ПРЕДИСЛОВИЕ

За время, прошедшее после выхода 1-го издания «Руководства к лабораторным занятиям по микробиологии», получила дальнейшее развитие специализация студентов лечебных факультетов по одной из трех основных медицинских специальностей—терапии, хирургии, акушерству и гинекологии. Поэтому возникла необходимость в более тесной связи микробиологии с клиническими дисциплинами. Провереннее авторами анализ и оценка интеграции преподавания микро* биологии с медико-биологическими и клиническими дксципш^ нами показали, что в учебных пособиях недостаточно полно изложены вопросы клинической микробиологии и иммунологий, знание которых необходимо лечащему врачу. Для устранения этого существенного недостатка кардинальным образом перестроено данное руководство, в которое включены основные положения клинической микробиологии и иммунологии: характеристика всех этапов микробиологической диагностики бактериальных, вирусных и грибковых заболеваний, преимущества, сроки проведения и информативность микробиологических методов исследования, анализ и оценка их результатов. Это облегчит будущему лечащему врачу постановку окончательного диагноза заболевания и решение вопроса об этиологической и патогенетической роли выделенных микроорганизмов, а также выбор и назначение иммунологических и химиотерапевтических препаратов. Указанные сведения необходимы также врачу-эпвдемиологу для проведения эпидемиологического анализа вспышек инфекционных заболеваний с целью установления источника и путей передачи инфекции. Патогенные микроорганизмы распределены в зависимости от патогенетических и эпидемиологический осо- бейностей вызываемых ими заболеваний (гнойных, респираторных, кишечных, трансмиссивных и др.), которыми обусловлен выбор материала для их микробиологической диагности-

ки, с чем прежде всего сталкивается лечащий врач, исходя из поставленного им предварительного диагноза заболевания.

Кроме того, темы «Микрофлора организма человека», «Антибиотики» переработаны с целысГ усиления их клинической направленности. Для студентов санитарно-гигиенического факультета написана специальная тема «Санитарнобактериологическая оценка объектов окружающей среды и пищевых продуктов».

Как и в первом издании, сохранены целевая направленность лабораторных занятии и план их построения. Все темы изложены таким образом, чтобы их можно было изучить на одном или нескольких практических занятиях.

Авторы выражают благодарность ассистентам кафедры микробиологии I ЛМИ им. И. П. Павлова В. В. Бабкову, Г. П. Петровой и Н. К. Артеменко за участие в работе над руководством, а также всем преподавателям медицинских институтов за сделанные ими критические замечания и пожелания по первому изданию руководства. •

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

В данном разделе описаны устройство и оборудование бактериологической, вирусологической и серологической лабораторий, а также основные методики, применяемые при бактериологических и вирусологических исследованиях: микроскопия, стерилизация, приготовление питательных сред, способы культивирования микроорганизмов г и выделение чистых культур. С помощью указанных методов изучаются морфологические, культуральные и биохимические признаки бактерий и вирусов, проводится санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей среды и пищевых продуктов. Рассматриваются также методы определения активности антибиотиков, чувствительности бактерий к ним и основы генетики бактерий.

Проведенные лабораторные работы позволят студентам закрепить знания, полученные на лекциях, и овладеть навыками микробиологических исследований, чтобы использовать их при лабораторной диагностике бактериальных и вирусных заболеваний, а также санитарно-бактериологических исследованиях окружающей среды.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ

И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ

Тема 1. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ, ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ

И СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ И ИХ ОБОРУДОВАНИЕ

Программа занятия

Организация микробиологических (бактериологических, вирусологических н серологических) лабораторий и правила работы в них.

Основные приборы и оборудование микробиологических лабораторий.

Микроскопы и микроскопическая техника.

Демонстрация

Устройство и применение основных приборов и оборудования, исполь< зуемого в микробиологических лабораториях: термостата, центрифуг, автоклава, сушильного шкафа и др., инструментария и посуды.

Устройство биологического микроскопа. Различные тйпы микроскопии： темнопольная, фазово-контрастная, л юминесцентная, электронная.

Препараты дрожжей и бактерий при различных типах микроскопии.

Задание для вьшолнения лабораторной работы

Микроскопировать и зщ)исовать препарат дрожжей.

Правила работы в микробиологических лабораториях

Работа в микробиологической лаборатории медицинского учреждения проводится с возбудителями инфекционных заболеваний— патогенными микроорганизмами Поэтому для предохранения от заражения персонал обязан строго соблюдать правила внутреннего распорядка,

Все сотрудники должны работать в медицинских халатах, шапочках и сменной обуви. Вход в лабораторию без халата категорически воспрещен. В необходимых случаях работающие надевают на лицо маску из марли. Работа с особо опасными микроорганизмами регламентируется специальной инструкцией и проводится в режимных лабораториях.

В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.

Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке. Личные веши сотрудников следует хранить в специально отведенном месте,

При случайном попадании заразного материала на стол, пол и пр. это место необходимо тщательно обработать дезинфицирующим раствором.

Хранение, наблюдение за культурами микроорганизмов и их уничтожение должны производиться согласно специальной инструкции. Все культуры патогенных микроорганизмов регистрируют в специальном журнале.

По окончании работы руки следует тщательно вымыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.

Принципы организации и оборудование бактериологической, вирусологической и серологической лаборатории

Бактериологические, вирусологические и серологические лаборатории входят в состав санитарно-эпидемиологических станций (СЭС) и крупных больниц. В лабораториях СЭС выполняются бактериологические, вирусологические и серологические анализы материалов, полученных от больных и контактировавших с ними лиц, обследуются бактерионосители и проводятся санитарномикробиологические исследования воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов и различных предметов.

В бактериологических и серологических лабораториях больниц проводятся диагностические исследования при кишечных и гнойных инфекциях, дифтерии, туберкулезе и др., а также исследования по контролю за качеством дезинфекции и стерилизации. Диагностика особо опасных инфекций (чума, туляремия, бруцеллез и др.) осуществляется в специальных лабораториях, организация и деятельность которых строго регламентированы.

В вирусологических лабораториях проводится диагностика заболеваний, вызванных вирусами (грипп, полиомиелит и др.), хламидиями (орнитоз и др.) и риккетсиями (сыпной тиф, Ку-лихорадка и др.)- При организации и оборудовании вирусологических лабораторий учитывается специфика работы с вирусами, клеточными культурами и куриными эмбрионами, требующая строжайшей асептики.

Лаборатории обычно размещаются в нескольких помещениях, которые в зависимости от объема работы и целевого назначения занимают определенную площадь. В каждой лаборатории предусмотрены: а) боксы для работы с отдельньгми группами бактерий или вирусами; б) помещения для серологических исследований, приготовления .питательных сред, стерилизации, мойки посуды; в) виварий с боксами для здоровых и подопытных животны!х;, г) регистратура для приема и выдачи анализов. Нараду с этими помещениями в вирусологических лабораториях имеются боксы для специальной обработки исследуемого материала и для работы с клеточными культурами.

Лаборатории снабжены следующим оборудованием: биологи-/ ческими иммерсионными микроскопами с дополнительными приспособлениями (осветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный конденсор и др.), люминесцентным микроскопом, термостатами, приборами для стерилизации (автоклав, сушильный шкаф, свертыватели), pH-метрами, аппаратом для получения дистиллированной воды (дистиллятор), центрифугами, техническими, аналитическими весами, аппаратурой для фильтрования (фильтр Зейтца и др.), водяными банями, холодильниками, аппаратом для изготовления ватно-марлевых пробок, набором инструментов (бактериологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.), лабораторной посудойг (пробирки, колбы, чашки Петри, матрацы, флаконы, ампулы, пастеровские и градуированные пипетки) и др.

В лаборатории имеется место для окраски микроскопических препаратов, где находятся растворы красок, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и пр. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой и банкой с дезинфициру-

HfHfРис. 1. Термостат.Рис. 1. Термостат.

Hf

Hf

Рис. 1. Термостат.

Рис. 1. Термостат.

к>щим раствором. Для повседневж)й работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими препаратами и другими лабораторными материалами. В крупных лабораториях имеются термальные комнаты для массового выращивания микроорганизмов, постановки серологических реакций.

Аппаратура для выращивания микро» организмов, стерилизации и других микробиологических целей

1. Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов 37℃. Термостаты бывают суховоздушными н водяными (рис. 1). Используются для культивирования микроорганизмов.

2・ Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.

3. Сушильный шкаф3. Сушильный шкаф(печь Пастера). Предназначен для

3. Сушильный шкаф

3. Сушильный шкаф

стерилизации лабораторной посуды и других материалов.

Автоклав. Предназначен для стерилизации паром под давлением (рис. 2, а, б). В микробиологических лабораториях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, переносные).

Холодильники. Используются в микробиологических лабораториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, кроЬи, вакцин, сывороток и прочих биологически активных препаратов при температуре около 4℃. Для сохранения биопрепаратов при температуре ниже 0℃ исполь-

зуются низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура -20℃ и ниже.

Центрифуги. Применяются для осаждения микроорганизмов, эритроцитов и других клеток для разделения неоднородных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях используют центрифуги, работающие на разных скоростях.

Прибор для счета колоний (рис. 3). Полуавтоматический

aaРпс. 2. Автоклавы.

a

a

a — горизонтальный; 6 — вертикальный (схема); / — стерилизационная камера； 2 — кран для выхода воз» духа; 3 — манометр； 4 — предох< ранительный клапан; $ — водопаровая камера； б — воронка для заполнения автоклава водой; 7 — отвер* стия для поступления пара в стерилизационную камеру； 8 — крышка； 9 — подставка для размещения стерилизуемых материалов.

Рпс. з. Прибор для счета колоний микроорганизмов.

/ — столик для чашки Петри； 2 — игла с пружинным устройством； 3 — показатель счетчика; 4 — тумблер для включения импульсного счетчика; $— тумблер для включения лампы освеще» ния счетчика.

Рнс. 4. Микроскопы.

<?— общий вид микроскопа «Биолэм»; б — схема микроскопа МБР-1: 1 — основание микроскопа； 2 ■— предметный столик； 3 — винты для перемещения предметного столика； 4 — клеммы, прижимающие препарат； 5 — конденсор； б — кронщтени конденсора； 7 — вннт, укрепляющий конденсор в гильзе； 8 — рукоятка перемещения конденсора； 9 — рукоятка ирисовой диафрагмы конденсора； 70 — зеркало； /7 — тубусодержатель； 12 — рукоятка макрометрического винта； 13 — рукоятка микрометрического вннта； " — револьвер объективов； 必—объективы； 16 — наклонный тубус； 〃一 винт для крепления тубусу /8 — окуляр.

счетчик, снабженный иглой с пружинным устройством. Легкий нажим иглы на участке дна чашки Петри, соответствующей положению колонии, оставляет на стекле метку. При этом держатель поднимается вверх, цепь замыкается и показания счетчика увеличиваются на единицу.

Микроскопы и методы микроскопии

Для микробиологическое исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный) и специальные методы микроскопии (фазовоконтрастный, темнопольный).

Биологический микроскоп. В микробиологической практике применяют микроскопы отечественных марок: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-Э, МБИ-6, Биолам Р-1 и др. Они предназначены для изучения формы, структуры, размеров и других признаков разлитаых микроорганизмов, величина которых не . менее О^—бЗ мкм. ~

Рпс. 5. Ход лучей в иммерсионной системе.Рпс. 5. Ход лучей в иммерсионной системе.

Рпс. 5. Ход лучей в иммерсионной системе.

Рпс. 5. Ход лучей в иммерсионной системе.

Микроскоп состоит из двух частей — оптической и механической (рис. 4). К оптике микроскопа относятся объективы, которые состоят из фронтальной (нижней) линзы, увеличивающей объект, и коррекционных линз, исправляющих недостатки оптического изображения. _ Объективы подразделяются на сухие и иммерсионные (от immersio — погружение). В микроскопах МБР-1 и МБИ-1 двз сухих объектива и один иммерсионный. Данные о каждом объективе имеются на его оправе： 1)X8, 40, 90; 2) числовая апертура; 3) заводской номер. Нщ)яду с этими обозначениями иммерсионные объективы 90 имеют дополнительный буквенный индекс ОИ или МИ (объектив иммерсионный или масляная иммерсия), а также черную маркировочную линию в нижней части объектива.

Фронтальная линза иммерсионного объектива имеет короткое фокурюе расстояние (f— 1,5—3 мм). При микроскопии ее погружают в каплю предварительно нанесенного на препарат иммерсионного масла, показатель преломления которого (1,52) близок к показателю преломления стекла. При этом устраняются неизбежные потери попадающих в объектив лучей света.

Предельная разрешающая способность иммерсионного микроскопа 02 мкм. Общее увеличение микроскопа определяется произведением увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, увеличение микроскопа с иммерсионным объективом 90 и окуляром 10 составляет: 90X10"=900 раз. Ход лучей в иммерсионной системе показан на рис, 5.

Дополнительные приспособления к биологическому микроскопу. Эти приспособления позволяют максимально использовать все его возможности, облегчают условия работы и значительно расширяют диапазон применения. В микробиологических лабораториях обычно используют следующие приспособления:

Темнопольные кардиоид- и параболоид-ковденсоры^ 二，

Фазово-контрастное приспособление КФ-1, КФ4 й другие модели. 、

Бинокулярная насадка, приближающая микроскопию к условиям естественного зрения. 丁」_

Осветители ОИ-7, ОИ-19, обеспечивающие оптимальное и стабильное освещение. Интенсивность света регулируется реостатом, ..： 工

Рис. 6. Ход лучей в темнопольных конденсорах.

а — параболоид<конденсор； 6 — кардионд-^сонденсор; 1 — объектив； 2 — иммерсионное масло; 3 —' препарат； 4 — зеркальная поверхность; 5 — диафрагма.

Окуляр-микрометр и объект-микрометр, предназначенные для измерения микроскопических объектов.

Нагревательный столик, устанавливаемый вместо предметного столика микроскопа для обеспечения постоянной температуры 37℃ и применяемый при длительном наблюдении за живыми микроорганизмами.

Рисовальный аппарат для зарисовки препарата, с помощью которого можно одновременно видеть изображение объекта и бумаги, расположенной на столе вблизи микроскопа, и обводить на бумаге контуры объекта.

Цветные, нейтральные и тепловые оптические светофильтры, устанавливаемые между источником света и микроскопом и применяемые при микрофотографии и при специальных методах микроскопии.

Микрофотонасадки МФН-1, МФН-3 и другие модели для фотографирования микроскопических объектов.

Микроустановка для цейтраферной (прерывистой) микрокиносъемки, в сочетании с фазовоконтрастной микроскопией используемая для изучения динамики развития и размножения микроорганизмов, влияния на них разных факторов н многих других вопросов.

Рис. 8. Фазово-контрастное устройство.

а — фазовые объективы； 6 — вспомогательный микроскоп； е — фазовый конденсор.

Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Это достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, который заменяет обычный конденсор в биологическом микроскопе (рис. 6, а,①.

Параболоид-жонденсор имеет затемнение в центре, задерживающее центральные лучи света, и внутреннюю зеркальную поверхность для отражения лучей. В кардиоид-конденсоре лучи сначала отражаются от выпуклой поверхности, затем от вогнутой. Краевые лучи, выходящие из темнопольного конденсора, проходят в косом направлении и не попадают в объектив, в связи с чем поле зрения остается темным. В объектив поступают отраженные от объекта лучи, которые образуют весьма характерное изображение ярко светящихся контуров микробных клеток и других частиц, находящихся в препарате на темном фоне (рис. 7).

Фазово-контрастная микроскопия. Основана на превращении изменений по фазе, возникающих при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом. С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превращаются в амплитудные и прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения^ негатив-

q

Рис. 9. Люминесцентный микроскоп МЛ-2.

а - общий внд; б-схема： / - основание микроскопа； 2 - тубусодержатель； 3 — предметный столик； 4 — кронштейн с конденсором； 5 一 элек^опульт ПРЛ-5； 6 — рукоятка полевой диаф- рагмы； 7 — рукоятка для переключения освещения； в — револьверный диск с «запирающими» светофшплрами; 9 — рукоятка включения ахроматической линзы； /О — револьвер объек. 1нво吗 〃 г светофильтры в оправах; 12 — винты для центрировки Ламп山：13 — рукояти

ным фазовым контрастом — светлое изображение объекта на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособление КФ-1 или КФ-4 (рис. 8). В их комплект входят:

Специальные объективы с фазовыми кольцами, изменяющие фазу и уменьшающие амплитуду световой волны. На оправе фазовых объективов обозначен дополнительный буквенный индекс «Ф»: Ф-10, Ф-20, Ф-40и ФОИ-90.

Фазовый конденсор с револьвером специальных кольцевых диафрагм для каждого объектива. Индексом «О» обозначено отверстие для наблюдения препарата обычным методом с ирисовой диафрагмой.

Вспомогательный микроскоп малого увеличения, которым заменяют окуляр при наблюдении за центровкой освещения.

Прн фазово-контрастной микроскопии используют осветители типа ОИ-7 или ОИ-19.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции (рис. 9).

Люминесценция (от lumen — свет) — свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии： света, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция — люминесценция объекта под влиянием света. Свет люминесценции имеет большую длину волны, чем свет возбуждающий, поэтому возбуждают люминесценцию коротковолновыми лучами. Если освещать люмннесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Длина волны излучаемого света (цвет люминесценции) зависит от физико-химической структуры люминеспирующего вещества.

Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями—флюорохрома- м и. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает радом преимуществ: /возможностью исследования живых микроорганизмов и обнаружения их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности.

В лабораторной практике . люминесцентная микроскопия широко применяется для выявления и изучения многих микроорганизмов.

Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0】мкм). Электронный микроскоп

перемещения коллектора； 14 — рукоятка полевой диафрагмы； /5 — крышка гнезда светофильтров； 76 — винты пентрировки полевой диафрагмы； 77 — макрометриче.ский винт； /5 — микрометрический винт； /9 — оправа коллектора； 20 — коро&са с механизмами грубого и тонкого перемещения препарата； 21 — винт для крепления насадки； 22 — винты для центрировки полевой диафрагмы； 23 一 бинокулярная насадка； 24 — рукоятка тормоза грубого движения； 25 一 рукоятка переключения освещения； 26 — рукоятка для перемещения препарата в горизонтальной плоскости; 27 — защитная втулка; 28 — корпус ртутной лампы； 29 — кювеТа с дистиллированной водой.

G

Рис. 10. Электронный микроскоп.

а — о&ций вид; 6 — схема колонки： 7 — ручка для регулировки юстирующего устройства; i — устройство, фиксирующее пучок электронов； 3 — камера для сеток, на котором помешаются исследуемые объекты； 4 — противозагрязнительное устройство; 5 — диафрагма объективной линзы; 6 —диафрагма поля зрения； 7 — бинокулярная лупа; 8 — флюоресцентный экран; 9 — электронная пушка; 10 — конденсорные линзы； // — устройство, фокусирующее пучок электронов； 12 — стигматор объективной линзы； 13 — объективная линза； 14 — промежуточные линзы； /5 — проекционная линза； 16 — фотоэкспонометр; /7 —фотокамера.

применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов (рис. 10). Световые лучи в таких микроскопах заменяют поток электронов, имеющий при определенных ускорениях йЖну волны около 0/Ю5 нм, т. е. почти в 100000 раз короче длины волны видимого света. Высокая разрешающая способность электронного микро-

скопа, практически составляющая 0,1—0,2 нм, позволяет получить общее полезное увеличение до 1000000 раз.

Наряду с приборами «просвечивающего» типа используют сканирующие электронные микроскопы, обеспечивающие рельефное изображение поверхности объекта. Разрешающая способность этих приборов значительно ниже, чем у электронных микроскопов «просвечивающего» типа.

Методические указания

Работа с любым микроскопом состоит из правильной установки освещенности поля зрения и препарата и его микроскопии разными объективами. Освещение может быть естественным (дневным) или искусственным, для чего используют специальные источники света, например осветитель ОИ-7.

При микроскопии препаратов с иммерсионным объективом следует строго придерживаться определенного порядка в работе: 1) на приготовленный и окрашенный мазок нанести небольшую каплю иммерсионного масла и поместить препарат на предметный столик (укреплять зажимами не обязательно); 2) повернуть револьвер до отметки иммерсионного объектива 90; 3) осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла; 4) установить ориентировочный фокус при помощи микрометрического винта; 5) провести окончательную фокусировку препарата микрометрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, так как это может повлечь поломку препарата или фронтальной линзы (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1—1 мм). I

По окончании работы микроскопа необходимо специальной тряпочкой тщательно вытереть масло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый сухой объектив 8.

Техника фазово>контрастной микроскопии. 1.Установить в микроскоп фазовый конденсор и соответствующий фазовый объектив. Револьвер конденсора поставить в положение «О». 2. Поместить преп叩ат на предметный столик. 3. Установить освещение так, чтобы четкое изображение нити электролампы находилось в плоскости полностью открытой ирис-диафрагмы конденсора. 4. Заменить окуляр вспомогательным микроскопом МИР-4 и перемещением его окуляра сфокусировать фазовое кольцо объектива до получения четкого темно-серого изображения. 5. Установить диафрагму в соответствии с фазовым объективом. В поле зрения появляется светлое кольцо диафрагмы. 6. С помощью центрировочных винтов конденсора полностью совместить светлое и темное кольца. 7. Заменить вспомогательный микроскоп окуляром и микроскопировать препарат. 8. При смене объектива или препарата вновь проверить центрировку кольцевой диафрагмы с фазовым кольцом. Правильное

выполнение всех условий обеспечивает достаточно высокую контрастность изображения.

Техника темнопольной микроскопии. 1. Заменить обычный конденсор в микроскопе темнопольным (параболоид- или кардиоид-конденсор). 2. Для создания оптически гомогенной среды на верхнюю линзу темнопольного конденсора нанести каплю дистиллированной воды или иммерсионного масла. Поднять конденсор до соприкосновения капли воды или масла с предметным стеклом. 3. Установить достаточно сильный и стабильный источник света (например, осветитель ОИ-7) и провести точную юстировку осветительной системы микроскопа.

Возможные ошибки при микроскопии в темном поле связаны с наличием пузырьков воздуха между конденсором и предметным стеклом, неправильной установкой конденсора и другими причинами.

Техника люмине сцентиой микроскопии. В повседневной работе объект обычно освещают сверху через объектив в падающем свете При этом используют синие световые фильтры ФС-1 (2 мм), ФС-2 (4 мм) и желтый фильтр Ж-18 для зациты глаз.

При работе с микроскопом МЛ-2 необходимо： 1) включить вилку блока питания микроскопа в электрическую сеть; 2) поворотом по часовой стрелке установить рукоятку регулятора напряжения у красной точки; 3) тумблер иа лицевой стороне блока питания установить в положение «ВКЛ» (включено) и нажать кнопку зажигания лампы микроскопа; если лампа ие загорается, повернуть рукоятку регулятора напряжения на несколько миллиметров по часовой стрелке и вновь нажать кнопку (на кнопку нажимать не более 2—3 с); 4) после зажигания лампы установить рукоятку регулятора рабочего тока на отметку 4 А; через 10 мин после включения лампы микроскопа можно начинать исследование препаратов.

Люминесцентную микроскопию проводят в затемненной комнате.

Методы приготовления препаратов для тем- нопольной, фазовО'Контрастнойилюминесцент- ной микроскопии. Для темнопольной и фазово-контрастной микроскопии готовят нативные препараты («раздавленная» капля и др.); микроскопируют с объективом 40 или специальным иммерсионным объективом с ирис-диафрагмой, позволяющей регулировать численную апертуру от 1^25 до 0,85. Толщина предметных стекол не должна превьпиать 1—1,5 мм, покровных -0,15-0^2 мм.

Для люминесцентной микроскопии готовят на предметных стеклах препараты-мазки или нативные препараты, которые окрашивают специальными флюоресцентными красителями: акридиновым желтым, акридиновым оранжевым, ауромином, корифосфином. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

Приго товление пре парато в для исследоваиия в электрон ном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят на специальных пленках<подложках, так как стекло непроницаемо для электронов. Исследуемый объект максимально очищают от посторонних примесей и наносят на пленку<подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую сеточку.

Рис. 11. Формы бактерий.Рис. 11. Формы бактерий.а — шаровидные; 6 — палочковидные; 6 — извитыеа — шаровидные; 6 — палочковидные; 6 — извитыепростейшие) относится к царствупростейшие) относится к царствулены в отдельное царство Vira.лены в отдельное царство Vira.эукариотов. Вирусы выдеэукариотов. Вирусы выде

Рис. 11. Формы бактерий.

Рис. 11. Формы бактерий.

а — шаровидные; 6 — палочковидные; 6 — извитые

а — шаровидные; 6 — палочковидные; 6 — извитые

простейшие) относится к царству

простейшие) относится к царству

лены в отдельное царство Vira.

лены в отдельное царство Vira.

эукариотов. Вирусы выде

эукариотов. Вирусы выде

МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

В данном разделе рассматриваются морфологические особенности основных представителей многообразного мира микроорганизмов: бактерий, вирусов и грибов. Бактерии от-

носятся к царству прокариотов. Согласно классификации Берги (1974), в него входят фото- и ско- тобактерии (индифферентные к свету). Последние подразделяются на три класса: 1) бактерии； 2) бактерии, являющиеся облигатными внутриклеточными паразитами (риккетсии и хламидии)； 3) бактерии, лишенные клеточной стенки (микоплазмы).

Классы подразделяются на порядки, семейства, роды и виды. Ряд групп микроорганизмов (грибы.

Темя 2. МОРФОЛОГИЯ И СТРУКТУРА БАКТЕРИЙ

Бактерии — одноклеточные микроорганизмы. Они имеют разнообразную форму и довольно сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны четыре основные формы: сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная (рис. 11).

Бактерии шаровидной формы —кокки—в зависимости от плоскости деления и расположения отдельных особей подразделяются на микрококки (отдельно лежащие кокки), диплококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кокков), стафилококки (имеющие вид виноградных гроздьев), тетракокки (образования из четырех кокков) и сарцины (пакеты из 8 или 16 кокков).

Палочковидные бактерии располагаются в виде одиночных клеток, дипло- или стрептобактерий.

Извитые формы бактерий — вибрионы и спириллы, а

также спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы — извитую форму с несколькими спиральными завитками.

Размеры бактерий колеблются от 0,1 до 10 мкм. В состав бактериальной клетки входят капсула, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана и цитоплазма, в которой содержатся нуклеоид, рибосомы и включения (рис. 12). Некоторые бактерии снабжены жгутиками (рис. 13) и ворсшками. Рад бактерий образуют споры, которые располагаются терминально, субтерминально или центрально (рис. 14); превышая поперечный размер клетки, споры придают ей веретенообразную форму.

Для изучения морфологии бактерий из них готовят нативные (прижизненные) препараты и фиксированные мазки, которые окрашивают анилиновым красителем. В основе окраски лежат сложные химические и физико-химические реакции. Протоплазма бактерий, особенно в фиксированных мазках, обладает сродством к основным красителям. Поэтому для их окраски используют главным образом основные красители: метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, везувин и др. Для выявления различных структурных элементов в бактериальной клетке применяют нейтральные и кислые краски.

Различают простые и сложные методы окраски (по Граму, Цилю — Нельсену и др.). Последние имеют дифференциальнодиагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства.

а — монотрих; 6 — лофотрих； е — амфитрих; 2 — перитрих.а — монотрих; 6 — лофотрих； е — амфитрих; 2 — перитрих.Рис. 14. Споры бактерий (схема).Рис. 14. Споры бактерий (схема).а — терминальное расположение； 6 ^- субтер- мииальное; 6 — центральное.а — терминальное расположение； 6 ^- субтер- мииальное; 6 — центральное.Рис. 13. Жгутики бактерий (схема).Рис. 13. Жгутики бактерий (схема).

а — монотрих; 6 — лофотрих； е — амфитрих; 2 — перитрих.

а — монотрих; 6 — лофотрих； е — амфитрих; 2 — перитрих.

Рис. 14. Споры бактерий (схема).

Рис. 14. Споры бактерий (схема).

а — терминальное расположение； 6 ^- субтер- мииальное; 6 — центральное.

а — терминальное расположение； 6 ^- субтер- мииальное; 6 — центральное.

Рис. 13. Жгутики бактерий (схема).

Рис. 13. Жгутики бактерий (схема).

Рис. 15. Актиномицеты.

Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.

Актиномицеты (Actinomyces) относятся к порядку Actinomy-

бов, но встречаются такжебов, но встречаются такжеcetales. Клетки актиномицетов обычно имеют вид длинных и ветвящихся нитей (рис. 15), напоминающих в ряде случаев мицелий одноклеточных грм- палочковидные и кокковидные

бов, но встречаются также

бов, но встречаются также

формы. Нити мицелия имеют длину 100—600 мкм и толщину 0^—1,2 мкм. Актиномицеты размножаются спорами, поперечным делением и почкованием. Они не имеют выраженной капсулы, жгутиков и ворсинок. Как и другие бактерии, актиномицеты окрашиваются анилиновыми красителями. Обычно их окрашивают простыми методами или по Граму. Актиномвдеты являются грамположительными микроорганизмами.

Прок^амма занятия

Формы бактерий и методы их изучения.

Ультраструктура бактериальных клеток (изучение электронно-микроскопических фотографий).

Простые и сложные методы окраски.

Демонстрация

Методика приготовления мазков из бактериальных культур и их окраска.

Различные морфологические формы бактерий в препаратах-мазках, окрашенных простыми методами.

Подвижность бактерий в препарате «висячая» капля.

Мазок из смеси бактерий. Окраска по Г раму

、5. Препарат актиномицета. Окраска по Граму.

Мазок из чистой культуры капсульных бактерий. Окраска по Бурри -Гинсу.

I7. Мазок из чистой культуры дрожжей, содержащих зерна волютина.

Окраска по Нейссеру.

Мазок из чистой культуры спорообразующих бактерий. Окраска по методу Ожешки.

Мазок из чистой культуры кислотоустойчивых бактерий. Окраска по Цилю — Нельсену.

Методика определения размеров микробной клетки с техникой градуировки окулярного микрометра по объект-микрометру.

Структурны© компоненты бактериальной клетки на электронно-микроскопических фотографиях.

Задание для выполнения лабораторной работы

Определить форму клеток неизвестной бактериальной культуры, используя простой метод окраски.

Определить форму клеток и отношение к окраске по Граму разных бактерий, содержащихся в исследуемой смеси бактериальных культур.

Определить наличие спор, зерен волютина и кислотоустойчивость исследуемой бактериальной культуры, используя соответствующие методы окраски.

Определить подвижность исследуемых бактерий. Составить протокол и сдедать заключение по результатам проведенных исследований (см. табл. 1).

Методические указания

Приготовление препаратов для микроскопического исследования.

Взятие материала для исследования. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях используют для этой цели препаровальные иглы.

Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель — в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и затыкают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой, удерживая ее в правой руке и закрывая отверстие II пальцем.

Приготовление препаратов для изучения микроорганизмов в живом состоянии.

Метод «висячей» капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8, под увеличением которого

находят край капли, а затем устанавливают объектив 40 и исследуют препарат.

Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40.

Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микробов вносят в каплю 0001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «висячая» или «раздавленная» капля и микроскопируют. После микроскопии препараты «раздавленной» или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1—1,5 см, только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то петлей его непосредственно наносят на предметное стекло н готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза (в течение 3 с) через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур микроорганизмов фиксируют погружением на 5—20 мин в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт или другие фиксирующие жидкости'

Методы окраски мазков

Простой метод. Фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1—2 мин) или метиленовым синим (3—5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Сложные методы. Включают последовательное нанесение на препарат красителей, различающихся по химическому

составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по методу Грама. 1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолето- вого через полоску фильтровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снимают, а краситель сливают,

Наносят раствор Люголя на 1—2 мин.

Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30—60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

Промывают препарат водой.

Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1—2 мин, промывают водой, высушивают и микроскопи- руют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 16).

Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и в проницаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также от соотношения РНК и ДНК в их цитоплазме. В клеточной стенке грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый (мукопептидный слой), содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту. Пептидогликаны грамположительных бактерий структурно отличаются от грамотрицательных бактерий. Тейхоевые кислоты стабилизируют ионы магния на поверхности клеток. У грамположительных бактерий на поверхности клетки имеется комплекс протеин — рибонуклеат магния； соотношение РНК и ДНК в их цитоплазме составляет 8 :1; у грамотрицательных бактерий это соотношение равно 1 ： 1. Изоэлектрическая точка цитоплазмы у грамположительных бактерий находится при pH 2,0-3,0, у грамотрицательных — около 5,0. После обработки раствором йода, являющегося окислителем, происходит сдвиг изоэлектрической точки в кислую сторону, выраженный у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.

Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.

Окраска по Граму имеет важное дифференциально -диагностическое значение и широко используется в микробиологии. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза и др., к грамотрицательным — гонококки, менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерий могут окрашиваться по Граму вариабельно в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, изменяющих структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по Граму,

состоит в переобесцвечиваяии или недообесцвечивании мазка спиртом. В первом случае грамположителтьные бактерии могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым н приобретать красный цвет (характерный для грамот- рицательных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином. Во втором случае грамотрицательньхе бактерии могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания (см. п. 3 описания окраски по Граму).

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля— Нельсена. 1. На фиксированный мазок наносят карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров в течение 3—5 мин.

2. Снимают бумагу, промывают мазок водой.

3・ На мазок наносят 5 % раствор серной кисло™ или 3% раствор солянокислого спирта на 1—2 мин для обесцвечивания.

Промывают водой.

Докрашивают мазок водным раствором метиленового синего в течение 3—5 мин.

Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Кислотоустойчивость обусловлена наличием в клеточной стенке и цитоплазме бактерий повышенного количества липидов, воска и оксикислот, в частности миколовой кислоты. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодействия красителя с бактериальными клетками, которые окрашиваются при этом в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окрашенными фуксином в красный цвет (рис. 17).

Окраска спор по методу Ожешки. 1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2—3 мин.

Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.

Окрашивают препарат по Цилю — Нельсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы —синий (рис. 18).

Окраска зерен волютина по методу Нейссера. 1. На фиксированный мазок наносят ацетат синьки Нейссера на 2—3 мин.

Наносят раствор Люголя на 10—30 с.

Промывают препарат водой.

Мазок докрашивают водным раствором везувина или хризоидина в течение %—1 мин.

Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Зерна волютина представляют собой соединения, имеющие в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окрашиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтьш цвет (рис. 19).

Обнаружение капсул по методу Бурри—Гинса. 1. Г отовят препарат по Бурри: смешивают каплю взвеси микробов с каплей туши и при помощи стекла со шлифовальным краем готовят мазок так же, как мазки из крови; затем его высушивают и фиксируют.

На мазок наносят водный раствор фуксина на 1—2 мин.

Промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно- розовом фоне (рис. 20).

Измерение микробов

Все микроскопические объекты измеряются в нанометрах (нм) и микрометрах (мкм): 1 мкмв10-3 мм; 1 нмв10"~8 мм; 1 мкмв «1000 нм. Для измерения микробов применяются окуляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр служит для непосредственного измерения объекта и представляет собой стеклянную пластинку, в центральной части которой нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр представляет собой стекло, в середине которого имеется эталонная шкала, разделенная на 100 частей. Цена деления шкалы известна и указана на стекле. Обычно каждое деление шкалы объект-мик- рометра равно 10 мкм.

Величину микроорганизмов измеряют окуляр-микрометром, помещая его на диафрагму окуляра делениями вниз, величину делений — с помощью объект- микрометра： пластинки, в центре которой нанесена линейка длиной 1 мм. Линейка разделена на 100 делений, каждое из которых равно 10 мкм. Объект- микрометр устанавливают на предметном столике микроскопа так, чтобы одно из его делений совпало с каким-либо делением окуляр-микрометра. Линейки обоих микрометров должны располагаться параллельно. Затем отмечают число делений объект-микрометра, в которые полностью укладывается число делений окуляр-микрометра. Зная величину деления объект-микрометра (10 мкм), устанавливают величину деления окуляр-микрометра. После этого объект-микрометр заменяют исследуемым препаратом и определяют размеры бактериальной клетки линейкой окуляр-микрометра при той же степени увеличения, при которой была измерена величина его делений.

Результаты работы по изучению бактериальной культуры протоколируют (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика культуры по морфологическим п тинкториальвым признакам (форма протокола).

Форма клеток

Величина

Окраска по Граму

Наличие

^Кислото- _ устойчи-

Подвижность

Включения

спор

кап- сул

зерен волютина

вость

Тема 3. МОРФОЛОГИЯ СПИРОХЕТ

Спирохеты — извитые подвижные бактерии, относящиеся к порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaceae. Патогенные спирохеты принадлежат к трем родам: Borrelia, Treponema, Leptospira.

Клетка спирохеты имеет цилиндрическую извитую форму, содержит цитоплазму, отграниченную цитоплазматической мембраной,. снаружи которой расположена клеточная стенка со с лабовыраженным пептидогликановым слоем. Патогенные спирохеты имеют длину 3—20 мкм и толщину 0,1-0,5 мкм. Представители отдельных родов различаются по длине и толщине, числу и характеру завитков (табл. 2; рис. 21). Спирохеты грамотрицательны. Боррелии в отличие от трепонем и лептоспир хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Морфологию трепонем и лептоспир изучают путем микроскопии живых микроорганизмов в препаратах «раздав^- ленная» или «висячая» капля в темнопольном или фазовоконтрастном микроскопе, а также в мазках, окрашенных по Романовскому — Гимзе или специальными методами, например серебрением.

Прш^амма занятия

Методы изучения морфологии спирохет.

Дифференцирование спирохет по морфологическим признакам.

Рис. 21. Морфология спирохет.

а — трепонемы; б — боррелии； 6 — лептоспиры.

Демопстрация

Движение лептоспир в темнопольном микроскопе.

Препарат лептоспир по Бурри.

Препарат бледной трепонемы по Бурри.

Препарат боррелии в толстой капле крови. Окраска по Романовскому — Гимзе.

Задание для выполнения лаборятори(ж работы

Определить родовую принадлежность спирохет в готовом мазке, окрашенном по Романовскому—Гимзе, используя данные, приведенные в табл. 2.

Методические указания

Морфологию спирохет изучают в препаратах «раздавленная» капля и в мазках, окрашенных по Романовскому — Гимзе. Нативные препараты микроскопируют в темном поле или с помощью фазово-контрастного микроскопа, наблюдая за активным и характерным движением спирохет и особенностями их формы.

Приготовление мазков из к.р о в и. На чистое обезжиренное стекло ближе к одному из его концов помещают каплю крови. Другое предметное стекло, имеющее шлифованный край, прижимают под углом 45° к капле крови, а затем скользящим движением передвигают его к свободному концу первого стекла. При этом кровь распределяется по предметному стеклу тонким слоем. Высушивают препарат на воздухе, фиксируют в жидком фиксаторе (метиловый спирт или смесь этилового спирта и эфира).

Для приготовления «толстой» капли на предметное стекло наслаивают 2—3 капли крови, распределяя ее до величины 10-копеечной монеты. После высушивания на воздухе осторожно наливают несколько капель дистиллированной воды на 10—15 мин для удаления гемоглобина из эритроцитов.

Окрашивание препарата по Романовскому— Гимзе смесью метиленового синего, эозина и а з у р а. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10—2} мин. Затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Таблица 2. Морфологические признаки спирохет

Род

Количество и характер зайитков

Характер движения

Окраска по Романовскому — Гимзе

Borrelia

Treponema

Leptospira

3—10, крупные, неравномерные

8Т2, мелкие, равномерные

Многочисленные первичные завитки; вторичные завитки в виде буквы S

Толчкообразное, сгибательно-поступательное

Плавное, сгибательнопоступательное

Очень активное, враща

тельно-поступательное

Сине-фиолетовая

Бледно-розовая

Розовосиреневатая

По Романовскому — Гимзе спирохеты возвратного тифа окрашиваются в фиолетовый цвет, эритроциты крови — в розовый, ядра лейкоцитов — в фиолетовый. Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, лептоспиры — в розово-сиреневатый.

Тема 4. МОРФОЛОГИЯ РИККЕТСИЙ И ХЛАМИДИЙ.

МОРФОЛОГИЯ МИКОПЛАЗМ

Риккетсии и хламидии относятся к классу Rickettsia облигатных внутриклеточных паразитов, который делится на два порядка: Rickettsiales и Chiamidiales.

Риккетсии представляют собой мелкие грамотрицательные микроорганизмы, характеризующиеся выраженным полиморфизмом *- образуют кокковидные, палочковидные и нитевидные формы (рис. 22). Размеры риккетсий варьируют от 0,5 до 3—4 мкм, длина нитевидных форм достигает 10—40 мкм. Спор и капсул не образуют, окрашиваются по Здродовскому в красный цвет.

Хламидии имеют шаровидную, овоидную или палочковидную форму. Их размеры колеблются в пределах 02-1,5 мкм. Морфология и размеры хламидий зависят от стадии их внутриклеточного цикла развития, для которого характерно превращение небольшого шаровидного элементарного образования в крупное инициальное тельце с бинарным делением. Перед делением частицы хламидий обволакиваются образованием, напоминающим бактериальную капсулу. Хламидии окрашиваются"* по Романовскому—Гимзе, грамотрицательны, хорошо видньх в прижизненных препаратах при фазовоконтрастной микроскопии.

К классу Mollicutes относится только один порядок Mycoplasmatales. Представители этого порядка — микоплазмы —

зо

отличаются от бактерий отсутствием клеточной стенки. Вместо нее они содержат трехслойную липопротеидную цитоплазматическую мембрану. Размеры микоплазм колеблются в пределах 125—250 мкм. Они имеют форму круглых, овальных или нитевидных образований, грамотрицательны.

Программа занятия

Изучение морфологических признаков риккетсий, хламидий и микоплазм.

Демонстрация

Хламидии е инфицированных клетках эпителия конъюнктивы, мазках- отпечатках из органов и культуры ткани.

Электронно микроскопические фотографии риккетсий, хламидий и микоплазм.

Задание для выполнения лабораторной работы

Изучить морфологию риккетсий в препарате, окрашенном по Романовскому— Г имзе.

Рис. 22. Морфологические типы риккетсий. Кокковидные, палочковидные и мицеллярные формы.

Методические указания

Окраска риккетсий по методу Здродовского. 1. Окрашивают мазок разведенным фуксином Циля (10—15 капель на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 мин.

Промывают водой.

Обрабатывают мазок 0,5% раствором лимонной кислоты или 0 <01% раствором хлористоводородной кислоты.

Промывают водой.

Окрашивают метиленовым синим в течение 1 мин.

Промывают водой, высушивают препарат.

Риккетсии по методу Здродовского окрашиваются в красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют,— в голубой, ядра — в синий.

Тема 5. МОРФОЛОГИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА ВИРУСОВ

Вирусы человека, животных, растений, насекомых и бактерии (фаги) выделены в царство вира (Vira). Они отличаются от других микроорганизмов своей ультраструктурной органи» зацией и наличием только одного типа нуклеиновой кислоты —РНК или ДНК. Внеклеточная форма существования вируса называется вирионом. Размеры вирионов колеблются от 15—20 до 300—500 нм. Они имеют палочковидную или цилиндрическую форму (вирус табачной мозаики), нитевидную форму в виде изгибающихся тонких нитей шириной около 10 нм и длиной до 500 нм и более (вирусы растений и некоторые фаги), сферическую форму, напоминающую многогранники (пикорнавирусы, аденовирусы), форму параллелепипеда (поксвирусы) и булавовидную или сперматозоидную форму (вирусы бактерий—фаг^.

Простейшие вирионы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки — капсида, который плотно ее окружает. В морфологическом отношении их характеризуют как нуклео- капсиды, а в химическом — как нуклеопротеиды.

Капсиды вирионов состоят из отдельных структурных субъединиц (полипептвдные цепи), объединенных в симметричные группы по кубическому или спиральному типу симметрии (рис. 23, о,①.Объединения единиц с кубическим типом симметрии называются морфологическими единицами, или капсомерами, которые могут быть обнаружены при электронной микроскопии. Капсиды построены из определенного числа капсомеров, характерного для каждой группы вирусов с кубическим типом симметрии. Например, у аденовирусов (рис. 24, 〃，б) капсид построен из 252 капсомеров. У вирионов со спиральным типом симметрии структурные

Рис. 25. Вирус табачной мозаики (ВТМ).

ООа — модель ВТМ. Изображен фрагмент вирусного капскца, построенного из одинаковых спирально расположенных белковых субъединиц. Между субъединицами помещается цепочка РНК, конфигурация которой целиком осгределяется их спиральным расположением. Часть спирали РНК условно показана свободной； 6 — вирионы ВТМ. Электронная микроскопия.

О

О

Рис. 27. Фаги.Рис. 27. Фаги.а — фаг Та. Электронная микроскопия； х 100 000. Видны гексагональная головка, отросток с фибриллами, базальная пластинка； б ~ адсорбция фага Та на клетках Е. coli в сканирующем электронном микроскопе.а — фаг Та. Электронная микроскопия； х 100 000. Видны гексагональная головка, отросток с фибриллами, базальная пластинка； б ~ адсорбция фага Та на клетках Е. coli в сканирующем электронном микроскопе.

Рис. 27. Фаги.

Рис. 27. Фаги.

а — фаг Та. Электронная микроскопия； х 100 000. Видны гексагональная головка, отросток с фибриллами, базальная пластинка； б ~ адсорбция фага Та на клетках Е. coli в сканирующем электронном микроскопе.

а — фаг Та. Электронная микроскопия； х 100 000. Видны гексагональная головка, отросток с фибриллами, базальная пластинка； б ~ адсорбция фага Та на клетках Е. coli в сканирующем электронном микроскопе.

Рис. 26. Вирус оспы.

а — строение вириона оспы (схема)： / — фрагмент цитоплазматической оболочки, захваченной вирионом при выходе из клетки； 2 — пространство между этой оболочкой и поверхностью вириона； 3 — внешняя осмиофильная мембрана оболочки вириона； 4 — средняя осмиофильная мембрана оболочки вириона： 5 — внутренняя мембрана оболочки вириона； 6 — боковое (латеральное) тело； 7 — фрагмент клеточной - оболочки； 8 — внутривирусная гранула； 9 — локальное втяжение оболочки； j。— тяж связывающий компонент нуклеоида с оболочкой; 11 — вирусоплазма； 12 — внешняя осмиофильная мембрана оболочки нуклеоида； 13 — средняя осмн- офобная мембрана оболочки нуклеоида； 〃 —внутренняя осмиофильная мембрана оболочки нуклеоида-/5 — нуклеоидо- плазма； 16 — осмиофооный компонент S-образной структуры； /7 — кольцо-срез спиральной укладки ДНК (гипотеза)； 18 — центр этого кольца； 19 一 внутренний компонент S-образной структуры нуклеоида* 20 — центральный компонент S-образнон структуры нуклеоида； б — вирион натуральной оспы. Электронная микроскопия. X 230 000. Видна S-образная структура нуклеоида.

субъединицы уложены в виде спирали .вокруг оси (рис. 25, а, 6). К таким вирионам относятся вирус табачной мозаики, миксовирусы. Сложно устроенные вирионы, например вирусов оспы, гриппа, имеют внешнюю оболочку—суперкапсид (рис. 26, а, 0, в состав которого входят липиды и полисахариды, принадлежащие клетке хозяина. Для фагов, имеющих сперматозоидную форму, характерен смешанный тип симметрии, так как капсид их головки построен по кубическому типу симметрии, а субъединицы капсида отростка объединены по спиральному типу симметрии (рис. 27).

Программа занятия

Изучение морфологии и ультраструктуры вирионов различных вирусов человека, животных, бактерий (фагов).

Задание для выполнения лабораторной работы

Изучить морфологию вируса осповакцины в препарате, окрашенном по Морозову.

Изучить структуру простых и сложных вирионов по схемам и электронномикроскопическим фотографиям.

Методические указания

Для окраски по способу Морозова готовят три реактива: 1) к 1 мл ледяной уксусной кислоты добавляют 2 мл 40% раствора формалина и доводят дистиллированной водой до объема 100 мл; 2) 5г танина . вносят в 1 мл карболовой кислоты и доводят дистиллированной водой до объема 100 мл; 3) к 5 *мл раствора нитрата серебра добавляют по каплям раствор аммиака до легкой опалесценции.

Техника окраски: 1) высушенный мазок фиксируют раствором 1 в течение 1 мин, затем раствор сливают и мазок промывают водой; 2) протравляют его раствором 2 в течение 1—2 мин при подогревании до появления паров, после чего промывают водой; 3) окрашивают мазок раствором 3 при подогревании до появления темнокоричневого цвета, промывают водой, высушивают и микроскопируют. При этом вирусы окрашиваются в черный цвет.

АСЕПТИКА И АНТИСЕПТИКА. ДЕЗИНФЕКЦИЯ

Асептика—система мероприятий, предупреждающих внесение (попадание) микроорганизмов из окружающей среды в ткани или полости человеческого организма при лечебных и диагностических манипуляциях, а также в материал для

исследования, в питательные среды и культуры микроорганизмов при лабораторных исследованиях. Асептика предусматривает стерилизацию инструментов и материалов, специальную обработку рук медицинских работников, соблюдение особых санитарно-гигиенических правил и приемов работы. Методы и правила асептики должны строго соблюдаться при производстве лечебных и профилактических препаратов, а также в работе микробиологических Лабораторий, Антисептика — комплекс лечебно-профилактических мероприятий, направленных на уничтожение микроорганизмов, способных вызвать инфекционный процесс на поврежденных или интактных участках кожи и слизистых оболочек. В качестве антисептиков используются различные химические соединения, оказывающие антимикробное действие: 70% этиловый спирт, 5% спиртовой раствор йода, 0,5—2% раствор хлорамина, 0,1% раствор КМпО4, 0,5—1 % раствор формалина, 1—2% спиртовые растворы метиленового синего или бриллиантового зеленого, различные детергенты.

Антимикробные вещества добавляют также к различным материалам используемым для изготовления перевязочных средств, лейкопластырей, для пломбирования зубов, изготовления зубных протезов и т. п. с целью придания им бактерицидных свойств.

Дезинфекция— обеззараживание объектов окружающей среды: уничтожение патогенных для человека и животных микроорганизмов с помощью химических веществ, обладающих антимикробным свойством. К наиболее распространенным дезинфицирующим веществам относятся хлорная известь (0,1—10% раствор), хлорамин (0,5—5% раствор), фенол или карболовая кислота (3—5 % раствор), лизол (3—5% раствор), двутреть основная соль гипохлората кальция—ДТСГК (0,1—16% раствор). Выбор дезинфицирующего вещества и его концентраций зависит от материала, подлежащего дезинфекции.

Некоторые вещества (борная кислота, мертиолат, глицерин, фенол) применяют как консерванты для приготовления лечебных и диагностических сывороток, вакцин и других препаратов.

Тема 6. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ СТЕРИЛИЗАЦИИ И ДЕЙСТВИЯ АНТИСЕПТИЧЕСКИХ И ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ

Проп)амма занятия

Антамикробное действие физических и химических факторов.

Методы стерилизации.

Аппаратура, используемая для стерилизации.

4 Методы определения эффективности стерилизации, действия антисептических и дезинфицирующих веществ.

Стерилизация — обеспложивание, т. е. полное уничтожение вегетативных форм микроорганизмов и их спор в различных материалах. Стерилизацию проводят физическими методами: 1) воздействием высокой температуры: 2) путем ультрафиолетового облучения; 3) механическим путем — фильтрацией жидкостей через бактериальные фильтры, а также химическими методами.

Физические методы стерилизации» 1. Прокаливание в пламени спиртовки или газовой горелки. Данный способ применяется ограниченно, например для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл, пинцетов.

Стерилизация кипячением. Этим методом стерилизуют шприцы, мелкий хирургический инструментарий, предметные и покровные стекла и некоторые другие предметы. Их помещают в стерилизаторы, в которые наливают воду. Для устранения жесткости и повышения температуры кипения к воде добавляют 1—2% раствора бикарбоната натрия. Кипячение производят не менее чем 30 мин. Однако данный метод не обеспечивает полной стерилизации, так как некоторые вирусы (например, вирус гепатита) и споры бактерий могут остаться жизнеспособными.

_ Стерилизация сухим жаром, или с ухо в оз- \душная стерилизация в сушильном шкафу (печи Пастера). Метод основан на бактерицидном действии нагретого до 165—180℃ воздуха. При более высокой температуре происходит обугливание ватных пробок, бумаги, в которую завернута посуда, а при более низкой температуре требуется больший срок стерилизации. Сухим жаром стерилизуют стек- лянную посуду: чашки Петри, пробирки, пипетки и др.

Стерилизация паром под давлением в автоклаве (см. рис. 2).

Один из наиболее эффективных методов стерилизации, который широко применяется не только в микробиологической практике, но и в клинической медицине. Работа с автоклавом требует точного выполнения специальной инструкции и соблюдения правил безопасности. Многие питательные среды, перевязочный материал, белье стерилизуют при давлении 1 атм в течение 15—20 мин, питательные среды с углеводами— при 0,5 атм в течение 15 мин, а обеззараживание инфицированного материала производят при 1J—2 атм в течение 20—25 мин (табл. 3).

Максимальную температуру пара измеряет максимальным термометром, который помещают в автоклав вместе со стери-

Таблица 3. Соотношения между давлеияем, температурой и продолжитель^ иостью стерилизапии в автоклаве

Давление пара, атм

Температура, ℃

Время стерилизации, мин

0

100

ЗОТО (дробно)

0,5

111

20-30

1

121

15-20

1,5

127

15-20

2

133

15

лизуемым материалом. В некоторых случаях используют химические вещества с определенной температурой плавления: бензонафтол (110°), бензойную кислоту (120°С).

Стерилизация текучим паром в аппарате Коха или в автоклаве. Данный виц стерилизации (при незавинченной крышке и открытом выпускном кране) сюнован на антибактериальном действии пара в отношении вегетативных клеток. Он применяется в тех случаях, когда стерилизуемый материал не выдерживает высокой температуры, например питательные среды с витаминами, углеводами. Для полного обеспложивания применяют принцип дробной стерилизации, т. е. стерилизуют материал при 100℃ (или 80—90℃) в течение 20—30 мин 3 дня подряд. При этом вегетативные клетки погибают, а споры сохраняются и за сутки прорастают. Последующее двукратное прогревание обеспечивает достаточно надежную стерильность материала.

Тиндализация. Дробная стерилизация материалов при 58—56℃ в течение часа 5-6 дней подряд. Применяется для стерилизации легко разрушающихся при высокой температуре веществ (сыворотка крови, витамины и др.).

Пастеризация. Данный метод основан на антибакте- риальном действии температуры в отношении вегетативных клеток, но не бактериальных спор. Нагревание материала производится при температуре 50-65℃ в течение 15—30 мин или 70—80°С в течение 5—10 мин с последующим быстрым охлаждением. Обычно пастеризуют напитки и пищевые продукты (вино, пиво, соки, молоко и др.).

Стерилизация ультрафиолетовыми лучами. Метод основан на бактерицидном действии УФ-лучей с длиной волны 260—300 мкм. Для стерилизации воздуха в боксах, операционных, детских учре^щениях используют бактерицидные лампы разной мощности (БУВ-15, БУВ-30).

Механическая стерилизация (фильтрование). Данный метод основан на механической задержке микроорганизмов и их спор мелкопористыми фильтрами с определенным диаметром

Н ртутному манометру

Рис. 28. Установка для фильтрования в условиях вакуума.

/-—фильтр Зейтца； 2 — колба Бунзена для сбора фильтрата； 3 — переходная трубка ватным фильтром; 4 5 — вакуумные краны； 6 — ловушка.

пор. В лабораторной практике широко применяется фильтрация материала через асбестовые и мембранные фильтры с разным диаметром пор. Эти фильтры помещают в разъемную часть цилиндрической воронки Зейтца, обе части которой скрепляются барашкообразными болтами. Трубчатый конец воронки через резиновую пробку вставляют в колбу Бунзена. Перед фильтрацией вся смонтированная система с асбестовым фильтром стерилизуется в автоклаве. Мембранные фильтры стерилизуют отдельно кипячением, а потом вставляют в стерильную воронку Зейтца. Фильтрация проводится с помощью вакуум-насоса, к которому присоединяют колбу Бунзена (рис. 28).

Асбестовые фильтры выпускаются диаметром 35 и 140 мм; различают фильтрующую марку (ф) и стерилизующую (сф). Мембранные фильтры представляют собой пластинки толщиной около 0,1-0,5 мм и диаметром 35 мм из нитроклетчатки или ацетилцеллюлозьк В зависимости от размеров пор эти фильтры имеют номера 1—5 (размеры пор соответственно равны 350—1200 нм). Оба типа фильтров рассчитаны на однократное применение. Фильтрование используют для стерилизации жидких материалов, не выдерживающих нагревания (сыворотка крови, антибиотики), для получения бактериальных токсинов, фагов и разных продуктов жизнедеятельности бактерий.

Химические методы ст師илизации. Используют различные химические вещества (см. с. 37), обладающие бактерицидным свойством, но в лабораторной практике применяют ограниченна

Демонстрация

Аппаратура (автоклав, сушильный шкаф, фильтрадФюнная установка) используемая для стерилизации.

Задание для вьшолнения лабораторной работы

Учесть результаты опытов, поставленных с бактериальными тест- объектами для контроля эффективности стерилизации, проведенной путем кипячения и автоклавирования. Сделать заключение.

Определить по готовым посевам антибактериальное действие УФ-лучей на стафилококк и кишечную палочку.

Учесть результаты опытов, поставленных для определения антимикробного действия антисептических и дезинфицирующих веществ. Сделать заключение.

Методические указания

Изучение антибактериального действия высоких температур. В три пробирки с питательным бульоном поместить шелковые нити, смоченные смесью споровой и неспоровой культур. Первую пробирку подвергнуть автоклавированию, вторую —кипячению; третью (контроль) никакому воздействию не подвергать. Посевы выдержать в термостате при 37℃ в течение 24 ч. Отметить результат поставленного опыта н сделать заключение.

Изучение антибактериального действия Уф-лучей. Суспензию стафилококка или Е. coli в изотоническом растворе хлорида натрия в объеме 1 мл поместить на стерильное часовое стекло и облучить лампой БУВ-30 в течение 15 мин на расстоянии 10—20 см от центра лампы. Облученную и не- облученную (контроль) суспензии бактерий засеять в питательный бульон и инкубировать при 37℃ в течение 16—24 ч, после чего отметить результаты: отсутствие помутнения среды связано с гибелью облученной культуры бактерии, в контроле — наличие роста (помутнение).

Определение антимшфобиого действия антисептических и дезинфицирующих веществ. 1. Приготовить два вида тест-объек- тов: а) шелковые нити, смоченные культурой Е. coli; б) шелковые нити, смоченные спорообразующей культурой (с большим содержанием спор). Нити поместить в растворы фенола (5%), лизола (5%), хлорной извести (10%) на 5 и 60 мин, после чего отмыть от исследуемых веществ, засеять в питательный бульон и поместить в термостат до следующего дня. Контрольные тесты не подвергать действию химических веществ. Отметить результат поставленного опыта и сделать заключение.

Диски из фильтровальной бумаги смочить растворами исследуемых веществ и поместить на поверхность питатель-

ного агара в чашке Петри, засеянной (газоном) тест-культу- рой стафилококка или кишечной палочки. Чашки инкубировать в течение суток при 37℃. Об антибактериальном действии исследуемых веществ судят по зонам задержки роста бактерий, образующихся вокруг дисков.

ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

В данном разделе изложены основные методы микробиологического исследования: приготовление питательных сред, техника посевов и пересевов, способы культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях и выделение чистых культур. Изучение физиологии бактерий заключается в исследовании их пищевых потребностей, ферментов, участвующих в пластическом и энергетическом метаболизме, характера роста и размножения на плотных и жидких питательных средах. Наличие общих закономерностей в метаболизме разных микроорганизмов сочетается с существенными различиями в путях и способах превращения веществ и энергии. На этом основаны их дифференцирование и идентификация — важнейшие этапы в микробиологической диагностике инфекционных заболеваний. Наряду с прикладным значением изучение метаболизма у бактерий открыло широкие перспективы для познания биохимических и генетических механизмов, ответственных за наследственную информацию и способы ее реализации, систему регуляции синтеза белка и другие процессы, протекающие в микробной клетке.

Тема 7. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для размножения определенных микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме, иметь оптимальную влажность, вязкость, pH, быть изотоничной и по возможности прозрачной. Каждую среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.

Ряд питательных сред готовят непосредственно в микробиологических лабораториях из продуктов животного или

растительного происхождения (говяжье мясо, молоко, яйца, сыворотка крови, овощи, дрожжи, казеин) или из искусственно полученных из этих продуктов веществ (пептон, аминопептид, дрожжевой и кукурузный экстракты).

Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые играют роль катализаторов метаболических процессов, главным образом витаминрв группы В, никотиновой кислоты и др.

По консистенции питательные среды могут быть плотными, жидкими и полужидкими. Плотные среды готовят путем добавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полу- жвдкие — 03~0,7 % агара, который представляет собой продукт переработки особого вида морских водорослей и в застывшем состоянии придает среде плотность. Агар плавится при температуре 80—86℃ и затвердевает при температуре около 40℃.

В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%). Такие естественные среды, как свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок, сами по себе являются плотными.

В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые изготовляются в промышленных масштабах —• триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин) и питательный агар. Сухие среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.

По целевому назначению питательные среды делят на основные, элективные и дифференциально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты рыбных продуктов или казеина, из которых готовят жидкую среду—питательный бульон и плотную — питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления более сложных: сахарных, кровяных, сывороточных и других комбинированных, удовлетворяющих пищевые потребности более требовательных патогенных бактерий. В качестве основных иногда используют синтетические питательные среды, приготовленные из навесок определенных минеральных солей, к которым добавляют аминокислоты, витамины, глюкозу. К ним также можно добавлять пептон, кукурузный или дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Синтетические среды чаще всего применяют в научно-исследовательской практике, а синтетические среды с упомянутыми

экстрактами —в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.

Элективные питательные среды предназначены для избирательного выделения и накопления микробов определенного вида из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. Создавая элективные для определенных микробов питательные среды, исходят из биологических особенностей, которые отличают данные микробы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококка наблюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, холерного вибриона —в щелочной среде и т. д.

Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для разграничения отдельных видов (или групп) микроорганизмов. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что разные виды бактерии различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. В состав дифференциально-диагностической среды входят следующие основные компоненты: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат (например, лактоза), различное отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроба; в) цветной индикатор (например, индикатор Андреде), изменение цвета которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуе- мого микроорганизма. Д ифференциально-диагнсютические среды широко используются в лабораторных микробиологических диагностических исследованиях для дифференциации и идентификации бактерий.

Программа занятия

Питательные среды и ингредиенты,, используемые для их приготовления

Техника приготовления питательных сред.

Демонстрацвя

Ингредиенты, используемые для приготовления питательных сред.

Питательные срдды： основные^ дифференциально-диагностические, элективные, синтетические.

Приготовление питательной среды из порошка или пасты.

Определение pH питательного бульона.

Методические указания

Приготовление питательных сред. Основные среды. Пасту триптического гидролизата растворяют в определенном объеме

дистиллированной воды, устанавливают pH, разливают в соответствующую посуду, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве. Порошок питательного агара вносят в определенный объем воды и кипятят в течение 10—15 мин, после чего разливают в чашки Петри или пробирки. Для приготовления скошенного питательного агара пробирки с разлитым агаром оставляют застывать в наклонном положении на столе.

Кровяные, сывороточные и асцитические среды. К расплавленному и остуженному до 45—50℃ питательному агару стерильно добавляют 5—10% дефибриниро- ванной крови или в таком же количестве сыворотку крови, или 25% асцитической жидкости, хорошо перемешивают и сразу же разливают в чашки Петри, пробирки или другую лабораторную посуду. Для приготовления жидкой среды такие же количества сыворотки или асцитической жидкости добавляют к питательному бульону.

Среды с углеводами. К питательному агару или бульону добавляют 0,5—1% глюкозы или другого углевода. Стерилизацию производят текучим паром или паром под давлением 0,5 атм.

Элективные питательные среды. Пептонная вода 1%, pH 8,0. Элективна для холерного вибриона, который размножается быстро, опережая рост других микробов. Щелочная реакция среды не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.

Щелочной агар. Плотная среда: питательный агар, pH 7,8, аналогично предыдущей среде, элективен для холерного вибриона.

Среда Леффлера. Смесь 1 ч. лошадиной сыворотки и 3 ч. сахарного бульона, скошенная в пробирках при нагревании в аппарате Коха, элективна для дифтерийных палочек. Быстрый рост этих микробов (4—6 ч) обеспечивает элективность среды.

С реда Мюллера. Элективна для тифо-паратифозных бактерий, которые значительно менее, чем кишечные палочки, чувствительны к тетратионату натрия (это соединение образуется в питательном бульоне, куда добавляют раствор Люголя и серноватистокислый натрий).

Желточно-солевой агар (Ж С А). Содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8—10 %), которые не препятствуют размножению стафилококков, что создает элективность этой среды для данных микробов. Среда дифференцирует стафилококки, продуцирующие лецитовител- лазу, от стафилококков, не выделяющих этот фермент, по

образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний лецитовителлазоположительных микробов (фермент расщепляет лецитиназу куриного желтка, который вносится в расплавленный и остуженный до 45℃ питательный солевой агар).

Дифференциально-диагностические среды. Среды Гис- са. К 1% пептонной воде добавляют 0,5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит и др.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 н. растворе NaOH); разливают по пробиркам, в которые помещают поплавок (трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении углеводов. Стерилизацию проводят текучим паром или паром под давлением 0,5 атм; поплавок при этом заполняется питательной средой. Среда при pH 7,2—7,4 бесцветна. При разложении углеводов приобретают красный цвет.

Промышленность выпускает в виде порошка полужидкие среды с углеводами и индикатором ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты). Индикатор ВР при нейтральной реакции среды бесцветен, в кислой среде он имеет синюю окраску, в щелочной — красную. Образующийся газ разрывает столбик полужидкого агара.

Среда Эндо. Выпускается в виде порошка, который состоит из высушенного питательного агара с 1% лактозы и индикатора — основного фуксина, обесцвеченного сульфитом натрия. Перед употреблением определенную навеску порошка вносят в дистиллированную воду, кипятят, а затем разливают по чашкам Петри. Свежеприготовленная среда бесцветна или имеет бледно-розовую окраску. При росте лактозоположительных бактерий их колонии окрашиваются в темно-красный цвет с металлическим блеском; лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные колонии.

Среда Л евина. Выпускается. в виде порошка и состоит из высушенного питательного агара с лактозой, К2НРО4, метиленовым синим и эозином. Готовится так же, как и среда Эндо. Среда темно-фиолетового цвета. Лактоположитель- ные бактерии образуют колонии насыщенного синего цвета, лактозоотрицательные — бесцветные колонии.

Среда Плоскирева (бактоагар Ж). Выпускается в сухом виде и содержит питательный агар с лактозой, бриллиантовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными солями и индикатором (нейтральный красный). Эта среда является не только дифференциально-диагностической, но и селективной, так как подавляет рост многих микро-

бов (кишечная палочка и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудители брюшного тифа, паратифов, дизентерий). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные —красные.

Среды для культивирования анаэробов. Среда Вильсона — Блера (железосульфитный агар). Приготовляется нз питательного агара, к которому добавляют глюкозу, Na2soз, FeCl2 (хлорид железа). Анаэробные клостридии (Cl. perfringens) образуют на этой среде колонии черного цвета за счет восстановления Na2sОз в Na2s (сульфит натрия), который, соединяясь с хлоридом железа, дает осадок сульфата железа черного цвета.

Среда Китта — Тароцци. Состоит из питательного бульона, 0,5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 10—15 мин для удаления воздуха. С целью изоляции от атмосферного воздуха среду заливают небольшим слоем вазелинового масла.

Тема 8. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ, КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБНЫХ И АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары (син: биотипы). Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Культуры микробов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, кото- рые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирку с твердой или, реже, жидкой питательной средой.

Колония представляет собой изолированное скопление бактерий одного вида, или биовара, выросших на плотной питательной среде в результате размножения одной или нескольких бактериальных клеток. Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей морфологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру • бактерий получают для проведения диагностических исследований, которые заключаются в идентификации, т. е. определении родовой и видовой принадлежности выделенных бактерий. Это достигается путем изучения их морфологических, культуральных, биохимических и других признаков (см. схему 1).

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препара* тов.

Культуральные свойства характеризуют питательные потребности, условия и тип роста бактерий на плотных и жидких шггательных средах. Эти свойства устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются набором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической практике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические признаки бактерий, которые определяют на дифференциально-диагностических средах.

Для идентификации бактерий до рода и вида имеют значение пигменты, окрашивающие колонии и культуры в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens (палочка чудесной крови), золотистый пигмент—Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент—Pseudomonas aeruginosa (палочка синезеленого гноя).

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выполнению соответствующего маркера — определению фермента, антигена, чувствительности к фагам.

Проп)амма занятия

Получение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Методы идентификации бактерий, используемые при определении их, родовой, видовой и типовой принадлежности.

Демовс^ация

Техника посева петлей, пипеткой, иглой, шпателем.

Аппаратура, используемая для культивирования аэробных и анаэробных бактерий.

Характер роста разных бактериальных культур на плотных и жидких питательных средах, различные типы колоний, «пестрые» ряды бактерий с разной ферментативной активностью.

Методы выделения чистых культур анаэробных бактерий.

Задание для вьшолнения лабораторной работы

Выделить чистую культуру аэробных бактерий из исследуемого материала.

Идентифицировать выделенную культуру по морфологическим, тинкто- риальным, культурным и биохимическим свойствам, используя схему 1. Составить протокол по проведенным исследованиям, как показано в табл. 4.

Методические указания

ТЕХНИКА ПОСЕВОВ И ПЕРЕСЕВОВ

«Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля?Жроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри—металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жвдких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой вьшимают из нее ватную пробку над пламенем горелки, набирают петлей посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой, \как описано на с. 23. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петшо с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Въшув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).

При работе с пипеткой прежде всего ее освобождают от бумаги или вьшимают из пенала, быстрым движением проводят над пламенем горелки, вводят в пробирку и остужают об ее внутреннюю сторону. Затем всасывают посевной материал ртом и, соблюдая описанные выше правила, выдувают его в пробирку или другую лабораторную посуду,* Микробную культуру безопаснее всасывать через резиновую трубку или с помощью резиновой груши. Отработанную пипетку опускают в банку с дезинфицирующим раствором. Таким же образом производят посевы пастеровскими пипетками, предварительно обламывая запаянный конец.)

Посевы газоном производят шпателем ца питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. При этом крышку придерживают левой рукой и одаовременно вращают чашку, не отрывая ее от стола. После инкубации посева появляется равномерно сплошной рост бактерий.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ

АЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

Выделение отдельных видов бактерий из исследуемого материала, содержащего, как правило, смесь различных микроорганизмов, является одним из этапов любого бактериологического исследования, проводимого с различными целями: диагностики заболеваний, определения микробной обсеменен- ности окружающей среды и т. д. Для выделения чистой культуры применяют методы, основанные на： 1) механическом разобщении бактериальных клеток； 2) предварительной обработке исследуемого материала с помощью физических или химических факторов, оказывающих избирательное антибактериальное действие； 3) избирательном подавлении размножения сопутствующей микрофлоры физическими или химическими факторами во время инкубации посевов； 4) способности некоторых бактерий быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопробы)., /Для механического разобщения клеток бактерий исследуемый материал петлей или пипеткой наносят на поверхность питательного агара в чашку Петри и равномерно распределяют стерильным шпателем. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) материал растирают по поверхности питательного агара во второй чашке.

11 осев материала также делают бактериальной петлей. Для этого в верхней части чашки густо заштриховывают зигзагообразными движениями петли небольшой участок агаровой среды, освободив таким образом петлю от излишнего материала. Затем наносят параллельные штрихи по остальной части среды. Иногда применяют метод пластинчатых разводок, который заключается в перемешивании различных разведений исследуемого материала с расплавленным и остуженным питательным агаром в колбе или пробирке. После этого его разливают в чашки Петри и инкубируют в термостате. Для уничтожения сопутствующих неспорообразующих микроорганизмов иссле-

дуемый материал прогревают при 80℃ или подвергают крат- ковремешюму кипячению. Споры микроорганизма при этом сохраняются и при посеве прогретого материала на питательную среду прорастают, образуя чистую бактериальную культуру в том случае, если принадлежат только данному виду. Если в исследуемом материале содержатся споры разных видов бактерий, то данный метод для получения чистой культуры непригоден.

Подавление размножения посторонней микрофлоры при посеве исследуемого материала на питательные среды достигается воздействием на них каких-либо факторов, не препятствующих размножению основного микроба: неодинаковой оптимальной температуры для роста разных бактерий, антибиотиков или других химических веществ, а также фагов. В первом случае посевы инкубируют при температуре, задерживающей рост сопутствующей микрофлоры. Так, например, для выделения чистой культуры бактерий чумы посевы инкубируют при температуре около 5℃. Во втором случае в питательную среду вносят соответствующее вещество или фаг в строго определенной концентрации, препятствующей размножению сопутствующих бактерий, но не оказывающей выраженного ингибирующе го действия на исследуемый микроб.

Кроме упомянутых методов, в бактериологической практике、 иногда применяются и другие, например для выделения чистой культуры бактерий протея (Proteus vulgaris) используют его способность к «ползучему» росту.

Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2—3 сут. Для выращивания микобактерий туберкулеза этот срок удлиняется до 4—6 нед.

Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.

Первый этап； Из исследуемого материала готовят мазок.

окрашивают по Граму или другим методом и микроскопируют. Для посева исследуемый материал в случае необходаости разводят в пробирке со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Одну каплю приготовленного разведения наносят петлей на поверхность питательного агара в чашку

Петри и тщательно втирают шпателем в среду, равномерно распределяя материал по всей ее поверхности. После посева чашку переворачивают дном кверху, подписывают и помещают в термостат при 37℃ на 18—24 ч.

Втор ой этап. Просматривают чашки и изучают изолированные колонии, обращая внимание на их форму, величину, консистенцию и другие признаки. Для определения морфологии клеток и их тинкториальных свойств из части исследуемой

колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопи- руют. Для выделения и накопления чистЪй культуры одну изолированную колонию или несколько различных изолированных колоний пересевают в отдельные пробирки со скошенным агаром или какой-либо другой питательной средой.'Для этого часть колонии снимают петлей, не задевая соседние колонии.

Третий этап. Отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазк^ приготовленного из такой культуры, в нем обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного полиморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры наряду^ с типичными встречаются и другие формы клеток.

ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ

Посевы на анаэробную микрофлору, как спорообразующую (клостридии), так и особенно неспорообразующую (вейлонеллы, бактероиды, пептококки), производят в строго анаэробных условиях. Первоначальные посевы делают на обогатительные среды типа Китта—Тароцци, затем пересевают на плотные сре/й»1： сахарный кровяной агар в чашки Петри, в пробирки с сахарным питательным агаром или другими средами для получения изолированных колоний. После инкубации посевов в анаэробных условиях из образовавшихся колоний бактерий готовят мазки, окрашивают, микроскопируют, а затем пересевают на среду Китта—ТароЦци и агаровые среды для выделения чистой культуры.

При выделении спорообразуюпдих анаэробных бактерий Ослостридии) первоначальные посевь/ прогревают на водяной оане при 80℃ в течение 20 мин для уничтожения вегетативных клеток посторонней микрофлоры, которая может присутствовать в исследуемом материале (схема 1).

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ

Идентификацию выделенных бактериальных культур проводят путем изучения морфологии бактерий, их культуральных, биохимических и других признаков, которые присущи каждому виду.

Культуральные признаки. К ним относятся морфологические особенности колоний бактерий, характер роста на плотных и в жидких питательных средах.

80。hhhe关dguoj зоякоазиос Hdu Бой зшьАи SS^OH^ 01Н0Ы0Х 行 3d:OHKOdo5sxa9 8 — HHd¥9 ◎工 H9odeo^^os:sI龍cslo: 11 I骋."§0謎 0Hd蘇9 XS0R0E .sebi «oais^ofes «iaao^^ Ksao^os^ Ks ooo« 0^ 2SErt«oafea iko«§E нонноурниоийуй 11』二 w 三a

«ни«ойо x2E.aoe.xas» s x3HHg』slHB gsHghAW

nOXBHEMdu XHX『h ,SSH出0S9 BHHghAes rttibd《OJOd-lau》 35ao bh aggdgu

-qdAIqlMX HHOOHtlodoHEI。им ■deaodu kith SS^SH 6S MWHJAdF s ^ssu OB sorts© ^ой^

14dAi qiMx rtHooa EXHLOMdOiyBdBX

UBh-e «'^

MnodM -юоайило И00ОС s s«Hrfy«Kbo*s« 8s хгшхоам关 gHlmdxQB

X3H10HS% XSH taoH&ooae- gMH°关 EdBm

3BJ£X HOIOSH KMH°IHIOXEH «& 35aog-Mdv s§ dB』B*sqH .XSBSe S2ffiseao«o «и «ООО c

.ssb -хи н

илои^ xlqHqudoN «0^05- SSUORO^&S

«SEO^S ^ё S05H0S

иии Awad』OU В工JEdMO

ss工 dEl «O8EW

SSEOe-ow xlqHHBmodHlTOSH EXHIQHdo^BdEX

них ^.^

X5au oixxahHL。 loau§?oa^5sa ・Hgd昌ензн 80OK

X5ao mAh

•BSH曽 e eh И00ОС

工ОЗЕ S3K тойале •xsbrtHSE 0 s&oc ioaE XiqH8HLBH SE.S s«3rf^ EH moooc 80缄sew KHUOXOOaMHn

IfBUBs«sso^5e.uos

戛寻，9 ЗИ» 唱gh sa««Bf Ш05 я »яя«51 ・二 w

Колонии различаются по величине, форме, цвету, консистенции, контуру края, структуре и характеру поверхности (рис. 29). По величине колонии могут быть крупные (диаметр более 4—5 мм), средние (2-4 мм) и малые (1—2 мм), по форме — круглые, розеткообразные, в форме листа и т. д. Цвет колонии зависит от выработки определенного пигмента—белого, желтого, красного и др. Колонии беспигментных бактерий бесцветны. По консистенции различаются сухие, влажные, сочные или слизистые колонии. Поверхность колонии ^бывает гладкой, морщинистой, исчерченной, плоской, плосковыпуклой, вдавленной. Край колонии может быть ровным, волнистым, бахромчатым! Колонии могут иметь аморфную, зернистую, волокнистую внутреннюю структуру.

Характер роста бактерий в чистой культуре, выращенной на скошенном питательном агаре, может быть сухим, влажным, ползучим, складчатым, пигментированным. В жидкой питательной среде одни бактериальные культуры дают диффузное помутнение, другие характеризуются придонным, пристеночным ростом; некоторые культуры образуют пленки на поверхности среды, другие —осадок на дне пробирки.

Биохимические признаки. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы (сахаролитические свойства) используют короткий и длинный «пестрый» ряд. К первому относятся жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами： глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с шестиатомным спиртом — маннитом. В длинный «пестрый» ряд наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахаридами (инулин, крахмал, гликоген и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). В качестве индикатора ко всем средам добавляют реактив Андреде или ВР.

Чистую культуру исследуемого микроба засевают петлей в среды «пестрого» ряда. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 18—24 ч или более длительно. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды： при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используются среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют «пестрым» рядом (рис. 30).

Для определения протеолитических ферментов производят посев культуры бактерий уколом в столбик 10—20% желатина, пептонную воду. Посевы в желатине инкубируют при 20—22°С в течение нескольких дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин, причем в этом месте образуется фигура, напоминающая воронку или елочку.

В посевах в пептонную воду определяют продукты расщепления пептона после инкубирования в течение 2T сут при 37℃ — ставят реакции на аммиак, индол, сероводород и др.

Реакция на аммиак. Узкую полоску лакмусовой бумаги укрепляют под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. Посинение бумаги свидетельствует

о наличии аммиака.

Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий прибавляют 2T мл эфира, содержимое энергично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламвдобензаль- дегвда с хлористоводородной кислотой). В присутствии индола наблюдается розовое окрашивание； при осторожном наслаивании

образуется разовое кольцо (см. рис. 35).

Реакция на сероводород. Делают посев культуры бактерий уколом в столбик с питательной средой, содержащей реактивы для выявления Н2s (смесь солей： сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). При наличии Н2s происходит почернение агара (см. рис. 35).

Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят каплю 1—3% раствора перекиси водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает перекись водорода на Н2О и О2. Выделение пузырьков кислорода свидетельствует о наличии у данного вида бактерий

фермента каталазы.

Результаты работ по идентификации выделенной культуры протоколируют (табл. 4).

В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если это является достаточным для их идентификации. В необходимых случаях проводят изучение других признаков, например восстановление нитратов, декарбоксилирование аминокислот, образование оксидазы, плазмоко- агулазы, фибринолизина и других ферментов, а также определение антигенной структуры, чувствительности к фагам, вирулентности и т. д.

Тема 9・ МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РИККЕТСИЙ

И ХЛАМЦДИЙ. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ

Риккетсии и хламидии — облигатные внутриклеточные бак< терии, которые не растут на искусственных питательных средах. Вирусы также являются облигатными внутриклеточными микроорганизмами, но они принципиально отличаются от всех внеклеточных и внутриклеточных бактерий： отсутствием клеточной организации, ферментов строительного и энергетического метаболизма, наличием одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), неспособностью к бинарному делению. Для культивирования риккетсий, хламидий и вирусов используют клеточные культуры, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных.

Программа запятая

Культивирование риккетсий, хламидий н вирусов в клеточных культурах, куриных эмбрионах и в организме лабораторных животных.

Методы выявления (индикации) вирусов в культуре клеток и в курином эмбрионе.

Клеточные культуры. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Переви- виваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов： измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с дабавлением телячьей сыворотки крови.

Клетки эпителиалБной и соединительной тканей растут в суспензии； при оседании они довольно прочно прикрепляются

к стенке пробирки или флакона, по которой распространяются в виде*пласта, состоящего из одного слоя клеток (монослоя).

Перевиваемые однослойные клеточные культуры приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально вьщеленные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

Все работы с культурами клеток требуют строжайшего соблюдения правил асептики во избежание заноса в них различных микроорганизмов из окружающей среды.

‘После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток, которая начинает расти и развиваться, ее заражают материалом, содержащим риккетсии, хламидии или вирусы. Упомянутые микроорганизмы проникают внутрь клеток, где и размножаются：

В клетках, пораженных риккетсиями, на 3—8-й день отмечается большое количество коккобациллярных форм, заполняющих целиком цитоплазму или ядро клеток, которые затем гибнут.

*：' Хламидии также рассматривают в окрашенных по Рома- .новскому—Гимзе препаратах клеток“в которых наблюдают различные формы размножающихся микроорганизмов.

<О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток. При этом часть из них погибает и отслаивается от стенки пробирки^Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие клетки, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплошного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточные островки.

Характер ЦПД, вызванный разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних (парамиксовирусы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других 、(энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) — агрегация клеток (рис. 31, о, б) и т.д. ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая клеточную

Рис. 31. Культура клеток.

а — неизмененные клетки; 6 — цитопатические изменения в клетках (ЦПД).

культуру под микроскопом в разные сроки после ее заражения вируссодержащим материалом) Некоторые вирусы (энтеровирусы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие — в более поздние сроки (на 4-6-й день). Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентиройочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции (рис. 32).. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Другой метод — реакция гемагглютинации. Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости клеточной культуры либо хорион-аллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Гемагглютинацию — скучивание эритроцитов кур, гусей, морских свинок — вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин?

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50% зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз (ЦпдБ0).

Рнс. 32. Адсорбция эритроцитов на поверхности клеток, зараженных вирусом (гемадсорбция).Рнс. 32. Адсорбция эритроцитов на поверхности клеток, зараженных вирусом (гемадсорбция).Рнс. 33. Колонии (бляшки) вирусов в клеточной культуре.а — бляшки вируса ньюкаслской болезни; 6 — бляшки вируса Коксаки.Рнс. 33. Колонии (бляшки) вирусов в клеточной культуре.а — бляшки вируса ньюкаслской болезни; 6 — бляшки вируса Коксаки.Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек (рис. 33). Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тонким слоем агара. После инкубирования посевов в течение нескольких суток на агаровом покрытии появляются просветленные участки определенной формы (бляшки), представляющие собой участки погибших клеток в сплошном монослое клеточной культуры. Каждая бляшка образуется при размножении одной вирусной частицы и хорошо заметна в виде круглого светлого участка на красном фоне клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным. Титр вируса, установленный этим методом, выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. Размеры, морфология и сроки появ-

Рнс. 32. Адсорбция эритроцитов на поверхности клеток, зараженных вирусом (гемадсорбция).

Рнс. 32. Адсорбция эритроцитов на поверхности клеток, зараженных вирусом (гемадсорбция).

Рнс. 33. Колонии (бляшки) вирусов в клеточной культуре.

а — бляшки вируса ньюкаслской болезни; 6 — бляшки вируса Коксаки.

Рнс. 33. Колонии (бляшки) вирусов в клеточной культуре.

а — бляшки вируса ньюкаслской болезни; 6 — бляшки вируса Коксаки.

пения бляшек отличаются не только у разных видов вирусов, но и у отдельных штаммов одного и того же вида. Перечисленные признаки используются для селекции штаммов и получения так называемых чистых линий вирусов.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Включения имеют различную форму и размеры от 0?5 до 25 мкм. Они представляют собой места скопления вирусных частиц или реакцию клетки на присутствие в ней вируса и могут быть выявлены в препаратах, приготовленных из зараженной ткани и окрашенных по Романовскому-Гимзе или флюорохромами. В последнем случае используют люминесцентную микрсюкопию.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с клеточными культурами и подопытными животными значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют куриные эмбрионы 卫 возрасте от 8 до 12 дней. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, которые обнаруживают после вскрытия эмбриона на его оболочках. О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроба без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.

Лабораторные животные. На практике чаще всего используют беспородных лабораторных животных. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу н、их возраст определяют репродуктивную способность вирус。％ Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).

Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или курином эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходи-

мость последующего заражения клеточной культуры для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.

Применяют подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, субдуральный и другие методы заражения лабораторных животных.

Демонстрация

Этапы приготовления однослойной клеточной культуры.

Цитопатические изменения клеток, вьаванные репродукцией в них вируса.

Техника заражения вирусами и вскрытие куриного эмбриона.

Задание для ныполяения лабораторной работы

Определить репродукцию вируса в клеточной культуре и курином эмбрионе： а) по ЦПД^ б) с помощью реакции гемагглютинации с куриными эритроцитами.

Методическне указания

Изучение ЦПД вирусов. Для исследования клеток пробирку помещают на предметный столик микроскопа так, чтобы монослой находился сверху. Местоположение монослоя клеток в пробирке определяют по черте, предварительно проведенной карандашом на противоположной стороне. Морфологические изменения клеток выявляют при микроскопическом исследовании пробирки с культурой с помощью объектива 8 при опущенном конденсоре и прикрытой диафрагме. При сравнении клеточного монослоя, инфицированного вирусом, с незараженными клетками в контрольной пробирке отмечают полное или островковое разрушение пласта клеток или другие изменения, которые характеризуют ЦПД вируса.

Заражение куриных эмбрионов. Исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, хорион-аллантоис- ную оболочку или желточный мешок куриного эмбриона (рис. 34). Перед заражением скорлупу яйца над воздушной камерой обрабатывают 70% спиртом, обжигают на пламени, смазывают 2% йодной настойкой, вторично протирают спиртом и обжигают.

Для заражения в аллантоисную полость в скорлупе над воздушной камерой (границы ее заранее обводят карандашом при просвечивании яйца) проделывают небольшое отверстие с помощью ножниц, скальпеля или специального буравчика. Шприцем вводят 0,1—0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2—3 мм ниже границы воздушной камеры. Отверстие в скорлупе заливают расплавленным парафином.

Рис. 34. Способы заражения куриного эмбриона.

7 — в амнион； 2 — в аллантоисную полость； 3 — в желточный мешок.

Вскрытие зараженных эмбрионов производят в сроки максимального накопления вируса (через 48—72 ч инкубации при 37℃). После обработки спиртом и 2% йодной настойкой скорлупу рассекают ножницами немного выше очерченной карандашом границы воздушной камеры, наклоняя яйцо так, чтобы избежать попадания скорлупы в полость (рис. 35). Скорлупу отбрасывают, осторожно снимают ее оболочку и рассматривают хорион-аллантоисную оболочку вокруг места заражения, отмечая наличие или отсутствие очагов поражения —геморрагий, белесоватых очагов (рис. 36). Затем пастеровской пипеткой прокалывают хорион-аллантоисную оболочку в участке, свободном от сосудов, и отсасывают аллантоисную жидкость. После этого извлекают хорион-аллан- тоисную оболочку, которую дважды промывают изотоническим раствором хлорида натрия, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений.

Постановка РГА. После вскрытия куриного эмбриона аллантоисную жидкость отсасывают и разливают в пробирки или лунки плексигласовой пластины в объеме 0， мл (для контроля берут 0，мл такой же жидкости незараженного эмбриона). Затем добавляют по 0,2 мл 1% суспензии отмытых куриных эритроцитов и выдерживают при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают через 40 мин после оседания эритроцитов: I I I 卜 выраженная гемагглютинация — тонкая

Рис. 35. Вскрытие куриного эмбриона.

пленка из склеившихся эритроцитов на дне пробирки, имеющая вид зонтика; “Н 1・ наличие просветов в пленке; -Н- наличие пленки с фестончатыми краями из склеившихся эритроцитов; + хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов; — резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля. Наличие гемагглютинации в опытных пробирках при ее отсутствии в контрольных указывает на содержание вируса в исследуемой жидкости.

Тема 10. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ВИРУСЫ (ФАГИ)

Вирусы бактерий (фаги), или бактериофаги, широко распространены в окружающей среде — водоемах, почве. Фаги кишечных бактерий — кишечной палочки, шигелл, сальмонелл — могут быть выделены из сточных вод и испражнений. Стафилофаги обнаруживаются в слизи из носоглотки, на коже и в раневом отделяемом, фаги клостридий анаэробной раневой инфекции — в раневом отделяемом, почве. Наличие фага в среде указывает на присутствие чувствительных к нему бактерий.

Существуют вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают инфекцию, заканчивающуюся лизисом бактериальных клеток и синтезом новых фаговых частиц. Умеренные фаги не лизируют зараженные ими клетки.

63

Рнс. 36. Поражение на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона, зараженного вирусом оспы.

ДНК этих фагов включается в хромосому бактерий и передается при их делении неограниченному числу потомков. Такой тип взаимодействия фага с клеткой называется лизогенией, а бактерии, несущие в *своей хромосоме фаговую ДНК (профаг), являются лизогенными. Они широко распространены в природе.

Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной бактериальной культуры сопровождается. их лизисом и просветлением среды. На газоне чувствительных бактерий, выращенных на агдровой среде в чашке Петри, фаги обра< зуют зоны очагового или сплошного лизиса, что зависит от их концентрации. Зоны очагового лизиса получили название негативных колоний фага, или стерильных пятен — бляшек (рис. 37, а, б). Они имеют морфологию, характерную для определенных фагов, и образуются из одной фаговой частицы при внедрении ее и последующей репродукции в бактериальных клетках.

Для получения «чистой линии» фага (свободной от примеси других фагов) проводят последовательные пассажи морфологически однотипных негативных колоний на газоне одного и того же бактерияльного штамма.

Большинство фагов характеризуется видоспецифичностью в отношении бактерий. Однако существуют фаги, которые могут поражать только отдельные варианты одного и того же вида бактерий. Их используют для определения фаготи- пов (фаговаров) внутри данного вида. Вместе с тем имеются фаги, лизирующие несколько родственных видов бактерий.

В практической работе фаги применяют для: 1) фаготипи- рования бактерий, т. е. определения фаготипа по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типоспецифи-

ческими фагами, что важно для маркировки исследуемых культур при эпидемиологическом анализе заболеваний; 2) фа- годифференцировки бактериальных культур с целью установления их видовой принадлежности; 3) фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих микробов^ 4) фагопрофилактики —предупреждения некоторых заболеваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся в эпидемическом очаге; 5) фаготерапии — лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызванных, например» шигеллами, протеем, стафилококком, палочкой синезеленого гноя.

Программа занятия

Методы выделения фага из объектов окружающей среды.

Методы индикации фага.

Методы титрования фага по Грациа,

Демонстрация

Методы выделения фага из объектов окружающей среды.

Методика обнаружения лизогенных бактерий.

Задание для вьшолнення лабораторной работы

По результатам поставленных опытов： а) рассчитать титр фага по методу Грациа； б) определить спектр литического действия поливалентного фага； в) определить фаготип стафилококковых культур, выделенных при пищевом отравлении.

М етодические указания

Выделение фага из объектов окружающей среды. Для получения вирулентного фага готовят фильтрат исходного материала (вода, суспензия фекалий и др.), пропуская его через бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37℃ в течение 18—24 ч. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага в фильтрате определяют качественными и количественными методами.

Качественный метод определения фагов Е・ coli. Чашку Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37℃ в течение 10—15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После - суточной инкубации в термостате

Рис. 37. Негативные колонии (стерильные пятна) бактериофагов, а — пятна фага Тг; 6 — пятна фага Ti.

просматривают чашку, отмечая наличие зоны лизиса на месте стекания капли фага.

Количественный метод — определение титра фага по Грациа. Для постановки опыта предварительно: а) разливают питательный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате; б) приготовленный полужидкий (0,7 %) питательный агар, разлитый по ЗТ мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого фага (10一2_10一7, но может быть и дальше, в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведения фага (Ю-7) смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к фагу бактерий и выливают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45℃. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. Так же готовят смесь из следующего разведения фага (10 6) с бактериями и полужидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем — из разведения 10-5. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37℃.

Незараженные фагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется и освобождает потомство фага, состоящее из сотен новых фаговых частиц. Они внедряются в интактные клетки, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна, или негативные колонии фага. Число этих пятен соответствует

количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характеризующая концентрацию фага, называется его титром (табл. 5).

Определение спектра литического действия фага. Чашку с питательным агаром делят на квадраты по числу испытуемых бактериальных культур. На каждый квадрат петлей наносят каплю соответствующей бульонной культуры и распределяют ее по агару в пределах данного квадрата. Затем на каждый засеянный квадрат петлей или пастеровской пипеткой наносят по одной капле испытуемого фага. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая те квадраты,屮е имеется сплошной лизис бактерий или так называемые стерильные пятна на бактериальном газоне. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его литического действия.

Таблица 5. Результаты титрования фага по методу Грациа (форма протокола)

№ исследуемой пробы

Число «стерильных» пятен фага, полученных при посевах проб в взведениях

Число фаговых частиц в 1 мл

10"5

10-в

1()т

1

370

42

3

7,3 • Ю7

2

463

50

6

1,0.108

3

37

4

0

7,7 • 10е

Фаготипирование бактерий. Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, слегка подсушивают в термостате, затем делят на、квадраты, на которые пастеровской пипеткой наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации просматривают чашку, отмечая те квадраты, в которых имеется лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис (рис. 38).

Определение лизогении. Исследуемую бульонную культуру центрифугируют с целью отделения фага от бактерий. В том случае, если бактерии спонтанно продуцируют фаг, он будет содержаться в надосадочной жидкости. Для выявления фага надосадочную жидкость засевают на газон индикаторной (чувствительной) бактериальной культуры, на котором через сутки инкубации при 37℃ образуются очаги лизиса — «стерильные» пятна.

Рис. 38. Схема постановки опыта фаготипирования культуры стафилококка. Цифрами обозначены типовые стафилококковые фаги.

При отрицательном результате опыта исследуемую бактериальную культуру предварительно подвергают УФ-облучению с целью индукции содержащегося в ней профага. Затем поступают так же, как и в предыдущем опыте.

Тема 11. ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ

Генетические механизмы изменчивости бактерий обусловлены модификациями, мутациями, рекомбинациями, а также приобретением различных плазмид. При этом изменяется один или несколько признаков одновременно в зависимости от числа мутировавших (при мутациях) или приобретенных (при рекомбинациях) генов. Так, например, при S—R мутации, как правило, изменяются морфология колонии, антигенные и вирулентные свойства бактерий.

Плазмиды контролируют разнообразные признаки у бактерий: образование бактериоцинов — колицинов (Col-плазмиды), резистентность к антибиотикам (R-плазмиды) и др. Бактерио- цины продуцируют различные бактерии, например кишечная палочка, шигеллы, сальмонеллы. Колицины, образуемые разными сероварами Е. coli, могут отличаться друг от друга по спектру чувствительных к ним бактерий. Метод определения спектра чувствительных к определенному колицину бактерий называется колицинотипированием, а метод определения типа самой С ol-плазмиды (Col A, Col В и др.) — колициногенотипированием. Данные методы позволяют маркировать бактерии одного и того же ввда или биовара, что имеет эпидемиологическое значение для установления источника инфекции.

R-плазмиды контролируют образование ферментов, разрушающих или модифицирующих разные антибиотики, например Р-лактамаз, разрушающих пенициллины. R-плазмиды благодаря своей трансмиссивности передаются от одних бактерий другим, способствуя тем самым формированию антибиотикорезистентных популяций бактерий.

Про1рамма занятия

Модификации у бактерий н методика их обнаружения.

Мутации у бактерий и методика их выделения.

Изучение генетических рекомбинаций у бактерий в опытах трансформации, трансдукции и конъюгации.

Методы изучения бактериоциногении (определение колицинотипа и колициногенотипа Е. coli).

Демонстрация

S- и R-формы колоний Е. coli и других бактерий.

Различные методы, используемые при изучении генетики бактерий.

Задание для вьшолнения лабораторной работы

Установить модификационную или мутационную природу утраты подвижности бактериями Proteus vulgaris.

Доказать мутационную природу возникновения устойчивости к стрептомицину по результатам опыта Лурия и Дельбрюка.

Определить частоту образования трансформантов (рекомбинантов) по данным опыта трансформации признака Str『 (стрептомицинорезистентности) У Вас. subtilis.

Определить частоту образования трансдуктантов Е. coli по данным опыта специфической трансдукции фагом 入 dgal.

Определить частоту образования рекомбинантов 1еи+ по данным опыта конъюгации между Hfr-клетками Е. coli и F~-клетками Е. coli.

Определить частоту образования рекомбинантов (трансконъюгантов) при передаче R«плазмиды, контролирующей множественную резистентность к антибиотикам, от одного штамма Е. coli другому.

По результатам поставленных опытов определить наличие Col-плазмид У разных штаммов Е. coli и их колициногенотип.

М етодичес кие указания

Постановка опыта по вы^сненшо механизма действия фенола на подвижность культуры бактерий Proteus vulgaris. Суточную культуру засевают в две пробирки с питательным бульоном, в одну из которых был предварительно внесен раствор фенола в конечной концентрации 1:100. После инкубации при 37℃ в течение 18—20 ч определяют подвижность бактериальных клеток в препаратах «висячая» капля, приготовленных из обеих пробирок. Для решения вопроса о модификационном или мутационном механизме утраты под-

Uoce^Kf-IO3 бактерий/мл

культура, содержащая

сгрегггрмициноистойчибь1е

бактерии

Рис. 39. Схема постановки опыта флюктуации (флюктуационного теста) по Лурия и Дельбрюку. Цифрами обозначено количество стрептомициноустойчивых колоний на агаровой среде в чашках Петри.

вижности культурой протея, обработанной фенолом, ее пересевают в пробирку с бульоном и инкубируют до следующего дня. Затем готовят препарат в «висячей» капле и определяют подвижность. Реверсия (восстановление) утраченного признака свидетельствует о модификационной природе наблюдаемой изменчивости.

Постановка флюктуационного теста Лурия и Дельбрюка для выявления частоты спонтанных мутаций, возникающих в бактериальной популяции без предварительного воздействия какого-либо мутагена. Для определения частоты Strr спонтанных мутантов в культуре Е. coli, чувствительной к стрептомицину, ее засевают одновременно в одну пробирку с 10 мл питательного бульона и в 10 пробирок с 1 мл той же среды так, чтобы в каждой пробирке содержалось примерно 100—1000 клеток. После суточной инкубации посевов из каждой пробы делают высевы на чашки Петри с питательным агаром, содержащим 100 ЕД стрептомицина. Пробы из 1-й пробирки («общей» культуры) в объеме 0,1 мл засевают на 10 чашек, пробы из 10 пробирок («независимых» культур) в объеме 0,1 мл —на отдельные чашки. Таким образом, делают посевы на 20 чашек, которые инкубируют в течение 18—20 я (рис. 39).

На агаровой среде могут вырасти колонии только из тех бактерий, которые резистентны к 100 ЕД стрептомицина.

В том случае, если стрептомицинрезистентные бактерии образовались только в течение суточного контакта с антибиотиком, число колоний на всех чашках должно быть примерно одинаковым. Это свидетельствовало бы об адаптационном механизме устойчивости к стрептомицину. Образование на чашках различного числа колоний, выросших при высеве каждой из 10 «независимых» культур, указывает на предсуществование мутантных Strr клеток в исследуемой популяции бактерий. Данный вывод подтверждается тем, что мутации могут проявляться только в некоторых «независимых» культурах. Значительные колебания (флюктуации) числа мутантных клеток в разных «независимых» культурах обусловлены временем возникновения мутаций. Культура, в которой мутация произошла задолго до высева на чашки, должна содержать большое число Strr клеток и наоборот. При высевах из «общей» культуры такие флюктуации не смогут проявиться, поскольку мутанты независимо от момента их возникновения будут равномерно распределены по всей популяции бульонной культуры.

Постановка опыта трансформации (рис. 40). Реципиент — штамм Вас. subtilis Strs (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину). Донор —ДНК, выделенная из штамма Вас. subtilis Strr (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.

К 1 мл бульонной культуры Вас. subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37℃ в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят 0,1 мг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомициноустойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразведенной смеси (поскольку число трансформированных клеток крайне незначительно) высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры приготовляют ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до Ю~5 —10-6 (для получения сосчитываемого количества колоний), которые в объеме 0,1 мл высевают на питательный агар без стрептомицина, а для контроля — на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину. Посевы инкубируют при 37℃. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению коли-

чества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма, разведенного в 10-5, выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси — 68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножения только одной бактериальной клетки, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170 • 105 жизнеспособных клеток, а в 1 мл —170 • 106, или 1,7 • 108. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинантных клеток, а в I мл — 680, или 6,8 • 102. Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна:

Постановка опыта специфической трансдукции (рис. 41). Реципиент — штамм Е. coli 1ас~, лишенный р-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуци- рующий фаг — фaгXdgal, в геноме которого часть генов замещена Р-галактозидазным опероном Е. coli. Он является дефектным, т. е. неспособен вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг 入 dgal) с названием содержащегося в его геноме бактериального оперона gal. Селективная среда — среда Эндо, на которой лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный цвет с металлическим оттенком.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующегр фага 入 dgal в концентрации 106 —107 частиц в 1 мл. Смесь инкубируют при 37℃ в течение 60 мин, после чего приготовляют рад десятикратных разведений (в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчитываемого количества колоний. Из пробирки с разведением 10-6 высевают по 0,1 мл на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентыого штамма. Так, например, после посева 0,1 мл смеси в разведении 10-6 на чашке со средой Эндо выросло 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, на первой

и последней чашках — пять и одна колония трансдуктантов красного цвета. Следовательно, частота трансдукции в этом случае будет равна:

业)]°т.6(138+170+ 160) 10 • 10е468'

Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, содержащего ген 1еи9 контролирующего синтез лейцина (рис. 42), Донор — штамм Е. coli К12 Hfr leu+ Strs. Реципиент — штамм Е. coli К12 F- leu" St产.Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая среда [КН2РО4—6,5 Г, MgSO4-0,l г, (NH4)2SO4—1 г, Са (NO3)2—0,001 г, FeSO4^ 0,0005 г, глюкоза — 2 г, стрептомицин —200 ЕД/мл, дистиллированная вода — 1 л].

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10~2 — 10~3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают донорный и реципиентный штаммы, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорного штамма высевают на селективную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма — на полную среду (питательный агар) с антибиотиками для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 37℃. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентаым. Так, например, после посева 0,1 мл смеси донорных и реципиентных культур в разведении 10*"2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципиента из разведения 10-6 — 75 колоний. Таким образом, частота рекомбинации будет равна:

150 10 • 100] § , jq5

Ъ Ю Ю67,5 10е

Постановка опыта конъюгации с целью передачи R-плазми* ды, контролирующей множественную устойчивость к антибиотикам —стрептомицину (Str，тетрациклину (Тсг) и хлорамфени< колу (Сшг). Донор — штамм Е. coli К12 R+ leu~ St「Тсг Стг Реципиент—штамм Е. coli К12 R" leu+ Strr Tcs Cm8 Селективная среда ~ минимальная глюкозосолевая среда, со-

держащая упомянутые антибиотики в концентрации 50 мкг/мл каждый.

В стерильную пробирку вносят по 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора и реципиента. Смесь инкубируют при 37℃ в течение 2 ч и высевают в объеме 0,1 мл на чашку с селективной средой с тремя антибиотиками. На данной среде вырастут только колонии рекомбинантов (трансконъюган- тов), которые приобрели резистентность к данным антибиотикам. Отсутствие роста донорного н реципиента ого штаммов на этой среде объясняется тем, что первый нуждается в лейцине^ а второй чувствителен к антибиотикам. Частоту формирования трансконъюгантов определяют по отношению

к числу клеток рещпн- высеве 0,1 мл культуры 10~4 на глюкозосолевую колоний, а при высевек числу клеток рещпн- высеве 0,1 мл культуры 10~4 на глюкозосолевую колоний, а при высевеколичества клеток трансконъюгантов ентного штамма. Так, например, при реципиентного штамма в разведении среду с лейцином образовалось 20

к числу клеток рещпн- высеве 0,1 мл культуры 10~4 на глюкозосолевую колоний, а при высеве

к числу клеток рещпн- высеве 0,1 мл культуры 10~4 на глюкозосолевую колоний, а при высеве

0,1 мл неразведенной смеси —60 колоний трансконъюгантов. Таким образом, частота формирования трансконъюгантов равна:

60・1020 10 • 10460・1020 10 • 1046- юа , £ в з,о. 10~4

60・10

20 10 • 104

60・10

20 10 • 104

2 • 10е

Определение колициногенных факторов. Исследуемые культуры Е・ coli засевают уколом в питательный агар в чашке Петри (по 7T уколов на одну чашку). Посевы инкубируют при 37℃ в течение суток, после чего на внутреннюю поверхность крышки чашки помещают кусочек ваты, смоченной хлороформом, в парах которого погибают бактерии. Затем по поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного до 45℃ полужидкого (0,7%) питательного агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной индикаторной культуры. В качестве таковой подбирается наиболее чувствительная к данному типу колицина культура E.coli. Через 18—24 ч такубации посевов при 37℃ учитывают результаты опыта. Вокруг посевов исследуемых культур, продуцирующих колицины, появляются прозрачные зоны подавления роста индикаторного штамма.

Определение колицинотипа. В питательный агар в чашке Петри уколом засевают эталонные штаммы бактерий с известным колициногенотипом. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 24 ч, после чего бактерии убивают в парах хлороформа. Затем по поверхности агара равномерно распределяют 3 мл расплавленного и остуженного полужидкого агара, смешанного с 0,1 мл 4-часовой бульонной культуры E.coli неизвестного колициногенотипа (например, Col А,

Col В и др.). Через 18—24 ч отмечают результаты опыта по наличию или отсутствию роста исследуемой культуры вокруг эталонных штаммов. Рост наблюдается лишь в том случае, если обе культуры (исследуемая и индикаторная) имеют один и тот же колициногенотип, т. е. содержат идентичные Col-плазмиды. В противном случае вокруг эталонных штаммов появляются прозрачные зоны подавления роста бактерий.

АНТИБИОТИКИ

Антибиотики занимают ведущее место среди химиотерапевтических средств, используемых для лечения различных бактериальных инфекций. В зависимости от происхождения, химического строения, механизма антибактериального действия и числа чувствительных к ним бактерий (спектр антибактериального действия) антибиотики подразделяют на ряд групп. Наряду с антибиотиками узкого спектра (пенициллины, цефалоспорины) широко применяются антибиотики широкого спектра действия (тетрациклины, левомицетин и др.).

В связи с широким распространением антибиотикорезистентных бактерий выбор препарата для лечения определенного

Таблица 6. Классификация бактерии по степеии их чувствительности к антибиотикам

Антибиотик

Группа бактерий

I

П

in

IV

чувстви* тельные

среднечувствительные

умеренноустойчивые

устойчивые

Бензилпенициллин

0,25

16

128

>128

Метициллин

0,25

—

—

—-

Ампициллин

0,25

16

128

>128

Карбенициллин

亠

16

128

>128

Цефалоспорины

2

16

128

>128

Стрептомицин

4

—

128

>128

Канамицин

4

—

128

>128

Неомицин

4

—

128

>128

Г ентамицин

0,5

4

64

>128

Левомицетин

1

8

—

—

Тетрациклины

1

4

64

>64

Эритромицин

1

4

64

>64

Линкомицин

1

4

64

>64

Примечание. Цифрами обозначены минимальные ингибирующие концентрации антибиотика в мкг/мл или ЕЦ/мл; — группа не установлена.

больного зависит прежде всего от чувствительности к данному антибиотику выделенного возбудителя. В настоящее время бактерии по степени их чувствительности к антибиотикам разделены на четыре группы (табл. 6).

Тема 12. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ

Программа занятия

Рассмотрение (по таблицам и схемам) механизмов антибактериального действия важнейших групп антибиотиков.

Качественные и количественные методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

• 3. Метод определения активности антибиотика в жидкостях организма человека (кровь, моча и др.).

4. Метод определения р-лактамазы.

Демонстрация

Препараты различных антибиотиков,

Стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиками, для определения чувствительности к ним бактерий.

Таблицы и схемы антимикробных спектров важнейших групп антибиотиков и механизмов их антибактериального действия.

Задание для выполнения лабораторной работы

Поставить опыт по определению чувствительности стафилококка к различным антибиотикам методом дисков.

По результатам поставленных опытов определить: а) минимальную ингибирующую концентрацию пенициллина для различных бактериальных культур методом серийных разведений； б) концентрацию пенициллина (ЕД/мл), содержащегося в сыворотке крови больного； в) способность различных штаммов стафилококка продуцировать р-лактамазу, инактивирующую пенициллин.

Методические указания

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар в “ашке Петри, после чего на его поверхность пинцетом помещают на равномерном расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков (рис. 43). Посевы инкубируют при 37℃ до следующего дня. По диаметру зон задержки роста культуры стафилококка судят об ее чувствительности к соответствующим антибиотикам. При зоне задержки роста диаметром до 10 мм культура расценивается как малочувствительная, а свыше 10 мм —как высокочувств ительная. В том случае, если диски пропитаны разными концентрациями одного

Таблица 7. Определение чувствительности бактериальной культуры к антибиотику методом серийных разведении

№ пробирки

Разведение антибиотика

Концентрация антибиотика, мгк/мл

Исследуемая культура, мл

Рост бактерий (помутнение среды)

1

1 :100

、0,1

一

2

1 : 200

0,1

—

3

1 :400

0,1

—

4

1 ：800

0,1

—

5

1 : 1600

0,1

+

6

1 :3200

0,1

+

7

1 мл бульона без антибиотика

0,1

+

(контроль)

Примечание. — отсутствие роста исследуемой бактериальной культуры； + наличие роста. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика 12,5 мкг/мл.

и того же антибиотика, можно установить наименьшую дозу препарата, к которой чувствительна исследуемая бактериальная культура.

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. Данным методом определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий. Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (в мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей Ю6 —107 бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37℃ до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий содержащейся в ней минимальной ингибирующей дозой антибиотика (табл. 7).

Определение чувствительности бактерии к антибиотикам методом серийных разведений в питательном агаре. Данный метод определения минимальной ингибирующей концентрации антибиотика более точен, чем предыдущий. Готовят двукратные разведения антибиотика, после чего к 1 ч. каждого разведения добавляют 9 ч. питательного агара, расплавленного и остуженного до 45℃. Смесь хорошо перемешивают в пробирке н выливают в чашку Петри. Приготовленные таким образом

чашки, каждая из которых содержит определенную концентрацию антибиотика, делят на 20 секторов так же, как при фаготипировании стафилококка. На агаровую поверхность каждого сектора петлей засевают суточную бульонную культуру исследуемой бактериальной культуры. Посевы инкубируют при оптимальной температуре до появления роста в контрольной чашке, не содержащей антибиотика, после чего учитывают результаты. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика определяется по видимой задержке роста бактерий по сравнению с контролем на чашке, содержащей наименьшее количество данного препарата.

О1феделение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда пробирок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом—исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пенициллина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм Staph, aureus, а при определении стрептомицина—Е. coli. После инкубирования посевов при 37℃ в течение 18—20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-5актерйями. Концентрация антибиотика определяется умножением наибольшего разведения исследуемой жидкости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, равно 1 ： 1024, а минимальная концентрация эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий,— 0,313 мкг/мл, то произведение 1024 - 0,313 *=• 320 мкг/мл составляет концентрацию антибиотика в 1 мл.

Охфеделение способности Staph, aureus продуцировать 0-лак- тамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульойной культуры стандартного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45℃ питательного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агаров центр чашки на поверхность среды помещают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37℃ до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать р-лактамазу судят по наличию роста стандартного штамма стафилококка вокруг той или другой исследуемой культуры до самого диска.

МИКРООРГАНИЗМЫ окружающей среды

И САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

ИХ ОБНАРУЖЕНИЯ

Микроорганизмы широко распространены в воздухе, воде, почве и окружающих предметах, а также находятся в организме человека и животных. Патогенные микробы, обитающие в организме больных и бактерионосителей, попадают в окружающую среду и циркулируют в ней в течение определённого времени. Заражение окружающей среды делает ее фактором передачи инфекций, хотя она и не является средой обитания для патогенных микроорганизмов, так как они в ней не размножаются.

В данный раздел включены две темы. Одна из них, посвященная микрофлоре организма человека и методам, позволяющим установить качественные и количественные изменения в ее составе, рассчитана на студентов всех факультетов медицинских институтов. Другая тема посвящена санитарно-бактериологическим исследованиям, которые играют решающую роль в практической работе санитарных врачей и эпидемиологов при санитарно-гигиенической оценке объектов окружающей среды, пищевых продуктов, напитков и состояния персонала пищевых, детских и больничных учреждений, что имеет большое значение в борьбе с инфекционными заболеваниями. Данная тема предназначена главным образом для студентов санитарно- гигиенических факультетов.

Тема 13. МИКРОФЛОРА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

Микрофлора организма человека включает различные микроорганизмы, обитающие на кожных покровах, слизистых оболочках органов： ротовой полости, зева, носоглотки, верхних участков респираторного тракта, кишечник% особенно толстой кишки, и т. д Одни из них являются постоянными (или облигатными) обитателями организма человека, другие — временными (факультативными или транзиторными). Среди последних нередко встречаются патогенные микроорганизмы.

Качественный и количественный состав микрофлоры человека меняется в течение жизни и зависит от пола, возраста, питания и др. Кроме того, колебания в составе микробной флоры тела человека могут быть обусловлены возникновением заболевании и применением химиотерапевтических и иммунологических средств, прежде всего антибиотиков. Оценка качественного и количественного состава микрофлоры организма человека по определенным показателям позволяет установить ее нарушения и связанные с ними последствия — дисбактериоз.

Про1рамма занятия

Качественный метод определения состава микрофлоры организма человека.

Метод изучения количественных изменений в составе микробного биоценоза различных полостей и органов человеческого организма.

Демонстрация

Окрашенные мазки, приготовленные из чистых культур бактерий — представителей облигатной микрофлоры человека.、

Микрофлора фекалий ребенка при естественном и искусственном вскармливании.二

Чашки с ко л ичественным посевом материала, содержащего дрожжеподоб-《

ные грибы рода Candida.)

Задание для вьшолнения лабораторной работы

Определить микрофлору зубного налета, слизистой оболочки зева и ， фекалий на основании данных бактериоскопического исследования.§

Сделать смывы с кожи лица, рук для установления состава имеющихся | там бактерий.|

Определить по готовым посевам количественный состав грибов рода | Candida в кишечнике в динамике заболевания.f

Методические указания

Дл4 качественного изучения состава микрофлоры исполь- -； зуют микроскопический н микробиологический методы исследования. Препараты-мазки готовят из зубного налета, смывов со слизистой оболочки зева, окрашивают их по Граму и микроско- '- пируют (рис. 44). Из зубного налета можно приготовить при- I жизненные препараты в «раздавленной» капле и микроскопи- \ ровать их в темнопольном или фазово-контрастном микроскопе для обнаружения подвижных микроорганизмов.

Для микробиологического исследования делают смывы с кожи лица, рук или других частей тела тампоном, смоченным в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем этим же тампоном делают посев на питательные среды в чашках Петри. Кроме того, отдельный тампон помещают в пробирку с глюкозопептонной средой для обнаружения бактерий группы кишеч- , ных палочек (состав среды см. с. 83). Ориентировочно идентификацию микроорганизмов проводят по характеру выросших колоний, газообразованию на глюкозопептонной среде и морфологии клеток в мазках, окрашенных по Г раму.

Для количественных посевов берут определенный объем исследуемого материала (например, смывы из зева) или опре- « деленную навеску (например, фекалий), разводят в изотоническом растворе хлорида натрия (в зависимости от предполагаемой концентрации) и делают посевы соответствующих

разведений на питательные среды： для выявления гемолитических стрептококков или стафилококка — на кровяной агар, для выделения Е. coli — на среду Эндо, для выделения грибов рода Candida — на среду Сабуро. Посевы производят таким образом, чтобы получить сосчитываемое количество колоний. Такие исследования повторяют через определенные сроки, чтобы сделать заключение о количественных изменениях в составе микрофлоры (особенно важно —в динамике заболевания).

Тема 14. САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Про1рамма занятия

Методы изучения микрофлоры окружающей среды.

Методы сан итарно -бактер ио л о г и чейко й оценки воды, воздуха и почвы.

Мембранный метод определения копи-индекса воды.

Определение микробного числа воздуха при помощи прибора Кротова н методом седиментации.

Методы определения перфрингенс-титра и коли-титра почвы.

Рост гемолитического стрептококка на кровяном агаре.

Рост Staph, aureus на желточно-солевом агаре.

Рост протея в посеве по Шукевичу.

Задание для вьшолнения лабораторном работы

Провести оценку санитарно-бактериолог и ческого состояния воздуха, воды, почвы по результатам следующих опытов： а) определение микробного числа воздуха； б) определение микробного числа водопроводной воды н открытых водоемов； в) определение бродильного титра и коли-индекса воды； г) определение микробного числа, коли-титра н перфрингенс-титра почвы.

Определить присутствие Е. coli на коже рук н предметов обихода методом смывов.

Провести санитарно-бактериологическую оценку молока, лимонада, мяса и мясных консервов.

Методические указания

Для оценки санитарно-гигиенического состояния различных объектов окружающей среды, воды, пищевых продуктов и напитков проводятся санитарно-бактериологические исследования, целевое назначение которых состоит в определении эпидемической безопасности указанных объектов. Выявление в них

патогенных микроорганизмов служит показателем эпидемической опасности, но прямое обнаружение их сопряжено с рядом трудностей, связанных прежде всего с низкой концентрацией данных микроорганизмов, которые, как правило, не могут размножаться в воздухе, воде и * почве^ Поэтому в санитарномикробиологической практике применяют косвенные методы, основанные на определении микробной обсемененности того или другого объекта и на обнаружении в нем так называемых санитарно-показательных бактерий.

Таблица 8. Савитарно-показательные бактерия окружающей среды в пищевых продуктов

Объект

Характер загрязнения

Санитарнопоказательные бактерии

Рода

Фекальное

Бактерии группы кишечных палочек (Е. coli, Citrobacter freundii, Entero- bacter aerogenes). Str. faecalis

Почва

»

Те же бактерии и клостридии (Cl. perfiringens. Cl. sporogenes и др.)

Разлагающиеся отбросы

Термофильные бактерии, Proteus vulgaris

Пищевые продукты

Фекальное

Бактерии группы кишечных палочек, Str. faecalis, Proteus vulgaris

Орально-капельное

Staph, aureus

Предметы обихода

Фекальное

Бактерии группы кишечных палочек, Proteus vulgaris. Str. faecalis

Орально-капельное

Staph, aureus

Воздух

»

Staph, aureus. Str. pyogenes

О микробной обсемененности судят по ми кробному числу— общему количеству микроорганизмов, содержащихся в единице объема или массы исследуемого объекта (1 мл воды, 1 г почвы, 1 мз воздуха). Содержание санитарно-показательных бактерий оценивается по двум показателям — титру и индексу. Титром называется та минимальная масса или объем.

в котором обнаруживаются данные бактерии, индексом — количество санитарно-показательных бактерии, содержащихся в 1 л жидкости, 1 г плотных веществ, 1 俯 воздуха.

К санитарно-показательным бактериям относятся представители облигатной микрофлоры организма человека и теплокровных животных, для которых средой обитания является кишечник или респираторный тракт. Они обладают следующими свойствами： 1) постоянно выделяются в большом количестве с калом или капельками слизи из респираторного тракта； 2) не имеют других мест обитания； 3) способны сохраняться в окружающей среде в течение тех же сроков, что и патогенные бактерии, паразитирующие в кишечнике или респираторном тракте； 4) неспособны интенсивно размножаться на каких-либо объектах вне организма хозяина и изменять свои свойства. Перечисленные признаки присущи ряду бактерии, которые признаны санитарно-показательными для различных объектов окружающей среды (табл. 8).

Санитарно-показательные бактерии группы кишечных палочек (БГКП) принадлежат к разным трибам семейства Entero- bacteriaceae. Их дифференцируют по различным признакам. Важнейшие из них приведены в табл. 9.

Обнаружение Е. coli в разных объектах окружающей среды, пищевых продуктах считается наиболее достоверным показателем свежего фекального загрязнения. Наличие в этих же объектах Citrobacter и Enterdbacter указывают на относительно давнее фекальное загрязнение.

Таблица 9. Двфференциальво-диагностические прнзнакв БГКП

Вид бактерий

Признак

продукты сбраживания

метиловый красный

реакция Фогеса — Проска- уэра

индоло- образова- ние

рост на цитратной среде

рост в присутствии KCN

E.coli

Смесь кислот

+

—

+

—

—

Citrobacter freundii

То же

+

—

р

+

+

Entero bacter aerogenes

Бутандиол

—

+

—

十

+

Условные обозначения: + положительная реакция; — отрицательная реакция; р — различные реакции.

Присутствие Cl. perfringens, CL sporogenes н других клостридий в почве свидетельствует об ее фекальном загрязнении, причем как свежем, так и давнем, поскольку эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно переживать в окружающей среде (в частности, в почве).

Обнаружение в объектах окружающей среды Str. faecalis также свидетельствует об их фекальном загрязнении.

Термофильные бактерии включают группу разных бактерий (Lactobacillus lactis. Str. thermophilus и др.), размножающихся при температуре 60℃ и выше. Они не являются постоянными обитателями кишечника человека и не служат критериями фекального загрязнения окружающей среды. Резкое увеличение количества этих бактерий в саморазогревающемся навозе и компостах может свидетельствовать о загрязнении почвы разлагающимися отбросами.

Бактерии, принадлежащие к трибу Proteae (Proteus vulgaris и др.) семейства Enterobacteriaceae, широко распространены в природе. Они являются гнилостными бактериями и в большом количестве встречаются на разлагающихся останках животных и растений. Обнаружение этих бактерий в каких-либо пищевых продуктах свидетельствует о гнилостном распаде.

Гемолитические стрептококки (Str. pyogenes), так же как и фекальный стрептококк, относятся к семейству Streptococ- сасеае. Являясь транзиторными обитателями носоглотки, зева, они выделяются с капельками слизи орально-капельным путем.

Рис. 45. Аппарат Кротова для бактериологического исследования воздуха.

Сроки выживания гемолитических стрептококков в окружающей среде практически не отличаются от сроков, характерных для большинства других возбудителей воздушно-капельных инфекций. Обнаружение гемолитических стерептококков в воздухе помещений указывает на возможное его загрязнение микроорганизмами (бактерии, вирусы и др.), содержащимися в зеве, носоглотке, верхних отделах респираторного тракта человека и являющимися возбудителями воздушно-капельных инфекций.

Staph, aureus является факультативным обитателем носоглотки, зева, а также кожных покровов человека. Его присутствие в воздухе помещений или на находящихся там предметах является показателем орально-капельного загрязнения. Одновременное обнаружение золотистого стафилококка и гемолитических стрептококков свидетельствует о высокой степени загрязнения воздуха.

Определение микробного числа воздуха

Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации.

(^едиментационяыи метод. Две чашки Петри с питательным агаром оставляют открытыми в течение 60 мин, после чего посевы инкубируют в термостате при 37℃. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках： при наличии менее 250 колоний воздух считается чистым, 250—500 колоний — загрязненным в средней степени, при количестве колоний более 500 — загрязненным.

Аспврационныи метод. Более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов. Прибор Кротова (рис. 45) устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром； при этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей его поверхности, поскольку чашка (под входной щелью) находится в постоянном вращении. После инкубации посева в термостате производят расчет микробного числа по формуле:

а - 1000

где а — количество выросших на чашке колоний； V— объем пропущенного через прибор воздуха, л； 1000 — искомый объем воздуха,几

Для определения микробного числа воздуха используют питательный агар, для вьщеления гемолитических стрептококков —кровяной агар с добавлением генцианового фиолетового, с последующим контрольным микроскопированием и выборочным пересевом подозрительных колоний на кровяной агар. Staph, aureus выявляют методом посевов воздуха на желточносолевой агар.

Состав сред. Кровявой агар с генциановым ф и о л ето в ым： 2% питательный агар с 5—10% дефибринированной крови лошади, кролика или барана и генциановый фиолетовый (1 ： 50 000). Желточно-солевой агар： 2% питательный агар с 10% хлорида натрия, 20% (по объему) желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 200 мл изотонического раствора хлорида натрия!

Для исследования воздуха могут быть применены и другие приборы (Дьякова, Речменского, Киктенко, ПАБ-1 — пробоотборник аэрозольный бактериологический, ПОВ-1 — прибор для отбора воздуха), в которых определенный объем воздуха пропускается через жидкости или фильтры, а затем делаются мерные высеПы на питательные среды. Используя ПАБ-Г и ПОВ4, можно исследовать большие объемы воздуха и обнаруживать патогеннйе бактерии и вирусы. Непосредственное обнаружение патогенных и условно-патогенных бактерий — возбудителей внутрибольничных инфекций (стафилококки, синегнойные палочки и другие грамотрицательные бактерии) в настоящее время проводится при исследовании воздуха стационаров: хирургических, акушерско-гинекологических и др.

При возникновении внутрибольничных инфекций стафилококковой этиологии проводят исследование на выявление источников и путей распространения инфекции： определяют идентичность стафилококков, выделенных из объектов окружающей среды, а также от больных и обслуживающего персонала путем фаготипирования. Нормативные показатели микробного числа и содержания Staph, aureus, разработанные для воздуха больничных помещений, приведены в табл. 10.

Таблица 10. Критерия оценка микробного обсеменения воздуха в больничных вомещениях

Исследуемый объект

Микробное число

Staph, aureus (в 250 л)

Воздух операционных: до начала работы во время ее

Воздух родильных залов

Не выше 500

» » 1000

» » 1000

Не должно быть

То же » »

Определение микробного числа воды

Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, воду открытых водоемов — в объемах 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10—12 мл расплавленным и остуженным до 45—50℃ питательным агаром, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 24-48 % Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37℃ в течение суток, а другую —2 сут при 20°С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине среды колоний и вычисляют ми кробно е число воды — количество микробов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-*ивдекса воды

Коли-титр воды измеряется минимальным количеством воды (в мл), в котором обнаруживаются БГКП, к о л и - и н- де к с — количеством БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды. Коли-титр воды определяют бродильным методом и методом мембранных фильтров.

Бродильный метод. Воду открытых водоемов в объемах 100; 10; 1 и ОД мл засевают в глюкозопептонную среду, причем для посевов больших количеств воды (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую десятикратные количества указанных веществ.

Состав глюкозопептонвой среды: 1% пептонная вода, 0,5%глю- козы, 0,5% хлорида натрмя, индикатор Андреде и поплавок.

Для исследования водопроводной воды делают посев 4 проб по 100 мл и 10 проб по 10 мл или 3 проб по 100 мл и 3 проб по Ю мл в концентрированную среду и 3 проб по 1 мл в обычную гщокозопептонную среду. Посевы инкубируют в течение суток при 37℃. О брожении судят по наличию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб производят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudo- monadaceae н других оксидазаположительных бактерий, обитающих в воде. С этой целью стеклянной палочкой снимают 2—3 изолированные колонии с поверхности среды и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-п- фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном — она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин.

Г рамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте — вносят в полужидкий питательный агар с 0,5% глюкозы и инкубируют при 37℃ в течение суток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по таблицам ГОСТа 18963—73 (табл. 11).

Таблица 11. Определение коли-индекса прн исследовании 500 мл воды

Количество положительных результатов анализа воды из 5 флаконов по 100 мл

Коли-индекс

Пределы индекса (доверительные границы)

Коли-титр

нижний

верхний

0

Менее 2

0

6,0

Более 455

1

2

0,1

12,6

455

2

5

0,5

19,2

196

3

9

1,6

29,4

109

4

16

зз

52,9'

62

5

Более 16

8,0

—

Менее 62

Метод мембранных филыров. Мембранный фильтр № 3 помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуум-насосу (см. рис. 28). Мембранные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Воду из водопроводной сети Москвы и Ленинграда и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 500 мл, воду других городов — в объеме 333 мл. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100; 10; 1 и 0,1 мл, более загрязненную перед фильтрацией разводят стерильной водой. Затем фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашку Петри и после инкубации при 37℃ в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2—3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерии переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-п-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. Две — три колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37℃. При наличии газообразования подсчитывают количество красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс, из значения которого вычисляют коли-титр. Например, если коли- индекс равен 5, то коли-титр составит 200 (1000:5 = 200). Нормативные показатели микробного числа, коли-титра и коли- индекса воды приведены в табл. 12.

Таблица 12. Нормативы для водопроводной воды (ГОСТ 2874—73)

Показатель-

Норма

Общее количество бактерий в 1 мл неразбавленной воды, не более Количество БГКП, определяемое по плотной среде с применением концентрации бактерий на мембранных фильтрах в 1 л

100

воды (коли-индекс), не более

3

При использовании жидких сред накопления коли-титр, не менее

333

Для определения титра Staph, faecalis готовят десятикратные разведения воды. Цельную воду и ее разведения в объеме 1 мл засевают в одну из жидких элективных сред (КФ, полимиксиновая и др.), инкубируют при 37℃ в течение 2 сут, а затем через 24 и 48 ч производят высевы на чашки с плотными элективно-дифференциальными средами： агар КФ, агар ТТХ (среда с трифенилтетразолхлоридом), полимиксинотеллуритный агар. Идентифицируют фекальные стрептококки по виду колоний, морфологии клеток и окраске по Граму. На среде с ТТХ Staph, faecalis образует колонии темно-красного цвета, на агаре с теллуритом — черного цвета.

Состав сред. Среда К Ф： 2% питательный агар с 1% дрожжевого экстракта, 2% мальтозы, 0,1% лактозы, 0,4% азида натрия, 0,06% карбоната натрия, индикатор бромкрезоловый красный. Полимиксинова я среда: питательный агар, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, полимиксин М 200 ЕД/мл, индикатор бромтимоловый синий. Полимиксинотеллуритный агар： питательный агар, дрожжевой экстракт, 1% глюкозы, кристаллический фиолетовый 1 ： 800 000, полимиксин М 200 ЕД/мл, 0,01% теллурита калия. Агар ТТХ： питательный агар, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, кристаллический фиолетовый 1 ： 800 000, 0,01% ТТХ.

При определении индекса Staph, faecalis пользуются статистическими таблицами, применяемыми при установлении коли- индекса. Кроме того, с этой целью используют метод мембранных фильтров.

Для обнаружения патогенных бактерий максимальные объемы воды пропускают через мембранные фильтры, которые затем помещают в жидкие элективные среды или на поверхность плотных дифференциально-диагностических сред.

Определение микробного числа почвы

Почву берут на глубине 10—15 см стерильным ножом (из разных мест исследуемой территории в количестве 10 и большего числа проб) и помещают в стерильную банку. Из проб готовят навеску (30 г), которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Из полученной

суспензии готовят разведения 10~3,10~4,10**5. Из двух последних разведений берут 0,1 мл и смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45℃ питательного агара, после чего выливают в чашки Петри с 2% питательным агаром. Посевы инкубируют при 37℃. Затем подсчитывают количество выросших колоний и определяют микробное число.

Определение коли-тшра, перфрингенс-тяпра и титра термофильных бактерии почвы

Различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера и инкубируют при 43℃ в течение 48 ч. В дальнейшем анализ проводят по схеме, применяемой при определении коли-титра воды.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии по 1 мл засевают в пробирки со стерильным обезжиренным молоком или железосульфитной средой Вильсона—Блера, приготовленный ex tempore. Посевы инкубируют при 43℃ в течение 24-48 % после чего учитывают результата по свертыванию молока или по образованию черных колоний Cl. perfringens в агаровом столбике среды Вильсона—Блера. Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопи- руют и вычисляют перфрингенс-титр.

Состав сред. Среда Кесслера: 1% пептонная вода, 5% желчи, 0.25% лактозы, генциановый фиолетовый для подавления роста грамположительных бактерий. Железосульфитная среда Вильсона — Блера： 3% питательный агар, 1% глюкозы, 2% сульфита натрия, 0,08% хлорида железа.

Для определения титра термофильных бактерий разведения почвенной суспензии по 1 мл вносят в чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным питательным агаром. Посевы инкубируют в течение суток при 60℃, а затем подсчитывают количество выросших колоний и делают пересчет на 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическую оценку почвы производят по комплексу показателей, из которых наиболее важным является установление степени фекального загрязнения (табл. 13).

Таблица 13. Оцевка фекальвого загрязнения подзолистых почв Подмосковья

Характеристика почвы

Коли-титр

Перфрингенс>титр

Общее число бактерий, млн / г

Чистая Загрязненная Сильно загрязненная

1,0 и выше 0,9-0.01 0,009 и ниже

0,01 и выше 0,009-4).0001 0,00009 и ниже

До 0,5 0,5-5,0 5,1 и более

Охфеделение фекального захрязнеяия предметов обихода (инвентарь, оборудование, мебель, посуда, игрушки в др.) и рук персонала

Стерильным ватным тампоном, увлажненным изотоническим раствором хлорида натрия, делают смыв с исследуемого предмета. Тампон помещают в среду Кесслера или втирают в поверх工 ность среды Эндо. Посевы на плотных средах инкубируют при 37℃, на жидких средах —при 43℃. Для исследования гладких поверхностей и тканей используют также специальные трафареты, представляющие собой металлические формы в виде усеченного конуса, в которые наливают расплавленную и охлажденную до 45-Ч8℃ среду Эндо (двойной концентрации) или питательный агар. После застывания и затвердения агаровый гель стряхивают в стерильную чашку Петри и инкубируют при 37℃ в течение суток. Выросшие колонии подсчитывают и идентифицируют по схеме. Зная площадь агарового геля, определяют число колоний на 1 см2.

Обсемененность предметов обйхода золотистым стафилококком и фекальным стрептококком устанавливают аналогичным способом, используя для этого соответствующие питательные среды (см. методы исследования воды и воздуха).

Санитарво-бактериологическое нсследование молока

в Молочных продуктов

О санитарно-бактериологическом состоянии молока и молочных продуктов судят по микробному числу и коли-титру. Для определения микробного числа пастеризованное молоко разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия (1:10, 1:100, 1:1000) и 1 мл каждого разведения выливают на дно стерильной чашки Петри, которую затем заливают расплавленным и остуженным агаром. Посевы инкубируют при 37℃ в течение суток, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

Для определения коли-титра цельное пастеризованное молоко засевают в шесть пробирок со средой Кесслера: в три пробирки вносят по 1 мл молока4 а в остальные три—по 0,1 мл (1 мл молока, разведенного в 10 раз стерильной водой). Посевы инкубируют при 43℃ в течение, суток, после чего из забродивших проб делают посевы на среду Эндо и инкубируют при 37℃. Из выросших колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и делают посев на среду Козера, а также в пептонную воду с 1% глюкозы. Пробирки с посевами на среде Козера инкубируют при 37℃, а на среде

с глюкозой — при 43° С в течение суток. При оценке результатов учитываются бактерии, вызывающие брожение глюкозы с образованием кислоты и газа, но не дающие роста на цитратной среде Козера.

Таблица 14. Определение коли-титра в пастеризованном молоке, сливках, кефире и других молочных продуктах

Кишечная палочка обнаружена в следующих объемах, мл

К оли-титр, мл

1，

1,0

1,0

0,1

0,1

0,1

—

—

—

—

—

Более 3,0

+

—

—

—

—

—

3,0 •

+

+

—

—

—

—

Менее 3,0

+

+

+

•—

—

—

Более 0,3

+

+

+

+

—

—

0,3

+

+

+

+

+

—

Менее 0,3

+

+

+

+

+

+

Таблица 15. Санитарно-бактервологнческве нормативы для молока в молочных продуктов

Продукт

Документ, регламентирующий качество

Допустимое количество микробов в 1 мл или I г, не более

К оли-титр, не менее

Молоко пастеризованное：

ГОСТ 13277-67

группа А

75 000

3

» Б

150 000

03

Молоко во флягах, цистернах

300 000

0,3

Сливки пастеризованные: группа А

РТУ 50-69

100 000

3

» Б

300 000

0,3

Молоко сгущенное с сахаром

ГОСТ 2903-65

50 000

0,3

Какао со сгущенным молоком и

сахаром

ГОСТ 718-54

35 000

0,3

Кофе со сгущенным молоком и

сахаром

ГОСТ 719-54

35 000

0,3

Молоко сухое: высший сорт

ГОСТ 4495-74

50 000

0』

первый »

70 000

0,1

Мороженое

ОСТ 4973-74

100 000

0,3

Детские молочные смеси пасте-

ризованные и вареные

Инструкция ГСИ СССР 123-13/132 1963 г.

500

11,1

Молоко сухое для детей грудного

возраста

ГОСТ 9873rl

500

11』

Состав среды Козера： дистиллированная вода, 0,15% фосфата натрия-аммония, 0,1% фосфата калия однозамещенного, 0,02% сульфата магния, 0,25% цитрата натрия.

Аналогичным образом исследуют сливки, молочнокислые продукты, мороженое. Величину коли-титра устанавливают по таблицам ГОСТа (табл. 14 и 15).

Для обнаружения в молоке патогенных бактерий делают посевы на соответствующие элективные и дифференциальнодиагностические среды с последующим выделением чистых культур и их идентификацией.

Санитарно-бактериологическое исследование напитков (лимонад, минеральные воды)

При исследовании лимонада и минеральных вод определяют микробное число и коли-титр, используя при этом методы, применяемые для исследования питьевой воды. Перед исследованием лимонад нейтрализуют 10% раствором гидрокарбоната натрия, проверяя реакцию с помощью лакмусового индикатора. Отобранные пробы минеральной воды выдерживают при 43℃ в течение 1 ч для удаления избытка газа. Коли-титр определяют методом мембранных фильтров. С этой целью 500 мл воды фильтруют через мембранные фильтры (100 мл через один фильтр), после чего их промывают стерильной водопроводной водой для удаления остатков минеральных солей и помещают на поверхность среды Эндо. Посевы инкубируют при37℃. После определения коли-индекса высчитывают коли-титр.

Санитарно-бактериологические нормативы для лимонада и минеральных вод соответствуют нормативам питьевой водопроводной воды. Такие же требования предъявляются к воде, используемой для изготовления кваса и различных фруктовоягодных безалкогольных напитков.

Санитарно-бактериологическое исследование мяса, колбасных издений н мясных продуктов

При исследовании мяса определяют количество бактерий в мазках-отпечатках, которые готовят из кусочков мяса размером 2 X1,5 X 2,5 см. Мазки окрашивают по Граму и микроскопируют. Мясо считается свежим, если в поле зрения обнаружено не более 10 палочковидных бактериальных клеток, и сомнительно свежим, если количество бактерий превышает 30. При выявлении большего числа бактерий мясо оценивается как несвежее.

При исследовании колбасных изделий и мясных продуктов определяют микробное число, а также устанавливают присутст-

вие кишечных палочек, сальмонелл, бактерий «рода Proteus и клостридии. Для проведения этих исследований из продукта готовят 20% взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия, которую высевают на различные питательные среды. Для определения микробного числа исследуемую взвесь (неразведенную и разведенную в 2 раза) в количестве 0,5 мл вносят в стерильную чашку Петри, заливают расплавленным и охлажденным питательным агаром. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 48 ч, после чего подсчитывают количество выросших колоний.

Присутствие Е. coli устанавливают по их способности сбраживать лактозу до кислоты и газа при 43℃ в течение 24 ч. Исследуемую взвесь (1 г продукта) засевают в среду Кесслера, после чего из нее делают высев на среду Эндо. Из характерных для этих бактерий красных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Для выделения сальмонелл взвесь засевают на соответствующие элективные среды, после чего выделяют чистые культуры бактерий и идентифицируют их по методике, принятой для изучения этих бактерий (см. с, 183).

Бактерии рода Proteus выявляют по методу Шукевича. Для этого взвесь вносят в конденсационную воду свежескошенного питательного агара. Посев инкубируют при 37℃ в течение суток. При наличии протея наблюдается ползучий рост. При этом в мазках определяются грамотрицательные палоупси.

Для обнаружения анаэробных, спорообразующих бактерий делают посев в две пробирки со средой Китта—Тароцци； одну из них после посева нагревают в течение 20 мин при 80℃ для уничтожения вегетативных клеток. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 5 сут. При появлении роста готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Кроме того, проверяют способность выделенных бактерий восстанавливать сульфит натрия в сульфат. Для этого их засевают в среду Вильсона— Блера, где анаэробы образуют черные колонии за счет выпадения -черного осадка сульфата железа, образующегося в результате соединения сульфата натрия с хлорным железом, содержащимся в среде.

Колбасные изделия и продукты из мяса не должны содержать кишечных палочек, сальмонелл, бактерий рода Proteus и анаэробных спорообразующих бактерий. Общее количество бактерий в 1 г не должно превышать 1000.

Санитарно-бактериологическое исследование консервов

При исследовании консервов определяют присутствие аэробных и анаэробных бактерий. По эпидемиологическим показаниям

выявляют CL botulinum и проводят исследование на наличие ботулинического токсина. Перед бактериологическим исследованием консервную банку проверяют на герметичность в сосуде с горячей водой, ставят контроль на бомбаж, выдерживая в термостате при 37℃ в течение 5 сут, после чего моют теплой водой, высушивают, протирают спиртом и обжигают верхнюю крышку смоченной спиртом горящей ватой. Извлеченное содержимое засевают для выявления аэробной флоры в две пробирки с бульоном, а для обнаружения анаэробной флоры — в две пробирки со средой Китта—Тароцци, содержащей 0,15% агара. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 5 сут. При появлении признаков роста аэробные бактерии пересевают на питательный агар, среду Эндо, скошенный агар (по Шухевичу) и на питательный агар с 1% глюкозой. Из среды Китта—Тароцци берут 1—2 мл, вносят в чашки Петри и заливают расплавленным и охлажденным до 4578°С питательным агаром с 1% глюкозы. После застывания на поверхность среды помещают стерильное предметное стекло (для создания анаэробных условий) и посевы инкубируют в течение суток при 37℃. Из выросших колоний получают чистые культуры, которые затем идентифицируют по обычной схеме.

Для выявления ботулинического токсина исследуемые пробы консервов фильтруют и с фильтратом ставят реакцию нейтрализации токсина антитоксической противоботулинической сывороткой типов А, В, С, Е, F на белых мышах. В консервах не допускается присутствие Cl. botulinum и его токсина, С1. perfringens и других патогенных бактерий.

Присутствие аэробной неспорообразующей флоры указывает на недостаточную эффективность примененных методов консервирования и возможность порчи. Присутствие сапрофитных аэробных бацилл (Вас. subtilis. Вас. mesentericus) является допустимым при герметичности и отсутствии бомбажа консервных банок.

ПРИКЛАДНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

В данном разделе изложены основные методы изучения тесно взаимосвязанных процессов инфекции и иммунитета. Характер их взаимосвязи определяется биологическими свойствами микроба и состоянием иммунной системы организма хозяина. Студенты должны последовательно ознакомиться с методами оценки вирулентности и токсичности патогенных бактерий, диагностическими возможностями экспериментального заражения и вскрытия лабораторных животных. Из иммунологических методов исследования выборочно представлены некоторые методики изучения факторов естественного иммунитета: фагоцитоза, комплемента в связи с оценкой иммунологического статуса организма человека и выявлением иммунодефицитных состояний. С целью изучения иммунной системы организма, обеспечивающей специфический иммунный ответ, дано краткое описание основных методов исследования иммунокомпетентных клеток (Т- и В-лимфоцитов). Основное внимание следует уделить изучению серологических реакций, которые широко используются при лабораторной диагностике различных заболеваний, а также принципам применения специфических диагностических, лечебных и профилактических препаратов.

Тема 15. ПАТОГЕННОСТЬ И ВИРУЛЕНТНОСТЬ МИКРОБОВ.

ТОКСИНЫ

Программа двух занятий

Методы экспериментального заражения и иммунизации животных.

Бактериологическое исследование трупов павших животных.

Изучение факторов патогенности бактерий.

Методы определения силы токсина.

Демонстрация

Методы выявления факторов патогенности, подавляющих защитные механизмы организма хозяина： капсулы у патогенных бактерий, корд-фактора у патогенных микобактерий.

Кератоконъюнктивальная проба Шереня на морской свинке.

Определение вирулентности бактерий или силы токсина методом заражения животных.

Задание для вьшолнения лабораторной работы

3 ан я т и е 1-е

Заразить белую мышь подкожно суточной бульонной культурой испытуемых бактерий.

Посеять культуру стафилококка на среды для изучения факторов патогенности.

Поставить дермонекротическую пробу.

Провести внутривенно иммунизацию кролика убитой вакциной для получения имунной сыворотки (первое введение антигена).

Занятие 2-е

Произвести бактериологическое исследование трупов белых мышей, павших после заражения. Определить присутствие возбудителя в органах и тканях, отметить наличие капсул. Сделать заключение о форме инфекции и возможных причинах гибели животного.

Отметить результаты посева стафилококка ]на питательные среды и сделать соответствующее заключение.

Отметить результаты дермонекротической пробы на кролике.

Провести иммунизацию кролика убитой вакциной (второе введение антигена).

Методические указания

Экспериментальное заражение животных. Инфекционный процесс может быть искусственно воспроизведен путем заражения лабораторных животных： кроликов, морских свинок, белых мышей, белых крыс и др. Экспериментальное заражение животных производится для： 1) изучения патогенности и вирулентности микроорганизмов; 2) выделения чистой культуры возбудителя из различных материалов (метод биопробы); 3) воспроизведения экспериментальной инфекции, испытания лечебного действия химиотерапевтических препаратов и других целей.

Заражают животных накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, внутривенно, перорально, интраназально, внутритрахеально, интрацеребрально и внутрибрюшинно. Перед началом опыта животных отбирают, взвешивают и маркируют. Мышь при заражении берут за хвост, опускают на стол, туловище быстро прижимают к столу двумя пальцами и, скользя ими по спине, захватывают кожу над головой; животное фиксируют в левой руке в растянутом положении. Взвесь микробов определенной концентрации набирают в шприц через иглу. Шприц держат, как писчее перо, в правой руке.

При подкожном заражении иглой прокалывают кожную складку на спине или у корня хвоста и медленно вводят содержимое шприца под кожу. Затем иглу быстро извлекают, прикрыв место инъекции ватой, смоченной спиртом.

Рис. 46. Внутрибрюшинное заражение белой мыши.

При внутрибрюшинном заражении животное фиксируют головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. В левой нижней трети живота делают прокол кожи, удерживая иглу под острым углом, затем переводят шприц в положение, перпендикулярное к брюшной стенке, толчкообразным движением прокалывают брюшину и вводят содержимое шприца (рис. 46).

Инструменты стерилизуют кипячением.

Бактериологическое исследование 1рупов белых мышей. Для обнаружения микроба, вызвавшего гибель животного, определения его локализации в организме и выделения чистой культуры возбудителя производят вскрытие зараженного животного сразу после его гибели, соблюдая правила асептики во избежание загрязнения посторонними бактериями. Мышь помещают брюшком кверху на марлю, смоченную дезинфицирующим раствором, поверх слоя застывшего парафина в ванночке и прикрепляют булавками за лапки. Тщательно обрабатывают кожу раствором какого-либо антисептика. Вскрытие производят стерильными инструментами.

Делают продольный разрез кожи по прямой линии от нижней челюсти до лобка, осторожно отсепаровывают в стороны. Отмечают состояние подкожной клетчатки и лимфатических узлов; при необходимости из них делают мазки-отпечатки и посевы.

Грудную полость вскрывают поперечным разрезом под мечевидным отростком и двумя продольными разрезами через ребра параллельно грудине. Откладывают вырезанный лоскут и осматривают органы грудной полости, отмечая в протоколе наличие экссудата (рис. 47). Для посева крови из сердца его

Рис. 47. Вскрытие мыши.

/ — 4 этапы вскрытия.

поверхность прижигают раскаленным кончиком пинцета и вводят капилляр стерильной пастеровской пипеткой в полость сердца. Затем каплю крови из пипетки выдувают в пробирку со средой. Из ткани легких готовят мазки-отпе чатки и делают посевы.

Брюшную полость вскрывают продольным разрезом брюшины ножницами, не задевая кишечник. Осматривают органы полости.

отмечая в протоколе наличие экссудата, величину, цвет и консистенцию печени, селезенки, надпочечников, мезентериальных лимфатических узлов. При необходимости делают посевы из этих органов на питательные среды. Для приготовления мазков-отпечатков вырезают из печени, селезенки, почек небольшие кусочки ткани, берут их пинцетом и прикасаются к предметному стеклу поверхностью разреза. Мазки-отпечатки фиксируют в жидком фиксаторе и окрашивают метиленовым синим. При микроскопии отмечают присутствие микроба- возбудителя в различных органах н тканях. Результаты посевов учитывают на следующий день после инкубации в термостате. Данные вскрытия трупа протоколируют. Труп животного после вскрытия подлежит уничтожению.

Методы оценки вирулентности патогенных бактерий и силы токсинов

Патогенность и токсигенность являются видовыми генотипическими признаками микроорганизмов. Фенотипическое проявление патогенного генотипа выражается в вирулентности (степени патогенности), а токсигенность проявляется фенотипически в способности образовывать токсины.

Вирулентность является штаммовым признаком, который определяется метаболической активностью бактериальных клеток, их компонентами и продуктами, подавляющими защитные механизмы организма хозяина, в том числе фагоцитоз, способствующими колонизации и распространению бактерий в организме (инвазивность), повреждающими клетки и ткани хозяина. '

К факторам, подавляющим защитные реакции организма, относятся капсульное вещество бактерий (полисахариды или полипептиды), протеины клеточной стенки бактерий (М-протеин стрептококка, А-протеин стафилококка), корд-фактор микобактерий, липополисахариды энтеробактерий и др. Колонизация (заселение) бактерий обусловлена наличием пилей (ворсинок) или свойствами клеточной стенки, от которых зависит прилипание бактерий. Инвазивные и повреждающие свойства бактерий связаны с образованием ферментов, способствующих расщеплению биополимеров тканей. К таким ферментам относятся гиалуронидаза, фибринолизин, коллагеназа, нейраминидаза, ДНК-аза и др.

Токсигенность бактерий фенотипически проявляется в образовании белковых токсинов, полностью или частично секрета руемых в окружающую среду. Эндотоксины, являющиеся компонентом липополисахаридного слоя клеточной стенки.

освобождаются только после разрушения клетки, о^исловливая токсическое действие на ткани макроорганизма.

Вирулентность и токсичность патогенных бактерий представляют собой разные, но взаимосвязанные формы проявления патогенного генотипа. Они измеряются в специальных единицах： минимальных смертельных дозах (Dosis letalis minima)- DLM. За 1 DLM принимают наименьшую дозу возбудителя или белкового токсина, которая вызывает гибель 95% зараженных животных. Чаще пользуются более точной дозой： LDso, вызывающей гибель 50% зараженных животных.

Определение ферментов, обусловливающих инвазивность бактерий

Гиалуронидаза гидролизует гиалуроновую кислоту, которая перестает давать с уксусной кислотой сгусток муцина. Для определения этого фермента в пробирку с субстратом, содержащим гиалуроновую кислоту, вносят суточную культуру бактерий или фильтрат бульонной культуры и инкубируют в течение 15 мин при 37°С. Затем добавляют 2—3 капли крепкой уксусной кислоты. В пробирках, где содержится гиалуронидаза, не происходит образования сгустка.

Плазмокоагулаза выявляется при nqceBe испытуемой культуры в 0,4 мл стерильной цитратаой плазмы крови. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 2—5 q. В случае выработки фермента происходит свертывание плазмы, и в контроле она остается жидкой.

Гемолизины определяют путем посева испытуемой культуры «бляшками» в чашку Петри с кровяным агаром. Чашкр инкубируют в термостате при 37℃ в течение суток. В положительном случае вокруг «бляшек» образуются зоны гемолиза.

Определение ввфулентности с помощью биологических проб на лабораторных животных

Дермонекротическая проба. Кролику внутрикожно вводят 0,2 мл бульонной испытуемой культуры при помощи туберкулинового шприца с тонкой иглой. В положительном случае через 2—3 сут на месте введения образуется очаг некроза (рис. 48).

Кератоконъкшктивальвая проба. Суточную агаровую культуру бактерий стандартной петлей диаметром 5 мм вводят под нижнее веко глаза морской свинки. Через 2T сут оценивается

Рве. 48. Дермонекротическая проба.а — отрицательная реакция； 6 — положительная реакция.Рве. 48. Дермонекротическая проба.а — отрицательная реакция； 6 — положительная реакция.выраженность кератоконъюнктивита по наличию помутнения роговицы, нагноения и изъязвления (проба Шереня).

Рве. 48. Дермонекротическая проба.

а — отрицательная реакция； 6 — положительная реакция.

Рве. 48. Дермонекротическая проба.

а — отрицательная реакция； 6 — положительная реакция.

Оцределение вирулентности бактерии или силы токсина. Испытуемые препараты в определенных дозах вводят группам лабораторных животных с последующей регистрацией их гибели и расчетом летальных доз. Обязательным условием при этом является строгая стандартизация： вида, пола, массы животных, условий их содержания, полноценности питания и т. д. Ряд десятикратных разведений токсина (или культуры бактерий) вводят нескольким группам животных. Через определенный срок отмечают число погибших животных в каждой группе и производят расчет LD50.

Иммунизация кролика для получения иммунной сьшоротки. Для получения иммунной сыворотки про

водят цикл иммунизации кролика убитой вакциной — взвесью убитых бактерий, содержащей 1 млрд, микробных тел в 1 мл. Вакцину вводят в краевую вену уха кролика 3 раза с интервалами в 6 дней. Через 7 дней после последнего введения антигена у кролика берут кровь, из которой готовят сыворотку и титруют для выявления в ней антител.

Тема 16. ФАГОЦИТОЗ И ДРУГИЕ ФАКТОРЫ

ЕСТЕСТВЕННОГО ИММУНИТЕТА

Естественный иммунитет организма- обеспечивается клеточными факторами (микро- и макрофаги крови н тканей), а также гуморальными вне- и внутрисосудистыми факторами (лизоцим,

комплемент и другие белки сыворотки крови). При оценке иммунологического статуса организма принято определять фагоцитарную активность лейкоцитов крови, уровни содержания в сыворотке крови лизоцима и комплемента.

Провямма занятия

Изучение стадий фагоцитоза и фагоцитирующих клеток в опыте фагоцитоза in vivo (в организме подопытного животного).

Определение фагоцитарных показателей и показателя опсонофагоци- тарной реакции в опыте in vitro (в исследуемой крови людей).

Исследование гуморальных факторов естественного иммунитета.

Демонстрация

Миграция и хемотаксис фагоцитирующих клеток.

Фагоцитоз бактерий в тканевой культуре макрофагов.

Незавершенный фагоцитоз гонококков в мазке из уретрального гноя больного гонореей.

Задавне для вьшолвения лабораторной работы

Учесть результаты посева крови из трупа белой мыши, сделанного на прошлом занятии, и дать заключение.

3明азить белую мышь внутрибрюшинно взвесью стафилококка для изучения явления фагоцитоза in vivo. Проанализировать защитную роль фагоцитоза в организме,

Определить показатель опсонофагоцитарной реакции на основании подсчета фагоцитарных показателей в готовых мазках, приготовленных ранее при постановке этой реакции in vitro. Сделать заключение.

Провести иммунизацию кролика убитой вакциной (третье введение антигена).

Учесть и оценить результаты определения титра лизоцима в слюне.

Методические указания

Постановка опыта фагоцитоза на белых мышах. За 24 ч до постановки опыта белым мышам вводят внутрибрюшинно по 2—3 мл стерильного 1% раствора крахмала. Это вызывает скопление в брюшной полости фагоцитирующих клеток как результат асептического воспаления и хемотаксиса фагоцитов к крахмалу. Затем мыши вводят внутрибрюшинно 1 мл двухмиллиардной взвеси белого стафилококка. Через 30 мин брюшную стенку мыши прокалывают концом тонкого капилляра пастеровской пипетки и набирают несколько капель экссудата. Из него готовят мазки на предметных стеклах, высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают раствором метиленового синего в течение 3—4 мин.

При микроскопии мазков отмечают наличие микрофагов (полиморфно-ядерных клеток) и макрофагов (мононуклеаров)

с поглощенными стафилококками, окрашенными в интесивно синий цвет на фоне светло-голубой цитоплазмы фагоцитов (рис. 49). Отмечают в препарате отдельные стадии фагоцитоза： прилипание, захват, частичное переваривание.

Постановка опсонофагоцитарнон реакции. В пробирку с одним объемом стерильного 2% раствора цитрата натрия вносят два объема свежевзятой крови и один объем взвеси бактерий, содержащей 1 млрд/мл микробных клеток, убитых нагреванием при 80℃ в течение часа. Содержимое пробирки перемешивают, инкубируют в течение 30 мин при 37℃, затем готовят мазки и окрашивают по Романовскому—Гимзе. В мазке подсчитывают количество бактерии, захваченных каждым из 25 нейтрофилов. По результатам учета определяют следующие фагоцитарные показатели： фагоцитарный показатель (индекс) — процент фагоцитирующих нейтрофилов, фагоцитарное число — среднее количество фагоцитированных бактерий на один нейтрофил. Показатель опсонофагоцитарнон реакции (ПОФР) вычисляют по формуле： ПОФР = За + % + 1с + 0d, где а — число нейтрофилов, содержащих свыше 41 бактерии； Ь — число нейтрофилов, содержащих 21-40 бактерий； с—число нейтрофилов, содержащих от 1 до 20 бактерии； с/—число нейтрофилов, не содержащих бактерий. Максимальный показатель при такой системе учета составляет 75. Ориентировочно считают, что показатель в пределах 10—24 характеризует слабоположительную реакцию, 25^49 — ясно выраженную, 50—75 — резко положительную реакцию. Ясно выраженная и резко положительная реакции характеризуют опсонизирующую активность сыворотки больного и функциональную активность фагоцитов.

Определение титра лизоцима в слюне. Готовят ряд последовательных разведении слюны в пробирках, в каждую из которых вносят по 1 мл суспензии суточной культуры Micrococcus lysodeiticus, содержащей 1 млрд/мл микробных тел. После инкубации в термостате в течение 3 ч определяют титр лизоцима по последнему разведению, в котором наблюдается полный лизис бактерий — просветление. Оценку активности лизоцима можно проводить по степени мутности с использованием фотоэлектроколориметра или по изменению оптической плотности микробной взвеси нефелометрическим методом.

Тема 17. ОЦЕНКА ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА

Современные методы определения иммунологического статуса организма человека включают ряд тестов для дифференцированной оценки Т- и В-систем иммунитета. Оценка клеточного иммунитета (Т-системы) проводится путем определения；

1)количества Т-лимфоцитов в крови методом спонтанного розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами бщзана (Е-ро- зетки); 2) функциональной активности Т-лимфоцитов в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) in vitro под влиянием митогенов или антигена либо по уровню продукции лимфоцитами гуморальных медиаторов клеточного иммунитета (лимфо- кинов) в тестах подавления миграции макрофагов и др., а также при постановке кожных проб гипер чувствительности замедленного типа (ГЗТ) для оценки возможной предвщзительной сенсибилизации организма к данному антигену (аллергену).

Оценка гуморального иммунитета (В-системы) проводится путем определения количества В-лимфоцитов в крови реакцией иммунофлюоресценции с антисывороткой против иммуноглобулинов человека или путем выявления на В-лимфоцитах рецепторов для комплемента — с помощью теста розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами, несущими на себе комплекс： антиэритроцитарные антитела + комплемент (ЕАС-розет- ки). Функциональная активность В-лимфоцитов оценивается косвенно по уровням сывороточных иммуноглобулинов (Ig) различных классов： A,G, М.

Программа занятия

Методы оценки Т-системы иммунитета.

Методы оценки В-системы иммунитета.

Методы оценки специфической сенсибилизации организма.

Демонстрация

Результаты теста угнетения миграции макрофагов.

Результаты определения концентрации сывороточных иммуноглобулинов по Манчнни.

Различные виды аллергенов.

Задание для вьшолвення лабораторной работы

Произвести учет результатов метода розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана для количественной оценки содержания в крови Т-лимфоцитов.

Произвести учет результатов РБТЛ для оценки функциональной активности Т-лимфоцитов.

Произвести учет результатов метода ЕАСч)озёток для количественной оценки содержания в крови В-лимфоннтов.

Отметить результаты кожно-аллергической пробы, поставленной на предварительно сенсибилизированной морской свинке.

Получить иммунную сыворотку крови кролика после проведенного цикла иммунизации (титр антител определить на следующем занятии).

Методические указания

Метод розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами барана является наиболее простым и самым распространенным

методом количественного учета Т-лимфоцитов периферической крови людей. При смешивании лимфоцитов человека и эритроцитов барана последние присоединяются избирательно только к Т-лимфоцитам, образуя так называемые розетки. Розеткообразующей клеткой считают лимфоцит, присоединив- ший три эритроцита барана и более. У здоровых людей Т-лимфоциты составляют 50—70% от общего числа лимфоцитов.

Метод ЕАС-розеток. Один из простых методов количественного учета В-лимфоцитов крови человека. В этом случае тест розеткообразования ставят, как и в случае Е-розеток, но с эритроцитами барана, предварительно инкубированными последовательно с антиэритроцитарными антителами, а затем с комплементом. Такие эритроциты присоединяются избирательно к клеткам, несущим рецепторы для комплемента, в том числе к В-лимфоцитам. У здоровых людей В-лимфоциты (Е АС-розетки) составляют 15—25% от общего числа лимфоцитов.

РБТЛ. При культивировании лимфоцитов крови человека в присутствии митогенов ~ фитогемагглютинина (ФГА) или специфического антигена — малые лимфоциты увеличиваются в размерах и превращаются в бластные клетки, активно синтезирующие ДНК. Этот феномен называется бластной трансформацией лимфоцитов. Сравнение результатов производят по отношению к лимфоцитам, культивированным в тех же условиях без стимуляторов. При морфологическом учете РБТЛ по окончании срока культивирования делают мазки клеток, окрашивают по Романовскому—Гимзе и подсчитывают количество бластных форм на 100 лимфоцитов в препарате. У здоровых людей РБТЛ с ФГА дает 60—80% бластных форм, что характеризует нормальный уровень функциональной активности Т-лимфоцитов.

При активации лимфоцитов под влиянием митогенов или антигенов они выделяют в среду клеточные медиаторы — лимфокины, по выходу которых также можно оценивать функциональную активность Т-лимфоцитов. Из них наиболее изучен фактор, угнетающий миграцию макрофагов. Выявляют этот фактор в тесте угнетения миграции макрофагов. Можно, например, поместить макрофаги (моноциты) в лунки, вырезанные в слое агарозы. За 24 ч инкубации они образуют вокруг лунки равномерную зону миграции. В присутствии лимфокина миграция клеток резко заторможена и зона миграции уменьшена.

Определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов по Манчини. Образцы исследуемых сывороток помещают в лунки агарового геля, который содержит антитела против IgM, IgG или IgA в известной концентрации. Диффундирующие

в агар иммуноглобулины образуют кольца преципитации с антиглобулиновыми антителами, размер которых зависит от содержания в сыворотке иммуноглобулинов соответствующего класса. Уровень сывороточных иммуноглобулинов отражает функциональное состояние В-системы иммунитета.

Постановка и оценка кожно-аллергической пробы. Для выявления специфической сенсибилизации (при туберкулезе, бруцеллезе и других инфекционных заболеваниях) ставят кожные аллергические пробы. Например, при постановке пробы Манту туберкулиновым шприцем внутрикожно вводят раствор туберкулина определенной концентрации. Реакцию учитывают через 24 и 48 ч, определяя степень ее выраженности. Гиперемию и инфильтрат вокруг места введения оценивают следующим образом： + размером до 5 мм, 4+до 1 см, •+++больше 1 см, а также наличие везикулы и лимфангита (рис. 50).

Тема 18. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ.

РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ

Проп)амма занятия

Изучение реакции агглютинации： механизм, роль отдельных ингредиентов, диагностическое применение для определения титра специфических антител в сыворотке крови больных и идентификации вида микроорганизма.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА, РИГА) и реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГ А).,

Метод выявления неполных антител (проба Кумбса).

Реакция агглютинации бактерий протекает в две фазы. Первая, специфическая, невидимая фаза реакции агглютинации состоит во взаимодействии антител с антигенными детерминантами, расположенными на поверхности бактерий и других корпускулярных частиц. Вторая, видимая, фаза реакции, протекающая лишь в присутствии электролита в среде, заключается в склеивании и оседании на дно пробирки иммунных комплексов в виде хлопьев или зерен, видимых невооруженным глазом.

Кроме специфической агглютинации бактерии, вызванной антителами, возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие иммунной сыворотки). Спонтанную агглютинацию дают R-фор- мы бактерий, не образующие гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждающиеся в виде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в результате снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической зоне происходит склеивание — наступает «кислотная» агглютинация.

В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний реакцию агглютинации очень часто применяют как для идентификации видов и сероваров бактерии с помощью диагностических агглютинирующих сывороток, так и для определения присутствия антител в сыворотке больного по известным антигенам (диагностикумам), т. е. для серодиагностики.

Количество агглютинирующих антител в иммунной сыворотке оценивается их титром — наибольшим разведением сыворотки, в котором еще наблюдается .выраженная (++) реакция агглютинации со взвесью бактерий.

При различных инфекционных заболеваниях накопление специфических антител в сыворотке вдет с неодинаковой скоростью и достигает разных величин. В связи с этим принято говорить о диагностическом титре антител—той величине титра, при которой можно с уверенностью поставить серологический диагноз заболевания в определенный его период. При многих инфекциях наиболее надежным диагаостическим признаком считается не наличие антител, а нарастание их титра в динамике заболевания, которое выявляется путем постановки серологических реакций с парными сыворотками, т. е. полученными дважды от одного и того же больного.

Реакция агглютинации внешне проявлется по-разному в зависимости от величины клеток, наличия жгутиков у бактерий и антител к ним.

При работе с растворимыми, мелкодисперсными антигенами применяют реакцию непрямой, или пассивной, гемаг- глю тинации (РПГА). Антиген предварительно адсорбируют на инертных монодисперсных частицах или клетках, например на эритроцитах, готовят эритроцитарный диагностикум. Такие нагруженные антигеном эритроциты склеиваются под действием иммунной сыворотки, содержащей антитела к данному антигену (РПГА). Реакция отличается высокой чувствительностью и позволяет выявлять сравнительно небольшие концентрации антител в исследуемых сыворотках. При необходимости обнаружения антигена в исследуемом материале эритроциты предварительно нагружают специфическими антителами и также ставят РПГА.

При помощи РПГА определяют полные (бивалентные) антитела. Неполные (моновалентные, блокирующие) антитела не выявляются этим методом, так как, соединяясь с антигеном, блокируют его, но не могут вызвать агрегации, частиц в крупные конгломераты. Для выявления неполных, например антирезусных, антител в исследуемой сыворотке используют специальную реакцию — пробу с антиглобу- линовой сывороткой, которая получила название реак - 108

ции Кумбса. Реакция проходит в два этапа： 1) связывание эритроцитами (резус +) неполных антиэритроцитарных антител, содержащихся в сыворотке крови； 2) агглютинация эритроцитов при добавлении антиглобулиновой сыворотки в результате ее взаимодействия с фиксированными на эритроцитах неполными антителами — иммуноглобулинами.

Задание для выполневия лабораторной работы

Поставить развернутую реакцию агглютинации в пробирках для определения титра специфических антител в сыворотке, полученной от кролика на предыдущем занятии.

Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью идентификации изучаемых бактерий. Объяснить отрицательные результаты в контрольных пробирках, исходя из необходимого сочетания ингредиентов, участвующих в реакции агглютинации.

Отметить результаты РПГА： а) определить титр специфических антител в сыворотке крови по результатам РПГА и б) присутствие специфического антигена в исследуемом материале от больного по результатам РПГА. Объяснить необходимость контролен в РПГА.

Отметить результаты реакции Кумбса： определить титр неполных анти- резусных антител в сыворотке беременной женщины. Объяснить, какие конт- роли должны сопровождать реакцию Кумбса.

Методические указания

Получение иммунной сыворотки. Из уха или сердца кролика на 7-й день после окончания иммунизации берут кровь, помещают в термостат при 37℃ на 10—15 мин. После свертывания крови сгусток отслаивают от стенок пробирки стеклянной палочкой и выдерживают при 4℃ в течение часа для лучшей ретракции сгустка и более полного отделения сыворотки. Затем сыворотку осторожно отсасывают пипеткой.

Титрование исследуемой сыворотки. Схема постановки реакции агглютинации для определения титра антител приведена в табл. 16. Сначала готовят основное разведение сыворотки, которое в зависимости от титра может составлять 1 ：50, 1:100 или 1 ： 1000. Затем делают серию разведений сыворотки путем последовательного переноса 1 мл из предыдущей пробирки в следующую пробирку ряда. Из последней пробирки 1 мл разведенной сыворотки удаляют для сохранения одинакового объема. В контрольную пробирку (контроль антигена) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В каждую пробирку с разведениями сыворотки и в контрольную пробирку вносят пастеровской пипеткой по 2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки

Результаты

Рис. 51. Реакция агглютинации.

а — плохо выраженная; б — хорошо выраженная.

м перемешиают круговыми движениями в каждой капле до получения равномерной взвеси. Стекло можно слегка подогреть, высоко держа над пламенем горелки в течение 2—4 мин. Реакция протекает быстро. Наблюдают за появлением зерен агглютината в каплях. Учет производят через 3—5 мин (рис. 52).

РПГА. Реакцию используют либо для выявления специфических антител в сыворотке больного при серодааг； ностике, либо для идентификации неизвестного возбудителя или индикации его антигенов в исследуемом

патологическом материале. Соответственно используют стан

дартные (коммерческие) эритроцитарные диагностикумы или суспензионные антитела, полученные путем сенсибилизации обработанных танином (танизированных) эритроцитов антителами. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения сыворотки больного, ориентируясь на диагностический титр. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем (0,05 мл) 3% суспензии нагруженных антигеном эритроцитов —соответствующего эритроцитарного диагностикума. Через 2 ч инкубации при 37℃ учитывают результат, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивание)： отрица- тельная реакцн牙一осадок эритроцитов в виде компактного диска или колечка с ровными краями на дне лунки, положительная реакция — характерный кружевной вид осадка эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями (рис. 53).

Реакция Кумбса. Для выявления неполных антител, например к резус-антигену эритроцитов в сыворотке беременной, реакция ставится в два этапа: ,1) к двукратным разведениям испытуемой сыворотки добавляют эритроциты, содержащие резус-антиген, и выдерживают при 37℃ в течение часа; 2) к тщательно отмытым после первого этапа эритроцитам добавляют кроличью античеловеческую антиглобулиновую сыворотку (в заранее оттитрованном рабочем разведении). После инкубации в течение 30 мин при 37℃ результаты оценивают по наличию гемагглютинации (положительная реакция). Контроли ингредиентов реакции: 1) антиглобулино- вая сыворотка + заведомо сенсибилизированные эритроциты;

Рнс. 52. Реакция агглютинации на стекле.

а — наличие агглютинации； А — отсутствие агглютинации.

>>>>>>三+[三+[

>>>

>>>

三

+[

三

+[

(схема).(схема).Рнс. 53. Реакция пассивной гемагглютинации

(схема).

(схема).

Эр — эритроциты； Аг — антиген; Ат — антитело.

нормальная сыворотка + эритроциты + антиглобулиновая сыворотка; 3) исследуемая сыворотка + эритроциты (без ре- зус-антигена) + антиглобулиновая сыворотка (рис. 54).

Тема 19. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ И ЕЕ ВАРИАНТЫ.

ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД

Программа занятий

Реакция преципитации： механизм, варианты постановки (кольиепреци- питация, преципитация в геле, иммуноэлектрофорез) и их диагностическое применение.

Иммунофлюоресцентный метод Кунса.

3画

Рнс. 54. Реакция Кумбса (схема).Рнс. 54. Реакция Кумбса (схема).Неполные Лтанти Rh

Рнс. 54. Реакция Кумбса (схема).

Рнс. 54. Реакция Кумбса (схема).

Реакция преципитации характеризуется осаждением специфических мелкодисперсных антигенов эквивалентным количеством антител в присутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса антиген — антитело в виде осадка наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингредиентов. Образовавшийся комплекс может раствориться в избытке антигена или антител. Антиген должен иметь характер прозрачного коллоидного раствора.

В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний реакция преципитации служит главным образом для выявления или идентификации антигена (преципитиногена) по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела (преципитины). Для приготовления коллоидных антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные методы их экстракции из исследуемого материала: физические, химические и биологические.

Рис. 55. Иммунофлюоресцентный метод Кунса (схема).

а — прямой метод; б — непрямой метод; АГ — антиген； Ат — антитело; АГС — антигло- булиновая сыворотка.

Иммунофлюоресцентный метод. Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфицированных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Иммунофлюоресцентный метод относится к экспресс-диагностике, не уступая другим серологическим реакциям по чувствительности и специфичности (рис. 55).

Рнс. 56. Иммунофлюоресцентный метод Кунса. Выявление вируса корн в клетках инфицированной им тканевой культуры.、

Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресценна) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

При прямом иммунофлюоресцентном методе Кунса специфические флюоресцирующие антитела, связавшиеся с микробными антигенами, образуют комплексы, которые светятся при люминесцентной микроскопии препаратов (рис. 56). Недостатком прямого метода Кунса является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток против каждого изучаемого антигена.

Непрямой метод предусматривает использование одной универсальной флюоресцирующей сыворотки — антиглобулино- вой, содержащей антитела только против кроличьих глобулинов. В связи с тем что диагн остические антисыворотки содержат кроличьи глобулины (так как их получают путем иммунизации кроликов), они реагируют с флюоресцирующей анхиглобулиновой сывороткой в качестве антигена и вместе с тем соединяются с гомологичным исследуемым антигеном (микроорганизмом) как антитела. При этом на образовавшемся комплексе (специфические антитела+исследуе- мый антиген) фиксируются флюоресцирующие антиглобули- новые антитела, вызывая его свечение при люминесцентной микроскопии.

Демонстрация

Иммунофлюоресцентный метод Кунса.

Иммуноэлектрофореграммы.

Задание для выполнення лабораторной работы

Отметить результаты титрования сыворотки, проведенного на предыдущем занятии, определить титр антител и объяснить отрицательные результаты в контрольных пробах, исходя из необходимости сочетания ингредиентов, участвующих в реакции агглютинации.

Поставить реакцию кольцепреципитации для определения природы антигена в исследуемом материале. Объяснить отрицательные результаты в контрольных пробирках.

Отметить результаты реакции преципитации в геле, поставленной с целью определения токсигенностн дифтерийной палочки с помощью антитоксической сыворотки.

Методические указания

Реакция преципитации. Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды и чистых культур бактерий. Один из распространенных методов хими-

ческой экстракции антигенов бактерий — получение комплексного антигена по Ъуавену с помощью гидролиза бактерий трихлоруксусной кислотой. В реакции используются П1юзрач- ные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата — помутнения.

Реакция кольцепреципитации. Ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2-Ч)3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно, по стенке, держа пробирку в наклонном положении, наслаивают 0,1-Ч),2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Результаты опыта протоколируют (табл. 17).

Таблица 17 Реакции преципитации с буавеновскнм антигеном (форма протокола)

Ингредиенты, мл№ пробирки

1

2

3

4

Тифозная антисыворотка

ел

—

—

—

Дизентерийная»

—

0』

—

Нормальная сыворотка

Изотонический раствор

—

0,1

хлорида натрия

—

—

0,1

Исследуемый антиген

0,1

0,1

0,1

0,1

Результаты

Учет реакции производят через 1—2 мин. В случае положительной реакции в первой пробирке на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В остальных (контрольных) пробирках преципитат не образуется (рис. 57).

Реакция преципитации в геле (агаре). Чашки заливают агаром, в котором вырезают несколько луночек на равном расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят сыворотку, содержащую антитела, в остальные — различные испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях. При диффузии реагентов в агаре в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и антител образуются мутные полосы — дуги преципитации (рис. 58).

Рис. 57. Реакция преципитации.

/ — преципитирующая сыворотка + исследуемый материал； 2 — преципитирующая сыво- ротм + гомологичный преципитиноген； 3 — преципитирующая сыворотка + контрольный экстракт без антигена； 4 — преципитирующая сыворотка + изотонический раствор хлорида натрия； 5 - нормальная сыворотка + исследуемый антиген； , - нормальная сыворотка + + контрольный экстракт без антигена.

В случае постановки реакции преципитации с различными разведениями антигена можно установить титр преципитиру- ющей сыворотки — максимальное разведение антигена, которое дает преципитацию с данной сывороткой. Одна из разновидностей реакции преципитации в геле позволяет определять токсигенность исследуемых бактерий (например, дифтерийной палочки) с помощью антитоксической сыворотки. Для этого в чашку Петри на питательную среду помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Затем чашку подсушивают в термостате и засевают испытуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги, на рассто5шии 0,D,8 см от ее края. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. Чашки инкуби- руют при 37℃ в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации в виде дуг (рис. 59).

Иммуноэлектрофорез. Исследование проводится в два этапа: 1) электрофоретическое разделение исследуемого материала в агаре; 2) иммунологический анализ. В агаре параллельно оси миграции электрофоретических фракций вырезают траншеи, в которые вносят иммунную сыворотку, содержащую антитела к исследуемым антигенам. В случае реакции между антигенами и диффундирующими в агар антителами формируется преципитат в виде дискретных дуг, соответст-

Рнс. 58. Реакция преципитации в геле по Оухтерлони.

вующих индивидуальным системам антиген—антитело (см. рис. 58).

Иммунофлкюресцентный метод. На предметном стекле готовят мазок из испражнений больного ко- лиэнтеритом, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной сывороткой, содержащей антитела к возбудителям колиэнтерита. Для образования комплекса антиген — антитело препа

рат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37℃ в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия — удаляют несвязавшиеся с антигеном антитела. Затем на препарат наносят флюорес

цирующую антиглобулиновую сыворотку, выдерживают в течение 15 мин при 37℃ и препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

Тема 20. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ. РЕАКЦИЯ ЛИЗИСА.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

Для постановки реакции лизиса и реакции связывания комплемента (РСК) используют комплемент, который содержится в сыворотке крови морских свинок. Гемолитическая активность комплемента термолабильна и полностью утрачивается при прогревании сыворотки в течение 30 мин при 56℃. При адсорбции комплемента на комплексе антиген — антитело его действие проявляется в реакции лизиса антигена, если это клетки, или не сопровождается никакими видимыми изменениями, если это мелкодисперсные или растворимые антигены. Для учета результатов данной реакции РСК вводят вспомогательную (индикаторную) гемолитическую систему. Она состоит из взвеси эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической

Рве. 59. Определение токсигенности коринебактерий дифтерии в реакции преципитации в агаре.

>еыворотки кролика, полученной путем его иммунизации упомянутыми эритроцитами. Положительная РСК характеризуется задержкой гемолиза вследствие адсорбции комплемента системой антиген — антитело (рис. 60). Отрицательная РСК характеризуется наличием гемолиза, поскольку свободный комплемент связывается с системой эритроциты барана — гемолитическая сыворотка кролика. РСК обладает высокой чувствительностью Я специфичностью, что позволяет использовать ее для серодиагностики многих заболеваний, а также для выявления антигенов в крови больного. Кроме того, ее применяют для идентификации бактерий, вирусов и других антигенов.

Для постановки РСК требуется точное определение количественных соотношений всех ингредиентов, участвующих в реакции: исследуемой сыворотки, антигена, комплемента, гемолитической сыворотки кролика и эритроцитов барана. Поэтому постановке основного опыта предшествуют титрование гемолитической сыворотки и выбор ее рабочего разведения, титрование комплемента и выбор его рабочей дозы, титрование других ингредиентов.

Пр01фамма занятия

Реакция лизиса (гемолиза).

РСК： механизм, роль отдельных ингредиентов, техника постановки и диагностическое применение.

Задание для выполнения лабораторной работы

Отметить результаты титрования комплемента и рассчитать рабочую дозу для постановки РСК.

Отметить результаты титрования гемолитической сыворотки и рассчитать рабочее разведение для приготовления гемолитической системы.

Поставить РСК (первую и вторую фазы) для определения присутствия специфических антител в испытуемой сыворотке по известному антигену. Объяснить результаты контрольных проб н необходимость их постановки, исходя из механизма РСК.

Гемолиза нетГемолиза нетисследуемая+ сыио(ютка> +"нетисследуемая+ сыио(ютка> +"нет_— РСК отрицательная_— РСК отрицательнаягемолизгемолиз

Гемолиза нет

Гемолиза нет

исследуемая

+ сыио(ютка> +"нет

исследуемая

+ сыио(ютка> +"нет

_— РСК отрицательная

_— РСК отрицательная

гемолиз

гемолиз

Рнс. 60. Реакция связывания комплемента (схема).

Лг — антиген; Атп — антитело； Эр — эритроциты; Гем. сыв. — гемолитическая сыворотка.

Методические указания

Приготовление и титрование ингредиентов для РСК. Комплемент. Для определения титра и рабочей дозы производят титрование комплемента с помощью реакции иммунного гемолиза. Для этого свежую сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида натрия от 1:10 до 1:40 (табл. 18). К 0,2 мл каждого разведения комплемента добавляют по 04 мл гемолитической системы (смеси равных объемов 3% суспензии эритроцитов в(изотоническом растворе хлорида натрия н гемолитической сыворотки в разведении, соответствующем ее тройному титру). Пробирки выдерживают при 37℃ и через 30 мин определяют титр комплемента —наибольшее разведение комплемента, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочую дозу комплемента рассчитывают, исходя из его титра. Рабочая доза комплемента должна быть выше титра на 25 %. Так, например, при титре комплемента 1:20 в качестве рабочей дозы берут его предыдущее разведение 1:15 (см. табл. 18).

Таблица 18. Тнтровавне комплемента (форма протокола)

Ингредиенты, мл

№ пробирки

1

2

3

4

5

6

7

8

Комплемент в разведе* нии 1:5

Изотонический раствор

03

0,2

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

—

хлорида натрия

03

0,4

03

0,4

0,5

0,6

0,7

0,2

Избыток, который удаляется из пробирки Получаемые разведения

0,4

0,4

0,2

03

0,4

0,5

0.6

—

комплемента

1 : 10

1:15

1:20

1:25

1:30

1:35

1:40

—

Г емолитическая система

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

Инкубация при 37℃ в течение 30 мин

Результаты

Антигены изготовляются “производственными институтами из взвесей убитых микробов, лизатов микробов, полных антигенов, гаптенов, экстрактов тканевых липидов.

Взвесь эритроцитов барана получают из дефибри- нированной крови барана, отмывая эритроциты изотоническим раствором хЯорида натрия до полной бесцветности и прозрачности над осадочной жидкости, и готовят из них 3 % взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия.

Гемолитическая сыворотка, приготовленная путем 3—4-кратной внутривенной иммунизации кролика 50% взвесью бараньих эритроцитов, инактивирована при 56℃ (разрушен комплемент) и на этикетке ампул имеет обозначенный титр — максимальное разведение данной сыворотки, которое обеспечивает полный лизис 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента при 37℃ в течение часа (рис. 61). Для РСК в качестве рабочей дозы берут гемолитическую сыворотку в тройном титре.

Постановка основного опыта. После установления титра и рабочих доз всех ингредиентов ставят основной опыт РСК (табл. 19). Испытуемую и контрольные сыворотки предварительно инактивируют нагреванием при 56℃ в течение 30 мин. Стандартная схема постановки РСК предусматривает проведение первой фазы — соединение антигена, испытуемой сыворотки и комплемента при 37℃ в течение 30 мин. При постановке РСК на холоду эту фазу проводят при 0Т℃ в течение 18—20 ч, что повышает чувствительн ость реакции.

Таблица 19. Освоваой опыт реакция связывания комплемевта (форма протокола)

Ингредиенты, мл

№ пробирки

1

2

3

4

5

6

7

Испытуемая сыворотка в разведении 1 :5

0,2

0,2

Положительная сыворотка

0,2

—

Отрицательная»

—

0,2

—

—

Антиген

0,2

0,2

0,2

—

02

—

Изотонический раствор хлорида натрия

0,2

0,2

0,4

0,6

Комплемент в рабочей дозе

0,2

0,2

0,2

0,2

од

0,2

—

Инкубация на холоду при 0-4℃ в течение 18—20 ч или при 37℃ в течение 30 мин

Г емолитическая система

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

Инкубация при 37℃ в течение 20—30 мин

Результаты

После добавления в каждую пробирку по 0,4 мл гемолитической системы пробирки встряхивают и выдерживают 20—30 мин при 37℃. Результаты опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках (см. табл. 19): реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной — при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая кровь»). Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне ( I +1 匕 +-Н-, -Н-, +).

В качестве контроля (2-я и 3-я пробирки) учитывают реакцию с заведомо положительной и заведомо отрицательной сыворотками; 4-я и 5-я пробирки служат для проверки анти- комплементарных свойств сыворотки и антигена; в 6-й и 7-й пробирках контролируется качество комплемента и гемолитической системы.

Тема 21. ВАКЦИНЫ И ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ

Программа занятия

Способы приготовления вакцин.

Получение диагностических и лечебно-профилактических сывороток.

Вакцинами называются препараты, предназначенные для создания искусственного активного иммунитета. Некоторые вакцины применяют для лечения инфекционных заболевании. Вакцины делят на живые и убитые, корпускулярные и химические. К вакцинным препаратам относятся также анатоксины.

Живые* вакцины готовят из микроорганизмов, обладающих стойко сниженной вирулентностью, но сохранивших иммуногенные свойства. Убитые (температурой или действием химических веществ) корпускулярные вакцины содержат инактивированные микроорганизмы. Химические вакцины готовят из антигенов, экстрагированных из бактериальных клеток химическими методами. Анатоксины готовят из экзотоксинов, обезвреженных формалином.

Вакцины выпускают в жидком и сухом виде. Сухие вакцины состоят из микроорганизмов, высушенных методом лиофилизации.

Все вакцинные препараты подлежат государственному контролю для установления их безвредности, иммуногенности и стерильности (для убитых вакцин). Признаками негодности вакцин являются наличие посторонних частиц и хлопьев, изменение физических свойств и цвета, повреждение ампулы и др.

Иммунные сыворотки делятся на лечебно-профилактические и диагностические. Лечебно-профилактические сыворотки и иммуноглобулины получают из крови гипериммунизированных лошадей или крови иммунизированных или переболевших людей.

Диагностические сыворотки получают путем иммунизации кроликов. Эти сыворотки подразделяются на агглютинирующие, преципитирующие и гемолитические; применяются для постановки серологических реакций с целью идентификации микроорганизмов.

Демонстрация

Различные виды вакцин, анатоксинов, иммуноглобулинов и иммунных сывороток. Адъюванты.

Задание для выполнения лабораторной работы

Приготовить стафилококковую аутовакцину.

Определить силу антитоксической сыворотки по известному токсину с помощью реакции нейтрализации токсина антитоксином (реакция флоккуляции).

Таблица 20. Реакция флоккуляции (форма протокола)

Ингредиенты, мл

№ пробирки

1

2

3

4

5

6

7

Токсин, содержаихий 20 Lf в 1 мл

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

2,0

Исследуемая сыворотка

0,2

03

0,4

0,5

0,6

0,6

Инкубация при 45℃ в течение 30 мин

Результаты по «инициальной» флоккуляции

Этапы приготовления стафилококковой аутовакцины. Убитую аутовакцину приготовляют из штамма возбудителя, выделенного непосредственно от больного

Посев стафилококка в пробирку со скошенным питательным агаром.

Проверка чистоты выросшей культуры (микроскопия мазка).

Получение маточной взвеси микробных клеток путем смыва культуры 5 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Прогревание бактериальной взвеси на водяной бане при 70—80℃ в течение часа.

Контроль на стерильность (высев из прогретой • взвеси на питательные среды).

Стандартизация вакцины по оптическому стандарту： 1 мл прогретой микробной взвеси разводят определенным количеством стерильного изотонического раствора хлорида натрия, сравнивая ее мутность с мутностью оптического стандарта (1 млрд/мл)； остальной объем взвеси бактерий разводят, добавляя соответствующее количество изотонического раствора хлорида натрия.

Реакция флоккуляции. В результате взаимодействия токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя («инициальная») флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях.

Реакцию ставят в два этапа. 1. По стандартной сыворотке устанавливают количество Lf (Limes flocculationis) в 1 мл токсина. Lf токсина определяется его количеством, которое дает «инициальную» флоккуляцию с международной единицей (ME) сыворотки. Установив силу токсина, приступают к определению силы сыворотки.

Известной силы токсин и испытуемую антитоксическую сыворотку разливают в пробирки в определенном объеме, как показано в табл. 20. Пробирки выдерживают в водяной бане при 45℃ в течение 30 мин до выпадения^ хлопьев в одной из них. «Инициальная» флоккуляция проявляется в той пробирке, где количество токсина соответствует количеству международных единиц сыворотки. Например, если флоккуляция произошла в 3-й пробирке, значит в 0,4 мл сыворотки находится 40 ME. Следовательно, 1 мл сыворотки содержит 40:0,4 = 100 ME.

ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ВАЖНЕЙШИХ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

В данном разделе изложена лабораторная диагностика бактериальных, грибковых и вирусных инфекций, которая проводится для установления этиологическо й и патогенетическо й роли выделенных из организма больных микробов, определения иммунологических сдвигов и аллергических состояний, выбора эффективных химиотерапевтических и иммунологических препаратов. Особое значение при этом имеет диагностика заболеваний, вызванных условно-патогенными бактериями и грибами рода Candida, развитие которых связано с резким снижением иммунологической реактивности организма, интенсивной антибиотикотерапией и другими причинами. Подобные инфекции нередко возникают у больных, госпитализированных в хирургические, терапевтические, детские и другие отделения, а также среди новорожденных в акушерских клиниках. В этих случаях инфекции называют внутрибольничными, или госпитальными, а раздел микробиологии^ изучающий условно-патогенные и некоторые патогенные бактерии — возбудители госпитальных и других форм инфекций, — клинической микробиологией.

С целью приближения проводимых студентами диагностических микробиологических исследований к практической деятельности лечащего врача и решения частных вопросов клинической микробиологии рассматриваемые микроорганизмы сгруппированы с учетом патогенетических и эпидемиологических признаков вызываемых ими заболеваний и подразделены на возбудителей раневых, гнойных, воздушно-капельных, кишечных, зоонозных, кровяных, трансмиссивных и венери< ческих инфекций. Это дает возможность обосновать выбор материала и направление микробиологического исследования,

исходя из предварительного клинического диагноза болезни.

Полученные лабораторные данные необходимы лечадему врачу для постановки окончательного диагноза заболевания и назначения рациональной антибиотико- и иммунотерапии. Врач- эпццемиолог использует результаты микробиологических и иммунологических исследований для проведения эпвдемиологи- ческого анализа заболеваемости с целью установления источника инфекции, путей ее передачи, выявления микробоносителей и других целей.

Материал для исследования

Выбор материала определяется прежде всего предварительным клиническим диагнозом заболевания и его стадией, что решает лечащий врач. В зависимости от стадаи болезни микроорганизмы могут находиться в зеве, носоглотке, лимфатических узлах, крови, кишечнике и выделяться в окружающую среду с мокротой, фекалиями, мочой. Так, например, при брюшном тифе и паратифах бактерии в начале болезни содержатся в крови, а затем выделяются с испражнениями и мочой； при полиомиелите вирус в первой стадии болезни вьзделяется с испражнениями, а затем в течение короткого срока обнару» живается в крови； при сепсисе микроорганизмы всегда находятся в крови； при респираторных инфекциях бактерии и вирусы, как правило, выделяются с мокротой, априкишечных — с испражнениями.

Существенное значение для оценки полученных лабораторных данных имеет характер исследуемого материала. Так, например, выделение микроорганизмов из стерильных (у здоровых людей) жидкостей (кровь, перитонеальная, плевральная, спинномозговая жидкость, моча, взятая катетером из мочевого пузыря) свидетельствует об инфекционном заболевании. В то же время выделение микроорганизмов из испражнений, мокроты, со слизистой оболочки зёва, из мочеполовых путей, с поверхности кожных и слизистых покровов требует их обязательной дифференциации от нормальной микрофлоры соответствующих полостей и органов. При этом сами представители нормальной микрофлоры, являющиеся условно-патогенными, могут явиться возбудителями болезней.

При взятии исследуемого материала от больных людей или бактерионосителей требуется соблюдение определенных правил.

Материал следует брать до применения антибиотиков или других химиотерапевтических препаратов.

Материал нужно брать в достаточном количестве, соблю-

дая правила асептики, чтобы не загрязнить его микроорганизмами окружающей среды. Взятие стерильного материала (кровь и др.) производят так, чтобы не загрязнить его микроорганизмами —представителями нормальной микрофлоры организма человека.

При гнойно-воспалительных процессах гной собирают из глубины раны； при респираторных заболеваниях берут гнойные комочки мокроты или собирают промывные воды бронхов, или исследуют кусочки ткани, взятые при биопсии； при болезнях мочевыводящих путей собирают среднюю порцию мо^и или берут мочу из мочевого пузыря катетером; при кишечных инфекциях собирают кал в стерильные банки, а также берут промывные воды желудка и желчь, которую получают при зондировании； при венерических заболеваниях материал берут из уретры или половых органов после обмывания их водой с мылом у мужчин и спринцевания (без применения антисептиков) у женщин; материал из зева и носоглотки берут специальными тампонами, которые помещают в стерильную пробирку, или производят посев у постели больного. Посев стерильного материала (кровь и другие не содержащие микробов жидкости у здоровых лиц) также лучше делать у постели больного. Для серодиагностического исследования берут кровь из пальца или вены, из которой в лаборатории получают сыворотку.

Исследуемый материал в возможно короткие сроки следует доставить в бактериологическую, микологическую, вирусологическую или серологическую лабораторию. Его доставка должна производиться в лабораторной посуде или специальных контейнерах при сохранении первоначальной температуры материала, или при охлаждении, замораживании сухим льдом (в зависимости от характера материала). Любой метариал, направляемый в лабораторию, должен сопровождаться соответствующим направлением, в котором указываются фамилия, имя и отчество больного, вид материала и дата его взятия, предварительный клинический диагноз заболевания.

Направления и методы исследования

Выбор направления исследования зависит от предварительного клинического диагноза заболевания, основанного на предположении лечащего врача о возможной природе болезни — бактериальной, микозной или вирусной. В зависимости от этого применяют соответствующие методы исследования. Все методы клинической микробиологии и иммунологии можно разделить на четыре группы： 1) микроскопические (бактериоскопические, вирусоскопические); 2) микробиологические (бактериологические, микологические, вирусологические); 3) биологические, или биопробы； 4) иммунологические (серодиагностика, кожно-аллергические пробы, тесты для оценки иммунологического состояния организма). Перечисленные методы отличаются друг от друга трудоемкостью, сроками проведения исследований, чувствитель-

ностью и специфичностью, а также информативностью полученных данных.

Микроскопический метод. Применяется главным образом для обнаружения бактерий и п)ибов в патологическом материале. Вирусоскопическое исследование проводится редко и с ограниченными целями, в частности для обнаружения элементарных вирусных частиц и их включений： телец Бабеша—Негри при бешенстве, телец Пашена и Гварниери при оспе, риноцитоско- пическое исследование при гриппе.

Основным недостатком микроскопического метода является сложность идентификации обнщ)уженных микробов, а в некоторых случаях невозможность их дифференциации (например, кишечной палочки от сальмонелл или шигелл). При некоторых бактериальных инфекциях и микозах диагностическая ценность микроскопического исследования весьма велика и является основанием для постановки окончательного диагноза заболевания, например лептоспироза, возвратного тифа, первичного сифилиса, гонореи, дерматомикозов, кандидозов, глубоких микозов. Преимущество микроскопического исследования состоит в том, что для его проведения требуется всего не более 30-60 мин.

Достоверность микроскопического метода значительно повышается при проведении иммунофлюоресцентного исследования, которое придает ему специфичность. В настоящее время иммунофлюоресцентный метод (ИФМ) широко применяется для обнаружения разнообразных микроорганизмов в патологическом материале.

Микробиологические • (бактериологический, микологический, в^усологический) методы. Основаны на выделении чистой культуры возбудителя и ее последующей ицентификации на основании морфологических, культуральных, биохимических, антигенных (серологических) и других признаков. Микробиологическая диагностика осложняется в случае выделения не одной, а двух и более культур патогенных или условно-патогенных бактерий. Располагая чистой культурой бактерий, можно определить ее патогенные признаки в опытах на животных или in vitro, а также чувствительность к антибиотикам.

Микологические исследования осуществляются реже, чём бактериологические, поскольку микроскопическая диагностика микозов достаточно надежна. Микологические исследования проводят при диагностике кандидозов путем определения нарастания количества клеток дрожжеподобных грибов рода Candida, а также глубока микозов.

Вирусологический метод является наиболее достоверным в диагностике вирусных инфекций. Однако его трудоемкость.

связанная с приготовлением клеточных культур, обработкой исследуемого материала, а также со сравнительно частым получением отрицательных результатов, органичивает применение данного метода. Кроме того, он требует затраты сравнительно большого времени, особенно при проведении «слепых» пассажей. Во многих случаях вирусологический метод используют для ретроспективной диагностики вирусных инфекций.

Все микробиологические исследования наиболее информативны и достоверны, особенно если они подтверждены дополнительными серологическими данными (выявление антител к выделенному возбудителю или возбудителям).

Для эпидемиологического анализа вспышек бактер иальных инфекций проводят типирование культур, выделенных от разных больных и из других источников (вода, пищевые продукты и т. д.) с целью установления их биовара, серовара, фаговара на основании изучения биохимических, антигенных особенностей или чувствительности к фагам соответственно.

Кроме того, микробиологические исследования проводят для выявления бактерионосителей среди детей и взрослых, в том числе работников медицинских и пищевых учреждений.

Биопробы. Основаны на неодинаковой чувствительности разных лабораторных животных к определенным микроорганизмам. Данный метод заключается в заражении животных определенного вида, возраста и массы тела чистыми культурами микробов или исследуемым материалом. В первом случае биопробы используются для дифференциации патогенных микроорганизмов, одни из которых вызывают заболевание или гибель этих животных, другие не оказывают подобного действия. Во втором случае биопробы применяют для выделения чистой культуры возбудителя из патологического материала, загрязненного посторонними микроорганизмами, в результате чего посевы данного материала на питательные среды не дают положительного результата. Кроме того, биопробы применяются для изучения вирулентности выделенной чистой культуры.

Иммунологические методы. Включают серодиагностику, кожно-аллергические пробы, методы оценки клеточного (Т- системы) и гуморального (В-системы) иммунитета.

Серодиагностика основана на обнаружении специфических антител в сыворотке крови больного человека и определении накопления их в процессе заболевания. В последнем случае сроки исследования значительно удлиняются и ответ может быть получен из серологической лаборатории в период

реконвалесценцйи, что придает данному методу ретроспективный характер.

Особое значение серологическое исследование имеет в лабораторной диагностике вирусных заболеваний в связи с серьезными трудностями, возникающими при выделении многих вирусов из организма человека и их последующей идентификации. Серологические исследования часто проводятся и для эпидемиологического анализа инфекционной заболеваемости. С этой целью определяется наличие специфических антител У здоровых лиц, что свидетельствует о перенесении ими соответствующей инфекции или во всяком случае о контакте с ее возбудителем.

Кожно-аллергические пробы применяются для выявления гиперчувствительности к различного рода антигенам (аллергенам) при диагностике ряда инфекционных заболеваний (туберкулез, бруцеллез, туляремия и др.), а также атопий и других неинфекционных аллергических состояний.

Методы оценки иммунологического состояния организма чело века включают ряд тестов, по которым судят о количестве и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов.

После изучения частной и клинической микробиологии и иммунологии студенты должны уметь использовать приобретенные знания для оценки роли микроорганизмов в этиологии и патогенезе бактериальных, грибковых и вирусных заболеваний, а также четко представлять себе информативность микробиологических н иммунологических методов лабораторного анализа в соответствии с этапами течения болезни.

ВОЗБУДИТЕЛИ РАНЕВОЙ И ГНОЙНОЙ

ИНФЕКЦИИ

В настоящее время раневая и нераневая гнойная инфекция чарю встречается в хирургической, акушерско-гинекологической, терапевтической, педиатрической и других клиниках. Нередко она носит характер внутрибольничной (госпитальной) инфекции. В озбудителями раневой и гнойной инфекции явля- ются различные бактерии, которые относятся к разным порядкам, семействам, родам и видам. Среди них — аэробные и анаэробные формы, грамположительные и грамотрицательные палочки и кокки (табл. 21).

Несмотря на разное систематическое положение, перечислен- ные в табл. 21 бактерии обладают общей патогенетической особенностью — способностью вызывать гнойно-воспалитель-

б*

Таблица 2L Возбудятеля раневой инфекции и гнойно-воспалительных процессов

Аэробные бактерии

Анаэробные бактерии

Staph, aureus и другие виды

Str. pyogenes

Str. faecalis

Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка)

E. coli

Cl. perfringens

CL oedematiens и другие возбудители раневой анаэробной инфекции (газовой гангрены)

Clostridium teuni — возбудитель столбняка

Peptococcus sp.

Peptostreptococcus sp.

Bacteroides sp.

Veillonella sp.

ные процессы. Они поражают различные органы респираторного, кишечного, мочеполового трактов, кожные покровы, вызывают сепсис. Некоторые из них являются возбудителями не только гнойных инфекций, но и таких нозологических форм заболеваний, которые не сопровождаются выраженным гнойновоспалительным процессом. Например, стрептококки вызывают скарлатину, катаральную ангину, гломерулонефрит, рожистое воспаление наряду с типичными гнойными инфекциями — стрбптодермиями, флегмонами.

Стафилококки, стрептококки, протей, кишечная палочка и анаэробные бактерии нередко вызывают смешанную инфекцию в разнообразных сочетаниях как между собой, так и с другими микроорганизмами — вирусами, грибами.

При локальных поражениях материалом для исследования служит гной или другое отделяемое, а при генерализованных формах инфекции (сепсис, септикопиемия) — кровь, стерильно взятая для посева из вены. Вследствие того что возбудители раневой и гнойной инфекции являются как аэробными, так и анаэробными бактериями, их выделение из исследуемого материала требует применения разных методов. Аэробные бактерии (стафилококки, стрептококки, псевдомонас, протей и эшерихии) выделяют в обычных условиях, используя для посевов соответствующие питательные среды. Анаэробные бактерии (бактероиды, пептококки и вейллонеллы) выделяют в строго анаэробных условиях, соблюдая определенные правила взятия материала, посевов на питательные среды и их инкубирования в анаэробных условиях.

Тема 22. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ СТАФИЛОКОККАМИ И СТРЕПТОКОККАМИ

Гнойную инфекцию чаще всего вызывают стафилококки (сем. Micrococcaceae), которые относятся к виду Staph, aureus, реже к видам Staph, epidermidis и Staph, saprophyticus, стрептококки (сем. Streptococcaceae) — Str. pyogenes. Str. faecalis, реже Str. pneumoniae. Кроме того, при стоматологических заболеваниях встречаются Str. sanguis. Str. mutans. Str. mitis и др.

Программа занятия

Изучение схем микробиологической диагностики стафилококковых и стрептококковых инфекций.

Бактериоскопическая и бактериологическая диагностика заболеваний, вызванных стафилококками и стрептококками.

Выявление источников заражения при внутрибольничной стафилококковой инфекции.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты.

Демонстрация

Мазки из чистых культур стафилококков и стрептококков.

Стафилококки и стрептококки в мазках из гноя.

Рост а- и р-гемолитических стрептококков на кровяном агаре.

Определение серогруппы стрептококка в реакции преципитации с сыворотками А, В, С, D.

Этапы бактериологического исследования при сепсисе.

Антистрептоли жновая реакция с О-стрептолизином.

Международный набор стафилококковых фагов, стафилококковая аутовакцина, стафилококковый анатоксин, токсин Дика, преципитирующие стрептококковые сьгаоротки, сухой О-стрептолизин. Антибиотики. Лечебные стафило- фаги и стрептофаги.

Задание для выполнения лабораторной работы

Занятие 1-е

Микробиологическое исследование гноя при подозрении на стафилококковую или стрептококковую инфекцию. Материал — гной из раны (раневое отделяемое). Микробиологическое исследование для выявления источника стафилококковой внутрибольничной инфекции. Материал — мазки, взятые тампоном из зева и со слизистой оболочки носа людей (обслуживающий персонал больничного отделения), обследуемых на носительство стафилококка.

Бактериоскопическое исследование： приготовить, окрасить по Граму и микроскопировать мазки из гноя и зева. Сделать заключение и наметить план дальнейшего анализа.

Бактериологическое исследование： учесть результаты готовых посевов гноя и мазков из зева на чашки с кровяным агаром: а) описать колонии и отметить наличие гемолиза； б) приготовить, окрасить по Граму и микроскопировать мазки из колоний； в) пересеять колонию, в мазке из которой видны стафилококки, в пробирку со скошенным питательным агаром для получения

чистой культуры стафилококка и другую, содержащую цепочки кокков, колонию —на скошенный кровяной агар и сахарный бульон для получения чистой культуры пиогенного стрептококка.

Зан ятие 2-е

Продолжение бактериологического исследования гноя и мазков из зева и носа бактерионосителей： а) отметить характер роста культур в пробирке с питательным агаром, в частности наличие золотистого пигмента. Сделать мазок, окрасить по Граму и микроскопировать; б) отметить характер роста культур в пробирке с кровяным агаром (наличие гемолиза) и в пробирке с сахарным бульоном (помутнение, осадок). Сделать мазок, окрасить по Граму и микро- скопировать.

В случар выделения золотистого стафилококка： а) определить его способность продуцировать плазмокоагулазу; б) установить фаготипы стафилококков, выделенных из разных источников — больных и бактерионосителей по готовым пробам или полученным от преподавателя данным.

Отметить по готовым посевам чувствительность выделенных стафилококков к антибиотикам. Сделать окончательное заключение на основании анализа собственных, демонстрационных и полученных из лаборатории данных о видах выделенных культур стафилококка и стрептококка и об их патогенных свойст> вах. Определить источник госпитальной инфекции на основании фаготипо» выделенных от больных и носителей стафилококков.

Методические указания

Материал для исследования： гной, экссудат, раневое отделяемое, перевязочный материал, слизь из носоглотки, мазки из зева; при подозрении на сепсис — кровь.

Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций

Бактериоскопическое исследование (схема 2). Из исследуемого материала (за исключением крови) готовят мазки для первичной бактериоскопии, окрашивают по Граму и микроско- пируют. Наличие в препаратах грамположительных кокков, располагающихся в виде скоплений, напоминающих виноградные гроздья (рис. 62), позволяет поставить предварительный диагноз стафилококковой инфекции.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают петлей на чашки с кровяннм агаром и ЖСА для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37℃. На следующий день исследуют выросшие колонии на обеих средах. На кровяном агаре отмечают наличие или отсутствие гемолиза (рис. 63). На ЖСА Staph, aureus образуют золотистые круглые выпуклые непрозрачные колонии. Вокруг колоний стафилококков, обладающих лецитиназной активностью, образуются зоны помутнения с перламутровым оттенком. Для окончательного установления вида стафилококка 2—3 колонии пересевают в пробирки со скошенным питательным агаром для получения чистых культур. На следующий

E38EOHZHqyauiBhwMO

seMmos9H.ьнв X HIQOHqlmHEHAh SHHgugnIO

С2.Л ?^

Kwbrt «.M

кяьл ^.^

UEHaoJEn

ХКИПмзфШ! хпяоххохоинф，.！、Hdn «ЯЯ2О35ОН 0e^0«sheR.eK«eaMKS Z В 工 0 X。

Таблица 22. Дифферевциалъвыепризвякнстафилококков

Признак

Вид

Staph, aureus

Staph, epider- midis

Staph, sapro- phyticus

Образование:

плазмокоагулазы

+

лецитиназы

Ферментация:

глюкозы

+

+

—

маннита в анаэробных условиях

+

—

+

Образование а-токсина

+

Чувствительность к новобиоцину

S

S

R

Условные обозначения. + наличие признака; — отсутствие признака; S — чувствительный; R — резистентный.

день делают посевы с целью определения их дифференциальных признаков (табл. 22).

Постановка реакции на плазмокоагулазу. Разведенную в 2 раза плазму крови разливают по 0,4 мл в пробирки, в которые вносят одну петлю исследуемых чистых культур стафилококка, и помещают в термостат при 37℃. Через 2, 4 и 24 ч отмечают результаты опыта. При наличии плазмокоагулазы образуется сгусток.

В некоторых случаях наряду с плазмокоагулазой и лецито- вителлазой определяют другие ферменты — фибринолизин, гиалуронидазу и ставят дермонекротическую пробу на кролике. "Для этого на боку кролика выщипывают шерсть и внутрикожно вводят 0,2 мл взвеси исследуемой культуры, содержащей 2 млрд/мл клеток по оптическому стандарту? Положительный результат оценивают по появлению в месте инъекции инфильтрата, а затем (через 2478 ч) некроза.

При подозрении на сепсис делают посевы крови больного. Из локтевой вены берут шприцем 5—10 мл крови и вносят в колбу с 50—100 мл сахарного бульона. Посевы инкубируют при 37℃ в течение нескольких суток, периодически делая мазки для бактериоскопии и пересевы на кровяной агар в чашки Петри. При положительном результате выделяют чистую культуру стафилококка, которую идентифицируют по описанным выше признакам.

Для установления источника госпитальной инфекции выделяют чистые кульуры стафилококка от больных и бактерионосителей, после чего проводят их фаготипирование с помощью набора типовых стафилофагов, устанавливая идентичность фаготипов. Фаги разводят до титра, указанного на этикетке.

Каждую из исследуемых культур засевают на питательный агар в чашку Петри газоном, подсушивают, а затем петлей наносят по капле каждого фага на 22 квадрата (по числу фагов, входящих в набор), предварительно намеченных карандашом на дне чашки Петри. Посевы инкубируют при 37℃. Результаты оценивают на следующий день по наличию лизиса культуры в квадратах (см. рис. 38). Определение чувствительнючти стафилококка к антибиотикам описано в теме 12.

Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций

Бактериоскопическое исследование (схема 3). Мазки для первичной бактериоскопии готовят из патологического материала, окрашивают по Граму и микроскопируют. При положительном результате обнаруживают грамположительные кокки, располагающиеся в виде цепочек (см. рис. 62).

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают на кровяной агар в чашку Петрк После инкубации при 37℃ в течение 24 ч изучают характер колоний и наличие вокруг них зон гемолиза. Из части материала, взятого из колоний, готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Для получения чистой культуры 2—3 подозрительные колонии пересевают в пробирки со скошенным кровяным агаром и сахарным бульоном.

На кровяном агаре Str. pyogenes образуют мелкие, величиной с булавочную головку, мутноватые круглые колонии. В бульоне

Таблиц а 23. Дифференциальные признаки С1рептококковТаблиц а 23. Дифференциальные признаки С1рептококковStr. pyogenesStr. pneumoniaeStr. faecalisStr, sanguis*Str. salivarius*Str. pyogenesStr. pneumoniaeStr. faecalisStr, sanguis*Str. salivarius*AA++±±генная группа (cepo- груп-генная группа (cepo- груп-Образование растворимогс гемолизинаОбразование растворимогс гемолизинаРост при pH 9,6Рост при pH 9,6метиленовый синий (0,1%)метиленовый синий (0,1%)желчы (40%*желчы (40%*D НилиD НилиРост на средах, содержащихРост на средах, содержащиххлорид натри：［ (6^%)хлорид натри：［ (6^%)— или К— или Кн н я: + наличие признака; — отсутствие признака* 土 на- н отсутствие его у других штаммов данного вида.н н я: + наличие признака; — отсутствие признака* 土 на- н отсутствие его у других штаммов данного вида.ВидВидТер-моус-той-чиво-стьпри60℃ Етече-ние30Тер-моус-той-чиво-стьпри60℃ Етече-ние30Условные обозначе личие признака у одних штаммов * Обитатели ротовой полости.

Таблиц а 23. Дифференциальные признаки С1рептококков

Таблиц а 23. Дифференциальные признаки С1рептококков

Str. pyogenes

Str. pneumoniae

Str. faecalis

Str, sanguis*

Str. salivarius*

Str. pyogenes

Str. pneumoniae

Str. faecalis

Str, sanguis*

Str. salivarius*

A

A

+

+

±

±

генная группа (cepo- груп-

генная группа (cepo- груп-

Образование растворимогс гемолизина

Образование растворимогс гемолизина

Рост при pH 9,6

Рост при pH 9,6

метиленовый синий (0,1%)

метиленовый синий (0,1%)

желчы (40%*

желчы (40%*

D Нили

D Нили

Рост на средах, содержащих

Рост на средах, содержащих

хлорид натри：［ (6^%)

хлорид натри：［ (6^%)

— или К

— или К

н н я: + наличие признака; — отсутствие признака* 土 на- н отсутствие его у других штаммов данного вида.

н н я: + наличие признака; — отсутствие признака* 土 на- н отсутствие его у других штаммов данного вида.

Вид

Вид

Тер-моус-той-чиво-стьпри60℃ Етече-ние30

Тер-моус-той-чиво-стьпри60℃ Етече-ние30

ВНИЕИиоь —EoabQSHSrt'o osffiossaEO

.gig* H Cisco 8盲8 xdu SHOdx ОИНВНОЕаи。。宜hsJouosdxBg

E38E0 B3s

IquuAdJodB OSK055aKO

?^HJS« KBIJSh) 2d=90du н dEE «OKKttoax rta s

£§sou tj

E hoss d U

rfsousbsrt OJOB .OXXOXOJL 口百。 VSX0S5&0

EXSXJOHJBMUOdoo

smodx SH0&M20

^ж^%^;^T^vl-,

SSSHOSOSHKrt X

HLLQoHqugJsHHQ8Ah Osffio55&o

Hoqlfa «ЗЖВЯО « mouoc

AsEd J OE 一 J EXQVayo cxoeEW 1>ХИНО1ГОХ dNXBdvx

UBJX»SN

E38E0

L1=11 ен ^ —Jou J』2 。工HloueH ocxoo»sfe^os&o£«w iaosgH ooxowioHiq ♦dlr s OLOdXO工 CAhox —OOH s rtttoo 5 лзчи 5S 宮 хквпмаф, XIWOMMOMOlnadw 昏 0ИИ30558 aoMHEOisogw Tew。

стрептококк в отличие от стафилококка дает придонно-пристеночный рост в виде хлопьев или зерен, оставляя всю среду прозрачной.

По характеру гемолиза на кровяном агаре стрептококки делят на три группы： 1) негемолитические; 2) а -гемолитические, или зеленящие, образующие зеленоватую зону частичного гемолиза; 3) Р-гемолитические, образующие вокруг колонии полностью прозрачную зону гемолиза.

3аключительным этапом бактериологического исследования является идентификация выделенной культуры по антигенным свойствам (табл. 23). По данному признаку все стрептококки делят на серологические группы (А, В, С, D и т. д.). Серо- группу стрептококков определяют в реакции преципитации с полисахаридным приципитиногеном С, выделенным из исследуемой культуры, и сыворотками (обычно четырех наиболее распространенных серогрупп： А, В, С и D). Большинство патогенных для человека р -гемолитических стрептококков относится к серологической группе А. По содержанию типоспецифических антигенов протеиновой природы Р-гемолитические стрептококки подразделяются на серовары, из которых 47 относятся к группе А. Серовар стрептококков определяют в реакции агглютинации. Развернутое серологическое исследование и типирование стрептококков проводят главным образом при эпидемиологическом обследовании. Выделенную культуру стрептококка проверяют на чувствительность к антибиотикам методом дисков (см. рис. 46).

При подозрении на сепсис делают посевы крови больного (см. с. 136). Инкубируют посевы длительный срок (до 3 нед).

Серодиагностика. При отдельных нозологических формах ^стрептококковой инфекции с помощью РСК или реакции преципитации устанавливают наличие специфических антигенов в крови больного. Антитела к О-стрептолизину определяют главным образом для подтверждения диагноза ревматизма. Реакция основана на нейтрализации способности О-стрептоли- зина растворять эритроциты в случае наличия в крови больного соответствующих антител. Реакцию ставят со стандартным сухим О-стрептолизином.

Реакция Дика. Применяется для определения антитоксического иммунитета против эритрогенного токсина скарлатинозного стрептококка. Токсин Дика вводят внутрикожно в область предплечья и через 24 ч учитывают результат, отмечая местную воспалительную реакцию. Положительная реакция Дика свидетельствует об отсутствии антитоксического иммунитета против скарлатины； отрицательная указывает на наличие иммунитета, так как введенный токсин нейтрализуется антитоксином, имеющимся в организме.

Диагностические, профилактические, и лечебные препараты

Стафилококковый анатоксин (очищенный и адсорбированный). Получается из нативного анатоксина путем его осаждения трихлоруксусной кислотой с дополнительной очисткой этиловым спиртом и адсорбцией на гидрате окиси алюминия. Обладает высокими иммуногенными свойствами. Применяется для активной иммунизации с целью профилактики стафилококковых инфекций (у контингентов повышенного риска — беременных и новорожденных, лиц, работающих на соответствующих предприятиях) и для лечения стафилококковых заболеваний.

Стафилококковая вакцина. Взвесь коагулазоположительных золотистых стафилококков, инактивированных нагреванием. Применяется для активной иммунизации с целью лечения длительно, вяло текущих стафилококковых заболеваний. Чаще используют аутовакцину.

Стафилококковый антифагш. Экстракт из культур патогенных стафилококков, прогретых при 100℃ и профильтрованных через бактериальный фильтр. Содержит термостабильные стафилококковые антигены. Применяется для специфической иммунотерапии стафилококковых заболеваний.

Иммуноглобулин человеческий щротивостафилококковыи. Гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови, содержащая стафилококковый антитоксин. Готовят из крови людей, содержащих высокие титры антител, или доноров, иммунизированных стафилококковым адсорбированным анатоксином. Применяется для специфического лечения стафилококковых заболеваний.

Стафилококковый бактериофаг (жидкий). Фильтрат фаголизата стафилококка. Применяется наружно, внутрикожно и внутримышечно для лечения стафилококковых заболеваний.

Диагностические стафилококковые фаги. Набор типоспецифических фагов для фаготипирования стафилококков.

Токсин Дика. Очищенный эритрогенный токсин пиогенного стрептококка. Активность препарата измеряется в кожных дозах. Применяется для постановки внутрикожной пробы Дика с целью определения наличия антитоксического иммунитета у детей.

Стрептококковый бактериофаг (жидкий). Фильтрат фаголизата стрептококка. Применяется наружно, внутрикожно и внутримышечно для лечения стрептококковых заболеваний.

О-стрептолизин (сухой). Лиофильно высушенный фильтрат бульонной культуры стрептококка—активного продуцента

О-стрептолизина. Применяется для постановки серологических реакций — определения анти-О-стрептолизина в сыворотках больных стрептокковыми инфекциями (чаше ревматизмом).

Тема 23. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

РАНЕВОЙ И ГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ

АЭРОБНЫМИ И АНАЭРОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

Гнойные инфекции могут быть вызваны как аэробными, так и анаэробными бактериями (см. табл. 21) в разнообразных сочетаниях. Наряду с гнойной инфекцией в хирургии различают гнилостную инфекцию, при которой встречаются ассоциации аэробных и анаэробных бактерий. В них чаще других обнаруживаются протей, синегнойная палочка и анаэробные клостридии. При гнилостной инфекции происходит распад тканей с выделением зловонного гноя, геморрагического экссудата. Это приводит к интоксикации организма бактериальными токсинами и продуктами распада тканей. При поступлении в кровь большого количества эндотоксина грамотрицательных бактерии может наступить септический шок.

Основное значение в лабораторной диагностике раневой инфекции имеет бактериологическое исследование — выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Бактериоско- пический метод имеет ориентировочное значение, так как в окрашенных мазках невозможно идентифицировать бактерии, присутствующие в патологическом материале, и тем более выяснить их роль в инфекции. Несмотря на это, бактериоскопия дает возможность распознать смешанную инфекцию и сделать предположение о возбудителях.

Серодиагностика данных инфекций практически не проводится в связи с трудаостями в выборе антигенов и с низким титром антител.

Программа занятия

Изучение схем микробиологической диагностики раневых аэробных и анаэробных гнойных инфекций.

Бактериоскопический и бактериологический методы, используемые в лабораторной диагностике раневой инфекции.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты.

Демонстрация

Мазки из гноя и чистых культур синегнойной палочки, кишечной палочки, протея, вейллонеллы, пептококка, пептострептококка, бактероида и клостридий.

Методика посева для выделения облигатных анаэробов.

Аппаратура и питательные среды для выращивания анаэробов.

Пестрые ряды с культурами клостридий — возбудителями раневой анаэробной инфекции. .

Определение перфрингенс-токсина в раневом отделяемом с помощью лецитовителлазной пробы.

Задапяе для выполнения лабораторной работы

Бактериоскопическое исследование： приготовить мазки из гноя, окрасить их по Граму и микроскопировать. Сделать предварительное заключение и наметить ход дальнейшего анализа.

Сделать окончательное заключение о возбудителе или возбудителях раневой инфекции на основании бактериоскопических, бактериологических, биохимических и других данных, полученных из бактериологической лаборатории.

Методические указания

Материал дл須 исследования: гной, раневое отделяемое, отечная жидкость, кусочки мышечной ткани, перевязочный материал и др.

Микробиологическая диагностика раневой и гнойной

аэробной инфекции

Бактериоскопическое исследование. Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Обнаружение в мазках разных форм бактерий (стафилококка, стрептококка, грамотрицательных или грамположитель- ных палочек) позволяет сделать предварительное заключение.

Бактериологическое исследование. 1. Методы выделения чистых культур стафилококков и стрептококков и их идентификация описаны выше.

Для выделения культуры бактерий Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) исследуемый материал засевают на питательный агар в чашки Петри с целью получения изолированных колонии. Посевы инкубируют при 37℃ в течение суток. Синегнойная палочка образует круглые плоские слизистые колонии с характерным сине-зеленым пигментом, который диффундирует в агар. При бактериоскопии нативных препаратов в «раздавленной» или «висячей» капле, приготовленных из колоний, обнаруживаются подвижные и слегка изогнутые палочки, в мазках, окрашенных по Г раму, — грамотрицательные палочки. Для установления вида получают чистую культуру, которую идентифицируют по биохимическим признакам. Патогенные штаммы Pseudomonas aeruginosa образуют белковые токсины (экзотоксины)： гистотоксин, обладающий цитотоксическим свойством, и лейкоцидин, лизирующий лейкоциты человека, которые могут быть обнаружены путем биопробы.

Для выделения культуры бактерий Е. coli исследуемый материал засевают на одну из дифференциально-диагностических сред (например, среду Эндо, на которой кишечная палочка образует красные колонии). Дальнейшая идентификация выделенной чистой культуры с определением серовара описана на с. 178).

Для выделения культуры бактерий рода Proteus исследуемый материал вносят в конденсационную воду скошенного в пробирке питательного агара (метод Шухевича). Посевы инкубируют при 37℃ в течение 18—20 ч. Характерным признаком протея является ползучий рост снизу вверх по поверхности скошенного агара. При бактериоскопии препаратов в «висячей» или «раздавленной» капле видны подвижные палочки, в мазках, окрашенных по Граму, — грамотрицательные палочки. Дальнейшая идентификация выделенной чистой культуры Proteus до вида (Proteus vulgaris, Proteus mirabilis и др.) описана в теме 30.

Микробиологическая диапюстика гнойно-воспалительных процессов, вьвванных неспорообразующими анаэробными бактериями

Возбудителями разнообразных гнойно-воспалительных процессов довольно часто являются неспорообразующие анаэробные бактерии, пр инадлежащие к родам Bacteroides, Veillonella, Peptococcus, Peptostreptococcus. Они вызывают как моноинфекции, так и смешанные инфекции во всевозможных сочетаниях друг с другом и с аэробными бактериями — Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, E. coli, кокками. Для микробиологической диагностики этих заболеваний главным образом осуществляют бактер ио логическое исследование в строго анаэробных условиях, так как даже незначительное количество кислорода воздуха резко тормозит размножение бактерий, в результате чего они не растут на питательных средах.

Взятие материала (гной, отделяемое раны, отечная жидкость) производят шприцем с хорошо притертым поршнем до полного его заполнения и вытеснения воздуха. Затем шприц надевают на иглу, вставленную через резиновую пробку в пробирку со смесью инертных газов (N2 + H2) и СО2, и вводят в нее исследуемый материал.

Бактериологическое исследование. Посевы производят в пробирку с предварительно прокипяченной средой Китта—Тароцци и в пробирку с полужидким тиогликолевым агаром. В его состав входят дрожжевой экстракт, триптон, цистеин, хлорид натрия, тиогликолевая кислота, метиленовый синий и 0,75%

+ + + 1

X

х х + 1 + +

d|

+ + + 1

+

X

1

т

1 + +

ss

+ + + j

+

X

1

-+

х +

+

&e 二？

+ + + +

1

1

1

4

х + +

十

+

+。

X

1

1

4

х + +

渉

1

+ + +

+

1

■+

X X +

汗1

+

+ HI+H- -н-н

1

1 1

1++ 1 1

+ 1 1

1 1 ++1

1 1

1 1 1

5 g

g I

1

1

4

1 +中

1

+ 1+ 1

d

KHnet-Hvsd^««ю«чо I 0 ^«OSSMHH eRHHmqlrog A ExeHSMdu SPSS» 引«ONNelm ER •工smqyog A BXMSaK OSOHUHBO ^»eHEHdu ^SXXKOHUOCOX I X«XEHSdu oxmHOH^UHO I .^xrtxMK& osrssx + 芯 HHShEHeog。 “KHUOUQA

*■■■£*■9 Хнв9о』е■胃 ммве&м&шеоАови a MMSSKnMaweoAonsB HMaKmaAa tted3BB£»$H^ .為 rt я s П ю « H

Рнс. 64. Возбудители анаэробной раневой инфекции.

а - Clostridium perfringens； 6 - Cl. novyi；

6 - Cl. septicus； г - Cl. histolyticum.

агара. Посевы помещают в эксикатор или анаэростат, который заполняют газовой бескислородной смесью (с палладиевым катализатором) и инкубируют при 37℃ в течение 24—48 ч. После просмотра выросшей культуры делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Бактерио

скопия дает возможность установить однородность или неоднородность культуры, а по морфологии клеток и отношению к окраске по Граму ориентировочно отнести ее к определенному роду. Для получения чистой культуры делают пересевы на сахарный кровяной агар в чашки Петри, которые инкубируют в анаэробных условиях 3—4 сут до формирования изолированных колоний. После изучения колоний их пересевают на среду Китта—Тароцци. Идентификацию выделенной чистой культуры производят на основании присущих им дифференциальных признаков, которые определяют в тех же строго анаэробных условиях (табл. 24).

Микробиологическая диагностика раневой анаэробной инфекции (газовой ган!рены)

Возбудителями раневой анаэробной инфекции являются бактерии рода Clostridium (схема 4). К данному роду относятся CL perfringens, CL novyi, CL septicum. Cl. sordellii. Cl. histo- lyticum. Чаще других возбудителем является CL perfringens. Заражение происходит при попадании в рану почвы или пыли, загрязненной спорами клостридий. В анаэробных условиях (в глубине раны) они прорастают в вегетативные клетки, продуцирующие разнообразные токсины, которые вызывают распад и некротизацию мышечной ткани. В этом процессе участвуют стафилококки, синегнойная палочка, протей и другие бактерии, в значительной мере осложняющие течение заболевания.

Бактериоскопическое исследование. Проводится путем микроскопии мазков, приготовленных из отечной жидкости или некротизированной ткани. Наличие в препаратах крупных (1—15X3—10 мкм) грамположительных палочек (рис. 64), часть

•них oz DMHgKDl H

oooy s^c J>sOHKKtOB анbOIEcagdJodu xodsgodu xlqHHK。。黑 AHSHOIfou Iqdolfa MOHgodeB KSX^S&SE KIfF 一itoso DZHquauiohHOXO

xrtass xsugg АН лкко^оьом^п sl«ssaH«os KKIUBQd 《йнаг。？》

口 Nd

H8OU

EaicEO

s?n «>^

(BdxJqs KWHE HmlodEb

I Bxlsx AyodQ eh WOQOK

Anedj OK BXQedxo cxocen dHHOyox dwiEOEX

E3BJ.;，E

ewmoiKSHg*AdEHgo «5 ИЬООМЕЮК «0ЖЛ5ВА-В г!вдхфн<цнд=гVSXO50ML-

sodBJB S2XK0O&6X ■dEXEo“AxmEh вн И00ОС

Awed j о 匚 SQ«&0 -Х0Й5

Bwbn>?z

Ea81ao

3sb^£x «obosy KSHglfgmqH Ks ихннн。«0«Qa02 usxv^s^

一 dir и OXOIfox cedgyq — EHOOquHa®modEJ I Bllsx Iqygd。ен ЗИОООС

HEd Ms S3S0WC-04H0。 ■godu KSMSSHKSOf I §b»s ylqHHgdoxJA

ulalulo

AsEdJ ou BXJBdxowOCBn

Dabn*■，

OSKrt»040e.QOS

«юоакоки

0SKSO4050S aoxshHJOIfosdwfE

OO^O^SKOWOOSaosrtrt

s ss^ «ЗК-08Й&С KEHHBBOdMgsdxgH л^^^—^^^

нипнаони «es^eAnsa «ОЙОКЯА HdB«MasesR.QOK aoxwhHJOITOH^dxHW

R.MSBMS

T_啷凯.‘ •，r*■?E-■•,

九-:心“・<:> • ".〈■•$7rlvr"i ■" _^^-'“.•/■.-•.『1.

I >^Irt Ort, ■ s^ »^r ^ i ^ ?v£«f^-rj>- .5/>^^_ff^

из которых (Cl. perfringens) образует капсулу (рис. 65), позволяет поставить предварительный диагноз.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал вносят в несколько пробирок со средой Китта—Тароцци, железосульфитным агаром (среда Вильсона—Блера) и молоком. Часть пробирок прогревают при 80℃ в течение 30 мин для уничтожения неспорообразующих бактерий. Посевы инкубируют в обычном термостате при 37°С. Cl. perfiingens растет в глубине среды. В молоке уже через 37 ч после посева образуется губкообразный сгусток, содержащий пузырьки газа и отделившуюся прозрачную жидкость. На следующие сутки на среде Китта—Тароцци отмечается помутнение и газообразование, а на ЖСА несколько позднее появляются черные колонии в глубине агарового столбика. Для получения культур других видов клостридий требуются более строгие анаэробные условия. Из всех посевов делают мазки, окрашивают по Граму и микро-

Таблица 25. Определение лецитиназной активности токсияа CL perfringens (ф<фма протокола)

Ингредиенты, мл

№ пробирки

1

2

3

4

Исследуемый материал

03

03

03

03

Лецитин

0,1

0,1

0,1

—

Раствор хлорида натрия

0,1

—

—

0,2

Сыворотка анти-С1. perfringens

—

0,1

—

—

Сыворотка анти-С1. novvi

—

0,1

Инкубация при 37℃ в течение 46To мин

Учет результатов

скопируют. При положительном результате обнаруживают крупные грамположительные палочки Cl. perfringens. Для получения чистой культуры делают пересевы на сахарный кровяной агар в чашки Петри, которые инкубируют в строго анаэробных условиях при 37℃ в течение 3—4 дней. Выросшие колонии пересевают в пробирки со средой Китта—Тароцци. Идентификацию чистой культуры производят на основании признаков, перечисленных в табл. 24.

Для определения токсигенности исследуемую культуру, выращенную на среде Китта — Тароцци, центрифугируют и надосадочную жидкость вводят морской свинке, которая в положительном случае погибает.

Для быстрого обнаружения токсина Cl. perfnngens в раневом отделяемом определяют его лецитиназную активность (табл. 25).

Положительная реакция на лецитиназу проявляется в виде помутнения жидкости в пробирке при отрицательной реакции, характеризующейся нейтрализацией фермента соответствующей антисывороткой, жидкость остается прозрачной.

Вследствие того что токсины разных видов клостридий отличаются по своим антигенным свойствам, их серологическую идентификацию проводят в реакции нейтрализации на лабораторных животных. С этой целью смесь исследуемого токсина с антитоксической сывороткой (Cl. perfnngens или Cl. novyi) вводят подкожно морской свинке. В случае нейтрализации токсина животное остается живым; при отрицательной реакции морская свинка погибает через 30 мин—4 ч после инъекции.

Микробиологическая диагностика столбняка

Возбудитель столбняка Cl. tetani (рис. 66) проникает в организм человека через поврежденные кожные покровы при травмах и ранениях, у женщин через родовые пути при родах и абортах, у новорожденных через пупочную рану.

Материал для исследования: кусочки ткани вокруг предполагаемых входных ворот инфекции, гной, перевязочный материал, кетгут. При подозрении на столбняк у женщин после родов или аборта — выделения из матки.

Бактериологическое исследование. Материал засевают в среду Китта — Тароцци и инкубируют в анаэробных условиях при 37℃ в течение 37 сут； наблюдают придонный рост бактерий. Затем делают пересевы на сахарный кровяной агар в чашки Петри и в столбик сахарного питательного агара в пробирке. Посевы также инкубируют в анаэробных условиях.

На поверхности кровяного агара палочка столбняка образует нежные прозрачные колонии, окруженные малозаметной зоной гемолиза. Для получения чистой культуры подозрительные колонии пересевают в пробирки со средой Китта — Тароцци и сохраняют их под слоем вазелинового масла или в эксикаторе, заполненном смесью инертных газов.

Биопроба. Основной метод лабораторной диагности столбняка. Проводится для обнаружения столбнячного токсина в исследуемом материале. С этой целью материал растирают в стерильной ступке с песком, заливают изотоническим раствором хлорида натрия для экстрагирования токсина и фильтруют через бумажный фильтр. Часть фильтрата смешивают с антитоксической сывороткой и внутримышечно вводят белым мышам (контрольная группа); подопытным животным вводят один фильтрат.

Через 1—2 сут у мышей появляется ригидность мышц хвоста и задних конечностей. В результате резкого сокращения хвостовых мышц хвост поднимается в виде дуги. Затем подопытные животные погибают. Для определения токсигенности выделенной культуры белым мышам вводят надосадочную жидкость, полученную при центрифугировании этой культуры, выращенной на жидкой питательной среде.

Профилактические и лечебные препараты

Антитоксические сыворотки — антиперфрингенс9 антиэдема- тиенс (антинови), антисептикум. Выпускаются в жидком и сухом виде после очистки и концентрации методом фермента^ тивного гидролиза (диаферм-3) антитоксической сыворотки, полученной при иммунизации лошадей соответствующими анатоксинами. Применяется для профилактики и специфической терапии раневой анаэробной инфекции (газовой гангрены).

Адсорбированный столбнячный анатоксин. Получен путем обезвреживания формалином столбнячного токсина с последующей его очисткой, концентрацией и адсорбцией на гидрате окиси алюминия. Входит в состав ассоциированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины и других препаратов. Применяется для активной иммунизации против столбняка.

Противостолбнячная сыворотка. Получена из крови лошадей, гипериммунизированных столбнячных анатоксином. Очищена и концентрирована методом диаферм-3. Активность измеряется в международных единицах. Применяется для профилактики н лечения столбняка.

Иммуноглобулин человеческий противостолбнячный. Получен из гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови людей- доноров, ревакцинированных очищенным сорбированным столбнячным анатоксином. Применяется для пассивной экстренной профилактики столбняка в сочетании со столбнячным анатоксином при травмах кожных покровов, а также для лечения начавшегося заболевания.

ВОЗБУДИТЕЛИ ВОЗДУШНО-КАПЕЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Возбудители инфекций, передающихся воздушно-капельным путем, принадлежат к бактериям, риккетсиям и хламидиям, микоплазмам (табл. 26).

Перечисленные в табл. 26 микроорганизмы относятся к разным семействам, родам и видам, которые существенно

бактериями

риккетсиями и хламндмями

микоплазмой

Staph, aureus — пневмония

Str. pneumoniae — пневмония

Str. pyogenes — пневмония

Klebsiella pneumoniae — пневмония

BordeteMa pertussis — коклюш

Corynebacterium diphtheriae — диф- / терия

Mycobacterium tuberculosis — туберкулез легких

Actinomyces bovis — актиномикоз ль- ких

Neisseria meningitidis — менингококковая инфекция

Veillonella sp. — пневмония?

Bacteroides sp. — пневмония?

Peptococcus sp. — пневмония?

Coxiella burnetii — пневмония(в 15% случаев)

Chlamidia psitta- ci — пневмония

Mycoplasma pneumoniae — пневмонии

Таблица 26. Возбудители бактериальных воздушно-капельных инфекций

Наименование возбудителей и заболевании» вызванных

отличаются друг от друга по морфологии, культуральным и биохимическим свойствам, антигенной структуре. Многие из них (Str. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Coxiella burnetii, Chlamidia psittaci. Mycoplasma pneumoniae) вызывают, как правило, пневмонию, другие (Staph, aureus. Str. pyogenes, Pep- tostreptococcus, Peptococcus, Veillonella, Bacteroides) — разнообразные заболевания, в том числе респираторные инфекции. Респираторные инфекции разной этиологии клинически диагностируются как острые респираторные заболевания (ОРЗ) или как пневмонии; возбудители же могут быть идентифицированы только с помощью микробиологического исследования.

Другие бактерии вызывают более избирательные поражения определенных органов и тканей. Так, бактерии коклюша, как правило, локализуются в эпителии респираторного тракта; скарлатинозный стрептококк и бактерии дифтерии вызывают воспалительный процесс б зеве (реже — местные процессы иной локализации) и при этом возникают системные поражения, связанные с токсинемией; менингококки локализуются в носоглотке, вызывают фарингиты, назофарин- гиты, а проникая в мозговые оболочки и кровь, — менингит и сепсис. К бактериям, вызывающим специфические поражения респираторного тракта, относятся возбудители туберкулеза и актиномикоза. Вместе с тем они поражают и другие 150

органы (кишечник, печень, кости, суставы и др.). Вызванные всеми упомянутыми бактериями заболевания существенно отличаются по клинической картине н патогенезу. Для бактериологического подтверждения клинического диагноза и выявления бактерионосителей используют главным образом бактериоскопический и бактериологичекий методы, иногда биопробы. Экспресс-диагностика осуществляется иммунофлюо- ресцентным методом.

Тема 24. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ОРЗ

И ПНЕВМОНИЙ, ВЫЗВАННЫХ БАКТЕРИЯМИ,

РИККЕТСИЯМИ БЕРНЕТА, ХЛАМИДИЯМИ И МИКОПЛАЗМОЙ

ПНЕВМОНИИ

Микробиологическая диагностика респираторных заболеваний, вызванных золотистым стафилококком, пиогенным стрептококком, а также анаэробными бактериями (пептококки, вейл- лонеллы, бактероиды), проводится теми же методами, которые применяются при диагностике гнойных инфекций (темы 22, 23). Лабораторная диагностика респираторных инфекций, вызванных другими бактериями, будет рассмотрена ниже.

Программа занятия

Изучение схем микробиологической диагностики ОРЗ и пневмоний, вызванных разными микроорганизмами.

Бактериологическая диагностика пневмоний, вызванных стрептококком пневмонии и клебсиеллой пневмонии.

Серодиагностика пневмоний, вызванных риккетсиями Бернета, хламидиями пситтакоза (орнитоза) и микоплазмой пневмонии.

Диагностические, профилактические н лечебные препараты, применяемые при указанных заболеваниях.

Демонстрация

Мазки из патологического материала и чистых культур стрептококка пневмонии и клебсиеллы пневмонии.

Колонии стрептококка пневмонии на кровяном агаре и клебсиеллы пневмонии на питательном агаре.

РСК с антигенами риккетсий Бернета, хламидий пситтакоза (орнитоза) и микоплазмы пневмонии.

Диагностические, профилактические и лечебные препщэаты.

Зяданис для вьшолнения лабораторной работы

Микроскопировать окрашенные мазки из исследуемого материала. Сделать заключение и наметить план дальнейшего анализа.

Сделать заключение о возможном возбудителе респираторной инфекции на основании данных бактериоскопического и бактериологического исследований, полученных из лаборатории (студенты получают заполненные бланки с результатами соответствующих анализов).

Отметить результаты и сделать заключение по реакции агглютинации и РСК с антигеном риккетсий Бернета и РСК с орнитозным диагностикумом.

Мокрота, промывные воды бронхов, гной.Мокрота, промывные воды бронхов, гной.экссудатэкссудатБактериоскопиче- ское исследование Мазок, окраска по Г рамуБактериоскопиче- ское исследование Мазок, окраска по Г рамуБактериологическое исследованиеБактериологическое исследованиеХарактер колонийМазок, окраска по Г рамуХарактер колонийМазок, окраска по Г рамуОтветОтветМазки-отпечатки из органов, окрас- а-Г емо-ка по Г рамулиз一Мазки-отпечатки из органов, окрас- а-Г емо-ка по Г рамулиз一Посевы на кровяной агарПосевы на кровяной агарБиопроба (редко) Зара遥нне белых мышейБиопроба (редко) Зара遥нне белых мышейПосев на скошенный кровяной агар или сахарный бульон (чистая культура)Посев на скошенный кровяной агар или сахарный бульон (чистая культура)ОтветОтветПосев на «пестрый» РЯДС еротипирование <-Посев на «пестрый» РЯДС еротипирование <-Методические указанияМетодические указания

Мокрота, промывные воды бронхов, гной.

Мокрота, промывные воды бронхов, гной.

экссудат

экссудат

Бактериоскопиче- ское исследование Мазок, окраска по Г раму

Бактериоскопиче- ское исследование Мазок, окраска по Г раму

Бактериологическое исследование

Бактериологическое исследование

Характер колоний

Мазок, окраска по Г раму

Характер колоний

Мазок, окраска по Г раму

Ответ

Ответ

Мазки-отпечатки из органов, окрас- а-Г емо-ка по Г раму

лиз一

Мазки-отпечатки из органов, окрас- а-Г емо-ка по Г раму

лиз一

Посевы на кровяной агар

Посевы на кровяной агар

Биопроба (редко) Зара遥нне белых мышей

Биопроба (редко) Зара遥нне белых мышей

Посев на скошенный кровяной агар или сахарный бульон (чистая культура)

Посев на скошенный кровяной агар или сахарный бульон (чистая культура)

Ответ

Ответ

Посев на «пестрый» РЯД

С еротипирование <-

Посев на «пестрый» РЯД

С еротипирование <-

Методические указания

Методические указания

Схема 5. Микробиологическое исследование при пневмонии» вызванной стрен- тококком пневмонив

Материал

1-й этап

2-й этап

3-й этап

Чувствительность к желчи, оптохину Чувствительность

к антибиотикам

Окончательный ответ

Микробиологическая диагностика инфекций, вызванных стрептококком пневмонии

Str. pneumoniae относится к сем. Streptococcaceae. Является возбудителем крупозной пневмонии, а также ползучей язвы роговицы, а в более редких случаях — сепсиса и гнойновоспалительных процессов (отит, ринит, менингит и др.).

Бактериоскопическое исследование (схема 5). Мазки для первичной бактериоскопии готовят из патологического материала (мокрота, гной и др.). Наличие в них грамположитель- ных, несколько удлиненных, имеющих ланцетовидную форму диплококков 0,—1工5 мкм), окруженных капсулой, позволяет поставить предварительный диагноз (рис. 67).

Бактериологическое исследование. Материал засевают на кровяной агар и одновременно на сахарный бульон с добавлением сыворотки крови. После инкубации при 37℃ через 24 ч образуются мелкие нежные колонии, окруженные небольшой зеленоватой зоной гемолиза. Из колоний делают мазки для изучения морфологии и тинкториальных свойств, а

затем пересев на скошенный кровяной агар или сывороточный бульон для выделения чистой культуры. Для отличия стрептококка пневмонии от пиогенного стрептококка проверяют чувствительность выделенной культуры к желчи, оптохину и ферментацию инулина (табл. 27).

Серовар стрептококка устанавливают в реакции агглютинации с типоспецифическими сыворотками (из 80 известных вариантов в патологии человека основную роль играют 1-й, 2-й и 3-й серовары). Быстрым методом типирования стрептококка пневмонии является реакция Нейфельда, которая основана на феномене набухания капсул стрептококка под влиянием типоспецифической сыворотки. Результаты учитывают при микроскопии препаратов «висячая» капля.

Для выделения чистой культуры стрептококка пневмонии в некоторых случаях материал непосредственно вводят внутрибрюшинно белым мышам, которые являются высокочувствительными к данному микробу. Культуру стрептококка выделяют из крови и органов погибшего или забитого животного, а также проводят бактериоскопию мазков-отпечатков, сделанных из его органов.

Таблица 27. Дифференциальные щ

ризннкз Str. pi

eumoniae и Sti

.pyogenes

Вид

Характер гемолиза

Ферментация инулина

Лизис в Ю№% растворе желчи

Чувствительность к оптохину (1 : 100 000)

Str. pneumoniae

Str. pyogenes

a

а и р

+

+

+

Примечание, a-и гемоглобин серо-зеленого

еполный гемолиз, связанный с хвета; р-полныЛ гемолиз.

переходом гемоглобина в мет-

Микробиологическая диагностика респираторных инфекции, вызванных клебсиеллами

К клебсиеллам, вызывающим поражения респираторного тракта, относятся Klebsiella pneumoniae — возбудитель пневмонии, К. ozaenae — возбудитель озены, или зловонного насморка, К. rhinoscleromatis — возбудитель риносклеромы или склеромы.

М етодические указания

Бактериоскопическое исследование. Мазки для первичной бактериоскопии готовят из мокроты, слизи и соскобов из носа, окрашивают по Граму и Бурри—Гинсу. Наличие в

мазках грамотрицательных капсульных бактерий (см. рис. 20) позволяет сделать предварительное заключение. В случае склеромы при гистологическом исследовании гранулематозной ткани, взятой из носа, обнаруживаются своеобразные гигантские клетки Микулича, в которых содержатся клебси- еллы.

Бактериологическое исследование. Материал засевают на чашки Петри с питательным агаром, содержащим пенициллин для подавления роста сопутствующей микрофлоры, или на дифференциально-диагностические среды с лактозой и бромтимоловым синим. На питательном агаре клебсиеллы образуют блестящие выпуклые слизистые колонии. На дифференциальной бромтимоловой среде колонии клебсиеллы склеромы и клебсиеллы озены, нерасщепляющие лактозу, окрашены в цвет среды (голубой), а на бромкрезоловой — в фиолетовый. Лактозопозитивные клебсиеллы пневмонии образуют колонии желтого цвета. На 2-й день нЗ подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Граму, Бурри- Гинсу и пересевают на скошенный агар или среду Ресселя (см. с. 184) с бромтимоловым синим для получения чистой культуры. На 3-й день учитывают рост на агаре и среде Ресселя. Лактозонегативные бактерии окрашивают столбик среды в желтый цвет, а лактозопозитивные — всю среду в желтый цвет и часто разрывают ее в результате газообразования при ферментации глюкозы. Идентификацию выделенной культуры проводят по наличию капсулы, отсутствию подвижности и другим признакам (табл. 28).

Таблица 28. Дифференциация Klebsiella pneumoniae, К. ozaenae, К. rhinoscleromatisПризнак или тестК. pneumoniatK.ozaenaeK.rhinosclero- matisРасщепление глюкозы с образованиемгазаТX—Расщепление лактозы (до кислоты)+(+)—Растепление дульцита (до кислоты)X—Реакция с метиловым красным—++Реакция Фогеса — Проскауэра+—-—Утилизация цитрата+X—Образование уреазы+X—Образование лизиндекарбоксилазы+X—Таблица 28. Дифференциация Klebsiella pneumoniae, К. ozaenae, К. rhinoscleromatisПризнак или тестК. pneumoniatK.ozaenaeK.rhinosclero- matisРасщепление глюкозы с образованиемгазаТX—Расщепление лактозы (до кислоты)+(+)—Растепление дульцита (до кислоты)X—Реакция с метиловым красным—++Реакция Фогеса — Проскауэра+—-—Утилизация цитрата+X—Образование уреазы+X—Образование лизиндекарбоксилазы+X—Условные обозначения: (+) — медленная ферментация; х — не все штаммы.Условные обозначения: (+) — медленная ферментация; х — не все штаммы.Для установления серовара выделенной культуры проводят реакцию агглютинации или иммунофлюоресценции с типоспецифическими противокапсульными сыворотками.

Таблица 28. Дифференциация Klebsiella pneumoniae, К. ozaenae, К. rhinoscleromatis

Признак или тест

К. pneumoniat

K.ozaenae

K.rhinosclero- matis

Расщепление глюкозы с образованием

газа

Т

X

—

Расщепление лактозы (до кислоты)

+

(+)

—

Растепление дульцита (до кислоты)

X

—

Реакция с метиловым красным

—

+

+

Реакция Фогеса — Проскауэра

+

—

-—

Утилизация цитрата

+

X

—

Образование уреазы

+

X

—

Образование лизиндекарбоксилазы

+

X

—

Таблица 28. Дифференциация Klebsiella pneumoniae, К. ozaenae, К. rhinoscleromatis

Признак или тест

К. pneumoniat

K.ozaenae

K.rhinosclero- matis

Расщепление глюкозы с образованием

газа

Т

X

—

Расщепление лактозы (до кислоты)

+

(+)

—

Растепление дульцита (до кислоты)

X

—

Реакция с метиловым красным

—

+

+

Реакция Фогеса — Проскауэра

+

—

-—

Утилизация цитрата

+

X

—

Образование уреазы

+

X

—

Образование лизиндекарбоксилазы

+

X

—

Условные обозначения: (+) — медленная ферментация; х — не все штаммы.

Условные обозначения: (+) — медленная ферментация; х — не все штаммы.

Серодиагностика. Проводится с сыворотками больных людей в РСК или РИГА с химическим склеромным диаг- ностикумом.

Серодиагностика пневмоний, вызванных риккетсиями

Бернета, хламидиями пситтакоза и микоплазмой пневмонии

Бактериологическая диагностика пневмоний, вызванных перечисленными микроорганизмами, практически не проводится, поскольку риккетсии и хламидии не растут на искусственных питательных средах. Выделение их на куриных эмбрионах или клеточной культуре требует длительного времени и не всегда бывает успешным. Хотя микоплазма пневмонии растет на специальных питательных средах (рис. 68), выделить ее в чистой культуре удается не всегда и не ранее чем через месяц после посева. В этой связи основным методом микробиологической диагностики данных пневмоний является серологическое исследование.

Серодиагностика Ку-риккетсиоза. Начиная с 8-го дня болезни ставят реакцию агглютинации или РСК. Стандартные диагностикумы готовят из риккетсий Бернета. Титр антител в РСК достигает 1 :80—1:160 на 5—6-й неделе болезни. Реакция считается положительной при нарастании титра антител не менее чем в 2 раза (табл. 29).

Серодиагностика пситтакоза (орнитоза). Ставят РСК со стандартным орнитозным диагностикумом и сыворотками больного, взятыми первый раз на 7-м дне заболевания, а второй в конце 3-й недели. При отсутствии нарастания титра антител реакцию повторяют через 4 нед после начала заболевания. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител на менее чем в 2 раза (табл. 31).

Кожно-аллергическая проба. Для ранней диагностики орнитоза ставят кожно-аллергическую пробу с пситтакозным аллергеном.

Серодиагностика пневмонии, вызванной микоплазмой. Осуществляется постановкой РСК с диагностикумом, приготовленным из микоплазмы пневмонии, или РПГА, в которой используют эритроциты барана с адсорбированным на них микоплазменным антигеном. Д иагностическое значение имеет нарастание титра антител в 4 раза и более в парных сыворотках крови, взятых от больного на 7—8・й день и в Конце 2-й недели болезни. Высокий титр антител, выявленный в этих реакциях при однократном исследовании, не является доказательством наличия болезни, так как положи-

Рис. 68. Колонии Mycoplasma pneumoniae на агаре с лошадиной сывороткой, имеющие типичный вид яичницы- глазуньи.Рис. 68. Колонии Mycoplasma pneumoniae на агаре с лошадиной сывороткой, имеющие типичный вид яичницы- глазуньи.Диагностические, профилактические н лечебные препаратыДиагностические, профилактические н лечебные препаратытельная реакция часто возникает после перенесения заболевания даже в форме бессимптомной инфекции. Комплемент- связывающие антитела сохраняются после перенесения заболевания около 1% лет, а антитела, выявляемые в РТГА,— несколько дольше. В лабораторных условиях РСК нередко ставят одновременно с риккетсиозным, пситтакозным и микоплазменным диагностикумами по следующей схеме (табл. 29).

Рис. 68. Колонии Mycoplasma pneumoniae на агаре с лошадиной сывороткой, имеющие типичный вид яичницы- глазуньи.

Рис. 68. Колонии Mycoplasma pneumoniae на агаре с лошадиной сывороткой, имеющие типичный вид яичницы- глазуньи.

Диагностические, профилактические н лечебные препараты

Диагностические, профилактические н лечебные препараты

Сыворотки противопневмококковые типоспецифические I, Н и III типов. Применяются для типирования (установления серовара) стрептококков пневмонии.

Диагностикумы клебсиеллезные. Химические диагностикумы, полученные по способу Буавена. Применяются для постановки РСК и РПГА•

Риккетсиозный сухой растворимый антиген риккетсий Бернета. Получен цутем экстракции с последующей обработкой эфиром. Применяется для постановки РСК и РПГА. Обладает более высокой активностью, чем риккетсиозный диагнос- тикум.

Орнитозныи диагностикум. Взвесь убитых хламидий пснт- такоза. Применяется для постановки РСК.

Микоплазменный диагностикум. Взвесь убитой культуры микоплазмы пневмонии. Применяется для РСК и РПГА.

Сухая живая вакцина М-44. Высушенная взвесь вакцинного штамма риккетсий Бернета (мутанта 44), выращенного в курином эмбрионе. Применяется для профилактики Ку-лихорадки.

Антибиотики: бенз илпенициллин, стрептомицин, левомицетин, тетрациклин, рондомицин.

Тема 25. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ И КОКЛЮША

Возбудитель менингококковой инфекции (цереброс пиналь- ныйменингит,назофарингит, менингококкемия) —Neisseriameningitidis —относится к роду Neisseria сем. Neisseriaceae. Основным методом лабораторной диагностики этих инфекций является бактериологическое исследование, поскольку бактериоскопия не позволяет дифференцировать как борде- теллы, так и менингококки. Экспресс-диагностика проводится иммунофлюоресцентным методом.

Возбудитель коклюша — Bordetella pertussis — относится к роду Bordetella, который не включен в какое-либо семейство. Бордетеллы играют важную роль в инфекционной патологии детского возраста.

Программа занятия

Изучение схемы микробиологической диагностики менингококковой инфекции и коклюша.

Бактериологическое и серологическое исследования.

Диагностические, профилактические и лечебные препщ)аты, применяемые при менингококковой инфекции 肘 коклюше.

Демонстрация

Окрашенные по Граму мазки из чистой культуры менингококка и ликвора.

Культура менингококка на сывороточном агаре.

Тампон для взятия материала из высоких отделов носоглотки.

Мазки из чистых культур коклюшных и паракоклюшных бактерий, -окрашенные по Граму.

Колонии коклюшных бактерий на казеиноугольном агаре (КУА) и среде Борде—Жангу.

Определение уреазной активности паракоклюшных бактерий.

РСК для серодиагностики коклюша.

Экспресс-диагностика коклюша с . помощью иммунофлюреспентного метода.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты.

Задание для выполнения лабораторной работы

Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции： а) микро- скопировать готовые мазки из ликвора и носоглотки и сделать заключение； 6) по данным бактериологического исследования, пол ченным из лаборатории, сделать заключение о выделенных бактериях.

Микробиологическая диагностика коклюша： а) микроскопировать готовые мазки из носоглотки, сделать заключение н наметить дальнейший план анализа； б) сделать окон нательное заключение на основании данных микробиологического исследования, полученных из бактериологической лаборатории.

Методическ ие указания

Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции

Менингококки обнаруживаются в носоглотке у бактерионосителей и больных, в спинномозговой жидкости (ликвор) при эпидемическом цереброспинальном менингите.

Материал для исследования берут специальным тампоном (который на % длины сгибают под углом 45°) из верхних отделов носоглотки. При доставке в лабораторию его предохраняют от охлаждения и высушивания, поскольку менингококк очень чувствителен к воздействию этих факторов.

Ликвор берут путем пункции спинномозгового канала в количестве 2—5 мл и делят на две части: одау центрифугируют и исследуют осадок, к другой добавляют полужидкую питательную среду и выдерживают при 37℃ для накопления бактерий. Из исследуемого материала готовят мазки и производят посевы.

Бактериоскопическое исследование (схема 6). Мазки из осадка ликвора окрашивают по Г раму и микроскопируют. При наличии гноя в большинстве случаев обнаруживаются типичные грамотрицательные диплококки, имеющие характерное расположение — внутри лейкоцитов, что позволяет сделать окончательное заключение о менингококковой инфекции. При микроскопии мазков из носоглотки бактерионосителей наряду с менингококком обнаруживаются грамположительные стафилококки и стрептококки, а также непатогенные нейс- серии — бранхамелла и другие бактерии. Дифференцировать их по морфологической картине мазка не представляется возможным.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают петлей на чашки с питательным агаром, содержа- 158

Схема 6. Микробнологическое мсслеломаие щт мешшгококковод вифекцш! и у бяктерноносителен

МатериалМатериалЛиквор, слизь из зева и носа, кровь, гной. Ликвор зкссудатЛиквор, слизь из зева и носа, кровь, гной. Ликвор зкссудатБастериоскопиче- ское исследованиеБастериоскопиче- ское исследованиеБактериологическое исследованиеБактериологическое исследованиеОбнаружение антигенаОбнаружение антигенаСыворотка кровиСыворотка кровиСеродиагностикаСеродиагностика1-й этап1-й этапМазок, окраска по Граму. Люминесцентная микроскопия мазков, обработанных флюоресцирующей иммунной сывороткойМазок, окраска по Граму. Люминесцентная микроскопия мазков, обработанных флюоресцирующей иммунной сывороткойПосев на сывороточный питательный агарПосев на сывороточный питательный агарРПГА с эритроцитами, нагруженными антителамиРПГА с эритроцитами, нагруженными антителамиРПГ А с парными сыво< роткамиРПГ А с парными сыво< роткамиОтветОтветОтветОтвет

Материал

Материал

Ликвор, слизь из зева и носа, кровь, гной. Ликвор зкссудат

Ликвор, слизь из зева и носа, кровь, гной. Ликвор зкссудат

Бастериоскопиче- ское исследование

Бастериоскопиче- ское исследование

Бактериологическое исследование

Бактериологическое исследование

Обнаружение антигена

Обнаружение антигена

Сыворотка крови

Сыворотка крови

Серодиагностика

Серодиагностика

1-й этап

1-й этап

Мазок, окраска по Граму. Люминесцентная микроскопия мазков, обработанных флюоресцирующей иммунной сывороткой

Мазок, окраска по Граму. Люминесцентная микроскопия мазков, обработанных флюоресцирующей иммунной сывороткой

Посев на сывороточный питательный агар

Посев на сывороточный питательный агар

РПГА с эритроцитами, нагруженными антителами

РПГА с эритроцитами, нагруженными антителами

РПГ А с парными сыво< ротками

РПГ А с парными сыво< ротками

Ответ

Ответ

Ответ

Ответ

Ответ

2-й этап2-й этапХарактер колоний.Характер колоний.Посев на сывороточный питательный агар (чистаяПосев на сывороточный питательный агар (чистая3-й этап3-й этапМазок, окраска по Г рамуМазок, окраска по Г рамукультура)Посев на «пестрый» ряд Серотипирова-— нне культурыкультура)Посев на «пестрый» ряд Серотипирова-— нне культурыОпределение чувствительности к антибиотикамОпределение чувствительности к антибиотикам

2-й этап

2-й этап

Характер колоний.

Характер колоний.

Посев на сывороточный питательный агар (чистая

Посев на сывороточный питательный агар (чистая

3-й этап

3-й этап

Мазок, окраска по Г раму

Мазок, окраска по Г раму

культура)

Посев на «пестрый» ряд Серотипирова-— нне культуры

культура)

Посев на «пестрый» ряд Серотипирова-— нне культуры

Определение чувствительности к антибиотикам

Определение чувствительности к антибиотикам

Окончательный ответ

щим кровь, сыворотку крови или асцитическую жидкость, которые способствуют росту менингококка； Кроме того, используют данную среду с добавлением антибиотика ристомицина (150 ЕД/мл), который задерживает размножение грамполо- жительных кокков, содержащихся в исследуемом материале, н тем самым способствует выделению чистой культуры менингококка. Образование колоний менингококка на этих средах наблюдается через 48 ч после инкубации посевов при 37℃. В отличие от колонии других кокков колонии менингококка прозрачны, имеют голубоватый оттенок, ровные края и величину с булавочную головку. Такие колонии пересевают в пробирку со скошенным сывороточным агаром для получения чистой культуры.

Идентификацию чистой культуры, дифференциацию от сапрофитных нейссерий, обитающих в носоглотке, проводят по раду признаков. Так, менингококк растет только в присутствии нативного белка, в то время как другие нейссерии размножаются на простых средах и образуют пигмент; на

МатериалМокрота, слизьиз носоглоткиСыворотка кровиБактериоскопическое исследованиеБактериологическоеС еродиагн остикаисследование1-й этапЛюминесцентнаяПосев материалаРеакция агглюти-микроскопия мазков, обработанных флюо-методом «кашлевых нации РСК пластинок» или но-2-й этап3-й этапресцирующей иммунной сывороткойОтветсоглоточными там-Ответпонами на КУА илисреду Борде — ЖангуХарактерМазки,колонийокраскапо ГрамуПересев на пробирки или чашки с КУА либо средой Борде — Жангу (чистая культура) IРост на пи-Проба на уреазутательном 」Реакция агглютинации агаре (пигмент)МатериалМокрота, слизьиз носоглоткиСыворотка кровиБактериоскопическое исследованиеБактериологическоеС еродиагн остикаисследование1-й этапЛюминесцентнаяПосев материалаРеакция агглюти-микроскопия мазков, обработанных флюо-методом «кашлевых нации РСК пластинок» или но-2-й этап3-й этапресцирующей иммунной сывороткойОтветсоглоточными там-Ответпонами на КУА илисреду Борде — ЖангуХарактерМазки,колонийокраскапо ГрамуПересев на пробирки или чашки с КУА либо средой Борде — Жангу (чистая культура) IРост на пи-Проба на уреазутательном 」Реакция агглютинации агаре (пигмент)Схема 7 Микробиологическое исследование при коклюше и паракоклюшеСхема 7 Микробиологическое исследование при коклюше и паракоклюшеОкончательный ответОкончательный ответ

Материал

Мокрота, слизь

из носоглоткиСыворотка крови

Бактериоскопическое исследование

БактериологическоеС еродиагн остика

исследование

1-й этап

Люминесцентная

Посев материалаРеакция агглюти-

микроскопия мазков, обработанных флюо-

методом «кашлевых нации РСК пластинок» или но-

2-й этап

3-й этап

ресцирующей иммунной сывороткой

Ответ

соглоточными там-Ответ

понами на КУА или

среду Борде — Жангу

ХарактерМазки,

колонийокраска

по Граму

Пересев на пробирки или чашки с КУА либо средой Борде — Жангу (чистая культура) I

Рост на пи-Проба на уреазу

тательном 」Реакция агглютинации агаре (пигмент)

Материал

Мокрота, слизь

из носоглоткиСыворотка крови

Бактериоскопическое исследование

БактериологическоеС еродиагн остика

исследование

1-й этап

Люминесцентная

Посев материалаРеакция агглюти-

микроскопия мазков, обработанных флюо-

методом «кашлевых нации РСК пластинок» или но-

2-й этап

3-й этап

ресцирующей иммунной сывороткой

Ответ

соглоточными там-Ответ

понами на КУА или

среду Борде — Жангу

ХарактерМазки,

колонийокраска

по Граму

Пересев на пробирки или чашки с КУА либо средой Борде — Жангу (чистая культура) I

Рост на пи-Проба на уреазу

тательном 」Реакция агглютинации агаре (пигмент)

Схема 7 Микробиологическое исследование при коклюше и паракоклюше

Схема 7 Микробиологическое исследование при коклюше и паракоклюше

Окончательный ответ

Окончательный ответ

средах Гисса с добавлением сыворотки крови менингококк ферментирует до кислоты лактозу и мальтозу.

Фаготипирование менингококка проводят для эпидемиологического анализа. Определение фаготипа производят в реакции агглютинации в пробирках.

Микробиологическая диагностика коклюша

Бактериоскопическое исследование (схема 7). Для быстрого обнаружения и идентификации Bordetella pertussis используют иммунофлзооресяхентный метод. Материал берут стерильным ватным тампоном из носоглотки больного ребенка. Для взятия материала у маленьких детей тампон, приготовленный на тонкой эластичной проволоке, вводят через нос. Тампоном делают два мазка, высушивают их на воздухе и фиксируют на пламени. Один мазок обрабатывают флюоресцирующей иммунной противококлюшной сывороткой, другой — паракоклюш- ной сывороткой. Препараты микроскопируют в люминесцентном микроскопе; просматривают не менее 50 полей зрения.

Рис. 69. Bordetella pertussis (чистая культура).

В положительном случае обнаруживают В. pertussis, для которых характерны темные клетки с четким светящимся венчиком.

Бактериологическое исследование. Основной метод лабораторной диагностики коклюша. Материал для посева берут носоглоточным тампоном (см. выше)

или методом «кашлевых пластинок». Для этого в момент появления кашля открытую чашку Петри с питательной средой - подносят ко рту ребенка и держат в течение 6—8 кашлевых толчков. Правильное и раннее взятие материала позволяет выделить коклюшные микробы в начальном периоде болезни от 8(Н90% больных. Материал засевают на КУА или кровянне среды — к^тгофельно-глицериновый кровяной агар Борде- Жангу и молочно-кровяной агар. В питательные среды добавляют пенициллин для угнетения роста посторонней микрофлоры. Колонии В. pertussis на указанных средах обычно появляются через 48—72 ч культивирования, паракоклюшные — несколько раньше: через 24—72 ч. Бордетеллы образуют мелкие (диаметром около 1 мм) выпуклые влажные блестящие колонии. На КУА колонии имеют серовато-кремовый цвет, а на среде Борде—Жангу приобретают жемчужный или ртутный блеск. Колонии паракоклюшных бактерий более крупные. На среде Борде—Жангу и молочно-кровяном агаре они образуют ограниченную зону гемолиза. Из колонии, выросших на чашках, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии в мазках овоидных грамотрицательных палочек (рис. 69) ставят ориентировочную реакцию агглютинации с коклюшной и паракоклюшной сыворотками. Затем подозрительные колонии пересевают в пробирки для дальнейшего изучения чистых культур бордетелл (табл. 30).•

В отличие от других бордетелл В. pertussis не растут на питательном агаре н не изменяют цвета специальных питательных сред.

Для определения уреазы в агглютинационные пробирки вносят ОД мл 2% раствора мочевины, 0,3 мл густой суспензии испытуемой культуры и 2—3 капли

Таблица 30. Дифферешшальные признаки бордетеллПризнакВ. pertussisB.parapertussusB.bronchisepticusРост на агаре (простом)++То же с тирозиномс коричневой окраской++Изменение цвета: КУАс ярко-коричневой окраскойБур о^коричневыйкровяного агара—Потемнение—Образование уреазы—++Наличие антигенов:родового (общего)777видового (специфического)11412Таблица 30. Дифферешшальные признаки бордетеллПризнакВ. pertussisB.parapertussusB.bronchisepticusРост на агаре (простом)++То же с тирозиномс коричневой окраской++Изменение цвета: КУАс ярко-коричневой окраскойБур о^коричневыйкровяного агара—Потемнение—Образование уреазы—++Наличие антигенов:родового (общего)777видового (специфического)11412Условные обозначения: + наличие признака; — отсутствие признака; цифрами обозначены номера антигенов.Условные обозначения: + наличие признака; — отсутствие признака; цифрами обозначены номера антигенов.0,1% спиртового раствора фенолфталеина. В положительном случае через 20—30 мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщепление мочевины уреазой.0,1% спиртового раствора фенолфталеина. В положительном случае через 20—30 мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщепление мочевины уреазой.Установление серологической специфичности бордетелл, дифференциацию видов и определение сероваров проводят в реакции агглютинации с адсорбированными факторными сыворотками. При этом исходят из того, что антиген (фактор) 7 является родовым, а антиген (фактор) 1 присущ только В. pertussis, 14 — В. parapertussis и 12 — В. bronchiseptica.

Таблица 30. Дифферешшальные признаки бордетелл

Признак

В. pertussis

B.parapertussus

B.bronchisepticus

Рост на агаре (простом)

+

+

То же с тирозином

с коричневой окраской

+

+

Изменение цвета: КУА

с ярко-коричневой окраской

Бур о^коричневый

кровяного агара

—

Потемнение

—

Образование уреазы

—

+

+

Наличие антигенов:

родового (общего)

7

7

7

видового (специфического)

1

14

12

Таблица 30. Дифферешшальные признаки бордетелл

Признак

В. pertussis

B.parapertussus

B.bronchisepticus

Рост на агаре (простом)

+

+

То же с тирозином

с коричневой окраской

+

+

Изменение цвета: КУА

с ярко-коричневой окраской

Бур о^коричневый

кровяного агара

—

Потемнение

—

Образование уреазы

—

+

+

Наличие антигенов:

родового (общего)

7

7

7

видового (специфического)

1

14

12

Условные обозначения: + наличие признака; — отсутствие признака; цифрами обозначены номера антигенов.

Условные обозначения: + наличие признака; — отсутствие признака; цифрами обозначены номера антигенов.

0,1% спиртового раствора фенолфталеина. В положительном случае через 20—30 мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщепление мочевины уреазой.

0,1% спиртового раствора фенолфталеина. В положительном случае через 20—30 мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщепление мочевины уреазой.

Бактериологическое исследование продолжается не менее 5 дней. При бактериологической диагностике коклюша может возникнуть необходимость дифференциации бордетелл от гемоглобинофильной бактерии Haemophilus influenzae, относящейся к роду Haemophilus. Палочка инфлюэнцы часто встречается на слизистой оболочке дыхательных путей и вызывает ряд воспалительных заболеваний. В отличие от бордетелл Н. influenzae выращивается только на кровяных питательных средах — кровяном агаре, «шоколадном» агаре Левинталя, содержащих X-фактор (гемин) и V-фактор (коэнзим дегидрогеназы). Идентификацию выделенной культуры производят на основании комплексного изучения морфологических, культуральных, биохимических и серологических свойств.

Серодиагностика. Реакция агглютинации и РСК применяются в основном для ретроспективного подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики атипичных форм коклюша. Агглютинины в крови больных появляются на

3—4-й неделе заболевания в титрах 1 20 и выше. В условиях массовой вакцинации детей против коклюша диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4—5 дней.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Вакцина АКДС. Адсорбированная коклюшно-дифтерийно- столбнячная вакцина. Содержит взвесь коклюшных бактерий, убитых формалином или мертиолатом, и очищенные концентрированные дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидрате окиси алюминия. Применяется для ассоциированной вакцинации детей против коклюша, дифтерии и столбняка.

Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получен из плацентарной или венозной крови человека. Содержит специфические антитела против возбудителей многих инфекционных заболеваний, в том числе возбудителя коклюша. Применяется для пассивной профилактики и лечения коклюша.

Агглютинирующие адсорбированные (факторные) сыворотки. Применяются для серологической дифференциации коклюшных бактерий.

Тема 26. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

ТУБЕРКУЛЕЗА И АКТИНОМИКОЗА

Программа занятая

Изучение схем микробиологической диагностики туберкулеза и актиномикоза.

Бактериоскопическое и бактериологическое исследования при туберкулезе и актиномикозе.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые при туберкулезе и актиномикозе.

Демонстрация

Мазок из чистой культуры микобактерий туберкулеза, окрашенный по Цилю—Нельсену.

Препарат микобактерий туберкулеза в люминесцентном микроскопе.

Ускоренный метод микробиологической диагностики туберкулеза.

Рост туберкулезных микобактерий на среде Левенштейна—Йенсен а.

Питательные среды для культивирования туберкулезных микобактерий.

Туберкулин, вакцина БЦЖ, антибиотики и химиотерапевтические противотуберкулезные препараты.

Мазки из чистой культуры актиномицетов.

Друзы патогенных актиномицетов в препаратах гноя.

Рост актиномицетов на питательных средах.

审」审」Биохимические тесты для идентификации актиномицетов

审」

审」

И. РСК для серодиагностики актиномикоза.

Актинолизат, актиномицетная поливалентная вакцина^

Антибиотики и химиотерапевтические препараты.

Задавие для вылолвенвя лабораторной работы

Бактериоскопическое исследование при туберкулезе. Материал для исследования — мокрота, взятая у больных с подозрением на туберкулез легких. Окрасить приготовленные из мокроты мазки и провести микроскопи> ческое исследование. Сделать заключение и наметить ход дальнейшего исследования для подтверждения бактериоскопического даигноза.

Бактериологическое исследование при туберкулезе： а) отметить характер роста исследуемой культуры на среде Левенштейна—Йенсена; б) отметить результаты ниациновой пробы； в) определить чувствительность микобактерий туберкулеза к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам. Отметить наличие или отсутствие роста микобактерий на среде Левенштейна—Иенсена с разными концентрациями противотуберкулезных препаратов. Сопоставить полученные данные с клиническими границами устойчивости туберкулезных микобактерий. Дать окончательное заключение по проведенным исследованиям.

Сделать заключение на основании лабораторных данных исследования морфологических, культуральных и биохимических свойств выделенной культуры, предположительно отнесенной к роду Actinomyces.

Микробиологическая диагностика туберкулеза

Возбудители туберкулеза — Mycobacterium tuberculosis, М. bovis — являются кислотоустойчивыми бактериями, характеризующимися медленным ростом на питательных средах. Заражение происходит воздушно-капельным путем, иногда через желудочно-кишечный тракт.

Основные методы, применяемые для микробиологической диагностики туберкулеза, приведены на схеме 8.

Методические указания

Материал для исследования: мокрота, экссудат, гной, промывные воды бронхов, желудка, ликвор, моча. Для консервации и ингибиции сопутствующей микрофлоры патологический материал перед транспортировкой в лабораторию обрабатывают 10% раствором фосфата натрия.

Бактериоскопическое исследование (схема 8). Мокроту помещают в чашки Петри и ставят на черную поверхность. Петлей или препаровальными иглами выбирают гнойный комочек, переносят его на предметное стекло ближе к одному из концов и, растирая между двумя стеклами, готовят мазок. Ликвор отстаивают в холодильнике и готовят мазки из нежной пленки фибрина, в которой находятся микобактерии туберкулеза и клеточные элементы. Мочу центрифугируют 164

VJUd

Нонн

•do wagJOG

Easluo

ttOUAdh

Mod

«Msboo€stt.o&vo

ss^x MMHOaottsu

sOHSlfAxdg9A.i 0 B9edu jm8hsJdgulf，oH%ox 4— Xg8olrvhutasuio dNHqyawmlHOXо

UXKS05C.Q0S

备』do ей

T gauqdxjg

ss sxgEn

MOXS0U xsxodos gsHMWBm

Bgoduosg

*0s9mHE к sbo •OHqlmsCQbQHAh gJHHglfgr&UOJ

L usxoosssxos^ gsMdF и d9 ■odu BemoHHnBHH

AHgoqugH I опт吕 ОС zxoEdxoxogBW ErQod qJQOdoMQ и dREdEX

§«so

§sn«Tz

(>sgHr £ s 二gdgE AHg° .Л5ШI 2K-S»- ОС 00мss EXQBdxo

XBUX2Q xlqHlgsFgdu bh dAIqlMMOd

•xss gsHghAIfo口

vsxsos^oos

^BS^MBos^^ EHguHgsI BH>s2InHe)ttgu^5& eh Soos

goxshsJolfosdEB g

AHguqlfoH I ollfssrОС Ewdxos管 E3

^ssa^HOC.^^ bsHgmEJOgo qalgw

Ea8E0

SSEOXQO&SS «0SHSU90USSS •опт шгр Х08ЕП

AHguqlfoH I 2§д ОС as&s -«Oss

osx^aosc-oos VOMOV^SCOMQOS&bx^

.drsEhos»&nMSK-.虫OH J ^SOOMm«lodxon

S2.m«I

SSAttss

esITEdogxl HdHoHmmoH胃 QQH 903iddbHJe40H9bdxHs.8 Esg x0

и делают мазки из осадка. Препараты из мочи обязательно обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации микобактерий туберкулеза от М. smegmatis, которые могут находиться в моче здоровых людей. В отличие от микобактерий туберкулеза они обесцвечиваются спиртом.

Мазки окрашивают по Цилю — Нельсену и микроскопируют, просматривая до 100 полей зрения в препарате. Микобактерии туберкулеза окрашиваются в ярко-красный цвет, располагаются поодиночке или небольшими скоплениями (см. рис. 17). Единичные бактерии можно обнаружить в препарате, если их содержание не менее 105 в 1 мл мокроты. Поэтому при небольшом содержании микобактерий туберкулеза в материале применяют методы «обогащения» — гомогенизации и осаждения или флотации.

Метод гомогенизации и осаждения. К суточной порции мокроты добавляют равный объем 1 % раствора едкого натра (или антиформина) для гомогенизации, флакон плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 10—15 мин После центрифугирования и нейтрализации кислотой из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю — Нельсену.

Метод флотации. Мокроту гомогенизируют и прогревают при 55℃ в течение 30 мин на водяной бане. Затем добавляют 1—2 мл ксилола, дистиллированную воду, повторно встряхивают в течение 10 мин и отстаивают 20 мин при комнатной температуре. На поверхности образуется пена, состоящая из всплывших капелек ксилола с адсорбированными микробами. Пипеткой или петлей из пенообразного слоя готовят мазок, несколько раз наслаивая материал на предметное стекло по мере его высыхания. Мазок обезжиривают эфиром, фиксируют нагреванием и окрашивают по Цилю—Нельсену.

Применение люминесцентной микроскопии повышает число находок микобактерий туберкулеза в патологическом материале.

Микроскопическое исследование является ориентировочным и позволяет судить лишь о наличии кислотоустойчивых бактерий в материале без определения видовой и типовой принадлежности.

Бактериологическое исследование. Для посева используют предварительно обработанный Na3PO4 исследуемый материал; необработанный материал непосредственно перед посевом в течение нескольких минут подвергают действию 10% серной кислоты или 4 — 6% раствора едкого натра для освобождения

от сопутствующей микрофлоры, затем тщательно встряхивают и центрифугируют. Осадок нейтрализуют и засевают на несколько пробирок со средой Левенштейна — Йенсена или другими специальными средами. Среду Левенштейна — Йенсена готовят из суспензии свежих яиц, картофельной муки, глицерина, аспарагина, КН2РО4, сульфата и цитрата магния и малахитового зеленого. Среду свертывают в наклонном положении при 85℃ в течение 45 мин. Посевы инкубируют при 37℃ 4 — 6 нед и более, так как микобактерии туберкулеза размножаются очень медленно, особенно в первых генерациях. Культуры этих микобактерий имеют вид сероватого или светло-кремового морщинистого или крошкообразного сухого налета (рис. 70).

При идентификации выделенной культуры микобактерий туберкулеза и дифференциации ее от потен циально-патогенных микобактерий учитывают морфологические и тинкториаль- ные особенности, характер и скорость роста на питательных средах, биохимические свойства и вирулентность для лабораторных животных. Из биохимических свойств чаще всего определяют способность исследуемой культуры синтезировать никотиновую кислоту (ниациновая проба Конно). Это один из важных признаков, с помощью которого удается отличить Mycobacterium tuberculosis, хорошо синтезирующие никотиновую кислоту, от палочек М. bovis, образующих ее в минимальных количествах.

Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5% раствора хлорамина. При наличии ниацина через несколько минут появляется ярко-желтая окраска. Для нейтрализации KCN после учета результатов реакции в пробирке добавляют 3—5 мл 10% раствора гидрокарбоната натрия.

Для ускорения диагностики используют метод микрокультур Прайса. На нескольких предметных стеклах (ближе к одному концу) делают толстые мазки из исследуемого материала. Мазки высушивают, обрабатывают несколько минут 2—6% серной кислотой и нейтрализуют. Затем стекла опускают во флаконы с гемолизированной цитратной кровью в разведении 1 ：4— 1:8 и ставят в термостат. Через 7 — 14 дней извлекают стекла, фиксируют препарат, окрашивают по Цилю — Нельсону и микроскопируют (рис. 71) — вирулентные штампы образуют микрокультуры, имеющие вид жгутов или кос (корд-фактор).

Определение чувствительности микобактерий туберкулеза к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам проводят

методом серийных разведений. С этой целью по 0,1 мл взвеси микобактерий туберкулеза засевают в пробирки со средой Левенштейна — Йенсена, содержащей различные концентрации антибактериальных препаратов первого и второго ряда: 5, 10, 50 мкг/мл стрептомицина; 5, 10, 50, мкг/мл ПАСК; 1, 5, 10, 25 мкг/мл тубазида; 30 мкг/мл циклосерина и этионамида. Учитывают результаты на 12 —21-й день инкубации. Клинические границы устойчивости микобактерий туберкулеза: стрептомицин — 5 мкг/мл, ПАСК —10 мкг/мл, тубазид — 1 мкг/мл, циклосерин и этионамид — 30 мкг/мл.

Биопроба. Применяется при первичной диагностике с целью выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза из

органов животного, зараженного исследуемым материалом, а также для определения вирулентности этих микобактерий. Исследуемый материал обрабатывают серной кислотой для освобождения от посторонней микрофлоры, нейтрализуют и вводят подкожно в количестве 2 — 3 мл морской свинке с отрицатель ной туберкулиновой реакцией. Через 4 мес, если животное не погибнет, его забивают, проводят макро- и микроскопическое исследование органов и делают посевы. М. tuberculosis высокопатогенны для морских свинок и

малопатогенны для кроликов, М. bovis непатогенны для морских свинок и кроликов.

Серодиагностика. Проводится ограниченно, ставят РСК и РПГА. Положительные результаты отмечаются при активном туберкулезном процессе в организме, а также при инфицировании микобактериями туберкулеза и вакцинации БЦЖ.

Кожно-аллергическая проба. Ставится с туберкулином — очищенной белковой фракцией, полученной из микобактерий туберкулеза, для характеристики состояния аллергии у людей с целью определения инфицированности, оценки течения туберкулезного процесса, определения эффективности вакцинации и отбора контингентов для ревакцинации против туберкулеза. Туберкулин вводят внутрикожно в строго определенной дозировке. Учитывают реакцию через 24 — 48 ч по образованию гиперемии и папулы (см. рис. 50).

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Туберкулин сухой очищенный. Получен из фильтрата бульонной культуры микобактерий путем добавления химических веществ, осаждающих белок, с последующей очисткой. Применяется для постановки кожно-аллергической пробы (реакция Манту).

Вакцина БЦЖ. Живая лиофильно высушенная культура апатогенного штамма микобактерий туберкулеза, полученного французскими учеными Кальметтом и Гереном. Применяется внутрикожно для активной специфической профилактики туберкулеза.

Антибиотики и химиотерапевтические препарать!, применяемые для лечения туберкулеза. К препаратам первого ряда относятся основные противотуберкулезные препараты： стрептомицин, ПАСК и производные ГИНК： тубазид, фтивазид, метазид, к препаратам второго ряда — циклосерин, канамицин, этионамид. При лечении больных обычно комбинируют препараты первого и второго ряда с учетом клинической характеристики заболевания и чувствительности микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам.

Микробиологическая диагностика актиномикоза

Возбудителями актиномикоза являются Actinomyces bovis, Actinomyces israelii. Они вызывают заболевания, проявляющиеся в поражении легких и, реже, других органов и тканей. Основным методом лабораторной диагностики актиномикоза являются бактериоскопическое и бактериологическое исследования.

Методические указания

Материал для исследования： гнойное отделяемое, мокрота, моча, пунктат и биоптаты ткани из глубоких и закрытых очагов поражения.

Микроскопическое исследование. Подозрительные плотные комочки из патологического материала переносят на предметные стекла в каплю 10—20% раствора гидрокарбоната натрия, слегка подогревают и готовят препарат «раздавленная» капля, который исследуют под микроскопом с объективами 8 и 40. В положительном случае в препаратах обнаруживаются актиномицеты в виде друз — характерных зернистых образований с плотным центром, окруженным лучистыми нитевидными клетками. Наряду с друзами встречаются отдельные грамположительные неравномерно окрашивающиеся ветвистые бактерии (см. рис. 15).

Бактериологическое исследование. Материал засевают штрихом на две чашки с кровяным агаром, содержащим экстракт сердечной мышцы. Одну чашку инкубируют в атмосфере азота, водорода и СОг, вторую —в анаэробных условиях с добавлением 5% СО2. Через 18—24 ч образуются микроколонии, а через 1—2 нед —зрелые колонии. Характерным признаком является «паукообразная» структура микроколонии с многочисленными

ветвящимися нитями или зернистый центр с ветвящимися нитями по периферии. Зрелые колоний могут быть плоскими, моршинистыми, бугристыми или пленчатыми. Характер колонии и морфология клеток во многих случаях позволяют отнести исследуемую культуру к роду Actinomyces. Окончательная идентификация культуры до вида проводится на основании биохимических и антигенных свойств (табл. 31).

ПризнакA. bovisA. israeliiХарактер микроколонийГ ладкиеШероховатыеГидролиз крахмала (широкая зона)+—Ферментация (до кислоты):арабинозы—+/-рибозы—+ксилозы+/一+рафинозы—+/-растворимого крахмала++/-ПризнакA. bovisA. israeliiХарактер микроколонийГ ладкиеШероховатыеГидролиз крахмала (широкая зона)+—Ферментация (до кислоты):арабинозы—+/-рибозы—+ксилозы+/一+рафинозы—+/-растворимого крахмала++/-Таблица 31. Дифференциальные прпзнаки Actinomyces bovis и Actinomyces israeliiТаблица 31. Дифференциальные прпзнаки Actinomyces bovis и Actinomyces israeliiУсловные обозначения: + наличие признака; — отсутствие признака; + /— вариабельность признака.Условные обозначения: + наличие признака; — отсутствие признака; + /— вариабельность признака.Быстрые и специфические результаты дает иммунофлюорес- центное исследование.

Признак

A. bovis

A. israelii

Характер микроколоний

Г ладкие

Шероховатые

Гидролиз крахмала (широкая зона)

+

—

Ферментация (до кислоты):

арабинозы

—

+/-

рибозы

—

+

ксилозы

+/一

+

рафинозы

—

+/-

растворимого крахмала

+

+/-

Признак

A. bovis

A. israelii

Характер микроколоний

Г ладкие

Шероховатые

Гидролиз крахмала (широкая зона)

+

—

Ферментация (до кислоты):

арабинозы

—

+/-

рибозы

—

+

ксилозы

+/一

+

рафинозы

—

+/-

растворимого крахмала

+

+/-

Таблица 31. Дифференциальные прпзнаки Actinomyces bovis и Actinomyces israelii

Таблица 31. Дифференциальные прпзнаки Actinomyces bovis и Actinomyces israelii

Условные обозначения: + наличие признака; — отсутствие признака; + /— вариабельность признака.

Условные обозначения: + наличие признака; — отсутствие признака; + /— вариабельность признака.

Серодиагностика. Ставится РСК с сывороткой крови больного и антигеном, представляющим собой поливалентный актинализат. Положительная реакция наблюдается у 80% больных людей.

Кожно-аллергическая проба. Ставится с экстрактом из акти- номицетов.

Диагностические и лечебные препараты

Актинолизат. Фильтрат бульонной культуры спонтанно лизированных штаммов актиномицетов. Применяется для специфической иммунотерапии н в качестве антигена для постановки РСК.

Актиномицетная поливалентная убитая вакцина. Готовится из спороносных штаммов актиномицетов. Применяется с лечебной целью.

Антибиотики и химиотерапевтические препараты: тетрациклин, стрептомицин, левомицетин, ристомицин, канамицин, сульфаниламиды.

Тема 27. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

ДИФТЕРИИ

Возбудитель дифтерии — Corynebacterium diphtheriae - относится к порядку Actinomycetales роду Corynebacterium, не включенному в какое-либо семейство. Кроме дифтерийной палочки, к этому роду принадлежат псевдо дифтерийная палочка С. xerosis, а также дифтероиды — С. pseudodiphtheriticum и др., являющиеся представителями нормальной микрофлоры. Основной биологической особенностью возбудителя дифтерии является способность продуцировать токсин, определяющий патогенез заболевания. Местный патологический процесс обычно локализуется в зеве.

Лабораторная диагностика проводится путем бактериоскопи- ческого и бактериологического исследований.

Программа занятия

Изучение схемы микробиологической диагностики дифтерии.

Бактериоскопическое и бактер ио логическое исследования при дифтерии.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые при дифтерии.

Демонстрация

Мазки из чистых культур дифтерийных бактерий и дифтероидов, окрашенные по Нейссеру и Граму,

Мазок дифтерийных бактерий, окрашенный корнфосфнном, в люминесцентном микроскопе.

Рост дифтерийных бактерий и дифтероидов на свернутой сыворотке и теллуритовой среде.

«Пестрые» ряды культур дифтерийной палочки и дифтероидов. Пробы на цистиназу и уреазу.

Определение токсигенности дифтерийной культуры (в реакции преципитации в агаре).

Ускоренный метод диагностики дифтерии.

Токсин Шика, дифтерийный анатоксин, противодифтерийная сыворотка.

Задание для вьшолнения лабораторной работы

Бактериоскопическое исследование： а) микроскопировать мазки, приготовленные из материала, взятого из зева лиц с подозрением на дифтерию или бактерионосительство； б) определить метод окраски и дать предварительное заключение. Наметить ход дальнейшего исследования для подтверждения бактериоскопического диагноза.

Бактериологическое исследование： а) описать рост культуры, полученной на свернутой сыворотке, и колоний на теллуритовой среде； б) отметить результаты готовых посевов исследуемых культур на средах «пестрого» ряда； в) в случае обнаружения С. diphtheriae определить ее токсигенность. Сопоставить данные бактериоскопического и бактериологического исследований с целью идентификации выделенной культуры и поставить окончательн ый микро биологический

диагноз.

Схема 9. Микробиологическое исследовапие прп дифтерии

Материал

1-иэтаи

2-и этап

3-й этап

Слизь из зева и носа, пленки миндалин и носоглотки и др.

Бактериоскопическое исследование

Бактериологическое исследование

Мазки, окраска корифосфином (люминесцентная микроскопия)

Мазки, окраска по Г раму и Нейссеру

Посевы на свернутую сыворотку, кровяной агар или среду Клау- бергаI

Ответ

Характер культур и колоний

Мазки, окраска по Г раму и Нейссеру

Пересев на свернутую сыворотку(чистая культура)J I］】

Посев на «пестрый» ряд 1 I I Гемолиз

Определение токсигенности*-* I UПроба на цис- тиназу

'"->Проба на уре

азу

Реакция агглютинации

Окончательный ответ

Методические указания

Бактериоскопическое исследование (схема 9). Материал берут двумя, ватными стерильными тампонами, один из которых используют для приготовления мазков, другой — для посева. Мазки окрашивают по Нейссеру и Граму. Для дифтерийной палочки характерно наличие полярно расположенных зерен волютина и положение в виде буквы «V» (см. рис. 19). Диф- тероиды и псевдодифтерийная палочка не имеют зерен волютина или содержат их не на концах, а по длине палочки. Кроме того, сами бактерии располагаются в виде «частокола».

Применение люминесцентной микроскопии позволяет повысить эффективность исследования. При этом дифтерийные палочки можно отличить от пс едо дифтерийных по коричневокрасному свечению зерен волютина, которое они приобретают после окраски флюорохромом — корифосфином. Цитоплазма этих бактерий дает зеленое или желтое свечение. Однако дифтерийные палочки часто изменяют свою морфологию, в частности при санации зева антибиотиками, поэтому для точной идентификации возбудителя проводят бактериологическое исследование.

Таблица 32. Биологические свойства дифтерийной палочки и сходвых с иед коринебактерий

Вид

Зерна волютина

Гемолиз

Ферментация

Ток- си- ген- ность

Цис- тн- наза

Уреаза тина-

Аг- глю- тина< ция про- тиво・ диф- те- рий- ной сывороткой

Патогенность для человека

сахарозы

глюкозы

крахмала

С. diphtheriae：

биовар gravis

» mitis

С. xerosis

С. pseudodiphthericum

+

+

-/+

-/+

+

+

+ + +

+

+/_ +/_

+ + +/-

+

+ +

+ +

Условные обозначения те же, что и в табл. 31

Бактериологическое исследование. Материал засевают на элективные питательные среды — свернутую сыворотку н теллуритовую среду Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия, глицерином и дефибринированной кровью) для получения чистой культуры. На этих средах задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева, что способствует размножению бактерий дифтерии. Дифтерийная палочка образует на свернутой сыворотке мелкие круглые колонии с уплотнением в центре. При сплошном росте поверхность культуры напоминает шагреневую кожу. На теллуритовой среде бактерии дифтерии биовара gravis формируют колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающей цветок маргаритки, тип mitis — круглые выпуклые колонии черного цвета вследствие интенсивного восстановления теллура (рис. 72). Выделенную культуру дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфологическим особенностям, ферментации сахарозы, глюкозы, крахмала, токсиген- ности и антигенным признакам (табл. 32).

Способность бактерий дифтерии продуцировать токсин устанавливают в реакции преципитации в агаре. Для этого в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15—20% лошадиной сыворотки, 03% мальтозы и 0,03% цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги (1,5X6 см), пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37℃ в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге

штрихов на расстоянии 0,6—0,8 см от края бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. Посевы инкубируют при 37℃ до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения токсина с антитоксином в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий — «усов» (см. рис. 59).

В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительные пробы на цистиназу, уреазу и реакцию агглютинации с агглютинирующей дифтерийной сывороткой.

Для определения цистиназы (проба Пизу) в столбик питательного агара с цистином уколом засевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при 37℃ до следующего дня. Истинные дифтерийные палочки вызывают почернение среды по ходу посева (в результате образования сульфида свинца), вокруг которого появляется зона коричневого цвета, а на глубине 1 см от поверхности в среде образуется коричневое «облачко».

Для определения уреазы (проба Закса) готовят спиртовый раствор мочевины и раствор индикатора — фенолового красного, которые смешивают перед употреблением в соотношении 1 • 9 и разливают по 1—2 мл в агглютинационные пробирки. Затем одну петлю исследуемых бактерий вносят и растирают по стенке пробирки. После 20—30-минутной инкубации при 37℃ наблюдают расщепление мочевины уреазой, в результате чего среда приобретает красный цвет.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Токсин Шика. Высокоочищенный экзотоксин дифтерийных бактерий. Применяется для постановки внутрикожной реакции Шика с целью определения напряженности антитоксического ; иммунитета против дифтерии у детей.

Дифтерийный адсорбированный очшценныи анатоксин (АД). Дифтерийный экзотоксин, обезвреженный формалином при нагревании с последующей очисткой, концентрацией и адсорбцией на гидрате окиси алюминия. Применяется для проведения активной иммунизации против дифтерии. Входит в состав адсорбированного дифтерийно-столбнячного анатоксина (АДС) и АКДС.

Противодифтерийная антитоксическая сыворотка. Получена из крови лошадей, гипериммунизированных дифтерийным анатоксином, очищают и концентрируют методом диаферм-3. Активность сыворотки измеряется в международных единицах.； Применяется для профилактики и лечения дифтерии.

Агглютинвфующая противодифтерийная сыворотка (поливалентная и типовые). Применяется для дйфференциации бактерий дифтерии от дифтероидов.

ВОЗБУДИТЕЛИ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ,

ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ И ИНТОКСИКАЦИЙ

Кишечные инфекции вызываются： а) бактериями, принадлежащими к сем. Enterobacteriaceae, трибам Escherichieae, Salmonella, Shigella и, реже, Yersiniae (Y. enterocolitica) и Klebsielleae； б) холерными вибрионами (Vibrio cholerae и др.) сем. yibrionaceae； в) анаэробными грамотрицательными неспоровыми бактериями — бактероидами и вейллонеллами.

Пищевые отравления (токсикоинфекции и интоксикации) вызываются сальмонеллами, протеями, относящимися к сем. Enterobacteriaceae, и микроорганизмами, продуцирующими токсины, относящимися к семействам Micrococcaceae (Staph, aureus), Bacillaceae (Cl. perfringens и Cl. botulinum) (табл. 33).

Таблица 33 Возбудители бактериальных кишечных инфекций

Возбудители, вызывающие

острые кишечные заболевания

пищевые токсикоинфекции

пищевые интоксикации

Е. coii — колиэнтериты, дизентериеподобные и холероподобные заболевания

S. typhi, S. paratyphi A, S. schottmuei- leri — брюшной тиф и паратифы

Yersinia enterocolitica — энтериты Enterobacter sp. — энтериты Bacteroides sp. — энтериты Veillonella sp. — энтериты

Vibrio cholerae — холера (гастроэнтероколит)

S. typhimurium и другие виды сальмонелл

Shigella sonnei

Proteus vulgaris и другие виды Proteus

Е. coli

Белковые токсины： Staph, aureus. Cl. perfringens. Cl. botulinum

Обнаружение возбудителей кишечных инфекций и пищевых отравлений имеет большое диагностическое и эпидемиологическое значение. Оно позволяет подтвердить клинический диагноз заболевания, выявить бактерионосителей, установить источник заражения, пути передачи и своевременно провести противоэпидемические мероприятия. Основным (а при некоторых кишечных инфекциях единственным) методом определения

вида возбудителя является бактериологическое исследование, так как клиническое течение кишечных заболеваний не всегда позволяет поставить правильный диагноз.

Тема 28. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

В данную тему включены исследования при острых кишечных инфекциях： колиэнтеритах детей раннего возраста, дизентериеподобных заболеваниях детей и взрослых, дизентерии, брюшном тифе и паратифах.

Проп^амма занятая

Изучение схем микробиологической диагностики кишечных инфекций.

Бактериологическая и серологическая диагностика кишечных инфекций.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые при кишечных инфекциях.

Демоис^ацни

Мазки из читых культур возбудителей кишечных инфекций： Е. coli, S. typhi, S. paratyphi A, Shigella sonnei.

Колонии эшерихий, шигелл, сальмонелл на дифференциально<диагности> ческих питательных средах.

Агглютинирующие сальмонеллезные, дизентерийные и ОВ-коли-сыво> ротки, брюшнотифозные монодиагностикумы, вакцины, бактериофаги (брюшно< тифозный, дизентерийный, коли-протейный и др.), антибиотики и химиотера^ певтические препараты.

Задаяне для вьшолиения лабораторной работы

Занятие 1-е

Бактериологическая диагностика колиэнтерита — первый этап： материал для исследования — фекалии больного ребенка посеять на чашки со средой Эидо.

Бактериологическая диагностика дизентерии и дизентериеподобных заболеваний, вызванных эшерихиями — первый этап： материал для исследования —фекалии больного посеять на чашки со средой Плоскнрева и Эндо.

Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов.

Выделение гемокультуры. Материал для исследования — кровь больного. Первый этап： исследование гемокультуры, ранее полученной на среде Рап- попорт〔： а) отметить характер роста, наличие или отсутствие газообразования； б) приготовить мазкн, окрасить по Граму и микроскопировать； в) сделать пересевы в пробирку со средой Ресселя и на чашки со средой Эндо.

Выделение копрокультуры — первый этап： материал для исследования — фекалии больного посеять^в пробирку со средой Мюллера или с селенитовой средой и на чашки со средой Эндо. Наметить план второго этапа бактериологического исследования при колиэнтерите. дизентерии и дизентериеподобном заболевании, брюшном тифе.

I Посев на среду Раппопорт следует произвести накануне (для экономии времени).

176

Занятие 2-е

Продолжение бактериологической дигностики колиэнтерита. Второй этап а) описать колонии, выросшие на среде Эндо； б)приготовить мазки из колонии, окрасить по Граму и микроскопировать； в) провести серологическую идентификацию выросших на среде Эндо колоний в реакции агглютинации на стекле с ОВ-агглютинирующими сыворотками: Сделать заключение по проведенным исследованиям и наметить план дальнейшего анализа для установления серовара выделенной культуры.

Продолжение бактериологической диагностики дизентерии и дизентерие> подобного заболевания. Второй этап： а) описать колонии, выросшие на средах Плоскирева и Эндо; б) сделать пересев бесцветной колонии со (феды Плоски- рева на среду Ресселя； в) провести серологическую идентификацию выросших на среде Эндо колоний в реакции агглютинации на стекле с агглютинирующими диагностическими сыворотками для установления серотипа выделенной культуры. Сделать заключение.

Продолжение бактериологической диагностики брюшного тифа и пара* гифов.

I. Выделение гемокультуры. Второй этап: а) отметить характер роста гемокультуры на среде Ресселя и на чашке со средой Эндо; б) провести серологическую идентификацию выделенной на среде Ресселя гемокультуры в реакции агглютинации с агглютинирующими диагностическими сыворотками. Сделать заключение по проведенным исследованиям.

П. Выделение копрокультуры. Второй этап： а) отметить характер роста на средах Эндо и Мюллера； б) пересеять бесцветную колонию со среды Эндо в пробирку со средой Ресселя.

Серодиагностика брюшного тифа и паратифов. Учесть результаты реакции Видаля. На основании полученных данных поставить серологический диагноз и в положительном случае определить период заболевания брюшным тифом.

Занятие 3 -с

L Окончание бактерио лог и ческой диагностики дизентерии. Третий этап а) отметить характер роста на среде Ресселя； 6) провести серологическую идентификацию копрокультуры в реакции агглютинации на стекле с диагностическими агглютинирующими дизентерийными сыворотками Сделать окончательное заключение.

Окончание бактериологического исследования копрокультуры при брюш< ном тифе. Третий этап： а) отметить рост на среде Ресселя； б) провести серо» логическую идентификацию копрокультуры в реакции агглютинации на стекле с диагностическими агглютинирующими тифозной и паратифозными сыворотками. Сделать окончательное заключение.

Микробиологическая диагностика колиэнтеритов и дизентериеподобных заболевании (эшерихиозов)

Возбудителями колиэнтеритов являются эшерихии определенных серогрупп (026, 055, ОШ и др.), отличающиеся друг от друга антигенной структурой. Дизентериеподобные заболевания вызываются эшерихиями серогрупп 025,0112,0124 и др. Микробиологическая диагностика этих инфекций проводится исключительно бактериологическими методами. Бактериоскопический метод и серодиагностика не применяются.

Мет(ьдическ:ие указанияМет(ьдическ:ие указанияБактериологическое исследование (схема 10). Испражнения ребенка засевают на чашки со средой Эндо для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37℃ до следующего дня, затем из части красной колонии (рис. 73) делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. По морфологии эшерихии практически не отличаются от шигелл и сальмонелл (рис. 74). Материал из другой части колонии используют для постановки реакции агглютинации на стекле со смесью ОВ-сывороток, содержащих антитела против наиболее распространенных серогрупп энтеропатогенных эшерихий. Обычно проверяют на агглютинабельность не менее 10 колоний с каждой чашки. При положительном результате ставят реакцию агглютинации с сыворотками 026:В6, О55：В* О111:В4, О124:В17 и др., после чего делают предварительное заключение. Затем пересевают несколько агглютинабельных колоний на скошенный питательный агар для получения чистых культур. На 3-й день проверяют агглютинабельность чистых культур в реакции агглютинации на стекле со смесью ОВ-сыво-

Мет(ьдическ:ие указания

Мет(ьдическ:ие указания

Схема 10. Бактериологическое исследовавие прм колиэитеритях и дизенте- рвеподобных заболеваниях (эшерихиозах)

МатериалИспряжпенияМатериалИспряжпенияПересев агглютинабельных колоний на скошенный питательный агар (чистая культура)Пересев агглютинабельных колоний на скошенный питательный агар (чистая культура)3-й этап Реакция агглютинации на стекле со смесями ОВ-сы- <— вороток Реакция агглютинации с типоспецифическими < сыворотками

МатериалИспряжпения

МатериалИспряжпения

Пересев агглютинабельных колоний на скошенный питательный агар (чистая культура)

Пересев агглютинабельных колоний на скошенный питательный агар (чистая культура)

I Развернутая реакция агглютинации*> Посев на «пестрый&> рядI Развернутая реакция агглютинации*> Посев на «пестрый&> рядОкончательный ответ

I Развернутая реакция агглютинации

*> Посев на «пестрый&> ряд

I Развернутая реакция агглютинации

*> Посев на «пестрый&> ряд

Рис. 74. Возбудители тифо-паратифозных заболеваний.

/ S. typhi; 2 - S. paratyphi; 3 Е. coli.

роток, а затем с отдельными ОВ-сыворотками. При положительном результате ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с соответствующей ОВ-сыво- роткой. Для этого готовят два ряда разведений агглютинирующей ОВ-сыворотки. В пробирки первого ряда вносят живую исследуемую культуру Е. coli, второго ряда — туже культуру, предварительно прокипяченную

на водяной бане в течение часа.на водяной бане в течение часа.Использование в качестве антигена убитых нагреванием бактерий связано С наличием у живых К-антигена, который часто препятствует проявлению О-агглютинабельности.

на водяной бане в течение часа.

на водяной бане в течение часа.

Микробиологическая диагностика дизентерии

Возбудителями бактериальной дизентерии являются микроорганизмы, относящиеся к роду Shigella. Современная классификация шигелл приведена в табл. 34.

Микробиологическая диагностика дизентерии проводится главным образом бактериологическим методом.

Методические указания

Бактериологическое исследование (схема 11). Фекалии больного засевают на среду Плоскирева. При наличии в исследуемых испражнениях гнойных или слизисто-кровянистых комочков их выбирают петлей, промывают в изотоническом растворе хлорида натрия и наносят на поверхность среды Плоскирева, после чего тщательно растирают шпателем. На 2-й день прозрачные бесцветные колонии пересевают на среду Ресселя

；• 4亦

Схема 11.

Материал

1-й этап

3-й этап

Микробиологическое всследование при дизентерии

Исцражненяя

Бактериологическое исследование

1

Характер и цвет колоний Мазок, окраска по Граму ~ Реакция агглютинации на + стекле со смесями дизен« терийных сывороток

Ответ

—

2-и этап

Посев на дифференциальные среды (Плоскирева и др.)

Сьторозка крови

Серодиагностика

Реакция агглютинации (по типу реакции Видаля) с дизент^)ийными диа- гностикумами. РПГА с эритроцитарными диа> гностикумами

Пересев бесцветных колоний на среду Рес- селя или трехсахарную среду

Мазок, окраска по Граму Регистрация изменений <• цвета среды

Ответ

Посев на «пестрый» ряд > Реакция агглютинации на стекле со смесями дизен-

терийных сывороток, а затем с видовыми и типовы- ми сыворотками

Окончательный ответ

или на короткий «пестрый» ряд с лактозой и глюкозой. Оставшуюся часть колоний используют для прстановки ориентировочной реакции агглютинации на стекле со смесью дизентерийных сывороток и смесью сывороток против сальмонелл (для исключения брюшного тифа или сальмонеллеза). Окончательное заключение дают на 4-й день по результатам изучения ферментативных свойств (табл. 35) и реакции агглютинации.

Колицивогенотипирование. Шигеллы Зонне содержат разные типы колициногенных факторов, которые обнаруживаются с помощью специального набора индикаторных штаммов. Коли- циногенотипирование может быть использовано для эпидемиологических целей.

Серодиагностика. Применяется для ретроспективного обоснования диагноза дизентерии при стертых формах, а также для уточнения вида возбудителя. Ставят реакцию агглютинации по типу реакции Видаля и РПГА с эритроцитарными диагностику- мами Флекснера и Зонне. Диагностическим титром при дизентерии, вызванной шигеллами Флекснера, считают разведение 1:200, а шигеллами Зонне — 1 ： 100.

Таблица 34. Международная классификация бактерии рода Shigella

Подгруппа

Вид

Серовар*

Подвар

А

Sh. dysenteriae

1-10

В

Sh. flexneri

1-й

2-й

3-й

4-й

5-й &й

la, 1b

2а, 2b За, 3U3c 4а, 4Ь

С

D

Sh. boydii

Sh. sonnei

15

Микробиологическая диагностика брюшного тифа и наратмфов

Брюшной тиф и п^ратифы вызываются бактериями рода Salmonella, которые по антигенной структуре относятся к серо- группам D, А и В. Микробиологическая диагностика тифо-паратифозных заболеваний проводится на основании бактериологического и серологического исследований. Бактериоскопия первичного материала не применяется, так как в мазках из испражнений невозможно отличить сальмонеллы от кишечной палочки, а в другом материале (кровь, желчь) возбудителей слишком мало, чтобы их можно было обнаружить при микроскопии мазков. Исходя из особенностей патогенеза брюшного тифа, на 1-й неделе заболевания, в период бактериемии, возбудителей выделяют из кровн (получение гемокультуры), со 2-й недели заболевания — из испражнений (получение коп- рокультуры), мочи или желчи. Антитела в сыворотке накапливаются при брюшном тифе в конце 1-й недели заболевания.

Методические ука заиия

Бактериологическое исследование (схема 12). Получение гемокультуры. В 1-й день у больного из локтевой вены шприцем берут 5—10 мл крови и засевают в колбочку с 50—100 мл среды Раппопорт. Указанные соотношения крови и среды необходимы для подавления бактерицидного действия белков крови. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 18—20 ч. На 2-й день при росте тифозных бактерий наблюдается помутнение

Вид шнгелл

Ферментация

Образование

лактозы

глюкозы

маннита

мальтозы

сахарозы

сорбита

дульцита

мочевины

сероводорода

индола

каталазы

Sh dysenteriae серовар 1

-

к ,

一

Sh. dysenteriae серовары 2—10

-

К

-

一

-

-

+

-

-

+

±

Sh. flexneri серовары 1—5

-

К

+

±

±

±

-

-

-

±

+

Sh. flexneri (Sh. newcastle) серовар 6

-

К или

КГ

±

-

-

+

+

-

-

-

+

Sh. boydii серовары 1—15

-

к

+

±

-

±

±

-

-

±

+ .

Sh. sonnet

什）

к

+

±

(+)

±

+

-

-

-

+

Таблица 35. Ферментативные свойства пшгелл

Условные обозначения: + положительная реакция； — отрицательная реакция； (+) поздняя реакция, наступающая не ранее 2—3-го дня; 土 большее число штаммов дает положительную реакцию, меньшее — отрицательную； К 二 ферментация до кислоты； КГ — ферментация до кислоты и газа.

Схема 12. Микробиологическое ясследование при брюшном тнфе и п^атифах

Материал

Сыворотка крови

1-н этап

2-й этап

3-й этап

11

1

Бактериологическое исследование-

Испражнения, желчь, моча (со 2-н недели болезни)

Кровь

(на 1-й неделе болезни)

Посев на среду Раппопорт

Регистрация измене

Высев на дифференциальную среду с дальнейшим исследованием по схеме 2—3-го этапов

ний в среде Мазок, окраска по Граму

С еродиагностика

Посев на среду Эндо или другую- дифференциальную среду

Посев на среду Ресселя или трехсахарную среду

Реакция агглютинации на стекле с полива* лентными и моноре- цепторными сальмо- неллезными сыворотками

Характер колоний

Посев на среду —► Реакция агглютинации обогащения (Мюл- Видаля

лер а илн селенитовую)

Реакция агглютинации на стекле со смесью сальмонел- лезных сывороток

Регистрация изменения цвета среды •Фаготипирование

Посев на «пестрый» ряд

Окончательный ответ

Реакция Vi-гемагглю- тинации<

Ответ

и изменение цвета среды. При росте паратифозных бактерий наряду с указанными изменениями появляются пузырьки газа в поплавке. Для ускорения ответа из среды Раппопорт делают мазки и препараты «висячая» капля. При наличии чистой культуры грамотрицательных подвижных палочек и изменении цвета среды (или наличии газа) дают первый предварительный ответ. Затем культуру из среды Раппопорт пересевают в пробирку со средой Ресселя, полагая при этом, что из крови выделена чистая культура и можно сразу приступить к ее идентификаций. Одновременно со среды Раппопорт делают посевы на среду Эндо для получения изолированных колоний с целью проверки чистоты выросшей культуры.

Состав среды Р е с с е л я： питательный агар, 1% лактозы, 0,1% глюкозы и индикатор Андреде. Среду готовят таким образом, чтобы внизу она была в виде столбика, а верхняя часть имела скошенную поверхность. Исследуемую культуру засевают уколом в столбик и на поверхность среды. При ферментации углеводов происходит покраснение среды； разрывы столбика свидетельствуют о газообразовании. Покраснение всей среды наблюдается при ферментации лактозы, покраснение только столбика — глюкозы, так как содержание ее в среде в 10 раз меньше, чем лактозы. Вместо среды Ресселя можно использовать трехсахарную среду (в ее состав входят глюкоза, лактоза, сахароза, мочевина, некоторые соли и. индикатор — феноловый красный).

На 3-й день отмечают ферментацию глюкозы на среде Ресселя и ставят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле. На основании полученных данных дают второй предварительный ответ.

Для дальнейшего исследования отбирают несколько бесцветных колоний со среды Эндо и пересевают их в среду Ресселя или скошенный питательный агар (для контроля полученных результатов). Чистую культуру, выросшую на среде Ресселя или скошенном питательном агаре, пересевают на среды «пестрого» ряда и используют для постановки реакции агглютинации на стекле со смесью групповых сывороток, а затем с адсорбированными монорецепторными О- и Н-сальмонеллезными сыворотками. Окончательный диагноз устанавливают на основании данных «пестрого» ряда (табл. 36) и реакции агглютинации.

По способности разлагать ксилозу и арабинозу культуры бактерий брюшного тифа могут быть разделены на три ферментативных типа (биовара)： 1) ксилозоположительные, арабинозоотрицательные; 2) ксилозоотрицательные, арабинозоотрицательные； 3) ксилозоположительные, арабинозоположительные. Определение ксилозоарабинозного признака может быть использовано для маркировки бактерий в эпидемиологических целях.

Фаготипирование. С помощью набора стандартных Vi-фагов определяют до 78 ф纣отипов S. typhi. При этом необходимым условием является наличие в культуре Vi-антигена. Культуры

schottmuelleri дифференцируются на 11 фаготипов и подтипов.

Получение копржультуры. Испражнения засевают на одну из дифференциально-диагностических сред (Эндо или Левина). Для посева петлю кала вносят в пробирку с изотоническим раствором хлорида натрия и готовят суспензию. После оседания крупных комочков петлю тонкой суспензии наносят на поверхность агаровой среды — на одну половину чашки. Материал тщательно растирают шпателем по одной, а затем по другой половине чашки для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 18—20 ч. Одновременно испражнения засевают на среду обогащения Мюллера или селенитовую среду. На этих средах удается получить рост возбудителя даже в том случае, когда он содержится в исследуемом материале в незначительном количестве. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 18—20 ч.

Состав среды Мюллера： 4,5 г х. ч. мела, 90 мл питательного бульона, 2 мл раствора Люголя и Ю мл 50% раствора гипосульфита натрия. Среду разливают по 8—10 мл в пробирки. При взаимодействии йода и гипосульфита образуется тетратионат натрия, подавляющий рост кишечной палочки, но не препятствующий росту сальмонелл.

Селенитовая среда готовиться из основного раствора, который содержит 0,5% пептона, 0,7% фосфата натрия однозамещенного, О】％ фосфата натрия двузамещенного, 0,4% лактозы в дистиллированной воде. К 50 мл стерильной основной среды добавляют ex tempore 2 мл 10% раствора кислого селенистокислого натрия и разливают приготовленную среду по 5—7 мл в пробирки. Селенистокислый натрий стимулирует рост сальмонелл и подавляет сопутствующую флору.

Таблица 36. Биохимические свойства твфо-паратнфозных бактерий

Вид бактерии

Ферментация

Образование

Действие на пак- мусовое мо-

ЛОКО

Лак- 、тозы

глюкозы

маль> тозы

сахарозы

маннита

Н2s

NH3

индола

S. typhi

—

к

К

—

К

+

—

-

Кислая реакция

S. paratyphi А

—

КГ

КГ

—

КГ

—

—

—

То же

S. schottmuelleri

—

КГ

кг

кг

+

+

—

Щелочная реакция

Условные обозначения те же, что и в табл. 35.

На 2-й день изучают характер колоний, выросших на чашках (см. рис. 73), пересевают 2—3 бесцветные колонии на среду Ресселя л в пробирки со скошенным питательным агаром. При отсутствии подозрительных колоний на чашках делают

высевы из среды Мюллера или селенитовой среды на чашки со средой Эндо для получения изолированных колоний тифозных или паратифозных бактерий. Для ускорения ответа ставят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с материалом, взятым из бесцветной колонии. Далее поступают так же, как и при идентификации гемокультуры.

Серодиагностика. В лабораторной практике широко применяется реакция агглютинации Видаля, основанная на обнаружении в сыворотке крови людей агглютининов, которые появляются в конце 1-й — начале 2-й недели заболевания, и на изучении динамики нарастания и длительности сохранения антител. Реакция ставится одновременно с 4 антигенами： О- и Н-брюшнотифозными, А- и В-паратифозными диагностикумами. Брюшнотифозные монодиагностикумы применяются для установления стадии болезни, так как содержание О- и Н-антител в разные ее периоды неодинаково. О-антитела накапливаются в разгар заболевания и исчезают к моменту выздоровления. Н-антитела появляются к концу заболевания и сохраняются у переболевших в течение длительного времени.

У людей, вакцинированных против брюшного тифа и пара- тифов, также наблюдается положительная реакция Видаля, причем в довольно высоком титре, поэтому «инфекционный Видаль» удается отличить от «прививочного» только по нарастанию титра агглютининов у больных в процессе заболевания.

Реакцию Видаля ставят в четырех радах пробирок по 7 пробирок в каждом ряду, из которых 5 опытных и 2 контрольные. Техника приготовления разведений сыворотки описана в табл. 16. Для. контроля каждого диагностикума в пробирки вносят по 1 мл изотонического раствора хлорида натрия, в который добавляют 2 капли диагностикума. В контрольной пробирке с 1 мл сыворотки (без диагностикума) не должно быть хлопьев. При спонтанной агглютинации реакция не учитывается. Диагностический титр реакции Видаля равен 1 : 200.

Для серологического исследования реконвалесцентов и выявления бактерионосителей широко используют реакцию пассивной Vi-гемагглютинации, с помощью которой определяют Vi-антитела в сыворотке крови людей. В качестве антигена используют эритроцитарный Vi-диагностикум, который представляет собой взвесь эритроцитов человека 1(0) группы, обработанных формалином и сенсибилизированных Vi-антигеном брюшнотифозных микробов. Испытуемую сыворотку разводят от 1 ： 10 до 1 ： 1280. При положительной реакции эритроциты покрывают дно пробирки в виде диска с зазубренными краями, а надосадочная жидкость остается прозрачной. При отрицательной реакции, так же как и в контроле, эритроциты осаждаются

на дне пробирки и имеют вид диска с ровными краями («пуговки＞；). Диагностическое значение имеет титр пассивной Vi-гемагглюти- нации, начиная с 1 ：40 и выше. Всех лиц, сыворотки которых дают положительный результат в РПГА с эритроцитарным Vi-ди- агностикумом, рассматривают как подозрительных на носительство брюшнотифозных бактерий и подвергают многократному бактериологическому обследованию.

Лабораторная диагностика кишечных инфекций, вызванных анаэробными бактериями (бактероиды, вейллонеллы), проводится исключительно с помощью бактериологического метода. Взятие материала и выделение чистой культуры описаны в теме 23.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Агглютинирующие ОВ -сыворотки против энтеропатогенных кшпечных палочек: ОВ-колисыворотка 026 : Вб, ОВ-колисыво- ротка ОШ ：В4, ОВ-колисыворотка 055: В5 и др. Получены путем иммунизации кроликов взвесью эшерихий соответствующей серогруппы. Применяются в реакции агглютинации для идентификации энтеропатогенных эшерихий.

Адсорбированные агглютинирующие сыворотки для идентификации шигелл. Групповые и моновалентные сыворотки. Получены путем иммунизации кроликов определенными видами и сероварами шигелл дизентерии Флекснера, Бойда и Зонне с последующей адсорбцией лишних антител.

Сальмонеллезвые 1рушювые9 адсорбированные и монорецептор** ные О- и Н-аиглютинирующие сыворотки. Получены так же, как и предыдущие сыворотки. Применяются для установления серогрупп и сероваров сальмонелл в реакции агглютинации.

Сальмонеллезные О- и Н-монодиагаостикумы. Взвеси сальмонелл, убитых нагреванием (О-диагностикумы) или обработкой формалином (Н-диагностикумы). Применяются для серодиагностики брюшного тифа в реакции Видаля.

Фаги. Применяются для типирования энтеропатогенных эшерихий, шигелл и сальмонелл.

Химическая сорбированная тифо-паратифозно-столбнячная вакцива. Состоит из полных антигенов, извлеченных из возбудителей брюшного тифа, паратифов А и В, а также столбнячного анатоксина, адсорбированных на гидроокиси алюминия. Применяется для специфической профилактики брюшного тифа и столбняка.

Дизентерийная вакцина спиртовая, сухая. Содержит шигеллы

Флекснера и Зонне. Применяется для лечения хронических форм дизентерии.

Брюшнотифозная вакцина с секста(тетра)анатоксином. Содержит О- и Vi-антигены брюшнотифозных бактерий и очищенные анатоксины возбудителей столбняка, газовой гангрены и ботулизма.

Поливалентный брюшнотифозный бактериофаг. Выпускается в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием. Применяется для специфической профилактики брюшного тифа.

Поливалентный дизентерийный бактериофаг. Содержит разные фаги, лизирующие шигеллы Флекснера и Зонне. Вьшускается в виде таблеток с кислотоустойчивым покрытием. Применяется с лечебно-профилактическими целями.

Коли-протеиный бактериофаг. Содержит фаги, лизирующие наиболее распространенные серо группы энтеропатогенных эше- рихий и протей. Выпускается в жидком виде. Применяется с лечебно-профилактическими целями.

Колибактернн. Содержит высушенные живые клетки Е. coli штамма М17, обладающего выраженными антагонистическими свойствами в отношении ряда кишечных патогенных бактерий. Применяется для лечения дисбактериоза и дизентерии, главным образом у детей.

Бифидумбактерин. Содержит лиофильно высушенную взвесь живых клеток В. bifidum. Применяется для лечения дизентерии и хронических кишечных инфекций невыясненной этиологии у детей.

Бификол. Содержит смесь высушенных живых бактерий Е. coli штамма М17 и В. bifidum. Показания к применению те же.

Антибиотики и химиотерапевтические препараты, использующиеся для лечения кишечных инфекций.

Тема 29. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ

Возбудителями холеры являются два биовара холерного вибриона — Vibrio cholerae и Vibrio eltor, которые относятся к сем. VibrionUceae. Холера — острое инфекционное заболевание, характеризующееся общей интоксикацией организма и острым гастроэнтеритом. Чрезвычайно важна быстрая лабораторная диагностика холеры, так как первые случаи заболевания требуют бактериологического подтверждения для своевременного принятия эффективных противоэпидемических мероприятий. Лабораторная диагностика холеры проводится путем бактериоско- пического и бактериологического исследований. Трудности диагностики связаны с дифференциацией биоваров холерных виб-

рионов от сходных с ними холероподобных вибрионов (Мечникова, Финклера, Приора и др.), широко распространенных в природе и непатогенных для человека.

Программа занятия

Изучение схемы микробиологической диагностики холеры.

Бактериологическое исследование при холере.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые при холере.

Демонс1рация

Мазки, приготовленные из культуры холерного вибриона； окраска по Граму.

Реакция иммобилизации вибриона О-противохолерной сывороткой

Тесты для дифференциации холерных вибрионов.

Специальный патрон для взятия и транспортировки материала при холере.

Противохолерная агглютинирующая сыворотка, холерный бактериофаг, холерная вакцина, холероген-анатоксин, антибиотики.

Задание для выполнения лабораторной работы

Материал для исследования： испражнения больного с подозрением на холеру： а) микроскопировать готовые мазки из исследуемой культуры; б) определить подвижность культуры, выращенной на щелочной пептонной воде； в) отметить результаты развернутой реакции агглютинации с О -противохолерной сывороткой； г) отметить наличие или отсутствие роста исследуемой культуры на среде с полимиксином и результаты гексаминового теста. Дать заключение по проведенным исследованиям.

Методические указания

Бактериоскопическое исследование (схема 13). Из исследуемого материала (испражнения, рвотные массы) готовят мазки, окрашивают по Граму и водным фуксином. Кроме того, из нативного материала готовят препарат «висячая» капля, в котором определяют наличие подвижных вибрионов при обычной или фазово-контрастной микроскопии. Обнаружение в мазках большого количества грамотрицательных, слегка изогнутых палочек (длиной от 1,5 до 3 мкм) и активноподвижных вибрионов в препарате «висячая» капля позволяет дать первый предварительный положительный ответ (рис. 75).

Бактериологическое исследование. Материал засевают в различные жидкие и на плотные питательные среды, в частности, во флаконы со щелочной пептонной водой (1% пептонная вода, Of% хлорида натрия, 0,01% KNOa и 0,2% Na2 cОз; pH 9,0), на чашки со щелочным питательным агаром. Посевы на пептонной воде инкубируют при 37℃ в течение 5—6 ч, на чашках —

Схема、

Материал

1-й этап

Микробиологнческое исследование при холере

1

Бактериоскопическое исследование

1

Бактериологическое исследование

1

Ускоренные методы

J

i

Мазки, окраска

Препарат «вися-

Посев на щелоч-

Посев на чашки

Иммобилизация

Иммунофлюоресцент-

по Граму и фуксином

чая» капля

ную пептонную воду

со щелочным питательным агаром

вибрионов холерными сыворотками

ное исследование

Испражнения, рвотные массы, желчь, патологоанатомический материал, вода и др.

Ответ

Ответ

2-й этап

J Нитрозоиндоловая проба Пересев пленки на чашку со щелочным питательным агаром и вторично на щелочную пептонную воду

Мазок, окраска по Граму Подвижность

Пересев колоний на скошенный щелочной питательный агар (чистая культура)

3-й этап

Характер колоний

Мазок, окраска по Г раму

Агглютинация на стекле с

■^0-сывороткой

Ответ

Реакция агглютинации на стекле с О-сывороткой и сыворотками Инаба и Огава

Пересев на скошенный щелочной питательный агар. Изучение выделенной чистой культуры по схеме 3—4-го этапов

Подвижность Чувствительность к специфиче- ■ ским фагам Развернутая реакция агглютинации с О-сывороткой и с типовыми агглютинирующими сыворотками

Характер колоний

> Мазок, окраска поГраму

Гемолиз, гексаминовый тест

_ Посев на «пестрый» ряд

Окончательный ответ

「

10 丄 2 q・S3 пленки》оо«8^3£о^ом на пептонной воде》или из поверхностного слоя делают мазки S препарать-《раздавленная》 S《<внсядая》капля，Зтот 星 е материал используется для поста— новкм реакции аттлютинацин на стекле 00 cneus今иаеской Противохолернок<О8ЫВОРОТКОЙ，Часть пептонной вопи перенос2T в другуюиробирку для постановки нитрозоинхоловой: Пробью Для зтого добавляют несколько капель серной кислоты, В полозкительяом случае появляется розовое окрашивание вследствие образования нмтрозоиндола (03 индола и нитритов^ которые образуются под влиянием холерного вибриона* Независимо от результатов исследования делают пересев на вторую пептонную воду・ Наличие грамотрицательных вибрн， оно»агтлютинигруюЕкхся О-сывороткой, позволяет дать второй предварительный ответ* Независимо от полуденных результатов продолжают исследование》как показано на схеме 13・ Выделение ёочо^ КУЛЬТУРЕ м ее идентнфикацмю Проводит ио 54<-однотипным колониям》внросхним на Ее-лочном агарр Для ускорены хода анализа ставят развернутую реакцию агглютинацим с бактериальной о^ояозко^ д«5.ономйдао& S колоний。Дп2 зтого • агглютинирующую О-сыворотку развод, в пробирках до тигра пептонное мо§& (в объеме 0。мл* Затем в ка关дую пробирку вноент 112 капли суспензии бактерий。 宀 Результат реакции агтлютинацнн учитывают после 3丄—расовой

инкубацмн при зос，

окондательнуюкдентнфикацию культурн проводят на осно- ванмн определение чувствительности выделенных культур к холерному фагу》их гемолишиеских свойств》бнохимииескоН активности м аттлютинабельностм противохолерной обыворот。 кой S типовым»атпотинируюЕИМН сывороткам»Инаба S Огава (табл. 37)・ Таким Образом》ндентл.иканию культур проводят в три зтапа: 1) устанавливают нх принадлежность к роду Vibrio; 2) днф^еренимруют их от холероподобных В06— рмонов в реакции агглютинации с О8ЫВОРОТКОЙ》до иувствитель— ностн к спеиненческому 今агу и другим»тестами； 3) определяют видовые признаки культур (см. табл. 37)・

Окончательное 3aKJnoqeHse о выделении м дифферениирова— HMSхолерных вибрионов дают £ерез 36 丄 8 q на основании комплексного 03учен»2 основных биопошнеских 11Pliзнаков возбудитеп»

Трудности при оценке результатов бактериолошческого мсспепованкя ион^олвочп» при выделении атипичных холернЕХ toso^sosoM S в первую очередь не агглютинирующихся холер— ной обывороткой (НА「—ВМ6РМОНЫ)・ НАГвмбрпоны могут лмзироваться однимs3 cneusBsqecKHX холерннх фагов S обпа， дать другими свойствами》сходными с холерньплм вибрионами。

19-

Таблица 37. Теетыдляднффоренциациихолеряыхвибрионов

Тест

Классический холерный вибрион

Холерный вибрион Эль-Тор

Неагглютн- нирующнеся вибрионы

Агглютинация О-сывороткой

+

+

—

Агглютинация типовыми сыворотками

Огава и Инаба

+

+

—

Лизис фагами：

холерный фаг С (фаг IV)

+

—

фаг Эль-Тор II

—

+

Агглютинация куриных эритроцитов

—

+

Гемолиз эритроцитов барана

—

±

Рост иа агаре с 50 ЕД полимиксина

—

+

Гексаминовый тест

一

+

Реакция Фогеса — Проскауэра (образо-

вание ацетилметилкарбинола)

—

+

±

Условные обозначения： + наличие признака; — отсутствие признака; 土 признак непостоянный.

Ускоренные методы обнаружения холерных вибриоиов. 1. Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами. Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты «раздавленная» капля, которые исследуют в микроскопе, снабженном темнопольным или фазово-контрастным устройством. В положительном случае через 3f5.・мин движение вибрионов прекращается.

2. И.мм уноф люоресцентный метод. Препараты из исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микроскопе. Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым, свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1—2 ч после начала исследования при концентрации вибрионов не менее Ю6 клеток в 1 мл, поэтому рекомендуется предварительное подращивание материала на питательных средах.

Серодиагностика. Серологическое исследование является вспомогательным и применяется для ретроспективной диагностики холеры, выявления вибриононосителей и оценки напряженности постинфекционного и поствакцинального иммунитета» Для этого обычно ставят реакцию агглютинации или РПГА, а также определяют вибриоцидные антитела в реакции лизиса in vitro.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Противохолерная агглютинирующая О-сыворотка, типовые сыворотки Огава и Инаба. Получены из крови кроликов, иммунизированных холерными вибрионами. Применяются для серологической вдентификации и типирования холерных вибрионов в реакции агглютинации.

Холерный фаг. Типовые холерные фаги применяются для идентификации и типирования холерных вибрионов. Поливалентный холерный бактерйофаг используется для лечебнопрофилактических целей.

Холерная вакцина. Взвесь убитых холерных вибрионов. Применяется для активной иммунизации против холеры. Готовится из вибрионов Эль-Тор и классических холерных вибрионов серотипов Инаба и Огава.

Холероген-анатоксин. Взвесь убитых холерных вибрионов, выращенных в жидкой питательной среде. Препарат очищен от балластных веществ, выпускается в сухом виде. Применяется для специфической профилактики холеры.

Антибиотики： тетрациклин, морфоциклин, сигмамицин.

Тема 30. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

ПИЩЕВЫХ ТОКСИКОИНФЕКЦИЙ И ИНТОКСИКАЦИЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

Наиболее распространенными возбудителями пищевых токси- коинфекций являются сальмонеллы — Salmonella typhimurium, S. enteritidis, S. choleraesuis, S. heidelberg, S. anatum, S. derby. Реже эти заболевания вызываются Е. coli, Proteus vulgaris, Proteus morganii и другими энтеробактериями.

Патогенез и клиническая картина пищевых токсикоинфекций определяются проникновением в желудочно-кишечный тракт большого количества соответствующих бактерий с зараженными пищевыми продуктами (мясо, рыба), подвергшимися недостаточной термической обработке. При этом сохранившие жизнеспособность бактериальные клетки быстро размножаются в благоприятных условиях. Одновременное проникновение в кишечник массивной дозы возбудителя, его последующее размножение и разрушение бактериальных клеток приводят к освобождению значительного количества эндотоксина, оказывающего воздействие на интрамуральный нейрорецепторныи аппарат тонкой кишки, периферические сосуды брюшной полости. Это сопровождается нейродистрофическими изменениями в стенке кишки и поражением клеток других органов. При пищевых токсикоинфекциях освобождение желудочно-кишеч-

ного тракта от возбудителей во многих случаях происходит довольно быстро, иногда через несколько часов после начала заболевания. Однако в ряде случаев сальмонеллы длительно, в течение нескольких недель и месяцев, сохраняются в кишечнике, выделяясь с испражнениями бактерионосителя. Бактериемия при этих заболеваниях, как правило, не возникает.

Лабораторная диагностика проводится бактериологическим методом. Материалом для исследования являются как испражнения, рвотные массы, промывные воды желудка больных людей, так и остатки пищи и продуктов, из которых она была приготовлена. Это необходимо для установления источника инфекции.

Пищевые интоксикации бактериальной природы возникают при попадании с пищей в желудочно-кишечный тракт бактериальных токсинов, из которых наибольшую опасность представляют энтеротоксины Staph, aureus. Cl. perfringens и особенно ботулонейротоксин Cl. botulinum. Для возникновения пищевой интоксикации не обязательно присутствие в пищевом продукте живых возбудителей, так как это заболевание может быть воспроизведено при помощи чистых токсинов.

Микробиологическая диагностика пищевых отравлений проводится методом выявления токсинов, а также выделения чистых культур возбудителей — продуцентов токсинов в остатках пищи и материале, взятом от больных.

Программа занятия

Бактериологическая диагностика пищевых токсикоинфекций, вызванных сальмонеллами, шигеллами Зонне, эшерихиями и протеем.

Определение токсинов Cl. perfringens и Cl. botulinum.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые при указанных заболеваниях.

Демонстрация

Мазкм，из чистых культур сальмонелл, шигелл Зонне, эшерихий и протея, окрашенные по Граму.

Мазки из чистых культур токсигенного штамма Staph, aureus, окрашенные по Граму, Cl. perfringens и Cl. botulinum, окрашенные по Граму и Ожешко.

Реакции нейтрализации токсина Cl. botulinum моновалентными антитоксическими сыворотками А, В и Е.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты.

Задание для выполнения лабораторной работы

Бактериологическое исследование. Описать характер колоний, выросших на чашках с дифференциально-диагностической средой после посева испражнений больного и остатков пищи — возможных источников пищевой токсикоин- фекции.

Поставить реакцию агглютинации на стекле с монорецепторными саль- монеллезными сыворотками.

Отметить результаты изучения биохимических свойств исследуемой культуры сальмонелл по ранее засеянному «пестрому» ряду. Сделать заключение на основании полученных данных.

Отметить характер роста посева на питательный агар по Шутсевнчу и на основании данных ранее засеянного «пестрого» ряда определить вид простея. Сделать заключение.

Методические указания

Пищевые токсикоинфекции. Материал для исследования： фекалии, рвотные массы, промывные воды желудка больного и остатки пищевых продуктов — возможные источники и факторы передачи инфекции.

Бактериологическое исследование. Производится путем посева материала на дифференциально-диагностические среды (Эндо, Плоскирева и др.) для выделения чистой культуры сальмонелл, шигелл или эшерихий, а также в конденсационную воду скошенного питательного агара для выделения протея. После инкубации посевов при 37°С в течение 20—24 ч отмечают цвет колоний на чашках с дифференциальной средой и наличие «ползучего» роста, характерного для протея, в пробирке со скошенным питательным агаром. Подозрительные колонии пересевают; на скошенный питательный агар для получения чистых культур и одновременно ставят с ними реакцию агглютинации на стекле, используя смеси диагностических сывороток к разным сероварам сальмонелл. Затем, в зависимости от результатов реакции, ставят повторную реакцию с тем же материалом и с соответствующими монорецепторными сыворотками к определенным сероварам сальмонелл. На следующий день с чистой культурой сальмонелл ставят развернутую реакцию агглютинации с соответствующей монорецепторной сывороткой и делают посев на среды «пестрого» ряда. При выделении одного и того же серовара сальмонелл из организма больных людей и пищевого продукта делают окончательное заключение об этиологии пищевой токсикоинфекции и источнике заболевания. Важнейшие биохимические признаки и антигенная структура ряда сальмонелл приведены в табл. 38.、

При наличии ползучего роста на скошенном питательном агаре из конденсационной воды петлей берут материал для пригото в ле ния препарата «висячая» капля с целью установления подвижности и для мазка, который окрашивают по Граму и микроскопируют. Вид протея устанавливают на основании биохимических признаков после посева выделенной чистой культуры на среды «пестрого» ряда и других признаков (табл. 39).

Пшцевые интоксикации. Материал для исследования： рвотные массы, промывные воды желудка больных и

Таблица 38. Бнохимическне свойства и антигевнаа структура сальмонелл

остатки пищи (чаще кремы, сметана, мороженое, но и мясные продукты, в которых хорошо размножаются стафилококки). Энтеротоксин стафилококков экстрагируют изотоническим раствором хлорида натрия и определяют его присутствие, и серологическую специфичность реакцией преципитации в геле с иммунными антитоксическими сыворотками А, В, С. Техника постановки реакции описана выше (см. рис. 58). Можно использовать биопробу — скормить изучаемый материал котятам- сосункам, у которых стафилококковый энтеротоксин вызывает рвоту и понос через 30—60 мин после скармливания.

С целью выделения чистой культуры стафилококка исследуемые материалы, которые могут содержать жизнеспособ-

Таблица 39. Биохимические тесты для дифференциации бактерий рода Proteus

Признак

Р. vulgaris

P mirabilis

P. morganii

P. rettgeri

Ферментация：

маннита

—

—

—

+

мальтозы

+

—

—

—

ксилозы

+

+

—

—

Разжижение желатина

+

+

—

Образование Н2s

+

+

+

—

Ассимиляция цитрата

—

二

—

+

Образование индола

+

+

+

Условные обозначения те же, что и в табл. 35.

ные бактерии, засевают в чашки с ЖСА. Полученные по схеме 2 чистые культуры проверяют на способность продуцировать энтеротоксины.

Для эпидемиологического анализа массовых стафилококковых интоксикаций проводят фаготипирование выделенных из разных источников культур с помощью стафилококкового набора фагов.

Материалом для выявления энтеротоксина CL perfringens являются мясные, рыбные консервы и другие продукты, из которых экстрагируют токсин изотоническим раствором хлорида натрия. Экстракт центрифугируют и надосадочную жидкость вводят внутрибрюшинно белым мышам или внутрикожно морским свинкам. Гибель животных в течение первых 37 ч или появление некроза на месте внутрикожных инъекций свидетельствует о наличии токсина. Для его идентификации ставят реакцию нейтрализации с антитоксическими сыворотками CL perfringens.

Выделение чистой культуры Cl. perfringens и CL botulinum производят, используя методы выделения анаэробных бактерий (см. схему 4).

Материалом для выявления ботулотоксина служат сыворотка крови, моча, испражнения, промывные воды желудка больного, остатки пищи или подозреваемые продукты (колбасы, мясные, рыбные, фруктовые, овощные консервы и др.). Для обнаружения ботулотоксина в сыворотке крови больного ставят РПГА с эритроцитами, нагруженными моновалентными антитоксическими противоботулиническими / сыворотками типов А, В, Е. В качестве контроля берут нормальную сыворотку крови. Обнаружение ботулотоксина в пищевых продуктах и определение токсигенности Cl. botulinum проводят в реакции нейтрализации токсина на белых мышах. Для оп-

ределения серотипа токсина реакцию ставят с моновалентными сыворотками типов А, В, Е. При' нейтрализации токсина гомологичной антитоксической сывороткой мыши остаются живыми.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Сальмонеллезные групповые, адсорбированные и монорецеп- торные О- и Н-агглютинируюшие сыворотки. Применяются для постановки реакции агглютинации с целью определения вида сальмонелл, выделенных при пищевой токсикоинфекции.

Адсорбированная агглютинирующая сыворотка Зонне. Используется для идентификации шигелл Зонне, выделенных при пищевой токсикоинфекции.

Стафилококковые бактериофаги (международный набор). Применяются для фаготипирования стафилококков с целью эпидемиологического анализа пищевой интоксикации.

Антитоксическая сыворотка Cl. perfringens. Применяется с диагностической целью в реакции нейтрализации исследуемого токсина на белых мышах.

Против оботулинические сыворотки. Получены из крови лошадей, гипериммунизированных ботулиническими анатоксинами. Очищены и концентрированы методом диаферм-3. Для лечебно-профилактических целей готовят противоботули- нические сыворотки четырех типов: А, В, Е, F. Моновалентные сыворотки перечисленных типов используются в диагностических целях для определения серотипа токсина в исследуемом материале в реакции нейтрализации на белых. мышах.

ВОЗБУДИТЕЛИ ЗООНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ

К зоонозным инфекциям относятся такие заболевания, возбудители которых передаются человеку от животных. Они принадлежат к разным семействам и родам: возбудите- jfti чумы — Yersinia pestis, туляремии — Francisella tularensis, бруцеллеза — Brucella abortus, Br. melitensis, Br. suis; сибирской язвы — Вас. anthracis, лептоспирозов — Leptospira icterohaemorra- giae, L. grippotyphosa. Перечисленные бактерии отличаются высокой вирулентностью и вызывают особо опасные инфекционные заболевания. Работа с данными бактериями проводится в специальных лабораториях с обязательным соблюдением режима безопасности.

Для лабораторной диагностики зоонозных инфекций применяются бактериоскопические, бактериологические, серологические методы исследования, биопробы. Кроме того, ставятся кожно-аллергические пробы.

Тема 31. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

ЗООНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Программа занятия

Изучение схем микробиологической диагностики чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, лептоспироза.

Бактер ио логи ческие и серологические исследования при зоонозных инфекциях.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые при зоонозных инфекциях.

Демонстрация、

Мазки, приготовленные из органов зараженных животных и чистых культур возбудителей зоонозных инфекций.

Препарат из культуры лептоспиры в темном поле зрения.

Рост Вас. anthracoides на питательных средах.

Реакция агглютинации — лизиса лептоспир.

Реакция Хеддлсона для серодиагностики бруцеллеза.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты.

Задание для выполнения лабораторией работы

Микробиологическое исследование при чуме. Материал для исследования： гной из бубона, органы погибших грызунов с подозрением на чумную инфекцию. М икроскопировать готовые мазки. Поставить предварительный диагноз. Наметить ход дальнейшего исследования с учетом использования тестов для дифференциации возбудителя чумы от бактерий псевдотуберкулеза грызунов.

Серодиагностика туляремии. Материал для исследования： сыворотка крови больного с подозрением на туляремию. Провести учет результатов реакции агглютинации с парными сыворотками. Сделать заключение.

Серологическая диагностика бруцеллеза. Материал для исследования： сыворотка крови больного с подозрением на бруцеллез. Провести учет результатов реакции агглютинации Райта. Сделать заключение.

Микробиологическое исследование при сибирской язве. Материал для исследования： содержимое везикул и пустул； отделяемое карбункула и язвы： а) микроскопировать готовый препарат. Поставить предварительный диагноз. Наметить ход бактериологического исследования； б) определить наличие сибиреязвенного антигена в исследуемом материале (шерсти погибшего животного) реакцией кольцеиреципитации Асколи.

Микробиологическая диагностика лептоспироза. Отметить результаты реакции агглютинации — лизиса лептоспир и сделать заключение.

Микробиологическая диагностика чумы

Возбудитель чумы Yersinia pestis относится к роду Yersinia, сем. Enterobacteriaceae, в который также включена группа бактерий, вызывающих иерсиниозы, — Y pseudotuberculosis.

MOHeJdo

” ем sl^o₽o.swas

OJOHLOaH* WSH2^«um

SMXSno

•soxudow 9HH〔％BdBm

Ea8E。^nalu&hHOXO

Bgoduoxg ЬЕФ x кьоояле-он f ■M£axh 0SXS05&O

ttKd 《nsdlQguw eh sooc

(BdxlqlfAX KBIUSh) Iqttgd。9* ai bh SMVUOE

E38E0

ШМХ>s.

«soeodoH •30 «ОЕЛХ^ОИКЬО& 0. SSSKSHSEUrt KsrMEgd

VJULd VJUd

(EH2HJ.HB вин。％ CAdeHgo Kurr) 0SKrt004 .OE.OUS〔OXSKSJOUOd。。

AsBdJ on J EXOEdxo .S«8S ^sxoc.ox dggdBX • T oow^ Mdu йоюк кип ■E9Axнм .IqHgdu OHJXdp ♦ SC.S Bd2HHLLOX dH3 •dBsdEJB BH 2800 к

sssso 1И eHH/aoHQU8M зон .ОЯОК-SHVS и Awedj ■ннипомоошф'оНАИИаОС sort^o -SX3S

шмх 呷 7

ШМХ 呷 I

9ИНВ80Н91Г8М gox8hH」oE:OH dwrng

OHHBCQOHBUOOH 92。❹hMUOXJOndaLXEq

AgoduoMg

.§ к КЕЗ&ОИ eds&fes 風 odxow dBO 殳«OHO9X9 VOSS^&4OQ

анХь нАп аинв 豊口胃总 doxzhHJOITOHgodxHW .寸 I Bw。x。

Y. enterocolitica. В естественных условиях 丫 pestis содержатся у грызунов, вызывая у них эпизоотии со смертельным исходом. Исключительную важность приобретает выделение культур чумных бактерий от больных людей, так как первые случаи заболевания нуждаются в бактериологическом подтверждении для своевременного принятия эффективных противоэпидемических мер.

Методические указания

Бактериоскопическое исследование (схема 14). Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по Г раму и водным раствором метиленового синего. Бактерии чумы имеют вид палочек овоидной формы (О^Х 1,7 мкм), грамотрицатель- ны. В мазках, окрашенных метиленовым синим, хорошо заметно биполярное распределение краски (рис. 76). Встречаются полиморфные формы.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают на чашки с питательным агаром. Посевы инкубируют при 25—28°С. Первичное изучение посевов производят через 10—12 ч. К этому сроку появляются колонии в виде «батистового платочка», которые образуют вирулентные R-формы микроба. Мало- и авирулентные бактерии формируют S-формы колоний. Идентификацию чистой культуры проводят по морфологии бактериальных клеток, характеру роста, антигенным и биохимическим свойствам, чувствительности к специфическому фагу и биопробе.

На бульоне бактерии чумы образуют пленку со спускающимися нитями, напоминающими сталактиты; ферментируют многие сахара до кислоты, индола не образуют, желатин не разжижают. Бактерии чумы содержат групповой термостабильный соматический антиген и специфический термолабильный капсульный антиген, который обнаруживается только у вирулентных штаммов.

В случае исследования материала, взятого у погибших грызунов, проводится дифференциальная диагностика с бактериями псевдотуберкулеза грызунов Yersinia pseudotuberculosis на основании характера роста на специальных средах, ферментации рамнозы, адонита и других признаков (табл. 40).

Биопроба. Проводится для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой. Наиболее чувствительными лабораторными животными являются морские свинки, которым материал вводят подкожно. Внутрибрюшинно материал вводят в том случае, если он не загрязнен другими бактериями. Загнивший материал

Таблица 40. Дифференциально-диагностические признаки возбудителей чумы и псевдотуберкулеза

Признак

Y. pestis

Y. pseudotub証 culosis

Подвижность

—

+ прм 22℃

Рост на голодном (без пептона) 3% агаре

—

+

Уреазная активность

—

+

Лнз нс‘фагами：

Y. pestis

+

一

Y. pseudotuberculosis

—

+

Наличие бактериоциногенных (пестицино-

генных) плазмид

+

—

Условные обозначения те же, что и в табл. 35.

втирают морской свинке в выбритый участок кожи в области живота. После гибели животных (на 3—7-й день, в зависимости от способа введения материала) делают вскрытие, отмечают патологические изменения органов и производят бактериологическое исследование по схеме 14.

Ускоренные методы лабораторной диагностики. 1. Иммуно- флюоресцентный метод позволяет обнаружить присутствие возбудителя как б патологическом материале, так и в объектах окружающей среды (вода, воздух), а также в пищевых продуктах н эктопаразитах. С этой целью используют люминесцентную видоспецифическую противочумную сыворотку, люминесцентные противокапсульную и противосо- матичес^ую сыворотки.

2. РТПГА применяется для обнаружения антигенов бактерий чумы в исследуемом материале с помощью стандартной противочумной сыворотки, антитела которой нагружены на эритроциты.

Микробиологическая диагностика туляремии

Возбудитель туляремии Francisella tularensis относится к роду Francisella, не включенному в определенное семейство. В естественных условиях встречается у грызунов, вызывая у них смертельную инфекцию. Для диагностики туляремии у людей обычно применяют кожно-аллергическую пробу и серологические реакции. Микробиологическая диагностика проводится в специальных лабораториях путем заражения лабораторных животных, так как непосредственное выделение возбудителя на питательных средах из крови или другого материала, взятого от больных людей, удается редко.

Схема 15. Микробиологическое исследование при туляремии

МатериалМатериалСод^)жимое бубонов, кровь, органы яошотныхСод^)жимое бубонов, кровь, органы яошотныхБактериоскопическое исследованиеБактериоскопическое исследованиеБиопроба и бактериологическое исследованиеБиопроба и бактериологическое исследование1■血 этап1■血 этапМазок, окраска по ГрамуМазок, окраска по ГрамуЗаражение морской свинкиЗаражение морской свинкиСыворотка кровиСыворотка кровиСеродиагностикаСеродиагностикаРазвернутая RIIFA реакция агглютинацииРазвернутая RIIFA реакция агглютинацииОтветОтветВскрытие трупаВскрытие трупаОтветОтвет3-н этап3-н этапМазки, окраска по <'Граму и Романовскому-ГимзеМазки, окраска по <'Граму и Романовскому-ГимзеОтветОтветПосевы наПосевы нанутую желточную или другие средынутую желточную или другие средыХарактер роста Мазок, окраска по ГрамуХарактер роста Мазок, окраска по ГрамуРеакция агглютит нации с противо- туляремийной сывороткойРеакция агглютит нации с противо- туляремийной сывороткой

Материал

Материал

Сод^)жимое бубонов, кровь, органы яошотных

Сод^)жимое бубонов, кровь, органы яошотных

Бактериоскопическое исследование

Бактериоскопическое исследование

Биопроба и бактериологическое исследование

Биопроба и бактериологическое исследование

1■血 этап

1■血 этап

Мазок, окраска по Граму

Мазок, окраска по Граму

Заражение морской свинки

Заражение морской свинки

Сыворотка крови

Сыворотка крови

Серодиагностика

Серодиагностика

Развернутая RIIFA реакция агглютинации

Развернутая RIIFA реакция агглютинации

Ответ

Ответ

Вскрытие трупа

Вскрытие трупа

Ответ

Ответ

3-н этап

3-н этап

Мазки, окраска по <'

Граму и Романовскому-Гимзе

Мазки, окраска по <'

Граму и Романовскому-Гимзе

Ответ

Ответ

Посевы на

Посевы на

нутую желточную или другие среды

нутую желточную или другие среды

Характер роста Мазок, окраска по Граму

Характер роста Мазок, окраска по Граму

Реакция агглютит нации с противо- туляремийной сывороткой

Реакция агглютит нации с противо- туляремийной сывороткой

Больной человекБольной человекОкончательный ответ

Больной человек

Больной человек

кожно -аллергическая проба с тулярином

Методические указания

Бактериоскопическое исследование (схема 15). Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по Граму и метиленовым синим. Бактерии туляремии весьма полиморфны. В чистой культуре они представляют собой очень мелкие микроорганизмы (0J—0,5 мкм) коккобактериальной формы (рис. 77). В мазках из органов преобладают палочковидные формы. Спор не образуют, имеют небольшую капсулу, неподвижны, грамотрицательны, иногда выражена биполярная окраска.

Бактериологическое исследование и биопроба. Применяются для выделения чистой культуры бактерий туляремии. Наиболее чувствительными животными являются белые мыши и морские свинки, которые заболевают со смертельным исходом даже при подкожном введении единичных бактерий. Выделение бактерий туляремии проводят на свернутой яично-желточной среде, глюкозоцистиповом кровяном агаре. Вирулентные штаммы образуют S-формы колоний — мелкие, гладкие, беловатого цвета с голубоватым оттенком.

Идентификацию чистой культуры проводят по морфологии бактериальных клеток, характеру роста, биохимическим и антигенным свойствам. Бактерии туляремии в отличие от бруцелл разлагают глюкозу, мальтозу н маннозу до кислоты. Биохимические свойства этих бактерий выявляются на специальной плотной среде с ограниченным содержанием белка. Бактерии туляремии содержат оболочечный антиген, с которым связаны их вирулентные и иммуногенные свойства, и О-соматический антиген. По антигенным свойствам близки к бруцеллам.

Серодиагностика. Ставится реакция агглютинации с туляремийным диагностикумом по типу реакции Видаля (см. с. 186). Относительно позднее появление агглютининов в крови (на 2-й неделе болезни) затрудняет применение этой реакции для ранней диагностики, однако их длительное сохранение делает возможной ретроспективную диагностику. Д иагн остический титр реакции равен 1:100. Обязательно прослеживается нарастание титра агглютинации (в парных сыворотках). Наиболее чувствительным методом серодиагностики туляремии является РПГА, которая бывает положительной в конце 1-й —начале 2-й неделе заболевания. Титры сывороток в разгар заболевания достигают 1 ： 1280—1:2560 и выше.

Для ускоренной диагностики применяется кровяно-капельная реакция: кровь из пальца больного наносят на обезжиренное предметное стекло, добавляют каплю дистиллированной воды (для лизиса эритроцитов), вносят каплю диагности- кума и смешивают стеклянной палочкой. При наличии в крови агглютининов в диагностическом титре (1 :100 и выше) в капле немедленно наступает агглютинация диагностикума; при титрах ниже диагностических агглютинация происходит через 2—3 мин.

Кожно-аллергическая проба. Выпускаются два вида тулярина： для внутрикожной пробы и для накожной. Проба высокочувст-, вительна н дает положительные результаты у больных, начиная с 3—5-го дня болезни, но также и у переболевших и вакцинированных, поэтому оценка реакции должна проводиться с осторожностью

Микробиологическая диагностика бруцеллеза

Возбудители бруцеллеза — бактерии рода Brucella, не включены в определенное семейство. По происхождению и некоторым биологическим особенностям различают следующие виды: Вг. melitensis — возбудитель бруцеллеза мелкого рога- того скота, Вг. abortus — возбудитель бруцеллеза крупного

-VJUd

soassosa^。egodu UEXahsJdQInrB.GH关ox • r-着£6h yosqlrogE39E0 'Zxqyaw/Dhxgxo

笠 38so

нвлвф HAHMJXXe ssEXLOdonx。SS3X 'НИНОШ. X SHOOS •doIU3o.&HOW。иип，^ЛЧОЁИНОЙХГ CRH •EHHIOHm HsnxEod a - - CHHHEadg。ОС c-s^-x^^ mo§« холь зинеа0dHlшзадффмр захнл£« Qolush BSHQhAIfo 匚 kith 工ode」e nlqHHemox。0。Ахай 90 du 8aDoodQU Ea9E。 芟 38R0T

xittu OE ex Gsgx。ourl 纟 dxo«OHE』do Es 3sao EH ЗЙОООЕ^「HXLehBEO，SXKEW

(BMHOJKEdBe 豊。on,s3Hlr OE—03 adoh) mo£&-' gEqd工。н

ssexLodoalq。Hs.зхмё^йлюов•ssdu JHSnEH.SHSEfe Ks&s^

Ф Anedj ОС«JXQcddJIOCXOCBs4SHdaL4ex

dEJB.sqH .Т0ЖОУОЕ EH ЗИООШ&Е

mu£>sA

KHnxBQd BBH .artbsaourt^osooEO

EHglfmrgxUSTIXEOd

Ksa«d«^

^2fvo SC.K Х0НИ8。

xsxodo 工 ЗННОЖЕаЕт

HoqEiAg HlgHhoHohou eh qgou

mux*»I

BXHlJOHJEHqod。。

люоаЕОЖ^

вмнЕаоГзи an 3OXQ3hH』OIroMdaLMBg

sHodxexlodonIqo

(JCOWHIqHL。。工-Hhlrg关o工Сион 00X5& в 关 M) qmodx

3M31nrmcd9 Hdn »Ba§3R.UUS 9o*J9haIOITOH9odxBs.91 ew з x и

Рис. 78. Brucella melitensis (чистая культура).

рогатого скота, Вг. suis — возбудитель бруцеллеза свиней. Все три вида патогенны для человека. Наиболее вирулентным является первый вид； третий вид вызывает спорадические случаи заболеваний.

М икро биоло гическая диагностика обычно проводится путем серологических нссле-

довауий (реакция Райта н Хеддлсона). К выделению культур бруцелл прибегают сравнительно редко.

Методические указания

Бактериологическое исследование (схема 16). Для получения гемокультуры 5—10 мл крови, взятой из локтевой вены больного, засевают в два флакона с 50—100 мл печеночного бульона. Один из них (для выделения культур Вг. melitensis) инкубируют в обычных аэробных условиях, другой (для выделения первичной культуры Вг. abortus) — в атмосфере с 10% СО2. В первых генерациях бруцеллы растут очень медленно, поэтому посевы выдерживают в термостате не менее месяца. В то же время рост лабораторных культур наблюдается через 1—2 сут. На агаре бруцеллы образуют бесцветные с перламутровым блеском колонии, в бульоне — помутнение н слизистый осадок. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживаются мелкие (от 0J—0,5 до 1,5 мкм) грамотрицательные коккобактериальные или более удлиненные формы (рис. 78). Они неподвижны, спор не образуют, в определенных условиях появляется видимая капсула.

Для быстрой идентификации бруцелл ставят реакцию агглютинации со специфическими агглютинирующими сыворотками на стекле и определяют чувствительность к специфическому фагу. Все виды бруцелл не ферментируют углеводы. Их дифференцируют по образованию H2S, чувствительности к СО2, действию анилиновых красок (основной фуксин н тионин) и другим признакам.

Серодиагностика. Чаще всего используют реакцию агглютинации Райта с бруцеллезным диагностикумом, которая ставится по типу реакции Видаля (см. с. 186). Реакция доста-

точно специфична. Положительные результаты отмечаются спустя. 1—2 нед после начала заболевания и сохраняются у переболевших многие годы. Диагностический титр реакции равен 1:200.

Для ускоренной серодиагностики применяется реакция агглютинации Хеддлсона, которая ставится с неразведенной сывороткой больного и с концентрированным антигеном — диагностикумом, окрашенным метиленовым синим.

Обезжиренное квадратное стекло размером 9Х 12 см делят на 5 квадратов, в которые микропипеткой вносят ингредиенты, как указано в табл. 41. Капли смешивают палочкой, начиная с минимальной дозы сыворотки. Стекло осторожно подогревают над пламенем примерно до 37℃ в течение 2 мин. При положительной реакции в первые минуты появляются хлопья синего цвета. Реакция положительна при наличии агглютинации на -Н- в дозах сыворотки 0,02— 0,01 мл.

Кроме того, для серодиагностики бруцеллеза используют РПГА, реакцию иммунофлюоресценции, опсонофагоцитарную реакцию, РСК, определение неполных антител и др. Эти серологические реакции обладают достаточно высокой чувствительностью и специфичностью. В поздние периоды заболевания процент положительных с ерологических реакций (агглютинации, РПГА и РСК) начинает снижаться и большее диагностическое значение приобретают кожно-аллергическая проба н реакция Кумбса, поэтому комплексный сероаллергический метод является наиболее надежным в диагностике бруцеллеза.

Биопроба. Применяется для выделения чистой культуры из материала, загрязненного посторонней микрофлорой или содержащего небольшое количество бруцелл. Материал вводят морским свинкам или белым мышам подкожно в

Таблица 41. Постановка пластинчатой реакции агглютинации Хеддлсона

Ингредиенты, мл

Квадрат

1

2

3

4

5

контроль сыворотки

контроль диа- гностикума

Сыворотка

0,04

0,02

0,01

0,02

—

Диагностикум

Изотонический раствор хло-

0,03

0,03

0,03

—

0,03

рида натрия

—

—

—

0,03

0,03

паховую область. Мышей вскрывают через 20 дней после заражения, морских свинок — через 30. Кусочки органов и лимфатических узлов засевают на питательные среды для получения чистой культуры и ее идентификации.

Кожно-яллергическая проба (реакция Бюрне). На ладонной поверхности предплечья внутрикожно вводят 0,1 мл бруцел- лина. При наличии аллергии уже через 6—8 ч могут появиться гиперемия кожи и болезненная отечность. Учет реакции производят через 24 ч (см. рис. 50). Реакция чувствительна и появляется не только у больных н переболевших, но и у' вакцинированных людей, в связи с чем ее диагностическая оценка должна производиться с осторожностью.

Микробиологическая диагностика сибирской язвы

Возбудитель сибирской язвы — спорообразующая аэробная палочка Вас. anthracis, относится к семейству Bacillaceae. Наиболее достоверным методом лабораторной диагностики сибирской язвы является выделение из исследуемого материала культуры возбудителя. Диагностическую ценность представляют также реакция термопре ципитации по Асколи и кожно-аллергическая проба.

Методические указания

Бактериоскопическое исследование (схема 17). Изучение окрашенных по Граму мазков из патологического материала позволяет обнаружить возбудителя, представляющего собой грамположительную крупную (1-2 文 6 -10, мкм) неподвижную стрептобациллу. В организме больных и на белковой питательной среде микробы образуют капсулу (рис. 79), в почве — споры (см. рис. 18).

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают на чашки с питательным агаром, кровяным агаром и в пробирку с питательным бульоном. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 18—20 ч. В бульоне культура Вас. anthra- cis растет в виде хлопьевидного осадка; на агаре вирулентные штаммы образуют колонии в R-форме, имеющие под малым увеличением микроскопа вид «львиной гривы» или «головы медузы». А вирулентные или слабовирулентные бактерии образуют S-формы колоний.

Сибиреязвенная палочка обладает сахаролитическими свойствами, не гемолизирует эритроциты, медленно разжижает желатину (в виде елочки верхушкой вниз). Под действием пенициллина сибиреязвенные палочки образуют сферопласты.

EagEO

se.o«o< KSZBDd

WOHHZBdlHE 0 a90du BQ«^suawsa.os^o« n XMORghyoHqlfog

Ею (namhHOXO

е90dLlosq

rtKSHS

•? gHHg*s%£Bd， 《'sqdLoOIP》eh asou

WOHMIf .§§ЖОЕ 0 Egodu

AJea 工 41。0Hqims&Loaxh

mux«.

Ea8E0

4工edj on BxoedxonOHBJdo ms MX±BhoLLLO，MN£BW

(Bdxl 41Mx«Bl ■oHh) dp』E HlqHquaL .«Hsc eh Bsgou

xlqHloraM 关 OHiiqdxOH

^SS«O55QS

oo»ooysuo§aou

eslfosOJ AsEdJ OE exuedxosXCBW

шжоё^ю вшйьй^« И 3dE』B ЕН^ХДО5« Qal工BQEX

w>s・z

ХОНИП。XMMOdow«OXMlfodx ^ОЭ1^зе.ою gMHOJKBdEg

egoduosg

1

xlqHXOCQM* X9s6ЮК0*貞。3m

自 e,SOH .BCQodx к ночий aEJE «2ЯЙЙ- ■ULMU EH ЗИ0ООС

一

osxrtnossos BOXJghsJOIfoHdaLawg

gsHEq

.0ЧШ5О5 Q0H1HQTT

•00ao2e.^o£is

AsBdJ ОС exoEdxosXEBn

ОИНЕНОНЗизи goxoBhsuoxoosdalxeg Н2.Л 工

5« dHodxow A笛odx CJ-OEqa «ЗДОЕЛ^Ьиек и 1fAxHAgdex OOHOKIrgmo HXIMU HAXHega Q0WH*agq03

賞：OMQdHdHQ sab »sai«e.0UB 90MQ9hHJiH90dxHW .CI e w g x и

имеющие вид «жемчужин». Это явление используется для дифференциации Вас. anthracis от непатогенных бацилл.

Биопроба. Исследуемый материал вводят подкожно белым мышам, морским свинкам или кроликам. Павших животных вскрывают, готовят мазки из крови и внутренних органов, делают посевы для выделения чистой культуры возбудителя.

Серодиагностика. При необходимости диагностировать сибирскую язву у павших животных или у людей, умерших от неизвестной болезни, напоминающей висцеральную форму сибирской язвы, а также для определения зараженности сырья (кожа, мех, шерсть) ставят реакцию термопреципитации по Асколи. Кусочки органов, шерсти, меха измельчают и кипятят в пробирке с изотоническим раствором хлорида натрия в течение 10—15 мин, после чего фильтруют до полной прозрачности. Контрольный термоэкстракт готовят из того же материала, взятого о»т здорового животного (табл. 42).

Таблица 42. Постановка реакции термопреципитации (форма протокола)

Ингредиенты, мл

Опытная проба

№ контрольной пробирки

1

2

3

4

Сибиреязвенная преци-

питирующая сыворотка

Нормальная кроличья

0,3

—

03

0,3

0,3

сыворотка

—

0,3

—

—

—

Осторожно наслаивать по стенке пробирки

Испытуемый термоэкст-

ракт

0,3

0,3

—

—

一

Стандартный сибиреяз-

венный антиген

—

—

0,3

—

Контрольный нормаль-

ный термо экстракт

—

-—

—

0,3

一

Изотонический раствор

хлорида натрия

—

—

—

—

0,3

Результаты

Ускоренная диагностика сибирской язвы проводится методом иммунофлюоресценции, который позволяет выявить капсульные формы Вас. anthracis в экссудате. Мазки из экссудата через 5—18 ч после заражения животного обраба-

При положительной реакПри положительной реакРнс. 80. Лептоспира в темном поле зрения.

При положительной реак

При положительной реак

тывают капсульной сибиреязвенной антисывороткой, а затем флюоресцирующей анти- кроличьей сывороткой, мечен- ной ^родамином. В препаратах, содержащих капсульные бациллы, наблюдается желто- зеленое свечение возбудителя.

Кожно-яллергическая проба.

ции через 24 ч появляются гиперемия н инфильтрат.ции через 24 ч появляются гиперемия н инфильтрат.Ставится на внутренней поверхности предплечья — внутрикожно вводят 0,1 мл антра»

ции через 24 ч появляются гиперемия н инфильтрат.

ции через 24 ч появляются гиперемия н инфильтрат.

Микробиологическая диагностика лептоспирозов

Возбудители лептоспироза относятся к порядку Spirochaeta- les, роду Leptospira. Патогенные лептоспиры, циркулирующие в нашей стране, относятся к виду L. interrogans, включающему 18 серогрупп, объединяющих 160 сероваров. Из них чаще всего встречаются L. icterohaemorragiae — возбудитель желтушного лептоспироза (болезни Васильева — Вейля) и L. grippotyp- hosa — возбудитель безжелтушного лептоспироза (водная лихорадка).

Материалом для микробиологического исследования в разных стадиях болезни служат кровь, ликвор и моча. В первые 5 дней заболевания проводят ба^ериоскопическое н бактериологическое исследования крови и биопробы, с Ю-го дня — бактериоскопию мочи, а с конца 1-й недели — серологическое исследование (реакция агглютинации — лизиса).

Методические указания

Бактериоскопическое исследование (схема 18). Из исследуемого материала готовят препарат в «раздавленной» капле н микроскопируют его в темном поле зрения. В положительном случае видны серебристые лептоспиры, представляющие собой подвижные изогнутые нити длиной 6—9 мкм с первичными и вторичными завитками (рис. 80), которые имеют вид загнутых крючкообразных концов, придающих лептоспирам S-образную форму. Для живых лептоспир характерны активное поступательное (прямолинейное) движение, вращение

на месте и перемещение по кругу. Ввиду очень слабой восприимчивости лептоспир к красителям исследуют только нативные препараты.

Бактериоскопия крови (а при* менингеальных явлениях н ликвора) позволяет установить диагноз в ранней стадии заболевания. Однако отрицательные результаты не исключают лептоспирозной природы заболевания.

Бактем：;ологическое исследование. Культуры лептоспир выделяют на водно-сывороточной или фосфатно-сывороточной среде с добавлением инактивированной кроличьей сыворотки. Исследуемый материал засевают у постели больного в 3—5 пробирок, заливают стерильным вазелиновым маслом (для ограничения доступа кислорода воздуха) н инкубируют при температуре 28°С не менее 2 мес. Вследствие того что при росте лептоспир среда остается прозрачной, через каждые 5~*6 дней из среды готовят препараты для микроскопии в темном поле. Серогруппу выделенной культуры устанавливают в реакции агглютинации с набором диагностических сывороток.

Биопроба. Внутрибрюшинно или подкожно заражают морских свинок, крольчат или золотистых хомячков. Животных держат под наблюдением в течение месяца. При заболевании или гибели животного готовят препараты из крови, мочи, материала вскрытия, микроскопируют в темном поле и делают посевы для выделения чистой культуры лептоспир.

Серодиагностика. Ставится реакция агглютинации — лизиса с живыми эталонными культурами лептоспир разных серогрупп и сероваров. Учет результатов реакции проводят в препаратах «раздавленная» капля в темном поле. В положительном случае отмечают агглютинацию и лизис лептоспир. При этом в первых разведениях сыворотки наблюдается полное растворение лептоспир, частичный лизис или зернистое набухание, в последующих разведениях — агглютинация лептоспир и появление агломератов в виде «паучков». Диагностический титр реакции равен 1: 100. Максимальный титр антител (1 :1000— 1 :10000 и выше) наблюдается на 15—30-й день болезни. Ввиду того что у части переболевших антитела сохраняются в течение многих лет, реакцию агглютинации рекомендуется ставить повторно для установления нарастания титра антител.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Бруцеллезный диагностикум. Взвесь убитых бруцелл, окрашенных метиленовым синим. Применяется для серологической

E38R0

rtossE-1 xsa

■EHHICHEJe USTWEOd

ВХИ10ОН JBMqodQu

1

sCQodx EXLOdomqu

Ea8luo'sqHquauluhHOX。

E98E。

WXKrt«04^K.OOS ooxoahsjolrosdal 工CS9 » oo«o«ysco^oo&s s .SS3S UOHH* ее ёжо§е.юах

HsexlodoCQIq。 sss XJghslJOHJ ,as°еоиени I ssa ，eHsJ2E』E BMnxeod

giro и SOKS он m SMUOXJOd工 K5 ledeu<Ddu ^2Е§ЙХ

«OKS«0

XSXQdosИки «ои£ооо ■H2MIT3 динзжвает

A3dJ o^x^ob

•оаоизо«оꧫ ен ssooc

BITOU 20KSUH H SKE0WO0&S2 ЫПТ ■LedBLIudLI'sqHBHlEH

egoduoss

§ои сгшинесш usnoHSEсхоа 工 HLfahow qmodw

0sxamo5E.00s оо«оюук^ок.охл«ь»л^

0XKrtmo40e.00s BOXUBhxLIO 工oodxxw

IrBHdaLBs

зпо&нов^ Hdn 0silve.0QS аожюыалндоаэшм061 Юхо

диагностики бруцеллеза при постановке реакции агглютинации Райта и Хеддлсона.

Туляремийный диагностикум. Взвесь убитых бактерий туляремии. Применяется при постановке реакции агглютинации для серодиагностики туляремии.

Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Получена из крови кролика, гйпериммунизированного культурой сибиреязвенных бацилл. Применяется для постановки реакции термопреципитации по Ас коли.

Чумиой бактериофаг. Используется для идентификации Y. pestis.

Сибиреязвенный бактериофаг. Применяется для идентификации Вас. anthracis.

Бруцеллин. Фильтрат 3-недельных бульонных культур Brucella melitensis, Вг. abortus, Вг. suis, убитых нагреванием. Применяется для постановки кожно-аллергической пробы Бюрне.

Тулярин. Взвесь туляремийных бактерий (вакцинного штамма), убитых нагреванием. Используется для постановки кожно-аллергической пробы.

Антраксин. Белково-полисахаридно-нуклеиновый комплекс, извлеченный при гидролизе сибиреязвенных бацилл. Применяется для постановки кожно-аллергической пробы.

Чумная живая сухая вакцина. Высушенная живая культура Y pestis вакцинного штамма EV. Используется для профилактики чумы.

Туляремийная живая сухая накожная вакцина. Высушенная живая культура вакцинного штамма Francisella tularensis. Применяется для профилактики туляремии.

Накожная сухая живая бруцеллезная профилактическая вакцина. Взвесь вакцинного штамма Вг. abortus. Применяется для профилактики бруцеллеза.

Бруцеллезная лечебная вакцина. Взвесь убитых нагреванием бруцелл. Используется с лечебной целью, способствует десенсибилизации организма.

Сибиреязвенная живая вакцина СТИ. Названа в честь Санитарно-технического института, в котором была впервые получена. Представляет собой высушенную взвесь живых спор сибиреязвенных бацилл. Применяется для профилактики сибирской язвы.

Противосибиреязвенный иммуноглобулин. Гамма-глобулиновая фракция сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных живой сибиреязвенной вакциной и вирулентным штаммом Вас. anthracis. Используется с профилактической и лечебной целью.

Лептоспирозный антигеи. Живая 7—10-дневная культура основных сероваров лептоспир. Применяется для серодиагностики лептоспирозов в реакции агглютинации и лизиса.

Лептоспирозная вакцина. Содержит культуры основных сероваров лептоспир, распространенных в пределах СССР, убитых нагреванием и консервированных фенолом. Применяется для профилактики лептоспирозов в эндемичных очагах инфекции.

Лептоспирозный иммуноглобулин. Применяется для лечения и профилактики лептоспирозов.

Антибиотики： стрептомицин, тетрациклины, левомицетин.

ВОЗБУДИТЕЛИ КРОВЯНЫХ И ТРАНСМИССИВНЫХ ИНФЕКЦИЙ (СПИРОХЕТОЗОВ И РИККЕТСИОЗОВ)

Возбудители кровяных и трансмиссивных инфекций, передающиеся членистоногими (вши и клещи), относятся к разным порядкам бактерий — Spirochaetales и Rickettsiales (табл. 43).

Таблица 43. Возбудители бактериальных кровяных в трансмиссивных инфекций

Возбудители, вызывающие

возвратные тифы

риккетсиозы

Передающиеся вшами：

Сыпные тифы：

Borrelia reccurentis

Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi (mooseri)

Передающиеся клещами：

Пятнистые лихорадки：

Borrelia caucasica и другие виды

Rickettsia rickettsii.

Rickettsia akari

Лихорадка тсутсугамуши:

Rickettsia tsutsugamushi

В оз бу дителями спирохетоза (возвратного тифа) являются бор- релии, а риккетсиозов — риккетсии. Они отличаются друг от друга разнообразными признаками, но прежде всего тем, что риккетсии, являясь облигатными внутриклеточными паразитами, не растут на питательных средах. Возвратный тиф н риккет- сиозы характеризуются специфическими для каждой группы заболеваний патогенетическими и клиническими признаками.

Источником инфекции при возвратном тифе, вызванном Borrelia reccurentis, является человек, а переносчиком — вошь. Если заболевание вызывают Borrelia caucasica, то источником

инфекции служат грызуны, а переносчиком — клещ. Природными хозяевами риккетсий являются различные членистоногие и млекопитающие. Передаются они также членистоногими — вшами и клещами.

Основным методом лабораторной диагностики спирохетозов является бактериоскопическое исследование мазков крови или нативных препаратов в темном поле, а риккетсиозов — серодиагностика, поскольку бактериоскопия крови не дает положительных результатов, а выделение чистых культур на искусственных питательных средах невозможно.

Тема 32. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

ВОЗВРАТНОГО ТИФА И РИККЕТСИОЗОВ

Программа занятия

Методы лабораторной диагностики возвратного тифа и риккетсиозов.

Б актер иоскоп и ческая и серолог ическая диагностика спирохетозов.

Серодиагностика риккетсиозов.

Диагностические, профилактические и лечебные Ърепараты, применяемые при этих заболеваниях.

Демонстрация

Препарат из чистой культуры лептоспир в темном поле.

Препарат боррелий возвратного тифа из крови больного. Окраска по Романовскому—Гимзе.

Микропрепараты риккетсий в пораженных клетках и нз сыпнотифозной вакцины. Окраска по Здродовском^

Схема 19. Микробиологическое исследование при возвратном тифе

МатериалКровь

Микроскопическое исследованиеБиопроба

1-й этап Мазок, окраска Препарат «толстая Заражение морской свинки водным фукси- капля, окраска по «।

номРомановскому —

ГимзеII

Ответ]]

Мазок из крови, Препарат «толс- окраска фукси- тая» капля, окраска номпо Романовско

му—Г имзе

Окончательный ответ

Методы выделения риккетсий в куриных эмбрионах, клеточных^ культурах и путем заражения животных.

Риккетсиозные диагностические и профилактические препараты (корпускулярные и растворимые антигены, сыпнотифозная вакцина).

Задание для выполнения лабораторной работы

Микроскопическая диагностика возвратнрго тифа. Микро скоп ировать препараты крови «толстой» капли, окрашенные по Романовскому—Гимзе, и мазок, окрашенный фуксином. Сделать заключение по данным микроскопического исследования.

Учесть результаты реакции агглютинации риккетсий с сыворотками крови больных эпидемическим и крысиным сыпным тифом по данным, полученным из серологической лаборатории. Определить титр агглютининов в реакциях с антигенами из риккетсий Провацека и Музера, сопоставить результаты и- обосновать серологический диагноз заболевания.

Учесть результаты РСК, поставленных для дифференциации эпидемического и повторного сыпного тифа (болезнь Брилла—Цинссера) по данным, полученным из серологической лаборатории.

Методические указания

Микробиологическая диагностика возвратного тифа

Бактериоскопическое исследование (схема 19). Основной метод лабораторной диагностики возвратного тифа. У больного во время приступа болезни (высокой температурной реакции) берут кровь, готовят мазки и окрашивают фуксином, а также препарат «толстая» капля, который окрашивают по Романовскому—Гимзе. Borrelia reccurentis представляют собой тонкие изогнутые нити длиной 8—16 мкм с 4—12 завитками (рис. 81). В мазках они окрашиваются фуксином в красный цвет, в препарате «толстая» капля — в фиолетово-розовый.

Биопроба. Кровью больных заражают морских свинок. Через 5Г дней при положительном результате в крови животных появляется большое количество боррелий.

Микробиологическая диагностика риккетсиозов

Материалом для выделения возбудителей при всех видах риккетсиозов служит кровь, взятая у больного в возможно раннем периоде лихорадки (схема 20). Однако выделение риккетсий с диагностической целью практически не производится, поскольку они размножаются только в клеточных культурах и куриных эмбрионах, а для выделения риккетсий Провацека приходится предварительно заражать кровью вшей.

Биопроба. Применяется для дифференциации возбудителей эндемических риккетсиозов от риккетсий Провацека. Для этого самцу морской свинки внутрибрюшинно вводят кровь боль-

ного. При большинстве эндемических риккетсиозов у животных развивается специфический периорхит, сопровождающийся накоплением риккетсий в мезотелии влагалищных оболочек яичка.

Для обнаружения риккетсий в переносчиках, органах зараженных животных и клеточных культурах готовят препараты, окрашивают их по Здродовскому и микроскопируют. Риккетсии Провацека полиморфны. В зависимости от стадии инфекции, вида клеточной культуры различные морфологические типы риккетсий обнаруживаются в цитоплазме и ядрах зараженных клеток (рис. 82). Использование иммунофлюорес- центного метода облегчает обнаружение риккетсий.

Серодиагностика. Серологическое исследование является наиболее распространенным и доступным методом лабораторной диагностики риккетсиозов. Оно проводится в реакциях агглютинации, РСК и РПГА (см. схему 20).

Схема 20. Мшфобнологическое исследование при риккетсиозахСхема 20. Мшфобнологическое исследование при риккетсиозахСыворотка кровиСыворотка кровиВыделение возбудителейВыделение возбудителейБиопробаБиопробаСеродиагностикаСеродиагностикаРеакция РСК РПГА агглютинации риккетсийРеакция РСК РПГА агглютинации риккетсийКровь больного, переносчики, органы зараженных животныхКровь больного, переносчики, органы зараженных животныхВведение в жел- Заражение кле- Заражение сам- точный мешок точных куль- цов морских куриного эмб- турсвинокрионаВведение в жел- Заражение кле- Заражение сам- точный мешок точных куль- цов морских куриного эмб- турсвинокриона2-й этап2-й этап,Препараты, окраскапо Здродовскому,Препараты, окраскапо ЗдродовскомуВскрытие животныхВскрытие животныхОтветОтветМатериал

Схема 20. Мшфобнологическое исследование при риккетсиозах

Схема 20. Мшфобнологическое исследование при риккетсиозах

Сыворотка крови

Сыворотка крови

Выделение возбудителей

Выделение возбудителей

Биопроба

Биопроба

Серодиагностика

Серодиагностика

Реакция РСК РПГА агглютинации риккетсий

Реакция РСК РПГА агглютинации риккетсий

Кровь больного, переносчики, органы зараженных животных

Кровь больного, переносчики, органы зараженных животных

Введение в жел- Заражение кле- Заражение сам- точный мешок точных куль- цов морских куриного эмб- турсвинок

риона

Введение в жел- Заражение кле- Заражение сам- точный мешок точных куль- цов морских куриного эмб- турсвинок

риона

2-й этап

2-й этап

,Препараты, окраскапо Здродовскому

,Препараты, окраскапо Здродовскому

Вскрытие животных

Вскрытие животных

Ответ

Ответ

ОтветИ ммунофлюорес-центный методОтветИ ммунофлюорес-центный методОтветОтветПрепараты из органов, окраска по Здро довскому

ОтветИ ммунофлюорес-

центный метод

ОтветИ ммунофлюорес-

центный метод

Ответ

Ответ

Ответ

Реакция агглютинации риккетсий применяется для серодиагностики всех риккетсиозов и характеризуется высокой специфичностью. Реакция ставится в пробирках с двукратными разведениями исследуемой сыворотки крови (1 ： 50,1 :100 н т. д.). К каждому разведению сыворотки в объеме 0,25 мл добавляют по 0,25 мл соответствующего антигена. Через 18 ч инкубации при 37℃ учитывают результаты реакции, не встряхивая про-

бирок. Интенсивность реакции обозначают следующим образом: ++++ полное просветление с нежным мелкозернистым осадком на дне пробирки в виде зонтика； +++ неполное просветление с таким же осадком; ++ незначительное просветление с зернистым осадком； + незначительный зернистый осадок. Положительной считается реакция, которая проявляется не менее чем на ++.

РСК ставят по обычной методике (см. с. 121) с использованием корпускулярных н растворимых антигенов риккетсий. Реакция считается положительной при задержке гемолиза не менее чем на ++. Специфичность РСК позволяет дифференцировать риккетсиозы.

РПГА ставят с растворимым риккетсиозным антигеном, адсорбированным на поверхности эритроцитов. Исследуемые сыворотки разводят от 1 :250 до 1 :64 ООО. В отличие от РСК по РПГА нельзя провести внутригрупповую дифференцировку риккетсиозов. Однако РПГА позволяет определить фазу инфекции, поскольку гемагглютинирующие антитела накапливаются в высоком титре на протяжении инфекционного процесса и титр их быстро падает в период реконвалесценции, а через 6 мес после выздоровления они не обнаруживаются. Использование РСК в сочетании с РПГА позволяет дифференцировать текущее заболевание от перенесенного в прошлом (анамнестического).

Серологическое дифференцирование первичного (эпидемического) и повторного сыпного тифа (болезнь Брилла) основана на образовании при этих двух формах болезни различных классов иммуноглобулинов — IgM (19S) и IgG (7S) соответственно. Дифференциация IgM-антител от IgG-антител проводится по их различной чувствительности к действию 2-меркаптоэтанола, цистеина или других редуцирующих веществ, которые вызывают разрыв дисульфитных связей в молекулах IgM и их распад на субъединицы, лишенные активности антител. IgG при этом не

Таблица 44. Результаты РСК при дифференцировании первичного сыпного тифа от болезни Брилла

изменяются. Дифференцирование первичного сыпного тифа от болезни Брилла проводится путем постановки РСК с испытуемой исходной сывороткой и обработанной 2-меркаптоэтанолом или цистеином. В случае первичного сыпного тифа, для которого характерно преобладание IgM-антител, наблюдается снижение титра антител в обработанной сыворотке не менее чем в 4 раза по сравнению с интактной исходной сывороткой (табл. 44). При болезни Брилла, протекающей с преобладанием IgG, титр антител в обеих сыворотках будет примерно одинаковым (допускается снижение титра не более чем в 2 раза).

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Риккетсиозные антигены сухие корпуску лярные. Взвесь убитых риккетсий, выращенных в курином эмбрионе и хорошо очищенных от примесей. Применяется для постановки реакции агглютинации, РПГА и РСК.

Риккетсиозные антигены сухие растворимые. Получены из суспензии риккетсий путем экстрагирования и обработки эфиром. Используются для постановки РСК и РПГА.

Сухая живая комбинированная сыпнотифозная вакцина Е、 (ЯСКСВ-Е). Смесь живой культуры риккетсий Провацека (вакцинный штамм Е), выращенного в курином эмбрионе, с растворимым антигеном вирулентного штамма риккетсий Провацека. Применяется для активной иммунизации против сыпного тифа.

ВОЗБУДИТЕЛИ ВЕНЕРИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Для возбудителей венерических заболеваний характерен половой путь передачи инфекции. К ним относятся возбудитель сифилиса — бледная трепонема, возбудитель гонореи — гонококк, негонорейных уретритов — стафилококки, стрептококки, уретральные микоплазмы и хламидии, возбудитель мягкого шанкра —гемофильная палочка Дюкрея (табл. 45).

Указанные в табл. 45 микроорганизмы вызывают различные по патогенетическим и клиническим признакам заболевания. Кокки и уретральные микоплазмы избирательно поражают эпителий уретры, шейки матки, палочка Дюкрея — слизистую оболочку мочеполовых путей и лимфатические сосуды. Бледная трепонема вызывает генерализованную инфекцию, сопровождающуюся поражением внутренних органов (печени) и ЦНС. Хламидии трахомы вызывают венерический лимфогранулематоз, а также конъюнктивит новорожденных или бленнорею с включениями, характеризующиеся инфильтрацией конъюнк-

Таблица 45. Возбудители венерических заболеваний

Наименование возбудителей и заболеваний, вызванных

бактериямиспирохетами

микоплазмами и хламидиями

N eisseria gonorrhoeae — го-Тгеропеша

нореяpallidum—

Staphylococcus aureus,сифилис

Streprococcus pyogenes — уретриты Haemophilus ducreyi — мягкий

Mycolasma hominis. Mycoplasma urealyticum — уретриты

Chlamidia trachomatis — венерический лимфогранулематоз

шанкр

тивы. Микробиологическая диагностика этих заболеваний проводится разными методами в зависимости от свойств возбудителя, его способности расти на питательных средах, локализации, периода заболевания и т. д. Микробиологическая диагностика стафилококковых или стрептококковых уретритов проводится так же, как и других заболеваний, вызванных этими бактериями.

Тема 33. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

УРЕТРИТОВ, МЯГКОГО ШАНКРА И СИФИЛИСА

Программа занятия

Микробиологическая диагностика гонореи и негонорейных уретритов.

М икробиологическая диагностика мягкого шанкра.

、3. Микробиологическая диагностика сифилиса.

Демонстрация

Мазки из гноя и чистых культур гонококков, стрептококков и стафилококков. Окраска по Граму.

Мазки из отделяемого язвы при мягком шанкре, содержащие Haemophilus ducrey. Окраска метиленовым синим и по Граму.

Колонии Mycoplasma hominis на питательном агаре или фотографии этих колоний.

Мазок из отделяемого твердого шанкра. Окраска Treponema pallidum методом серебрения и при контрастировании тушью.

Антигены для реакций Вассермана и осадочных реакций.

Задание для выполнения лабораторной работы

Микро скоп ировать мазки из уретрального гноя, окрашенные по Граму. Сделать заключение о возможном возбудителе уретрита.

Учесть поставленную для серодиагностики хронической гонореи реакцию Борде—Жангу. Сделать заключение по результатам реакции.

Учесть реакции Вассермана и осадочные, поставленные для серодиагностики сифилиса. Сделать заключение по результатам реакций.

Методические указания

Материал для исследования： гной или слизь из уретры, сперма, гной из шеечного канала, а также нити и осадок мочи лиц обоего пола.

Микробиологическая диагностика гонореи и негонорейного уретрита

Бактериоскопическое исследование (схема 21). Из исследуемого материала готовят мазки и окрашивают по Граму. В положительном случае обнаруживают коккн. Дифференцирование стафилококков, стрептококков н гонококков проводится на основании взаимного расположения клеток, локализации их внутри или вне лейкоцитов, окраски по Граму. Стафилококки и стрептококки являются грамположительными кокками, которые располагаются, как правило, вне лейкоцитов. Гонококки — грамотрицательные диплококки бобовидной формы (0,96—1 мкм), располагающиеся внутри лейкоцитов (рис. 83). Положительный бактериоскопический диагноз ставится в основном при острой форме гонореи до применения антибиотиков. При хронической гонорее бактериоскопическое исследование часто дает отрицательный результат.

Бактериологическое исследование^. Исследуемый материал петлей засевают на чашки с сывороточным или асцитическим питательным агаром для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 24—72 ч. Гонококки образуют круглые прозрачные колонии, напоминающие капли росы5 в отличие от более мутных колоний стрептококка или пигментированных колоний стафилококка, которые также будут расти на данной среде. Подозрительные колонии пересевают в пробирки с той же средой для получения чистых культур, которые идентифицируют по сахаролитическим свойствам на средах «пестрого» ряда. Гонококк в отличие от других гноеродных кокков ферментирует только глюкозу с образованием кислоты.

Микробиологическая диагностика уретрита, вызванного микоплазмой

Бактериоскопия не применяется, поскольку обнаружить Mycoplasma hominis или Mycoplasma urealyticum в патологическом материале не представляется возможным.

Бактериологическое исследование при бленнорее проводят точно так же.

Бактериологическое исследование. Проводится путем посева материала, взятого из уретры, петлей на твердую питательную среду в чашку Петри н уколом в пробирку с полужидкой средой того же состава. В качестве питательной среды используют триптический перевар бычьего сердца, пептон, хлорид натрия, к которому добавляют дрожжевой экстракт и пенициллин (1000 ЕД) для задержки роста бактериальной микрофлоры. Посевы инкубируют при 37℃ в течение 48 ч. Микоплазма образует колонии в виде яичницы-глазуньи с врастающим в среду центром и полупрозрачной периферией. Идентификацию выделенной культуры микоплазмы проводят по ферментации углеводов, разложению аргинина и серологическим свойствам в реакции ингибиции роста культуры специфической сывороткой и нейтрализации метаболизма аргинина той же сывороткой. М. hominis в отличие от других видов микоплазм не ферментирует углеводы и разлагает аргинин.

Микробиологическая диагностика мягкого шанкра

Материал для исследования： отделяемое язвы (мягкого шанкра).

Бактериоскопическое исследование. Проводится путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму н метиленовым синим.

1-й этап

Схема 21. Микробиологическое исследование при гонорее и бленнорее

Материал Гной из мочеполовых органов, осадок мочи, гной Сыворотка крови из конъюнктивы глаза при бленнорее

Серодиагностика

Бактериологическое исследование

Бактериоскопическое исследование

Мазок, окраска по Граму

Посев на сывороточный питательный агар в чашку

Петри J

РСК

ОтветОтвет

Ответ

Ответ

Ответ

2-й этап

Характер колоний *■

Пересев

на сывороточный пи-

тательный агар (чистая куль-

Мазок, окраска по Г раму «

тура)

3-й этап3-й этапПосев на «пестрый» рядПосев на «пестрый» ряд

3-й этап

3-й этап

Посев на «пестрый» ряд

Посев на «пестрый» ряд

Определение чувствительности к антибиотикам

Окончательный ответ

Сыворотка крови, ликворСыворотка крови, ликворСеродиагностикаСеродиагностикаРеакция ВассерманаРеакция ВассерманаРеакция иммобилизации трепонемРеакция иммобилизации трепонем

Сыворотка крови, ликвор

Сыворотка крови, ликвор

Серодиагностика

Серодиагностика

Реакция Вассермана

Реакция Вассермана

Реакция иммобилизации трепонем

Реакция иммобилизации трепонем

Схема 22 Микробиологическое исследование при сифилисе

Материал Отделяемое твердого шанкра, пунктат лимфатических узлов, отделяемое кожных поражений при вторичном сифилисе

Микроскопическое исследование

Нативный препарат для микроскопии в темном поле

РПГА <~

Осадочные реакции J Закса — Витебского Кана'

*"^-> Иммунофлюоресцент-ное исследование

ОтветОтвет

Ответ

Ответ

Ответ

Наличие в мазках грамотрицательных бактерий, располагающихся в виде длинных цепочек, позволяет подозревать присутствие возбудителя — палочки Дюкрея—Унны.

Бактериологическое исследование. Проводится путем выделения чистой культуры возбудителя. Материал засевают на кровяной агар или другие среды, содержащие дефибринирован- ную кровь. На этих средах гемофильная палочка Дюкрея— Унны через 48—72 ч образует мелкие круглые колонии, окруженные зоной гемолиза. Идентификацию выделенной культуры проводят по ферментации сахаров и по способности агглютинироваться сывороткой этого же больного.

Кожно-аллергическая проба. Ставится с антигеном из гемофильных бактерий Дюкрея—Унны для подтверждения диагноза.

Микробиологическая диагностика сифилиса

Наиболее достоверный метод лабораторной диагностики сифилиса — выявление возбудителя в пробах, взятых у больных в ранних стадиях заболевания, путем бактериоскопического исследования в темном поле (схема 22).

диаг-диаг-Методы и материал, используемые для лабораторной ностики сифилиса, зависят от периода заболевания.

диаг-

диаг-

Бактериоскопическое исследование. Проводят при первичном

сифилисе во время появления твердого шанкра. Материалом для исследования служат отделяемое шанкра, содержимое регионарных лимфатических узлов, из которого готовят препарат «раздавленная» капля и исследуют в темном поле. В положительном случае видны тонкие извитые нити длиной 6—14 мкм, имеющие 10—12 равномерных мелких завитков правильной

I рис. 84. Treponema pallidum в ¥ гемном поле зрения.

формы (рис. 84). Для бледной трепонемы характерны маятникообразные и поступательно -сгибательные движения. При локализации твердого шанкра в полости рта приходится дифференцировать бледную трепонему от сапрофитных тре

понем, являющихся представителями нормальной микрофлоры организма. В этом случае решающее диагностическое значение имеет обнаружение типичных трепонем в пунктате регионарных лимфатических узлов.

Серодиагностика. Наиболее доступна н применяется как основной метод диагностики сифилиса во всех периодах заболевания. Ставятся РСК, реакция Вассермана, осадочные реакции Кана н Закса—Витебского (цитохолевая), реакция иммобилизации трепонем н реакция непрямой иммунофлюоресценции.

Реакцию В ассермана ставят одновременно с тремя антигенами： 1) специфическим, содержащим антигены возбудителя —разрушенные ультразвуком трепонемы, 2) неспецифическим —кардиолипиновым (экстракт бычьего сердца с лецитином н холестерином); 3) неспецифическим — спиртовым экстрактом липоидов из мышцы сердца быка с холестерином. Исследуемую сыворотку разводят 1 ：4 и разливают в 4 пробирки по 0,1 мл. В табл. 46 показана схема постановки этой реакции.

Первый период сифилиса является серонегативным и характеризуется отрицательной реакцией Вассермана. У 50% больных I реакция становится положительной не ранее чем через 2—3 Нед после появления твердого шанкра. Во втором н третьем периодах сифилиса частота положительных реакций достигает 75—90%. После проведенного курса лечения реакция Вассермана стано- |вится отрицательной.

Для диагностики поздних и латентных форм сифилиса Е можно использовать реакцию Вассермана с ликвором, применив те же антигены, что н для реакции с сывороткой больного.

Параллельно реакции Вассермана ставятся две осадочные реакции： Кана и Закса—Витебского (цитохолевая). Для их постановки используют сыворотку больного и соответствующие антигены (табл. 47 и 48).

Непрямая реакция иммунофлюоресценции наиболее специфична. Антигеном является взвесь тканевых трепонем. Сыворотку больного инактивируют так же, как для реакции Вассермана, и разводят 1:200. На предметные стекла наносят капли антигена, высушивают н фиксируют 5 мин в ацетоне. Затем на препарат наносят сыворотку больного, через 30 мин промывают и высушивают. Следующим этапом является

Таб л иц а 46. ПостановкареакпииВассермана

Ингредиенты, мл

№ пробирки

1

2

3

4 (контроль)

Инактивированная испытуемая сы-

воротка

0,1

0,1

0,1

o,i-

Изотонический раствор хлорида натрия

0,4

0,4

0,4

0,9

Антиген № 1, разведенный по титру

0,5

—

—

一

Антиген № 2, разведенный по титру

—

0,5

—

-—

Антиген № 3, разведенный по титру

—

—

0,5

—

Комплемент (в рабочей дозе)

05

0,5

0,5

0,5

В термостат на 45 мин

Гемолитическая система (сенсибили-

зированная)

1,0

1,0

1,0

1,0

В термостат на 40—60 мин в зависимости от наступления гемолиза в контроле Регистрация результатов реакции после наступления гемолиза в контроле

Результат-Н-+-Н-+-Н-+-

Условные обозначения： -НТ полная задержка гемолиза； — гемолиз.

обработка препарата флюоресцирующей сывороткой против глобулинов человека. Изучают препарат с помощью люминесцентного микроскопа, отмечая степень свечения трепонем.

Реакция иммобилизации трепонем является специфической реакцией для диагностики сифилиса. Принцип реакции заключается в угнетении движения бледных трепонем (иммобилизация) антителами сыворотки крови в присутствии комплемента. Трепонемы получают из яичка кролика, зараженного экспериментальным сифилисом. Яичко измельчают в специальной среде, в которой трепонемы сохраняют подвижность. Ставят реакцию следующим образом： взвесь тканевых 226

Таблица 47. Постаноика реакции Кана

Ингредиенты, мл

№ пробирки

1

2

3

4

5

6

Антиген

0,05

0,025

0,0125

0,05

0,025

0,0125

Испытуемая сыворотка

Изотонический раствор

0,15

0,15

0,15

—

—

хлорида натрия

—

—

0,15

0,15

0,15

Тщательно встряхивать в течение 3 мин

Изотонический раствор хлорида натрия

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Встряхивать 1 мин

Результаты при положительной реакции

+-Н-

-НЧ-

3

—

—

—

Условные обозначения： 4 f ■{ появление приципитата и выпадение хлопьев; — отсутствие хлопьев.

(подвижных) трепонем соединяют в пробирке с исследуемой сывороткой и добавляют свежий комплемент. В одну контрольную пробирку вместо исследуемой сыворотки наливают сыворотку здорового человека, в другую — вместо свежего комплемента добавляют инактивированный, неактивный. После выдерживания при 35℃ в анаэробных условиях (анаэростат) из всех пробирок готовят препарат «раздавленная» капля и в темном поле определяют количество подвижных и неподвижных трепонем. Процент специфически иммобилизованных спирохет определяют по формуле：

где 7^ — число подвижных трепонем в контроле (с инактивированным комплементом); То — число подвижных трепонем в опыте (с активным комплементом). Результат реакции считают положительным, если процент иммобилизации выше 50, слабоположительным ~ от 31 до 50, сомнительным — от 21 до 30 н отрицательным — ниже 20.

Таблица 48. Постановка реакции Закся — Витебского

Ингредиенты, мл

№ пробирки

опытная

контрольные

с антигеном

с сывороткой

1

2

3

Испытуемая сыворотка

0,2

—

0,2

Антиген

0,1

0,1

—

Спирт 95%, разведенный 1 ： 2

—

—

0,1

Изотонический раствор хлорида

натрия

一

0,2

Встряхивать 1 мин, затем оставить при комнатной температуре на 30 мин

Изотонический раствор хлорида натрия

1,0

1,0

и

Результаты при положительной реакции

+++

—

一

Условные обозначения те же, что и в табл. 47.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Гонококковый антиген. Взвесь убитой культуры гонококка. Применяется для постановки РСК.

Гонококковая вакцина. Взвесь гонококков, убитых нагреванием. Используется для вакцинотерапии хронической гонореи, а также для «провокации» при диагностике этого заболевания.

Антигены для реакции Вассермана: № 1 — специфический из тканевых трепонем, разрушенных ультразвуком； № 2 — спиртовой экстракт липоидов из мышцы сердца быка с добавлением 0,3% холестерина (неспецифический) ； № 3 — кардиолипиновый (также неспецифический), — высокоочищенный экстракт бычьего сердца, имеющий постоянный химический состав липоидов и смешанный в определенной пропорции с лецитином и холестерином.' Антигены разводят согласно инструкции и используют в рабочих дозах, указанных на этикетках.

Антиген Кана. Для постановки осадочной реакции Кана разводят в соответствии с указаниями на этикетке.

Антиген цитохолевыи. Для постановки осадочной реакции

Закса—Витебского разводят по титру, указанному на этикетке. Этот антиген более концентрированный по сравнению с антигеном Кана, что позволяет быстрее учитывать поставленную с ним осадочную реакцию.

Антибиотики и химиотерапевтические йрепараты： пенициллин, тетрациклины и др. '

Таблица 49. Возбудители вирусных респираторных инфекции

Наименование вирусов

Вызываемые заболевания

ДНК-

Семейство Adenoviridae Аденовирусы

вирусы

Риниты, ларингиты, трахеобронхиты, ОРЗ, пневмонии, отиты, острый конъюнктивит

Семейство Herpesviridae

Вирус герпеса 1-го типа

Вирус герпеса 2-го типа

Вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая

Острый гингивостоматит у маленьких детей, герпетическая экзема, кератоконъюнктивит, герпетическая лихорадка

Герпес новорожденных (генерализованный, генитальный герпес)

Ветряная оспа у детей, опоясываю* ющий лишай у взрослых

РНК-1

Семейство Orthomyxoviridae Вирусы гриппа-А

Вирусы гриппа В и С

【нрусн

Грипп (эпидемии, пандемии, спорадические случаи)

Грипп (спорадические случаи, эпидемии)

Семейство Paramyxoviridae Вирусы парагриппа, болезни Ньюкастла,_респираторно-синци- тиальный вирус (РСВ) Вирус паротита Вирус кори

ОРЗ Паротит Корь

Семейство Coronaviridae Коронавирусы

ОРЗ

Семейство Picornaviridae

Риновирусы

Вирусы Коксаки Aio, А21, А24, Вз, А2, А4, As и др. Вирус ЕСНОго и др.

Риниты, бронхиты, ОРЗ ОРЗ

Герпангина

ОРЗ

Семейство Reoviridae Реовирусы

ОРЗ, пневмонии (редко)

Лабораторная диагностика вирусных инфекции

Для лабораторной диагностики вирусных инфекций используют вирусологические, серологические и биологические методы исследования. Среди них наиболее трудоемкими являются (вирусологические, заключающиеся в заражении исследуемым материалом клеточных культур или куриных эмбрионов. В связи с различной чувствительностью клеточных культур к вирусам приходится одновременно заражать несколько первичных или перевиваемых культур. Некоторые вирусы могут быть обнаружены при заражении лабораторных животных.

Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций： нейтрализации, РСК, РТГА, преципитации в агаре и др. Выбор той или другой реакции связан с особенностями антигенной структуры исследуемого вируса. Выделение вируса и его идентификация требуют сравнительно много времени： от 7—10 до 30 дней и более. Это объясняется тем, что во многих случаях приходится 2—3 раза пассировать вирус в культуре клеток для его накопления (слепые пассажи). Поэтому особое значение для ускорения проведения анализов имеет иммунофлюоресцентный метод, позволяющий в некоторых случаях обнаружить и идентифицировать вирус в исследуемом материале в течение 30—60 мин.

Серодиагностика вирусных инфекций носит в основном ретроспективный характер и применяется для подтверждения диагноза. Чаще всего ставят РСК и РТГА, реже реакцию нейтрализации и др. не менее чем с двумя сыворотками одного и того же больного, взятыми в разные сроки заболевания (парные - сыворотки) для обнаружения нарастания титра антител.

Особое значение вирусологических и серологических исследований состоит в том, что только на основании полученных данных можно провести эпидемиологический анализ вспышек вирусных, заболеваний для установления источников инфекции и путей циркуляции вируса среди людей н животных как в эпидемическом, так и в межэпидемическом периодах.

ВОЗБУДИТЕЛИ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Возбудители респираторных вирусных инфекций относятся к разным семействам РНК- и ДНК-co держащих вирусов (табл. 49). Они объединены в одну группу на основании способности проникать в организм преимущественно через слизистую оболочку верхних дыхательных путей, а также общих принципов лабораторной диагностики. Приведенные в табл. 49 вирусы

вызывают главным образом поражения респираторного тракта. Однако некоторые из них могут поражать другие ткани и органы •человеческого организма. Так, ряд вирусов, например вирус паротита, преимущественно поражает слюнные железы, ткани яичек у мальчиков и другие органы, а вирус краснухи вызывает системное поражение лимфатических узлов, эмбриональных тканей у беременных (см. на с. 229, табл. 49).

Для респираторного тракта наиболее характерны смешанные инфекции, вызванные вирусными, вирусно-бактериальными, вирусно-микоплазменными ассоциациями, что необходимо учитывать при лабораторной диагностике. При всех респираторных инфекциях возбудитель локализуется в верхних дыхательных путях, поэтому материалом для исследования служат мазки и смывы из носоглотки, а при поражении легких — мокрота н промывные воды бронхов. При герпесе и ветряной оспе вирусы также обнаруживаются в высыпаниях на слизистой оболочке полости рта и на коже. Вирусемия наблюдается лишь при самых тяжелых формах заболеваний, вызванных перечисленными вирусами, а также при детских инфекциях： кори, паротите, краснухе, ветряной оспе.

В лабораторной диагностике ОРЗ наиболее широкое применение нашли экспресс-методы： иммунофлюоресценция н рино- цитоскопия, позволяющие в течение 2—3 ч поставить ориентировочный диагноз. Вирусологические методы с выделением М идентификацией возбудителя используются преимущественно для эпидемиологического анализа вспышек заболеваний, вызываемых данными вирусами. Серологическая диагностика при гриппе и других ОРЗ носит ретроспективный характер, так как накопление антител происходит в период реконвалесценции (через 2—3 нед после начала заболевания). Несколько более раннее накопление антител характерно для детских инфекций. Для серодиагностики используют РТГ А, РСК и реакцию нейтрализации вируса.

Тема 34. ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ И СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ

ДИАГНОСТИКА ГРИППА, ПАРАГРИППА И АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Программа занятия

Изучение схемы диагностики респираторных вирусных инфекций.

Экспресс-методы диагностики.

Вирусологическая диагностика гриппа и других респираторных вирусных инфекций.、

Серодиагностика гриппа и других респираторных вирусных инфекций.

Диагностические, пр оф илактич еские и лечебные препараты, применяемые при указанных заболеваниях.

Демонстрация

Иммунофлюоресцентный метод экспресс-диагностики гриппа и ОРЗ.

Риноцитоскопия при гриппе и аденовирусной инфекции.

Вакцины, иммуноглобулины, лечебные сыворотки, диагностикумы, диагностические моно- и поливалентные сыворотки.

Задание для выполнения лабораторной работы

Исследовать полученную из зараженных куриных эмбрионов амниотическую и аллантоисную жидкость на присутствие вируса гриппа в реакции гемагглютинации.

Учесть результаты идентификации выделенного вируса гриппа в РТГА. Сделать заключение.

Учесть результаты идентификации аденовирусов, выделенных в культуре клеток, в РСК. Сделать заключение.

Оценить результаты серодиагностики разных респираторных вирусных инфекций в РТГА и РСК.

Методические указания

Материал для исследования： смывы из носоглотки, мокрота, мазки из зева. Риноцитоскопическое исследование является ориентировочным экспресс-методом лабораторной диагностики гриппа. С поверхности нижней носовор раковины больных берут мазки-отпечатки (с помощью узких стекол со шлифованным краем или пластинок из плексигласа). Препараты окрашивают смесью основного фуксина и метиленового синего. В цитоплазме цилиндрического эпителия, а также в цитоплазме дегенерированных макрофагов, в лейкоцитах располагаются ширококонтурированные включения, окрашенные в красный цвет. Риноцитоскопическое исследование не является специфическим методом диагностики гриппа, однако данный метод позволяет дифференцировать грипп от аденовирусных инфекций, при которых наблюдаются деструкция клеток, вакуолизация ядер и образование внутриядерных включений.

При репродукции аденовирусов в эпителиальных клетках наблюдаются характерные цитопатические изменения, существенно отличающиеся от тех, которые вызываются другими вирусами： своеобразная группировка дегенерированных клеток в виде гроздьев на периферии клеточного пласта и быстрое отслоение пораженных клеток от поверхности стекла. В культурах фибробластов цитопатические изменения развиваются медленнее и характеризуются резким набуханием клеток с распадом ядра. Для аденовирусной инфекции эпителиальных клеток и фибробластов характерно образование внутриядерных включений.

Экспресс-диагностика (схема 23). Иммунофлюоресцентный

метод Кунса является наиболее специфичным, универсальным в отношении разных видов возбудителей. Определение вирусных антигенов с помощью флюоресцентных антител проводится прямым и непрямым способами.

Материалом для исследования служат смывы из зева и носоглотки больных, а также зараженные смывами клеточные культуры. Для приготовления препаратов смыв центрифугируют при 2000—3000 оборотов в течение 10 мин. Из осадка готовят нативные мазки на нескольких обезжиренных предметных стеклах для обработки различными флюоресцирующими сыворотками： против вирусов гриппа Al, А2 и В, против вирусов парагриппа II и III типов, против респираторно-синцитиального вируса, поливалентной противоаденовирусной сывороткой.

При микроскопии препаратов обращают внимание на светящиеся вирусные частицы, располагающиеся внутри клеток： аденовирусы — в ядре, вирусы гриппа и парагриппа —в цитоплазме в виде круглых или овальных мелких образований. Число светящихся вирусных частиц может быть различным — от единичных до боташих скоплений.

Вирусологическое исследование. Носоглоточные смывы обрабатывают смесью антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 1000 ЕД/мл) и центрифугируют. Надосадочной жидкостью производят заражение куриного эмбриона (для вируса гриппа), клеточных культур перевиваемых клеток почек обезьян МК-2 (для вирусов гриппа и парагриппа) и клеток НЕР-2 (для аденовирусов)；

Для приготовления препаратов в пробирки, предназначенные для клеточных культур, предварительно помещают половинки покровных стекол. Через 24 ч после заражения при первых признаках ЦПД вирусов покровные стекла извлекают н обрабатывают различными флюоресцирующими антисыворотками.

Метод флюоресцирующих антител дает возможность выявить респираторные вирусы в зараженных клеточных культурах в более ранние сроки, чем их индикация по ЦПД или по гемадсорбции, н при весьма малой инфицирующей дозе. С помощью иммунофлюоресцентного метода проводится не только индикация, но и идентификация вирусов парагриппа, РСВ, аденовирусов и микоплазм в зараженных клеточных культурах. Кроме того, после накопления в клеточных культурах можно идентифицировать аденовирусы—в РСК, вирусы парагриппа —в РТГА, РСК н в реакции нейтрализации со специфическими антисыворотками.

Для выделения, пассирования и титрования вирусов гриппа их культивируют в развивающихся куриных эмбрионах.

Наличие вируса гриппа в амниотической или аллантоисной

Рис. 85. Постановка реакции торможения гемагглютинации.

жидкости определяется ориентировочно с помощью РГА. Вирусы гриппа А хорошо агглютинируют эритроциты курицы, морской свинки, человека с группой крови I (0); вирусы гриппа В — эритроциты курицы.

Для титрования вируса в реакции гемагглютинации берут 1% взвесь эритроцитов. Титром вируса считается то наибольшее разведение, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов не менее чем на ++ (1 АЕ — одна агглютинирующая единица).

Штаммы вируса гриппа, выделенные от больных во время эпидемических вспышек или в межэпидемические периоды, подлежат изучению с целью определения их серологического типа. Типирование вируса проводят в РТГА с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Тип вируса (А, В или С) дифференцируют в РСК. Подтипы вируса А с антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и др. могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток (табл. 50 и 51).

Для идентификации Н- и N-антигенов используют моно- рецепторные сыворотки, полученные отдельно к гемагглютинину и нейраминидазе. При этом идентификация Н-антигена проводится в РТГА или с помощью реакции иммунопреципитации в геле, а N-антигена — в реакции ингибиции нейраминидазы и реакции иммунопреципитации в геле.

Таблица 50. Постановка РТГА для типирований вируса гриппа

Ингредиенты, мл

№ пробирки

опытные

контрольные

1

2

3

4 ...

1 сыво> ротки

2 виру- 'са

3 эритро-

Разведение типоспецифической сыврротки

Вирус (4-гемагглю- тинирующие

1 :10

0,2

1 :20

0,2

1 :40

0,2

1 :80 и т. д. 0,2 до титра

0,2

-

дозы)

Изотонический раствор хлорида

0,2

0,2

0,2

0,2 ...

0,2

натрия

—

—

—

一...

0,2

0,2

0,2

Экспозиция 60 мин при комнатной температуре

1% суспензия эритроцитов курицы

0,4

0,4

0,4

0,4 ...

0,4

0,4

0,4

Экспозиция 30—60 мин при комнатной температуре

Результаты

Таблица 51. Результаты РТГА при типированин вируса гриппа.

Типоспецифиче- ская противогрип- позная сыворотка

Разведение сыворотки

Контроль

1 : 10

1 :20

1 :40

1 :80

1 : 160

сыворотки

вируса

эритроцитов

HONi

H1N1

H3N2

—

+

-н-

+++ +-Н-

+-Н-

4-Н-

+++ +-Н-

—

-Н-+ +++ +++

—

Условные обозначения：・Н■+1 выраженная гемагглютинация (тонкая пленка из склеившихся эритроцитов на дне пробирки, имеющая вид зонтика); I I I наличие просветов в пленке； -Н- наличие пленки с фестончатыми краями из склеившихся эритроцитов； + хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов; — резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля.

Таблица 52. Результаты РСК с парными сыворотками больного (1 и 2) при серодиагностике гриппа и ОРЗ

Результаты РТГА (рис. 85, 86), приведенные в табл. 51, свидетельствуют, что гемагглютинирующая активность исследуемого вируса нейтрализуется типоспецифической сывороткой H3N2 в разведениях 1:10—1 ： 160 (до его титра), т. е. исследуемый вирус относится к подтипу A(H3N2).

Серодиагностика. Осуществляется с помощью РСК и РТГА со стандартными диагностикумами, представляющими собой наборы эталонных штаммов различных серологических типов вируса гриппа (табл. 52 и 53). РСК более чувствительна, чем РТГА, и позволяет выявить антитела для всех штаммов одного и того же серотипа вируса. Диагностическое значение имеет четырехкратное увеличение титра антител в парных сыворотках

Таблица 53. Результаты РТГА с парными сыворотками больного (1 н 2) при серодиагностике гриппа и парагриппа

Диагностикум

Разведение сыворотки

.Контроль сыворотки

1 : 10

1 : 20

1 :40

1 : 80

1 : 160

Вирус гриппа А 1

一

(H3N2)2

—

—

一

Вирус гриппа В 1

—

—

—

一

一

2

—

一

Вирус парагриппа I 1

+

—

一

一

2

+

+

+

—

一

Вирус парагриппа II 1

十

一

一

一

一

2

+

Вирус парагриппа III 1

+

—

一

一

2

+

—

—

—

—

—

(в период эпидемии гриппа) и двукратное нарастание в сыворотках больных при характерной клинической картине. Отсутствие нарастания титра антител, однако, не исключает гриппозной инфекции. РТГА применяется для уточнения антиген- ных разновидностей вируса в пределах одного серотипа и подтипа.

Диагностические, профилактические и лечебные

препараты

Типоспецифические гриппозные сыворотки HON, H1N1, H2N2, H3N2, В и С. Применяются для серотипирования вирусов гриппа в РТГА и РСК.

Типоспецифические парагриппозные сыворотки. Используются для дифференцирования и серотипирования вирусов парагриппа.

Сухие типоспецифические диагностикумы (гриппозный и пара1риппозный). Применяются для серодиагностики соответствующих инфекций.

Таблица 54. Возбудители иейровирусиых инфекпий

Наименование вирусов

Вызываемые заболевания

Энтеровирусы

Семейство Picornaviridae Полиовирусы 1,2,3

Вирусы ЕСНО< 5 9 и и и др.

Вирусы Коксаки А?, Аэ

Вирусы Коксаки В~6

Неп ара литический полиомиелит (асептический менингит). Паралитический полиомиелит

Асептический менингит Асептический менингит Энцефаломиелокардит у детей

Группа арбовирусов

Семейство Togaviridae

Вирус клещевого энцефалита

Вирус японского«

Вирус омской геморрагической лихорадки

Семейство Bunyaviridae

Вирус крымской геморрагической

лихорадки

Семейство Arenaviridae

Вирус лимфоцитарного хорио-

менингита

Энцефалит, асептический менингит

Энцефалит, асептический менингит Геморрагическая лихорадка с кровотечениями и поражениями ЦНС

Геморрагическая лихорадка с кровотечениями и поражениями ЦНС

Асептический менингит или энцефаломиелит

Семейство Rhabdoviridae Вирус бешенства

Энцефаломиелит с поражением нейронов головного и спинного мозга

Живая 1риппозная вакцина. Готовится из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных вакцинными штаммами вируса гриппа основных серотипов, вакцину одного вида вводят через нос, другую — через рот.

Лечебно-профилактическая поливалентная гриппозная сыворотка. Получена путем гипериммунизации лошадей вирусами гриппа разных серотипов. Выпускается в сухом виде в смеси с антибиотиками и сульфаниламидами. Применяется интрана- зально с целью профилактики гриппа и для лечения больных в самом начале заболевания.

Противовриппозный донорский иммуноглобулин. ГОТОВИТСЯ из сыворотки крови доноров, иммунизированных живой гриппозной вакциной типов А и В. Применяется для профилактики и лечения гриппа в эпидемических очагах.

Человеческий лейкоцитарный интерферон. Видоспецифический белок, синтезированный лейкоцитами человека, находящимися в культуральной среде, в ответ на воздействие вируса- интерфероногена. Применяется для профилактики и лечения гриппа и других вирусных респираторных заболеваний.

Аденовирусные диагностикумы. Применяются для серодиагностики соответствующих инфекций.

Типоспецифические аденовирусные сыворотки. Используются для серологического типирования аденовирусов в реакции нейтрализации и РТГА.

ВОЗБУДИТЕЛИ НЕЙРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Нейровирусные инфекции вызываются представителями разных семейств, главным образом РНК-содержащих вирусов, отличающихся друг от друга многими признаками (табл. 54). К ним относятся тогавирусы, аренавирусы, рабдовирусы, а также ряд пикорнавирусов, объединенных в род энтеровирусов —вирусы полиомиелита, Коксаки и ECHO, которые первично репродуцируются в лимфатических узлах тонкой кишки и выделяются с фекалиями. Однако по патогенетическим и клиническим признакам вызьшаемых ими заболеваний (полиомиелит, серозные менингиты, менингоэнцефалиты и др.) данные вирусы можно отнести к возбудителям нейровирусных инфекций. В более редких случаях поражение ЦНС вызывают и ДНК- содержащие вирусы, например герпесвирусы 1-го и 2-го типов.

Для лабораторной диагностики нейровирусных инфекций существенное значение имеет стадия заболевания. Почти во всех случаях в течение первых 5T сут вирус обнаруживается в крови (стадия вирусемии), после появления неврологических

симптомов — в ликворе. При некоторых нейровирусных инфекциях, например полиомиелите, вирус выделяется с фекалиями больного, а при бешенстве — со слюной. Наиболее доступным методом лабораторной диагностики этих инфекций являются серологические исследования, которые проводят с помощью РСК, РТГА, реакции нейтрализации и др. Серологические реакции всегда ставят не менее чем с двумя сыворотками крови больного, взятыми в острый период болезни и в стадии реконвалесценции.

Тема 35. ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ И СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ

ДИАГНОСТИКА НЕЙРОИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ-

ПИКОРНАВИРУСАМИ, ФЛАВИВИРУСАМИ, ВИРУСАМИ БЕШЕНСТВА И ЛИМФОЦИТАРНОГО ХОРИОМЕНИНГИТА

Программа занятия

Изучение схемы диагностики нейровирусных инфекций.

Вирусолог ическая. диагностика полиомиелита.

Серологическая диагностика нейровирусных инфекций.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые гри этих заболеваниях.

Демонстрация

Тельца Бабеша — Негри.

Диагностйкумы, сыворотки и вакцины, применяемые при диагностике, лечении и профилактйке нейровирусных инфекций.

Задание для выполнения лабораторной работы

L Учесть результаты заражения исследуемым материалом культуры клеток. Отметить наличие и выраженность ЦПД, его характер и наметить план дальнейшего вирусологического исследования.

Учесть результаты идентификации энтеровирусов в реакции нейтрализации со специфическими иммунными сыворотками. Сделать заключение на основании полученных данных.

Оценить результаты титрования вируснейтрализующих антител в парных сыворотках больного к эталонным штаммам энтеровирусов. Сделать заключение.

Учесть результаты РСК с парными сыворотками больного энцефалитом и обосновать серологический диагноз заболевания.

Методические указания

Вирусологическая и серологическая диагностика полиомиелита и инфекции, вызванных вирусами Коксаки и ECHO

Материал для исследования; фекалии, смывы из зева, ликвор.

В первые 10 дней заболевания энтеровирусы выделяются с

фекалиями и только в течение первых 3 дней обнаруживаются в носоглоточном отделяемом.

Вирусологическое исследование. Испражнения больного собирают в стерильный флакон троекратно на протяжении первых 3—5 дней заболевания. Для уничтожения многочисленной бактериальной флоры обрабатывают их антибиотиками (смесь пенициллина со стрептомицином, содержащая по 1000 ЕД/мл каждого антибиотика в растворе Хенкса) в течение суток при 4℃, после чего проводят контрольный высев на стерильность. При отсутствии бактерий суспензию испражнений используют для заражения клеточных культур, а при сохранении бактериальной флоры повторно обрабатывают теми же антибиотиками. Заражают одновременно по 2—3 пробирки с первичной культурой клеток (фибробластов эмбриона человека или почек обезьян) и перевиваемой культурой клеток (линий HeLa, амниона человека и др.), поскольку одни виды энтеровирусов лучше репродуцируются в первичных, другие — в перевиваемых клетках. Обычно на 2—3-й день после инкубации зараженных клеточных культур при 35℃ наблюдается полная или частичная дегенерация клеток. При этом интенсив- нось ЦПД зависит от многих причин： дозы вируса, вида и состояния культуры клеток и др. В случае слабовьфаженного или полного отсутствия ЦПД проводят дополнительно 2T пассажа. При отрицательном результате исследование прекращают, при положительном—приступают к идентификации вьзде- ленного цитопатогенного агента (вируса). Исследуемый вирус предварительно титруют в той же клеточной культуре, на которой он был выделен. Для реакции нейтрализации берут 100 ЦПД50 данного вируса (за 1 ЦПД50, принимают максимальное разведение виру。％ вызывающее дегенерацию не менее 50% клеток культуры).

Идентификацию энтеровирусов проводят путем серотипирования в реакции нейтрализации в культуре клеток. С этой целью используют смеси диагностических моновалентных сывороток или стандартные поливалентные сыворотки, а затем соответствующие моновалентные сыворотки. Вначале устанавливают принадлежность исследуемого агента к вирусам полиомиелита, Коксаки или ECHO в реакциях нейтрализации с поливалентными сыворотками к каждой из трех упомянутых групп вирусов. Так, если нейтрализация исследуемого вируса произошла с поливалентной сывороткой Коксаки, то на следующем этапе ставят реакцию нейтрализации с моновалентными сыворотками к каждому серотипу данного вируса (табл. 55—57).

Некоторые серотипы вирусов ECHO (3, 6, 7), Коксаки А (20, 21), Коксаки В (1—5), обладающие гемагглютинирующими

Тип €ЫВОрОТКИ к вирусам полиомиелита

День учета

Контроль .сыворотки

Тип выделенного вируса полиомиелита

2-й

3-й

4-й

5-й

6-й

7-й

I

1

II

—

—

+

-Н-+

++++

++++

—

III

—

++

+++

-Н-Н-

-н-н-

—

Контроль вируса

—

+

-н-

4-Н-

-н-н-

++++

Таблица 55. Результаты реакции нейтрализации выделенных от больных вирусов с моновалентными иммунными сыворотками к вирусам полиомиелита I—III тяпов

Условные обозначения： ++-Н-выраженная дегенерация клеток с их отслаиванием от стенок пробирки； I I 卜 менее выраженная дегенерация клеток с частичным отслаиванием от стенок пробирки； ++ наличие не более 50% дегенерированных клеток； + наличие одиночных дегенерированных клеток; —отсутствие ЦПД.

Сыворотка к вирусам Коксаки

День учета

Контроль .сыворотки

Тип выделенного вируса

2-й

3-й

4-й

5-й

6国

7-й

Bi

+

++

+++

-н-н-

-н-н-

в2

—

-Н-

+-Н-

-Н-+

-н-н-

-н-н-

Вз

—

—

—

—

—

—

—

Коксаки Вз

В4

—

+

++

4-Н-

-Н-Н-

++-Н-

—

в5

—

++

++

+-Н-

-н-н-

++++

—

в6

—

+

++

4-Н-

++++

++++

—

Контроль

вируса

一

++

+++

4-Н-

-Н-Н-

-Н-Н-

Таблица 56. Результаты реакции яейтрализацни выделенных от больных вирусов с моновалентными иммунными сыворотками к вирусам Коксаки

У словные обозначения те же, что и в табл. 55.

свойствами, типируют в РТГА. Для выделения вирусов Коксаки А, которые плохо репродуцируются в клеточных культурах, заражают новорожденных белых мышей, у которых на 3—5-й день развиваются вялые параличи. Идентификацию этих вирусов проводят в реакции нейтрализации на новорожденных мышах с моновалентными диагностическими сыворотками против серотипов вирусов Коксаки А.

Тип сыворотки к вирусам

ECHO

День учета

Контроль „сыворотки

Тип выделенного вируса

2-й

3-й

4-й

5-й

6-й

7-й

9

一

一

+

++

+++

+++

——

Н

—

—

—

—

—

—

—

11

12-

—

+

++

4-Н-

+++

-Н-Н-

—

13

—

+

++

++

+++

+-Н-+

—

14

—

++

++-

+++

-НЧ-

-н-н-

—

15

—

+

++

+++

-н-н-

++++

—

16

—

+

-Н-+

+++

-Н-Н-

4-Н-+

Контроль

вируса

—

++

+-Н-

-Н4-

-н-н-

-н-н-

Таблица 57. Результаты реакции нейтрализации вируса моновалентными иммунными сыворотками против 9—16-го типов вирусов ECHO

Условные обозначения те же, что и J табл. 55.

Сроки взятия

крови после начала заболевания,

дни

Вирус

Разведение сыворотки

Контроль сыворотки

Титр антител

Кратность нарас- тавия титра

1:4

1:16

1:64

1:256

1512

1:1024

3

Кокса-

киВз

——

++++

-н-н-

++++

—

1:4]

64

20

То же

—

一

——

——

+++ +

-н-н-

——

1 : 256|

3

Кокса-

КИ В5

—

—

1 -н h

++++

++-Н-

-Н-++

—

1:16]

о

20

То же

—

—

-н-н-

-н-н-

-н-н-

-н-н-

—

1:16]

Таблица 58. Результаты реакции нейтрализации с парными сыворотками крови больного и антигенами — вирусами Коксаки Вз н Вб

Условные обозначения те же, что и в табл. 55.

Серодиагностика. Ретроспективный метод лабораторной диагностики, поскольку ответ обычно дается после выздоровления или смерти больного. Серодиагностика энтеровирусных инфекций основана не на абсолютных показателях титра антител в исследуемой сыворотке, а на его увеличении не менее чем в 4 раза в процессе заболевания. С этой целью кровь у больного берут 2 раза： в первые дни болезни и вторично через 3—4 нед. Сыворотку первой пробы крови сохраняют в

холодильнике, и реакцию ставят одновременно с обеими сыворотками.

Для серодиагностики применяют реакцию нейтрализации в культуре клеток с эталонными штаммами тех типов энтеровирусов, которые чаще всего выделяют от больных. Выбор эталонных штаммов зависит от эпидемиологической обстановки и клинических симптомов заболевания. Эталонный вирус берут в количестве 100 ЦПД. Парные сыворотки разводят с коэффициентом 4 :от 1/4 до 1/1024 (табл. 58). Серодиагностику заболеваний, вызванных гемагглютинирующими типами вирусов Коксаки и ECHO, проводят в РТГА.

Серологическая диагностика клещевого энцефалита и хронического менингоэнцефалита

Экспресс-диагностика. Для определения зараженности клещей используют иммунофлюоресцентный метод (мазки-отпечатки) и РПГА со взвесью исследуемого материала и эритроцитами, нагруженными антителами к вирусу клещевого энцефалита. Предварительный ответ получают спустя 2—3 ч.

Серодиагностика. Проводится в реакции нейтрализации, РСК и РТГА со стандартными вирусными антигенами и парными сыворотками больного, взятыми в начале болезни и через 5—7 нед. Постановка реакции требует соблюдения мер безопасности вследствие возможного присутствия вируса в исследуемых пробах крови больного в острый период заболевания. Оценка результатов серологических реакций производится с учетом анамнестических дайных (ревакцинация, введение противоэнце- фалитного иммуноглобулина).

Лабораторная диагностика бешенства

Прижизненная диагностика бешенства у людей не разработана. Лабораторная диагностика бешенства у животных (собак и др.) проводится постмортально по обнаружению включений： телец Бабеша—Негри. Морфологическому исследованию подлежат срезы аммонова рога и мозжечка. Выявление включений с несомненностью подтверждает диагноз бешенства, а их отсутствие не исключает его. Тельца Бабеша—Негри имеют округлую или овальную форму, размеры 4—10 нм, окружены оболочкой, содержат от 1 до 15 зернышек разной величины. В большинстве случаев включения окрашиваются в красный цвет на голубом фоне цитоплазмы (рис. 87).

Широкое распространение в лабораторной диагностике бешенства получил иммунофлюоресцентный метод.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Поливалентная и типоспецифические полиомиелитные сыворотки I—III типов. Применяются для типирования вирусов полимиелита.

Поливалентные и типоспецифические (моновалентньш) сыворотки Коксаки и ECHO. Применяются для дифференцировки и типирования соответствующих вирусов.

Пероральная живая вакцина против полиомиелита. Содержит аттенуированные штаммы вирусов полиомиелита I—III типов, выращенных на культуре клеток почек африканских зеленых мартышек. Вакцина выпускается в жидком виде и в форме драже для перорального применения.

Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получается путем фракционирования крови человека (донорской, плацентарной или абортивной), содержащей антитела. Применяется для профилактики и лечения полиомиелита.

Диагностические эталонные типоспецифические сыворотки против вируса клещевого энцефалита и других арбовирусов. Получены путем иммунизации животных определенными арбовирусами или используются сыворотки людей, переболевших соответствующей арбовирусной инфекцией. В каждом случае предварительно устанавливают титр антител.

Диагностикум из вируса клещевого энцефалита. Готовится из мозга мышей, зараженных выделенным вирусом, прошедшим 1—2 пассажа на мышах Применяется для постановки РСК.

Инактивированная культуральная вакцина против клещевого энцефалита. Стерильный культуральный специфический антиген вируса клещевого энцефалита, инактивированного формалином. Применяется для профилактики энцефалита у населения и персонала лабораторий в природных очагах по эпидемиологическим показаниям.

Иммуноглобулиа против клещевого энцефалита. Содержит в высоком титре специфические противовирусные антитела, которые извлекают из сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных вирусом клещевого энцефалита. Данный иммуноглобулин применяют для лечения н профилактики клещевого энцефалита.

Сухая антирабическая вакцина Ферми. Изготовляется из мозга овец в возрасте до 1 года, зараженных вирусом бешенства, и вьшускается в сухом виде. Антирабические вакцины вводят лицам, укушенным больными или подозрительными на бешенство животными. Прививки проводят по специальной инструкции. Антирабические вакцины обладают высокой эффектив-

Таблица 59. Возбудители вирусных кишечных инфекций и гепатита

Наименование вирусов

Вызываемые заболевания

Семейство Picornaviridae】 Энтеровирусы ECHO и, ш ЕСНО2, 5, 8, 9, 22 и др.

Вирус гепатита (НА Y)

Вспышки энтерита у детей младшего возраста

Спорадические случаи энтерита

Инфекционный гепатит

Семейство Reoviridae

Реовирусы Ротавирусы

Энтериты у детей

Энтериты и гастроэнтериты у детей младшего возраста

Семейство Coronaviridae Коронаварусы

Г астроэнтериты

Семейство Нepatoviridae Вирус гепатита В (HBY)2

Сывороточный гепатит

1 В редких случаях гепатит вызывается вирусами Коксаки, желтой лихорадки, краснухи, герпеса.

2 В отличие от перечисленных РНК-содержащих вирусов HBv содержит ДНК.'

ностью и проверены многолетней практикой. Поствакцинальный иммунитет развивается через 2 нед и сохраняется в течение 6 мес.

Антирабический иммуноглобулин. Получен путем гипериммунизации лошадей фиксированным вирусом. Вводится не позднее 72 ч после укуса животного в сочетании с антирабическими вакцинами. Препарат обезвреживает вирус уличного бешенства и предупреждает поствакцинальные энцефалиты.

ВОЗБУДИТЕЛИ КИШЕЧНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Возбудители кишечных вирусных инфекций относятся к разным семействам РНК- и ДНК-содержащих вирусов (табл. 59). Они объединены в одну группу на основании их общей способности проникать в организм фекально-оральным путем, вызывать поражения преимущественно органов желудочно-кишечного тракта, а также на основании общих принципов лабораторной диагностики.

Основным материалом для исследования служат испражнения, а также (с учетом возможных входных ворот инфекции и клинических проявлений) мазки со слизистой оболочки полости рта (ящур) или носоглотки (вирусы Коксаки, ECHO). Учитывая способность большинства вирусов этой группы вызывать вирусемию, в качестве материала для исследования используют кровь (особенно при вирусном гепатите).

Вирусологические методы с выделением и идентификацией возбудителя используют при кишечных вирусных инфекциях для эпидемиологического анализа вспышек заболеваний, вызываемых энтеровирусами, вирусами ящура.

Для лабораторной диагностики гепатита применяют серологические методы исследования сывороток крови больных, контактировавших с ними лиц, переболевших, доноров с целью выявления специфических антигенов и антител вируса гепатита В.

Тема 36. ВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ И СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ

ДИАГНОСТИКА ЭНТЕРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ВИРУСНОГО

ГЕПАТИТА・

Программа занятия.

Изучение схемы диагностики энтеровирусных инфекций.

В ирусологи чес кая диагностика.

Серодиагностика вирусного гепатита В.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые при этих заболеваниях.*

Демонстрация

Реакция преципитации в агаре (двойная диффузия в геле по Оухтерлони) для обнаружения антител (анти-НВ8) в сыворогке крови больного вирусным гепатитом В.丿

Метод встречного электрофореза для выявления антигенов* и антител в сыворотке больных вирусным гепатитом В.

Иммуноглобулины, диагностикумы, диагностические моно- и поливалентные сыворотки.

Задание для выполнения лабораторной работы

Учесть результаты выявления специфических антигенов и антител в сыворотке больного гепатитом В методом преципитации в агаре.

Оценить результаты серодиагностики вирусного гепатита В.

Методические указания

Вирусологические н серологические методы диагностики энтеровирусных инфекций (вирусы Коксаки и ECHO) описаны в разделе «Возбудители нейровирусных инфекций». В сыворотке крови людей, заболевших гепатитом В, через 3—5 нед после

инфицирования обнаруживается HBS-антиген (австралийский антиген). Исчезновение этого антигена совпадает с началом выздоровления или предшествует ему; персистирование вируса в большинстве случаев сопутствует хроническому течению гепатита. Антитела к HBS-антигену значительно реже выявляются при остром вирусном гепатите В.

Самым распространенным методом определения антигена и антител является преципитация в агаре (реакция двойной диффузии в геле по Оухтерлони). Преимуществами данной реакции являются относительная простота, высокая специфич- ность, отсутствие ложноположительных и ложноотрицательных ответов, небольшой расход материалов и возможность определения полноты антигенной идентичности. Недостатками реакции являются низкая чувствительность, длительность： получение предварительного ответа через 24 ч, а окончательного —лишь спустя 48—72 ч. Для исследования берут кровь больного в количестве, необходимом для получения 0,3 мл сыворотки. Реакции ставят на пластинах, в 1% агаре, в котором вырезают лунки для ингредиентов реакции. В качестве тест- системы используют стандартный австралийский антиген и соответствующую специфическую антисыворотку. Учет реакции проводят через 1—3 дня по появлении дуг преципитации между лунками.

Реакция встречного электрофореза в агаровом геле по чувствительности не отличается от реакции преципитации, но несколько уступает ей по специфичности, однако значительно превосходит ее по скорости получения результатов: в течение 2 ч можно одновременно исследовать около 200 сывороток.

РСК обладает сравнительно более высокой чувствительностью, но ее использование ограничивается часто встречающейся антикомплементарной активностью сывороток крови больных.

Для серодиагностики вирусного гепатита В наиболее чувствительной и специфичной является РПГА, однако эта реакция требует затраты больших количеств тест-системы.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Тест-система для серодиагностики гепатита В： стандартный австралийский антиген и соответствующая специфическая антисыворотка.

Иммуноглобулин нормальный человеческий. Получается из крови человека (донорской, плацентарной) путем фракционирование Применяется для профилактики и лечения вирусного гепатита.

ОБЩАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ МИКОЛОГИЯ

Тема 37. МОРФОЛОГИЯ ГРИБОВ

Программа занятия

Морфология плесневых грибов, дрожжеподобных грибов.

Методы изучения морфологии грибов.

Грибы — растительные организмы, имеющие как макро-, так и микроскопические размеры и характеризующиеся следующими основными свойствами： наличием дифференцированного ядра, отсутствием хлорофилла, размножением спорами, наличием у большинства видов вегетативных органов — гифов, которые, переплетаясь, образуют мицелий. У грибов различают субстратный мицелий, погруженный в питательную среду, и мицелий воздушный, растущий на ее поверхности. Многие грибы имеют септированный (многоклеточный) мицелий, гифы которого разделены внутренними перегородками — септами; для других грибов характерен несептированный мгщелий.

Споры грибов располагаются внутри мицелия (эндоспоры) или вне его (экзоспоры). Среди гифов выделяют так называемые плодоносящие (спороносные) гифы. Так, например, у мукоровой плесени (Mucor) плодоносящие гифы — спорангиеносцы, на конце имеют расширение： спорангии, внутри которых находятся эндоспоры (рис. 88). Плодоносящие гифы гри&)в рода Aspergillium и Penicillium называются конидие- носцами. На их концах имеются небольшие клетки — стеригмы, на которых свободно располагаются цепочки конидий (экзоспоры). У некоторых грибов споры покрыты толстой двухконтурной оболочкой (хламидоспоры) и располагаются внутри нити мицелия или на ее конце. Существуют и другие типы спор, отличающиеся друг от друга по происхождению, структуре и расположению в мицелии гриба. Дрожжевые грибы представляют собой крупные клетки овальной, шаровидной и палочковидной формы； они не образуют мицелия и размножаются различными путями： почкованием, делением, половым путем и эндоспорами, которые располагаются в особых сумках (асках) и называются аскоспорами. Бластоспорами называют экзоспоры дрожжевых или других грибов, образующиеся в результате почкования материнской клетки. Однако при раз-

Рис. 88. Мукоровая плесень (Мисог).

множении клетки дрожжеподобных грибов располагаются цепочками и вытягиваются в длинные нити — псевдомицелий.

Демонстрация

Методика приготовления препаратов из культур грибов.

Препараты дрожжеподобных грибов, окрашенные метиленовым синим.

Задание для выполнения лабораторной работы

Определить родовую принадлежность плеснейЫх грибов на основании особенностей строения мицелия, плодоносящих гифов и спор, пользуясь табл. 60.

Методические указания

При приготовлении препарата «раздавленная» капля препаровальными иглами отделяют небольшой участок мицелия с плодоносящими гифами и прилегающим к нему тонким слоем питательной среды. Материал помещают в каплю воды на предметном стекле, иглой расправляют мицелий, придавливают покровным стеклом и микроскопируют при опущенном конденсоре. Препарат просматривают с объективом 8, а затем

Таблица 60. Морфодогнческне признаки плесневых “кбов

Род

Мицелий

Плодоносящие гифы

Тип спор

Расположение спор

Mucor

Несептированный

Несептирован- ный спорангиеносец

Эндоспоры

В спорангии

Aspergillus

Септированный

Несептированный конидиено- сец

Экзоспоры (конидии)

В видеСвободное

«лейки» на концах

В виде ] ответвлений «кисточек»! плодонося-

J щих гифов

Penicil- lium

То же

Септированный конидиеносец

То же

с объективом 40. Предварительно колонии или культуры грибов микроскопируют непосредственно на чашках или в пробирках под малым увеличением.

Лабораторная диагностика микозов

Заболевания, вызываемые грибами (myces), — микозы, чрезвычайно разнообразны как по биологическим особенностям их возбудителей, так и по патогенезу и клинике. Раздел микробиологии, занимающийся изучением патогенных грибов, называется медицинской миколог ией.

Среди патогенных грибов можно выделить следующие группы： 1) дерматофиты — возбудители эпидермикозов' (дерматомикозов) —заболеваний кожи и ее придатков (волосы, ногти);

грибы рода Candida — возбудители кандидозов — заболеваний кожи и слизистых оболочек, иногда внутренних органов;

криптококки, гистоплазмы, бластомицеты, кокцидиоиды, а также плесневые грибы — возбудители глубоких микозов, поражающие различные органы и ткани.

Микробиологическая диагностика микозов осуществляется главным образом путем микроскопического н культурального исследований. Идентификацию и дифференцирование выделенной чистой культуры гриба проводят по морфологическим, культуральным н биохимическим признакам и в некоторых случаях — по антигенной структуре. Определение патогенных свойств грибов в опытах на животных во многих случаях не удается. Серодиагностика разработана не для всех микозов. Аллергические пробы самостоятельного значения не имеют, так как аллергены, полученные из грибов, недостаточно специфичны.

Тема 38・ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

ДЕРМАТОМИКОЗОВ И КАНДИДОЗОВ、

Дерматофиты являются возбудителями фавуса, трихофитии, микроспории и эпидермофитии. Они принадлежат к группе несовершенных грибов. Заражение происходит при непосредственном контакте с больными людьми и животными, а также через игрушки, банные принадлежности, головные уборы и другие вещи.

Возбудителями кандидозов являются грибы рода Candida, обитающие на коже н слизистых оболочках человека, а также домашних птиц и некоторых животных, на плодах, ягодах.

Программа занятия

Изучение схемы микробиологической диагностики кандидозов.

Микроскопические, культуральные и серологические методы диагностики грибковых заболеваний.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты, применяемые при микозах.

Демовстрацвя

Препараты из чистых культур грибов рода Candida.

Мазки из патологического материала от больных, пораженных кандидозом (окраска генциановым фиолетовым).

Типы филаментации грибов рода Candida на картофельном агаре.

Колонии патогенных грибов на плотной питательной среде.

РСК, и реакции агглютинации при серодиагностике висцерального кандидамикоза.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты: а) грибковые антигены для серологических реакций; б) грибковые аллергены; в) противо* грибковые антибиотики: нистатин, леворин, гризеофульвин.

Задание для выполнения лабораторной работы

Микроскопическое исследование при дерматомикозах: из пораженных волос, кожных чешуек приготовить препарат для микроскопии и поставить микроскопический диагноз заболевания трихофитии, микроспории, фавуса или эпидермофитии.

Определить видовую принадлежность дрожжеподобного гриба рода Candida на основании морфологии клеток и колоний, типа филаментации и биохимических свойств.

Методические указания

Микроскопическое исследование. Для приготовления препарата на предметное стекло наносят каплю 10% едкой щелочи или спирта с глицерином, в которую помещают 2—3 подозрительных волоса или несколько кожных чешуек, или беловатые влажные налеты со слизистых оболочек. Препарат (со щелочью)

Рис. 89. Дерматофиты в пораженном волосе./ - Microsporon； 2 - Trichophyton； 3 - Achorion.Рис. 89. Дерматофиты в пораженном волосе./ - Microsporon； 2 - Trichophyton； 3 - Achorion.осторожно подогревают над пламенем до появления белого ободка из кристаллов щелочи по периферии капли, не доводя ее до кипения. Затем каплю накрывают покровным стеклом н рассматривают под микроскопом с объективом 8 и 40.

Рис. 89. Дерматофиты в пораженном волосе.

/ - Microsporon； 2 - Trichophyton； 3 - Achorion.

Рис. 89. Дерматофиты в пораженном волосе.

/ - Microsporon； 2 - Trichophyton； 3 - Achorion.

Прн фавусе в волосе обнаруживают полиморфные грибковые элементы. Наряду с тонким мицелием встречается мицелий широкий, состоящий из прямоугольных клеток. Часто наблюдаются споры круглой или прямоугольной формы, а также пузырьки воздуха (рис. 89). '

Прн трихофитии локализация элементов гриба в патологическом материале может быть различной. Споры гриба Trichophyton либо располагаются только внутри пораженного волоса, сплошь заполняя его содержимое (эндотрикс) либо

несколькими слоями окружают волос снаружи в виде чехла (эктотрикс), либо споры н мицелий находятся как внутри, так и снаружи волоса (эндоэктотрикс).

При микроспории волос в фолликулярной части окружен «чехлом» из мозаично расположенных мелких спор гриба. Внутри волоса обнаруживаются фрагменты гриба и споры.

При эпидермофитии элементы гриба содержатся в чешуйках кожи, где располагаются в виде толстых септированных ветвящихся нитей мицелия наряду со спорами многогранной формы.

При кандидозах в патологическом материале видны одноклеточные грамположительные микроорганизмы круглой и овальной формы, не образующие истинных спор и истинного мицелия. Грибы рода Candida формируют псевдомицелий, который отличается от истинного отсутствием общей оболочки и перегородок и состоит из длинных тонких клеток, соприкасающихся друг с другом узким основанием. Для установления диагноза кандидоза необходимы многократные количественные высевы патологического материала на агаровую среду в чашки Петри. Нарастающее количество колоний, обнаруженных в посевах, а также антител в сыворотке крови подтверждает диагноз.

Культуральное исследование. Проводится для установления родовой и видовой принадлежности возбудителя путем выделения чистой культуры гриба и изучения его биологических свойств. Материал предварительно обрабатывают кислотами или антибиотиками. Затем делают посев на сахарный питательный агар, сусло-агар (готовится из неохмеленного пивного сусла), агар Сабуро (пептонная вода с мальтозой и агаром), овощные среды (морковный агар), куда добавляют антибиотики для задержки роста бактериальной флоры. Посевы инкубируют при ЗО°С. В положительных случаях рост наблюдается на 3—5-е сутки в виде разнообразных колоний： гладких, морщинистых, мучнистых, пушистых, часто пигментированных. При микроскопии препаратов, приготовленных из культур, хорошо заметен развитой, широко ветвящийся септированный мицелий. Органами размножения служат споры, которые могут быть как внутренними (эндоспоры), расположенными внутри мицелия, так и наружными (экзоспоры), расположенными на концах или по сторонам нитей мицелия. Специальных органов плодоношения типа асков (сумок) у дерматофитов не обнаружено, что дало основание отнести их к несовершенным грибам — Fungi imper- fecti.

Грибы рода Candida на 2—3-й день после посева образуют мелкие выпуклые колонии, которые нередко сливаются в мощные образования, врастающие в среду. Идентификацию грибов

Рис. 90. Типы роста (филаментации) дрожжеподобных грибов рода Candida.

I - mycotorula； 2 - mycotoruloides； 3 - candida； 4 - mycocandida.

рода Candida проводят на основании данных микроскопии патологического материала, культуральных признаков, биохимической активности, типов роста — филаментации (рис. 90) и патогенности, которую определяют при заражении лабораторных животных.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

ГЛУБОКИХ (СИСТЕМНЫХ) МИКОЗОВ

Возбудителями глубоких микозов являются грибы： Cryptococ- cus neoformans, вызывающие криптококкоз. Histoplasma capsulatum — гистоплазмоз. Coccidioides immitis — кокцидиоидоз, Blastomyces dermatitidis — бластомикоз и др. Мйкробиологиче- ская диагностика проводится путем микроскопического исследования, при котором выявляются характерные морфологические особенности возбудителя, н путем микологического исследования, т. е. выделения чистой культуры гриба.

Диагностические, профилактические и лечебные препараты

Кандидозный антиген — взвесь двухсуточной агаровой куль- турн грибов рода Candida в изотоническом растворе хлорида натрия. Применяется для постановки реакции агглютинации при кандидозах.

Кандидозный антиген для РСК — спиртоводный экстракт из культуры грибов рода Candida. Применяется для постановки РСК и кожно-аллергических проб при кандидозах.

Противогрибковые антибиотики： нистатин, леворин, гри- зеофульвин, амфотерицин В.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие 3

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 5

Микробиологические лаборатории и их оборудование 5

Морфология микроорганизм ои 20

Асептика и антисептика. Дезиифекпия 36

Физиология микроорганизмов 42

Антибиотики 75

Микроорганизмы окружающей среды и ,савитарио-бактериологические методы их обнаружения 79

ПРИКЛАДНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 96

ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 126

Микробиологическая и иммунологическая диагностика важнейших инфекционных заболеиавий и клиническая микробиология 126

Возбудители раневой и гнойной инфекции 131

Возбудители воздушно-капельных инфекций 149

Возбудители кишечных инфекций, пищевых токсикоиифекций и интоксикаций 175

Возбудители зоонозных инфекций 198

Возбудители кровяных и трансмиссивных инфекций (сиирохетозов и риккетсиозов) . . 215

Возбудители венерических заболеваний 220

Возбудители респираторных вирусных инфекций 230

Возбудители нейровиру(;ных инфекций 239

Возбудители кишечных вирусных инфекции 246

ОБЩАЯ И МЕДИЦИНСКАЯ МИКОЛОГИЯ 249

Леонид Борисович Борисов, Борне Николаевич Козьмни*-Соколов, Ирина Соломоновна Фрейдлин, Зинаида Федоровна Федорова

РУКОВОДСТВО К ЛАБОРАТОРНЫМ ЗАНЯТИЯМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ

Зав. редакцией С Д Крылов. Редактор Л. М. Смирнова. Редактор издательства В. Ю. Лернер. Художественный редактор С. М Лымина. Оформление художника В. С. Сергеевой.

Технический редактор В. Я. Сорокина. Корректор Н. Л. Кузнецова

ИБ № 3548

Сдано в набор 21.09.83. Подписано к печати 16.03.84 Т-02470. Формат бумаги 84 X 1081 /э2. Бумага кн. журн. Гарнитура Таймс Печать высокая. Усл. печ. л. 14,28. Усл. кр.-отт. 16,80. Уч.-изд. л. 15,83.Тираж 50 000 экз. Заказ 639. Цена 90 к.

Ордена Трудового Красного Знамени издательство «Медицина»

103062 Москва, Петроверигский пер., 6/8

Ярославский полиграфкомбинат Союзполиграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. 150014, Ярославль, ул. Свободы, 97

1 Антаглобулиновую сыворотку против глобулинов человека получают путем гипернммунизации кролика человеческой сывороткой.

ББК 52.64 р ?д

УДК 57.083.2(035)

Л. Б. БОРИСОВ, Б. Н. КОЗЬМИН-СОКОЛОВ, И. С. ФРЕЙДЛИН, 3. Ф. ФЕДОРОВА. Руководство к лабораторным занятиям по микробиология/ Под ред. Л. Б. БОРИСОВА. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина. 1984.— 256 с., ил.,

Л. Б. БОРИСОВ — проф., зав. кафедрой микробиологии 1 ЛМИ им.И. П； Павлова.

Во второе издание (первое вышло в 1979 г.) включены новые разделы： «Прикладная иммунология», клиническая микробиология и иммунология^ «Общая и медицинская микология». Более подробно изложены материалы 賣 санитарной микробиологии и лабораторной диагностике вирусных инфекцй^ Все основные разделы руководства лодразделены на темы и занятия, построенные по единому принципу. Приведен перечень диагностических, профилактических и лечебных препаратов, применяемых при описываемых заболеваниях.

Руководство соответствует программе, утвержденной Министерством здравоохранения СССР, и предназначено для студентов медицинских институтов.

Рисунков 90. Таблиц 60. Схем 24.

Рецензент А. П. КРАСИЛЬНИКОВ, проф., зав. кафедрой микробиологии с вирусологией и иммунологией Минского медицинского института

© Издательстве «Медицина», Москва, 1979

© Издательство «Медицина», Москва, 1984, с изменениями