению:
NaOH + HJ -> NaJ + Н2О.
Na2CO3 + 2HJ -> 2NaJ + Н2О.
Н2О + SO2 + J2 -> 2HJ + SO3.
Титрованием испытуемого раствора серной или соляной кислотой определяют общее количество натрия (C2HsONa + NaOH + Na2CO3), а при помощи реактива Фишера — количество NaOH или Na2CO3. По разности между титрованиями вычисляют содержание этилата натрия.
Определение содержания едкого натра в пересчетена натрий
К навеске спиртового раствора этилата натрия в количестве 0,5—0,6 г, помещенной в коническую колбу с притертой пробкой, добавляют 5 мл безводного этилового спирта, раствор титруют реактивом Фишера до появления бурого окрашивания. Отдельно титруют 5 мл безводного этилового спирта как контрольный опыт.
Вычисление процентного содержания едкого натра в пересчете на натрий в испытуемом образце (х) производят по формуле:
(v — v^-m-23-100х =,
а-18
где у — количество реактива Фишера, пошедшее на титрование навески, в мл;
У1 — количество реактива Фишера, пошедшее нт титрование спирта, в мл;
т — титр реактива Фишера, выраженный в грам мах Н2О;
23 — атомный вес натрия;
100 — пересчет в %;
а — навеска в г;
1'8 — молекулярный вес Н2О.
Определение общего количества натрия
Навеску этилата натрия в количестве около 0,5 г растворяют в 15—20 мл воды и титруют 0,5 н. раствором H2SO4 в присутствии нескольких капель метилового оранжевого. Конец реакции проверяют потенциометрически.
Содержание общего количества натрия в процентах в испытуемом образце (%i) вычисляют по формуле:
v-23-ЮО
Xi — ,
а-2-1000
где: у — количество точного 0,5 н. раствора H2SO4, пошедшее на титрование, в мл;
23 — атомный вес натрия;
100 — пересчет в %;
— навеска в г;
— коэффициент пересчета на нормальный раствор; 1000 — пересчет на мл.
При сокращении формула приобретает значение:v-1,15х, = ■•
а
Расчет процентного содержания этила га натрия в спиртовом растворе (х2) производят по формуле:
(Xj — х)-68,05у ,—
где 68,05— м. вес этилата натрия;
— ат. вес натрия.
Расчет содержания натрия, связанного в этилат натрия (%з), по отношению к общему количеству натрия производят по формуле:
(Ху — х)•100
х3 = ———•
X
Примечание. Методы, основанные на титровании этилата натрия реактивом Фишера, имеют преимущество в смысле быстроты выполнения
АКРИЛОНИТРИЛ
Нитрил акриловой кислоты
CH2=CHCNМ. вес 53,06
Бесцветная или окрашенная легко подвижная жидкость, обладающая своеобразным запахом. Уд. вес 0,806—0,809 (при 20°). Пределы- кипения в интервале 72—80°; коэффициент рефракции 1,390—1,392.
Методы анализа качества акрилонитрила описаны в ВТУ МХП 1926-49.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЕДЕЛОВ КИПЕНИЯ
Перегонку ведут из круглодонной колбы тугоплавкого стекла емкостью 150 мл. Колба имеет следующие размеры: внутренний диаметр шара 65—67 мм, высота горла 25 мм. Горло колбы соединяют при помощи шлифа с дефлегматором диаметром 14 мм и высотой 150 мм. Дефлегматор имеет посередине шарик диаметром 30 мм, под которым на расстоянии 10 мм припаяна отводная трубка с внутренним диаметром 8 мм, длиной 120 мм.
Для охлаждения применяют холодильник Либиха, внутренняя трубка которого имеет длину 800 мм и диаметр 12 мм. Холодильник устанавливается таким образом, чтобы конец его внутренней трубки был на 100 мм ниже его начала. Дефлегматор соединяют с холодильником при помощи плотной корковой пробки. Горелку окружают железным кожухом высотой 250 мм и диаметром 130 мм с дверкой для горелки На расстоянии 10 мм от верхнего и нижнего края кожуха имеется 4 круглых отверстия для циркуляции продуктов горения.
Кожух в верхней части прикрывают асбестовым картоном толщиной 3—5 мм, имеющим вырез диаметром 50 мм, на который устанавливают перегонную колбу. С помощью мерного цилиндра (градуированного через 1 мл) емкостью 100 мл отбирают для анализа 100 мл испытуемого продукта (при 20°) в сухую, предварительно взвешенную с точностью до 0,01 г перегонную колбу. Отсчет температуры производят по термометру Аншют- ца с делениями на 0,5°.
Термометр укрепляют так, чтобы центр ртутного резервуара находился в центре расширения дефлегматора. Цилиндр, взятый для отмеривания акрилонитрила, используют в качестве приемника конденсата, закрывают крышкой из картона и устанавливают его в стакан с водой для охлаждения конденсата (20±2°). Скорость перегонки регулируют таким образом, чтобы в 1 минуту перегонялось 4—5 мл акрилонитрила. За начальную температуру кипения принимают наблюдаемую при падении первой капли жидкости из холодильника. За конечную температуру принимают максимальную, наблюдаемую во время перегонки, но не выше 80°.
Остаток в колбе охлаждают, взвешивают и рассчитывают по формуле.
а — Ь
% остатка =,
d
где а — вес колбы с остатком в г;
b — вес колбы в г;
d —удельный вес акрилонитрила (при 20°).
К отсчету температур, наблюдаемых при перегонке, прибавляют поправку (At), вычисленную по формуле:
Д1 = 0,042(760 —Р),
где Р— фактическое барометрическое давление в мм рт. ст.
Примечание При давлении ниже 760 мм поправка прибавляется, при давлении выше 760 мм — вычитается.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
Метод основан на отщеплении циан-группы, разложении ее щелочью и отгонке образующегося аммиака в титрованный раствор H2SO4. По количеству свободной
H2SO4 судят о количестве аммиака, связанного серной
кислотой.В колбу Б (рис. 15) раствора H2SO4 и в нее холодильника Е. В реаккислотой.В колбу Б (рис. 15) раствора H2SO4 и в нее холодильника Е. В реакРис 15. Прибор для анализа акрилонитрила.Рис 15. Прибор для анализа акрилонитрила.А—реакционная колба; Б — колба Эрленмейера; В — капельная воронка; Г, Е — холодильники, Д — насадка Кьельдаля 'А—реакционная колба; Б — колба Эрленмейера; В — капельная воронка; Г, Е — холодильники, Д — насадка Кьельдаля 'сят из бюретки 25 мл 0,5 н. мекают аллонж форштосса ннукг колбу А вносят 50 мл 0,12% раствора метилалко- голята натрия в метиловом спирте и туда же вводят стеклянную ампулу с точной навеской (0,5—0,6 г) акрилонитрила. Колбу А быстро присоединяют к холодильнику Г, соединенному при помощи насадки Кьельдаля Д с холодильником Е. Содержимое колбы А нагревают в течение 30 минут с таким расчетом, чтобы жидкость в колбе кишела и пары спирта конденсировались в первом шарике холодильника Г. Затем в колбу А из капельной воронки В прибавляют 25 мл 40% раствора КОН (удельный вес 1,40) и 200 мл воды и вновь кипятят содержимое колбы в течение 75 минут. Из муфты холодильника Г сливают воду и, не прекращая нагревания колбы А, отгоняют из нее аммиак с 100—150 мл воды в колбу Б.
кислотой.
В колбу Б (рис. 15) раствора H2SO4 и в нее холодильника Е. В реак
кислотой.
В колбу Б (рис. 15) раствора H2SO4 и в нее холодильника Е. В реак
Рис 15. Прибор для анализа акрилонитрила.
Рис 15. Прибор для анализа акрилонитрила.
А—реакционная колба; Б — колба Эрленмейера; В — капельная воронка; Г, Е — холодильники, Д — насадка Кьельдаля '
А—реакционная колба; Б — колба Эрленмейера; В — капельная воронка; Г, Е — холодильники, Д — насадка Кьельдаля '
По окончании отгонки
аммиака, не прекращая нагревания колбы А, колбу Б опускают таким образом, чтобы аллонж находился выше
уровня жидкости, и продолжают отгонку еще около 10 минут, чтобы промыть аппаратуру.
По окончании отгонки содержимое колбы Б оттитро- вывают 0,5 н. раствором КОН или NaOH в присутствии нескольких капель метилового красного до появления желтого окрашивания раствора (продолжительность анализа 3—4 часа).
Расчет процентного содержания акрилонитрила в испытуемом продукте (х) производят по формуле:
(и —vj. 2,6503х ,
а
где и — количество точного 0,5 н. раствора H2SO4, взятое в приемную колбу, в мл;
У]—количество точного 0,5 н. раствора щелочи, пошедшее на титрование, в мл;
2,6503—постоянный коэффициент;
а — навеска акрилонитрила в г.
НАТРИЙ-а-ОКСИМЕТИЛЕН-р-ЭТОКСИПРОПИОНИТРИЛ(НАТРЭНОЛЯТ)
С2Н5ОСН2 — С — CN
II
CHONaм. вес 149,129
Гигроскопический порошок кремоватого цвета. В воде разлагается.
КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД АНАЛИЗА
В химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. А. Девятниным, В. В. Никифоровой и И. А. Солуни- ной разработан колориметрический метод анализа нат- рий-а-оксиметилен-|3-этоксипропйонитрила, позволяющий определять его содержание в реакционной массе, включающей другие компоненты.
„Метод основан на том, что некоторые энолы, взаимодействия с хлоридом железа, образуют окрашенные соли по типу:
OFeCl2
Н3С — С = С-СООС2Н6
Н3С — С=-С-СООС2Н6
OFeCl2
Этот комплекс имеет максимум поглощения при Х.=470 тц и может быть количественно определен фото- колориметрическим путем.
65655 В А. Девятиин
65
65
Навеску энйлятй натрия й количестве 0,1—0,2 г с содержанием в ней 50—80 мг энолята растворяют в аб-- солютном этиловом спирте в мерной колбе емкостью 50 мл и объем раствора доводят спиртом до метки. Из по-’ лученного раствора отбирают пипеткой 0,5—1 мл (из расчета содержания 0,8—1 мг энолята натрия) в кювету электрофотоколориметра, добавляют туда же спирт до общего объема 6 мл и быстро приливают 1 мл 0,25% раствора хлорного железа в абсолютном спирте.
По истечении точно 10 секунд окраску раствора измеряют со светофильтром 470 тр.
Расчет содержания энолята натрия в процентах (х) производят по формуле:
С-50х —~,
a-v-10
где С — найденное по калибровочному графику количество энолята в мг;
50 —разведение в мл;
а — навеска в г;-
у — количество раствора, взятое для реакции, в мл; 10 — постоянный коэффициент.
, Составление калибровочного графика. Точную навеску химически чистого энолята натрия растворяют в абсолютном этиловом спирте в мерной колбе подходящего объема с таким расчетом, чтобы в 1 мл полученного раствора содержалось 0,7—0,75 мг энолята. Из полученного раствора последовательно отбирают пипеткой в кюветы электрофотоколориметра 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мл и в каждую кювету приливают соответственно 5,5; 5,0; 4,5; 4,0; 3,5 мл абсолютного спирта (общий объем 6 мл). Затем последовательно в каждой кювете проводят реакцию, добавляя 1 мл 0,25%' раствора хлорного железа в абсолютном спирте, как описано.
Окраску продукта реакции измеряют со светофильтром 470 шр. Для установления прибора на нуль пользуются абсолютным спиртом. Полученные экстинкции показаний прибора откладывают на графике по оси ординат, а соответствующие им концентрации энолята в миллиграммах по оси абсцисс. Калибровочный график должен представлять прямую линию.
АЦЕТОНИТРИЛ
CH3CN М. вес 41,05
Бесцветная подвижная жидкость. Уд. вес 0,783 (при 20°). Т. кип. 82°. Растворим в воде.
Методы определения качества продукта разработаны в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. М. Ио- сиковой, В. В. Зворыкиной и Е. Н. Чесалиной (1953) и основаны на определении азота в продукте. Однако технический продукт может содержать примесь аммиака, который необходимо удалить из продукта перед анализом.
КАЧЕСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ НА ПРИСУТСТВИЕАММИАКА
В пробирку вносят 2 мл ацетонитрила, 2 мл воды и несколько капель 30—40% раствора щелочи,, нагревают до кипения и по запаху определяют наличие аммиака.
В случае наличия аммиака ацетонитрил перегоняют на кипящей водяной бане, удаляя из приемника дистиллят, полученный при температуре ниже 79°, а фракцию, перегоняющуюся выще 79°, собирают, вновь проверяют на наличие аммиака и в случае его отсутствия используют для анализа.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
Пипеткой для взвешивания берут навеску ацетонитрила в количестве около 100 мг, переносят в кьельда- левскую колбу емкостью 50—100 мл, добавляют 3 мл х. ч. H2SO4, уд. вес 1,84, 2—3 капли 10% -раствора CUSO4 и сжигают в вытяжном шкафу до полного обесцвечивания содержимого (полученный раствор может иметь слабый голубой оттенок). Сжигание заканчивается в течение 60—70 минут.
После охлаждения к содержимому колбы осторожно, по стенке, добавляют 5—10 мл воды, содержимое колбы количественно переносят в круглодонную колбу для отгона, смывая из кьельдалевской колбы остатки жидкости
50 мл воды в 2—3 приема. Отгоночную колбу емкостью 150—200 мл снабжают резиновой пробкой с двумя отверстиями, в одно из которых вставлена капельная воронка с краном, в другое — капдеуловитель (насадка Кьельдаля). Каплеуловитель соединяют с холодильни- ком, на форштосс которого надета трубка, погруженная в отмеренное в приемную коническую колбу количество (10 мл) 0,1 н. раствора H2SO4 (из бюретки) с одной каплей метилового оранжевого.
В капельную воронку наливают 15—20 мл 40% раствора NaOH, быстро спускают их в отгоночную колбу, быстро закрывают кран воронки, нагревают колбу и ведут перегонку ее содержимого до появления первых толчков в колбе.
Отгон аммиака заканчивается за 60—80 минут, после чего отъединяют каплеуловитель ют холодильника, форштосс и трубку на конце холодильника обмывают небольшим количеством воды в приемную колбу и содержимое ее титруют 0,1 н. раствором NaOH до перехода розовой окраски в соломенно-жеЛтую.
Содержание ацетонитрила в процентах (х) вычисляют по формуле:
(и —Uj). 0,004105-100х =,
а
где и —количество точного 0,1 н. раствора H2SO4, взятое в приемную колбу, в мл;
Ui —количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,004105 —количество натрэнолята, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора H2SO4, в г;
а — навеска в г;
100 — пересчет в %.
АЦЕТОИМИНОВЫЙ ЭФИР
yNH-HClC4H10OC1N
СН3 — СМ. вес 123,589
\ос2н5
Гигроскопические белые кристаллы, обладающие неприятным запахом. Растворим в воде, этиловом и метиловом спиртах.
Методы анализа эфира разработаны в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. М. Иосиковой, В. В. Зворыкиной и Е. Н. Чесалиной (1953) и основаны на определении его по хлору.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА ХЛОРА
Точную навеску эфира в количестве не более 2 г растворяют в воде в мерной колбе емкостью 100 мл, доводят водой до объема. Из полученного раствора отбирают 10 мл в коническую колбу, прибавляют 25 мл 0,1 н. раствора AgNOs, 2 мл раствора железоаммониевых квасцов и титруют 0,1 н. раствором NH4CNS или KCNS до появления бледно-розового окрашивания раствора.
Вычисление процентного содержания общего хлора в эфире (х) производят по формуле:
(25 —и). 0,003546-100х =,
а
где 25 — количество точного 0,1 н. раствора AgNOs, взятое в анализ, в мл;
и —количество точного 0,1 н. раствора роданата, пошедшее на обратное титрование, в мл; 0,003546 —количество эфира, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора AgNOs, в г;
а — навеска в г;
100 — пересчет в %.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ НС1 (В ПЕРЕСЧЕТЕ НА С1)
Точную навеску эфира в количестве 1 г растворяют в 20—25 мл воды и титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии 2—3 капель метилового оранжевого до появления соломенно-желтого окрашивания.
Вычисление процентного содержания примеси хлора (xt) производят по формуле:
v-0,003546-100
Х1 =,
а
где и —количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,003546 — количество хлора, соответствующее 1 Мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
а — навеска в г;
100—пересчет в %.
Расчет процентного содержания (хг) производят по формуле:
где 28,7—содержание хлора в ацетоиминовом эфире в %;
х и Xi — см. выше;
100 — пересчет в %.
АММИАК В СПИРТОВОМ РАСТВОРЕ
Метод анализа спиртового раствора аммиака основан на определении избытка серной кислоты, не вступившей в реакцию < аммиаком.
В коническую колбу емкостью 150—200 мл вносят 25 мл 0,1 н. раствора H2SO4, туда же быстро вносят 0,5 мл испытуемого спиртового раствора аммиака, добавляют 2—3 капли метилового оранжевого и избыток серной кислоты оттитровывают 0,1 н. раствором NaOH до появления соломенно-желтого окрашивания.
Вычисление процентного содержания аммиака в растворе (х) производят по формуле:
_ (и —у,). 0,001708-100
a-d
где о —количесши точного 0,1 н. раствора H2SO4, взятое для связывания аммиака, в мл;
Di — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,001708— количество аммиака, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора H2SO4, в г;
а— количество испытуемого раствора, взятое на анализ, в мл;
d—удельный вес испытуемого раствора;
100 — пересчет в % •
АЦЕТАМИДИН ГИДРОХЛОРИД »NH
СН3 — С/М. вес 94,55
^NH2HC1
Белый кристаллический продукт, хорошо растворимый в воде и спирте. Т. пл. 167°.
Методы анализа качества ацетамидина разработаны в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. М. Иосиковой, В. В. Зворыкиной и Е. Н. Чесалиной (1953).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА ХЛОРА
Точную навеску около 0,2 г (а) ацетамидина растворяют в 10 мл воды, прибавляют 25 мл 0,1 н. раствора AgNOs (и), 2 мл раствора железоаммониевых квасцов и титруют 0,1 н. раствором NH4CNS или KCN'S (ut) цо появления бледно-розового окрашивания раствора (расчет см. ниже).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ ХЛОРИСТОГО АММОНИЯ
В основу положен метод, опубликованный в VIII Гос- фармакопее СССР. Медгиз, 1946.
Метод основан на том, что в присутствии щелочи из хлористого аммония освобождается аммиак, обусловливающий превращение формальдегида в уротропин:
6НСНО + 4NH4C1 + 4NaOH -> N4(CH2)6 + 4NaCl + H2O.
Точную навеску около 1 г ацетамидйна растворяют в 30 мл воды, прибавляют 5 мл нейтрализованного формалина и титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии 2—3 капель спиртового раствора фенолфталеина до появления розового окрашивания.
Расчет процентного содержания примеси NH4C1 производят по формуле:
(и2-из)-0-00535.100
где и2— количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование ацетамидина с формалином,в мл;
и3 — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование формалина, в мл;
«1 — навеска ацетамидина в г;
0,00535—количество хлористого аммония, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
— пересчет в %.
Расчет процентного содержания ацетамидина в испытуемом препарате (%i) производят по формуле:
/и— и, V»— V, \
Xi = 1— -0,009455 -100,
\ аа /
где у— количество точного 0,1 н. раствора AgNOs, взятое для определения общего количества хлора, в мл;
Щ— количество точного 0,1 н. раствора роданата, пошедшее на титрование, в мд;
а — навеска ацетамидина, в'зятая для определения общего количества хлора, в г;
0,009455 — количество ацетамидина, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора AgNO3, в г;
«1 — см. выше;
— пересчет в %.
АМИНОПИРИМИДИН
(2-метил-4-аминопиримидин)
N = CNH2
Н3С — С С — СН2ОС3Н5
М. вес 167,216М. вес 167,216II II
М. вес 167,216
М. вес 167,216
N — СН
Белые или с креМоватым оттенком кристаллы, обладающие характерным (мышиным) запахом. Т. пл. 87°. Растворим в воде и органических растворителях.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ ПО АЗОТУ
(методы анализа разработаны в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. М. Новиковой, В. В. Зворыкиной, Е. Н. Чесалиной)
Навеску аминопиримидина в количестве 0,05—0,07 г, взятую на аналитических весах, в маленькой пробирке переносят в кьельдалевскую колбу емкостью 50—100 мл, добавляют 3 мл концентрированной H2SO4 (уд. вес 1,84), несколько кристалликов C11SO4 и содержимое колбы сжигают до полного обесцвечивания (что устанавливают только после полного охлаждения колбы).
Далее поступают, как указано в методе определения азота в ацетонитриле.
Содержание аминопиримидина в процентах (х) в испытуемом продукте вычисляют по формуле:
(у — уД-0,0014-167,216-100
Х=д-42
где и — количество точного 0,1 н. раствора H2SO4, взятое в приемную колбу, в мл;
vx— количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
— навеска в г;
0,0014—количество азота, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора H2SO4, в г;
— грамм-эквивалент азота в аминопиримидине;
167,216 — м. вес аминопиримидина;
— пересчете %.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯСПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Метод разработан в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. А. Девяткиным и Г. А. Федоровой и ос
нован на том, что 2-метил-4- аминопиримидин обладает свойством поглощать свет в ультрафиолетовой области спектра. Максимум абсорбции находится на длине волны X —240 тц (рис. 16). Измеряя величину экстинкции для раствора аминопиримидина известной концентрации, можно определить количество 2-метил-4-амино-
пиримидина, находящегося рис щ Кривая абсорбции В растворе.2-метил-4-амннопиримидина.
Точную навеску испыту
емого продукта в количестве 0,25 г помещают в мерную колбу емкостью 50 мл, растворяют в бидистиллирован- ной воде (перегнанной из стекла) и доводят водой до
метки. После тщательного перемешивания содержимого колбы переносят ! мл раствора в мерную колбу емкостью 200 мл и объем раствора доводят водой до метки. Полученный раствор поступает на измерение экстинкции. Измерение производят на длинах волн 225; 230; 235; 240; 245 ши-
Содержание 2-метил-4-аминопиримидина в препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
Енайа-
•г-станд-
Предварительно устанавливают описанным способом величину Е для чистого 100% 2-метил-4-аминопирими- дина.
Примечание. Для 2-метил-4-аминопиримидина 99,8% чистоты при описанной концентрации Е = 0,9. В случае отсутствия стандарта высокой степени чистоты можно воспользоваться этим значением Е и вычисление процентного содержания в испытуемом продукте производить по формуле:
_ ^найд- '99,8lino
х —— £иайд. • 110,9,
где 99,8— процентное содержание стандартного образца;
0,9 Естана.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПО АЛКОКСИ-ГРУППЕ(ПО ФИБЕКУ И БРЕХЕРУ)
Точную навеску вещества в количестве 0,01—0,02 г, помещенную в колбу (7) (рис. 17), растворяют в 1 мл ледяной уксусной кислоты или в небольшом количестве фенола и прибавляют 1 мл йодисто-водородной кислоты (уд. вес 1,68—1,70). Предварительно осторожно так, чтобы капли растворов не попали в соединительные трубки (2), в промывалки (3) наливают по 0,5—1 мл 5% родного раствора сернокислого кадмия и 5% водного рас-, твора тиосульфата натрия и закрывают их корковыми пробками.
В приемник (4) наливают 5 мл 10% раствора уксуснокислого натрия в ледяной уксусной кислоте и прибавляют несколько капель брома (уд. вес 3,14).
Для поглощения паров брома отверстие приемника прикрывают ватным тампоном, смоченным слабым рас- гвором муравьиной кислоты.
Когда прибор готов для определения, на боковой отросток колбы (/) надевают каучуковую трубку, соединяющую прибор с газометром, наполненным N2 или СОг, и пропускают газ, регулируя его ток так, чтобы новый пу-
Рис. 17. Схема прибора для определения алкоксигрупп (по Фибеку и Брехеру).
Г — реакционная колба; 2— холодильник; 3— промывалки;
4 — приемник.
зырек газа -появлялся в растворе в тот момент, когда предыдущий достигнет поверхности. Затем начинают подогревать колбу (1) на маленьком пламени и доводят содержимое ее до кипения.
Через 20—30 минут прекращают подогрев и содержимое приемника (4) переливают в эрленмейеровскую колбу емкостью 100 мл с притертой пробкой, в которой находится 1 г CHgCOONa в небольшом количестве воды, тщательно ополаскивая выводную трубку водой в .ту же колбу.
В колбу добавляют по каплям муравьиную кислоту до обесцвечивания жидкости. При этом раствор сильно взбалтывают. В отсутствии брома убеждаются по исчезновению запаха.
Затем в колбу прибавляют несколько миллилитров разбавленной H2SO4 (1:10) и 5 мл 5% раствора KJ, > взбалтывают и оставляют на 10—15 минут в темноте при комнатной температуре. Выделившийся йод титруют 0,02 н. раствором тиосульфата натрия в присутствии 1 % раствора крахмала в качестве индикатора.
Расчет процентного содержания алкоксила (х) производят по формуле:
и-6-100
* “ а-1000 ’
где У — количество точного 0,02 н. раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование,- в мл;
а— навеска в г;
100 -—пересчет в %;
b— 0,1034 мг СН3О или 0,1501 мг С2Н5О, соответствующее 1 мл точного 0,02 н. раствора ЫагЗгОз.
1000 — пересчет в г
РАСТВОР БРОМА В УКСУСНОЙ КИСЛОТЕ
(методы анализа разработаны во ВНИВИ
В. М. Иосиковой, В. В. Зворыкиной, Е. Н. Чесалиной)
В колбу емкостью 250 мл вносят 2 мл испытуемого раствора, добавляют 50 мл воды, 15 мл HNO3 (разведенной водой в отношении 1:1), 25 мл 0,1 н. раствора AgNOs; 0,5 мл раствора железоаммониевых квасцов в качестве индикатора и смесь титруют 0,1 н. раствором KCNS или HN4CNS до появления бледного розово-желтого окрашивания.
Расчет содержания НВг в граммах на 1 л в растворе (х) производят по формуле:
(и— У]).0,008092-1000х =,
а
где о—количество точного 0,1 н. раствора AgNOs, взятое в анализ, в мл;
Ui— количество точного 0,1 н. раствора роданата, пошедшее на титрование, в мл;
0,008092—количество НВг, соответствующее 1 мл точ-ного 0,1 н. раствора AgNOs, в г;
a — количество испытуемого раствора, взятое на анализ, в мл;
1000— пересчет в г/л.
БРОМАМИНОПИРИМИДИН (БРОМГИДРАТ)
N —С—NH2-HBr
Н3С—С — СН2Вг
II IIМ. вес 283
N — СН
Кристаллическое вещество буроватого цвета. Т. пл. 209°. Растворим в воде и спирте. Нерастворим в большинстве органических растворителей. В кристаллическом виде и особенно в растворах легко изменяется.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПО АЗОТУ
(методы анализа разработаны во ВНИВИ
В. М. Новиковой, В. В. Зворыкиной, Е. Н. Чесалиной)
Навеску бромаминопиримидина в количестве 0,05— 0,07 г, взятую на аналитических весах, в маленькой пробирке переносят в кЬельдалевокую колбу емкостью 50—100 мл, добавляют 3 мл концентрированной H2SO4, несколько кристалликов CuSO4 5Н2О, в горло колбы вставляют химическую воронку и содержимое колбы сжигают до полного обесцвечивания (что устанавливают после полного охлаждения колбы). Далее поступают, как описано ранее (стр. 67).
Содержание бромаминопиримидина в препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
_ (^-^1)-0,0014-283-100
Х-д-42
где и — количество точного 0,1 н. раствора H2SO4, взятое в приемную колбу, в мл;
fi — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
а — навеска в г;
0,0014— количество азота, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора H2SO4, в г;
42 — грамм-эквивалент азота для бромаминопиримидина;
283—м. вес бромаминопиримидина;
100 —пересчет в %.
При сокращении формула приобретает следующий вид:
(у — у,) -0,9433х =—.
а
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БРОМА
Навеску бромаминопиримидина в количестве 0,2—0,3 г, взятую на аналитических весах, помещают в колбу емкостью 250 мл, растворяют в 40—50 мл воды, прибавляют 15 мл разведенной (в отношении 1:1) HNO3 25 мл 0,1 н. раствора AgNO3, 0,5 мл раствора железоаммониевых квасцов и смесь титруют 0,1 н. раствором NH4CNS или KCNS до появления бледно-розового окрашивания.
Расчет процентного содержания общего количества брома (%i) производят по формуле:
(и —и,). 0,007992-100
где и — количество точного 0,1 н. раствора AgNOa, взятое в анализ, в мл;
Hi — количество точного 0,1 н. раствора роданата, пошедшее на титрование, в мл;
а— навеска в г;
0,007992 — количество брома, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора AgNO3, в г;
100 — пересчет в %.
Определение примеси аминопиримидина в виде бром гидрата производят по методу определения алкокси групп, как уже описано. Из найденного количества бром- вычитают количество брома, связанного с аминопирими дином. Разность приходится на бромаминопиримидин.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕТУЧИХ ПРИМЕСЕЙ
Проводится высушиванием навески в количестве око ло 2 г в сушильном шкафу при 100—105° до постоянног веса.
АЦЕТОПРОПИЛАЦЕТАТ
СНЭСОСН2СН2СН2ОСОСН3М. вес 144,173
Жидкость желтоватого цвета. Т. кип. 108—115° при 22 мм остаточного давления.
определение процентного содержания по оксиму
(метод разработан во ВНИВИ В. М. Иосаковой,В. В. Зворыкиной, Е. Н. Чесалиной)
Метод основан на том, что вещества, содержащие СО-группу, реагируют с гидрохлоридом гидроксиламина. Освобождающаяся при этом НС1 отщепляется и может быть количественно определена. По количеству освободившейся НС1 судят о количественном содержании СО, так как реакция оксимирования является эквимолекулярной:
СН3СОСН2СН2СН2ОН + NH2OH- НС1 СН3ССН2СН2СН2ОН 4- Н2О + 2НС1.
II
NOH
НС1 + NaOH -> NaCl + Н2О.
В коническую колбу вносят точную навеску испытуемого продукта в количестве около 1 г. К навеске приливают 15 мл спиртового раствора гидроксиламина гидрохлорида, содержащего индикатор (бромфеноловый синий), колбу закрывают резиновой пробкой и оставляют на 2 часа в покое, после чего смесь оттитровывают 0,5 и. спиртовым раствором КОН или NaOH.
В начале титрования раствор имеет золотисто-желтый цвет. При дальнейшем прибавлении щелочи он мутнеет от выделяющегося осадка NaCl. Конец титрования определяют по появлению бутылочно-зеленой окраски раствора. Так как спиртовой раствор гидроксиламина гидрохлорида имеет кислую реакцию, необходимо вводить на него поправку.
Для этого 15 мл раствора гидроксиламина гидрохлорида титруют 0,5 н. спиртовым раствором щелочи до появления зеленого с красноватым оттенком окрашивания. Количество миллилитров спиртового раствора щелочи, пошедшее на контрольный опыт, вычитают из количества щелочи, пошедшего на титрование навески.
Расчет процентного содержания ацетопропилацетата в продукте (х) вычисляют по формуле:
и-О,07208-100х =,
а
где и— количество точного 0,5 н. спиртового раствора щелочи, пошедшее на титрование, за вычетом поправки на контрольный опыт, в мл;
0,07208 — количество ацетопропилацетата, соответствующее 1 мл точного 0,5 н. спиртового раствора щелочи, в г;
а — навеска в г;
100 — пересчет в % •
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯВ ТЕХНИЧЕСКОМ ПРОДУКТЕ
В связи с тем что в техническом продукте может содержаться примесь ацетопропилового спирта, которая участвует в реакции оксимирования и может привести к получению завышенных результатов при анализе описанным методом, применяют другой способ анализа, основанный на разгонке смеси.
Для этого во взвешенную на технических весах колбу Кляйзена вносят 100 г ацетопропилацетата для разгонки в вакууме. В предварительно взвешенный приемник собирают фракцию, отгоняющуюся в пределах 108—115° при остаточном давлении 22 мм. Собранную фракцию взвешивают, количество ее отвечает содержанию ацетопропилацетата.
При работе с остаточным давлением выше 22 мм каждые 2 мм разницы в давлении повышают температуру кипения на Г (например, при разгонке при 38 мм остаточного давления разница составляет 16 мм и температура кипения будет завышена на 8°).
При работе с остаточным давлением ниже 22 мм каждый 1 мм разницы в давлении снижает температуру кипения на 2° (например, при разгонке с 12 мм остаточного давления разница составляет 10 мм и температура кипения продукта снижается на 20°).
Можно проводить разгонку без вакуума; при этом фракция, собранная при 207—217°, 1будет соответствовать пропилацетату, а фракция, собранная до 207°, —- примесям.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ПРИМЕСЕЙ
Около 2 г ацетопропилацетата взвешивают на аналитических весах, помещают в коническую колбу, содержащую 15—20 мл этилового спирта, и титруют 0,1 н. спиртовым раствором КОН иЛи NaOH в присутствии фенолфталеина до появления розового окрашивания.
Расчет процентного содержания примесей в препарате (х0 производят по формуле:
у. 1,44173
где и— количество точного 0,1 н. раствора щелочи, пошедшее на титрование, в мг;
а— навеска в г;
1,44173 — постоянный коэффициент.
Примечание. В случае отбора пробы объемом 2 мл в знаменателе должна находиться еще величина d (уд. вес ацетопропилацетата).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯПО АЦЕТИЛЬНЫМ ГРУППАМ
Навеску ацетопропилацетата в количестве около 0,2 г, взятую на аналитических весах при помощи пипетки для взвешивания, омыляют в колбе, снабженной воздушным или обратным холодильником, на водяной бане при 85—90° в течение 1 часа с помощью 20 мл 0,1 н. спиртового раствора КОН.
По окончании омыления содержимое колбы охлаждают и титруют избыток щелочи 0,1 н. раствором НС1 в присутствии фенолфталеина до исчезновения окраски.
Параллельно проводят холостой опыт с тем же количеством щелочи.
Расчет процентного содержания ацетильных групп в пересчете на ацетопропилацетат (х2) производят по формуле.
81816 В. А. Девятнин
81
81
(у—У1). 1,44173
а
где у— количество точного 0,1 н. раствора НС1, пошедшее на титрование холостого опыта, в мл;
У1'—количество точного 0,1 н. раствора НС1, пошедшее на титрование испытуемой пробы, в мл;
1,44173 —постоянный коэффициент;
й — навеска в г.
Пользуясь этими методами, можно вычислить процентное содержание ацетопропилацетата в испытуемом продукте (х3) по формуле:
Х3 = х2 — xt
Значение х2 и xj см. выше.
БРОМАЦЕТОПРОПИЛАЦЕТАТ
СНз
I
С—ОН
II
СНВ rCH2CH2 ОСОСН3М. в ес 224,089
Густая маслянистая жидкость темного или бурого цвета с резким раздражающим запахом. Уд. вес 1,463. Растворим в хдороформе. Чрезвычайно сильно действует на глаза и требует осторожного обращения. При бромировании ацетопропилацетата бром может присоединиться не только в а-, но и в p-положении; в препарате может также присутствовать примесь свободного НВг и непрореагировавший ацетопропилацетат (Я. Слободин, М. Зигель, М. Янишевская, 1943).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА БРОМА(а-, р- и примеси)
(метод разработан во ВНИВИ В. М. Иосиковой,В. В. Зворыкиной, Е. Н. Чесалиной)
Метод анализа основан: на определении общего количества брома (а-, р- и свободный), определяемого после омыления вещества спиртовой щелочью; определе-
нии p-брома путем нагревания спиртового раствора ве щества, причем бром, находящийся в a-положении, в данных условиях не отщепляется и не определяется без предварительного омыления. Примеси брома определяются титрованием на холоду по Фольгарду; при этом бром, вступивший в ip-положение, не определяется.
В мерную колбу с притертой пробкой емкостью 50 мл отвешивают 2 г испытуемого продукта, навеску растворяют в 96% этиловом спирте, доводят спиртом до метки и хорошо перемешивают. Из полученного раствора отбирают 5 мл в колбу емкостью 250 мл, снабженную обратным холодильником, туда же добавляют 10 мл 1% спиртового раствора КОН, содержимое колбы нагревают на водяной бане в течение 15 минут при 85—90°.
По истечении указанного времени колбу охлаждают водой, к ее содержимому добавляют 50 мл дистиллированной воды, 15 мл азотной кислоты, разбавленной водой в отношении 1:1, 25 мл 0,1 н. раствора AgNOs, 0,5 мл раствора железоаммониевых квасцов и смесь титруют 0,1 н. раствором NH4CNS или KCNS до появления слабого розоватого окрашивания.
Вычисление содержания общего количества брома в миллиграммах во взятой навеске (х) производят по формуле:
х = (у — Уд)-7,992,
где ч) — количество точного 0,1 н. раствора AgNOs, взятое на определение, в мл;
^ — количество точного 0,1 н. раствора KCNS или NH4CNS, пошедшее на титрование, в мл;
7,992 — количество брома, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора роданата, в мг.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА ПРИМЕСЕЙ БРОМА(p-бром и броматы)
В колбу емкостью 250 мл, снабженную обратным холодильником, помещают 5 мл испытуемого спиртового раствора бромацетопропилацетата (см. Рыше) и, 10 мл 96% этилового спирта. Содержимое колбы нагревают на водяной бане 15 минут при 85—90°.
Дальнейший ход анализа см. выше.
Вычисление содержания общего количества примесей брома в продукте в миллиграммах во взятой навеске (xi) производят по формуле:
= (v2 — и3)-7,992,
где ®2 — количество точного 0,1 н. раствора AgNO3, взятое в анализ, в мл;
г/3 — количество точного 0,1 н. раствора роданата, пошедшее на титрование, в мл;
7,992 — см. выше.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БРОМА, НЕ ВСТУПИВШЕГО В РЕАКЦИЮ('бром в бромистых солях)
В колбу емкостью 250 мл помещают 5 Мл испытуемого спиртового раствора, 10 мл 96% этилового спирта, 50 мл дистиллированной воды, 15 мл HNO3, разведенной водой в отношении 1 : 1, 25 мл 0,1 н. раствора AgNO3, 0,5 мл раствора железоаммониевых квасцов и смесь титруют 0,1 н. раствором KCNS или NH4CNS, как указано выше.
Количество брома, не вступившего в реакцию, в миллиграммах (х2), вычисляют по формуле:
х2 = (и4 — v5)-7,992,
где ^4— см. v2;
®6 — см. и3;
7,992 — см. выше.
Процентное содержание а-бромацетопропилацетата вычисляют по формуле:
_ (x—xQ-224,089-50-100а-5-79,92-1000
где у — чистота продукта в %;
х — см. выше;
Xi — см. выше;
а— количество точного 0,1 н. AgNO3, взятое в анализ, в мл;
224,089— молекулярный вес бромацетоиропилаце- тата;
50 — разведение навески в мл;
5 — количество спиртового раствора, взятое для анализа, в мл;
9,92—м. вес брома;
1000 — пересчет в г;
— пересчет в %.
В сокращенном виде формула приобретает следующее значение:
(л—Xi)-2,8
Содержание брома, вступившего в реакцию в р-поло- жение:
(Xj — х2)-50- 100tn =,
а-5-1000
где т — количество p-бромацетопропилацетата в продукте в %.
Остальные обозначения см. выше.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЦЕТИЛЬНЫХ ГРУПП В ПРОДУКТЕ
Уксусная кислота, образующаяся при гидролизе серной кислотой продукта, содержащего ацетильную группу, в присутствии этилового спирта этерифицируется в уксусноэтиловый эфир, который отгоняют вместе с избытком спирта в приемник, содержащий раствор щелочи, подвергают гидролизу и определяют избыток щелочи, не вступившей в реакцию с уксусной кислотой, освободившейся при гидролизе эфира. Химизм процесса можно представить в следующем виде:
H2SO4
ROCOCHg + С2Н6ОН> ROH + СН3СООС2Н6
СН3СООС2Н6 + Н2О -> С2Н6ОН + СНдСООН СН3СООН + 3NaOH -> NaCHaCOO + Н2О + 2NaOH 2NaOH + H2SO4 -> Na2SO4 + Н2О
0,5 мл бромацетопропилацетата (уд. вес 1,463) переносят в колбу Вюрца емкостью 250 мл при помощи автоматической пипетки. Отдельно приготовляют 30 мл смеси, состоящей из 2 мл концентрированной H2SO4 (уд. вес 1,84) и 30 мл абсолютного этилового спирта. Пипетку, которой брали бромацетопропилацетат, осторожно (до метки!) промывают в ту же колбу небольшим количеством (2—3 мл) указанной смеси, а оставшееся ее количество вносят в колбу небольшими порциями при взбалтывании содержимого колбы. В горло колбы встав-
ляют на пробке капельную воронку, конец которой находится ниже отводной трубки колбы. Колбу соединяют с холодильником Либиха. В качестве приемника берут колбу, используемую в дальнейшем для гидролиза. В приемник вносят 25 мл 0,5 н. спиртового раствора КОН. В капельную воронку наливают 20 мл абсолютного этилового спирта. Колбу с содержимым медленно нагревают на водяной бане (нагретой до кипения), прибавляя в нее из делительной воронки по каплям спирт со скоростью, равной скорости отгона.
После прибавления всего количества спирта кран воронки закрывают и перегонку продолжают еще в течение 10—12 минут, пока в колбе останется около 15 мл жидкости.
Перегонку прекращают, приемник присоединяют к обратному холодильнику и содержащийся в приемнике уксусноэтиловый эфир подвергают омылению на водяной бане в течение 15 минут при 70—80°.
По охлаждении к содержимому приемника добавляют 100 мл воды (воду вводят через холодильник), к смеси добавляют 3—5 капель спиртового раствора фенолфталеина и избыток щелочи титруют 0,5 н. раствором H2SO4 до исчезновения окрашивания.
Параллельно ставят контрольный опыт: для 'этого в колбу вносят 25 мл 0,5 н. спиртового раствора КОН, гидролиз проводят с обратным холодильником на водяной бане в течение 15 минут при 70—80°. По охлаждении добавляют в колбу через холодильник 100 мл воды, к смеси добавляют 3—5 капель спиртового раствора фенолфталеина и титруют 0,5 н. раствором H2SO4, как описано.
Расчет процентного содержания бромацетопропилацетата по ацетильным группам (х) производят по формуле:
43,03-(v — Uj)-100
10-2-a-19,5.d
где 43,03 — м. вес ацетильной группы;
и—Ui — разность между результатами титрования контрольного опыта (и) и продукта гидролиза (Vi) в мл;
100 и Ю—постоянные коэффициенты;
2— эквивалент H2SO4 по СН3СО;
а — навеска в г;
d—уд. вес;
19,5—процентное содержание СН3СО в бромацетопропилацетате;
100—пересчет в %.
Описанный метод может оказаться полезным при необходимости определения примеси ацетопропилацетата в бромацетопропилацетате.
Разность между процентным содержанием бромацетопропилацетата по ацетильной группе и по брому приходится на долю свободного ацетопропилацетата.
ФОРМАМИД
(амид муравьиной кислоты)
HCONH2М. вес 45,043
Бесцветная подвижная жидкость со своеобразным запахом, уд. вес 1,135, т. кип. 114°. Очень хорошо растворим в воде и спирте, нерастворим в эфире. При хранении разлагается.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО АЗОТА
(Метод анализа разработан во ВНИВИ В. М. И осиновой,В. В. Зворыкиной, Е. Н. Чесалиной)
Навеску формамида в количестве 0,05—0,07 г, взятую на аналитических весах с помощью пипетки для взвешивания, помещают в кьельдалевскую колбу емкостью 50—100 мл, прибавляют 3 мл концентрированной H2SO4 (уд. вес 1,84), несколько кристалликов CuSO4-5H2G и содержимое колбы сжигают до полного обесцвечивания. Далее поступают, как указано в определении ацетонитрила.
Расчет процентного содержания азота в продукте (х) вычисляют по формуле:
(и — иО-О,14х =,
а
где и — количество точного 0,1 н. раствора H2SO4, взятое в приемную колбу, в мл;
Ui — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,14 — постоянный коэффициент;
а — навеска в г.
УПРОЩЕННЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Навеску формамида в количестве около 0,1 г переносят в колбу для отгона, снабженную 'капельной воронкой и соединенную с парообразователем, добавляют 50 мл воды и через капельную воронку 15 мл 40% раствора NaOH, через колбу пропускают из парообразователя пар, а отгоняющийся аммиак собирают в приемную колбу, куда заранее внесено из бюретки точное количество 0,1 н. раствора H2SO4 (обычно 20 мл) с 2—3 каплями метилового красного в качестве индикатора. По окончании отгонки аммиака (на что уходит 15—20 минут) содержимое приемной колбы оттитровывают 0,1 н. раствором NaOH.
Расчет процентного содержания азота в веществе (х) вычисляют по формуле, приведенной выше.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ МУРАВЬИНОКИСЛОГО АММОНИЯ
Метод основан на реакции замещения группы NH4 на Na в муравьинокислом аммонии:
НСООМН4 + NaOH -> HCOONa + NH4OH.
По количеству израсходованной щелочи судят о количестве муравьинокислого аммония.
мл формамида помещают в коническую колбу, добавляют 10—15 мл воды и титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии фенолфталеина до появления розового окрашивания.
Расчет процентного содержания муравьинокислого аммония в формамиде (х^ вычисляют по формуле:
v-0,63х,=• а
где у —количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,63 — постоянный коэффициент;
ах — количество формамида, взятое на анализ, в мл;
d — удельный вес формамида.
Расчет процентного содержания азотистых примесей (Хг) в формамиде производят по формуле:
где 0,14 —постоянный коэффициент;
-и, щ и d —см. выше.
Расчет процентного содержания формамида в прела рате (хз) производят по формуле:
_ (Xi—Хз). 100-45,043
где 45,043— м. вес формамида;
14 — ат. вес азота;
xj и х2 — см. выше.
При сокращении формула приобретает значение: Хд = (х, —х3)-3,2173.
ТИАЗОЛ
(4-метил-5-оксиэтилтиазол)
СН3
М. вес 143,212М. вес 143,212-С = С — СН2 — СН2ОН
М. вес 143,212
М. вес 143,212
^СН—S
Густая маслянистая жидкость Желтоватого цвета с характерным стойким запахом. Уд. вес 1,2 (при 20°), т. кип. 136—137° при 7 мм. Растворим в воде, спирте, эфире, хлороформе, дихлорэтане.
Для определения тиазола предложен ряд методов, основанных как на определении его по азоту или по сере, входящих в состав его молекулы (методы химические), так и на его способности поглощать свет в ультрафиолетовой области спектра (рис. 18).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПО СЕРЕ
(метод анализа разработан во ВНИВИ
В. М. Иосиковой, В. В. Зворыкиной, Е. Н. Чесалиной)
В круглодонную колбу емкостью 0,5 л из стекла Пирекс с пришлифованным воздушным холодильником, высотой не менее 1,25 м, вносят 3 г кристаллического КМпО4 и 0,75 г кристаллического КОН. В колбу помещают точную навеску вещества в количестве около 0,2 г, колбу закрывают холодильником и через него вводят в колбу небольшими порциями 30 мл воды.
Содержимое колбы нагревают в вытяжном шкафу, на электроплитке через слой асбеста, вначале осторож-
но, а затем доводят до слабого равномерного кипения. По.истечении 3 часов окисление вещества заканчивается. Содержимому колбы дают охладиться до комнатной температуры и через холодильник маленькими порциями вйосят в колбу около 30 мл концентрированной НС1
Рис. 18. Абсорбционные кривые тиазола.
7 — 100% тиазола; 2— 67,3% тиазола; 3— 33,5% тиазола; 4 — 27% тиазола; 5 — 13,8% тиазола.
(уд. вес 1,19) до прекращения выделения паров. Колбу вновь помещают на электроплитку и содержимое ее нагревают до прекращения изменения цвета раствора.
Охлажденный раствор количественно переносят из колбы в стакан, смывая стенки колбы 25—30 мл воды; содержимое стакана нагревают до кипения и обрабатывают при помешивании стеклянной палочкой, нагретой до кипения смесью, состоящей из 30 мл 5% раствора ВаСЬ и 15 мл 5% раствора МН4С1. Образовавшемуся
осадку BaSO4 дают отстояться и по охлаждении содержимое стакана отфильтровывают через беззольный фильтр; стакан, палочку и осадок на фильтре промывают водой до отсутствия в промывных водах реакции на хлор (проба с раствором азотнокислого серебра).
Фильтр с осадком переносят в прокаленный и взвешенный фарфоровый тигель, вначале осторожно обугливают на электроплитке или горелке, а затем слегка прокаливают, охлаждают, добавляют 0,5 мл концентрированной H2SO4, вновь обугливают на электроплитке до прекращения выделения паров и прокаливают в тигельной или муфельной печи при красном калении до постоянного веса.
Вычисление процентного содержания тиазола в препарате (х), производят по формуле:
143,212.32,06-6-10032,06-0-233,44
где 143,212 — м. вес 4-метил-5-оксиэтилтиазола; 32,06 — ат. вес серы;
233,44 — м. вес BaSO4;
b — вес сернокислого бария в г; а — навеска в г;
100 — пересчет в % •
При сокращении формула приобретает значение:6-61,3485х .
о
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТОДОМ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ
Около 1 г тиазола (точная навеска) вносят в колбу, снабженную пришлифованным холодильником, туда же добавляют из микробюретки точно '1 мл уксусного ангидрида м смесь нагревают в течение 1 часа на кипящей водяной бане. Через холодильник в колбу приливают 50 мл воды и содержимое ее нагревают точно 5 минут на кипящей водяной бане. Колбу быстро охлаждают струей холодной .воды, холодильник промывают водой и весь раствор количественно переносят в мерную колбу емкостью 200 мл, доводя раствор водой до метки. Отбирают 20 мл и титруют 0,1 н. раствором NaOH до появлений бледно-розового окрашивания (индикатор фенолфталеин). Параллельно ставят контрольный опыт на реактивы.
Содержание тиазола в процентах (х) вычисляют по формуле:
(у— у,).0,01432-200-100(у —и^-и.З
~а-20а
где и—количество 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
Ui — количество 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование испытуемой пробы, в мл;
0,01432 — количество тиазола, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора NaOH, в г;
200 — разведение в мл;
20 — количество раствора, взятое на титрование, в мл;
а — навеска в г;
100 — пересчет в %.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯСПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ(по В. А. Девяткину и Г. Л. Федоровой, 1958)
Точную навеску испытуемого образца тиазола в количестве 250 мг растворяют в воде в мерной колбе емкостью 25 мл. После тщательного перемешивания отби-
о ю го зо ад so go ад so so юо %о ю го зо ад so go ад so so юо %Рис. 19. Кривая зависимости концентрации от экстинкции для тиазола.Рис. 19. Кривая зависимости концентрации от экстинкции для тиазола.рают 1 мл раствора в мерную колбу емкостью 200 мл. Полученный раствор промеряют в закрытых кюветах на спектрофотометре с включением водородной лампы при Х= 230—300 mg, производя измерения через 10 тр.
о ю го зо ад so go ад so so юо %
о ю го зо ад so go ад so so юо %
Рис. 19. Кривая зависимости концентрации от экстинкции для тиазола.
Рис. 19. Кривая зависимости концентрации от экстинкции для тиазола.
Расчет процентного содержания 4-метил-5-оксиэтилтиа- зола в испытуемом образце (х) производят по формуле.
Е
16,8 ’
где Е— Найденнаяэкстинкцияпри
250 шц;
16,8 — постоянный коэффициент.
На рис. 19 представлен калибровочный график для определения качества тиазола. Опуская перпендикуляр из точки, соответствующей найденной экстинкции, находим на оси абсцисс соответствующее значение концентрации вещества в процентах.
ИСПЫТАНИЕ ТИАЗОЛА НА РАСТВОРИМОСТЬ
В градуированную пробирку вносят 2—3 мл тиазола и равный объем дистиллированной воды, энергично встряхивают в течение 2—3 минут и оставляют в покое. Тиазол, не содержащий посторонних примесей, должен полностью раствориться; наличие двух слоев указывает на загрязненность препарата и на непригодность его для технологического процесса.
•N:•N:ВИТАМИН В, (ТИАМИН)
•N:
•N:
СНз
NNСН2-NСН2-NСН2-СН2ОНСН2-СН2ОНSS
N
N
СН2-N
СН2-N
СН2-СН2ОН
СН2-СН2ОН
S
S
С1
Физико-химические свойства тиамина
Показатель
Характеристика
Состояние вещества
Формула
Бесцветные иглы
CisHigONjSCli (хлорид гидрохлорид)
Ci2Hi8ON4SBr2 • V2H2O (бромид гид-
Молекулярный вес
Температура плавления
робромид)
337,29 (хлорид); 435,2 (бромид) 246—250° (разл.) — хлорид
210—215° (разл.) — бромид
Растворимость
В воде 100/100, в этиловом 95% спирте 1/100, в 100%—0,3/100, в глицерине 5/100. Нерастворим в
Оптическая активность
эфире, ацетоне, бензоле, хлороформе
Показатель
Характеристика
Биологическая активность
Максимум абсорбции Флуоресценция Абсорбционный максимум флуоресценции
pH 1% водного раствора
1 гкристаллического витамина
В! — 333 000 ИЕ
245—247 тц
Для тиохрома — голубая
260—270 шц
3,13
ФЛУОРОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИАМИНА
Принцип метода заключается в том, что тиамин при окислении в щелочной среде красной кровяной солью превращается во флуоресцирующее вещество — тиохром:
Н3С-/ у \-СН2СН2ОН
Тиохром извлекают растворителями, не смешивающимися с водой (изобутиловый, изоамиловый спирт) и флуоресценцию раствора измеряют при помощи флуорометра.
Определение тиамина в таблетках и драже
1 г порошка растертых таблеток или драже (точная навеска), содержащих'около 5 мг тиамина, растворяют при слабом нагревании в воде в мерной колбе емкостью 250 мл, доводят водой до метки и фильтруют. 5 мл филь- т|рата переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.
Из полученного раствора отбирают 3 пробы по 1 мл в капельные воронки с притертыми пробками и добавляют туда же по 4 мл воды; в первую и вторую воронки приливают по 3 мл окислительной смеси, а в третью —
3 мл 15% раствора едкого натра и встряхивают. Из бюретки к содержимому всех воронок приливают по 12 мл изобутилового, изоамилового или бутилового спирта, встряхивают 2 минуты и дают разделиться слоям. Водный слой удаляют, а спиртовой фильтруют через бумажный фильтр, в который помещают небольшое количество прокаленного сульфата натрия, в кюветы флуорометра.
Отбирают по 1 мл стандартного рабочего раствора тиамина и переносят их в делительные воронки, туда же прибавляют по 4 мл воды и далее обрабатывают так, как описано выше, добавляя во вторую воронку только раствор щелочи.
Растворы тиохрома предохраняют от света. Вначале измеряют флуоресценцию стандартного рабочего раствора и контрольной пробы к нему (только со щелочью), а затем флуоресценцию испытуемых растворов и контрольной пробы к ним.
Содержание витамина Bi в миллиграммах в 1 шт. таблеток или драже (х) вычисляют по формуле:
— И — Byb-v-va-d
0! — В^-а-Op о3-1000
где А— показания флуорометра для испытуемого раствора;
В — показания флуорометра для контрольной пробы к нему;
Л1 — показания флуорометра для стандартного рабочего раствора;
Вх — показания флуорометра для контрольной пробы к нему;
а — навеска в г;
b — количество тиамина в 1 мл стандартного рабочего раствора в гаммах;
о — объем, в котором растворена навеска, в мл; 01 — объем раствора, взятый для приготовления испытуемого рабочего раствора, в мл;
у2— объем второго разведения в мл;
у3 —объем испытуемого раствора, взятого на окисление, в мл;
1000 — пересчет в мг;
d— средний вес 1 шт. драже или таблеток в г.
ОБЪЕМНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИАМИНА
Определение тиаминбромида-гидробромида
Около 0,3 г препарата (точная нареска) растворяют в 30 мл воды и титруют 0,1 н. раствором едкого натра до голубовато-зеленого окрашивания (индикатор—бромтимоловый синий). После титрования раствор подкисляют азотной кислотой, прибавляют 1 мл раствора железоаммониевых квасцов, 0,1 мл 0,1 н. раствора роданистого аммония и титруют 0,1 н. раствором азотнокислого серебра до исчезновения окраски. Из количества миллилитров 0,1 н. раствора азотнокислого серебра, израсходованного при последнем титровании, вычитают 0,1 мл 0,1 н. раствора роданистого аммония и количество миллилитров 0,1 н. раствора едкого натра, затраченного на первое титрование.
Содержание тиаминбромида-гидробромида в препарате в процента (х) вычисляют по формуле:
(у— уО'О,04352-100х = —— >
а
где у—количество точного 0,1 н. раствора AgNOs, пошедшее на титрование, в мл;
Ui — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,04352 — количество тиаминбромида-гидробромида, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
100 — пересчет в %;а — навеска в г.
Определение тиаминхлорида-гидрохлорида*"
Около 1 г препарата (точная навеска) растворяют в воде в мерной колбе емкостью 100 мл и доводят водой до
метки (раствор А). Из полученного раствора отбирают в коническую колбу 20 мл, прибавляют 10—15 мл воды, 5—6 капель индикатора бромтимолового синего и титруют 0,1 н. раствором NaOH до появления голубовато-зеленого окрашивания.
Отбирают 20 мл раствора А в коническую колбу, прибавляют 1 мл HNO3 (разведенной 1:1), 15 мл 0,1 н. раствора AgNO3 (из бюретки), 20—30 мл воды, взбалтывают и титруют 0,1 н. раствором NH4CNS в присутствии 1 мл раствора железоаммониевых квасцов до появления розового окрашивания.
Содержание тиаминхлорида-гидрохлорида в препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
[(15 — и) — vj-0,03373-100-100
20
где 15 — количество точного 0,1 н. раствора AgNO3, взятое для связывания галоида, в мл;
v — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
Щ — количество точного 0,1 н. раствора NH4CNS, пошедшее на титрование, в мл;
0,03373 — количество тиаминхлорида-гидрохлорида, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
100 — объем разведения в мл;
а — навеска в г;
20 — количество раствора, взятое для титрования, в мл.
Примечание. При содержании в препарате более 0,2% золы определение производят флуорометрическми методом или методом, описанным ниже.
Объемный метод определения в неводных растворителях. Весьма перспективный метод титрования органических соединений в неводных растворителях основан на теории Бренстед и Лоури, согласно которой сила кислот и оснований не обязательно является функцией степени ионизации, и, что кислота, будучи сильной в водных растворах может быть еще более сильной в среде органического растворителя. Это касается и оснований. Так, хлорная, серная, соляная и трихлоруксусная кислоты равносильные в водном растворе, в безводной уксусной
кислоте располагаются в порядке убывающей силы следующим образом:
хлорная -> серная -> соляная -> трихлоруксусная.
(В равной мере это относится и к основаниям.)
На этом принципе построены методы титрования органических соединений в неводных растворителях.
По этому вопросу имеется обширная литература, с исчерпывающей полнотой представленная в соответствующих монографиях '.
В химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. А. Девятниным и М. Я. Мойжес разработан способ анализа тиаминов с помощью неводного титрования, отличающийся от опубликованных в литературе методов.
Около 0,1 г препарата (точная навеска) растворяют в 20 мл безводной уксусной кислоты, прибавляют 5 мл 5% раствора уксуснокислой ртути, приготовленной на безводной уксусной кислоте и титруют 0,1 н. раствором хлорной кислоты в безводной уксусной кислоте в присутствии нескольких капель индикатора кристаллического фиолетового до появления изумрудно-зеленой окраски раствора. Одновременно ставят контрольный опыт на реактивы.
Примечание. Раствор уксуснокислой ртути прибавляют лишь в случае анализа галогенидов.
Содержание тиамина в процентах (х) вычисляют по формуле:
(и — «О-А-ЮОх _,
а
где и —количество 0,1 н. раствора хлорной кислоты, пошедшее на титрование препарата, в мл;
у,— количество 0,1 н. раствора хлорной кислоты, пошедшее на титрование контрольной пробы, в мл;
а — навеска в г;
100 — пересчет в %;
К— количество тиамина, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора хлорной кислоты, в г:
Шанти Р. Палит, Мехр Натх Дас, Г. Р. Сомаядулу. Неводное титрование ГНТИЗд-во хим лит., М., 1958. Крешков А. П„ Быкова Л. Н„ Казарян Н. А, Ахдарова Н. Ш. и др. Усп. хим., 1962, 31, 4, 490—526.
i иаминхлорид-гидрохлорид — 0,01686 тиаминбромид-гидробромид — 0,02176 тиаминмононитрат — 0,01635 тиотиамин —0,02963 тиаминпропилдисульфид — 0,03563
ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Метод полярографического определения тиамина в драже и таблетках, содержащих один или несколько витаминов, разработан в Украинском научно-исследовательском институте пищевой промышленности А. И. Шко- диным и Г. П. Тихомировой.
Определение в драже и таблетках с витамином В!
Драже и таблетки с витамином В]
Навеску средней пробы растертых в порошок драже или таблеток в количестве 1—1,5 г растворяют в мерной колбе емкостью 50 или 100 мл в 0,1 н. растворе КС1. Раствор фильтруют и около 10 мл его наливают в электролизер. После 15-1Минутного пропускания через раствор тока водорода или азота снимают полярограмму.
Можно воспользоваться методом калибровочных графиков или методом добавок.
Калибровочный график строят следующим образом: навески кристаллического тиамина в количестве 2, 5, 8, 10 и 12 мг растворяют в 50 или 100 мл 0,1 н. раствора КО. Для каждого раствора в отдельности снимают полярограмму и определяют высоту волны. На графике по оси абсцисс откладывают концентрации тиамина, по оси ординат — соответствующие высоты волн. Полученные точки соединяют прямой линией.
Определение методом добавок производят следующим образом: после снятия полярограммы испытуемого раствора приготовляют смесь из 9 мл испытуемого раствора и 1 мл стандартного раствора, содержащего 5 мг тиамина в 1 мл 0,1 н. раствора КС1, и полярографируют.
Расчет содержания тиамина в испытуемой пробе (лс) в данном случае производят по формуле:
c-h-v-dх =hx-a
где с— концентрация стандартного раствора в мг/мл;
h— высота волны испытуемого раствора в мм;
hx— высота волны после добавки стандартного раствора в мм;
и—объем, в котором растворена навеска, в мл; d— вес 1 шт. драже или таблеток в г;
а— навеска в г.
Драже поливитаминное
Навеску средней пробы растертого в порошок драже в количестве 7—10 г растворяют к 100 мл 0,1 н. раствора НС1. К раствору по каплям прибавляют 4% раствор КМпО4 до появления неисчезающей бурой окраски. Отстоявшийся раствор фильтруют. Около 10 мл фильтрата наливают в электролизер и полярографируют после пропускания тока водорода.
Определение производится по методу добавок, как описано выше.
ФЛУОРОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИАМИНАВ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ'
Навеску испытуемого материала около 5—10 г в зависимости от ожидаемого содержания тиамина тщательно растирают в ступке с 10—25 мл 0,1 н. раствора серной кислоты, переносят в колбу, доводят объем тем же раствором приблизительно до 75 мл.
В колбу вставляют воронку и помещают ее в кипящую водяную баню на 45 минут, время от времени перемешивая ее содержимое.
По истечении указанного времени содержимое колбы охлаждают до 35—40° и добавляют в нее взвесь мицелия грибка Penicillium или Aspergillius oryzae из расчета 0,03 г мицелия на 1 г сухого вещества навески. Для этого навеску мицелия растирают в ступке с 2—3 мл 2,5 М раствора уксуснокислого натрия и содержимое ступки количественно переносят при помощи 2—3 мл того же раствора в колбу, доводя pH вытяжки в колбе раствором уксуснокислого натрия до 5. После этого колбу помещают на 15—18 часов в термостат при 38°’. По истечении указанного времени содержимое колбы доводят водой до 100 мл и фильтруют.
10—20 мл фильтрата пропускают через адсорбент декальсо (синтетический натриевый алюмосиликат НагОАЬОз-бЗЮз) для адсорбции тиамина следующим образом: заготовляется стеклянная колонка, имеющая в верхней части диаметр 2,5 см и длину 9 см, в средней части диаметр 0,7 см и длину 15 см и в нижней части диаметр 0,5 см, внутренний диаметр 0,03 см и длину 3 см. Колонку укрепляют на пробке в мерном цилиндре емкостью 100 мл.
В средней части колонки помещают стеклянную вату, насыпают адсорбент слоем 6 см и промывают его 10 мл 3% раствора СНзСООН, после чего пропускают испытуемый раствор и промывают адсорбент 3 раза дистиллированной водой порциями по 10 мл.
Содержимое цилиндров выливают, цилиндры тщательно промывают водой и элюируют тиамин из адсорбента при помощи 15—20 мл кипящего 25% раствора КС1 в 0,1 н. растворе НС1, доводят объем элюата в цилиндре до 25 мл.
По 5 мл полученного раствора помещают в три делительные воронки; в первую и во вторую прибавляют по 3 мл окислительной смеси, перемешивают и прибавляют по 12 мл изобутилового, бутилового или изоамилового спирта. В третью пробирку, служащую для холостого опыта, прибавляют 3 мл 15% раствора NaOH, переме-
шивают и прибавляют 12 мл изобутилового, бутилового или изоамилового спирта. Содержимое пробирок встряхивают 2 минуты и фильтруют через бумажный фильтр, куда помещено небольшое количество сульфата натрия, в кюветы флуорометра.
Одновременно готовят стандартный раствор тиохрома, как было описано выше, и контроль к нему.
Вначале производят измерение флуоресценции в стандартном растворе и в контрольном опыте к нему, а затем в испытуемых растворах и в контрольном опыте к ним.
Содержание тиамина в миллиграмм-процентах (х) вычисляют по формуле:
(Л — В)-100-25-100
Х= ^-Sa-a-y.5-1000 ’
где А— показания флуорометра для испытуемого раствора;
В— показания флуорометра для контроля к нему;
Л1— показания флуорометра для стандартного раствора;
В\ — показания флуорометра для контроля к нему;
100 — объем, до которого доведена навеска, в мл; 25 — объем элюата в мл;
а — навеска испытуемого продукта в г или объем в мл;
у — объем фильтрата, взятый для адсорбции, в мл;
5 — количество элюата, взятое для окисления, в мл;
1000 — пересчет в мг;
100 — пересчет в %
С^^етоды анализа
кокарбоксилазы
п
ри получении кокарбоксилазы образуется ряд фосфорных эфиров тиамина:
Трифосфат
c12h22o14n4sp4
Дифосфат
C12H21O11N4SP3
Монофосфат
C18H80O8N4SP8
М. вес 602,31
М вес 522,32
М. вес 442,34
Кроме того, смесь фосфатов может содержать свободный тиамин и неидентифицированные полифосфаты тиамина.
Это обусловливает чрезвычайные затруднения в анализе указанной смеси. Д. Силипранди и Н. Силипранди (D. Siliprandi, N. Siliprandi, 1954) и Гаудиано с соавторами (Gaudiano a. oth.) предложили методы анализ# смеси фосфорных эфиров тиамина, основанные на хроматографическом разделении смеси на бумаге. Этот метод был использован в нашей лаборатории В. И. Колтуновой и с некоторыми Изменениями и дополнениями, внесенными ею, применяется в контроле производства препаратов кокарбоксилазы.
Ниже описан метод анализа кокарбоксилазы по принятой прописи.
Полосу хроматографической бумаги размером 9X35 см расчерчивают вдоль на три равные части и на расстоянии 3 см от нижнего края проводят поперечную линию, на которой в центре каждой полосы наносят пятно исследуемого раствора.
Для этого 0,1 г препарата (точная навеска) растворяют в 10 мл воды (раствор 1), отбирают при помощи микропипетки по 0,01 мл полученного раствора и наносят его (в 2 приема по 0,005 мл) на хроматографическую бумагу. Полосу бумаги помещают в камеру для хроматографирования на 20 часов, используя в качестве подвижного растворителя смесь: н-пропанол-вода-1 М ацетатный буферный раствор (pH = 5) в отношении 70:20: 10.
По прошествии указанного времени хроматограмму удаляют из камеры и высушивают на воздухе. Хроматограмму разрезают вдоль на три полосы и среднюю полосу обрызгивают из пульверизатора ' свежеприготовленной смесью, состоящей из 1 ч. 15% раствора NaOH, 2 ч. 96% этилового спирта и 0,05 ч. 2,5% водного раствора красной кровяной соли. Под влиянием щелочного раствора феррицианида калия тиамин фосфорных эфиров окисляется в тиохром с образованием интенсивной синей флуоресценции. При просмотре в ультрафиолетовом свете флуоресцирующие пятна обрисовывают карандашом, и соответственно их местоположению определяют пятна на боковых, не проявленных окислителем, полосах бумаги. Фосфорные эфиры на хроматограмме располагаются в следующем порядке (от места нанесения анализируемого раствора):
Трифосфорный эфир тиамина Rt = 0,05 Дифосфорный эфир тиамина Rt = 0,12 Монофосфорный эфир тиамина Rt = 0,20 Свободный тиамин Rt = 0,7
Каждое пятно хроматограммы вырезают, мелко наре.- зают ножницами и помещают в мерные колбы емкостью 25 мл; в колбы приливают по 5 мл 1 н. раствора соляной кислоты и помещают их на кипящую водяную баню на 60 минут. В течение этого времени колбы с содержимым периодически энергично встряхивают, чтобы добиться полного механического измельчения бумаги и тем самым — полной элюции вещества. По окончании экстрак- 104
ции содержимое колб охлаждают, объем растворов в колбах доводят до метки водой и фильтруют. Из каждого полученного раствора отбирают три пробы по 5 мл в колбы или пробирки с притертыми пробками, туда же прибавляют по 2 мл дистиллированной воды и перемешивают. К двум пробам прибавляют по 1 мл окислительной смеси (см. выше), к третьей (контрольной) — 1 мл 15% раствора NaOH. Пробы встряхивают в течение 1 минуты, после чего прибавляют в каждую по 2 мл раствора перекиси водорода.
Интенсивность флуоресценции растворов определяют на флуорометре по сравнению с флуоресценцией стандартного раствора тиаминхлорида.
Содержимое каждого фосфорного эфира тиамина (х) в процентах вычисляют по формуле:
_(4—Ву^-Уз-с-ЮО-К
~ (Л; — BJ-a^-o.-lOOO • 1000 ’
где А— показание прибора для опытного раствора;
В—показание прибора для контроля к опытному раствору;
Ai — показание прибора для стандартного раствора;
— показание прибора для контроля к стандартному раствору;
а— навеска в г;
У1 — объем, в котором растворена навеска, в мл;
Уг—объем, нанесенный на бумагу, в мл;
Уз — объем, в котором «растворено» пятно, в мл;
Уд — объем раствора, взятый для окисления, в мл;
с — количество стандарта, взятое на окисление, в гаммах;
1000 — пересчет в мг;
пересчет в г;
пересчет в %;
К — коэффициент пересчета на: монофосфорный эфир = 1,311 дифосфорный эфир = 1,548 трифосфорный эфир = 1,785
^^^етоды контроля в синтезе
витамина В,
М вес 114,97М вес 114,97ДИХЛОРМЕТИЛОВЫЙ ЭФИР
М вес 114,97
М вес 114,97
СН2С1
ББ°\ СН2С1
Б
Б
есцветная жидкость В воде быстро разлагается с образованием формальдегида:
С1СН2ОСН2С1 + Н2О -» 2СНОН + 2НС1
Уд. вес 1,37. Т кип. 103—105° Растворим в абсолютном алкоголе. Токсичен и требует особого обращения в работе (методы анализа разработаны В А. Девятни- ным, Л. Н. Кравчиной, Н. М. Стольниковой).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПО ХЛОРУ
Определение общего количества хлора
На аналитических весах взвешивают мерную колбу с притертой пробкой, емкостью 100 мл, в которую внесено приблизительно 20 мл воды (колба должна быть закрыта пробкой). Затем в колбу пипеткой спускают около 0,8 мл дихлорметилового эфира» и’ взвешивают колбу вторично (навеска дихлорметилового эфира не должна превышать 1 г). Содержимое кол бы. доводят водой до метки ’(раствор А), тщательно перемешйвайт и отбира.
ют 10 мл раствора для определения соляной кислоты титрованием 0,1 н. раствором NaOH в присутствии фенолфталеина в качестве индикатора.
Расчет общего количества НС1 в процентах (х) производят по формуле:
«V 100-0,003646 100х = ,
«•10
где и —количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
100—объем разведения в мл;
0,00364 6 — эквивалент НС1;
100 — пересчет в %;
а—навеска дихлорметилового эфира в г;, 10—количество раствора, взятое на титрование, в мл.
Определение примеси соляной кислоты
На аналитических весах взвешивают мерную колбу емкостью 50 мл, закрытую притертой пробкой, куда внесено 20—30 мл абсолютного этилового спирта. В колбу пипеткой вносят около 0,8 мл испытуемого образца дихлорметилового эфира, закрывают пробкой и взвешивают вторично. Затем содержимое колбы доводят до метки абсолютным спиртом, перемешивают, отбирают 10 мл и быстро оттитровывают 0,1 н. спиртовым раствором этилата натрия в присутствии фенолфталеина, также приготовленного на абсолютном этиловом спирте.
Титр раствора этилата натрия устанавливают отдельно перед каждым определением по 0,1 н. раствору НС1.
Расчет примеси НС1 в образце в процентах (xt) производят по формуле:
V1-50-0,003646-100
где Ui — количество точного раствора этилата натрия, пошедшее на титрование, в мл;
50—объем разведения в мл;
О] —навеска дихлорметилового эфира в г (остальные обозначения указаны выше).
Содержание хлора в дихлорметиловом эфире
Процентное содержание хлора находят по разности:
с=х—хг.
Содержание дихлорметилового эфира
Процентное содержание диХлОрметилового эфира рассчитывают по формуле:
с-100
61,7 ’
где 61,7—коэффициент пересчета на теоретическое содержание хлора в дихлорметиловом эфире.
Определение общего количества формальдегида
В основу описываемого метода положен способ йодометрического определения формальдегида, предложенный Ромийном (Romj’n, 1897).
Сущность метода заключается в том, что в присутствии щелочи формальдегид окисляется йодом в муравьиную кислоту. Избыток йода определяют в подкисленном растворе гипосульфитом:
J2 + 2NaOH -> NaOj + NaJ+ Н2О
HCOH + NaOj + NaOH -» HCOONa '+ NaJ + H2ONaOj +NaJ +H2SO4 -» Na2SO4 + J2 + H2O.
Из раствора А (см. стр. 106) отбирают 5 мл в коническую колбу с притертой пробкой, прибавляют 20 мл 0,1 н. раствора Jj и 10 мл нормального раствора едкого натра. Колбу закрывают пробкой и помещают на 10 минут в темноту, после чего прибавляют 11 мл нормального раствора H2SO< и выделившийся йод оттитровывают 0,1 н. раствором гипосульфита в присутствии 0,5% раствора крахмала.
Расчет общего количества формальдегида в процентах (х3) производят по формуле:
(у2 —у3).0,001501-100-100
где и2— количество точного 0,1 н. раствора йода, взятое на анализ, в мл;
из — количество точного 0,1 н. раствора гипосульфита, пошедшее на титрование, в мл;
0,001501 — количество формальдегида, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора йода, в г;
5 — количество раствора, взятое на титрование, в мл.
Остальные обозначения указаны выше.
Вычисление содержания формальдегида в дихлорметиловом эфире в процентах ^х^ производят по формуле:
- 26,1
х4 = —^
100
где 26,1 —коэффициент пересчета на теоретическое содержание формальдегида в дихлорметиловом эфире.
Примесь формальдегида в дихлорметиловом эфире в процентах (т) находят по разности:
т = х3 — х4.
2-ХЛОРМЕТИЛ-4-НИТРОТОЛУОЛ
cih2C^^/^^.no2
C8H8O2C1N
Н3СМ. вес 185,6
Легкий кристаллический порошок белого цвета, силь- нохраздражающий кожу и слизистые оболочки. Токсичен. Т. пл. 61,5°. Нерастворим в холодной воде, умеренно растворим в метаноле, хорошо — в бензоле. В качестве примеси может содержать 2,6-дихлорметил-4-нитротолуол с т. пл. 145° и минеральные кислоты (методы анализа разработаны В. А. Девятниным, Л. Н. Кравчиной, Н. М. Стольниковой).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХЛОРА
В основу метода положен способ определения хлора в боковой цепи, предложенный Р. П. Ластовским (1949).
Рис 20 График для расчета примеси дихлорметил-4-нитро- толуола в монохлорметил-4-нит- ротолуолеРис 20 График для расчета примеси дихлорметил-4-нитро- толуола в монохлорметил-4-нит- ротолуолеТочную навеску вещества в количестве около 0,2 г помещают в круглодонную колбу емкостью 250 мл, прибавляют 25 мл нормального раствора КОН и 25 мл 96% этилового спирта, колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают в течение 1 часа на кипящей водяной бане. Раствор охлаждают, подкисляют 10 мл HNOs (разведенной водой в отношении 1:3), прибавляют 20 мл 0,1 н. раствора AgNOa, 2 мл раствора железоаммониевых квасцов в качестве индикатора и смесь титруют 0,1 н. раствором KCNS до появления розовожелтого окрашивания. Одновременно ставят холостой опыт без испытуемого вещества, показания которого учитывают при расчете (рис. 20).
Рис 20 График для расчета примеси дихлорметил-4-нитро- толуола в монохлорметил-4-нит- ротолуоле
Рис 20 График для расчета примеси дихлорметил-4-нитро- толуола в монохлорметил-4-нит- ротолуоле
Количество хлора в продукте в процентах (х) вычисляют по формуле:
(« — «,) -0,003546-100 х=1—,
а
где и— количество точного 0,1 н. раствора AgNOa, взятое на анализ, в мл;
V] — количество точного 0,1 н. раствора KCNS, пошедшее на титрование, в мл;
0,003546 — количество хлора, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора AgNOa, в г;
100 — пересчет в %;а — навеска в г.
Примечание Содержание хлора в монохлорметиловом производном — 19,11%
Содержание 2-хлорметил-4-нитротолуола в продукте в процентах (xj вычисляют по следующей формуле:
(у — V1).Q,01856-100
где 0,01856 — количество 2-хлорметил-4-нитротолуола, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора AgNOs, в г.
Остальные обозначения см. выше.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ МИНЕРАЛЬНЫХ КИСЛОТ
Точную навеску вещества в количестве около 1 г растворяют в 50 мл метилового спирта в мерной колбе емкостью 50 мл.
Для определения примеси НС1 10 мл полученного раствора переносят в коническую колбу, добавляют 5 мл 0,1 н. раствора AgNO3, 1 мл раствора железоаммониевых квасцов и титруют 0,1 н. раствором NH<CNS до появления розово-желтого окрашивания.
Содержание примеси НС1 в процентах (х3) вычисляют по формуле:
(о —У1).0,003646-50-100
^s = —.—,
а-10
где 50 — объем разведения в мл;
10 — количество раствора, взятое на анализ, в мл;
Остальные обозначения см. выше.
При сокращении формула приобретает значение:
(V —«0-1,823
^2 =.
а
Для определения примеси H2SO4 отбирают 10 мл приготовленного раствора и титруют в присутствии фенолфталеина 0,1 н. раствором NaOH. Отдельно оттитро- вывают 10 мл Метилового спирта в качестве контроля, и это показание вычитают из показаний опыта.
Израсходованное при титровании количество щелочи соответствует сумме НС1 и H2SO4 или одной H2SO4.
Содержание примеси H2SO4 в процентах (х3) вычисляют по формуле:
[(«2 —Уз) —(V —V1)] 0,004904-50-100
где у2— количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование пробы, в мл;
t)4— количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование метилового спирта, в мл;
0,004904— количество H2SO4, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора NaOH, в г.
Остальные обозначения см. выше.
При сокращении формула приобретает следующее значение:
_ [(у2 —■ Уз) — (у — «1)] • 2,452
определение No2-rpynnbi
Метод основан на том, что группа NO2 подвергается восстановлению до NH2, а первичные амины при взаимодействии с азотистой кислотой определяется по изменению цвета йодкрахмальной бумаги:
<^^>— NH2 + №NO2 + 2НС1 -> RN2C1 + NaCl + 2H3O.
Метод разработан на основе способа, предложенного Р. П. Ластовским.
Точную навеску вещества в количестве около 1 г помещают в колбу, снабженную воздушным холодильником, длиной около 1 м, растворяют в 40 мл 80% СН3СООН, добавляют 20 мл концентрированной НС1 (уд. вес 1,19) и 7 г цинковой пыли.
По окончании бурной реакции содержимое колбы нагревают 15 минут на слабом огне, по окончании реакции восстановления раствор охлаждают, фильтруют в мерную колбу емкостью 250 мл, осадок на фильтре промывают 3—4 раза водой, объем раствора в колбе доводят водой до метки. Из полученного раствора после тщательного перемешивания отбирают 50 мл, охлаждают до температуры ниже 10° и титруют 0,1 М раствором NaNO2 по методу диазотирования с выдержкой конца реакции по йодокрахмальной бумаге 5 минут.
Расчет содержания НОг-группы в процентах (х4) производят по формуле:
у-0,0046-100-250^4 =—*
а -50
где и— количество точного 0,1 М раствора NaNO2,
пошедшее на титрование, в мл;
0,0046 — количество NO2, соответствующее 1 мл точного 0,1 М раствора NaNO^, в г;
100 — пересчет в %;
250 — объем разведения в мл;
а— навеска в г;
титрование, в мл.титрование, в мл.50 — количество испытуемого раствора, взятое на
титрование, в мл.
титрование, в мл.
При сокращении формула приобретает следующий вид:
«•2,3
NO,NO,Примечание 2-хлорметил1-нитротолуол содержит 24,7%
NO,
NO,
3,4-КСИЛИДИН
СНз
А/СНз
NH,NH,CeHuN
NH,
NH,
М. вес 121,18
Бесцветный кристаллический продукт, на свету темнеющий, т. пл. 49—50°. Слабо растворим в воде, хорошо—в спирте.
Метод анализа 3,4-ксилидина основан на общеизвестном принципе, что первичные амины при взаимодействии с азотистой кислотой в присутствии соляной кислоты образуют соли диазония (методы анализа разработаны В. А. Девяткиным, Л. Н. Кравчиной, Н. М. Стольнико- вой).
При реакции диазотирования берут избыток минеральной кислоты против теоретически необходимого количества, чтобы устранить побочную реакцию образования диазо-амино и амино-азосоединений, получающихся в результате взаимодействия соли диазония с еще непрореагировавшим с азотистой кислотой амином. Диазо-
8 В А Девяткин Ц3
тирование проводят при охлаждении раствора. В присутствии бромистого калия скорость диазотирования сильно возрастает (Р. П. Ластовский, 1949).
УСТАНОВКА ТИТРА РАСТВОРА НИТРИТА НАТРИЯ
В толстостенный стакан емкостью 500 мл внося! 25 мл 0,1 М раствора сульфаниловой кислоты, 175 мл воды и 25 мл НС1 (уд. вес 1,19). Раствор охлаждают (температура раствора должна быть ниже 10°) и титруют приготовленным раствором нитрита натрия, прибавляя его медленно, небольшими порциями, при постоянном помешивании содержимого стакана стеклянной палочкой. Конец реакции устанавливают следующим образом: после прибавления очередной порции раствора нитрита натрия стеклянной палочкой наносят каплю испытуемого раствора на полоску йодокрахмальной бумаги. Если в центре капли не появится синее пятно, прибавляют новую порцию нитрита натрия. Если же пятно появится, наносят вторую и затем третью каплю раствора на бумагу, и если все они дают побурение йодокрахмальной бумаги, раствор оставляют стоять в покое в течение 5 минут. Вторичное появление пятна через 5 минут служит признаком конца титрования.
Первое титрование считается ориентировочным. Испытание на йодокрахмальной бумаге производят после добавления каждой новой порции нитрита. При втором титровании прибавляют нитрита натрия на 0,5—1 мл меньше, чем при ориентировочном титровании, и продолжают титрование, прибавляя его по 1 капле и производя пробу на йодокрахмальной бумаге после прибавления каждой капли.
Такое титрование повторяют 2—3 раза.
Коэффициент поправки к титру нитрита вычисляют по формуле:
гдегдеа—количество раствора нитрита натрия, пошедшее на титрование 25 мл 0,1 М раствора сульфаниловой кислоты, в мл.
где
где
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
Точную навеску ксилидина в количестве около 0,25 г переносят в стакан, растворяют в 2 мл НС1, разведенной водой в отношении 1:1, прибавляют 23 мл воды и 1,5 мл нормального раствора КВт, смесь охлаждают льдом до 6—8° и титруют 0,1 М раствором нитрита натрия, как описано выше.
Расчет процентного содержания 3,4-ксилидина в препарате (х) производят по формуле:
V-0,012118-100х =,
а
где и — количество точного 0,1 М раствора NaNO2, пошедшее на титрование, в мл;
0,012118— количество 3,4-ксилидина, соответствующее 1 мл точного 0,1 М раствора NaNO2, в г;
100 —пересчет в %;а — навеска в г.
Недостаточно очищенные растворы 3,4-ксилидина могут содержать в качестве загрязнений некоторое количество аммиака.
Определение примеси аммиака производят, как указано в следующем пункте.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ АММИАКА В РАСТВОРАХ
3,4-КСИЛИДИНА
Измеряют объем испытуемой смеси и фильтруют через сухой взвешенный фильтр. Кристаллы на фильтре подсушивают и устанавливают их вес.
10—20 мл фильтрата после удаления кристаллов ксилидина титруют 0,1 н. раствором НС1 в присутствии 2—3 капель метилового оранжевого.
Содержание примеси аммиака в испытуемом растворе в граммах (х) вычисляют по формуле:
V-0,0017-с,х =,
а
где у — количество точного 0,1 п. раствора НС1, пошедшее на титрование, в мл;
0,0017 —количество NHs, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора НС1, в г;
Vt —объем испытуемого раствора в мл;
а — количество фильтрата, взятое на анализ, в мл.
3,4-ксилидин в качестве примеси может содержать также 3,4,5,-триметиламиноазобензол. В синтетической лаборатории ВНИВИ В. М. Березовским и Л. И. Стрель- чунас разработан способ определения примеси 3,4,5- триметиламиноазобензола, основанный на том, что при наличии примеси температура расплавления 3,4-ксилиди- на снижается пропорционально количеству 3,4,5-триметиламиноазобензола. Ниже излагается этот способ.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ3,4-КСИЛИДИНА В СМЕСИ ПО ТЕМПЕРАТУРЕЗАСТЫВАНИЯ
Применяемый для этого определения прибор состоит из пробирки диаметром 18 мм, длиной 63 мм, впаянной в nrvnRunw пияметпом
другую пробирку диаметром 38 мм, длиной 75 мм. Междудругую пробирку диаметром 38 мм, длиной 75 мм. МеждуРис. 21. Диаграмма плавкости смеси 3,4,5-триметилами- ноазобензола и 3,4-ксилидн- на.Рис. 21. Диаграмма плавкости смеси 3,4,5-триметилами- ноазобензола и 3,4-ксилидн- на.мешивают вещество длямешивают вещество дляпробирками создан вакуум.
другую пробирку диаметром 38 мм, длиной 75 мм. Между
другую пробирку диаметром 38 мм, длиной 75 мм. Между
Рис. 21. Диаграмма плавкости смеси 3,4,5-триметилами- ноазобензола и 3,4-ксилидн- на.
Рис. 21. Диаграмма плавкости смеси 3,4,5-триметилами- ноазобензола и 3,4-ксилидн- на.
мешивают вещество для
мешивают вещество для
Около 5 г вещества вносят во внутреннюю пробирку и нагревают прибор, расплавляя вещество. Опускают термометр в продукт таким образом, чтобы ртутный резервуар находился в середине расплавленной массы. Прибор с содержимым охлаждают на воздухе до температуры, на 5—10° ниже ожидаемой температуры застывания. Чтобы вызвать кристаллизацию, слегка потирают стенки, пробирки термометром. После начала кристаллизации медленными колебательными движениями термометра пере- лучшей теплоотдачи у ртутного
шарика термометра: температура начинает подниматься. Наибольшая температура, остающаяся некоторое время постоянной, отмечается как температура застывания.
Производят два определения и берут среднее значение. По найденной температуре застывания определяют по графику плавкости (рис. 21) процентное содержание 3,4-ксилидина в анализируемом продукте.
РАСТВОР ЭЛЕКТРОЛИТА
(после электролитического восстановления3,4-ксилидина)
Методы анализа жидкости из электролизера после электролитического восстановления 3,4-ксилидина разработаны в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. А. Девятниным, Л. Н. Кравчиной и Н. М. Стольнико- вой.
Анализ электролита предусматривает следующие определения:
определение содержания 3,4-ксилидина в растворе;
определение серной кислоты;
определение аммиака.
Образец испытуемого электролита подготавливают к анализу следующим образом: измеряют объем жидкости и фильтруют через высушенный до постоянного веса и взвешенный фильтр. Если в электролите содержатся кристаллы, 3,4-ксилидина, их собирают на фильтре, подсушивают на воздухе, и, взвешивая фильтр с кристаллами, устанавливают вес кристаллического ксилидина.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ 3,4-КСИЛИДИНА
Метод основан на принципе, изложенном при определении ксилидина.
Для анализа отбирают 10—20 мл фильтрата, прибавляют 25 мл воды, 1,5 мл нормального раствора бромистого калия и 2 мл НС1 (разведенной в отношении 1:1). Титрование производят 0,1 М раствором NaNOs, как указано выше.
Расчет содержания ксилидина в растворе (х) производят по формуле:
и-0,012118-и,х = ,
а
где о — количество точного 0,1 М раствора NaNO2, пошедшее на титрование, в мл;
0,012118 —количество ксилидина, соответствующее
мл точного 0,1 М раствора NaNO2, в г;
Ui— пересчет на объем испытуемого раствора в мл;
а — количество фильтрата, взятое на анализ, в мл.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНОЙ СЕРНОЙ КИСЛОТЫ
К Ю мл фильтрата прибавляют 4—5 капель 1 % спиртового раствора бромтимолового синего и титруют 0,1 н. раствором NaOH до появления голубого окрашивания.
Расчет содержания свободной серной кислоты в растворе (х) производят по фомуле:
и2-0,004904-и,л = —,
а
тпе о2~ количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,004904 — количество H2SO4, соответствующее 1 мл точного 0;1 н. раствора NaOH, в г;
Ui и а —см. выше.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ АММИАКАВ ВИДЕ АММОНИЙНОЙ СОЛИ
В основу метода положена реакция образования уротропина из аммонийных солей в присутствии формальдегида. Освобождающийся анион SO4 или С1 оттитровыва- ется щелочью. Реакция протекает количественно по уравнению:
6НСОН + 4NH4C1 -> (CH2)6N4 + 4НС1 + 6Н2О.
Этот метод описан в IX издании Госфармакопеи СССР. В химико-аналитической лаборатории ВНИВИ он приспособлен к определению аммиака в электролите.
К Ю мл фильтрата прибавляют 1 мл 35—40% раствора формальдегида, 1 мл воды и сильно встряхивают для разложения аммонийных солей с образованием уротропина и свободной кислоты и титруют в присутствии 4—5 капель 1% спиртового раствора бромтимолового
синего 0,1 н. раствором NaOH. Из полученного показания вычитают результат определения свободной серной кислоты.
Расчет содержания аммиака в аммонийной соли, присутствующей в электролите (х) производят по формуле:
(у3 — у2) • 0,0017032 • и,х = —,
а
где Уз— количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,0017032 —количество аммиака, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
■У^Пз и а — см- выше.
БАРБИТУРОВАЯ КИСЛОТА
(малонил-мочевина)
C4H4O3N2
М. вес 128,09
Белый кристаллический порошок. Кристаллизуется с двумя молекулами Н2О из воды. При нагревании разлагается. Не имеет характерной температуры плавления. Растворима в горячей воде и плохо растворима в холодной.
Методы анализа разработаны в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В- А. Девятниным, Л. Н. Крав- чиной и Л. А. Михайловой и включают качественные определения и количественный анализ.
РЕАКЦИЯ ИДЕНТИЧНОСТИ
Цветная реакция
Реакция основана на образовании под действием нитрита натрия на барбитуровую кислоту натриевой соли виолуровой кислоты, реагирующей с закисными
лями железа с образованием интенсивного окрашивания (Торп и Уайтли, 1937).
10—20 мг барбитуровой кислоты растворяют в пробирке в 3—5 мл горячей воды, охлаждают и нейтрализуют кристаллическим углекислым натрием. К нейтральному раствору прибавляют несколько кристалликов азотистокислого натрия и 1—2 капли 5—10% раствора уксусной кислоты. Смесь подогревают; при наличии барбитуровой кислоты сразу или через некоторое время появляется красное окрашивание. К раствору добавляют 1—2 капли 5% раствора сернокислого закисного железа, раствор приобретает интенсивную синюю окраску. Диал килбарбитуровая кислота этой реакции не дает.
Примечание. Маточные растворы рибофлавина, содержащие примесь барбитуровой кислоты, необходимо предварительно разводить водой в отношении 1 : 10 или даже 1 : 50. Красная окраска реакции появляется не сразу и иногда имеет другой оттеиок, а при добавлении раствора закисного железа приобретает густо-зеленый цвет. Поэтому в маточниках рибофлавина удобнее пользоваться реакцией осаждения.
Реакция осаждения
К водному раствору барбитуровой кислоты добавляют 5% водный раствор уксуснокислой ртути, выпадает обильный хлопьевидный осадок барбитурата ртути.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНОЙ БАРБИТУРОВОЙ КИСЛОТЫ
Точную навеску барбитуровой кислоты в количестве около 0,5 г помещают в мерную колбу емкостью 50 мл, растворяют в горячей воде и по охлаждении раствор доводят водой до метки. Отбирают 10 мл полученного раствора и титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии фенолфталеина до появления бледно-розового окрашивания.
Вычисление процентного содержания свободной барбитуровой кислоты в препарате (х) производят по формуле:
у.0,012809-100х =,
а
где у —количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,012809 — количество барбитуровой кислоты, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
100 — пересчет в %;
а — навеска вещества, взятая на титрование, в г с учетом принятого разведения.
К-СОЛЬ D-АРАБОНОВОЙ КИСЛОТЫ
н он он
коос — с — i — i — сн2онс5нео6к
IIIМ. вес 204,22
ОН н н
Белый или серовато-белый кристаллический порошок, растворимый в воде.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ ОКСАЛАТА КАЛИЯ
Точную навеску арабоната в количестве около 0,5 г помещают в стакан емкостью 200 мл, растворяют в 100 мл теплой воды, прибавляют 2 мл концентрированной НС1 (уд. вес 1,19) и нагревают до кипения. Горячий раствор подщелачивают концентрированным раствором аммиака, предварительно внеся в испытуемый раствор 1—2 капли фенолфталеина, затем прибавляют 10 мл горячего насыщенного раствора СаСЬ, перемешивают и помещают на 2 часа в кипящую водяную баню, затем охлаждают и осадок оксалата кальция фильтруют через бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывают горячей водой до исчезновения реакции на кальций (проба с раствором щавелевой кислоты), под воронку подставляют чистую колбу, конус фильтра прокалывают иглой, смывают осадок с фильтра горячей водой и тщательно промывают фильтр. К фильтрату добавляют 30 мл 20% раствора H2SO4, содержимое колбы перемешивают и после растворения осадка оксалата кальция нагревают на электроплитке и горячий раствор титруют 0,1 и. раствором КМпО4 до появления розового окрашивания.
Процентное содержание оксалата калия в арабонёте (х) вычисляют по формуле:
и-0,00831•100х =,
а
где 0,00831 — количество К2С2О4, отвечающее 1 мл точного 0,1 и. раствора КМПО4, в г;
и—количество точного 0,1 н. раствора КМПО4, пошедшее на титрование, в мл;
а — навеска в г;
100 — пересчет в %.
D-АРАБОНАТ КАЛЬЦИЯ
СООСа1/2
носн
С10Н18О12Са -5Н2ОЭкв. вес 230,11С10Н18О12Са -5Н2ОЭкв. вес 230,11неон
С10Н18О12Са -5Н2О
Экв. вес 230,11
С10Н18О12Са -5Н2О
Экв. вес 230,11
неон
СН2ОН
Бесцветные кристаллы. Кристаллизуется с 5 молекулами воды (для 2 молекул арабоновой кислоты). 1ч. растворяется в 72 ч. воды при 12°. В качестве примеси может содержать арабонат калия.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
(по прописи Л. И. Стрельчунас)
Точную навёску арабоната кальция в количестве около 0,5 г помещают в стакан емкостью 250 мл, прибавляют 2 мл концентрированной НС1 (уд. вес 1,19) "и 100 мл воды. Смесынагревают до кипения, подщелачивают 25% раствором аммиака, предварительно добавив 1—2 капли раствора фенолфталеина, и при перемешивании вливают 10 мл горячего насыщенного раствора щавелевокислого аммония. Смесь нагревают на кипящей водяной бане в течение 2 часов, фильтруют через плотный фильтр, осадок на фильтре промывают теплой водой
до отсутствия в фильтрате реакции на щавелевую кислоту (с раствором СаСЬ). Затем конус фильтра прокалывают иглой, смывают осадок с фильтра горячей водой в стакан и приливают 30 мл 20% раствора H2SO4. Раствор нагревают до 60° и титруют 0,1 н. раствором КМпО4 до появления розового окрашивания.
Вычисление процентного содержания арабоната кальция в препарате (х) производят по формуле:
v-0,023011-100х =,
а
где о — количество точного 0,1 н. раствора КМпО4, пошедшее на титрование, в мл;
0,023011 — количество арабоната кальция, соответствующее 1 мл точного 0,1 и. раствора КМпО4, в г;
100 — пересчет в %;
а— навеска в г.
Примечание. D-арабонат кальция содержит 8,7% Са.
D-РИБОНО-у-ЛАКТОН
ОС
неон
Iо
неон IС5н8о5
IМ. вес 148,12
НС!
СН2ОН
Сиропообразная жидкость бледно-желтого цвета или стекловидная масса. Т. пл. 78—80°. Растворим в воде и спирте, трудно—в этилацетате.
Но + 18,4° (для раствора 5 г/100 мл воды).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯСВОБОДНОЙ РИБОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЛАКТОНА
Метод основан на том, что при осторожном титровании щелочью на холоду D-рибоно-у-лактона свободная рибоновая кислота оттитровывается, тогда как лактон может быть оттитрован только после размыкания кольца под влиянием нагревания (Мейер, 1935).
Точную навеску испытуемого вещества (0,1—0,2 г твердого продукта или 10—20 мл раствора) вносят в коническую колбу, растворяют в воде, прибавляют 1—2 капли фенолфталеина и осторожно (по каплям) титруют 0,1 н. раствором NaOH до первого появления бледно- розового окрашивания. При взбалтывании раствора окраска через некоторое время исчезает. Отмеченное количество щелочи расходуется на титрование свободной рибоновой кислоты, имеющейся в растворе в качестве примеси. После первого появления розового окрашивания испытуемый раствор нагревают до кипения и продолжают титровать почти кипящий раствор щелочью до появления неисчезающего розового окрашивания. Нагревание повторяют еще раз в конце титрования. Количество миллилитров щелочи, пошедшее на продолжение (после нагревания) титрования, соответствует количеству рибо- новой кислоты, находящейся в веществе в форме лактона.
Расчет процентного содержания свободной рибоновой кислоты, находящейся в рибонолактоне (%i) производят по формуле:
v-0,016608-100Х1 = ,
а
где у — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на первое (холодное) титрование, в мл;
0,016608—количество рибоновой кислоты, отвечающее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
а— навеска в г;100—пересчете %.
Расчет процентного содержания рибоновой кислоты, находящейся в испытуемом веществе в форме лактона (х2), производят по формуле:
Ut-O,0148.100х2 = ,
а
где Ui — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на дотитровывание испытуемого раствора после нагревания, в мл;
0,0148 — количество рибонолактона, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г. Остальные обозначения см. выше.
АМАЛЬГАМА НАТРИЯ
(метод анализа разработан в синтетической лаборатории ВНИВИ В. М. Березовским и Л. И. Стрельчунас)
Пробу амальгамы натрия высушивают фильтровальной бумагой и отбирают навеску в количестве 10 г в коническую колбу емкостью 100 мл. Навеску заливают 20 мл 0,1 н. раствора H2SO4 (из бюретки или пипетки), добавляют несколько капель метилового оранжевого и содержимое колбы нагревают в течение 5—10 минут. Если окраска смеси переходит в желтую, к раствору добавляют еще 1—2 капли индикатора; при отсутствии кислой реакции прибавляют еще 5 мл 0,1 и. раствора H2SO4. После разложения амальгамы (на что указывают наличие окраски и отсутствие пузырьков водорода в растворе) избыток кислоты оттитровывают 0,1 н. раствором NaOH. Параллельно оттитровывают щелочью точно такое же количество кислоты, которое было добавлено к испытуемой пробе.
Расчет процентного содержания натрия в амальгаме (х) производят по формуле:
(У — У]).0,0023-100х = ,
а
где и — количество 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование холостой пробы, в мл;
V] —то же для испытуемой пробы;
0,0023 — количество Na, соответствующее 0,1 и. раствора H2SO4, в г;
а — навеска амальгамы в г;
100 — пересчет в %.
D-ГЛЮКОЗА
о
СН2ОН(СНОН)4 — -Н2ОС6Н12О6-Н2О
М. вес 198,17
Бесцветные кристаллы или белый мелкокристаллический порошок без запаха, сладкого вкуса. Растворим в 1,5 ч. теплой воды и 60 ч. теплого этанола. Нерастворим в эфире. 10% раствор предварительно высушенный при 100—105° до постоянного веса глюкозы после прибавления 1—2 капель раствора аммиака должен иметь удельное вращение от +51 до 53°.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ процентного содержания
Применяемые методы общеизвестны и основаны на способности глюкозы (как и других редуцирующих сахаров) восстанавливать окись меди до закиси. Восстановление протекает в стехиометрическом отношении, и по количеству восстановленной меди можно рассчитать количество восстанавливающего сахара.
Микрометод Бертрана
3 мл испытуемого раствора помещают в пробирку, прибавляют 3 мл раствора Фелинга I и 3 мл раствора Фелинга II. Пробирку погружают в кипящую водяную баню и кипятят в течение 6 минут, после чего содержимое пробирки быстро охлаждают струей холодной воды.
Охлажденную жидкость фильтруют через асбестовый фильтр, помещенный в трубку Аллина, в колбу для отсасывания, не перенося осадка закиси меди на фильтр. Осадок в пробирке дважды промывают горячей водой, после чего колбу для отсасывания заменяют чистой колбой; а оставшийся в пробирке осадок растворяют с помощью 3—5 мл раствора сернокислой окиси железа.
Раствор сливают на асбестовый фильтр, отсасывают, пробирку и фильтр промывают дважды холодной водой, полученный раствор вместе с промывной жидкостью титруют раствором перманганата калия до появления розового окрашивания.
Расчет процентного содержания глюкозы (сахара) в испытуемом растворе (х) производят по формуле:
с-100х =,
где с — найденное по таблице (см. табл. 3) количество миллиграммов глюкозы в пересчете на г;
у — разведение навески в мл;
100 — пересчет в %.
Таблица 3
Расчет глюкозы по микрометоду Бертрана
(число миллилитров раствора КМпО4 соответствует количеству меди в мг)
Си
Глюкоза |
Си
Глюкоза
Си
Глюкоза
0 55
0,10
3,00
1,30
7,10
3,50
0 80
0,20
3,20
1,40
8,00
4,00
1 00
0,30
3,40
1,50
9,00
4,50
1 15
0,40
3,60
1,60
9,95
5,00
1 35
0,50
3,80
1,70
10,80
5,50
1 60
0,60
4,00
1,80
11,90
6,00
1 80
0,70
4,15
1,90
12,80
6,50
2 00
0,80
4,30
2,00
13,90
7,00
2 20
0,90
5,00
2,25
14,90
7,50
2 40
1,00
5,30
2,50
15,90
8,00
2 60
1,10
5,95
2,75
16,90
8,50
2,80
1,20
6,20
3,00
17,80
9,00
Макрометод Бертрана
количествеколичествеТочную навеску исследуемого сахара в
количестве
количестве
0,7—0,8 г растворяют в воде в мерной колбе емкостью 100 мл. Оттуда после приведения раствора к объему и тщательного перемешивания отбирают 10 мл в коническую колбу емкостью 100—200 мл, прибавляют 20 мл раствора Фелинга I и 20 мл раствора Фелинга II и кипятят на асбестовой сетке в течение 2 минут. После этого раствор в горячем состоянии фильтруют при слабом разрежении через трубку Аллина, в которую вложен слой промытого асбеста. Осадок закиси меди на фильтр не переносят. Осадок в колбе и на фильтре промывают несколько раз горячей водой, фильтрат и промывные воды из колбы для отсасывания выливают, колбу хорошо ополаскивают водой. Осадок в конической колбе растворяют при помощи 20—25 мл раствора железоаммониевых квасцов или раствора сернокислой окиси железа; по растворении осадка зеленоватый раствор фильтруют через трубку Аллина в ту же колбу для отсасывания, фильтр хорошо промывают холодной водой; полученный раствор
вместе с промывной водой оттитровывают 0,1 н. раствором КМПО4 до появления бледно-розового окрашивания.
Расчет содержания сахара производят следующим образом: вначале вычисляют количество образовавшейся закиси меди по формуле:
6 = д-6,357,
где b — количество закиси меди в мг;
а — количество точного 0,1 н. раствора КМПО4, пошедшее на титрование, в мл;
6,357 — постоянный коэффициент.
Количеству меди в мг (Ь) будет отвечать определенное количество глюкозы в мг (с), что находят, пользуясь специальной таблицей (табл. 4).
Расчет процентного содержания глюкозы производят по формуле, приведенной выше.
Т а б а и ц а 4
Пересчет миллиграммов меди на миллиграммы глюкозыпо макрометоду Бертрана
Си
1ЛЮКО- за
Си
Глюкоза
Си
Глюкоза
Си
Глюкоза
Си
Глюкоз а
20,4
10
60,9
31
98,9
52
134,7
73
168,3
94
22,4
11
62,8
32
100,6
53
136,3
74
169,9
95
24 ,'2
12
64,6
33
102,3
54
137,9
75
171,5
96
26,3
13
66,5
34
104,1
55
139,6
76
173,1
97
28^3
14
68,3
35
105,8
56
141,2
77
174,6
98
30,2
15
70,1
36
107,6
57
142,8
78
176,2
99
32,2
16
72,0
37
109,3
58
144,5
79
177,8
100
34,2
17
73,8
38
111,1
59
146,1
80
36,2
18
75,7
39
112,8
60
147,7
81
38,1
19
77,5
40
114,5
61
149,3
82
40,1
20
79,3
41
116,2
62
150,9
83
42,0
21
81,1
42
117,9
63
152,5
84
43,9
22
82,9
43
119,6
64
154,0
85
45,8
23
84,7
44
121,3
65
155,6
86
47,7
24
86,4
45
123,0
66
157,2
87
49,6
25
88,2
46
124,7
67
158,8
88
51,5
26
90,0
47
126,4
68
160,4
89
53,4
27
91,8
48
128,1
69
162,0
90
55,3
28
93,6
49
129,8
70
163,6
91
57,2
29
95,4
50
131,4
71
165,2
92
59,1
30
97,1
51
133,1
72
166,8
93
ПРИВОЗА
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ РИБОЗЫ(С ПРИМЕСЬЮ АРАБИНОЗЫ)
Производят, как указано в предыдущем разделе, используя для анализа точно 1 мл раствора, и рассчитывают по специальной таблице (табл. 5).
Таблица 5
Расчет арабинозы по количеству меди в миллиграммах (иитерполироваио по Бертрану)
Арабиноза
Медь
Арабиноза
МеД
Арабиноза
Медь
Арабиноза
Медь
Арабиноза
Медь
10
21,2
30
62,0
50
100,6
70
137,5
90
172,7
11
23,3
31
64,0
51
102,5
71
139,3
94
174,0
12
25,3
32
65,9
52
104,3
72
141,1
92
176,1
13
27,4
33
67,9
53
106,2
73
142,8
93
177,8
14
29,4
34
69,8
54
108,1
74
144,6
94
179,5
15
31,5
35
71,8
55
110,0
75
146,4
95
181,3
16
33,6
36
73,7
56
111,8
76
US', 2
96
183,0
17
35,7
37
75,7
57
113,7
77
150,0
97
184,7
18
37,7
38
77,6
58
115,6
78
151,7
98"
186,4
19
39,8
39
79,6
59
117,4
79
153,5
99
188,1
20
41,9
40
81,5
60
119,3
80
155,3
100
189,8
21
43,9
41
83,4
61
121,1
81
157,0
22
45,9
42
85,3
62
122,9
82
158,9
23
47,9
43
87,2
63
124,8
83
160,5
24
49,9
44
89,1
64
126,6
84
162,3
25
52,0
45
91,0
65
128,4
85
164,0
26
54,0
46
93,0
66
130,2
86
165,7
27
56,0
47
94,9
67
132,0
87
167,5
28
58,0
48
96,8
68
133,9
88
169,2
29
60,0
49
98,7
69
135,7
89
171,0
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ D-РИБОНО-у- ЛАКТОНА И СВОБОДНОЙ РИБОНОВОЙ КИСЛОТЫ
мл раствора смешивают с 10—20 мл воды и проводят определение, как указано в методе анализа D-рибо- но-у-лактона.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ СУЛЬФАТА НАТРИЯВ СГУЩЕННОМ РАСТВОРЕ САХАРА
мл испытуемого раствора помещают в стакан емкостью 50 мл, прибавляют 7 мл воды и 0,1 мл концентрированной НС1 (уд. вес 1,19). Смесь доводят до кипения,
1291299 В. А. Девятнин
129
129
прибавляют 10 мл 5% кипящего раствора хлористого бария и нагревают 30 минут на кипящей водяной бане. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре горячей водой до отсутствия реакции на хлор. Фильтр с промытым осадком помещают в прокаленный и взвешенный тигель, сжигают и обугливают. Остаток в тигле смачивают несколькими каплями серной кислоты и вновь обугливают и озоляют до постоянного веса.
Содержание сульфата натрия в процентах (л) вычисляют по формуле:
(g2-gQ-o. 6086.100
где g2 — вес тигля с прокаленным остатком в г;
^ — вес шустого тигля в г;
0,6086 — постоянный коэффициент;
— количество раствора, взятое на анализ, в мл;
— пересчет в %.
ОН ОН ОН IОН ОН ОН IС13Н, ANМ. вес 253,29С13Н, ANМ. вес 253,293,4-КСИЛИДИН-Х-П-РИБ0ПИРАП03ИД
ОН ОН ОН I
ОН ОН ОН I
С13Н, AN
М. вес 253,29
С13Н, AN
М. вес 253,29
Бесцветные кристаллы, трудно растворимые в воде Существует в виде комплексной соли с сульфатом натрия, состава 5CH3H19NO4 3Na2SO4 4Н2О, м. вес 1763. Теоретическое содержание рибозы 42,54%.
Методы анализа рибопиранозида разработаны в синтетической лаборатории ВНИВИ В. М. Березовским и Л. И. Стрельчунас и основаны на йодометрическом определении восстанавливающих сахаров.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯВ КРИСТАЛЛИЧЕСКОМ ПРОДУКТЕ
Навеску испытуемого вещества, содержащую от 20 до 38 1мг сахара, помещают в коническую колбу емкостью 200 мл, растворяют в 20 мл воды и нагревают до кипения. К раствору приливают 10 мл раствора Фелин-
га 1 и 10 мл раствора Фелинга И. Колбу закрывают часовым стеклом и содержимое ее кипятят точно 10 минут. Смесь охлаждают, к ней добавляют 20 мл свежеприготовленного 10% раствора йодистого калия и 20 мл 3 н раствора H2SO4. Выделившийся йод тотчас титруют 0,1 н. раствором гипосульфита натрия, применяя в качестве индикатора 2 мл 0,5% раствора крахмала.
Одновременно оттитровывают раствором гипосульфита натрия смесь из 10 мл раствора Фелинга I и 10 мл раствора Фелинга II.
Расчет процентного содержания рибозы в соли (х) производят по формуле:
(о —«0 3,37-100л а
где и —количество точного 0,1 н. раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование холостой пробы, в мл;
Ui — то Же для,испытуемого;
7 — постоянный коэффициент, 100—пересчет в %;
а — навеска в г.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В МАТОЧНИКАХ
Пробу маточника, содержащую от 20 до 40 мг сахара, отвешивают в коническую колбу емкостью 200 мл, смешивают с растворами Фелинга и проводят определение, как описано выше.
Определение может быть проведено также и по методу Бертрана.
сн,он носн но(*:нносн<1н2Н3С NHНзс~\/сн,он носн но(*:нносн<1н2Н3С NHНзс~\/В-РИБАМИН3,4-ксилил-О-рнбаминВ-РИБАМИН3,4-ксилил-О-рнбаминС1зН21О4ММ. вес 255,3С1зН21О4ММ. вес 255,3
сн,он носн но(*:н
носн
<1н2
Н3С NH
Нзс~\/
сн,он носн но(*:н
носн
<1н2
Н3С NH
Нзс~\/
В-РИБАМИН
3,4-ксилил-О-рнбамин
В-РИБАМИН
3,4-ксилил-О-рнбамин
С1зН21О4М
М. вес 255,3
С1зН21О4М
М. вес 255,3
Кристаллический бесцветный ворошок. Т. пл. 140—142°. Умеренно растворим в горячей и плохо в холодной воде. Растворяется в горячем этиловом и бутиловом спиртах.
В основу анализа D-рибамина положена реакция нитрозирования, протекающая между ароматическими аминами и нитритом натрия в солянокислой среде. Реакция протекает количественно с образованием нитроз- аминов. Конец реакции определяется по появлению синего окрашивания на йодокрахмальной бумаге (азотистая кислота реагирует с йодистым калием, содержащимся в йодокрахмальной бумаге, окисляет его, выделяя свободный йод, который дает с крахмалом синее окрашивание).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯВ КРИСТАЛЛИЧЕСКОМ ПРОДУКТЕ
(метод разработан В. А. Девяткиным, Л. Н. Кравчиной, Н. М. Стольниковой)
Точную навеску препарата в количестве около 0,2 г помещают в стакан, смачивают 0,1 мл концентрированной НС1 (уд. вес 1,19), прибавляют 10 мл воды и после полного растворения навески содержимое стакана охлаждают до 10° и титруют 0,1 М раствором NaNO2, как описано при анализе 3,4-ксилидина.
Параллельно ставят контрольный опыт на чувствительность йодокрахмальной бумаги, оттитровывая 0,1 мл НС1 с 10 мл воды раствором нитрита натрия.
Расчет процентного содержания D-рибамина (х) производят по формуле:
(и — У1). 0,02553-100х = —,
а
где v— количество точного 0,1 М раствора NaNO2, пошедшее на титрование испытуемой пробы, в мл;
Ui — количество точного 0,1 М раствора NaNO2, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
0,02553—количество D-рибамина, соответствующее 1 мл 0,1 М раствора NaNO2, в г;
100 — пересчет в %;
а — навеска в г.
3,4-КСИЛИЛ-6-ФЕНИЛАЗО-1-П-РИБАМИН(АЗОРИБАМИН)
Н3С СНз )—Ч \=/ Н ОН ОН ОН НC16H23O4N3
N NH—С — С — С — С — СОНМ. вес 359,43
X II1 IIII
NН Н Н Н Н
Кристаллический порошок кирпично-красного цвета. В воде и бензоле на холоду нерастворим. Растворяется в соляной и уксусной кислотах с образованием интенсивно окрашенных растворов, обесцвечивающихся гидросульфитом натрия. Хорошо растворим в ацетоне. Т. пл. 174—175°.
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЗОРИБАМИНА
Метод разработан в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В.М. Иосиковой и основан на очистке азори- бамина от желтых примесей, извлекаемых бензолом, и колориметрическом определении окрашенного раствора *.
Из средней пробы испытуемого образца кристаллического продукта отбирают две навески по 20 мг. Одну из них растворяют в мерной колбе емкостью 100 мл в ове- жеперегнанном сухом ацетоне и доводят раствор ацетоном до метки (раствор А). Другую навеску растворяют в свежеперегнанном сухом бензоле в мерной колбе емкостью 100 мл и доводят бензолом до метки (раствор Б).
Раствор Б после тщательного перемешивания оставляют в покое на 15—20 минут, после чего вновь перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр.
Как показано В. М. Иосиковой, азорибамин хорошо растворяется в ацетоне и нерастворим в холодном бензоле, тогда как сопутствующие азорибамину примеси в нем хорошо растворяются, что позволяет определить их количество.
Рис. 22. Калибровочный график для определения азорн- бамина.Рис. 22. Калибровочный график для определения азорн- бамина.СН2ОН но^нСН2ОН но^нноснноснПоказательПоказательСостояние веществаФормулаМолекулярный вес Температура плавления РастворимостьСостояние веществаФормулаМолекулярный вес Температура плавления РастворимостьОптическая активность Окислительно-восстановительный потенциалБиологическая активностьМаксимум абсорбции ФлуоресценцияМаксимум абсорбции флуоресценцииОптическая активность Окислительно-восстановительный потенциалБиологическая активностьМаксимум абсорбции ФлуоресценцияМаксимум абсорбции флуоресценции
Рис. 22. Калибровочный график для определения азорн- бамина.
Рис. 22. Калибровочный график для определения азорн- бамина.
СН2ОН но^н
СН2ОН но^н
носн
носн
Показатель
Показатель
Состояние вещества
Формула
Молекулярный вес Температура плавления Растворимость
Состояние вещества
Формула
Молекулярный вес Температура плавления Растворимость
Оптическая активность Окислительно-восстановительный потенциал
Биологическая активность
Максимум абсорбции Флуоресценция
Максимум абсорбции флуоресценции
Оптическая активность Окислительно-восстановительный потенциал
Биологическая активность
Максимум абсорбции Флуоресценция
Максимум абсорбции флуоресценции
В кюветы фотоколориметра отбирают по 1 мл -полученных растворов А и Б, доводят их до 10 мл соответствующими растворителями. Окраску обоих растворов измеряют со светофильтром X = 470 тр. В качестве контроля для установки прибора на нуль пользуются ацетоном (в первом случае) и бензолом (во втором случае).
Калибровочный график строят по 100% чистому азо- рибамину, по кривой находят соответствующее экстинкции измеряемых растворов содержание красящих веществ (рис. 22). Разность между найденным содержанием красящих веществ в растворах А и Б соответствует количеству азорибамина в испытуемом образце.
Расчет процентного содержания, азорибамина в образце (х) вычисляют по формуле: .
(Л— £)• 100-иа-1000-1000 ’
где Л — количество красящих веществ в 1 мл в у в ацетоновом растворе;
Б— то же в бензольном растворе;
и—объем, до которого доведена навеска, в мл; 100— пересчет в %;
а — навеска в г;
1000 — пересчет в мг;
1000 — пересчет в г.
ВИТАМИН В2 (РИБОФЛАВИН)
Физико-хнмические свойства рибофлавина
Характеристика
Желто-оранжевые игольчатые кристаллы (из спирта)
C17H2oON406
376,38
Около 282° (разл.)
В воде при 25°— 0,012 г в 100 мл, в этиловом спирте—0,0045 г в 100 мл, в эфире, ацетоне, бензоле, хлороформе нерастворим
—114° (в 0,1 н. растворе NaOH)
—0,21 в pH = 7,0)
г кристаллического витамина В2= 400 000 ИЕ'
, 269, 372, 445- тц
Желтовато-зеленая
515—645 тц
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯВ КРИСТАЛЛИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ
В основу описываемых методов положен способ, изложенный Рубиным с соавторами (Rubin a. oth., 1945)Ч
Методы определения рибофлавина описаны также в сб.: Методы определения витаминов. Под редакцией В. А. Девяткина, 1954.
Точную навеску препарата в количестве 0,01 г переносят в мерную колбу емкостью 250 мл, растворяют в воде при нагревании и доводят водой до метки. Из полученного раствора отбирают 1 мл в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят водой до метки. В кювету флуорометра переносят 10 мл полученного раствора и измеряют интенсивность его флуоресценции по сравнению со стандартным раствором.
Содержание рибофлавина в процентах в продукте (х) вычисляют по формуле:
Л- 250-100-0,4.100ДуЮО
Л-0,01-1-1000-1000- А ’
где At — показание флуорометра для испытуемого раствора;
250 — первое разведение в мл;
100 — второе разведение в мл;
0,4— концентрация стандарта в у ;
100 — пересчет в %;
А — показание флуорометра для стандартного раствора;
0,01 — навеска в г;
1 — количество раствора, взятое для второго разведения, в мл;
пересчет в мг;
пересчет в г.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯВ ТЕХНИЧЕСКОМ ПРОДУКТЕ
Образцы рибофлавина могут быть загрязнены флуоресцирующими примесями. Обработкой гидросульфитом натрия рибофлавин восстанавливают в лейкофлавин, который утрачивает способность флуоресцировать, тогда как примеси не восстанавливаются. По разности в интенсивности флуоресценции обработанных и необработанных гидросульфитом растворов судят о количестве рибофлавина.
Точную навеску испытуемого продукта в количестве 0,01 г переносят в мерную колбу емкостью 250 мл, растворяют в воде и доводят водой до метки. Если получен-
ный раствор имеет интенсивную флуоресценцию, производят второе разведение. Для этого отбирают 1 мл раствора в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем раствора до метки водой. Из полученного раствора отбирают две пробы:
8 мл раствора переносят в кювету для измерения флуоресценции и доводят водой до 10 мл. Содержимое этой кюветы поступает непосредственно на измерение интенсивности флуоресценции;
8 мл переносят в коническую колбу емкостью 50—100 мл, туда же по каплям добавляют 4% раствор перманганата калия до появления неисчезающего розового окрашивания. После этого содержимое колбы оставляют на 10 минут и затем избыток внесенного перманганата удаляют, добавляя по каплям 3% раствор Н2О2. К содержимому колбы добавляют 0,2 мл раствора хлористого олова и 0,1 мл раствора гидросульфита натрия, после чего содержимое колбы энергично встряхивают в течение 20 минут, а затем количественно переносят в мерную колбу или точно градуированный цилиндр и доводят водой до объема 10 мл. Полученный раствор фильтруют в кювету флуорометра.
Содержимое обеих кювет поступает на измерение флуоресценции.
Примечание Если при окислении перманганатом раствор во второй колбе от прибавления 1 капли перманганата окрашивается в розовый цвет, мешающих измерению флуоресценции примесей в испытуемом растворе не содержится Тогда при расчете принимают во внимание показания флуорометра для первой кюветы, содержимое, которой не подвергалось окислению.
Содержание рибофлавина в процентах (х) вычисляют по формуле:
Л-250-100.10.0,4-100Л1-125
Л-0,01-1.8-1000-1000" Л
где 100—второе разведение в мл;
— третье разведение в мл;
0,01 — навеска в г;
— количество раствора, взятое на окисление, в мл;
Остальные обозначения см. выше.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ в маточниках и промывных водах
мл испытуемой жидкости вносят в мерную колбу емкостью 250 мл, объем раствора доводят до метки водой. Из этого раствора отбирают:
1 мл в кювету для измерения флуоресценции и доводят водой до 10 мл;
1 мл в коническую колбу емкостью 50—100 мл, добавляют 7 мл дистиллированной воды и окисляют раствором перманганата, как указано ранее.
Дальнейший ход анализа см. выше.
Содержимое обеих кювет поступает на измерение флуоресценции.
Расчет процентного содержания рибофлавина в испытуемой жидкости (х) производят по формуле:
А,.25О-10-0,4-100ЛгОД
Х~ -Л-1,.12.1000.1000 ~ Л
где lt — количество раствора, взятое для первого разведения, в мл;
количество раствора, взятое для окисления, в мл;
Остальные обозначения см. выше.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯПО IX ГОСФАРМАКОПЕЕ СССР
Около 0,1 г (точная навеска) высушенного при 100° до постоянного веса препарата помещают в колбу Кьельдаля емкостью 200 мл и далее поступают, как указано в анализе ацетонитрила (стр. 67).
' 1 мл 0,1 н. раствора серной кислоты отвечает 0,009406 г рибофлавина.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В ДРАЖЕ И ТАБЛЕТКАХ
Около 1 г порошка растертых драже или таблеток (точная навеска) растворяют при нагревании в воде, переносят в мерную колбу емкостью 250 мл, охлаждают, доводят до метки водой и фильтруют. Из фильтрата отбирают 5 мл в мерную колбу емкостью 250 мл, доводят объем до метки водой и перемешивают. В две кюветы флуорометра переносят 8—10 мл испытуемого и стан-
дартного рабочего раствора для измерения флуоресценции. Одновременно в другие две кюветы переносят 8—10 мл испытуемого и стандартного рабочего раствора, прибавляют около 0,1 г бикарбоната натрия й гидросульфита натрия для гашения флуоресценции рибофлавина как в стандартном, так и в испытуемом растворе, где остается флуоресценция только посторонних флуоресцирующих веществ.
Результат измерения сравнивают с показанием флуорометра для стандартного рабочего раствора рибофлавина.
Содержание рибофлавина в 1 шт. драже или таблеток в миллиграммах (х) вычисляют то формуле:
(А — B)-0,4-v-v2-d
Х~ (Л—В,)-а-У!-1000 ’
где А— показание флуорометра для испытуемого раствора;
В — показание флуорометра для испытуемого раствора после гашения;
А^— показание флуорометра для рабочего стандартного раствора;
В\ — показание флуорометра для стандартного раствора после гашения;
0,4 — концентрация стандартного раствора рибофлавина в у;
а — навеска в г;
о— объем, в котором растворена навеска, в мл;
Ui — объем, взятый для разведения в мл;
о2 — объем, взятыйшосле разведения, в мл;
d — средний вес 1 шт. таблеток или драже в г; а—навеска в г;
пересчет в мг.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
(метод разработан К. Л. Поволоцкой, Н. И. Зайцевой, Е. П. Скоробогатовой в Институте биохимии имени Баха
АН СССР)
В настоящее время известны 4 формы рибофлавина: свободный рибофлавин, мононуклеотид, флавинаденин- динуклеотид и прочно связанная с белком форма, воз-
можно также являющаяся нуклеотидом, но не определяемая известными методами.
Описываемый ниже метод позволяет определять общее содержание рибофлавина и раздельно его различные формы.
Определение общего количества рибофлавина
Навеску испытуемого материала тщательно растирают в ступке с небольшим количеством фосфатного буфера (рН = 7—8). Растертую массу переносят в колбу с помощью буферного раствора с таким расчетом, чтобы общее разведение соответствовало отношению 1:15 или 1:20. Смесь выдерживают на кипящей водяной бане в течение 40 минут, охлаждают до 30°, проверяют pH и в случае сдвига в кислую зону, что часто наблюдается при работе с кислыми объектами, вновь доводят до 7,8—8,0, после чего к смеси добавляют ферментный препарат (трипсин, панкреатин, клараза и др.) из расчета 30 мг препарата на 1 г сухого вещества навески.
Смесь помещают в термостат и выдерживают в течение 12—20 часов при 37°. В этих условиях отщепляется прочно связанная с белком форма рибофлавина. Смесь доводят водой до определенного объема с таким расчетом, чтобы общее разведение соответствовало отношению 1:25 или 1:30, и фильтруют через складчатый фильтр. Из фильтрата отбирают в колбу 5 мл, добавляют 5 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, помещают на кипящую водяную баню и выдерживают 10 минут.
Обработка трихлоруксусной кислотой освобождает рибофлавин из его нукдеотидных форм. Вытяжку охлаждают и добавляют % объема 4 М. раствора К2НРО4 с целью доведения pH до 6,0. Затем к вытяжке прибавляют по каплям 4% раствор КМпО4.до тех пор, пока красноватая окраска раствора не перестанет исчезать (обычно это соответствует 0,2—0,5 мл). Вытяжку оставляют на 10 минут в покое, после чего к ней добавляют по каплям 3% раствор Н2О2 до исчезновения окраски вытяжки. К вытяжке прибавляют 0,2 мл рабочего раствора SnCb и 0,1 мл 2,5% раствора гидросульфита натрия. Энергично встряхивают в течение 20 минут. Объем вытяжки доводят до 15 мл и в случае необходимости фильтруют. Фильтрат поступает на измерение флуоресценции.
Вытяжку и стандартный рабочий раствор рибофлавина, приготовленный на трихлоруксусной кислоте, помещают в кюветы флуорометра и интенсивность флуоресценции определяют по шкале гальванометра. Затем в обе пробирки прибавляют по 0,1 г NaHCO3 и около 0,1 г Na2S2O4 и вновь производят измерение флуоресценции. Флуоресценция рибофлавина гасится до нуля. В опытных вытяжках остается небольшая флуоресценция, вызываемая посторонними флуоресцирующими веществами, которые сохранились в вытяжках, несмотря на указанную обработку. Тушение флуоресценции рекомендуется проводить 2—3 раза, так как в некоторых случаях оно протекает очень медленно. Для этого к пробам повторно добавляют гидросульфит и вновь измеряют флуоресценцию растворов.
Содержание рибофлавина в у на 1 г вещества (х) вычисляют по формуле:
(Л— В).0,4-1»х = ,
с-а
где Л — показание флуорометра для испытуемого раствора (1-й отсчет);
показание флуорометра для испытуемого раствора после гашения (,2-й отсчет);
с— показание флуорометра для стандартного раствора, содержащего 0,4 у рибофлавина, в мл;
0,4 — концентрация стандартного раствора рибофлавина в у;
а — навеска в г;
у —объем разведения в мл.
Определение кислотногидролизуемогои фосфатазноотщепляемого рибофлавина
Навеску испытуемого вещества тщательно растирают в ступке с небольшим количеством 0,1 н. раствора H2SO4 и переносят в колбу, куда добавляют 0,1 н. раствор H2SO4 до общего разведения 1:15 или 1:20. Смесь выдерживают на кипящей водяной бане в течение 40 минут, охлаждают до 40°, pH вытяжки доводят насыщенным раствором уксуснокислого натрия до 4,5, прибавляют ферментный препарат (клараза или мицелий пеницилли-
ума) из расчета 30 мг препарата на 1 г сухого вещества навески. Вытяжку помещают в термостат и выдерживают при 37° 12—16 часов. Затем вытяжку доводят водой до такого объема, чтобы общее разведение соответствовало отношению 1 :25 или 1 : 30 и фильтруют. 8 мл вытяжки обрабатывают раствором перманганата калия, хлористого олова' и гидросульфитом натрия так, как описано выше. Интенсивность флуоресценции измеряют, как описано, с той только разницей, что в качестве стандарта используют рабочий раствор рибофлавина, приготов- лен-ный иа воде. Содержание рибофлавина вычисляют по приведенной выше формуле.
Примечание. Измерение флуоресценции вытяжки, подвергнутой только кислотному гидролизу без ферментативной обработки, дает сумму свободной и мононуклеотидной формы рибофлавина.
Вычисление содержания отдельных формрибофлавина
Общее количество рибофлавина включает прочно связанный с белком рибофлавин + флавинаденин-динук- леотид+мононуклеотид рибофлавина + свободный рибофлавин.
Из результатов, полученных при первом определении, вычитают результаты второго определения; разность составляет содержание прочно связанной с белком формы рибофлавина.
Разность в результатах измерения флуоресценции рибофлавина до и после ферментативной обработки во втором определении составляет содержание кислотноот- щепляемого флавинаденин-динуклеотида.
Обработка кислотой вытяжки до ферментативного гидролиза (второе определение) бензиловым спиртом дает возможность определить раздельно свободную и моно- нуклеотидную форму рибофлавина. Следует иметь в виду, что в некоторых случаях определение истинного количества рибофлавина в естественных объектах может быть достигнуто лишь после автолиза или автоклавирования ткани.
етоды контроля в синтезе витамина В3 (пантотеновой кислоты)
р-АМИНОПРОПИОНОВАЯ КИСЛОТА (р-АЛАНИН)
CgHANМ. вес 89CgHANМ. вес 89nh2ch2ch2cqoh
CgHAN
М. вес 89
CgHAN
М. вес 89
■ Г елый кристаллический порошок. Т. пл.
■—^ 200°. Хорошо растворим в воде, трудно растворяется в метиловом, этиловом, изопропиловбм спиртах, нерастворим в эфире и ацетоне.
Метод определения качества р-аланина основан на известном методе формольного титрования аминокислот, предложенном еще в 1907 г. Серенсеном (цит. по Н. Н. Иванову, 1935).
Сущность этого метода заключается в том, что аминогруппа аминокислоты понижает кислотную константу ее диссоциации, добавление же формальдегида уничтожает влияние аминогруппы.
СН3НСН3
сн — мн2+ с = о н» сн — n = сн2 + н2о
III
сооннсоон
Образующаяся в этой реакции метилен-аминокислота является более сильной кислотой, чем исходный аланин, и может быть оттитрована щелочью по уравнению:
СН3СН2
CH — N = СН3-> CH — N = СН2 + Н3О
СООНCOONa
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
(метод разработан В. А. Девяткиными В. В. Никифоровой в химико-аналитическойлаборатории ВНИВИ)
Точную навеску вещества в количестве 0,3—0,5 г растворяют в 20 мл воды, добавляют 10 мл формольной смеси и титруют 0,5 н. раствором NaOH до появления синего окрашивания, одинакового с окрашиванием контрольной пробы.
Для контрольного определения к 20 мл воды добавляют 10 мл формольной смеси и титруют 0,5 н. раствором NaOH до появления синего окрашивания.
Содержание р-аланина в процентах (х) вычисляют по формуле:
(V, — и,)-0,0445-100х =,
а
где Ui — количество точного 0,5 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование испытуемого вещества, в мл;
у2— количество точного 0,5 н. раствора NaOH, пошедшее на контрольное титрование, в мл;
а — навеска в г;
0,0445 — количество р-аланина, соответствующее 1 мл точного 0,5 н раствора NaOH, в" г;
— пересчет в %.
Аммонийные соли, могущие присутствовать в виде примеси в исследуемом образце, мешают определению р-аланина формольным методом, так как в присутствии щелочи из них выделяется аммиак, обусловливающий образование с формальдегидом уротропина, а освобождающаяся при этом кислота будет титроваться щелочью.
Поэтому если в исследуемом образце имеется примесь аммонийных Солей (реакция с реактивом Несслера), то поступают следующим образом.
Точную навеску вещества в количестве 0,3—0,5 г растворяют в небольшом количестве воды, переносят в круглодонную колбу с холодильником Либиха. К форштоссу холодильника присоединяют приемную колбу, куда вносят 20 мл 0,1 н. раствора H2SO4. Приемную колбу соединяют с источником вакуума. В отгоночную колбу быстро вносят 2 мл 0,5 н. раствора NaOH, колбу быстро соединяют с холодильником и при нагревании на водяной бане при 60—70° содержимое колбы отгоняют в вакууме досуха. По окончании -отгонки форш- тосс холодильника слегка ополаскивают водой в приемную колбу и содержимое ее титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии 2—3 капель метилового красного в качестве индикатора.
Расчет примеси аммонийных солей по азоту в процентах (xj) производят по формуле:
(г, —v2)-0,0014-100
Xi а
где U] — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
у2—количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование содержимого приемника, в мл;
а — навеска в г;
0,0014 — количество азота, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
—пересчет в %.
Остаток в круглодонной отгоночной колбе после удаления аммиака растворяют в 20 мл воды и далее проводят формольное титрование, как описано выше. Содержание общего азота в процентах (х2) вычисляют по формуле:
- Kui + 2) — и3] 0,007-100 а’
где 2 —количество точного 0,5 н. раствора NaOH, добавленное к пробе перед отгонкой аммиака, в мл;
0,007 — количество азота, соответствующее 1 мл точного 0,5 ц. раствора NaOH, в г.
Остальные обозначения см. выше.
Содержание ip-аланина в процентах в исследуемом образце (л:3) при наличии примеси аммонийных солей вычисляют по формуле:
(х2— xJ-100
15,8
где 15,8 — содержание азота в р-аланине в %.
Остальные обозначения см. выше.
L (+) -ТРЕО-1- (р-НИТРОФЕНИЛ) -2-АМИНОПРОПАНДИОЛ-1,3
мо3А
он —с —н
2H2SO4 - Н2 N — А СН2ОН
н
Бесцветные кристаллы, т. пл. 226° (разл.). Растворим в воде 1 :20 при 20°, плохо растворим в этаноле, ацетоне, нерастворим-в хлороформе и эфире |[а]о +24,2° (5% раствор в воде).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
Для анализа этого соединения В. В. Никифоровой в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ предложен следующий полярографический метод: 0,05—0,055 г вещества (точная навеска) растворяют в этиловом спирте при слабом подогревании, переносят в мерную колбу емкостью 25 мл, доводят спиртом до метки и перемешивают. Из полученного раствора отбирают 1 мл в эрленмейе- ровскую колбу, доводят объем спиртом до 10 мл, приливают 1 мл 0,1% водного раствора агара и 9 мл ацетатного буферного раствора (pH = 3,0). Полученный раствор
помещают в ячейку полярографа, пропускают 5 минут ток азота и затем при 25° производят съемку полярограммы начиная с 0—0,2 в.
Расчет содержания вещества в процентах (х) производят по формуле:
с-у-у3-100
Х а-тц-ЮОО
где с—количество L( + )-треоамина, найденное по калибровочному графику, в мт/мл;
а — навеска в г;
и — объем, в котором растворена навеска, в мл;
У] — объем раствора, взятый для снятия полярограммы, в мл;
-у2 — общий объем раствора, взятый для поляро- графирования, в мл;
пересчет в г;
пересчет в %.
Построение калибровочного графика. Точную навеску треоамина (определенного методом диазотирования и микроэлементарным анализом)в количестве 0,05 г растворяют в спирте, переносят в-мерную колбу емкостью 25 мл, доводят спиртом до метки и перемешивают. Отбирают количества раствора, соответствующие 0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,125; 0,150 мг треоамина, доводят объем раствора в каждой колбе до 10 мл, прибавляют в каждую колбу по 1 мл 0,1% раствора агара, 9 мл ацетатного буферного раствора (pH—3,0) и снимают для каждого раствора полярограмму, как указано выше. Калибровочный график строят, откладывая по оси абсцисс концентрации раствора треоамина в мг/мл, а по оси ординат — соответствующие им высоты волн.
а-ОКСИ-р, р-ДИМЕТИЛ-у-БУТИРОЛАКТОН
сн3 н
CgHigOgМ. вес 130CgHigOgМ. вес 130н3с — сd—он
CgHigOg
М. вес 130
CgHigOg
М. вес 130
I I
Н2С- /С = о ЧУ
147147Бесцветное стекловидное вещество. Т. пл. 56—80°, т. кипения 100—110° при 7 мм. Хорошо растворим в воде.
147
147
10*
Принцип размыкания лактонов после обработки щелочью был положен В. В. Никифоровой в основу метода количественного определения у-бутиролактона. Протекающая при этом реакция может быть представлена в следующем виде:
(СНзЬ - ССНОН
Н2СCO+NaOH-»HOCH2—С(СН3)2 — СНОН — COONa.
При кипячении у-бутиролактона со щелочью происходит размыкание лактонного кольца и образуется соответствующая натриевая соль у-оксикислоты; избыток щелочи, не вступившей в реакцию, обратно оттитровы- ваеТся соляной кислотой.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
(по прописи В. А. Девяткина и В. В. Никифоровой,химико-аналитическая лаборатория ВНИВИ)
Точную навеску вещества в количестве 0,1—0,15 г, взятую на аналитических весах, растворяют в небольшом количестве воды в эрленмейеровской колбе емкостью 100 мл, прибавляют из бюретки 25 мл 0,1 н. раствора NaOH и нагревают смесь с обратным холодильником .на кипящей водяной бане в течение 1 часа. По охлаждении смеси избыток щелочи оттитровывают 0,1 и. раствором НО в присутствии фенолфталеина в качестве индикатора.
Содержание у-бутиролактона в веществе в процентах (х) вычисляют по формуле:
_ (Ut —и2).0,013.100а
где Ui — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, взятое в реакцию, в мл;
и2 — количество точного 0,1 н. раствора НС1, пошедшее на титрование, в мл;
а — навеска в г;
0,013 — количество у-бутиролактойа, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
— пересчет в %.
ВИТАМИН Вэ (ПАНТОТЕНОВАЯ КИСЛОТА)
(а-а-ДИОКСИ-р-р-ДИМЕТИЛ-р-АЛАНИДМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ)
СН3
НО — СН3 — i — СН(ОН) — CONH - сн2 — сн2 — соон ^Нз
Пантотеновая кислота, витамин Вз, участвует в образовании крэнзима А, фермента, имеющего важнейшее значение в реакциях ацилирования в организме и в обмене жирных кислот. Совместное Применение 'пантотеновой (Кислоты с антибиотиками устраняет их токсическое действие на организм. Широко применяется при поражениях радиоактивными веществами и воспалительных (процессах кожи.
Промышленными препаратами пантотеновой кислоты, получаемыми путем синтеза, являются ее соли, глав-
Физико-химические свойства пантотеновой кислоты
Показатель
Характеристика
пантотеновая кислота
пантотенат кальция
Состояние вещества
Бледно-желтое масло
Бесцветные кристаллу
Брутто-формула
c9h17o8n
(CigHaaOioNs) Са
Молекулярный вес
219,2
476,53
Температура плавления
—-
—
Растворимость
Хорошо растворима в воде, этаноле, этилацетате, диоксане, слабо—в эфире и амилалкоголе; нерастворима в бензоле, хлороформе
Хорошо растворим в воде, этаноле, этилацетате, диоксане; нерастворим в ацетоне, хлороформе, бензоле, эфире
Удельное вращение
+ 37,5 (в воде)
+ 24,3 (в вод^)1
Стандарт
1 г = 70—75 цыпл. един.
1 ц. е. = 14 у пантотеновой кислоты
1,087 г пантотената кальция = 1 г пантотеновой кислоты
Абсорбционный максимум
500 мц
—•
иым образом хорошо кристаллизующаяся кальциевая соль пантотеновой кислоты.
В основу метода определения пантотеновой кислоты и пантотената кальция положена реакция, описанная Шальковским и Девидсоном (Szalkowsky, Davidson, 1958), Воллиш и Шмолом (Wollish, Schmall, 1950). Принцип метода заключается в том, что пантотеновая кислота (I) подвергается гидролизу с образованием р-аланина и у-бутиролактона (II). Лактон подвергают обработке гидроксиламином в щелочной среде; при дальнейшей реакции гидроксамовой кислоты (III) с раствором FeCl3 получают окрашенный продукт — гидрок- самат железа (IV), определяемый по стандартному графику при Х=515 шр.
Реакция протекает в следующем направлении:
(НОСН2 — С — СНОН — CONHCH2CHsCOO)2Ca НС1
(СН3)31
(СНз)2
->(СН3)3 — с — снон nh2oh носн2С — СНОН — CONHOH
Н2С СО NaOH
IIIll
FeCl3
(кисл^а) Ре[НОСН3 — С - СНОН — CONHO]3 + ЗН2О
(СН3)2
IV
Этот метод был проверен в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. В. Никифоровой и показал возможность его применения для контроля качества пантотеновой кислоты.
Кроме того, качество пантотената кальция может быть определено комплексонометрическим титрованием, в настоящее время все более широко применяющимся в аналитических лабораториях. Этот метод подробно описан В. И. Кузнецовым и В. А. Михайловым (1957). Он основан на том, что динатриевая соль этилендиамин- тетрауксусной кислоты легко образует комплексы с рядом металлов, в том числе с кальцием. Конец реакции 150
комплексообразования определяется применением внут реннего индикатора, эриохрома черного.
НООССНЗХ ,CH3COONa — СН2 — СН2 — • 2ILO
НООССН/ ^CHsCOONa
Динатриевая соль э т и л е н д и а м и н-те т р а- уксусной кислоты, комплексон III или три- лон Б. М. вес. 372,3.
Брутто-формула:С10Н12О8К2Н2Ка2-2Н2О.
Этот способ, как показали исследования В. В. Никифоровой в нашей лаборатории, также может быть при менен для дополнительной оценки качества пантотената кальция.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
Определение по лактону. Точную навеску вещества в количестве 0,1—0,15 г растворяют в воде в мерной колбе емкостью 50 мл и доводят до метки водой. Из полученного раствора отбирают 1 мл в мерную колбу емкостью 50 мл, добавляют 4 мл воды, 3 мл 1 н. раствора НС1, горло колбы закрывают ватной пробкой и оставляют на 3 часа в термостате при 80°.
По окончании гидролиза колбу с содержимым охлаждают, добавляют 2 мл щелочного раствора гидро- каиламина, 5 мл 1 н. раствора NaOH, перемешивают и оставляют на 5 минут.
После выдержки в течение указанного времени смесь в мерной колбе оттитровывают 1 н раствором НС1 до обесцвечивания в присутствии 2—3 капель 2,4-динитрофенола в качестве индикатора. Содержимое колбы доводят до метки водой и перемешивают. Из полученного раствора отбирают 40 мл и добавляют 2 мл 2% водного раствора FeCl3.
Развивается красноватая окраска, интенсивность которой измеряют с помощью фотоэлектроколориметра, пользуясь зеленым светофильтром, и сравнивают показания с показаниями для стандартного раствора пантотената кальция, обработанного точно таким же образом.
Контрольный опыт для пантотената кальция приготовляется тем же способом, но без проведения гидролиза.
Содержание пантотената кальция в препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
л-6-100х _(
nva
где л —показание прибора для исследуемой пробы за вычетом показания для контрольного опыта;
Л]—показания прибора для стандарта за вычетом контроля для стандарта;
а — навеска исследуемой пробы в г;
Ь — -навеска стандартного препарата в г;
100— пересчет в % -
Комплексонометрическое титрование. Точную навеску вещества в количестве 0,3—0,7 г растворяют в небольшом количестве воды, к раствору добавляют 25 мл 0,1 М раствора комплексона Ш и 10 мл аммиачного раствора и титруют 0,1 М раствором ZnSO4 в присутствии эриохрома черного (в качестве индикатора).
Расчет содержания пантотената кальция -в препарате в процентах (х) производят по формуле:
(у,—у3). 0,047653 100а’
где У1 — количество точного 0,1 М раствора ZnSO4, пошедшее на контрольное титрование, в мл;
Уз—количество точного 0,1 М раствора ZnSO4, пошедшее на титрование навески испытуемого образца, в мл;
Ct — навеска в г;
0,047653 — количество пантотената кальция, соответствующее 1 мл точного 0,1 М раствора комплексона III, в г; ;
100 — пересчет в %.
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯПАНТОТЕНАТА КАЛЬЦИЯ ПО АМИННОМУ АЗОТУС РЕАКТИВОМ НЕССЛЕРА
Навеску вещества в количестве 0,05—0,06 г (точная навеска) растворяют в воде, переносят в мерную колбу емкостью' 25 мл и доводят водой до метки (раствор А). 152
5 мл раствора А переносят в колбу Кьельдаля емкостью 100 мл, добавляют 1 мл концентрированной H2SO« (уд. в. 1,84), помещают на электроплитку и нагревают до потемнения раствора. Содержимое колбы охлаждают, прибавляют 2—-3 капли пергидроля и снова нагревают до обесцвечивания раствора (в течение 10 минут).
После сожжения содержимое колбы количественно переносят в мерную колбу емкостью 25 мл. Промывают водой, сливая в ту же колбу промывные воды, и довозят водой до метки (раствор Б).
На реакцию отбирают 1 мл раствора Б в мерную колбу емкостью 25 мл, прибавляют 10—15 мл воды, 2 мл реактива Несслера, доводят водой до метки и перемешивают.
После пятиминутной выдержки измеряют развившуюся желтую окраску раствора на электрофотоколориметре со светофильтром 440 mH.
Параллельно ставят контрольный опыт на реактивы. Содержание пантотената кальция в процентах (х) зычисляют по формуле:
c-Vt • v3-17,02-100
a-v2-v4-1000-1000 ’
где с —количество аминного азота в пробе, найденное по калибровочному графику, в у;
а — навеска в г;
Pi — объем первого разведения в мл;
у2 — количество первого разведения, взятое на. сожжение, в мл;
о3 —объем второго разведения в мл;
у4—объем второго разведения, взятый на реакцию, в мл;
10О—пересчет в %;
17,02—фактор пересчета пантотената кальция по азоту;
1000 — пересчет в мг;
1000— пересчет в г.
Построение калибровочного графика 0,059 г (точная навеска) предварительно высушенного при 105° х. ч (NH<)?SO4 растворяют в воде в мерной колбе на 250 мл и доводят водой до метки. Содержание аминного азота в растворе 0<05 мг/мд.
В мерные колбы.емкостью 25-мл отбирают соответственно 3, 5, 7, 10, 15, 20 мл основного раствора, добавляют по 3 мл 10% раствора H2SO4, доводят водой до метки и перемешивают.
На реакцию с реактивом Неослера отбирают из каждого раствора по 1 мл в мерные колбы емкостью 25 мл, добавляют по 2 мл реактива Несслера и доводят водой до метки. После перемешивания и 5-минутной выдержки измеряют оптическую плотность растворов на электрофотоколориметре со светофильтром 440 шр.
Для установки прибора на нуль пользуются водой. Параллельно ставят контроль на реактивы; вычитая в дальнейшём экстинкцию контроля из экстинкции испытуемых растворов.
Величины экстинкций, найденных по показаниям прибора, откладывают по оси ординат, а по оси абсцисс— соответствующие им концентрации азота в гаммах.
етоды контроля в синтезе витамина РР (никотиновой кислоты)
ЖЖПИРИДИНОВЫЕ ОСНОВАНИЯ (СМЕСЬ р-ПИКОЛИНА И 2,6-ЛУТИДИНА)
Ж
Ж
идкость характерного . запаха, содержит до 65% 'пиридиновых оснований и 36%
воды. Выделение Р-пиколина из смеси основано на его способности давать с сульфатом меди нерастворимую комплексную соль, которая отделяется таким образом от 2,6.-лутидина, находящегося в свободном состоянии. Способ разделения разработан в синтетической лаборатории ВНИВИ Е. С. Жданович и А. Ф. Галкиным.
Под действием щелочи происходит разложение комплексной- соли р-пиколина, свободное основание выделяется в виде маслянистого слоя.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛАГИ В СМЕСИ ПИРИДИНОВЫХОСНОВАНИЙ
(метод разработан Е. С. Жданович и А. Ф. Галкиным,ВНИВИ)
В мерный цилиндр с притертой пробкой емкостью 50 мл вносят 5 мл испытуемой смеси р-пиколина и 2,6-лутидина и 45 мл сухого бензина, встряхивают и оставляют до полного расслоения.
•Расчет содержания влаги в (процентах (х) производят по формуле:
гг 100х =,
у
где а^ — объем влаги в мл;
у — объем испытуемой смеси
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ФОРМАЛЬДЕГИДА
(по прописи Ю. И. Чумакова, лаборатория завода«Акрихин»)
Точную навеску смеси пиридиновых оснований в количестве 10—15 г помещают в мерную колбу емкостью 250 мл и доводят водой до метки. Из полученного раствора отбирают 10 мл в ионическую колбу с притертой пробкой; туда Же добавляют 25 мл точного 0,1 н. раствора йода и 10 мл 4% раствора NaOH. Колбу закрывают пробкой, взбалтывают и оставляют в темном месте иа 10 минут. По истечении указанного времени в колбу прибавляют 10 мл 10% раствора H2SO4 и выделившийся йод тотчас оттитровывают 0,1 н. раствором Na2S20a до исчезновения окрашивания. Параллельно проводят контрольный опыт с реактивами.
Расчет процентного содержания формальдегида в смеси (х) производят по формуле:
(у — Уд-о, 0015.250-100х _
10 а
где о —количество точного 0,1 н. раствора NagSgOs, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
Ui — количество точного 0,1 н, раствора ЫагЗгОз, пошедшее на титрование испытуемой пробы, в мл;
0,0015—количество формальдегида, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора Na2S2O3, в г;
10—объем раствора, взятый на анализ, в мл;
объем разведения навески в мл; а— навеска в г;
пересчет в %.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦА ОТМЫВКИ КОМПЛЕКСНОЙ СОЛИ
(по прописи Ю. И. Чумакова, лаборатория завода«Акрихин»)
Приготовление бумаги для хроматографиии техника хроматографирования
Полоски хроматографической фильтровальной бумаги размером 15 X 20 см погружают в смесь, состоящую из 5 г хлорной меди, 20 мл глицерина и 100 мл воды. Затем их слепка отжимают между лентами фильтровальной бумаги и высушивают на воздухе.
Хроматографирование осуществляют в цилиндре, на дно которого налит в качестве растворителя серный эфир. Цилиндр закрывают пробкой, через которую пропущен стеклянный или металлический крючок для подвешивания полосок бумаги, обработанных водно-глице- риновым раствором хлорной меди. На расстоянии 1—1,5 см от нижнего края полоски бумаги помещают каплю исследуемого раствора и полоску опускают нижним концом в эфир. Проявление заканчивается через 10— 20 минут. Хроматограммы смесей р-пиколина и 2,6-лути- дина представлены на рис. 23. К 20 г комплексной соли прибавляют 20—40 мл 20—30% раствора NaOH, переме-
шивают, верхний слой сливают в пробирку. После того как р-пиколин отстоялся, его отбирают узким капилляром и каплю его наносят на полоску хроматографической бумаги, обработанной, как указано выше. Полоску бумаги подвешивают в цилиндр, нижний конец ее опускают в
Рис. 23. Хроматограммы смеси Р-пиколина +2,6-лу- тндина.
а — хроматограмма смеси 50% Р-пиколииа +50% 2,6-лутидина; б — хроматограмма эталона 95% р-пиколииа +5% 2,6-лутидина; / — место нанесения испытуемого раствора: 2 — лиловая полоса 2,6-лутидина; 3— зеленовато- голубая полоса р-пиколина.
эфир. Через 10—15 минут проявление заканчивается. Проявляется полоса р-пиколина чистого голубого цвета. Примеси 2,6-лутидина (сиреневого цвета) должно быть не больше, чем в эталонной смеси.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВА₽-ПИКОЛИНА
(по прописи. Ю. И. Чумакова,лаборатория завода«Акрихин»)
К 5—10 мл водного раствора р-пиколина прибавляют 2,3 г твердого NaOH, встряхи-
ферментов. В естественных продуктах, кроме ■Связанной- формы никотиновой кислоты, встречается также свободная никотиновая кислота и ее амид.
Промышленными препаратами витамина РР являются синтетическая никотиновая кислота и ее амид в кристаллическом виде, а также в драже, таблетках и растворах для инъекций.
Физико-химические свойства никотиновой кислоты
никотиновая кислота
никотинамид
Характеристика
вают и дают отстояться в тече- ние 5—10 минут. После разделения слоев тонким капилляром отбирают каплю р-пиколина и хроматографируют, как описано выше. Примеси 2,6- лутидина должно быть не больше, чем в эталоне.
Состояние вещества
Бесцветные кристаллы
Вкус
Слабокислый
Горьковатый
Запах
Практически отсутствует
Очень слабый
Формула
C6H6O2N
C6H6ON2
Молекулярный вес
123,11
122,13
Температура плавления
234—238°
128—131°
Растворимость
В воде при25°—
1,67/100 мл, в этаноле—0,73/100 мл, в эфире не растворяется
В воде при 25°— 100/100 мл, в этаноле—66/100 мл, в эфире очень плохо растворим
pH 1% раствора
3,0
6,0
Максимум абсорбции
385 и 375 тц для CNBr комплекса
212 шц
Флуоресценция (для
N — метилнико- тинамида)
—
Голубая
Показатель
ВИТАМИН. РР(Р-ПИРИДИНКАРБОНОВАЯ КИСЛОТА)
Никотиновой кислоте свойственна достаточно специфическая реакция образования глутаконового альдегида:
Витамин РР — никотиновая кислота — имеет следую
щее строение:
соон
— conh2
^\- СООН^\ соон
+ BrCN ->2R
NC Вг
НС сн
R-CH R+ • Вг—
Никотиновая кислота
Никотинамид
В виде никотинамида никотиновая кислота входит
в качестве активной группы в состав молекулы ряда
При взаимодействии никотиновой кислоты с бромистым цианом образуется цианбромидное производное никотиновой кислоты, которое в присутствии ароматических аминов (R) дает интенсивно окрашенный продукт, производное глутаконового альдегида, дианилид. Найде-
158
159
но, что KCN в- этой реакции может быть с успехом заменен KCNS, что имеет практическое значение: реакция никотиновой кислоты с KCNS или NH<CNS, заменяющими ядовитый KCN, оказывается более стабильной, позволяет производить повторные измерения окраски без ограничения времени и является более чувствительной, чем реакция с KCN. Свойством никотиновой кислоты давать описанную реакцию широко пользуются в аналитической практике.
Никотиновой кислоте, как ip-пиридинкарбоновой кислоте, свойственно также образование нерастворимых комплексов с окисными солями меди. Учитывая количество меди, введенной в анализ (йодометрическим путем) и оставшейся в свободном состоянии, можно рассчитать количество ее, пошедшее на образование медного комплекса. Реакция протекает в стехиометрических отношениях и используется поэтому для количественного анализа.
В чистых растворах никотиновая кислрта может быть оттитрована щелочью, однако при этом нужно учитывать возможность присутствия в растворе изоникотиновой кислоты. Вследствие этого алкалиметрический метод це может иметь столь широкого применения.
КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ ДЛЯ ОТЛИЧИЯ НИКОТИНАМИДА ОТ НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ
Небольшое количество испытуемого кристаллического препарата или мелко измельченного в ступке драже или таблеток с витамином РР помещают в пробирку, добавляют 1—2 мл воды, ’/г объема 40% водного раствора NaOH и содержимое пробирки нагревают около 5 минут на кипящей водяной бане. В присутствии никотинамида развивается запах аммиака и красная лакмусовая бумажка, смоченная водой, синеет, что позволяет отличать никотинамид от никотиновой кислоты.
ОБЪЕМНЫЙ МЕТОД ,ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИКОТИНОВОЙКИСЛОТЫ В КРИСТАЛЛИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ, В ДРАЖЕИ ТАБЛЕТКАХ*
При анализе драже и таблеток взвешивают 30—50 шт. и определяют вес 1 шт. как среднее арифметическое. Отобранную пробу тщательно растирают в ступке.
По IX Госфармакопее СССР.
Точную навеску в количестве около 0,5 г кристаллической никотиновой кислоты или соответствующую навеску растертого драже или таблеток, содержащую около 0,5 г витамина РР, растворяют в 25 мл горячей воды; по охлаждении нейтрализуют по фенолфталеину 0,5 н., а под конец —0,1 н. раствором NaOH, переводят в мерную колбу емкостью 100 мл, прибавляют точно 20 мл 5% раствора сернокислой меди, доводят до метки водой, перемешивают и через 10—15 минут фильтруют в сухую колбу, отбрасывая первые 25 мл фильтрата. 50 мл фильтрата переносят в колбу с притертой пробкой, прибавляют 10мл разведенной (1:2) соляной кислоты, 2 г йодистого калия, колбу закрывают пробкой и оставляют на 10 минут в темноте. Выделившийся йод титруют 0,1 н. раствором Na2S2O3 (индикатор крахмал).
Параллельно в тех же точно условиях проводят контрольный опыт. Разность между титрованием контрольного и испытуемого раствора пересчитывают на никотиновую кислоту.
Содержание никотиновой кислоты в кристаллическом продукте в процентах (х) вычисляют по формуле:
_ (у —Щ).0,02462-10Q.100«•50
где о — объем точного 0,1 н. раствора Na2S2O3, пошедшего на титрование контрольной пробы, в мл;
— объем точного 0,1 н. раствора Na2S2O3, пошедшего на титрование испытуемой пробы, в мл;
0,02462—■ количество никотиновой кислоты, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора Na2S2O3, в г;
а— навеска в г;
— объем, до которого доведена навеска, в мл; 50— количество раствора, взятое на титрование, в мл;
пересчет в %.
Содержание никотиновой кислоты в миллиграммах в 1 шт. драже или таблеток вычисляют по формуле:
(у —y1)-24,62.rf-ioo
где d— средний вес 1 шт. драже или таблеток в г;
объем,.до которого доведена навеска, в мл; 50—количество раствора, взятого на титрование, в мл;
2— количество никотиновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора Na2S2O3, в мг; Остальные обозначения см. выше.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИКОТИНАМИДА В КРИСТАЛЛИЧЕСКОМПРЕПАРАТЕ, ДРАЖЕ И ТАБЛЕТКАХ
Точную навеску кристаллического препарата в количестве около 0,2 г или соответствующую навеску мелко измельченных драже или таблеток, содержащую около 0,2 г никотинамида, взятую на аналитических весах, переносят в круглодонную колбу емкостью 100—120 мл, прибавляют 75 мл воды, колбу закрывают резиновой пробкой с двумя отверстиями, в которые вставлены каплеуловитель и капельная воронка. Каплеуловитель соединяют с холодильником Либиха, на форштосс которого надета трубка, погруженная в точно отмеренное в приемную колбу количество (35 мл) 0,1 н. раствора H2SO4 с 1—2 каплями метилового оранжевого.
Через капельную воронку в отгоночную колбу наливают 25 мл 40% раствора NaOH, быстро закрывают кран воронки и отгоняют с водяным паром. Отгонку жидкости в колбе ведут до тех пор, пока в приемной колбе наберется около 300 мл жидкости.
Избыток внесенной в приемник серной кислоты отти- тровывают 0,1 н. раствором NaOH до появления соломенно-желтого окрашивания. Параллельно в тех же условиях проводят контрольный опыт, результаты которого вычитают из результатов основного определения.
Содержание никотинамида в кристаллическом препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
(у —У1).0,01221-100х =,
а
где и— объем точного 0,1 н. раствора H2SO4, взятого в приемник, в мл;
Oi— объем точного 0,1 н. раствора ЫаОН, пошедшего на титрование, в мл;
0,01221 — количество никотинамида, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора H2SO4, в г;
а — навеска в г;
100 — пересчет в % *.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ПИЩЕВЫХПРОДУКТАХ
(метод разработан В. М. Иосиковойв химико-аналитической лаборатории ВНИВИ)
Навеску испытуемого материала в количестве 1—20 г с содержанием никотиновой кислоты в пределах 100—150 у подвергают гидролизу при помощи 100 мл нормального раствора НС1 на кипящей водяной бане в течение 1 часа.
После охлаждения вытяжку нейтрализуют 20% едким натром до pH = 6,5 (по универсальному индикатору), обрабатывают 100 мл 96% этилового спирта (при использовании отработанного спирта берут 150 мл), отфильтровывают на фарфоровой воронке от образовавшегося осадка и прозрачный фильтрат обрабатывают 2 г асканита, встряхивая его в течение 3 минут.
Асканит отфильтровывают на маленькой бюхнеров- ской воронке; фильтр с асканитом переносят в колбу, в которой обрабатывали асканитом, и извлекают из него никотиновую кислоту встряхиванием с 25 мл нормального раствора NaOH в течение 3 минут, после чего переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Объем центрифугата измеряют (цилиндром, которым отмеряли щелочь), переносят бед потерь в стакан и обрабатывают водным насыщенным раствором сернокислого цинка. Так как при этом получается настолько густая масса, что полноту осаждения установить трудно, то обработку сернокислым цинком проводят до pH = 6,5
(по универсальному ийдикаТору), затем фильтруют, фильтрат сливают в колбу и окисляют посторонние примеси нормальным раствором КМпО<, добавляя его по каплям до получения прозрачного раствора.
Обработку перманганатом проводят с нагреванием на электроплитке (на окисление обычно требуется 4—6 капель).
После обработки перманганатом содержимое колбы охлаждают и центрифугируют, центрифугат сливают в стакан и обрабатывают кристаллическим трифосфатом калия (по фенолфталеину), затем нейтрализуют НС1 (разбавленной 1:1) до pH = 6,5 и фильтруют на бюхнеровской воронке.
Для проведения реакции к 5 мл испытуемой вытяжки и соответственно к 5 мл стандарта, содержащего 10 у никотиновой кислоты, предварительно прогретых на кипящей водяной бане в течение 5 минут, приливают по 2 мл раствора бромистого родана и 7 мл спиртового раствора анилина.
По прошествии */2—1 часа фильтруют через бумажный фильтр и колориметрируют в колориметре Дюбоска или электрофотоколориметре со светофильтром 440 шн, применяя в последнем случае контроль в виде разбавленного водой спирта (1 : 1).
Расчет содержания никотиновой кислоты в милли- грамм-процентах в испытуемом объекте (х) производят по формуле:
для колориметра Дюбоска:
25-у,-/г-10-100
й-и-б-Тц-1000
где 25 — количество щелочи, взятое для элюции, в мл;
а — навеска в г;
01 — объем элюата после обработки сернокислым цинком,в мл;
и — объем элюата в мл;
h — высота столба стандартного раствора в мм;
5 — количество вытяжки, взятое для реакции, в мл;
10—содержание никотиновой кислоты в стандартном растворе в у;
hi — высота столба испытуемого раствора в мм;
100 — пересчет в %;
1000 — пересчет в мг.
для электр офот о к о л о р и м е т р а: 25-и,.п^Ю-100
Х a-v-5-п-1000
где; п —показание прибора для стандартного раствора;
«1 — показание прибора для испытуемого рас твора.
Остальные обозначения см. выше.
Удобнее пользоваться калибровочным графиком. Длч этого 100 мг никотиновой кислоты растворяют в мерной колбе емкостью 100 мл в 20 мл спирта и по растворении доводят водой до объема. 5 мл полученного раствора переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят водой до объема. В 1 мл раствора содержится 50 у никотиновой кислоты. К 4 мл полученного раствора (200 у никотиновой кислоты) прибавляют 25 мл 0,1 н. раствора H2SO4, 2 г асканита, встряхивают 3 минуты и отфильтровывают.
Фильтр с асканитом переносят в колбу, в которой обрабатывали асканитом, извлекают никотиновую кислоту встряхиванием с 25 мл нормального раствора NaOH, центрифугируют и измеряют объем центрифугата цилиндром, которым отмеряли щелочь. Центрифугат сливают в стакан, обрабатывают раствором ZnSO4 до pH — 6,5 и фильтруют. Фильтрат сливают в коническую колбу, добавляют 1 каплю нормального раствора перманганата калия, доводят до кипения, охлаждают и центрифугируют. Центрифугат сливают в стакан, добавляют несколько капель фенолфталеина и обрабатывают кристаллическим трифосфатом калия до ясно-розового окрашивания, добавляют разведенную НС1 и фильтруют.
В конические колбы емкостью 20 мл помещают 2, 3, 4 и 5 мл фильтрата, объем в каждой колбе доводят до 5 мл водой, закрывают колбы пробками, помещают на 5 минут в кипящую водяную баню и проводят реакцию так же, как и для испытуемого объекта. Через 30—60 минут фильтруют и измеряют окраску на фотоколориметре.
Для построения калибровочного графика по оси -ординат откладывают показания прибора, а по оси абсцисс — соответствующие им концентрации никотиновой кислоты в гаммах.
РОДАНБРОМИДНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯНИКОТИНАМИДА И НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫВ ПОЛИВИТАМИННОМ ДРАЖЕ И ТАБЛЕТКАХ
(метод разработан В. М. Иосиковойв химико-аналитической лаборатории ВНИВИ)
Точную навеску растертых драже или таблеток в количестве 0,5 г растворяют в воде в мерной колбе емкостью 100 мл, доводят объем до метки водой, хорошо перемешивают и фильтруют.
1 мл фильтрата переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем до метки водой.
Для проведения реакции используют 5 конических колб с пробками емкостью 15—20 мл.
В три колбы наливают по 5 мл испытуемого раствора, в четвертую колбу — 5 мл стандартного раствора и в пятую — 5 мл дистиллированной воды. Колбы закрывают пробками, помещают в штатив, который опускают в кипящую водяную баню на 5 минут. Во время прогревания готовят роданбромидный раствор. После прогревания штатив с колбами вынимают из бани, открывают пробки, в градуированную пипетку на 10 мл при помощи груши набирают роданбромидный раствор и в каждую колбу спускают по 2 мл этого раствора. Затем в каждую колбу добавляют по 7 мл спиртового раствора анилина, содержимое колб перемешивают, закрывают пробками и оставляют для образования окраски на 30—60 минут. После этого фильтруют и интенсивность окраски фильтратов измеряют на электрофотоколориметре.
Расчет содержания витамина РР в миллиграммах в 1 шт. драже или таблеток (х) производят по формуле:
100-100 nyc-dХ= a-l-5-n-lOOO '
где а — навеска в г;
100 и 100 — разведение;
количество раствора, взятое лля реакции, в мл;
п— показание прибора для стандартного раствора;
«1 — показание прибора для испытуемого раствора *;
с — содержание никотиновой кислоты в 5 мл стандартного раствора в у;
d — средний вес драже или таблеток в г;
1000 — пересчет в мг.
При пользовании калибровочным графиком формула расчета следующая:
lQQ-100-c-rf
Х-а-1-5-1000 *
где с — количество (никотиновой кислоты в испытуемом растворе, найденное по калибровочному графику, в у.
Остальные обозначения см. выше.
В случае наличия в поливитаминных препаратах рибофлавина проводят обработку асканитом, как указано выше, или поступают следующим образом (по прописи Л. Н. Кравчиной и В. И. Колтуновой):
г растертой массы поливитаминных драже или таблеток (точная навеска) растворяют в стакане в воде, переносят в мерную колбу емкостью 25 мл, доводят до метки водой, перемешивают и фильтруют. Из фильтрата отбирают 2 мл, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят водой до метки. Этот раствор поступает на определение рибофлавина непосредственно измерением флуоресценции, как описано в разделе «Определение рибофлавина».
Затем приступают к определению содержания никотинамида или никотиновой кислоты в фильтрате. Для этого подготавливают 6 конических колб емкостью 15—20 мл. В первую из них вносят 5 мл стандартного раствора никотинамида или никотиновой кислоты, содержащего 0,2 мг в 1 мл, во вторую — 5 мл фильтрата, в котором должно содержаться около 0,6 мг никотинамида или никотиновой кислоты и около 0,1мг рибофлавина.
Среднее из определения в трех первых колбах.
третья колба служит для контрольного опыта на то количество рибофлавина, которое взято в анализ во второй колбе. Для этого отбирают рассчитанное количество раствора рибофлавина из основного стандартного раствора, содержащего 40 у рибофлавина в 1 мл.
Остальные три колбы служат для параллельных опытов. Содержимое всех колб подогревают на водяной бане и далее поступают, как описано выше.
Содержание никотинамида или никотиновой кислоты в миллиграммах в 1 шт. драже или таблеток (х) вычисляют по формуле:
(и, —n^-c-vx-dх = ,
a-n-v^
где ti\ — показания прибора для испытуемого раствора;
«2 — показания прибора для контроля на рибофлавин;
с — содержание никотинамида или никотиновой кислоты в стандартном растворе в мг;
У1— объем, до которого доведена навеска, в мл;
d — средний вес 1 шт. драже или таблеток в г; а — навеска в г;
п — показания прибора для стандартного раствора;
у2 — количество вытяжки, взятое на реакцию, в мл.
Примечание Указанные величины навески и разведения рассчитаны для драже и таблеток, содержащих в 1 шт весом 1 г 0,5 мг рибофлавина и 3 мг никотинамида При анализе препаратов с другим содержанием рибофлавина и никотинамида необходимо соответственно изменить объем разведения, сохранив количества рибофлавина и никотинамида, идущие на реакцию (около 600 у никотинамида и около 100 у рибофлавина) Если на реакцию приходится брать не 5 мл фильтрата, а меньше, то добавляют соответственное количество воды, чтобы сохранить общий объем 5 мл.
Определение никотинамида неводным титрованием. В химико-аналитической лаборатории ВНИВИ В. А. Девяткиным и М. Я- Мойжес разработан метод определения никотинамида в водных ампулированных растворах, позволяющий обойтись без длительной процедуры отгонки аммиака, что представляет известные удобства для производственного контроля препаратов никотинамида, 168
CONH3+ СН3СОО —CONH3+ СН3СОО —НСЮ4 + СНдСООН ^ сн3соон+ +сю4- СН3СООН2 + СН3СОО- ^ 2СН3СООННСЮ4 + СНдСООН ^ сн3соон+ +сю4- СН3СООН2 + СН3СОО- ^ 2СН3СООН+ сю4-+ сю4-Химизм реакции титрования никотинамида в уксусной кислоте хлорной кислотой можно представить следующим образом:
CONH3
+ СН3СОО —
CONH3
+ СН3СОО —
НСЮ4 + СНдСООН ^ сн3соон+ +сю4- СН3СООН2 + СН3СОО- ^ 2СН3СООН
НСЮ4 + СНдСООН ^ сн3соон+ +сю4- СН3СООН2 + СН3СОО- ^ 2СН3СООН
+ сю4-
+ сю4-
CONH2+ СН3СООН;ДCONH2+ СН3СООН;Д
CONH2
+ СН3СООН;Д
CONH2
+ СН3СООН;Д
Присутствующая в препарате вода связывается уксусным ангидридом. На этом принципе построен анализ кристаллического никотинамида, но без применения уксусного ангидрида.
К 2 мл 1%, или к 1 мл 2,5%, или к 0,5 мл 5% или 10% растворов никотинамида, взятых пипеткой в коническую колбу емкостью 50 мл, снабженную пробкой с воздушным холодильником, приливают 10 мл уксусного ангидрида, колбу закрывают пробкой и нагревают на кипящей водяной бане 30 минут. Пробку вынимают, осторожно удаляют фильтровальной бумагой капли воды с горлышка колбы, содержимое ее охлаждают до комнатной температуры, в колбу приливают 10 мл безводной уксусной кислоты, 5 капель индикатора кристаллического фиолетового, приготовленного на безводной уксусной кисйоте и титруют 0,1 н. раствором хлорной кислоты до изумрудно-зеленой окраски раствора. Одновременно ставят контрольный опыт на реактивы.
Содержание никотинамида в 1 мл раствора в граммах (х) вычисляют по формуле:
(У — У]).0,01221х = ’
а
где у — количество 0,1 н. раствора хлорной кислоты, пошедшее на титрование препарата, В мл,
Oi — количество 0,1 н. раствора хлорной кисло; ты, пошедшее на титрование контрольной пробы, в мл.
0,01221 — см. выше.
а—количество раствора, взятое на определение, в мл.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫВ РАСТВОРАХ НИКОТИНАТА НАТРИЯ
(по IX Госфармакопее СССР)
10 мл препарата помещают в мерную колбу емкостью 100 мл, приливают 2 капли фенолфталеина и 0,1 н. раствора едкого натра до появления бледно-розового окрашивания, добавляют 5 мл 5% раствора сульфата меди й далее проводят определение, как описано в объемном методе определения никотиновой кислоты (см. стр. 160).
в «годы контроля в синтезе витамина В^ (пиридоксина)
М. вес 104,1М. вес 104,1МЕТИЛОВЫЙ ЭФИР МЕТОКСИУКСУСНОЙ кислоты
М. вес 104,1
М. вес 104,1
СНзОСНгСООСНз
есцветная жидкость, смешивающаяся во всех отношениях с водой, хлороформом и этиловым спиртом, Т. кип. 129,6—130,2° при 760 мм, п о'= 1,396.
Методика анализа Эфира разработана Л. А. Петровой.
Метод основан на гидролитическом расщеплении сложного эфира щелочью:
СН3ОСН2СООСН3 + NaOH-» CHaOCH^COONa + СН3ОН.
Так как эфир может быть загрязнен хлороформом в связи с условиями его получения, причем хлороформ, вступая в реакцию оо щелочью:
СНС13 + 4NaOH-»3NaCl + HCOONa,
может завышать результаты определения, то для компенсации влияния примеси хлороформа проводят дополнительное определение хлориона по Фольгарду.
В коническую колбу с притертой пробкой емкостью 100 мл помещают точную, навеску эфира в количестве 0,09—0,12 г. В колбу с навеской добавляют из бюретки 20 мл 0,1 н. раствора NaOH и кипятят с обратным холодильником в течение 5—10 минут. Охлажденный раствор
титруют 0,1 н. раствором H2SO4 в присутствии нескольких капель фенолфталеина.
К оттитрованному раствору добавляют 1 мл концентрированной HNO3 (уд. вес 1,4) и из бюретки 2 мл 0,1 н. раствора AgNO3. Появление мути или осадка указывает на присутствие в пробе хлорида. В этом случае в колбу добавляют 10 мл бензола, закрывают ее пробкой и энергично встряхивают. После некоторого отстаивания на границе жидкостей собирается хлорид серебра, нижний слой становится прозрачным. Добавляют 1 мл железоаммониевых квасцов и титруют 0,1 н. раствором KCNS или NH4CNS до появления неисчезающего красноватого окрашивания.
Расчет процентного содержания эфира в пробе (х) производят по формуле:
0,0104-1000х „
х (v — Vt) — 1,333( у2 — v3).
а
где 0,0104—количество метилового эфира метоксиуК' сусной кислоты, соответствущее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
а— навеска вещества в г;
100— пересчет в %;
v— количествоточного 0,1 н.раствора
NaOH, взятое для гидролиза, в мл;
vt— количество точного 0,1н. раствора
H2SO4, пошедшее на титрование избытка щелочи, в мл;
1,333— количество эфира, эквивалентное 1 атому хлора, в молях;
у2— количество точного 0,1 н. раствора AgNO3, взятое в анализ, в мл;
и3— количество точного 0,1 н. раствора роданата, пошедшее на титрование, в мл.
2-МЕТИЛ-4-МЕТОКСИМЕТИЛ-
5-ЦИАН-6-ОКСИПИРИДИН5-ЦИАН-6-ОКСИПИРИДИНСН2ОСН3СН2ОСН3н3с/у\онн3с/у\онCeHjoNjOjМ. вес 178,19CeHjoNjOjМ. вес 178,19
5-ЦИАН-6-ОКСИПИРИДИН
5-ЦИАН-6-ОКСИПИРИДИН
СН2ОСН3
СН2ОСН3
н3с/у\он
н3с/у\он
CeHjoNjOj
М. вес 178,19
CeHjoNjOj
М. вес 178,19
Бесцветный кристаллический продукт, трудно растворимый в воде и органических растворителях. Т. пл. 241 —242°.
Метод анализа разработан Л. А. Петровой.
Метод основан на том, что фенольный гидроксил в 6-м положении легко образует соли. Титрованием с метиловым красным производят нейтрализацию вещества, а применение индикатора тимолфталеина дает возможность определить конец образования соли. По количеству вступившего в эту реакцию NaOH определяют содержание 2-метил-4-метоксиметил-5-циан-6-оксипиридина.
СН3ОСН3СН2ОСН3
А/™А/™
| || +NaOH->| ||+ Н3О
HgCA^^OHHaC^^^ONa
Для этого в коническую колбу помещают навеску вещества в количестве 0,15 г и растворяют при кратковременном нагревании на кипящей водяной бане в 20 мл 96% этилового спирта. Не давая раствору охладиться, его титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии 0,5 мл метилового красного до исчезновения розовой окраски. К раствору добавляют 0,5 мл тимолфталеина и продолжают титровать до первого изменения окраски (зеленое окрашивание).
Содержание 2-метил-4-метоксиметил-5-циан-6-оксипи- ридина в процентах (х) вычисляют по формуле:
(у — у,).0,0178-100х G,
а
где у— общее количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование с двумя индикаторами, в мл;
У1—количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование с метиловым красным, в мл;
0,0178—количество окаипиридина, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
а — навеска в г;
100 — пересчет в %.
2-МЕТИЛ-3-НИТРО-4-МЕТОКСИМЕТИЛ-5-ЦИАН-6-ОКСИПИРИДИН
CgHgN3O4М. вес 223,2CgHgN3O4М. вес 223,2СН3ОСН3 OiNx/k/CN
CgHgN3O4
М. вес 223,2
CgHgN3O4
М. вес 223,2
ононн3с
он
он
Бесцветный кристаллический продукт, слабо растворимый в воде, растворимый в органических растворителях.
Метод контроля качества продукта разработан Л. А. Петровой. В основу его положен способ, подробно описанный Хинкелем, Айлином и Вальтерсом (Hinkel, Ayling, Walters, 1939), восстановления нитрогруппы в органических соединениях хлористым оловом. Он заключается в нагревании вещества с титрованным раствором хлористого олова в соляной кислоте. Превращения могут быть выражены следующим уравнением:
RNO2 + 3SnCl8 + 6НС1 -» RNH2 4- 3SnCl4 + 2Н30‘.
По окончании восстановления избыток хлористого олова определяется титрованием раствором йода. По количеству олова, пошедшего на восстановление нитрогруппы в аминогруппу, судят о процентном содержании нитрогруппы, а следовательно, и вещества.
Техника метода. Точную навеску вещества в количестве 0,1 г переносят с помощью 6 мл б6% этилового спирта в реакционную колбу, снабженную пробкой с обратным холодильником и трубкой для пропускания через раствор инертного газа. Колбу закрывают пробкой и помещают в горячую водяную баню. Как только навеска полностью растворится, в колбу добавляют 5 мл серной кислоты, разведенной водой в отношении 1:1, и 2 мл раствора хлористого олова. Смесь в кблбе подвергают нагреванию на водяной бане в течение 30 минут, пропуская в колбу углекислоту со скоростью 1—2 пузырька в секунду. По прошествии указанного времени колбу вынимают из бани, добавляют 50 мл воды и содер-
Губен — Вейль. Методы органической химии, т. II. ГНТизд. Хим. Л. М., 1963.
жимое ее тцтруют 0,2 В- раствором йода в присутствии крахмала в качестве йндикатора.
Содержание 2-метил-3-нитро-4-метоксиметил-5-циан- 6-оксипирйдина в процентах (х) вычисляют по формуле: (у —У1).0,0744-100
а‘
где и — количество точного 0,2 н. раствора йода, пошедшее на титрование 2 мл раствора хлористого олова, в мл;
и 1—количество точного 0,2 Н. раствора йода, пошедшее на титрование пробы после восстановления, в мл;
0,0744 — количество нитрооксипиридина, соответствующее 1 мл точного 0,2 н. раствора йода, в г;
а— навеска в г;
100— пересчет в %.
2-МЕТИЛ-3-НИТРО-4-МЕТОКСИМЕТИЛ-5-ЦИАН-6-ХЛОРПИРИДИН
СН3ОСН3
O2N\/\/CNCeHgOsNsCl
Г IМ. вес 241,6
н ZSA,
Бесцветный кристаллический продукт. Т. пл. 73—75°. Хорошо растворим в горячем этиловом спирте, растворим в петролейном эфире и ледяной уксусной кислоте; практически нерастворим в холодной воде.
Метод определения чистоты 2-метил-3-нитро-4-мето- ксиметил-З-циан-б-хлорНиридица разработан Л. А. Петровой в синтетической лаборатории ВНИВИ. В основу метода положен способ Шенигера (Schoniger, 1955), предложенный им для быстрой минерализации вещества на платиновой проволоке в атмосфере кислорода.
Техника метода. Точную навёску вещества в количестве около 0,05 г взвешивают на беззольном фильтре, вырезанном, как указано на рис. 24, и прикрепляют к платиновой проволоке (d=0,5—0,7 мм; /*=100 мм),
бпаянной в пришлифованную пробку конической колбы с отогнутыми краями (рис. 25) объемом 300—400 мл так, чтобы свободный кусочек фильтра свисал (см. рис. 24). В колбу вливают 50 мл дистиллированной воды, 8 мл 2 н. раствора КОН и 10 капель концентрированной перекиси водорода. В течение нескольких секунд колбу промывают кислородом из газометра, чтобы вытеснить воздух. Затем поджигают полоску фильтровальной бу-
L—L-U.1
।
Рис 24. Фильтр для сжигания хлорпириди- на.
Рис. 25 Колба для сжигания и титрования хлорпиридинаРис. 25 Колба для сжигания и титрования хлорпиридинамаги и быстро закрывают колбу пробкой (колбу держат в левой руке, а правой придерживают пробку). По окончании сжигания в колбе образуется вакуум. Содержимое колбы энергично перемешивают в течение 10 минут. Затем в ютогнутые края горла колбы наливают воду и открывают пробку. Вода омывает шлиф. Платиновую проволоку и стенки колбы также омывают водой. Щелочной раствор кипятят 3—5 минут для разрушения перекиси водорода, добавляют 5 мл 6 н. раствора HNO3, кипятят еще 2 минуты и охлаждают содержимое до температуры ниже 25° струей водопроводной воды. К содержимому колбы добавляют 10 мл бензола или толуола, 5 мл 0,1 н. раствора AgNOs и энергично взбалтывают. На границе жидкостей собирается хлорид серебра, раствор же становится прозрачным. К смеси добавляют 10 мл раствора железоа^ммониевых квасцов и титруют 0,1 н. раствором KCNS или NH4CNS до появления неизчезающего красно-коричневого окрашивания. За 1 каплю до конца тит-
Рис. 25 Колба для сжигания и титрования хлорпиридина
Рис. 25 Колба для сжигания и титрования хлорпиридина
рования появляется окрашивание, исчезающее при взбалтывании.
Содержание 2-метил-3-нитро-4-метоксиметил-5-ниан- 6-хлорпиридина в продукте в процентах (х) вычисляют по формуле:
_ (у —и,) — у3-0,02416-100
а
где у — количество точного 0,1 н. раствора нитрата серебра, взятое в реакцию, в мл;
У1 — количество точного 0,1 н. раствора роданата, пошедшее на титрование, в мл;
0,02416 — количество 2-метил-3-нитро-4-метоксиме- тил-5-циан-6-хлорпиридина, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора нитрита серебра, в г;
Уг— количество точного 0,1 н. раствора роданата, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
а — навеска в г;
100— пересчет в %.
ХЛОРГИДРАТ 2-МЕТИЛ-3-ОКСИ-4-МЕТОКСИ-5-ОКСИМЕТИЛПИРИДИН (МЕТИЛОВЫЙ ЭФИРПИРИДОКСИНА)
СН3ОСН3
НОХА/СН3ОН
IICqH14NO3Cl
М вес 219,6 НзС^^ТЧС!
Кристаллический бесцветный продукт. Т. пл. 176°. Хорошо растворим в воде, трудно — в этиловом спирте, плохо — в ацетоне.
Метод анализа разработан Л. А. Петровой
СН3ОСН3СН3ОСН3
НОхД/СН2ОННО\/\/СН2ОН
||+ NaOH||+ NaCl + Н2О
ИзС^^С!НзС^^^
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
Точную навеску метилового эфира пиридоксина в количестве 0,1—0,2 г растворяют в 10—15 мл воды и титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии 3 капель бромтимолового синего до изменения окраски.
Расчет процентного содержания (х) производят по формуле:
у.0,02196-100л = ,
а
где у — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,02196 — количество эфира пиридоксина, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH,' в г;
а —■ навеска в г;
100 — пересчет в %.
Рис. 26. Пробирка с отводом для фильтрования раствора хлористого палладия.Рис. 26. Пробирка с отводом для фильтрования раствора хлористого палладия.ХЛОРИСТЫЙ ПАЛЛАДИЙРЕГЕНЕРИРОВАННЫЙ
Рис. 26. Пробирка с отводом для фильтрования раствора хлористого палладия.
Рис. 26. Пробирка с отводом для фильтрования раствора хлористого палладия.
В регенерированном катализаторе определяют содержание палладия весовым методом.
Для этого точную навеску регенерированного хлористого палладия в количестве 0,3—0,5 г растворяют в 3 мл 2 н. раствора НС1 в небольшом стеклянном стакане при нагревании на водяной бане. Раствор осторожно фильтруют в пробирку с отводом через воронку, в конус которой вложена вставка (рис. 26), декантируя раствор с нерастворив- шегося осадка. Фильтрат переносят в фарфоровую чашку. Осадок на вставке промывают 2 мл 2 н. раствора НС1 и 5 мл горячей воды. Промывные воды присоединяют к фильтрату и нейтрализуют насыщенным раствором со-
ды до появления оранжевой окраски по метиловому оранжевому. Добавляют 2 мл 10% водного раствора муравьинокислого натрия и закрывают чашку часовым стеклом. Содержимое чашки нагревают 30 минут на водяной бане до прекращения выделения газов. При этом происходит следующая реакция:
PdCl2 + 2HCOONa -> 2NaCl + 2СО2 + Pd + Н2.
Осадок фильтруют через беззольный фильтр, промывают 100 мл горячей воды, переносят в прокаленный до постоянного веса и взвешенный тигель, озоляют вначале на электроплитке, а затем прокаливают в муфельной печи до постоянного веса. Охлаждают тигель в эксикаторе над серной кислотой.
Содержание палладия в процентах (х) вычисляют по формуле:
Л-100
а
где А — а — 100 —где А — а — 100 —вес золы в г; навеска в г; пересчет в %.
где А — а — 100 —
где А — а — 100 —
КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИДРОКСИЛАВ АЛИФАТИЧЕСКОЙ ЦЕПИ
Описание принципа метода см. в определении пиридоксина [Хохберг, Мельник, Озер (Hochberg, Melnick, Oser, 1944)].
Навеску вещества в количестве около 0,05 г растворяют в 50 мл воды, прибавляют 0,5 мл НС1 (уд. вес 1,19), 1 мл 0,1 н. раствора NaNOz, перемешивают и оставляют на 10 минут. Из полученной смеси отбирают 0,1 мл, прибавляют 1 мл раствора борной кислоты, 2 мл аммонийного буфера, 1 мл раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида, 2 мл бутилового спирта и смесь тщательно перемешивают. При этом в слое бутилового спирта не должна развиваться синяя окраска.
ВИТАМИН В6 (ПИРИДОКСИН)
(2-метил-3-окси-4.5-диоксиметилпиридин)
Пиридоксин, или витамин Вб, является антидермати- ческим фактором, имеет чрезвычайно большое значение в нормальном обмене веществ.
В естественных объектах находятся в виде сопряженно действующей системы пиридоксин-пиридоксаль-пири- доксамин и в виде фосфорных эфиров включается в качестве кофермента в состав важнейших ферментов пе- реаминирования:
СН2ОННОХ^/СН2ОНH3C/4NZ[ПиридоксинСН2ОННОХ^/СН2ОНH3C/4NZ[ПиридоксинсонНО\^\/СН2ОНсонНО\^\/СН2ОНПиридоксальПиридоксальch2nh2НО\/\/СН2ОННзС^м/Пиридоксамииch2nh2НО\/\/СН2ОННзС^м/Пиридоксамии
СН2ОННОХ^/СН2ОН
H3C/4NZ
[Пиридоксин
СН2ОННОХ^/СН2ОН
H3C/4NZ
[Пиридоксин
сон
НО\^\/СН2ОН
сон
НО\^\/СН2ОН
Пиридоксаль
Пиридоксаль
ch2nh2
НО\/\/СН2ОН
НзС^м/
Пиридоксамии
ch2nh2
НО\/\/СН2ОН
НзС^м/
Пиридоксамии
ПоказательПоказательСостояние вещества Формула Молекулярный вес Температура плавленияРастворимостьСостояние вещества Формула Молекулярный вес Температура плавленияРастворимостьpH водного раствора Максимум абсорбцииpH водного раствора Максимум абсорбции
Показатель
Показатель
Состояние вещества Формула Молекулярный вес Температура плавления
Растворимость
Состояние вещества Формула Молекулярный вес Температура плавления
Растворимость
pH водного раствора Максимум абсорбции
pH водного раствора Максимум абсорбции
Физико-химические свойства пиридоксина
Характеристика
Бесцветные кристаллы
CsHnOaN НС1 (гидрохлорид) 170. Гидрохлорид — 205,65 160°. Гидрохлорид 203—206° (разл.)
г гидрохлорида растворяется в 4,5 мл воды или 90 мл этанола при 20°
3,0—3,2 (гидрохлорид) 270—370 mil (в 0,01 и. НС1)
Пиридоксин выпускается в виде гидрохлорида. Методы его анализа основаны на определении по галоиду визуальным или потенциометрическим титрованием и колориметрическом определении по ОН-группе. Промышленными препаратами витамина В6 является кристаллический продукт, его водные растворы, а также драже и таблетки с витамином Be и другими витаминами.
ОБЪЕМНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Осуществляется одним из следующих способов: около 0,1 г препарата (точная навеска) растворяют в воде в мерной колбе емкостью 50 мл и доводят до метки водой. К 20 мл этого раствора прибавляют 2—3 капли индикатора бромтимолового синего и титруют из микробюретки 0,1 н. раствором едкого натра до первого появления голубой окраски раствора.
Расчет процентного содержания гидрохлорида пиридоксина в препарате (х) производят по формуле:
y.0,02056-yr100х ,
где и — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,02056— количество пиридоксина гидрохлорида, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора NaOH, в г;
tr— навеска в г;
У1 — объем разведения в мл;
и2— количество раствора, взятое на титрование, в мл;
100 — пересчет в %.
Около 0,06 г препарата (точная навеска) растворяют в 10—15 мл воды, прибавляют 1 каплю разведенной азотной кислоты, 8—10 капель раствора дифенилкарбазона и титруют из микробюретки 0,1 н. раствором нитрата окисной ртути до перехода желтой окраски в светло-сиреневую.
Содержание пиридоксина в процентах (х) вычисляют по формуле:
о-0,02056-100х ^а
Обозначения см. выше.
ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ
(метод разработан О. С. Шермани Е. И. Гершкович)
Точную навеску гидрохлорида пиридоксина в количестве около 0,2 г растворяют в 30 мл воды, прибавляют 2 мл 0,1 н. раствора НС1 и при постоянном перемешивании титруют 0,1 н. раствором NaOH. Запись показаний
Рис- 27. Кривая потенциометрического титрования гидрохлорида пиридоксина.
гальванометра производят после добавления каждых 0,5 мл, а в областях скачков потенциала — через 0,2—0,3 мл.
На графике по оси абсцисс откладывают количество миллилитров израсходованной щелочи, а по ординате — показания гальванометра в милливольтах (рис. 27).
Содержание гидрохлорида пиридоксина рассчитывают по числу миллилитров щелочи, израсходованной между 1-м и 2-м скачками потенциала.
Расчет процентного содержания пиридоксина в препарате (х) производят по формуле:
v-0,02056-100х = ,
а
где у— количество точного 0,1 н. раствора NaOH, израсходованное между 1-м и 2-м скачками потенциала, в мл;
0,02056 — количество пиридоксина, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
пересчет в %;
а — навеска в г.
РЕАКЦИЯ ИДЕНТИЧНОСТИ
НОН2СНОН2ССН2ОНСН2ОНВ основу реакции положен метод Хохберга, Мельника, Озер и Скуди (Hochberg, Melnick, Oser и Scudi), сущность которого заключается в том, что пиридоксин, „реагируя с 2,6-дихлорхинонхлоримидом, образует синий индофенол по схеме:
НОН2С
НОН2С
СН2ОН
СН2ОН
:N СН3 НЭС:N СН3 НЭССН2ОНСН2ОНУстановлено, что эта реакция является достаточно избирательной для пиридоксина, так как только те фенолы реагируют с 2,6-дихлорхинонхлоримидом, образуя окрашенный индофенол, которые имеют открытое пара- положение к фенольному гидроксилу. В присутствии же солей бора эта реакция не идет, так как бор связывает ОН-группу пиридоксина, образуя боратный комплекс, вследствие чего фенольный характер пиридоксина маскируется:
:N СН3 НЭС
:N СН3 НЭС
СН2ОН
СН2ОН
Связывание солями бора гидроксильной группы пиридоксина использовали О. С. Шерман и Е. И. Гершкович в качестве метода идентификации (определения подлинности пиридоксина).
Навеску пиридоксина в количестве около 0,05 г растворяют в 50 мл воды, отбирают 0,1 мл полученного раствора, прибавляют 1 мл воды, 2 мл аммонийного буфера, I мл раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида, 2 мл бутанола и смесь энергично встряхивают. При этом в бутаноловом слое должно развиться синее окрашивание. В параллельной пробе к 0,1 мл испытуемого раствора прибавляют 1 мл раствора борной кислоты, 2 мл аммонийного буфера, 1 мл раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида, 2 мл бутанола и смесь энергично встряхивают. При этом в бутаноловом слое не должно развиться синее окрашивание.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ МЕТИЛОВОГО ЭФИРАПИРИДОКСИНА
Поскольку в метиловом эфире пиридоксина в 5-м положении находится ОСН3-группа, он не способен реагировать, подобно пиридоксину, с борной кислотой и образовывать борный комплекс, не дающий реакции образования индофенола с 2,6-дихлорхинонхлоримидом. На этом свойстве основан способ определения примеси метилового эфира пиридоксина в препарате пиридоксина, предложенный Л. А. Петровой.
Составление калибровочного графика
Приготовляют растворы, содержащие в 1 мл следующие количества пиридоксина и его метилового эфира (табл. 6).
Подготавливают 6 капельных воронок емкостью 25—50 мл. В каждую из них вносят по 1 мл растворов № 1—6, по 2 мл 5% водного раствора борной кислоты, по 2 мл буферного аммиачного раствора, по 1 мл раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида и 2 мл бутилового спирта. Смесь в воронках тщательно встряхивают в течение 1 минуты и дают разделиться слоям. Бутаноловый слой сливают в пробирки № 1—6 через бумажные фильтры с небольшим количеством овежепрокаленного сернокисло-
Таблица 6
Шкала растворов пиридоксина и метилового эфира
М раствора
Содержание в 1 мл в 7
хлоргидрата пиридоксина
метилового эфира пиридоксина
1
100,0
—
2
99,0
1,0
3
98,0
2,0
4
97,0
3,0
5
96,0
4,0
6
95,0
5,0
го натрия. Обработку растворов производят последовательно с таким расчетом, чтобы измерение окраски на электрофотоколориметре проводилось спустя 10 минут от начала опыта. Измерение производят со светофильтром, имеющим Л = 680 тц. Установку прибора на нуль производят с реактивами. На основании показаний гальванометра прибора строят калибровочный график общепринятым способом.
Техника метода. 1 мл испытуемого раствора, содержащего смесь пиридоксина и его метилового эфира, помещают в капельную воронку и обрабатывают описанным выше способом. По калибровочному графику находят процентное содержание примеси метилового эфира.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПИРИДОКСИНА В ДРАЖЕ, ТАБЛЕТКАХИ ДРУГИХ ПРЕПАРАТАХ С ОДНИМ ИЛИ НЕСКОЛЬКИМИВИТАМИНАМИ
(метод разработан В. А. Девятниными Г. А. Федоровой (1961) на основе способа Хохберга,Мельника, Озер, Скуди и др.)
Навеску порошка растертых таблеток в количестве около 1 г (при содержании в таблетках до 2 мг пиридоксина) или около 0,4 г (при содержании 5—10 мг) размешивают в небольшом количестве 0,5% соляной кислоты
в мерной колбе емкостью 100 мл, доводят до метки этой же кислотой, перемешивают и фильтруют. 2 мл фильтрата помещают в мерную колбу емкостью 50 мл, доводят соляной кислотой до метки и перемешивают.
4 мл полученного раствора переносят в кювету фотоколориметра, добавляют 7 мл 0,5% раствора соляной кислоты, 1 мл воды, 5 мл изопропилового спирта, 2 мл аммонийного буферного раствора и перемешивают. Затем добавляют 1 мл раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида и вновь осторожно перемешивают. Через 1—172 минуты измеряют оптическую плотность раствора на фотоколориметре с красным светофильтром (7 = 680 тц) в кювете с толщиной слоя 3 см.
Одновременно ставят контрольный опыт: в кювету фотоколориметра помещают 4 мл испытуемого раствора и далее поступают, как описано выше, добавляя вместо 1 мл воды 1 мл 5% раствора борной кислоты.
Содержание пиридоксина в миллиграммах в 1 шт. испытуемого препарата (х) вычисляют по формуле:
c-v-dа-1000 ’
где с—содержание пиридоксина, найденное по калибровочному графику, в мг;
а — навеска в г;
и — разведение в мл;
d— средний вес 1 таблетки в г.
Составление калибровочного графика 0,0125 г пиридоксина гидрохлорида помещают в мерную колбу емкостью 100 мл, растворяют в 0,5% растворе соляной кислоты, доводят этой же кислотой до метки и перемешивают (основной раствор стандарта). Раствор хранят в склянке темного стекла с притертой пробкой при 4°. Устойчив в течение 1 месяца.
2 мл основного раствора вносят в мерную колбу емкостью 50 мл и доводят до метки 0,5% раствором соляной кислоты (рабочий раствор стандарта). Из полученного раствора готовят серию растворов в соотношениях, указанных в табл. 7, и через 1—Р/г минуты измеряют окраску растворов, как указано выше.
Для построения калибровочного графика на оси абсцисс откладывают количества пиридоксина в милли-
Приготовление стандартных растворов
№ п/п
Объем в мл
Общий объем
Содержание пиридоксина в y
рабочего раствора стандарта
0,5%
НС1
ВОДЫ
изопропилового спирта
аммонийного буферного раствора
раствора 2,6-днхлор- хинонхлор- имида
1
1,о
10,0
1,0
5,0
2,0
1,о
20
5
2
2,0
9,0
1,0
5,0
2,0
1,0
20
10
3
3,0
8,0
1,0
5,0
2,0
1,0
20
15
4
4,0
7,0
1,0
5,0
2,0
1,0
20
20
5
5,0
6,0
1,0
5,0
2,0
1,0
20
25
6
6,0
5,0
1,0
5,0
2,0
1,0
20
30
граммах, а на оси ординат — соответствующие им оптические плотности. Правильно построенный график должен иметь вид прямой линии и проходить через точки калибровочного графика и через точку пересечения ординат.
етоды контроля в синтезе витамина Вй
(фолиевой кислоты)
ГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА
C5HANМ. вес 147,13C5HANМ. вес 147,13ноос — сн3 — сн2 — сн — соон
C5HAN
М. вес 147,13
C5HAN
М. вес 147,13
NH3
■ S елый кристаллический порошок кислого 1 вкуса, трудно растворимый в спирте и холодной воде. Хорошо растворяется в горячей воде, разбавленных кислотах и щелочах; нерастворим в эфире. Т. пл. 189°, уд. вращ. 5% раствора в 2,5% НС1 = +30,0— 32,5.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМОЛЬНО-ТИТРУЕМОГО АЗОТА
Около 0,25 г препарата (точная навеска) растворяют в 20 мл дистиллированной, лишенной СОг, воды при слабом нагревании (не доводя до кипения). К охлажденному раствору добавляют 3 капли индикатора нейтрального красного и титруют 0,2 н. раствором КОН или NaOH до первого изменения окраски в оранжевый цвет. Прибавляют 10 мл формольной смеси и титруют 0,2 н. раствором щелочи до появления ясного красного окрашивания, одинакового с окраской контрольного опыта.
Одновременно готовят контрольный опыт из 20 мл дистиллированной, лишенной СО2, воды, к которой при-
бавлено 3 капли индикатора нейтрального красного, 10 мл формольной смеси и 0,1 мл 0,2 н. раствора щелочи. К концу титрования уравнивают объем контроля, добавляя к нему столько воды, сколько было затрачено 0,2 н. раствора щелочи на титрование испытуемого.
Содержание азота в процентах (х) вычисляют по формуле:
/о —0,1)-0,02943.100х =,
а
где и — количество точного 0,2 н. раствора щелочи, пошедшее на титрование испытуемого раствора, в мл;
0,1— количество точного 0,2 н. раствора щелочи, добавленное в контрольный опыт, в мл;
0,02943— количество глутаминовой кислоты, соответствующее 1 мл точного 0,2 н. раствора щелочи, в г;
а — навеска в г.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УДЕЛЬНОГО ВРАЩЕНИЯ
Около 1,25 г препарата (точная навеска) растворяют в пикнометре емкостью 25 мл, в 20 мл 2,5% раствора НС1 и помещают в термостат при 20° на 1 час. Раствор доводят до метки той же кислотой, перемешивают и определяют в поляриметре угол вращения при длине трубки в 2 дм.
Удельное вращение определяют по формуле:
где I — длина трубки в дм;
с— количество глутаминовой кислоты в 25 мл раствора в г;
а— наблюдаемый угол вращения.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ПЛАВЛЕНИЯ
Определение проводят в незапаянном капилляре в приборе Рота. Скорость повышения температуры должна составлять 4—5° в 1 минуту. Капилляр с веществом вносят в прибор при температуре 175—180°.
КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСЕЙСвободный аммиак
0,5 г препарата помещают в коническую колбу емкостью ^50 мл. с притертой пробкой, прибавляют 12,5 мл ледяной СНзСООН, взбалтывают 5 минут и фильтруют через складчатый фильтр. К 5 мл фильтрата прибавляют 3 мл 0,1 н. раствора NaNO2 и взбалтывают. Отбирают из полученного раствора 2 мл и прибавляют их к 5 мл щелочного раствора бета-нафтола и взбалтывают. При этом не должно возникать розового окрашивания.
Связанный анилин
0,5 г препарата растворяют в конической колбе емкостью 50—100 мл в 5 мл разбавленной (1:1) НС1 и кипятят на сетке в течение Р/г часов с обратным холодильником. По охлаждении раствор нейтрализуют по лакмусу 30% раствором NaOH (около 3 мл) и доводят до 12,5 мл ледяной уксусной кислотой. После перемешивания отбирают 5 мл раствора, прибавляют 3 мл 0,1 н. раствора NaNO2, перемешивают и к 2 мл полученного раствора прибавляют 5 мл щелочного раствора бета- нафтола. Не должно появляться розовое окрашивание.
Соли аммония и диэтиламин
0,2 г препарата с 3 мл 10%' раствора щелочи не должны вызывать посинения красной лакмусовой бумажки при кипячении этого раствора в течение 10—15 секунд.
ХЛОРГИДРАТ ГЛУТАМИНОВОЙ кислоты
СООН — СН2 — СН2 — СН — СООН • НС1
|C6HloO4NCl
NH3м. вес 183,6
Белый порошок кислого вкуса. Хорошо растворим в воде и спирте.
Количественное определение. Около 0,8 г препарата (точная навеска) растворяют в мерной колбе емкостью 100 мл в 60—70 мл свежепрокипяченной и охлажденной воды, доводят водой до метки и перемешивают. Отбирают по 25 мл в две конические колбы емкостью
100—150 мл. В одну из колб прибавляют 2—3 капли фенолового красного и титруют 0,1 н. раствором NaOH до четкого розового окрашивания. В другую колбу добавляют 2 мл 10% раствора азотной кислоты, 20 мл 0,1 н. раствора азотнокислого серебра и титруют 0,1 н. раствором роданистого аммония в присутствии железоаммониевых квасцов до появления розового окрашивания.
Содержание хлоргидрата глутаминовой кислоты в процентах (х) вычисляют по формуле:
(о —V,).4-0,01836-100X _ .f
а
где и— количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
U] — количество точного 0,1 н. раствора AgNOs, пошедшее на титрование, в мл;
0,01836— фактор пересчета на хлоргидрат глутаминовой кислоты;
пересчет в %;
а — навеска в г;
часть навески, взятая на титрование.
2,4-ДИАМИНО-5-ИЗОНИТРОЗО-6-ОКСИПИРИМИДИН
C4H5N5O2 М. вес 155,124
Розоватый мелкокристаллический порошок. При обычной температуре практически не растворим в воде, спирте и в растворах кислот. Слабо растворим в разбавленных растворах щелочей.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСИ 2,4-ДИАМИНО-6-ОКСИПИРИМИДИНА
Около 0,1 г изонитрозосоединения (точная навеска) растирают с 10 мл воды, приливают 10 мл 1 н. раствора NaOH, 180 мл горячей (40—50°) воды и растворяют навеску. Приливают 20 мл 20% раствора H2SO4 и нитрози- руют 0,1 н. раствором NaNO2 при комнатной температу-
ре /ю появк-пия синего пятна на йодокрахмальной бу- мл е ици выдержке 5 минут.
Параллельно ставят контрольный опыт. Количество раствора NaNO2, пошедшее на титрование контрольного опыта, вычитают из количества раствора NaNO2, затраченного при нитроз-ировании навески.
Расчет процентного содержания 2,4-диамино-6-окси- пиридина (%) производят по формуле:
(у —у^-0,0126-100х _ .———,
а
где у— количество точного 0,1 н. раствора NaNO2, пошедшее на нитрозирование навески, в мл;
У1— количество точного 0,1 н. раствора NaNO2, израсходованное на контрольный опыт, в мл;
0,0126 — фактор пересчета на 2,4-диамино-6-окси- пиримидин;
пересчет в %;
а— навеска в г.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ 2,4-ДИАМИНО-5-ИЗОНИТРОЗО-6-ОКСИПИРИМИДИНА
Около 0,1 г препарата (точная навеска) помещают в колбу Кьельдаля емкостью 100 мл, прибавляют растертую в порошок смесь из 1 г сульфата калия, 0,3 г сульфата меди и 0,5 г глюкозы, приливают 10 мл концентрированной H2SO4 и сжигают до обесцвечивания раствора. Далее поступают, как описано в анализе ацетонитрила. Параллельно ставят контрольный опыт на реактивы.
Расчет процентного содержания изонитрозосоединения (%i) производят по формуле:
(у— у,)-0,003102-10хг = —х • 0,984,
а
где у — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
У1 — количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование аммиака, в мл; 0,003102— фактор пересчета на изонитрозосоедине ние;
IGO— пересчет в %;
х— процентное содержание примеси диамино- оксипиримидина;
0,984— фактор пересчета диаминопиримидина на изонитрозосоединение;
а— навеска в г.
2,4,5-ТРИАМИНО-6-ОКСИПИРИМИДИН-ДИХЛОРГИДРАТ
ОН
^X^NHsC4H7ON6-2HC1
J |М. вес 214,07
^N^N^^NHs • 2НС1
Хорошо растворим в воде. Его растворимость уменьшается в присутствии соляной кислоты.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
0,22—0,23 г препарата (точная навеска) растворяют в 50 мл воды, приливают 25 мл 0,1 н. раствора йода и по истечении 1 минуты титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия в присутствии крахмала.
Параллельно ставят контрольный опыт на реактивы.
Содержание дихлоргидрата 2,4,5,-триамино-6-оксипи- римидина в процентах (х) вычисляют по формуле:
(v-vJ-0,0107-100
х _ -,
а
где и — количество точного 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
»1 — количество точного 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование навески, в мл;
0,0107 — фактор пересчета на дихлоргидрат триами- нооксипиримидина;
100—- пересчет в %;
а — навеска в г.
19319313 В А Девятннн
193
193
4, 5-ТРИАМИНО-6-ОКСИПИРИМИДИН-СУЛЬФАТ
CJbON, SO,M. вес 237,07
триамино-6-оксипиримидин-сульфат получают при каталитическом гидрировании 2,4-диамино-5-изонит- розо-6-оксипиримидина со скелетным никелевым катализатором в щелочной среде. После гидрирования основание выделяют в виде сульфата.
Методы анализа разработаны в лаборатории синтеза ВНИВИ В. М. Березовским с сотрудниками.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
0,23—0,25 г вещества (точная навеска) растворяют в 50 мл воды при нагревании на водяной бане при 50° и перемешивании до полного растворения навески. К охлажденному до комнатной температуры раствору приливают 25 мл 0,1 н. раствора йода и по истечении 1 минуты титруют 0,1 н. раствором тиосульфата натрия в присутствии крахмала.
Параллельно ставят контрольный опыт.
Содержание сульфата триаминооксипиримидина в процентах (х) вычисляют по формуле:
(v — vO-0,01285-100х =,
а
где, и — количество точного 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
О; — количество точного 0,1 н. раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование навески, в мл;
0,01285 — фактор пересчета на триаминооксипирими- дин-сульфат;
100 — пересчет в %;
а — навеска в г.
АКРОЛЕИН
СН2 = СН — СНОС3Н4О
М. вес 56,065
Бесцветная жидкость с т. кип. 52,5° при 760 мм, уд. вес 0,841. Хорошо смешивается с органическими растворителями, растворим в воде. Акролеин обладает слезоточивым действием и токсичностью.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
В две одинаковые склянки с притертыми пробками вносят пипеткой по 25 мл раствора гидроксиламина. В одну из склянок помещают около 0,5 г акролеина (точная навеска), взятых в ампулу. Вещество в ампулу вводят при помощи длинного капилляра, хорошо охлаждают ампулу в смеси льда с солью и, не вынимая ампулы, запаивают ее. Ампулу разбивают стеклянной палочкой под раствором гидроксиламина, смывают палочку 3 мл этилового спирта, тотчас закрывают склянку пробкой и оставляют в темноте на 2 часа. Затем в каждую склянку приливают по 10 мл воды, а в контрольный раствор гидрбксиламина — еще 20 мл этилового спирта, чтобы к концу титрования анализируемые пробы имели равный объем, и затем титруют 0,5 н. спиртовым раствором КОН в присутствии метилового красного до окраски, равной нейтральному раствору гидроксиламина.
Содержание акролеина в процентах (х) вычисляют по формуле:
v-0,0028х =,
а
где и— количество 0,5 н. раствора КОН, пошедшее на титрование, в мл;
0,0028— фактор пересчета на акролеин; а— навеска в г.
ДИБРОМПРОПИОНОВЫЙ АЛЬДЕГИД
CH2Br-CHBr-CHOМ вес 215,86
Тяжелая, бесцветная жидкость, уд. вес 2,198. Т. кип. 79—84° (при 5—6 мм 86,4°). Легко растворим в большинстве органических растворителей. В присутствии воды гидролизуется до глицеринового альдегида. Обладает слезоточивым действием.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
В коническую колбу емкостью 100 мл, содержащую 5 мл этилового спирта, берут навеску 0,15—0,16 г вещества (точная навеска), приливают 40—50 мл 10% водного раствора КОН и кипятят с обратным холодильни-
19519513*
195
195
ком в течение 2 часов Раствор количественно перенося^ и колбу емкостью 250—300 мл, подкисляют 20% раствором азотной кислоты, прибавляют 25 мл 0,1 н. раствора AgNO3 и титруют ОД и. раствором роданистого аммония в присутствии железоаммониевых квасцов.
Параллельно ставят контрольный опыт.
Содержание ди-бромпропионового альдегида в процентах (х) вычисляют по формуле:
_ (V—У1)-0,0108-100а
где и— количество точного 0,1 и. раствора NH4CNS, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
О1— количество точного 0,1 н. раствора NH4CNS, пошедшее на титрование навески, в мл;
0,0108—фактор пересчета на дибромпропионовый альдегид;
пересчет в %;
а— навеска в г.
П-НИТРОБЕНЗОИЛГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА
C^HigOfNg М вес 296,244C^HigOfNg М вес 296,244соон
C^HigOfNg М вес 296,244
C^HigOfNg М вес 296,244
"^— CONH — СН2 — СН2 — СНсоон
Бесцветные пластинки. Т. пл. 114—116°; [а]® =16,02 (2% раствор в 2 н NaOH) В воде растворяется умеренно, при нагревании легче, так же и в спирте; нерастворим в эфире.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
Около 0,4 г хорошо растертого вещества (точная навеска) помещают в коническую колбу емкостью 150 мл, в колбу вставляют воронку с укороченной трубкой, через которую пропускают стеклянную палочку. К навеске приливают 150 мл разбавленной НС1 (1:2,5) и постепенно, в три приема, прибавляют 1 г цинковой пыли. Содержимое колбы при этом часто перемешивают. Когда выделение газа очень замедляется, приливают 10 мл НС1 196
(уд. вес 1,19) и прибавляют еще 1 г цинковой пыли. Перед прибавлением соляной кислоты проверяют, все ли вещество полностью растворилось. Если имеются крупные крупинки нерастворенного вещеетва, их растворяют растиранием палочкой. Когда выделение газа почти Прекратится, воронку смывают водой, жидкость фильтруют через ватный тампон в стакан для диазотирования. Колбу, в которой производилось восстановление, промывают водой, сливая ее также на ватный фильтр, который затем промывают водой, употребляя в общей сложности 150 мл воды. К фильтрату прибавляют 2 г бромистого калия и диазотируют при 10—42° 0,1 М раствором NaNOs до появления на иодокрахмальной бумаге четкого синего пятна. При выдержке 5 минут параллельно ставят контрольный опыт и количество 0,1 М раствора нитрита натрия, затраченное на этот опыт, вычитают из числа миллилитров 0,1 М раствора нитрита натрия, затраченного на диазотирование навески.
мл 0,1 М раствора Нитрита натрия соответствует 0,02962 г п-нитробензоилглутаминовой кислоты и 0,01671 г п-нитробензойной кислоты.
Содержание п-нитробензоилглутаминовой кислоты в процентах (xi) вычисляют по формуле:
1(100 —с) «-0,02962]—(100 у.0,02962-0,01671)«-(0,02962 — 0,01671)
где о —количество точного 0,1 М раствора NaNOs. пошедшее на диазотирование навески, в мл: с— процентное содержание примеси (NaCl) и потеря при высушивании;
а — навеска в г.
Содержание п-нитробензойной кислоты в процентах (хг) вычисляют по формуле:
(100 у-0,02962 0,01671) —f«.(100 —с) 0,01671] .
Х2=«.(0,02962 — 0,01671)
Обозначения те же.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХЛОРИСТОГО НАТРИЯ
Около 0,5 г (точная навеска) хорошо растертой п-нитробензоилглутаминовой кислоты высущивают при 50—55° До постоянного веса, затем растворяют навеску
в 100 мл Iсилой воды, прибавляют 10 мл 0,1 н. раствора AgNO3, подкисляют раствор 2 мл 10% раствора азотной кислоты и титруют 0,1 и. раствором NH4CNS в присутствии железоаммониевых квасцов.
Содержание NaCI в процентах (х) вычисляют по формуле:
у-0,005846-100100—6
х = •,
а100
где о— количество точного 0,1 н. раствора AgNO3, пошедшее на титрование, в мл;
0,005846— фактор пересчета на хлористый натрий;
100— пересчет в %;
а— навеска в г;
b— потеря при высушивании, выраженная в %.
П-АМИНОБЕНЗОИЛГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА
соон
C12H14O6N3М. вес 266,26C12H14O6N3М. вес 266,26h2n —/CONH — сн2 — сн2— сн
C12H14O6N3
М. вес 266,26
C12H14O6N3
М. вес 266,26
Ч//।
СООН
Бесцветные иглы, собранные в пучки. Т. пл. 166—167°. Умеренно растворима в воде, плохо—в органических растворителях.
Ио = +27,4 (2% раствор в 2 н. NaOH).
Определение в водном растворе 5 мл раствора, содержащего п-аминобензоилглутаминовую кислоту, помещают в стакан, прибавляют 25 мл 20% НС1, 60 мл воды, 1,5—2,0 г бромистого калия и диазотируют при 10— 14° 0,1 М раствором ПаПОг с йодокрахмальной бумагой. Выдержка 5 минут. Параллельно ставят контрольный опыт.
Содержание п-аминобензоилглутаминовой кислоты в процентах (х) вычисляют по формуле:
(у —у,)-0,0266-100~5
где о— количество 0,1 М раствора NaNOa, пошедшее на титрование навески, в мл;
У! — количество 0,1 М раствора NaNOs, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
0,0266— фактор пересчета на п-аминобензоилглу- таминовую кислоту;
100— пересчет в %;
5 — количество испытуемого раствора в мл.
ВИТАМИН Вс (ФОЛИЕВАЯ КИСЛОТА)
N-4 - {[ (2-АМИНО-4-ОКСИ-ПТЕРИДИЛ) -МЕТИЛ]-АМИНО} -БЕНЗОИЛГЛУТАМИНОВАЯ КИСЛОТА
Фолиевая кислота, витамин Вс, является антианеми- ческим фактором, называется также р-аминобензоилглу таминовой или птероилглутаминовой кислотой.
H=N //Nx
Y Г 1ч
NsAn/-CH2'NH-< >-conh-C-ch2-ch2—соон
В положении 6 в молекуле фолиевой кислоты могут быть разные группировки; глутаминовых остатков в мо-
Физико-химические свойства фолиевой кислоты
Показатель|
Характеристика
Состояние вещества Формула Молекулярный вес Температура плавления
Растворимость
Желтые гигроскопические кристаллы C19Hi9O6N7
441,4
Не установлена
Не растворима в воде, спирте и органических растворителях
Растворяется в разбавленных щелочах и кислотах
Максимум абсорбции (для раствора в
0,1 н. NaOH)
256 mu (Е^м = 590);282 т.п (Б';;,- = 570); 365 т.п (Е}^ =206) При разведении 1 : 600
Е1%см256 тр
= 2,8 — 3,0
Е^%СМ365 тр
Флуоресценция
Абсорбционный максимум флуоресценции продуктов окисления
Голубая у продуктов окисления
470 тц
лекуле .фолиевой кислоты, находящейся в естественных продуктах, может быть от 1 до 7.
Промышленными препаратами фолиевой кислоты является кристаллический продукт, а также натриевая соль фолиевой кислоты, драже и таблетки, содержащие фолиевую кислоту.
Фолиевая кислота Не обладает флуоресценцией, но продукты распада, возникающие в результате ее окисления, приобретают способность флуоресцировать голубым светом. На этом свойстве фолиевой кислоты основаны некоторые методы ее химического определения.
В растворе соляной кислоты фолиевая кислота может восстанавливаться цинковой пылью. Освобождающаяся аминокислота (I) диазотируется нитритом натрия, полученная соль диазония <П) сочетается с N-(l-нaфтил)- этилендиамином дигидрохлоридом (III) в присутствии сульфамата аммония (NH2SO2ONH4) или мочевины (NH2 • СО • NH2). Образуется фиолетовая окраска раствора, интенсивность которой пропорциональна концентрации и может служить для целей количественного определения.
Химизм протекающих в описанно.м методе реакций может быть представлен следующим образом:
H3N М N\ZN\/NS\ Д NZ ~ СН2 - NH - \Ьн— СООН ЛД H3N —H3N-/—)-СООН^° NIN = N -Z VCOOH+"C1IIs/\zHOOG/4/\ZH_y— CONH — C —CH3—CH3— COOH2)-COOH 4-R=J4 - /X- COOHci"- NH —CHS — CH3 — NH3 —* in-NH—CH3-CH3-NHgH3N М N\ZN\/NS\ Д NZ ~ СН2 - NH - \Ьн— СООН ЛД H3N —H3N-/—)-СООН^° NIN = N -Z VCOOH+"C1IIs/\zHOOG/4/\ZH_y— CONH — C —CH3—CH3— COOH2)-COOH 4-R=J4 - /X- COOHci"- NH —CHS — CH3 — NH3 —* in-NH—CH3-CH3-NHg
H3N М N
\ZN\/NS
\ Д NZ ~ СН2 - NH - \
Ьн
— СООН ЛД H3N —
H3N-/—)-СООН^° N
I
N = N -Z VCOOH+"
C1II
s/\z
HOOG/4/\Z
H
_y— CONH — C —CH3—CH3— COOH
2)-COOH 4-R
=J4 - /X- COOH
ci"
- NH —CHS — CH3 — NH3 —* in
-NH—CH3-CH3-NHg
H3N М N
\ZN\/NS
\ Д NZ ~ СН2 - NH - \
Ьн
— СООН ЛД H3N —
H3N-/—)-СООН^° N
I
N = N -Z VCOOH+"
C1II
s/\z
HOOG/4/\Z
H
_y— CONH — C —CH3—CH3— COOH
2)-COOH 4-R
=J4 - /X- COOH
ci"
- NH —CHS — CH3 — NH3 —* in
-NH—CH3-CH3-NHg
Этот метод принят в XV издании Фармакопеи США и в некоторой модификации принят для МРТУ на витаминные препараты.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯВ КРИСТАЛЛИЧЕСКОМ ПРОДУКТЕ
Составление калибровочного графика 0,05 г п-амиио- бензойной кислоты (т. пл. 186—187°, с содержанием не ниже 99%) отвешивают в стакан емкостью 15—20 мл и растворяют в спирте. Раствор переносят в мерную колбу емкостью 50 мл, стакан промывают несколько раз спиртом' (общее количество спирта 25 мл), раствор доводят в колбе водой до метки и перемешивают: 1 мл полученного раствора помещают в мерную . колбу емкостью 250 мл, туда же прибавляют 175 мл воды, 45 мл разведенной НС1, 2,5 мл раствора желатины, доводят до метки водой и перемешивают. В 1 мл раствора содержится 0,004 мг п-аминобензойной кислоты.
В 5 колб емкостью 15—20 мл помещают- отмеренные пипеткой 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 и 2,5 мл приготовленного раствора и доводят объем в каждой колбе до 5 мл водой. В каждую колбу добавляют по 1 мл разведенной НС1, по 1 мл 0,1% раствора нитрита натрия, хорошо перемешивают и оставляют на 5 Минут. Затем в' каждую колбу приливают по 1 мл 12% водного раствора мочевины, перемешивают и вновь оставляют на 5 минут. В каждую колбу добавляют по 1 мл 0,1% водного раствора N-( 1-нафтил)-этилендиа^мина дигидрохлорида, по 6 мл воды, перемешивают и точно через 10 минут измеряют оптическую плотность растворов на электрофотоколориметре со светофильтром 550 тц (зеленый) в кюветах с толщиной слоя 3 см. Для построения калибровочного графика на оси абсцисс откладывают количество пара- аминобензойной кислоты в миллиграммах, а на оси ординат наносят показания гальванометра. График должен иметь вид прямой линии.
Определение свободной и связанной п-аминобензоил- глутаминовой кислоты. Точную навеску препарата в количестве 0,049—0,050 г отвешивают в стакане емкостью 15—20 мл, смачивают несколькими каплями воды и рас-
■I воряют в 0,1 н. растворе NaOH. Раствор переносят в мерную колбу емкостью 50 мл, стакан промывают несколько раз 0,1 н. раствором NaOH, сливая промывную жидкость в ту же колбу, объем раствора доводят 0,1 н. раствором NaOH до метки и хорошо перемешивают. Из полученного раствора отбирают 1 мл в мерную колбу емкостью 100 мл, добавляют 75 мл воды, 18 мл разведенной НС1, 1 мл раствора желатины, доводят до метки водой и перемешивают (раствор А).
Переносят 70 мл раствора А в коническую колбу емкостью 150 мл, прибавляют 0,5 г цинковой пыли и оставляют на 15 минут при частом перемешивании раствора. Раствор фильтруют через сухой фильтр в сухую колбу, отбрасывая первые 15—20 мл фильтрата. Из фильтрата отбирают 2 мл, переносят в колбу емкостью 15—20 мл, прибавляют 3 мл воды, 1 мл разведенной НС1 и далее поступают, как указано выше (начиная со слов: «1 мл 0,1% раствора нитрита натрия...»).
Определение свободной п-аминобензоилглутаминовой кислоты. Переносят 2 мл раствора А в колбу емкостью 15—20 мл, добавляют 3 мл воды, 1 мл разведенной соляной кислоты и далее поступают, как описано при определении общего количества п-аминобензоилглутаминовой кислоты, начиная со слов: «1 мл 0,1% водного раствора нитрита натрия...»
Вычисление содержания фолиевой кислоты в препарате. Из показателя плотности, соответствующего содержанию общей п-аминобензоилглутаминовой кислоты, вычитают показатель плотности, соответствующий свободной п-аминобензоилглутаминовой кислоте, и по калибровочному графику находят содержание связанной п-аминобензоилглутаминовой кислоты в испытуемом растворе в миллиграммах.
Содержание фолиевой кислоты в препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
_ с-50-100-3,22-100
Х= 1-2-а-1000
где с — содержание фолиевой кислоты, найденноепо калибровочному графику, в мг;
а — навеска в г;
объем первого разведения в мл;
объем второго разведения в мл;
— количество раствора первого разведения,взятое для второго разведения, в мл;
— количество раствора первого разведения, взятое на определение, в мл;
3,22 — постоянный коэффициент;
пересчете %;
1000 — пересчете г.
При сокращении формула приобретает следующее значение:
с- 250-3,22х =а
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В ТАБЛЕТКАХ С ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТОЙИ ДРУГИМИ ВИТАМИНАМИ*
Точную навеску порошка растертых таблеток около 5 г (при содержании в 1 таблетке 1 мг фолиевой кислоты) или около 2,5 г (при содержании 2 мг фолиевой кислоты) помещают в стакан емкостью 50 мл, смачивают небольшим количеством воды и растворяют в 10 мл 0,1 н. раствора едкого натра. Раствор переносят в мерную колбу емкостью 50 мл, промывают стакан несколько раз 0,1 н. раствором едкого натра, сливая его в ту же колбу, объем раствора в колбе доводят 0,1 н. раствором едкого натра до метки, тщательно перемешивают и фильтруют, отбрасывая первые порции фильтрата.
мл фильтрата переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и далее поступают, как описано при определении свободной и связанной п-аминобензоилглутаминовой кислоты, начиная со слов: «добавляют 75 мл воды...» и т. д. Содержание фолиевой кислоты в миллиграммах в 1 таблетке (х) вычисляют по формуле:
(с — с,)-50-100.3,22-dх =,
«•Ь2
где с — содержание суммы свободной и связанной п-аминобензоилглутаминовой кислоты в мл;
С[— содержание свободной п-аминобензоилглутаминовой кислоты в мг;
а— навеска в г;
50 и 100— разведение в мл;
d— средний вес 1 таблетки в г;
1; 2; 3,22— см. выше.
МРТУ-42 № 2839—61.
Методы контроля
в производстве витамина Вхг
ВВитамин В12, цианокобаламин, является ан- тианемическим фактором. В естественных
В
В
продуктах присутствует ряд аналогов цианокобаламина;
некоторые из них не являются биологически активными соединениями. Бернхауер и Фридрик (цит. по А. В. Труфанову, 1955) предложили для всех соединений, относимых к группе витаминов В12, следующую классификацию:
Витамин Biz
Полные кобаламины (в молекулеприсутствует нуклеотидная часть)
НуклеотидыНуклеотиды
(бензимидазол)(пурины)
Истинные кобал- Псевдокобаламиныамины
II
При pH = 7,0 (моноцианокомплексы красного цвета)
Макс. Х=361 тц
II
Бензимидазоловые Пуриновые
Биологически активны Активны для микробов и цыплят только для (протеиновый фактор) микробов н человека (антианемн- ческий фактор)
Неполные этикобал- амины (в молекуле отсутствует нуклеотидная часть)Неполные этикобал- амины (в молекуле отсутствует нуклеотидная часть)При pH = 7,0 (дицианокомплексы фиолетового цвета)Макс абсорбции X = = 376 тцПри pH = 7,0 (дицианокомплексы фиолетового цвета)Макс абсорбции X = = 376 тцБиологической актив-ностью нё обладаютБиологической актив-ностью нё обладаютФизиблогическое значение витамина Big для организма очень'еелико.
Неполные этикобал- амины (в молекуле отсутствует нуклеотидная часть)
Неполные этикобал- амины (в молекуле отсутствует нуклеотидная часть)
При pH = 7,0 (дицианокомплексы фиолетового цвета)
Макс абсорбции X = = 376 тц
При pH = 7,0 (дицианокомплексы фиолетового цвета)
Макс абсорбции X = = 376 тц
Биологической актив-ностью нё обладают
Биологической актив-ностью нё обладают
Различные формы витамина В12 получили в настоящее время следующие обозначения:
Витамин Ви— цианокобаламин,
» Ви— тидроксокобаламин (выделен из культу
ральной жидкости стрептомицетов),
»ВцЬ—тидроксокобаламин,
»В12с—ннтритокобаламин (выделениз культураль
ной жидкости стрептомицетов),
»Bijd—тидроксокобаламин,
»В12$—выделен из фекалий различных животных,
»В 12m—выделен из фекалий свиньи,
Псевдовитамин В12 — выделен из содержимого рубца жвачных
животных
Структурная формула витамина Bi2 (цианокобаламина) следующая:
мн?сон2с
НОСН2 О
ПоказательПоказательСостояние веществаБрутто-формула Молекулярный вес РастворимостьОптическая активностьАбсорбционный максимумТемпература плавленияБиологическая активностьСостояние веществаБрутто-формула Молекулярный вес РастворимостьОптическая активностьАбсорбционный максимумТемпература плавленияБиологическая активность[“Id= —59+9278mp/pi% см= И5);361mp/р1% см= 207);550mp1^1 см= 63)При190—215°— потемнение;при[“Id= —59+9278mp/pi% см= И5);361mp/р1% см= 207);550mp1^1 см= 63)При190—215°— потемнение;при300°—разлагаетсяДля L. easel=0,000013 у на 1 мл средыДля крыс—0,063 у300°—разлагаетсяДля L. easel=0,000013 у на 1 мл средыДля крыс—0,063 у
Показатель
Показатель
Состояние вещества
Брутто-формула Молекулярный вес Растворимость
Оптическая активность
Абсорбционный максимум
Температура плавления
Биологическая активность
Состояние вещества
Брутто-формула Молекулярный вес Растворимость
Оптическая активность
Абсорбционный максимум
Температура плавления
Биологическая активность
[“Id
= —59+9
278
mp
/pi% см
= И5);
361
mp
/р1% см
= 207);
550
mp
1^1 см
= 63)
При
190—215°
— потемнение;
при
[“Id
= —59+9
278
mp
/pi% см
= И5);
361
mp
/р1% см
= 207);
550
mp
1^1 см
= 63)
При
190—215°
— потемнение;
при
300°—разлагается
Для L. easel=0,000013 у на 1 мл среды
Для крыс—0,063 у
300°—разлагается
Для L. easel=0,000013 у на 1 мл среды
Для крыс—0,063 у
Физико-химические свойства цианокобаламииа
Характеристика
Кристаллы фиолетово-красного цвета
СщНззОцМцРСо
1355,42
Хорошо растворяется в воде и этаноле, не растворяется в хлороформе, эфире, ацетоне
» цыплят—6 у на 1 кг корма » человека—10—100 у перорально »» —3 у внутривенно
Витамин В12 в настоящее время получается главным образом из естественных источников (отходы производства антибиотиков, биосинтез Ac. propionicum, а также извлечение концентратов из активного ила водоочистительных станций — для целей животноводства и птицеводства).
Промышленными препаратами витамина Вщ являются кристаллический препарат и его растворы для парентерального применения (розового цвета), биомасса, содержащая витамин В12, для животноводства, а . также драже и таблетки, содержащие комплекс витаминов группы В, в том числе и витамин Вщ *.
Существующие методы химического определения витамина В12 основаны главным образом на измерении абсорбции света в ультрафиолетовой части спектра.
1 Следует указать на несовместимость витамина В12 с витамином С, который способствует разрушению молекулы витамина Bi2. 206
Наиболее характерным для цианокобаламина является максимум абсорбции при Х=361 тр, (рис. 28). По-види- мому, большинство из известных аналргов цианокобал
амина не дает характерного поглощения на этой длине волны.
Определение витамина В12 в естественных продуктах, из которых он выделяется, осложняется необходимостью высокой степени очистки вытяжек от посторонних примесей.
ОПРЕДЕЛЕНИЕВ КРИСТАЛЛИЧЕСКОМПРЕПАРАТЕ(Госфармакопея СССР,IX изд.)
Рис. 28. Абсорбционная кривая цианокобаламина в этаноле (по Е. Кноблоху).Рис. 28. Абсорбционная кривая цианокобаламина в этаноле (по Е. Кноблоху).Около 0,02 г препарата (точная навеска) растворяют в воде в мерной колбе емкостью 500 мл и доводят водой до метки. Определяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 361 мц в кювете с толщиной слоя 1 см, употребляя в качестве контрольного раствора воду.
Рис. 28. Абсорбционная кривая цианокобаламина в этаноле (по Е. Кноблоху).
Рис. 28. Абсорбционная кривая цианокобаламина в этаноле (по Е. Кноблоху).
Содержание витамина Bi2 в процентах (х) вычисляют по формуле:
с-500-100,207-100-д
где с— оптическая плотность испытуемого раствора;
207 — Е , *м = 36Г шц (водный раствор) чистого цианокобаламина;
а — навеска в г;
500 — разведение в мл;
—• постоянный коэффициент;
— пересчет в %.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В РАСТВОРАХСпектрофотометрический метод
Растворы, содержащие в 1 мл 0,03 мг, и растворы, содержащие 0,1; 0,2; 0,5 или 1 мт в 1 мл, предварительно разбавленные водой в отношении 1:2, 1:4, 1:10 и 1:20, помещают в кювету спектрофотометра с толщиной слоя в 1 см и определяют оптическую плотность при длине волны 361 шц.
Содержание цианокобаламина в миллиграммах в 1 мл (х) вычисляют по формуле:
5-h).v
где о — разведенйе;
10 — постоянный коэффициент;
найденная оптическая плотность.
Остальные обозначения см. выше.
Колориметрический метод
Испытуемый раствор наливают в кювету фотоколориметра с толщиной слоя 1—2 см и находят величину оптической плотности раствора (зеленый светофильтр). По найденной величине, пользуясь калибровочным графиком, устанавливают содержание витамина В^ в 1 мл раствора прямым путем.
Ддя построения калибровочного графика берут растворы чистого кристаллического цианокобаламина, содержащие 0,02; 0,025; 0,03; 0,035; 0,04; 0,045; 0,05; 0,055; 0,065 и 0,07 мг в 1 мл и определяют 'оптическую плотность этих растворов.
На оси абсцисс откладывают содержание витамина В12, а на оси ординат—соответствующие величины оптической плотности.
lBlBетоды анализа витамина Нх
lB
lB
итамин Hi, или пара-аминобензойная кислота, имеет строение:
H2N -/ соон
Пара-аминобензойная кислота участвует в образовании молекулы витамина Вс, или фолиевой кислоты, а также входит в состав некоторых других соединений в растительных и животных тканях, где она и встречается преимущественно в связанном состоянии.
Физико-химические свойства витамина Hf
Показатель
Характеристика
Состояние вещества
Желтоватые, с * бледно- розовым оттенком кри-
Формула
Молекулярный вес Температура плавления
Растворимость
сталлы
C7H7O2N
137,14 185—187°
В 100 мл при комнатной температуре растворяется: в воде—0,34 г, в этаноле—1,3 г, в этилацетате — 7,0, в эти-
Абсорбционный максимум
ловом эфире — 8,2 275 тц
14 В. А Девятиин
Промышленность выпускает синтетическую пара- аминобензойную кислоту, достаточно точно анализируемую общепринятыми методами алкалиметрического титрования.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В КРИСТАЛЛИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ
Точную навеску высушенной в течение 4 часов в эксикаторе над H2SO4 пара-аминобензойной кислоты в количестве 0,10—0,15 г растворяют в воде, подогретой до 50—60° в конической колбе. Полученный раствор титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии фенолфталеина до появления розового окрашивания. Содержание пара- аминобензойной кислоты в препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
«■0,0137-100х _а
где и— количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,0137— количество пара-аминобензойной кислоты, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. рас
твора NaOH, в г;
а — навеска в г.
. Примечание. Раствор препарата проверяют на наличие хлор- иона по реакции с AgNO3. В случае образования мути или осадка (что свидетельствует о загрязнении препарата НС1) в отдельной пробе определяют аргентометрическим путем содержание НО. Из полученного значения процентного содержания пара-аминобензойной кислоты (л) вычитают примесь в процентах НС1
етоды контроля
в производстве витамина С (аскорбиновой кислоты)
D-СОРБИТ
Ссн14о6М. вес 182,0Ссн14о6М. вес 182,0СН2ОН нсх!:н носн
Ссн14о6
М. вес 182,0
Ссн14о6
М. вес 182,0
носн
носн
сн2он
Однородный бесцветный мелкокристалличе- ский порошок, кристаллизуется с 1 или '/г молекулой воды. Т. пл. 110° (для безводного). Очень легко растворим в’воде и практически нерастворим в спирте. Может выпускаться так называемый плавленный сорбит в виде платок, напоминающих парафин, с бледно-зеленоватым оттенком. Обладает сладким вкусом и применяется в питании диабетиков как замена сахара.
АНАЛИЗ КРИСТАЛЛИЧЕСКОГО СОРБИТА
В основе метода лежит свойство D-сорбита образовывать с бензальдегидом продукт конденсации, дибензаль- дегид-сорбит, аморфный бесцветный продукт с т. пл.
1б2°. Реакция протекает в присутствии серной кислоть! на холоду. Этот метод был предложен Вердером и Мартини, описан применительно к анализу растительных веществ Н. Н. Ивановым (1946) и в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ модифицирован Л. Н. Кравчиной применительно к кристаллическому продукту.
Навеску сорбита в количестве около 0,25 г отвешивают на аналитических весах в химический стакан емкостью 150 мл, добавляют 1 мл H2SO4 (разведенной водой в отношении 1:1) и 0,5 мл бензальдегида. Смесь тщательно перемешивают в течение 5 минут и оставляют на 18—20 часов при температуре не выше +3°.-За это время образуется пастообразная розовато-белая масса, конденсация сорбита с альдегидом заканчивается. К образовавшемуся продукту конденсации добавляют 5 мл охлажденной воды, содержимое стакана растирают палочкой и нейтрализуют добавлением 1,5 г безводного Na2CO3. Смесь перемешивают, оставляют на 1 час при температуре не выше 3°, затем содержимое стакана нагревают до кипения, кипятят в течение 1—2 минут, охлаждают струей холодной воды и фильтруют через взвешенный тигель Гуча или Шотта при слабом разрежении. Осадок на фильтре промывают водой и высушивают при 90—100° до постоянного веса.
Содержание сорбита в образце в процентах (х) вычисляют по формуле:
_ ' 6-1001,968-а
где b — вес полученного дибензальдегида-сорбита в г; .
1,968 — коэффициент пересчета веса осадка на сорбит;
а — навеска в г;
пересчет в %.
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПО МЕДНОМУ КОМПЛЕКСУ
Навеску вещества в количестве около 1 г помещают в мерную колбу емкостью 200 мл и растворяют в 15— 20 мл воды. Колбу с содержимым помещают на водяную баню, нагретую до 30°, приливают 16 мл 15% раствора NaOH и затем при перемешивании постепенно добавля- 212
ют 30 мл 10% раствора сернокислой меди. По мере того как медь потребляется на образование комплекса с сорбитом, раствор приобретает синий цвет, а избыточное количество меди образует со щелочью гидрат окиси меди, выпадающий в осадок. Как только прилито указанное количество раствора сернокислой меди, содержимое колбы доводят водой до метки и оставляют для осаждения гидрата окиси меди (приблизительно на 15—20 минут). Затем осторожно, не взмучивая осадка, пипеткой отбирают из колбы прозрачный раствор над осадком, фильтруют его, отбирают 25 мл фильтрата в коническую колбу с притертой пробкой емкостью 200—250 мл, подкисляют 25 мл 20% раствора H2SO4, приливают 20 мл 10% раствора KJ, быстро взбалтывают и выделившийся йод тотчас оттитровывают 0,1 н. раствором Na2S2O3 в присутствии раствора крахмала до исчезновения синего окрашивания.
Содержание сорбита (а также маннита и глюкозы, если они присутствуют в испытуемом образце) в процентах (х) вычисляют по формуле:
«•0,0091-100% =,
a-v2
где и — количество точного 0,1 н. раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование, в мл;
0,0091 — количество сорбита, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора Na2S2O3, в г;
Ui— объем, до которого доведена навеска, в мл; а— навеска в г;
1*2 — объем фильтрата, взятый на титрование, в мл;
пересчет в %.
В отдельной навеске определяют методом Бертрана или Лейна и Эйнона процентное содержание глюкозы (если она присутствует) и количество ее (в процентах) вычитают из полученного в расчете значения. Разность приходится на содержание сорбита (и маннита) в процентах ’.
В кристаллическом сорбите практически майнит и глюкоза не обнаруживаются. Эти определения имеют значение для технических растворов сорбита.
АНАЛИЗ СОРБИТА В РАСТВОРЕ
Определение сухих веществ
(методы разработаны Б И Идельсономи А Д. Поспеевым на I Ленинградском витаминномзаводе)
Определение сухих веществ в растворе сорбита производят при помощи рефрактометра. На рис. 29 изображен рефрактометр-сахариметр Киевского завода.
Рис 29 Рефрактометр-сахариметр Киевского завода а — шкала (внутри окошка) 6 — термо метр в — окуляр г — зеркало 8 — призмы
По полученным показаниям рефрактометра определяют содержание сухих веществ, пользуясь специальной таблицей (измерение производят при 20°)
Определение процентного содержания
Многие органические вещества обладают свойством отклонять плоско поляризованный луч света на величину, которая измеряется углом вращения. Определение 214
угла вращения производится при помощи поляриметра (рис 30). В табл 8 приведены удельные вращения некоторых веществ
Отбирают пипеткой 50 мл испытуемого раствора сорбита в мерную колбу емкостью 100 мл, пипетку смывают водой в ту же колбу, добавляют 0,5 мл раствора азотнокислого свинца и 0,5 мл 5% раствора емкого натра
Рис 30 Схема поляриметраРис 30 Схема поляриметраб — источник света б — конденсатор в — неподвижный ииколь (поляризатор) с — испытуемый раствор д — подвижный ииколь (анализатор) е — окуляри шкалаб — источник света б — конденсатор в — неподвижный ииколь (поляризатор) с — испытуемый раствор д — подвижный ииколь (анализатор) е — окуляри шкала
Рис 30 Схема поляриметра
Рис 30 Схема поляриметра
б — источник света б — конденсатор в — неподвижный ииколь (поляризатор) с — испытуемый раствор д — подвижный ииколь (анализатор) е — окуляр
и шкала
б — источник света б — конденсатор в — неподвижный ииколь (поляризатор) с — испытуемый раствор д — подвижный ииколь (анализатор) е — окуляр
и шкала
Таблица 8
Удельное вращение некоторыхвеществ
НаименованиеНаименованиемм20 D20 D
Наименование
Наименование
м
м
20 D
20 D
Сахароза Мальтоза Глюкоза Фруктоза Рафиноза Рамноза Маннит D сорбит L сорбозаСахароза Мальтоза Глюкоза Фруктоза Рафиноза Рамноза Маннит D сорбит L сорбоза
Сахароза Мальтоза Глюкоза Фруктоза Рафиноза Рамноза Маннит D сорбит L сорбоза
Сахароза Мальтоза Глюкоза Фруктоза Рафиноза Рамноза Маннит D сорбит L сорбоза
+66,5
+ 135,5
+52,8
—93,3—97,17
L104,5
+9,43
—0,244
—1,7
—43,65
Объем раствора в колбе доводят водой до метки и энергично встряхивают в течение 1 минуты. Смеси дают отстояться и фильтруют через воронку с широким гордом Прозрачным фильтратом заполняют поляриметрическую трубку длиной 2 дм, предварительно ополоснутую этим же раствором, и поляризуют.
Содержание сорбита в растворе в граммах на 100 мл (х) вычисляют по формуле:
X = 0,969-а — 0,32-Р,
где Р— показания поляриметра;
а— содержание сухих веществ в растворе в г на 100 мл;
0,969 и 0,32— постоянные коэффициенты.
Примечание. Указанная формула приведена для поляриметра со шкалой Вентцке
Качественная реакция на глюкозу
В пробирку, содержащую 1—2 мл испытуемого раствора сорбита, приливают 2—3 капли раствора альфа- нафтола и по стенке пробирки осторожно 0,5 мл конценг- рированной H2SO4, избегая смешивания растворов. В присутствии глюкозы на границе жидкостей появляется фиолетовое, а при содержании около 0,1% глюкозы буреющее кольцо.
Определение содержания сорбита в раствореочищенного сорбита
Испытуемый раствор без разбавления и осветления фильтруют, фильтратом заполняют поляриметрическую трубку длиной 2 дм и поляризуют, хак описано выше.
Содержание сорбита в пересчете на сухое вещество (х) вычисляют по формуле:
Р
х = 96,9— 32 — ,а
где 96,9 и 32 — постоянные коэффициенты.
Качественное испытание на присутствие никеля
(по прописи А. Д. Лебедева, лаборатория Йошкар-Олинского витаминного завода)
К 5 мл раствора сорбита добавляют 5—8 капель 10% раствора HNO3, смесь нагревают до кипения; после охлаждения к ней добавляют 0,5 мл 10% раствора ам-
миака и 3—5 капель 1 % спиртового раствора диметил- глиоксима. При стоянии в течение 5 минут при отсутствии в растворе никеля не должно появиться розового окрашивания.
L-СОРБОЗА
СН2ОН
,С — ОН
С6Н13ОЬМ. вес 180,16С6Н13ОЬМ. вес 180,16но —с —н
С6Н13ОЬ
М. вес 180,16
С6Н13ОЬ
М. вес 180,16
I н — с —он но —с —н
сн2
Бесцветные кристаллы ромбической формы. Т. пл. 160—16101. Обладает сладким вкусом; легко растворима в воде, очень трудно — в этиловом спирте и нерастворима в эфире. Восстанавливает раствор Фелинга уже на холоду.
ПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
(разработан Б. И. Идельсоном, Л. Л. Петровойи Б. Б. Кантор в лаборатории / Ленинградскоговитаминного завода)
Точную навеску 19,8 г сорбозы растворяют в мерной колбе емкостью 100 мл в теплой воде (заполняя колбу на 4/s объема); после растворения навески содержимое колбы охлаждают до 20°, добавляют в колбу 1 мл раствора азотнокислого свинца и 1 мл раствора едкого натра (см. методы анализа сорбита).
Содержимое колбы доводят водой до метки и энергично взбалтывают в течение 1 минуты. Смеси дают отстояться, фильтруют через воронку с широким горлом, фильтратом заполняют поляриметрическую трубку дли-
1 В литературе встречаются и другие данные (165°). См. Спутник химика. Т, 2. ОНТИ, 1935.
ной 2 дм, предварительно ополоснутую тем же фильтратом, и поляризуют вместе с заранее вложенной в ложе поляриметра кварцевой трубкой.
Содержание сорбозы в процентах в испытуемом образце (х) вычисляют по формуле:
х = (К — Руч,
где К — величина угла вращения кварцевой трубки (постоянная);
Р — показание поляриметра;
коэффициент пересчета на нормальную навеску.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОРБОЗЫ В РАСТВОРАХ
(по прописи Б. И. Идельсона, Я. А. Петровойц Б. Б. Кантор, лаборатория / Ленинградскоговитаминного завода)
Отбирают пипеткой 50 мл испытуемого раствора в мерную колбу емкостью 100 мл, туда же добавляют по 1 мл растворов азотнокислого свинца и едкого натра, содержимое колбы доводят воцой до метки, встряхивают, дают смеси отстояться, фильтруют и фильтрат поляризуют в трубке длиной 2 дм.
Содержание сорбозы в граммах на 100 мл раствора (х) вычисляют по формуле:
х = 0,396-(АГ — Р)Я,
где 0,396— коэффициент соответствия между 1° шкалы поляриметра и содержанием сорбозы в г на 100 мл;
К — величина угла вращения кварцевой трубки
Кварцевую трубку с известным углом вращения вправо применяют для расширения диапазона левой шкалы поляриметра с двойной компенсацией Величина угла вращения кварцевой трубки должна составлять не менее 30°,
Р — показание поляриметра;
разведение раствора.
Примечание. Указанная формула приведена для поляриметра со шкалой Вентцке
ДИАЦЕТОНСОРБОЗА
СиН19О6М вес 260СиН19О6М вес 260
СиН19О6
М вес 260
СиН19О6
М вес 260
Диацетонсорбоза кристаллизуется из петролейного эфира в виде бесцветных пластинок с т. пл. 77—78°. Хорошо растворима в воде, спирте, серном эфире, труднее— в бензине и петролейном эфире; очень плохо растворима в хлороформе. В технической диацетонсорбозе может присутствовать моноацетонсорбоза. Она также хорошо растворима в воде и спирте, плохо растворяется в серном и совсем не растворяется в петролейном эфире. Ацетоновые группы у моноацетонсорбозы могут находиться в положениях 2 и 3 или 1 и 2; т. пл. этих соединений 93 и 143°.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАЦЕТОНСОРБОЗЫ ПО АЦЕТОНОВЫМГРУППАМ
(метод разработан в Научно-исследовательском химико-фармацевтическом институте А. К- Руженцовой,Р. И. Крамаровой и Н. С. Горяйновой)
В основу метода положено отщепление кислотой ацетоновых групп и определение ацетона йодометрическим путем [Мессингер (Messinger, 1888, 1934, 1946)].
При этом протекают реакции в следующем направлении:
I С/I
H2SO4H2SO42CH3COCH32CH3COCH3о I ХО — с —н
H2SO4
H2SO4
2CH3COCH3
2CH3COCH3
Н3СI
с —о сн,
Н2С—ХСН3
Освобождающийся ацетон определяется йодометрическим путем:
J2 + 2КОН -> KJO 4 KJ 4 Н2О
СН3СОСН3 + 6KJO -> CH8COCJ3 4- 3KJ 4- ЗКОН
CH3CC CJ3 4 КОН -> СН3СООК 4- СШ3
6KJO 4- 6KJ 4 12НС1 -> 6J2 4 12КС1 4 6Н2О
Выделяющийся при подкислении свободный йод от- титровывается гипосульфитом натрия.
Анализ чистой диацетонсорбозы
Точную навеску не более 0,2 г диацетонсорбозы помещают в мерную колбу с притертой пробкой емкостью 100 мл, растворяют в 20 мл воды, прибавляют 25 мл 60% раствора H2SO4, колбу закрывают пробкой и оставляют на ночь при 20—25°. За это время от диацетонсорбозы количественно отщепляется ацетон. После этого содержимое колбы доводят до метки водой и тщательно перемешивают. Из полученного раствора переносят 10 мл в коническую колбу с притертой пробкой, туда же добавляют 25 мл воды, раствор нейтрализуют щелочью по фенолфталеину. К нейтральному раствору прибавляют 20 мл 0,1 н. раствора йода (из бюретки) и 15 мл нормального раствора NaOH (при помешивании). Колбу закрывают пробкой и оставляют точно на 4 минуты, после чего к содержимому колбы приливают 16 мл нормального раствора H2SO4 и выделившийся йод тотчас оттит- ровывают 0,1 н. раствором Na2S2O3.
Одновременно ставят холостой опыт; из числа миллилитров гипосульфита, пошедшего на титрование холо- 220
CtOrO опыта, вычитают число миллилитров гипосульфита, пошедшего на титрование испытуемой пробы. Разность соответствует числу миллилитров йода, вступившего в реакцию с ацетоном.
Содержание диацетонсорбозы в процентах (х) вычисляют по формуле:
V-О,000967-2,2414-1000х =—,
а
где и—количество точного 0,1 н. раствора йода, вступившее в реакцию, в мл;
0,000967—количество ацетона, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора йода, в г;
коэффициент пересчета на диацетонсорбозу;
1000 — постоянный коэффициент;
а — навеска в г.
Определение свободного ацетонав техническом продукте
Точную навеску около 0,2 г технической диацетонсорбозы помещают в коническую колбу с притертой пробкой емкостью 250—300 мл, прибавляют 40—50 мл воды, 20 мл 0,1 н. раствора йода (из бюретки), 15 мл нормального раствора NaOH, закрывают колбу пробкой и точно через 4 минуты добавляют 16 мл нормального раствора H2SO4 и выделившийся йод тотчас оттитровывают 0,1 н. раствором гипосульфита натрия. Параллельно ставят холостой опыт. Из числа миллилитров гипосульфита, пошедшего на титрование холостого опыта, вычитают число миллилитров гипосульфита, пошедшего на титрование испытуемой пробы. Разность соответствует числу миллилитров йода, вступившего в .реакцию с ацетоном.
Содержание свободного ацетона в процентах (х) вычисляют по формуле:
v-0,000967-100
х =,
а
где и— количество точного 0,1 н. раствора йода, вступившее в реакцию, в мл;
0,000967 — см. выше;
пересчета %;
а — навеска в г.
Определение моноацетонсорбозы в техническом продукте
Метод основан на извлечении диацетонсорбозы из смеси петролейным эфиром, в котором моноацетонсорбоза практически нерастворима, и дальнейшем определении в остатке моноацетонсорбозы по ацетоновым группам.
Точную навеску около 0,2 г технической диацетонсорбозы помещают во взвешенный вместе с палочкой стакан емкостью около 50 мл и экстрагируют диацетон- сорбозу при нагревании на водяной бане (при 40—50°) отдельными порциями (по 5 мл) петролейного эфира при тщательном растирации стеклянной палочкой содержимого стакана. Эфирные вытяжки сливают. Извлечение петролейным эфиром производят до тех пор, пока капля эфирного экстракта перестанет оставлять на часовом стекле пятно по испарении эфира. Остаток в стакане сушат в вакууме и взвешивают. Затем остаток растворяют в мерной колбе емкостью 100 мл в 20 мл воды, прибавляют 25 мл 60% раствора H2SO4, колбу закрывают пробкой и оставляют на ночь. В дальнейшем поступают, как описано в методике определения диацетонсорбозы.
Процентное содержание ацетона (xi) вычисляют по формуле.
и 0,000967-1000Xi —,
а
где у— количество точного 0,1 н. раствора йода, вступившее в реакцию, в мл;
0,000967 — см. выше;
а— навеска технической диацетонсорбозы в г; 1000— постоянный коэффициент.
Содержание моноацетонсорбозы в технической диа- цетонсорбозе в процентах (х2) вычисляют по формуле: х2 = 3,7931 -xj,
где 3,7931 — коэффициент пересчета на моноацетонсор- бозу;
X] — содержание ацетона в пробев %.
Определение общего количества ацетона
Определение производйтся, как описано ранее (см. анализ чистой диацетонсорбозы).
Общее количество ацетона в пробе в процентах (x-j рассчитывают по формуле:
у.О,000967-1000х3 =а
Обозначения см. выше.
Расчет процентного содержания диацетонсорбозы в испытуемом продукте (х4) производят по формуле:
л4 = х3 — (х, + х)-2,2414
Обозначения см выше
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАЦЕТОНСОРБОЗЫ ПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИММЕТОДОМ
(разработан Б. И. Идельсоном а Л, А. Ростачевойв лаборатории I Ленинградского витаминного завода)
Метод основан на извлечении диацетонсорбозы из технического продукта, содержащего моно- и диацетон- сорбозу, хлороформом (в котором, по данным исследований авторов, моноацетонсорбоза не растворяется) с последующим поляриметрическим определением. Исходным положением при этом является то, что удельное вращение диацетонсорбозы в ацетоне при С=1,38 г в 100 мл составляет {а] ^ = —18,1° [по данным Рейхштей- на и Грюсснера (Reichstein, Griissner, 1934)], а раствор диацетонсорбозы в хлороформе при С = 20 г в 100 мл и при 20°, при длине трубки в 1 дм составляет [а]^ = = —6,3° (по данным Б. И. Идельсона и Л. А. Роста- чевой).
Определение в кристаллическом продукте
Отвешивают на технохимических весах точно 27,5 г технической диацетонсорбозы (0,1 нормальной навески), растворяют is 10—12 мл воды (при нагревании) и возможно меньшим количеством воды переносят, без потерь, в узкогорлую колбу емкостью 200—250 мл. В колбу добавляют около 1 г активированного угля и по 25 мл растворов азотнокислого свинца и едкого натра (см. поляриметрический метод определения сорбозы). Содер- жммое колбы энергично взбалтывают в течение 1 мину-
ты и после пятиминутного отстаивания фильтруют через двойной бумажный складчатый фильтр. Колбу и фильтр промывают небольшим количеством воды и промывную жидкость присоединяют к фильтрату. Фильтрат количественно переносят в делительную воронку, добавляют туда же хлороформ и экстрагируют диацетонсорбозу, повторяя экстракцию 4 раза, каждый раз с помощью 25 мл хлороформа.
Хлороформные экстракты соединяют, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, объем раствора в колбе доводят хлороформом до метки. Поверх метки в колбу приливают дополнительно по 1 мл растворов азотнокислого свинца и щелочи. Содержимое колбы энергично встряхивают в течение 1 минуты и отстаивают в течение 5 минут.
Верхний водный слой из воронки сливают (при этом может быть слито некоторое количество хлороформного слоя, что не имеет значения), хлороформный слой быстро фильтруют и фильтратом заполняют поляриметрическую трубку длиной 2 дм. Трубку с раствором выдерживают в поляриметре 2 минуты и поляризуют (со включенным стеклянным светофильтром).
Содержание диацетонсорбозы в процентах в образце (х) вычисляют по формуле:
х = 10-Р,
где Р — показание поляриметра;
10— постоянный коэффициент.
Определение в растворе
50 мл раствора диацетонсорбозы переносят в узкогорлую колбу емкостью 100 мл, добавляют около 0,5 г активированного угля и по 10 мл растворов азотнокислого свинца и щелочи. Далее поступают, как описано выше.
Содержание диацетонсорбозы в граммах на 100 мл раствора (х) вычисляют по формуле:
х = 2,75.Р-2,
где Р—показание поляриметра;
2 — пересчет на 100 мл;
2,75 — постоянный коэффициент.
Определение щелочности растворов днацетонсорбозы
Отбирают 10 мл испытуемого раствора в коническую колбу, добавляют около 50 мл воды и титруют нормальным раствором НС1 в присутствии метилового красного до изменения окраски. Для сравнения перехода окраски рекомендуется рядом с титруемым раствором ставить холостой опыт с теми же количествами испытуемого раствора и воды в качестве «свидетеля».
Расчет щелочности раствора в граммах щелочи на 1 л (х) вычисляют по формуле:
х = ^-0,056-100,где у — количество точного нормального раствораНС1, пошедшее на титрование, в мл;
0,056 — коэффициент пересчета на КОН;
100 — пересчет на л.
Контроль конца реакции окисления днацетонсорбозы
(метод предложен Б. И. Идельсоном, Л. П. Петровойи Б. Б. Кантор, лаборатория I Ленинградскоговитаминного завода)
Отбирают 100 мл реакционного раствора, добавляют 2—3 мл этилового спирта, раствор нагревают до обесцвечивания и фильтруют на бюхнеровской воронке. 50 мл фильтрата переносят в делительную воронку емкостью 200 мл и фильтрат дважды обрабатывают равным объемом хлороформа для извлечения днацетонсорбозы. Хлороформные экстракты собирают, фильтруют в заранее взвешенную на технохимических весах фарфоровую чашку, растворитель упаривают на водяной бане досуха (в вытяжном шкафу с хорошей вентиляцией), чашку с сухим остатком вновь взвешивают.
Расчет содержания остаточной днацетонсорбозы в граммах на 1 л (х) производят по формуле:
x = (gi —^-го, где gi — вес чашки с остатком днацетонсорбозы после выпаривания в г;
5г — вес пустой чашки в г;
20 — постоянный коэффициент.
Этот, метод применим как контрольный в ходе технологического процесса окисления днацетонсорбозы.
22522515 В. А Девятнин
225
225
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛАГИ В АЦЕТОНЕ КАРБИДНЫМ МЕТОДОМ
(разработан Л. А. Петровой и Н. Г. Шинкаревойв лаборатории I Ленинградского витаминного завода)
Метод основан на взаимодействии карбида кальция с водой. Реакция протекает по уравнению:
СаСд 4- 2НдО = Са(ОН)2 4- CgHg.
Измерив объем выделяющегося ацетилена, можно рассчитать содержание воды в испытуемом образце.
Рис 31 Прибор для определения воды карбидным методом.а — реактор 2 с карманом /, б — бюретка на 25 мл, в—напорная грушаРис 31 Прибор для определения воды карбидным методом.а — реактор 2 с карманом /, б — бюретка на 25 мл, в—напорная грушаДля определения пользуются прибором, изображенным на рис. 31. В качестве рабочей жидкости употребляют насыщенный водный раствор поваренной соли (для удобства отсчета слегка подкрашенный метиленовой синей). Анализ производят следующим образом: поднимают грушу в и выравнивают уровни рабочей жидкости в бюретке и напорной груше вблизи нулевого деления. В отросток 1 реактора а насыпают из пробирки около 0,7 г тонко измельченного порошка карбида кальция. Пипеткой вводят в цилиндрический отросток 2 реакто-
Рис 31 Прибор для определения воды карбидным методом.
а — реактор 2 с карманом /, б — бюретка на 25 мл, в—напорная груша
Рис 31 Прибор для определения воды карбидным методом.
а — реактор 2 с карманом /, б — бюретка на 25 мл, в—напорная груша
pa а 1 мл испытуемого ацетона. Реактор а закрывают пробкой, соединенной каучуковой трубкой с бюреткой б и выдерживают в течение 6 минут (по песочным ча
сам), а затем выравнивают уровни рабочей жидкости в бюретке и напорной груше и отсчитывают начальный объем V].
Опускают напорную грушу в в нижнее положение и с помощью деревянных щипцов (во избежание нагревания реактора руками) наклоняют реактор так, чтобы порошок карбида кальция высыпался в цилиндрический отросток, легким потряхиванием перемешивают ацетон с карбидом кальция, пока уровень жидкости в бюретке
не перестанет изменяться.
Прибор оставляют в покое на 3 минуты (по пбсочйЫМ/ часам), затем, поднимая грушу, выравнивают уровни жидкости и отсчитывают по бюретке объем газовой смеси W Объем выделившегося газа V находят по разности V = Vz-Vj.
Содержание влаги в ацетоне в процентах (х) рассчитывают по формуле:
_ 100-36.и
1-22 400’
где 36 — г/мол 2Н2О, участвующей в реакции;
22 400—количество ацетилена, выделяемого 36 г/мол воды, в мл;
О — объем выделившегося газа в мл;
пересчет в %.
При сокращении формула приобретает значение:
х = 0,16-и.
ДИАЦЕТОН-2-КЕТО-Ь-ГУЛОНОВАЯ КИСЛОТА
СООН-Н3О
I Н3С о-^с
0 /с\ I
Н3С о— с — н
С12Н17О6С12Н17О6М. вес 274 (безв.)М. вес 274 (безв.)с—о сн3
С12Н17О6
С12Н17О6
М. вес 274 (безв.)
М. вес 274 (безв.)
с—ь?" с^
СНзО^ ^СНд
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
fno прописи А. К- Руженцовой, Р. И. Крамаровойи Н. С. Горяйновой, Научно-исследовательскийхимико-фармацевтический институт)
Навеску кислоты в количестве около 0,4 г растворяют в 10 мл 96% этилового спирта, прибавляют 20 мл воды и титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии индикатора тимолфталеина до появления синего окрашивания.
Расчет процентного содержания 2-кето-Ь-гулоновой кислоты (х) производят по формуле:
15*227
щО,0274-100щО,0274-100Л- ass'w 1 »
щО,0274-100
щО,0274-100
а
где и—количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование, в мл;
0,0274 — количество диацетон-2-кето-Ь-гулоновой кислоты (безводной), соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
а — навеска в г;
100 — пересчет в %.
КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАЛИЧИЯ ХЛОРИДОВИ СУЛЬФАТОВ В СЫРОЙ ДИАЦЕТОН-2-КЕТО-Е-ГУЯОНОВОИ
КИСЛОТЕ
Около 1 г сырой диацетон-2-кето-Ь-гулоновой кислоты растворяют в небольшом количестве (15—25 мл) воды при нагревании, фильтруют. К 5 мл фильтрата добавляют 2—3 капли 10% раствора HNO3 и 1—2 мл 1% раствора AgNO3. Наличие мути или белого осадка указывает на присутствие хлоридов. К другим 5 мл фильтрата добавляют 1—2 мл 1% раствора ВаС12. Появление мути или осадка указывает на присутствие сульфатов.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В МАТОЧНИКАХ
(по прописи А. К. Руженцовой, Р. И.' Крамаровойи Н. С. Горяйновой, Научно-исследовательскийхимико-фармацевтический институт)
10 мл маточника (после отделения диацетон-2-кето- L-гулоновой кислоты) титруют в присутствии фенолфталеина 0,1 н. раствором NaOH.
Следующие 10 мл маточника помещают в делительную воронку и экстрагируют несколько раз серным эфирам. По отделении от эфира водного слоя его титруют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии фенолфталеина. Разность между первым и вторым титрованием соответствует находящейся в маточнике диацетон-2-кето-Ь-гуло- новой кислоте.
Расчет содержания диацетон-2-кето-Ь-гулоновой кислоты в граммах на 1 л маточника (х) производят по формуле:
(v — vJ-0,0292-1000х =«= —— ,
а
где у-—количество точного 0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на первое титрование, в мл;
У1 — то же, пошедшее на второе титрование, в мл; 1000 — пересчет на л;
а — объем маточника, взятый на анализ, в мл; 0,0292 — количество диацетон-2-кето-Ь-гулоновой кислоты, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора NaOH, в г;
ВИТАМИН С (L-АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА)
Аскорбиновая кислота в природе встречается в виде L-аскорбиновой кислоты (I), наиболее биологически активной формы витамина С, в виде D-аскорбиновой кислоты (II), -не обладающей биологической активностью, и других биологически неактивных форм, в виде окисленной дегидроаскорбиновой кислоты (HI), обладающей биологической активностью, поскольку эта форма легко восстанавливается в аскорбиновую кислоту, а также в виде связанной формы с белками, аскорбигена, и другими соединениями.
СО.<i — ОН ।IIС —ОНHjHOCH (!н2ОНСО.<i — ОН ।IIС —ОНHjHOCH (!н2ОНс0со
СО.
<i — ОН ।
II
С —ОН
Hj
HOCH (!н2ОН
СО.
<i — ОН ।
II
С —ОН
Hj
HOCH (!н2ОН
С—OHj = o
1О
С — ОНС = оЧ
СННСI
неонносн
(!н2ОНсн3он
IIIII
Промышленными препаратами витамина С являются L-аскорбиновая кислота синтетическая в кристаллическом виде, в драже, таблетках и растворах для инъекций в чистом виде, в смеси с глюкозой, с другими витаминами, а также препараты (сухие и жидкие концентраты, сиропы и настои) витамина С, получаемые из естественных источников (ложные плоды шиповника, плоды черной смородины, облепихи и др.).
Физико-химические свойства L-аскорбииовойкислоты
Показатель
Характеристика
Состояние вещества
Бесцветные кристаллы кислого вкуса, без запаха
Формула
Молекулярный вес
Температура плавления
Растворимость
СбН80б
176,13
190—193° (разл)
Легко растворяется в воде. Растворяется в метиловом и этиловом спирте.
Не растворяется в эфире, бензоле, хлороформе, петролейном эфире
Оптическая активность
Абсорбционный максимум
Окислительно-восстановительный потенциал
pH нормального раствора
Биологическая активность
+ 24°( в воде); + 48° (в метаноле)
265 тр (в воде)
0,166 в. при 35° и рН = 4,0
2,2
1 ИЕ = 0,05 мг L-аскор- биновой кислоты
ONa
А
YN
А +
Cl/^/^Clо
со
С— он
II О с—он
НС
носн
СН2ОН
он Лейкоформа индикатора
СО
А о
I
С = О
НС
I
НОСН
Аон
Окрашенная фор-ма индикатора
Аскорбиноваякислота
Дегидроаскорбино-вая кислота
L-аскорбиновой кислоте свойствен ряд окислительно- восстановительных реакций, которые обычно и используются is аналитических целях. При взаимодействии аскорбиновой кислоты с раствором натриевой соли 2,6- дихлорфенолиндофенола аскорбиновая кислота восстанавливает (обесцвечивает) индикатор, сама же при этом окисляется (см. схему на стр. 230).
При взаимодействии аскорбиновой кислоты с йодноватокислым калием происходит аналогичная реакция окисления аскорбиновой кислоты:
2С6Н8О6 + KJO3 + 2НС1 -> 2С6Н6О6 + JC1 + КС1 + ЗН2О.
Эти реакции положены в основу описываемых ниже методов определения L-аскорбиновой кислоты.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫВ КРИСТАЛЛИЧЕСКОМ ПРОДУКТЕ
Йодатный метод
(по IX Госфармакопее СССР)
Около 0,5 г препарата (точная навеска) растворяют в воде в мерной колбе емкостью 50 мл, доводят до метки водой и перемешивают. Отбирают пипеткой 10 мл приготовленного раствора, к нему приливают 0,5 мл 1% раствора йодистого калия, 2 мл 0,5% раствора крахмала и 1 мл 2% раствора соляной кислоты и титруют 0,1 н. раствором йодноватокислого калия до появления стойкого слабо синего окрашивания.
Содержание аскорбиновой кислоты в процентах (х) (вычисляют по формуле:
у.0,008806-^.100х _ ,
где и— количество 0,1 н. раствора йодноватокислого калия, пошедшее на титрование, в мл;
а — навеска в г;
0,008806 — количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора KJO3, в г;
Ui — разведение в мл;
U2 — количество раствора, взятое на титрование, в мл;
100 — пересчет в %.
Йодометрический метод
(по ГОСТ 4815-54)
Из полученного, как указано выше, раствора аскорбиновой кислоты отбирают 10 мл, приливают 2 Мл 0,5%' раствора крахмала и титруют 0,1 н. раствором йода до появления слабо синего стойкого окрашивания..
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫВ АМПУЛИРОВАННЫХ РАСТВОРАХ
(по IX Госфармакопее СССР)
К 5 мл 5% раствора или 2,5 мл 10% раствора аскорбиновой кислоты приливают 10 мл воды и 0,2 мл 1% раствора формальдегида *, перемешивают, прибавляют 2 мл 10% уксусной кислоты и титруют 0,1 н. раствором йода до появления неисчезающей синей окраски (индикатор — крахмал).
Содержание аскорбиновой кислоты в 1 мл раствора в граммах (х) вычисляют по формуле:
и-0,008806
а
Обозначения см. выше.
Примечание. Для определения сульфита отдельно оттитро- вывают 0,1 н. раствором йода 10 мл испытуемого раствора в присутствии крахмала. Разность между этим н описанным выше определением приходится на сульфит натрия.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫВ ПРЕПАРАТАХ
Железоаскорбиновая кислота
(по ВТУ-Ф № 1961)55)
0,3 г препарата (точная навеска) помещают в коническую колбу емкостью 200—250 мл, прибавляют 20 мл воды, растворяют навеску (при этом раствор окрашивается в темно-фиолетовый цвет), добавляют 5 мл ор-
Для связывания сульфита натрия, прибавляемого к ампулн- рованным растворам аскорбиновой кислоты, для их стабилизации, 232
тофосфорной кислоты (уд. вес 1,7) и обесцветившийся раствор оттитровывают 0,1 н. раствором йода в присутствии крахмала до появления синего окрашивания.
Расчет процентного содержания аскорбиновой кислоты в препарате (х) производят по формуле:
и-0,008806-100х =,
а
где и — количество точного 0,1 н. раствора йода, пошедшее на титрование, в мл;
0,008806— количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора йода, в г;
а — навеска в г;
100 — пересчет в % •
Определение аскорбиновой кислотыв таблетках и драже
(по IX Госфармакопее СССР)
Около 0,2 г (точная иавеска) порошка растертых таблеток или драже взбалтывают с 10 мл воды и титруют 0,1 н. раствором йода в присутствии крахмала (индикатор) до появления неисчезающей синей окраски.
Содержание аскорбиновой кислоты в миллиграммах в 1 шт. драже или таблеток (х) вычисляют по формуле: v-0,008806-d х =—,
а
где d — средний вес 1 шт. драже или таблеток в г; 0,008806 — количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора йода, в мг;
а и -и — см. выше.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ И ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТ ПРИ ИХ СОВМЕСТНОМ ПРИСУТСТВИИ
Существует два способа определения обеих форм аскорбиновой кислоты: один из них заключается в том, что вначале-в испытуемом растворе определяют содержание восстановленной аскорбиновой кислоты титрованием раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, йодноватокислым калием или йодом, а затем в параллельной пробе производят восстановление сероводородом дегидро-
аскорбиновой кислоты и после удаления из раствора избытка сероводорода оттитровывают тем же путем общее количество аскорбиновой кислоты. Из результатов второго титрования вычитают результаты первого титрования, разность соответствует содержанию дегидроас- корбиновой кислоты.
В объектах окрашенных, мутных, содержащих редуцирующие примеси, мешающие определению вещества, их удаляют с помощью раствора уксуснокислого свинца (растительные продукты) (В. А. Девятнин и В. М. Иоси- кова, 1935, 1936) или уксуснокислой ртути (животные ткани и органы) (В. М. Иосикова, 1939, 1940) с последующим восстановлением сероводородом. Эти методы подробно изложены в ГОСТ 7047-55 и других руководствах *, поэтому нет необходимости подробно на «их останавливаться.
Другие способы определения дигидро- и дегидроас- корбиновой кислот основаны на свойстве дегидроаскор- биновой кислоты давать окрашенные озазоны с динитро- фенилгидраЗином, подобно другим соединениям, обладающим СО-группой. Основываясь на этой реакции Рое и Эстерлинг (Roe, Oesterling, 1944) разработали метод, позволяющий определять содержание аскорбиновой и де- гидроаскорбиновой кислот при их совместном присутствии колориметрическим путем. Для этого дигидроаскор- биновую кислоту предварительно превращают в дегидро- аскорбиновую кислоту и после проведения реакции образования озазона сравнивают образующуюся окраску колориметрическим путем со стандартными растворами.
Реакция протекает в следующем направлении (В. А. Девятнин,1948):
с = оIno2IО\С “°| + 2(H3N.NH-/>-NO,).НС'HOCHСН3ОНс = оIno2IО\С “°| + 2(H3N.NH-/>-NO,).НС'HOCHСН3ОНСО
с = оIno2
IО\
С “°| + 2(H3N.NH-/>-NO,).
НС'
HOCH
СН3ОН
с = оIno2
IО\
С “°| + 2(H3N.NH-/>-NO,).
НС'
HOCH
СН3ОН
С —ОН
IIО
С —ОН | НС!
hoJh
СН3ОН
Методы определения витаминов. Пищепромиздат, 1954; Методическое руководство по определению витаминов. Медгиз, I960, 234
МОз нCO—
O2N—/V-N —N=C
XI О +2H2O
O,NN - N =C
HHC—
HO —CH
CH2OH
Шварц и Вильямс (Schwartz, Williams, 1955) в недавнее время разработали очень простой способ, позволяющий избежать применения довольно сложной техники анализа. Этот метод 'был нами проверен и показал вполне удовлетворительные результаты. Ниже описывается метод Шварца и Вильямса в том виде, как он используется в нашей лаборатории.
Составление калибровочного графика!". В серию пробирок вносят по 2 мл эталона-стандарта, содержащего 0, 5, 10, 15, 20, 25 и 30 у аскорбиновой кислоты, добавляют по 1 капле раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, по 2 мл раствора тиомочевины, по 1 мл раствора 2,4-ди- нитрофенилгидразина. Все пробирки с содержимым помещают в термостат и оставляют на 3 часа при 37°. По прошествии указанного времени во все пробирки добавляют по 5 мл смеси — солянофосфатного реактива (общий объем смеси в каждой пробирке должен составлять 10 мл) и после тщательного перемешивания содержимого пробирок окраску растворов измеряют с помощью электрофотоколориметра со светофильтром Х=540 тщ
Полученные показания гальванометра пересчитывают на экстинкцию и откладывают на графике по оси ординат, а по абсциссе — соответствующие им количества аскорбиновой кислоты в гаммах.
Примечание. При пользовании колориметром типа Дюбоска с полученными растворами сравнивают окраску испытуемых растворов.
Метод о п р ед ел е н и я. Подготавливают три пробирки (№ 1, 2 и 3).
В пробирку № 1 вносят 1 каплю раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола и 2 мл раствора тиомочевины.
В Пробирки № 1, 2 и 3 вносят по 2 мл испытуемого раствора (содержащего не более 30 мкг аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот в 1 мл).
В пробирки № 2 и 3 добавляют по 1 капле раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола и по 2 мл раствора тиомочевины.
В пробирки № 1 и 2 вносят по 1 мл раствора 2,4-ди- нитрофенилгидразина.
Пробирки с содержимым помещают в термостат и оставляют в нем при 37° на 3 часа. По истечении.указанного времени к содержимому всех пробирок добавляют по 5 мл соляно-фосфатного реактива (общий объем смеси в каждой пробирке должен составлять 10 мл) и после тщательного перемешивания содержимого пробирок окраску растворов измеряют с помощью электрофотоколориметра со светофильтром % = 540 тр,.
В пробирке № 1 определяют содержание дегидроаскорбиновой кислоты (общее количество), в пробирке № 2 — общее количество аскорбиновой кислоты. Пробирка № 3 служит контрольным опытом. Показания его вычитают из показаний для пробирок № 1 и 2.
Порядок работы и добавления реактивов проводятся по следующей схеме.
Пробирка № 1 (дегидроаскорбииовая кислота)
Пробирка № 2 (аскорбиновая кислота)
Пробирка № 3 (контроль)
капля индофенола
мл тиомочевины
мл испытуемого
1 мл фенилгидразина Термостат 37°
5 мл НС1+Н3РО4
Всего 10 мл
2 мл испытуемого
капля индофенола
мл тиомочевины
1 мл фенилгидразина Термостат 37°
5 мл HCI+H3PO4
Всего 10 мл
мл испытуемого
капля индофенола
мл тиомочевины-
Термостат 37°
мл HCI+H3PO4
1 мл фенилгидразина
Всего 10 мл
Примечание Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола вносят для окисления аскорбиновой кислоты, раствор тиомочевииы — для стабилизации аскорбиновой кислоты
Расчет содержания дегидроаскорбиновой кислоты (общее количество) в миллиграмм-процентах (х) производят по формуле:
e-v-100
a-Vp 1000
где с — количество дегидроаскорбиновой кислоты, найденное по калибровочному графику, за вычетом из экстинкции испытуемого экстинкции контрольного опыта, в у;
у — разведение в мл;
пересчет в г;
а — навеска в г;
Ui — количество испытуемого раствора, взятое на определение, в мл;
пересчет в %.
Расчет содержания аскорбиновой кислоты в образце в миллиграмм-процентах (X]) производят по формуле:
с и ЛОО
д.г>г1000
где с — количество аскорбиновой кислоты, найденное по калибровочному графику, за вычетом из экстинкции испытуемого экстинкции контрольного опыта, в у.
Остальные обозначения см. выше.
Расчет содержания дегидроаскорбиновой кислоты в образце в миллиграмм-процентах (х2) производят по формуле:
Х2 = X —хх.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ПРЕПАРАТАХИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
Согласно ГОСТ 7047-55’, определение витамина С может быть проведено не только свинцово-сероводород- ным (арбитражным), но и упрощенным методом в следующих растительных продуктах и препаратах: шиповник, свежеприготовленные настои, сиропы, порошок, сухие и жидкие концентраты, пюре из плодов шиповника, свежие плоды и овощи и другие свежие растительные продукты, растительные консервы, свежеотжатые
Текст ГОСТ 7047-55 по разделу «Витамин С» был подготовлен специальной комиссией, выделенной Методбюро при ВСНИТО в составе В. А. Девятнииа, В М Иосиковой, С М Немец, К Л Поволоцкой, В М Селивановой и Н С Ярусовон
Томатный, мандариновый и апельсиновый соки. Не Допускается анализировать свежие растительные продукты упрощенным методом, если они содержат большое количество дубильных веществ.
Упрощенный (индофенольный) метод определениявитамина С
(по ГОСТ 7047-55)
Навеску жидких продуктов и продуктов густой консистенции разводят 2% раствором соляной кислоты в мерной колбе емкостью 50 или 100 мл до объема. Получают так называемый первоначальный раствор.
Рекомендуемая величинанавесок:
1-2 г5 г1—50 мл5 г10 г10—50 г5—50 г1-2 г5 г1—50 мл5 г10 г10—50 г5—50 гдраже, таблетки, порошок и концентраты шиповника
1-2 г
5 г1—50 мл
5 г
10 г10—50 г5—50 г
1-2 г
5 г1—50 мл
5 г
10 г10—50 г5—50 г
сироп из плодов шиповника
соки и экстракты
плоды шиповника очищенные, пюре шиповника с сахаром
плоды шиповника целые и сульфити- рованные продукты
свежие плоды, ягоды, фрукты, зелень консервы
Первоначальный раствор для настоев хвои, соков и прочих продуктов с содержанием не выше 20 мг%' витамина С получают путем разведения без применения мерных колб. В этом случае кислоту в зависимости от содержания витамина С берут к весу навески в отношении 1 :1 или больше.
Навеску твердых продуктов тщательно растирают, применяя в случае надобности 5—10 г стеклянного порошка, и приливают постепенно 2% раствор НС1 в кратном к навеске отношении (не менее Змл на 1г навески). При использовании в анализе мерной посуды стеклянный порошок не употребляют. После растирания смесь оставляют в ступке настаиваться в течение 10 минут.
После настаивания таких продуктов, как драже, таблетки или порошок шиповника, содержимое ступки количественно переносят в мерную колбу емкостью 50—100 мл и отмеренную для настаивания кислоту расходуют не полностью- часть кислоты оставляют для про- 238
МЫвкй ступки и йестикй И доведения жидкости в колбе до метки. Допускается непосредственный перенос навесок хорошо растворяющихся драже и таблеток в мерную колбу для растворения в ней и настаивания.
Перед переносом в центрифужные стаканы содержимое колбы хорошо перемешивают.
При экстракции прочих твердых продуктов 2% раствор соляной кислоты наливают в ступку строго по расчету выбранной кратности к навеске. По окончании настаивания жидкость из ступки вместе с нерастворив- шейся частью разливают по центрифужным стаканам.
Содержимое центрифужных стаканов центрифугируют до просветления.
При отсутствии центрифуги центрифугирование заменяют фильтрованием через гигроскопическую вату или сложенную в несколько слоев марлю.
После центрифугирования жидкость из центрифужных стаканов сливают в один сосуд, перемешивают и получают так называемый первоначальный экстракт.
При применении фильтрования содержимое ступки после настаивания тщательно перемешивают и отфильтровывают не всю жидкость, а только некоторую ее часть в таком количестве, чтобы в случае надобности возможно было многократное повторение анализа первоначального экстракта.
При анализе сухих плодов шиповника навеску измельченных плодов количественно переносят в ступку с заранее внесенным туда стеклянным порошком (около 5 г); осторожно, тщательно и возможно мельче растирают, подливая небольшими порциями 150 мл дистиллированной воды комнатной температуры и настаивают 10 минут. Из полученной взвеси после тщательного размешивания центрифугируют или фильтруют некоторую часть через слой ваты, вложенной в воронку.
В зависимости от содержания витамина С отбирают пипеткой от 1 до 5 мл центрифугата или фильтрата и переносят в колбу емкостью 50—100 мл, куда заранее внесено 1 мл 2% pacTBOipa НС1, затем приливают столько воды, чтобы общий объем содержимого колбы составлял 15 мл, и титруют раствором 2,6-дихлорфенолин- дофенола из микробюретки, слегка взбалтывая до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 7г—1 минуты. В случае титрования слабого витамино-
носителя раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола прибавляют по каплям; при титровании сильного витаминоносителя вначале приливают по нескольку капель раствора 2,6-дихлорфенолнндофенола сразу. По 'окончании титрования после записи отсчета по бюретке дополнительно приливают две контрольные капли раствора.2,6-дихлор- фенолиндофенола, и если они дадут интенсивное розовое окрашивание, то это указывает, что конец титрования определен правильно.
Примечание. При отсутствии микробюретки допускается применение при титровании градуированной на 0,01 мл пипетки.
В случае окрашенности центрнфугата или фильтрата, мешающей уловить появление розового окрашивания, а также при высоком содержании витамина С центрифу- гаты или фильтраты разводят перед титрованием водой вдвое или более ’.
Примечание. В случае анализа незрелых плодов шиповника вместо воды для экстракции применяют 2% соляную кислоту.
При каждом анализе проводят не менее двух параллельных определений (с двумя навесками), причем повторные титрационные числа в каждом определении не должны разниться между собой более чем на 0,03 мл. Из них берут среднее арифметическое. Титрование должно продолжаться не более 2 минут, а количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшее на одно титрование, должно быть в пределах 1—2 мл. Результаты параллельных определений (из двух навесок) не должны отличаться друг от друга более чем на ±5%.
Для каждого анализа делают поправку на реактивы (контрольный опыт). В коническую колбу наливают 1 мл 2% НС1 и такое количество воды, чтобы получился объем, "который имелся при титровании испытуемого объекта. Затем прибавляют из микробюретки по каплям раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола до первого появления розовой окраски. Количество израсходованного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола в миллилитрах является поправкой на реактивы. Поправка обычно составляет для титруемого объекта (15 мл) 0,04—0,06 мл
Окрашенные объекты можно титровать с применением хлороформа или другого органического растворителя; при встряхивании с ним избыток индофенола окрашивает растворитель.
и вычитается из объема раствора 2,6-дихлорфенолиндо* фенола, пошедшего на титрование экстракта. При увели- ении титруемого объекта до 20—30 мл производят соответствующее определение поправки.
Содержание аскорбиновой кислоты в миллиграмм- процентах (х) вычисляют по формуле:
= У1*^*9д*0,08806-100
a-v3
где о, количество рабочего раствора 2,6-дихлор- фенолиндофенола, пошедшее на титрование, за вычетом поправки на реактивы,
F — поправка на титр раствора 2,6-дихлорфе- нолиндофенола для перевода на точно 0,001 н. раствор; '
Уз объем, до которого доведена навеска при прибавлении к ней экстрагирующей жидкости, в мл;
Уз объем анализируемой жидкости, взятой для титрования, в .мл;
п “ навес'ка ® г или объем в мл;
,иооиь количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл точно 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофепола, в мг;
— пересчет в %.
Упрощенный (йодатный) метод определения витамина С
(по ГОСТ 7047-55)
Экстракцию витамина С проводят 2% НС1, как указано выше.3
При работе с объектами твердой или густой консистенции из центрифугата или фильтрата солянокислых экстрактов отбирают 1—5 мл (в зависимости от содержания витамина С), вносят в коническую колбу емкостью 50 100 мл, куда заранее налито 0,5 мл 1% раствора йодистого калия, 2 мл 0,5% раствора крахмала и столько воды, чтобы общий объем жидкости составил ЫЛ- С°ДеРжим°ое колбы титруют из микробюретки ,ищ н. раствором йодноватокислого калия до появления стойкого слабо синего окрашивания.
24124116 В. А. Девятнии
241
241
Жидкие пробы разводят непосредственно перёд титрованием соляной кислотой или водой или титруют без разведения. В последнем случае титруют в присутствии 1 мл 2% соляной кислоты.
Поправка на реактивы (контрольный опыт) производится следующим образом: в коническую колбу наливают 0,5 мл 1 % раствора йодистого калия, 2 мл 0,5% раствора крахмала, 1 мл 2% НС1 и столько воды, чтобы общий объем жидкости составил 10 мл, и титруют из микробюретки 0,001 н. раствором KJO3 до появления слабо синего окрашивания ’.
Содержание витамина С в миллиграмм-процентах (х) вычисляют по формуле:
V, .0,08806.100-С v2л = ,
где V! — количество 0,001 Щ. раствора KJO3, пошедшее на титрование, за вычетом поправки на реактивы, в мл.
Остальные обозначения см. выше.
Примечание. Определение витамина С йодатным упрощенным методом, согласно ГОСТ 7047-55, в жидких концентратах из плодов шиповника, витаминизированных конфетах, консервированных соках, свежеотжатых окрашенных соках, растительных консервах, свежих плодах, овощах и ягодах, сушеных продуктах, сульфи- тированных овощах, витаминизированном чае не применяется.
Упрощенный метод определения витамина Св сульфитированных продуктах
(разработан В. А. Девятниным и В. В. Грунт, ВНИВИ)
Навеску сульфатированного продукта тщательно измельчают в ступке со стеклянным порошком или кварцевым песком и 2% раствором НС1, взятым в
25-кратном количестве по отношению к навеске. - Полученную вытяжку количественно переносят в колбу, снабженную пробкой с двумя отверстиями; через одно из них проходит опущенная в жидкость трубка, соединенная с источником азота или углекислоты. На стенке колбы делают отметку, соответствующую объему жидкости в колбе; через систему пропускают ток инертного газа и одновременно нагревают содержимое колбы до кипения, время от времени взбалтывая.
По прошествии 3—5 минут кипячения из колбы отбирают пробу жидкости для определения в ней наличия SO2. В случае положительной реакции кипячение продолжают несколько минут и вновь пробу жидкости испытывают на SO2.
Проба на SO2: исследуемую кислую вытяжку нейтрализуют по лакмусу 10% раствором КОН или NaOH. На фарфоровую пластинку или крышку от тигля помещают 5 капель нейтрализованной жидкости и прибавляют 1 каплю водного раствора малахитовой зеленой (концентрация 1 :2000). В присутствии SO2 голубая окраска смеси быстро исчезает.
В случае отсутствия в пробе SO2 систему разъединяют, содержимое колбы охлаждают струей воды, вытяжку в колбе приводят 2% раствором НС1 к исходному объему и в дальнейшем определяют витамин С, как описано выше (там же см. расчет результатов анализа).
етоды контроляетоды контроляПоказательХарактеристикаПоказательХарактеристикаФизико-химические свойства эргостеринаФизико-химические свойства эргостеринаСостояние веществаСостояние веществаБесцветные игольчатые кристаллыИз этанола кристаллизуется с 1 молекулой водыCzgHUtO (безв.)396,66 (безв.) 166°Бесцветные игольчатые кристаллыИз этанола кристаллизуется с 1 молекулой водыCzgHUtO (безв.)396,66 (безв.) 166°Нерастворим в воде; растворяется в органических растворителяхМ^° -132е (2% раствор в СНС13)260, 270, 280 и 293 шц (в этаноле)Серо-голубаяНерастворим в воде; растворяется в органических растворителяхМ^° -132е (2% раствор в СНС13)260, 270, 280 и 293 шц (в этаноле)Серо-голубая
етоды контроля
етоды контроля
Показатель
Характеристика
Показатель
Характеристика
Физико-химические свойства эргостерина
Физико-химические свойства эргостерина
Состояние вещества
Состояние вещества
Бесцветные игольчатые кристаллы
Из этанола кристаллизуется с 1 молекулой воды
CzgHUtO (безв.)
396,66 (безв.) 166°
Бесцветные игольчатые кристаллы
Из этанола кристаллизуется с 1 молекулой воды
CzgHUtO (безв.)
396,66 (безв.) 166°
Нерастворим в воде; растворяется в органических растворителях
М^° -132е (2% раствор в СНС13)
260, 270, 280 и 293 шц (в этаноле)
Серо-голубая
Нерастворим в воде; растворяется в органических растворителях
М^° -132е (2% раствор в СНС13)
260, 270, 280 и 293 шц (в этаноле)
Серо-голубая
в производстве витамина D
эргостерин
рпостерин при облучении ультрафиолетовыми лучами превращается в витамин D2 и является, следовательно, провитамином D2. В значительном количестве содержится в дрожжах, мицелии
пеницилдиум и других продуктах, используемых в качестве сырья в витаминной промышленности.
Эргостерин имеет следующее строение:
Эргостерин в отличие от витамина D осаждается дигитонином, сапонином растения Digitalis (эр) (наперстянка), образуя нерастворимое молекулярное соединение (1:1) — дигитонид-эргостерин *. С уксусным ангид-
Дигитонин CseHgzOzg; т пл. 235°; [а]^ —54° (этанол).
ридом и серной кислотой образует окрашенный комплекс. Однако эта реакция, ранее использовавшаяся для количественного определения эргостерина, не является
Формула
Молекулярный вес
Температура плавления
Растворимость
Оптическая активность
Максимум абсорбции
Флуоресценция
достаточно специфичной. В основу существующих методов определения эргостерина положена реакция осаждения его дигитонином как более избирательная.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЭРГОСТЕРИНА В ДРОЖЖАХИ МИЦЕЛИИ ГРИБОВ
(по данным I Московского витаминного завода^
К навеске испытуемого продукта (дрожжи, мицелий) в количестве 1 г, взятой на аналитических весах, добавляют 30 мл 40% водного раствора КОН, 30 мл 96% этилового спирта и омыляют.в течение 27г часов в колбе с обратным холодильником на кипящей водяной бане.
1 Разработан на I Московском Витаминной заводе
244
?45
По окончании омыления содержимое колбы охлаждают, количественно переносят в делительную воронку, смывая водой; добавляют 30 мл воды и 15 мл 96% этилового спирта и взбалтывают. К содержимому воронки добавляют серный эфир в количестве 50 мл, осторожно (во избежание образования эмульсии) перемешивают, эфирный слой сливают. Извлечение неомыляемых .повторяют еще 5 раз с порциями по 25 мл серного эфира. Эфирные экстракты соединяют, тщательно промывают водой до нейтральной реакции (по фенолфталеину), после отделения воды сушат в течение 20—30 минут свежепрокаленным сернокислым натрием.
Эфирный экстракт фильтруют, фильтр и сернокислый натрий на нем промывают эфиром, эфир отгоняют на водяной бане в токе азота или углекислоты досуха.
Остаток в колбе растворяют в 5 мл 96% этилового спирта, спиртовой раствор нагревают почти до кипения и к нему добавляют по каплям при помешивании 5 мл горячего 1% раствора дигитонина в 96% этиловом спирте'.
Для полноты выделения осадка раствор оставляют в темноте на 18—24 часа, после чего осадок количественно переносят на высушенный до постоянного веса и взвешенный фильтр. Осадок на фильтре промывают 50 мл 96% этилового спирта и затем 25 мл серного эфира.
После испарения эфира фильтр с осадком высушивают при 90—95° до постоянного веса и взвешивают.
Содержание эргостерина в процентах (х) вычисляют по формуле:
_ Л-1004,034-а
где А — вес осадка после высушивания в г; а— навеска в г;
4,034 — постоянный коэффициент;
100 -*- пересчет в %.
Для более полного и быстрого осаждения стеринов рекомендуется добавить к смеси несколько капель дистиллированной воды, 246
АНАЛИЗ ЭРГОСТЕРИНА
(по ВТ У 416-52 МПП СССР)
Определение летучих примесей
В тарированный бюкс помещают навеску эргостерина в количестве 0,5 г, взятую на аналитических весах. Бюкс с навеской помещают в вакуум-сушильный шкаф и выдерживают при 45—50° в течение 2 часов при разрежении не менее 600 мм ртутного столба. По окончании сушки бюкс с навеской охлаждают в эксикаторе над хлористым -кальцием и взвешивают. Если изменение в весе не превышает 2%, сушку можно считать законченной; если изменение в весе превысит 2%, высушивание продолжают еще в течение 1 часа, после чего бюкс с на^ веской вновь взвешивают.
Содержание летучих веществ в процентах (х) рассчитывают по формуле:
(a — by 100х =,
а
где а — вес вещества до высушивания в г;
b — вес вещества после высушивания в г;
100 — пересчет в %.
Определение температуры плавления
Это определение проводится в запаянном капилляре или в токе СОг *.
Определение процентного содержания
Точную навеску испытуемого образца эргостерина в количестве около 0,01 г переносят с помощью 20 мл 96% этилового спирта в стакан и нагревают на водяной бане до полного растворения навески. В другой стакан наливают 5 мл 1% спиртового раствора дигитонина.
Содержимое обоих стаканов доводят на водяной бане до кипения и горячий раствор дигитонина приливают
1 Определение т. пл. в токе СО2 и прибор для этой цели описаны в сб.: Методы определения витаминов. Под рёд. В. А. Девят- нина. Пищепромиздат, 1954.
к горячему испытуемому раствору. Кипение поддержи* вают 2—3 минуты. Затем стакан покрывают часовым стеклом и ставят в холодную воду для охлаждения. Для полноты выделения осадка стакан с ним оставляют в темноте на 18—24 часа, после чего выпавший осадок дигитонид-эртостерина количественно отфильтровывают через высушенный и взвешенный фильтр. Можно для этих целей использовать стеклянный фильтр № 5 или 4, предварительно высушенный и взвешенный.
Остаток на фильтре промывают вначале 50 мл 96% этилового спирта, а затем 25 мл серного эфира.
После испарения эфира фильтр с осадком высушивают в сушильном шкафу при 90—95° до постоянного веса и взвешивают.
Содержание эргостерина в процентах (х) вычисляют по формуле:
_ Л-100Х~ 4,034-д
Обозначения см. выше.
ВИТАМИН D
Витамин D образуется путем облучения стеринов ультрафиолетовым светом. Известно несколько витаминов D, которые различаются между собой лишь строением боковой цепи в зависимости от того, из какого провитамина Иони образованы:
П р ов и т а м и н D Эргостерин 7-дегидро-холестерин 22-дигидро-эргостерин 7-дегидро-ситостеринП р ов и т а м и н D Эргостерин 7-дегидро-холестерин 22-дигидро-эргостерин 7-дегидро-ситостеринВитаминD
П р ов и т а м и н D Эргостерин 7-дегидро-холестерин 22-дигидро-эргостерин 7-дегидро-ситостерин
П р ов и т а м и н D Эргостерин 7-дегидро-холестерин 22-дигидро-эргостерин 7-дегидро-ситостерин
Витамин Dj, эргокальциферол
Витамин D3, холекальциферол
Витамин D4
Витамин Ds
Биологическая активность витаминов D также различна. Наиболее биологически активными являются витамины D2 и D3'.
Из моллюсков Mediolus demlssus выделены стерины, дающие прн облучении витамин D. Т. пл. 128°. Биологическая активность = % активности витамина Ds (для крыс и цыплят). Спектр поглощения сходен с таковым для витамина Dj.
Физико-химические свойства витамина D
Характеристика
ПоказательПоказательвитамин Daвитамин Оавитамин Daвитамин Оа
Показатель
Показатель
витамин Daвитамин Оа
витамин Daвитамин Оа
Состояние вещества Формула Молекулярный вес Температура плавленияРастворимостьУдельное вращениеБиологическая активностьМаксимум абсорбциидля продуктов фотолиза:люмистерин тахистернн токсистеринСостояние вещества Формула Молекулярный вес Температура плавленияРастворимостьУдельное вращениеБиологическая активностьМаксимум абсорбциидля продуктов фотолиза:люмистерин тахистернн токсистеринБесцветный кристаллический порошокС23Н44ОС27Н44О396,66384,65115—117°82—83°Бесцветный кристаллический порошокС23Н44ОС27Н44О396,66384,65115—117°82—83°В воде нерастворимРастворим в органических растворителяхВ воде нерастворимРастворим в органических растворителях+ 103 (этанол)+82,6 (ацетон)1 ИЕ = 0,025 у265 mn(E!1%CM =460—485) в абсолютном алкоголе+ 103 (этанол)+82,6 (ацетон)1 ИЕ = 0,025 у265 mn(E!1%CM =460—485) в абсолютном алкоголе265, 280 тц268, 280, 294 тц248 тц265, 280 тц268, 280, 294 тц248 тц+83,3 (ацетон)+83,3 (ацетон)1 ИЕ = 0,025 у265 тц(Е}«м = 450—490) в абсолютном алкоголе1 ИЕ = 0,025 у265 тц(Е}«м = 450—490) в абсолютном алкоголе
Состояние вещества Формула Молекулярный вес Температура плавления
Растворимость
Удельное вращение
Биологическая активность
Максимум абсорбции
для продуктов фотолиза:
люмистерин тахистернн токсистерин
Состояние вещества Формула Молекулярный вес Температура плавления
Растворимость
Удельное вращение
Биологическая активность
Максимум абсорбции
для продуктов фотолиза:
люмистерин тахистернн токсистерин
Бесцветный кристаллический порошок
С23Н44ОС27Н44О
396,66384,65
115—117°82—83°
Бесцветный кристаллический порошок
С23Н44ОС27Н44О
396,66384,65
115—117°82—83°
В воде нерастворимРастворим в органических растворителях
В воде нерастворимРастворим в органических растворителях
+ 103 (этанол)
+82,6 (ацетон)
1 ИЕ = 0,025 у
265 mn(E!1%CM =
460—485) в абсолютном алкоголе
+ 103 (этанол)
+82,6 (ацетон)
1 ИЕ = 0,025 у
265 mn(E!1%CM =
460—485) в абсолютном алкоголе
265, 280 тц
268, 280, 294 тц
248 тц
265, 280 тц
268, 280, 294 тц
248 тц
+83,3 (ацетон)
+83,3 (ацетон)
1 ИЕ = 0,025 у
265 тц(Е}«м = 450—490) в абсолютном алкоголе
1 ИЕ = 0,025 у
265 тц(Е}«м = 450—490) в абсолютном алкоголе
Превращение эргостерина в витамин D2 имеет ступенчатый характер: в процессе фотолиза образуется ряд промежуточных продуктов, имеющих поглощение в ультрафиолете в области 250—300 тр, (рис. 32).
В последние годы эта схема подверглась пересмотру; предполагают, что превращение эргостерина идет так: эргостерин— провитамин D2 — витамин D2 — тахистерин — люмистерин — провитамин D2.
Промышленными препаратами витамина D являются масляные концентраты, получаемые путем облучения спиртовых растворов эргостерина с последующим переводом продуктов облучения в масле и удалением спирта; спиртовые концентраты, получаемые путем облучения спиртовых растворов эргостерина и последующего сгущения в вакууме до требуемой концентрации: масляные
Эргостерин. Т. пл. 166°
И^°— 132°(СНС1,)
Люмистерин. Т. пл. 118°[а]ц +192° (ацетон)
ПротахистеринПротахистеринТахистерин Иу—70° (бензол)
Протахистерин
Протахистерин
Токсистерин Макс. X = 248 тр.
Супрастерин I Т. пл. 104°
[а]20-76о(СНС13)
максим, глуб. в ультрафиолете
Супрастерин II. Т. пл. 110°[а]2°+63°(СНС13)максим, глуб. в ультрафиолете
и спиртовые концентраты, получаемые растворением в масле или спирте кристаллического витамина D2,
эргокальциферола; масляные растворы го витамина D3, драже и таблетки, содержащие витамин D, а также облученные дрожжи, служащие для кормовых целей.
Витамины D2, D3 и др. дают в присутствии ацетилхлорида розоватожелтое окрашивание с хлороформным раствором треххлористой сурьмы. Механизм реакции недостаточно изучен; по-видимому, он аналогичен реакции треххлористой сурьмы с витамином А. Это свойство и положено в основу всех существующих методов определения витаминов D. Чапке и Плессинг (Pschapke, Plessing, 1957) рекомендована новая реакция витамина D с SnCl2.
Основным затруднением при определении витамина D является наличие в масляных и спиртовых препаратах облученного эргостерина фотодериватов, которые дают аналогичную реакцию.
В естественных продуктах этому определению также мешают стерины, кетон 250, витамин А и каротин. Ценные исследования проведены И. Н. Гар-
кристаллическо-кристаллическо-Рис. 32. Абсорбционные кривые продуктов фотолиза эргостерина (по Виндау- су)./ — эргостерин;2 — алюмистерин;3 — тахистерин;4 — витамин D2;5 — токснстерин; б — супрастерин.Рис. 32. Абсорбционные кривые продуктов фотолиза эргостерина (по Виндау- су)./ — эргостерин;2 — алюмистерин;3 — тахистерин;4 — витамин D2;5 — токснстерин; б — супрастерин.киной и В. Н. Букиным (1957), которые использовали для разработки количественного метода определения витамина D метод хроматографии на бумаге, описанный ранее Брухманом (Bruchmann, 1951), Чапке и Плессин- гом (1955), Мак Магоном (Mac Mahon, 1950) и другими
кристаллическо-
кристаллическо-
Рис. 32. Абсорбционные кривые продуктов фотолиза эргостерина (по Виндау- су).
/ — эргостерин;
2 — алюмистерин;
3 — тахистерин;
4 — витамин D2;
5 — токснстерин; б — супрастерин.
Рис. 32. Абсорбционные кривые продуктов фотолиза эргостерина (по Виндау- су).
/ — эргостерин;
2 — алюмистерин;
3 — тахистерин;
4 — витамин D2;
5 — токснстерин; б — супрастерин.
авторами.
Метод, предложенный И. Н. Гаркиной и В. Н. Букиным для хроматографического определения витамина D, был положен в основу разработанного в нашей лаборатории И. А. Солуниной способа определения витаминов D2 и D3, отделения от интерферирующих веществ и коли
чественного анализа промышленных препаратов и пищевых продуктов.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА D В ПРОМЫШЛЕННЫХПРЕПАРАТАХ
Подготовка к определению
Спиртовые концентраты витамина D (облученный эргостерин) разводят 96% этиловым спиртом с таким расчетом, чтобы в 1 мл полученного раствора содержалось около 40 000 ИЕ витамина D2.
Масляные концентраты витамина D2 (облученный эргостерин) обрабатывают по методике, описанной ниже (стр. 255). Неомыляемую фракцию растворяют в 1 мл 96% этилового спирта с расчетом получения 40 000 ИЕ витамина D2 в 1 мл раствора.
Сухие (препараты, содержащие масляный раствор витамина D, подвергают экстрагированию эфиром; после удаления растворителя остаток омыляют, как описано ниже.
«С в и д ет е-л ь» витамина D2 — 20 мг кристаллического эргокальциферола (точная навеска) растворяют в абсолютном этиловом спирте в мерной колбе емкостью 25 мл. Содержание витамина О2 в 1 мл составляет 32000 ИЕ.
Хроматография
Хроматографическую (бумагу (ленинградская, плотностью 85) нарезают вдоль листа на полосы размером 15 X 35 см и обрабатывают 20% раствором муравьиной кислоты или 10% раствором НС1 в течение 15—20 часов. Бумагу промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод на лакмус. Отмытую бумагу подсушивают при комнатной температуре. В эмалированную кювету наливают 5—10% водный раствор А12(5О4)з и пропитывают бумагу протягиванием листов через указанный раствор. Бумагу подвешивают и дают возможность стечь излишнему раствору сернокислого алюминия. Затем бумагу обрабатывают, как описано, 2 н. раствором аммиака и промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод. Отмытую бумагу сушат при комнатной температуре.
На обработанную раствором сернокислого алюминия бумагу наносят микропипеткой в несколько приемов
по две Одийаковые «Пробы испытуемого раствора и «свидетеля» витамина Da в количестве 0,025—0,03 мл на расстоянии 3 см друг от друга и 5—7 см от нижнего края листа бумаги. Нанесенные пятна должны иметь диаметр не более 0,5 см. Содержание витамина D в конечном объеме должно составлять около 1000 ИЕ (для испытуемого) и 640—800 ИЕ (для «свидетеля»). После высыхания нанесенных растворов бумагу помещают в хроматографическую камеру, насыщенную парами растворителя, состоящего из смеси петролейного эфира (температура кипения 50—70°) и ацетона (6% к петролейному эфиру). При восходящей хроматограмме бумагу помещают нижним концом в растворитель на 1—2 м, при нисходящей — в лодочку, в которую затем наливают растворитель. Для лучшего насыщения камеры парами растворителя на дно ее наливают небольшое количество растворителя.
Процесс хроматографирования при 20—22° длится 17г—2 часа, после чего хроматограмму удаляют из каме- .ры и быстро высушивают на воздухе. Высушенную хроматограмму разрёзают вдоль листа на 4 равные полоски.
Отбирают 2 полоски, на которых нанесены испытуемый раствор и «свидетель» витамина D, и проявляют горячим хлороформным раствором треххлористой сурьмы (50 г 5ЬС1з в 50 мл хлороформа), быстрым протягиванием полос через налитый в чашку Петри горячий раствор. Проявленные пятна витамина D и фотодериватов очерчивают .карандашом, по проявленным пятнам отмечают расположение пятен на непроявленных полосах и вырезают пятна витамина D с некоторым Запасом по длине к верхнему и нижнему концу. Из нижнего конца хроматограммы (отступив на 2—3 см от точки нанесения пятен) вырезают полоску бумаги, по величине соответствующую вырезанным пятнам, которая служит в качестве контроля на бумагу.
Экстракция
Вырезанные пятна витамина D и контроля мелко нарезают и помещают в конические колбы с притертыми пробками; в каждую колбу наливают по 1 мл хлороформа и оставляют на 20—30 минут.
Колориметрирование
По истечении 20—30 минут в колбах проводят реакции витамина D с раствором треххлористой сурьмы в хлороформе, прибавляя для этого в колбы по 6 мл раствора треххлористой сурьмы и 3 капли уксусного ангидрида. Точно через 4 минуты после добавления последнего реактива измеряют интенсивность образовавшейся окраски со светофильтром 480—530 шц.
В 'качестве контроля для установки прибора на нуль используют хлороформ.
При расчете величину экстинкции для контрольной бумаги вычитают из величины экстинкции для бумаги с пятнами витамина D. Расчет содержания витамина D проводят по калибровочному графику, составленному по чистому эргокальциферолу, с учетом объема испытуемого раствора, взятого на анализ Ч
Содержание витамина D в 1 мл испытуемого концентрата в ИЕ (х) вычисляют по формуле:
с-иX = •
где с — содержание витамина D в 1 мл раствора, найденное по калибровочному трафику, в ИЕ;
и— объем спирта, взятый для предварительного разведения спиртового концентрата, в мл;
и,—количество спиртового (концентрата, взятое для разведения, в мл;
и2 —объем разбавленного концентрата, нанесенный на хроматограмму, в мл.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА D В КРИСТАЛЛИЧЕСКОМЭРГОКАЛЬЦИФЕРОЛЕ
Точную навеску кристаллического эргокальциферола в количестве 0,04 г растворяют в этаноле в мерной колбе
Хроматографирование «свидетеля» с известной концентрацией дает возможность установить процент потерь (или возврата) витамина D при хроматографировании и внести соответствующую поправку на содержание витамина D в испытуемом растворе.
Для снижения потерь витамина D при хроматографировании желательно испытуемые растворы наносить на бумагу в токе СО2, при этом возврат витамина D достигает до 90%.
ёмкбстьк) 100 мл й доводят этанолом до метки. Полученный раствор разводят этанолом с таким расчетом, чтобы в 1 мл раствора содержалось около 400 ИЕ витамина D. На реакцию берут 1 мл хлороформного раствора, измеряют оптическую плотность раствора при 265 тц.
Содержание витамина D2 в препарате в (процентах (х) вычисляют по формуле:
X = ,
a-Vj-465
где D— содержание витамина D в 1 мл раствора в ИЕ;
а — навеска в г;
у, У] и и2 — разведения в мл;
465 — постоянный 'коэффициент.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА D
(разработано В. А. Девяткиным и И. А. Солуниной,химико-аналитическая лаборатория ВНИВИ)
К навеске испытуемого образца, взятой из расчета содержания в ней 200—300 ИЕ витамина D, добавляют двойной объем 20% спиртового раствора КОН и омы- ляют на водяной бане при температуре кипения спирта с обратным холодильником в течение не менее 2 часов. По окончании омыления содержимое колбы количественно переносят в делительную воронку двумя объемами воды, неомыляемую фракцию 6 раз экстрагируют серным эфиром, каждый раз порциями по 40—50 мл. Эфирные экстракты соединяют, промывают водой до нейтральной реакции по фенолфталеину и после отделения водно-спиртового слоя просушивают безводным сернокислым натрием.
Из экстракта эфир отгоняют в токе азота или СО2 досуха. Сухой остаток растворяют в 5—8 мл 96% этилового спирта, стерины из раствора вымораживают на холоду или удаляют их осаждением 1 % спиртовым раствором дигитонина и отфильтровывают.
Примечание. Если требуется определить содержание стери- нов, осадок растворяют в небольшом количестве бензола и наносят на хроматографическую бумагу, как описано выше.
Из фильтрата упаривают растворитель досуха в вакууме, остаток растворяют в небольшом количестве петролейного эфира и пропускают через адсорбционную колонку, заполненную свежепрокаленной окисью алюминия (высота слоя адсорбента 10—12 см, диаметр колонки 10 мм).
Витамин D элюируют с колонки при помощи 25—35 мл петролейного эфира. Из элюата отгоняют растворитель в вакууме, сухой остаток растворяют в 1 мл хлороформа и проводят колориметрическое определение, как описано выше.
В случае применения хроматографического метода определения сухой остаток растворяют в 1, мл 96% этилового спирта и далее поступают, как описано выше.
Составление калибровочного графика. Для составления калибровочного графика применяют раствор чистого кристаллического эргокальциферола в хлороформе, содержащий 10 000 ИЕ витамина D2 в 10 мл (1 ЙЕ витамина D2 соответствует 0,025 у чистого эргокальциферола). Хлороформный раствор витамина D хранится не более 1 дня.
Измерение интенсивности окраски хлороформного раствора кристаллического эргокальциферола с треххлористой сурьмой проводят в электрофотоколориметре со светофильтром 480—530 тщ
Для приведения электрофотоколориметра к нулю пользуются чистым хлороформом. Для получения калибровочного графика берут 1,0; 0,75; 0,5 и 0,25 мл стандартного раствора витамина D2, доводят хлороформом до объема 1 мл, добавляют по 3 капли уксусного ангидрида и по 6 мл раствора треххлористой сурьмы (отношение испытуемого раствора к раствору треххлористой сурьмы должно составлять 1:6). Общий объем реакционной смеси должен составлять 7 мл.
Точно через 4 минуты после добавления последнего реактива измеряют получаемые окраски, и величины экстинкции откладывают на графике по оси ординат, а соответствующие концентрации витамина—по оси абсцисс.
В пределах содержания витамина D от 200 до 1000 ИЕ в 1 мл на графике получается прямая линия.
Удобно пользоваться для целей сравнения стандартным раствором эргокальциферола.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА D2 АДСОРБЦИОННЫММЕТОДОМ
Чапке и Плесси-нг (1955, 1958) рекомендовали для отделения витамина D2 от фотодериватов испытуемую вытяжку взбалтывать с активированным тальком. На этой основе в химико-аналитической лаборатории В. А. Девятниным, И. А. Солуниной и Л. А. Кузнецовой (1962) был разработан количественный метод.
Подготовка образца к анализу. 1 мл испытуемого спиртового раствора, -содержащего около 200 000 ИЕ витамина D2, помещают в колбу Вюрца и отгоняют в вакууме спирт при слабом нагревании на водяной бане досуха. Сухой остаток растворяют в хлороформе, -переносят в мерную колбу емкостью 25 мл и доводят хлороформом до метки.
При анализе масляных препаратов витамина D вначале препарат омыляют, неомыляемую фракцию растворяют в хлороформе и далее поступают, как описано выше.
Отделение фо т о д е р и в а т о в. 1—1,5 мл полученного хлороформного раствора пропускают при слабом разрежении через адсорбционную колонку с активированным тальком, предварительно смоченную хлороформом (высота слоя адсорбента 10 см; поверх его помещают -слоем 0,5 ом безводный сульфат натрия; диаметр колонки 0,8 см, скорость пропускания 30—40 капель в минуту). Элюцию витамина D с адсорбента производят при помощи 10 мл хлороформа (в несколько приемов). Элюат переносят в мерную колбу емкостью 25 мл, приемник несколько раз споласкивают хлороформом, который сливают в ту же колбу, объем раствора доводят до метки хлороформом.
Колориметрирование. Из полученного раствора отбирают пипеткой 1 мл в кювету фотоколоримет- ра и проводят реакцию с раствором треххлористой сурьмы, как описано выше.
Содержание витамина D2 в 1 мл препарата в ИЕ (х) вычисляют п-о формуле:
с-25.25х =•
25725717 В А. Девятнин
257
257
етоды контроляв производстве витамина Еетоды контроляв производстве витамина Е
етоды контроля
в производстве витамина Е
етоды контроля
в производстве витамина Е
Где с—найденное по калибровочному графику содержание витамина D2 в ИЕ;
25 — первое разведение в мл;
25 — второе разведение в мл;
t»i — количество испытуемого раствора, взятое для первого разведения, в мл;
os — количество раствора, взятое на адсорбцию, в мл.
СН3НО | СН2 \Z\/\CHСН3НО | СН2 \Z\/\CH
СН3
НО | СН2 \Z\/\CH
СН3
НО | СН2 \Z\/\CH
од общим названием витамина Е известен ряд (соединений, обладающих Е-витамин- ными свойствами: а-токоферол, p-токоферол, у-токофе- рол, д-токоферол и другие токоферолы *.
Структурная форма токоферолов следующая:
СН3
НО | СН2
YYYh2
С—RА3С—RА3а-токоферола-токоферол7-токоферол7-токоферолНОНО(!н3° СНз6-токоферол(!н3° СНз6-токоферол
С—R
А3
С—R
А3
а-токоферол
а-токоферол
7-токоферол
7-токоферол
НО
НО
(!н3° СНз6-токоферол
(!н3° СНз6-токоферол
/S/Х/
Н3с 1 о
С —Р
х/\/YR
I О ртт
СН3
Р-токоферол СН2
1 Недавно выделенный ^-токоферол находится в оливковом масле, которое содержит до 72% этой формы токоферола [Буниан, Грин, Мамелис, Мацинкевич (Bunyan, Green, Mamelis, Macinkewitz, 1 №711
СН3НО I сн2уУхсн2zzzzVR ° СН3 е-токоферолR = СН2 — СН2 — СН2СН3НО I сн2уУхсн2zzzzVR ° СН3 е-токоферолR = СН2 — СН2 — СН2НО СН2уу\сн2Z\Z\Z\~RН3С О \Нзт]-токоферолСН3сн2 — (!:н — сн-, —НО СН2уу\сн2Z\Z\Z\~RН3С О \Нзт]-токоферолСН3сн2 — (!:н — сн-, —НОНОСНз IСНз IСН2СН2а-токоферола-токоферол
СН3
НО I сн2
уУхсн2
zzzzVR ° СН3 е-токоферол
R = СН2 — СН2 — СН2
СН3
НО I сн2
уУхсн2
zzzzVR ° СН3 е-токоферол
R = СН2 — СН2 — СН2
НО СН2
уу\сн2
Z\Z\Z\~R
Н3С О \Нзт]-токоферол
СН3
сн2 — (!:н — сн-, —
НО СН2
уу\сн2
Z\Z\Z\~R
Н3С О \Нзт]-токоферол
СН3
сн2 — (!:н — сн-, —
НО
НО
СНз I
СНз I
СН2
СН2
а-токоферол
а-токоферол
СН3
НО I СН2
Уу\сн2
ZSZ\ZC<R
Н3С О \Ндt-токоферол
СН3
- сн — сн2 — сн2 —СНз
сн2 — сн2 — сн
СНз
Наибольшей Е-витаминной активностью отличается а-токоферол; р-, у- и б-токоферолы менее активны. Токоферолы обладают также антиокислительными свойствами: их антиокислительная активность противоположна их Е-витаминной активности:
da-токоферол,
биологическая
активность
в
процентах
100
dla-токоферол
67
dp-токоферол
»
33
dip-токоферол
»
»
16
df-токоферол
»
»
1
dlf-токоферол
»
меньше
dS-токоферол
»
»
»
меньше 1
а-токоферол
»
около 20
С-токоферол
»
50
Промышленными препаратами витамина Е являются синтетический а-токоферол-ацетат, препараты, получаемые из естественного сырья, концентраты из пшеничных зародышей, получаемые путем экстракции, и концентраты из богатых токоферолом масел, получаемые методом молекулярной дистилляции. /
Химические методы определения витамина Е основаны на образовании окрашенных хинонов при окислении молекулы токоферола:
260
О | СН2У^уСНдzv\ C<R
Н3С СНз О \.Нза-токоферол—хинон
Физико-химические свойства токоферола
Показатель
Характеристика
а-токоферол
^-токоферол
у-токофе- рол
6-токофе- рол
Внешний вид
Маслянис
тая жидкс
)СТЬ
Брутто-формула
С2дН60О2
C2gH4gO2
С2дН48О2
С27Н46О2
Молекулярный вес
430
416
416
402
Температура плавления аллофаната
161—162°
138-139°
136—138°
41—42° для п-фенил- азобензоата
Растворимость
Растворяе
телях и
тся в ор жире В
ганических воде нер<
раствори- астворим
Биологическая активность
1 ИЕ=
1 мг
—
—
Максимумабсорбции
Е^м (в этаноле)
294 ши— 77,0— 88,01
285,8тр.= 86,0
298 шр.=
92,8
298 шр.=92,8
Удельное вращение [a] q
1,503—
1,505
1 Е i*M для dla-гокоферол-ацетата при X = 285 тр = 42—45 [Кноблох (Knobloch)].
Окисление может производиться HNO3, AgiNO3, FeCl3, AuCl3, Сег(5О4)3 и т. д. Так, токоферолы, окисляясь хлорным железом, восстанавливают его до хлористого; количество же хлористого железа определяется интенсивностью окраски раствора при добавлении ортофенантролина или а-а'-дипиридила, который дает с двухвалентным железом комплексный ион:
С помощью химических методов удается разделить и отдельно определить 'содержание а-токоферола и суммы ₽-, у-, б- и других токоферолов. Это представляет интерес, так как позволяет судить одновременно о Е-вита- минной активности и антиокислительной ценности испытуемого продукта. Метод раздельного определения а-токоферола и других форм токоферола основан на том, что р-, у-, б- и другие формы токоферолов способны с солями азотистой кислоть! давать желтоокрашенные нитрозопроизводные, тогда как а-токоферол в реакцию нитрозирования не вступает. Эта цветная реакция, описанная Скуди и Бушем (Scudi, Buhs, 1942), в дальнейшем послужила основой метода определения этих токоферолов в смеси с а-токоферолом, предложенного Стерном и Бакстер (Stern, Baxter, 1947). Сочетая метод определения суммы токоферолов с методом нитрозирования, нам удалось, разработать доступный метод раздельного определения а- и других токоферолов.
Более детальное разделение токоферолов может быть достигнуто с помощью хроматографических или полярографических методов. Такой метод был предложен Кноблохом (1955). В. И. Колтуновой (1958) в нашей лаборатории удалось значительно его упростить и модифицировать, в связи с чем этот метод может быть рекомендован для исследовательских целей.
Абсорбциометрические методы, основанные на измерении максимума поглощения на соответствующей длине волны в ультрафиолете, применимы лишь к индивидуальным синтетическим токоферолам, а в применении к смесям дают зачастую искаженные «результаты.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОКОФЕРОЛОВ В МАСЛАХ, МАСЛЯНЫХРАСТВОРАХ ТОКОФЕРОЛ-АЦЕТАТА И КОНЦЕНТРАТАХ,ПОЛУЧЕННЫХ ПУТЕМ ЭКСТРАКЦИИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ
ДИСТИЛЛЯЦИИ
(разработано В. А. Девятниным и И. А. Солунинойво ВНИВИ)
Определение суМмы токоферолов
Точную навеску масла в количестве 2—3 г или концентрата в количестве 1—2 г или 10—30% масляного раствора синтетического токоферолацетата в количестве 0,1—0,3 г помещают в колбу, куда приливают 10—15 мл 10% спиртового раствора КОН и омыляют на водяной бане при 80—85° с обратным холодильником в течение 30—45 минут в присутствии 50—60 мг пирогаллола. По окончании омыления содержимое колбы количественно переносят в делительную воронку двойным объемом воды, неомыляемую фракцию четырежды экстрагируют серным эфиром, каждый раз порциями по 35—40 мл. Эфирные экстракты собирают, промывают в делительной воронке дистиллированной водой до нейтральной реакции по фенолфталеину. После отделения воды сушат свежепрокаленным сернокислым .натрием. Высушенный эфирный экстракт сливают в колбу, растворитель отгоняют в токе углекислоты или азота досуха. Остаток неомыляемых веществ растворяют в несколько приемов в 10—15 мл бензола, переносят в мерную колбу емкостью 25 мл и доводят объем до метки бензолом. Из полученного раствора отбирают пипеткой 8—10 мл раствора и пропускают через адсорбционную колонку с диатомитом (высота слоя диатомита 3,5 см, диаметр 15 мм) при слабом разрежении. Токоферолы с адсорбента смывают 12-45 мл бензола, после чего весь элюат количественно переносят в мерную колбу емкостью 25 мл и ддводят объ-
ем до метки бензолом (основной раствор). Из полученного раствора отбирают пипеткой 1—2 мл в колбу емкостью 25 мл, приливают 10—20 мл бензола, затем добавляют 1 мл раствора ортофенантролина или 0,5% раствора ct-a'-дипиридила, хорошо перемешивают и приливают 1 мл раствора хлорного железа по каплям при перемешивании содержимого колбы; объем раствора быстро доводят бензолом до метки, перемешивают и оставляют в темноте точно на 10 минут. По истечении 10 минут измеряют окраску раствора со светофильтром 490 тр, устанавливая нулевое показание прибора по чистому бензолу. Параллельно ставят контроль на реактивы, взятые в тех же количествах, что и в опыте. Показания экстинкции для контрольного опыта вычитают из показания экстинкции для испытуемого раствора. Содержание суммы токоферолов определяют по графику, составленному по чистому а-токоферолу. Содержание токоферолов в миллиграмм-процентах (х) вычисляют по формуле:
_ С-25-25-100
где С— найденное по калибровочному графику содержание токоферолов в мг;
первое разведение в мл;
второе разведение в мл;
пересчет в %;а— навеска в г;v - количество ооновного раствора, взятое наадсорбционную колонку, в мл;
■Hi - количество испытуемого раствора, взятое для проведения реакции, в мл.
Составление калибровочного графика. Точную навеску 50 мг чистого а-токоферола растворяют в бензоле в мерной колбе емкостью 250 мл. Для получения точек калибровочного графика из полученного раствора отбирают пипеткой последовательно 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 мл раствора для получения 5 точек калибровочного графика
позволяетпозволяетконцентрацииконцентрацииОртофенантролин C12H8N2/^~\
позволяет
позволяет
концентрации
концентрации
открывать ионы железа (двухвалентного) в
и проводят реакцию в мерных колбах емкостью 25 мл с РеОз и ортофенантролином или a-ct'-дипиридилом, как указано выше. Получаемые окраски измеряют на электрофотоколориметре со светофильтром 490 тр, и величины экстинкций по показаниям прибора откладывают на графике по оси ординат, а соответствующие концентрации а-токоферола в миллиграммах—на оси абсцисс. Для приведения прибора к нулю пользуются чистым бензолом.
Определение 0-, у-, 6- и других нитрозирующихсятокоферолов
Основной раствор (см. технику метода определения суммы токоферолов) после отбора из него 1—-2 мл для определения суммы токоферолов, как указано выше, выпаривают в вакууме досуха, сухой остаток растворяют в 8—10 мл абсолютного спирта, который отмеривают пипеткой. Из полученного раствора отбирают пипеткой 1—2 мл и помещают в делительную воронку емкостью 50 мл, туда же добавляют при перемешивании точно 0,2 мл ледяной уксусной кислоты и точно 3 мл 2% раствора нитрита натрия из быстро освобождающейся пипетки. Смесь интенсивно перемешивают в течение 5 секунд и оставляют стоять точно 60 секунд, а затем добавляют 2 мл 20% раствора КОН, перемешивают, добавляют 10 мл дистиллированной воды, 0,7—1 г безводного сернокислого натрия и точно 12 мл петролейного эфира. Смесь интенсивно перемешивают в течение 30 секунд, дают отстояться; слой петролейного эфира, окрашенный в желтый цвет, переносят в кювету электрофотоколориметра и колориметрируют со светофильтром 400 тр, устанавливая нулевое показание прибора по чистому петролейному эфиру.
Параллельно ставят контроль: для этой цели берут такое же количество основного раствора, что и для опыта, Приливают 10 мл дистиллированной воды, прибавляют 0,7—1 г безводного сернокислого натрия и 12 мл петролейного эфира, смесь интенсивно перемешивают в течение 30 секунд и после отстаивания слой петролейного эфира колориметрируют, как указано выше. Экстинкцию для контрольного опыта вычитают из экстинкции испытуемого. Расчет содержания нитрозирующихся токоферо-
лс® производят по калибровочному графику, составленному по у-токоферолу.
Содержание нитрозирующихся токоферолов в милли- грамм-процентаХ (у) вычисляют по формуле:
С-25-25-100
а-и^Уг
где С— найденное по калибровочному графику содержание нитрозирующихся токоферолов, за вычетом контроля в мг;
25 — первое разведение в мл;
25— второе разведение в мл;
100 — пересчет в %;а— навеска в г;
Ui— количество испытуемого раствора, взятое на определение нитрозирующихся токоферолов, в мл;
«2— количество основного бензольного раствора, взятое на отгонку в вакууме, в мл.
Составление калибровочного графика. Точную навеску концентрата у-токоферола после определения в нем процентного содержания у-тОкоферола на спектофо- тометре или хроматографическим методом растворяют в абсолютном спирте в мерной колбе из расчета содержаниях),4—0,5 мг у-токоферола в 1 мл стандартного раствора. Для получения точек калибровочного графика из полученного стандартного раствора поеледовательно отбирают пипеткой 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1 и 1,2 мл стандартного раствора и проводят реакцию нитрозирования, как указано выше. Получаемые окраски измеряют на электрофотоколориметре со светофильтром 400 шр,, и величины экстинкций по показаниям прибора откладывают на графике по оси ординат, а соответствующие концентрации витамина в миллиграммах — на оси абсцисс. Для приведения прибора к нулю пользуются чистым петролей- иым эфирам.
Содержание а-токоферола в испытуемом образце в миллитрамм-процентах (Z) производят расчетным путем по формуле:
Z — х — 5,
где х— содержание суммы токоферолов (а + р + +т + б) ® мт %;
у— содержание нитрозирующихся токоферолов (р+y + d) в мг%.
Примечание. Пересчет процентного содержания «-токоферола к общему содержанию витаминов группы Е (в процентах) производят по формуле'
ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯТОКОФЕРОЛОВ В МАСЛАХ И ЖИРАХ
(разработан В. А. Девяткиным, и В. И. Колтуновой,химико-аналитическая лаборатория ВНИВИ)
Точную навеску испытуемого продукта в количестве 3—5 г подвергают омылению с помощью 25 мл 2 н. раствора КОН в течение 30 минут на кипящей водяной бане в присутствии 50—60 мл пирогаллола. К содержимому колбы добавляют 25 мл воды и неомыляемую фракцию извлекают в делительной воронке 3—4 раза серным эфиром. Эфирные экстракты промывают водой, высушивают сернокислым натрием, фильтруют, а растворитель удаляют (более подробно технику омыления см выше).
Неомыляемый остаток растворяют в 96% этиловом спирте, а содержащиеся стерины осаждают 1 % спиртовым раствором дититонина. После полного осаждения стеринов смесь фильтруют, к фильтрату добавляют 5 мл 0,1 н. спиртового раствора комплексной соли аммоний- нитрата церия и взбалтывают. Через 10 минут окисленные продукты извлекают в делительной воронке серным эфиром, эфирный раствор промывают водой, высушивают сернокислым натрием и фильтруют. Из фильтрата удаляют растворитель отгонкой в вакууме.
Полученный остаток растворяют в абсолютном этиловом спирте. К аликвоту спиртового раствора, содержащего не менее 2 мг токоферилхинонов, добавляют 10 мл ацетатного буфера, содержащего 75% этилового спирта (рН = 7,0). Раствор после пропускания через него азота подвергают электролизу в ячейке поляро- графа.
чувствительностичувствительности
чувствительности
чувствительности
Расчет содержания токоферолов производят по калибровочному графику, составленному по чистому а-то- коферолу.
Содержание отдельных форм токоферолов в милли- грамм-процентах вычисляют по формуле:
и -с- 100х = ,
где х— содержание а-, р-, у-, 6-токоферолов в мг%; о— объем опирта, взятый для растворения неомыляемой фракции, в мл;
с— количество токоферилхинонов, найденное по калибровочному графику, в мг;
а — навеока в г;
01 — объем спиртового раствора токоферилхино- нов, взятый на полярографирование, в мл;
100— пересчет в мг%.
Характер кривых восстановления токоферилхинонов синтетических и в естественных продуктах представлен на рис. 33, 34 и 35.
**-ДД"1"“,,,,""~
v Хетоды контроляо производстве витамина К
оокк2-МЕТИЛ-1,4-НАФТОХИНОН (МЕТИНОН)
о
о
к
к
CiiHgOs М. вес 172,19
ристаллический порошок лимоино-желтого цвета с очень слабым характерным запахом.
ПрПрактически нерастворим в воде, растворим в ацетоне,
Пр
Пр
бензоле, хлороформе, этиловом спирте и растительных маслах. Неустойчив к действию света и на свету легко разлагается. Т. пл. 105—107°. Разлагается в щелочной
среде, с бисульфитом натрия дает бисульфитное произ- во!дное, легко растворимое в воде. При попадании на ко
жу и слизистые оболочки вызывает сильное раздражение. Ввиду того что его антигеморрагическая активность
намного выше естественного витамина Кь он применяется в терапевтической практике как вещество, в известной мере заменяющее витамин К, способствующее нормаль
ному свертыванию крови, и неправильно называется некоторыми авторами витамином Кз, поскольку 2-метил- 1,4-нафтохинон в живой клетке в свободном виде не об
наружен.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
(разработано М. П. Захаровой и В. Л. Девяткинымво ВНИВИ)
В основу метода положена реакция хинонов с HJ, описанная еще в конце прошлого столетия Валюром (Valeur, 1899). Хиноны при воздействии на них йодистоводородной кислоты легко восстанавливаются до гидрохинонов; освобождающийся три этом йод количественно определяется гипосульфитом натрия. Реакция протекает следующим образом:
Аналогичным ном:Аналогичным ном:образом реакция протекает и с метино-образом реакция протекает и с метино-00ОНОН
Аналогичным ном:
Аналогичным ном:
образом реакция протекает и с метино-
образом реакция протекает и с метино-
0
0
ОН
ОН
/\/\— СН3/\/\— СН3+ 2Ш+ 2ШI II СНз +J2I II СНз +J2
/\/\— СН3
/\/\— СН3
+ 2Ш
+ 2Ш
I II СНз +J2
I II СНз +J2
ООон
О
О
Это позволяет по количеству выделившегося при реакции йода судить о количестве 2-метил-1,4-нафтохинона.
Техника метода. Навеску испытуемого препарата, содержащую не более 150 мг метинона, помещают в коническую колбу с притертой пробкой и растворяют в небольшом количестве 96% этилового спирта. Отдельно смешивают при охлаждении льдом 20 мл концентрированной НС1 (уд. вес 1,19) с равным объемом 96% этилового спирта. К хорошо охлажденной смеси добавляют
20 мл 10% водного раствора KJ, смесь быстро оттитро- вывают 0,1 н. раствором гипосульфита до обесцвечивания и немедленно приливают к испытуемому раствору. Выделившийся в свободном состоянии йод тотчас оттит- ровывают 0,1 н. раствором гипосульфита натрия.
'Содержание метанона в испытуемом препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
у-8,6-100
Х== а-1000 ’
где и— количество точного 0,1 н. раствора Na2S2O3, пошедшее на титрование, в мл;
6— количество метинона, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора Na2S2O3, в мг, а— навеска в г;
пересчете %;
пересчет в г.
При сокращении формула приобретает значение:у-0,86х =а
ВИКАСОЛ
(бисульфитное производное 2-метил-1,4-нафтохинона)
— О— О-NaHSO3-3HaO-NaHSO3-3HaOCnHASNa-3HaOМ. вес 330,3CnHASNa-3HaOМ. вес 330,3
— О
— О
-NaHSO3-3HaO
-NaHSO3-3HaO
CnHASNa-3HaO
М. вес 330,3
CnHASNa-3HaO
М. вес 330,3
Бесцветный мелкокристаллический порошок горького вкуса, легко растворим в воде, не растворяется в органических растворителях. Имеет значительное преимущество перед 2-метил-1,4-нафтохиноном, так как обладает хорошей растворимостью в воде и лишен его токсических свойств.
Бисульфитное производное (викасол) содержит:
часть 2-метил-1,4-нафтохинона, м. вес 172,19
»бисульфита натрия » » 104,06'
части воды»»54,02
Таким образом, это соединение с молекулярным весом 330,3 содержит 52,1 % органической части молекулы, 16,4% воды и 31,5% неорганической части.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ
Йодометрический метод
(разработан М. П. Захаровой и В. А. Девяткинымво ВНИВИ)
В основу метода положен способ йодометрического определения 2-метил-1,4-нафтохинона, описанный при анализе 2-метил-1,4-нафтохинона. Предварительно би- сульфитное соединение осторожно разлагают щелочью, выпадающий осадок метинона далее поступает на определение.
Техника Метода. Навеску препарата, содержащую не более 500 мг викасола, или навеску растертой средней пробы таблеток, содержащую не более 0,5 г ви- касола, растворяют в 100 мл воды и если нужно при анализе таблеток, фильтруют. К раствору добавляют осторожно, по каплям, 1% раствор щелочи (КОН или NaOH) до полноты осаждения метинона. Осадок отфильтровывают через небольшой гладкий фильтр, на фильтре промывают 2—3 раза сильно охлажденной (на льду) водой и затем растворяют в 96% этиловом спирте. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу емкостью 50 мл, фильтр несколько раз промывают спиртом, сливая его в ту же колбу. Объем раствора в колбе доводят спиртом до метки. Из полученного раствора отбирают по 10 мл в конические колбы или склянки с притертымр пробками и оттитровывают метинон.
Для этого отдельно смешивают при сильном охлаждении льдом 20 мл концентрированной НС1 (уд. вес 1,19) с равным объемом 96% этилового спирта. К смеси добавляют 20 мл 10% водного раствора KJ, смесь быстро оттитровывают 0,1 н. раствором гипосульфита натрия до обесцвечивания и немедленно выливают в колбу или склянку с испытуемым раствором. Выделяющийся в свободном состоянии йод тотчас оттитровывают 0,1 н. раствором гипосульфита натрия *.
Крахмал не применяют
27327318 В А Девятнин
273
273
Содержание викасола в испытуемом препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
v-O.OlGS-vrlOO
a-v<ia-v<iX ,— ;
a-v<i
a-v<i
где у— количество точного 0,1 н. раствора NazSzOa, пошедшее на титрование, в мл;
0,0165— количество викасола, соответствующее 1 мл точного 0,1 н. раствора Na2S2O3, в г;
У1— объем спиртового раствора метилона в мл;
пересчет в %;
а — навеска в г;
Уг — объем спиртового раствора метинона, взятый на титрование, в мл.
, у- 16,5-Vfd При анализе таблеток пользуются формулой: х= ’
<?• Уз
где х — содержание викасола в мг в 1 таблетке; 16,5 — количество викасола в мг, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора гипосульфита; d— средний вес 1 таблетки в г, остальные обозначения см. выше.
Весовой метод (по IX Госфармакопее СССР)
Около 0,3 г препарата (точная навеска) растворяют в 15 мл воды, переносят в делительную воронку, прибавляют 10 мл 0,1 н. раствера едкого натра и извлекают хлороформом 2 раза по 20 мл. В делительную воронку при- ливайт еще 5 мл 0,1 н. раствора едкого натра и повторяют извлечение хлороформом еще 3 раза по 20 мл. Хлороформные извлечения после подсушивания их 0,5 г безводного сульфата натрия фильтруют через вату во взвешенную колбу. Вату промывают 3—4 раза хлороформом по 5 мл и фильтрат присоединяют к хлороформным извлечениям. Хлороформ отгоняют на водяной бане до объема 1—2 мл, затем осторожно удаляют его продуванием воздухом, остаток сушат до постоянного веса в эксикаторе над серной кислотой. Вес остатка, умноженный на 1,9183, соответствует количеству викасола во взятой навеске.
Колориметрический метод определения викасолав таблетках
В связи с наличием в молекуле викасола 2-метил- 1,4-нафтохйнона, обладающего СО-группой, указанное соединение легко образует с 2,4чдинитрофенилгидрази- ном соответствующий озазон по реакции:
II СН3°iN
/\/\/\х
| |+2(H3N-HN—/NO2)
\/\/
+ 2Н2О+ 2Н2О
+ 2Н2О
+ 2Н2О
Реакция образования озазона метанона была использована в 1943 г. в Научно-исследовательском институте полупродуктов и красителей для весового определения метанона. Озазон метинона обладает интенсивной окраской, что позволяет также проводить определение колориметрическим методом. Основываясь на этом, Огава (Ogawa, 1953) разработал метод колориметрического определения метинона. Этот метод был проверен и приспособлен нами для колориметрического определения викасола в таблетках. Ниже излагается пропись метода в том виде, как он применяется в нашей лаборатории.
Техника метода. На технохимических весах взвешивают 30—50 таблеток с викасолом, устанавливая, таким образом, средний вес 1 шт. Из хорошо измельченной пробы отбирают навеску в количестве около 2 г, растворяют в ваде, фильтруют, фильтр промывают небольшим количествам воды. К фильтрату добавляют по каплям, осторожно, 1% раствор NaOH или КОН до пол-
йены осаждения метинона. Смесь фильтруют, осадок количественно переносят на фильтр, промывают на фильтре 2—3 раза сильно охлажденной водой, фильтрат испытывают на полноту осаждения.
Осадок на фильтре растворяют в 96% этиловом спирте, раствор переносят количественно в мерную колбу емкостью 100 мл, фильтр промывают спиртом, сливая последний в ту же колбу; объем раствора в колбе доводят спиртом до метки.
В пробирку берут 1 мл полученного раствора, прибавляют 1,5 мл 0,1% раствора 2,4-динитрофенилгидразина, растворенного в 2 н. НС1. Пробирку закрывают пробкой со вставленным в нее воздушным холодильником, и содержимое ее нагревают в течение 15 минут на водяной бане при 70—80°.
Образовавшийся осадок озазона после охлаждения содержимого пробирки под струей воды отфильтровывают, осадок на фильтре промывают 8—10 мл 2 н. НС1, затем 8—10 мл воды. Воронку с фильтром вставляют в горло мерной колбы емкостью 25 мл и осадок растворяют в смеси аммиака с ацетоном (1 ч. 25% раствора аммиака и 4 ч. ацетона). После промывки фильтра этой же смесью раствор в колбе доводят до (метки и хорошо взбалтывают.
Из полученного раствора в кювету фотоколориметра отбирают 1 мл, прибавляют 9 мл аммиачНо-ацетоновой смеси и окраску раствора измеряют в фотоколориметре со светофильтром Х=620 шц.
. Расчет содержания викасола в миллиграммах в 1 таблетке (х) производят по формуле:
с-у-vt -6?-1,9 182
Х~ а-1-1000
где с— найденное по калибровочному графику количество метинона в у, соответствующее плотности испытуемого раствора;
а — навеска в г;
и— разведение викасола в мл;
1 — количество раствора, взятое на реакцию, в мл;
01 — разведение метинона в мл;
d— средний вес 1 таблетки в г;
1000 — пересчет в мг;
1,9182 — коэффициент пересчета метинона в вика- сол.
Составление калибровочного трафика. Навеску метинона в количестве 10 мг растворяют в 100 мл 96% этилового спирта. Из полученного раствора отбирают 1 мл и далее проводят реакцию с раствором 2,4-динитрофенилгидразина, как описано выше.
В ряд пробирок отбирают следующие количества полученного аммиачно-ацетонового раствора озазона метинона и аммиачно-ацетоновой смеси (табл. 9).
Таблица 9
Составление калибровочного графика для метинона
№ пробирки
В миллилитрах
Содержание метинона в у
раствор озазона
смесь
1
0,25
9,75
1,0
2
0,50
9,50
2,0
3
0,75
9,25
3,0
4
1,25
8,75
5,0
5
2,50
7,50
10,0
6
3,25
6,75
13,0
7
3,75
6,25
15,0
8
4,00
6,00
16,0
Измеряют на фотоколориметре плотность каждого полученного раствора со светофильтром Х = 620 шц, по оси ординат на графике откладывают найденные соответствующие им плотности экстинкции (Е), а по оси абсцисс— соответствующие им концентрации метинона в V W.
Правильно построенный график имеет вид прямой линии.
-м-—
^ Методы контроля
в производстве витамина Р
1 ГОвитамину Р относят ряд веществ, обладаю- щих капилляроукрепляющим действием,
участвующих в окислительно-восстановительных процессах и, возможно, выполняющих другие важные функции в организме. В природе эти вещества представлены очень широко, как в виде агликонов, так и гликозидов. Установлено, что вещества, оказывающие Р-витаминное действие, в основе своей имеют у-бензопиреновое кольцо, сконденсированное с бензольным кольцом; в а-положе- нии к у-бензопиреновому кольцу присоединяется фенильное кольцо.
ОО
О
О
Ряд веществ с Р-витамииными свойствами выделен в чистом виде; некоторые из них получаются путем химического синтеза. К наиболее изученным Р-витамин- ным веществам следует отнести рутин, гесперидии, эрио- диктиол, кверцетин и группу катехинов.
Промышленным способом получения Р-витамйнных веществ является выделение их из естественных источников. Так, для получения рутина и кверцетина иопользу- ют цветы и листья гречихи, для получения рутина—почки и цветы софоры японской, для получения гесперидина и эриодиктиола — кожуру цитрусовых плодов, для получения катехинов — отходы чайной промышленности.
Строение некоторых Р-витаминных веществ следующее:
ноо/он
S/\Z \<ж
Рутин (флавонол)
ноо /0Н
\/\/°\ /о
оИ со
ЭриОдиктиол (флавонон)
RO0/°Н
ноо/Он
1он
со
Кверцетин (агликод рутина)
ноо /0Н
4\ уОСНз
Цбг’
Монометиловый эфир эриодиктиола, гесперидии (агликон гесперидина)
Гесперидии (флавонон)
но0/0Н
|Чон
х/\/\ сн он
L-эпикатехингаллат
= С]2 Н21О9 (дисахарид)
Н
Физико-химические свойства «веществ, обладающих Р-витаринным действиемХарактеристика флавонолыIфлавононыФизико-химические свойства «веществ, обладающих Р-витаринным действиемХарактеристика флавонолыIфлавононыL-эпигаллокатехинL-эпигаллокатехинО.О.НОНОдн СНг ос°-дн СНг ос°-/ОН онХ°н /ОН / он \он/ОН онХ°н /ОН / он \онL-эпигаллокатехингаллатL-эпигаллокатехингаллатL-эпикатехинL-эпикатехин
Физико-химические свойства «веществ, обладающих Р-витаринным действием
Характеристика флавонолыIфлавононы
Физико-химические свойства «веществ, обладающих Р-витаринным действием
Характеристика флавонолыIфлавононы
L-эпигаллокатехин
L-эпигаллокатехин
О.
О.
НО
НО
дн СНг ос°-
дн СНг ос°-
/ОН он
Х°н /ОН / он \он
/ОН он
Х°н /ОН / он \он
L-эпигаллокатехингаллат
L-эпигаллокатехингаллат
L-эпикатехин
L-эпикатехин
Методы анализа Р-витаминных веществ основаны на хроматографическом их разделении, спектрофотометрическом или колориметрическом определении, а также на весовом определении продуктов гидролиза гликозидов (например, рутина).
В основу одного из колориметрических методов определения флавонолов положена реакция Уильсона (Wilson, 1942) с лимонно-борным реактивом, в ходе которой, по мнению Херхаммера и Хензеля (Horhammer, Hanse, 1935), образуется пятичленный клешневидный борный комплекс (см. стр. 282).
Этот комплекс обладает интенсивной окраской и большой устойчивостью, однако химизм этой реакции еще в достаточной степени не изучен.
Реакция образования борного комплекса с флавонолами была применена А, Р. Гусевой и М. Н. Нестюк 281
ОС—coОС—co
ОС—co
ОС—co
к разработанному ими (методу определения кверцетина в листьях эуккомии. Нами на основе этого принципа был разработан метод определения флавонолов в сырье, используемом для получения рутина (гречиха, софора и пр.), и в готовом продукте.
Кроме того, А. А. Сиймом на Таллинском фармацевтическом заводе был разработан упрощенный метод, пригодный для контроля готового продукта, основанный на том, что рутин, будучи подвергнут гидролизу с соляной кислотой, отщепляет сахарный остаток (рут^нозу), в результате чего остающийся кверцетин выпадает в осадок и может быть количественно определен:
С — О — СеН10О3 • СдНцО4С — О — СеН10О3 • СдНцО4НС1НС1+ С13Н21О9+ С13Н21О9
С — О — СеН10О3 • СдНцО4
С — О — СеН10О3 • СдНцО4
НС1
НС1
+ С13Н21О9
+ С13Н21О9
Кроме того, для целей идентификации применяются способы, основанные на хроматографическом разделении указанных соединений.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОЛОВ (РУТИНА И КВЕРЦЕТИНА)В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ
(разработан во-ВНИВИ В. А. Девяткиными Г. А Федоровой, 1959)
Составление калибровочного графика. В мерную колбу емкостью 100 мл помещают точную навеску многократно перекристаллизованного рутина в количестве 10 мг, растворяют в 4 мл абсолютного этилового спирта, доводят сухим ацетонам до метки и тщательно перемешивают.
В кюветы фотоколориметра помещают полученный раствор, лимонно-борный реактив и ацетон в количествах, указанных в табл. 10.
Таблица 10 Составление калибровочного графика флавонолов
Стандартный раствор
Лимонно- бориый
Сухой ацетон
Общий объем
Содержание
№ раствора
реактив
флавонолов в растворе в 7
в миллилитрах
1
2
3
4
5
6
о,1
0,3
0,5
0,7
0,9
1,0
0,4 1,2 2,0 2,8 3,6
4,0
9,5
8,5
7,5
6,5
5,5
5,0
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
10
30
50
70
90
100
Окраску растворов № 1—6 измеряют на электрофотоколориметре со светофильтром 470 тщ откладывая на графике по оси абсцисс концентрацию стандарта в гаммах, а по оси ординат — показания плотности, и строят калибровочный график, соединяя нанесенные точки линией. Правильно построенный трафик имеет вид прямой линии.
Техника метода. Из высушенного и тщательно измельченного растительного материала берут точную навеску в количестве 1—3 г. Навеску помещают в пакет из фильтровальной бумаги, а затем в экстрактор аппарата Сокслета и экстрагируют хлороформом до прекращения
окрашивания растворителя *. По окончании экстракции пакет с навеской подсушивают в вытяжном шкафу до удаления запаха хлороформа, содержимое пакета количественно переносят в круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником, и экстрагируют с помощью 60 мл сухого метилового спирта на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Экстракт сливают в мерную колбу емкостью 200 мл. Извлечение флавонолов повторяют таким же путем еще 2 раза теми же объемами спирта. Объединенные экстракты доводят в мерной колбе метиловым спиртом до объема, перемешивают и фильтруют. Из фильтрата отбирают 10 мл в небольшую колбу, соединенную с холодильником Либиха, метиловый спирт отгоняют досуха, к остатку из пипетки прибавляют 1 мл метилового спирта, растворяют в нем остаток, полученный раствор количественно переносят в мерную колбу емкостью 25 мл; отгоночную колбу дополнительно промывают сухим ацетоном, сливая ацетон в мерную колбу; объем раствора в 'колбе доводят ацетоном до метки и тщательно перемешивают.
Метанольно-ацетоновый раствор фильтруют; из фильтрата отбирают 2 мл в кювету фотоколориметра, туда же приливают 8 мл лимонно-борного реактива, смешанного непосредственно перед употреблением; кювету с содержимым оставляют в темноте на 10 минут, образовавшуюся окраску измеряют на фотоколориметре со светофильтром 470 тц. Для установки прибора на нуль используют сухой ацетон. По калибровочному графику находят соответственно содержание флавонолов в испытуемом растворе.
Контролем на окраску служит смесь, состоящая из 2 мл метанольно-ацетонового испытуемого раствора и 8 мл сухого ацетона. Полученное показание для контроля вычитают из показания для испытуемого.
Содержание флавонолов (рутина и кверцетина) в процентах (х) рассчитывают по формуле:
с-иг - v4-100
а-и3-и4-1000-1000
Извлечение красящих веществ иногда протекает длительное время. Целесообразно в аппарат Сокслета загружать сразу несколько проб.
где: с— найденное по калибровочному графику содержание флавонолов в у;
а — навеска в г;
»1— объем метанольного экстракта в мл;
02— объем метанольного экстракта, взятый для анализа, в мл;
Оз— объем метанольно-ацетоновото раствора в мл;
04— объем метанольно-ацетонового раствора, взятый на реакцию, в мл;
100 —пересчет в %;
пересчет в мг;
1000 — пересчет в г.
При сокращении формула приобретает следующее значение:
_ С-УуУг
Ха • о3 • и4 • 10 000
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЛАВОНОЛОВ В КРИСТАЛЛИЧЕСКОМПРОДУКТЕ
Колориметрический метод
(по прописи В. А. Девятнина и Г. А. Федоровой, химикоаналитическая лаборатория ВНИВИ)
0,02 г кристаллического препарата растворяют в мерной колбе емкостью 200 мл в 8 мл абсолютного метилового спирта и доводят до метки сухим ацетоном. После тщательного перемешивания раствор, если нужно, фильтруют, отбирают 2 мл в кювету фотоколориметра и далее поступают, как указано в предыдущей методике.
Контрольную пробу на естественную окраску не ставят.
Содержание флавонолов (рутина и кверцетина) в в процентах (х) вычисляют по формуле:
с-и-100
а-Уу1000-1000
где с— найденное по калибровочному графику содержание флавонолов в у;
а — навеока в г;
о — объем раствора в мл;
Ui — объем раствора, взятый на реакцию, в мл; 100— пересчет в %;
1000 — пересчет в мг;
пересчет в г.
Весовой метод
(по IX Госфармакопее СССР)
г препарата (точная навеска) кипятят со 100 мл 0,5% раствора соляной кислоты в колбе е обратным холодильником в течение 30 минут. Раствор охлаждают, выделившийся осадок собирают иа предварительно взвешенный стеклянный фильтр (№ 3 или 4), осадок промывают 3—4 раза водой по 10 мл до отрицательной реакции на хлор-ион и сушат при 110° до постоянного веса.
Содержание рутина в процентах (х) вычисляют по формуле:
х = п-2,019-100,
где п — вес осадка в г;
2,019— коэффициент пересчета кверцетина на рутин;
пересчет в %'.
Спектрофотометрический метод определения рутинаи кверцетина
Навеску кристаллического препарата в количестве 0,01 г помещают в Мерную колбу емкостью 100 мл, растворяют в этиловом спирте *; объем раствора в колбе доводят до метки (первое разведение). Отбирают 5 мл раствора и доводят в мерной колбе емкостью 50 мл спиртом (второе разведение). Из полученного раствора (второе разведение) отбирают в кювету спектрофотометра и измеряют поглощение раствором света при 375, 363, 258 и 256 тц, используя в качестве контроля этиловый спирт
Для рутина:
максимум! при X = 363 тр.-Е]*м = 327максимум.; при X = 258 тр,-е{ ^м = 380
Употребляют этиловый спирт, перегнанный для спектральных целей
Для кверцетина:
максимум! при X ■ 375 т^-Е1]^ = 843,7
максимума при X = 256 m[i-E]cM = 702,5
Вычисление экстинкции 1% раствора для кюветы 1 см производят по формуле:
см д-Уд-ЮО’
где Ех — экстинкция найденная;
а — навеска в г;
У1 — объем первого разведения в мл;
о2— объем второго (разведения в мл;
у3— объем раствора, взятый для второго разведения в мл;
100 — пересчет на 1 % раствор.
Содержание рутина или кверцетина в препарате в процентах (xj вычисляют по формуле:
£1-100
где Ех—Ej*M — экстинкция найденная;
Ест.— Е1см для стандарта (ом. данные).
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД РАЗДЕЛЕНИЯИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОЛОВИ ФЛАВОНОНОВ
(разработан В. А. Девяткиным и Г. А. Федоровой, 1961)
Подлежащий изучению растительный материал высушивают в сушильном шкафу и измельчают. Навеску сухого материала в количестве 1—5 г помещают в пакет из фильтровальной бумаги и экстрагируют в аппарате Сокслета сухим хлороформом с целью удаления пигментов и смол. Экстракцию проводят до обесцвечивания растворителя, после чего.пакет с навеской слегка подсушивают до удаления запаха хлороформа.
Навеску из пакета количественно переносят в круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником, и экстрагируют на кипящей водяной бане с помощью 60 мл сухого метилового спирта в течение 30 минут. Экстракт сливают в мерную колбу емкостью 200 мл.
Извлечение Р-витаминных веществ повторяют таким ж^ путем еще 2 раза теми же объемами спирта. Объединенные экстракты доводят в мерной колбе метиловым спиртом до объема, перемешивают и фильтруют.
Из фильтрата отбирают микропипеткой 0,02 мл и наносят в виде пятна на полоску фильтровальной хроматографической бумаги плотностью 120 г/м2 на расстоянии 3 см от ее нижнего конца. Полоску бумаги помещают в герметически закрытый сосуд (цилиндр, вегетационный сосуд, специальная камера), подвешивая ее на стеклянный или стальной крючок к пробке сосуда. На дно сосуда наливают водный 60% раствор уксусной кислоты, полоску бумаги нижним концом (на глубину 1 см) помещают в растворитель, который постепенно поднимается по бумаге и разделяет находящиеся в смеси вещества.
В случае применения радиальной хроматографии диск из фильтровальной бумаги помещают на вставку из фарфора или плексиглаза в эксикатор, на дно которого наливают растворитель. В центр диска через отверстие в бумаге и вставке помещают туго скрученный фитиль из фильтровальной бумаги, опущенный нижним концом в растворитель. На расстоянии 3 см от центра на фильтровальном диске по очерченной карандашом окружности помещают пятна исследуемых веществ. Растворитель, поднимаясь по фитилю, доходит до бумажного диска, растекается равномерно по нему и разделяет кольцеобразно вещества. Разгонка веществ продолжается от 3 до 6 часов. После разгонки хроматограмму высушивают и обрызгивают из пульверизатора 1% спиртовым раствором хлористого алюминия.
Проявленные вещества дают в ультрафиолетовом свете характерную флуоресценцию:
рутин — желтовато-коричневую, R[—0,77 кверцетин —■ светло-зеленую, R[—0,43 гесперидии — желто-зеленую, Rt—0,87.
эриодиктиол—голубоватую, R(—0,78
Пятна веществ, проявленные раствором хлористого алюминия, для дальнейшего количественного определения флавоновых веществ не могут быть использованы. Поэтому параллельно проявляемой хроматограмме в тех
же условиях ставят опыт с контрольной хроматограммой, которую после высушивания не проявляют, как описано, а на нее (накладывают проявленную хроматограмму, очерчивают пятна и точно по ней аккуратно вырезают участки на непроявленной хроматограмме. Вырезанные кусочки бумаги тщательно измельчают ножницами, помещают в точно отмеренное количество (5 или 10) миллилитров абсолютного этилового спирта и экстрагируют при взбалтывании вещества, адсорбированные бумагой.
Профильтрованные элюаты помещают в кювету спектрофотометра и измеряют поглощения для растворов рутина, кверцетина, гесперидина и эриодиктиола.
Предварительно снимают на спектрофотометре абсорбционные кривые для чистых многократно перекристаллизованных до получения постоянной температуры плавления веществ (стандарт), пользуясь этими кривыми при расчете содержания Р-витаминных веществ в хроматографированном материале (желательно иметь наряду с этим контрольную хроматограмму со стандартными веществами).
Расчет содержания веществ в хроматографированном объекте в процентах (х) производят по формуле:
Е-у-у2- 100Х a-yvEvV№
.где Е —- экстинкция найденная;
а — навеока в г;
у — разведение навеоки в мл;
щ — объем раствора, нанесенный на хроматограмму, в мл;
Уг— объем элюата в мл;
Ех — Е^м для стандарта;
100 ( в числителе) — перевод в %;
100 в (знаменателе)—перевод показания спектрофотометра в Е(1^м,
УПРОЩЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯСУММЫ ФЛАВОНОВ
В контроле производства в целях ориентировочного определения качества продукции могут быть использованы упрощенные методы, основанные на том, что флавоновые гликозиды дают со щелочью окрашенные продукты (по-видимому, соединения типа халконов), которые
28928919 В А Девятнин
289
289
могут быть определены колориметрическим путем. Этот Способ был первоначально предложен Лоренцом и Арнольдом (Lorenz, Arnold, 1941) для определения витамина Р в цитрусовых плодах. Он не может иметь широкого распространения и лишь для некоторых продуктов дает достаточно удовлетворительные результаты (драже с витамином Р, плоды шиповника и некоторые другие).
Определение флавонов в драже и таблетках с витамином Р
(разработано В. А. Бадовой и В. А. Планер,Ленинградский филиал ВНИВИ)
Точную навеску мелкоизмельченной в ступке средней пробы драже или таблеток с витамином Р в количестве 1 г помещают в колбу емкостью 100 мл, добавляют 40 мл 2% водного раствора КОН; колбу закрывают пробкой, снабженной воздушным холодильником, помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в ней 15 минут. За -это время в амеси, находящейся в колбе, развивается коричневое окрашивание. По истечении указанного времени колбу вынимают, содержимое ее охлаждают струей воды, а затем количественно переносят -в мерную колбу емкостью 50 мл при помощи 2% водного раствора щелочи и доводят объем раствора в колбе щелочью до метки. После тщательного перемешивания раствора из него отбирают пипеткой 5 мл, переносят в пробирку или стакан, добавляют 5 мл дистиллированной водьц смесь снова перемешивают, если нужно, фильтруют; в прозрачном фильтрате определяют интенсивность окраски при помощи колориметра Дюбоска, пользуясь в качестве стандарта 0,05 н. раствором йода.
Стандартный раствор устанавливают на 15 мм; 1 мл стандартного раствора соответствует' по окраске 0,24 мг витамина Р1.
Содержание витамина Р в миллиграммах в 1 шт. драже (х) вычисляют по формуле:
0,24-й) -у-2-dх =;>
ha-a
Моносахариды при обработке щелочью развивают слабо желтую окраску. По данным В. А. Валовой, 1 г глюкозы дает окраску, соответствующую 13,65 мг флавонов. Это следует иметь в виду при анализе объектов, богатых моносахаридами.
где 0,24 — .количество флаванов, отвечающее по окраске 1 мл стандартного 0,05 н. раствора йода, в мг;
—высота столба стандартного раствора в мм ha — высота столба испытуемого раствора в мм; у — объем раствора в мл;
d— средний вес 1 шт. драже в г; а — навеска драже в г;
— разведение.
Определение флавонов в плодах шиповника
(по прописи В. А. Видовой и биохимической лабораторииВНИВИ)
Навеску 0,5—1 г мелкоизмельченных сухих или 3—5 г свежих плодов шиповника, освобожденных от семян и волосков *, помещают в ступку, добавляют небольшое количество стеклянного порошка. В мерный цилиндр вносят 40 мл 2% водного раствора КОН, из него отливают в ступку 3—5 мл и тщательно растирают содержимое ступки до получения однородной суспензии. Содержимое ступки количественно переносят в коническую колбу емкостью 100 мл, смывая ступку и пестик раствором щелочи из Цилиндра. Объем содержимого колбы доводят оставшимся в цилиндре раствором щелочи до 40 мл, колбу снабжают пробкой с воздушным холодильником и содержимое ее нагревают 15 минут на кипящей водяной бане. По истечении указанного времени колбу вынимают, содержимое ее охлаждают струей воды и количественно переносят в мерную колбу емкостью 50 мл, смывая остаток смеси в колбе 2% раствором КОН.
Объем содержимого мерной колбы доводят раствором щелочи до метки и после тщательного перемешивания фильтруют, отбирают 10 мл фильтрата в стакан- чмк колориметра Дюбоока и сравнивают окраску испытуемого раствора со стандартным 0,05 и. раствором йода, как указано в прописи предыдущего метода.
Если необходимо, фильтрат можно разбавить водой, учитывая дополнительное разведение при расчете полученных результатов.
Вес перикарпия, семян и волосков учитывают при последующих расчетах содержания флавонов в цельных плодах.
19*291
Содержание флавонов в испытуемом образце в процентах (х) вычисляют по формуле:
0,24-Ai-u-100
a-h2-1000
где 0,24—количество флавонов, отвечающее по окраске 1 мл стандартного 0,05 н. раствора йода, в мг;
Ai — высота столба стандартного раствора в мм; и — объем раствора в мл;
100 — пересчет в %;
Аг — высота столба испытуемого раствора в мм; а — навеска в г;
1000 — пересчет в г.
Примечание Так как в шиповнике редуцирующие вещества имеют фенольный характер, поправка на моносахариды во внимание Не принимается.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАТЕХИНОВ В ПРЕПАРАТАХ
Катехины в препаратах могут быть определены колориметрическим путем и титрованием по методу Левенталя, предложенному А. Л. Курсановым и М. Н. Запро- метовым (Институт физиологии растений АН СССР). Колориметрический метод основан на реакции сочетания фенильного радикала катехинов с диазотированным л-нитроанилином. Можно предположить, что это сочетание протекает следующим образом:
Главным направлением реакции является сочетание с фенолами в пара-положении к окси-группе. Ввиду большой реакционной способности n-нитроанилина сочетание может произойти и в орто-, а также в орто- и мета-положении. В результате получается диазосоедине- ние, обладающее интенсивной окраской, как это может иметь место, например, в случае эпикатехингаллата:
Образующуюся окраску сравнивают со стандартом.
Колориметрический метод определения суммы катехиновв препаратах катехинов из чайного листа
(разработан В. А. Девятниным и Г. А. Федоровойво ВНИВИ)
Составление калибровочного графика. Точную навеску 9,6 мг L-эпигаллокатехингаллата растворяют в мерной колбе емкостью 200 мл в воде, доводят раствор водой до метки и тщательно перемешивают. В кюветы фотоколориметра помещают полученный раствор и раствор диазотированного n-нитроанилина в количествах, указанных в табл. 11.
Через 5 минут после добавления реактива окраску каждого из полученных растворов (№ 1—4) измеряют на электрофотоколориметре со светофильтром 440 шц, откладывая на графике по оси абсцисс концентрацию, а по оои ординат — плотности, и строят калибровочный график, соединяя нанесенные на бумагу точки. Правильно построенный график имеет вид прямой линии.
В качестве контроля на окраску попользуют раствор, состоящий из 2 мл диазотированного п-нитроанилина в 60% растворе уксусной кислоты и 2 мл воды. Показания контрольного опыта вычитают из показаний для раствора катехина. Для установки прибора на нуль используют дистиллированную воду.
Таблица 11
Составление калибровочного графика для катехинов
№
В миллилитрах
Содержание L-эпи- галлокате- хин- галлата в 7
раствор катехина
раствор п-нитроанилина
общий объем
1
0,1
9,9
10,0
4,8
2
0,3
9,7
10,0
14,4
3
0,5
9,5
10,0
24,0
4
0,7
9,3
10,0
33,6
Техника метода. Навеску препарата катехинов в количестве 0,01 г переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, растворяют в воде и доводят водой до метки. После тщательного перемешивания раствора отбирают 1 мл в мерную колбу емкостью 25 мл и доводят водой до метки. Ив второго раствора отбирают в кювету фотоколориметра 2 мл, добавляют 8 мл свежеприготовленного уксуснокислого раствора диазотированного п-нитроанилина, кювету с содержимым оставляют на 5 минут, после чего образовавшуюся окраску измеряют на фотоколориметре со светофильтром 440 тр. В качестве контроля на окраску используют раствор, состоящий из 2 мл диазотированного n-нитроанилина, как указано при составлении калибровочного графика.
Содержание катехинов в препарате в пересчете на L-эпигаллокатехингаллат в процентах (х) вычисляют по формуле:
с-у-у2-100a-vv 1000-1000’
где с—найденное по калибровочному графику содержание катехине^ в у;
a— навеска в г;
v —объем испытуемого раствора в мл;
Vi — количество испытуемого раствора, взятое для второго разведения, в мл;
Уг — второе разведение в мл;
100 — пересчет в %;
1000 —пересчет в мг;
1000 — пересчет в г.
Объемный метод определения витамина Р в препаратекатехинов
(по МРТУ-42 № 2819-6I)
Около 0,1 г/препарата (точная навеска) растворяют в небольшом количестве воды в мерной колбе емкостью 100 мл, раствор доводят водой до метки и тщательно перемешивают. 10 мл приготовленного раствора вносят в большую фарфоровую чашку, содержащую 900 мл воды и 25 мл раствора индигокармина. Титруют при тщательном помешивании стеклянной палочкой 0,1 н. раствором КМпО4, вначале быстро приливая основное количество КМПО4, а затем—по каплям до перехода окраски от синей в зеленовато-желтую и затем в желтую
Параллельно ставят контрольный опыт на реактивы в таких же условиях, без испытуемой пробы.
Содержание витамина Р в препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
_ И —Б^бЛ-УуМО
Х a -v^-1000
где А— количество 0,1 н. раствора КМпО4, пошедшее на титрование пробы, в мл;
Б—количество 0,1 н. раствора КМПО4, пошедшее на титрование контрольного опыта, в мл;
щ— объем, до которого доведена навеска, в мл; у2 _ количество раствора, взятое на титрование, в мл;
а — иавеска в г;
4—количество катехинов, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора КМпО4, в мг;1
пересчет в %;
пересчет в г.
Определение витамина Р в таблетках с катехинамии аскорбиновой кислотой
(по ВТУ МО 12-57У
Из подготовленной для анализа средней пробы таблеток отбирают навеску с таким расчетом, чтобы в ней содержалось около 0,1 г витамина Р, растворяют в воде в мерной колбе емкостью 100 мл и доводят водой до метки. После тщательного перемешивания раствор фильтруют через бумажный фильтр Из фильтрата отбирают 1 мл в мерную колбу емкостью 50 мл, туда же добавляют 5 мл 0,1 М фосфатного буфера (pH = 6,2—6,3), 2 мл железотартратного реактива и доводят водой до метки. После тщательного перемешивания интенсивность*
Таблица 12
Пересчет показаний шкалы фотоколориметра в миллиграммах витамина Р
Показания
шкалы
Витамин Р в мг
Показания шкалы
Витамин Р в мг
Показания шкалы
Витамин Р в мг
33,6
104,2
37,0
92,1
40,4
81,8
33,8
103,5
37,2
91,8
40,6
81,0
34,0
102,7
37,4
91,1
40,8
80,6
34,2
101,9
37,6
90,4
41,0
80,2
34,4
101,1
37,8
89,6
41,2
79'3
34,6
100,4
38,0
88,8
41,4
79,1
34,8
99,6
38,2
88,4
41,6
78,5
35,0
98,8
38,4
88,0
41,8
77,5
35,2
98,4
38,6
87,3
42,0
77,1
35,4
97,7
38,8
86,5
42,2
76,7
35,6
96,9
39,0
86,1
42,4
76,2
35,8
96,1
39,2
85,7
42,6
75,6
36,0
95,1
39,4
84,9
/42,8
75,0
36,2
95,0
39,6
84,1
43,0
74,6
36,4
94,2
39,8
83,4
43,2
74,0
36,6
93,5
40,0
83,0
43,4
73,0
36,8
92,7
40,2
82,6
43,6
73,1
1 Метод разработан на Щелковском витаминном заводе
возникшей фиолетовой окраски измеряют при помощи электрофотоколориметра, пользуясь красным светофильтром.
Показания шкалы прибора перечисляют на миллиграммы витамина Р во взятом для анализа количестве вещества по табл. 12.
Содержание витамина Р в 1 шт. таблеток в миллиграммах (х) вычисляют по формуле:
c-d
а
где с—найденное по таблице содержание витамина Р в мг;
d — средний вес 1 шт. таблеток в г;
а — навеска в г.
етоды контроля
в производстве каротина
(синтетического
и природного)
■ ^контРоле полупродуктов синтеза кароти- w на используются методы анализа псевдоионона, бета-иомона и альдегида Си, описанные ранее в разделе «Методы контроля в синтезе витамина А». Ниже описываются разработанные в химико-аналитической лаборатории ВНИВИ И. А Солуниной методы анализа альдегида Си в присутствии его диэтилацеталя, альдегида С]6 и его диэтилацеталя, бутилвинилового и этилпропенилового эфира, а также анализ каротина
ЭТИЛПРОПЕНИЛОВЫЙ ЭФИР
сн3 - сн - СНОС3Н6с5н]0о
М. вес 86
Бесцветная легко летучая жидкость с резким запахом. В очень чистом состоянии незначительно растворим в воде. Смешивается со многими органическими растворителями. Т. кип 69,1—69,4°. Уд. вес 0,7754 (при 20°), [а]2о — 1,3986.
Двойная связь в пропениловом эфире очень легко вступает в реакции присоединения, алкоксигруппа сравнительно мало реакционно способна. На этом основан метод его количественного определения изложенный ниже (стр. 304).
АЛЬДЕГИД р-С14
2 метил-4-(2, 6, 6,-триметилциклогексаи-1-ил-тетра-2-еналь-1)
Н3С СНз
X/ сно
С14Н22ОМ вес 206,32С14Н22ОМ вес 206,32z\/\/s/
С14Н22О
М вес 206,32
С14Н22О
М вес 206,32
СН3
Светло-желтая маслянистая жидкость. Т. кип. 52—55° при 10~3 м'м, п2^ = 1,5111. Легко растворим в органических растворителях, плохо — в воде. Абсорбционный максимум при 230 тц EJ^ =956.
Точную навеску вещества в количестве 50—100 мг, взятую в мерную колбу емкостью 25 мл, в которую предварительно налито около 10 мл 96% этанола, растворяют в 96% этаноле, доводят объем раствора до метки и тщательно перемешивают (основной раствор).
Из этого раствора для определения альдегида Си в колбу с притертой пробкой отбирают количество раствора, соответствующее содержанию в нем 2—4 мт альдегида Си, доводят объем 96%' этанолом до 10 мл, затем добавляют 9 мл 0,5 М водного раствора (С2Н5)4 NOH и 1мл 0,1% раствора желатины. Раствор наливают в ячейку полярографа, пропускают в течение 5 минут ток азота и затем производят съемку полярограммы, начиная с—1,2 в.
Процентное содержание альдегида Си W определяют по калибровочному графику с учетом навеоки и принятых разведений по формуле:
c-v-vrlOOх =(
где с—количество альдегида Си, найденное по калибровочному графику, в мг;
и —объем, в котором растворена навеока, в мл; а— навеска вещества в мт;
Ui—объем раствора, взятый на определение, в мл;
i»2 — общий объем раствора, взятый для поляро- графирования, в мл.
Построение калибровочного графика. В мерной колбе емкостью 25 мл, в которую предварительно налито около 10 мл 96° этанола, взвешивают 50 мг стандартного препарата альдегида 0-С14, растворяют в 96° этаноле, доводят объем раствора до метки и тщательно перемешивают.
Для построения калибровочного графика в колбы с притертой пробкой отбирают количества раствора, соответствующие 1, 2, 3, 4, 5 и 6 мг препарата, и доводят объем каждого из них до 10 мл этанолом, добавляют по 1 мл 0,1% раствора желатины и по 9 мл 0,5 М. раствора (C2H5)4NOH.
ДИЭТИЛАЦЕТАЛЬ АЛЬДЕГИДА ₽-С14ДИЭТИЛАЦЕТАЛЬ АЛЬДЕГИДА ₽-С14Полученные растворы поочередно помещают в ячейку полярографа, пропускают ток. азота в течение 5 минут и снимают полярографические кривые, начиная с—1,2 в. Высоты волн— величины диффузного тока в микроам- перах — наносят на график по оси ординат, а по оси абсцисс откладывают -соответствующие им концентрации раствора в миллиграммах.
ДИЭТИЛАЦЕТАЛЬ АЛЬДЕГИДА ₽-С14
ДИЭТИЛАЦЕТАЛЬ АЛЬДЕГИДА ₽-С14
Н3С СНз СНз
^18^32^2М. вес 280,25^18^32^2М. вес 280,25Х/\/\/ОС2Нб
^18^32^2
М. вес 280,25
^18^32^2
М. вес 280,25
|ХОС3Н5
Х/\н3
Маслообразная желтая жидкость, легко растворима в органических растворителях, плохо растворима в воде. Т. кип. 87—90° при 0,2 мм, п^° = 1,4773.
Для определения ацеталя альдегида Си из основного раствора (см. метод определения альдегида Си) отбирают пипеткой в колбу с притертой пробкой количество раствора, соответствующее содержанию в нем 2—4 мг ацеталя, доводят объем до 10 мл 96° этанолом, затем добавляют 9 мл ацетатного буферного раствора с рН = 3 и 1 мл 0,1% раствора желатины и снимают полярогра- фичеокие кривые, как описано выше.
Суммарное содержание альдегида Си в процентах (у), имеющегося в образце и полученного из ацеталя, находят по калибровочному графику, составленному по 300
стандартному препарату ацеталя в пересчете на альдегид См, на фоне ацетатного буферного раствора рН=3.
Формула расчета следующая:
с-и-«о-100
У =,
a-Vt
где с—количество альдегида См, найденное по калибровочному графику, в мг;
у — объем, в котором растворена навеска, в мл;
а— навеска в мг;
У1 — объем раствора, взятый па определение, в мл;
т>2 — общий объем раствора, взятый для поляро- трафирования, в мл.
Для расчета процентного содержания ацеталя (2) пользуются следующей формулой:
z = (у —х). 1,3592,
где у—суммарное содержание альдегида См, найденное по калибровочному графику на фоне ацетатного буферного раствора с рН = 3, в %;
х — содержание альдегида См, найденное по калибровочному графику на фоне 0,5 М (C2H5)4NOH, в %;
1,3592—коэффициент пересчета альдегида См на ацеталь.
АЛЬДЕГИД P-См
4-метил-6-12,6', 6', 6/-триметилциклогексен-1/-ил-(гек- са-3,4-диеналь-1).
Н3С СН3 СН3
Х/\А/\С16Н24О
М. вес 232,19
Х/\н3
Светло-желтые кристаллы. Т. пл. 77—78°. Легко растворим в органических растворителях, плохо — в воде. Абсорбционный максимум при 276—280 шц (спирт), 1347.
Точную навеску вещества в количестве 50—100 мг, взятую в мерную колбу с притертой пробкой емкостью 25 мл, в которую предварительно налито около 10 мл 96” этанола, растворяют в 96° этаноле, доводят объем раствора до метки и перемешивают (основной раствор).
Для определения альдегида tp-CI6 из этого раствора в колбу с притертой пробкой отбирают количество раствора, соответствующее содержанию в нем 2—3 мг альдегида i0-Ci6, доводят объем 96° этанолом до 10 мл, затем добавляют 9 мл 0,2 М водного раствора (С2Н5)4 NOH и 1 мл 0,1 % раствора желатины.
Раствор помещают в ячейку поляропрафа, пропускают в течение 5 минут ток азота и снимают полярограмму, начиная с—1,0 в.
Содержание альдегида р-С!6 (х) в процентах вычисляют по формуле:
с-у4-у. 100X =f
ПХе. с—количество альдегида .p-Cie, найденное по калибровочному графику, в мг;
и — объем, в котором растворена навеска, в мл; а— навеска в мг;
О1 — объем раствора, взятый на определение, в мл;
п2 — общий объем раствора, взятый для поляро- графирования, в мл.
Построение калибровочного графика. В мерной колбе с притертой пробкой емкостью 25 мл, в которую предварительно налито около 10 мл 96° этанола, взвешивают 50 мг стандартного препарата альдегида ip-Ci6 (точная навеска), растворяют в 96° этаноле, доводят объем раствора до метки и тщательно перемешивают.
Для построения калибровочного графика в колбы с притертыми пробками отбирают количества рабтвора, соответствующие 1, 2, 3, 4, 5 и 6 мг альдегида, доводят объем каждого из них до 10 мл 96° этанолом, добавляют по 9 мл 0,2 М раствора (С2Н5)4 NOH и по 1 мл 0,1% раствора желатины.
Полученные растворы поочередно помещают в ячейку полярографа, пропускают ток азота в течение, 5 минут и снимают полярограммы, начиная с—1,0 в. Высота волн—величины диффузионного тока в микроамперах— 302
наносят на график по оси ординат, а по оси абсцисс откладывают соответствующие им концентрации растворов в миллиграммах.
ДИЭТИЛАЦЕТАЛЬ АЛЬДЕГИДА р-С16
Н3С СН3 СНз
\/ I ОС2Н5 /х/\/\/\/с20н34о3
иМ. вес 306,27
UC2H5
Х/\н3
Желтая маслообразная жидкость, растворимая в органических растворителях, нерастворимая в воде. Т. кжт. 135° при 0,1 мм, п ® = 1,5082. Абсорбционный- макси- м'ум при 237 тц, Е. }^м = 950 (спирт).
Для определения ацеталя альдегида p-*Ci6 из основного раствора (см. метод определения альдегида Р-С15) отбирают пипеткой в колбу с притертой пробкой 2—3 мл раствора, соответствующего содержайию в нем 2—4 мт ацеталя, доводят объем до 10 мл 96° этанолам, затем добавляют 9 мл ацетатного буферного раствора с рН = 3 и 1 мл 0,1% раствора желатины. Полярографические кривые снимают, начиная с—0,6 в, как описано выше.
Суммарное содержание альдегида p-Ci6 в процентах (у) vимеющегося в образце и полученного из ацеталя при омылении его в кислом буферном растворе, нахбдят по калибровочному Трафику, составленному по стандартному препарату ацеталя, в пересчете на альдегид Р-С16, на фоне ацетатного буферного раствора с рН = 3. Формула расчета следующая:
c-v-Vo-100
У =
a-uv
где с —количество альдегида p-Ci6, найденное по калибровочному графику, в мг;
и — объем, в котором растворена навеска, в мл; а — навеска в мг;
»1 — объем раствора, взятый на определение, в мл;
и2 — общий объем раствора, взятый для поляро- графирования, в мл.
Для расчета процентного содержания ацеталя (г) Пользуются следующей формулой:
г = (у — х\ 1,319,
где у—суммарное содержание альдегида р-С15, найденное по калибровочному графику на фоне ацетатного буферного раствора с рН = 3, в %;
х — содержание остаточного альдегида р-С16, найденное по калибровочному графику на фоне 0,2 М раствора (С2Н5)4 NOH, в %;
1,319 — коэффициент пересчета альдегида 0-С16 на ацеталь.
Построение калибровочного графика. В мерной колбе с притертой пробкой емкостью 25 мл, в которую предварительно налито около 10 мл 96° этанола, взвешивают 50 мг стандартного препарата диэтилацеталя альдегида Р-С16, растворяют в 96° этаноле, доводят объем до метки и тщательно перемешивают.
Для построения калибровочного графика в колбы с притертыми пробками отбираю? количества раствора, соответствующие 1, 2, 3, 4, 5 и 6 мг ацеталя, доводят объем каждого из них до 10 мл 96° этанолом, добавляют по 9 мл ацетатного буферного раствора с рН = 3 и по 1 мл 0,1 % раствора желатины.
Полученные растворы поочередно помещают в ячейку полярографа, пропускают в течение 5 минут ток азота и снимают полярограммы, начиная с—0,6 в. Высоты волн—величины диффузионного тока в микроамперах— наносят на график по оси ординат, а по оси абсцисс откладывают соответствующие им концентрации ацеталя в пересчете на альдегид, в миллиграммах.
БУТИЛВИНИЛОВЫЙ И ЭТИЛПРОПЕНИЛОВЫЙЭФИРЫ
Точную навеску эфира в количестве 0,05—0,08 г, взятую в колбу с притертой пробкой, в которую предварительно налито 5 мл метанола, заливают 25 мл 0,5 н. солянокислого гидроксиламина и выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре. Образовавшуюся в результате реакции кислоту оттитровывают точным 0,5 н. раствором КОН в присутствии индикатора бром-
фенолового синего до появлений синей окраски контрольного опыта, который проводится в тех же условиях.
Расчет содержания эфира в образце в процентах (х) производят по формуле:
(у — гц)-0,5-МЛ 00
Х = я-1000’
где и — количество точного 0,5 н. раствора КОН, пошедшее на титрование опыта, в мл;
О1 — количество точного 0,5 н. раствора КОН, пошедшее на титрование контроля, в мл;
М— молекулярный вес эфира (бутилвиниловый эфир — 100, этилпропениловый эфир — 86,08);
а — навеска в г.
— количество— количествоэфира, соответствующееэфира, соответствующее„0,5 М
— количество
— количество
эфира, соответствующее
эфира, соответствующее
Примечание. — р1000
1 мл 0,1 и. раствора КОН в г.
Ртутно-ацетатный метод
Метод основан на реакции ненасыщенных эфиров с избытком ацетата ртути в метаноле при —10°: в результате реакции освобождается уксусная кислота, которую оттитровывают раствором КОН в метаноле. Избыток ацетата ртути Превращают в бромид добавлением бромистого натрия.
Точную навеску эфира в количестве 0,05—0,08 г, взятую в колбу с притертой пробкой, в которую предварительно налито 25 мл 4% ацетата ртути _в метаноле, выдерживают в ледяной бане (используется баня с кусочками льда в метаноле) в течение 10 минут. Затем в колбу добавляют 2 г кристаллического бромистого натрия, энергично перемешивают до полного его растворения и тотчас же титруют в присутствии 1% раствора фенолфталеина в абсолютном метаноле точным 0,1 М раствором КОН в метаноле до появления розового окрашивания контрольного опыта, который проводят в тех же условиях. Температура раствора при титровании не должна превышать 15°.
30530520 в- А. Девятннн
305
305
Расчет содержания эфира в процентах (х) произвб1 дят по следующей формуле:
(и — v^-Af-0,1 • 100
Х== а-1000
где о — количество точного метанольного 0,1 н. раствора КОН, пошедшее на титрование опыта, в мл;
01 — количество точного метанольного 0,1 н. раствора КОН, пошедшее на титрование контроля, в мл;
М —молекулярный вес эфира в г (см. выше); а — навеска в г.
КАРОТИН
Каротин является провитамином А. Образуется в растениях. В организме животного превращается в витамин А. Почти единственным источником для образования витамина А в животном организме являются, по- вцдимому, каротиноиды растительного происхождения.' Наибольшее значение для животного организма имеет 0-каротин, обладающий следующим строением:
Н3С СН3СН3СН3
/\С-СН = СН-С = СН-СН = СН-С=СН-СН
Н3СН3С^^СНз
Н3С
Н3С
СН3
= сн-сн = с — сн = сн-сн
Каротин и его растворы обладают интенсивной желто-оранжевой окраской.
Промышленными препаратами 0-каротина является синтетический 0-каротин, а также масляные концентраты каротина, получаемого из моркови и витаминной тыквы, а также концентраты каротина из облепихи.
В обнове существующих методов определения карб- тина лежит естественная желтая окраска его растворов, которая легко поддается колориметрированию со стандартными растворами, а также свойство каротина поглощать свет в видимой области спектра.
Физико-химические свойства 0-каротина
Показатель
Характеристика
Состояние вещества
Интенсивно оранжево-красные кристаллы ромбической формы с ме-
Формула
Молекулярный вес
Температура плавления
Растворимость
таллическим блеском
С40Н56
536,85 183—184°'
В воде нерастворим. В этиловом спирте растворим очень слабо. Растворяется во многих органических рас-
Оптическая активность
Биологическая активность
Максимум абсорбции
творителях
Неактивен
В 1 г кристаллического продукта
1 660 000 ИЕ витамина А
456 тц (в бензоле) и 465 тц (в хло-
Флуоресценция
Коэффициент экстинк- ции
реформе)
^Wm = 2400 (при 455 тц) и 2396 (при 465 тц)
1 181—182° по Кноблоху.
Каротин в естественных объектах сопровождается другими каротиноидами, многие из которых не обладают провитаминными свойствами. Поэтому методы анализа каротина в естественных объектах предусматривают обязательное отделение сопутствующих примесей, которое осуществляется с помощью хроматографической адсорбции.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРОТИНА В СВЕЖЕМ РАСТИТЕЛЬНОММАТЕРИАЛЕ
(по Гост 6604-53)
Первый вариант. Навеску от 1 до 50 г (в зависимости от предполагаемого содержания каротина) растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством
йрокйлённого и промытого песка или измельченного стекла. Растертый в ступке материал обрабатывают 5—10-кратным по отношению к взятой навеске количеством 96% спирта. Затем в ступку добавляют порциями 20—30 мл бензина или петролейного эфира, смесь снова тщательно растирают, экстракт фильтруют через бумажный фильтр (стараться не переносить осадок на фильтр).
Экстрагирование петролейным эфиром повторяют до тех пор, пока бензин перестанет окрашиваться. Бензиновые (или петролейные) фильтраты переносят в делительную воронку, добавляют несколько миллилитров воды до полного (разделения слоев: верхний слой бензиновый (или петролейный), нижний—спиртовой. Спиртовой слой сливают в другую делительную воронку и промывают 2 раза бензином (или петролейным эфиром) порциями по 10 мл. Бензиновые или петролейные вытяжки присоединяют к основному раствору, переносят в колбу и концентрируют на водяной бане в вакууме до 20—30 мл.
К экстракту прибавляют приблизительно равный объем 5% спиртовой щелочи и омыляют в течение Уз—1 часа на водяной бане с воздушным обратным холодильником при температуре кипения спиртовой щелочи. Омыленный раствор переносят в делительную воронку и туда же прибавляют несколько миллилитров воды до разделения слоев. Смесь взбалтывают и производят отделение бензинового (или петролейного) слоя. Бензиновый (или петролейный) раствор промывают 8—10 раз дистиллированной водой. Отмытый бензиновый (илипет- ролейный) раствор сушат в колбе обезвоженным сульфатом натрия при взбалтывании до исчезновения мутности раствора, затем экстракт фильтруют и сгущают в колбе до объема 5—10 мл. Сгущенный экстракт пропускают под небольшим отрицательным давлением через адсорбционную колонку, наполненную адсорбентом.
Второй в ар и а н т. Отличается от первого тем, что вначале проводится омыление навески с последующим переводом неомыляемой фракции в бензин (или петролейный эфир). Указанную в первом варианте навеску растирают в фарфоровой ступке с небольшим количествам прокаленного и промытого песка или
измельченного стекла, затем материал количественно переносят в колбу для омыления, прибавляют 20—40 мл 5% 'Спиртовой щелочи и нагревают на водяной бане с обратным или воздушным холодильником при температуре кипения спиртовой щелочи в течение ’/г—1 часа. Затем раствор переносят в делительную воронку, прибавляют 20—30 мл бензина (или петролейного эфира) и несколько миллилитров воды (до разделения слоев). Смесь взбалтывают и производят отделение бензинового (или петролейного) слоя. Извлечение неомыляемых повторяют до получения бесцветных бензиновых вытяжек..
Оставшуюся в колбе после омыления массу промывают несколько раз бензином, а полученные бензиновые вытяжки присоединяют к основному раствору. Далее поступают, как указано выше.
Адсорбция на окиси магния или окиси алюминияи подготовка к колориметрированию
Адсорбционная колонка представляет собой суженную внизу стеклянную трубку длиной 15—20 см и диаметром 1—1,5 см. Эту трубку вставляют в резиновую пробку, предварительно подобранную к колбе для отсасывания. (Последняя при помощи резиновой трубки соединяется с предохранительной склянкой, которая в свою очередь соединяется с водоструйным насосом или с иным приспособлением для создания вакуума
В нижней части адсорбционной колонки помещают небольшой слой ваты. Для наполнения адсорбционной колонки адсорбентом приготовляют кашицу из адсорбента и бензина (или петролейного эфира). Этой кашицей заполняют колонку на 4—6 см и промывают небольшими порциями бензина (или петролейного эфира). Необходимо при этом избегать образования пузырьков воздуха между кашицей и стенками трубки и следить за тем, чтобы перед началом адсорбции и во время нее верхний слой кашицы был покрыт ^небольшим слоем бензина (или петролейного эфира) во избежание прохождения воздуха в адсорбционную колонку. Через колонку пропускают испытуемый раствор в таком коли-
честве, чтобы он полностью поглотился адсорбентом, затем промывание колонки бензином (или петролейным эфиром) продолжают до тех пор, пока через колонку станет проходить бесцветная жидкость. Прошедший через колонку раствор каротина доводят в .мерной колбе до определенного объема путем прибавления бензина (или петролейного эфира) и колориметрируют *.
Колориметрирование
Колориметрирование проводят с помощью колориметра Дюбоска со стандартным раствором азобензола или бихромата калия (или колориметров других систем, включая штуфенфотометр или э;Тектрофотоколориметр).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРОТИНА В СУХОМ РАСТИТЕЛЬНОММАТЕРИАЛЕ
Первый вариант. Навеску от 1 до 20 г (в зависимости от предполагаемого содержания каротина) измельчают, обрабатывают бензином или петролейным эфиром, но без предварительной обработки спиртом. Бензиновые (или петролейные) экстракты сгущают дю объема 20—30 мл и омыляют 5% спиртовой калийной щелочью. Дальнейшее определение каротина проводят, как и в случае его определения в свежих растительных объектах.
Второй вариант. Отличается от первого тем, что вначале Проводится омыление исследуемого объекта с последующим переводом в бензин неомыляемой фракции.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРОТИНА В РАСТИТЕЛЬНЫХ СОКАХ
100 мл сока нагревают до 70—80° и прибавляют к нему 20—40 мл 5% раствора сернокислого алюминия или 5% раствора (алюмокалиевых квасцов и оставляют на, 1 час при комнатной температуре, затем центрифугируют, раствор сливают, а с осадком поступают так же, как при исследовании свежего растительного материала.
Р. Ц. Абельсон показала, что при добавлении к петролейному эфиру 1—3% ацетона удается хорошо и быстро разделять каротиноиды на колонке с окисью алюминия.
При исследовании сока некоторых растений (например, цитрусовых) рекомендуется перед осаждением (квасцами или сернокислым алюминием) разбавлять сок водой -в 5—6 раз.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРОТИНА В ЖИРАХ, МАСЛАХИ МАСЛЯНЫХ РАСТВОРАХ КАРОТИНА
К навеске жира или масла от 0,20 до 1 г (в зависимости от содержания каротина) прибавляют 10 мл 5% раствора калийной спиртовой щелочи и смесь омыляют при 80° в течение 1 часа на водяной бане с обратным воздушным или водяным холодильником. Омыленный раствор переносят в делительную воронку, прибавляют 20 мл воды и экстрагируют бензином или петролейным эфиром несколько раз (беря на каждую экстракцию по 25—30 мл) до тех пор, пока экстракционная жидкость перестанет окрашиваться. Бензиновые йли петролейно- эфирные вытяжки соединяют и затем поступают, как указано выше.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРОТИНА В КРИСТАЛЛИЧЕСКИХПРЕПАРАТАХ
Навеску кристаллического каротина в количестве около 0,1 г, взятую на аналитических весах, количественно переносят в мерную -колбу емкостью 250 мл при помощи 100 мл петролейного эфира; колбу с содержи-, мым слегка подогревают на водяной бане до полного растворения кристаллов. По охлаждении объем раствора доводят до метки. Из полученного раствора отбирают 5 мл и подвергают хроматографической адсорбции, как указано.
Элюат переносят количественно в мерную колбу емкостью 100 мл, объем раствора доводят до метки растворителем. После тщательного перемешивания содержимого колбы из нее отбирают 5 мл раствора в мерную колбу емкостью 50 мл, объем раствора в колбе доводят до метки и после тщательного перемешивания раствор подвергают колориметрированию.
При пользовании стандартным раствором азобензола содержание каротина в миллиграмм-процентах (х) вычисляют по следующей формуле:
О,ОО235-7г-и-100х =,
h, -а
где у — объем фильтрата после хроматографической адсорбции в мл;
h — показание шкалы стандартного раствора в мм (обычно ставится на 10 мм);
/ц — показание шкалы испытуемого раствора в мм (допустимые колебания в толщийе столба исследуемого раствора от 8 до 12 мм);
а — навеска в г;
0,00235—количество каротина в 1 мл раствора, соответствующее по окраске стандартному раствору в мг.
При пользовании стандартным раствором бихромата калия содержание каротина в миллиграмм-процентах (х2) вычисляют по следующей формуле:
0,00208-й-v100х^ :=,
hva
где 0,00208— количество каротина в миллиграммах в 1 мл раствора, соответствующее по окраске стандартному раствору.
Остальные обозначения те же, что и выше.
При пользовании электрофотоколориметром:
K-hvvA00
Xi = -,
a-h
где К— 1) 0,00208 — количество каротина в мг, соответствующее по окраске 1 мл стандартного раствора бихромата калия;
0,00235 то же при пользовании в качестве стандарта азобензолом;
hi —показание шкалы реохорды для испытуемого раствора;
h — то же для стандартного раствора. Остальные обозначения см. выше,
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА А В ПРОДУКТАХ, СОДЕРЖАЩИХОДНОВРЕМЕННО КАРОТИН
Вначале проводят определение приведенным указаниям. ЗатемВначале проводят определение приведенным указаниям. Затемкаротина согласно определяют интенсив-каротина согласно определяют интенсив-ность сйнеи окраски неомыляемой фракции исследуемого объекта с треххлористой сурьмой, поступая так же, как и при определении витамина А в продуктах, не содержащих каротина. Из полученного количества синих единиц вычитают синие единицы, приходящиеся на долю каротина, согласно приведенным в табл. 13 данным.Содержание витамина А в граммах на 1 г навески (xi) или в интернациональных единицах на 1 г навески (хг) вычисляют по формуле:v-20-125(rf—е)а-1000y-20-125(<Z —е)'2 а-1000-0,3ность сйнеи окраски неомыляемой фракции исследуемого объекта с треххлористой сурьмой, поступая так же, как и при определении витамина А в продуктах, не содержащих каротина. Из полученного количества синих единиц вычитают синие единицы, приходящиеся на долю каротина, согласно приведенным в табл. 13 данным.Содержание витамина А в граммах на 1 г навески (xi) или в интернациональных единицах на 1 г навески (хг) вычисляют по формуле:v-20-125(rf—е)а-1000y-20-125(<Z —е)'2 а-1000-0,3Число синих единиц1Содержание каротина в 7 в 1 мл0,55,50,710,51,016,51,324,51,5291,8372,0452,3562,5642,8753,0833,3933,51013,8ПО4,0117Число синих единиц1Содержание каротина в 7 в 1 мл0,55,50,710,51,016,51,324,51,5291,8372,0452,3562,5642,8753,0833,3933,51013,8ПО4,0117Таблица 13Таблица 13Таблица перевода синих единиц каротинаТаблица перевода синих единиц каротина1 Синие единицы и единицы CLO—условные; при смешивании 20 мг эталонного рыбьего жира с треххлористой сурьмой развивается окраска, условно принимаемая за 10 синих единиц. Эта величина соответствует 1 единице CLO.1 Синие единицы и единицы CLO—условные; при смешивании 20 мг эталонного рыбьего жира с треххлористой сурьмой развивается окраска, условно принимаемая за 10 синих единиц. Эта величина соответствует 1 единице CLO.
Вначале проводят определение приведенным указаниям. Затем
Вначале проводят определение приведенным указаниям. Затем
каротина согласно определяют интенсив-
каротина согласно определяют интенсив-
ность сйнеи окраски неомыляемой фракции исследуемого объекта с треххлористой сурьмой, поступая так же, как и при определении витамина А в продуктах, не содержащих каротина. Из полученного количества синих единиц вычитают синие единицы, приходящиеся на долю каротина, согласно приведенным в табл. 13 данным.
Содержание витамина А в граммах на 1 г навески (xi) или в интернациональных единицах на 1 г навески (хг) вычисляют по формуле:
v-20-125(rf—е)а-1000
y-20-125(<Z —е)'
2 а-1000-0,3
ность сйнеи окраски неомыляемой фракции исследуемого объекта с треххлористой сурьмой, поступая так же, как и при определении витамина А в продуктах, не содержащих каротина. Из полученного количества синих единиц вычитают синие единицы, приходящиеся на долю каротина, согласно приведенным в табл. 13 данным.
Содержание витамина А в граммах на 1 г навески (xi) или в интернациональных единицах на 1 г навески (хг) вычисляют по формуле:
v-20-125(rf—е)а-1000
y-20-125(<Z —е)'
2 а-1000-0,3
Число синих единиц1
Содержание каротина в 7 в 1 мл
0,5
5,5
0,7
10,5
1,0
16,5
1,3
24,5
1,5
29
1,8
37
2,0
45
2,3
56
2,5
64
2,8
75
3,0
83
3,3
93
3,5
101
3,8
ПО
4,0
117
Число синих единиц1
Содержание каротина в 7 в 1 мл
0,5
5,5
0,7
10,5
1,0
16,5
1,3
24,5
1,5
29
1,8
37
2,0
45
2,3
56
2,5
64
2,8
75
3,0
83
3,3
93
3,5
101
3,8
ПО
4,0
117
Таблица 13
Таблица 13
Таблица перевода синих единиц каротина
Таблица перевода синих единиц каротина
1 Синие единицы и единицы CLO—условные; при смешивании 20 мг эталонного рыбьего жира с треххлористой сурьмой развивается окраска, условно принимаемая за 10 синих единиц. Эта величина соответствует 1 единице CLO.
1 Синие единицы и единицы CLO—условные; при смешивании 20 мг эталонного рыбьего жира с треххлористой сурьмой развивается окраска, условно принимаемая за 10 синих единиц. Эта величина соответствует 1 единице CLO.
где
"О— объем хлороформного раствора в мл; а— навеска в г;
d—- количество синих единиц, установленное на основании колориметрирования;
е— количество синих единиц, приходящихся на долю каротщна;
0,3;20;125 и 1000— постоянные коэффициенты.
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯКАРОТИНА
Биологическая, (провитаминная активность различных каротиноидов неодинакова: если за 100% принять транс- Р-иаротин, то активность других каротиноидов будет соответственно меньшей Таблица 14 (g j стиллер; 1952). Био- Биологическая активность логическая активность неко-
КаротиноидАктивность в процентах к транс- (3-каротйнуКриптоксантин57Транс-а-каротин53Про-у-каротин44Нео-Р-каротин U38Траис-у-каротин28Нео-а-каротин16Нео-а-каротин U13КаротиноидАктивность в процентах к транс- (3-каротйнуКриптоксантин57Транс-а-каротин53Про-у-каротин44Нео-Р-каротин U38Траис-у-каротин28Нео-а-каротин16Нео-а-каротин U13каротииоидовкаротииоидовОколо 0,02Около 0,02ГГкаротинакаротинаторых каротиноидов показана в табл. 14.
Каротиноид
Активность в процентах к транс- (3-каротйну
Криптоксантин
57
Транс-а-каротин
53
Про-у-каротин
44
Нео-Р-каротин U
38
Траис-у-каротин
28
Нео-а-каротин
16
Нео-а-каротин U
13
Каротиноид
Активность в процентах к транс- (3-каротйну
Криптоксантин
57
Транс-а-каротин
53
Про-у-каротин
44
Нео-Р-каротин U
38
Траис-у-каротин
28
Нео-а-каротин
16
Нео-а-каротин U
13
каротииоидов
каротииоидов
Около 0,02
Около 0,02
Г
Г
каротина
каротина
Спектрофотометрический метод в сочетании с методом хроматографической адсорбции дает возможность раздельного определения каротиноидов, что позволяет проводить оценку биологических свойств растительного сырья, используемого для получения препаратов, и готовых препаратов \
(точная навеока) растворяют
в хлороформе в мерной колбе емкостью 200 мл, доводят раствор хлороформом до метки и тщательно перемешивают (раствор А). 2 мл раствора А переносят в мерную колбу емкостью 100 мл, доводят хлороформом до метки
и тщательно перемешивают (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 465 ту (табл. 15).
Содержание каротина в препарате в процентах (х) вычисляют по формуле:
Д-УгУз-ЮО,а-о2-2396
где D—найденная оптическая плотность раствора Б;
а — навеска в г;
Uj —объем первого разведения в мл (раствор А);
Methods of analisis. Ass. off. agric, chem. 6 ed. Washington, 1945. Применяют также в качестве растворителя петролейный эфир, Н — гексан и др.
u2— количество раствора А, взятое для второго разведения в мл (раствор Б);
2396 — Е} сМ —удельный показатель поглощения при длине волны 465 тц.
Таблица 15
Абсорбционные максимумы изомеров p-каротина в петролейном эфире
Каротиноиды
Хтр.-максимум
Автор
а-каротин Р-каротин у-каротин
6-каротин
Нео-(3-каротин V Нео-Р-каротин U Транс-Р-каротин Нео-Р-каротин А Нео-Р-каротин В
475—478; 446,5—447,5
480—486; 451—453,5
490—495; 460—463;
400—407,5
484; 454; 428
472,5 441,5
481; 450
485; 452
469; 437,5
475,5; 444,5
Б. Савинов (1948)
Он же
Кноблох (1956)
Он же
» »
астъ третья
ПРИГОТОВЛЕНИЕ
НЕКОТОРЫХ РЕАКТИВОВ
Приготовление реактивов описывается в ряде методических руководств и пособий, а также в Госфармакопее СССР IX издания. В настоящем разделе описаны лишь те из них, которые являются оригинальными или предложенными авторами изложенных мето- дов и поэтому мало известными широкому кругу химиков-аналитиков. В этом же разделе описывается также подготовка некоторых адсорбентов, применяемых в хроматографическом разделении витаминов от примесей, а также установка титрованных растворов, специфических для определения некоторых витаминов.
сновные реактивы
и адсорбенты
АА
А
А
л ю м и н и й х л о ip и с т ы й, 1 % раствор в аб солютном этиловом спирте.
Аммиачный раствор (для определения иона Са). 13,5 г хлористого аммония и 88 мл концентрированного раствора аммиака (около 25%) смешивают в мерной колбе емкостью 250 мл и доводят водой до метки.
Аммиачный буферный ра створ. В мерную колбу емкостью 1 л помещают 160 г хлористого аммония, растворяют в 600—700 мл воды, перемешивают до полного растворения, прибавляют 160 мл 27% раствора аммиака и доводят до 1 л водой.
Анилин, спиртовой раствор. Один объем
свежеперегнанного над цинковой пылью анилина растворяют в 6 объемах 96% этилового спирта. Раствор должен быть бесцветным (хранят в склянках темного стекла с притертой пробкой в темноте и на холоду с предосторожностью).
Аскорбиновая • кислота (стандартный раствор) (по Шварцу и Вильямсу). Приготовляют раствор, содержащий 1,5 мг аскорбиновой кислоты в 1 мл ацетатно-фосфатного реактива. Путем соответствующего разведения из него готовят серию стандартов- эталонов с содержанием от 1 до 30 у аскорбиновой кислоты в 1 мл для построения калибровочного графика.
А ц е та т н о-ф о с ф а тн ы й реактив. Приготовляют 5% раствор метафосфорной кислоты в 10%
СНзСООН (служит для экстракции и разведения, по Шварцу и Вильямсу).
Ацетатный буферный раствор (pH = 7,0). 0,1 н. раствор уксуснокислого натрия в 75% -этиловом спирте доводят до pH = 7,0 добавлением уксусной кислоты (применяется в полярографии токоферолов).
Ацетатный буферный раствор (рН = 3,0). Приготовляю^ из 0,1 н. раствора уксуснокислого натрия и ледяной уксусной кислоты, проверяя pH потенциометрически.
Азобензол ч. д. а. Стандартный раствор готовят путем растворения 14,5 мг кристаллического химически чистого азобензола в 100 мл 96% этилового спирта; 1 мл такого раствора по окраске соответствует 0,00235 мг каротина в 1 мл.
Ацетилхлорид. Т. кип. 51°. Сохраняют в склянке или капельнице темного стекла с притертой пробкой.
Бензин (т. кип. 70—80°) или петролейный эфир (т. кип. 55—70°). Можно использовать также фракции, перегоняющиеся при 70—110°, однако в этом случае при сгущении экстрактов приходится пользоваться вместо водяной песчаной баней и отгонку вести в токе СО2.
Бензол. Бензол очищают от тиофена обработкой серной кислотой до отсутствия окрашивания с изатином, Для этого к 1 л бензола в делительной воронке добавляют 200 мл концентрированной серной кислоты и взбалтывают в течение 1 часа на лабораторной мешалке, слой кислоты сливают и повторяют эту операцию еще раз. Отделенный от кислоты бензол промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции на лакмус, сушат в течение 12—18 часов над безводным сернокислым натрием и перегоняют на водяной бане при 80°.
Борная кислота (раствор) (для анализа оксидиамина и пиридоксина). 5 г борной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
Бром химически чистый, уд. вес. 3,2. Хранят с особой предосторожностью в склянке с притертой пробкой, помещенной в жестяную банку, заполненную песком.
Бромтимоловый синий (индикатор). 0,1 г хорошо растертого индикатора растворяют в 20 мл теплого спирта и по охлаждении доводят водой- до 100 мл.
Бромфеноловый синий (индикатор). 0,1 г индикатора заливают в стакане 3 мл 0,005 н. раствора NaOH и затем горячей водой. После полного растворения раствор переносят в мерную колбу емкостью 250 мл и доводят водой до метки.
Бром феноловый синий (для реакции оксидирования). 0,1 г индикатора растирают в ступке с 3 мл V20 н. раствора NaOH, после полного растворения индикатора раствор доводят водой до 20 мл.
Вода хлорная. Через воду пропускают ток хлора, который получают действием перманганата на соляную кислоту. Сохраняют в темной склянке с притертой пробкой.
Гидроксиламин солянокислый (0,5 н. раствор). Растворяют 34,75 г солянокислого гидроксиламина в мерной колбе емкостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки.
Гидроксиламин солянокислый, раствор (для реакции оксидирования). В мерную колбу емкостью 10 мл вносят 5 г NH2OH • НС1 и растворяют в 9 мл горячей воды. К этому раствору прибавляют 80 мл 95% этилового спирта, смешивают, вносят 2 мл раствора бромфенолового синего и общий объем раствора доводят до метки этиловым спиртом.
Г и др 0 к с и л а мин солянокислый (20% рас- твор). На технических весах отвешивают 40 г солянокислого гидрокоиламина, растворяют в небольшом количестве воды в мерной колбе емкостью 200 мл и раствор доводят водой до метки.
Г и др окси л амин солянокислый (0,5 и. раствор). Готовят 0,5 н. водный раствор солянокислого гидроксиламина, 25 мл которого должны быть эквивалентны 0,2 мл 0,5 н. раствора NaOH по бромфеноловому синему (употребляется в определении пропенилового эфира).
Гидроксиламин (щелочной раствор). 7,5 г гидроксиламина содянокислого растворяют в 100 мл 1 н. раствора NaOH (готовится перед употреблением).
Декальсо (по способу О. С. Шерман) 20,5 г сернокислого алюминия растворяют в 120 мл дистиллированной воды, к раствору добавляют при непрерывном взбалтывании 30 мл 60% водного раствора едкого натра. Выпадает осадок, растворяющийся по мере прибавления
щелочи. По растворении осадка к смеси приливают отвешенные 36 г 60—64% раствора кремнекислого натрия. Содержимое колбы быстро и тщательно перемешивают; образуется студенистая масса, которую оставляют на 24 часа. Полученную массу отмывают водой на фарфоровой воронке от щелочи до нейтральной реакции по фенолфталеину. В качестве фильтрующего материала рекомендуется применять ткань типа бельтинг.
Промытый от щелочи остаток сушат при температуре 60—70°, пока вес его не будет составлять около 30 г, переносят в стакан или чашку, растворяют в 200 мл 80% раствора соляной кислоты и оставляют на 40—48 часов. За это время образуется гель, который постепенно укрепляется, затем начинает сморщиваться и отрываться от стенок. Такой гель переносят в фарфоровую чашку и сушат при температуре 100—410°, время от времени отмывая концентрирующуюся в чашке соляную кислоту водой до исчезновения желтой окраски. Отмытый от желтизны осадок, который к этому времени сильно уменьшается в объеме, сушат в течение 2 часов при 130—140°, после чего промывают 1—2 раза водой и сушат при 100—105° в течение 1—'Р/г часов. Весь процесс сушки длится 14—46 часов.
Полученные в результате сушки желтоватого цвета блестящие зерна осторожно измельчают в ступке с таким расчетом, чтобы около 60% их просеивалось через сито с отверстиями диаметром 0,25 мм и 40% через сито с отверстиями 0,5 мм. Выход продукта 8—10 г.
Полученный адсорбент дважды обрабатывают при нагревании с 8—10 объемами 3% СНзСООН 15 минут. Обработку повторяют 4 раза. Между 3-м и 4-м прибавлением кислоты адсорбент обрабатывают четырьмя объемами 25% хлористого калия 20 минут, промывают водой до исчезновения реакции на хлор, фильтруют, высушивают и сохраняют в склянке с притертой пробкой *.
Диазореактив (для определения тиамина). Раствор I: 0,159 г п-аминоацетофенона растворяют в 2,25 мл концентрированной НС1 (уд. вес 1,19) и доводят водой до объема 25 мл. Раствор сохраняют в темноте. Устойчив в течение 6 месяцев.
Раствор II: 22,5 г NaNO2 растворяют в 500 мл воды. Раствор сохраняют в темноте. Устойчив в течение 1 месяца.
Перед употреблением смешивают цри охлаждении в бане со льдом или снегом растворы I и II в отношении 1 : 1, встряхивают (при охлаждении) в течение 10 минут, к полученному раствору добавляют 4 части второго раствора, смесь взбалтывают и оставляют на льду на 20 минут.
Щелочной раствор. 40 г NaOH растворяют в 600 мл воды, добавляют 28,8 г NaHCO3 и доводят водой до 1 л.
Диатомит (адсорбент). Диатомит обрабатывают концентрированной соляной кислотой при настаивании в течение суток. После этого кислоту сливают и диатомит заливают двунормальным раствором соляной кислоты и кипятят с обратным холодильником в течение 1 часа. Затем кислоту сливают и диатомит промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод. После отсасывания воды на воронке Бюхнера диатомит промывают спиртом и бензолом и сушат на открытом воздухе или в термостате при 50°. Срок годности диатомита без повторной активации не более 6 месяцев.
Дигитонин (1% раствор). 1 г дигитонина растворяют при нагревании на водяной бане при 60—70° в 80 мл 96% этилового спирта в мерной колбе емкостью 100 мл. После полного растворения навески колбу охлаждают до 20° и доводят тем же спиртом при той же температуре до метки. Содержимое колбы тщательно перемешивают.
дм нитрофенил гидразин (2% раствор) в смеси, состоящей из 1 ч. концентрированной H2SO4 и 3 ч. воды.
д и н и т р о ф е н о л (раствор). 0,1 г 2,4-динитрофенола растворяют в 100 мл 95% этилового спирта.
а-а'-д и п и р и д и л (0,5%’ раствор). 0,5 г а-а'дипири- дила растворяют в абсолютном этиловом спирте в мерной
колбе емкостью 100 мл и доводят до метки спиртом. Раствор сохраняют в склянке темного стекла с притертой пробкой. Годен в течение не более 1 месяца.
Дифениламин (раствор). 0,5 г дифениламина растворяют в смеси 100 мл концентрированной H2SO4 (уд. вес 1,84) и 20 мл воды.
Дифенилкарбазон (1 % раствор). 1 г дифенил- карбазона растворяют в мерной колбе емкостью 100 мл в этиловом спирте и доводят спиртом до метки.
д и х л о р ф е н о л и н д о ф е н о л (по Шварцу и Вильямсу). 100 г натриевой соли 2,6-дихлорфенолиндо- фенола растворяют в 50 мл воды.
дихлорфенолиндофенол (натриевая соль), 0,001 н. раствор (приготовление и установка титра по ГОСТ 7047-55). 0,2 г соли растворяют в 600 мл воды при энергичном взбалтывании L Раствор фильтруют и доводят водой до 1 л.
Установку титра раствора производят по одному из следующих методов:
. П о с о л и М о р а. В коническую колбу наливают 10 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, а в микробюретку— 0,01 н. раствор соли Мора; к раствору 2,6-ди- хлорфенолиндофенола прибавляют 5 мл насыщенного раствора щавелевокислого аммония или натрия и титруют до изменения синей окраски раствора в соломенно-желтую (появление бурой окраски указывает на непригодность раствора 2,6тдихлорфенолиндофенола).
Поправку (Г) к титру раствора 2,6-дихлорфенолин- дофенола вычисляют по формуле:
где Ui — количество соли Мора, пошедшее на титрование 10 мл раствора 2,6-дихлорфенолиндо- фенола, в Мл;
иг - количество раствора КМПО4, пошедшее на титрование 10 мл соли Мора, в мл;
из —количество раствора КМПО4, пошедшее на титрование 10 мл точного 0,1 н. раствора щавелевокислого аммония или натрия, в мл.
1 Вместо воды целесообразно употреблять буферную смесь (однозамещенный фосфат калия и двузамещенный фосфат натрия, pH-7,0).
1 мл точного 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндо- фенола соответствует 0,088 мт аскорбиновой кислоты.
. По йодату. Несколько кристалликов аскорбиновой кислоты растворяют в 50 мл 2% раствора H2SO4. Из полученного раствора отбирают 5 мл для титрования рабочим (приблизительно 0,001 н.) раствором 2,6-ди- хлорфенолиндофенола и 5 мл для титрования точным 0,001 н. раствором KJO3.
Титрование раствором KJO3 ведут в присутствии нескольких кристаллов (1—2 мг) KJ и 2—3 капель 1% раствора крахмала до появления голубого окрашивания; титрование раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола производят до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 3 минут.
Титрование удобно производить в фарфоровой чашке. Расчет титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте (х) производят по следующей формуле, исходя из того, что 1 мл 0,001 н. раствора йода, а следовательно, и KJO3 эквивалентен 0,08806 мг аскорбиновой кислоты.
0,03806-у,Л _ - t
где и 1 — количество 0,001 н раствора KJO3, пошедшее на титрование, в мл;
и2—количество раствора 2,6-дихлорфенолиндо-фенола, пошедшее на титрование, в мл.
Таким образом узнают, какому количеству аскорбиновой кислоты в миллиграммах соответствует 1 мл приготовленного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.
д и х л о р х и н о н х л о р и м и д. 20 мг перекристаллизованного 2,6-дихлорхинонхлоримида растворяют в 50 мл изопропилового спирта. Раствор хранят в склянке темного стекла с притертой пробной на холоду. (Если нужно, реактив вначале перекристаллизовывают: для этого 1 г реактива растворяют в 50 мл ацетона и 200 мл воды. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, высушивают на воздухе и сохраняют в темном месте.)
Желатина (раствор) для полярографии. 1 или 0,1 г желатины растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
Желатина (раствор) для определения фолиевой кислоты. 0,5 г желатины и 0,1 г бензойной кислоты растворяют в 100 мл воды.
Железоаммониевые квасцы (индикатор при объемном определении галоидов). 30 г железоаммониевых квасцов [FeNH4(SO4)2-12 Н2О] растворяют в 100 мл дистиллиров!анной воды. К раствору после фильтрования добавляют разбавленной (1:1) азотной кислоты до перехода коричневой окраски раствора в желтовато-зеленую.
Железо сернокислое окисное (5% рас- твор). 50 г Fe2(SO4)3 растворяют в воде, добавляют 200 г концентрированной H2SO4 (уд. вес 1,84), раствор доводят водой до 1 л.
Железотартратный реактив. 1,25 г сег- нетовой соли и 0,25 г безводного FeSO4 (или эквивалентное количество FeSO4'7 Н2О) растворяют в 250 мл дис- тиллированной воды. Реактив сохраняется на холоду не более 48 часов.
Железо хлорное (1 и 2% водный раствор). 1 или 2 г FeCl3 растворяют в мерной колбе емкостью 100 мл в воде и раствор доводят водой до метки.
Железо хлорное (0,25%' спиртовой раствор). 0,25 г сухого препарата хлорного железа растворяют в абсолютном этиловом спирте в мерной колбе емкостью 100 мл, объем раствора доводят до метки спиртом. Раствор сохраняют в темноте (применяется в апределении токоферолов).
Индигокармин. 1 г индигокармина растирают в ступке и растворяют в 50 мл концентрированной H2SO4. Полученный раствор доводят до 1 л водой, выдерживают в темном месте в течение суток и фильтруют.
Йод (раствор) для определения нитро- окси пиридин а. 25,4 г кристаллического йода смешивают в склянке темного стекла с 30 г йодистого калия, прибавляют немного воды и оставляют на 2 часа. Фильтруют через вату в мерную колбу емкостью 1 л, тщательно смывая содержимое склянки водой. Раствор доводят водой до метки.
Поправку к титру раствора (к) устанавливают следующим образом: 5 мл полученного раствора переносят в коническую колбу, добавляют 20—30 мл воды и ти-
труют точным 0,1 н. раствором Na2S2O3, добавляя в конце титрования 2 мл раствора крахмала.
Расчет производят по формуле:
где и —количество точного ОД н. раствора NaaSaOa, пошедшее на титрование, в мл;
Ui — количество раствора йода, взятое на титрование, в мл.
Йод (0,1 н. раствор). 12,692 г свежевозогнанного йода растворяют в 20 мл водного раствора йодистого калия, содержащего 20 г KJ в указанном объеме. После полного растворения йода раствор переводят в мерную колбу емкостью 1 л и содержимое колбы доводят водой до метки. Титр раствора устанавливают по общим правилам объемного анализа.
йодокрахмалыная бумага. В ступке тщательно растирают 2 г крахмала, перемешивают с 10 мл воды до получения однородной кашицы и медленно вносят в 500 мл кипящей воды. Кипячение продолжают еще 1—2 минуты. Раствор охлаждают и добавляют к нему 2 г йодистого калия. Фильтровальную бумагу смачивают приготовленным раствором йодистого калия в крахмальном клейстере и сушат в помещении, защищенном от действия паров, газов, влаги, пыли и света. Высушенную бумагу нарезают полосками и хранят в склянке темного стекла с притертой пробкой.
йод и сто в о дородная кислота (уд. вес 1,68—4,7), применяемая в анализе, должна быть бесцветной или с очень слабо желтым оттенком. Для регенерации кислоты к ней добавляют небольшое количество красного фосфора и перегоняют из колбы Вюрца при пропускании умеренного така азота или углекислоты, собирая фракцию, кипящую при 127°. Хранят в темной склянке с притертой пробкой на холоду.
Калий двухромовокислый (для определения спирта). 19 г дважды перекристаллизованного х. ч. К2Сг2О? растворяют в 1 л дистиллированной воды. 1 мл этого раствора соответствует 1 мл этилового спирта в 1 мл испытуемого раствора.
Калий двухромовокислый (стандарт для определения каротина). Стандартный раствор готовят
путем растворения 300 мг трижды 1перекристаллизавдя- ного бихромата калия в 1 л воды; 1 мл такого раствора по окраске соответствует 0,00208 мг каротина в 1 мл.
Кали едкое (0,5 н. раствор). Растворяют 28 г КОН в воде в мерной колбе емкостью 1 л и доводят объем раствора до метки. Титр его устанавливают по янтарной кислоте.
Кали едкое (спиртовой раствор для реакции ацетилирования). 35 г кристаллического КОН промывают 3—4 раза этиловым спиртом, растворяют в 1 л этилового спирта, осадку дают отстояться и фильтруют через стеклянную вату до полной прозрачности.
Кали едкое (20% раствор). 20 г КОН растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе емкостью 100 'мл, объем раствора доводят дб метки водой.
Кали едкое (10% спиртовой раствор).
Калий йодистый (10% раствор в воде).
Калий йодноватокислый (0,1 н. раствор). Растворяют точно отвешенные 3,5670 г химически чистой йодноватокислого калия в воде, доводят объем водой до 1 л и получают 0,1 н. раствор, из которого по мере надобности путем разведения получают растворы нужной нормальности (0,01 н., 0,001 н.). При отсутствии химически чистого йодноватокислого калия применяют перекристаллизованный и высушенный при 105° до постоянного веса реактив.
Калий марганцовокислый (0,1 н. раствор для макрометода Бертрана). Приготовление и установка титра см. Н. А. Шилов, Объемный анализ, ВХТИ, 1933.
Калий марганцовокислый (0,01574 н. раствор для микрометода Бертрана). 0,5 г КМпО4 растворяют в воде и доводят до 1 л водой. 1 мл полученного раствора должен соответствовать 1 мг меди.
Калий марганцовокислый (для окисления примеси в рибофлавине). 4 г КМпО4 растворяют в воде, объем раствора доводят до 100 мл. Раствор приготовляют заново каждые 2 недели.
Комплексона III 0,1 М. раствор. Растворяют 37,23 г комплексона в воде в мерной колбе емкостью 1 л и доводят водой до метки. Титр раствора устойчив неограниченное время.
Крахмал (р аствор). 0,5 г растворимого крахмала растирают в ступке с 5 мл воды до получения одно- 328
родной кашицы; смесь медленно вливают при постоянном помешивании в 100 мл кипящей воды и -кипятят еще 2—3 -минуты до получения прозрачной или слабо опалесцирующей жидкости. Раствор употребляют профильтрованным. Сохраняют на холоду не более 2—3 дней.
Крахмал с йодистым калием (раствор). 0,5 г йодистого калия растворяют в 100 мл свежеприготовленного раствора крахмала. Раствор приводен в те-, чение 24 часов.
Кристаллический фиолетовый, гексаме- тил-п-розанилин хлорид. 0,1 г индикатора растворяют в безводной уксусной кислоте и доводят этой кислотой до 100 мл. (Применяется для неводного титрования.)
Ликопин (для проверки адсорбента при определении каротина). Получают бензиновый экстракт из свежих или консервированных томатов таким образом, как указано йри определении каротина в свежих растительных веществах. Затем -бензиновый экстракт пропускают через адсорбционную колонку, наполненную окисью магния, просушенной при 100—105°, и колонку промывают бензином до тех пор, пока проходящий через колонку бензин перестанет окрашиваться. После этого вводят через верхнее отверстие колонки шпатель, извлекают часть адсорбента, содержащего розовое кольцо. Розовый пигмент (ликопин) из адсорбента извлекают бензином с примесью 3°/о спирта. Из бензинового экстракта спирт отмывают водой, а остаток влаги удаляют с помощью сернокислого натрия, поступая так же, как и при просушивании бензиновых экстрактов каротина.
Л и м о нм о-б о р н ы й реактив Раствор I: 10 г лимонной кислоты, высушенной при 60° в течение 2 часов, растворяют в 100 -мл сухого ацетона.
Раствор II: 0,8 г борной кислоты растворяют в 100 мл сухого ацетона.
Оба раствора пересыщены и перед употреблением их фильтруют.
Непосредственно перед употреблением смешивают 4 мл раствора с 4 мл раствора II (на одно определение).
Магния окись (адсорбент). Химически чистый продажный препарат сушат в сушильном шкафу при 100—-105° до постоянного веса. Адсорбционная способность окиси магния проверяется пропусканием через нее бензинового раствора ликопина и каротина. Адсорбент
пригоден, если при пропускании через него бензинового раствора каротина потеря составляет не более 15% и наряду с этим задерживается ликопин в виде розового кольца. Испытывают адсорбционную способность адсорбента при различном его увлажнении и устанавливают процент влажности, при котором адсорбент удовлетворяет указанному выше требованию. Увлажнение адсорбента проводится в эксикаторе над водой, влажность проверяют путем высушивания в сушильном шкафу при 105° до постоянного веса.
Примечание Увлажнение проводится в том случае, когда сухой адсорбент не удовлетворяет предъявленным требованиям.
Адсорбент следует хранить в стеклянной банке; пробка должна быть залита парафином.
При расчете результатов анализа необходимо принимать во внимание процент потери каротина, который дает данный адсорбент.
Определение качеств а адсорбента
Определение потери каротина при адсорбции. Навеску кристаллического каротина 0,05 г растворяют в 50 мл бензина. Путем последовательного разведения это- -ро раствора получают бензиновый раствор с примерным содержанием 0,01 мг каротина в 4 мл.
3—5 мл этого раствора пропускают через колонку с адсорбентом. В прошедшем через колонку растворе (а) определяют каротин колориметрированием. Затем раствор пропускают вторично через колонку, наполненную свежим адсорбентом, снова определяют каротин в про* шедшем через колонку растворе (б).
Потерю каротина при адсорбции вычисляют по разности между содержанием каротина в растворах а и б.
Определение способности адсорбента задерживать ликопин. В наполненную адсорбентом колонку наливают 1 мл раствора ликопина в бензине. Раствор ликопина должен быть приготовлен таким образом, чтобы по окраске он соответствовал раствору азобензола, полученному путем растворения 14,5 мг кристаллического азобензола в 100 мл 96% спирта. На колонке должно оставаться прочно удерживающееся при промывании колонки бензином розовое кольцо (прошедший через колонку при ее промывании бензин должен быть бесцветным;
рассматривать собранный в пробирке бензин следует в слое около 15 см). Затем в колонку вносят 2 мл бензинового раствора каротина, содержащего примерно 0,01— 0,005 мг каротина в 1 мл. При промывании колонки бензином каротин должен проходить через колонку, не увлекая за собой розового (ликопинового) кольца.
Майера реактив, 1,358 г сулемы растворяют в 60 мл воды, приливают раствор, содержащий 5 г йодистого калия в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл.
Метиловый синий (раствор). 1 г метиленовой синей растворяют в 100 мл воды, тщательно взбалтывают и отфильтровывают от нерастворившихся примесей.
Метиловый красный (индикатор). 0,1 г индикатора растворяют в 100 мл 60% этилового спирта. Переход окраски к желтому в пределах pH = 4,2—6,2.
Метиловый оранжевый (индикатор). 0,1 г тонко растертого индикатора растворяют в воде в мерной колбе емкостью 100 мл и доводят водой до метки.
Мора соль (двойная сернокислая соль закиси железа и аммония, FeSO4 (NH4)2SO4-6 Н2О, 0,01 н. раствор). Навеску 3,92 г соли растворяют в 1 л 0,02 н. раствора H2SO4. Раствор соли Мора хранят в склянке темного стекла. Титр его проверяют каждые 3—4 недели. Установку титра соли Мора ведут по титрованному 0,01 н. раствору KMnO4.
Мочевина — 8% водный раствор.
Натрия гидросульфит (раствор).
Растворяют 1 г гидросульфита натрия в 40 мл 2% раствора двууглекислого натрия. Раствор сохраняют в бане со льдом не более 4 часов.
Натрия нитрит (раствор). 2 г нитрита натрия растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе емкостью 100 мл и доводят объем до метки водой. Раствор готовят свежий через 2—3 дня, сохраняют в холодильнике и доводят до комнатной температуры перед употреблением (применяется в определении токоферолов).
Натрия нитрит (0,1 н. раствор) и установка его титра. Навеску НаМОг около 7 г растворяют в воде в мерной колбе емкостью 1 л и доводят до метки водой. Поправку к титру раствора устанавливают по сульфаниловой кислоте, которую предварительно очищают следующим образом: 100 г сульфаниловой.кислоты
дважды перекристаллизовывают из кипящей воды и су- щат в сушильном шкафу при 120°. После сушки в течение 2 часов кислоту растирают в ступке и вновь высушивают при 120° до постоянного веса.
Для приготовления 0,1 М раствора отвешивают около 8,7 г высушенной сульфаниловой кислоты (точная навеска), прибавляют 10 мл воды и 4,5 г NaHCOs, размешивают стеклянной палочкой до полного растворения кислоты, раствор количественно переносят в мерную колбу емкостью 500 мл, доводят до метки водой, и хорошо перемешивают.
Поправку (к) к приготовленному 0,1 М раствору сульфаниловой кислоты устанавливают по формуле:
"■8,659 ’
где Д — навеска кислоты в г;
8,659— эквивалент сульфаниловой кислоты.
После определения поправки к раствору сульфаниловой кислоты устанавливают поправку к раствору нитрита натрия.
Для этого в толстостенный стакан емкостью 500 мл вливают 25 мл 0,1 М раствора сульфаниловой кислоты, 175 мл воды и 20 мл НС1 (уд. вес 1,19). Раствор охлаждают (температура -раствора должна быть не выше 10°) и титруют приготовленным раствором нитрита натрия, прибавляя его медленно, небольшими порциями, при постоянном помешивании стеклянной палочкой содержимого стакана. Конец реакции устанавливают следующим образом: после прибавления очередной порции раствора нитрита натрия палочкой наносят каплю смеси из стакана на полоску йодокрахмальной бумаги. Если в центре кап- Ми не появится синее пятно, прибавляют новую порцию раствора нитрита натрия. Если же пятно появилось, наносят вторую, затем третью каплю смеси на бумагу, и, если все они дают побурение на бумаге, раствор остав- ляют стоять в течение 5 минут. Вторичное появление пятна через 5 минут служит признаком окончания титрования.
Первое титрование считается ориентировочным. Испытание на йодокрахмальной бумаге производят после прибавления каждой новой порции нитрита натрия. При втором титровании прибавляют раствор нитрита натрия 332
в 'количестве на 0,5—1,0 мл мейьшё, чём при первом, и продолжают титрование, добавляя раствор нитрита натрия по 1 капле, проверяя после добавления каждой капли конец реакции на йодокрахмальной бумаге.
Титрование повторяют 2—3 раза и останавливаются при схождении параллельных результатов.
Поправку к раствору нитрита натрия вычисляют по формуле:
агде а — количество раствора нитрита натрия, по-шедшее на титрование, в мл.
Установка титра нитрита натрияпо белому стрептоциду
Титр раствора нитрита натрия можно устанавливать по белому стрептоциду, который предварительно очищают следующим образом: навеску стрептоцида растворяют в восьмикратном объеме кипящей воды, куда прибавляют 1 г активированного угля. Раствор фильтруют. Выпавшие при охлаждении кристаллы отделяют и сушат до постоянного веса при 100°.
Точную навеску белого высушенного стрептоцида в количестве 8,61 т растворяют в 500 мл 0,5 н. раствора НС1. В коническую колбу отбирают 20 мл раствора стрептоцида, добавляют 150 мл воды, 1,5 мл НС1 (уд. вес 1,19) и 1 мл 10% раствора КВг, охлаждают до 5— 10° и титруют приготовленным раствором нитрита натрия. При титровании раствор нитрита прибавляют небольшими порциями, проверяя каждый раз конец реакции по йодокрахмальной бумаге. Концом титрования считают тот момент, когда спустя б минут после прибавления последней порции раствора нитрита натрия капля раствора оставляет на йодокрахмальной бумаге пятно.
При повторном титровании, зная примерный расход нитрита натрия, большую часть его приливают сразу, но на 0,5—1 мл меньше, чем требуется, добавляя последние порции раствора по каплям и контролируя конец реакции по йодокрахмальной бумаге, после прибавления каждой капли.
Поправку к раствору рассчитывают по формуле.1',20
R = ,
где, а — количество раствора нитрита, пошедшее на титрование, в мл.
Натрия с е р н и с т ото р а с тв о р. Одну весовую часть NaOH растворяют в 8 частях воды. 4 части полученного раствора насыщают сероводородом до тех пор, пока в закрытом сосуде запах сероводорода будет стойким в течение 30 минут. Затем добавляют оставшиеся 5 частей раствора NaOH и 48 частей глицерина, смесь оставляют в закупоренных склянках на 3—5 дней до осаждения нерастворимых сульфидов и раствор фильтруют через смоченную водой вату. Сохраняют в небольших, хорошо закупоренных наполненных доверху склянках в прохладном и защищенном от света месте.
Смесь из 5 мл воды, 3 капель разведенной уксусной кислоты и 3 капель реактива не должна изменяться в течение 10 минут.
Натрий серноватокислый (гипосульфит натрия), 0,1 н. раствор. 24,82 г Na2S20s растворяют в свежепрокипяченной дистиллированной воде и доводят объем до 1 л. Титр раствора устанавливают по 0,1 н. раствору КМпО4, который проверяют по точной навеске щавелевокислого аммония или натрия, по общим правилам объемного анализа. Для приготовления 0,002 ч. раствора производят соответствующее разведение 0,1 н. раствора.
Примечание. Титр 0,1 н. раствора NajSjOa следует устанавливать спустя 5—7 суток после его приготовления.
Натрий уксуснокислый (2,5 М раствор). 340 г соли растворяют в 1 л воды.
Натрий сернокислый, кристаллический прокаливают для обезвоживания, а безводный подсушивают при 105—410°.
N-1-нафтилэтилендиами н-ди гидрохлори д (0,1 % раствор). 0,1 г соли растворяют в воде в мерной колбе емкостью 100 мл и доводят водой раствор до метки.
Нафто л-а л ь ф а. 5 г а-нафтола растворяют в 50 мл 96% этилового спирта. Реактив сохраняют в темной склянке в течение не более 7 дней.
Несслера реактив. liS г двуйодистой ртути смешивают с 10 г йодистого калия и 40 т едкого кали и растворяют в 50 мл воды. Реактив оставляют на 2—3 дня в темноте, после чего его декантируют от осадка и сохраняют в склянке с притертой пробкой темного стекла.
Никотинамида стандартный раствор. Содержит 0,2 мт в 1 мл. Приготовляется так же, как раствор никотиновой кислоты.
Никотиновая кислота (стандартный раствор). 20 мг чистой никотиновой кислоты растворяют в 100 мл 'дистиллированной воды. 1 мл раствора содержит 0,2 мг никотиновой кислоты. Дальнейшую обработку раствора ведут параллельно с испытуемым раствором.
п-н и т р о а н и л ин диазотированный. 14 г п-нитроанилина (0,1 моля) растворяют при нагревании в 60 мл разведенной (1 : 1) НС1. Раствор выливают на находящиеся в небольшом толстостенном стакане 80 г льда. Диазотирование ведут при 5—10°, сразу приливая (при энергичном размешивании) раствор 8 г азотистокислого натрия в 20 мл воды. После прекращения вспенивания раствор соли диазония приливают при помешивании к 400 мл 4 н. раствора NaOH, подогретого до 40—50°.
При охлаждении раствора из него выделяются красивые золотисто-желтые листочки.
Через несколько часов соль отфильтровывают на бюх- неровской воронке и промывают 5 раз насыщенным водным растворам NaCl, используя каждый раз по 50 мл раствора. Высушенный на глиняной тарелке препарат сохраняется длительное время. Для освобождения его от примесей NaCl препарат растворяют в небольшом количестве 60% этилового спирта и фильтруют; фильтрат упаривают досуха на кипящей водяной бане. Выход 18 г.
Препарат растворяют в 60% уксусной кислоте для переведения в активную форму. Непосредственно перед анализом приготовляют 0,1% раствор препарата в 60% уксусной кислоте и после фильтрования употребляют для анализа.
Окислительная смесь (для определения тиамина). Перед анализам непосредственно смешивают 4 мл 1% водного раствора красной кровяной соли (перекристаллизованной из воды) с 96 мл 15% водного раствора едкого натра.
Олово хлористое (раствор). Растворяют 10 г SnCl2 в 25 мл концентрированной НС1 и сохраняют в темной склянке с притертой пробкой при комнатной тем* пературе. Из этого раствора перед анализом приготовляют рабочий раствор, доводя 1 мл раствора до 500 мл дистиллированной водой.
Олово хлористое (раствор) для определения нитрооксипиридина. Навлеку хлористого олова в количестве 28,3 г растворяют в 30 мл концентрированной НС1 (уд. вес 1,19) и доводят до объема водой, насыщенной углекислотой. Раствор хранят в склянке с притертой пробкой, заполненной углекислотой.
Пантотенат кальция (стандартный раствор). Готовят раствор из предварительно высушенного в вакуум-эксикаторе над серной кислотой в течение 24 часов 100% пантотената кальция с содержанием 1 мг пантотената в 1 мл; для этого 100 мг пантотената растворяют в воде в мерной колбе емкостью 100 мл и доводят водой до метки. Раствор устойчив при хранении в темноте и на холоду в течение 2 недель.
Пара-аминобензойная кислота: растворяют при нагревании п-аминобензойную кислоту в спирте. К кипящему раствору добавляют немного активированного угля и перемешивают. Горячий раствор фильтруют и охлаждают. Выпавшие кристаллы отсасывают на бюхнеровской воронке и высушивают при комнатной температуре на фильтре.
Если температура плавления кристаллов ниже 187— 188°, перекристаллизацию повторяют.
Р-пиколина эталон. 4,75 г р-пиколина, очищенного тройной перекристаллизацией комплекса с медным купоросом, приливают к 0,25 г 2,6-лутидина, очищенного четырехкратной перекристаллизацией. Ьюкс, в котором взвешивали р-пиколи,н, дважды ополаскивают порциями по 3 мл-абсолютного серного эфира и добавляют к основной смеси. Эфир выпаривают на слепка нагретой водяной бане. Получают эталон с содержанием 95% Р-пиколина и 5%' 2,6-лутидина.
Рибофлавин (стандартный р а створ). Точную навеску рибофлавина в количестве 10 мг растворяют в воде в мерной колбе емкостью 250 мл. Этот раствор содержит 40 у рибофлавина в 1 мл. Раствор стоек на холоду при хранении его в темноте в течение 1 месяца. Для, 336
определения каждый раз готовят рабочий раствор. Для этого 1 мл стандартного раствора доводят в мерной колбе емкостью 100 мл водой до метки. В 1 мл рабочего раствора содержится 0,4 у рибофлавина.
Р од а нбромидный раствор. 4 мл 'брома вносят в 100 мл дистиллированной воды, энергично встряхивают и отстоявшийся раствор декантируют. К охлажденной на льду бромной воде, взятой в нужном для анализа количестве, прибавляют по каплям 10% раствор роданистого аммония или калия до светло-желтого окрашивания, затем 1 % раствор до полного обесцвечивания. К обесцвеченному раствору добавляют небольшими порциями 20—50 мг углекислого кальция до прекращения выделения СОг и образования мути. Раствор фильтруют в склянку темного стекла с притертой пробкой и сохраня- югна холоду. Годен в деныпритотовления.
Роданбромидный раствор (по В. М. Иоси- ковой). В коническую колбу отбирают 10 мл н. раствора KCNS или NH4CNS, добавляют 1 г бромистого калия, после полного растворения его прибавляют 1 мл разведенной 1 :1 НС1 и из автоматической пипетки прибавляют по каплям 2 мл брома (уд. в. 3,2) при постоянном помешивании содержимого колбы. Приготовленный раствор используют немедленно, не давая ему охладиться.
Ртути ацетата 4% р а ств ор. Растворяют 40 г ацетата ртути в абсолютном метаноле, объем раствора доводят до 1 л. Для стабилизации раствора к нему добавляют 3—8 капель ледяной уксусной кислоты. Перед использованием раствор фильтруют.
Свинец азотнокислый. 50гРЬ(МОз)2 растворяют в 100 мл воды.
337337Силикагель (адсорбент). Силикагель, ГОСТ 7956-54, крупнопористый, марки МФК или ШФК, измельчают на шаровой мельнице и просеивают через сито с размером ячеек 0,15—0,20 мм. Каждую полученную фракцию обрабатывают 6 н. раствором НС1. Кислота должна полностью покрывать силикагель. Обработка длится 4 часа при кипячении с последующей отмывкой дистиллированной водой до отсутствия реакции промывных вод на ионы хлора. Силикагель высушивают при 115° в сушильном шкафу, после чего прокаливают в муфельной печи при 650—700° в течение 2*/г—3 часов. Затем печь выключают и силикагель постепенно охлаждают до
337
337
22 В. А. Девятнян
150°. Силикагель (пересыпают в банки с притертыми пробками.
С о л я н о-ф о с ф а т н ы й реактив. Смешивают 3 ч. концентрированной НО (уд. вес 1,19) с 2 ч. 85% НЭРО4.
Спирты для извлечения тиохрома (изобутиловый, изоамиловый, (бутиловый) В случае наличия флуоресценции спирты перед употреблением (подвергают очистке: к 1 л спирта добавляют 15—'20 г активированного угля, встряхивают 15 минут, оставляют на сутки, повторяя несколько раз встряхивание. Декантируют, фильтруют, высушивают «над хлористым кальцием и перегоняют при соответствующей температуре. Перегонку изобутилового, изоамилового и бутилового спирта ведут на глицериновой или песчаной бане, а этилового — на водяной бане. '
Сурьма треххлористая (раствор). Продажную треххлористую сурьму промывают хлороформом, пока це будет стекать прозрачный и бесцветный раствор, и высушивают в эксикаторе над серной кислотой в течение 1—2 суток. Насыщенный раствор треххлористой сурьмы в очищенном хлороформе приготовляют при 20°.
Т а л ьк. Продажный тальк активируют следующим образом: кипятят 100 г талька 4 часа с 500 мл 2 н. раствора НС1 при постоянном перемешивании мешалкой. Соляную кислоту сливают, адсорбент промывают водой на бюхнеровской воронке при разрежении до нейтральной реакции, сушат 6—8 часов при 100—105° и сохраняют в склянках с притертыми пробками. В случае увлажнения адсорбента при хранении его снова нужно подсушить при 100—105°. Для проверки качества адсорбента после пропускания через него раствора витамина Вг колонку проявляют при слабом (разрежении горячим 50% раствором треххлористой сурьмы: в верхнем слое должно появиться красно-бурое кольцо фотодериватов.
Тиамин (стандартный раствор). 100 мг (точная навеска) кристаллического тиаминхлорида, предварительно высушенного при 100—'105° в течение 2 часов, растворяют в мерной колбе емкостью 1 л в воде и доводят до метки водой. В 1 мл стандартного раствора содержится 100 у тиамина. Раствор устойчив в течение 1 месяца при хранении на холоду в темной склянке с притертой пробкой.
Тиамин (стандартный рабочий раствор). 1 >мл стандартного раствора тиамина доводят в мерной колбе емкостью 100 мл водой до метки. В 1 мл раствора содержится 1 у тиамина. Раствор пригоден только в день анализа.
Тимолфталеин (индикатор). 0,1 г индикатора растворяют в 100 мл 96% этилового спирта. Переход окраски от бесцветного к синему в пределах рН = 9,3— 10,6.
Т и о м о ч е в и н а. 4 % раствор тиомочевины в 5% метафосфорной кислоте.
Углекислый газ или аз от для очистки от примесей пропускают через поглотители с водой, щелочным раствором пирогаллола и серной кислотой.
Фелинга I раствор (для метода Бертрана). 40 г перекристаллизованного медного купороса растворяют в воде и доводят водой до 1 л.
Фелинга II раствор (для метода Бертрана). 200 г сегнетовой соли растворяют в 400—500- мл воды. 150 г химически чистого едкого натра растворяют в 200— 300 мл воды. Оба раствора смешивают и доводят водой до 1 л.
Фелинга I раствор (для метода Лейна и Эйно- на). 69,28 г химически чистого перекристаллизованного медного купороса (CuSO4-5H2O) растворяют в воде в мерной колбе емкостью 1 л и доводят водой до метки.
Фелинга II раствор (для метода Лейна и Эйно- на). 340 химически чистой сегнетовой соли растворяют при слабом нагревании в 400—500 мл воды. Отдельно растворяют 100 г КОН в 200—300 мл воды. После полного растворения растворы смешивают, доводят водой в мерной колбе емкостью 1 л до метки и фильтруют.
о-ф е н а н тро ли н а раствор. Растворяют 0,5 г ортофенантролина в абсолютном этиловом спирте в «мерной колбе емкостью 100 мл и доводят спиртом до метки. Раствор Сохраняют в темной склянке с притертой пробкой. Срок годности раствора не более 1 (месяца.
Фенолфталеин, 1 % спиртовой раствор.
Фишера реактив (приготовление и установка титра).
Метанол. Применяют синтетический метанол. Для обезвоживания к 1 л метанола прибавляют 100— 150 г безводной сернокислой меди и настаиваю! в тече-
ние 10—12 часов при периодическом помешивании. Если первая порция сернокислой меди голубеет, метанол сливают и настаивают на другой порции меди и т. д. Высушенный метанол перегоняют. Влажность его не должна превышать 0,1—0,2%.
Пиридин. К 1 л химически чистого пиридина добавляют около 50 г кристаллического КОН. Если щелочь расплавляется, добавляют свежую порцию ее. Высушенный пиридин перегоняют, собирая фракцию, отгоняющуюся при 114—115°. Влажность пиридина не должна превышать 0,1—0,2%.
Йод. Кристаллический йод очищают возгонкой и сушат в эксикаторе над СаС12.
Приготовление реактива В бунзеновскую колбу, соединенную с осушительной системой, состоящей ИЗ U-образной трубки, содержащей прокаленный СаС12, и промывной склянки с химически чистой H2SO4, помещают 67 г пиридина, 167 г метанола и 21 г йода. Через смесь пропускают ток SO2, получаемый из прибора приливанием из капельной воронки серной кислоты к КМпО4 и высушенный над СаС12 и затем H2'SO4 Во все время пропускания SO2 склянка со смесью должна охлаждаться ледяной водой. На указанное количество смеси должно быть израсходовано 16 г SO2, что определяют привесом смеси на 16 г. Готовый реактив сохраняют защищенным от влаги, воздуха и света Попадание в реактив влаги делает его Непригодным к употреблению.
Установка титра. Точную навеску в количестве около 1 г помещают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят сухим метанолом до метки. Из полученного раствора отбирают несколько проб в количестве от 1 до 5 мл и титруют приготовленным реактивом Фишера из бюретки, снабженной хлоркальциевой -трубкой, или, что лучше, включенной в замкнутую систему, дб появления бурого окрашивания Параллельно титруют такое же количество сухого метанола.
Примечание Вся посуда, применяемая прн работе с реактивом Фишера, должна быть совершенно сухой.
Титр реактива Фишера выражают в граммах Н2О на 1 мл и вычисляют по формуле:
t а-100 к =•
(о —oj-zn
где а — навеска воды в г;
100 — постоянный коэффициент;
у — количество реактива Фишера, пошедшее на титрование воды, в мл;
У1 — количество реактива Фишера, пошедшее на титрование метанола, в 'мл;
т— количество раствора воды, взятое на титрование, в мл.
Определение влажности применяемых реактивов (метанол, пиридин). 1 мл испытуемого раствора титруют реактивом Фишера до появления бурого окрашивания.
Расчет содержания влаги в процентах (х) ведут по формуле:
v-k-100X =;,
т
где у — количество реактива Фишера, пошедшее на титрование, в мл;
к— титр реактива, выраженный в граммах Н2О на 1 мл;
100— пересчет в %;
т — количество испытуемого раствора, взятое на титрование, в мл.
Формольная смесь (для определения глутаминовой кислоты). К'50 мл 40% раствора формалина добавляют 1 мл раствора фенолфталейна и 0,2 н. раствор щелочи до слабо-розовой окраски. Смесь должна быть свежеприготовленной.
Формольная смесь. К 50 мл продажного 30— 40% формалина добавляют 25 мл абсолютного этилового спирта, 5 мл раствора тимолфталеина и 0,5 н. раствора NaOH до появления бледно-синеватой окраски.
Тимолфталеин для этого реактива готовят растворением 0,05 г тимолфталеина в 100 мл 95% этилового спирта. Применяется при формольном титровании.
Фосфатная буферная смесь с pH = 7,0 11,876 г Na2HPO4 2 Н2О растворяют в 1 л дистиллированной воды — раствор I.
9,078 г КН2РО4 растворяют в 1 л дистиллированной воды — раствор II.
Смешивают 7 ч раствора I и 3 ч. раствора II; pH раствора около 7,0.
Хлорная к и с л о т а. 0,1 н. раствор для неводного титрования витаминов 'приготовляют следующим образом: 4'1,7 мл 57% или 18,1 мл 42%' водного раствора хлорной кислоты помещают в мерную колбу емкостью 1 л, туда же добавляют 300 мл безводной уксусной кислоты. Колбу помещают в холодную воду и (постепенно прибавляют при помешивании 140 мл уксусного ангидрида, избегая сильного разогревания. По охлаждении раствор доводят до метки уксусной кислотой. Для установки титра раствора поступают следующим образом: 0,53 г карбоната натрия (точная навеска) переносят в мерную колбу емкостью 100 мл при помощи безводной уксусной кислоты и после полного растворения навески Объем раствора доводят той же кислотой до метки. 5 мл полученного раствора разбавляют 10—15 мл безводной уксусной кислоты и титруют из бюретки приготовленным раствором хлорной кислоты в (присутствии 1—2 капель раствора кристаллического фиолетового до перехода окраски ив фиолетовой в голубовато-зеленую. 1 мл 0,1 н. раствора HCIO4 содержит 0,01005 г хлористой кислоты.
Хлороформ химически чистый, не содержащий примесей. Хлороформ отмывают 3—4 раза дистиллированной водой, отделяют от воды, высушивают свежепрокаленным сернокислым натрием или хлористым кальцием в течение суток и отгоняют на водяной бане при температуре 61°. Хранится в склянках темного стекла с притертой пробкой не более 1 месяца.
Ц е р и й-а м м о н и й нитрат (0,1 н. раствор). Навеску 5,48 г (МН4)2Се(МОз)6 растворяют в 100 мл 96% спирта.
Цинк сернокислый (0,1 М раствор). 28,755 г перекристаллизованного химически чистого сернокислого цинка растворяют в воде в мерной колбе емкостью 1 л и доводят водой до метки.
Эриохром черный. 0,1 г .индикатора растворяют в 5 мл 25% раствора аммиака и затем добавляют 20 мл этилового спирта.
Этилат натрия (0,1 н. раствор). В 1 л абсолютного этилового спирта постепенно, небольшими кусочками, вносят при перемешивании металлический натрий в коли-
честве 2,3 г. После полного растворения и прекращения реакции раствор тщательно перемешивают. Титр его устанавливают по 0,1 н раствору НС1 перед каждым определением по общим правилам анализа.
Этиловый спирт. Для освобождения спирта от альдегидов настаивают его в течение 10—12 часов над твердым NaOH (5—'10 г на 1 л спирта) и перегоняют.
Этиловый спирт (для спектральных и полярографических целей). В колбу емкостью 750 мл прибора для разгонки спирта (на шлифах!—применение пробок не допускается) загружают 500 мл 96% этилового спир- та-ректификата и нагревают на колбонагревателе. Первую фракцию (50 мл) и конечную фракцию (50 мл) отбрасывают. Полученный спирт сохраняют в склянке темного стекла с притертой пробкой.
Этиловый спирт абсолютированный. 96% этиловый спирт кипятят в кол!бе с окисью кальция на водяной 'бане с обратным холодильником в течение 4—6 часов и отгоняют в изолированный от влага при помощи хлоркальциевой трубки приемник, соединенный с форштоссом холодильника Либиха. Полученный отгон настаивают с прокаленной сернокислой медью -и отгоняют безводный спирт, как указано выше. Реактив сохраняют в склянке с притертой пробкой.
Эфир in етр о л е й н ы й. Температура кипения 35— 40°.
Эфир этиловый (серный). В склянку с корковой пробкой помещают 500 мл эфира, 50 мл 4% раствора КМпО4, 5 мл 40% раствора NaOH или КОН, взбалтывают и оставляют на сутки в темноте. Смесь переносят в делительную воронку, нижний слой сливают, а эфир промывают 5—6 раз дистиллированной водой (в отношении 2:1), высушивают в течение суток сернокислым натрием, перегоняют и сохраняют в темноте.
Примечание Эфир необходимо проверять на отсутствие перекисей по качественной реакции с йодистым калием
Приложение 1
Таблица перевода показаний гальванометра фотоколориметра Дв экстинкцию Е (L=2—1g Д)
д
Е
д
Е
Д
Е
Д
Е
100
0,000
78
0,108
56
0,252
34
0,462
99,5
0,002
77,5
0,111
55,5
0,256
33,5
0,475
99
0,004
77
0,114
55
0,260
33
0,482
98,5
0,007
76,5
0,116
54,5
0,264
32,5
0,488
98
0,009
76
0,119
54
0,268
32
0,495
97,5
0,011
75,5
0,122
53,5
0,272
31,5
0,502
97
0,013
75
0,125
53
0,276
31
0,509
96,5
0,016
74,5
0,128
52,5
0,280
30,5
0,516
96
0,018
74
0,131
52
0,284
30
0,523
95,5
0,020
73,5
0,134
51,5
0,288
29,5
0,530
95
0,022
73
0,137
51
0,292
29
0,538
94,5
0,025
72,5
0,140
50,5
0,297
28,5
0,545
94
0,027
72
0,143
50
0,301
28
0,553
93,5
0,029
71,5
0,146
49,5
0,305
27,5
0,561
93
0,032
71
0,149
49
0,310
27
0,569
92,5
0,034
70,5
0,152
48,5
0,314
26,5
0,577
92
0,036
70
0,155
48
0,319
26
0,585
91,5
0,039
69,5
0,158
47,5
0,323
25,5
0,594
91
0,041
69
0,161
47
*0,328
25
0,602
90,5
0,043
68,5
0,163
46,5
0,332
24,5
0,611
90
0,046
68
0,168
46
0,337
24
0,620
89,5
0,048
67,5
0,171
45,5
0,342
23,5
0,629
89
0,051
67
0,174
45
0,347
23
0,638
88,5
0,053
66,5
0,177
44,5
0,352
22,5
0,648
88
0,056
66
0,181
44
0,357
22
0,658
87,5
0,058
65,5
0,184
43,5
0,362
21,5
0,668
87
0,061
65
0,187
43
0,367
21
0,678
86,5
0,063
64,5
0,191
42,5
0,372
20,5
0,688
86
0,066
64
0,194
42
0,377
20
0,699
85,5
0,068
63,5
0,197
41,5
0,382
19,5
0,710
85
0,071
63
0,201
41
0,387
19
0,721
84,5
0,073
62,5
0,204
40,5
0,392
18,5
0,733
84
0,076
62
0,208
40
0,398
18
0,745
83,5
0,078
61,5
0,211
39,5
0,403
17,5
0,757
83
0,081
61
0,215
39
0,409
17
0,770
82,5
0,084
60,5
0,218
38,5
0,414
16,5
0,782
82
0,086
60
0,222
38
0,420
16
0,796
81,5
0,089
59,5
0,226
37,5
0,426
15,5
0,810
81
0,092
59
0,229
37
0,432
15
0,824
80,5
0,094
58,5
0,233
36,5
0,438
14,5
0,838
80
0,097
58
0,237
36
0,444
14
0,854
79,5
0,100
57,5
0,240
35,5
0,450
13,5
0,870
79
0,102
57
0,244
35
0,456
13
0,886
78,5
0,105
56,5
0,248
34,5
0,402
12,5
0,908
344
Продол жен Ие
Д
Е
Д
Е
Д
Е
Д
Е
12
0,921
9
1,046
6
1,222
3
1,523
11,5
0,939
8,5
1,071
5,5
1,260
2,5
1,602
11
0,959
8
1,097
5
1,301
2
1,699
10,5
0,979
7,5
1,126
4,5
1,347
1,5
1,824
10
1,000
7
1,155
4
1,398
1
2,000
9,5
1,022
6,5
1,187
3,5
1,456
Приложение 2
Таблица для определения сорбозы в миллиграммах (по Бертрану),0,1 и. раствор КМпО4
Раствор КМпО4
Сорбоза
в мг
Раствор КМпО4 в мл
Сорбоза в мг
Раствор КМпО4
Сорбоза в мг
Раствор КМпО4 в мл
Сорбоза в мг
Раствор КМпО4 в мл
Сорбо- зах в мг
1,54
10,0
5,24
35,0
8,84
60,0
12,27
85,0
15,61
110,0
1,69
11,0
5,41
36,0
8,98
61,0
12,40
86,0
15,74
111,0
1,84
12,0
5,55
37,0
9,12
62,0
12,54
87,0
15,87
112,0
1,99
13,0
5,70
38,0
9,25
63,0
12,67
88,0
16,0
113,0
2,14
14,0
5,84
39,0
9,39
64,0
12,81
89,0
16,14
114,0
2,30
15,0
5,99
40,0
9,53
65,0
12,94
90,0
16,27
115,0
2,45
16,0
6,13
41,0
9,67
66,0
13,07
91,0
16,40
116,0
2,60
17,0
6,28
42,0
9,81
67,0
13,21
92,0
16,53
117,0
2,75
18,0
6,42
43,0
9,94
68,0
13,34
93,0
16,67
118,0
2,90
19,0
6,56
44,0
10,08
69,0
13,48
94,0
16,79
119,0
3,05
20,0
6,70
45,0
10,23
70,0
13,61
95,0
16,93
120,0
3,20
21,0
6,85
46,0
10,37
71,0
13,74
96,0
17,06
121,0
3,35
22,0
6,99
47,0
10,50
72,0
13,88
97,0
17,19
122,0
3,49
23,0
7,13
48,0
10,64
73,0
14,01
98,0
17,32
123,0
3,64
24,0
7,28
49,0
10,77
74,0
14,15
99,0
17,45
124,0
3,79
25,0
7,42
50,0
10,91
75,0
14,28
100,0
17,58
125,0
3,94
26,0
7,56
51,0
11,05
76,0
14,41
101,0
17,72
126,0
4,09
27,0
7,70
52,0
11,18
77,0
14,55
102,0
17,85
127,0
4,23
28,0
7,85
53,0
11,32
7; ,0
14,68
103,0
17,98
128,0
4,38
29,0
7,99
54,0
11,45
79,0
14,81
104,0
18,11
129,0
4,53
30,0
8,13
55,0
11,59
80,0
14,95
105,0
18,24
130,0
4,68
31,0
8,27
56,0
11,72
81,0
15,08
106,0
18,37
131,0
4,82
32,0
8,41
57,0
11,86
82,0
15,21
107,0
18,50
132,0
4,97
33,0
8,55
58,0
12,0
83,0
15,34
108,0
18,63
133,0,
5,11
34,0
8,70
59,0
12,13
84,0
15,48
109,0
18,76
134,0
23 В А Девяткин
345
Приложение 3
Определение сухих веществ в растворе сорбита по показаниямрефрактометра
(до 4% содержание сухих веществ в процентах и в граммах на 100 мл раствора соответствует показанию сахарной шкалы рефрактометра)
s а
S = о £ С >4
Содержание сорбита
я 3
х я X
5 я о£ С х
Содержание сорбита
Я 2
К X s а X
Я :Х " О S я о £ С х
Содержание сорбита
51 К X » а
X
С >4
Содержание сорбита
е\
S
!§
я ®
4,0
4,0
4,1
11,8
11,-8
12,3
19,4
19,4
20,8
27,0
27,1
29,9
4,2
4,2
4,3
12,0
12,0
12,5
19,6
19,6
21,1
27,2
27,3
30,1
4,4
4,4
4,5
12,2
12,2
12,7
19,8
19,9
21,3
27,4
27,5
30,4
4,6
4,6
4,7
12,4
12,4
13,0
20,0
20,1
21,6
27,6
27,7
30,6
4,8
4,8
4,9
12,6
12,6
13,2
20,2
20,3
21,8
27,8
27,9
30,8
5,0
5,0
5,1
12,8
12,8
13,4
20,4
20,5
22,0
28,0
28,1
31,1
5,2
5,2
5,3
13,0
13,0
13,6
20,6
20,7
22,3
28,2
28,3
31,3
5,4
5,4
5,5
13,2
13,2
13,8
20,8
20,9
22,5
28,4
28,5
31,6
5,6
5,6
5,7
13,4
13,4
14,1
21,0
21,1
22,7.
28,6
28,7
31,8
5,8
5,8
5,9
13,6
13,6
14,3
21,2
21,3
23,0
28,8
28,9
32,1
6,0
6,0
6,1
13,8
13,8
14,5
21,4
21,5
23,2
29,0
29,1
32,2
6,2
6,2
6,3
14,0
14,0
14,7
21,6
21,7
23,4
29,2
29,3
32,6
6,4
6,4
6,5
14,2
14,2
14,9
21,8
21,9
23,7
29,4
29,5
32,8
6,6
6,6
6,7
14,4
14,4
15,2
22,0
22,1
23,9
29,6
29,7
33,1
6,8
6,8
7,0
14,6
14,6
15,4
22,2
22,3
24,2
29,8
30,0
33,4
7,0
7,0
7,2
14,8
14,8
15,6
22,4
22,5
24,4
30,0
30,2
33,7
7,2
7,2
7,4
15,0
15,0
15,8
22,6
22,7
24,6
30,2
30,4
33,9
7,6
7,6
7,8
15,2
15,2
16,0
22,8
22,9
24,8
30,4
30,6
34,1
7,8
7,8
8,0
15,4
15,4
16,3
23,0
23,1
25,1
30,6
30,8
34,4
8,0
8,0
8,2
15,6
15,6
16,5
23,2
23,3
25,3
30,8
31,0
34,6
8,2
8,2
8,4
15,8
15,8
16,7
23,4
23,5
25,6
31,0
31,2
34,9
8,4
8,4
8,6
16,0
16,0
16,9
23,6
23,7
25,8
31,2
31,4
35,2
8,6
8,6
8,8
16,2
16,2
17,1
23,8
23,9
26,0
31,4
31,6
35,4
8,8
8,8
9,1
16,4
16,4
17,4
24,0
24,1
26,3
31,6
31,8
35,7
9,0
9,0
9,3
16,6
16,6
17,6
24,2
24,3
26,5
31,8
32,0
35,9
9,2
9,2
9,5
16,8
16,8
17,8
24,4
24,5
26,7
32,0
32,2
36,2
9,4
9,4
9,7
17,0
17,0
1'8,1
24,6
24,7
27,0
32,2
32,4
36,5
9,6
9,6
9,9
17,2
17,2
18,3
24,8
24,9
27,2
32,4
32,6
36,7
9,8
9,8
10,1
17,4
17,4
18,5
25,0
25,1
27,6
32,6
32,8
37,0
10,0
10,0
10,4
17,6
17,6
18,7
25,2
25,3
27,7
32,8
33,0
37,2
10,2
10,2
10,6
17,8
17,8
19,0
25,4
25,5
27,9
33,0
33,2
37,5
10,4
10,4
10,8
18,0
18,0
19,2
25,6
25,7
28,2
33,2
33,4
37,7
10,6
10,6
11,0
18,2
18,2
19,4
25,8
25,9
28,4
33,4
33,6
38,0
10,8
10,8
П,2
18,4
18,4
19,6
26,0
26,1
28,7
33,6
33,8
38,3
11,0
11,0
11,4
18,6
18,6
19,9
26,2
26,3
28,9
33,8
34,0
38,5
11,2
11,2
11,6
18,8
18,8
20,1
26,4
26,5
29,2
34,0
34,2
38,8
11,4
11,4
11,9
19,0
19,0
20,3
26,6
26,7
29,4
34,2
34,4
39,0
11,6
11,6
12,1
19,2
19,2
20,6
26,8
26,9
29,6
34,4
34,6
39,3
Продолжение
К «
= а о С X
•.Содержание сорбита
" 5
ЕЙ
Содержание сорбита
Я 2
к X х а X
S’®
С х
Содержание сорбита
3 | х В
К х
Содержание сорбита
2
3
=8
я ®
=§
34,6
34,8
39,5
40,0
40,6
47,1
45,4
46,4
54,9
50,8
52,2
63,2
34,8
35,0
39,8
40,2
40,8
47,3
45, &
46,6
55,2
51,0
52,4
63,'5
35,0
35,2
40,1
40,4
41,0
47,6
45,8
46,9
55,6
51,2
52,6
63,8
35,2
35,4
40,3
40,6
41,2
47,9
46,0
47,1
55,9
51,4
52,8
64,0
35,4
35,6
40,5
40,8
41,5
48,3
46,2
47,3
56,2
51,6
53,0
64,3
35,6
35,8
40,8
41,0
41,7
48,5
46,4
47,5
56,5
51,8
53,3
64,6
35,8
36,1
41,2
41,2
41,9
49,8
46,6
47,7
56,8
52,0
53,5
64,9
36,0
36,3
41,5
41,4
42,1
49,0
46,8
47,9
57,0
52,2
53,7
65,2
36,2
36,5
41,7
41,6
42,3
49,3
47,0
48,1
57,3
52,4
53,9
65,5
36,4
36,7
42,0
41,8
42,5
49,6
47,2
48,2
57,6
52,6
54,1
65,9
36,6
36,9
42,2
42,0
42,7
49,9
47,4
48,5
57,9
52,8
54,4
66,3
36,8
37,2
42,6
42,2
42,9
50,2
47,6
48,7
58,2
53,0
54,6
66,7
37,0
37,4
42,9
42,4
43,1
50,4
47,8
49,0
58,6
53,2
54,8
66,0
37,2
37,6
43,1
42,6
43,3
50,7
48,0
49,2
58,9
53,4
55,0
67,3
37,4
37,8
43,4
42,8
43,5
50,7
48,2
49,4
59,2
53,6
55,2
67,6
37,6
37,8
43,4
43,0
43,8
51,4
48,4
49,6
59,5
53,8
55,5
68,0
37,8
38,2
43,9
43,2
44,0
51,7
48,6
49,8
59,8
54,0
55,7
68,3
38,0
38,4
44,2
43,4
44,2
51,9
48,8
50,1
60,2
54,2
55,9
68,6
38,2
38,6
44,5
43,6
44,4
52,2
49,0
50,3
60,5
54,4
56,1
68,9
38,4
38,8
44,7
43,8
44,7
52,6
49,2
50,5
60,7
54,6
56,3
69,2
38,6
39,0
45,0
44,0
44,9
52,8
49,4
50,7
61,0
54,8
56,5
69,5
38,8
39,3
45,4
44,2
45,1
53,1
49,6
50,9
61,3
55,0
56,7
69,8
39,0
39,5
45,6
44,4
45,3
53,4
49,8
51,2
61,7
55,2
56,9
70,1
39,2
39,7
45,9
44,6
45,5
53,7
50,0
51,4
62,0
55,4
57,1
70,4
39,4
39,9
46,2
44,8
45,8
54,1
50,2
51,6
62,3
55,6
57,3
70,7
39,6
40,1
46,4
45,0
46,0
54,4
50,4
51,8
62,6
55,8
57,6
71,1
39,8
40,4
46,8
45,2
46,2
54,7
50,6
52,0
62,9
56,0
57,8
71,4
итератора
Апельцвейг Н. Хроматография. Под ред. М. Дубинина. М., 1949,
Асатиани Г. С. Биохимический анализ. Т. I, II. Грузмедгиз. Тбилиси, 1951.
Баёаргнн Н. Н. Карбоксиарсеиазо. Союзреактив. М., 1963.
Беэр А. А., Рубцов И. А. Синтез витаминов. Пищепромиздаг, 1956.
Березовский В. М. Химия витаминов. Пищёпромнздат. М., 1959.
Берл ь-Л у н г е Е. Химико-технологические методы исследования. ,Т. IV. Госхимиздат, 1941.
Бернгауэ р К- Введение в технику лабораторных работ по органической химии. ОНТИ, 1935.
Блок Р., Лестранж Р., Цвейг Г. Хроматография на бумаге. М„ 1954.
Вайсберг Л. Физические методы органической химии. М., 1955
Вейганд К- Методы эксперимента в органической химии. Т. IV М., 1955.
Вейгерт Ф. Оптические методы химии. ОНТИ, 1934.
Витамины. Сб. I, II, III. Изд. АН СССР, 1953—1958.
Витамины. Сб. 1, 2, 3, 4, 5. Пищепромнздат, 1956—1958.
Г а р к и н а И. Н. Тезисы докладов и сообщений IV Всесоюзного совещания по витаминам. Изд. МГУ, 1957.
Гейровскин Я. Техника полярографического исследования. М., 1951.
Гейровский Я. Полярография. ОНТИ, 1937.
Гиллебранд В. и Л е и д е ц ь Г. Практическое руководство по неорганическому анализу. ОНТИ, 1937.
Г н л л е м А., Штерн Е. Электронные спектры поглощения органических соединений И. Л., М„ 1957.
Государственная фармакопея СССР. IX нзд. Медгиз, 1961.
ГОСТ 7047-55. Витамины А, Вь В2, РР, С ш D. Методы определения. Губен-Вейль. Методы органической химии. II. Методы анализа. М., 1963.
Гусева А. Р., Нес тюк М. Н. Биохимия, 1953, 18, 4.
Девятнин В. А. Витамины. Пищепромиздат, 1948.
Девятнин В. А. В сб.: Витамины за рубежом. 5. Пищепромиздат, 1958.
Девятнин В. А. и Иоснкова В. М. Вопросы питания, 1935, 4.
Девятнин В. А. и Иосикова В. М. ДАН СССР, 3, 4, 1935.
Девятнин В. А.гКравчнна Л. Н., Стольникова Н. М. Сб. трудов ВНИВИ. IV. Пищепромиздат, 1953.
Девятнин В. А., Федорова Г. А. Труды ВНИВИ, VII. Пищепромиздат, 1961.
Девятнин В. А., Федорова Г. А. Труды ВНИВИ, VIII, 1961; цит. по МРТУ—42 № 2892—62.
Девятнин В. А. и Федорова Г. А. Труды ВНИВИ. Т. 6, Пищепромиздат, 1958.
Демьянов Н. Я. и Прянишников Н. Д. Общие приемы анализа растительных веществ. Сельхозгиз, 1930.
Дихлорэтан. Под ред. Ю. Руденко. ГИОВ, 1939.
Залкинд Ю. С. Химия органических соединений с открытой цепью. Л. Гос. науч.-техн. издательство Центрохимсектор, 12 тип. ОГИЗ'а РСФСР, 1932.
Иванов Н. Н. Методы физиологии н биохимии растений. М.—Л„ Сельхозгнз, 1946.
Иосикова В. М. Журнал «Лабораторная практика», 1939, 8.
Иоснкова В. М. Журнал «Лабораторная практика», 1940, 1.
Иоснкова В. М. Журнал «Аналитическая химия», 1955, 10, 3.
Иосикова В. М., Зворкина В. В., Чесалкина Е. Н. Сб. трудов ВНИВИ. IV. Пищепромиздат, 1953.
И оу Д. Г. Колориметрия. Госхнмиздат, Г935.
Каневский Е. Журнал прикладной химии, 17, 514—519, 1944.
Карякин Ю. В. Чистые химические реактивы. Госхнмиздат, 1947.
Каррер П. Курс органической химии. ОНТИ, 1938.
К и з е л ь А. Р Практическое руководство по биохимии растений. Бномедгиз, 1934.
Кларк Т. Руководство по качественному и количественному анализу. ОНТИ, 1934.
Кольтгоф И. М. Объемный анализ. Ч. I, 1930; ч. II, 1932.
Кольтгоф н Лингейи. Полярография. Госхимнздат, 1948.
Колтунова В. И. Труды ВНИВИ. VI. Пищепромиздат, 1958.
Конант Д. Курс органической химии. Госхнмиздат, 1962.
К о р ш а к В. В., Рафиков С. Р. Синтез и исследование высокомолекулярных соединений. Изд. АН СССР, 1949.
Коренман И. М. Количественный микрохимический анализ". М.—Л., Госхимнздат, 1949.
К'удряшов Б. А. Биологические основы учения о витаминах. Советская наука, 1948.
Кузнецов В. И., Михайлов В. А. Журнал аналитической химии, 1957, 12, 1.
Лас г о-в ск и й Р. П. Технический анализ в производстве проце* жуточных продуктов и красителей. Госхнмиздат, 1949.
Лечебно-профилактические средства, предметы санитарии и .гигиены, витаминные препараты. Сборник стандартов. Стандартгиз, 1957.
Л я л н к о в Ю. С. Физико-химические методы анализа. Металлург - издат, 1948.
Мейер Г. Анализ н определение строения органических веществ. ОНТИ, 1935.
Методическое руководство по определению витаминов. Под ред. Б. А. Лаврова, Медгнз, 1960.
Методы определения витаминов (химические и биологические). Под ред. В. А. Девятнина. Пищепромиздат, 1954.
Михайленко Ю. А. Журнал «Успехи химии», 1947, 16, 443.
Мортон Э. А. Лабораторная техника в органической химии, 1941.
Обзор применяемых в Институте питания в Потсдаме-Ребрюкке методов определения витаминов. Потсдам-Ребрюкке, 1958.
Органические реакции. Сб. под ред. Адамса. М., 1948.
Оствальд Лютер. Физико-химические измерения. ОНТИ. Ч. I, 1933; ч. II, 1934.
Палладина О. К- Доклад на совещании по химии витаминов. Институт органической химии АН УССР. Киев, 1954.
ПалаузовВ. А. Химические реактивы. ОНТИ, 1935.
П а с х и н а Г. С. Журнал «Успехи биологической химии». Изд. АН СССР, 1950.
Преображенский Н. А., Генкин Э. Н. Химия органических лекарственных веществ. Госхимиздат, 1953. ■
Проскуряков Н. и Белозерский А. Практическое руководство по биохимии растений, 1950.
Рачинский В. В. Журнал «Успехи химии», 1950, 19, 4.
Рачинский В. В., Г а п о н Т. Б. Хроматография в биологии. Изд. АН СССР, 1953.
Реактивы и препараты лабораторного назначения. Под ред. В. В. Логинова. ГОНТИ, 1938.
Родио.нов В. М., Богословский В. М., Федорова А. М. Лабораторное руководство по химии промежуточных продуктов и красителей. ГХИ, 1948.
Руженцова А. К., Виноградова М. Е. Медицинская промышленность, 1950, 7, 8.
Савинов Б. Г. Каротии (провитамир А). Изд. АН УССР, 1948.
Самсонов Г. В. Хроматография. Медгиз, 1955.
Свешников Б. Я. Журнал прикладной химии, 1940, 13, 768.
Сеткина О. Н. Журнал «Оптико-механическая промышленность», 1940, 9.
Слободин Я. 3., Зигель М., Янишевская М. Журнал прикладной химии, 1943, 16, 7—8, 280.
Словарь органических соединений. Пер. с англ. Под ред. В. М. Родионова, т. I, II, III. М„ 1949.
Смирнов Б. С. Практические работы по органической химии. Сельхозгиз, 1935.
С о п i н Е. Ф. Основи вчення про в!там1ни. Рад. Шк., 1957.
Стиллер Э. Т. Физические методы определения витаминов. В сб.: Биохимия и физиология витаминов. В. 5. М., 1952.
Спутник химика. Т. II, III. Цнт. по «Chern. Kalender». ОНТИ, 1935.
ТананаевН. А. Объемный анализ. М., 1939.
Татьянин А. Р. Производство витамина D. М., Пищепромиздат, 1943.
Торп Д. и У а й т л и М. Практическое руководство по органическому анализу. М., ОНТИ, 1937.
Труфанов А. В. Журнал «Вопросы питания», 1955, 14, 5, 3.
Труфанов А. В. Биохимия и физиология витаминов и антивитаминов. Сельхозгизиздат, 1959.
Т о л л е н с-Э л ь с н е р Ф. Краткий справочник по химии углеводов. ГОНТИ, 1938.
Ф а н г л ь Ф. Капельный анализ. ОНТИ, 1937.
Фармацевтические препараты. Спр. Под ред. Б. Вотгал, И. Левин- штейна и др. ОНТИ, 1934.
Федорова Г. А. В сб.: Витаминные ресурсы. Изд. АН СССР. М., 1959.
Ф и а л к о в Л. А. Методы исследования лекарственных веществ. Медгиз, 1946.
Цвет М. Хроматографический адсорбционный анализ. Изд. АН СССР, М„ 1946.
Челинцев Г. и Беневоленская 3. Журнал общей химии, 1944, 14, 1142.
Чичибабин А. Основные начала органической химии. Госиздат, 1961.
Чулановский В. М. Введение в молекулярный спектральный анализ. Государственное издательство технической литературы, 1951.
Шемякин Ф. М., Мицеловский Э. С., Романов Д. В. Хроматографический анализ. Госхимиздат, 1955.
Шерман О. С. Сборник трудов ВНИВИ. IV. Пищепромиздат, 1953.
Шоры гии П. П. Журнал «Успехи химии», 1944, 13, 90.
Ш и л о в Н. А. Объемный анализ. М., 1932
Ш к о д и н А. М. Журнал общей химии, 1940, 10, 1694.
Шленк В. и Бергман Э. Органическая химия. ОНТИ, 1936.
Шнайдман Л. О. Витаминная промышленность. Сб. 2. Пищепромиздат. М., 1956.
Шнайдман Л. О. Производство витаминов. Пищепромиздат, 1958.
Bandelin F., Tuschoff J. Anal. Chern., 1953, 8, 1198.
В e i 1 s t e i n B., Ber., 1872, 5, 620;
Bomskov H. Methodik der Vitaminforschung. L„ 1936.
Borgstrom P., H e г s ch W. J. Am. Chem. soc , 1923, 45, 6, 1493.
Bruchmann E. Brauntweinwietschaft, 1951, 76, 184.
Bunyan J., Green J., M a m e 1 i s P., Macinkiewitz S. Nature, 1957, 179, 4556.
Chromatografi a. Rea. J. Opienskij. Warzawa, 1957.
Chromatographie unter besonder Beriickstigung der Papier Chromatographie. E. Merck, Darmstadt.
D e w a 11 C., Green R. Anal, chem., 1935, 1789
Ge г п о c h M., D о k о u p i 1 J., C h u t п у В. Chem. Listy, 1953, 47, 2, 269, 271.
H a i s J. M. u. M a c ek К. Handbuch der Papierchromatographie. Jena, 1958.
Hincel J., AylingE., Walters T. J. chem. Soc., 1939, 403.
Hochberg M., Melnick D., Oser B. J. Biol. Chem., 1944, 155, 109.
Hdrhammer R„ Hansel A. Arch, pharm., 1955, 42, 7, 180—181.
Gaud i a no A., T о f f о 1 i F., В а с с a с c i M. Inst, de Sanitas. Roma.
.1 и li ii ь и n B. Methods Of vitamin determination, 1948.
Knobloch E Physikalne-chernicke metodu stanovenja vitaminu. Praha,'1956.
L a n.d i n b u r g К., T i s c h e r M., Wall J., R о b s о n. R. J.1 Amer. л chbm, Soc. 1944, 66, 1217.
Lorenz A., Arnold L. Food research, 1941, 6, 151—156.
McMahon J., Davis R., Kal nitsky G. Proc. Soc. exp. biol. a med., 1950, 75, 799.
Methods of vitamin assay. Ass. vitam. chem., 1947.
M i 1 r a t h H. Chem. Ztg., 1909, 33, 1249.
Morton R. Absorption spectra. London Hilger.
Morton R. The application of absorption spectra, 1942.
Nicloux M. Bull. Soc chim., 1906, 35, 330.
Messinger H. B. 21", 3386, 1888; B. 59, 695, 1946.
Pace E. Les vitamines. Roma, 1949.
Pifer C., WoIIish E. Anal. Chem., 1952, 24, 519.
Ogawa S. Vitamins, 1953, 6, 2, 241—246.
Reichstein T.. Griissuer A. Helv. chim.' Acta, 1934, 17, 311.
Roe J. H., Oesterling M. J. J. Biol, chem., 1944, 152, 511.
Romjn Z. Anal. Chem., 1897, 36, 19.
Rubin S. H., De Ritter E., Schuman R. L., Bauernfield.
Method of vitamin assay. Chim. anal, ed., 1945, 17, 136.
Sbornik vedeckych praci potravinarskeho prumyslu, 1955.
Schoniger IV. Microchim. Acta, 1955, 1, 123—129.
Sen di J. J. Biol, chem., 1941, 139, 707.
Scudi J., Buhs R. J. Biol, chem., 1942, 1,' 146.
Schwartz M., W i 11 i a m s J. N. Proc, soc exp. biol. a. med., 1955, 88, 1, 136—138.
Acta,1958,Acta,1958,1954,258,1954,258,Siliprandi D., Siliprandi N. Biochim. biophys. 14, 52.
Acta,
1958,
Acta,
1958,
1954,
258,
1954,
258,
Szalkowsky C. R., Davidson J. H. Anal, chem., 192.
II, OrganicII, OrganicSnell F.. Snell C. Colorimetric methods of analysis v. and biological, 1937.
II, Organic
II, Organic
Stern M., Baxter J. Anal, chem., 1947, 19, 902.
Tannenbaum M., Clark E. Anal. Chem., 1951.
Tschapke H., P leasing H. Naturwiss.. 1955, 14, 417.
1955, 42,1955, 42,Tschapke H., P 1 e s s i n g H. Naturwissenschaften, 417. Nahrungs, 1958, 2, 444.
1955, 42,
1955, 42,
Tschapke H„ Pies sing H. Pharmazie, 1957, 12, 5, 262—264.
Valeur С. C. R. Soc. biol., 1899, 129, 552.
Vielel V. Determination of functionally organic compounds. Anal. Chem., 4, 665, 1951.
Vogel H Chemie und Technik des Vitamines, 1951.
V i g u e s R. K-, C h e r v e t P. C. R., 1951, 232, 1412—21.
Wagner A., Burger A., Elze F. Die Aldehyde, 1931.
W о 11 i s h E. G., S c h m a 11 M. Anal, chem., 1950, 22, 8, 1038.
W i 1 s о п C., W e a t e r b у L. Ind. Eng. Chem., 1942, 14, 5, 425. Zechmeister L. Carotinoide. Berlin, 1934.
одержание
Предисловие Часть первая КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ О НЕКОТОРЫХ ФИЗИКО
ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДАХ АНАЛИЗА Спектрофотометрия ...11
Полярография-...15
Хроматография на бумаге21
Часть в т ор а я
ОПИСАНИЕ СПЕЦИАЛЬНЫХ МЕТОДОВ АНАЛИЗАВ ПРОИЗВОДСТВЕ ВИТАМИНОВ
Методы контроля в синтезе витамина А
Метилвииилкетои
Определение влажности по Фишеру
Полярографический метод определения метилвинилкетона и формальдегида Определение метнлвннилкетона
Определение формальдегида
Метил-3-пентен-2-ин-4-ол-1
Определение процентного содержания
Фенолят натрия".
Качественная реакция на фенол
Определение влажности .
Цитраль
Определение процентного содержания полярографическим "методом
Псевдоионон
Определение процентного содержания спектрофотометрическим методом -.
Р-нонои ..
Определение процентного содержания спектрофотометрическим методом
Альдегид С14
Полярографический метод определения цитраля, ф-, р-, а- иоиона и альдегида С»,
Определение Р-ионона, а-ноноиа и альдегида Си .
Аксерофтол (витамин А)
Определение витамина А в кристаллическом витамин' А — ацетате . . ..- .
292929303031333334343435363738394042424446484949292929303031333334343435363738394042424446484949Определение витамина А — ацетата в масляных растворах Спектрофотометрический метод......
29
29
29
30
30
31
33
33
34
34
34
35
36
37
38
39
40
42
42
44
46
48
49
49
29
29
29
30
30
31
33
33
34
34
34
35
36
37
38
39
40
42
42
44
46
48
49
49
Колориметрический метод
Дополнительные анализы
Определение числа индукционного периода масла'
Подготовка к определению витамина А в промышленных препаратах и пищевых продуктах
Определение витамина А в продуктах, содержащих витамин А и каротин
Методы контроля в синтезе витамина Bj
Этилформиат
Определение процентного содержания . i
Определение примеси свободной муравьиной кислоты
Определение влаги в этилформиате
Определение спирта в этилформиате
Определение муравьиной кислоты в кубовых остатках при получении этилформиата
Этилат натрия
Определение процентного содержания ''''
Определение этилата натрия реактивом Фишера .".
Определение содержания едкого натрия в пересчете на натрий
Определение общего количества натрия .
Акрилонитрил...
Определение пределов кипения
Определение процентного содержания
Натрий-а-оксиметилен-р-этоксипропионитрил (натрэнолят) Колориметрический метод анализа
Ацетонитрил
Качественное испытание на присутствие аммиака
Определение процентного содержания
Ацетонминовый эфир
Определение общего количества хлора .
Определение примеси НС1 (в пересчете на С1) *"\
Аммиак в Спиртовом растворе
Ацетамидин гидрохлоридi '
Определение общего количества хлора "
Определение примеси хлористого аммония
Аминопиримидин
Определение Процентного содержания по азоту
Определение процентного содержания спектрофотометрий ческим методом
Определение по алкоксигруппе (по Фибеку и Брехеру) Раствор брома в уксусной кислоте Бромаминопнримидии (бромгидрат).
Определение по азоту ’
Определение брома ...,"'
Определение летучих примесей
Ацетопропилацетат .. .
Определение процентного содержания по оксиму
Определение процентного содержания в техническом продукте
Определение количества примесей
Определение процентного содержания по ацетильным группам
5051525254555555565757585859606061626263656567676768696970707171727273747677777878797980818150515252545555555657575858596060616262636565676767686969707071717272737476777778787979808181Бромацетопропилацетат
50
51
52
52
54
55
55
55
56
57
57
58
58
59
60
60
61
62
62
63
65
65
67
67
67
68
69
69
70
70
71
71
72
72
73
74
76
77
77
78
78
79
79
80
81
81
50
51
52
52
54
55
55
55
56
57
57
58
58
59
60
60
61
62
62
63
65
65
67
67
67
68
69
69
70
70
71
71
72
72
73
74
76
77
77
78
78
79
79
80
81
81
Определение общего количества брома ....82
Определениеобщего количества примесей брома..83
Определениеброма, не вступившего в реакцию..84
Определениеацетильных групп в продукте ...85
Формамид87
Определениеобщего азота.87
Упрощенный"метод определения 88
Определениепримеси муравьинокислогоаммония88
Тиазол89
Определениепо сере89
Определениеметодом ацетилирования.91
Определение процентного содержания спектрофотометрическим методом92
Испытание тиазола на растворимость93
Витамин Bi (тиамин)93
Флуорометрический метод определения тиамина...94
Определение тиамина в таблетках и драже ...94
Объемный метод определения тиамина....96
Определение тиаминбромида-гидробромида....96
Определение тиаминхлорида-гидрохлорида....96
Полярографический метод определения.99
Определение в драже с витамином Bi....99
Драже и таблетки с витамином Bi....99
Драже поливитаминное100
Флуорометрический метод определения тиамина в пищевых продуктах .ЮО
Методы анализа кокарбоксилазыЮЗ
Методы контроля в синтезе витамина В2 . . .. Юб
Дихлорметиловый эфир106
Определение по хлору ..106
Определение общего количества хлора....106
Определение примеси соляной кислоты....107
Содержание хлора в дихлорметиловомэфире ...108
Содержание дихлорметилового эфира....108
Определение общего количества формальдегида ..108
2-хлорметил-4-иитротолуол109
Определение хлора .109
Определение примеси минеральных кислот ...111
Определение МО2-группы112
3,4-ксилидии113
Установка титра раствора нитрита натрия.114
Определение процентного содержания.115
Определение примеси аммиака в растворе 3,4-ксилидина ' 115
Определение процентного содержания 3,4-ксилидина в смеси по температуре застывания .116
Раствор электролита .. 117
Определение 3,4-ксилиднна117
Определение свободной серной кислоты..118
Определение примеси аммиака в виде аммонийной соли118
Барбитуровая кислота ....119
Реакция идентичности119
Цветная реакция 119
Реакция осаждеиия .120
Определение свободной барбитуровой кислоты ...120
К-соль D-арабоновой кислоты л 121
Определение прнмеси оксалата калия .,..121
D-арабонат кальция,,.. , .122
Определение процентного содержания ....122
D-рибоно-у-лактон123
Определение процентного содержания свободной рибоновой кислоты илактона123
Амальгама натрия 125
р-глюкоза ... .125
Определение процентного содержания126
Микрометод Бертрана .....126
Макрометод Бертрана127
D-рибоза ...129
Определение процентного содержания рибозы (с примесью арабинозы) .129
Определение процентного содержания D-рибоно-у-лакто- на и свободной рибоиовой кислоты 129
Определение примеси сульфата натрия в сгущенном растворе сахара129
3,4-кcилидин-N-D-pибoпиpaнoзид 130
Определение процентного содержания в кристаллическом
продукте .130
Определение в маточниках 131
D-рибамии 131
Определение процентного содержания в кристаллическом продукте132
3,4-ксилил-6-фенилазо-1-В-рибамин(азорибамин)...133
Экспресс-метод определения азорибамина....133
Витамин В2 (рибофлавин)135
Определение процентного содержания в кристаллическом препарате 135
Определение процентного содержания в техническом продукте .136
Определение в маточниках и промывных водах ..138
Определение процентного содержания по IX Госфармако- пее СССР133
Определение в драже и таблетках138
Определение в пищевых продуктах139
Определение общего количестварибофлавина..140
Определение Кислотногидролизуемогонфосфатазноот-
щепляемого рибофлавина .141
Вычисление содержания отдельных формрибофлавина 142
Методы контроля в синтезе витамина В3 (пантотеновой кислоты) 143
Р-аминопропиоиовая кислота (р-алании)143
Определение процентного содержания144
L (+) -трео-1 - (р-иитрофенил) -2-аминопропандиол-1,3146
Определение процентного содержания146
а-оксн-р,р-диметил-у-бутиролактон147
Определение процентного содержания ...143
Витамин В3 (пантотеновая кислота)149
Определение процентного содержания ....151
Метод определения процентного содержания пантотената кальция по ^минному азоту с реактивом Несслера* .152
Методы кднТрдля в синТеЗб йиТДмина £Й (никотиновой кислоты)155
Пиридиновые основания (смесь р-пиколина и 2,6-луТидина) 155
Определение влаги в смеси пиридиновых оснований, 156
Определение содержания формальдегида ....156
Определение конца отмывкн комплексной солн ..-* 157
Приготовление бумаги для хроматографии и техника хроматографирования157
Определение качества р-пиколииа158
Витамин РР (p-пиридинкарбоиовая кислота) ...158
Качественная реакция для отличия никотинамида от никотиновой кислоты 160
Объемный метод определения никотиновой кислоты в кристаллическом препарате, в драже и таблетках 160
Определение никотинамида в кристаллическом препарате, драже н таблетках162
Определение никотиновой кислоты в пищевых продуктах 163
Роданбромидиый метод определения никотинамида н никотиновой кислоты в поливитаминном драже и таблетках166
Определение никотиновой кислоты в растворах никотината натрия170
Методы контроля в синтезе витамина В6 (пиридоксина)171
Метиловый эфир метоксиуксусной кислоты ....171
2-метил-4-метоксиметил-5-циан-6-оксипиридии172
2-метил-3-нитро-4-метоксиметйл-5-циан-6 оксипиридин174
2-метил-3-нитро-4-метоксиметил-5-циан-6-хлорпиридин175
Хлоргидрат 2-метил-3-окси-4-метокси-5-оксиметилпиридии (метиловый эфир пиридоксина).177
Определение процентного содержания178
Хлористый палладий регенерированный .178
Качественное определение гидроксила в алифатической цепи179
Витамин В6 (пиридоксин)180
Объемный метод определения181
Потенциометрический метод определения .182
Реакция идентичности183
Определение примеси метилового эфира пиридоксина184
Определение пиридоксина в драже, таблетках и других препаратах с одним нли несколькими витаминами185
Методы контроля в синтезе витамина Вс (фолиевой кислоты)188
Глутаминовая кислота ... 188
Определение формольно-титруемого азота .•188
Определение удельного вращения .189
Определение температуры плавления .189
Качественное определение примесей190
Свободный аммиак .......190
Связанный анилин190
Соли аммония и диэтиламнн190
Хлоргидрат глутаминовой кислоты .... , ..190
2,4-днамино-5-изонитрозо-6-оксипирИмидин191
Определение примеси 2,4-диамиио-6-оксипиримидина191
Определение 2,4-диамино-5-изонитрозо-6-оксипиримндйндj 93
2Д5-трнамино-6-оксипиримидин-дихлоргндрат ..-193
Определение процентного содержания ......193
2,4,5-триамино-б-оксипириМидин-сульфат194
Определение процентного содержания ....194
Акролеин194
Определение -процентного содержания195
Дибромпропионовый альдегид .......195
Определение процентного содержания195
П-нитробензоилглутаминовая кислота196
Определение процентного содержания..196
Определение хлористого натрия197
П-аминобензоилглутаминовая кислота198
Витамин Вс (фолиевая кислота)199
N-4-{ [(2-амино-4-окси-птеридил) -метилрамииобензоилглута- миновая кислота 199
Определение процентного содержания в кристаллическом продукте201
Определение в таблетках с фолиевой кислотой и другими витаминами203
Методы контроля в производстве витамина В12 .204
Определение в кристаллическом препарате ....207
Определение в растворах 208
Спектрофотометрический метод208
Колориметрический метод208
Методы анализа витамина Hj209
Определение в кристаллическом препарате ...210
Методы контроля в производстве витамина С (аскорбиновой кислоты)211
D-сорбит211
Анализ кристаллического сорбита211
Метод определения по медному комплексу...212
Анализ сорбита в растворе .......214
Определение сухих веществ .... * ..214
Определение процентного содержания ....214
Качественная реакция на глюкозу216
Определение содержания сорбита в растворе очищенного сорбита216
Качественное испытание на присутствие никеля ...216
L-сорбоза217
Поляриметрический метод217
Определение сорбозы в растворах 218
Диацетоисорбоза .. 219
Определение диацетонсорбозы по ацетоновым группам219
Анализ чистой диацетонсорбозы220
Определение свободного ацетона в техническом продукте221
Определение моноацетонсорбозы в техническом продукте222
Определение общего количества ацетона ...222
Определение диацетонсорбозы поляриметрическим методом 223
Определение в кристаллическом продукте ...223
Определение в растворе 224
Определение щелочности растворов диацетонсорбозы225
Контроль конца реакции окисления диацетонсорбозы225
Определение влаги в ацетоне карбидным методом226
Диацетон-2-кето-Ь-гулоновая кислота227
Определение процентного содержания227
Качественное определение наличия хлоридов и сульфатой в сырой диацетон-2-кето-Ь-гулоновойкислоте228
Определение в маточниках . ■228
Витамин С (L-аскорбиновая кислота)229
Определение-аскорбиновой кислоты п кристаллическом продукте .. 231
Йодатный метод231
Йодометрический метод232
Определение аскорбиновой кислоты в ампулиропанпых растворах 232
Определение аскорбиновой кислоты в препаратах232
Железоаскорбиновая кислота232
Определение аскорбиновой кислотывтаблетках и драже 233
Определение аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот при их совместном присутствии233
Определение аскорбиновой кислоты в препаратах из растительного сырья237
Упрощенный (индофенольный) метод определения витамина С238
Упрощенный (йодатный)методопределения витамина С 241
Упрощенный метод определения витамина С в сульфи- тированных продуктах242
Методы контроля в производствевитаминаD244
Эргостерин244
Определение содержания эргостерина в дрожжах и мицелии грибов245
Анализ эргостерина247
Определение летучих примесей247
Определение температуры плавления 247
Определение процентного содержания247
Витамин D248
Определение витамина D в промышленных препаратах 252
Подготовка к определению252
Хроматография252
Экстракция253
Колориметрирование . 254
Определение витамина D в кристаллическом эргокальцифероле 254
Определение витамина D255
Определение витамина D2 адсорбционнымметодом257
Методы контроля в производстве витаминаЕ250
Определение токоферолов в маслах, масляных растворах токоферол-ацетата и концентратах, полученных путем экстракции и молекулярной дистилляции ....5858
Определение суммы токоферолов283
Определение р-, у-, а- и других нитрозирующихся токоферолов
Полярографический метод определения токоферолов в маслах и жирах 267
Методы контроля в производстве витамина К270
2-метил-1,4-нафтохинон (метинон) 270
Определение процентного содержания ....271
Викасол272
Определение процентного содержания ....373
Йодометрический метод2?3
Весовой метод .274
Колориметрический метод определения викасола в таблетках 275
Методы контроля в производстве витаминаР278
Определение флавонолов (рутина и кверцетина) в растительном материале283
Определение флавонолов в кристаллическом продукте285
Колориметрический метод *285
Весовой метод286
Спектрофотометрический метод определения рутина и кверцетина286
Хроматографический метод разделения и количественного определения флавонолов и флавоноиов287
Упрощенные методы определения суммы флавонов289
Определение флавонов в драже и таблетках с витамином Р 290
Определение флавонов в плодах шиповника...291
Определение катехинов в препаратах .292
Колориметрический метод определения суммы катехинов в препаратах катехинов из чайного листа ..293
Объемный метод определения витамина Р в препарате катехинов295
Определение витамина Р в таблетках с катехинами и аскорбиновой кислотой .296
Методы контроля в производстве каротина (синтетического и природного) 298
Этилпропениловый эфир298
Альдегид 0-Сц299
Диэтилацеталь альдегида Р-Сн300
Альдегид р-Cie301
Диэтилацеталь альдегида 0-С16303
Бутилвиниловый и" этилпропениловый эфиры...304
Ртутно-ацетатный метод305
Каротин306
Определение каротина в свежем растительномматериале307
Адсорбция на окиси магния или окиси алюминия и подготовка к колориметрированию309
Колориметрирование 310
Определение каротина в сухом растительномматериале310
Определение каротина в растительных соках...310
Определение каротина в жирах, маслах и масляных растворах каротина,....311
Определение каротина в кристаллических препаратах311
Определение витамина А в продуктах, содержащих одновременно каротин313
Спектрофотометрический метод определения каротина314
Часть третья
ПРИГОТОВЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ РЕАКТИВОВ
Основные реактивы иадсорбенты319
Приложения344
Литература348
1 Ферментативная обработка может быть также проведена при 50° в течение 3 часов.
1 При расчете содержания никотинамида в драже и таблетках пересчет в процентах заменяется иа средний вес 1 шт. драже или таблеток в г.
1 Допускается применение при титровании 0,01 н. раствора KJOS.
В.А.ДЕВЯТКИН
ЕТОДЫ
ХИМИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА
I ПРОИЗВОДСТВЕ
В.А.ДЕВЛТНИН
ЕТОДЫ
ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
<7 ПРОИЗВОДСТВЕ
ВИТАМИНОВ
ИЗДАТЕЛЬСТВО «МЕДИЦИНА»
Москва — 1964