Книга
← К списку книгЗагрузка разделов…
активнаАктивные записи участвуют в каталоге и синках. Неактивная книга скрыта, но не удалена из базы.
Книга
Предисловие автора
Настоящий учебник содержит фактический материал, апробированный мною в результате преподавания радиационной биофизики, начиная с 1953 г. — года становления кафедры биофизики на биологическом факультете Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова. За этот полувековой период была организована лаборатория радиационной биофизики, постоянно проводился радиобиологический практикум и читались общие и специальные курсы лекций по биофизике, радиобиологии и радиоэкологии в МГУ и во многих других отечественных и зарубежных университетах и институтах.
В связи с отсутствием учебной литературы остро чувствовалась необходимость в радиобиологических и биофизических учебниках и учебных пособиях. Поэтому в 1962 и 1964 гг. были впервые изданы Практикумы по радиобиологии [29, 168], а в 1979 и 1982 гг. — лекции [30] и учебник [31] по радиационной биофизике. Мой ученик и соавтор Борис Семенович Беренфельд уехал преподавать биологию в Гарвардский университет, и я с грустной благодарностью вспоминаю сейчас то время, когда мы, полные энтузиазма, работали над созданием учебника.
Итак, прошло два десятилетия со времени написания предыдущего учебника. Других учебников по радиационной биофизике в мировой литературе не выходило).
Невольно задаешься вопросом — много это или мало — прошедшие двадцать лет?
Для написания современного учебника — очень много, так как за это время произошли принципиально важные события, открывшие новый, современный период в истории радиобиологии. Прежде всего к ним можно отнести открытия в области молекулярной и клеточной биологии и поворот радиобиологии к малым «техногенным» дозам радиации, возникший вследствие радиоэкологического кризиса на нашей планете.
Не останавливаясь здесь на многих исключительно важных приоритетных достижениях радиобиологии и радиационной биофизики, которые внесли крупный вклад в фундаментальную биологию (они подробно изложены в данной книге), отмечу лишь то, что скромный
вклад нашей лаборатории радиационной биофизики и кафедры биофизики сумел успешно пройти проверку временем. Например, приоритетные исследования лаборатории: гипотезы «радиотоксинов» (19561987), «эндогенного фона радиорезистентности и общей резистентности» (1980-2002). И, конечно, речь идет о триумфе идей покойного профессора Бориса Николаевича Тарусова — моего дорогого учителя и друга, основателя кафедры биофизики, выдвинувшего и развившего (в период 1954-1962) теорию первичных цепных механизмов лучевого поражения.
Еще двадцать лет назад эти идеи продолжали с трудом пробивать себе дорогу, а сейчас и вопрос о ключевой роли липопероксида- ции («липидных радиотоксинов») в лучевой патологии и стрессе, и непрямое действие излучений посредством липидных оксирадикалов, и участие «эндогенного фона» в формировании устойчивости биологических объектов и систем к ионизирующим и неионизирующим воздействиям, и роль биологических мембран (БМ) уже в качестве «критической мишени» заняли в радиобиологии достойное место.
Беспристрастное его величество Время расставило свои акценты в радиобиологии, вдохнув в нее также и новое мышление о нелинейности процессов в живой системе. Пожалуй, первый фундаментальный в этом направлении шаг сделала общетеоретическая наука — термодинамика, провозгласив нелинейность и неравновесность открытых систем. Ответ живой материи на возмущения, в том числе и на действие ионизирующих излучений, выход ее из стационарного состояния также происходит по нелинейным законам.
Последние экспериментальные достижения молекулярной биологии и радиобиологии позволили переосмыслить укоренившееся ранее представление о линейной зависимости биологических эффектов от дозы облучения («т. е. большие дозы вызывают сильные повреждения, а малые дозы — якобы те же, но менее значительные повреждения»). Исследования эффектов малых доз показали качественно иной и немонотонный характер системного биологического ответа на облучение, в отличие от действия высоких летальных доз ионизирующих излучений. Необычно высокая чувствительность при сверхмалых дозах («эффект колокола»), противоположный, стимулирующий эффект радиации («гормезис») и «адаптивный ответ», «обратный эффект» мощности доз, квазилучевое действие секретируемых облученными клетками в микросреду токсических веществ («эффект свидетеля»), нестабильность генома и отдаленные последствия облучений — все это открыло новый мир изменений живой системы в ответ на низкоинтенсивные ионизирующие излучения.
Однако и нелинейная термодинамика не все смогла предусмотреть. В классическом варианте она рассматривает только тепловые эффекты. С ее позиций оказалось невозможным объяснить, например, энергетический парадокс в радиобиологии, характер поглощения энергии ионизирующих излучений биологическими структурами и их ответные реакции на воздействия.
Учитывая все сказанное, становится понятным необходимость и своевременность описания последовательности лучевых изменений на разных уровнях организации живой материи и попытки выстроить воедино основные принципы радиобиологии. Этим задачам посвящен настоящий учебник.
Приведенный в данном учебнике список рекомендуемой литературы, как это можно видеть, делится на основную и общую библиографию. Знакомство с основной литературой поможет читателю расширить круг вопросов, изложенных в главах учебника. Дополнительная литература — библиография включает книги и оригинальные статьи, знакомство с которыми позволит углубить специальные вопросы радиационной биофизики, биохимии и генетики, радиоэкологии и общей радиобиологии при выполнении задач на практикумах, а также курсовых, дипломных и диссертационных работ. Считаю, что предлагаемая библиография может оказаться полезной для любого специалиста- радиобиолога и биофизика. В конце библиографии приведен выборочный перечень основных международных форумов по радиобиологии, материалы которых создают представление о безусловно громадном интересе мировой науки к важным проблемам радиобиологии на разных этапах ее развития с середины прошлого столетия.
Написание учебника потребовало привлечения специалистов-профессионалов разных, подчас далеких друг от друга областей знания. Многие любезно согласились внести свою лепту в данную книгу. Я сердечно благодарю за это следующих моих глубокоуважаемых коллег: профессора Виктора Константиновича Мазурика, взявшего на себя тяжелый и кропотливый труд научного редактора учебника и написавшего совместно с профессором В. Ф. Михайловым раздел «Нестабильность генома»;
профессора Михаила Федоровича Ломанова, редактировавшего первые три «физические главы» книги; очень уместным считаю критически осмысленный им материал по микродозиметрии — дисциплины, которая пыталась создать базу для взаимного обмена идеями между физикой и радиобиологией (все успехи или неудачи этого направления ощутимо отражаются сегодня на решении насущных практических вопросов);
профессора Давида Михайловича Спитковского, написавшего важные фрагменты по биофизической оценке малых доз ионизирующих излучений, а также по лучевым изменениям и репарации классической радиобиологической мишени — ДНК;
профессора Сергея Витальевича Мамихина за его раздел «Математическое моделирование в радиобиологии»; «легкое перо» его компьютера и необычайно четкое и критическое выполнение задачи вселяло в меня дух оптимизма и веры в более полный охват многогранной работы. В данном разделе он особо подчеркнул, что последние 20 лет периода ускоренного развития компьютерных технологий оказали большое воздействие на радиобиологические исследования и анализ их результатов. Широкая доступность информационно-вычислительных
средств придала новый импульс применению такого традиционного для радиационной биофизики метода как математическое моделирование. Вместе с тем наблюдается и определенное отставание в данной области, связанное как со спецификой радиационных исследований, так и с рядом проблем иного рода. Все это нашло отражение в упомянутом разделе настоящего учебника.
Благодарю также кандидата биологических наук Нину Юрьевну Кудряшову, предоставившую материал по ДНК-мембранному комплексу и его изменениям при лучевом поражении клеток.
Особую благодарность выражаю заведующему кафедрой биофизики биологического факультета МГУ члену-корреспонденту РАН РФ А. Б. Рубину за многолетнюю высоко профессиональную и дружескую помощь в напряженной педагогической работе и творчестве; без такой помощи работа над учебником была бы невозможна.
Выражаю глубокую благодарность зам. директора института биохимической физики РАН РФ, председателю научного Совета РАН по радиобиологии, члену-корреспонденту РАЕН РФ, профессору Е. Б. Бурлаковой за постоянное внимание и поддержку. Совместная с нею работа в Совете являлась мощным положительным стимулом в моей научной деятельности.
Искренне благодарю также многих моих близких, друзей и коллег: профессора Е. Н. Гончаренко, которая является постоянной помощницей и соавтором многих совместных радиобиологических работ; благодарю ее за многократный и тщательный просмотр рукописи данного учебника и чрезвычайно важные советы;
профессора И. И. Пелевину, добрые замечания и советы которой всегда очень помогали при работе над книгой;
профессоров и преподавателей О. И. Василенко, А. А. Касьяненко, О. Р. Колье, И. Н. Острецова, Г. Ю. Ризниченко, К. Н. Тимофеева, Д. С. Чернавского, В. А. Шарпатого за ценные замечания при прочтении фрагментов рукописи учебника;
кандидатов биологических наук, моих учеников, старших научных сотрудников Л. И. Деева и А. Г. Платонова за обсуждение отдельных фрагментов учебника;
студента С. Ю. Перова и, конечно, моего внука Александра Шило (еще школьника) за помощь в компьютерном оформлении некоторых рисунков к учебнику, а также
коллектив издательства ФИЗМАТЛИТ».
Выход в свет этого учебника совпадает с юбилейными датами — 50- летия кафедры биофизики биологического факультета (2003) и 250-летия Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова (2005). Хочется верить, что этот учебник послужит своевременным вкладом в общий мощный поток университетского образования.
Введение
Радиационная биофизика — научная дисциплина, изучающая молекулярные механизмы биологического действия ионизирующих и неионизирующих излучений, выясняющая последовательную картину изменений, начиная от поглощения энергии радиации отдельными молекулами до сложных биологических изменений в клетке и организме. По существу, радиационная биофизика решает радиобиологические проблемы с позиций биофизики, так как радиобиология изучает влияние излучений на биологические объекты и системы, а биофизика — молекулярные взаимодействия, лежащие в основе нормальных жизненных явлений и патологии.
Данный учебник посвящен радиационно-биофизическим механизмам действия ионизирующей радиации.
Ионизирующие излучения являются наиболее изученной частью широкого спектра электромагнитных излучений, встречающихся в природе или генерируемых искусственными источниками, созданными в результате деятельности человека. Место, занимаемое ими в указанном спектре, а также основные свойства их даны в табл. 1, где в виде краткой схемы представлена область электромагнитного спектра излучений от 7-лучей до низкочастотных радиоволн, указаны основные физические параметры излучений и генерирующие их источники.
Что касается биологических эффектов, вызываемых излучениями, представленными в табл. 1, то, как уже отмечено, в настоящее время наиболее полная информация получена по действию ионизирующих излучений, а также ультрафиолетового и видимого света. Расширяется фронт исследований механизмов действия инфракрасного, длинноволнового электромагнитного излучений и «нулевых», т. е. постоянных электрических и магнитных полей.
Интерес физиков и биологов к различным типам излучений оформился в виде таких научных разделов, как радиационная биология ионизирующих излучений, фотобиология (изучается действие оптического спектра, например фотосинтез, фотопериодизм, фотодинамический эффект) и электромагнитная биология (исследуются эффекты радиации радиочастотного диапазона).
Различные виды электромагнитных и корпускулярных излучений — важнейший инструмент познания живой материи. Современная биология немыслима без методов рентгеноструктурного анализа, ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной спектроскопии, радиоспектроскопии, лучевой ультрамикрометрии, световой, электронной
Таблица 1. Спектр электромагнитных излучений
Излучение
диапазон волн, м
Полоса частот, Гц
Энергия кванта, эВ
Природнвхе источники, основные методвх возбуждения
Тип
Вид
ионизи- рующее
у-излу- чение
Ю"10 ^ 10“15 и менее
ЗЛО18 4-ЗЛО23 и более
1, 24Л044-1, 24Л09 и более
космические источники, вторичнвхе космические лучи, взаимодействие уско- реннвхх частиц с атомами, радиоактив- ниш распад радионуклидов, ядернвхе реакции и космические процессв!
рентгеновское
10"7 4- 10"11
ЗЛ0154-ЗЛ019
12,40 4- 1,24 ЛО5
оптиче- ское («свет»)
улвтрафи- олетовое
4Л0-7 4-10-8
7,5Л014 4-ЗЛО16
3,10 4- 1, 24 Л О2
солнце и луна, звездв: и туманности, другие космические источники; зем- нвхе объектвц излучение молекул и атомов, излучение возбужденнвхх атомов... любое нагретое тело
видимое
7,640-7 4-4-10-7
3,95Л0144-7, 5Л014
1,63Т 3,10
инфракрасное
10-3 4-7,6Л0-7
ЗЛО11 4-3,95Л014
1,24Л0~3 4- 1,63
радиоча- стотное
децимил- лиметровое
10"3 4-10"4
ЗЛО11 4- ЗЛО12
1, 24-Ю"34-1, 24-Ю"2
солнце и луна, планетв:, звездв: и другие космические объектвц разря- дв! молний, полярнвхе сияния; любвхе электрические воздействия, живвхе ор- ганизмв: и т. д.
ввхсокоча- стотное
102 4-10-3
ЗЛО6 4- 3-1011
1,24Л0“84-1,24Л0"3
среднечастотное
103 4- 102
ЗЛО5 4-3-106
1, 24ЛО-9 4-1, 24ЛО-8
низкочастотное
108 4-103
Зт ЗЛО5
1,24-Ю-14 4-1,24-Ю”9
и протонной микроскопии, широкого использования радиоактивных изотопов. В последнее время принципиально новые методические усовершенствования (использования радиоактивных индикаторов, применение рентгеноэлектронной и атомной спектроскопии, селективной ион- и масс-спектрометрии, криоэлектронной томографии клетки и других современных методов) создали основу для высокочувствительной и специфической идентификации лабильных биологических структур, в том числе оксирадикалов и оксиаддуктов с биомакромолекулами в норме и патологии. Большинство наиболее впечатляющих успехов в познании структуры и свойств живой материи достигнуто благодаря широкому внедрению методов исследований радиационной биофизики. Решение этой проблемы требует комплексного подхода, основанного, с одной стороны, на учете физических принципов передачи энергии излучений, их дискретной природы и характера взаимодействия с атомами и молекулами биологических структур, а с другой — на знании уникальных особенностей структурной и функциональной организации живого.
Как видно из табл. 1, ионизирующие излучения составляют узкий участок электромагнитного спектра. Это наиболее коротковолновые, высокочастотные излучения, кванты которых несут огромную энергию, достигающую многих тысяч и миллионов электрон-вольт. Благодаря своим физическим свойствам, они обладают высокой проникающей способностью через вещество, и поэтому такие ионизирующие излучения часто называют «проникающей радиацией». Термин «ионизирующие излучения» выбран для наименования разнообразных по физической природе типов излучений для того, чтобы подчеркнуть наиболее характерное, общее их свойство — способность непосредственно или косвенно ионизировать атомы и молекулы поглотителя.
К ионизирующим излучениям относят электромагнитные и корпускулярные излучения, энергия которых превышает величину «потенциала ионизации», т. е. 10-12 эВ. Электромагнитные ионизирующие излучения — это рентгеновское излучение, а также у-излучение радионуклидов. Оптический спектр излучений и радиоволны тоже относятся к электромагнитным излучениям, но они называются неионизирующей радиацией, поскольку из-за присущей им низкой энергии (и соответственно, высоких длин волн) не способны к ионизации молекул и лишены высокой проникающей способности.
К корпускулярным излучениям относят заряженные частицы В- частицы (электроны и позитроны); ядра атомов водорода (протоны), дейтерия (дейтроны), гелия (a-частицы) и других элементов; ядерные частицы, не имеющие зарядов — нейтроны, а также многие нестабильные частицы, например, я+, я- и я0 мезоны и др.
Актуальность исследований биологического действия ионизирующих излучений продиктована многими научными и социальными задачами.
Во-первых, известно, что все живое постоянно подвергается действию естественного радиационного фона (1-2 мЗв/год), который составляют космическая радиация и излучения радиоактивных элементов, залегающих в поверхностных слоях земной коры и входящих в состав самих живых организмов и их продуктов питания.
Во-вторых, в связи с техногенной деятельностью человека, ядер- ными взрывами и авариями на АЭС и атомных промышленных предприятиях радиационный фон во многих регионах нашей планеты значительно возрос. Если учитывать возможное экстремальное действие ионизирующих излучений, особенно в сочетании с другими загрязнениями среды, то такие условия существенно сказываются на экологии живой Природы и состоянии здоровья и жизни человека. Поэтому возникла необходимость развития исследований в области радиобиологии и радиационной экологии.
И наконец, хорошо известно значение ионизирующих излучений как диагностического и терапевтического средства при многочисленных заболеваниях. Применение и дальнейшие разработки радиационной терапии невозможны без глубоких знаний в области радиобиологии и радиационной биофизики — механизмов взаимодействия излучений с веществом и лучевых изменений клеток, тканей и целостного организма.
Радиобиология — это комплексная наука. Она требует объединенных усилий физиков, химиков, математиков, медиков, биофизиков, молекулярных биологов, представителей различных классических биологических направлений. В связи с этим в настоящее время развиваются многие направления: радиационная экология и генетика, радиационная биохимия и цитология, радиационная медицина и гигиена. В ряду этих исследований особое место принадлежит радиационной биофизике, так как ее основная задача — выяснение физико-химических и молекулярных механизмов первичных процессов лучевых изменений, протекающих с момента возникновения ионизированных и возбужденных атомов и молекул до появления видимых структурных и функциональных изменений. Для решения такой задачи необходим углубленный анализ процессов, происходящих на каждом этапе «размена энергии» излучения в живой системе, описание этих этапов в терминах молекулярных изменений и создание единой картины, отражающей всю последовательность реакций, приводящих, в зависимости от дозы облучения, к лучевым изменениям или лучевому поражению. Чтобы определить круг задач, стоящих перед современной радиационной биофизикой, следует рассмотреть основные исторические периоды развития радиобиологии, становление и развитие радиационной биофизики и появление конкретных направлений в исследовании биологического действия ионизирующей радиации, многие из которых продолжаются и поныне.
Радиобиология — это наука XX века. Время ее рождения определяется открытием X- (рентгеновских) лучей, радиоактивности и первыми упоминаниями их действия на живой организм. В декабре 1895 г. в Германии заведующий кафедрой физики физического факультета,
ректор Вюрцбургского университета профессор Вильгельм Конрад Рентген передал физико-медицинскому обществу первый рентгеновский снимок кисти своей руки и рукопись на 17 страницах с изложением об открытии катодных проникающих X-лучей, которые вскоре стали называться именем их открывателя. Уже в январе 1896 г. брошюра Рентгена под названием «Новый род лучей» вышла в свет на русском, английском, французском и итальянском языках — открытие быстро стало достоянием мировой общественности.
Открытие Рентгена стимулировало новые исследования в физике, а также в биологии и медицине. В марте 1896 г. профессор физики Парижского музея естественной истории Анри Беккерель обнаружил новое явление — самопроизвольное испускание невидимых глазу проникающих излучений (а-, /3- и у-излучений), исходящих от солей урана. Через два года Мария и Пьер Кюри выделили из урановой смолы ранее не известные элементы, так же, подобно урану, испускающие излучения, которым они дали название радий и полоний. Для явления, свойственного этим, а в последующем другим подобным элементам был предложен термин радиоактивность.
Открытие урановых, а затем и ториевых лучей послужило началом исследований естественной (природной) радиоактивности.
В дальнейшем, в 1934 г. Ирен и Фредерик Жолио-Кюри при исследовании ядерной реакции 27А1(сц п)30Р обнаружили образование нового, не встречающегося ранее в природе радионуклида — фосфора 30Р. Так произошло открытие нового явления — искусственной радиоактивности.
Открытия в физике нашли очень быстрый отклик в биологических исследованиях. Дата рождения радиобиологии — начало 1896 года — как видно, почти совпадает с датой открытия рентгеновских лучей. В это время петербургский физиолог Иван Романович Тарханов (Тар- ханишвили) провел первые исследования на лягушках и насекомых, облученных лучами Рентгена, и пришел к выводу, что «X-лучами можно не только фотографировать, но и влиять на ход жизненных функций» [328].
Другим пионером в радиобиологии был также наш соотечественник Ефим Семенович Лондон, который начал в 1896 г. многолетние широкие исследования по рентгенорадиологии и экспериментальной радиобиологии.
Первая официальная информация о патологическом влиянии радиации на кожу была опубликована только в 1901 г. в работе П. Кюри и А. Беккереля, в которой авторы сообщили, что неосторожное обращение с радием вызывало у них ожоги кожи.
Основной и очень важной задачей радиобиологии в то время была необходимость точной количественной оценки дозы радиации. Вполне понятно, что к необходимости дозировать излучения пришли в первую очередь рентгенологи, вынужденные эмпирически устанавливать хотя бы условные единицы биологических доз рентгеновских лучей. Так появилась первая единица измерения дозы — Haut Erythem
2 Ю. Б. Кудряшов
Dosis (нем.) — HED — «кожно-эритемная доза»), которая регистрировалась спустя несколько суток и недель после облучения.
Дозиметрия как раздел физики, задачей которого является количественная оценка испускаемой (экспозиционной) и поглощенной энергий излучения, а также активности радиоизотопов, появилась значительно позднее. Отсутствие научно обоснованных дозиметров и невозможность количественно оценивать дозы облучения, а также незнание (или часто пренебрежение опасностью) было причиной гибели первых рентгенологов от лучевой болезни, вызванной интенсивным их облучением.
Понимая необходимость элементарных дозиметрических знаний, Е. С. Лондон и его сотрудник врач-хирург С. В. Гольдберг проводили экспериментальные исследования действия радия на себе. Вот описание одного из таких наблюдений, проведенного в Институте экспериментальной медицины в Петербурге. С. В. Гольдберг прибинтовал к своему предплечью коробочку с 75 мг бромистого радия на 3 часа. После удаления препарата участок кожи, соприкасавшийся с ним, оставался как бы интактным, однако на 4-й день на этом месте появилось красное пятно. Постепенно увеличиваясь в размерах, оно приобретало все более интенсивную окраску и окаймлялось зоной нарастающей инфильтрации. Еще через 2 дня развился некротический процесс, зона инфильтрации стала больше и к 14 дню представляла собой некротическую язву, дно которой было покрыто гноем и отторгающимися тканями. На 14-16 день после облучения начали появляться новые очаги повреждения в местах, куда препарат радия не был приложен (на подбородке, бедре, на другой руке). Эти эритемы имели сходство по циклам развития с радиогенными. Облучая различные участки кожи на себе, Е. С. Лондон пришел к выводу, что скрытый (латентный) период кожного радиогенного дерматита, а также степень его выраженности находятся в прямой зависимости от активности препарата и длительности его действия.
В 1901 и в последующие годы появилось множество зарубежных и отечественных работ о лучевом поражении кожи (дерматиты, эритемы, лучевые ожоги и язвы, выпадение волос), а в 1902 г. описан первый случай лучевого рака кожи.
Постепенно стало выясняться, что проникающая радиация, будучи невидимой и неощутимой, не только воздействует на кожу, но и вызывает лучевое поражение внутренних органов и тканей, а также гибель живых организмов и человека (эксперименты Е. С. Лондона в России, Г. Хейнеке в Германии и др.).
В последующие годы обнаруживаются лучевые изменения различных биохимических процессов: нарушения активности ферментов в органах и тканях, появление токсических веществ в крови (лейкоток- синов). Таким образом, сведения о высокой биологической эффективности нового вида излучений стимулировало мощный взрыв радиобиологических работ, характеризующий начальный, описательный период в истории радиобиологии.
Постепенно накапливаются данные о различии в устойчивости отдельных облучаемых биологических объектов и систем к летальному облучению и о высокой радиочувствительности процессов клеточного деления. В 1906 г. французские радиобиологи И. Бергонье и Л. Трибонд о сформулировали фундаментальный закон (правило) радиочувствительности клеток: ионизирующее излучение оказывает тем большее повреждающее действие на клетки, чем интенсивнее те делятся и чем менее определенно выражены их морфология и функция, т. е. чем менее они дифференцированны.
По мере накопления фактов становилось ясным, что ионизирующие излучения, в зависимости от интенсивности источника радиации и длительности облучения, способны вызывать повреждения и гибель любого биологического объекта, любой биологической системы.
Начиная с 1910 г. М.И. Неменов и сотрудники публикуют работы по выяснению изменений обмена веществ при лучевом поражении и о сходстве лучевых изменений с процессами патологии раннего старения. Появляются отдельные сообщения об угнетающем действии облучения на иммунную систему, эмбриогенез, половые функции (бесплодие). Все чаще появляются сведения о лучевом канцерогенезе.
Возникла необходимость обобщить накопившийся фактический материал мировой литературы по радиобиологии и радиационной медицине.
Лейпцигское издательство выбрало для этой цели профессора Е. С. Лондона. Первая в мире монография (Е. С. Лондон «Радий в биологии и медицине») вышла в свет в 1911 г. на немецком языке, а в 1968 г. переведена на русский язык в издательстве «Медицина». Важное место в монографии занимают описание различной радиочувствительности биологических объектов и систем, первичных физиологических и биохимических процессов лучевого поражения, рассмотрение медицинских и биологических аспектов лучевой болезни, практического применения радиации в медицине.
В 1918 г. в Петербурге был открыт первый в стране радиобиологический Государственный институт рентгенологии и радиологии, организатором и директором которого стал известный рентгенолог М.И. Неменов.
В 1925 г. была наглядно показана важная роль биохимических процессов в развитии лучевого поражения. Анцель и Винтенбергер в опытах на куриных эмбрионах обнаружили, что у облученного эмбриона, помещенного в холодильник, радиационные нарушения не проявляются, в отличие от выраженных их признаков, которые обнаруживаются у эмбриона, облученного в той же дозе, но находящегося в инкубаторе. Выясняется, что интенсивность обменных процессов оказывается основополагающей в формировании проявлений лучевого поражения.
Это наблюдение позволило авторам предсказать участие трех существенных моментов в развитии лучевого поражения:
наличие первичного радиационного повреждения;
существование факторов, способствующих усилению этого повреждения;
влияние восстанавливающих факторов.
Так постепенно формировалось представление, согласно которому степень лучевого поражения определяется не только интенсивностью первичного повреждения, но и физиологическим состоянием организма и характером метаболических процессов в нем.
Многочисленные исследования развития лучевого поражения организмов позволили радиобиологам прийти к общему выводу о том, что для возникновения острой лучевой болезни должен произойти сложный комплекс взаимосвязанных изменений в организме, появление которых зависит от величины дозы, характера и способа облучения, от времени, прошедшего после лучевого воздействия и биологической особенности организма (его радиочувствительности).
Попытки найти какое-либо действующее начало, специфическое только для лучевого поражения, так и не увенчались успехом. Поиски в облученном организме радиационно-индуцированных токсических веществ (радиотоксинов) показали, что последние представляют собой не что иное, как результат избыточного накопления продуктов нормально протекающих процессов, усиленного действием облучения. Исследование динамики и механизмов формирования биохимических нарушений при лучевых поражениях заняло все дальнейшие годы развития радиобиологии и позволило собрать ценнейший материал для характеристики и классификации клинических проявлений радиационного эффекта.
Изучение ионизирующего действия проникающей радиации на элементарные единицы вещества, создание количественной дозиметрии привело исследователей к установлению количественных принципов, связывающих радиобиологические эффекты с дозой облучения. Этим в 20-е годы XX в. был открыт следующий, второй период в развитии радиобиологии — период изучения механизмов действия ионизируюи^их излучений на биологические объекты и системы и положено начало формированию количественной радиобиологии.
Начались интенсивные поиски критических биологических молекулярных и клеточных структур, а также органов и тканей облучаемых организмов, ответственных за развитие лучевого поражения, ведущего к смертельному исходу. Одновременно шло изучение и анализ количественных закономерностей зависимости биологических эффектов от величины доз облучения.
В этот период произошло осознание одной из важнейших особенностей биологического действия ионизирующих излучений — существования так называемого радиобиологического парадокса, состоящего в том, что энергия ионизирующих излучений при ее выражении в тепловом эквиваленте оказывается несопоставимо малой по сравнению с тем биологическим эффектом, который она вызывает.
Середина двадцатых годов ознаменовалась крупным открытием в радиобиологии. Речь идет об обнаружении в 1925-1927 гг. советскими учеными Г. А. Надсоном и Г. С. Филипповым в экспериментах на дрожжевых клетках, а позднее Г. Мёллером (США) на дрозофиле эффекта радиационного мутагенеза, проявляющегося не только в повреждении «вещества наследственности», но и в образовании стойких необратимых изменений в нем, передающихся по наследству. Были получены строгие доказательства возникновения мутаций под влиянием облучения. Впервые биологи получили возможность экспериментально воспроизвести наследственную изменчивость.
С открытием мутагенного действия излучений многие радиобиологи перешли к изучению единичной реакции дискретных биологических структур (генов, хромосом) на радиационное воздействие. В это же время значительно совершенствуются методы дозиметрии излучений, вводится ионизационная единица дозы — рентген. Появляется возможность количественного анализа биологического действия излучений, основанного на выяснении зависимости между наблюдаемым биологическим эффектом и дозой радиации, поглощенной изучаемой системой. Такие эксперименты проводились не только на ядерных наследственных структурах, но и на колониях клеток, вирусных частицах, препаратах ферментов.
Результаты, полученные в точных количественных опытах, свидетельствовали о вероятностном характере проявления единичной реакции объекта в ответ на облучение в данной дозе радиации. Иначе говоря, при облучении однородных объектов (клетки одной линии, молекулы одного типа и т. д.) наблюдали, что при любой малой дозе радиации некоторое число объектов оказывается пораженным, а другие сохраняют исходные свойства; при самой большой дозе радиации небольшая доля объектов все еще остается непораженной. Кривые «доза-эффект» в этих случаях имели экспоненциальный характер и их можно было надежно экстраполировать к нулевой точке.
Обнаруженный эффект нельзя было объяснить естественной вариабельностью: речь шла о генетически однородных клетках и вирусных частицах или молекулах одного типа. Его трактовка потребовала привлечения фундаментальных физических концепций, прежде всего, представлений о вероятностном характере поглощения энергии излучений, о дискретной природе частиц, составляющих ионизирующие излучения, о физически микрогетерогенной организации биологических структур.
По-видимому, начало исследований в области количественной радиобиологии (20-е гг.) и стало рождением радиационной биофизики, так как впервые для объяснения радиобиологических феноменов и создания общей теории биологического действия ионизирующих излучений в качестве отправных концепций потребовалось использовать теоретические положения квантовой механики и ядерной физики.
Одним из первых это сделал в 1922 г. Ф. Дессауэр, предложив теорию «точечного нагрева». Ионизирующие излучения обладают малой
объемной плотностью, однако отдельные фотоны несут гигантский запас энергии. Исходя из этого, Ф. Дессау эр предположил, что при поглощении системой относительно небольшой общей энергии (смертельная для человека доза облучения вызывает нагрев тела всего на 0,001 °C) некоторые дискретные микрообъемы поглощают настолько большие порции энергии, что действие ионизирующих излучений можно сравнить с таким микролокальным нагревом, который вызывает глубокие структурные изменения и в конечном счете биологическое поражение. Вероятностный характер проявления эффекта у отдельных объектов автор гипотезы объяснял статистическим распределением «точечного тепла».
Так впервые физический принцип попадания был использован в исследованиях количественной радиобиологии. Дальнейшее его развитие связано с работами Дж. Кроутера, Д. Ли, К. Г. Циммера, Н. В. Тимофеева-Ресовского, В. И. Корогодина и др.
Работы этого периода оказали большое влияние на дальнейшее развитие радиационной биофизики, превратили ее в одну из самых точных биологических дисциплин. Математический аппарат, развитый в этих работах, позволил с достаточной надежностью судить о «пусковых событиях», приводящих к регистрируемым в эксперименте биологическим реакциям (мутации, гибель клетки и др.) и оценивать параметры «мишени», ответственной за наблюдаемый радиобиологический эффект.
Согласно принципу попадания, начальный физический пусковой механизм, необходимый для возникновения конечной биологической реакции, обусловлен случайным взаимодействием ионизирующего излучения с веществом. В силу этого в каждую молекулу или клетку происходит неодинаковое число попаданий. С принципом попаданий тесно связана теория мишени, основанная на принципе гетерогенности строения живых систем, поражение излучением отдельных элементов которых имеет не одинаковое значение для данной системы. Например, необратимое повреждение уникальной клеточной структуры фатально для клетки, тогда как такое же повреждение иных, множественных структур для судьбы клетки может иметь существенно меньшее значение. В многочисленных работах получены новые факты высокой радиочувствительности делящихся клеток, клеточного ядра, молекулы ДНК.
Сейчас хорошо известно, что лучевые нарушения генетических структур могут проявляться как сразу после облучения, так и отдаленно, в потомках, даже спустя нескольких поколений, становясь в организме причиной возникновения злокачественных опухолей, а также различных уродств развития.
При облучении биологического объекта ионизирующая радиация поглощается не избирательно, а любыми молекулами, клетками, органами и тканями. Даже при облучении в малых дозах происходит много тысяч актов ионизации молекул, а это может привести к разнообразным нарушениям структуры и функции клеток. И лишь только некоторые из этих нарушений приводят клетку к потере способности
к делению и к гибели. Такой «критической структурой», мишенью в клетке является уникальная макромолекула ДНК, несущая генетическую информацию.
Впоследствии оказалось, что применение теории мишени весьма ограничено и позволяет количественно интерпретировать зависимость эффекта от дозы лишь для элементарных или сравнительно простых реакций биологических систем. Конечная ответная реакция на облучение сложной системы (например, гибель клетки) зависит не только от событий попадания в ДНК. Она зависит от системного ответа клетки и целостного организма на облучение, т. е. от ряда свойств самого биологического объекта, например от способности устранять или восстанавливать повреждения. Системный ответ также носит стохастический характер, определяющий меру нестабильности биологической системы, 'усиливаемой действием излучения. Отсюда следует вывод, что количественная оценка системного ответа в зависимости от дозы облучения должна учитывать мноснсественные стохастические взаимоотношения.
Важным направлением радиационной биофизики является создание математических моделей которые являются формализованным выражением большинства теоретических закономерностей в радиобиологии. Математические модели лежат в основе объяснительного аппарата и в радиационной биофизике. Накопление исходной экспериментальной информации и развитие теоретических представлений сопровождалось, а иногда и предвосхищалось появлением соответствующих моделей.
Насколько широк спектр объектов, процессов и проблем, которые решаются в радиационной биофизике с помощью метода математического моделирования, настолько разнообразны используемые модели. Первые модели были основаны на принципах попаданий и мишени. Появление «стохастической концепции» биологического действия ионизирующих излучений привело к созданию моделей, более адекватно отражающих сложный вероятностный характер процессов, происходящих в живом объекте при облучении. Дальнейшим развитием математической интерпретации радиобиологических эффектов стало создание так называемой «вероятностной» модели, представляющей синтез двух вышеупомянутых подходов.
Появление моделей следующего поколения было напрямую связано с резким скачком в информационно-технической области и с повышением доступности и быстродействия компьютеров. К концу прошлого столетия математические модели в биологии характеризуются большим разнообразием подходов и широким спектром возможностей. Они позволяют изучать и прогнозировать динамику отдаленных последствий облучения в условиях, которые варьируют во времени и пространстве, учитывать сочетанное или комбинированное влияние облучения и других факторов, проводить численные эксперименты на виртуальных объектах и т. д. «Компьютеризация» математического моделирования в радиационной биофизике позволяет реализовать
многие сформулированные ранее перспективные идеи в этой области, например, создание моделей на основе цепей Маркова.
Однако следует всегда помнить также и о том, что моделирование зависимости ответной реакции живой системы от дозы облучения не является самоцелью, поскольку оно не дает нового фактического материала о конкретных физико-химических молекулярных изменениях при облучении. Для этого необходимо проведение только экспериментальных исследований.
В середине XX столетия стали известны трагические последствия для жителей Хиросимы и Нагасаки атомных бомбардировок августа 1945 г., сопровождавшихся помимо прочего высокими дозами облучения. Этот год стал, рубежным для вступления радиобиологии в третий этап своего развития.
Как писал академик Н.П.Дубинин, “... в 1945 году были взорваны атомные бомбы в Хиросиме и Нагасаки. Стало ясно, какую угрозу таит в себе радиация, если ее обрушить на ... человека”. Возникшую ситуацию в науке довольно точно охарактеризовал А. М. Кузин: “На первое место выдвигается проблема изучения тотального облучения высших организмов, проблема защиты организмов от вредного действия ионизирующей радиации, создание теоретических основ профилактики и лечения лучевой болезни. Возникает необходимость установления точных количественных закономерностей зависимости между биологическими проявлениями действия ионизирующей радиации и дозой, мощностью облучения, энергией элементарных частиц и видом радиации.” Среди перечисленных проблем особое внимание радиобиологов привлекает изучение первичных и начальных физико-химических процессов в облученном организме и, в связи с расширением масштабов испытания ядерного оружия, радиоэкологическая проблема глобального изменения радиационного фона.
Действительно, вскоре создаются мощные арсеналы ядерного оружия, расширяются масштабы его испытания. В атмосферу выбрасывается большое количество искусственных радионуклидов, выпадающих с осадками на поверхность Земли и распространяющихся на значительные расстояния, создавая обширные очаги радиоактивного загрязнения. В 1955 г. при ООН создается специальный Научный комитет по изучению действия атомной радиации на человека — НКДАР. В результате своей деятельности НКДАР собрал и обобщил огромный фактический материал по поражающему действию атомной радиации на человека. Как отметил в 1987 г. Л. Саган, на основе этого материала в радиобиологии сложилась «парадигма», согласно которой в любых дозах «атомная радиация вредна и только вредна для живых организмов».
С середины столетия происходит перенос акцентов в развитии радиобиологии и радиационной биофизики — получают импульс исследования молекулярных механизмов действия излучений. Этому
предшествовал ряд достижений в области биофизики и молекулярной биологии, в частности, получение доказательства биологической роли ДНК как главного вещества наследственности и расшифровка ее структуры.
Еще в 40-е гг. при анализе физико-химической природы процессов, происходящих в период между первичной абсорбцией энергии излучения и конечным биологическим эффектом, было обнаружено зарождение в облучаемом растворе высокоактивных продуктов радиолиза воды — свободных радикалов, способных диффундировать на значительные расстояния и поражать биологические структуры. Радиационная биофизика начинает оперировать представлениями о «непрямом действии» излучения, опосредованном активными продуктами радиолиза воды. Были изучены физико-химические свойства первичных продуктов радиолиза воды и характер их взаимодействия с макромолекулами клетки.
Это дало возможность приступить к исследованиям химических средств защиты (радиопротекторов) от действия ионизирующих излучений.
Так, в 1942 г. В. Дейлу удается снизить поражающее действие радиации на ферменты введением в раствор ряда веществ — перехватчиков радикалов.
Проблемы, связанные с реальной угрозой гибели человечества от ядерного оружия и радионуклидных загрязнений биоты, привели к интенсивному развитию исследований в области химической защиты организма от ионизирующих излучений.
В 1948 г. был получен защитный эффект в опытах с бактериофагами. Эти работы логически привели радиобиологов к открытию, практическую важность которого трудно переоценить: в 1949 г. была доказана способность ряда веществ защищать млекопитающих от лучевого поражения. В опытах X. Патта с соавторами введение цистеина за 10 мин до облучения защищало крыс от неминуемой гибели (т. е. действия радиации в «минимальной абсолютно летальной дозе»); 3. Бак и А. Эрв обнаружили аналогичное действие цианида на мышах.
Во многих лабораториях мира начинается интенсивный поиск эффективных радиозащитных препаратов. Формируется самостоятельное направление радиационной биофизики — выяснение механизмов модифицированной радиочувствительности биологических объектов. Помимо практической значимости, эти работы представляли теоретический интерес, поскольку были детально исследованы многие физико-химические процессы как возможная точка приложения активности радиозащитного агента.
Так, наблюдения, согласно которым многие эффективные ра- диозащитные препараты понижают содержание кислорода в тканях животных, стимулировали углубленные исследования ряда новых противолучевых средств (работы Н.П. Суворова, П. Г. Жеребченко, С. П. Ярмоненко в нашей стране; Л. Грея, Д. Кейтера, X. Лангендорфа и других авторов за рубежом).
Первоначально были высказаны гипотезы, связывающие защиту исключительно с инактивацией свободных радикалов и торможением свободнорадикальных окислительных процессов. Эти гипотезы находили хорошее подтверждение в модельных экспериментах на простых молекулярных системах. Однако для сложных биологических систем такого объяснения было явно недостаточно.
Анализ физиологических и биохимических изменений, возникающих в тканях животных после введения радиозащитных соединений, привел в середине 60-х гг. 3. Бака и П. Александера к формулированию гипотезы «биохимического шока», согласно которой различные радиопротекторы однотипно изменяют метаболические процессы, переводя клетки в состояние повышенной устойчивости к действию ионизирующей радиации.
В дальнейшем появился ряд обширных исследований, посвященных анализу конкретных биохимических изменений, возникающих под влиянием радиозащитных агентов и модифицирующих радиорезистентность организма. Возникли гипотезы «комплексного биохимического механизма действия радиозащитных средств» (Е.Ф. Романцев, 1968), «сульфгидрильная гипотеза» (Э. Я. Граевский, 1969) и др. Несмотря на стремление некоторых исследователей придать исключительное значение какому-то одному фактору, экспериментальные данные указывали на существование альтернативных путей реализации защитного эффекта даже для одного и того же радиопротектора.
В 70-е гг. Е. Н. Гончаренко и Ю. Б. Кудряшов установили, что различные радиозащитные агенты к моменту своей максимальной эффективности снижают в тканях животных уровень продуктов перекисного окисления липидов — природных сенсибилизаторов лучевого поражения — и увеличивают содержание биогенных аминов, которые, наряду с тиолами и другими антиокислителями, относятся к природным противолучевым веществам. На основании этих данных авторы предложили гипотезу «эндогенного фона радиорезистентности» (1980).
Эти исследования привели к накоплению обширного фактического материала по общей картине лучевого поражения и его модификации, позволили наметить пути к выяснению основных закономерностей зарождения «пусковых», «запальных» физико-химических процессов, механизмов ослабления или усиления первичных лучевых реакций. В результате на первый план вышли исследования, посвященные анализу физико-химических процессов, протекающих в клетке от момента возникновения начальных структурных повреждений до проявления выраженных биохимических и морфологических изменений.
Анализируется модифицирующее действие кислорода, температуры и других агентов, влияющих на развитие лучевого поражения биологических объектов. Большое число работ посвящается проблеме миграции энергии и заряда в облученной системе. Проводится также изучение роли свободных радикалов, относительного вклада прямого и непрямого действия ионизирующей радиации, накопления
оксирадиотоксинов в формировании радиобиологического эффекта и эффекта защиты.
Значительный вклад в расшифровку первичных молекулярных механизмов лучевого поражения внесли пионерские работы Б. Н. Тарусова и его школы.
Согласно выдвинутой им теории, немногочисленные первичные повреждения инициируют цепные процессы окисления, в которые вовлекаются множественные субклеточные структуры. Такая теория физико-химического механизма и принцип усиления начального радиационного повреснсдения позволили объяснить многие радиобиологические феномены: развитие лучевого поражения во времени, влияние на этот процесс температуры, газового состава атмосферы и т. д.
В середине 50-х гг. в лаборатории Б. Н. Тарусова обнаружено, что высшие ненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав клеточных липидов, обладают значительной уязвимостью к радиационному воздействию, а продукты перекисного окисления липидов во многом имитируют действие излучения на разнообразных биологических объектах и системах: например, продукты окисления высших ненасыщенных жирных кислот обладают радиомиметическими и радиосенсибилизирующими свойствами. Эти и другие исследования позволили предположить, что в результате облучения происходит активное вовлечение липидов биомембран в процессы перекисного окисления, что впоследствии приводит к множественному поражению и гибели клетки.
Б. Н. Тарусов обосновал предположение о том, что в норме окислительные процессы в тканевых липидах протекают на низком уровне и находятся в стационарном режиме. После облучения эти процессы могут переходить в нестационарный режим и вовлекать в окислительные изменения различные компоненты внутриклеточных мембранных структур, обусловливая этим динамику лучевого поражения.
Для развития этих представлений большое значение имели классические исследования механизмов окислительных реакций, проведенные Н. Н. Семеновым и его школой. Появилось значительное количество работ Н. М. Эмануэля, Е. Б. Бурлаковой и ряда других авторов, посвященных выяснению механизмов окисления липидов, индуцированного ионизирующей радиацией, и антиокисли- тельных защитно-восстановительных процессов в биологических мембранах (БМ) клетки.
Открытие и изучение биохимической системы антиокислительной защиты, состоящей из ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов, играющей важную роль в формировании радиорезистентности клетки и организма, явилось значительным вкладом радиобиологии и радиационной биофизики в биологическую науку. Было установлено, что активные формы кислорода (так называемые оксирадикалы) возникают не только после облучения, но и продуцируются метаболически, вызывая повреждения клеточных структур и патологические состояния организма. Предложенная защита от таких повреждений
стала важным способом лечения, используемым при многих заболеваниях. Радиобиологи и биофизики (Н. М. Эммануэль и Б. Н. Тарусов — руководители коллектива)) за цикл работ «Физико-химические механизмы свободно-радикального перекисного окисления липидов в биологических мембранах», опубликованных в 1954-1981 гг., в 1984 г. стали лауреатами Государственной премии.
В последние два-три десятилетия в молекулярной биологии и радиационной биофизике происходит совершенствование методических приемов и высокочувствительной аппаратуры для тонкой идентификации лабильных биомолекул: находят применение селективная ионная масс-спектрометрия, рентгеноэлектронная и атомная спектроскопия, ЭПР, различные виды хроматографии, активированная хеми- и биолюминесценция, использование радиоактивных индикаторов, модификаторы свободнорадикальных состояний и др.
Благодаря этому возникает значительный сдвиг в направлении изучения образования и биологической роли низкомолекулярных оксирадикалов и биогенных продуктов окисления — активных кислородсодержащих соединений (АКСС): активных форм кислорода, моноксида азота, продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов. В результате показана принципиальная возможность образования в интактных и облученных клетках оксиаддуктов ДНК с перекисями, эпоксидами, альдегидами ненасыщенных липидов, т. е. оксиаддуктов, обладающих цито- и генотоксическим действием, способностью вызывать в клетках активацию апоптоза и мутации.
В 1960-е годы значительных успехов в расшифровке механизма лучевой инактивации ферментов и нуклеиновых кислот добилась молекулярная радиобиология, использовавшая весь экспериментальный арсенал, накопленный ею за два десятилетия бурного развития. Сформировалось новое, молекулярное направление радиационной биофизики системного ответа на действие излучений, которое основывается на фундаментальных физических и квантово-механических принципах, опыте количественной радиобиологии и новейших открытиях молекулярной биологии о причинно-следственных отношениях между структурой и биологическими функциями макромолекул.
Феномен клеточного восстановления от радиационного поражения, описанный в 1960-е годы благодаря развитию методов культивирования клеток, начинает приобретать объяснение на молекулярном уровне: открыты и детально проанализированы механизмы восстановления ДНК от радиационных повреждений. Это стало крупнейшим вкладом радиобиологии в науку о живом.
Оказалось, что в клетках функционирует сложнейший комплекс ферментных систем, поддерживающих структурную целостность генома. К одной из них относят разнообразные ферменты репарации ДНК, распознающие дефекты ее структуры, «ремонтирующие» ее при лучевых повреждениях путем специфического устранения различных повреждений и восстановления структуры и функций ДНК, а вместе с тем и нормального клеточного деления.
Были обнаружены несколько механизмов восстановления ДНК от повреждений: фотореактивация; эксцизионная репарация нуклеотидов и оснований; рекомбинационная репарация и репарация путем некомплементарного сшивания концов ДНК. Показано, что функционирование систем восстановления ДНК зависит от состояния внутриклеточного метаболизма, интенсивности энергетических процессов клетки. Таким образом, стал понятным молекулярный механизм известных радиобиологических эффектов, таких как зависимость лучевого поражения от условий пострадиационного культивирования клеток, состояния метаболических систем и других физиологических факторов. В зависимости от величины дозы облучения, восстановление ДНК может оказаться полным или частичным, и от этого зависит выживаемость пораженной клетки.
Для радиационной биофизики становится общепринятым рассмотрение конечного радиобиологического эффекта как результата интерференции двух противоположно направленных процессов: реализации первичного поражения и восстановления от него внутриклеточных структур при помоици систем репарации.
Важную роль в развитии радиобиологии и радиационной биофизики сыграла структурно-метаболическая теория лучевого поражения, сформулированная и развивавшаяся А. М. Кузиным. Последняя предполагает, что множественные структурные повреждения клеточных органелл приводят к дезорганизации метаболизма в клетке. Результатом этого может быть не только гибель облученной клетки, но и нарушение жизнедеятельности и гибель соседних и даже находящихся на удалении от нее клеток (так называемый дистанционный эффект радиации).
Исследование механизмов радиационного повреждения ДНК, процессов репарации ДНК, направленных на его устранение, их роли в формировании закономерностей лучевого поражения клеток лимфоидной ткани стали основополагающими в понимании «запрограммированности» процесса интерфазной гибели клеток при действии ионизирующей радиации. Полученные результаты в этом направлении стали предтечей открытия в 1972 г. такой формы гибели клеток, как апоптоз, принципиально отличный от другой формы — некроза. За почти четвертьвековой цикл работ в этом направлении коллектив
авторов во главе с А. М. Кузиным и П. Д. Горизонтовым ) в 1987 г. был удостоен Государственной премии «за разработку теоретических основ радиационной гибели лимфоидных клеток и их использование для выяснения патогенеза лучевой болезни».
Было высказано предположение, что ведущим механизмом гибели неделящихся или медленно делящихся клеток организма (нервные клетки, клетки мышц и паренхиматозных тканей и др.) является поражение уже других критических структур, например, биологических мембран. Эта интерфазная гибель свойственна клеткам, относительно устойчивым к облучению. Само лучевое воздействие на ДНК или БМ при определенных уровнях доз не всегда оказывается для этих структур и клетки повреждающим, поскольку в клетке имеются собственные системы противодействия образуемым в ходе облучения оксирадикалам.
Так, было обнаружено, что помимо систем, репарирующих структуры от лучевых повреждений, в любой клетке имеются иные собственные защитные ресурсы, способные предохранять от повреждения такие структуры, как ДНК и биологические мембраны. К превентивным системам такого рода относится ряд биологически активных молекул и ферментов, составляющих «эндогенный фон радиорезистентности», определяющий окислительно-восстановительный гомеостаз клетки.
Открытие механизмов программируемой гибели клетки — апоптоза — явилось одним из выдающихся достижений молекулярной биологии и радиобиологии. Биологический смысл этого процесса, осуществляемого многоэтапным каскадом биохимических реакций, состоит в уничтожении клеток, выработавших свой «ресурс», ставших нежизнеспособными или чужеродными для организма в результате мутационных изменений.
В последнее время установлено, что механизмы апоптоза свойственны не только клеткам, но они также присущи субклеточным и надклеточным структурам. В.П. Скулачев сформулировал обилий биологический закон самоликвидации: любая живая система (от органеллы и выше) уничтожает себя, если становится опасной для жизнедеятельности системы, занимающей более высокую ступень в иерархии организации жизни. Самоликвидация митохондрий была названа митоптозом, а органов и тканей — органоптозом.
При лучевом поражении происходит клеточное опустошение критических органов и тканей, наблюдаемое при развитии, например, костномозгового и кишечного синдромов. Высокие дозы острого облучения приводят к некротической гибели (например, при ЦНС-синдро- ме). Показано, что одним из сигнальных механизмов, приводящих к апоптозу или некротической гибели клетки при лучевом воздействии,
является избыточное образование активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов.
На фоне исследований механизмов повреждения и восстановления критических структур периодически, начиная с работ 3. Бака и П. Александера (1955 г.), обсуждался вопрос о том, являются ли эти механизмы специфичными только для ионизирующих излучений или данный системный ответ является общебиологическим явлением, свойственным любой клетке, реагирующей на любые внешние воздействия?
В 60-е гг. В.П.Парибок высказал предположение, согласно которому известная способность репаративных систем устранять радиационные повреждения ДНК — это лишь одно из проявлений неспецифической реакции живой системы на повреждающее воздействие. Иначе говоря, отмечается, что в клетках «заложены» системы, поддерживающие нормальную, стационарную динамику состояния ее структур и стандартно реагирующие изменением на любое повреждающее воздействие. В исследованиях Л. X. Эйдуса, начавшихся еще в 1979 г., проанализирован биофизический механизм неспецифической реакции клеток на повреждающие воздействия, к которым автор наряду с ионизирующей радиацией относит и действие различных физических и химических раздражителей. Согласно развиваемой им гипотезе, под влиянием повреждающего агента возникают однотипные изменения, включающие нарушение мембранного транспорта и соответствующих градиентов концентрации низкомолекулярных соединений, которые локально накапливаются в компартментах клеток, сорбируются на макромолекулах и изменяют их конформационную подвижность.
Имеющийся в настоящее время большой фактический материал отечественных и зарубежных школ позволяет говорить о конкретных механизмах стрессовой реакции, развивающейся в результате изменений окислительно-восстановительного гомеостаза в клетке при радиационном воздействии.
Облучение, так же, как и любой раздражитель, вызывает в клетке «оксидативный стресс», проявления которого зависят от величины дозы и продолжительности воздействия. Он состоит из двух основных взаимосвязанных процессов: оксидативного, развивающегося в результате накопления прооксидантов, и сдерживающего его процесса с помощью мобилизации запасов защитных ресурсов клетки — системы ферментных и низкомолекулярных антиоксидантов. Соотношение скоростей конкурирующих между собой процессов окисления и восстановления в уникальных клеточных структурах определяет степень развития той или иной стадии стрессовой реакции и, в конечном счете, при исчерпании «емкости» антиоксидантной системы ферментов и низкомолекулярных соединений вносит вклад в вероятность развития радиационно-обусловленного патологического процесса.
Проблемы, возникшие после Чернобыльской катастрофы(современный период)
Казалось бы, в почти вековой истории радиобиологии фундаментальные исследования в основном завершились, и радиационным биофизикам остались лишь «отделочные», «косметические» работы. Однако, как это бывало и ранее, социальные проблемы внезапно поставили перед радиобиологами принципиально новые задачи. Так, можно считать, что авария на Чернобыльской АЭС в 1986 г., снятие секретов с информации о ее последствиях, а также последствиях других радиационных аварий и ядерных испытаний открыли новый, четвертый период в истории радиобиологических исследований.
Как известно, на ЧАЭС произошла крупнейшая техногенная катастрофа глобального масштаба: следы ее фиксировались от Филиппин до Канады и Южной Америки. Миллионы кюри искусственных радионуклидов, поступивших в биосферу за короткое время, практически впервые после запрета, введенного в начале 1960-х гг. на проведения ядерных испытаний в атмосфере (если не считать глобальные радиоактивные загрязнения атмосферы в тот же период от испытаний, проводившихся в Китае), явились тем фактором, с которым нельзя не считаться и в настоящее время. Формы поступления, характер миграции, пути накопления и рассеивания чернобыльских радионуклидов, особенности их хронического действия в малых дозах на живые организмы и человека — все это потребовало незамедлительного и тщательного изучения.
Глобальный характер наступившего радиоэкологического кризиса оказался связанным также и с постоянным загрязнением биосферы в результате других техногенных катастроф, промышленных аварий, с существованием большого числа могильников радиационных и химических отходов, с появлением других ядерных ситуаций, таящих угрозу постепенного истощения экологического потенциала и генофонда в различных регионах нашей планеты.
Стало очевидно, что для решения проблем, возникших после Чернобыльской катастрофы, накопленные знания и имеющийся опыт традиционной радиобиологии и медицины оказываются явно недостаточными, и поэтому в современной радиобиологии стали быстро развиваться новые направления. К ним можно отнести, по крайней мере, следующие:
изучение биологического действия излучений в малых дозах и отдаленных последствий облучения;
исследование комбинированного действия широкого спектра радионуклидов с химическими загрязнителями среды;
поиск принципиально новых средств защиты от хронического облучения.
Поскольку современный период развития радиобиологии начался недавно, разрешение возникших проблем находится еще в начальной стадии. Наряду с традиционными фундаментальными дисциплинами — общей радиобиологией и медицинской радиобиологией — быстрое развитие получила радиоэкология, изучающая ответные реакции биологических объектов на действие ионизирующей радиации в загрязненной среде.
Перед радиационной биофизикой возникли новые задачи. Наиболее важными оказались фундаментальные исследования механизмов радиобиологических эффектов, вызываемых слабыми воздействиями, поскольку оказалось, что эффекты, вызываемые ионизирующими излучениями в малых дозах, нельзя оценивать путем простой экстраполяции в область малых доз данных, полученных при больших дозах. Действительно, открылись принципиально новые явления при изучении эффектов малых доз.
Это и повышенная чувствительность биообъектов к воздействию радиации в сверхмалых дозах, переходящая к повышенной радиорезистентности — адаптивному ответу — при более высоких нелегальных дозах. Это и стимулирующее действие излучений на рост, развитие и другие физиологические показатели (эффект гормезиса), а также «необычное» снижение выраженности радиобиологических эффектов по мере увеличения мощности малой дозы (обратный эффект моиц- ностей доз).
Вместо априорно принятой ранее концепции линейной зависимости радиобиологических изменений от изменения низкоинтенсивных доз облучения, радиобиологи пришли к выводу о немонотонной, синусоидальной кривой зависимости «доза-эффект» в этом диапазоне. Неудачными оказались и некоторые попытки объяснить особенности действия радиации в малых дозах с традиционных позиций первичного повреждения ДНК. Ряд радиобиологов в связи с этим стали рассматривать БМ в качестве основной радиобиологической мишени в эффектах малых доз.
До недавнего времени считалось, что такие лучевые реакции клеток как их гибель, мутации, хромосомные аберрации, а также опухолевая трансформация тканей являются следствием только прямых и необратимых повреждений первичной структуры ДНК. Достижения современной молекулярной биологии и радиационной биофизики привели к выводу о более сложных изменениях, происходящих в радиационных мишенях в связи с оксидативными реакциями. В результате все большее значение приобретают исследования механизмов регуляции изменений, происходящих в БМ и ДНК и образующихся в них под влиянием ионизирующих излучений оксирадикалов, оксиаддуктов и других продуктов окисления.
На рубеже двух столетий внимание радиобиологов привлекло еще одно принципиально важное радиобиологическое явление — способность облученной клетки передавать путем контактов или секреции
3 Ю. Б. Кудряшов
в межклеточные пространства цито- и генотоксических веществ сигналы, действующие на соседние необл ученные клетки подобно облучению. Это явление, получившее название «эффекта свидетеля», давно было замечено при исследовании радиотоксинов, экстрагированных из органов и тканей тотально или локально облученных животных и растений, а также из одиночных клеток.
Важно отметить, что цито- и генотоксический эффект «свидетеля» отмечен при облучении клеток в малых дозах а- и у-излучения и свойственен как непосредственно облученным клеткам, так и части их потомков в последующих поколениях. В настоящее время ведутся интенсивные исследования химической природы секретируемых веществ и механизма их действия.
Современный период, связанный с проблемами радиоэкологического кризиса, диктует также новые подходы и в разработке методов химической защиты от ионизирующей радиации. Появилась необходимость в исследованиях природных пищевых продуктов и препаратов, способных, не оказывая вредного побочного действия на организм, снижать или предотвращать эффекты хронического низкоинтенсивного облучения в сочетании с другими экстремальными природными и техногенными факторами. Большое внимание также уделяется исследованию средств, способствующих выведению радионуклидов из организма. Не менее актуальны и остры задачи проведения программ медицинской реабилитации облученного населения.
Накопив данные по изучению лучевой патологии, радиобиологи обратились к идеям древней народной медицины: помочь организму мобилизовать собственные защитные ресурсы, способствующие повышению общей устойчивости к ионизирующей радиации и вредным факторам среды. Благодаря этим идеям уже сейчас используется значительное количество препаратов, пищевых добавок и веществ, многие из которых хорошо известны в народной медицине, но впервые применяются в целях защиты организма от вредных последствий хронического облучения. Нетрудно видеть, что и это актуальное направление должно получить дальнейшее развитие, но оно уже далеко выходит за рамки одной только радиационной биофизики.
В кратком обзоре актуальных проблем трудно охватить все направления, по которым развиваются сегодня и будут развиваться завтра радиационная биофизика и радиобиология. Однако в настоящее время появились все основания для того, чтобы, используя имеющийся фактический материал многогранной науки, сформулировать основные принципы радиобиологии. Этому посвящена заключительная часть данного учебника.
Глава I
ИОНИЗИРУЮЩИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ,ИХ ХАРАКТЕРИСТИКА, ДОЗИМЕТРИЯ ИДОЗОВЫЕ ВЕЛИЧИНЫ
Виды ионизирующих излучений, их энергия
К ионизирующим излучениям относят фотоны электромагнитного излучения (7- и рентгеновское излучение с длиной волны менее 19 нм) и корпускулярные излучения (ускоренные частицы и ядра различных элементов).
В радиационной физике и химии за единицу энергии ионизирующих излучений принимается электрон-вольт (эВ, eV). 1 эВ — это энергия, приобретаемая одним электроном, движущимся в постоянном поле с разностью потенциалов в один вольт; 1 эВ = 1, 602-1019 Дж ).
Фотонное излучение с энергией от 50 эВ до 500 кэВ называют рентгеновским излучением, а при более высоких энергиях принято говорить о 7-излучении.
Рентгеновское излучение разделяют на мягкое (Е < 50 кэВ) и жесткое (Е > 50 кэВ). Энергии 7-квантов лежат в диапазоне от десятков кэВ до нескольких МэВ. В определении этих несколько перекрывающихся диапазонов энергии излучений нет путаницы: слово «гамма- лучи» принадлежит Марии Кюри и возникло в результате наблюдения ею излучения радиоактивного распада, имевшего высокое значение энергии; наоборот, в зарубежной литературе любые фотоны с высокой энергией часто называют X-лучами, хотя В. К. Рентген называл так открытое им излучение с энергиями в более низкой энергетической области.
Термин «корпускулярное излучение» применяют к любым частицам с ненулевой массой. К этому виду излучений относят электроны, позитроны, нейтроны, a-частицы, протоны, ускоренные ионы, ядер- ные фрагменты и осколки деления ядер, а также многие нестабильные частицы.
К электронному излучению относят ^-частицы (электроны с энергией 0,002-2,3 МэВ, возникающие при распаде радиоактивных ядер) и
ускоренные электроны, которые создаются ускорителями электронов (с энергией от кэВ до сотен МэВ).
Ядра атома гелия называются «-частицами, когда они образуются при распаде некоторых радионуклидов и несут энергию до ~10 МэВ. Те же ядра, ионизированные и ускоренные, образуют пучки ионов гелия. Эти и другие пучки заряженных частиц — протонов, дейтронов и вообще любых многозарядных тяжелых ионов (например, углерода) — получают в протонных и ионных ускорителях. На них при облучении мишеней получают также пучки нейтральных частиц - фотонов и нейтронов, и даже пучки радиоактивных ионов.
Наиболее интенсивные потоки нейтронов получают при делении ядер урана и плутония в ядерном реакторе, а также в нейтронных генераторах. Нейтроны деления имеют широкий спектр энергий с максимумом при 1-2 МэВ.
Линейная передача энергии излучения
Когда отдельная частица или пучок частиц излучения воздействует на вещество, то их путь можно наблюдать по произведенным ими эффектам. Ионизационний след заряженной частицы в веществе, или ее путь, называется треком. В отличие от непосредственно ионизирующих частиц, косвенно ионизирующие частицы такого следа не образуют, и он может проявиться лишь под действием вторичных частиц, если они несут электрический заряд.
Действие ионизирующих излучений на вещество связывают с величиной линейной передачи энергии — ЛПЭ (linear energy transfer, LET), которая определяет величину средних потерь энергии на единицу пути первичной заряженной частицы в пределах объема ее трека. Обычно принимается, что вещество — это вода с плотностью 1 г/см3, и поэтому ЛПЭ измеряется в единицах кэВ/мкм. Таким образом, вводится различие между ЛПЭ и удельными ионизационными потерями энергии частицы, в которых учитывается не только выделенная локально, но и вся энергия, потерянная при прохождении частицей 1 г/см2 вещества. Характерной величиной ЛПЭ является 0,2 кэВ/мкм — к этой минимальной величине довольно близки ЛПЭ в очень широком диапазоне — для электронов всех энергий и фотонов выше 0.5 МэВ.
Еще одно различие: по мере прохождения частиц вглубь среды их энергия изменяется как бы непрерывно, то есть часто теряется малыми порциями за счет ионизации атомов среды.
Иначе происходит изменение энергии фотонов и нейтронов — это более редкие события, обычно с большой передачей энергии сразу, без образования треков, и проследить, как меняется энергия частицы, становится трудно. Поэтому к ним вообще не применяется понятие ионизационных потерь энергии, а говорить об ЛПЭ фотонов или нейтронов можно всегда, это практически удобно. В этом и заключается причина, почему радиационная физика перешла на «язык ЛПЭ» (линейных передач энергии).
Когда говорят просто об удельных потерях энергии частицы ^—dEjdx\ знак минус часто не ставится), то обычно подразумевают, что это «ионизационные потери», хотя лучше всего это уточнять. Тормозная способность вещества, как правило, численно имеет то же самое значение, но в принципе она должна объединять все виды потерь энергии, в том числе на ядерные превращения частиц. Строго говоря, необходимо указывать, что рассматривается, допустим, тормозная способность среды относительно процесса ионизации и возбуждения электронами, и тогда недостаточно строгое применение термина устраняется [56].
При делении линейных потерь энергии на плотность вещества р получаем значение (—dE/dx^/p, которое не зависит от плотности. Эту величину тоже можно называть тормозной способностью вещества, или даже Л ПЭ, и тогда она измеряется в МэВ/см2 «г-1. Как видно из определения, величина ЛПЭ характеризует распределение энергии, переданной веществу, вдоль трека частицы. Зная ЛПЭ, легко определить среднее число ионов, образованных на единицу пути частицы. Для этого достаточно разделить значение ЛПЭ на величину энергии, необходимой для образования одной пары ионов (И). Отношение L/W называют линейной плотностью ионизации (ЛПИ).
Точное значение W тканей определить трудно. Для газов значение W было измерено многими исследователями, оно составляет около 34 эВ. Для приблизительной оценки плотности ионизации в конденсированных системах обычно используют соотношение:
ЛПИ = ЛПЭ/34 (пар ионов на мкм пути), (1.1) (здесь ЛПЭ в эВ/мкм). Чем выше значение ЛПЭ, тем больше энергии теряет частица на единицу пути, тем плотнее распределены создаваемые ею ионы вдоль трека.
- поглощенную дозу (дозу облучения), при поглощении энергии излучения в облучаемом объекте.
Таблица 1.1. Множители и приставки для образования десятичных кратных и дольных единиц и их обозначения
Множитель
Приставка
Обозначение
Русское
междунар.
ю18
экса
Э
Е
ю16
пета
п
Р
ю12
тера
т
Т
ю9
гига
г
G
106
мега
м
М
103
кило
к
к
ю2
гекто
г
h
ю1
дека
да
da
КГ1
деци
Д
d
10"2
санти
с
с
10"3
милли
м
m
10"6
микро
мк
Д
10"9
нано
и
n
10“12
ПИКО
и
Р
10“15
фемто
ф
f
Ю"18
атто
а
а
Единицы активности радионуклидов и доз радиации
Активность радионуклида
Количество радиоактивного вещества определяется не только его массой (в миллиграммах, граммах и т. д.), но и активностью, т. е. количеством атомных ядер, распадающихся в единицу времени. Поскольку скорости распадов разных радионуклидов не одинаковы, равные весовые количества радионуклидов имеют различную активность.
Активность (А) — мера радиоактивности какого-либо количества радионуклида, находящегося в данном энергетическом состоянии в данный момент времени:
(1-2)(1-2)dN
(1-2)
(1-2)
dt
Т аблица 1.2. Единицы активности радионуклидов и их соотношения
Физическая величина
Наименование единицы и ее обозначение
Соотношение между единицами
внесистемное
системное (СИ)
Активность нуклида
Ки (Ci)
Бк (Bq)
1 Ки = 3, 7 1010 Бк
1 Бк = 2, 7-10-11 Ки
Плотность радиоактивного загрязнения
Ки/км2 (Ci/km2)
кБк/м2 (kBq/m2)
1 Ки/км2 = 37 кБк/м2
1 кБк/м2 = 27-10-3 Ки/км2
где dN — ожидаемое число спонтанных ядерных превращений из данного энергетического состояния за промежуток времени dt.
Таким образом, активность — это физическая величина, характеризующая число распадов в единицу времени. Единицей активности в СИ служит Беккерель (Бк, Bq). Беккерель — это такая активность радионуклида, при которой в нем за 1 с происходит 1 акт распада: 1 Бк = 1 расп/с. Наиболее распространенной внесистемной международной единицей до введения системы СИ являлась единица Кюри (Ки, Ci). Такой активностью обладает 1 г радия 226Ra. 1 Ки = 3, 7 • 1010 Бк (табл. 1.2).
Концентрация активности радиоактивного вещества часто определяется величиной удельной Ат (или объемной Л у) активности, представляющей отношение активности (Л) радионуклида в исследуемом веществе к его массе (т) или объему (У). Например, удельная активность 222Rn в воздухе:
(1.3)
(1-4)
Для оценки радиоактивного загрязнения территории (плотности радиоактивного загрязнения), т. е. присутствия радиоактивных веществ на поверхности предметов, в почве, внутри материала или в другом месте в количестве, превышающем уровни, установленные ныне действующими «Нормами радиационной безопасности 1999 года» — НРБ-99, применяют величины радиоактивности, отнесенные к единице площади — Ки/км2 или кБк/м2 (табл. 1.2). В связи с тем, что единица Бк — величина незначительная, а Ки — подчас «громоздкая», удобно употреблять кратные или дольные их значения в соответствии с табл. 1.1. Например, единицы удельной концентрации обозначаются: кБк/кг, МБк/кг, ГБк/кг; мКи/т, мкКи/т и т.п., а объемной концентрации в жидкостях и газах — МБк/л, кБк/мл, нКи/см3 и т. д.
Таблица 1.3. Единицы экспозиционных доз ионизирующих излучений и их соотношения
Физическая
Наименование единицы и ее обозначение
Соотношение между
величина
внесистемное
системное (СИ)
единицами
Экспозиционная доза излучения
р
(R)
Кл/кг (C/kg)
1 Р = 2, 58-Ю"4 Кл/кг 1 Кл/кг = 3876 Р
Мощность экспозиционной дозы излучения
Р/с (R/s)
А/кг *) (A/kg)
1 Р/с = 2,58-10“4 А/кг
1 А/кг = 3876 Р/с
*) А/кг — ампер на килограмм. По мнению В. И. Иванова с сотрудниками [161, с. 5], такое обозначение единицы мощности дозы ошибочно: ампер — единица силы тока, а ни о каком токе здесь речь не идет. Правильно: «кулон на килограмм в секунду — Кл/(кг • с)».
Доза излучения (экспозиционная доза)
Для получения представления о количестве энергии ионизирующего излучения, падающей на объект за время облучения, измеряют величину экспозиционной дозы. Единицы ее измерения представлены в табл. 1.3 вместе с единицами физической величины, производной от дозы по времени — мощности дозы. Обратим внимание на размерность экспозиционной дозы — это заряд, возникающий в единице массы поглотителя (к этому вопросу мы еще вернемся при определении поглощенной дозы).
Экспозиционная доза (X) - это количественная характеристика ионизирующей способности рентгеновского или ^-излучения в воздухе (в диапазоне энергий излучения от десятков кэВ до 3 МэВ), измеренная по количеству образованных зарядов {пар ионов) в воздухе по формуле
X =(1.5)
ат где da — полный заряд ионов одного знака, возникающих в сухом воздухе при торможении всех вторичных электронов, образованных фотонами в малом объеме воздуха; dm — масса воздуха в этом объеме. Единица экспозиционной дозы в Международной системе единиц (СИ) выражается в Кулонах на килограмм воздуха — Кл/кг (C/kg). На практике все еще применяют установленную еще в 1928 г. Международной комиссией по радиологическим единицам (МКРЕ) внесистемную единицу Рентген — Р (R).
Для характеристики распределения во времени экспозиционной (а также и любой другой) дозы используют величину мощности дозы. Тогда расчет ведется на единицу времени (табл. 1.3).
Общая формула, связывающая величину экспозиционной дозы излучения X с активностью препарата А, представлена следующим
выражением:
X = AtKjR2, (1.6) где активность А выражается в мКюри, t — время облучения — в часах; К^ — у-постоянная данного изотопа — в Р/ч; расстояние от источника излучения до измеряемого объекта R — в см. При этом доза излучения будет выражена в рентгенах).
Доза облучения (поглощенная доза)
Хотя использование экспозиционной дозы учитывает полную потерю энергии излучения, но тогда неточно оценивается степень поражения объекта, поскольку лучевое повреждение вызывается энергией, поглощенной объектом; часть потерянной энергии излучения, пронизывая облучаемый объект и не испытывая поглощения, не оказывает на него действия. Например, при дозе излучения в воздухе в 1 Р энергия, поглощенная в воздухе, составляет 88 эрг/г, тогда как в мягких тканях животных 92-97 эрг/г, но только после того, как процессы рождения и поглощения вторичных электронов придут в равновесие. Практически это соблюдается далеко не всегда.
Эта трудность преодолевается, если перейти к понятию поглощенной дозы. Кроме этого для оценки действия тех или иных доз облучения на живые системы возникла необходимость учитывать не только поглощенную энергию рентгеновского и у-излучения, но и других видов радиации, а также функциональную специфику живого облучаемого объекта (его радиочувствительность). Доза поглощенная D — это величина энергии ионизирующего излучения, переданная веществу:
D = ^~, (L7) ат
где de — средняя энергия, переданная ионизирующим излучением веществу, находящемуся в элементарном объеме, a dm — масса вещества в этом объеме.
На пучке заряженных частиц (электроны, протоны и др.) поглощенная доза рассчитывается из следующего соотношения:
D = 1,602- 1(Г10ЬФ Гр, (1.8) где L — средняя Л ПЭ в единицах МэВ • г-1 см2, Ф — флюенс частиц, то есть отношение dN/dS, если dN — количество частиц, падающих на площадку dS см2. Множитель 1,602 • ПК10 численно равен заряду электрона, что понятно, если перевести энергию (МэВ) в систему СИ как 1 эВ = 1,602 • 10-19 Дж (нужно еще учесть множители 106 для
Таблица 1.4. Единицы поглощенных доз ионизирующих излучений и их соотношения
Физическая величина
Наименование единицы и ее обозначение
Соотношение между единицами
внесистемное
системное (СИ)
Поглощенная доза
рад (rad)
Гр (Gy)
1 рад = 1 -10—2 Гр 1 Гр = 100 рад
Мощность поглощенной дозы
рад/с (rad/s)
Гр/с (Gy/s)
1 рад/с = 1 -10—2 Гр/с 1 Гр/с = 100 рад/с
перевода из МэВ в эВ и 103 из кг в г; в показателе формулы (1.8) остается 19 — 6 — 3 = 10).
Энергия может быть усреднена по любому определенному объему, и в этом случае средняя доза будет равна полной энергии переданной объему деленной на массу этого объема. Единицы поглощенных доз радиации представлены в табл. 1.4. В Международной системе единиц (СИ) принята единица Грей (Гр, Gy), предложенная в честь английского физика-радиобиолога Луи Гарольда Грея. Один Грей — это поглощенная доза ионизирующего излучения любого вида, при которой в 1 кг массы вещества поглощается 1 Дж энергии излучения (1 Гр = 1 Дж/кг = 100 рад).
В лучевой терапии применяется также так называемая интегральная доза, т. е. энергия, суммарно поглощенная во всем объеме облучаемого объекта при локальном облучении.
Единицей СИ энергии ионизирующего излучения является Джоуль (Дж, J). Внесистемной международной единицей поглощенной дозы является рад (rad, «radiation absorbed dose»). 1 рад — это поглощенная доза любого вида ионизирующих излучений, при которой в 1 г массы вещества поглощается энергия излучения, равная 100 эрг (1 рад = 100 эрг/г = К)2 Дж/кг).
Мы уже заметили, что экспозиционная доза определена в рентгенах так, что она имеет физическую размерность удельного заряда (на единицу массы). Размерность поглощенной дозы другая — это величина энергии на единицу массы. Размерность третьего типа имеет интегральная доза, которая фактически сохраняет размерность энергии, а не дозы, в привычном смысле этого слова.
Доза для отдельных органов или тканей Вт рассчитывается как средняя поглощенная в них доза:
DT = — ттDT = — ттD dm,D dm,(1-9)(1-9)
DT = — тт
DT = — тт
D dm,
D dm,
(1-9)
(1-9)
где тт — масса органа или ткани, а D — поглощенная доза в элементе массы dm.
Методы дозиметрии
Объективные методы количественной оценки поглощенной энергии ионизирующих излучений разрабатываются специальной областью измерительной техники — дозиметрией ионизирующих излучений). Дозы ионизирующих излучений измеряются с помощью различных физических и химических методов: ионизационного, калориметрического, химического, люминесцентного, сцинтилляционного, твердотельного, трекового.
Рассмотрим принципы, лежащие в основе некоторых из перечисленных методов дозиметрии.
Метод ионизационной камеры
то ионизация, происходящая в такой полости,поглощенной в окружающем полость веществе,то ионизация, происходящая в такой полости,поглощенной в окружающем полость веществе,(1.10)(1.10)Z\m beZ\m beпоглощенная единицей массы вещества среды,поглощенная единицей массы вещества среды,Заряды ионов, образованные в газе, помещенном в поле электрического конденсатора, собираются на его электродах и создают электрический ток ионизационной камеры. Такой детектор может измерять поглощенную дозу на основании принципа Брэгга-Грея. Так, если среда пересекается пучком фотонов и в ней имеется небольшая полость, размеры которой достаточно малы по сравнению с пробегом возникающих электронов, связана с энергией, соотношением: где -— — энергия, Ат
то ионизация, происходящая в такой полости,поглощенной в окружающем полость веществе,
то ионизация, происходящая в такой полости,поглощенной в окружающем полость веществе,
(1.10)
(1.10)
Z\m be
Z\m be
поглощенная единицей массы вещества среды,
поглощенная единицей массы вещества среды,
окружающей полость; N — число пар ионов, образованных в единице массы полости; ш — средняя энергия, затрачиваемая на образование одной пары ионов в газе, которым заполнена полость. Величины Sm и Sq — массовые тормозные способности (в единицах МэВ • г-1 см2) соответственно среды и газа, которым заполнена полость. При измерениях на пучке быстрых нейтронов действует тот же принцип, только речь идет не о пробегах электронов, пересекающих полость, а о пробегах нейтронов.
Калориметрический метод
Этот метод основан на измерении количества тепла, создаваемого поглощенной энергией излучения.
Образец из углерода или воды с помещенным в него полупроводниковым детектором помещается в термостат и калибруется по току электрического нагревателя с помощью высокочувствительного электрометрического прибора. Выбор материала зависит от требований к эксперименту: вода по тканеэквивалентности лучше, чем графит, но возможность затраты части энергии излучения на электролиз требует особых предосторожностей. Так или иначе, калориметрический метод лучше других удовлетворяет требованиям так называемой абсолютной
дозиметрии. Нагрев тел чрезвычайно мал: так, доза 5 Гр повышает температуру тела только на 10-3 °C. Отсюда, кстати, понятно, что нагрев организма не определяет биологического действия излучений.
Необходимость измерять чрезвычайно малые изменения температуры ограничивает применимость метода лабораторными условиями.
Сцинтилляционный метод
Световой выход ряда веществ (сцинтилляторов) линейно зависит от поглощенной дозы в достаточно широком диапазоне доз. Такие вещества в сочетании с фотоэлектронным умножителем используют в качестве дозиметров. В каждом случае стараются максимально приблизить химический состав вещества-поглотителя и сцинтиллятора, т. е. сделать его «тканеэквивалентным».
Химические методы дозиметрии
Любую радиационно-химическую реакцию, выход которой зависит от дозы ионизирующего излучения, можно использовать для определения поглощенной дозы. Необходимо, чтобы такая реакция не зависела от мощности дозы, от плотности ионизации и могла происходить в системах, по составу близких к биологическим тканям. Тип выбираемой реакции определяется диапазоном измеряемых доз. Так, дозы более 106 Гр определяют по окрашиванию кристаллов и стекол, дозы от 104 до 105 Гр — по реакциям в жидкой фазе, дозы менее 104 Гр — по обесцвечиванию ряда красителей. В последнее время для дозиметрии в широком диапазоне доз (10-105 Гр) используется образование свободных радикалов в аланине, которые измеряются методом ЭПР (Л. А. Блюменфельд, А. Н. Тихонов, 1997).
Один из наиболее распространенных химических дозиметров — «дозиметр Фрике» — обеспечивает измерение доз в диапазоне 4400 Гр. Мерой поглощенной дозы служит концентрация соли трехвалентного железа, в которую при облучении водного раствора переходит соль двухвалентного железа. Применяются также цериевый, би- хроматный, хлорбензольный, щавелевокислотный, глюкозный и другие дозиметры.
Эквидозиметрия и концепция риска)
Несмотря на широкие возможности повышения точности методов дозиметрии, трудно установить связь между измеряемой физической величиной и ожидаемым радиационным эффектом. Для понимания механизмов этих эффектов еще предстоит узнать многое, чему посвящены другие главы учебника. Нельзя также составить представление о радиационном эффекте, не зная пространственного распределения поглощенной энергии, вида и энергии ионизирующего излучения и
других факторов, которые позволили бы определить эквивалент дозы с поправкой на действие излучения на ткани живого организма. Совокупность принципов и методов определения таких дозиметрических величин объединяется емким термином «эквидозиметрия», который впервые был введен И. Б. Кеирим-Маркусом (1980). Эквидозиметрия вводит нас в круг вопросов, позволяющих формулировать критерии безопасности обращения с источниками ионизирующих излучений. В задачи эквидозиметрии входит также создание аппаратуры для измерения эквивалентных доз. Поначалу это делалось на основе уже рассмотренных методов дозиметрии, а в настоящее время эту цель выполняют методы экспериментальной микродозиметрии, которые будут описаны в конце гл. III.
Качество излучения
Величина поглощенной дозы учитывает только энергию, абсорбированную облучаемым объектом, и не оценивает «качество излучения». Понятие качества излучения выражает его способность производить различные радиационные эффекты в зависимости как от сорта частиц, так и в первую очередь от его ЛПЭ. С возрастанием плотности ионизации меняется степень повреждения живых систем.
Из-за различия характера радиационного эффекта, зависимостей от состава излучения и временных характеристик процесса облучения и т. д., казалось бы трудно сводить качество излучения к одной только характеристике, допустим, к ЛПЭ. Однако во многих случаях это просто необходимо — сюда относится широкий круг проблем экологии, радиационной безопасности и защиты от излучений. Нередко нет возможности определить состав излучения и многие другие факторы, а обстоятельства требуют предвидеть или оценить эффекты хотя бы в среднем.
Поэтому в целях противорадиационной защиты используются не конкретные значения биологической эффективности того или иного действия излучений, (в этом нам еще предстоит разбираться в дальнейшем), а так называемый коэффициент качества (КК, quality factor) излучения. Такой «фактор качества» (ныне принято выражать его в виде «взвешивающих коэффициентов») является регламентированной величиной, его значения определены специальными комиссиями и включены в международные и национальные нормы, предназначенные для контроля радиационной опасности. КК зависит только от интервала значений ЛПЭ, а его детализация в виде взвешивающих коэффициентов зависит также от того, какой орган или часть тела подвергается облучению.
Существует два типа взвешивающих коэффициентов. Первый Wr предназначен для учета ЛПЭ излучений в целом (табл. 1.5).
Основным в дозиметрии ионизирующих излучений является выражение дозы в терминах эквивалентной дозы Hrr — поглоиценной
Таблица 1.5. Значения взвешивающих коэффициентов Wr для отдельных видов ионизирующих излучений при расчете эквивалентной дозы
Ионизирующие излучения
Wk
1.
Фотоны любых энергий
1
2.
Электроны и мюоны любых энергий
1
3.
За.
Нейтроны с энергиями: менее 10 кэВ
5
36.
от 10 кэВ до 100 кэВ
10
Зв.
от 100 кэВ до 2 МэВ
20
Зг.
от 2 МэВ до 20 МэВ
10
Зд.
Более 20 МэВ
5
4.
Протоны с энергиями более 2 МэВ, кроме протонов отдачи
5
5.
ct-частицы, осколки деления, тяжелые ядра
20
в органе или ткани дозы, умноженной на соответствующий взвешивающий коэффициент для данного вида излучения Wr:
Ht.r = WrDt.r,(Ы1)
где Dr r — средняя поглощенная доза в органе или ткани Т, a Wr — взвешивающий коэффициент для излучения типа R (тип ткани Т в этом случае не учитывается). Таким образом, взвешивающие коэффициенты для отдельных видов ионизирующих излучений учитывают относительную эффективность радиации в индуцировании биологических эффектов и используются в расчетах радиационной защиты.
При воздействии различных видов излучения эквивалентная доза определяется как сумма эквивалентных доз для этих видов излучения с их взвешивающими коэффициентами:
Нт = ^2 HT.R.(1.12)
R
В международной системе единиц СИ для эквивалентной дозы принята специальная единица Зиверт (Зв, Sv), названная по имени известного шведского специалиста в области дозиметрии и радиационной безопасности Рольфа Максимилиана Зиверта. Как и для поглощенной дозы, его эквивалентом является 1 Дж/кг. Внесистемной международной единицей эквивалентной дозы является бэр (биологический эквивалент рада). 1 Зв = 100 бэр.
Приведем в табл. 1.6 единицы эквивалентных доз и их соотношения.
Таблица 1.6. Единицы эквивалентных доз ионизирующих излучений и их соотношение
Физическая величина
Наименование единицы и ее обозначение
Соотношение между единицами
внесистемное
системное (СИ)
Эквивалентная доза
бэр (rem)
Зв (Sv)
1 бэр = 1 -10—2 Зв 1 Зв = 100 бэр
Мощность эквивалентной дозы
бэр/с (rem/s)
Зв/с (Sv/s)
1 бэр/с = 1 -10—2 Зв/с 1 Зв/с = 100 бэр/с
Эффективная доза облучения
При общем однократном облучении организма разные органы и ткани (а в клетке — органеллы, макромолекулы) обладают различной чувствительностью к действию радиации. Так, при одинаковой эквивалентной дозе риск генетических повреждений наиболее вероятен при облучении репродуктивных органов. Риск возникновения рака легких при воздействии, например, а-излучения радона в равных условиях облучения более вероятен по сравнению, например, с раком кожи и т. и. Поэтому понятно, что дозы облучения отдельных элементов живых систем также следует рассчитывать с учетом еще одного типа взвешивающих коэффициентов Wt для оценки радиочувствительности биологических систем (табл. 1.7).
Эффективная доза Е — это величинаиспользуемая как мера риска возникновения отдаленных последствий облучения всего тела человека и отдельных его органов и тканей с учетом их радиочувствительности. Она представляет сумму произведений эквивалентной дозы в органах и тканях на соответствующие взвешивающие коэффициенты:
Е = ^ WTHT,(1.13)
Т
где Нт — эквивалентная доза в органе или ткани Т, Wt — взвешивающий коэффициент для органа или ткани Т.
Эффективные дозы измеряются так же, как и эквивалентные, в бэрах и зивертах.
Ожидаемые индивидуальные дозы
Применяются также эквивалентная Нт^ и эффективная Е(т) дозы, ожидаемые при внутреннем облучении за время т, прошедшее после поступления радиоактивных веществ в организм:
Нт^ = Нт^ dt(1.14)
to
Таблица 1.7. Значения взвешивающих коэффициентов Wt для разных органов и тканей при расчете эффективной дозы
Органы и ткани
WT
Органы и ткани
Wt
Гонады
0,20
Печень
0,05
Костный мозг (красный)
0,12
Пищевод
0,05
Тонкая кишка
0,12
Щитовидная железа
0,05
Легкие
0,12
Кожа
0,01
Желудок
0,12
Клетки костных поверхностей
0,01
Мочевой пузырь
0,05
Грудная железа
0,05
Остальное
0,05 *)
*) При расчетах учитывается, что «остальное» включает надпочечники, головной мозг, экстраторакальный отдел органов дыхания, тонкую кишку, почки, мышечную ткань, поджелудочную железу, селезенку, вилочковую железу и матку. В тех исключительных случаях, когда один из перечисленных органов или тканей получает эквивалентную дозу, превышающую самую большую дозу, полученную любым из двенадцати органов или тканей, для которых определены взвешивающие коэффициенты, следует приписать этому органу или ткани взвешивающий коэффициент, равный 0,025, а оставшимся органам или тканям из рубрики «Остальное» приписать суммарный коэффициент, равный 0,025.
и
Е^т) =^WtHtH,(1.15)
т
где to — момент поступления, а H^t) — мощность эквивалентной дозы к моменту времени t в органе или ткани Т. Когда т не определено, то его принимают равным 50 лет для взрослого человека и 70 — to для ребенка.
Иногда в радиобиологических расчетах ожидаемых индивидуальных доз используют так называемую эффективную годовую дозу, представляющую собой сумму эффективных доз внешнего облучения, полученных за календарный год, и ожидаемой эффективной дозы внутреннего облучения, обусловленной поступлением в организм радионуклидов за этот же год.
Концепция риска облучения
Ионизирующие излучения являются одним из множества источников риска для здоровья человека.
Следует различать два вида этого риска: в случае, когда речь идет о непосредственном вреде, наносимом организму человека и проявляющемся при той или иной патологии; можно говорить о соматическом действии излучения, которое может возникать как при остром, так и при хроническом облучении в больших дозах. Но опасность представляют и относительно малые дозы, когда облучению подвергаются
те или иные контингенты населения и можно опасаться накопления генетических последствий, или популяционных эффектов у будущих поколений.
Однако популяционные эффекты свойственны не только «населению» в целом, но и клеточным популяциям внутри отдельного организма. Для того, чтобы различать эти варианты, необходимо иметь в виду прежде всего конкретные проявления действия радиации на живые клетки и организм, что и интересует в первую очередь биологов. Сначала рассмотрим эти вопросы, а затем перейдем к подходам, когда концепции «генетического» характера могут ставиться на первое место (но не только они), что определяется нормативными документами радиационной безопасности, которые выработаны для радиационной защиты и безопасности персонала установок и населения.
Основными документами, как и входящими в законодательство многих стран, в России являются «Нормы радиационной безопасности» — НРБ-99 [38] и соответствующие им санитарные правила ОСПРБ-99 [42]. Именно обеспечение мер радиационной безопасности и научное обоснование необходимых для этого средств и методов и является конечной целью дозиметрии ионизирующих излучений, рассмотренной в этой главе.
Представленная в ней многоступенчатая иерархия измерений радиоактивности, доз излучения и облучения отражает логическую цепь последовательно развивающихся во времени и пространстве событий, начинающихся с момента эмиссии ионизирующей радиации и затем включающих поглощение энергии излучений единицей массы облучаемого объекта, эффекты, зависящие от вида радиации, и, что не менее важно, от радиобиологического эффекта, т. е. от чувствительности живой системы к ионизирующим излучениям.
И еще один аспект всегда учитывается при количественной оценке лучевых воздействий. Оказывается, мало знать только активность источника излучения и величину поглощенных доз облучения. Для оценки степени поражения живого объекта не менее важен учет характера, способа его облучения, т. е. распределение поглощенной энергии во времени и пространстве.
Так при облучении организма различают: кратковременное и длительное; однократное и многократное (фракционированное, дробное); обицее и локальное; равномерное и неравномерное; внешнее и внутреннее (инкорпорированное), острое и хроническое облучения.
Например, в биологическом плане важно знать не только дозу, которую получил объект, но и дозу, отнесенную к единице времени, т. е. мощность дозы, интенсивность самого облучения. Известно, что при летальных дозах чем больше мощность дозы, тем с большей скоростью возрастает доза облучения, а выживаемость биологических объектов снижается. Обнаружено, что при высокой мощности дозы облучения репарирующая активность биологических систем не успевает проявиться в полной мере.По временному критерию все виды общих облучений можно разделить на три разновидности: кратковременное (острое), протяженное (пролонгированное) и хроническое.
4 Ю. Б. Кудряшов
Кратковременным (острым) облучением считают такое лучевое воздействие, при котором поражающую дозу организм получает за короткий промежуток времени, исчисляемый минутами. В радиобиологических исследованиях это требование в отношении у- и рентгеновских излучений может быть реализовано в условиях внешнего общего равномерного облучения мелких лабораторных животных при мощности дозы 0,15-5,0 Гр/мин., а крупных животных — 0,2-6,0 Гр/мин. Однако конкретные величины мощности дозы, при которых начинает сказываться зависимость биологического эффекта от этих показателей, будут в определенной степени условными, так как они зависят не только от процессов степени восстановления систем, но и от других биохимических и физиологических особенностей облучаемых организмов.
Протяженное (пролонгированное) облучение — это такое лучевое воздействие, при котором облучение животных в абсолютно летальной дозе (LDioo) длится от нескольких часов до нескольких суток. Протяженные воздействия могут осуществляться с постоянной или переменной мощностью дозы.
Хроническая лучевая болезнь развивается при суммарных дозах поглощенной энергии 0,7-1,0 Дж/кг и мощности дозы излучения 0,001-0,005 Дж/кг за одни сутки. Лучевая болезнь возникает и при длительном локальном или неравномерном облучении.
В международных документах, в том числе и в нашем национальном НРБ-99, все эффекты, не имеющие генетического (популяционного) или канцерогенного свойства, получили название «детерминированных». В том же смысле, как и в Нормах, термин употреблять начали в лучевой терапии. Поэтому ранние реакции на облучение, когда процессы восстановления клеток еще не так сильно выражены, тоже оказываются более стохастическими, чем поздние реакции).
Детерминированными) называют клинически выявляемые биологические эффекты, когда предполагается существование порога, ниже которого эффект отсутствует, а выше — зависит от дозы.
Эффекты излучения стохастические — это биологические эффекты, не имеющие дозового порога возникновения, когда лучевые изменения, в частности тяжесть их проявления, не зависят от дозы. При радиозащитных оценках вероятность их возникновения предполагается пропорциональной дозе.
Таким образом, чтобы избежать вредного действия радиации, приходится учитывать любые возможные лучевые последствия и только разумно выбрать нижнюю границу для них. В качестве такой
Таблица 1.8. Основные пределы доз
Нормируемые величины
Пределы доз
Персонал (группа А)
Население
Эффективная доза
20 мЗв в год в среднем за любые последовательные 5 лет, но не более
50 мЗв/год
1 мЗв в год в среднем за любые последовательные 5 лет, но не более
5 мЗв/год
Эквивалентная доза за год в: хрусталике глаза, коже, кистях и стопах
150 мЗв
500 мЗв
500 мЗв
15 мЗв
50 мЗв
50 мЗв
границы в настоящее время выбран предел дозы (ПД). Так называется величина годовой эффективной или эквивалентной дозы техногенного облучения, которая не должна превышаться в условиях нормальной работы. Соблюдение годового ПД предотвращает возникновение детерминированных эффектов, а вероятность стохастических эффектов сохраняется на приемлемом уровне исключения возможности их появления на действующем фоне естественной радиоактивности и других экологических факторов. Для технического персонала, работающего в сфере действия источников ионизирующих излучений, из-за его относительной малочисленности накопление популяционных эффектов намного менее вероятно, чем для населения в целом. Поэтому НРБ-99 устанавливают различные пределы доз для персонала и населения. Имеется в виду, что персонал — это две группы лиц: работающие с техногенными источниками излучения (группа А) и находящиеся по условиям работы в сфере их воздействия (группа Б). Понятно, что все лица, включая и персонал, вне работы с источниками излучения условно относятся к категории «населения».
Естественно, более высокий предел дозы устанавливается для работников атомной промышленности, или, если выражаться более точно, для персонала группы А. Для группы Б все пределы доз установлены ровно вчетверо меньше, чем для группы А. Для населения — уже в 10-20 раз. Более точные значения приводятся в табл. 1.8.
Таким образом, при общем хроническом облучении организм может временно подвергаться воздействию ионизирующих излучений в дозах, превышающих предел дозы, достигающий для персонала группы А 50 мГр/год (по прежним нормам это допускалось при любом сроке воздействия). Однако в период постоянного длительного облучения это должно быть скомпенсировано так, чтобы в среднем за любые последовательные 5 лет доза не превысила нормы 20 мЗв в год. В этом состоит существенное ужесточение современных норм радиационной безопасности от действовавших прежде.
В Нормах уделено внимание и природным источникам излучения: излучению изотопов радона и продуктов их распада в воздухе помещений, природных радионуклидов в питьевой воде и т.п. Если эффективная доза не превышает 2 мЗв в год, то облучение не превышает средних значений доз, допустимых для населения страны от природных источников. Как и при техногенном облучении, высоким считается уровень облучения более 5 мЗв/год.
Известная радиофобия у части населения многих стран не признает никаких дозовых пределов. Однако уже приведенные нами выдержки из действующих норм оценки радиационной опасности позволяют понять, что принятые уровни допустимой техногенной, медицинской и природной лучевой нагрузки являются глубоко продуманными. Само собой разумеется, что ориентация норм на генетическую защиту от облучения заведомо учитывает и любую соматическую опасность.
Выше приводились две цифры: для населения вообще допускается предел дозы 1 мЗв/год по техногенным источникам, а при рентгеновских обследованиях — 2 мЗв/год. Кажущееся противоречие устраняется, если вспомнить, что эти обследования резко ограничиваются в двух случаях: для женщин в репродуктивный период и для детей. Соматическая опасность облучения этих двух контингентов значительно возрастает. В то же время очевидно, что при обычной техногенной нагрузке эту часть населения специально оградить от дополнительного облучения невозможно. Впрочем, ряд изменений сделан и в этом направлении: совсем недавно положение было иным — до принятия новых норм радиационной безопасности в 1999 году предельно допустимая доза (ПДД) была в 2,5 раза более высокой, чем ПД в настоящее время.
Необходимо подчеркнуть, что в рамках эквидозиметрии мы можем пользоваться только физическим подходом к определению заведомо усредненных факторов риска облучения, выводя за скобки конкретные биологические данные. По сравнению с обычной дозиметрией, эквидозиметрия делает шаг вперед — пользуется концепциями риска облучения, вводит усредненные факторы популяционного характера и т. п. Но нельзя забывать, что вводимые ею понятия типа эквивалентной дозы представляют собой прежде всего физические, а не биологические величины, так как непосредственные измерения в эквидозиметрии выполняются только физическими методами. Биологический результат входит в них как абстрактная формула, касающаяся в данном случае, «по определению», только вредного действия ионизирующей радиации, хотя уже хорошо известно, что к этому нельзя свести все процессы, происходящие в организме под действием облучения.
Подробно вопросы о лучевом поражении человека, животных и растительных организмов специально не рассматриваются в данном учебнике. Однако следует подчеркнуть чрезвычайно важное значение динамических, биологических свойств облучаемых организмов,
их репаративную способность, наличие компенсаторных структурнофункциональных механизмов ответа на любые повреждающие воздействия, включая действие ионизирующих излучений.
Кроме того, известно влияние мощности дозы, в зависимости от которой меняется скорость восстановительных процессов в биологических системах, особенности лучевых реакций на способы облучения при распределении поглощаемой энергии во времени и пространстве, зависимость эквивалентных и эффективных доз от радиочувствительности объектов. Все это говорит о том, что на строгие стандартные условия облучения следует стохастический биологический ответ, многогранность которого, как мы увидим, будет сказываться все в большей степени по мере усложнения организации живой системы.
Глава II
ПОГЛОЩЕНИЕ ЭНЕРГИИ ИОНИЗИРУЮЩИХИЗЛУЧЕНИЙ
Общий принцип Гроттгуса.
Дискретный характер поглощения энергии ионизирующихизлучений
Прохождение через вещество фотонов рентгеновского или 7- излучения, потока нейтронов, электронов или ускоренных ядер элементов может привести к поглощению части энергии этим веществом. При облучении живой материи мы наблюдаем биологические последствия радиационного воздействия. Тестируемый биологический эффект — результат поглощения энергии излучения атомами и молекулами, составляющими клетки и ткани. Иначе говоря, в радиобиологии выполняется общий принцип Гроттгуса, согласно которому только та часть энергии излучения может вызвать изменения в веществе, которая поглощается этим веществом*, энергия отраженного или проходящего сквозь вещество излучения не оказывает действия. Именно в силу этого принципа возникает различие, с одной стороны, между экспозиционной и поглощенной дозами и с другой стороны — между удельными потерями энергии и ЛПЭ, о чем говорилось в предыдущей главе. Разница между потерянной и поглощенной энергией излучения бывает достаточно велика для того, чтобы говорить о нарушении равновесия между образованием и поглощением вторичных электронов в среде, облученной 7-квантами.
Принцип Гроттгуса учитывается при построении дозного распределения излучения (или, как говорят, дозного поля), которое осуществляют лучевые терапевты, чтобы на изображении анатомического среза тела больного определить область мишени (например, злокачественной опухоли) и совместить ее границы с выбранной, обычно 90%-ной, изодозой. Под изодозой понимают линии, проведенные через точки с одинаковой поглощенной дозой в гомогенной или гетерогенной среде (макроскопическом смысле этих понятий).
Радиационная биофизика учитывает и более глубокие различия в распределении энергии в веществе, которые также связаны с принципом Гроттгуса. При прохождении ионизирующих излучений в веществе выделение энергии происходит лишь в отдельных, редко расположенных микрообъемах, так как обмен энергией между излучением и атомами поглотителя носит дискретный вероятностный характер.
Во многих облучаемых областях излучение вообще не передает энергию веществу. Эти области, следовательно, «не знают» о том, что облучение имело место, и испытывают лишь вторичное воздействие измененных структур, поглотивших энергию.
Вероятностный характер поглощения энергии приводит к необходимости описания ряда радиационных величин в терминах статистики. Статистические флуктуации радиационных величин существенны, следовательно, действие излучения должно определяться фактическими, а не средними значениями (математическим ожиданием) соответствующих величин. Поэтому стохастические величины рассматриваются в радиобиологии наряду с нестохастическими.
«Энергетический парадокс» в радиобиологии
Пользуясь количественными методами дозиметрии, можно установить зависимость между величиной поглощенной энергии и выраженностью биологического эффекта облучения, например, определить минимальную поглощенную дозу, вызывающую гибель различных организмов.
Установлено, что при внешнем общем однократном и равномерном облучении поглощение ионизирующей радиации в дозе 7-10 Гр достаточно для возникновения острой формы лучевой болезни и последующей гибели млекопитающих, в том числе и человека.
Согласно определению, доза в 1 Гр соответствует поглощению 1 Дж энергии 1 кг ткани. Следовательно, смертельная для млекопитающих доза общего облучения в 10 Гр ионизирующей радиации приводит к поглощению одним граммом ткани 105 эрг энергии излучения. Удивительно, что столь незначительная порция энергии вызывает фатальные последствия для организма. Если такое же количество энергии сообщить ткани не в виде потока ионизирующих частиц, а квантами теплового (инфракрасного) излучения, то регистрируемым результатом воздействия будет незначительное повышение температуры тела — всего менее, чем на 0,002 °C. Естественно, что такое повышение температуры тела никак не может повлиять на состояние организма. Этот «энергетический парадокс» указывает на кажущееся глубокое несоответствие между количеством энергии, теряемой в тканях ионизирующим излучением, и теми биологическими последствиями, к которым приводит облучение.
Следовательно, в самом факте поглощения дозы ионизирующей радиации и ее величине нет никаких сведений о причинах необыкновенно высокой биологической эффективности ионизирующих излучений. Для понимания их надо начать с рассмотрения элементарных физических процессов, в результате которых осуществляется передача энергии ионизирующих излучений атомам и молекулам вещества, чтобы затем установить их значение для процессов, происходящих в биологических средах.
Относительная биологическая эффективность (ОБЭ)разных видов ионизирующих излучений
На различных биологических объектах проводилось сопоставление эффективности различных типов ионизирующих частиц. В опытах на млекопитающих критерием эффективности служило летальное действие излучений и различные отдаленные эффекты, такие как появление лучевых катаракт и злокачественных опухолей, снижение продолжительности жизни. При облучении клеточных суспензий оценивали выживаемость клеток при действии радиации в одинаковых дозах, сообщенных различными типами ионизирующих частиц, подсчитывали число индуцированных облучением хромосомных аберраций и мутаций.
Эти и другие эксперименты позволили количественно оценить эффективность различных видов ионизирующих излучений и ввести коэффициент, который для каждой конкретной биологической системы показывает эффективность данного типа излучения по сравнению с выбранным стандартным излучением — 'коэффициент относительной биологической эффективности (ОБЭ). ОБЭ определяется из соотношения, начальная часть которого показывает, как осуществляется переход от «абсолютной» биологической эффективности (такой термин редко употребляется) к ее относительной величине:
биологическаяэффективностьисследуемогоизлучениябиологическаяэффективностьрентгеновскогоизлучения сгеогией « 200 кэВбиологическаяэффективностьисследуемогоизлучениябиологическаяэффективностьрентгеновскогоизлучения сгеогией « 200 кэВОБЭ =ОБЭ =поглощенная доза, необходимая дляполучения данного биологическогоэффекта при действии рентгеновскогоизлучения 200 кэВ (в греях)
биологическаяэффективностьисследуемогоизлучениябиологическаяэффективностьрентгеновского
излучения с
геогией « 200 кэВ
биологическаяэффективностьисследуемогоизлучениябиологическаяэффективностьрентгеновского
излучения с
геогией « 200 кэВ
ОБЭ =
ОБЭ =
поглощенная доза исследуемогоизлучения, необходимая для получениятого же биологического эффекта
(в греях)
Как видно из определения, в данном случае в качестве стандартного выбрано рентгеновское излучение с энергией квантов 200 кэВ, которое образует примерно 100 пар ионов на 1 мкм пути в воде. Для такого излучения ОБЭ принимают равной единице. Необходимо отметить, что иногда в качестве эталона вместо рентгеновского принимается излучение источника 60Со, что приводит к некоторым
неучтенным различиям в ОБЭ.
Для каждой изучаемой системы коэффициент ОБЭ находят путем сопоставления эффектов исследуемого и стандартного излучений, примененных в одинаковой дозе. При этом необходимо учитывать, что значение ОБЭ может изменяться в зависимости от условий облучения, например, от того, однократно или дробно поглощалась объектом определенная доза излучения, а также от мощности дозы. Желательно, чтобы сравниваемые виды излучения имели сходную «картину действия» на выбранную тест-систему.
В качестве примера рассмотрим результаты одного из экспериментов по определению ОБЭ нейтронов по критерию возникновения лучевой катаракты у мышей. Оказалось, что стандартное рентгеновское излучение в дозе 8 Гр приводило к появлению катаракты у 50% мышей. Такой же эффект достигался в результате нейтронного облучения (0,5 МэВ) в дозе 2 Гр. Коэффициент^ 1661 ОБЭ для этой системы равен четырем. Однако если облучение в той же дозе производили отдельными фракциями, то коэффициент ОБЭ значительно возрастал.
Характерная зависимость ОБЭ от Л ПЭ излучения графически представлена на рис. II. 1. Из рисунка видно, как в широком диапазоне ЛПЭ излучений (от 0,2 до 100 кэВ/мкм) ОБЭ ионизирующих частиц
Рис. II. 1. Зависимость ОБЭ излучения от ЛПЭ по критерию выживаемости клеток почек человека в культуре: 1, 2, 3 — результаты облучения в дозах, при которых доля выживших клеток составляет соответственно 0,8, 0,1 и 0,01Рис. II. 1. Зависимость ОБЭ излучения от ЛПЭ по критерию выживаемости клеток почек человека в культуре: 1, 2, 3 — результаты облучения в дозах, при которых доля выживших клеток составляет соответственно 0,8, 0,1 и 0,01растет по мере увеличения ЛПЭ. Таким образом, экспериментально установлена ведущая роль плотности распределения ионов вдоль пути ионизирующей частицы для эффективности биологического действия радиации.
Рис. II. 1. Зависимость ОБЭ излучения от ЛПЭ по критерию выживаемости клеток почек человека в культуре: 1, 2, 3 — результаты облучения в дозах, при которых доля выживших клеток составляет соответственно 0,8, 0,1 и 0,01
Рис. II. 1. Зависимость ОБЭ излучения от ЛПЭ по критерию выживаемости клеток почек человека в культуре: 1, 2, 3 — результаты облучения в дозах, при которых доля выживших клеток составляет соответственно 0,8, 0,1 и 0,01
При значениях ЛПЭ выше 90-100 кэВ/мкм кривая зависимости ОБЭ от ЛПЭ на рис. II. 1 проходит максимум и снижается. Вероятно, это связано с тем, что уже при значении ЛПЭ 100 кэВ/мкм в клетке возникает «критическое» число ионизаций, доста-
точное для ее гибели. Дальнейшее увеличение плотности ионизации неэффективно.
Таким образом, в радиобиологических экспериментах возможно использование излучений с различной величиной ЛПЭ, а следовательно и ОБЭ. Для этого необходимо выбирать ионизирующие частицы с определенным зарядом и скоростью (т. е. энергией). Знание механизма взаимодействия ионизирующих частиц с атомами поглотителя позволяет судить о характере ионизации в облученном биологическом субстрате, что необходимо при использовании ионизирующих излучений
в радиотерапии при определении оптимальных режимов облучения различных биологических объектов и систем.
Механизмы процессов поглощения энергии излучений
Поглощение рентгеновского и 7-излучений
Рентгеновское излучение — это высокоэнергетическое коротковолновое (высокочастотное) электромагнитное излучение, которое может генерироваться при торможении ускоренных электронов в кулоновском поле ядер атомов вещества-поглотителя. В соответствии с законами электродинамики электрон, испытывающий торможение, теряет часть своей энергии за счет излучения; при энергии электрона выше 20 МэВ потеря энергии на излучение становится почти пропорциональной полной энергии электрона:
~ Z^Ek+mc^N, радиац~ Z^Ek+mc^N, радиац(ПЛ)(ПЛ)
~ Z^Ek+mc^N, радиац
~ Z^Ek+mc^N, радиац
(ПЛ)
(ПЛ)
Рис. II.2. Рентгеновская трубка: а) принципиальная схема включения трубки: источник высокого напряжения (U) включается между анодом (А) и катодом (Ку б) спектр излучения трубки с молибденовым антикатодомРис. II.2. Рентгеновская трубка: а) принципиальная схема включения трубки: источник высокого напряжения (U) включается между анодом (А) и катодом (Ку б) спектр излучения трубки с молибденовым антикатодом
Рис. II.2. Рентгеновская трубка: а) принципиальная схема включения трубки: источник высокого напряжения (U) включается между анодом (А) и катодом (Ку б) спектр излучения трубки с молибденовым антикатодом
Рис. II.2. Рентгеновская трубка: а) принципиальная схема включения трубки: источник высокого напряжения (U) включается между анодом (А) и катодом (Ку б) спектр излучения трубки с молибденовым антикатодом
где Е^ — кинетическая энергия электрона, Z — заряд ядра материала поглотителя, N — число атомов в 1 см3
поглотителя.
Из соотношения (II. 1) следует, что энергия квантов рентгеновского излучения примерно пропорциональна полной энергии электрона и находится в квадратичной зависимости от атомного номера материала поглотителя. Это учитывается при конструировании рентгеновских трубок (рис. II.2), в которых электроны приобретают большую кинетическую энергию при ускорении в электрическом поле, создаваемом за счет приложения высокого напряжения (сотни тысяч вольт) между катодом и анодом.
Анод изготовляют из материалов с большим атомным номером, так как именно в кулоновском поле атомов анода и происходит торможение ускоренных электронов. При бомбардировке анода электронами только 0,2% их кинетической энергии испускается в виде квантов рентгеновского излучения, остальная энергия рассеивается в виде тепла. Поэтому необходимо надежное охлаждение рентгеновских трубок.
Для некоторых экспериментальных исследований в качестве источника рентгеновского излучения используют ускорители — синхротроны, в которых электроны могут ускоряться до околосветовых скоростей. Искривление их траекторий в магнитном поле сопровождается так называемым синхротронным, или магнитотормозным излучением. Это излучение генерируется в узком конусе и направлено по касательной к траектории электрона в поле ускорителя. Благодаря высокой интенсивности такие пучки находят многие применения для научных исследований в ультрафиолетовой и мягкой рентгеновской области спектра.
д-излучение — это электромагнитное излучение с чрезвычайно малой длиной волны (меньше 1 А), возникающее при изменении энергетического состояния атомного ядра, распада элементарных частиц и аннигиляции пар частиц, характеризуется дискретным спектром, д- излучение появляется также при торможении ускоренных электронов в кулоновском поле ядер атомов — в этом случае это тормозное излучение со сплошным спектром.
Во многих биологических исследованиях в качестве источника д- излучения используют радиоактивный изотоп кобальта 60 Со (источник д-излучения с этим радионуклидом иногда называют «кобальтовой пушкой»); в этом случае д-кванты генерируются в процессе радиоактивного распада 60Со с превращением в 60Ni. Возбужденное ядро никеля переходит в стабильное состояние с последовательным испусканием двух квантов с энергиями 1,17 и 1,33 МэВ.
Рентгеновское и д-излучение по их физической природе относят к высокочастотным (коротковолновым) электромагнитным излучениям. Частота их квантов и, соответственно, энергия в десятки и сотни тысяч раз выше, чем у квантов ультрафиолетового излучения. Используя различные источники, можно получить рентгеновские и д- кванты сравнимой энергии, которые будут оставлять в тканях одинаковое количество энергии и образовывать одно и то же число ионов на единицу пути.
Следовательно, различие этих двух видов излучения связано с происхождением: рентгеновские лучи генерируются при торможении ускоренных электронов в кулоновском поле ядер атомов, а д-излу- чение испускается возбужденными ядрами или возникает при аннигиляции частиц. Хотя, как видим, источники обоих видов излучений весьма отличны, по физическим параметрам они различаются только энергиями.
Ослабление интенсивности рентгеновского и д-излучения в веществе подчиняется закону
/ = /о e-NSI, (П.2)
где I и /0 — соответственно значения интенсивности излучения до и после их прохождения через слой толщиной 1; N — плотность частиц (число частиц в 1 см3 вещества); S — эффективное сечение, характеризующее вероятность процесса взаимодействия. Энергия квантов
б
в
Рис. II.3. Схема основных процессов поглощения энергии фотонов рентгеновского и у-излучения: а) фотоэффект; б) эффект Комптона; в) эффект образования электрон-позитронных пар
рентгеновского и у-излучения поглощается веществом в результате одного из следующих процессов (рис. II.3).
Фотоэлектрический эффект (фотоэффект) состоит в том, что квант излучения полностью передает энергию атому; этой энергии достаточно для того, чтобы атом испустил электрон (рис. II.3, а). Электрон, высвобожденный из атома в результате фотоэффекта, обладает запасом кинетической энергии, равным энергии падающего кванта hv за вычетом энергии связи электрона с соответствующим атомом или молекулой:
-Е'кин. электрона — ^^ ^связи* (П.З)
Вероятность фотоэффекта зависит от энергии падающего кванта и атомного номера поглощающей среды. Сечение процесса существенно зависит от Z заряда ядра атомов среды Z, и при одной и той же энергии фотонов возрастает как Zn, где и ^ 4-5. С ростом энергии
сечение уменьшается как Ет, где значение т понижается по мере возрастания энергии от трех (малые энергии) до единицы (высокие значения энергии). При этом сечение испытывает большие скачки при величине энергии фотона, равной энергии связи электрона в атоме.
Эффект Комптона можно рассматривать как результат упругого соударения кванта излучения с электроном (рис. II.3, б). При этом квант отдает электрону не всю энергию, а лишь некоторую ее часть, причем сам он продолжает движение в качестве рассеянного кванта в новом направлении и с меньшей энергией. В отличие от фотоэлектрона, комптон-электрон (его еще называют электроном отдачи) приобретает не всю энергию первичного кванта.
Коэффициентом комптоновского поглощения называется доля энергии, приобретенная электроном отдачи. Он определяется по формуле Клейна-Нишины:
„ 2 f 2(1 + а)21 + За , (1 + а)(1 + 2а — 2а2)
(п2(1 + 2п)(1 + 2а)2ц2(1 + 2Д2
тI чхт(I “Ь 2d) / ,(II.4) 3(1 +2а)3V а32а2а3 /V V
где те = е2/тс2 = 2,818 • 10-15 м — постоянная, так называемый «классический радиус электрона»; е — заряд электрона; m — масса электрона; с — скорость света; а = hvjmc^^ h = 6, 626 • 10-34 Дж • с = 6, 626 • 10 27 эрг • с — постоянная Планка; v — частота падающего кванта.
Определив величину ас для кванта определенной энергии и умножив этот коэффициент на число электронов, находящихся в 1 г ткани, получим величину комптоновского «поглощения» на 1 г ткани (так называемый «массовый коэффициент комптоновского поглощения»). Следует, однако, уточнить, что д-квант не поглощается, а меняет направление и энергию (в отличие от фотоэффекта) и может далее участвовать в процессе ионизации.
Как видно из табл. II. 1, электронный коэффициент комптоновского поглощения в ткани возрастает с увеличением энергии кванта излучения. Следовательно, с увеличением энергии падающих квантов увеличивается число комптоновских электронов и уменьшается число фотоэлектронов.
Таблица ПЛ. Электронные коэффициенты комптоновского поглощения
Энергия квантов hv^ кэВ
а = hv/mc2
Ос • 1025
Энергия квантов hv^ кэВ
а = hv/mc2
ас ■ 1025
5,108
0,01
0,0638
137,9
0,27
0,7812
25,54
0,05
0,2731
199,2
0,39
0,8793
45,98
0,09
0,4276
306,5
0,6
0,9562
76,62
0,15
0,5914
715,2
1,4
0,9711
Таблица II.2. Комптоновские и фотоэлектроны, возникающие в воде при воздействии рентгеновского и у-излучений
Длина волны А, А
Энергия квантов Е, кэВ
Вклад в полное число электронов для
фотоэффекта
комптон-эффекта
2,4265
5,108
0,994
0,006
0,4853
25,542
0,676
0,424
0,2696
45,975
0,195
0,805
0,1618
76,625
0,052
0,948
0,0899
137,92
0,010
0,990
0,0622
199,22
0,004
0,996
0,0404
306,50
0,001
0,999
В табл. II.2 представлены данные об относительном числе фото- и комптоновских электронов, образующихся в воде при воздействии рентгеновского и д-излучений.
В воде и биологических тканях поглощение излучения с энергией квантов более 300 кэВ в основном происходит за счет эффекта Комптона. В результате нескольких последовательных комптоновских взаимодействий энергия кванта снижается настолько, что он уже может полностью поглотиться в результате фотоэффекта.
Образование электрон-позитронных пар. Если энергия падающего кванта превышает 1,022 МэВ, становится возможным еще один тип взаимодействия — эффект образования пар. Электрон-позитрон- ные пары возникают в результате взаимодействия кванта излучения с кулоновским полем ядра. Квант высокой энергии, приближаясь к полю ядра атома, исчезает, и одновременно возникает пара элементарных частиц позитрон-электрон (рис. II.3, в): км —> е+ + е~.
Вся энергия падающего кванта используется на образование пары, причем энергия, равная 1,022 МэВ, всегда преобразуется в «массу покоя» элементарных частиц, а остаток — в их кинетическую энергию:
^кин. е- + ^кин. е+ = Им — 1, 022 МэВ. (П-5)
Суммарную кинетическую энергию пары можно условно разделить поровну между электроном и позитроном, но в действительности она зависит от углов разлета этих частиц.
Пролетающий через вещество позитрон испытывает взаимодействия с электронами среды, при этом происходит их аннигиляция. В результате образуется д-квант, способный передать энергию веществу за счет комптоновского и фотоэффекта, а также ядро отдачи, которое обязательно получает свою порцию энергии за счет действия закона сохранения энергии. Вероятность рождения пары электрон-позитрон увеличивается с ростом энергии кванта и пропорциональна Z2. В биологических системах этот эффект выражен слабо, так как средний эффективный атомный номер Z имеет малые значения.
Рис. II.4. Относительная частота образования электронов и пар фотонами в углероде: 1 — фотоэффект; 2 — комптоновский эффект; 3 — образование парРис. II.4. Относительная частота образования электронов и пар фотонами в углероде: 1 — фотоэффект; 2 — комптоновский эффект; 3 — образование парОтносительная частота трех перечисленных процессов поглощения веществом квантов ионизирующего излучения показана на рис. II.4. Как видно из рисунка, кванты с энергией 10-100 кэВ в биологических тканях поглощаются преимущественно за счет фотоэффекта; в диапазоне энергий 0,3-10 МэВ основной тип взаимодействия — эффект Комптона, а при энергиях квантов более 10 МэВ начинает преобладать эффект образования пары
Рис. II.4. Относительная частота образования электронов и пар фотонами в углероде: 1 — фотоэффект; 2 — комптоновский эффект; 3 — образование пар
Рис. II.4. Относительная частота образования электронов и пар фотонами в углероде: 1 — фотоэффект; 2 — комптоновский эффект; 3 — образование пар
электрон-позитрон. Аннигиляция пары приводит к образованию двух д-квантов с энергией 0,511 МэВ (рис. II.3). Проходя через вещество, они теряют свою энергию в результате комптоновского рассеяния и фотоэффекта. Поэтому в дальнейшем мы ограничимся рассмотрением характера взаимодействия с веществом фото- и комптоновских элек-
тронов.
Поглощение квантов электромагнитного излучения высокой энергии приводит к возникновению в веществе небольшого числа атомов, утративших электроны. Эта первичная ионизация — следствие фото- и комптоновского эффектов. Высвободившиеся электроны обладают огромным запасом кинетической энергии (к ним перенесена большая часть энергии падающего кванта) и могут многократно взаимодействовать с атомами и молекулами, отдавая энергию на их ионизацию и возбуждение. Так продолжается до тех пор, пока энергия свободного электрона не снизится до того минимального уровня, при котором электрон уже сможет присоединиться к нейтральному атому с образованием отрицательного иона.
Каждый первичный электрон от момента своего рождения до захвата нейтральным атомом или молекулой многократно взаимодействует с атомами, расположенными вдоль направления его движения, генерируя большое число вторичных электронов. Распределение энергии вторичных электронов точно может быть рассчитано лишь для атома водорода. Для более сложных молекул возможны лишь качественные рассуждения (подробнее см. гл. IV). В среднем около 70% энергии первичных электронов переносится к вторичным электронам, обладающим энергией, достаточной для того, чтобы индуцировать дальнейшую ионизацию. Остальные 30% энергии первичного электрона расходуются на возбуждение молекул и высвобождение электронов с «нулевой» кинетической энергией. Незначительная доля энергии затрачивается на тормозное излучение. Следовательно, перенос веществу энергии квантов излучения осуществляют главным образом высокоэнергетические вторичные электроны.
Первичная ионизация при действии рентгеновского или д-излу- чения пренебрежимо мала по сравнению с тем количеством ионизированных и возбужденных атомов, которое возникает в результате
взаимодействия вторичных электронов с веществом. Поэтому фотоны рентгеновского и д-излучения следует относить к косвенно ионизирующим частицам, высвобождающим в веществе непосредственно ионизирующие частицы — высокоэнергетические вторичные электроны.
Поглощение нейтронного излучения
Нейтронное излучение представляет собой поток элементарных частиц с массой 1,0087 атомной единицы и нулевым зарядом. Нейтронное излучение в зависимости от энергии частиц подразделяется на группы: быстрые, промежуточные и медленные нейтроны.
Вследствие электронейтральности нейтроны не взаимодействуют с кулоновскими полями атомов и молекул и могут проходить в веществе значительные расстояния, не отклоняясь от первоначального направления. Нейтрон, не имея заряда, тем не менее вызывает ионизацию атомов и молекул. Происходит это за счет косвенных эффектов, связанных со следующими типами взаимодействия нейтронов с ядром атома.
Упругое рассеяние — результат соударения нейтрона с ядром атома. Кинетическая энергия нейтрона распределяется между ним и «ядром отдачи» согласно уравнению:
Е = Ен cos2 9, (П.6) 1+тн/М н ’ v 7
где тн и Ен — масса и энергия нейтрона, М и Е — масса и энергия ядра отдачи, 9 — угол между направлением движения падающего нейтрона и ядра отдачи. Из уравнения (II.6) следует, что ядру отдачи передается максимальная энергия, если это ядро имеет минимальную массу М. Значит, в результате упругого рассеяния наибольшее количество энергии нейтронного излучения поглощает водород (М = 1). Поэтому для экранирования нейтронных источников используют не свинец, а материал, богатый водородом, например парафин.
Биологические ткани богаты водородом, следовательно, в результате нейтронного облучения в них появляются ядра водорода, обладающие значительным запасом кинетической энергии — так называемые «протоны отдачи». Эти протоны, обладая электрическим зарядом, могут взаимодействовать с электронными оболочками атомов, вызывая ионизацию. Упругое рассеяние нейтронов в тканях можно рассматривать как способ генерирования в глубине биологического объекта протонного излучения.
В биологических тканях нейтроны с энергией от 20 до 0,5 МэВ передают протонам отдачи соответственно от 78 до 96% своей энергии.
Неупругое рассеяние нейтронов состоит в том, что часть их энергии идет на сообщение ядру запаса кинетической энергии, а часть — на возбуждение ядра. Возбужденное ядро переходит
в основное состояние с испусканием одного или нескольких д- квантов. Неупругое рассеяние становится возможным при энергии нейтронов больше нескольких кэВ. В результате этого эффекта помимо непосредственно ионизирующих частиц (ядра элементов) в веществе возникают д-кванты, косвенное ионизирующее действие которых обсуждалось выше.
Радиационный захват нейтрона ядром. Этот эффект становится вероятным при низких значениях скоростей нейтронов. Согласно уравнению Ферми:
^(п,7) ~ 1/аМ ~ 1/^н5 (П-7) где Ен и гн — энергия и скорость нейтрона соответственно, а — эффективное сечение реакции, т. е. величина, количественно характеризующая вероятность взаимодействия нейтронов с ядром. В результате захвата нейтрона образуется короткоживущее высоковозбужденное ядро (его называют компаунд-ядром, или сложным ядром), которое переходит в стабильное состояние с испусканием д-квантов, протонов или a-частиц. При захвате нейтрона легкими ядрами, например ядром водорода, испускается д-квант с энергией 2,2 МэВ:
Д + in Д + 7. (П.8)
Если же нейтрон захватывается промежуточным или тяжелым ядром, то могут испускаться протоны или a-частицы. Так, в случае захвата нейтрона ядром азота образуется изотоп углерода 14 С и испускается протон с энергией 0,66 МэВ:
+ 'Д +Д (П.9)
Среди элементов, составляющих основную долю биологических тканей, наибольшее значение сечения реакции радиационного захвата медленных нейтронов установлено для водорода и азота. В результате этой ядерной реакции возникает высокоэнергетическое д- и протонное излучение. Соотношение каждого из перечисленных процессов поглощения нейтронного излучения зависит от энергии частиц. Если ткань облучают потоком быстрых или сверхбыстрых нейтронов, то вначале преобладает упругое соударение с выбиванием ядер отдачи. После нескольких упругих соударений энергия нейтронов снижается, и нейтрон переходит в разряд медленных. Теперь преобладающим становится процесс радиационного захвата с испусканием вторичного излучения. В конечном счете облучение ткани нейтронами приводит к появлению протонов отдачи, ускоренных ядер других элементов и д- излучения. Все эти продукты взаимодействия нейтронов с атомными ядрами могут вызывать значительную ионизацию в веществе.
Таким образом, ионизация поглотителя происходит косвенным путем. Нейтрон сам не в состоянии взаимодействовать с орбитальными электронами. Взаимодействие осуществляют быстрые заряженные частицы, высвобождаемые в веществе в результате поглощения кинетической энергии нейтронов. Это обстоятельство позволяет отнести нейтроны к разряду косвенно ионизирующих частиц и объединить их
5 Ю. Б. Кудряшов
по принципу действия в одну группу с фотонами рентгеновского и д-излучения.
Согласно принятому определению, косвенно ионизирующие частицы — это незаряженные частицы, которые могут высвобождать непосредственно ионизирующие частицы или вызывать ядерные превращения.
Рис. II.5. Характер ионизации вещества фотонами мягкого (а) и жесткого (б) рентгеновского и у-излучений: 1 — фотоэлектроны (выбиты рассеянным квантом): 2 — треки электронов отдачиРис. II.5. Характер ионизации вещества фотонами мягкого (а) и жесткого (б) рентгеновского и у-излучений: 1 — фотоэлектроны (выбиты рассеянным квантом): 2 — треки электронов отдачиИонизация в тканях косвенно ионизирующими частицами
Рис. II.5. Характер ионизации вещества фотонами мягкого (а) и жесткого (б) рентгеновского и у-излучений: 1 — фотоэлектроны (выбиты рассеянным квантом): 2 — треки электронов отдачи
Рис. II.5. Характер ионизации вещества фотонами мягкого (а) и жесткого (б) рентгеновского и у-излучений: 1 — фотоэлектроны (выбиты рассеянным квантом): 2 — треки электронов отдачи
Нейтронное, рентгеновское и д-излучение генерируют в веществе ионизации, пространственное распределение которых существенно отличается от такового при действии ускоренных заряженных частиц. Электронейтральные частицы, обладая высокой проникающей способностью, углубляются в ткани организма на значительные расстояния. Они формируют большинство ионизаций косвенным путем: фотоны рентгеновского и д-излучения — за счет комптоновских и фотоэлектронов, а нейтроны — за счет ядер отдачи. Эти заряженные частицы в основном и осуществляют перенос энергии излучения веществу, вызывая ионизации и возбуждения атомов.
Мягкие рентгеновские лучи (до 100 кэВ) поглощаются в поверхностных слоях ткани за счет фотоэффекта. Длина пробега фотоэлектронов не превышает 2 мм, поэтому биологически существенный эффект, связанный с ионизацией атомов и молекул, возникает вблизи места поглощения падающего кванта. Пространственное распределение ионов определяется энергией выбитых фотоэлектронов. Так, фотоны мягкого рентгеновского излучения с энергией 10 кэВ (это соответствует длине волны А = 10 нм) передают фотоэлектрону около 9,5 кэВ энергии.
Из табл. II.4 (с. 78) мы увидим, что длина пробега такого
электрона в ткани — 2,3 мкм, ЛПЭ = 2,4 кэВ/мкм, а плотность ионизации — около 32 пар ионов на 1 мкм пути. Число таких треков, т. е. количество выбитых фотоэлектронов в результате первичной ионизации, определяется поглощенной дозой. Картина ионизации ткани мягким рентгеновским излучением при поглощенной дозе 104 Гр показана на рис. II.5, а.
Глубина слоя воды, смГлубина слоя воды, смРис. II.6. Поглощение энергии в воде для рентгеновского и д-излучения с разной энергией квантовРис. II.6. Поглощение энергии в воде для рентгеновского и д-излучения с разной энергией квантовЖесткие рентгеновские и 7-лучи с энергией фотонов выше 300 кэВ изменяют направление движения (меняется их энергия) в основном за счет эффекта Комптона. Максимум выделения энергии лежит на глубине вплоть до нескольких сантиметров и связан с процессом накопления вторичных электронов, кото-
Глубина слоя воды, см
Глубина слоя воды, см
Рис. II.6. Поглощение энергии в воде для рентгеновского и д-излучения с разной энергией квантов
Рис. II.6. Поглощение энергии в воде для рентгеновского и д-излучения с разной энергией квантов
рый начинается на малых глубинах и возрастает до того момента, когда устанавливается равновесие между образованием вторичных частиц и их поглощением. Так, у-лучи 60Со теряют 60% всей энергии при прохождении первых 5-6 см ткани, а фотоны с энергией 35 МэВ, генерируемые в бетатронах, отдают максимум своей энергии на глубине 68 см. Эта важная особенность действия жесткого электромагнитного излучения позволяет воздействовать на глубоко расположенные опухоли без чрезмерного повреждения кожи и промежуточной ткани. Существование такого максимума (рис. II.6) объясняется тем, что в результате комптоновского взаимодействия фотонов высокой энергии и электронов атома последние воспринимают значительную часть энергии фотона (чем выше энергия излучения, тем более вероятен перенос к электрону отдачи максимальной энергии, вплоть до 99,9% энергии кванта). Электроны таких высоких энергий (несколько тысяч кэВ) проникают в ткань на глубину в несколько сантиметров, образуя максимальное число ионизаций и возбуждений в конце пробега, когда
скорость их значительно снижается.
Следовательно, электроны, высвобождаемые квантами излучения на поверхности облучаемого объема, образуют максимальное число ионов на глубине ткани в несколько сантиметров, т.е. они осуществляют перенос энергии излучения вглубь ткани.
Так, например, у-лучи с энергией квантов 1 МэВ высвобождают в результате комптоновского взаимодействия электроны отдачи с максимальной энергией 817 кэВ и средней энергией 452,5 кэВ. При энергии 450 кэВ электрон теряет около 0,2 кэВ на 1 мкм пути и способен пройти путь в 1500 мкм от места своего образования. В среднем он образует около 10 пар ионов на 1 мкм пути, однако ионизация распределена неравномерно, резко выраженный максимум наблюдается в конце трека.
На рис. II.6 показан характер ионизации вещества жестким рентгеновским излучением при общей поглощенной дозе 104 Гр. Облучение нейтронами высоких энергий (10-15 МэВ) приводит к пространственному распределению ионов в поглощающей ткани, которое сходно с картиной ионизации жестким у-излучением. Отличие состоит в том, что энергия нейтрона переносится не к электронам, а к ядрам отдачи,
т. е. к тяжелым ускоренным частицам, несущим положительный заряд. Наибольшее количество энергии переносится протонами отдачи, т. е. ускоренными ядрами водорода.
Так, при облучении тканей такими нейтронами основная часть поглощенной дозы создается протонами и тяжелыми ядрами отдачи с высокой плотностью ионизации. В результате облучения тканей в редкорасположенных микрообъемах возникают короткие треки с очень высокой плотностью ионизации. Это служит причиной значительно более высокого, чем для рентгеновского и д-излучения, значения ОБЭ нейтронов высоких энергий.
Поглощение ускоренных заряженных частиц
Облучение тканей косвенно ионизирующими частицами в конечном счете заканчивается появлением заряженных частиц: фотоны рентгеновского и д-излучения высвобождают в тканях высокоэнергетические электроны; нейтроны вызывают появление в тканях протонов отдачи, a-частиц и ядер других элементов. Все эти заряженные частицы обладают значительной энергией и способны многократно вызывать ионизацию и возбуждение атомов и молекул.
Для того чтобы описать характер ионизации поглотителя, необходимо построить качественную картину и выяснить количественные закономерности взаимодействия ускоренных заряженных частиц с атомами.
Пучки таких частиц, движущихся с большими скоростями, часто используются в радиобиологических экспериментах. Вместо ^-частиц, т. е. быстрых электронов, испускаемых в процессе радиоактивного распада, можно создавать потоки электронов, ускоренных в электрическом поле. Протонное излучение также генерируется специальными ускорителями; a-частицы, испускаемые радиоактивными веществами, тоже заменяются ускоренными до различных энергий ионами гелия.
Ускоренные заряженные частицы, которыми облучают ткани, вызывают возбуждение и ионизацию атомов точно так же, как и те заряженные частицы, которые высвобождаются нейтронами или фотонами рентгеновского и д-излучения. Различие связано только с неодинаковой энергией и зарядом высвобождающихся в каждом отдельном случае ионизирующих частиц. Важно знать, как зависит ионизирующая способность заряженных частиц от величины их энергии, от массы и величины заряда, который они несут.
При возмущении атомов существует вероятность либо перехода их в возбужденное состояние, либо их ионизации. Она возрастает при увеличении длительности возмущения или его интенсивности, поэтому медленные частицы вызывают больше переходов, чем быстрые, а многократно заряженные — больше, чем однократно заряженные; масса частицы не оказывает влияния на эти эффекты. Ускоренную частицу можно рассматривать как перемещающийся в пространстве
источник электрического поля. За счет взаимодействия электрического поля частицы с полем орбитального электрона последний при
обретает энергию. Если заряженная частица пролетает достаточно
близко от орбитального электрона, то перенесенной энергии достаточно для ионизации: электрон отрывается от соответствующего атома или молекулы, и в результате образуются положительно заряженный ион и свободный электрон. Если же частица значительно удалена от электронных оболочек, то электрон приобретает энергию, недостаточную для ионизации, и переходит на более удаленную энергетическую орбиту.
Такая схема, основанная на принципе упругого и неупругого соударений, еще не позволяет определить зависимость характера поглощения энергии ускоренной заряженной частицы от ее параметров — заряда, массы, скорости. Качественно на эти вопросы можно ответить, рассмотрев модель, предложенную Дертингером и Юнгом еще в конце 60-х годов XX столетия, которая
а
©© ^© к© ~
б
ф •——i►
в I
Положение частицы
быстрая частица
Время
Рис. II.7. Модель, поясняющая характер взаимодействия ускоренных заряженных частиц с атомом: а) частица проходит че-
медленная частица
учитывает изменение поля частицы во времени (рис. II.7).
В верхней части рис. II.7, а показан путь летящей частицы через область с высокой плотностью атомов. Стрелками обозначено возникновение ионизации (в данном случае двух), а пунктирными кружками - возбужден-
рез некоторую совокупность атомов, производя несколько ионизаций и возбуждений; б) атом и частица, проходящая мимо него; в) зависимость величины поля, создаваемого в атоме быстрой заряженной частицей, от положения частицы; г) зависимость того же поля от времени
ные атомы. Ниже (рис. II.7, б) изображена траектория частицы при
ее прохождении вблизи одного из атомов. На рис. II.7, в вычерчена
зависимость поля, действующего в атоме, от положения частицы, а на рис. II.7, г — зависимость этого поля от времени, прошедшего после приближения частицы к атому. Для медленной частицы это поле существует длительное время, для быстрой оно сначала резко возрастает, а затем быстро уменьшается. Значит, медленная частица будет вызывать возмущение в атоме в течение длительного времени и передаст ему гораздо больше энергии, чем быстрая частица.
Рассмотрение такой модели позволяет сформулировать ряд следствий, к которым приведет наложение на атом дополнительного поля заряженной частицы:
1) действие поля ускоренной частицы вызывает временное возмущение каждого атома, вблизи которого эта частица проходит;
это возмущение существует тем дольше, чем медленнее движется частица;
частицы, несущие неединичный заряд, вносят большее возмущение, чем однозарядные;
величина массы движущейся частицы не влияет на количество перенесенной энергии, т. е. при равных скоростях электроны и протоны переносят веществу одинаковое количество энергии, хотя массы их различаются почти в две тысячи раз.
Такое взаимодействие частицы с веществом называется электромагнитным взаимодействием (в отличие, например, от ядерного взаимодействия, которое происходит под действием ядерных, а не кулоновских, т. е. электрических сил).
dE _ 47reV/VZ dx тс2dE _ 47reV/VZ dx тс2Вероятность взаимодействия отдельной частицы с веществом характеризуется эффективным сечением взаимодействия. Обычно его пересчитывают на более удобные для практического применения величины. Количественно дифференциальная потеря энергии заряженной частицы, т. е. потери энергии на единицу длины трека (в единицах МэВ/см), определяются из уравнения Бете-Блоха:
dE _ 47reV/VZ dx тс2
dE _ 47reV/VZ dx тс2
In_ In (1 _,(П10)
1о
где е = 1,602 • 10-19 Кл — заряд электрона; и — скорость частицы в см/с; г — заряд частицы в единицах элементарного заряда е; N — число атомов в 1 см3 вещества; Z — среднее число электронов в атоме, т. е. «эффективный» атомный номер; Iq — средний потенциал ионизации или возбуждения атома, определяемый экспериментально; 3 = г/с (отношение скорости заряженной частицы к скорости света); для того, чтобы получить потери энергии в единицах МэВ/см, массу электрона принимают равной т = 0,511 МэВ/с2.
Анализируя уравнение (11.10), можно количественно обосновать те качественные представления, которые были основаны на простой модели взаимодействия (рис. II.7).
Действительно, член e4z2 соответствует взаимодействию между полем заряженной частицы и электроном (это становится яснее, если записать его в виде (е2г)2, т. е. в виде квадрата произведения квадрата заряда летящей частицы на заряд электрона в атоме). Зависимость от скорости определяется в основном первым множителем, в который входит 1/г2, так как во втором множителе скорость частицы входит в медленно изменяющуюся функцию, содержащую энергию тг2/2 под знаком логарифма. В формуле фигурирует только масса электрона как масса возбуждаемой в атоме частицы. Масса летящей частицы в уравнение (П.8) не входит. Потеря энергии пропорциональна N Z. т. е. зависит от числа атомов в единице объема и от числа электронов в атоме (для многих биологических тканей и воды среднее
число электронов на 1 г примерно одинаково и находится в пределах 3 • 1023—3, 5 • 1023). Сжатие электрического поля при больших скоростях частицы (рис. II.7) учитывается с помощью членов, зависящих от скорости частицы.
Следует учесть одну особенность, вытекающую из уравнения (II.8). Так как dE/dx зависит от 1/г2, то можно ожидать бесконечно больших удельных потерь энергии излучения при низких скоростях частицы. Однако этого не происходит. Кажущаяся противоречивость устраняется, если принять во внимание уменьшение заряда частицы по мере ее замедления, так что уже малая энергия частицы подходит к порогу ионизации или возбуждения. Так, по мере снижения скорости a-частицы увеличивается вероятность захвата ею электрона. При этом она продолжает свой путь как частица, имеющая одиночный заряд (ион гелия Не+, а не Не2+). При достаточно низких скоростях одиночно заряженный ион гелия захватывает еще один электрон и превращается в атом гелия.
Для учета такого рода процессов в формулу Бете—Блоха вводится уточнение, связывающее изменение заряда частицы со скоростью:
= Д1 — ехр (—125^г-2/3)], (11.11)
где г* — заряд частицы, зависящий от скорости. Если г —> 0, то и член ^ = г/с —>0, а следовательно, и г* —> 0, т. е. при достаточно низких скоростях частицы удельные потери энергии dE/ dx снижаются
и стремятся к нулю.
Это происходит уже после того, как удельные потери достигли максимума (например, для протонов — при энергии между 60 и 100 кэВ). Величина этого максимума в реальных условиях оказывается сниженной во много раз (и средняя энергия частиц также во много раз больше) из-за другого эффекта. По мере торможения частиц их энергетический спектр постепенно размывается из-за флуктуаций потерь энергии в единичных столкновениях с атомами вещества. Тем не менее
Рис. II.8. Изменение линейной плотности ионизации при прохождении ускоренной тяжелой заряженной частицы через веществоРис. II.8. Изменение линейной плотности ионизации при прохождении ускоренной тяжелой заряженной частицы через веществоопределенный максимум наблюдается, и он известен под названием «пик кривой Брэгга». Для электронов пик Брэгга почти незаметен, для протонов его величина по отношению к начальной ионизации является 4-10-кратной.
Рис. II.8. Изменение линейной плотности ионизации при прохождении ускоренной тяжелой заряженной частицы через вещество
Рис. II.8. Изменение линейной плотности ионизации при прохождении ускоренной тяжелой заряженной частицы через вещество
На рис. II.8 показано это резкое возрастание удельных потерь энергии dE/ dx в конце пути заряженных частиц (пик Брэгга).
Подбирая соответствующий тип излучения (или нескольких излучений) и варьируя энергию ионизирующих частиц, можно добиться оптимального распределения поглощенной дозы, в частности
благоприятного соотношения между степенью поражения нормальных тканей и опухолей, залегающих на значительной глубине, что
Рис. II.9. Пространственное распределение поглощенной дозы для разных видовРис. II.9. Пространственное распределение поглощенной дозы для разных видовизлученияизлучения
Рис. II.9. Пространственное распределение поглощенной дозы для разных видов
Рис. II.9. Пространственное распределение поглощенной дозы для разных видов
излучения
излучения
показано на рис. II.9. Все кривые проведены так, что относительная доза, равная 1,0, лежит в центре опухоли диаметром 4 см; уплощение и расширение пика Брэгга достигается установкой по ходу пучков специальных гребенчатых фильтров.
Оптимизация дозового распределения для проведения лучевой терапии требует одновременного решения нескольких задач: максимального поражения опухолевых клеток как в самой опухоли, так и в зонах регионарного метастазирования; при этом находящиеся по соседству радиочувствительные органы должны быть защищены.
Существование пика Брэгга позволяет с максимальной эффективностью проводить лучевую терапию злокачественных опухолей. В зависимости от локализации опухолей выбирают вид излучения и его энергетическую характеристику такими, чтобы пик Брэгга приходился на топографически обозначенный очаг злокачественных клеток. Поскольку размер очага может оказаться большим по сравнению с шириной пика Брэгга, составляющей только миллиметры, то приходится искусственно увеличивать размытие энергетического спектра частиц. Так создается модифицированная кривая Брэгга с максимумом, в котором обеспечена постоянная доза в пределах облучаемого очага новообразования. Доза в любом месте вне очага имеет значительно меньшую величину, что позволяет добиваться улучшенных условий дозирования для прилегающих к очагу радиочувствительных тканей. Эта область применения пучков протонов и более тяжелых ускоренных ионов в целях лучевой терапии получила название адротерапии. Ее развитие, начатое в 60-х гг. в США, Швеции и СССР, в настоящее время продолжается, и во многих странах мира созданы установки уже на индустриальной основе.
Пространственное распределение ионов
Итак, поглощенная энергия излучений затрачивается на возбуждение и ионизацию атомов и молекул. В основе конечного радиобиологического эффекта лежат физико-химические превращения с участием возбужденных и ионизированных молекулярных структур. И поскольку число возбуждений и ионизаций определяется величиной поглощенной дозы излучения, можно было бы ожидать, что раз
личные виды ионизирующих частиц приводят к одному и тому же биологическому эффекту при условии, что объект поглотил излучениеличные виды ионизирующих частиц приводят к одному и тому же биологическому эффекту при условии, что объект поглотил излучениев одинаковых дозах. В действительности это не так.На рис. 11.10 приведены результаты эксперимента по определению выживаемости клеток, облученных ионизирующими частицами различных типов. Поглощение излучения в одной и той же дозе приводит к различным эффектам. Так, сообщение популяции клеток потоком ci-частиц поглощенной дозы 4-6 Гр приводит к гибели 99,9% клеток, а при такой же дозе рентгеновского или у-излучения гибнет только 20-30% облученных клеток (рис. II.10).Следовательно, поглощенная доза, по величине которой судят о суммарном числе образованных возбуждений и ионизаций, не может использоваться для сопоставления эффективности различных типов излучения. Точно так же не совпадает со степенью конечного биологического эффекта величинав одинаковых дозах. В действительности это не так.На рис. 11.10 приведены результаты эксперимента по определению выживаемости клеток, облученных ионизирующими частицами различных типов. Поглощение излучения в одной и той же дозе приводит к различным эффектам. Так, сообщение популяции клеток потоком ci-частиц поглощенной дозы 4-6 Гр приводит к гибели 99,9% клеток, а при такой же дозе рентгеновского или у-излучения гибнет только 20-30% облученных клеток (рис. II.10).Следовательно, поглощенная доза, по величине которой судят о суммарном числе образованных возбуждений и ионизаций, не может использоваться для сопоставления эффективности различных типов излучения. Точно так же не совпадает со степенью конечного биологического эффекта величинаРис. 11.10. Выживаемость культуры Т — клеток почки человека при действии ионизирующих частиц различных типов: 1—а-частицы с энергией 2,5 МэВ, ЛПЭ =165 кэВ/мкм; 2 — а-частицы с энергией 27 МэВ, ЛПЭ=25кэВ/мкм;3—дейтроны с энергией 3,0 МэВ, ЛПЭ=20кэВ/мкм;4—рентгеновские лучи, 20 кВ, ЛПЭ=6кэВ/мкм;5—рентгеновские лучи, 250 кВ, ЛПЭ = 2, 5 кэВ/мкм; 6 — /3-частицы с максимальной энергией 2,2 МэВ, ЛПЭ = 0,3 кэВ/мкмРис. 11.10. Выживаемость культуры Т — клеток почки человека при действии ионизирующих частиц различных типов: 1—а-частицы с энергией 2,5 МэВ, ЛПЭ =165 кэВ/мкм; 2 — а-частицы с энергией 27 МэВ, ЛПЭ=25кэВ/мкм;3—дейтроны с энергией 3,0 МэВ, ЛПЭ=20кэВ/мкм;4—рентгеновские лучи, 20 кВ, ЛПЭ=6кэВ/мкм;5—рентгеновские лучи, 250 кВ, ЛПЭ = 2, 5 кэВ/мкм; 6 — /3-частицы с максимальной энергией 2,2 МэВ, ЛПЭ = 0,3 кэВ/мкм
личные виды ионизирующих частиц приводят к одному и тому же биологическому эффекту при условии, что объект поглотил излучение
личные виды ионизирующих частиц приводят к одному и тому же биологическому эффекту при условии, что объект поглотил излучение
в одинаковых дозах. В действительности это не так.
На рис. 11.10 приведены результаты эксперимента по определению выживаемости клеток, облученных ионизирующими частицами различных типов. Поглощение излучения в одной и той же дозе приводит к различным эффектам. Так, сообщение популяции клеток потоком ci-частиц поглощенной дозы 4-6 Гр приводит к гибели 99,9% клеток, а при такой же дозе рентгеновского или у-излучения гибнет только 20-30% облученных клеток (рис. II.10).
Следовательно, поглощенная доза, по величине которой судят о суммарном числе образованных возбуждений и ионизаций, не может использоваться для сопоставления эффективности различных типов излучения. Точно так же не совпадает со степенью конечного биологического эффекта величина
в одинаковых дозах. В действительности это не так.
На рис. 11.10 приведены результаты эксперимента по определению выживаемости клеток, облученных ионизирующими частицами различных типов. Поглощение излучения в одной и той же дозе приводит к различным эффектам. Так, сообщение популяции клеток потоком ci-частиц поглощенной дозы 4-6 Гр приводит к гибели 99,9% клеток, а при такой же дозе рентгеновского или у-излучения гибнет только 20-30% облученных клеток (рис. II.10).
Следовательно, поглощенная доза, по величине которой судят о суммарном числе образованных возбуждений и ионизаций, не может использоваться для сопоставления эффективности различных типов излучения. Точно так же не совпадает со степенью конечного биологического эффекта величина
Рис. 11.10. Выживаемость культуры Т — клеток почки человека при действии ионизирующих частиц различных типов: 1—
а-частицы с энергией 2,5 МэВ, ЛПЭ =165 кэВ/мкм; 2 — а-
частицы с энергией 27 МэВ, ЛПЭ=25кэВ/мкм;3—
дейтроны с энергией 3,0 МэВ, ЛПЭ=20кэВ/мкм;4—
рентгеновские лучи, 20 кВ, ЛПЭ=6кэВ/мкм;5—
рентгеновские лучи, 250 кВ, ЛПЭ = 2, 5 кэВ/мкм; 6 — /3-частицы с максимальной энергией 2,2 МэВ, ЛПЭ = 0,3 кэВ/мкм
Рис. 11.10. Выживаемость культуры Т — клеток почки человека при действии ионизирующих частиц различных типов: 1—
а-частицы с энергией 2,5 МэВ, ЛПЭ =165 кэВ/мкм; 2 — а-
частицы с энергией 27 МэВ, ЛПЭ=25кэВ/мкм;3—
дейтроны с энергией 3,0 МэВ, ЛПЭ=20кэВ/мкм;4—
рентгеновские лучи, 20 кВ, ЛПЭ=6кэВ/мкм;5—
рентгеновские лучи, 250 кВ, ЛПЭ = 2, 5 кэВ/мкм; 6 — /3-частицы с максимальной энергией 2,2 МэВ, ЛПЭ = 0,3 кэВ/мкм
энергии ионизирующих частиц: а-
частицы с энергией 2,5 МэВ эффективнее d-частиц с энергией 27 МэВ, а Р" и ci-частицы примерно равной энергии значительно различаются по степени поражающего действия.
Приведенные данные еще раз подтверждают, что биологический эффект зависит не только от поглощенной дозы, но и от ЛПЭ излучения. Поэтому упрощенных критериев, применяемых в системе нормативов радиационной защиты в виде вводимых весовых множителей (см. гл. I, раздел 6), совершенно недостаточно при осуществлении дозиметрии в конкретных биологических исследованиях.
Обратимся еще раз к данным рис. 11.10. Наклон кривых на этом рисунке отражает эффективность, с которой различные виды излучения вызывают гибель клеток. Чем больше наклон кривой, тем
меньше клеток выживает в популяции, поглотившей определенную дозу излучения, т. е. тем эффективнее биологическое действие данного типа ионизирующих частиц. Наклон кривых увеличивается с ростом ЛПЭ излучения. Наибольшей эффективностью в рассматриваемом эксперименте обладали a-частицы с ЛПЭ = 165 кэВ/мкм. И мы знаем, что чем выше значение ЛПЭ, тем больше энергии теряет частица на единицу пути и тем плотнее распределены создаваемые ею ионы вдоль трека.
Величина ЛПЭ — важнейшая радиобиологическая характеристика излучения, показатель его биологической эффективности, или, как иногда говорят, «качества». Физическая природа частиц или квантов не сказывается на специфике биологического действия: например, при равных ЛПЭ наблюдают одинаково эффективное подавление размножения клеток как в результате рентгеновского облучения, так и при действии а-частиц.
Для того чтобы представить возможную причину различной эффективности излучений с высокими и низкими значениями ЛПЭ, рассмотрим схематическое изображение треков некоторых частиц (рис. II. 11). Здесь представлены участки треков частиц, сферическая молекула белка радиусом в 310 нм, распределение актов возбуждения и ионизации, произведенных частицами вдоль направления своего движения.
ct-Частицы, обладающие энергией 4 МэВ, передают веществу 130 кэВ на 1 мкм пути, что соответствует примерно 3800 ионизациям на 1 мкм. При такой высокой плотности ионизации в масштабе белковой молекулы частица может произвести несколько следующих друг за другом актов ионизации и возбуждения.
Электроны с энергией 0,5 МэВ имеют величину ЛПЭ = = 0,2 кэВ/мкм. Такие электроны образуют около 6 пар ионов на 1 мкм пути, т. е. вероятность возникновения ионизации в пределах белковой молекулы толщиной около 0,003 мкм весьма мала.
При облучении клеток величина поглощенной дозы показывает лишь среднее количество энергии, переданной облучаемой системе. О плотности ионизации в клетке можно судить по величине ЛПЭ.
Если движущаяся частица производит ионизации, значительно удаленные друг от друга, то вероятность возникновения нескольких ионов в пределах макромолекулы, субклеточной органеллы или клетки в целом сравнительно невелика. Напротив, когда акты ионизации следуют непрерывно вдоль трека частицы, можно ожидать возникновения многих ионов в пределах одной субклеточной структуры, например, двух ионизаций в комплементарных участках двунитевой молекулы ДНК.
Конечно, биологические последствия поражения (в результате ионизации) обеих нитей этой уникальной молекулярной структуры значительно ощутимее для клетки, чем разрушение какого-либо участка одной спирали ДНК при сохранении целостности комплементарной цепи. Так как с ростом линейной плотности ионизации возрастает вероятность именно такого «двунитевого» разрыва,
100 А
дейтрон 3,5 МэВдейтрон 3,5 МэВ1е1 электрон”Т0,5 МэВ1е1 электрон”Т0,5 МэВ1 - пеРвичная 2-0 вторичная 3-е возбуждение ионизация ионизация1 - пеРвичная 2-0 вторичная 3-е возбуждение ионизация ионизацияРис. 11.11. Схематическое изображение отрезка траектории различных заряженных частиц, показывающее распределение актов ионизации и возбуждения вдоль трека частицы в указанном масштабе: а) трек дейтрона с Е = 4 МэВ, ЛПЭ = 19,4 кэВ/мкм, ЛПИ = 570 ионов/мкм; б) трек дейтрона с Е = 1 МэВ, ЛПЭ = 54,0 кэВ/мкм, ЛПИ = 1600 ионов/мкм; в) трек а-частицы с Е = 4 МэВ, ЛПЭ = 130 кэВ/мкм, ЛПИ = 3800 ионов/мкм; г) трек электрона с Е = 0,5 МэВ, ЛПЭ = 0,2 кэВ/мкм, ЛПИ = 6 ионов/мкм; 1 — первичная ионизация; 2 — вторичная ионизация; 3 — возбуждениеРис. 11.11. Схематическое изображение отрезка траектории различных заряженных частиц, показывающее распределение актов ионизации и возбуждения вдоль трека частицы в указанном масштабе: а) трек дейтрона с Е = 4 МэВ, ЛПЭ = 19,4 кэВ/мкм, ЛПИ = 570 ионов/мкм; б) трек дейтрона с Е = 1 МэВ, ЛПЭ = 54,0 кэВ/мкм, ЛПИ = 1600 ионов/мкм; в) трек а-частицы с Е = 4 МэВ, ЛПЭ = 130 кэВ/мкм, ЛПИ = 3800 ионов/мкм; г) трек электрона с Е = 0,5 МэВ, ЛПЭ = 0,2 кэВ/мкм, ЛПИ = 6 ионов/мкм; 1 — первичная ионизация; 2 — вторичная ионизация; 3 — возбуждение
дейтрон 3,5 МэВ
дейтрон 3,5 МэВ
1е1 электрон
”Т0,5 МэВ
1е1 электрон
”Т0,5 МэВ
1 - пеРвичная 2-0 вторичная 3-е возбуждение ионизация ионизация
1 - пеРвичная 2-0 вторичная 3-е возбуждение ионизация ионизация
Рис. 11.11. Схематическое изображение отрезка траектории различных заряженных частиц, показывающее распределение актов ионизации и возбуждения вдоль трека частицы в указанном масштабе: а) трек дейтрона с Е = 4 МэВ, ЛПЭ = 19,4 кэВ/мкм, ЛПИ = 570 ионов/мкм; б) трек дейтрона с Е = 1 МэВ, ЛПЭ = 54,0 кэВ/мкм, ЛПИ = 1600 ионов/мкм; в) трек а-частицы с Е = 4 МэВ, ЛПЭ = 130 кэВ/мкм, ЛПИ = 3800 ионов/мкм; г) трек электрона с Е = 0,5 МэВ, ЛПЭ = 0,2 кэВ/мкм, ЛПИ = 6 ионов/мкм; 1 — первичная ионизация; 2 — вторичная ионизация; 3 — возбуждение
Рис. 11.11. Схематическое изображение отрезка траектории различных заряженных частиц, показывающее распределение актов ионизации и возбуждения вдоль трека частицы в указанном масштабе: а) трек дейтрона с Е = 4 МэВ, ЛПЭ = 19,4 кэВ/мкм, ЛПИ = 570 ионов/мкм; б) трек дейтрона с Е = 1 МэВ, ЛПЭ = 54,0 кэВ/мкм, ЛПИ = 1600 ионов/мкм; в) трек а-частицы с Е = 4 МэВ, ЛПЭ = 130 кэВ/мкм, ЛПИ = 3800 ионов/мкм; г) трек электрона с Е = 0,5 МэВ, ЛПЭ = 0,2 кэВ/мкм, ЛПИ = 6 ионов/мкм; 1 — первичная ионизация; 2 — вторичная ионизация; 3 — возбуждение
ясно, что плотноионизирующие частицы (с высокой ЛПЭ) должны значительно эффективнее поражать ДНК и связанные с ней клеточные функции, чем редкоионизирующее излучение.
Ионизация в тканях при действии тяжелых заряженных частиц
На примере ускоренных ядер гелия (a-частицы) в табл. II.3 представлены результаты количественных измерений ионизирующей способности частиц и глубины их проникновения в ткани (по данным Д. Е. Ли). На основании этих данных можно оценить картину первичной ионизации вещества.
а-Частицы с энергией 1 МэВ теряют свою энергию на первых 5,3 мкм ткани, в среднем на каждый микрон пути веществу переносится 263,9 кэВ энергии (табл. II.3), которая расходуется на возбуждение и ионизацию атомов. В среднем на каждый микрон пути образуется около 6,2 тыс. пар ионов, неравномерно распределенных вдоль трека частицы. Тяжелые заряженные частицы практически не отклоняются от своего первоначального направления распространения благодаря значительной разнице их массы и массы электрона, с которым они взаимодействуют, т. е. их треки можно
Таблица II.3. Длина пробега, потеря энергии и число первичных ионов при прохождении а-частиц в ткани плотностью 1 г/см3
Энергия а-частиц, МэВ
ЛПЭ, кэВ/мкм
Длина пробега, мкм
Число первичных ионов на 1 мкм пути в ткани, пар ионов/мкм
1
263,9
5,3
6207,0
3
134,6
16,8
2031,0
6
82,01
47,0
1109,0
9
60,41
91,6
775,4
10
55,71
108,4
706,4
считать прямолинейными, и имеет смысл говорить об определенной «глубине проникновения» их в вещество.
При ионизации атомов вдоль своего пути а-частица оставляет
вдоль своего прямолинейного трека не всю энергию, иначе тяжелые частицы были бы идеальным «щупом», позволяющим зондировать клетки, строго избирательно повреждая микроструктуры, расположенные на определенной глубине. Некоторая доля энергии частицы выносится за пределы ее трека выбитыми из атомов электронами, обладающими значительным запасом энергии и большой длиной пробега. Эти электроны образуют треки, ответвляющиеся от трека первичной частицы, и вызывают на своем пути ионизации и возбуждения, плотность распределения которых зависит от энергии выбитого электрона. Так, например, a-частицы с энергией 1 МэВ могут генерировать вторичные электроны, длина пробега которых вдвое превосходит
Рис. 11.12. Передача энергии по траектории тяжелой заряженной частицы. Для а-частицы с энергией 6 МэВ расстояние АБ = 3,1 нм, что соответствует размеру средней молекулы белка: а — «рой ионов»; а(5) — 5-электроныРис. 11.12. Передача энергии по траектории тяжелой заряженной частицы. Для а-частицы с энергией 6 МэВ расстояние АБ = 3,1 нм, что соответствует размеру средней молекулы белка: а — «рой ионов»; а(5) — 5-электронытрек самой тяжелой частицы. Вторичные электроны, энергия которых превосходит 100 эВ, называют J-электронами (иногда этот предел приравнивают к 1 кэВ). На их долю приходится приблизительно 25% всей иониза-
Рис. 11.12. Передача энергии по траектории тяжелой заряженной частицы. Для а-частицы с энергией 6 МэВ расстояние АБ = 3,1 нм, что соответствует размеру средней молекулы белка: а — «рой ионов»; а(5) — 5-электроны
Рис. 11.12. Передача энергии по траектории тяжелой заряженной частицы. Для а-частицы с энергией 6 МэВ расстояние АБ = 3,1 нм, что соответствует размеру средней молекулы белка: а — «рой ионов»; а(5) — 5-электроны
ции, вызываемой первичной частицей. Схема, иллюстрирующая этот процесс, представлена на рис. 11.12.
Большая часть энергии тяжелой заряженной части
цы переносится к вторичным электронам «малыми порциями», т. е. образуются свободные электроны с энергией менее 100 эВ. Вызванная ими ионизация происходит в непосредственной близости от места первичной ионизации, на расстоянии порядка нескольких десятков нанометров от трека частицы.
Таким образом, в относительно небольшом объеме вдоль трека частицы возникает некоторое число пар ионов (положительные ионы и
электроны), порожденных первичной ионизацией и вторичными электронами с энергией менее 100 эВ. Эти скопления получили название «рой ионов»; они и формируют трек частицы. Термины «первичная ионизация», «рой ионов» и «событие потери энергии» можно считать эквивалентными.
Рои ионов называют также шпорами. Несколько тесно расположенных шпор (100-500 эВ) образуют «блобы» и короткие треки (0,55 кэВ). В состав последних входят также так называемые Оже-электроны, выносящие из ионизированного атома энергию перестройки внутренних оболочек (но не следует путать это с фотонным Оже- эффектом). Например, в случае ионизации АГ-оболочки кислорода вероятность испускания дополнительного Оже-электрона с энергией около 540 эВ близка к 100%.
Тяжелые заряженные частицы образуют короткие плотные треки, имеющие форму основного стержня с высокой удельной плотностью ионизации (рои ионов плотно прилегают друг к другу, образуя сплошной столбик, или «колонну» ионов), от которого во все стороны отходят стержни, соответствующие 5-лучам со значительно более низкой плотностью ионизации. Такая картина характерна не только для а- частиц, но и для ускоренных тяжелых ядер различных элементов.
Ионизация в тканях при действии ускоренных электронов
Картина, наблюдаемая при облучении тканей потоком ^-частиц,
отличается от рассмотренной выше прежде всего криволинейной траекторией частиц в веществе. Это связано с равенством масс взаимодействующих частиц: в единичном акте соударения с орбитальным
Рис. 11.13. Истинная иРис. 11.13. Истинная ипрактическая длина пробега электронов в веществе. Путь от А до В — истинная длина пробега; L — практическая длина пробега (глубина проникновения)практическая длина пробега электронов в веществе. Путь от А до В — истинная длина пробега; L — практическая длина пробега (глубина проникновения)электроном ^-частица теряет большое количество энергии и изменяет первоначальное направление движения (рис. 11.13).
Рис. 11.13. Истинная и
Рис. 11.13. Истинная и
практическая длина пробега электронов в веществе. Путь от А до В — истинная длина пробега; L — практическая длина пробега (глубина проникновения)
практическая длина пробега электронов в веществе. Путь от А до В — истинная длина пробега; L — практическая длина пробега (глубина проникновения)
Данные о распределении ионизаций получают путем фотографирования треков частиц в камере Вильсона или в пузырьковой камере. В этих приборах создается метаста- бильное (неустойчивое) состояние рабочего вещества, пара или жидкости, так, чтобы при прохождении через них даже единичной заряженной частицы вдоль ее трека происходила конденсация (или испарение) и возникали хорошо видимые следы частицы. На рис. 11.14
представлен участок трека электрона, каким он виден в камере Вильсона. Капли воды конденсируются из насыщенного пара в местах образования ионов.
Длина пробега ^-частиц определяется их энергией: при энергии 150 кэВ они проникают в ткань на глубину 278 мкм, а очень быстрые частицы с энергией 50 МэВ — на глубину до 19 см.
скопление капель воды соответствует возникновению ионов
Рис. 11.14. Трек быстрого электрона (по фотографии в камере Вильсона): 1 — трек быстрого электрона (Е = 200 кэВ), 2 — трек медленного электрона (Е = 20 кэВ). При низкой энергии изгибание трека вызвано рассеянием.
Приведем таблицу (по данным Д. Е. Ли) зависимости длины пробега, потери энергии и числа пар ионов электрона от его энергии на единицу пути в ткани (табл. II.4).
Таблица II.4. Длина пробега, потеря энергии и число первичных ионов, вызываемых электронами в ткани плотностью 1 г/см3
Энергия электрона, кэВ
Длина пробега, мкм
Потеря энергии, кэВ/мкм
Число первичных ионов на 1 мкм ткани, пар ионов/мкм
0,1
0,003
33,23
1697
0,2
0,006
28,71
843,1
0,8
0,038
14,17
285,3
2,0
0,1595
7,680
127,8
9,5
2,303
2,367
31,90
22,5
10,51
1,233
15,06
45,0
35,76
0,7255
8,452
90,0
118,0
0,4462
4,986
150,0
278,1
0,3278
3,567
450,0
1508,5
0,2108
2,166
Локальные характеристики поглощения энергиивеществом. Проблемы микродозиметрии (М. Ф. Ломанов)
Ввиду вероятностного характера явлений, связанных с энергетическим парадоксом, сформировалось особое направление в радиационной физике, которое носит название микродозиметрии. Для того, чтобы понять, в чем основное отличие новых методов от обычной дозиметрии, можно привести такую аналогию. Любая газовая среда характеризуется давлением, но никогда не говорят о давлении отдельной частицы газа так же, как и о температуре молекулы. Вместо макроскопических характеристик в статистической физике речь идет только о максвелловском статистическом распределении энергий и скоростей молекул газа. Аналогичным образом понятие поглощенной дозы заменяется в микроскопических масштабах соответствующей статистически распределенной величиной.
Энергия, переданная излучением веществу, определяется по формуле:
е = £^-£52-£е, (П.12) где ^Еу — сумма кинетических энергий всех ионизирующих частиц, которые вошли в данный объем; ^Е) сумма кинетических энергий всех ионизирующих частиц, которые покинули объем; ^ Q — сумма всей энергии, затраченной на любые превращения ядер и элементарных частиц внутри объема (знак минус может быть поставлен в случае увеличения суммарной массы покоя этих частиц).
Энергия е ионизирующего излучения, фактически поглощенная в элементе объема, является стохастической величиной, когда речь идет о микрообъеме. Пусть т — масса вещества в этом объеме. Частное от деления s на т называют удельной энергией Z:
Z = s/m. (11.13)
Единица измерения — та же, что и для поглощенной дозы D, грей. Как стохастическая величина удельная энергия может значительно отклоняться от нестохастической величины D, хотя в пределе к большим объемам она переходит в обычную дозу. Формально при определении величины поглощенной дозы D может применяться соотношение (11.14, то же 1.6):
D = (11.14) ат
где ds — ожидаемая (нестохастическая) величина переданной энергии, т. е. средняя энергия, переданная ионизирующим излучением веществу в элементе объема, dm — масса вещества в этом объеме. Для того, чтобы не было противоречия с малостью элемента dm, вводя такое определение, подчеркивают макроскопический характер применяемых здесь величин.
Можно сказать, что удельная энергия, как и вероятность процесса, зависит от ряда параметров, в том числе от поглощенной дозы. Из соотношения (11.14) следует, что поглощенная доза D — это средняя величина, полученная путем усреднения удельной энергии по достаточно большим объемам и интервалам времени.
Почему мы должны переходить от дозы не просто к ее локальной характеристике, а к ее стохастическому аналогу? Напомним об энергетическом парадоксе: энергия, фактически поглощенная в малом микрообъеме, может испытывать огромные флуктуации и определяется вероятностными законами. Изучение флуктуаций энергопоглощения в чувствительных микрообъемах, анализ соответствующих пространственных распределений поглощенной энергии и составляет предмет микродозиметрии, которая возникла из потребностей радиобиологии и дала в руки исследователей новый инструмент познания. Ее основные подходы и методы в основном были завершены в период 1970-1980-х гг.
Статистический характер процесса передачи энергии означает, что результат взаимодействия излучения с веществом может быть предсказан, если пользоваться вероятностями больших передач энергии веществу, которые определяются методами микродозиметрии. Размеры микрообъема настолько малы, что изменением обычной, поглощенной дозы в его пределах всегда можно пренебречь. Линейные размеры таких чувствительных областей находятся в области 0.01-10 мкм.
Микродозиметрия ) изучает распределение поглощенной в веществе энергии в таких микрообъемах. Дозиметрия ионизирующих излучений также пользуется понятием статистического распределения дозы, но только в значительно больших, макроскопических объемах, в которых только возможно непосредственное измерение дозы физическими приборами.
Кроме удельной энергии, микродозиметрия широко пользуется аналогом такой макроскопической дозиметрической величины, как ЛПЭ. Это линейная энергия у — стохастическая величина, равная отношению энергии в, переданной в одном событии поглощения микрообъему, к средней длине I треков, пересекающих этот микрообъем (для сферического объема диаметром d это средняя длина хорды I = 2d/3):
У = е/1. (11.15)
В отличие от г, линейная энергия, как и ЛПЭ, не зависит ни от дозы, ни от потока частиц, поскольку относится к единичным трекам или к событиям пересечения ими микрообъема. Но ее статистическое распределение (а не сама величина!) характеризует качество излучения более точно, чем величина ЛПЭ, и именно по нему может производиться расчет биологической эффективности излучения. Единица измерения — та же, что и для ЛПЭ, — кэВ/мкм.
Микродозиметрические величины у и г характеризуются следующими особенностями случайных величин: их значения изменяются скачкообразно в пространстве и времени, они принципиально непредсказуемы и до их измерения можно указать лишь вероятность обнаружения заданного значения величины. В приложениях микродозиметрии обычно рассматривается сферический микрообъем, в котором распределение хорд хорошо известно (оно близко к треугольному распределению), что позволяет строить математические модели. Представляют большой интерес и другие типы микрообъема, например плоская поверхность мембраны, но в этом случае препятствия для моделирования колоссально возрастают. Из результатов отечественных исследований широко известны расчеты Лаппа (новосибирская школа), выполненные по методу Монте-Карло, и построенная им база микродозиметрических данных.
Зависимость ОБЭ от локального распределения энергии излучения
Рассмотренные положения о действии излучения на биологические объекты уже достаточны для того, чтобы вместо упрощенного подхода к ОБЭ перейти к пониманию характера изменения ОБЭ излучения при различном составе и энергии излучения. Для определенности будем говорить о нейтронах, хотя особенности процессов в треках образованных ими вторичных частиц — те же, что и для тяжелых заряженных частиц (если не говорить о примеси вторичных фотонов, которая мало меняет существо рассуждений).
«Теория дуального действия» излучения (ТДД) ), разработанная Келлерером и Росси в 1970-х годах, предполагает, что каждое первичное элементарное повреждение происходит путем взаимодействия двух субповреждений, допустим, одиночных разрывов (ОР) отдельных цепочек молекулы ДНК. Это возможно в пределах некоторой ограниченной области, «сайта». Случайно оба субповреждения могут быть инициированы внутри сайта одной и той же частицей, и тогда это приведет к двунитевому разрыву ДНК (др).
Допустим, это фотонное излучение в дозе D- или нейтронное в дозе Dn. Обладающее значительно более низкой плотностью ионизации фотонное излучение чаще будет производить такое же двойное событие не в одном и том же треке, а за счет двух независимых попаданий треков разных частиц в один и то же сайт, и вероятность этого пропорциональна уже квадрату дозы D^. В какой-то степени это возможно и для нейтронов, поэтому при равенстве вероятностей обоих биологических эффектов, всегда предполагаемом при определении ОБЭ, с учетом некоторых постоянных коэффициентов, получим
anDn + 3«D^ = а7Щ + /?7Щ. (11.16)
В пределе малых доз следует пренебречь квадратом дозы, и тогда ОБЭ не зависит от дозы и равна отношению Dy/Dn = ап/а^. Точно так же можно ожидать, что ОБЭ не зависит от дозы и в пределе больших доз. Но величина ОБЭ окажется намного больше, что сразу вытекает из ситуации для промежуточных доз. Тогда, как мы видели, функции для протонов и нейтронов имеют различный характер. Заметим кстати, что по современной терминологии воздействия, связанные с совместным действием нескольких частиц, иногда называют «д- смертельным ударом» или «д-ударом» ), по типу облучения фотонами, а процессы, происходящие в пределах одного и того же трека, по типу трека быстрого многозарядного иона — «ионным ударом» ). Конечно, удар этого типа возможен и под действием фотона. Нейтрон
чаще производит ионный удар, а фотон — д-удар, и уравнение (11.16) сокращается: anDn = P4D^. Тогда сразу определяем ОБЭ нейтронов как отношение доз равного эффекта:
D^/Dn = const/УД?-D^/Dn = const/УД?-(П.17)(П.17)
D^/Dn = const/УД?-
D^/Dn = const/УД?-
(П.17)
(П.17)
Рис. 11.15. Зависимость ОБЭ нейтронов от дозы для инактивации клеток человека в культуре (1), клеток кожи (2), хромосомных аберраций в клетках лейкоцитов человека (3), различных эффектов на семенах кукурузы (4), уменьшения скорости роста бобов (5), индукции опухолей молочной железы у крыс (б), мутаций тычинок у традесканции (7) и помутнения хрусталика у мышей (8)Рис. 11.15. Зависимость ОБЭ нейтронов от дозы для инактивации клеток человека в культуре (1), клеток кожи (2), хромосомных аберраций в клетках лейкоцитов человека (3), различных эффектов на семенах кукурузы (4), уменьшения скорости роста бобов (5), индукции опухолей молочной железы у крыс (б), мутаций тычинок у традесканции (7) и помутнения хрусталика у мышей (8)ждения пока были проведены нами безждения пока были проведены нами без
Рис. 11.15. Зависимость ОБЭ нейтронов от дозы для инактивации клеток человека в культуре (1), клеток кожи (2), хромосомных аберраций в клетках лейкоцитов человека (3), различных эффектов на семенах кукурузы (4), уменьшения скорости роста бобов (5), индукции опухолей молочной железы у крыс (б), мутаций тычинок у традесканции (7) и помутнения хрусталика у мышей (8)
Рис. 11.15. Зависимость ОБЭ нейтронов от дозы для инактивации клеток человека в культуре (1), клеток кожи (2), хромосомных аберраций в клетках лейкоцитов человека (3), различных эффектов на семенах кукурузы (4), уменьшения скорости роста бобов (5), индукции опухолей молочной железы у крыс (б), мутаций тычинок у традесканции (7) и помутнения хрусталика у мышей (8)
ждения пока были проведены нами без
ждения пока были проведены нами без
Полученная зависимость ОБЭ нейтронов от квадратного корня из
дозы хорошо подтверждается многими экспериментами и в широких пределах изменения дозы, как показано на рис. II. 15 (в двойном
логарифмическом масштабе зависимость (11.17) изображается прямой линией).
Этот результат был большим успехом теории микродозиметрии. При малых дозах в уравнении (1) остаются только линейные члены, что означает, что ОБЭ больше не зависит от дозы. Подобные рассуждения могли бы также связать между собой значения ОБЭ при малых и больших дозах, но экспериментального подтверждения такой связи получить не удалось.
Заметим, что все рассу- применения микродозимет-
рических функций (у и г) и разработанной для них своеобразной статистики. Поскольку речь идет о повреждающем эффекте при двух
попаданиях в микрообъем, а вероятность каждого попадания про
порциональна удельной энергии г, то два попадания — это просто
квадрат г.
Путем таких рассуждений Келлерер и Росси пришли в точности к тому же результату, что ОБЭ нейтронов обратно пропорциональна
квадратному корню от дозы, а при малых дозах становится постоянной.
Чисто микродозиметрический подход позволял также определить размер «сайта» и можно было надеяться, что наконец биологически ориентированная модель микродозиметрии построена. Однако связать факт двунитевых разрывов ДНК с полученными в расчетах по гипотезе прямого действия размерами сайтов порядка микрометров, никак не удавалось: реально им следовало приписывать размеры порядка десятков нанометров.
Разительное расхождение сайтовой модели с экспериментом было обнаружено группой Гудхеда, использовавшей низкоэнергетическое
рентгеновское излучение характеристических линий алюминия с энергией 1,5 кэВ и углерода, 0,28 кэВ, в опытах на культуре клеток китайского хомячка. Вопреки ожиданиям, углеродная линия оказалась намного эффективнее алюминиевой, а размер сайта составил 70 и 7 нм соответственно, что близко к диаметру нативной молекулы ДНК (2 нм). Этот и многие другие результаты позволяют считать, что сайт имеет сложную природу.
Другим недостатком теории дуального действия является отсутствие учета внутренней структуры трека, о которой мы уже говорили и которая послужила основой для разработки трековых моделей. Большим этапом развития микродозиметрии явились исследования школы Буттса-Каца. Создаваемые в настоящее время пакеты программ учитывают и положения, развивавшиеся на основе частично упомянутых разработок Росси и Келлерера. Трековые модели основное внимание уделяют структуре трека заряженной частицы. Выше подробно обсуждалась эта структура. По этим представлениям, 5- электроны, отлетающие от ствола трека на заметное расстояние, можно считать образованными в свободных соударениях (что происходит при передаче электронам энергии, намного превосходящей потенциал ионизации атома). Согласно классической формуле Резерфорда, дифференциальное эффективное сечение а§ образования таких электронов с энергией выше Е§ обратно пропорционально квадрату их конечной энергии:
da8 = CZ^dEi/^Ej, (11.18) где Z* — эффективный заряд частицы, который, кстати, изменяется при малых скоростях частицы /3, согласно формуле (11.11). Несмотря на сложный характер зависимости пробег-энергия электронов при учете их почти диффузионного рассеяния в среде, выполняется закон обратной пропорциональности создаваемой ими дозы квадрату радиуса трека D 1 / г 2.
Упомянем о двух результатах последних работ по «трековой теории». Зависимость ОБЭ от ЛПЭ оказалась не однозначной, как утверждал Барендсен, автор кривых рис. II. 1, а эта функция проходит через максимум при разных ЛПЭ для разных зарядов частиц, даже если биологический тест один и тот же.
Впоследствии этот вывод был блестяще подтвержден многочисленными экспериментами. К такому же выводу можно прийти на основании формулы для эффективного заряда частицы, но оказалось, что положение максимума различается даже для пучков ионов разных изотопов одного и того же элемента, так как их зависимости пробега от энергии не совпадают.
Мы уже не раз повторяли, что после того, как ОБЭ проходит через максимум, новые повреждения уже не эффективны, и ОБЭ стремительно уменьшается. Как уже говорилось, это приводит к пе- реубиванию клеток, «overkill». Недавно эта гипотеза была проверена непосредственно в опытах с электрофорезом гелей. В итоге этих опытов возник неожиданный результат: уменьшение репараций — главная 6*
причина снижения ОБЭ, а вовсе не «overkill». Это лишь один пример того, как выводы моделирования постоянно подвергаются все новым испытаниям при проверке в эксперименте!
Здесь мы переходим к наиболее спорному моменту трековой теории. В настоящий момент принято считать, что за высокую концентрацию энергии ответственны флуктуации ионизации, то есть рои ионов, и вероятность эффекта непосредственно зависит от ЛПЭ. Однако есть и другая точка зрения. Замедляясь, электроны наиболее реактивны при их энергиях в несколько сотен электронвольт, когда образуются, как мы определили выше, короткие треки и S-электроны, а также Оже-электроны (напомним, что их энергия точно определена и близка к потенциалу ионизации АГ-оболочки).
Равная или большая энергия передается атомным ядрам отдачи, радиационный эффект от которых проявляется, например, в виде окрашивания кристаллов КС1 (Дюрап, Платцманн). Так или иначе отсюда возникают поправки, возможно немалые, и это особенно очевидно для всей области низких ЛПЭ, где обычная теория просто приравнивает коэффициенты ОБЭ единице, но их значения могут доходить до 2 и выше. При больших ЛПЭ эта поправка может уменьшиться, так как вклад обычных ионизаций возрастает из-за перекрытия ионных «шпор». Эти вопросы, детально разработанные в 60-х и 70-х гг. XX в. в русских публикациях (ИТЭФ, ФИАН), в последнее время вновь стали обсуждаться зарубежными авторами.
Моделирование в микродозиметрии
На основании вышеизложенного можно предположить, что в решении проблем микродозиметрии преобладают аналитические методы математического моделирования, и это действительно так. Однако широко используются также методы физического моделирования и создаются приборы, эквивалентные биологическому объекту. Их применение во многих случаях позволяет избежать громоздких расчетов, а также многих недостатков, заложенных в самих гипотезах, принимаемых при этих расчетах.
Исторически наиболее ранним и до сих пор широко распространенным является ионизационно-импульсный метод микродозиметрии, в котором применяется бесстеночный газоразрядный пропорциональный счетчик. Физический процесс в нем тот же, что и в ионизационной камере, однако ионы, ускоренные электрическим полем, дают заранее усиленный сигнал. Масса газа в объеме прибора соответствует моделируемому микрообъему, а эквивалентность газа жидкости обеспечивается выполнением принципа Брэгга-Грея. Разумеется прибор имеет стенки, но их влияние исключено специальным дополнительным электрическим полем. Применяя двухкамерную конструкцию, удается даже разделить два процесса: ионизацию среды и газовое усиление.
В однокамерном варианте, так называемом счетчике Росси, были получены спектры событий — распределения у dy — в
чувствительных объемах размером от 0,1 до 10 мкм, а двухкамерный счетчик Буза позволяет довести этот предел до 50,0 А. Заметим, что 1 А = 10 s см = 0,1 нм. Поэтому в последнее время речь все чаще заходит о «нанодозиметрах».
Приборы, уже послужившие нам для иллюстрации механизма образования треков — камера Вильсона и пузырьковая камера, дают повод поразмышлять, не являются ли они по существу нанодозиметрами? Ведь процессы, на которых основано их действие, постоянно наблюдаются в природе: дождь не выпадет, пока в «абсолютно чистой» туче не возникнет центр, инициирующий конденсацию паров, которым может оказаться всего лишь одна частица космического излучения, прошедшая через микроскопический объем с размером порядка тех же ангстремов. Как происходит взрыв парового котла, также вполне известно. Таким образом, энергетический парадокс работает в полную силу и в неживой природе.
Нанодозиметры действительно создаются. Примером является «капле-пузырьковый детектор» Эппла, в котором капелька геля помещается в другую, но тоже гелевую среду. Эта капля приводится в метастабильное состояние, в котором она готова испариться, но это происходит лишь при наличии некоторого количества ионов. Авторы прибора утверждают, что количество центров капельного испарения соответствуют эквивалентной или биологической дозе (это зависит от режима работы прибора). Подобных публикаций насчитывается уже довольно много (на них в библиотеках Интернета заведено ключевое слово «nanodosimetry»). Но, по-видимому, серьезные разработки в этой области только еще начинаются.
* *
*
Рассмотренные нами сведения о процессах поглощения энергии излучения необходимы для выяснения механизмов радиобиологических процессов. Возникающие на физической стадии ионизированные и возбужденные молекулы запускают сложную цепь реакций, приводящих в конечном счете к тестируемому биологическому эффекту. Поэтому информация о первичных событиях (число ионизаций, характер их распределения и т. д.) служит отправной точкой биофизического анализа механизмов биологического действия ионизирующих излучений. Попытки как-то ввести эти механизмы, предпринятые микродозиметрией, коснулись лишь стадии определения эффективности передачи энергии чувствительным микрообъемам и никак не затронули существа реакции тканей или даже клеток на воздействие излучения. В принципе в клетке может существовать некая микроструктура (ми- шенъ\ поражение которой прямо или косвенно приведет к конечному биологическому эффекту. Например, глубокая деградация какого- либо мембранного участка может резко нарушить ионный гомеостаз и привести к быстрой гибели клетки, а поражение определенного участка хромосомы может привести к метаболическим изменениям,
которые постепенно приведут к нарушению жизненно важных функций и также к гибели клетки. Априори можно предполагать, что прохождение трека частицы через «мишень» приведет к ее поражению вследствие ионизации большого числа атомов, составляющих такую мишень, если для конечного эффекта достаточно этой ионизации в пределах определенной структуры.
Такого рода соображения открывают широкие возможности для формального анализа первичных процессов, приводящих к тестируемому биологическому эффекту облучения. Проводя соответствующую математическую обработку кривых, отражающих зависимость биологического эффекта от поглощенной дозы излучения, можно попытаться оценить минимальное количество актов ионизации, достаточное для возникновения эффекта, примерный размер мишени, в которой должны произойти акты ионизации, и т. д. Такой анализ (подробнее он будет рассмотрен в следующей главе) позволит получить важную информацию о характере ионизации, которая произошла в объекте на начальной стадии действия излучения и спустя определенное время (секунды или часы) приведет к конечному биологическому эффекту.
Глава III
ЗАВИСИМОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ОТПОГЛОЩЕННОЙ ДОЗЫ ИЗЛУЧЕНИЯ
Исследования, выполненные еще на начальном этапе развития радиобиологии, позволили в общих чертах установить качественную картину лучевого поражения клеток и разнообразных многоклеточных организмов. Экспериментаторы с большим интересом подвергали биологические объекты «рентгенизации» или действию эманации радия. Они отмечали, что в результате облучения угнетается клеточное деление, возникают аномалии роста и развития, происходит атрофия кроветворных и других органов, дегенерация семенников и яичников, гибель различных организмов, включая млекопитающих; наблюдается бластомогенное действие радиации и другие отдаленные во времени биологические эффекты облучения. Еще в начале XX века были описаны различные реакции клеток на облучение — от временной задержки роста и размножения до полной деградации и лизиса. Выраженность эффекта зависела от дозы облучения и особенностей объекта — его физиологического состояния, генетической конституции и др.
Принцип попадания и концепция мишеней
Зависимость «доза-эффект». Количественные закономерности
Строгие количественные эксперименты впервые были проведены в конце 20-х годов. Этому способствовало два обстоятельства. Во- первых, широкое распространение получают ионизационный метод дозиметрии излучения и использование в качестве единицы экспозиционной дозы рентгена. Благодаря этому облучение экспериментальных объектов становится строго дозированным, и условия опыта могут быть многократно воспроизведены. Во-вторых, для количественных экспериментов радиобиологи стали использовать клоны генетически однородных клеток, вирусные частицы, препараты макромолекул, т. е. такие системы, в которых легко определить реакцию единичного объекта на действие излучения в данной дозе.
Кривые «доза-эффект»
Уже в первых радиобиологических исследованиях отмечалась важнейшая закономерность — вероятностная природа проявления реакции клеток на облучение. При оценке зависимости доли погибших клеток от величины дозы облучения выяснялось, что различные одноклеточные объекты гибнут при самых малых дозах облучения, с ростом дозы увеличивается число погибших клеток, однако даже при облучении в очень высоких дозах некоторое число клеток сохраняет жизнеспособность.
Существенно, что с ростом дозы облучения наблюдалось увеличение не столько степени проявления эффекта (глубины поражения отдельной клетки), сколько доли летально пораженных клеток в облученной популяции. Примеры типичных графических кривых, отражающих зависимость доли выживших клеток от величины дозы облучения (кривые «доза-эффект»), приведены на рис. III. 1.
Рис. III. 1. Зависимость конечных биологических эффектов от дозы облучения: а) гибель инфузорий Colpidium colpoda через 2 часа после облучения; б) гибель яиц аскариды после облучения в аэробных условиях; в) инактивация вируса табачной мозаики у-лучами; г) инактивация сухой рибонуклеазы
Для построения этих кривых определенное количество объектов данного вида облучали в широком диапазоне доз; после облучения в каждой дозе определяли долю объектов, сохранивших исходные свойства, по отношению к их общему числу до облучения.
Изображенные на рис. III. 1 кривые «доза-эффект» построены разными авторами на основании экспериментов с простейшими организмами, одиночными клетками, вирусами и ферментами. Разнообразны объекты, различны диапазоны использованных доз излучения, но во всех случаях наблюдается интересная закономерность: при облучении ) уже в самых малых дозах обнаруживаются инактивированные организмы, клетки, вирусные частицы или макромолекулы, а при дозах, в сотни и тысячи раз больших, все еще удается обнаружить объекты, сохранившие исходные биологические свойства, т. е. не пораженные излучением (однако, в конечном итоге, все кривые достигают нулевой точки).
Возможная «биологическая» интерпретация кривых «доза- эффект», наблюдаемых в экспериментах с клетками, могла бы основываться на представлении о широкой индивидуальной вариабельности радиочувствительности. Действительно, фармакологам хорошо известно, что S-образные кривые «доза-эффект», получаемые при действии ядов на животных и клетки, связаны с их различной индивидуальной устойчивостью к действию токсического агента. Вплоть до некоторой пороговой дозы все организмы переносят действие яда; при концентрациях, превышающих пороговые, резко возрастает доля погибших особей; а при некоторой дозе яда обнаруживается 100% летальный эффект. Чем меньше выражены индивидуальные различия, тем круче наклон кривой «доза-эффект».
Однако такое объяснение в случае радиационного воздействия до сих пор считается малоубедительным. Во-первых, трудно представить, что внутри генетически однородной популяции клетки в десятки тысяч раз различаются по устойчивости к облучению. Во-вторых, на кривых «доза-эффект» отсутствует четкий порог: как угодно малая доза излучения убивает некоторое число клеток, а при высоких дозах все еще обнаруживаются выжившие (исключение составляют ситуации, когда в результате предшествующего облучения в малых дозах клетки становятся более радиорезистентными, реагируют явлением гормезиса). Тем не менее, полагают, что вряд ли у клеток одного клона существуют такие различия в строении или обмене веществ, которые делают их тысячекратно различающимися по радиочувствительности. Впрочем, в этом умозрительном заключении не учтены факторы состояния клеток в разных стадиях клеточного цикла, различий по степени вовлеченности в реализацию физиологических функций (по функциональному состоянию), по состоянию питания из прилежащих микрообъемов питательной среды, различий по ориентации по отношению к потоку ионизирующего излучения и т. и.
Еще труднее предполагать, что среди макромолекул рибонуклеазы (рис. III. 1, г), обладающих одинаковыми физико-химическими свойствами, одни молекулы утрачивают каталитическую активность при действии небольших доз, а другие сохраняют активность при действии тысячекратно превосходящих доз лишь в силу особенностей самого объекта, подвергающегося облучению. Хотя и при этом так же, как и в случае клеток, не учитываются различия в длительности предшествующего облучению существования и функциональной активности разных молекул фермента (их «возраста»), выделенных к тому же из разновозрастных клеток, — различия, основанные на постепенном «старении» молекул, изменении в них степени первоначальной «жесткости», исходного состояния прочности химических связей между атомами, способных оказывать заметное влияние на химическую устойчивость молекул к действию ионизирующей радиации.
Рассматриваемые кривые «доза-эффект» показывают, какая доля объектов инактивируется при поглощении системой определенного количества энергии ионизирующих излучений. Представим, что эта же система (суспензия клеток, препарат вирусных частиц или макромолекул) получает энергию иным путем, например за счет нагревания от какого-либо источника тепла. В этом случае кривая «доза- эффект» примет иной вид. Вплоть до некоторой температуры Ту не обнаруживаются инактивированные объекты; после этой пороговой температуры число пораженных объектов возрастает до максимального значения, и если процесс термоинактивации необратим, то при достижении некоторой температуры Т) мы не обнаружим ни одного вируса, макромолекулы и тем более клетки, оставшихся непораженными.
Объяснение наблюдаемого вида кривых зависимости эффекта от дозы облучения все же следует искать в особенностях воздействия ионизирующих излучений, в способе сообицения ими энергии биологическому объекту, т. е. в иной, биофизической трактовке экспериментальных кривых «доза-эффект». Она основывается на излагаемых в данном учебнике основополагающих принципах — представлении о дискретной природе ионизирующих излучений и вероятностном характере передачи энергии внутриклеточным молекулярным структурам.
Гипотеза «точечного нагрева»
В опытах по термоинактивации, о которых шла речь, энергия от источника тепла сообщалась всем объектам равномерно и одинаково за счет теплопроводности воды или воздуха (в жидких или сухих препаратах соответственно). Ионизирующие частицы, напротив, сообщают системе энергию дискретными порциями, и процесс передачи энергии носит статистический характер. Поэтому среди совокупности облучаемых микроструктур одни из них с определенной вероятностью поглощают энергию излучения, тогда как другие вообще «не знают», что облучение имело место.
Иными словами все микроструктуры могут поглощать энергию с некоторой вероятностью, так что в итоге определенная часть их поглощает больше, другая — меньше, а некоторая доля их может и вообще не провзаимодействовать. Такие представления, основанные на фундаментальных физических концепциях о механизме взаимодействия ионизирующих излучений с веществом, позволяют объяснить количественные закономерности, наблюдаемые в радиобиологических экспериментах.
Ф. Дессауэр в начале 20-х гг. подошел к проблеме биологического действия ионизирующей радиации, исходя из физической природы излучения. Выдвинутая им гипотеза «точечного нагрева» основывалась на следующих положениях):
ионизирующие излучения обладают очень малой объемной плотностью по сравнению с видимым или ультрафиолетовым светом энергетически эквивалентной дозы;
фотоны рентгеновского или у-излучения, ускоренные электроны или тяжелые заряженные частицы обладают огромной энергией, величина которой значительно превосходит энергию любой химической связи;
облучаемый биологический объект, например клетка, состоит, с одной стороны, из относительно менее значимых и, с другой — весьма существенных для жизни микрообъемов и структур;
в облучаемом объекте при поглощении относительно небольшой общей энергии в отдельных случайных и редкорасположенных микрообъемах остаются настолько большие порции энергии, что их можно сравнить с микролокальным нагреванием и они могут производить почти любые узколокальные изменения в веществе;
так как распределение «точечного тепла» является чисто статистическим, то конечный эффект в клетке будет зависеть от случайных попаданий дискретных порций энергии в жизненно существенные микрообъемы внутри клетки. С повышением дозы увеличивается вероятность таких попаданий, и наоборот, при понижении дозы вероятность снижается. Из этого следует, что любая самая малая доза может соответственно с малой вероятностью и, следовательно, малой частотой вызывать экстремальный биологический эффект (например, гибель клетки), но даже при очень высокой дозе могут с малой вероятностью и малой частотой сохраниться отдельные неповрежденные клетки.
В 1922 г. Блау и Альтенбургер предложили общую формулу для расчета кривых «доза-эффект», основанную на статистическом
принципе «попадания»:
(ШЛ)
к=0
где Nq — исходное число клеток до облучения, N — число клеток, прореагировавших данным образом, D — доза облучения, п — требуемое число попаданий в мишень и v — коэффициент, пропорциональный объему V «мишени», попадание в которую приводит к оцениваемому эффекту (точный смысл коэффициента v будет определен при рассмотрении статистики одноударных процессов).
Блау и Альтенбургер из уравнения (Ш.1) рассчитали теоретические кривые «доза-эффект» для разного «числа попаданий в мишень». Эти кривые соответствовали реальным дозовым кривым, наблюдаемым при облучении изолированных клеток.
Принцип попадания и концепция мишеней
В работах, выполненных Дж. Кроутером, Д. Ли, К. Циммером, Н. В. Тимофеевым-Рессовским и др., были предложены и использованы для анализа радиобиологических эффектов принцип попадания и концепция мишени (или, как иногда называют, «теория» мишеней).
В 1924 г. Дж. Кроутер сформулировал «теорию попадания» (принцип попадания). Считая попаданием возникновение акта ионизации в облучаемом объеме, автор предположил, что регистрируемый эффект связан с некоторым критическим числом ионизаций (попаданий) в пределах мишени, занимающей определенный чувствительный объем внутри клетки. Параметры мишени оказались сопоставимыми с размерами центриолей и ядрышек. С тех пор в радиобиологии начался активный поиск мишени на основании статистических принципов попадания. Он привел к выводу о ведущей роли ядра и внутриядерных наследственных структур в летальном поражении клетки.
Одиночные и множественные попадания в мишень
В общем виде количественный анализ, основанный на принципе попадания, состоит в том, что полученные в эксперименте кривые «доза-эффект» интерпретируются на основании следующих физических положений:
ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде;
акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и подчиняются пуассоновскому распределению;
исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую чувствительную область гетерогенной биологической структуры, так называемую мишень, составляет по крайней мере п ^ 1.
Рассмотрим простейший случай «одноударного процесса», когда попаданием считают одиночную передачу некоторого минимального количества энергии. Переданная энергия («энергия попадания») определяет характер повреждения, зависящий и от специфики облучаемой системы, т. е. тестируемый эффект наступает лишь тогда, когда определенное минимальное количество энергии поглощено чувствительной областью — мишенью.
Представим, что облучаемая система состоит из No объектов, каждый из которых обладает мишенью сечением S и объемом V. Пусть для инактивации объекта достаточно, чтобы трек плотноионизирую- щей частицы прошел через сечение мишени S; такое событие будем именовать попаданием.
Это предположение имеет физический смысл. Так, например, а- частица с энергией 2,5 МэВ образует около 3000 пар ионов на 1 мкм пути. Если пренебречь неравномерностью распределения ионов вдоль трека, то даже при толщине мишени 10-3 мкм с большой вероятностью в пределах мишени, через которую проходит трек частицы, возникнет несколько ионизаций. Если траектории частиц распределяются по поперечному сечению объекта случайным образом и не зависят друг от друга, то вероятность одного, двух, ..., п попаданий в мишень, находящуюся в пределах объекта, описывается уравнением:
(ПГ2)
где а — среднее число попаданий в мишень. Если Ф — флюенс, то есть среднее число частиц, пролетающих через единичную площадку, a S — сечение мишени, то а = 5Ф. Как было определено формулой (1.8) (гл. I), флюенс Ф пропорционален поглощенной дозе излучения.
При сколь угодно малой дозе излучения существует вероятность прохождения частицы через одну из мишеней. С увеличением потока частиц (т. е. с ростом дозы излучения) в объекте возрастает число мишеней, в которые произошло попадание.
Если No — общее число объектов в облучаемой системе, a N — число объектов, сохранивших после облучения исходные свойства (т. е. «выживших»), то величина N/Nq соответствует вероятности непопадания (п = 0). Из уравнения (III.2) для случая п = 0 (учитывая, что 0! = 1) получим
N _ (5Ф)°е”5Ф _ _№ “ 0! “6
При некоторой дозе облучения выполняется условие 5Ф = 1. Это соответствует случаю, когда в среднем число попаданий равно числу мишеней. В действительности же часть попаданий испытали уже однажды пораженные мишени, а некоторые не претерпели ни одного попадания.
Согласно формальной статистике Пуассона при 5Ф = 1 реально поражается только 63% мишеней, а 37% оказываются непораженными). Действительно, подставив в уравнение (III.3) значение 5Ф = 1, получим
ТГ = е“5Ф = е”1 = °, 37.ТГ = е“5Ф = е”1 = °, 37.(Ш.4)(Ш.4)Из соотношения (III.3) определяется и доза облучения, при которой выживает 37% объектов, т. е. N/Nq = 0,37, если воспользоваться формулой (1.8) для пересчета флю-
ТГ = е“5Ф = е”1 = °, 37.
ТГ = е“5Ф = е”1 = °, 37.
(Ш.4)
(Ш.4)
Доза облученияДоза облученияРис. III.2.Зависимость междучислом непораженных мишеней и поглощенной дозой ионизирующих излучений: 1 — объект с мишенью сечением S; 2 — треки частицРис. III.2.Зависимость междучислом непораженных мишеней и поглощенной дозой ионизирующих излучений: 1 — объект с мишенью сечением S; 2 — треки частиценса в дозу:
Доза облучения
Доза облучения
Рис. III.2.Зависимость между
числом непораженных мишеней и поглощенной дозой ионизирующих излучений: 1 — объект с мишенью сечением S; 2 — треки частиц
Рис. III.2.Зависимость между
числом непораженных мишеней и поглощенной дозой ионизирующих излучений: 1 — объект с мишенью сечением S; 2 — треки частиц
И = 1,602 • Ю"10ГФ Гр, (П1.5) где L — средняя Л ПЭ в единицах МэВ • г-1см2.
Отношение N/Nq легко определить в эксперименте: это доля «выживших» объектов по отношению к их общему числу до облучения. Узнав, при какой дозе облучения выживает 37% объектов, т. е. N/Nq = 0,37 (эту дозу излучения обозначают символом D37), мы можем определить сечение мишени, принимая, что дозе D37 соответствует флюенс Ф37, который определяется формулой (III.5):
5Ф37 = 1, S = 1/Ф37. (Ш.6)
На рис. III.2, а-б представлена схема, иллюстрирующая зависимость числа пораженных мишеней от дозы облучения. Из рис. III.2, а видно, что даже при облучении в малой дозе некоторое число частиц проходит через мишени и вызывает их инактивацию. С ростом дозы число пораженных объектов возрастает резко, почти линейно, а затем все более вероятно повторное
прохождение частиц через уже пораженные мишени. При дозе D37 общее число частиц соответствует числу мишеней (SD = 1), но 37% объектов остаются непораженными,
тогда как некоторые из 63% мишеней испытали по два и более попаданий (рис. III.2, б). Даже при очень большой дозе облучения все же какое-то число объектов оказалось не пораженным излучением (рис. III.2, в). Графически зависимость доли выживших клеток от величины дозы выражается экспонентой (рис. III.2, г)
N/No = е"5Ф = e~D/D31. (III.7)
Аналогичные рассуждения можно использовать для анализа «одноударных процессов» при действии рентгеновского или у-излучения, вызывающего редко расположенные акты ионизации по всему объему облучаемого объекта. В этом случае можно установить еще один важный параметр мишени — ее объем.
Пусть в системе имеется No объектов с мишенью объемом У, и для инактивации достаточно одиночной ионизации в пределах этой мишени. Если акты ионизации подчиняются распределению Пуассона, то вероятность 1, 2, ..., п попаданий в мишень описывается уравнением того же типа, что и (П1.2):
РМ = ЛГ’ (ПГ8)
где а — среднее число попаданий в мишень, пропорциональное дозе, то есть а = vD. причем смысл коэффициента будет определен, если воспользоваться правилом, по которому в показателе экспоненты должна стоять физически безразмерная величина). Для случая п = 0 доля выживших объектов определяется из соотношения
N _ (vD^e~uD _ _№ “ 0! “6
На рис. III.3, a-в показано, как с ростом числа ионизаций в облучаемой системе (т. е. с ростом дозы ионизирующего излучения) увеличивается доля пораженных объектов. Как и в случае плотной ионизации, при самой малой дозе вероятно возникновение ионизации хотя бы в одной из мишеней, и при дозе D37 число ионизаций в среднем соответствует числу мишеней. Зависимость между долей непораженных объектов N/No и поглощенной дозой экспоненциальна
Доза облученияДоза облученияРис. III.3. Зависимость между числом непораженных объектов и дозой 7- или рентгеновского облучения: 1 — объект с мишенью объемом V; 2 — акты ионизацииРис. III.3. Зависимость между числом непораженных объектов и дозой 7- или рентгеновского облучения: 1 — объект с мишенью объемом V; 2 — акты ионизацииДоза у-лучей, х!03 ГрДоза у-лучей, х!03 ГрРис. III.4. Инактивация вируса табачной мозаики 7-излучением. Кривая «доза-эффект» преобразована из соответствующей кривой на рис. III.1, вРис. III.4. Инактивация вируса табачной мозаики 7-излучением. Кривая «доза-эффект» преобразована из соответствующей кривой на рис. III.1, в(рис. III.3, г), а по величине дозы D37 можно определить так называемый коэффициент радиочувствительности и. пропорциональный объему мишени V.
Доза облучения
Доза облучения
Рис. III.3. Зависимость между числом непораженных объектов и дозой 7- или рентгеновского облучения: 1 — объект с мишенью объемом V; 2 — акты ионизации
Рис. III.3. Зависимость между числом непораженных объектов и дозой 7- или рентгеновского облучения: 1 — объект с мишенью объемом V; 2 — акты ионизации
Доза у-лучей, х!03 Гр
Доза у-лучей, х!03 Гр
Рис. III.4. Инактивация вируса табачной мозаики 7-излучением. Кривая «доза-эффект» преобразована из соответствующей кривой на рис. III.1, в
Рис. III.4. Инактивация вируса табачной мозаики 7-излучением. Кривая «доза-эффект» преобразована из соответствующей кривой на рис. III.1, в
Таким образом, точный смысл коэффициента v = I/D37 ~ это обратная величина средней дозы D^ при которой выживаемость уменьшается в е = 2,72 раза (т. е. 1/е = 0,37). Теоретические положения концепции мишени, основанные на предположении об «одноударности» процесса попадания, предсказывают экспоненциальную зависимость «доза-эффект». В реальных условиях эксперимента такую зависимость наблюдали при облучении макромолекул, вирусов, бактериальных спор, некоторых одноклеточных организмов (см., например, рис. III. 1, а-г). Чтобы выявить существование экспоненциальной зависимости эффекта облучения от поглощенной дозы, поступают следующим образом. Объекты облучают в широком диапазоне доз, для каждой дозы определяют долю выживших N/No и находят значение натурального логарифма этой величины. Если на графике, отражающем зависимость In N/No от поглощенной дозы, все точки укладываются на прямую, значит выполняется соотношение
lnN/N0 = -vD, или N/No = е"^. (ШЛО)
из рис. III.1, в. Видно, что доля вирусов, сохранивших исходную активность, экспоненциально зависит от дозы облучения, так как все экспериментальные точки укладываются на прямую, т. е. выполняется уравнение (ШЛО).из рис. III.1, в. Видно, что доля вирусов, сохранивших исходную активность, экспоненциально зависит от дозы облучения, так как все экспериментальные точки укладываются на прямую, т. е. выполняется уравнение (ШЛО).На рис. III.4 представлена зависимость эффекта от дозы, полученная преобразованием в полулогарифмических координатах кривой
из рис. III.1, в. Видно, что доля вирусов, сохранивших исходную активность, экспоненциально зависит от дозы облучения, так как все экспериментальные точки укладываются на прямую, т. е. выполняется уравнение (ШЛО).
из рис. III.1, в. Видно, что доля вирусов, сохранивших исходную активность, экспоненциально зависит от дозы облучения, так как все экспериментальные точки укладываются на прямую, т. е. выполняется уравнение (ШЛО).
Количественный анализ, основанный на принципе попадания, не в состоянии вскрыть природу физико-химических процессов, развивающихся в клетке вслед за возникновением одиночных актов ионизации (попаданий). Однако он позволил ввести в радиобиологию представление о вероятностной природе единичной реакции клетки на облучение. Появилась возможность корректного описания кривых «доза-эффект», анализа важнейших параметров кривых, планирования радиобиологического эксперимента и точного количественного учета полученных результатов.
Экспоненциальная зависимость «доза-эффект» — важный, но не единственный критерий одноударности процесса инактивации. Если действительно одного попадания в мишень достаточно для инактивации объекта, то должны выполняться следующие требования:
— эффект, вызываемый облучением в данной дозе, не зависит от интенсивности излучения (мощности дозы) и от того, какими частями доза сообщалась объекту;
— при одинаковом эффекте вызывающая его доза различных излучений возрастает при переходе от редко- к плотноионизиру- ющим частицам.
Рассмотрим значение этих ограничительных условий. Если выполняется первое требование, значит тестируемый эффект не возникает вследствие кумулятивного действия нескольких последовательных ионизаций (иначе эффект зависел бы от распределения ионизации во времени). Каждая ионизация, возникающая в пределах облучаемых объектов, имеет определенную вероятность оказаться причиной эффекта, но эта вероятность при одноударном процессе не должна зависеть ни от времени, прошедшего с момента предыдущей ионизации, ни от времени, отделяющего ее от последующей ионизации. Следовательно, эффект данной дозы должен определяться только ее величиной (т. е. числом возникших актов ионизации); интенсивность излучения и распределение дозы во времени не должны играть никакой роли.
Выполнение второго требования означает, что плотноионизирую- щие излучения менее эффективны, чем редкоионизирующие. Действительно, если одиночной ионизации достаточно для возникновения тестируемого эффекта, то частицы, производящие большое число ионов на единицу пути, вызовут в пределах мишени множество «ненужных» ионизаций. Редкоионизирующие излучения генерируют сгустки ионов, значительно удаленные друг от друга, и вероятность возникновения нескольких ионизаций в пределах мишени малого размера незначительна. Величина поглощенной дозы определяет общее число ионизаций, произведенных данным видом излучения в единице объема. При одноударном процессе большинство ионизаций, вызванных плотноионизирующим излучением, «бесполезно». Поэтому при равной дозе, т. е. при равном общем числе ионизаций, редкоионизирующие излучения окажутся более эффективными.
7 Ю. Б. Кудряшов
ааРис. III.5. Теоретические кривые выживаемости для объектов, инактивируемых в результате нескольких попаданий: а) в полулогарифмическом масштабе; б) в обычном масштабе. «Ударность» процесса инактивации обозначена на верхнем рисункеРис. III.5. Теоретические кривые выживаемости для объектов, инактивируемых в результате нескольких попаданий: а) в полулогарифмическом масштабе; б) в обычном масштабе. «Ударность» процесса инактивации обозначена на верхнем рисункеНапротив, если тестируемый эффект наступает вследствие большого числа ионизаций в пределах мишени (многоударный механизм инактивации), то частицы с высокой плотностью ионизации окажутся значительно эффективнее, чем редкоионизирующие.
а
а
Рис. III.5. Теоретические кривые выживаемости для объектов, инактивируемых в результате нескольких попаданий: а) в полулогарифмическом масштабе; б) в обычном масштабе. «Ударность» процесса инактивации обозначена на верхнем рисунке
Рис. III.5. Теоретические кривые выживаемости для объектов, инактивируемых в результате нескольких попаданий: а) в полулогарифмическом масштабе; б) в обычном масштабе. «Ударность» процесса инактивации обозначена на верхнем рисунке
Кривые «доза-эффект» при многоударном механизме инактивации отличаются от экспоненциальных дозовых кривых, наблюдаемых в случае одноударного процесса. В полулогарифмическом масштабе семейство дозовых кривых для случая п = 2, 3, ..., к представлено на рис. III.5 (по Дессауэру, 1954).
Чем больше «ударность» мишени, тем заметнее «плечо» — начальный, более горизонтальный участок кривой. Вслед за плечом следует переход к прямолинейному участку, наклон которого совпадает с наклоном соответствующей одноударной кривой. Вид дозовой кривой
при многоударном механизме инактивации определяется тем, что при малых дозах лишь небольшое число объектов может испытать требуемое число попаданий к, а все остальные — не более к — 1 попаданий. По достижении к—1 попаданий
во все или большинство объектов возникает ситуация, при которой последнее, к-е, попадание приводит к тестируемому эффекту. Начинаяво все или большинство объектов возникает ситуация, при которой последнее, к-е, попадание приводит к тестируемому эффекту. Начинаяс этой дозы кривая принимает вид, характерный для одноударногос этой дозы кривая принимает вид, характерный для одноударногопроцесса.
во все или большинство объектов возникает ситуация, при которой последнее, к-е, попадание приводит к тестируемому эффекту. Начиная
во все или большинство объектов возникает ситуация, при которой последнее, к-е, попадание приводит к тестируемому эффекту. Начиная
с этой дозы кривая принимает вид, характерный для одноударного
с этой дозы кривая принимает вид, характерный для одноударного
Формально такие кривые могут быть получены суммированием всех объектов, получивших 0, 1, 2, ..., п — 1 попаданий; согласно распределению Пуассона их точное число выражается соотношением (III. 1), а доля выживших, т. е. претерпевших от 0 до п—1 попаданий, определяется следующей формулой:
(Ш.11)(Ш.11)N _ -vD
(Ш.11)
(Ш.11)
No 2-, у.
к=0
где N — число выживших, а No — общее число особей в облученной совокупности объектов. Уравнение для одноударного процесса легко получить из (III.11), подставив п = 1.
На основании принципа попадания и концепции мишени можно анализировать кривые «доза-эффект», полученные в эксперименте. В зависимости от вида объекта и характера излучения получают различные дозовые кривые — от простых экспоненциальных до сигмоидальных с различной шириной плеча. Наиболее надежно поддаются формальному анализу одноударные радиобиологические реакции, в которых попаданием служит одиночная ионизация или рой ионов в пределах мишени. В этом случае, располагая кривыми «доза-эффект» для излучений с различными значениями ЛПЭ, можно рассчитать размеры и число мишеней, отражающие размеры и число тех элементарных биологических структур, поражение которых вследствие ионизации приводит к регистрируемому биологическому эффекту. Подобное применение принципа попадания позволило впервые определить размеры некоторых макромолекул, вирусов, генов, получить сведения о внутренней структуре бактериальных спор и т. д.
Попадания в мишени и гибель облученных клеток
Лишь в очень ограниченном числе случаев зависимость доли выЛишь в очень ограниченном числе случаев зависимость доли выживших клеток от величины нентой, т. е. простой одноударной кривой. Значительно чаще в эксперименте получают кривые «доза-эффект», которые имеют плечо (рис. III.6, по С.П.Ярмонен- ко, 1988).
Лишь в очень ограниченном числе случаев зависимость доли вы
Лишь в очень ограниченном числе случаев зависимость доли вы
Для построения кривой, используемой в качестве примера, на рис. III.6 взяты данные по выживаемости клеток ELD, полученные в работах С. П. Ярмоненко (рис. III.7, б).
дозы облучения описывается экспо-дозы облучения описывается экспо-Рис. III.6. Определение основных параметров кривой выживанияРис. III.6. Определение основных параметров кривой выживанияОсь абсцисс начинается не от нуля оси ординат, а от выбранной для удобства точки, соответствующей 0,01% выживаемости. Поэтому кривая упирается в ось абсцисс. В действительности же для популяции изолированных клеток не существует критической дозы, при которой гибли бы все 100% особей.
дозы облучения описывается экспо-
дозы облучения описывается экспо-
Рис. III.6. Определение основных параметров кривой выживания
Рис. III.6. Определение основных параметров кривой выживания
Доза рентгеновского облучения, ГрДоза рентгеновского облучения, ГрРис. III.7. Кривая «доза-эффект» для популяции клеток, подвергнутых воздействию д-из- лучения: а) клетки почки человека в культуре; б) линия клеток ELD в культуреРис. III.7. Кривая «доза-эффект» для популяции клеток, подвергнутых воздействию д-из- лучения: а) клетки почки человека в культуре; б) линия клеток ELD в культуреТакой тип кривой описывается уравнением:
Доза рентгеновского облучения, Гр
Доза рентгеновского облучения, Гр
Рис. III.7. Кривая «доза-эффект» для популяции клеток, подвергнутых воздействию д-из- лучения: а) клетки почки человека в культуре; б) линия клеток ELD в культуре
Рис. III.7. Кривая «доза-эффект» для популяции клеток, подвергнутых воздействию д-из- лучения: а) клетки почки человека в культуре; б) линия клеток ELD в культуре
N/No = 1 - (1 - e~D/D°y\ (П1.12) где п — экстраполяционное число, определяемое как значение ординаты в месте ее пересечения экстраполированным прямолинейным участком кривой выживаемости, Do определяет исходную радиочувствительность и вычисляется как приращение дозы, снижающей выживаемость в е раз на прямолинейном участке кривой «доза- эффект». Как видно из рис. III.6, Dq — «квазипороговая доза» — соответству
ет отрезку, отсекаемому от перпендикуляра, проведенного из точки 100-процентной выживаемости на оси ординат, продолжением линейного участка кривой выживаемости. В этом случае доза D37 связана с Dq и Dq простым уравнением
D37 -Do^Dq, (III.13) согласно которому выживает 37% облученных клеток, а 63% гибнет. Это соответствует распределению Пуассона: так как при дозе Do часть попаданий приходится в уже погибшие клетки, 37% клеток не испытывают ни одного попадания. Значение Do является мерой радиочувствительности клеток; для экспоненциальных, одноударных кривых эта доза не отличается по величине от D37, а для сигмоидальных кривых Do и D37 различны.
Рассматриваемый тип кривых выживания формально можно описать с позиции теории мишени рядом моделей. Если простые экспоненциальные кривые выживаемости хорошо описываются моделью «одно попадание — инактивация одной критической мишени», то для сигмоидальных кривых рассматриваются две модели: «много попаданий — инактивация одной критической клеточной мишени» и «одно попадание — инактивация каждой из многих клеточных критических мишеней». Первая модель предполагает наличие в клетке одной уникальной структуры — мишени, для инактивации которой необходимо осуществление в пределах чувствительного объема п актов абсорбции энергии («попаданий»), а вторая модель предполагает наличие в клетке т критических мишеней, для инактивации каждой из которых допускается по одному событию попадания.
Такие формальные модели используются для анализа первичных эффектов передачи энергии излучения клетке. Построив на основании экспериментальных данных как можно более точную кривую «доза- эффект», можно определить величины D37, Do, п и Dq, которые характеризуют радиочувствительность клетки и ее способность восстанавливаться от радиационного поражения. С помощью ЭВМ можно получать теоретические «кривые выживаемости», варьируя основные
параметры n, D^ Dq. При определенных значениях выбранных параметров теоретические кривые выживаемости совпадают с кривыми, полученными на основании экспериментов по облучению клеток. В таком случае можно формально судить о том, какая из моделей лучше описывает характер лучевого поражения клетки, высказывать предположения о числе критических мишеней и количестве событий попадания, необходимых для инактивации.
Развитие этих методов позволило создать весьма сложные модели. Например, Циркль и Тобайес для объяснения инактивации диплоидных и полиплоидных клеток предложили модель «одно попадание — п наборов — I мишеней». В экспериментах по облучению клеток разной плоидности получают семейство сигмоидных кривых. По мнению авторов модели, эти кривые соответствуют уравнению
N/No = [1 - (1 - (Ш.14)
где п — плоидность клетки, т. е. число наборов хромосом, а I — число генов в каждом наборе. Гибель клетки согласно такой модели происходит в результате одного попадания в г-й ген одной и той же хромосомы каждого набора; г-м геном может быть любой из I генов.
Другая возможность формального описания сигмоидальных кривых «доза-эффект» состоит в том, что предполагают наличие в объекте нескольких чувствительных объемов — мишеней, и что реакция наступает лишь после того, как все они получили определенное число попаданий. Согласно теории вероятности уравнение, описывающее «кривую гибели» для системы из т мишеней, имеет вид
к=0
где 2V+ соответствует числу нежизнеспособных объектов. Эта формула может быть распространена и на описание мишени с варьирующим размером щ и неодинаковым числом попаданий, необходимых для инактивации различных мишеней пд
^- = П(1-ВД где В^е"^^^-. (П1.16) г=1 к=0
Такие сложные выражения теряют свое практическое значение. На основании этих уравнений можно построить теоретические кривые «доза-эффект», однако с большой точностью сопоставлять их с кривыми, получаемыми в реальном эксперименте, не представляется возможным. Еще более сложно вычислить на основании экспериментальных дозовых кривых параметры мишени — ц, п и т. Иначе говоря, математический аппарат теории попадания и мишени не позволяет определить размеры и форму тех элементарных биологических структур, которые отвечают за биологические эффекты, описываемые
дозовыми кривыми, более сложными, чем одноударная кривая. Помимо чисто технических трудностей существует целый ряд теоретических ограничений для использования формальных построений теории попадания в анализе сложных радиобиологических процессов.
При облучении молекул и клеток наряду с прямым их повреждением от ионизирующей частицы, попавшей в мишень, в поражающее действие излучения вносят вклад активные продукты, возникающие в окружающем растворителе (радикалы воды и липидов; вещества, секретируемые соседними клетками). При облучении клеток биологический эффект может быть также обусловлен попаданием в различные мишени, параметры которых зависят от физиологического состояния объекта. В каждом отдельном случае поражение определенной структуры может вызываться различными по своей физической природе событиями попадания. В результате мы будем наблюдать появление у клеток генетически однородной популяции одного и того же тестируемого эффекта вследствие различных первичных повреждений.
И наконец, трудно ожидать, что клетка «пассивно» воспринимает полученные повреждения. За счет работы репаративных или компенсаторных систем некоторая часть повреждений может быть восстановлена. Вследствие этих и ряда других причин наблюдаются самые разнообразные формы кривых «доза-эффект», их вид может меняться в зависимости от физиологических особенностей объекта и условий, в которых проводится их облучение.
Таким образом, для интерпретации кривых «доза-эффект» гибели клеток привлекаются сложные математические модели, в основе которых лежит фактический материал радиационной биофизики и радиобиологии. Поэтому для прогнозирования и исследования зависимости биологических эффектов от дозы облучения необходимо совершенствовать методы математического радиобиологического моделирования и учитывать особенности гибели облученных клеток.
Математическое моделирование радиобиологическихэффектов (С. В. Мамихин)
Содержание предыдущих разделов наглядно показывает, что радиобиологические исследования характеризуются высокой степенью математизации. Формализация, то есть описание математическими уравнениями наблюдаемых или предполагаемых механизмов воздействия ионизирующих излучений на живые объекты и его последствий — типичный для радиобиологии способ количественной трактовки этих явлений. Именно такой подход и привел к появлению особой области знаний в радиобиологии, получившей название количественной радиобиологии.
Как уже отмечалось, фундаментом количественной радиобиологии служат принцип попадания и концепция мишени, которые являются системой представлений, позволяющих описывать в математической
Математическое моделирование радиобиологических эффектов 103 форме зависимость частоты поражения мишеней различных геометрических конфигураций. Эта теория основана целиком на физических представлениях и по отношению к биологическим объектам носит формальный характер, что позволяет использовать ее лишь для анализа простых одноударных радиобиологических реакций. Тем не менее именно на основе этих теоретических положений были построены первые математические модели, которые позволили удовлетворительно описать в формализованном виде эффекты воздействия облучения на биологические объекты. Позднее эти представления были дополнены «стохастической концепцией» биологического действия ионизирующих излучений (Хуг, Келлерер, 1969), и были построены модели, более адекватно отражающие сложный вероятностный характер процессов, происходящих в живом объекте при облучении. Дальнейшим развитием математической интерпретации радиобиологических эффектов стало создание так называемой «вероятностной» модели Капульцевича (1978), представляющей синтез двух вышеупомянутых подходов.
Накопление исходной экспериментальной информации, развитие теоретических представлений и совершенствование математических моделей в радиационной биофизике представляют собой неразрывный процесс. Зачастую в процессе создания и исследования математических моделей возникает необходимость осуществить дополнительные экспериментальные исследования в определенном направлении и дать теоретическое обоснование соответствующим математическим построениям.
Возможности применения метода математического моделирования при проведении радиационных исследований со временем расширяются. Например, появление вычислительной техники и повышение ее доступности обусловили развитие такого направления в математическом моделировании, как разработка имитационных моделей, которые применяются в первую очередь для прогнозирования последствий облучения живых объектов.
Краткое описание метода математического моделирования и его применение в биологии
В современной биологии метод математического моделирования используется очень широко. Основное достоинство математического моделирования как научного метода познания состоит в возможности подмены реальных объектов их математическими аналогами, представляющими собой одно или несколько уравнений, описывающих в упрощенной форме отдельные процессы, компоненты или целостные объекты. Это позволяет проводить в численной форме на модели эксперименты, которые слишком трудоемки или невозможны при работе с системой-оригиналом или могут нанести значительные повреждения системе, чувствительной к внешнему воздействию. Математические
104 Гл. III. Зависимость биологического эффекта от поглощенной дозы модели служат эффективным средством для формализованного описания механизмов изучаемых процессов, проведения исследований, прогнозирования и т. д.
Развитие и широкое внедрение математических и вычислительноинформационных методов в современные биологические исследования сняли некогда дискуссионный вопрос о применимости математического моделирования в биологических науках. Математическое моделирование стало полноправным методом научного познания.
Типы моделей
По способу реализации можно выделить два основных типа математических моделей, использующихся в биологии: аналитические (эмпирические) и имитационные. Если рассматривать наиболее простую математическую модель, в которой присутствует только одна переменная X. зависящая от одного фактора t, то ее можно представить в следующем виде: Х^ = F(XqX)d гДе F — некая функция, отражающая зависимость X от t. При рассмотрении моделей, включающих более одной переменной, F является разрешающим оператором совокупности математических соотношений между переменными и факторами. В случае, когда для F найдено точное аналитическое выражение, позволяющее для любого начального условия определить значение переменной X для любого Г модель принято считать аналитической (Федоров, Гильманов, 1980).
Аналитические модели
Подобные модели могут успешно использоваться при рассмотрении отдельных процессов или простых биосистем, подверженных воздействию небольшого числа факторов. Традиционно аналитические модели применяются для формализации представлений о механизмах изучаемых процессов и носят ярко выраженный объяснительный характер в отношении рассматриваемых явлений. Модели этого типа обладают многими удобными с математической точки зрения свойствами, облегчающими их применение для изучения моделируемых объектов. В частности, они позволяют использовать весьма эффективные аналитические методы качественной теории дифференциальных уравнений, теории колебаний и теории бифуркаций). Подробное изложение общих принципов описания кинетического поведения открытых систем с помощью аналитических моделей и приемов качественного исследования биологических процессов можно найти в учебниках Ю. М. Романовского, Н. В. Степановой, Д. С. Чернавского (1984), А. Б. Рубина (1999) и Г. Ю. Ризниченко (2002), поэтому мы опускаем этот материал в данной книге.
При моделировании сложных систем нахождение аналитического выражения для разрешающего оператора F часто оказывается затруднительным или в принципе невозможным. В случае, если соотношения между переменными и факторами не противоречат друг другу и их достаточно для нахождения решения, составляют алгоритм численного решения на компьютере уравнения или системы уравнений, формирующих модель. Оператор F реализуется в виде программы, с помощью которой по входным и начальным данным рассчитываются значения переменных модели. Такие модели называются имитационными.
Имитационние модели
Основа имитационного моделирования заключается в упрощенном графическом описании структуры объекта в виде потоковой диаграммы), написании системы уравнений, отражающих функционирование объекта с позиции такого упрощения, идентификации уравнений функций переноса и параметров, входящих в них, и реализации модели на компьютере, включая отладку программы и проверку работы модели. Все это предваряется и сопровождается сбором информации об объекте, необходимой для построения и проверки модели, и анализом ее поведения. Имитационные модели позволяют наиболее полно использовать всю имеющуюся информацию об объекте моделирования. Признано также, что имитационное моделирование остается пока одним из наиболее эффективных методов количественного прогноза поведения сложных систем (Розенберг, 1984). Традиционным способом реализации имитационных моделей является написание программ на различных алгоритмических языках), которые затем вводятся в компьютер для дальнейшего просчета.
Следует отметить, что зачастую исследователи, столкнувшись с невозможностью окончательной реализации модели в аналитическом виде, пытаются решить проблему, прибегая к приемам имитационного моделирования, реализуя модели в виде программы и просчитывая их на компьютере. Но при этом следует учитывать разницу в изначальном подходе при создании аналитических и имитационных моделей. Те ограничения и запреты, которые накладываются в аналитическом моделировании, например на число переменных, на изменение величин параметров и вида функций и т. д., не могут быть компенсированы даже при реализации аналитических моделей на компьютере.
Подтипы моделей
В свою очередь аналитические и имитационные модели подразделяются по ряду свойств на определенные подтипы. Например, по критерию времени оба типа моделей могут быть статичными и динамическими. В отличие от статичных моделей, динамические отображают динамику поведения объекта во времени. По пространственному критерию модели могут быть точечными или распределенными. Точечные модели описывают поведение моделируемого объекта в одной точке пространства, а распределенные модели отображают этот процесс в некоторой пространственной области. Так например, численные значения переменных динамических точечных моделей имеют только временную динамику, тогда как значения переменных распределенных моделей варьируют и во времени, и в пространстве.
Математические модели могут быть детерминированными или стохастическими. В детерминированных моделях значения рассчитываемых переменных при одних и тех же начальных условиях и входящих параметрах определяются однозначно (с точностью до ошибок вычисления), то есть при введении одних и тех же исходных данных каждый раз получается один и тот же результат. Стохастические модели дают для каждой переменной распределение возможных значений, характеризуемое такими вероятностными показателями, как математическое ожидание, среднее квадратичное отклонение и т. д., то есть при введении одних и тех же исходных данных каждый раз результаты модельных расчетов будут разными.
В ряде случаев применяются так называемые феноменологические (базовые) математические модели, в которых отбрасываются детали механизмов изучаемых процессов. Обычно это диктуется задачами исследований только главных (базовых) признаков объектов.
При выборе подтипа модели определяющим критерием обычно служит круг решаемых задач. Так например, хотя биологические процессы всегда стохастичны в той или иной степени, при решении определенных задач, скажем таких, как рассмотрение долгосрочной динамики объекта в усредненных условиях, исчерпывающим средством могут служить детерминированные и базовые модели.
Для разработки надежных математических моделей требуются параметры, характеризующие вещественные, энергетические и информационные потоки между компонентами моделируемой системы. Соответствующая количественная информация в полном объеме имеется лишь для ограниченного числа биосистем. Для преодоления трудностей, возникающих в связи с неполнотой информации, при моделировании приходится прибегать к экстраполяции или использованию косвенных сведений, полученных при решении других задач. В этом
случае уточнение параметров модели достигается методом последовательных приближений (итераций)) результатов моделирования к имеющимся экспериментальным данным при многократном проигрывании модели на компьютере.
В заключение данного подраздела остановимся на некоторых принципиально важных аспектах моделирования.
Исходные предпосылки в построении моделей. Ключевым моментом при создании моделей являются исходные предпосылки, которые закладываются в их основу. Часто недостатком моделирования является неполное или ошибочное обоснование принятых предпосылок.
Степень интегрированности и полнота отображения. При построении модели важно найти «золотую середину» в процессе отображения структуры изучаемого объекта. Слишком сложная структура модели делает невозможной ее реализацию, а чрезмерное упрощение структуры и слишком высокая интегрированность компонентов, иначе говоря, излишняя минимизация модели, может свести на нет какую-либо ее ценность. Следует учесть, что один из основных аргументов прошлого в пользу минимизации моделей — трудность или невозможность решения слишком сложных систем дифференциальных уравнений, составляющих модель (например, уравнений со многими неизвестными, где сами неизвестные могут в свою очередь являться функциями от каких-либо переменных). В настоящее время этот аргумент отчасти утратил свою актуальность в связи с появлением быстродействующих компьютеров нового поколения.
Достоверность моделей. Очень часто уравнения, включаемые в состав математических моделей биологических объектов, являются лишь формальным описанием экспериментальных кривых, отражающих функционирование этих объектов. Описание биологических процессов математическими формулами, включающими параметры, не имеющие физического или биологического толкования, не позволяет идентифицировать их величину в ходе лабораторных экспериментов. Это резко снижает достоверность модели. Поскольку биологические объекты, даже однотипные, не являются абсолютно идентичными, а также потому, что динамические исследования требуют много времени, нередко в качестве данных для проверки используется информация, на основании которой проводилась калибровка (подгонка параметров) моделей. Для проверки правильности отображения моделью изучаемых процессов необходимы независимые данные.
Классификация моделей, взаимоотношения моделей различных типов и подтипов. Следует принимать во внимание, что приведенная выше классификация моделей является достаточно условной. Деление на аналитические и имитационные модели осуществлено нами по наиболее общему признаку — по способу реализации. Как будет показано далее, возможны и другие подходы, которые диктуются задачами, решаемыми с помощью математического моделирования в той или иной области биологии. Столь же специфичным может быть и отношение специалистов к роли тех или иных типов или подтипов моделей. Со временем это отношение может меняться, как это было, например, в экологии, когда аналитические модели были оттеснены на второй план моделями имитационными.
Иногда возникают сомнения в правомочности отнесения некоторых видов математических моделей к моделям как таковым. Так, в биологии широко распространены так называемые регрессионные модели, которые включают в себя уравнения, позволяющие учитывать влияние целого ряда параметров на процессы, происходящие в системе. Однако поскольку эвристическая ценность этих моделей низка и их основная цель — описывать в компактной форме имеющийся эмпирический материал, это дает основания некоторым исследователям вообще не считать их моделями.
В ряде случаев модели, которые первоначально разрабатывались как модели одного типа или подтипа, полностью или частично трансформируются в модели другого типа (подтипа). Например, обычным случаем является развитие аналитических моделей в имитационные по мере накопления исходной информации, усложнения модели и реализации ее на компьютере. Возможно также включение элементов стохастичности в детерминированную модель, что повышает «правдоподобность ее поведения».
Специфика моделирования в радиационных исследованиях
Особенности применения метода математического моделирования в радиобиологических исследованиях в общих чертах совпадают с особенностями, отмеченными для математического моделирования в биологии в целом. Специфика моделирования в радиационной биофизике определяется сущностью и характером изучаемых объектов и явлений. Поскольку исследования в радиационной биофизике осуществляются на субклеточном и клеточном уровнях и уровне клеточных популяций, то большинство созданных к настоящему моменту моделей посвящено исследованию механизмов и последствий воздействия ионизирующих излучений на клетки, генетические структуры, клеточные органоиды и высокомолекулярные химические соединения, входящие в их состав. Изучаемые явления имеют ярко выраженный вероятностный характер, поскольку при формировании радиобиологического эффекта осуществляется взаимодействие множества случайных событий и происходит наложение стохастики нескольких порядков.
Насколько широк спектр объектов, процессов и проблем, которые решаются в радиационной биофизике с помощью метода математического моделирования, настолько разнообразны используемые модели. Четкой классификации радиобиологических моделей пока не существует. Модели достаточно произвольно подразделяются по различным критериям, например, по уровню биологической организации объекта моделирования, как предложил Г. Н. Обатуров (1987). Им же было предложено выделить так называемые «физические» и «системные» радиобиологические модели. Физические модели по интерпретации Обатурова представляют собой развитие теории мишеней и непосредственно связывают первичные физические процессы с конечными эффектами (к ним автор относит, например, модели Келлерера и Росси, Капульцевича). Модели системные рассматривают процессы на двух и более уровнях биологической организации (например, модели Мансона, Обатурова и др.). В основе таких моделей обычно лежит информационная количественная связь между различными уровнями организации живого.
Существуют также конструкционные или технические критерии систематизации моделей. Например, можно различать модели по уровню сложности, который варьирует от отдельных математических уравнений, описывающих единичные процессы, до блочных моделей биологических систем, каждый блок которых представляет собой систему таких уравнений.
По способу реализации наиболее распространенным типом математических моделей, использующихся в радиационной биофизике в прошлом и в настоящее время, являются аналитические модели, которые зачастую представляют собой единичные математические уравнения разной степени сложности. Их применение основано в первую очередь на методах качественной теории дифференциальных уравнений, теории колебаний и теории бифуркаций.
Развитие информационно-вычислительных технологий и широкий доступ ко все более высокопроизводительной компьютерной технике создали в настоящее время предпосылки к разработке имитационных радиобиологических моделей, которые в большей степени отвечают системному подходу в исследованиях, позволяют отражать временную и пространственную динамику, учитывать комбинированное воздействие различных факторов, изменение условий, в которых находится или может находиться моделируемый объект, и более адекватно воспроизводить стохастические процессы.
В заключение отметим, что на наш взгляд при создании радиобиологических математических моделей для исследователя существует особая опасность необоснованного применения чисто математических построений без учета физиолого-биохимических состояний облучаемых клеток.
Эволюция математических моделей, описывающих инактивацию облученных клеток
Рассмотрим три группы первичных радиобиологических моделей, описывающих инактивацию облученных клеток, выделяемые Ю. Г. Капульцевичем (1978).
. В основе «классических» моделей лежат два основных предположения:
разные клетки, облученные в одной дозе, поражаются в разной степени в соответствии с принципом попадания и концепцией мишеней;
выживаемость (или инактивация) клетки однозначно определяется числом повреждений облученной клетки: если число повреждений больше критического, то клетка инактивируется с вероятностью единица, а если число повреждений меньше критического, то клетка выживает.
К классическим моделям относятся, например, модель «многих попаданий» (Блау, Альтенбургер), модель «многих одноударных мишеней» (Этвуд, Норман), «репарационные модели инактивации клеток» (Хейнс). Все эти модели связывают гибель клетки с поражением определенного числа мишеней. Так, модель Блау и Альтенбургера подразумевает, что для гибели клетки, представляющей собой единую мишень, необходимо осуществление некоторого критического числа попаданий. Этвуд и Норман построили модель, основанную на положении, что клетка представляет собой п мишеней, и для ее инактивации необходимо поразить все эти мишени, причем для поражения достаточно одного попадания. Хейнс ввел в свою модель облучаемых клеточных популяций учет репарации клеточных повреждений, что позволило ему удовлетворительно описать экспериментальные кривые выживания двух штаммов бактерий — чувствительного и резистентного.
Модели, основанные на двух приведенных выше предположениях, позволили дать предварительное формализованное описание воздействия ионизирующих излучений на живые объекты. Однако последующий анализ количественных закономерностей различных радиобиологических эффектов, связанных с нарушением репродукционной способности клеток, показал, что второе из этих предположений противоречит экспериментальным данным.
I. Концепция «биологической стохастики», предложенная Хугом и Келлерером (1969), основана на следующих положениях, отличающихся от классических:
разные клетки, облученные в одной дозе, поражаются одинаково;
выживаемость клетки зависит от степени ее поражения по вероятностному закону.
Данная концепция в большей степени соответствовала представлениям о стохастичности биологических процессов, но не позволила объяснить многие закономерности различных проявлений действия излучений на клетки, причем все возникающие затруднения были связаны с первым из этих предположений.
II. Для снятия противоречий в вышеописанных подходах и дальнейшего продвижения вперед в математическом моделировании реакций клеток на облучение Капульцевичем были сформулированы два следующих компромиссных положения:
разные облученные клетки поражаются в различной степени в соответствии с принципом попадания, но каждое повреждение проявляется с вероятностью меньшей единицы, например, вследствие работы соответствующих компенсаторных систем, так что выживаемость клетки определяется степенью ее поражения по вероятностному закону;
облучение приводит к уменьшению вероятности Р успешного деления клетки, но эта вероятность неодинакова для разных клеток облученной популяции вследствие тех или иных причин, например биологической изменчивости или неравномерного распределения поглощенной энергии излучений.
Модель, в основу которой легли данные положения, учитывающая как принцип попадания и теорию мишеней, так и некоторые положения биологической стохастики, была названа Ю. Г. Капульцевичем (1978) «вероятностной» моделью радиационного поражения клетки. Модели первых двух групп являются частными случаями «вероятностной» модели.
В рамках каждой из упомянутых трех групп было построено большое количество моделей. Постепенное накопление количественной информации обуславливало эволюцию от простейших моделей к более сложным, учитывающим влияние вновь обнаруженных факторов. Ярким примером этому служит семейство моделей выживания клеток, подвергающихся воздействию ионизирующего излучения, описывающих кривые типа «доза-эффект». По мере совершенствования представлений о механизме рассматриваемого процесса, например обнаружения репарационных процессов в живых объектах или формирования представлений о дискретной природе ионизирующего излучения, совершенствовались и математические модели, описывающие его. В свою очередь, неполное соответствие расчетных кривых экспериментальным побуждало исследователей к дальнейшим поискам недостающей информации о процессе инактивации облученных клеток.
Некоторые нетрадиционные подходы к построению радиобиологических моделей
Помимо традиционно широко используемого в радиационных исследованиях аналитического моделирования, развитие новых подходов в математическом моделировании биологических объектов неизменно находило и находит применение в радиобиологии. Рассмотрим два таких примера.
Имитационное моделирование в радиобиологии
Учитывая сложность процессов, происходящих в живых объектах под воздействием ионизирующих излучений, можно утверждать, что имитационное моделирование в радиобиологии имеет многообещающие перспективы при решении разнообразных исследовательских и прогностических задач. Так, реализации моделей, отнесенных Г. М. Обатуровым (1987) к «системним», т. е. рассматривающим радиобиологические эффекты одновременно на различных уровнях биологической организации, оказываются весьма эффективными в виде имитационных моделей.
Использование метода имитационного моделирования позволяет разбивать такие многофакторные процессы, как, например, выживание клеток, на ряд более простых процессов, параметры которых имеют конкретный биофизический смысл и могут быть получены в ходе специально поставленных экспериментов. В таких моделях удобно менять условия облучения и жизнедеятельности изучаемых объектов, с легкостью переходить с одного уровня организации живой системы на другой (например, с молекулярного на субклеточный, а далее на клеточный) и т. д.
Подобная модель может быть реализована в виде блоков, вложенных друг в друга (рис. III.8) и, в свою очередь, состоящих из отдельных компартментов, связанных между собой энергетическими, вещественными или информационными связями.
Рис. III.8. Примерная схема построения имитационной модели облучаемого объекта
Такая форма реализации модели позволяет учесть специфику воздействия облучения на различные уровни организации живой материи, составляющей объект, на различных временных этапах. Именно имитационное моделирование обладает необходимым аппаратом для рассмотрения в динамике одновременно двух тесно связанных между собой сложнейших процессов — передачи энергии ионизирующих излучений и лучевых повреждений отдельных компонентов и объекта в целом, происходящих в трехмерном пространстве (при временной динамике процессов говорят даже о четырехмерном пространстве).
Следует констатировать, что существующие радиобиологические имитационные модели посвящены, как правило, рассмотрению какого- либо одного иерархического уровня. По всей видимости, появление более сложных по структуре моделей, построенных по схемам, аналогичным приведенной на рис. III.8 — дело ближайшего будущего.
Современный уровень развития вычислительных средств, постоянно повышающееся быстродействие компьютеров создают предпосылки к созданию все более правдоподобных радиобиологических моделей. При реализации адекватной имитационной модели подобного типа исследователь получит виртуальный объект для проведения любого рода экспериментов и разработки прогнозов для всевозможных режимов облучения различными видами излучений, в том числе комбинированных и в сочетании с нерадиационными факторами. Однако необходимым условием создания таких моделей является достаточная изученность основных процессов, определяющих функционирование биологических систем, подвергнутых облучению.
Стохастические модели, основанные на теории марковских случайных процессов
Вероятностный характер воздействия ионизирующего излучения на живые объекты, связанный со случайным, дискретным поглощением ими энергии, вынуждает исследователей прибегать к использованию стохастических моделей для оценки последствий радиационного воздействия. К таким моделям относится, например, описанная ранее в этой главе известная модель Блау и Альтенбургера, предложенная для математической интерпретации принципа попадания и объяснения кривой выживания клеток. Алгоритмы стохастических моделей постоянно совершенствуются.
Приведем как пример алгоритм, описанный Р. А. Бесядовским и др. (1978), который учитывает вероятностный характер процессов, происходящих при облучении объектов, и основан на теории марковских случайных процессов. При таком подходе обычно рассматривают состояние системы X. которая под влиянием случайного фактора через определенные промежутки времени может переходить из одного состояния в другое или оставаться без изменений. Под системой подразумевается совокупность однородных биологических объектов, подвергшихся воздействию ионизирующих излучений и находящихся в последующем в одинаковых условиях. Под состоянием понимается
8 Ю. Б. Кудряшов
Рис. III.9. Диаграмма состояний биологической системы
величина реакции организма на то или иное воздействие или ее отсутствие.
Функционирование такой системы описывается «цепью Маркова», то есть вероятность того или иного состояния в заданный момент времени определяется состоянием системы в предыдущий временной интервал. Если взять в качестве примера ситуацию, когда биологическая система может находиться в различные периоды формирования отдаленных последствий в четырех состояниях, тогда принципиальный граф имеет вид, изображенный на рис. III.9.
Используя теорию марковских случайных процессов, можно для вероятностей каждого из состояний pi(t), p^tY ..., pn(t) составить и решить систему линейных дифференциальных уравнений вида:
^ = —Xi^Pi^t) + Х^др^^,
) = Xi^Pi^t) — (А2Д + А2д)р2(^)?
(III. 17) = ^2,3^2^) — АздРз(^),
Решение задачи в данном случае сводится к отысканию значений Xtj, характеризующих скорость перехода из одного состояния в другое. При этом принимается, что для любого момента времени t для данной системы выполняется условие pi(t) + №(^) + ••• + Pn(t) = 1. Принимается также, что константы скорости перехода А^- из одного состояния в другое являются величинами постоянными, не зависящими от времени. Их значения могут быть найдены для каждого объекта и характера воздействия путем анализа статистически достоверных экспериментальных данных, позволяющих оценить вероятность состояния pn(t) в каждый конкретный момент времени. В основу таких оценок могут быть положены количественные характеристики ряда функциональных показателей ведущих внутриклеточных систем, их максимальное отклонение от исходного уровня и динамика изменения во времени с учетом значимости каждого из них в системе поддержания гомеостаза, а также такие интегральные показатели оценки функционального состояния объекта, как например продолжительность жизни.
Примеры построения радиобиологических математических моделей
Метод математического моделирования применяется во многих областях фундаментальной и прикладной радиационной биофизики и радиобиологии в целом. При создании моделей используются многие из рассмотренных выше подходов и приемов моделирования. Рассмотрим конкретные примеры.
Моделирование нарушений системы гемопоэза при лучевом поражении
Метод математического моделирования успешно применяется для изучения влияния ионизирующих излучений на процессы гемопоэза (кроветворения). В качестве примера рассмотрим разработанный О. А. Смирновой (1992) комплекс моделей системы гемопоэза в организме, подвергшемся облучению. Модели трудно отнести к какому- либо определенному типу. Они реализовывались на компьютере для идентификации параметров методом итераций и для разработки прогнозов, что типично для имитационных моделей, но для их исследования использовались также аналитические методы качественной теории дифференциальных уравнений, теории колебаний и теории бифуркаций.
Система гемопоэза рассматривается как совокупность четырех линий кроветворения: тромбоцитопоэза, лимфопоэза, эритропоэза и гра- нулоцитопоэза. Модели отдельных линий кроветворения построены с учетом главных этапов развития гемопоэтических клеток, а также отражают индивидуальные особенности отдельных ростков: непостоянство числа ядер мегакариоцитов и наличие костномозгового «депо» гранулоцитов. Одна из основных предпосылок — регуляция гемопоэза тканеспецифическими веществами (кейлонами), представляющими собой продукты жизнедеятельности и гибели клеток.
В модели отдельного ростка рассмотрены три типа клеток (Xi, Х2 и Х3): костномозговые клетки-предшественники — от стволовой, находящейся в соответствующем микроокружении, включительно до стадии морфологически идентифицируемой как делящаяся Xi; неде- ляи^иеея — созревающие клетки костного мозга Х2 и зрелые клетки крови Х3. В уравнении гранулоцитопоэза был рассмотрен еще один тип клеток — гранулоциты тканей Х4.
В свою очередь, пулы радиочувствительных клеток по реакции на облучение разделены на три группы. К первой отнесены неповрежденные клетки Х^, ко второй — поврежденные, погибающие через 1-2 суток Хп^, к третьей — тяжелоповрежденные, погибающие в течение 4-7 часов после акта взаимодействия с ионизирующим излучением Хтп^. В качестве переменных модели использованы концентрации перечисленных клеток, а также концентрация специфического кейлона I.
Динамика каждой отдельной линии кроветворения млекопитающих, подвергающихся хроническому облучению с мощностью дозы D, описана системой дифференциальных уравнений:
dXx/dt = ВХх - 7X1 - D'XxfDx,
(III. 18)
dX^jdt = 7М - FX2 - D'X2/D2,
(III. 19)
dX3/dt = FX3 - EX3 - D'X3/D3,
(III.20)
dX4(dt = EX3 - AX4 - D'X4/D4,
(III.21)
dXni/dt = D'Xi/Di/(1 + p^ - pXni, (г = 1, ..., n),
(III.22)
dXTni 1 dt — PiD XilDil(1 7 p4 ^Х-^г^ (^ — 1?
(III.23)
dl/dt = С£ 0^ + Ф^пг + rXTni) - HI.
(III.24)
В уравнениях (1П.18)-(Ш.2О) параметры В, 7, F — удельные скорости *) деления клеток Ад, перехода клеток из группы Ai в Х2 и из Х2 в Х3. В уравнении (III.20) коэффициент Е — удельная скорость перехода клеток из группы Х3 в А4, а в остальных — удельная скорость гибели клеток Х3. В уравнении (III.21) коэффициент А — удельная скорость гибели клеток А4. В моделях лимфопоэза и эритропоэза 7, Е, Е — константы. В модели гранулоцитопоэза А, 7, Е — константы, а функция F = 5(1 + МХ/)/(1 + LX^ описывает существование костномозгового «депо». В модели тромбоцитопоэза для воспроизведения зависимости средней плоидности мегакариоцитов от концентрации тромбоцитов введен коэффициент плоидности / = (К + 7А3)-1. на который в уравнении (III. 19) умножен постоянный коэффициент 7. Кроме этого, в уравнении (III.20) постоянный коэффициент F умножен на константу ст, равную среднему числу тромбоцитов, образующихся в норме из одного мегакариоцита. Влияние ингибитора на скорость деления клеток Ai описано в модели уравнением В = q(1 X I/К)~А. где а — максимальная удельная скорость деления, К —константа ингибирования.
При моделировании действия радиации на клетки использовалась одномишенная одноударная теория, согласно которой удельная скорость поражения клеток пропорциональна мощности дозы радиации D*, а также экспериментальные данные по радиочувствительности клеток кроветворения. Так, в уравнениях (1П.18)-(Ш.21) величины D'/Di — удельные скорости убыли неповрежденных радиацией клеток Xi, в уравнениях (III.23), (III.24) величины (Df / Di)(l/(1 + pi))
и ^D/Di){pi/(1+pi)) — удельные скорости перехода клеток Xi в поврежденное (Xni) и тяжелоповрежденное (XTnJ состояния, а константы р и v — удельные скорости гибели клеток Xni и ХТПг- Параметры pi выражены через величины Di и Dmi, характеризующие радиочувствительность клеток Хр
pi = (Dmi/Di-l')"1- (Ш-25)
В (III.25), (III.18)-(IIL19) Dmi и Di равны соответственно дозам острого облучения, после воздействия которых число клеток Xi, не погибших в интерфазе и оставшихся неповрежденными, в е = 2,71... раз меньше их исходного количества. Уравнение (III.24) описывает кинетику специфического кейлона I.
Коэффициенты GQp GФQi, GVQi в (III.24) — удельные скорости выделения кейлона клетками Xi, Хпр XTni при жизнедеятельности и гибели, причем Г = Фи/р. Параметр Н — удельная скорость естественного распада кейлона. С учетом того, что кейлоны сохраняют активность в течение нескольких часов, а процессы дифференцировки, созревания и функционирования гемопоэтических клеток имеют длительность нескольких суток, уравнение (III.24) считалось «быстрым» и было заменено стационарным решением. В результате было получено следующее выражение для удельной скорости деления клеток Хр
D = а \р 0^ + $Xni + №ni)] (Ш.26) i=l
где 3 = G/{HK) — константа.
Зрелые клетки крови некоторых линий, а в ряде случаев и их костномозговые предшественники являются радиорезистентными. Для таких клеток члены (—D'/Di)Xi в правых частях соответствующих уравнений опускались, концентрации Xni и ХТПг в уравнении (III.25) приравнивались нулю, а уравнения (III.22) и (III.23) не рассматривались. В частности, в моделях тромбоцитопоэза, лимфопоэза и эритропоэза т = 3 и п = 1, 3, 2, а в модели гранулоцитопоэза т = 4 и п = 4.
При D* = 0 уравнения (1П.18)-(Ш.21) описывают динамику отдельных линий кроветворения у необлученных млекопитающих. При этом модель сводится к уравнениям (1П.18)-(Ш.2О) или (III.18)— (III.21). Эти системы имеют две особые точки*). Первая — нулевая. Координаты второй положительны, если а > у. Исследования моделей показали, что тривиальная особая точка устойчива («узел» ))
при а < 7 и неустойчива («седло» )) при а > 7. Вторая особая точка с положительными координатами определенной области изменения параметров устойчива («узел», «фокус»). В этом случае величины Х^ можно отождествить со стационарными концентрациями клеток Х^ соответствующего ростка кроветворения в норме. При отклонениях от этого положения равновесия восстановительный процесс имеет апериодический или колебательный характер. Для моделей тром- боцитопоэза, лимфопоэза, эритропоэза и модифицированной модели гранулоцитопоэза, сведенной к трем уравнениям для концентрации гранулоцитов вне костного мозга и их способных и неспособных к делению костномозговых предшественников, были определены бифуркационные соотношения, которые задают в пространстве параметров условия потери устойчивости второй особой точки. В найденной области изменения параметров данные системы помимо двух неустойчивых особых точек имеют еще одно особое решение — устойчивый предельный цикл (устойчивые колебания концентраций клеток крови и их предшественников в костном мозге).
В рамках разработанных моделей имитировалась динамика гемопоэза у мелких лабораторных животных (мышей, крыс), подвергшихся острому и хроническому облучению. Значения большинства коэффициентов определялись на основе данных гематологических и биологических экспериментов. Величины параметров, которые невозможно измерить опытным путем, подбирались методом итераций в ходе численных экспериментов с моделями на компьютере. Пример результата моделирования представлен на рис. ШЛО.
Рис. ШЛО. Динамика концентрации тромбоцитов в крови необлученных крыс, у которых она была искусственно увеличена до 180% (о) и снижена до 10% (д) от первоначального уровня. Модельные кривые и соответствующие экспериментальные данные. По оси абсцисс — время в сутках, по оси ординат — концентрация тромбоцитов.
Сопоставление расчетных и опытных данных показывает удовлетворительное, на наш взгляд, качество воспроизведения моделями основных процессов кроветворения в условиях облучения. Модели позволили достаточно детально исследовать процессы поражения и восстановления пулов клеток и дали возможность описать вклад поврежденных радиацией клеток в кейлонную регуляцию кроветворения. Слабым местом приведенных моделей является их жесткая детерминированность, в них не учитывается стохастичность изучаемых процессов.
Клеточные модели, применяемые в радиотерапии
Поскольку в ответ на облучение в клетках, органах и тканях живых объектов развивается цепь весьма сложных, во многих деталях не исследованных процессов, модели в радиотерапии носят в основном феноменологический характер. Их главной задачей является оптимизация радиотерапевтической процедуры, т. е. определение наиболее эффективного распределения доз в пространстве и времени. Математические модели, которые применяются в лучевой терапии, отличаются широким разнообразием.
Математические модели лучевых изменений во времени
Рассмотрим в качестве примера один из возможных вариантов подхода к решению задачи изучения и оптимизации кинетики постлучевых изменений. При рассмотрении данной проблемы на клеточном уровне Балантер и др. (1980) выделяют процессы, сопровождающиеся изменением численности клеток с характерным временем не менее суток и более краткосрочные процессы изменения состояния клеток, называемых авторами процессами быстрой кинетики. Соответственно и модели, отображающие эти две группы процессов, значительно отличаются. К моделям, рассматривающим процессы первой группы, можно отнести, например, модель глобальной (многошаговой) оптимизации временного режима радиотерапии, предложенной В. К. Ивановым и А. М. Петровским (1986), с помощью которой исследуется результирующая выживаемость раковых и нормальных клеток.
В качестве примера модели, рассматривающей процессы второй группы, приведем модель, разработанную Д. С. Чернавским и др. (1975). Моделируемые процессы в данном случае — это изменение энергетического состояния клетки и ее мембранно-плазматического комплекса, продвижение клетки по циклу и (или) переключение ее из фазы покоя в пролиферацию (Gqi —> S; G02 —> М\ Авторы исходят из положения, что радиочувствительность клеток сильно зависит от их состояния и, следовательно, от процессов быстрой кинетики. Наиболее чувствительны клетки в поздней Gi и ранней S фазах и в митозе. Другими словами, наибольшая чувствительность существует в момент перехода (Gi —> S и Gqi —> S; G2 —> М и G02 —> М) из фазы в фазу или от одного состояния к другому. Радиация влияет на упомянутые процессы, и таким образом возникает типичная картина ретроингибирования с «обратной связью». Поскольку процессы
Рис. III.11. Блок-схема радиационного воздействия на клетку
быстрой кинетики сложны и их механизмы недостаточно изучены, используют полуфеноменологический подход. Для этого вводят показатель U, отражающий интенсивность метаболических процессов клетки, изменяющийся с характерным временем 10 мин и обладающий следующими свойствами: слабое воздействие излучения повышает показатель U, а сильное подавляет его.
На рис. III. 11 представлена блок-схема моделируемых процессов, где z — радиационные повреждения, ж — некий активный фактор, возникающий под действием радиации (например промежуточные продукты распада, дефекты мембран и т. д.), U — интенсивность метаболизма, s — доля выживших клеток. Соответствующая этой схеме система уравнений записана следующим образом:
§=QZ-Д-(6 + с/(Г)),(Ш.27)
^ = 7гЛЩД - И + Щ1 - Г),(П1.29)
^ = -XUzS.(Ш.30)
Первый член в уравнении (III.27) Q* — скорость возникновения радиационных повреждений д (на рис. III.11, стрелка 1). Величина Q* пропорциональна исходной радиочувствительности т^ и мощности источника радиации 1^. Второй член — скорость репараций (стрелка 3), обладающая насыщением. Зависимость ее от метаболизма отражена членом с /(?7), который имеет максимум при U = U. и представлена
в форме:
/(г) = (г/д2 +Г2))2. (ш.з1)
В уравнении (III.28) первый член Q — скорость возникновения активного фактора ж (стрелка 2); она пропорциональна Zq и исходной радиочувствительности тг и обратно пропорциональна скорости выведения веществ из клетки j. Величины Q и Q' обратны временным интервалам, за которые переменные х и г соответственно достигают характерных значений. Предполагается, что эти интервалы одного порядка, и в качестве первого приближения их можно принять одинаковыми. Второй член в уравнении (III.28) — отток х (стрелка 4), обладающий насыщением.
В уравнении (III.29) первый член описывает изменение метаболизма U под влиянием радиации (опосредованно, через фактор ж). Зависимость этого влияния от ж такова, что при малых ж имеется резкий максимум (стрелка 5), при больших ж оно отрицательно (стрелка 6). Функция ср(х) выбрана в виде ^(ж) = (ж2/(^3 + ж3)) , где д соответствует значению ж, при котором (^(ж) максимальна. Второй член в уравнении (III.29) описывает возвращение уровня метаболизма к норме в отсутствие радиации. Коэффициенты ^и и Еи — скорости изменения метаболизма — как под действием радиации, то есть в присутствии фактора ж, так и в норме они приняты одинаковыми.
Уравнение (III.30) описывает убыль клеток, не имеющих летальных повреждений (з = п*/п, где п* — число выживших клеток, и — общее число клеток), в результате реализации потенциально летальных повреждений. Как указывалось выше, этот процесс зависит как от количества радиационных повреждений г, так и от уровня метаболизма U (стрелка 7).
Рис. III. 12. Теоретические дозовые кривые для культуры клеток HeLa в контроле (2), в случае сенсибилизации (1) и защиты (3) предварительным облучением; эффективность высева в контроле принималась равной 100%. По оси абсцисс — доза облучения, Гр; по оси ординат — натуральный логарифм отношения числа выживших клеток к общему числу клеток (Чернавский и др., 1975)Рис. III. 12. Теоретические дозовые кривые для культуры клеток HeLa в контроле (2), в случае сенсибилизации (1) и защиты (3) предварительным облучением; эффективность высева в контроле принималась равной 100%. По оси абсцисс — доза облучения, Гр; по оси ординат — натуральный логарифм отношения числа выживших клеток к общему числу клеток (Чернавский и др., 1975)На рис. III. 12 приведены рассчитанные дозовые кривые при традиционном облучении, а также в модифицированных процедурах, т. е. при предварительном сенсибилизирующем и защитном облучениях. Из рисунка видно, что модификация облучения увеличивает (в случае защитной процедуры) или уменьшает (в случае сенсибилизации) плечо дозовой кривой, не изменяя ее наклона при высших дозах. Появление «ступеньки» при малых дозах D в интервале 0,5-1,5 рад авторы объясняют тем, что относительная
Рис. III. 12. Теоретические дозовые кривые для культуры клеток HeLa в контроле (2), в случае сенсибилизации (1) и защиты (3) предварительным облучением; эффективность высева в контроле принималась равной 100%. По оси абсцисс — доза облучения, Гр; по оси ординат — натуральный логарифм отношения числа выживших клеток к общему числу клеток (Чернавский и др., 1975)
Рис. III. 12. Теоретические дозовые кривые для культуры клеток HeLa в контроле (2), в случае сенсибилизации (1) и защиты (3) предварительным облучением; эффективность высева в контроле принималась равной 100%. По оси абсцисс — доза облучения, Гр; по оси ординат — натуральный логарифм отношения числа выживших клеток к общему числу клеток (Чернавский и др., 1975)
эффективность сравнительно низких доз может быть больше, чем высоких.
Следует отметить, что рассмотренная модель носит скорее объяснительный характер. Как отмечают сами авторы, для практического применения модели необходимо определить экспериментально большое число параметров. В данной модели не учтены межклеточные взаимодействия, т. е. популяционный уровень защиты не рассматривается.
Разноуровневые («системные») модели
В разноуровневых (или системных по Обатурову) моделях рассматриваются конечные радиобиологические эффекты в связи с первичными повреждениями низкоуровневых компонентов. Такой подход дает определенные преимущества при создании моделей. Например, при моделировании выживаемости облучаемых клеток такими компонентами принимают дезоксирибонуклеиновые кислоты. В данном случае это позволяет строить более надежные модели, поскольку для ДНК закономерности между уровнем облучения и повреждением уже установлены опытным путем.
Приведем в качестве примера разноуровневых моделей разработку Мансона с соавторами, описанную Обатуровым (1987). Это модель инактивации клеток бактерии Е. colt при облучении заряженными частицами в широком диапазоне линейной передачи энергии L. Модель основана на следующих предпосылках.
Чувствительной мишенью в клетке является молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты, состоящая из двух цилиндрических нитей диаметром d.
При прохождении частицы через ДНК каждое событие поглощения энергии (первичная ионизация) с вероятностью w индуцирует однонитевой разрыв в одной из ее нитей. Разрыв в противоположных нитях ДНК, вызванный воздействием одной частицы, приводит к двунитевому разрыву, который не репарируется и является летальным. Вероятность образования двунитевого разрыва двумя отдельными частицами мала, что подтверждается экспоненциальной формой кривых выживаемости и вытекает из общих принципов микродозиметрии.
Однонитевой разрыв частично репарируется; вероятность того, что репарация такого разрыва не произойдет, равна и. Нерепа- рируемые однонитевые разрывы являются также летальными.
Авторами была предложена следующая формула для описания выживаемости клеток бактерий:
S = ехр (—^сгР2) = exp (—aD\(III.32)
где Р2 = 1 — wiw2; гщ = exp [2sPin(l — ^Pi)], wi — вероятность того, что в клетке при пересечении заряженной частицей не образуется ни
одного нерепарированного однонитевого разрыва, a W2 — ни одного двухнитевого разрыва, W2 = exp (—s^P^), Pi — вероятность образования однонитевого разрыва ДНК при однократном пересечении молекулы заряженной частицей, Pi = 1 — exp (—16Lpdw); s — среднее число пересечений хроматиды одной частицей; д — вероятность того, что трек, пройдя через одну нить ДНК, пересечет другую; р — относительная плотность ДНК; а = сгР2/0,16L; D — доза.
Выражение (III.32) можно представить в следующем виде:
S = ехр {—^a\Y — exp (—m)]}, (III.33) где т — число летальных повреждений на одну частицу, описывается уравнением: т = s^P^ + 2Р1Ц1 — ^Pi)].
В модели содержится пять параметров (d, w, s, д. и), из которых только последний зависит от типа штамма Е. coli, остальные должны иметь значения, одинаковые для любых штаммов. Параметры получены путем калибровки модели по экспериментальным данным.
Модель позволила получить удовлетворительное описание зависимости радиочувствительности от ЛПЭ для различных клеточных штаммов.
* *
*
Развитие количественного направления в радиобиологии привело к накоплению таких экспериментальных данных, которые не могли быть истолкованы в рамках чисто биологических феноменов. Отсутствие порога на кривых «доза-эффект», полученных в опытах по облучению макромолекул, вирусов, бактерий, ряда изолированных клеток, указывало на то, что облучение в любой как угодно малой дозе может вызвать появление у некоторой части особей наблюдаемой реакции. В то же время поглощение облучаемой системой излучения в очень больших дозах не приводило к инактивации всех объектов, некоторые из них сохраняли исходные биологические свойства. Следовательно, с ростом дозы повышается не столько степень проявления эффекта у отдельных особей облучаемой популяции, сколько количество (доля) объектов, реагирующих данным образом, т. е. возрастает вероятность проявления данной реакции на облучение.
Для интерпретации стохастического характера биологического действия ионизирующего излучения были использованы фундаментальные физические концепции о вероятностном характере взаимодействия квантов высоких энергий и ускоренных заряженных частиц с веществом. При каждом акте взаимодействия к атому или молекуле переносится такая дискретная порция энергии, которая может заведомо привести к разрыву любой химической связи. Поэтому можно было рассматривать каждый акт такого одиночного переноса энергии как событие попадания, приводящее к поражению определенной структуры. Акты попадания статистически распределяются по всей облучаемой системе, так же статистически
будут распределены микрообъемы, поврежденные излучением. Если часть микрообъемов — это мишени, ответственные за наблюдаемую реакцию, то на основании соответствующих математических построений можно оценить их параметры — сечение, объем, молекулярную массу.
Подобные соображения стимулировали большое число исследований, посвященных математическому анализу экспериментальных кривых «доза-эффект». Методологической основой такого анализа послужил метод математического моделирования. Это сыграло большую положительную роль, но были и отрицательные моменты. В частности, высокая степень математизации исследований в радиобиологии в целом и радиационной биофизике привела во многих случаях к тому, что исследователи ограничились чисто формальной констатацией соответствия экспериментальных кривых тем или иным уравнениям без характеристики лежащих в их основе реакций изучаемых живых объектов на облучение.
Тем не менее следует отметить, что математическое моделирование стало мощным и эффективным средством интерпретации и прогнозирования влияния ионизирующих излучений на живые объекты.
В то же время, несмотря на эффективность математического моделирования, проявленную в научных исследованиях, и общепризнанные достоинства этого метода, в современной радиационной биофизике он применяется все еще недостаточно активно. Научный прогресс последних двадцати лет в информационно-технической области, связанный с повышением доступности ЭВМ и особенно с появлением персональных компьютеров во многих областях биологии сопровождался скачкообразным повышением интереса к математическому моделированию и появлению перспективных моделей, в первую очередь имитационных. Рискуя повториться, отметим, что к сожалению, это слабо коснулось исследований по изучению воздействия ионизирующих излучений на живые объекты.
До сих пор основная роль, которая отводится математическому моделированию в радиационной биофизике — это формализованная трактовка механизмов воздействия радиационных излучений с помощью аналитических моделей. Остались практически невостребованными имитационные математические модели, которые позволяют изучать и прогнозировать поведение объекта в сложной временной и пространственной динамике при постоянно меняющихся условиях (например, уровня излучения, концентрации веществ, модифицирующих действие излучения и т. д.).
Такое отставание объясняется сложностью явлений, изучаемых в радиобиологии, отсутствием достаточно полного объема исходной количественной информации и ее разрозненностью. Эта проблема может быть отчасти решена в рамках компьютеризации исследований, подразумевающей, в числе прочего, создание баз данных по результатам экспериментальных исследований в этой области, их последующий анализ и построение адекватных математических моделей. Развитие
и повышение доступности вычислительных средств также должны создать предпосылки к более активному использованию метода математического моделирования как в фундаментальной, так и в прикладной областях радиационной биофизики и радиобиологии.
Приведенный в данной главе биофизический анализ зависимости эффектов от поглощенной клеткой дозы ионизирующих излучений позволяет оценить параметры структур — мишеней и получить необходимые сведения о характере первичных физических событий (попаданий). Понятно, что такой анализ все же не позволяет раскрыть последовательности событий, приводящих к поражению мишени в результате попаданий.
Вопросу последовательного развития событий при лучевом воздействии на молекулы и клетки посвящены следующие главы данной книги.
Глава IV
ПРЯМОЕ ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ
Главная задача радиационно-биофизических исследований, как отмечалось, заключается в раскрытии последовательной цепи событий, начиная от поглощения энергии излучения до поражения мишени, а затем и изменений всего облучаемого объекта. Из-за высокой энергии, дискретно поглощаемой в клетке, и отсутствия избирательного действия ионизирующее излучение способно вызвать изменение любой молекулы, любой биологической системы. Для радиационной биофизики основной трудностью является установление (в сложной иерархии возникающих или уже возникших многочисленных, постоянно меняющихся во времени, молекулярных повреждений) в клетке «запального», ведущего механизма в формировании лучевого поражения, установление причинно-следственной связи в сложной цепи событий, формирующих зависимость «доза-эффект».
По-видимому, наиболее логично начать изучение лучевых радиационных эффектов с наиболее простого — с непосредственного (прямого) облучения интересующих биологов макромолекул и оценки последовательности возникающих изменений.
Однако при этом мы все же не будем застрахованы от того, что наблюдаемые изменения могут в точности не проявиться в более сложных системах, например в облученной клетке, или даже просто в облученных растворах. Необходимо это предвидеть и все же сделать первые шаги по тернистой, и вместе с тем увлекательной дороге исследований радиационной биофизики.
О прямой и непрямой радиационной инактивациимакромолекул
В результате облучения макромолекул их биологические функции могут полностью или частично утрачиваться. В этом случае говорят об инактивации макромолекул ионизирующей радиацией. Инактивация макромолекулы может произойти в результате прямого либо опосредованного действия ионизирующего излучения.
Прямое действие состоит в том, что инактивированными оказываются те молекулы, которые непосредственно поглотили энергию излучения.
Если же молекула была поражена активными реакционноспособными продуктами, возникшими за счет поглощения энергии излучения ее микроокружением (например, полярными или неполярными растворителями), то говорят о непрямом (опосредованном, косвенном) действии радиации.
О структурных повреждениях и радиационнойинактивации макромолекул
Определенные типы структурных повреждений, например, разрушение некоторых аминокислотных остатков в белковой молекуле или нуклеотидов в молекуле ДНК, влекут за собой изменения функциональных свойств соответствующих макромолекул. Выяснение причинно-следственных отношений между типами структурных повреждений и характером инактивации макромолекул составляет заключительный этап биофизического анализа механизмов лучевого поражения биологически активных молекул. Такие исследования имеют важное значение не только для радиационной биофизики, но и для молекулярной биологии в целом, так как позволяют выявить функциональную роль отдельных субмолекулярных структур.
В последние десятилетия успешно развивается особое направление радиационной биофизики — молекулярная радиобиология, основная задача которой состоит в исследовании радиационно-физических и химических процессов, вызывающих повреждение биомолекул, а также в объяснении радиационно-обусловленных нарушений жизненно важных процессов в терминах молекулярных изменений.
Биофизический анализ механизмов лучевой радиационной инактивации макромолекул состоит в описании в терминах физики и химии всей последовательности процессов, которые начинаются с поглощения молекулой дискретной порции энергии излучения и заканчиваются очевидными, доступными экспериментальному анализу изменениями ее биологических свойств. Такой анализ включает следующие три логически связанных этапа.
Первый этап — это феноменологический анализ картины лучевого поражения молекул. Он осуществляется путем построения кривых «доза-эффект» и изучения на их основе радиочувствительности ) отдельных биологических функций макромолекул.
В толковании понятия «биологические функции макромолекул» существует известная неопределенность, связанная с тем, что в настоящее время мы не в состоянии очертить весь круг функциональных признаков, определяющих уникальную роль данного типа молекул в жизнедеятельности клеток и организмов. Еще труднее охарактеризовать эти признаки количественно.
Однако для некоторых биомолекул уже сейчас можно указать на ряд свойств, определяющих их значение в процессах обмена веществ,
в хранении и передаче наследственных свойств, в возникновении естественной изменчивости. Анализируя влияние облучения на ферменты, мы прежде всего должны оценить изменения их каталитической активности, субстратной специфичности, чувствительности к соответствующим активаторам и ингибиторам, возможность воздействия на их стерическое регулирование. Если по любому из этих функциональных признаков отмечается негативный эффект облучения, то мы будем называть такое событие лучевой инактивацией фермента. Соответствующими биохимическими методами можно оценить степень инактивации количественно.
В экспериментах по облучению нуклеиновых кислот критерием инактивации ДНК может служить изменение ее инфекционно- сти, трансформирующей активности (для бактериальных и вирусных ДНК), способности служить матрицей для синтеза соответствующих комплементарных полинуклеотидных последовательностей. Влияние излучения на молекулы тРНК оценивают по их способности связывать специфические аминокислоты. В подобных опытах удается количественно оценить инактивирующее действие излучения на этот тип нуклеиновых кислот.
На втором этапе биофизического анализа механизмов радиационной инактивации макромолекул последовательно оценивают стадии прямого эффекта ионизирующей радиации (условно они делятся на первичную физическую, физико-химическую и химическую-деструктивную):
На третьем этапе биофизического анализа устанавливаются причинно-следственные связи между типами структурного повреждения и характером инактивации макромолекулы. Для решения этих вопросов перспективно использование модифицирующих агентов, видоизменяющих типы структурного повреждения и (или) характер инактивации. Сочетание различных модифицирующих агентов позволяет дифференциально оценить роль тех или иных типов повреждений в инактивации макромолекулы.
Детальное описание всех этапов радиационной инактивации макромолекул составляет одну из важнейших задач современной радиационной биофизики. Эта проблема еще далека от полного разрешения. Однако уже сегодня можно говорить о важнейших деталях и указать основные направления, по которым развиваются исследования.
Феноменологический анализ радиационного повреждениямакромолекул
Прямое действие ионизирующей радиации на макромолекулы обычно исследуют на обезвоженных или кристаллических препаратах ферментов и нуклеиновых кислот. В этом случае большинство
молекул инактивируется в результате прямого поглощения энергии излучения ).
Прямое действие излучения на ферменты
Схема эксперимента по определению числа инактивированных молекул фермента при действии излучения в данной дозе состоит в том, что ампулу с гомогенным препаратом (сухим или кристаллическим) подвергают облучению, а затем сопоставляют активность опытного и контрольного образцов. Путем соответствующего пересчета можно перейти от доли инактивированных молекул (или процента инактивации) к истинному числу молекул фермента, инактивированных излучением в данной дозе. Используя соответствующие биохимические методы, можно оценить изменение различных функциональных свойств облученного фермента — каталитической активности, субстратной специфичности, стерического регулирования и т. д.
На рис. IV. 1, а, б представлены результаты одного из экспериментов Юнга и Дертингера с кристаллической рибонуклеазой. В широком диапазоне доз излучения оценивается каталитическая активность и субстратная специфичность облученного фермента.
Так как деградация РНК под действием рибонуклеазы осуществляется в два этапа (вначале расщепляется фосфодиэфирная связь в РНК и образуется циклический диэфир, а на второй стадии фосфатная связь гидролизуется до нуклеотид-3-фосфата), то, используя РНК в качестве субстрата, можно исследовать суммарную реакцию, а с помощью цитидин-2', 3-циклофосфата — только вторую ее стадию.
Рис. IV. 1. Инактивация РНКазы д-излучением. Ферментная активность опреде-лялась для двух различных субстратов: 1 — РНК; 2 — цитидин-2', З'-циклофос-фата; а) зависимость «доза-эффект» выражена в линейных координатах; б) этиже данные представлены в полулогарифмическом виде, экспериментальные точкиукладываются на прямую
Одинаковую радиационную инактивацию РНКазы наблюдали при использовании обоих субстратов (рис. IV. 1), т. е. при облучении в равной мере поражаются обе функциональные единицы фермента.
Зависимость эффекта от дозы облучения экспоненциальна. При самых малых дозах обнаруживаются молекулы фермента, утратившие способность расщеплять субстраты обоих типов; с ростом поглощенной дозы число таких молекул возрастает вначале резко, почти линейно, а затем мы видим, как значительному приращению дозы соответствует лишь небольшое увеличение доли инактивированных молекул. Для проверки экспоненциального характера зависимости «доза-эффект» необходимо преобразовать кривую IV. 1, а, построив ее в полулогарифмических координатах, как это сделано на рис. IV. 1, б (по оси ординат откладывается не доля молекул, сохранивших исходную активность, а натуральный логарифм этой величины). Все
экспериментальные точки укладываются на прямую, проходящую под углом к оси ординат, следовательно, In JV/JVq = —kD или N/Nq = e-kD (см. уравнение (III.9)).
Экспоненциальная зависимость «доза-эффект» обнаружена в экспериментах по лучевой инактивации различных ферментов (рис. IV.2)
Доза облучения, х105 ГрДоза облучения, х105 ГрРис. IV.2. Радиочувствительность ряда ферментов, подвергнутых воздействию д-из- лучения в вакуумеРис. IV.2. Радиочувствительность ряда ферментов, подвергнутых воздействию д-из- лучения в вакуумеи может рассматриваться как общая закономерность прямого действия радиации на ферменты.
Доза облучения, х105 Гр
Доза облучения, х105 Гр
Рис. IV.2. Радиочувствительность ряда ферментов, подвергнутых воздействию д-из- лучения в вакууме
Рис. IV.2. Радиочувствительность ряда ферментов, подвергнутых воздействию д-из- лучения в вакууме
Сравнивая кривые «доза-эффект», можно сопоставить радиочувствительность различных ферментов. Из рис. IV.2 видно, что для получения сравнимой инактивации изученных ферментов требуются существенно различающиеся дозы. Обычно в качестве критерия радиочув
ствительности выбирают такую дозу излучения, которая необходима для инактивации 63% молекул в облученном препарате фермента. Так как при этом 37% молекул сохраняют нативные свойства, эта доза получила название «доза 37%-ой сохранности», или доза D37. По рис. IV.2 можно установить, что для инвертазы D37 в данных условиях составляет около 80 кГр, а для рибонуклеазы — 280 кГр, т. е. при одинаковой дозе молекулы первого фермента поражаются со значительно большей вероятностью. Это может быть связано с различными размерами макромолекулы, особенностями ее аминокислотного состава,
характером миграции энергии в полимере или другими причинами, которые должны быть установлены в ходе биофизического анализа. Известно, что функциональные свойства фермента определяются его различными структурными участками. Так как поглощение энер
гии излучения может приводить к различным типам структурного
Таблица IV. 1. Радиочувствительность функций, определяющих биологическую активность ферментов
Фермент
Радиочувствительность функций, связанных с ферментной активностью (по величине дозы D37)
химотрипсин
эстераза > протеаза > связывание диизопропилфосфата > уменьшение максимальной скорости > > увеличение константы Михаэлиса-Ментен *)
трипсин
протеаза > эстераза
глутаматдегидрогеназа
уменьшение максимальной скорости и увеличение константы Михаэлиса-Ментен > поражение активного центра и способности связывать кофермент
рибонуклуаза
уменьшение максимальной скорости; константа Михаэлиса-Ментен без изменения
аспартаткарбамо илтрансфераза
поражение активного центра > инактивация участка ингибирования по принципу обратной связи (аллостерические свойства)
*) Более высокая радиочувствительность (т. е. меньшие дозы D37) обозначена символом >. Например, эстераза > протеаза означает, что эстеразная активность фермента более радиочувствительна, чем протеазная.
повреждения, следует ожидать, что не все функции фермента подавляются радиацией в равной степени. В табл. IV. 1 сведены результаты исследований различных авторов, которые подтверждают такую возможность.
В опытах с рибонуклеазой обнаружено, что облучение приводит к снижению максимальной скорости реакции, а величина константы Михаэлиса-Ментен остается без изменения. Это означает, что число каталитически активных молекул в облученном препарате понижается, однако пораженные молекулы сохраняют сродство к субстрату. Вероятно, возникающие поражения структуры затрагивают активный центр, но не препятствуют взаимодействию фермента со специфическим субстратом. В случае с трипсином протеазная активность поражается в большей мере, чем эстеразная, т. е. в результате облучения возникают повреждения главным образом в тех структурных звеньях, которые определяют протеазную активность фермента.
Если ионизирующие излучения в состоянии вызывать специфические структурные повреждения в молекуле фермента и приводить к определенному изменению его функциональных характеристик, то с помощью радиационного воздействия можно исследовать причинную связь между структурой и функцией фермента.
Рассмотрение феноменологии лучевого поражения ферментов позволяет заключить, что в результате прямого действия излучения возникают различные нарушения функциональных свойств фермента; наблюдается экспоненциальная зависимость биологического эффекта от величины поглощенной дозы, т. е. с увеличением поглощенной дозы 9*
излучения доля макромолекул, сохранивших нативные свойства, убывает по закону e-kD, где к — константа, D — поглощенная доза. Облученный фермент может утрачивать одни функциональные свойства при сохранении других, т. е. наблюдается неодинаковая радиочувствительность различных биологических свойств фермента; по одному и тому же критерию, например каталитической активности, различные ферменты обладают неодинаковой радиочувствительностью.
Прямое действие излучения на нуклеиновые кислоты
Существуют определенные трудности количественного измерения инактивации нуклеиновых кислот. Ниже перечислен ряд модельных систем, которые позволяют количественно оценить важнейшие из функциональных характеристик этих макромолекул, и приведены основные феноменологические данные, полученные при изучении характера инактивации облученных нуклеиновых кислот.
Инфекционность нуклеиновых кислот
Термином «инфекционность» обозначают способность вирусной ДНК или РНК индуцировать образование бактериальной клеткой новых полноценных фагов. Методически эксперимент выглядит так. Бактерии обрабатывают лизоцимом, в результате чего они теряют часть клеточной стенки и образуют сферопласты, которые можно инфицировать нуклеиновой кислотой, выделенной из бактериофага. Если в инфицированной бактерии возникают новые полноценные фаги, то бактериальная стенка ее разрывается, и из бактерии высвобождается 100-200 бактериофагов. Количество вирусных частиц, высвободившихся из лизированных сферопластов, в определенных пределах пропорционально количеству молекул ДНК или РНК, сохранивших инфекционные свойства. Так как фаги лизируют новые сферопласты вблизи места своего высвобождения, то на сплошном газоне бактериальных клеток, выращенных на агаре, образуется пятно лизиса — «бляшка». Количество бляшек можно подсчитать визуально, и их число служит количественным критерием инфекционности вирусной нуклеиновой кислоты.
Этим методом определяют инактивацию вирусной ДНК в результате облучения. Результаты одного из таких экспериментов приведены на рис. IV.3. Доля молекул ДНК, сохранивших инфекционность, отложена по оси ординат в логарифмическом масштабе, все экспериментальные точки укладываются на прямую, т. е. In JV/JVq = —kD, кривая «доза-эффект» экспоненциальна.
Трансформирующая активность
Трансформирующая активность бактериальной ДНК часто оценивается по появлению специфических генетических маркеров у бактерий-реципиентов, «поглотивших» трансформирующую ДНК донора. Например, извлекают ДНК из бактерии, устойчивой к стрептомицину, и клетки стрептомицин-чувствительных мутантов
Рис. IV.3. Инфекционность ДНК фага у?Х174, препарат которого подвергнут воздействию д-излучения 6(?Со в вакуумеРис. IV.3. Инфекционность ДНК фага у?Х174, препарат которого подвергнут воздействию д-излучения 6(?Со в вакуумеРис. IV.4. Инактивация трансформирующей активности ДНК Bacillus subtilis при облучении сухих спор электронами с энергией 1 МэВРис. IV.4. Инактивация трансформирующей активности ДНК Bacillus subtilis при облучении сухих спор электронами с энергией 1 МэВ
Рис. IV.3. Инфекционность ДНК фага у?Х174, препарат которого подвергнут воздействию д-излучения 6(?Со в вакууме
Рис. IV.3. Инфекционность ДНК фага у?Х174, препарат которого подвергнут воздействию д-излучения 6(?Со в вакууме
Рис. IV.4. Инактивация трансформирующей активности ДНК Bacillus subtilis при облучении сухих спор электронами с энергией 1 МэВ
Рис. IV.4. Инактивация трансформирующей активности ДНК Bacillus subtilis при облучении сухих спор электронами с энергией 1 МэВ
инкубируют в ее присутствии. Если в результате этого путем рекомбинации происходит встраивание специфической последовательности нуклеотидов ДНК донора в геном реципиента, т. е. мутанты становятся устойчивыми к стрептомицину (генетический маркер), то на среде, содержащей стрептомицин, мутанты будут формировать колонии. Число таких колоний пропорционально доле молекул ДНК, сохранивших трансформирующую активность после облучения.
На рис. IV.4 показаны результаты опытов, в которых изучали трансформирующую активность ДНК после облучения электронами с энергией 1 МэВ. Для этого сухие споры Bacillus subtilis подвергали облучению, затем выделяли из них ДНК и инкубировали ее с клетками, не способными синтезировать индол (генетический маркер). Необлученная ДНК восстанавливала способность мутантных клеток синтезировать индол. Зависимость «доза-эффект» утраты трансформирующей активности ДНК после облучения является экспоненциальной.
Затравочная активность ДНК
Затравочная активность ДНК, т. е. ее способность служить матрицей для синтеза комплементарных нитей ДНК или РНК, также служит важным критерием для изучения инактивации нуклеиновых кислот ионизирующим излучением. Облученную ДНК инкубируют в полной ДНК-полимеразной (или РНК-полимеразной) системе, содержащей меченные рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, а затем измеряют индекс метки в кислотонерастворимой (полимерной) фракции.
Способность ДНК к образованию гибридов с мРНК
Способность ДНК к образованию гибридов с мРНК также позволяет количественно оценить инактивацию ДНК в результате облучения. Для проведения такого эксперимента при помощи матричного синтеза
на ДНК получают РНК, меченную радиоактивным фосфором. Затем ее смешивают с предварительно облученной порцией той же ДНК и инкубируют смесь в определенных условиях. В ряде опытов изучали торможение образования гибридов ДНК-РНК после рентгеновского облучения ДНК из Е. coU В (препарат мРНК выделяли из того же объекта). Молекула мРНК воспринимала ДНК как «комплементарную», даже если она уже содержала несколько индуцированных излучением повреждений; только после накопления определенного числа повреждений способность облученной ДНК образовывать гибриды с мРНК резко понижалась.
Способность транспортных РНК связывать соответствующие аминокислоты
Способность транспортных РНК связывать соответствующие аминокислоты можно оценить в специальных модельных системах и, таким образом, количественно оценить их инактивацию ионизирующими излучениями. Для этого препарат тРНК облучают и инкубируют с аминокислотами, мечеными по углероду 14С. Затем тРНК осаждают и в кислотонерастворимой фракции определяют содержание меченых аминокислот. Результаты такого эксперимента приведены в табл. IV.2. Относительную радиочувствительность различных тРНК оценивали по величине дозы D37. Наиболее радиочувствительной оказалась лейциновая тРНК.
Таблица IV.2. Сравнительная радиочувствительность различных тРНК (по способности связывать соответствующие аминокислоты)
Изученный комплекс: аминокислота/тРНК
D37 х 104, Гр
Изученный комплекс: аминокислота/тРНК
Dzy X 104, Гр
лейцин
25
пролин
58
аланин
43
метионин
62
изолейцин
46
валин
86
Кривые «доза-эффект» для радиационной инактивации тРНК представлены на рис. IV.5, из которого видно, что доля молекул, сохранивших способность связывать аминокислоты, экспоненциально убывает с ростом поглощенной дозы излучения.
Функциональная активность рибосом
Функциональная активность рибосом, облученных in vitro, оценивается по количеству белка, синтезированного в единицу времени в полной системе, содержащей соответствующие мРНК, тРНК и аминокислоты (рис. IV.6). Рибосомы выделяли из клеток Е. coli, облучали и инкубировали в системе, содержащей в качестве мРНК полиуридиновую кислоту (поли-У), которая инициирует синтез полифенилаланина. Как видно из рис. IV.6, с ростом дозы облучения экспоненциально
Доза облучения, х!05 ГрДоза облучения, х!05 ГрРис. IV.5. Инактивация сухих препаратов тРНК электронами с энергией 1 МэВ. 1, 2, 3, 4, 5, 6 — соответственно комплексы лейцина, аланина, изолейцина, пролина, метионина и валина со специфическими для каждого из них тРНКРис. IV.5. Инактивация сухих препаратов тРНК электронами с энергией 1 МэВ. 1, 2, 3, 4, 5, 6 — соответственно комплексы лейцина, аланина, изолейцина, пролина, метионина и валина со специфическими для каждого из них тРНКДоза облучения, х!03 ГрДоза облучения, х!03 ГрРис. IV.6. Инактивация лиофилизированных рибосом из клеток Е. соН д-излучением 60Со.Рис. IV.6. Инактивация лиофилизированных рибосом из клеток Е. соН д-излучением 60Со.
Доза облучения, х!05 Гр
Доза облучения, х!05 Гр
Рис. IV.5. Инактивация сухих препаратов тРНК электронами с энергией 1 МэВ. 1, 2, 3, 4, 5, 6 — соответственно комплексы лейцина, аланина, изолейцина, пролина, метионина и валина со специфическими для каждого из них тРНК
Рис. IV.5. Инактивация сухих препаратов тРНК электронами с энергией 1 МэВ. 1, 2, 3, 4, 5, 6 — соответственно комплексы лейцина, аланина, изолейцина, пролина, метионина и валина со специфическими для каждого из них тРНК
Доза облучения, х!03 Гр
Доза облучения, х!03 Гр
Рис. IV.6. Инактивация лиофилизированных рибосом из клеток Е. соН д-излучением 60Со.
Рис. IV.6. Инактивация лиофилизированных рибосом из клеток Е. соН д-излучением 60Со.
снижается доля рибосом, сохранивших исходную синтетическую активность.
Таким образом, в модельных системах in vitro можно анализировать инактивацию нуклеиновых кислот и надмолекулярных комплексов, в которые входят эти макромолекулы. Особый интерес представляют исследования радиационного поражения хроматина. Эти эксперименты приближают нас к пониманию реальных процессов инактивации ДНК в клетке.
Прямое действие радиации на молекулы ДНК, иРНК, тРНК и сложные надмолекулярные ансамбли — рибосомы — приводит к утрате ими биологических функций, связанных с репликацией, транскрипцией и трансляцией генетического кода. Такого рода эффекты имеют решающее значение при действии радиации на вирусы, бактерии, клетки и сложные многоклеточные системы. Поэтому изучению механизмов инактивации нуклеиновых кислот ионизирующим излучением уделяется большое внимание.
В настоящем разделе описаны некоторые экспериментальные подходы, позволяющие изучать характер инактивации белков и нуклеиновых кислот под действием ионизирующей радиации. Феномены, наблюдаемые в такого рода экспериментах, отражают заключительный этап лучевого поражения, когда стойкие структурные повреждения уже привели к необратимым изменениям биологических свойств макромолекулы. Эти данные могут служить отправной точкой биофизического анализа механизма инактивации при прямом действии излучения. Биофизический анализ должен воссоздать все предшествующие этапы «размена энергии» излучения, которые в конечном счете и сформировали наблюдаемые функциональные нарушения.
Последовательность стадий прямого действия радиации
Здесь будет рассмотрена последовательность событий, происходящих от момента непосредственной передачи энергии излучения макромолекуле и до появления в ней стойких структурных и функциональных изменений. Как упоминалось выше, условно этот процесс может быть поделен на три стадии.
На первой, или физической, стадии энергия излучения переносится веществу, возникают возбужденные и ионизированные молекулы, неравномерно распределенные в объеме вещества. Эти события происходят в первые К)16 1013 с.
Для выяснения природы первичных физических процессов необходимо определить параметры «мишени», ответственной за инактивацию молекул. Для решения этой задачи необходим формальный анализ кривых «доза-эффект», сопоставление эффективности излучений с различными ЛПЭ и с различной мощностью дозы, теоретические исследования величин «энергетических пакетов», переносимых молекуле в единичном акте взаимодействия излучения с веществом. Для этой цели привлекаются квантовомеханические представления и сложный математический аппарат.
Следующая, физико-химическая, стадия состоит из различных типов реакций, приводящих к перераспределению между возбужденными молекулами избыточной энергии. Эти реакции протекают за время порядка К)13 К)1 () с. Облученные молекулы, находящиеся в различных электронно-возбужденных состояниях, в течение физикохимической стадии имеют много возможностей для дальнейших превращений. В результате появляются разнообразные активные продукты: ионы, радикалы. Поэтому в веществе, состоящем даже из одного типа молекул, облучение генерирует ионы и радикалы с широким спектром химических свойств.
Для изучения этой стадии исследуют спектр первичных продуктов, возникающих в результате физико-химических процессов перераспределения избыточной энергии, поглощенной молекулами. Особая роль здесь принадлежит методу электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и другим способам идентификации свободных радикалов.
На третьей, или химической, стадии действия ионизирующих излучений ионы и радикалы взаимодействуют друг с другом и с окружающими молекулами, формируя структурные повреждения различного типа. Реакции химической стадии заканчиваются в первые 10° К)3 с после облучения). Для выявления разного типа структурных повреждений молекул используется современный арсенал физических и химических методов анализа макромолекул.
Первичные физические процессы
В гл. III рассматривался формальный подход к объяснению природы первичных событий, приводящих к конечному радиобиологическому эффекту, основанный на анализе экспериментальных кривых «доза-эффект». В частности, обсуждались критерии «одноударности» процесса инактивации и перечислялись условия, выполнение которых показывает, что радиобиологический эффект вызван одиночным переносом дискретной порции энергии излучения к мишени, находящейся в пределах объекта.
Рассмотрим, выполняются ли эти условия в случае инактивации белков и нуклеиновых кислот.
Первое условие — экспоненциальный характер кривых «доза- эффект». Как указывалось в данной главе, при облучении сухих или кристаллических белков и нуклеиновых кислот эффект облучения экспоненциально зависит от поглощенной дозы радиации.
Второе условие — независимость эффекта от мощности дозы и от того, какими частями она сообщалась объекту, — также выполняется на различных изученных системах.
вуют многочисленные опыты,к 100 g^ 80к £ 60g 8 50” § 40h 30О 20вуют многочисленные опыты,к 100 g^ 80к £ 60g 8 50” § 40h 30О 20010"203040010"203040Доза облучения, х 104 ГрДоза облучения, х 104 ГрО выполнении третьего условия — снижения эффективности излучения с ростом ЛПЭ — свидетельсз результат одного из которых представлен на рис. IV.7.
вуют многочисленные опыты,
к 100 g^ 80
к £ 60
g 8 50
” § 40
h 30
О 20
вуют многочисленные опыты,
к 100 g^ 80
к £ 60
g 8 50
” § 40
h 30
О 20
010"203040
010"203040
Доза облучения, х 104 Гр
Доза облучения, х 104 Гр
Рис. IV.7. Инактивация трипсинад-излучением 60 Со (1) и «-частица-ми полония (2) в вакуумепрактически непрерывно еле-Рис. IV.7. Инактивация трипсинад-излучением 60 Со (1) и «-частица-ми полония (2) в вакуумепрактически непрерывно еле-Трипсин подвергали воздействию у-излучения и d-частиц полония (с энергией 5,25 МэВ) в сравнимых дозах. Во всем диапазоне использованных доз у-излучение оказалось примерно вдвое более эффективным: доза D37 для 7-излучения составляла 180 кГр, а для ci-частиц — 320 кГр. При одинаковой поглощенной дозе 7- излучение генерирует редко расположенные одиночные ионизации, а ci-частицы — плотные колонны ионов,
Рис. IV.7. Инактивация трипсинад-излучением 60 Со (1) и «-частица-ми полония (2) в вакууме
практически непрерывно еле-
Рис. IV.7. Инактивация трипсинад-излучением 60 Со (1) и «-частица-ми полония (2) в вакууме
практически непрерывно еле-
дующие вдоль трека частиц. Если одиночной ионизации достаточно для инактивации макромолекулы, то d-частицы образуют множество «ненужных» ионизаций в пределах мишени, а большинство редко расположенных ионизаций, вызванных 7-излучением, эффективно и приводит к поражению большого числа молекул.
Если представление об одноударности процесса инактивации макромолекулы справедливо, то исходя из величины дозы D37, можно определить параметры мишени — ее геометрические размеры и молекулярную массу (см. уравнение (III.9)).
Определение параметров мишени проводится на основании следующих рассуждений. Как мы видели в гл. III, в случае одноударного процесса теория мишени позволяет по характеру повреждения судить об объеме V мишени при облучении 7-квантами (соотношение (ШЛО)),
а «-излучение дает другую информацию — о поперечном сечении S мишени (соотношение (III.7)). В любом случае как объем, так и поверхность коррелирует с массой мишени М, а ее молекулярная масса может определяться независимо химическими методами. Сравнивая эти значения, можно подтвердить (или наоборот, опровергнуть) основные положения, выдвигаемые теорией мишени.
Рассмотрим это подробнее на примере облучения у-квантами. Для этого связывают с массой мишени, например, соотношение (ШЛО). Для оценок достаточно принять 1/v = D37, и остальные расчеты относить только к этой дозе, если экспериментально определить число попаданий при одном и том же проценте выживающих объектов. Известно, что инактивация, снижающая число мишеней в е = 2, 73 раза, создается облучением в дозе D37.
Пусть на образование пары ионов расходуется 32-34 эВ, а на рой из 2-3 пар ионов — около 110 эВ; скоплению ионов можно приписать в среднем энергию 75 эВ. Такое энерговыделение в среднем соответствует одному попаданию в мишень. Поскольку 1 Гр = 1 Дж/кг, а 1 эВ — это 1,602 • 10-19 Дж (определение единиц см. в начале гл. I), доза в 1 Гр соответствует выделению 6,24 • 1015 эВ/г. Разделив эту величину на 75 эВ (определенная выше средняя энергия на одно попадание), получим число повреждений в мишени при дозе 1 Гр. Определив из эксперимента величину D37, найдем окончательно массу, на которую приходится одно повреждение, т. е. массу мишени. Зная массу мишени в граммах, легко определить и ее молекулярную массу умножением массы на число Авогадро.
На основании экспериментально установленных величин D37 были рассчитаны молекулярные массы мишеней, ответственных за инактивацию большого числа
Рис. IV.8. Корреляция между молекулярной массой веществ, определенной физикохимическими методами (Мфиз-_хим) и молекулярной массой мишени, ответственной за инактивацию (Мрадиац)Рис. IV.8. Корреляция между молекулярной массой веществ, определенной физикохимическими методами (Мфиз-_хим) и молекулярной массой мишени, ответственной за инактивацию (Мрадиац)молекул. Во всех случаях, начиная от небольшой молекулы пенициллина, имеющей молекулярную массу около 103 дальтон, и до трансформирующей ДНК массой в 107 дальтон, наблюдается хорошее соответствие между молекулярной массой мишени и истинной молекулярной массой соответствующей молекулы.
Рис. IV.8. Корреляция между молекулярной массой веществ, определенной физикохимическими методами (Мфиз-_хим) и молекулярной массой мишени, ответственной за инактивацию (Мрадиац)
Рис. IV.8. Корреляция между молекулярной массой веществ, определенной физикохимическими методами (Мфиз-_хим) и молекулярной массой мишени, ответственной за инактивацию (Мрадиац)
Представление о корреляции этих двух характеристик дает рис. IV.8, где по оси абсцисс отложены истинные мо-
пекулярные массы веществ, а по оси ординат — молекулярные массы мишеней, ответственные за инактивацию соответствующих молекул.
Если характеристики равны по величине, то пересечение проекций их значений в системе координат дает точку, лежащую на прямой, проходящей под углом 45°, как это в действительности и имеет место.
В большинстве случаев размер мишени близок к геометрическим размерам молекул, т. е. одиночное событие потери энергии в любой точке молекулы приводит к ее инактивации. Этот вывод имеет важное значение. Дальнейший биофизический анализ должен исходить из того факта, что в результате одиночного взаимодействия ионизирующей частицы и молекулы с затратой энергии около 75 эВ молекула белка или нуклеиновой кислоты утрачивает различные функциональные свойства.
Между двумя этими событиями — переносом дискретной порции энергии излучения на макромолекулу и ее инактивацией — происходит ряд последовательных физико-химических процессов, которые требуют детального описания.
Первичные продукты радиационного превращения молекул
Представление о вероятностном характере взаимодействия излучения с веществом, в результате которого некоторые атомы или молекулы поглощают дискретные порции энергии, сформировалось в 20-е годы XX в. Оно привело к формулированию принципа попадания в радиобиологии. Однако до настоящего времени не создана строгая теория, позволяющая на основании строения молекулы предсказать вероятность поглощения ею определенного количества энергии ионизирующего излучения, т. е. оценить относительную частоту поглощения различных «энергетических пакетов».
Исследования в этом направлении интенсивно проводились в последнее время. Наметилось два подхода: теоретический, основанный на квантовомеханических моделях, и экспериментальный, связанный с поиском методов прямого измерения потерь энергии в результате одиночного взаимодействия заряженной частицы с молекулой.
На основании приведенного нами ранее уравнения Бете-Блоха (II. 10) (см. с. 70) можно рассчитать дифференциальную потерю энергии частицей определенного заряда, движущейся со скоростью г в веществе данной плотности. Однако величина потери энергии dE/dx еще ничего не говорит о том, какие «энергетические пакеты» переносятся к молекуле.
В принципе, передача энергии может происходить за счет двух типов взаимодействия — лобового и скользящего соударения. Лобовое соударение достаточно точно описывается классической электродинамикой. При этом типе взаимодействия осуществляется «прямое попадание» заряженной частицы в орбитальный электрон, который приобретает необыкновенно большой момент количества движения. Вероятность этого эффекта низка.
В 8-10 раз чаще происходит скользящее соударение, которое служит основным типом взаимодействия заряженной частицы с молекулами.
При описании скользящего соударения частица рассматривается как источник электрического поля, в котором содержатся фотоны всех
возможных частот. Такое поле может взаимодействовать с орбитальными электронами на значительных расстояниях. В газах это расстояние («прицельный параметр») порядка 100 нм, в плотном веществе — около 10 нм. Взаимодействие электри
Рис. IV.9. Кривая потенциальной энергии молекулы, взаимодействующей с полем заряженной частицы: а) молекула до наложения поля; б) после взаимодействия с полем; 1 — возбужденная молекула; 2 — ионизи-Рис. IV.9. Кривая потенциальной энергии молекулы, взаимодействующей с полем заряженной частицы: а) молекула до наложения поля; б) после взаимодействия с полем; 1 — возбужденная молекула; 2 — ионизи-ческого поля заряженной частицы с молекулой переводит ее в то или иное возбужденное состояние, в том числе и соответствующее ионизации (рис. IV.9).
Рис. IV.9. Кривая потенциальной энергии молекулы, взаимодействующей с полем заряженной частицы: а) молекула до наложения поля; б) после взаимодействия с полем; 1 — возбужденная молекула; 2 — ионизи-
Рис. IV.9. Кривая потенциальной энергии молекулы, взаимодействующей с полем заряженной частицы: а) молекула до наложения поля; б) после взаимодействия с полем; 1 — возбужденная молекула; 2 — ионизи-
Силу, с которой электрическое поле действует на молекулы, можно разложить на две составляющие: параллельную пути частицы (продольная компонента) и перпендикулярную (поперечная компонента). Каждую компоненту можно изобразить рядом Фурье как сумму чисто гармонических функций времени:
-^попереч — * cos (2тгщ£). (IV. 1)
Продольная компонента так мала, что ею можно пренебречь (частица проходит на значительном расстоянии от молекулы).
Анализ функции Фурье для ВПОПереч показывает, что сила поперечной компоненты постоянна от низких до почти максимальных частот; каждый интервал частоты включает одно и то же количество энергии фотонов, составля-
рованная молекулающих поле частицы. Таким образом,
действие заряженной частицы (ее электрического поля) на молекулу совпадает с действием света источника, дающего равное число фотонов для каждого интервала частот от
видимого света до рентгеновского излучения.
В теории, развитой в 50-е годы Платцманом, для характеристики молекулы, взаимодействующей с заряженной частицей, вводится величина «силы осциллятора» этой молекулы, которая выражает вероятность перехода, приводящего к возбуждению или ионизации молекулы.
Силу осциллятора, пропорциональную коэффициенту макроскопического оптического поглощения света соответствующей частоты, обозначают через fs для перехода из основного состояния в дискретное возбужденное состояние s, которое появляется в результате поглощения света частотой vs = Eg/h, где Es — энергия молекулы в возбужденном состоянии относительно энергии в основном состоянии
(энергия возбуждения). Для переходов внутри непрерывного спектра дискретную силу осциллятора нужно заменить на df /du или df /dE, зависящую от энергии Е = hv. Обе формы выражения силы осциллятора нужно понимать как величины, усредненные по всем возможным ориентациям молекулы.
Если молекула возбуждается светом источника, дающего равное число фотонов для каждого интервала частот — от видимого света (белый свет) до рентгеновского излучения, то число молекул, активированных до состояния s, пропорционально силе осциллятора этого состояния:
Ns = const • Д. (IV.2)
Уравнение (IV.2) показывает, что при постоянном распределении частоты величина Ns пропорциональна силе осциллятора. Если частота падающего света характеризуется распределением 1 /hvs = 1 /Es, то число молекул, возбужденных до состояния з прохождением быстрой заряженной частицы, описывается уравнением
Ns - fs/Es. (IV.3)
Аналогичное выражение для непрерывного спектра:
N(E) - ^df/E^/E. (IV.4)
Уравнение (IV.4) называют «оптическим приближением». Основное ограничение этого метода — значительная погрешность при малых значениях fs. Однако применение оптического приближения дает хорошие результаты для анализа энергетического спектра первичных активаций, генерируемых излучением, в действующем спектре которого преобладают быстрые заряженные частицы.
Сила осциллятора fs пропорциональна числу электронов в оболочке, в которой индуцируется активация, т. е. она максимальна для внешних оболочек; Es пропорциональна квадрату эффективного заряда ядра и менее значима для внешних оболочек, так как электроны внутренних оболочек экранируют поле ядра. Поэтому, согласно уравнениям (IV.3), (IV.4), можно сделать вывод: активация валентных электронов — преобладающий первичный процесс происходящий в результате прохождения заряженной частицы через вещество.
Если бы существовала возможность теоретически рассчитать силу осциллятора молекулы, то можно было бы предсказать уровни активации молекул в результате взаимодействия с заряженной частицей. Такой расчет, основанный на квантовомеханических представлениях, был проведен лишь для атома водорода. Уже для малых многоатомных молекул эта задача практически невыполнима (не говоря уже о макромолекулах). Оценить спектр сил осциллятора удается на основании косвенных данных, полученных при изучении коэффициентов поглощения в области непрерывного абсорбционного спектра, показателя преломления и оптической дисперсии, сечения неупругого рассеяния электронов и др.
Согласно уравнению (IV.4) в области непрерывного спектра вероятность создания данного возбужденного состояния пропорциональна (df /dE^/E. Представив на основании косвенных данных спектр сил осциллятора многоатомной молекулы, можно для нее построить спектр возбуждения как функцию R(df /dE)/Е; константа Ридберга R вводится для единства размерности. При таком определении спектр возбуждения совпадает со спектром первичных активаций, создаваемых заряженной частицей при ее первом столкновении.
Анализ спектра возбуждения молекул, состоящих из атомов с Z < 10 и поэтому имеющих кроме валентных электронов только К- оболочку, показал, что практически все возбуждения сосредоточены в области сравнительно больших значений Е. Непрерывный спектр
поглощения молекул, в котором сосредоточена сила осциллятора, содержит в себе непрерывные спектры, обусловленные процессом
Энергия, эВЭнергия, эВРис. IV. 10. Спектр возбуждения метанаРис. IV. 10. Спектр возбуждения метанаионизации и процессом диссоциации, а также спектр, создаваемый процессами, в которых возможна как ионизация, так и диссоциация молекулы, конкурирующие между собой (сверхвозбужденное состояние) .
Энергия, эВ
Энергия, эВ
Рис. IV. 10. Спектр возбуждения метана
Рис. IV. 10. Спектр возбуждения метана
На рис. IV. 10 показан спектр возбуждения метана, построенный на основании экспериментальной оценки силы осциллятора молекулы. Видно, что из всех первичных событий, которые не приводят к ионизации, 45% составляют сверх
возбужденные состояния. Среднее значение энергии, соответствующее полосе сверхвозбуждения, равно приблизительно 15 эВ, т. е. более чем в 3 раза превосходит энергию диссоциации СН3-Н, равную 4,4 эВ. В этом сверхвозбужденном состоянии существует конкуренция между явлениями ионизации и диссоциации. Часть спектра, обозначенная
как «ионизация», соответствует тем уровням возбуждения, которые
всегда приводят к ионизации.
Анализ спектров возбуждения показывает, что для большинства органических молекул спектр сил осцилляторов лежит в области примерно 10-30 эВ над основным состоянием. Сила более длинноволновых осцилляторов невелика (исключение составляют молекулы, имеющие двойные и тройные связи: они могут возбуждаться и при меньших энергиях).
В большинстве случаев спектры энергий осцилляторов превышают потенциал ионизации. Однако не все состояния с энергиями, превосходящими потенциал ионизации, непременно приводят к ионизации молекулы. « Сверхвозбужденные состояния» могут рассеивать энергию при внутримолекулярных изменениях или при диссоциации молекулы на два радикала.
Только часть спектра, обозначаемая как «ионизация», относится к тем переходам, которые всегда приводят к потере электрона.
Рис. IV.11. Распределение потери энергии электронами, проходящими через тонкие слои органического вещества: 1 — электроны 20 кэВ проходят через слой полимера «формвар» толщиной 130 А; 2 — электроны с энергией 150 кэВ проходят через пленку ДНК толщиной 2000 А
Знание спектра возбуждения для биологически активных макромолекул позволило бы оценить распределение и частоту переносимых к молекуле дискретных порций энергии. Теоретический расчет сил осцилляторов многоатомных молекул, как уже говорилось, задача практически невыполнимая. Отсутствуют и экспериментальные исследования, которые позволили бы представить спектр возбуждения макромолекул.
Величину «пакетов энергии», передаваемых макромолекуле в результате одиночного взаимодействия, можно получить путем прямого измерения потери энергии электронами, проходящими через тонкие пленки, для которых вероятность более чем одного взаимодействия с электроном крайне мала. Для этого электроны с энергией 20 кэВ пропускали через тонкие пленки полимера (формваровая фольга) толщиной 13 нм и слои ДНК толщиной 200 нм. Исходя из величины неупругого рассеяния определяли частоту различных событий потери энергии электроном (рис. IV. 11). Вероятность более чем одного события потери энергии при прохождении электроном слоя толщиной в 13 нм очень мала. Поэтому данные 1 на рис. IV. 11 можно рассматривать как меру распределения частоты различных событий потери энергии. Из рисунка видно, что чрезвычайно редко величина потери энергии меньше 10 эВ. С наибольшей частотой при каждом первичном взаимодействии переносится пакет энергии в 22 эВ, в то время как среднее количество потери энергии на одно событие взаимодействия 60 эВ.
Спектры потери энергии в формваре и ДНК качественно сходны. Различие, вероятно, связано с неодинаковой толщиной пленок (технически очень трудно получить пленки ДНК тоньше 200 нм). При такой толщине слоя ДНК можно ожидать более одного события потери энергии. Следует также учесть, что оба рассматриваемых спектра
включают и небольшое число лобовых соударений. Если сделать необходимые поправки на эти эффекты, то мы получим спектр возбуждения ДНК, который позволил бы оценить спектр сил осцилляторов этой молекулы.
Итак, прямые эксперименты показывают, что на одно событие потери энергии в среднем на макромолекулы переносится 60 эВ энергии излучения. Эта величина значительно превосходит потенциал ионизации молекулы. Перенос такого большого количества энергии с высокой вероятностью переводит молекулу в ионизированное состояние. Помимо ионизированных, возникают возбужденные и сверхвозбужденные молекулы.
Относительный вклад ионизации и возбуждения в биологический эффект можно оценить некоторыми специальными методами.
Обратимся еще раз к рис. IV.11. Возбуждение различных осцилляторов приводит к появлению возбужденных, сверхвозбужденных и ионизированных молекул. Теоретический расчет выхода этих первичных продуктов требует знания действующего спектра, сечения возбуждения и ионизации и представляет пока еще не решенную задачу. Метод «оптического приближения» позволяет оценить соотношение этих продуктов исходя из распределения спектра сил осциллятора молекулы. Информацию о распределении силы осциллятора молекулы можно получить на основании косвенных экспериментов с использованием различных физических методов.
Образованием первичных продуктов, т. е. возбужденных, сверхвозбужденных и ионизированных молекул, неравномерно распределенных в пространстве, заканчивается первая, или физическая, стадия действия излучения.
Физико-химическая стадия действия излучения
С того момента, как в облученной системе возникли первичные возбужденные продукты, и до момента установления температурного равновесия протекает сложная цепь реакций, относящихся к физикохимической стадии действия излучения. На этом этапе высоковозбужденные продукты перераспределяют свою избыточную энергию или избавляются от нее.
В ряде работ, которые носят пока сугубо оценочный характер, рассматривается возможная судьба первичных возбужденных продуктов, генерируемых высокоэнергетическим излучением среди молекул поглощающей среды.
На рис. IV. 12 представлена временная шкала различных процессов, в результате которых молекула перераспределяет избыточную энергию или избавляется от нее.
Рассмотрим различные характеристики процессов в молекуле, представленные на рис. IV. 12. Нижний предел времени, необходимый для передачи энергии от частицы к частице, устанавливается принципом неопределенности Гейзенберга. Передача энергии Е, сравнимой с энергией связи электрона в молекуле, требует времени, равного по
Шкала времени, 10 ж сх —>
-16 -15 -14 -13— 12 -11 -10-9-8-7-6-5-16 -15 -14 -13— 12 -11 -10-9-8-7-6-520 эВэлектроннсМолекулярное е колебательноевозб^ вранjво^диссоциацИЯэлектроныв воде у1замедление теттловоеI равновесиевр<эмя жизни радикалов(реакция первого порядка >с К = 5- Ю^М-1^-1)20 эВэлектроннсМолекулярное е колебательноевозб^ вранjво^диссоциацИЯэлектроныв воде у1замедление теттловоеI равновесиевр<эмя жизни радикалов(реакция первого порядка >с К = 5- Ю^М-1^-1)ужден цатель:ие:шоеL-даIфлу<)елаксэресцеациянция—Л€Д; за:te в л<хват эвушк/вр Уемя жИЗНИ 6-гидр1МО.10-1 лярно<IO”2зть акз■ “Ю”3 цептор10"4рад:io-5икало!15ужден цатель:ие:шоеL-даIфлу<)елаксэресцеациянция—Л€Д; за:te в л<хват эвушк/вр Уемя жИЗНИ 6-гидр1МО.10-1 лярно<IO”2зть акз■ “Ю”3 цептор10"4рад:io-5икало!15
-16 -15 -14 -13— 12 -11 -10-9-8-7-6-5
-16 -15 -14 -13— 12 -11 -10-9-8-7-6-5
20 эВ
электроннс
Молекулярное е колебательное
возб^ вран
j
во^
диссоциац
ИЯ
электроны
в воде у1
замедление тет
тловое
I равновесие
вр<
эмя жизни радикалов
(реакция первого порядка >
с К = 5- Ю^М-1^
-1)
20 эВ
электроннс
Молекулярное е колебательное
возб^ вран
j
во^
диссоциац
ИЯ
электроны
в воде у1
замедление тет
тловое
I равновесие
вр<
эмя жизни радикалов
(реакция первого порядка >
с К = 5- Ю^М-1^
-1)
ужден цатель
:ие:
шое
L-
да
I
флу<
)елакс
эресце
ация
нция
—
Л€
Д
; за:
te в л<
хват эвушк
/
вр У
емя ж
ИЗНИ 6
-гидр
1
МО.
10-1 лярно<
IO”2
зть акз
■ “
Ю”3 цептор
10"4
рад:
io-5
икало!
1
5
ужден цатель
:ие:
шое
L-
да
I
флу<
)елакс
эресце
ация
нция
—
Л€
Д
; за:
te в л<
хват эвушк
/
вр У
емя ж
ИЗНИ 6
-гидр
1
МО.
10-1 лярно<
IO”2
зть акз
■ “
Ю”3 цептор
10"4
рад:
io-5
икало!
1
5
Рис. IV. 12. Временная шкала процесса превращений энергии, передаваемой заря-женными частицами молекулам среды
порядку величины периоду колебаний электрона — 1016—1015 с. Этого времени достаточно для любой перестройки электронной системы сильно возбужденной молекулы. Однако на самом деле некоторые из сильно возбужденных состояний существуют в сотни раз дольше. Это означает, что с процессами ионизации могут конкурировать процессы внутренней перестройки, сопровождающиеся смещением атомов в молекулах.
Эти изменения в молекуле происходят со скоростью, ограниченной инерцией атомов и силами, действующими между ними. Для этого необходимо время, сравнимое с периодом нормальных колебаний для данной связи. Инфракрасная спектрометрия позволяет получить сведения о частоте таких колебаний. Для целого ряда молекулярных колебаний (растяжение связей, изгиб линейных молекул и т. д.) периоды лежат в сравнительно узком диапазоне — от 10“14 до 2 • 10“13 с. Следовательно, в результате внутренней конверсии долгоживущие сильновозбужденные состояния могут перейти в слабовозбужденные.
В больших молекулах избыточная энергия электронов легко переходит в колебательную энергию из-за наличия целого ряда возможных электронных и колебательных энергетических состояний. В точках их пересечения переход от более высоких электронных возбужденных состояний к более низким может происходить без испускания излучения, и избыточная энергия будет переходить в колебательную форму. Такая внутренняя конверсия приводит к переходу молекулы в низшее возбужденное состояние с сохранением той же мультиплетности за 10 Ю. Б. Кудряшов
время, примерно равное 1013 К)12 с. Накопление колебательной энергии в отдельных связях может привести к диссоциации молекулы с образованием радикальных продуктов находящихся в возбужденном состоянии.
В конденсированной системе вероятность такого распада молекулы сильно снижается за счет двух обстоятельств.
Высокая частота столкновений молекул вызывает перераспределение колебательной энергии в результате внутренней конверсии. Таким образом, исключается накопление ее в той молекуле, которая получила первичное возбуждение.
Окружающие молекулы образуют «клетку», которая затрудняет расхождение фрагментов; вместо этого они, вероятно, испытывают ряд столкновений и рекомбинируют. Молекулы распадаются на два фрагмента, один из которых — атом водорода. Большую часть кинетической энергии уносит атом водорода, и поэтому он легче проникает через стенки «клетки».
Сверхвозбужденные молекулы
Сверхвозбужденные молекулы — это молекулы, обладающие избыточной энергией, которая превышает потенциал ионизации (рис. IV. 10). Существуют экспериментальные данные, подтверждающие представления о том, что сверхвозбужденное состояние в сложных молекулах сохраняется в течение времени, примерно в 100 раз превышающего период колебаний, т. е. больше 10“13 с.
Некоторые из сверхвозбужденных состояний возникают в результате одновременного перехода двух или нескольких электронов на более высокие энергетические уровни. Взаимодействие таких уровней может привести к концентрации энергии в одном из электронов. Если этот эффект произойдет, то электрон будет выброшен из молекулы, а сама она станет положительным ионом. С такой «автоионизацией» конкурируют процессы внутренней перестройки молекулы, в том числе и те, которые приводят к смещению атомов и переходу избыточной энергии в химическую и тепловую, что ведет к уменьшению имеющейся энергии до значений, меньших порога ионизации. Таким образом, в сверхвозбужденных молекулах существует конкуренция между процессом ионизации и диссоциации.
Ионизированные молекулы
Ионизацию можно рассматривать как одну из форм возбуждения, при которой электрон или группа электронов приобретает настолько большой запас энергии, что выбрасывается из молекулы. Образуются ионы, находящиеся в состоянии электронного и, как правило, некоторого колебательного возбуждения. Это происходит потому, что межатомные расстояния в ионе, находящемся в основном состоянии, и в нейтральной молекуле различаются между собой, акт же ионизации происходит значительно быстрее перестройки связи (принцип Франка-Кондона). В результате ион начинает свое существование с
атомными расстояниями, отличающимися от нормальных и соответствующими некоторой колебательной потенциальной энергии. Процесс внутренней конверсии, рассмотренный выше для возбужденных молекул, происходит аналогичным образом и в ионе, если ион изолирован; концентрация колебательной энергии на определенных связях может привести к его распаду. В жидкостях и твердых телах быстрое рассеяние колебательной энергии в состоянии предотвратить распад и позволить иону перейти в низшее электронное состояние, в котором он способен существовать некоторое время. Если затем ион встретится с каким-либо отрицательно заряженным образованием (ион, сольватированный электрон и т. д.), энергия соединения может оказаться достаточной для распада молекулы на два свободных радикала.
Таким образом, дальнейшие превращения, которые испытывает ионизированная молекула, вероятнее всего приведут ее к распаду на два свободных радикала.
Судьба электронов, испущенных молекулой
Электроны, выбитые из молекулы, обычно делят на две группы в соответствии с тем, больше их кинетическая энергия энергии низшего уровня электронного возбуждения молекул окружающей среды или меньше ее. Электроны первой группы взаимодействуют с электронной системой молекул, с которыми они сталкиваются, и теряют энергию в неупругих соударениях. В конце концов они переходят во вторую группу, оставляя на своем пути ряд молекул с электронными возбуждениями. В дальнейшем эти электроны теряют энергию за счет возбуждения колебательных и вращательных движений в сталкивающихся с ними молекулах.
Если в среде преобладают молекулы, у которых энергия низшего уровня электронного возбуждения существенно превышает кинетическую энергию электрона, но в этой же среде имеется небольшая доля молекул с низкими энергиями электронного возбуждения, то электроны, теряющие мало энергии при столкновении с молекулами первого типа, будут «разыскивать» и возбуждать молекулы второго типа, передавая значительно большую часть поглощенной энергии, чем это соответствовало бы их малой концентрации в среде. По данным Платцмана 15-20% всей энергии, поглощенной при воздействии высокоэнергетического излучения, передается медленными электронами, и среднее время, необходимое для достижения ими теплового равновесия со средой, составляет примерно 10“11 с. За время такого же порядка происходит поляризация среды вокруг замедлившегося электрона. Возникает чрезвычайно активное в химическом отношении образование, названное сольватированным электроном (в водной среде это так называемый «гидратированный электрон», о котором подробнее сказано в следующей главе).
Процессы, происходящие на физико-химической стадии, приводят к различным типам перераспределения возбужденными молекулами избыточной энергии и, таким образом, обусловливают появление 10*
разнообразных активных продуктов (ионов, радикалов и т. д.). Эти процессы протекают в течение очень короткого интервала времени, порядка 1011 К)11 с.
Последовательность образования промежуточных активных частиц
В настоящее время образование промежуточных активных частиц в облученных органических веществах изучено достаточно подробно. Известно, что образование возбужденных состояний молекул — синглетных и триплетных — может происходить:
при первичном возбуждении молекул излучением:
М-^М*,(IV.5)
при нейтрализации ионов:
М++е—>М*,(IV.6)
а также при передаче возбужденных молекул матрицы другим молекулам клетки (или «добавкам»), например, ингибиторам — Ing:
М* + Hing —> МН + Ing.(IV.7)
В отдельных молекулярных системах могут образовываться более сложные возбужденные и высоковозбужденные состояния.
На ионизацию атомов и молекул в клетке расходуется более половины поглощенной энергии излучений. При этом образуется материнский положительный ион М+ и электрон:
М-^М++е".(IV.8)
При высоких концентрациях молекул протекают ион-молекуляр- ные реакции, например, в воде:
Н2О+ + Н2О Н3О+ + ОН.(IV.9)
Электроны, выбитые вследствие ионизации, тратят свою энергию на ионизацию, возбуждение и термализуются:
М + е" —>М",(IV.10)
М + е" —>М*.(IV.11)
Свободные электроны после замедления захватываются матрицей углеводородов, воды и образуют сольватированные (гидратированные) электроны, которые взаимодействуют с другими молекулами.
Ионы так же, как и возбужденные молекулы, могут диссоциировать с образованием свободных радикалов молекул:
М+-^М'+Н+,(IV.12)
М" М’ + ОН",(IV.13)
M*-^Mi+M2.(IV.14)
При радиолизе молекул образуются также анион-радикалы М* и катион-радикалы М*, т. е. соединения, несущие одновременно и заряд, и неспаренный электрон. Фрагментация ион-радикалов приводит к образованию иона и радикала (реакция гомогетеролиза):
ЫР—^М'+М” и ЫР—>Mf+M‘,(IV.15)
М+—>Mi+M+ и М+—>Mf+M2.(IV.16)
В образовании свободных радикалов принимают участие и электроны, реагируя с нейтральной молекулой MX:
MX + е" М' + X-.(IV.17)
Свободные радикалы образуются также при ион-молекулярных реакциях с участием нейтральной молекулы и катиона MiH+:
MX + М1Н+ МХН+ + Mi.(IV.18)
При облучении вещества, состоящего из «однородных» молекул, с определенной вероятностью возникают возбужденные, сверхвозбужденные и ионизированные молекулы, а каждый из этих первичных продуктов имеет много возможностей для дальнейших превращений. В результате образуются ионы и радикалы разнообразной природы с широким спектром химических свойств, взаимодействующие друг с другом и с окружающими молекулами. Эти процессы составляют третью, или химическую, стадию действия ионизирующего излучения.
Реакции ионов и радикалов формируют различные типы структурного поражения молекул. Если исследуемые молекулярные структуры входят в состав биологических систем, то их повреждение может повлечь за собой такие нарушения в этих системах, которые могут стать проявлением биологического эффекта облучения. Если процессы, происходящие на химической стадии, заканчиваются в первые 10° 103 с после облучения, то биологическая стадия может длиться от нескольких секунд до многих лет (например, вызванное облучением уменьшение средней продолжительности жизни млекопитающих).
Химическая стадия
Структурные повреждения, возникающие в облученных макромолекулах
Повреждения, возникающие в структуре облученной макромолекулы, могут привести к изменению ее биологических свойств. Поэтому важнейший этап биофизического анализа механизмов инактивации макромолекул ионизирующим излучением состоит в выявлении всех типов структурного повреждения молекул, выяснении природы процессов, приводящих к данному типу повреждения, и в установлении причинно-следственной связи между типом структурного повреждения и характером изменения биологических свойств макромолекулы. Эти вопросы изучены все еще недостаточно.
Анализ структурных повреждений, возникающих в облученной макромолекуле, представляет сложную экспериментальную задачу, требующую использования высокочувствительных методов исследования.
Структурные повреждения, выявляемые в облученных нуклеиновых кислотах. При облучении сухих препаратов ДНК возникает ряд структурных повреждений, которые удается количественно оценить, как правило, при использовании высоких доз излучения, порядка 104 Гр. Это значительно превосходит значение дозы D37 для различных типов инактивации. Не исключено, что в действительности инактивация нуклеиновых кислот возникает в результате единичных повреждений, например вследствие разрушения нескольких нуклеотидов. Однако ни одним из современных методов анализа не удается прямо, не прибегая к расчетам и экстраполяции, обнаружить столь незначительные повреждения среди десятков тысяч нуклеотидов, составляющих полинуклеотидную последовательность ДНК или РНК.
Для выявления структурных повреждений нуклеиновых кислот, сопровождающихся изменением их размеров, используют различные методы измерения молекулярной массы облученного препарата (седиментационный анализ, изменение светорассеяния, осмоса, характеристической вязкости и т. д.), так как молекулярная масса ДНК или РНК изменяется вследствие разрыва полимерной цепи (двунитевого в случае ДНК) или из-за возникновения сшивок между молекулами.
Если разрыв произошел только в одной из цепей ДНК, то снижение молекулярной массы выявляется после щелочной денатурации или нагревания до 90°.
Количественно число однонитевых разрывов определяют с помощью фермента фосфомоноэстеразы, который отщепляет неорганический фосфат от всех концевых монофосфоэфирных групп по местам разрывов, а количество отщепившегося фосфата измеряют фотометрически.
Влияние облучения на состояние системы водородных связей в молекуле ДНК оценивают по возникновению в ней участков денатурации, например, сопоставив количество кислоты, необходимое для денатурации нативной и облученной ДНК при электрометрическом титровании.
Один из способов определения меры денатурированности ДНК основан на использовании гиперхромного эффекта, свойственного процессу денатурации. Так, коэффициент оптического поглощения нативной ДНК примерно на 30% ниже, чем для одиночной цепи ДНК или смеси равного по содержанию в ней количества соответствующих нуклеотидов, возрастание коэффициента оптического поглощения облученной ДНК указывает на ее денатурацию.
Еще один метод выявления денатурированных участков основан на хроматографическом отделении неповрежденных молекул от молекул, имеющих денатурированные участки.
Доза облучения, х104 ГрДоза облучения, х104 ГрРис. IV. 13. Зависимость образования однонитевых (Bi) и двунитевых (В2) разрывов в сухой ДНК тимуса теленка от дозы рентгеновского облучения в вакуумеРис. IV. 13. Зависимость образования однонитевых (Bi) и двунитевых (В2) разрывов в сухой ДНК тимуса теленка от дозы рентгеновского облучения в вакуумеКоэффициент седиментации SКоэффициент седиментации SРис. IV. 14. Профиль седиментации ДНК тимуса теленка при облучении сухих ее препаратов в вакууме в дозе 3 • 104 Гр: а) контроль; б) после облученияРис. IV. 14. Профиль седиментации ДНК тимуса теленка при облучении сухих ее препаратов в вакууме в дозе 3 • 104 Гр: а) контроль; б) после облучения
Доза облучения, х104 Гр
Доза облучения, х104 Гр
Рис. IV. 13. Зависимость образования однонитевых (Bi) и двунитевых (В2) разрывов в сухой ДНК тимуса теленка от дозы рентгеновского облучения в вакууме
Рис. IV. 13. Зависимость образования однонитевых (Bi) и двунитевых (В2) разрывов в сухой ДНК тимуса теленка от дозы рентгеновского облучения в вакууме
Коэффициент седиментации S
Коэффициент седиментации S
Рис. IV. 14. Профиль седиментации ДНК тимуса теленка при облучении сухих ее препаратов в вакууме в дозе 3 • 104 Гр: а) контроль; б) после облучения
Рис. IV. 14. Профиль седиментации ДНК тимуса теленка при облучении сухих ее препаратов в вакууме в дозе 3 • 104 Гр: а) контроль; б) после облучения
Наконец, разрушение азотистых оснований в облученной нуклеиновой кислоте можно обнаружить с помощью специфических химических реакций или по уменьшению оптического поглощения.
Использование перечисленных и ряда других методов позволило установить, что в результате облучения сухих препаратов ДНК возникают следующие типы структурного повреждения макромолекулы:
- одно- и двунитевые разрывы;
межмолекулярные поперечные сшивки полинуклеотидных цепей;
разветвленные цепи вследствие суммарного эффекта одно- и двунитевых разрывов (за счет присоединения обломков молекулы, образовавшихся в результате двунитевого разрыва, к местам однонитевых разрывов в цепях ДНК).
Результаты одного из экспериментов по определению одно- и двунитевых разрывов в ДНК приведены на рис. IV. 13.
Одиночные разрывы нитей ДНК и разрывы в комплементарных участках обеих нитей пропорциональны поглощенной дозе излучения. Это означает, что двунитевой разрыв вызывается одиночным событием потери энергии, а не случайным совпадением двух соседних однонитевых разрывов (в противном случае кривая В) имела бы иной вид). Вероятность двунитевого разрыва возрастает с увеличением ЛПЭ излучения. Так, при облучении ДНК из фага Т7 ускоренными ионами аргона однонитевые разрывы встречаются только в 2-3 раза чаще двухнитевых, в то время как для воздействия у-излучения это отношение достигает 5 или 6.
После облучения сухой ДНК возникают не только разрывы поли- нуклеотидных нитей, но и сшивки между ними (рис. IV. 14). По сравнению с контрольными образцами максимум коэффициента седиментации облученной ДНК сдвигается в область меньших значений, т. е. молекулярная масса основной части облученного препарата снижается вследствие одно- и двунитевых разрывов. Однако наряду с этим наблюдается небольшой пик в области 30-50 S, который не отмечен в контрольном образце. Он соответствует фракции, которая возникла вследствие сшивок между полинуклеотидными тяжами ДНК.
Механизм возникновения структурных повреждений ДНК в результате поглощения энергия ионизирующего излучения выяснен недостаточно. Работы в этом направлении интенсивно продолжаются. Большее число исследований посвящено анализу начальной стадии химических изменений в облученных нуклеиновых кислотах, для которой характерно появление свободных радикалов. Методом ЭПР- спектроскопии изучают выход и структуру радикалов, возникающих при облучении свободных азотистых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов. Сопоставление этих спектров с наблюдаемыми при облучении сухой ДНК позволяет в ряде случаев идентифицировать радикалы, возникающие в облученных нуклеиновых кислотах.
Один из компонентов сигнала ЭПР облученной ДНК — радикал тимина, образованный, по мнению ряда авторов, продуктом присоединения атомарного водорода к Сб-атомам тимина. Аналогичный эффект можно продемонстрировать при действии на порошкообразный образец тимина атомарным водородом, полученным при газовом разряде: образующиеся сигналы ЭПР сходны с наблюдаемыми в облученных тимидиннуклеотидах и препаратах ДНК. При облучении атомарный водород отщепляется от остатка дезоксирибозы, радикалы которой образуются посредством утраты атома водорода и раскрытия кольца.
В биофизических исследованиях последних лет анализируется роль эффектов миграции энергии в пределах двунитевой ДНК или между молекулами.
Ряд данных указывает на возможность передачи энергии от одной цепи к другой посредством системы водородных связей. Так, при облучении (при 77 К) 1:1-кокристалла, состоящего из 9-метиладенина и 1-метилтимина, обнаружили неспецифический сигнал ЭПР. После нагревания образца до комнатной температуры спектр приобретал характерные очертания радикала тиминового кольца. Обработанная таким образом эквимолярная смесь указанных соединений давала сигнал ЭПР, характерный для суммарного спектра аденина и тимина. Этот опыт свидетельствует о переносе энергии или спина через водородные мостики в кокристалле от аденина к тимину.
В облученной ДНК также наблюдают ярко выраженный сигнал тимина и слабый — аденина. О существовании внутримолекулярного переноса спина в облученной ДНК свидетельствует изменение сигнала ЭПР при нагревании облученных образцов от 77 К до комнатной температуры. Анализ форм спектра, полученного при комнатной
температуре, показывает, что он не образуется простым наложением первичного спектра отдельных составных частей ДНК, а на него оказывают влияние эффекты ее структурной перестройки.
Интересные данные о механизме возникновения структурных повреждений в облученной ДНК получены в экспериментах с использованием модифицирующих агентов.
Структурные повреждения облученных ферментов. Сложность построения реальной картины возникновения структурных повреждений в облученных белках заключается прежде всего в том, что необходимо выявить те физико-химические процессы, в результате которых одиночное событие потери энергии в пределах белковой молекулы, т. е. поглощение структурой около 60 эВ, вызывает ее генерализованное повреждение, такое, например, как изменение конформации. Первичное событие абсорбции энергии носит вероятностный характер, т. е. любая из аминокислот с равной вероятностью поглощает энергию излучения. Тем не менее, оказывается, что конечное структурное поражение локализуется в специфических участках. Для объяснения этого эффекта, вероятно, необходимо допустить возможность миграции энергии и заряда по полипептидной цепи вплоть до локализации в определенном структурном звене.
Большинство исследований по радиационной химии протеинов выполнено на белках с известной первичной структурой. Это позволило выявить тонкие различия облученных и нативных препаратов.
Анализ структурных повреждений, возникающих в облученных препаратах рибонуклеазы, показал, что при дозах, близких к D^ наблюдается:
изменение аминокислотного состава; заметнее всего в образцах снижалось содержание 6 аминокислот: метионина, фенилаланина, лизина, гистидина, тирозина и цистина;
нарушение третичной структуры макромолекулы, оцениваемое но изменению оптического поглощения и оптического вращения, доступности остатков тирозина, степени переваривания белка трипсином и т. д.;
возникновение разрывов полипептидной цепи, приводящее к появлению свободных амидных групп и фрагментов молекулы;
появление агрегатов, о наличии которых судили по изменению константы седиментации и скорости элюции при хроматографии на колонках из сефадекса;
разрыв сульфгидрильных связей и появление свободных SH- групп.
При облучении лизоцима обнаружен несколько иной характер структурных повреждений:
изменяется конформация макромолекулы;
появляется несколько компонентов, обладающих ферментной активностью;
не обнаруживаются изменения в аминокислотном составе макромолекулы.
Исследование структурных повреждений облученного химотрипсина показало, что поглощение энергии ионизирующих излучений вызывает:
появление новых хроматографических пиков при элюции облученного препарата; эти фрагменты утратили ферментную активность;
возникновение конформационных изменений, выявляемых по изменению оптического вращения и уменьшению прочносвязанных амидных атомов водорода;
разрушение аминокислотных остатков серина и триптофана (в среднем одна молекула серина и одна триптофана на молекулу фермента при дозе D37);
снижение способности активного центра фермента связывать субстрат.
Структурные повреждения, о которых говорилось выше, наблюдаются после облучения в дозе, меньшей или равной £>37, т. е. в случаях, когда в среднем каждая молекула испытывает только одно событие попадания (см. «одноударные» кривые инактивации, гл. III). В диапазоне больших доз картина существенно усложняется за счет возникновения повторных актов взаимодействия, вызывающих дополнительные повреждения.
Для понимания механизма обнаруживаемых изменений в белках при облучении в радиационной биофизике прибегают к идентификации свободнорадикальных состояний, возникающих в облученных макромолекулах. Для этого используются ЭПР-спектроскопия и другие специальные методы анализа).
Метод ЭПР (электронного парамагнитного резонанса) основан на взаимодействии исследуемого вещества с магнитным полем и применяется для изучения парамагнитных частиц, например, свободных радикалов. В радиационной биофизике метод ЭПР позволяет оценить процессы, протекающие с участием свободных радикалов, не только в модельных системах и биомакромолекулах, но и в клеточных фрагментах, в облученных системах и биологических объектах.
Установлено, что после облучения ферментов в сухом состоянии при температуре 77 К на спектрах ЭПР обнаруживается синглетный
сигнал ЭПР. При нагревании образцов до комнатной температуры
спектр ЭПР представляет собой уже спектр вторичных радикалов,
состоящих из дублетного сигнала (возможно, ci-углеродных радикалов) и сложного сигнала серосодержащих радикалов (рис. IV.15).
При дальнейшем анализе требуется установить роль наблюдаемых вторичных радикалов в появлении конечных структурных повреждений и в эффекте инак
тивации фермента. Перспективным для этого может оказаться использование модифицирующих агентов, т. е. воздействий,
способных изменить характер возникающих радикальных продуктов. Например, если эти агенты параллельно изменяют как спектр ЭПР вторичных радикалов,
Рис. IV.15. Спектр ЭПР рибонуклеазы, облученной при температуре 77 К: а-г) измерение сигнала ЭПР при различных температурахРис. IV.15. Спектр ЭПР рибонуклеазы, облученной при температуре 77 К: а-г) измерение сигнала ЭПР при различных температурахтак и характер структурных изменений в ферменте, то можно предположить причинную связь между появлением вторичных радикалов и потерей ферментной активности облученными молекулами.
Рис. IV.15. Спектр ЭПР рибонуклеазы, облученной при температуре 77 К: а-г) измерение сигнала ЭПР при различных температурах
Рис. IV.15. Спектр ЭПР рибонуклеазы, облученной при температуре 77 К: а-г) измерение сигнала ЭПР при различных температурах
М' + 3H2S 3HM + 3HS*.М' + 3H2S 3HM + 3HS*.(IV.19)(IV.19)Для локализации радикалов, возникающих в полипептидной цепи после облучения, применяют метод, основанный на использовании меченного тритием сероводорода. Образованные излучением радикалы должны взаимодействовать с 3H2S согласно уравнению
М' + 3H2S 3HM + 3HS*.
М' + 3H2S 3HM + 3HS*.
(IV.19)
(IV.19)
Помещая облученную рибонуклеазу в атмосферу 3H2S, а затем подвергая ее гидролизу, устанавливают, в каких аминокислотах содержится радиоактивная метка 3Н, т. е. определяют локализацию возникших радикалов. Опыты показали, что тритий включается (в убывающем количестве) в лизин, метионин, пролин, гистидин; в небольших концентрациях тритий обнаруживается в фенилаланине, изолейцине и валине. В общем, это соответствует количественному распределению поврежденных аминокислот в облученной РНКазе.
При комнатной температуре в облученных молекулах все еще содержится много нестабильных продуктов. При растворении фермента (необходимом для определения его активности) нестабильные промежуточные продукты превращаются в стабильные пораженные структуры. Это может быть связано с реакцией белковых радикалов или лабильных химических связей в молекуле фермента с водой либо с увеличением подвижности в растворе отдельных полипептидных цепей. В опытах с рибонуклеазой было показано, что растворение облученной молекулы приводит к ее денатурации. Появление свободных амидных групп и фрагментов после развертывания глобулярных структур облученных белков указывает на существование замаскированных разрывов полипептидной цепи.
Рис. IV. 16. Корреляция между потерей ферментной активности, поражением активных центров и конформационными изменениями химотрипсина, подвергнутого воздействию д-излучения 137Cs: 1 — остаточная ферментная активность; 2 — оставшиеся непораженными активные центры; 3 — изменение конформации, определяемое по оптическому вращению АРис. IV. 16. Корреляция между потерей ферментной активности, поражением активных центров и конформационными изменениями химотрипсина, подвергнутого воздействию д-излучения 137Cs: 1 — остаточная ферментная активность; 2 — оставшиеся непораженными активные центры; 3 — изменение конформации, определяемое по оптическому вращению АВ случае с лизоцимом (1?37 инактивации — 266 кГр) при дозе 300 кГр, как уже отмечалось, изменения аминокислотного состава не происходит. Однако выявлены конформационные изменения. Вероятно, они и обусловливают инактивацию фермента.
Рис. IV. 16. Корреляция между потерей ферментной активности, поражением активных центров и конформационными изменениями химотрипсина, подвергнутого воздействию д-излучения 137Cs: 1 — остаточная ферментная активность; 2 — оставшиеся непораженными активные центры; 3 — изменение конформации, определяемое по оптическому вращению А
Рис. IV. 16. Корреляция между потерей ферментной активности, поражением активных центров и конформационными изменениями химотрипсина, подвергнутого воздействию д-излучения 137Cs: 1 — остаточная ферментная активность; 2 — оставшиеся непораженными активные центры; 3 — изменение конформации, определяемое по оптическому вращению А
В случае с химотрипсином нет единства взглядов на роль отдельных структурных нарушений в эффекте инактивации. Данные на рис. IV. 16 свидетельствуют о параллелизме между инактивирующим действием излучения, возникновением конформационных изменений в
облученной молекуле и потерей способности к связыванию субстратаоблученной молекуле и потерей способности к связыванию субстратаактивным центром.
облученной молекуле и потерей способности к связыванию субстрата
облученной молекуле и потерей способности к связыванию субстрата
Эти результаты объясняют по-разному.
Первое объяснение состоит в том, что поглощение энергии излучения приводит к нарушению конформации белковой молекулы; это, в свою очередь, вызывает изменение конформации активного центра и его способности связывать субстрат, что и вызывает инактивацию фермента.
Другая точка зрения основана на том, что один сериновый и (или) триптофановый остаток в особом участке химотрипсина, например, в активном центре, более радиочувствителен, чем такие же аминокислоты в других участках белковой молекулы. Поскольку при дозе D37 в среднем на одну молекулу фермента разрушается по одному сериновому и триптофановому остатку, то в случае, если эти ключевые аминокислоты регулируют конформацию активного центра, их разрушение приведет к поражению активного центра и, тем самым, к инактивации химотрипсина.
Схема отдельных этапов радиационной инактивации сухих ферментов приведена на рис. IV. 17. Она нуждается в дальнейших уточнениях.
В последние годы особое внимание уделяют анализу скрытых повреждений, возникающих в облученных белках, и изучению механизмов миграции энергии в макромолекулах.
радиация
промежуточныеконечный
продуктыэффект
Рис. IV. 17. Свободнорадикальная модель радиационной инактивации сухих ферментов: I — спектр первичных продуктов; II — процессы, протекающие на физикохимической стадии; III — образовавшиеся промежуточные продукты; IV, V — конечный эффект — инактивация фермента
Миграция энергии излучения в биологических структурах
Анализ кривых «доза-эффект» свидетельствует о том, что инактивация фермента может произойти в результате одиночного события потери энергии излучения в любой точке макромолекулы (параметры мишени совпадают с истинными размерами макромолекулы). Представление об одноударности процесса инактивации означает, что поглощение энергии в любой точке молекулы однозначно приводит к изменению ее биологических свойств. Однако при объяснении механизма инактивации фермента в результате одиночного события попадания следует иметь в виду, что определенный тип инактивации (например, утрата субстратной специфичности) может быть связан со структурным повреждением, возникшим не в любом, а, скорее всего, в определенном участке макромолекулы. Теоретический анализ спектра сил осцилляторов молекулы и результаты прямых измерений потери энергии, приходящейся на одно взаимодействие, показывают, что ускоренные заряженные частицы с большой вероятностью переносят к макромолекуле значительные порции энергии, в среднем около 60 эВ. Этого более чем достаточно для разрыва любой химической связи и удаления электрона из молекулы.
Можно было бы думать, что разрыв химической связи, в какой бы точке макромолекулы он ни произошел, приведет к ее денатурации и потере функциональной активности. Это не всегда так.
Для многих ферментов показано, что при дозе D37, когда в среднем одиночному попаданию подвергается каждая макромолекула, наблюдается утрата лишь некоторых функциональных свойств, в то
время как другие остаются без изменения. Так, для рибонуклеазы, облученной в дозе D37, отмечена потеря каталитической активности при сохранении способности связывать специфический субстрат. Это подтверждает точку зрения, согласно которой в результате одиночного акта абсорбции энергии структурное повреждение локализуется в определенном звене макромолекулы, обусловливая специфический характер инактивации.
Возможное объяснение селективного действия облучения состоит в том, что, хотя первоначальное событие поглощения энергии с одинаковой вероятностью происходит в любом звене макромолекулы (например, в любой из сотен аминокислот, составляющих фермент), существует возможность миграции поглощенной энергии и «остановки» процесса в определенном «слабом звене», которое будет претерпевать дальнейшие химические изменения.
Существует ряд прямых способов доказательства миграции энергии возбуждения внутри молекулы и между молекулами.
Термолюминесценция возникает как следствие рекомбинации (по мере повышения температуры) короткоживущих продуктов, «замороженных» при температуре жидкого азота. Повышение температуры приводит к увеличению подвижности первичных продуктов (короткоживущих радикалов, электронов), что способствует реакциям их друг с другом и образованию вторичных продуктов. В процессе этих реакций и регистрируется термолюминесценция.
Измерение сигнала ЭПР. Мы уже отмечали, что характерный для исследуемого радикала сигнал ЭПР возникает в результате взаимодействия магнитного момента неспаренного электрона с магнитными полями окружающих ядер и электронов, т. е. сигнал ЭПР изменяется в зависимости от локализации неспаренного электрона.
На рис. IV. 18 приведен характерный спектр ЭПР при комнатной температуре белка, облученного при низкой температуре. С повышением температуры, как было показано на рис. IV. 15, сигнал ЭПР изменяется от синглета до характерного спектра, в котором можно выявить сигналы глицинподобного серосодержащего радикала.
Ранее мы упоминали, что при облучении смеси молекул двух типов суммарный сигнал ЭПР отличается от теоретической суммы спектров ЭПР этих молекул. Еще одно доказательство получено при изучении облученной глицеральдегиддегидрогеназы. В спектре ЭПР этого фермента после облучения не обнаруживается сигнал радикала серы. Если же к облученному ферменту добавить цистеамин, то в спектре ЭПР этой смеси регистрируют появление сигнала, характерного для радикала серы, т.е. можно предположить, что в результате межмолекулярного переноса энергии от облученного белка к необлученному цистеамину в последнем произошел отрыв атома водорода от SH- группы.
Реакция присоединения. Существование этого типа реакций прямо указывает на возможность переноса энергии от облученных белков к низкомолекулярным молекулам-примесям. Перенесенная энергия
++IСН2IS-HIСН2IS-HIСН2IIСН2IрентгеновскиерентгеновскиелучилучиН радикал водородаIН радикал водородаIглициноподобныйрадикалглициноподобныйрадикал\ радикал серы\ радикал серы9дублет — 2,00289дублет — 2,0028
+
+
I
СН2
I
S-H
I
СН2
I
S-H
I
СН2
I
I
СН2
I
рентгеновские
рентгеновские
лучи
лучи
Н радикал водорода
I
Н радикал водорода
I
глициноподобныйрадикал
глициноподобныйрадикал
\ радикал серы
\ радикал серы
9дублет — 2,0028
9дублет — 2,0028
Рис. IV. 18. Схема образования при комнатной температуре вторичных радикаловв белках, облученных при низкой температуре: а) полипептидная цепь до облуче-ния; б) полипептидная цепь после облучения; стрелки обозначают спины электро-нов; в) спектр ЭПР при 295 К трипсина, облученного в вакууме электронами сэнергией 6,5 МэВ
расходуется на отрыв от молекулы-примеси «Н-М» атома водорода, который присоединяется к радикалу белка:
R* + НМ R-H + М'.(IV.20)
Протекание такой реакции доказано в экспериментах с сероводородом, меченным тритием 3Н, описанных выше (см. (IV.19)). В экспериментах с облученной рибонуклеазой, обработанной 3H2S, были отмечены следующие эффекты:
исчезновение сигнала ЭПР облученного белка;
преимущественное включение метки в определенные типы аминокислот, главным образом, в остаток цистина;
соответствие между количеством включенного трития и числом свободных радикалов, возникающих в облученном белке при данной величине поглощенной дозы радиации.
Такие результаты свидетельствуют о межмолекулярном переносе энергии от облученной рибонуклеазы к необлученному сероводороду. Соответствие между общим количеством включенного в аминокислоты трития и радиационно-химическим выходом радикалов указывает на возникновение в облученном белке нескольких типов радикалов из различных аминокислотных остатков.
Механизмы переноса энергии выяснены недостаточно. Эксперименты по изучению термолюминесценции свидетельствуют о переносе энергии возбуждения с помощью особых структур, таких, как триптофановые кольца и кольца тирозина и фенилаланина, а в нуклеиновых кислотах — за счет расположенных в одной плоскости пуриновых и пиримидиновых оснований.
Еще один возможный механизм переноса энергии — это миграция электронов через зону проводимости с последующим захватом их положительно заряженными «дырками».
Эксперименты с 3H2S и анализ спектров ЭПР указывают на перенос энергии за счет миграции малых радикалов, таких, как атом водорода, NH3 и другие небольшие фрагменты облученных молекул.
Перенос энергии возбуждения и перенос электронов требуют участия специальных структур и, возможно, высоких энергий активации, тогда как экспериментально наблюдаемые значения энергии активации радикалообразования и инактивации различных молекул довольно малы. Эти факты позволяют предположить, что именно перенос радикалов имеет большое значение в процессах миграции энергии при прямом действии радиации.
Модификация лучевого повреждения макромолекул
Чувствительность макромолекул к радиационному воздействию можно изменить по меньшей мере в два или три раза в зависимости от условий во время облучения или после него. К числу агентов,
Рис. IV. 19. Инактивация сухой РНКазы д-излучением 60 Со в вакууме (1) ив присутствии кислорода (2)Рис. IV. 19. Инактивация сухой РНКазы д-излучением 60 Со в вакууме (1) ив присутствии кислорода (2)Рис. IV.20. Относительная чувствительность сухого трипсина к действию 7-излучения в зависимости от содержания кислорода во время облучения (за единицу принята радиочувствительность трипсина в вакууме)Рис. IV.20. Относительная чувствительность сухого трипсина к действию 7-излучения в зависимости от содержания кислорода во время облучения (за единицу принята радиочувствительность трипсина в вакууме)
Рис. IV. 19. Инактивация сухой РНКазы д-излучением 60 Со в вакууме (1) ив присутствии кислорода (2)
Рис. IV. 19. Инактивация сухой РНКазы д-излучением 60 Со в вакууме (1) ив присутствии кислорода (2)
Рис. IV.20. Относительная чувствительность сухого трипсина к действию 7-излучения в зависимости от содержания кислорода во время облучения (за единицу принята радиочувствительность трипсина в вакууме)
Рис. IV.20. Относительная чувствительность сухого трипсина к действию 7-излучения в зависимости от содержания кислорода во время облучения (за единицу принята радиочувствительность трипсина в вакууме)
которые модифицируют радиочувствительность макромолекул, относятся кислород, температурное воздействие, присутствие молекул- примесей и др. Каждый из этих факторов, естественно, не может повлиять на физический акт переноса энергии излучения к макромолекуле, и все-таки эти воздействия способны усилить или ослабить лучевое повреждение. Поэтому считают, что модифицирующие агенты влияют не на первичные акты абсорбции энергии, а на более поздние этапы лучевого поражения. Например, они могут изменить характер миграции энергии внутри макромолекулы или между молекулами, избирательно защитить определенные функциональные группы, ре- парировать лучевые повреждения или изменить характер физикохимических реакций, в которые вступают облученные молекулы.
Модифицирующее действие кислорода
В экспериментах с сухими препаратами ферментов было установлено, что их радиочувствительность значительно возрастает, если облучение проводится в атмосфере кислорода, а не в вакууме.
На рис. IV. 19 представлены результаты эксперимента по сопоставлению эффективности инактивации сухой РНКазы у-излучением в вакууме и в атмосфере кислорода. Значение дозы D37 для инактивации рибонуклеазы в вакууме примерно вдвое выше, чем в атмосфере О2.
Приведем еще один пример модифицирующего влияния кислорода на прямое действие облучения (рис. IV.20). На рисунке видно, что даже незначительное содержание кислорода в среде приводит к резкому возрастанию инактивирующего действия данной дозы облучения. При увеличении давления О2 примерно до 120 мм рт. ст. эффект инактивации возрастает; дальнейшее повышение содержания кислорода в среде оказывается неэффективным.
11 Ю. Б. Кудряшов
Механизм кислородной радиосенсибилизации молекул в прямом действии излучения выяснен все еще недостаточно. Ряд исследователей (например, Дертингер и Юнг, 1973) объясняли способность кислорода повышать чувствительность макромолекул к прямому действию излучения тем, что некоторые молекулы, изначально получившие повреждение, восстанавливаются в отсутствие кислорода в результате одного из таких процессов:
(ионизированная молекула) МН+ + е- —> МН,(IV.21)
(свободнорадикальноем" + Н" у МН(IV 22)
состояние молекулы)’\ • /
а кислород ингибирует обе реакции либо за счет перехвата электрона, либо за счет превращения радикала М' в перекисный радикал МО2 (в последнем случае возникает необратимое повреждение, связанное с пероксидацией радикала М).
В обоих случаях предполагается, что кислород оказывает потенцирующее действие, т. е. он не увеличивает истинное число первичных повреждений, а тормозит или полностью прекращает протекание восстановительных процессов.
Кислородное последействие
Л. X. Эйду с и его сотрудники обнаружили пострадиационное действие кислорода на ферменты, которое было названо кислородным последействием. Один из экспериментов, в которых был обнаружен этот эффект, состоял в следующем. Ампулы с сухим пепсином облучали в анаэробных условиях в дозах, в 1,5 раза превышающих дозу D37, затем облученный фермент переносили (без доступа О2) в герметическую камеру, наполненную аргоном, где и проверяли активность фермента. Было показано, что при облучении ферментная активность не теряется и в анаэробных условиях может сохраняться длительное время. В отсутствие воды кислород также не оказывал инактивирующего действия, и лишь при увлажнении препарата происходила его инактивация под действием кислорода, степень которой увеличивалась с ростом поглощенной дозы.
Существование долгоживущих скрытых повреждений*), реализуемых при взаимодействии с кислородом, доказано, по крайней мере, для некоторых ферментов по критерию их инактивации. Отсутствие поражения некоторых объектов при анаэробном облучении свидетельствует, что кислород не просто один из агентов, модифицирующих поражение, а необходимый участник определенных видов поражения.
При этом кислород может оказать поражающее действие, присутствуя не только во время облучения, но и после его окончания.
По мнению ряда радиобиологов, в облученном образце возникают два вида поражения: первый требует присутствия кислорода непосредственно «под лучом», второй способен длительное время сохраняться в отсутствие кислорода, т. е. образуются соответственно короткоживущие и долгоживущие «скрытые» повреждения.
Анализ физико-химических процессов, приводящих к возникновению скрытых повреждений, требующих для своей реализации кислорода, актуален и в настоящее время. В частности, продолжается исследование связи этих эффектов с возникающими в результате облучения свободными радикалами (кислород влияет на спектр ЭПР облученных биомакромолекул и в ряде случаев даже приводит к исчезновению сигнала ЭПР облученных белков).
В целом, проблема возникновения и реализации скрытых повреждений далека от окончательного разрешения и продолжает оставаться предметом радиационно-биофизического изучения.
Влияние температуры во время прямого действия радиации
Радиочувствительность многих макромолекул зависит от температуры во время облучения. Пример этого приведен на рис. IV.21, где
показана инактивация сухой РНКазы у-излучением при трех различных температурах.
Механизм температурного эффекта также окончательно еще не установлен. Предполагают, что константа скорости реакции (или реакций), определяющей инактивацию макромолекулы, зависит от повышения температуры. По крайней мере некоторыми из таких реакций могут быть взаимодействия макромолекул с атомарным водородом и другими малыми радикалами, которые высвобождаются при облучении органических материалов и, вероятно,
Рис. IV.21. Инактивация РНКазы д-из- лучением 60 Со в вакууме при различных температурахРис. IV.21. Инактивация РНКазы д-из- лучением 60 Со в вакууме при различных температурахатакуют непораженные молекулы.атакуют непораженные молекулы.Температурное последействие
Рис. IV.21. Инактивация РНКазы д-из- лучением 60 Со в вакууме при различных температурах
Рис. IV.21. Инактивация РНКазы д-из- лучением 60 Со в вакууме при различных температурах
атакуют непораженные молекулы.
атакуют непораженные молекулы.
В облученных белковых молекулах возникают скрытые повреждения, переходящие в явные при дополнительном тепловом воздействии. Например, возникающие внутримолекулярные повреждения приводят к инактивации фермента после обработки облученного препарата теплом. Тепловое воздействие эффективно и после аэробного облучения, т. е. в результате нагрева реализуются иные скрытые повреждения, чем те, на которые способен воздействовать кислород. Таким образом, 11*
ммольммольРис. IV.22. Влияние глутатиона на радиочувствительность инвертазы (смесь 5% инвертазы и глутатиона в разных концентрациях высушивали, а затем подвергали воздействию рентгеновского излучения)Рис. IV.22. Влияние глутатиона на радиочувствительность инвертазы (смесь 5% инвертазы и глутатиона в разных концентрациях высушивали, а затем подвергали воздействию рентгеновского излучения)мг цистерина/мг РНКазымг цистерина/мг РНКазыРис. IV.23. Зависимость фактора уменьшения дозы ФУД радиационной инактивации рибонуклеазы от концентрации прибавленного цистамина. ФУД = (D37 в присутствии цистамина)/(Пз7 для чистого фермента)Рис. IV.23. Зависимость фактора уменьшения дозы ФУД радиационной инактивации рибонуклеазы от концентрации прибавленного цистамина. ФУД = (D37 в присутствии цистамина)/(Пз7 для чистого фермента)
ммоль
ммоль
Рис. IV.22. Влияние глутатиона на радиочувствительность инвертазы (смесь 5% инвертазы и глутатиона в разных концентрациях высушивали, а затем подвергали воздействию рентгеновского излучения)
Рис. IV.22. Влияние глутатиона на радиочувствительность инвертазы (смесь 5% инвертазы и глутатиона в разных концентрациях высушивали, а затем подвергали воздействию рентгеновского излучения)
мг цистерина/мг РНКазы
мг цистерина/мг РНКазы
Рис. IV.23. Зависимость фактора уменьшения дозы ФУД радиационной инактивации рибонуклеазы от концентрации прибавленного цистамина. ФУД = (D37 в присутствии цистамина)/(Пз7 для чистого фермента)
Рис. IV.23. Зависимость фактора уменьшения дозы ФУД радиационной инактивации рибонуклеазы от концентрации прибавленного цистамина. ФУД = (D37 в присутствии цистамина)/(Пз7 для чистого фермента)
в одной и той же макромолекуле могут возникать по крайней мере два типа скрытых повреждений: независимые от кислорода и зависимые от присутствия его. В то же время под влиянием тепла не могут быть реализованы все типы скрытых повреждений.
Природа скрытых повреждений, требующих для своей реализации дополнительного теплового воздействия, продолжает исследоваться в настоящее время.
Роль молекул-примесей
Облучение белка в смеси с рядом низкомолекулярных веществ может либо уменьшить его радиочувствительность (эффект защиты), либо увеличить ее (эффект сенсибилизации). Наиболее выраженным защитным действием в сухих системах обладают тиолы (аминотиолы) и ин дол и л ал кил амины, известные в радиобиологии как классические радиопротекторы.
На рис. IV.22 показано, как изменяется относительная радиочувствительность инвертазы (ее оценивали по величине дозы D37) в зависимости от концентрации прибавленного глутатиона.
Для количественной оценки эффективности защитного агента часто определяют значение фактора уменьшения дозы (ФУД), которая определяется как отношение величины дозы D37 (или D50) в присутствии защитного агента к ее значению в отсутствие указанного агента. На рис. IV.23 показано изменение величины ФУД для рибонуклеазы в зависимости от концентрации цистамина, прибавленного к ней в качестве «защитного» агента.
Не все примесные молекулы защищают белки. Так, прибавление сахарозы увеличивает степень инактивации рибонуклеазы в 2,6 раза. Аналогичным действием обладает целый ряд углеводов.
Выяснение механизма защитного и сенсибилизирующего действия примесных молекул служит предметом радиационно-биофизического анализа. Прогресс в этой области во многом зависит от понимания природы начальных поражений, возникающих в облученных макромолекулах.
Существует ряд гипотез о механизме защиты макромолекул низкомолекулярными соединениями. Прежде всего, защитное действие последних может осуществляться за счет конкуренции за высокоактивные свободные радикалы (атомарный водород и другие фрагменты облученных молекул), которые могут вызывать структурные поражения макромолекулы. Другая возможность состоит в том, что защитный агент способствует восстановлению пораженной макромолекулы за счет переноса водорода с защитного вещества РН на свободный радикал пораженной биомакромолекулы В/ по типу реакции (IV.6).
Показано, что тиольные радиопротекторы (цистеамин, глютатион и др.) репарируют возникающие при радиолизе биополимеров (белки, ДНК, полисахариды) повреждения: пространственно-затрудненные фенолы реагируют с макрорадикалами по типу (IV.6).
Использование термина «репарация повреждений» для физикохимического уровня исследований требует разъяснений. Строго говоря, репарация по отношению к макрорадикалам ДНК, например, по реакции (IV.6), возможна лишь в случае, если неспаренный электрон (свободная валентность) находится на 2-дезоксирибозном остатке (радикал образуется по реакциям (IV.8) и (IV.9)). При этом макрорадикал в присутствии радиопротектора прекращает свое существование. Тем самым снижается количество разрывов в сахарофосфатной цепи ДНК, поскольку эти разрывы — результат превращений 2-дезоксири- бозильных радикалов с неспаренным электроном на атомах углерода в положениях СЗ, С4 и С5.
Если же в макрорадикале ДНК неспаренный электрон локализован на каком-либо из оснований, то реагируя с молекулой ингибитора (по реакции (IV.6)), исходная структура макромолекулы не восстанавливается — из оснований образуются молекулы с насыщенными связями. В таком модифицированном нуклеотиде в составе ДНК N- гликозидная связь (между 2-дезоксирибозилом и основанием) подвергается гидролитическому расщеплению. В результате в ДНК появляются апуриновые и апиридиновые сайты. При возрастании pH в измененных местах нитей ДНК образуются разрывы.
Были предложены гипотезы, связывающие защитное действие низкомолекулярных веществ с процессами межмолекулярной миграции энергии, т. е. полагают, что в облученном межмолекулярном комплексе «макромолекула-примесь» возможна миграция энергии и заряда. В зависимости от того, какая из компонент этого комплекса является донором или акцептором, возможно ослабление или усиление повреждения биомакромолекулы. Эффективность миграции энергии зависит от
степени комплексообразования. Показано, что в механической смеси (комплексообразование отсутствует) защитный агент обладает гораздо более слабым действием, чем при наличии комплекса защитного соединения и макромолекулы (комплекс получают из раствора при совместном осаждении макромолекулы и защитного соединения). В то же время известно, что при комплексообразовании миграция заряда гораздо сильнее, чем в механической смеси этих же веществ. Вероятно, за счет миграции энергии и заряда защитный агент «отводит» избыточную энергию, поглощенную облученной макромолекулой.
Модифицирующее действие низкомолекулярных примесных молекул используют для выяснения роли миграции энергии в начальных радиобиологических процессах, тем более что в реальных условиях (в ядре, цитоплазме или органоидах) биомакромолекулы окружены низкомолекулярными соединениями, которые могут служить донорами или акцепторами поглощенной энергии излучения.
Использование модифицирующих агентов стало традиционным приемом биофизического анализа первичных процессов лучевого поражения макромолекул и значительно более сложных систем, включая клетку и многоклеточный организм. Таким образом, пытаются подойти к выяснению роли свободных радикалов в возникновении структурных повреждений и последующей инактивации макромолекул. Представляет интерес использование агентов, видоизменяющих выход первичных радикалов или их характер, с последующим изучением структурных повреждений, возникающих в модифицированных условиях.
Изучение кислородного и температурного последействия выявило существование «скрытых» повреждений, требующих для своей реализации дополнительного, нерадиационного воздействия во время облучения и после него. Это означает, что в ряде случаев одного лишь прямого лучевого воздействия недостаточно для инактивации макромолекулы.
Использование модифицирующих агентов перспективно для выяснения причинно-следственной связи между различными типами радиационного поражения макромолекулы и характером изменения ее биологических свойств. Логика такого исследования состоит в следующем.
Пусть модифицирующий агент видоизменяет характер инактивации макромолекулы; например, в его присутствии облученный фермент сохраняет сродство к субстрату, хотя и утрачивает каталитическую активность, а без модифицирующего агента облучение инактивирует обе функции макромолекулы. В этом случае интересно сопоставить структурные повреждения, возникающие в присутствии модифицирующего агента и без него. Если в отсутствие модифицирующего агента наблюдаются какие-то дополнительные структурные повреждения, то можно предположить, что с ними связана потеря субстратной специфичности облученного фермента.
Для проверки такого предположения необходимы строгие количественные исследования, например сопоставление радиационнохимического выхода данного типа структурного поражения и выхода инактивированных молекул, концентрационных зависимостей и т. д. Если это возможно, следует вызвать такие же повреждения иными, нерадиационными воздействиями и оценить, к каким последствиям для фермента это приведет.
*
Материал этой главы посвящен рассмотрению биофизических подходов к анализу механизмов инактивации биомакромолекул ионизирующим излучением. В общем ряду радиобиологических проблем этот вопрос имеет первостепенное значение: радиационное поражение любой биологической системы, от вируса до многоклеточного организма, начинается с инактивации небольшого числа молекул, составляющих биологический объект.
Облученные сухие гомогенные препараты ферментов или нуклеиновых кислот — «идеальная» система для первоначального биофизического анализа. В живой клетке на первичные радиационные повреждения макромолекул накладываются эффекты, гораздо более сложные и пока еще не определенные: расширение поражения за счет метаболических реакций, восстановление пораженной молекулы за счет функционирования репарирующих систем, эффекты, связанные с гетерогенностью облучаемой системы, присутствием воды, липидов и низкомолекулярных субстратов и т. д. Следовательно, изучение механизмов инактивации сухих препаратов — только первый необходимый этап на пути познания природы радиобиологических процессов, протекающих при облучении клетки и организма.
В то же время изучение инактивирующего действия ионизирующей радиации на макромолекулах представляет и самостоятельный интерес как метод анализа функциональных свойств отдельных субмолекулярных структур. В этом случае ионизирующее излучение выступает в качестве уникального «инструмента» биофизического анализа ферментов, нуклеиновых кислот и различных надмолекулярных комплексов: ДНП, хроматина, рибосом и т. д.
Используя математический аппарат теории мишени, можно на основании экспериментальных кривых «доза-эффект» установить геометрические размеры мишени, ответственной за данный тип инактивации макромолекулы. Модифицируя условия облучения, в ряде случаев можно добиться возникновения селективных поражений макромолекулы и оценить их роль в эффекте инактивации (например, если в результате облучения фермента разрушается определенный аминокислотный остаток и при этом нарушается конформация активного центра и исчезает сродство к субстрату, то можно предположить, что данный структурный участок регулирует конформацию активного центра).
Преимущество использования радиационного воздействия состоит еще и в том, что с его помощью можно добиться возникновения узколокальных повреждений в любом участке молекулыщри этом другие структурные звенья останутся неповрежденными (существенно, что при этом макромолекулы могут оставаться сухими, находиться в вакууме или в любой газовой смеси, быть замороженными до любой температуры или параллельно подвергаться иным воздействиям).
Тем не менее, предстоит еще многое сделать для воссоздания целостной картины, которая развертывается от момента ионизации или возбуждения макромолекулы, поглотившей энергию излучения, до ее химического повреждения и инактивации. Необходим дальнейший глубокий теоретический анализ спектра первичных возбуждений макромолекул, детальное выяснение процессов миграции энергии и заряда внутри молекулы и между молекулами. В результате экспериментальных исследований предстоит установить спектр первичных продуктов и характер их дальнейших преобразований до возникновения стабильного радиационного повреждения. И, наконец, предстоит выяснить вклад определенных типов структурного повреждения в суммарный эффект функциональной инактивации макромолекул.
Глава V
НЕПРЯМОЕ ДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГОИЗЛУЧЕНИЯ
Общая характеристика непрямого действияионизирующих излучений на макромолекулы в водныхрастворах
В общих чертах механизм лучевого поражения биомакромолекул представляет следующую цепь процессов. К молекуле переносится и поглощается ею дискретная порция энергии излучения (вероятнее всего, она составляет 10-30 эВ над основным состоянием). Поглощенная энергия растрачивается на ионизацию, сверхвозбуждение и возбуждение. Ионизированные и возбужденные молекулы нестабильны — для образования стабильных структур электронные конфигурации их должны претерпеть определенную перестройку за счет миграции энергии внутри молекулы или между молекулами. В конечном итоге избыточная энергия оказывается в определенном «слабом звене», которое испытывает химическое изменение. Возникшее структурное повреждение может привести к определенному типу инактивации (характер инактивации определяется функциональной ролью пораженного структурного звена макромолекулы).
Представим, что облучению подвергаются не высушенные или кристаллические препараты, а водные растворы их в низкой концентрации, в которых каждую биомакромолекулу окружает множество молекул воды. Вероятность поглощения энергии ионизирующего излучения водой или органической молекулой примерно одинакова (см. уравнение (11.15)). Поэтому в разбавленных водных растворах большая часть энергии будет поглощаться молекулами воды, которых значительно больше, чем растворенных биомакромолекул.
Если в результате поглощения энергии ионизирующего излучения вода становится «химически активной», то растворенные молекулы будут испытывать дополнительное поражение. В этом случае эффективность лучевого поражения макромолекул в водных растворах должна быть значительно выше, чем в сухих препаратах.
На рис. V.1 сопоставлена радиочувствительность рибонуклеазы в сухих препаратах и в водном растворе. Как следует из данных эксперимента, если значение дозы D37 для инактивации сухого фермента составляет 420 кГр, то в водном растворе сравнимая инактивация достигается после облучения в дозе 4 кГр. Такой результат характерен
Рис. V.I. Инактивация д-излуче- нием рибонуклеазы в сухом состоянии (верхняя кривая) и в водном растворе фермента в концентрации 5 мг/мл (нижняя кривая)Рис. V.I. Инактивация д-излуче- нием рибонуклеазы в сухом состоянии (верхняя кривая) и в водном растворе фермента в концентрации 5 мг/мл (нижняя кривая)для различных макромолекул — белков, нуклеиновых кислот, и др.; в разбавленном водном растворе их радиочувствительность возрастает в десятки и сотни раз.
Рис. V.I. Инактивация д-излуче- нием рибонуклеазы в сухом состоянии (верхняя кривая) и в водном растворе фермента в концентрации 5 мг/мл (нижняя кривая)
Рис. V.I. Инактивация д-излуче- нием рибонуклеазы в сухом состоянии (верхняя кривая) и в водном растворе фермента в концентрации 5 мг/мл (нижняя кривая)
Зависимость «доза-эффект» при облучении водных растворов макромолекул носит экспоненциальный характер, аналогично наблюдаемому при облучении сухих препаратов. Это указывает на одноударность процесса инактивации. При одноударном механизме объем мишени, ответственной за инактивацию, пропорционален Х,ВЛ7 (см. уравнение (III.8)). Из сравнения доз D37
для инактивации сухого и растворенного ферментов можно было бы
заключить, что в растворе размер чувствительной мишени, инактивируемой одиночным попаданием кванта энергии, возрастает в сотни раз по сравнению с размером мишени для инактивации этого же фермента в высушенном состоянии. Такое предположение маловероятно. Объем макромолекулы не может увеличиться в сотни раз в результате
растворения ее в воде.
Убедительнее предположение, согласно которому в растворе формальная мишень охватывает область, превосходящую линейные размеры макромолекулы, и включает в себя прилегающие к ферменту молекулы воды. Тогда одиночное попадание не только в пределы рассматриваемой белковой молекулы, но и в окружающие ее молекулы воды может привести к ее инактивации.
Для рассматриваемого случая поражения мишеней, растворенных в воде, вводится понятие «эффективного объема», или такого объема, из любого места которого энергия попадания, не растраченная до уровня, более низкого, чем порог действия, тем или иным путем достигнет «места действия» (например, определенного структурного звена макромолекулы, ответственного за инактивацию) и приведет к возникновению «единицы реакции» (т. е. к инактивации фермента). В водном растворе энергия, поглощенная растворителем, может передаваться растворенной макромолекуле за счет диффузии активных продуктов радиолиза воды.
В принципе, более высокую радиочувствительность макромолекулы в водном растворе можно было бы объяснить снижением энергии активации. В этом случае на каждые 100 эВ поглощенной энергии в растворе инактивировалось бы значительно больше молекул, чем в сухом препарате. Для сравнения энергий активации необходимо
определять величину радиационно-химического выхода G инактивации фермента в растворе и в сухом препарате из соотношения
^ _ число образованных или пораженных молекул (VI) 100 эВ поглощенной энергии
В опытах с РНКазой установлено, что G в сухом препарате равна 1,68, в водном растворе — 0,89. Обе величины относительно мало отличаются друг от друга. По-видимому, причина повышения радиочувствительности фермента в водном растворе связана не с изменением его физико-химических свойств в результате растворения (энергия активации изменилась незначительно), а с появлением в облученной воде дополнительных поражающих факторов — активных продуктов радиолиза воды. Поэтому правильнее говорить не об истинном повышении радиочувствительности макромолекулы, а об увеличении эффективности данной дозы, которое обусловлено увеличением объема чувствительной мишени. В мишень большего размера более вероятно одиночное попадание, приводящее к инактивации.
Для изучения механизма радиационной инактивации растворенных в воде молекул необходимо осуществить ряд логически связанных друг с другом этапов биофизического анализа:
изучить характер радиационно-химического превращения молекул воды, природу возникающих активных продуктов, их физико-химические свойства и реакционную способность;
установить кинетические характеристики процесса инактивации растворенных молекул;
определить основные типы реакций, в которые могут вступать органические молекулы и продукты радиолиза воды;
исследовать характер структурных повреждений, возникающих в биомакромолекулах, взаимодействующих с активными продуктами радиолиза воды, и найти причинно-следственную связь между типами структурного повреждения и характером инактивации растворенных макромолекул.
Далее мы кратко рассмотрим ряд методических подходов к решению перечисленных задач и остановимся на некоторых важных результатах, полученных в биофизических исследованиях.
Биофизический анализ радиационной инактивациимолекул в растворах
Радиационно-химические превращения молекул воды
На рис. V.2 представлен оптический спектр поглощения воды, дающий представление о распределении сил осцилляторов молекулыН2О).Вчасти спектра, соответствующей обычному возбуждению
515253545Е, эВ515253545Е, эВРис. V.2. Оптический спектр поглощения водыРис. V.2. Оптический спектр поглощения водыс энергией, меньшей потенциала ионизации I = 12,6 эВ, можно различить три области. Полоса непрерывного поглощения с наименьшей энергией обусловлена только переходом, который приводит к диссоциации с образованием основного (электронного) состояния Н + ОН и ответственен за известную непрозрачность воды во всех фазовых состояниях для длин волн короче 180 нм. В другие полосы возбуждения входят как об
515253545
Е, эВ
515253545
Е, эВ
Рис. V.2. Оптический спектр поглощения воды
Рис. V.2. Оптический спектр поглощения воды
ласть непрерывного поглощения, так и ряд отчетливых полос, в которых соответствующие им наиболее распространенные первичные продукты диссоциируют на Н и ОН* или Н2 и О.
Область сверхвозбуждения простирается от Zq до энергии около 30 эВ. Сверхвозбуждение возникает в результате примерно 63% всех первичных событий, происходящих без ионизации, а конкуренция между двумя путями — ионизацией и диссоциацией — была доказана экспериментально. Сверхвозбужденные молекулы Н2О* могут диссоциировать на два радикала:
Н2О* ^Н'+ОН'.(V.2)
Конкурирующий процесс — «автоионизация» сверхвозбужденной молекулы воды:
Н2О* —>Н2О++е“.(V.3)
Большая часть энергии осцилляторов превосходит потенциал ионизации. Перенос к молекуле ЩО и передача ей энергии, большей, чем Zq, с высокой вероятностью приводят к ионизации:
Н2О —> Н2О++ е".(V.4)
Ионы Н2О+ могут находиться в различных электронных состояниях, одни из которых стабильны, а другие приводят к диссоциации. Концентрация колебательной энергии на определенных связях может привести к распаду иона:
Н2О+ ^Н+ + ОН'.(V.5)
Свободные радикалы Н' и ОН' пространственно не разобщены, поэтому они могут с большой вероятностью рекомбинировать с образованием молекулярных продуктов:
Н" + ОН" —> Н2О,(V.6)
Н"+Н—^Н2,(V.7)
ОН" +ОН" —>Н2О2.(V.8)
Чем выше Л ПЭ излучения, тем больше свободных радикалов возникает на единицу пути частицы и тем соответственно выше вероятность их рекомбинации с образованием молекулярных продуктов согласно реакциям (V.6)-(V.8).
До середины 60-х гг. считалось, что при облучении водных раст
воров макромолекул косвенное поражение их происходит за счет взаимодействия с радикалами Н’, ОН' и перекисью водорода. Это соответствовало гипотезе, высказанной еще в 1944 г. Вейсом. Роль свободного электрона, возникающего в реакциях (V.3), (V.4), оставалась невыясненной.
Рис. V.3. Гидратированный электрон: а) схематическое представление последнего участка пути «свободного электрона» в жидкости; б) основная ориентация полярных молекул воды вокруг гидратированного электронаРис. V.3. Гидратированный электрон: а) схематическое представление последнего участка пути «свободного электрона» в жидкости; б) основная ориентация полярных молекул воды вокруг гидратированного электронаПо одной схеме (Вейс, 1944) предполагалось, что электрон переходит на соседний ион водорода Н+ и превращает его в радикал Н'. Согласно схеме Ли (1946) электрон захватывается молекулой воды с образованием отрицательно заряженного иона ГЬО. который распадется на ОН- и Н’. Однако существование ионов Н2О даже в качестве промежуточных продуктов доказать не удалось. Дальнейшие исследования привели к открытию в облученной воде особой стабилизированной формы электрона, которая получила название «гидратированный электрон».
Рис. V.3. Гидратированный электрон: а) схематическое представление последнего участка пути «свободного электрона» в жидкости; б) основная ориентация полярных молекул воды вокруг гидратированного электрона
Рис. V.3. Гидратированный электрон: а) схематическое представление последнего участка пути «свободного электрона» в жидкости; б) основная ориентация полярных молекул воды вокруг гидратированного электрона
Гидратированный электрон, обозначаемый е^др, возникает в результате стабилизации свободного электрона в «потенциальной яме», образованной поляризованными молекулами воды (рис. V.3, а, б). Растеряв на возбуждение и ионизацию среды большую часть энергии, электрон продолжает взаимодействовать с окружающими его молекулами до тех пор, пока он в конце концов не окажется в «потенциальной яме», так как не сможет преодолеть электростатическое отталкивание электронного облака молекулы, через которую он проходит. Свободный электрон окажется в области относительно низкой потенциальной энергии, т. е. в промежуточном положении, соответствующем элементу свободного объема в жидкости. Здесь он стабилизирован близкодействующими силами отталкивания. Перед стабилизацией электрона его кинетическая энергия в областях с низкой потенциальной энергией уменьшается до 1 эВ и менее, а скорость падает до 6-107 см/с, так что для пересечения электроном молекулярного диаметра или среднего по размеру межмолекулярного промежутка ему требуется около 10“15 с. Поскольку электронная поляризация молекул
происходит быстрее чем за 10 15 с, стабилизированный электрон оказывается в электронно-поляризованной «дырке».
Последовательное уменьшение потенциальной энергии стабилизированного электрона происходит за счет атомной поляризации, расширения полости и ориентационной поляризации окружающих молекул. Глубина «потенциальной ямы» для стабилизированного электрона увеличивается с переходом от одного типа поляризации среды к другому, однако кинетическая энергия электрона не уменьшается до нуля, а сохраняет малое, но конечное значение.
Тепловое равновесие свободного электрона со средой достигается примерно за 10“11 с, время релаксации молекул воды при комнатной температуре составляет такую же величину. Следовательно, за К)11 10 |() с вокруг стабилизированного электрона возникнет область радиальной поляризации, т. е. поляризованные молекулы воды ориентируются в собственном электрическом поле электрона (рис. V.3). Область радиальной поляризации, обладающая избыточным положительным зарядом около своего центра, служит ловушкой для электрона, обусловливающего поляризацию.
Вместе они и формируют уникальное образование — гидратированный электрон, который в химическом отношении ведет себя, как очень активный ион, вступая в реакции со многими веществами при первом соударении. Скорость реакции ограничена временем, необходимым для того, чтобы перемещающиеся в результате диффузии реагенты «нашли друг друга». Время жизни е^др в высокоочищенной воде приближается к 1 мс. Такое большое время жизни позволяет гидратированному электрону диффундировать на значительные расстояния от трека первичной ионизирующей частицы и взаимодействовать с растворенными молекулами.
Основные характеристики e^p приведены в табл. V.I.
Таблица V.I. Характеристика гидратированного электрона
Амакс
720 нм
£720 нм
15800 моль-1-см-1
£578 нм
10600 моль-1-см-1
Tl/2 (^гидр + Н2О)
780 мкс
Ti/2 (нейтральная ГГО)
230 мкс
заряд иона
-1
радиус распределения заряда (расч.)
0,25-0,3 нм
энергия гидратации
1,82 эВ
коэффициент диффузии
4, 7-Ю"6 см“2-с-1
Е° (е" Др + Н3О+ —> 1/2Н2 + Н2О)
2,58 эВ
рК (е- др + Н2О —У Н + ОН")
9,7
к- +Н2О егидр
16
Рис. V.4. Схема образования первичных продуктов радиолиза водыРис. V.4. Схема образования первичных продуктов радиолиза водыИ’ + он-И’ + он-
Рис. V.4. Схема образования первичных продуктов радиолиза воды
Рис. V.4. Схема образования первичных продуктов радиолиза воды
И’ + он-
И’ + он-
Первичные реакции, происходящие после возбуждения и ионизации, которые мы обсуждали ранее, можно суммировать в виде общей схемы (рис. V.4). Первичные продукты радиолиза воды — радикалы Н’, ОН’, е^ — располагаются в пространстве достаточно близко друг от друга, образуя своеобразные скопления — «рои» небольшого объема, средний радиус которых около 1,5 нм. Радиохимики называют эти скопления шпурами. В среднем на шпур приходится около 6 радикалов. Именно в шпуре происходит рекомбинация радикалов с образованием молекулярных продуктов — Щ и Н2О2 — например, по реакциям (V.6)-(V.8).
Атаковать растворенные молекулы могут лишь те радикалы, которые не рекомбинируют, а выходят из шпура. Эти радикалы, а также молекулярные продукты радиолиза мы будем называть продуктами радиолиза воды. Образование их отражает следующее суммарное уравнение:
Н20Н" + ОН+ + е"др + Н2 + Н2О2 + H3O+,(V.9)
где Н30+ — принятая форма записи иона Н+, уравновешивающего отрицательный заряд гидратированного электрона.
В табл. V.2 приведены радиационно-химические выходы продуктов радиолиза воды.
Таблица V.2. Радиационно-химический выход G первичных продуктов радио-лиза воды
Продукты радиолиза воды
Значение G
^гидр
2,6
Н’
0,6
ОН’
2,6
Н2О2
0,75
н2
0,45
Оказалось, что при нейтральном значении pH на каждые 100 эВ поглощенной энергии излучения в наибольшем количестве образуются гидратированные электроны и радикалы ОН’.
Для исследования механизмов взаимодействия продуктов радиолиза воды и растворенных макромолекул необходимо располагать надежными методами идентификации продуктов радиолиза и уметь определять их количество. Количество молекулярных продуктов — Н2 и Н2О2 — оценивают стандартными методами химического анализа. Наличие гидратированного электрона можно зарегистрировать по характерному спектру оптического поглощения (табл. V.1). Спектр поглощения радикала ОН’ регистрируют в области ниже 300 нм. В сочетании перечисленные методы позволяют исследовать типы реакций, происходящих при взаимодействии продуктов радиолиза воды с органическими молекулами.
Роль продуктов радиолиза воды в инактивации биоорганических молекул
Рассмотрим характер химического превращения органических веществ, облученных в водных растворах низкой концентрации, когда преобладает непрямое действие излучения.
Спектр конечных продуктов определяют традиционными методами химического анализа. Значительно сложнее установить, какой из активных продуктов радиолиза воды приводит к данному типу структурного превращения молекулы. Для ответа на этот вопрос разработаны специальные методические приемы.
Эффекты, связанные с перекисью водорода, образующейся в облученной воде, установить несложно. Для этого в необлученный раствор вводят Н2О2 до такой же концентрации, какая отмечена после облучения.
Типы реакций, осуществляемые радикалом ОН’, также возможно исследовать в необлученных растворах. Так как в ходе реакции между перекисью водорода и двухвалентным железом возникают радикалы ОН" , то, подбирая соответствующие количества этих реагентов, добиваются появления в растворе требуемого количества ОН’.
Некоторые вещества служат перехватчиками свободных радикалов. С их помощью вызывают селективное поражение растворенных молекул одним из радикалов воды. Так, N2O в нейтральной среде перехватывает e^p, кислород — перехватчик e^p и Н’, этиловый спирт в нейтральной среде избирательно взаимодействует с радикалами ОН’. Облучая растворы в присутствии различных комбинаций конкурирующих агентов, раздельно изучают реакционную способность продуктов радиолиза воды.
Ниже перечислены основные типы реакций радикалов воды с органическими молекулами, обозначаемыми RH, где Н — реакционноспособный атом водорода, R — остальная часть молекулы (по Окада, 1974).
Отрыв атома водорода:
(V.10)(V.10)R Н + Н" —> R" +Н2.R Н + Н" —> R" +Н2.(V.11)(V.11)R—Н + ОН' ^R'+H2O,
(V.10)
(V.10)
R Н + Н" —> R" +Н2.
R Н + Н" —> R" +Н2.
(V.11)
(V.11)
Радикал e^p не отрывает атом водорода от органических молекул. В результате реакций (V.10), (V.11) в растворе появляется органический радикал R'. С помощью дейтериевого обмена установили, какой из атомов водорода отрывается от органической молекулы в реакциях этого типа. Отрыв водорода возможен от третичных углеродных атомов, атомов серы в сульфгидрильных группах и «-углеродных атомов. Не происходит отрыва атома водорода в функциональных группах -CONH2, -CONH, -CONH, -NH3, -ОН, -СООН.
Реакции диссоциации:
RNH++e-flp Ar’+NH3,RNH++e-flp Ar’+NH3,rnh2 + н" Лк + nh3.rnh2 + н" Лк + nh3.(V.12)(V-13)(V.12)(V-13)
RNH++e-flp Ar’+NH3,
RNH++e-flp Ar’+NH3,
rnh2 + н" Лк + nh3.
rnh2 + н" Лк + nh3.
(V.12)
(V-13)
(V.12)
(V-13)
3) Реакции присоединения:3) Реакции присоединения:НН/С=С\ + ОН" —>RRНН/С=С\ + ОН" —>RRНR—С—С—R ,ОН нНR—С—С—R ,ОН н(V-14)(V-14)
3) Реакции присоединения:
3) Реакции присоединения:
НН
/С=С\ + ОН" —>
RR
НН
/С=С\ + ОН" —>
RR
Н
R—С—С—R ,
ОН н
Н
R—С—С—R ,
ОН н
(V-14)
(V-14)
В результате протекания этих двух типов реакций также образуется растворенный органический радикал R'.
Для изучения кинетики перечисленных реакций необходимо знать константы абсолютных скоростей к. Их значения можно установить с помощью импульсного радиолиза. Суть метода состоит в том, что водный раствор облучают в течение очень короткого промежутка времени, измеряют концентрацию свободных радикалов и подсчитывают константы скоростей реакции органических молекул, в том числе белков и нуклеиновых кислот, с радикалами е^др, Н’ и ОН'.
Продукты радиолиза воды высокоактивны по отношению к аминокислотам, белкам, нуклеотидам и ДНК; константы скоростей соответствующих реакций лежат в пределах 107-10п М 1-с г. Радикальные продукты реакций можно зарегистрировать методом ЭПР.
12 Ю. Б. Кудряшов
Свободные радикалы органических молекул претерпевают внутримолекулярные перестройки, вступают в реакции друг с другом и с молекулами растворенных веществ. В результате формируется стабильное структурное поражение, приводящее к изменению биологических свойств макромолекул.
Реакции радикалов органических молекул, ведущие к образованию стабильных продуктов
Перечислим основные типы реакций, в которые вступают свободные радикалы органических молекул в водных растворах.
Димеризация и присоединение:
Rx + R2 —^ Ri —R2Rx + R2 —^ Ri —R2(V.17)(V.17)
Rx + R2 —^ Ri —R2
Rx + R2 —^ Ri —R2
(V.17)
(V.17)
R" + R R—R. (¥.18)
Продукты реакции — димеры молекул и агрегаты более высоких порядков. Например, при облучении водного раствора цистеина образуется димер — цистин:
ноос—ch—nh2
2НООС—CH—NH22НООС—CH—NH2сн2сн2сн2сн2SSSHSHSS(V-19)(V-19)сн2сн2
2НООС—CH—NH2
2НООС—CH—NH2
сн2
сн2
сн2
сн2
S
S
SH
SH
S
S
(V-19)
(V-19)
сн2
сн2
ноос—сн—nh2
цистинцистинцистеин
цистин
цистин
Другой пример — образование аспарагиновой кислоты из двух радикалов глицина:
2NH2—СН2—СООН > 2NH2"CHCOOH2NH2—СН2—СООН > 2NH2"CHCOOHnh2—снсоонnh2—снсоонСН2СООН (V.20)СН2СООН (V.20)
2NH2—СН2—СООН > 2NH2"CHCOOH
2NH2—СН2—СООН > 2NH2"CHCOOH
nh2—снсоон
nh2—снсоон
СН2СООН (V.20)
СН2СООН (V.20)
Реакции диспропорционирования:
(V.21)
В результате реакции атом водорода перераспределяется между радикалами. Один из радикалов может восстановиться до исходной структуры, а другой — превратиться в новое соединение. Например, при облучении раствора глицина в присутствии перехватчиков ОН' и e^p с аминокислотой взаимодействует радикал Н', осуществляя отрыв атома водорода:
2NH2CH2COOH2NH2CH2COOH5-д. 2NH2"CHCOOH.5-д. 2NH2"CHCOOH.(V.22)(V.22)
2NH2CH2COOH
2NH2CH2COOH
5-д. 2NH2"CHCOOH.
5-д. 2NH2"CHCOOH.
(V.22)
(V.22)
Реакция диспропорционирования, в которую вступают два радикала глицина, приводит к появлению иминоуксусной кислоты и восстановлению одного из радикалов до исходной структуры:
2NH2’CHCOOH > NH=CHCOOH + NH2CH2COOH. (V.23)
Реакции гидролиза:
R+H2O^P.(V.24)
Пример такой реакции — расщепление пептидной связи при облучении раствора белка:
—RiCONHCHR2> —RiCONH2 + R2COH.(V.25)
Присоединение кислорода.
В присутствии молекулярного кислорода в облученном растворе образуются окислительные радикалы НО2 и ОJ согласно реакциям:
Н'+О2 ^НО2,(V.26)
е-др + Н+ + О2^НО2,(V.27)
Н2О2 + ОН ^Н2О + НО2,(¥.28)
е-др + О2 О2.(¥.29)
Важно учесть, что в присутствии кислорода высокоактивные окислительные радикалы образуются за счет радикалов-восстановителей Н’ и e^p. Следовательно, в облученном водном растворе возникают условия, благоприятные для окисления. Свободные радикалы О2 и но2 энергетически способны вызвать окисление органических веществ по любым связям, в том числе и тем, которые обычно устойчивы в ходе окислительно-восстановительных реакций.
К числу наиболее характерных реакций органических радикалов с радикалами но2 относится реакция образования гидроперекисей:
R’ + НО2 ROOH.(V.30)
В облученных растворах аминокислот, тимина и цитозина обнаружено появление гидроперекисей этих соединений. Если аминокислоты имеют длинные углеродные цепи, то образующиеся гидроперекиси весьма стабильны, как, например, гидроперекиси лейцина и изолейцина. В конечном счете гидроперекиси распадаются с образованием стабильных продуктов.
Реакции переноса водорода.
В облученном водном растворе репарация молекул от повреждений может происходить при участии второго растворенного вещества Р—Н, которое отдает атом водорода:
R* +Р—НR—Н + Р*.R* +Р—НR—Н + Р*.(¥.31)(¥.31)
R* +Р—НR—Н + Р*.
R* +Р—НR—Н + Р*.
(¥.31)
(¥.31)
Особенно эффективны соединения, содержащие свободную SH-rpynny. Пример таких реакций — взаимодействие метанола с радикалом ОН' в присутствии SH-соединений:
СНзОН + ОН' Н2О + СН2ОН, (V.32)
СН2ОН + R—SH СНзОН + RS*. (V.33)
Количественные характеристики непрямого действия радиации в водных растворах. Эффект Дейла
Прежде чем перейти к результатам экспериментов, в которых изучали зависимость инактивации макромолекул от концентрации раствора, попытаемся качественно проанализировать возникающую ситуацию. При определенной концентрации раствора в нем существуют молекулы-мишени, поражение которых приводит к определенному типу инактивации.
Если в растворе преобладает прямое действие излучения на макромолекулы, то с ростом концентрации (больше мишеней) должно увеличиваться число пораженных молекул, так как увеличивается вероятность попадания. Если же инактивация происходит вследствие взаимодействия макромолекул с активными продуктами радиолиза воды, то лимитирующим будет не число объектов в растворе (концентрация), а количество образующихся радикалов воды, которое зависит лишь от дозы излучения.
Это означает, что в достаточно широком диапазоне концентраций выход инактивированных молекул при облучении в определенной дозе D не должен зависеть от числа этих молекул (концентрации раствора). Лишь при очень низких концентрациях, когда число объектов- мишеней меньше числа продуктов радиолиза, приращение концентрации приведет к увеличению абсолютного числа инактивированных молекул. Но вскоре, по мере роста концентрации, число мишеней сравняется с числом активных радикалов воды, и дальнейший рост концентрации не приведет к увеличению числа инактивированных молекул. Только при очень высоких концентрациях возможно некоторое увеличение числа поврежденных молекул вследствие их прямого поражения ионизирующим излучением.
Именно такую зависимость наблюдали в эксперименте (рис. V.5, а). На рис. V.5, б показано, как изменяется радиационно-химический выход пораженных молекул ДНК с ростом концентрации раствора. Видно, что в широком диапазоне концентраций раствора на каждые 100 эВ поглощенной энергии инактивируется одинаковое число молекул, т. е. радиационно-химический выход инактивированных молекул не зависит от концентрации. Этот эффект (его называют «эффектом разбавления» или «эффектом Дейла») используют для выявления непрямого действия радиации на молекулы.
Рассмотрим результаты других экспериментов, в которых определяли радиочувствительность макромолекул в растворах различной концентрации.
к м к Ен ^К к ок ук м к Ен ^К к ок уg 10-610-410-21Концентрация фермента, г/млg 10-610-410-21Концентрация фермента, г/млG6G60,1 0,5 15 101000,1 0,5 15 10100Концентрация ДНК, %Концентрация ДНК, %
к м к Ен ^
К к о
к у
к м к Ен ^
К к о
к у
g 10-610-410-21
Концентрация фермента, г/мл
g 10-610-410-21
Концентрация фермента, г/мл
G6
G6
0,1 0,5 15 10100
0,1 0,5 15 10100
Концентрация ДНК, %
Концентрация ДНК, %
Рис. V.5. Количественные закономерности непрямого действия радиации на молекулы веществ в водных растворах: а) зависимость числа инактивированных молекул карбоксипептидазы от концентрации раствора; б) зависимость радиационнохимического выхода G однонитевых разрывов от концентрации ДНК
В одном из таких опытов, представленном на рис. V.6, в разбавленных растворах облучение оказывается значительно эффективнее. При одной и той же дозе в растворе низкой концентрации инактивируется значительно большая доля молекул, чем в высококонцентрированных. Такой результат не находит объяснения с позиции прямого действия излучения на молекулы. При прямом действии величина дозы указывает на число попаданий. При данной дозе каждый из растворов испытывает одинаковое число попаданий, следовательно, в них должно было бы инактивироваться одно и то же относительное число молекул.
Иначе можно анализировать результат эксперимента, исходя из представлений о непрямом действии излучения, которое опосредовано активными продуктами радиолиза воды.
При низких концентрациях общее число молекул-мишеней невелико, поэтому необходимое число активных продуктов радиолиза воды появится уже при облучении в малых дозах. В концентрированных растворах такая же доля молекул (сравнимый процент от общего числа) окажется инактивированной только в том случае, если в воде возникнет достаточное число активных продуктов. В результате мы отмечаем кажущееся повышение устойчивости к излучению концентрированных растворов.
Таким образом, важный критерий непрямого действия излучения в водных растворах — это снижение относительного числа инактивированных молекул вещества (% инактивации) по мере роста его концентрации в растворе (рис. V.7).
Рис. V.6. Инактивация растворов дезоксирибонуклеазы I различной концентрацииРис. V.6. Инактивация растворов дезоксирибонуклеазы I различной концентрацииРис. V.7. Прямое (1) и непрямое (косвенное) (2) действие ионизирующих излучений в одной и той же дозе на фермент в раствореРис. V.7. Прямое (1) и непрямое (косвенное) (2) действие ионизирующих излучений в одной и той же дозе на фермент в растворе
Рис. V.6. Инактивация растворов дезоксирибонуклеазы I различной концентрации
Рис. V.6. Инактивация растворов дезоксирибонуклеазы I различной концентрации
Рис. V.7. Прямое (1) и непрямое (косвенное) (2) действие ионизирующих излучений в одной и той же дозе на фермент в растворе
Рис. V.7. Прямое (1) и непрямое (косвенное) (2) действие ионизирующих излучений в одной и той же дозе на фермент в растворе
Модификация радиолиза молекул в водных растворах
Приведенный фактический материал свидетельствует о том, что в разбавленных водных растворах веществ непрямое действие радиации, опосредованное продуктами радиолиза воды, играет ведущую роль в инактивации молекул. Последовательность протекающих процессов выглядит так.
В момент прохождения ионизирующей частицы через воду (в первые 1018 К)16 с) вдоль ее трека возникают возбужденные, сверхвозбужденные и ионизированные молекулы, которые испытывают цепь превращений, приводящих к образованию радикалов Н', ОН' И ^гидр'
Часть свободных радикалов рекомбинирует с образованием молекулярных продуктов Н2О2, ЩО и Н2; некоторые радикалы способны взаимодействовать с растворенными органическими молекулами.
Каждый из радикалов воды вступает в специфические реакции с растворенными макромолекулами, в результате возникают свободные органические радикалы (при этом биологически активные макромолекулы имеют высокое сродство к радикалам воды).
Возникшие радикалы органических молекул взаимодействуют друг с другом и с окружающими молекулами, образуя стабильные ре- парированные или поврежденные структуры. Характер инактивации макромолекул зависит от типа их структурного поражения.
Критерием непрямого действия излучения служит «эффект разбавления» и снижение относительного числа инактивированных молекул с ростом концентрации раствора.
Рис. V.8. Поражение сывороточного альбумина человека д-излучени- ем: а) 1%-ый раствор; б) то же в присутствии 240-3 моль/л /3-мер- каптоэтиламина; в) то же в присутствии 140-3 моль/л тиомочевиныРис. V.8. Поражение сывороточного альбумина человека д-излучени- ем: а) 1%-ый раствор; б) то же в присутствии 240-3 моль/л /3-мер- каптоэтиламина; в) то же в присутствии 140-3 моль/л тиомочевиныили ускоренных ядер элементов.или ускоренных ядер элементов.Эффект защиты. Если в растворе существуют молекулы- примеси, способные конкурировать с макромолекулами за активные продукты радиолиза воды, то это приводит к снижению радиационного поражения макромолекул. Справедливость такого утверждения доказана экспериментально (рис. V.8).
Рис. V.8. Поражение сывороточного альбумина человека д-излучени- ем: а) 1%-ый раствор; б) то же в присутствии 240-3 моль/л /3-мер- каптоэтиламина; в) то же в присутствии 140-3 моль/л тиомочевины
Рис. V.8. Поражение сывороточного альбумина человека д-излучени- ем: а) 1%-ый раствор; б) то же в присутствии 240-3 моль/л /3-мер- каптоэтиламина; в) то же в присутствии 140-3 моль/л тиомочевины
или ускоренных ядер элементов.
или ускоренных ядер элементов.
Влияние ЛПЭ излучения. Поражающее действие излучения снижается с ростом ЛПЭ излучения, т. е. рентгеновское и 7-излучения оказываются эффективнее п-частиц Это связано с неодинаковой линейной
плотностью ионизации, которая определяет пространственное распределение активных радикалов воды. В случае плотноиони- зирующего излучения продукты радиолиза формируются вдоль редких, но мощных треков ионизации, пространственно не разобщены,
Доза облучения, х103 ГрДоза облучения, х103 ГрРис. V.9. Инактивация трипсина в водных растворах (0,1 мг фермента в мл) рентгеновским излучением в аэробных (О2) и анаэробных (N2) условияхРис. V.9. Инактивация трипсина в водных растворах (0,1 мг фермента в мл) рентгеновским излучением в аэробных (О2) и анаэробных (N2) условияхРис. V.10. Инактивация трансформирующей ДНК из Diplococcus pheumonia в водном растворе: облучение в атмосфере азота (1) и кислорода (2) в присутствии 1, 4-10—3 моль/л глутатиона М; 3 — облучение в отсутствии защитного агентаРис. V.10. Инактивация трансформирующей ДНК из Diplococcus pheumonia в водном растворе: облучение в атмосфере азота (1) и кислорода (2) в присутствии 1, 4-10—3 моль/л глутатиона М; 3 — облучение в отсутствии защитного агента
Доза облучения, х103 Гр
Доза облучения, х103 Гр
Рис. V.9. Инактивация трипсина в водных растворах (0,1 мг фермента в мл) рентгеновским излучением в аэробных (О2) и анаэробных (N2) условиях
Рис. V.9. Инактивация трипсина в водных растворах (0,1 мг фермента в мл) рентгеновским излучением в аэробных (О2) и анаэробных (N2) условиях
Рис. V.10. Инактивация трансформирующей ДНК из Diplococcus pheumonia в водном растворе: облучение в атмосфере азота (1) и кислорода (2) в присутствии 1, 4-10—3 моль/л глутатиона М; 3 — облучение в отсутствии защитного агента
Рис. V.10. Инактивация трансформирующей ДНК из Diplococcus pheumonia в водном растворе: облучение в атмосфере азота (1) и кислорода (2) в присутствии 1, 4-10—3 моль/л глутатиона М; 3 — облучение в отсутствии защитного агента
значит, увеличивается вероятность их рекомбинации с образованием молекулярных продуктов Н2, Н2О и Н2О2. При действии редкоио- низирующего излучения радикалы воды диспергированы по всему облучаемому объему и потому с большей вероятностью достигнут растворенных молекул и вызовут их поражение.
Кислородный эффект. Наличие кислородного эффекта при прямом действии излучения доказано во многих работах. Для сухих препаратов ферментов и нуклеиновых кислот фактор кислородного эффекта равен 1,5-2,2, т. е. в присутствии кислорода макромолекулы в 1,5-2,2 раза эффективнее поражаются ионизирующим излучением.
В водных растворах веществ кислородный эффект либо очень мал, либо вообще отсутствует. Для ряда систем даже было показано защитное действие кислорода. Так, при облучении раствора трипсина (рис. V.9) обнаружено увеличение радиочувствительности фермента при замене атмосферы кислорода на атмосферу инертного газа.
В водных растворах ДНК наблюдают примерно одинаковое поражение ее молекул как в присутствии кислорода, так и в аноксических условиях (рис. V.10). В клетках инактивация трансформирующей ДНК происходит в 3,7 раза эффективнее, если клетки аэрировались во время облучения.
Прибавляя к раствору ДНК радиозащитные вещества (глутатион), удалось воспроизвести ситуацию, аналогичную наблюдаемой при облучении клетки. При концентрации глутатиона 1,4-10-3 моль/л трансформирующая ДНК в 3,7 раза эффективнее поражалась облучением в аэрированных растворах, чем в атмосфере азота (N2). Так возникло предположение, что наблюдаемый в клетках кислородный эффект связан с присутствием защитных веществ, главным образом сульфгидрильных соединений.
Г. Дертингер и X. Юнг (1973) предлагают следующую интерпретацию кислородного эффекта для макромолекул. Благодаря парамагнитным свойствам молекулярный кислород обладает высоким
сродством к возникающим под действием излучения радикалам. При взаимодействии кислорода с радикалом R' образуются пероксидные радикалы:
R’+O2 —>ROO’. (V.34)
Это свойство кислорода не зависит от того, является радикал R' радикалом макромолекул или одним из активных продуктов радиолиза воды. Кроме того, электроотрицательный кислород способен улавливать электроны согласно уравнению:
егиДР + о2 Оз (¥.35)
Таким образом, в присутствии кислорода вместо радикалов Н’, ОН' и е^ могут возникать радикалы ОН', НО2 и OJ.
Если определенный специфический тип инактивации макромолекул связан с радикалами Н’ и e^p, то кислород будет оказывать защитный эффект, конкурируя с ними за эти радикалы воды. В случае, когда данный тип повреждения преимущественно связан с радикалом ОН', кислород может усиливать радиационное поражение вследствие перехвата радикалов Н’ вследствие некоторого увеличения выхода радикалов ОН', поскольку в отсутствие кислорода возможна рекомбинация Н’ и ОН' с образованием Н2О, а взаимодействие радикалов Н’ с кислородом, согласно уравнению (V.26), уменьшает число рекомбинированных радикалов Н’ и ОН'. Действительно, в опытах по облучению РНКазы в присутствии кислорода обнаружено усиление поражающего действия излучения (фактор кислородного эффекта равен 1,2).
В присутствии SH-соединений лучевое поражение макромолекул снижается в результате двух эффектов: защитное соединение конкурирует за свободные радикалы воды и способно обеспечивать репарацию от начального повреждения путем переноса водорода с SH- группы на радикал макромолекулы. На рис. V.10 показано, что в анаэробных условиях глутатион в 3,7 раза понижает радиочувствительность трансформирующей ДНК (кривая 1), вероятно, в результате обоих эффектов.
В атмосфере кислорода защитный эффект глутатиона снижается, но все же радиочувствительность ДНК ниже, чем в водном растворе без радиозащитного соединения, даже если облучение проводили в аноксических условиях. Вероятно, кислород конкурирует с восстановительной способностью глутатиона, переводя радикалы ДНК в трудно репарируемую пероксидную форму, хотя и в этих условиях эффект глутатиона как перехватчика радикалов сохраняется (кривая 2 лежит выше, чем кривая 3).
Таким образом, модифицирующее действие кислорода на макромолекулы, облученные в водном растворе, определяется многими факторами: присутствием защитного соединения, его сродством к кислороду, типом радикала воды, вызывающего данное повреждение макромолекулы, вкладом прямого и непрямого действия радиации в
эффект поражения. Во всех случаях кислород, вероятно, не вызывает истинной сенсибилизации или защиты макромолекул, так как он не влияет на число первичных повреждений. По-видимому, действие кислорода связано с участием в процессах репарации макромолекул от начальных повреждений в присутствии защитных веществ. Поэтому в разбавленных водных растворах, не содержащих радиопротектора, кислородный эффект может отсутствовать.
Радиационно-обусловленные измененияи радиочувствительность биоорганических молекул
в растворах
Рассмотрим отдельные примеры радиационно-обусловленных изменений биологически важных молекул: белков (ферментов), нуклеиновых кислот, фосфолипидов, а также их низкомолекулярных составляющих. При этом попытаемся найти связь между типом структурного повреждения и характером инактивации макромолекул и сравнить их радиочувствительность.
Работы в этом направлении проводятся в настоящее время во многих лабораториях. Они требуют привлечения сложного арсенала биохимических и физико-химических методов анализа для выявления структурных повреждений макромолекул.
Радиационно-обусловленные изменения молекул
Переходя к экспериментам с облученными водными или липидными растворами биологически значимых молекул, необходимо по возможности точнее установить, какой из активных продуктов радиолиза вызывает данное повреждение молекулы. Для этого используют перехватчики радикалов определенных типов. В результате при облучении в растворе останется реакционноспособным только один из радикалов воды, остальные будут перехвачены. Другой прием состоит в том, что в растворе специальными методами создают определенную концентрацию какого-либо из радикалов воды, или липида, или молекулярных продуктов радиолиза, прибавляют исследуемое вещество и изучают характер реакции. Во обоих случаях стремятся к дифференциальной оценке эффекта каждого из активных продуктов радиолиза растворителя.
Изменения белковых молекул (ферментов)
Фермент лизоцим облучали в присутствии различных перехватчиков или селективно воздействовали на него радикалами Н' и ОН'. Было показано, что инактивация фермента происходит в результате атаки белковой молекулы тремя типами радикалов: Н', ОН' и е^др.
Другой фермент — трипсин — инактивируется главным образом за счет атаки радикалов ОН', из всех использованных перехватчиков только этанол — перехватчик ОН' — защищал трипсин от инактивации в водном растворе.
В растворе белковая молекула многократно взаимодействует с радикалами, среди вызываемых ими повреждений необходимо выявить
те, которые приводят к инактивации.
Зависимость «доза-эффект» для инактивации белковых молекул в водном растворе сохраняет экспоненциальный характер. Как и в случае прямого действия, причина их инактивации — одиночное событие попадания. В водном растворе белков инактивирующим событием может быть одна специфическая реакция водного радикала со структурным звеном макромолекулы. Выявить эту специфическую реакцию или ее последствия крайне трудно, так как белковая молекула испытывает множество соударений с радикалами. Рассмотрим
несколько примеров.
После облучения рибонуклеазы в водном растворе (1 мг/мл) физико-химический анализ выявил следующие структурные повреждения ее макромолекул: образование агрегатов (наблюдаются увеличение внутренней вязкости раствора и дополнительные фракции при гельфильтрации); появление свободных SH-групп; селективное
разрушение аминокислот метионина, цистина, лизина, тирозина, фенилаланина, гистидина; изменение конформации (увеличивается перевариваемость молекул трипсином).
Все эти структурные изменения обнаружены при дозе, близкой
к D37, когда каждая молекула подверглась в среднем одному инак
тивирующему событию попадания. Важной причиной инактивации
Максимальная вязкость, %Максимальная вязкость, %Рис. V.11. Зависимость между числом поврежденных триптофановых остатков и максимальной скоростью реакции облученной дезоксирибонуклеазы I: 1 — активность фермента, облученного в водном растворе; 2 — активность фермента, обработанного N-бром- сукцинимидом в разной концентрации (активность фермента оценивали по максимальной вязкости ДНК)Рис. V.11. Зависимость между числом поврежденных триптофановых остатков и максимальной скоростью реакции облученной дезоксирибонуклеазы I: 1 — активность фермента, облученного в водном растворе; 2 — активность фермента, обработанного N-бром- сукцинимидом в разной концентрации (активность фермента оценивали по максимальной вязкости ДНК)фермента является изменение ее конформации — развертывание молекулы вследствие разрушения аминокислот, формирующих гидрофобные или S=S-связи, поддерживающие вторичную структуру белка.
Максимальная вязкость, %
Максимальная вязкость, %
Рис. V.11. Зависимость между числом поврежденных триптофановых остатков и максимальной скоростью реакции облученной дезоксирибонуклеазы I: 1 — активность фермента, облученного в водном растворе; 2 — активность фермента, обработанного N-бром- сукцинимидом в разной концентрации (активность фермента оценивали по максимальной вязкости ДНК)
Рис. V.11. Зависимость между числом поврежденных триптофановых остатков и максимальной скоростью реакции облученной дезоксирибонуклеазы I: 1 — активность фермента, облученного в водном растворе; 2 — активность фермента, обработанного N-бром- сукцинимидом в разной концентрации (активность фермента оценивали по максимальной вязкости ДНК)
После облучения дезоксирибонуклеазы I обнаружено снижение числа триптофановых остатков на молекулу фермента. Известно, что эта аминокислота входит в состав активного центра. Если в норме на молекулу фермента приходится около 5 ее остатков, то после облучения в дозе D37 обнаруживается только 3 остатка триптофана. При этом происходит резкое снижение каталитической активности фермента. Интересно, что специфический
ингибитор дезоксирибонуклеазы I — бромсукцинимид — также вза
имодействует с триптофаном, и отмечается известный параллелизм в действии излучения и этого ингибитора (рис. V.11).
Таблица V.3. Предполагаемые причины инактивации ферментов, облученных в водных растворах
Фермент
Предполагаемая причина инактивации при облучении
рибонуклеаза
разрушение остатка метионина
дезоксирибонуклеаза I
разрушение одной молекулы триптофана
фосфоглюкомутаза
разрушение одной молекулы гистидина
каталаза
разрушение гемопорфириновой группы
лактопероксидаза
патетичное разрушение одной гемопорфириновой группы
фосфоглицеральдегиддегидрогеназа
деструкция SH-групп цистина или окисление SH-rpynn
аденозинтрифосфатаза
окисление SH-rpynn
сукцинатоксидаза
окисление SH-rpynn
уреаза
окисление SH-rpynn
глутаматдегидрогеназа
окисление SH-rpynn
лактатдегидрогеназа
окисление SH-rpynn
алколгольдегидрогеназа
окисление SH-rpynn
В табл. V.3 представлены выводы ряда исследователей, изучавших механизм инактивации ферментов ионизирующим излучением в воде.
Радиационно-химические изменения нуклеиновых кислот
Выяснению механизма поражения клеточной генетической мишени — ДНК — в облученных водных растворах посвящено большое число исследований. В физико-химических экспериментах выявлены основные типы структурных повреждений, возникающих в облученной ДНК. Представление об этом дает табл. V.4, где приведены результаты исследований Окада(1974) по инактивации ДНК, облученной в разбавленном водном растворе.
Появление разрывов полинуклеотидной цепи и поперечных межмолекулярных сшивок легко регистрируется методами седиментационного и хроматографического анализа. Значительно сложнее выявить разрушение нескольких азотистых оснований из десятков тысяч их в составе молекулы ДНК. Тем не менее такие повреждения происходят и могут иметь значительные биологические последствия.
Для оценки радиационных изменений макромолекул важно было установить, какой из активных продуктов радиолиза воды отвечает за определенный механизм инактивации. Это позволило в дальнейшем изучить кинетику реакции, выявить радикальный продукт или продукты, исследовать их дальнейшие превращения.
Для этой цели часто используют перехватчики радикалов. Например, облучение инфекционной ДНК фага у?Х-174 в присутствии
Таблица V.4. Радиационные повреждения ДНК из тимуса теленка, облученной в водном растворе
Типы радиационного повреждения ДНК
Среда суспендирования *)
Концентрация ДНК, %
Радиационнохимический выход G. моль/100 эВ
однонитевые разрывы
0,01 NaCl, моль/л
0,02
0,24
двунитевые разрывы
0,02
не определяли
поперечные сшивки
0,02
не определяли
денатурация ДНК (разрыв водородных связей)
0,14
38
разрушение оснований:
тимин цитозин гуанин аденин
0,01 фосфат Na, моль/л
0,5
0,45
0,28
0,17
0,12
образование перекисей тимина и цитозина
вода
0,025
0,30
дезаминирование (образование NH3)
вода
0,2
0,4
освобождение оснований:
тимин цитозин аденин гуанин
0,01 фосфат Na, моль/л
0,5
0,5 0,08 0,07 0,04
*) Облучение растворов проводили в атмосфере воздуха.
перехватчика ОН' (йод) и перехватчиков Н’ и егидр (кислород) показало, что утрата инфекционной способности вызывается действием радикала ОН'. В присутствии йода (понижающего количество ОН ) инактивация уменьшалась, в то время как кислород, хотя и уменьшал число радикаловН' и e^p, не влиял на выраженность инактивации.
За счет атаки радикалов ОН' в ДНК возникали однонитевые разрывы, повреждения азотистых оснований и другие эффекты. Удельный вклад каждого структурного повреждения в эффект инактивации оценивают путем сопоставления величин радиационно-химического выхода инактивации с выходом однонитевых разрывов, повреждения оснований и других типов структурных изменений.
Изучение радиационной инактивации инфекционной активности двунитевой ДНК фага (^29 показало, что она происходит вследствие двунитевых разрывов полинуклеотидных цепей. Зависимость числа возникающих двунитевых разрывов от дозы облучения сигмоидальна. Это означает, что в результате атаки водными радикалами в каждой из цепей вначале появляются одиночные разрывы, а при определенном критическом числе становится вероятным двунитевой разрыв как результат совпадения близкорасположенных однонитевых разрывов.
Эксперименты с трансформирующей ДНК показали, что ее инактивация также обусловлена атакой полинуклеотидной цепи радикалом ОН. Об этом свидетельствует независимость выхода инактивированных молекул от концентрации кислорода в среде (кислород — перехватчик радикалов е^ и Н ). Сопоставив величины радиационно-химических выходов инактивированных молекул с выходом различных типов повреждений, предположили, что инактивация возникает вследствие однонитевых разрывов цепи ДНК.
В целом проблема лучевого поражения нуклеиновых кислот в водных растворах далека от полного разрешения. В настоящее время интенсивно анализируется возможность миграции энергии в молекуле и между молекулами, роль различных модифицирующих факторов в первичных процессах лучевого поражения нуклеиновых кислот, возможность химической репарации повреждений, вызванных в молекуле ДНК водными радикалами.
О радиационно-химических изменениях фосфолипидов
Основные радиационно-химические превращения водных растворов, суспензий и эмульсий фосфолипидов начинаются с разрушения двойной связи в ненасыщенной жирной кислоте. В присутствии кислорода за ним следует образование гидроперекиси и распад последней с образованием различных карбонильных соединений, накопление которых в избыточных количествах оказывает токсическое действие на клетку (см. гл. V и VI). По мнению многих радиобиологов, фосфолипиды могут быть отнесены к молекулам-мишеням хотя бы по той причине, что повреждение их даже в небольших количествах приводит к изменению проницаемости биологических мембран, нарушению ионного гомеостаза, энергетических и обменных процессов в клетке. Такие нарушения могут привести клетку к летальному исходу при облучении ее в относительно невысоких дозах. Однако для выяснения неординарной роли фосфолипидов в лучевом поражении субклеточных структур и биологических структур более высокого порядка — клеток, иных тканевых структур, самих тканей — необходимы данные о сравнительной радиочувствительности *) различных биологически важных молекул.
Радиочувствительность биомолекул
В радиационно-химических экспериментах радиолиз молекул, как известно, определяется его радиационно-химическим выходом G, который выражается числом молей изменившегося субстрата или вновь образованных продуктов на 100 эВ поглощенной энергии (V.1).
Для оценки радиочувствительности радиационно-химический выход определяют и через производную от концентрации исследуемого вещества С по дозе излучения D с учетом коэффициента ц:
G = <eL,' (V-36>
где у — численный коэффициент, зависящий от выбранных единиц измерения. Если концентрация выражена в микромолях на литр, а доза в десятках грей (килорадах), то ц = 0, 96.
Известно, что радиационно-химические выходы зависят от многих факторов: вида соединения, его концентрации в облученной среде, pH среды, газовой атмосферы и др. Поэтому в табл. V.5, составленной по данным работ А. В. Савича (1987), приведено не одно какое- то значение радиационно-химического выхода для той или иной группы веществ или для тех или иных видов реакций, а диапазоны изменения G, в которые эти выходы преимущественно попадают. Выделены четыре диапазона радиочувствительности: I — высокая, II — средняя, III — низкая и IV — очень низкая. В соответствующих графах таблицы перечислены виды превращений, соответствующих каждому диапазону радиочувствительности.
Основываясь на приведенном нами ранее в данной главе (разделы 2 и 3) фактическом материале о радиационно-химических реакциях, можно выделить несколько общих путей радиационных превращений молекул белков, нуклеиновых кислот и фосфолипидов в растворах.
Начальный этап — образование радикалов растворенного вещества. Здесь можно отметить следующие основные типы реакций: отрыв атома Н с разрывом связи —С—Н, разрыв двойной межуглеродной связи, отщепление присоединенной группы (реакция диссоциации). Далее происходят межрадикальные реакции и реакции радикалов растворенного вещества с его молекулами и другими присутствующими в растворе молекулами.
Следует выделить также и такие реакции, как гидроксилирование или гидрирование; образование карбонильных соединений RC=O; димеризацию; диспропорционирование, в результате которого образуется исходная молекула и новое ненасыщенное соединение; образование гидроперекисных радикалов, гидроперекисей и далее продуктов их разложения — карбонильных соединений: альдегидов, кетонов, спиртов.
Продукты радиолиза, представленные в табл. V.5, образуются преимущественно в реакциях перечисленных типов.
Таблица V.5. Радиочувствительность к воздействию д-излучения молекул белков, нуклеиновых кислот, фосфолипидов и их компонентов в растворах
Класс биомолекул
Радиочувствительность (диапазон изменений радиационно-химических выходов G. моль/100 эВ)
I высокая (5-300)
II средняя (1-5)
Ill низкая (0,1-1)
IV очень низкая (0,01-0,1)
белки
—
распад, NH3
R-H, R-OH, R-R, разрыв тяжа
аминокислоты
—
распад, NH3
R-H, R-OH, R-R
—
ДНК
—
распад мономера
POf-, RC=O, однотяжевый разрыв, NH3
МДА, ШО*), двухтяжевый разрыв, сшивки
нуклеотиды
—
распад, R-OH, R-H
RC=O, NH3, PO^", ROOH
МДА, ШО
углеводы
—
распад, R-H, R-OH, RC=O
МДА
—
фосфолипиды
распад ROOH
—
РОД, RC=O
МДА, ШО
*)МДА — малондиальдегид; ШО — шиффовы основания.
Рассмотрим подробнее данные о радиочувствительности биологически важных молекул, полученные А. В. Савичем и его сотрудниками.
Радиочувствительность белков
Радиочувствительность белков во многом определяется характером радиационно-химических изменений входящих в них аминокислот. Поэтому рассмотрим сначала данные по радиолизу отдельных аминокислот в водных растворах.
Радиолиз не всех аминокислот изучен достаточно подробно. Для некоторых из них известны лишь общие выходы распада. Из общих реакций в них наблюдается дезаминирование, декарбоксилирование,
димеризация, а в присутствии кислорода может происходить образование гидроперекисей. Определенный вклад в радиолиз аминокислот вносит также образование карбонильных соединений и гидроксилирование. В циклических аминокислотах основные превращения затрагивают кольцевую структуру. Диапазоны выходов этих реакций приведены в табл. V.5.
Относительная радиочувствительность при одинаковой концентрации (1 ммоль/л) аминокислот определена при сравнении их выходов разложения и константы скоростей реакций с продуктами радиолиза воды при облучении в атмосфере воздуха. По этим критериям аминокислоты по убыванию радиочувствительности образуют ряд, который выглядит следующим образом: серосодержащие (серин, метионин); некоторые циклические (тирозин, триптофан, гистидин); имеющие в остатке Ra азотсодержащие группы (аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, глицин) и, наконец, те, у которых остаток Ra — углеводород без присоединенных групп или с ОН (фенилаланин, пролин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин).
Выход разрушения аминокислот увеличивается по мере роста их концентрации, а не стремится к постоянной величине (как это имеет место для углеводов и азотистых оснований). При концентрации около 0,1 моль/л выходы разложения глутаминовой кислоты, гистидина, пролина и аспарагиновой кислоты составляют несколько десятков единиц; выходы разложения серина, аланина, глицина и фенилаланина при концентрации, на порядок большей (1 моль/л), близки к 10. Эти данные говорят о том, что радиолиз аминокислот если и протекает в отдельных случаях по цепному механизму, то с развитием коротких цепей.
Данные по радиочувствительности аминокислот нельзя безоговорочно переносить на белки. На поражаемость аминокислотных остатков в белке влияют их расположение внутри белковой глобулы или фибриллы и связи между аминокислотными остатками. Показателем радиочувствительности аминокислоты в составе белка может служить относительный выход ее разложения:
_ G (мол./100 эВ) х
GoTH “ С (мМ) ’
Например, при облучении коллагена в 2.5-106 моль/л водных растворах в атмосфере воздуха GOTH изменялся в нешироких пределах от 1 до 3 для всех аминокислот, исключая цистеин (для которого GOTh составил 0,17) и метионин (4,8).
При облучении раствора коллагена в бескислородных условиях основным превращением является образование сшивок, а разрушение большинства аминокислот не регистрируется. Так, при дозе 2 кГр обнаруживается уменьшение количества только четырех аминокислот: фенилаланина, гистидина, метионина и тирозина.
Наличие в растворах кислорода, присоединяющегося к радикалам мишени, может объяснить малый выход сшивок при облучении в атмосфере воздуха. Повреждения аминокислотных остатков, а также
разрывы пептидных связей могут способствовать нарушениям вторичной и третичной структуры белков. Разрывы пептидных связей при действии ионизирующей радиации на белки происходят, как правило, беспорядочно по всей длине полипептидной цепочки с радиационнохимическим выходом, близким к 1 разрыву на 100 эВ.
Радиочувствительность нуклеиновых кислот
При радиолизе нуклеиновых кислот и их низкомолекулярных компонентов (табл. V.5) обнаружены изменения в азотистых основаниях углеводной части, а также разрыв гликозидной связи углевод- основание и фосфоэфирной связи углевод-фосфат.
Радиолиз углеводов в водных растворах начинается с отщепления Н от одного из углеродных атомов с образованием углеводного радикала. После этого отщепление молекулы воды и присоединение к радикалу Н' или ОН' приводит к образованию карбонильного соединения. Эту последовательность превращений мы демонстрируем на примере 2-дезоксирибозы — углеводной компоненты ДНК:
ОНОННСД ^сн—сн21I он онНСД ^сн—сн21I он онсн2—онсхДнхс—сн21II он осн2—онсхДнхс—сн21II он осн2—он2сАДнс—сн21 II онсн2—он2сАДнс—сн21 II онсн2—оHCfXJHсн2—оHCfXJH
ОН
ОН
НСД ^сн
—сн21
I он он
НСД ^сн
—сн21
I он он
сн2—онсхДн
хс—сн21
II он о
сн2—онсхДн
хс—сн21
II он о
сн2—о
н2сАДн
с—сн21 II он
сн2—о
н2сАДн
с—сн21 II он
сн2—о
HCfXJH
сн2—о
HCfXJH
он(V.38)он(V.38)ОН IIООН IIО
он
(V.38)
он
(V.38)
ОН IIО
ОН IIО
Суммарный выход карбонильных соединений в рассматриваемых условиях близок к выходу разложения дезоксирибозы. Этот процесс основной и относится к категории средней радиочувствительности (табл. V.5).
При облучении растворов дезоксирибозы в атмосфере кислорода обнаружено низкомолекулярное карбонильное соединение — малондиальдегид, возникающий после разрыва связи —С—С— в углеводной цепочке. Как видно из табл. V.5, выход этого вещества относительно невелик. При облучении быстрыми нейтронами со средней ЛПЭ порядка 35 эВ/нм суммарный, по сравнению с редкоионизирую- щим излучением, выход карбонильных соединений из дезоксирибозы уменьшается, а выход МДА увеличивается. Уменьшение суммарного выхода карбонильных соединений можно объяснить уменьшением выхода радикалов ОН" с ростом ЛПЭ. Увеличение выхода МДА ука
зывает на то, что этот процесс протекает в треках ионизирующих
13 Ю. Б. Кудряшов
частиц и требует последовательного участия двух радикалов воды (предположительно Н' и НО2).
Карбонильные соединения рассмотренного вида образуются и при радиолизе нуклеотидов и ДНК. Но выходы их меньше по сравнению с радиолизом дезоксирибозы (см. табл. V.5), поскольку в этих случаях большая часть радикалов воды расходуется на радиолиз азотистых оснований.
При радиолизе азотистых оснований в водных растворах основные их превращения начинаются с размыканий двойной связи в пиримидинах и в пуринах:
NH26 ДУНI1 5|О=НС2 3 iCHОН(Н)радикалцитозинаNH26 ДУНI1 5|О=НС2 3 iCHОН(Н)радикалцитозинаNНСNНСNH2NH29^СНн ОН(Н)9^СНн ОН(Н)(V.39)(V.39)радикал аденинарадикал аденина
NH2
6 ДУН
I1 5|
О=НС2 3 iCH
ОН(Н)
радикалцитозина
NH2
6 ДУН
I1 5|
О=НС2 3 iCH
ОН(Н)
радикалцитозина
N
НС
N
НС
NH2
NH2
9^СН
н ОН(Н)
9^СН
н ОН(Н)
(V.39)
(V.39)
радикал аденина
радикал аденина
После образования радикалов указанного типа в пиримидинах к свободной валентности присоединяются Н' либо ОН’, образуя разные виды конечных продуктов. Преобразования пуриновых радикалов приводят к возникновению различных продуктов с раскрытым пиримидиновым либо имидазольным циклом, а также ациклических соединений.
При облучении водных растворов азотистых оснований в присутствии кислорода образуются их гидроперекиси и происходит дезаминирование.
Выходы разрушения оснований соответствуют среднему диапазону радиочувствительности.
В макромолекуле-мишени ДНК разрушение азотистых оснований, образование гидроперекисей, карбонильных соединений, МДА и аммиака происходит примерно с такими же выходами, как и в нуклеотидах. Кроме того, при радиолизе ДНК возникают одно- и двунитевые разрывы, «плавление» водородных связей между комплементарными основаниями в двойной спирали, ковалентные сшивки между ее нитями. Диапазоны радиочувствительности этих превращений представлены в табл. V.5.
При разрыве фосфоэфирных связей образуются два вида концов: З'ОН и б'РО^, а также 5'ОН и З'РО^• Отрыв фосфатной группы приводит к образованию концов З'ОН и 5'ОН. Если же разрыв тяжа произошел с разрушением молекулы дезоксирибозы, тогда возникнет пробел с одним фосфатным, другим фосфаталкильным концом.
Выход однонитевых разрывов ДНК падает с ростом ЛПЭ, а выход двунитевых разрывов возрастает, достигая максимума при ЛПЭ в диапазоне 100-200 эВ/нм, при дальнейшем увеличении ЛПЭ он снижается. Такой характер зависимости выхода двунитевых разрывов ДНК от ЛПЭ подобен зависимости радиочувствительности клеток по эффекту репродуктивной гибели от ЛПЭ. Это подкрепляет представление о том, что двунитевые разрывы ДНК являются критическим событием для репродуктивной гибели клеток при облучении (см. гл. VI).
Однонитевые разрывы ДНК происходят с низкими выходами; выходы двунитевых разрывов и сшивок в ДНК еще примерно на порядок меньше.
Показано, что сшивки типа Шиффовых оснований образуются при радиолизе водных растворов нуклеотидов и нуклеозидов, содержащих аминогруппу, а также при радиолизе ДНК. Здесь возможен тот же механизм образования ШО, что и в фосфолипидах: карбонильные соединения, продукты радиолиза дезоксирибозы присоединяют аминогруппы азотистых оснований. Выходы этих соединений такого же порядка, что и выходы ковалентных сшивок ДНК. Накопление ШО происходит не только во время, но и в течение часов и даже дней после облучения. Эту реакцию рассматривают как начало механизма деструкции макромолекулы за счет образующихся в нуклеиновых кислотах токсических веществ — продуктов окисления ненасыщенных фрагментов макромолекулы.
Реакция окисления ненасыщенных связей является важнейшей в оценке радиочувствительности фосфолипидов, к рассмотрению которой мы сейчас переходим.
Радиочувствительность фосфолипидов
При облучении фосфолипидов обнаружены очень высокие выходы гидроперекисей. Радиочувствительность фосфолипидов превышает радиочувствительность любых других неполимерных молекул (табл. V.5).
Разрушения фосфолипидов намного превышают также выходы продуктов радиолиза воды, что свидетельствует о цепном механизме реакции (см. гл. V, раздел 4). Это подтверждается и тем, что выход гидроперекисей падает с увеличением мощности дозы, когда увеличивается вероятность реакций обрыва цепи. Среди продуктов радиолиза фосфолипидов обнаружены карбонильные соединения, дающие цветную реакцию с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Они являются ненасыщенными альдегидами с числом углеродных атомов от 3 до 10. Самый низкомолекулярный из них — МДА:
О=СН—СН2—НС=О . (V.40)
Выходы карбонильных соединений невелики (см. табл. V.5). Приблизительно 60% от общего их количества экстрагируется водой из облученной эмульсии (около 60% составляет МДА, а остальные — альдегиды с числом углеродных атомов от 6 до 10). Карбонильные 13*
соединения способны реагировать с молекулами, содержащими аминогруппу. Ди аль дегиды могут сшить две молекулы, содержащие аминогруппу, образуя Шиффово основание с хромофорной группой вида
К—Т=СР—СР=СР—ТР—К (V.41)
с сопряженными двойными связями, которое поглощает свет в области 360 нм и люминесцирует в области 430 нм. Такого рода флуоресцирующие продукты были найдены при радиолизе в водных эмульсиях фосфолипидов, содержащих аминогруппу — фосфатидилхолин и фос- фатидилэтаноламин. Некоторые из них оказались водорастворимыми, а другие липидорастворимыми. Водорастворимые ШО образуются в реакции карбонильных соединений с отщепившимися от фосфолипида гидрофильными головками, содержащими аминогруппу. Выходы ШО очень малы — процессы их образования при радиолизе фосфолипидов относятся к наименее радиочувствительным (см. табл. V.5).
Еще одно превращение фосфолипидов — отщепление неорганического фосфата — можно отнести к событиям, попадающим в третий диапазон радиочувствительности. Выход этого превращения растет линейно с увеличением дозы облучения и достигает 0,5 при 10 Гр.
Основные продукты радиолиза фосфолипидов — гидроперекиси, карбонильные соединения, Шиффовы основания — регистрируются, по данным А. В. Савича, и при облучении суспензий ядер, микросом, митохондрий и клеток. Радиационно-химические выходы этих соединений близки к тем, что зарегистрированы для облученных эмульсий фосфолипидов.
Сравнительная оценка радиочувствительности
Приведенный фактический материал позволяет дать ориентировочную сравнительную оценку радиочувствительности биомолекул. Так, для полимерных макромолекул — белков и нуклеиновых кислот — можно использовать не радиационный выход G, а иной критерий радиочувствительности — процент пораженных макромолекул на единицу дозы РПолимера [1]- Применив этот критерий, авторы пришли к выводу о высокой радиочувствительности ДНК среди других макромолекул.
Сравнивая данные табл. V.5 по радиационно-химическим выходам распада фосфолипидов, углеводов, нуклеотидов и аминокислот, легко заметить, что наибольшую радиочувствительность имеют фосфолипиды: выходы их распада на порядок и более выше, чем у остальных рассматриваемых соединений.
Из других типов превращений, представленных в таблице, в диапазон среднего уровня радиочувствительности укладываются реакции дезаминирования и гидроксилирования. Остальные превращения происходят, как правило, с низкими или с весьма низкими выходами.
Высокая радиочувствительность фосфолипидов привлекает внимание к ним не только как молекулам, формирующим биологические мембраны, но и как к неполярным растворителям, в которых, как и
в водных растворах, могут осуществляться процессы передачи поглощенной энергии ионизирующих излучений другим биоорганическим молекулам.
Непрямое действие радиации в липидных растворах
Исследуя возможности непрямого действия радиации посредством водных радикалов, радиобиологи долгое время не уделяли внимания другому необходимому для жизнедеятельности клетки неполярному растворителю — липидной фазе и системам, связанным с ней.
В середине 50-х гг. был достигнут значительный прогресс в понимании структурной организации и биологической роли субклеточных мембранных структур. В этот и последующий периоды накапливается обширный экспериментальный материал о роли липидов мембран в функционировании липопротеиновых комплексов, интегрированных ферментов, ДНК-мембранных взаимоотношений в функциональной активности субклеточных структур. Появились первые работы, посвященные физико-химическим процессам в липидной фазе облученных клеток, липидным радиотоксинам, начались исследования механизмов перекисного окисления липидов под действием ионизирующей радиации. В центре внимания этих работ лежат химические исследования высокорадиочувствительного механизма свободнорадикальных цепных реакций перекисного окисления ненасыщенных липидов.
Цепные свободнорадикальные реакции перекисного окисления в облучаемых липидах
Термин «цепные реакции» предложил еще в 1913 г. М. Боденштейн, обнаруживший необычную для того времени фотохимическую реакцию превращения десятков тысяч молекул (хлора) при поглощении только одного фотона света. Спустя несколько лет В. Нернст описал цепную реакцию с участием активного атома СГ. Так, при поглощении энергии фотона молекула С12 образует два активных атома СГ:
С12 СГ +СГ,(V.42)
каждый из которых вступает в реакции:
СГ+Н2 —>НС1 + Н’,(V.43)
Н'+С12 —>НС1 + СГ.(V.44)
Последовательность реакций (V.43) и (V.44) может повторяться многократно, подобно звеньям одной цепи, но протекает уже без участия фотона света (темновые стадии). Таким образом, цепная реакция — это каталитическая циклическая реакция, в которой катализатором являются свободные радикалы (или активные возбужденные частицы).
Отмечают три последовательные стадии цепной реакции:
— инициирования (реакции зарождения) цепи,
— развития (продолжения) цепи,
— обрыва цепи (реакция гибели).
Рассмотрим подробнее стадии цепной реакции, протекающей в липидах под действием поглощенной энергии излучений).
Стадия инициирования цепи
Зарождение цепи осуществляется в результате распада валентноненасыщенной молекулы и образования двух свободных радикалов с неспаренным электроном. В растворах это обычно происходит в результате переноса электрона. Стадия инициирования (или зарождения) цепи наиболее энергоемкая в любой цепной реакции. Поскольку ее энергия активации зависит от энергии разрыва химической связи, радиационный распад молекул на радикалы осуществляется неодинаково для различных молекул и систем.
Лауреат Нобелевской премии академик Н. Н. Семенов (1934) придавал большое значение наличию в сложных гетерогенных системах веществ («примесей»), облегчающих развитие цепных реакций. Такие вещества легко образуют свободные атомы и радикалы. Например, радикалы пероксидов являются наиболее универсальными инициаторами цепей. Анализируя реакционную способность различных субстратов и развивающихся цепных реакций, Б.Н.Тарусов (1962) и Н. М. Эммануэль (1969) установили, что наиболее вероятной для развития первичных лучевых процессов в живой системе является реакция окисления ненасыщенных липидов и образование перекисей.
Образование перекисей липидов может иметь цепной свободнорадикальный характер с образованием свободных радикалов, реакционная способность которых позволяет произойти реакции
X' +RH -^XH + R',(V.45)
где X' — свободный радикал, инициирующий цепь; RH — молекула жирной кислоты; R’ — радикал липида.
В простой модельной системе, состоящей из ненасыщенной жирной кислоты и молекулярного кислорода, происходит реакция между радикалом и молекулой О2:
R’ + O2 -^RO2,(V.46)
в результате которой возникают пероксидные радикалы липидов. Константа скорости этой реакции 107-108 л/моль-с, а энергия активации практически равна нулю. Следовательно, при концентрациях кислорода выше 10° моль/л все радикалы R’ превращаются в радикалы RO2.
Пероксидный радикал может вступить во взаимодействие с новыми молекулами ненасыщенных жирных кислот с образованием гидроперекиси и нового радикала Щ:
RO2 + RiH ROOH + Rp(V.47)
Эта реакция также имеет низкую энергию активации и высокую константу скорости, величина которой зависит от типа окисляющегося соединения, а также от активации молекулы кислорода.
В более сложных системах — в биологических средах — с участием активных форм кислорода происходит разрыв не двух, а только одной химической связи ненасыщенной жирной кислоты (фосфолипида) с образованием окислительного радикала RO' и гидроперекисей (см. гл. VI).
Стадия развития цепной реакции (продолжение цепи)
Чередование реакций (V.46) и (V.47) приводит к развитию цепной реакции окисления, схема которой может быть представлена так:
О2 RH О2 RH О2
R —> RO2 —У RO2 —•••(V.48)
ROOH ROOH
В процесс вовлекаются все новые молекулы липида RH и кислорода, в результате накапливаются гидроперекиси, а число радикалов R' и RO2 не изменяется (принцип неуничтожимости свободной валентности), они выступают в качестве катализаторов реакции; нечетное число валентных электронов не может измениться в процессе реакции радикала с молекулой. Реакции развития цепи имеют невысокие величины энергии активации.
Скорость всего процесса лимитируется реакцией взаимодействия перекисного радикала с новой окисляющейся молекулой — реакцией продолжения цепи.
Стадия обрыва цепи
С реакцией продолжения цепи конкурируют реакции, приводящие к обрыву цепей (Ю. А. Владимиров, А. И. Арчаков, 1972):
реакции взаимодействия радикалов — рекомбинации, например
R’ + R’ R-R,(V.49)
в результате которых образуются молекулярные продукты;
реакции радикалов с ионами переменной валентности, например с ионами железа:
RO2 + Fe2+ + Н+ —ROOH + Fe3+,(V.50)
R"+Fe2++Н+RH + Fe2+;(V.51)
реакции радикалов с ингибиторами-антиоксидантами (InH):
RO2 + InH —> ROOH + In",(V.52)
в результате которых возникают малоактивные радикалы антиоксидантов, не способные вступать в реакции с новыми молекулами (ненасыщенных жирных кислот). Они исчезают в результате рекомбинации с другим радикалом In' или радикалами R/ и RO^.
Коррекция цепных реакций
В присутствии металлов переменной валентности описанный процесс (V.50), (V.51) может приобрести разветвленный характер за счет реакции:
ROOH + Fe2+—RO" + ОН-+ Fe3+,(V.53)
т. е. появляются новые свободные радикалы, а значит, новые цепи перекисного окисления. Для того чтобы происходило эффективное разветвление цепей, необходимо добавлять в систему ионы металла переменной валентности или же регенерировать окисленное железо. Такая регенерация может происходить за счет сульфгидрильных соединений:
RSH + Fe3+ |RSSR + Fe2+ + Н+.(V.54)
В результате образуется восстановленное железо, способное инициировать образование радикалов RO' при взаимодействии с молекулой гидроперекиси ROOH.
Рассматривая последовательность реакций цепного перекисного окисления липидов, можно выделить три возможности значительной интенсификации процесса:
— увеличение содержания свободных радикалов, инициирующих цепи перекисного окисления;
— усиленное разложение гидроперекисей с образованием новых радикалов, инициирующих новые цепи окисления (процесс приобретает разветвленный характер);
— разрушение антиоксидантами, ингибирующими развитие процесса за счет обрыва цепей.
Химическая природа инициаторов или ингибиторов может быть различной — и молекулярной, и радикальной.
Применяя добавки инициаторов или ингибиторов, можно управлять цепными реакциями, создавать неразветвленные и разветвленные цепи, цепи с вырожденным разветвлением. В радиобиологии этот
принцип нашел большое применение при изыскании радиопротекторов и радиосенсибилизаторов, первичный отбор которых проводится также и на модельных растворах, с протекающими в них цепными процессами окисления липидов (Е. Н. Гончаренко, Ю. Б. Кудряшов, 1985).
Цепные процессы окисления липидов в модельных системах относятся к реакциям с самоускорением, поскольку их важным свойством является промежуточное образование гидроперекисей НО ОН:
R + О2 —^ RO2,RO2+ RHROOH + R’,
(V.55)(V.56)(V.55)(V.56)и цикл продолжения цепи может многократно повторяться по приведенной схеме.
(V.55)
(V.56)
(V.55)
(V.56)
4.2. Роль свободных радикалов липидов в непрямом эффекте инактивации биоорганических молекул
Выводы о высокой радиочувствительности ненасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидов и их способности к образованию активных свободных радикалов в цепных окислительных реак
циях позволили предположить наличие у липидных растворителей
способности осуществлять непрямой эффект радиации.
Для выяснения этого вопроса легко идти по проторенной дороге и использовать богатый опыт радиобиологов по классическим исследованиям непрямого эффекта в воде.
Еще в середине 60-х гг. в лаборатории радиационной биофизики МГУ им. М. В. Ломоносова были начаты работы, показав
Рис. V.12. Радиолиз /3-каротина в зависимости от величины дозы д-излу- чения: 1 — кристаллический /3-каротин, +18 °C; 2 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, в атмосфере азота, + 18 °C; 3 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, воздушная атмосфера, + 18 °C; 4 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, воздушная атмосфера, -196 °CРис. V.12. Радиолиз /3-каротина в зависимости от величины дозы д-излу- чения: 1 — кристаллический /3-каротин, +18 °C; 2 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, в атмосфере азота, + 18 °C; 3 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, воздушная атмосфера, + 18 °C; 4 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, воздушная атмосфера, -196 °Cшие возможность непрямого механизма действия ионизирующей радиации через продукты радиолиза липидов. Для исследований была выбрана молекулярная модель раствора каротина в липидах.
Рис. V.12. Радиолиз /3-каротина в зависимости от величины дозы д-излу- чения: 1 — кристаллический /3-каротин, +18 °C; 2 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, в атмосфере азота, + 18 °C; 3 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, воздушная атмосфера, + 18 °C; 4 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, воздушная атмосфера, -196 °C
Рис. V.12. Радиолиз /3-каротина в зависимости от величины дозы д-излу- чения: 1 — кристаллический /3-каротин, +18 °C; 2 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, в атмосфере азота, + 18 °C; 3 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, воздушная атмосфера, + 18 °C; 4 — раствор /3-каротина в олеиновой кислоте, воздушная атмосфера, -196 °C
Было обнаружено радиационное повреждение каротина в
результате прямого (кристаллический каротин) и опосредованного (в липидных растворах) действий излучения. Данные представлены на рис. V.12.
Как видно из рисунка, кристаллический каротин обладает значительной радиорезистентностью: облучение в дозе 105 Гр вызывает радиолиз лишь 10% облученных молекул. Растворение каротина в одном из строительных блоков липидов (в олеиновой кислоте) приводит к
Концентрация раствора, д/млКонцентрация раствора, д/млРис. V.13. Радиолиз /3-каротина в зависимости от его концентрации в олеиновой кислоте при облучении в разных дозах: 1 — 20 Гр, 2 — 50 Гр, 3 - 100 ГрРис. V.13. Радиолиз /3-каротина в зависимости от его концентрации в олеиновой кислоте при облучении в разных дозах: 1 — 20 Гр, 2 — 50 Гр, 3 - 100 ГрКоличество перекисей, мкмоль Ог/г-Ю-1Количество перекисей, мкмоль Ог/г-Ю-1Рис. V.14. Радиолиз /3-каротина, растворенного в олеиновой кислоте, в зависимости от содержания перекисей в раствореРис. V.14. Радиолиз /3-каротина, растворенного в олеиновой кислоте, в зависимости от содержания перекисей в растворе
Концентрация раствора, д/мл
Концентрация раствора, д/мл
Рис. V.13. Радиолиз /3-каротина в зависимости от его концентрации в олеиновой кислоте при облучении в разных дозах: 1 — 20 Гр, 2 — 50 Гр, 3 - 100 Гр
Рис. V.13. Радиолиз /3-каротина в зависимости от его концентрации в олеиновой кислоте при облучении в разных дозах: 1 — 20 Гр, 2 — 50 Гр, 3 - 100 Гр
Количество перекисей, мкмоль Ог/г-Ю-1
Количество перекисей, мкмоль Ог/г-Ю-1
Рис. V.14. Радиолиз /3-каротина, растворенного в олеиновой кислоте, в зависимости от содержания перекисей в растворе
Рис. V.14. Радиолиз /3-каротина, растворенного в олеиновой кислоте, в зависимости от содержания перекисей в растворе
резкому возрастанию его радиочувствительности. D37 составляет относительно незначительную величину — всего лишь 40 Гр. Естественно, такое возрастание радиочувствительности не может объясняться увеличением линейных размеров каротина в олеиновой кислоте в десятки тысяч раз. Формально можно утверждать, что чувствительный объем увеличился за счет того, что в растворе достаточно попадания кванта излучения в некую область, окружающую молекулу каротина, откуда возможна диффузия поражающего агента к молекуле. Так возникло предположение о существовании опосредованного действия ионизирующей радиации в липидах. Однако более строго доказать это предположение стало возможным при изучении температурных, дозовых, концентрационных зависимостей радиолиза каротина, добавления модифицирующих радиолиз веществ.
Из рис. V.12 следует, что радиолиз каротина, растворенного в олеиновой кислоте, резко уменьшается, если облучение растворов проводить при низкой температуре. Это свидетельствует о температурной зависимости процессов непрямого действия ионизирующей радиации. Исследование зависимости радиолиза каротина от его концентрации в растворах олеиновой кислоты позволило получить типичные кривые, подтверждающие вывод о непрямом действии радиации. Эти данные представлены на рис. V.13. Увеличение дозы облучения вызывает повышение количества активных, диффундирующих продуктов, поэтому уровень плато кривых возрастает с повышением дозы 7-излучения.
Высокая радиочувствительность веществ, растворенных в олеиновой кислоте, в значительной степени определяется уровнем содержания продуктов ее окисления, в первую очередь гидроперекисей и перекисей. На рис. V.14 показано, что предварительное окисление кислородом воздуха олеиновой кислоты приводит к резкому усилению процессов радиолиза.
Дальнейшие исследования показали, что вещества, модифицирующие лучевое поражение биологических объектов, аналогично влияют
на процесс радиолиза растворов каротина в липидах. Так, аминоэ- тилизотиуроний и ингибитор свободнорадикальных реакций — 4-ме- тил-2,6-дитретбутилфенол — обладали радиозащитным действием. Из приведенных ранее данных можно видеть, что снижение содержания кислорода в растворе также приводит к радиозащитному эффекту.
Вывод об опосредованном действии радиации в липидах подтвердили также данные о продолжительности жизни активных радикалов ненасыщенных жирных кислот. Так, используя метод «флеш-радиолиза», показали, что средняя продолжительность жизни первичных продуктов радиолиза — медиаторов реакции — не превышает 8 мс (Кудряшов, Балтбарздыс, 1966). Этот вывод особенно важен тем обстоятельством, что удалось определить участие перекисных радикалов липидов в непрямом эффекте ионизирующей радиации.
Данные о роли перекисных радикалов липидов в непрямом механизме действия ионизирующей радиации были подтверждены в дальнейшем на других липидных растворах, биологических объектах и системах.
* *
*
Материал гл. V посвящен рассмотрению непрямого действия ионизирующих излучений в растворах. Опосредованное поражение органических молекул в разбавленных водных растворах обусловлено действием высокоактивных диффундирующих свободных радикалов, возникающих в результате радиолиза молекул воды. Свободные радикалы Н’, ОН’, е^ обладают высокой реакционной способностью, они могут вызывать разрушение химических связей в белках, нуклеиновых кислотах, фосфолипидах и других органических молекулах. Во многих случаях реакция органической молекулы со свободными радикалами воды приводит к возникновению свободных радикалов органических молекул, которые вступают в различные реакции друг с другом и с другими молекулами. В результате формируются стабильные растворенные продукты — молекулы с измененными структурными и функциональными характеристиками. Это могут быть ферменты с нарушенными каталитическими характеристиками, молекулы ДНК с одно- и двунитевыми разрывами полинуклеотидных цепей или разрушенными азотистыми основаниями, фосфолипиды, образующие высокоактивные продукты перекисного окисления и т. д. Многие из этих повреждений, в принципе, могут служить причиной гибели клеток и организмов.
Оценивая радиационно-химический выход при облучении растворов ряда биоорганических веществ, можно отметить весьма высокую радиочувствительность фосфолипидов, образующих в присутствии кислорода высокоактивные перекисные радикалы и гидроперекиси при цепных автокаталитических реакциях. Так же как и водные радикалы, радикалы липидов, индуцированные облучением, способны
вызывать инактивацию биоорганических молекул, в том числе и молекул фосфолипидов биологических мембран. Цепные реакции окисления ненасыщенных липидов приводят к накоплению в биологических средах избыточного количества свободных радикалов, продуктов перекисного окисления липидов, способных, как это будет показано в следующей главе, к токсическому действию на клетку. Таким образом, не только в воде, но и в липидах осуществляется непрямой механизм действия ионизирующих излучений.
Ряд модифицирующих агентов, таких, как кислород, низкая температура, серосодержащие соединения и другие воздействия, изменяют характер радиационно-химических реакций в водных и липидных растворах, конкурируя с органическими молекулами за активные радикалы или восстанавливая пораженные молекулы. Это открытие стимулировало, например, использование радиопротекторов для защиты клеток и организмов от действия излучения.
Так, уже первые работы В. Дейла (1942), открывшего непрямое действие ионизирующих излучений в водных растворах, показали, что прибавление ряда антиокислителей к облучаемым растворам ферментов снижает их радиационную инактивацию. Эти работы, как известно, послужили дальнейшим открытиям химической защиты бактериофагов (Латарже и Эфрати, 1948) и мышей (Бак и Херве, 1952) радиопротекторами — аминотиолами.
По признанию 3. Бака (1968), на проведение исследований защитного действия антиокислителей повлиял факт образования в облученной воде перекисей, обладающих, по его мнению, радиомиметически- ми свойствами. В дальнейшем стали применяться и липидные модели оценки непрямого радиационного эффекта для первичного отбора, изучения свойств и биологического действия радиопротекторов.
Феномен непрямого действия излучения продемонстрирован на разбавленных водных растворах и липидах. Однако это не означает, что непрямое действие может наблюдаться только в данных биологически важных средах. В принципе, любой химический растворитель, в котором возникают диффундирующие активные продукты, может служить средой для проявления непрямого действия радиации.
Радиобиологов интересует не только сам факт прямого или непрямого эффектов радиации как таковых, а реакции живой клетки на повреждения, вызванные ими. Этому посвящена гл. VI.
Глава VI
РЕАКЦИИ КЛЕТКИ НА ДЕЙСТВИЕИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ
Реакции клеток на действие ионизирующих излучений исследуются со времени открытия рентгеновских лучей и радиоактивности. За этот период накоплен обширный экспериментальный материал о характере морфологических и биохимических изменений в облученной клетке, изучены закономерности развития лучевого поражения во времени, проведен количественный анализ гибели клеток в облученной популяции.
Однако и до настоящего времени выяснение механизмов ответных реакций клетки на действие ионизирующих излучений — одна из основных проблем радиобиологии. Ее решение имеет важное теоретическое значение, так как позволяет расшифровать природу процессов, приводящих к развитию радиационного поражения, а также восстановления как самой клетки, так и биологических структур более высоких, чем клеточный, уровней организации. Практическая значимость исследований, проводимых на клеточном уровне, несомненна, т. к. реакции различных клеток на действие ионизирующей радиации лежат в основе лучевого поражения сложных биологических систем — органов, тканей, организмов растительного и животного царств, включая млекопитающих.
До недавнего времени считалось, что такие лучевые реакции клеток как их гибель, хромосомные аберрации, соматические мутации, а также опухолевая трансформация тканей, являются следствием необратимых радиационных повреждений первичной структуры ДНК, возникающих в результате прямого и опосредованного молекулярным окружением воздействия ионизирующего излучения. Однако достижения современной молекулярной биологии и радиационной биофизики, радиобиологии привели к выводу о более сложных механизмах, связанных с функциональными реакциями самих радиационных мишеней: с одной стороны, ДНК, с другой — биологических мембран (БМ), непосредственно связанных с системой окислительно-восстановительного гомеостаза клетки.
В связи с этим все с большим интересом радиобиологи сосредоточивают внимание на образующиеся в биологической мембране и ДНК под влиянием ионизирующих излучений оксирадикалы и другие продукты окисления молекул, а также на вызываемые ими изменения
в механизмах регуляции, осуществляемые в клетке при непосредственном участии ДНК и БМ.
От изолированных молекул к клетке
В предыдущих главах была дана оценка характера процессов поглощения энергии радиации веществом, рассмотрены механизмы действия ионизирующих излучений на изолированные молекулы и простые системы. При переходе на новый уровень организации живого — клеточный — мы уже говорим не только о взаимодействии излучений с отдельными молекулами, а о более сложной, ответной реакции клетки, включающей в себя взаимосвязанные нарушения структуры и функции ее элементов, зависимые от характера и степени повреждений. Во многих случаях биологический клеточный эффект может быть связан с радиационным повреждением не только тех участков в макромолекуле или даже не только тех молекул, которые непосредственно поглотили энергию излучений, а с теми элементами клетки, которые вступили в реакцию с активными продуктами, образующимися вследствие облучения.
Иными словами, важно знать не только то, какие изменения претерпевают макромолекулы в клетке при действии ионизирующих излучений, но и каким образом клетка, как живая система, реагирует на возникающие в этих макромолекулах нарушения.
Таким образом, на более сложном, клеточном уровне рассматриваемые изменения макромолекул приобретают уже качественно новый смысл причастности к системному ответному эффекту. Поэтому в данной главе мы вынуждены будем обращаться к рассмотренным ранее фактическим данным, служащим фоном, на котором протекают более сложные радиационно-индуцируемые процессы в живой клетке.
Напомним, что основная задача радиационной биофизики состоит в изучении последовательности процессов, протекающих в живой материи в результате облучения от момента возникновения немногочисленных начальных повреждений до появления тестируемых биологических эффектов, включая гибель клетки. Как это очевидно из материалов предшествующих глав учебника, в настоящее время большое внимание уделяется первичным («инициальным», «запальным») физико-химическим реакциям.
До недавнего времени основную информацию о первичных и начальных биофизических процессах в облучаемой клетке получали в модельных экспериментах с изолированными биоорганическими молекулами, водными и липидными растворами или отдельными субклеточными органоидами. Опираясь на рассмотренные ранее данные о действии ионизирующих излучений на молекулы, можно воссоздать следующую элементарную качественную картину первых стадий биофизических процессов, возникаюицих в облученной клетке.
Как отмечалось в предыдущих главах, ионизирующие излучения с определенной вероятностью передают часть своей энергии отдельным молекулам, расположенным вдоль треков частиц. Напомним, что молекулы, поглотившие энергию излучения, переходят в различные возбужденные состояния, часть которых заканчивается ионизацией. Вероятность переноса энергии на молекулу не зависит от ее химической структуры, она определяется суммарной электронной плотностью, имеющей примерно равные значения для различных органических молекул и воды.
Это означает, что в облученной клетке не существует структур испитивающих преимущественное поглощение энергии, — возбужденными и ионизированными оказываются белки и нуклеиновые кислоты, липиды и углеводы, молекулы воды и различные низкомолекулярные органические соединения.
Первая, или физическая, стадия действия излучения в облученной клетке протекает, как и в изолированных молекулах, за время 10^16 10“14 с. Ее иногда называют неспецифической стадией. Она включает процессы поглощения, перераспределения и деградации поглощенной энергии в клетке. Результатом этих событий служит возникновение ионизированных и возбужденных молекул, неравномерно распределенных вдоль треков ионизирующих частиц.
Образуются ионы (М+), возбужденные ионы молекул (М+*), электроны, возбужденные, а также (в зависимости от дозы облучения) сверхвозбужденные состояния молекул (М*, М**), энергия которых превышает первый потенциал ионизации молекул, наконец, плазмоны — находящиеся в коллективно сверхвозбужденном состоянии ансамбли молекул [MiMn...Mn]**.
Общий радиационный выход первичных частиц составляет 710 частиц/100 эВ. Молекулярная система находится в энергетически неравновесном состоянии с гетерогенным распределением активных частиц.
Процессы, происходящие на этой стадии в клетке, нельзя модифицировать — число первичных актов ионизации и возбуждения не зависит от состояния объекта, а определяется лишь свойствами излучения.
На физико-химической стадии за время К)13 К)1 () с происходят реакции заряженных и возбужденных частиц, процессы внутримолекулярной миграции энергии и диффузии радикалов, различные межмолекулярные перестройки возбужденных и ионизированных клеточных структур.
Ионизированные и возбужденные молекулы в клетке, как и в растворах, нестабильны. Исчезновение этого состояния происходит за счет миграции энергии внутри молекул или между ними. Вероятно, энергия может мигрировать за счет переноса спина, миграции «положительно заряженной дырки», миграции малых радикалов, прежде всего атомарного водорода. Помимо возможного прямого действия
на органические молекулы в клетке, ионизирующие излучения вызывают их повреждение косвенным путем — диффундирующими e^p, свободными радикалами, образующимися в водной и липидной фазах клетки.
Возникающие первичные радикалы, как правило, неустойчивы и быстро претерпевают вторичные превращения, приводящие к образованию органических гидропероксидов и оксирадикалов органических молекул (в том числе ДНК и липидов биологических мембран), взаимодействующих друг с другом и с другими молекулами. Система переходит в состояние теплового равновесия.
Для модификации процессов на физико-химическом этапе лучевого поражения используют химические соединения, способные изменять характер миграции энергии или вступать в реакции со свободными радикалами.
На химической стадии, т. е. к IO 7 10 6 с, в шпорах, блобах, коротких треках в клетке успевает произойти взаимодействие органических радикалов друг с другом и с окружающими молекулами, которое приводит к возникновению стойких изменений — разнообразных повреждений в структуре молекул, составляющих живую клетку. Происходит выравнивание концентраций продуктов радиолиза по объему.
Как уже отмечалось, под действием излучения в «радиочувствительных», наиболее легко окисляемых молекулах — полинена- сыщенных липидах мембран — будут интенсифицироваться реакции свободнорадикального перекисного окисления и накапливаться в избыточных, токсических для живой системы количествах продукты окисления липидов. При этом нарушается структура и функции биологических мембран.
В белковых макромолекулах клетки при облучении ее в высоких, летальных дозах может произойти повреждение первичной структуры (селективное разрушение отдельных аминокислот), измениться их вторичная структура; нарушиться конформация и, возможно, в конечном итоге, произойдет деградация активного центра ферментов.
Упоминалось также, что в ДНК возникают одно- и двунитевые разрывы полинуклеотидных цепей, разрушаются некоторые азотистые основания, возникают межмолекулярные сшивки (ДНК—ДНК, ДНК—белок). Могут оказаться пораженными молекулы иРНК и тРНК, а также рибосомы.
Различные повреждения молекул и субклеточных структур приводят к разнообразным функциональным нарушениям и формированию ответных реакций облученной клетки, составляющих последнюю, биологическую стадию действия излучения.
Вовлечение липидов мембран в процессы перекисного окисления приводит к нарушению важнейших для клетки барьерно-матричных, энергетических и регуляторных функций, к снижению и выравниванию важнейших для клетки электро-химио-осмотических градиентов, а также к повреждению мембраносвязанных белков с выходом
ферментов из мест специфической локализации. При облучении в высоких дозах ферменты могут утрачивать каталитические свойства, субстратную специфичность, чувствительность к соответствующим активаторам и ингибиторам или (и) аллостерические свойства.
Повреждения ядерной мембраны могут иметь глубокие последствия для генетического аппарата, например, вследствие проникновения в ядро гидролитических ферментов — ДНКаз, РНКаз, кислых фосфатаз и др.
Структурные повреждения нуклеиновых кислот создают препятствия для протекания процессов репликации, транскрипции и трансляции генетической информации, нарушают контроль за развитием клеток и генетическую программу их гибели.
Инактивация отдельных компонентов различного типа биологических процессов в облученной клетке возникает при неодинаковых дозах облучения и имеет различные последствия для клеточного гомеостаза: одни процессы оказываются исключенными из цепи метаболических реакций, другие нарабатывают продукты в избыточных, токсических концентрациях, третьи перестают регулироваться соответствующими эффекторами.
Впрочем, с позиций радиационной биофизики описанная здесь картина развития биологической стадии радиационного поражения клетки носит в большой мере качественный вероятностный характер. Действительно, повреждение in situ, в самой клетке, каждого из рассмотренных здесь типов биомолекул не охарактеризовано количественно, особенно в отношении функциональной инактивации, с точки зрения масштабов биологических последствий ее при каждом уровне доз облучения и реального вклада в нарушение процессов жизнедеятельности клетки. Даже при наиболее упрощенном, чисто биофизическом подходе (без учета биохимической динамики процессов самообновления клеточных молекул) к решению проблемы радиационного поражения клетки до сих пор не просчитано (или не установлено экспериментально из-за методических трудностей), какая доля, какой процент повреждений возникает хотя бы в одном классе главных входящих в состав клетки биомолекул in vivo при каждой дозе облучения и какие последствия для соответствующих функций клетки могут иметь эти радиационные повреждения с учетом уникальности или множественности тех или иных субклеточных структур, в которые эти биомолекулы входят.
Это при том, что наряду с рассмотренными примерами радиационных нарушений в макромолекулах разных классов, в клетке активируются защитные механизмы, предохраняющие или восстанавливающие макромолекулы и субклеточные структуры от лучевых повреждений. Имеются в виду антирадикальные, гипоксические и антиокислитель- ные механизмы, контролирующие процессы липопероксидации, многоплановые процессы репарации повреждений ДНК и других макромолекул.
Вместе с тем, пожалуй, нет таких биохимических процессов, которые, в зависимости от величины дозы и характера облучения, рано или 14 Ю. Б. Кудряшов
поздно не претерпели бы изменений под действием ионизирующих излучений. Временная иерархия, т. е. последовательность появления стабильных структурно-метаболических радиационных изменений, проявляется в зависимости от этапов развития процессов повреждений и включения тех или иных защитных ресурсов в клетке.
Разнообразные и взаимосвязанные изменения на биологической стадии формируются в течение секунд, часов, суток, всего периода жизни клетки, исчисляемой для некоторых типов клеток месяцами.
Критическими для жизнедеятельности облученной клетки оказываются, в первую очередь, повреждения таких радиобиологических мишеней как ДНК и биологические мембраны. Повреждения их могут приводить к преждевременной гибели клетки посредством механизмов апоптоза или путем некроза, а в случае нелегального уровня — передаваться по наследству.
Таким образом, в клетке, в отличие от изолированных молекул и их растворов, развертывается более сложная, многоплановая картина системного ответа на поражающее действие ионизирующих излучений.
Об усилении первичных молекулярных повреждений
Основной результат, который следует из опытов по изучению инактивации облученных молекул, состоит в том, что значение инактивирующей дозы D37 варьирует от нескольких тысяч до миллиардов Гр. В то же время для большинства клеток летальная доза радиации колеблется в пределах от 1 до 100 Гр. Следовательно, в летально облученной клетке доля непосредственно инактивированных молекул чрезвычайно низка — около 0,001-0,1%. Если речь идет, например, о ферментах, то 99,9-99,999% молекул, оставшихся непораженными, способны выполнять свои функции. Маловероятно, чтобы убыль такого незначительного числа биокатализаторов имела столь серьезные последствия для клетки. Можно было бы предполагать, что повреждение столь ничтожной доли уникальных структур, таких, как ядерная ДНК, все же способно привести к гибели клетки. Однако этому предположению можно возразить, имея в виду то, что потери макромолекул клеткой в процессе ее нормальной жизнедеятельности значительно превышают потери, происходящие за счет непосредственного облучения в летальных дозах.
Могут ли все же ничтожные потери первично радиационно-инактивированных биологически значимых молекул привести к фатальному для облученной клетки исходу? Следует ответ: “Да, могут”, поскольку, как уже многократно отмечалось, изменения биомакромолекул в биологической стадии развития лучевого поражения развиваются (умножаются) во времени и могут достигнуть такого уровня, при котором происходят необратимые и фатальные для клеток повреждения.
Таким образом предполагается существование механизма усиления первичных молекулярных изменений, приводящих к развитию повреждений и к гибели облученной клетки.
Прямое и непрямое действие излучений в клетках
Возникновение стойких молекулярных повреждений на биологической стадии лучевого поражения клетки обнаруживали в облученных клетках еще в середине 50-х годов (в работах Хатчинсона, Полларда, Раевского и др.). Радиочувствительность некоторых молекул в изолированных сухих препаратах и висушенних клетках совпадала. Вероятно, в данном случае эти молекулы инактивируются в клетке за счет действия радиации независимо от водных радикалов.
В опытах с коферментом А было показано, что в висушенних клетках он в 2,7 раза более чувствителен к облучению, чем в изолированном состоянии. Такой результат позволяет предположить наличие в клетке факторов, модифицирующих радиочувствительность молекул (образование избытка радикалов в клетках, высокая степень агрегации, адсорбция на поверхности субклеточных структур, образование комплексов и др.). В большом числе экспериментов сопоставляли радиочувствительность молекул во влажных и обезвоженных клетках. Как правило, обезвоживание приводило к повышению радиоустойчивости молекул. Все это указывало на важную роль радикалов воды — одного из факторов чувствительности клетки к действию радиации.
К распространенным методам модификации свободнорадикальных лучевых изменений относятся метод температурних воздействий и уже упоминавшийся метод висушивания клеток^.
Так, замораживание клеток в равной мере предотвращало снижение уровня свободных радикалов и развитие лучевого поражения. При помещении клеток после облучения в атмосферу чистого кислорода наблюдали быстрое исчезновение радикалов и более глубокое, чем в обычных условиях, лучевое поражение.
Аналогичное действие оказывает високая температура. Предполагается, что в обоих случаях быстрое исчезновение свободных радикалов связано с образованием стабильных аддуктов поврежденных молекул, приводящих к летальному исходу клетки.
Во многих упомянутых радиобиологических исследованиях производили сопоставление радиочувствительности высушенных или замороженных клеток с радиочувствительностью клеток, облученных во влажном состоянии. В первых двух случаях преобладает прямое
действие радиации, а в последнем — происходит как прямое, так и опосредованное влияние (через продукты радиолиза воды).
В табл. VI.1 представлены данные Ш. Окада (1974), в которых приведены сопоставления прямого и опосредованного (непрямого) действия ионизирующих излучений на клетки. Автор завысил роль прямого эффекта радиации, поскольку в 70-е годы непрямой эффект излучений многими учитывался только на основании представлений об образовании водных радикалов.
По мнению известного генетика Ш. Ауэрбах (1978), включение в рассмотрение непрямых эффектов радиации придает более точное значение выводу о том, что радиационно-генетические эффекты вызываются ионизацией в самой хромосоме или (и) в непосредственной близости от нее.
Вопрос о количественном вкладе непрямого действия радиации в радиобиологический эффект длительное время оставался неясным и дискутировался более полувека. В количественные расчеты часто вносилась путаница при использовании ограниченного, устаревшего понятия «косвенного (непрямого, опосредованного) действия излучения», относящегося только к действию радикалов воды и не учитывающего роль других радикалов и миграцию поглощенной энергии излучений в биологических системах.
Так, в зависимости от метода и объекта исследования разные авторы предлагали цифры от 0 до 100% вклада непрямого эффекта за счет радиолиза воды.
Произведя тщательный анализ данным литературы, Ю. Н. Корыс- тов (1986) пришел к выводу, что в клетках прокариот и эукариот непрямое действие радиации за счет воды достигает 80-90% и является определяющим в инактивации клетки ионизирующим излучением. Действительно, сухие или замороженные клетки обычно в 23 раза более устойчивы к облучению, чем нативные. Этот результат указывает на роль диффундирующих активных продуктов (в жидкой фазе клетки) в поражении внутриклеточных структур, определяющих чувствительность клетки к радиационному воздействию.
Были проведены прямые эксперименты по сопоставлению радиочувствительности макромолекул во влажных и обезвоженных клетках. Критерием радиочувствительности служила величина дозы, вызывающей инактивацию 63% макромолекул (D37). Оказалось, что доза D37 для инактивации ряда ферментов значительно ниже во влажных клетках, чем в высушенных или замороженных. Например, активность алкагольдегидрогеназы во влажных дрожжевых клетках снижается до 37% от исходной величины в результате облучения клеток в дозе 12 кГр; в сухих клетках аналогичная степень инактивации наблюдалась после облучения в дозе 280 кГр. Для инвертазы во влажных клетках доза D37 = 6 Мрад, а в замороженных — 12 Мрад. По- видимому, более эффективное поражение макромолекул во влажных клетках связано с действием активных продуктов радиолиза воды.
Радиобиологический эффект
Тип клеток
Условия физического состояния клетки
Условия облучения, t °C и состав атмосферы
Соотношение вклада, % *)
непрямого действия
прямого действия
летальное поражение культивируемых клеток млекопитающих
клетки TI почки человека
замораживание
20 (воздух)
75
25
подавление синтеза ДНК в клетках млекопитающих
асцитная карцинома Эрлиха
замораживание
20 (воздух)
50
50
влияние на развитие трансплантированных яйцеклеток крыс
ткань яичника крысы
замораживание
20 (воздух)
50
50
летальное поражение культивируемых клеток млекопитающих
тимоциты крысы
замораживание
37 (кислород)
37 (азот)
54
26
46
74
хромосомные аберрации в клетках растений
традесканция
замораживание
20 (кислород)
20 (азот)
50
50
50
50
летальное поражение бактерий
Е. coli
замораживание замораживание
высушивание лиофильная сушка
о (воздух) 0 (азот) комнатная, (воздух)
82
53
71
91
18 47
29
9
летальное поражение дрожжей
гаплоидные клетки
замораживание
20 (воздух)
20 (азот)
0
0
100
100
Таблица VI. 1. Вклад прямого и непрямого действия радиации (через продукты радиолиза воды) в клеточные радиобиологические эффекты
*)Вклад (в %) прямого и непрямого действия рассчитан согласно уравнению:
3. Прямое и непрямое действие излучений в клетках213
1/доза в замороженном или сухом состоянии ^^^ 1/доза при условиях, приведенных в таблице1/доза в замороженном или сухом состоянии ^^^ 1/доза при условиях, приведенных в таблице
1/доза в замороженном или сухом состоянии ^^^ 1/доза при условиях, приведенных в таблице
1/доза в замороженном или сухом состоянии ^^^ 1/доза при условиях, приведенных в таблице
Не все изученные ферменты поражаются в клетке радикалами воды в одинаковой степени. Например, ^-галактозидаза и ацетилхо- линэстераза в равной степени инактивировались во влажных, обезвоженных и замороженных клетках. Возможно, некоторые макромолекулы локализованы в клетках таким образом, что становятся недоступными для продуктов радиолиза воды.
В связи с этим интересен вопрос о возможном расстоянии диффузии радикалов воды от места возникновения до поражаемой структуры. Если бы это расстояние было достаточно велико и сопоставимо с размерами клетки, то облучение любого участка клетки с равной эффективностью вызывало бы биологическое поражение, связанное только с непрямым действием радикалов воды. Опыты К. Коула, проведенные еще в 1965 г., показали, что радикалы воды, возникающие в цитоплазме, могут оказаться малоэффективными — пучки электронов были способны вызывать репродуктивную гибель клетки лишь в том случае, если они пронизывали ядро. Теоретическая оценка расстояния диффузии радикалов показывает, что наиболее вероятное значение этой величины для диффундирующих радикалов — 3 нм.
Следовательно, в непрямое действие радиации вовлекается водная оболочка, окружающая мишени, толщиной примерно в 10 молекул воды. Основная часть радикалов, образующаяся в более отдаленных участках клетки, возможно, рекомбинирует до того, как достигает мишени.
Как сейчас хорошо известно, радикалы могут образовываться и в липидах ядерных мембран. Тогда непрямой эффект ионизирующих излучений на генетический аппарат клетки может осуществиться не только в водной фазе, но и при поглощении электронов липидами ядерной мембраны).
Свободные радикалы в облученной клетке и методы ихопределения
Свободные радикалы обладают высокой реакционной способностью, поэтому исследовать переход молекул в облученной клетке в свободнорадикальное состояние и последующие процессы переноса энергии можно лишь с помощью высокочувствительных биофизических и биохимических методов. К их числу относятся методы радиоспектроскопии) (регистрация существования неспаренных электронов в образце, определение их концентрации и в ряде случаев — выяснение химической структуры радикалов).
В группу методов радиоспектроскопии входят уже упоминавшийся метод ЭПР — электронного парамагнитного резонанса, а также методы
ЯМР — ядерного магнитного резонанса и ЯКР — ядерного квадрупольного резонанса.
Явление ЭПР было открыто в 1944 г. российским физиком Е. К. Завой- ским. Разработанный на его основе метод применяется для исследований веществ, содержащих неспаренные электроны: свободные радикалы, ион- радикалы, молекулы в триплетных состояниях, ионы и комплексы переходных металлов и фазы, содержащие свободные электроны.
Мы уже отмечали (гл. IV), что характерный для исследуемого радикала сигнал ЭПР возникает в результате взаимодействия исследуемого вещества с магнитным полем. Неспаренный электрон обладает магнитным моментом ц, связанным с его механическим моментом (спином) s: // = ys. При помещении во внешнее магнитное поле магнитный момент неспаренного электрона ориентируется вдоль или против поля. Энергии электронов в этих состояниях отличаются, и их разность определяется уравнением:
^E = Е2 - Ei = д@Н, (VI.1) где Е — энергия электрона, д — фактор, равный 2 для спинового магнитного момента, /3 — константа (магнетон Бора), равная 9, 27-10“21 эрг/Гс, Н — напряженность магнитного поля. При Н = 3000 Гс (гауссов), AS = 4-10 5 эВ, т. е. меньше средней энергии теплового движения молекул при комнатной температуре.
Используя закон Больцмана, можно связать заселенность п2 верхнего уровня (магнитный момент электрона ориентирован против внешнего поля) и П1 нижнего уровня (магнитный момент ориентирован по полю) следующим выражением:
n2 = те-АБ/кт = nie-"H/kT. (VI.2) Переходы электронов между уровнями можно вызвать электромагнитным излучением такой частоты v. что энергия кванта этого излучения hv будет равна разности энергий электронных уровней AS:
hv = AS. (VI.3)
В результате получим так называемое условие резонанса:
hv = д0Н. (VI.4)
Таким образом, если к исследуемому образцу, находящемуся в магнитном поле напряженностью S. подвести высокочастотное излучение с частотой г, то в образце возникнут вынужденные электронные переходы из нижнего состояния Si в верхнее Е2 (с поглощением энергии), и наоборот — из Е2 в Si (с испусканием энергии). Поскольку заселенность нижнего состояния больше заселенности верхнего, в образце при выполнении условий резонанса (VI.4) будет происходить, в общем, резонансное ноглон^ение високочастотного излучения. При этом частота излучения связана с напряженностью магнитного поля соответственно:
Н = hv/gp. (VI.5)
Из уравнения (VI.5) следует, что резонансное поглощение может происходить: при изменении Н и постоянстве v. либо при постоянстве Н и изменении v. По техническим условиям применяется первый способ регистрации: меняется напряженность внешнего магнитного поля и сохраняется постоянной частота излучения. Для построения графика регистрации ЭПР по оси абсцисс откладывают напряженность магнитного поля Я, а по оси ординат — величину поглощенного образцом высокочастотного излучения при данной температуре РПогл (рис. IV. 15, IV. 18, в). Одним из параметров
сигнала ЭПР является амплитуда сигнала, характеризующая его интенсивность (чаще всего измеряется в относительных единицах, например, в мм). Значение амплитуды сигнала (при постоянстве ширины) отражает концентрацию парамагнитных частиц в образце. Ширина сигнала характеризуется величиной АНтах, измеряемой в единицах магнитной индукции магнитного поля — в гауссах (Гс) или миллитеслах (мТл).
При анализе сигнала ЭПР от исследуемого биологического образца оценки взаимодействия магнитного момента электрона с внешним полем лабораторного магнита оказывается явно недостаточным. В реальной ситуации необходимо учитывать еще и взаимодействия магнитного момента электрона с локальными магнитными полями, создаваемыми как неспаренными электронами соседних парамагнитных частиц (взаимодействия их друг с другом), так и атомными ядрами с ненулевым магнитным моментом. Вклад величины напряженности локальных магнитных полей Нлок и поля внешнего магнита Но в общую напряженность магнитных полей («эффективное магнитное поле» Нэфф) представляется в виде простой суммы:
Яэфф = Я0 + ЯЛОК. (VI.6)
В настоящее время созданы спектрометры, работающие в широком диапазоне частот (1-95 ГГц). Однако наиболее распространены спектрометры, использующие излучение с v ~ 1 ГГц (длина волны такого излучения А ~ 3 см).
С помощью метода ЭПР можно изучать не только структуру парамагнитных частиц, но и взаимодействие их с окружением и динамику в гетерогенной биологической структуре образца.
Явление ЯМР — ядерного магнитного резонанса — обнаружено также в 1945 г. одновременно в двух американских лабораториях — Ф. Блоха и Э. Пурселла. Метод ЯМР используется для изучения переходов в состояниях между уровнями энергии, соответствующими различной ориентации ядерных магнитных моментов по отношению к внешнему магнитному полю. Использование ЯМР-спектрометров позволяет проводить анализ состава сложных смесей веществ (экстрактов из тканей организмов, биологических жидкостей и т.п.), а применение ЯМР-томографов — получать картины (томограммы) послойных срезов внутреннего строения объекта исследования. Ядра со спином I > 1/2 обладают электрическим квадрупольным моментом eQ, отражающим степень отклонения распределения заряда в ядре от сферической симметрии.
Использование метода ЯКР — ядерного квадрупольного резонанса позволяет получать важную информацию о строении изучаемых объектов — твердых тел и кристаллов при низких температурах.
Методы спектроскопии основаны на способности веществ (молекул, атомов, свободных радикалов) поглощать и испускать кванты энергии электромагнитного излучения, величина которых составляет разность энергий дискретных состояний, между которыми происходит спектральный переход. Кванты энергии при таких переходах находятся в радиоволновом диапазоне — от единиц кГц до сотен МГц, что соответствует названию методов — «спектроскопия в радиодиапазоне» или «радиоспектроскопия» ). Эти методы нашли широкое применение в исследовании структуры
белков, нуклеиновых кислот, биологических мембран, а также могут быть использованы для исследования всех процессов, протекающих с участием парамагнитных частиц, в том числе — свободных радикалов.
Первые радиобиологические исследования с использованием методов радиоспектроскопии провел в конце 50-х годах К. Г. Циммер, получивший спектры ЭПР в тканях облученных животных. В последующие годы число таких исследований непрерывно возрастало.
Известно, что в клетке обнаруживаются высокоактивные свободные радикалы, количество которых может зависеть от величины дозы облучения. В диапазоне средних («промежуточных») доз число радикалов возрастает быстро с увеличением дозы облучения, а в области больших доз — значительно медленнее. Это может быть связано с интенсивной рекомбинацией радикалов в высоких концентрациях при больших дозах облучения. Различные биологически активные молекулы имеют близкие значения по величине радиационно-химических выходов радикалов. Следовательно, на единицу поглощенной энергии первично возникает примерно равное количество радикалов ДНК, белков, липидов и других органических молекул. Все они вносят вклад в суммарный сигнал ЭПР.
Следует отметить, что из-за высокой реакционной способности стационарная концентрация короткоживущих радикалов, возникающих при радиационном поражении живых систем, может оказаться слишком малой для того, чтобы эти радикалы могли быть обнаружены методом ЭПР. В этой связи для улавливания короткоживущих радикалов разработан и успешно применяется метод спиновых ловушек. Спиновая ловушка — это реагент, способный присоединять радикал. Получившийся продукт — спиновый аддукт — является относительно стабильным радикалом и поэтому может быть накоплен в концентрации, доступной для регистрации сигнала аддукта методом ЭПР. Кроме того по спектру ЭПР спинового аддукта можно сделать заключение о том, какой короткоживущий радикал уловлен спиновой ловушкой. Так, для захвата высокоактивного радикала ОН' используют такие ловушки как 5,5-диметил-пирролин-К-оксид и фенилбутилнитрон.
Помимо радиоспектроскопических используют и другие методы. Так, для выявления свободнорадикальных состояний в клетках применяют методы хемилюминесценции, привитой сополимеризации мономеров, вводимых в ткани до облучения, а также метод модифицирующих воздействий на клетки и модельные системы).
Один из эффективных методов определения свободнорадикальных реакций в тканях — метод хемилюминесценции — ХЛ («сверхслабого свечения»), предложенный Ю. А. Владимировым и Ф.Ф. Литвиным (1959). При взаимодействии радикалов выделяется энергия, которая может излучаться в виде квантов света. Интенсивность такой ХЛ пропорциональна скорости реакции, в которой участвуют радикалы. Таким образом, с помощью ХЛ
регистрируется изменение концентрации радикалов в процессе реакций, например, перекисного окисления липидной фазы мембран.
Б. Н. Тарусов с сотрудниками (1972) обнаружили, что в нормальных условиях, в интактных биологических системах, ХЛ испускается стабильно, непрерывно, на стационарном уровне, характерном для данного исследуемого биологического объекта. Ионизирующее излучение индуцирует вспышку ХЛ, обусловленную переходом стационарного окислительного процесса в процесс самоускоряющийся, автокаталитический, сопровождающийся образованием стойких свободных радикалов. Вспышка ХЛ может быть усилена влиянием электрического тока (метод электрохемилюминесценции — ЭХ Л).
Метод ЭХ Л отражает сложные, многоплановые процессы, развертывающиеся в биомембранах, находящиеся в тесной взаимосвязи с реакцией свободнорадикального окисления.
Предполагают, например, что динамика ЭХ Л сыворотки крови коррелирует со степенью тяжести лучевого поражения.
Попытки количественно связать суммарные свободнорадикальные изменения в клетке при облучении с величиной поглощенной ею дозы радиации приводили к поиску упрощенных биофизических методов и приемов, например, метода привитой сополимеризации.
Метод, предложенный Ю.П. Козловым (1965), основан на способности свободных радикалов катализировать полимеризацию некоторых ненасыщенных химических соединений. Измеряя скорость полимеризации, можно определять содержание свободных радикалов в системе. Свободные радикалы макромолекул взаимодействуют с ненасыщенными соединениями в результате захвата электрона из электронной пары ненасыщенной углеродуглеродной связи с образованием нового соединения — привитого сополимера. Количество свободных радикалов соответствует количеству «активных центров» полимеризации, которое пропорционально молекулярной массе образующегося за определенное время привитого сополимера. Так удалось получить сополимеры крахмала со стиролом, льняного масла и олеиновой кислоты с акриламидом, желатина и целлюлозы с акрилонитрилом и др.
Свободнорадикальные процессы в облученных организмах (реакция полимеризации с использованием винилпирролидона, акриламида) в разных тканях облученных животных не одинаковы. Так, в одной группе тканей и клеток (головной мозг, скелетные мышцы, эритроциты) после облучения животных в дозах 6-15 Гр не обнаружены пострадиационные изменения содержания свободных радикалов; в другой (печень и почки) происходит усиление процесса сополимеризации на первые-вторые сутки после облучения; в третьей группе (плазма крови, селезенка) наблюдаются фазовые изменения количества свободных радикалов в ткани. В плазме крови в течение двух суток после облучения происходит непрерывное увеличение концентрации свободных радикалов, интенсивность накопления которых зависит от дозы излучения в широком диапазоне. Еще ранее было показано, что основное количество активных оксипродуктов («радиотоксинов») возникает в тканевых ненасыщенных липидах, количество токсических продуктов возрастает в зависимости от величины дозы и времени, прошедшего после облучения (Ю. Б. Кудряшов, 1956, Е. Н. Гончаренко и сотр., 1968).
Фундаментальные исследования, экспериментально подтвердившие важнейшую роль свободных радикалов и антиоксиданов, регулирующих их уровень, в развитии лучевого поражения клетки и организма проводились в радиобиологических школах Н. М. Эмануэля и Б. Н. Тарусова. Получены многочисленные данные, указывающие на связь между количеством индуцируемых излучением свободных радикалов и степенью лучевого поражения клеток. Большинство таких данных получено с использованием методов, позволяющих регулировать уровень и дальнейшее превращение свободных радикалов в облученной клетке.
Следует отметить, что для проведения тонких радиобиологических исследований чувствительность упомянутых методов часто оказывается недостаточно высокой. Так, в биологических системах скорости образования свободных радикалов часто оказываются на границе пределов чувствительности метода определения содержания радикалов; вместе с тем скорости деградации радикалов достаточно велики, поэтому исследуемая концентрация радикалов в каждый момент времени оказывается низкой. Поэтому в радиационной биофизике успешно применяются такие методы, как «спиновые ловушки» в методе ЭПР и «активатор свечения» в методах ХЛ и ЭХЛ.
В радиобиологических исследованиях по изучению свойств свободных радикалов, возникающих в липидах, белках и нуклеиновых кислотах облученных клеток, успешно применяется метод обменных реакций свободных радикалов с ингибиторами радикальных процессов («метод ингибиторов», «метод добавок»).
Для этого используются вещества — ингибиторы радикальных процессов, которые вступают в обменные реакции со свободными радикалами, заменяют активные радикалы на неактивные и защищают тем самым животных и исследуемые системы от лучевого поражения. Обменные реакции синтезированных ингибиторов с радикалами в облученном организме контролировались методами ЭХЛ, привитой сополимеризации и ЭПР-спектро- скопии.
С помощью метода ингибиторов Н. М. Эмануэлю, Е. Б. Бурлаковой и сотр. удалось, например, показать возможность обменных реакций радикалов ДНК с ингибитором радикальных процессов. Методика эксперимента позволила количественно определить гидроксильные радикалы, гидратированные электроны, радикалы ДНК, а также радикалы, возникающие при добавлении ингибитора.
Показано, что сразу после облучения раствора ДНК с ингибитором происходит возрастание концентрации радикалов в ДНК, затем их концентрация уменьшается и появляется радикал ингибитора. В качестве ингибитора радикальных реакций применялся пропиловый эфир галловой кислоты. Используя другие ингибиторы, удалось обнаружить такую закономерность: чем выше антирадикальная активность, тем лучше препараты защищают молекулы ДНК от радиолиза.
Аналогичные закономерности обнаружены и при изучении свободнорадикальных процессов в облученных липидах. Ингибиторы в модельных опытах реагировали с радикалами липидов, накапливающимися в результате облучения, и снижали интенсивность окислительных свободнорадикальных реакций, индуцированных ионизирующим излучением.
Основополагающие выводы о роли свободных радикалов в лучевом поражении были подтверждены в зарубежных и отечественных исследованиях и значительно расширены, особенно в последние 10-20 лет.
Принципиально новые методические усовершенствования (селективной ион-масс-спектрометрии, рентгеноэлектронной и атомной спектроскопии, ЭПР, различных видов хроматографии, активированной ХЛ и биолюминесценции), использование радиоактивных индикаторов, применение модификаторов свободнорадикальных состояний и др. (Л. Дж. Мернетт, 2000) создали основу для высокочувствительной и специфической идентификации вызываемых активными кислород-содержащими соединениями — АКСС (в том числе оксирадикалами и активными соединениями азота) — повреждений биологических мембран и ДНК.
В предыдущей главе оценивалась возможность образования ППОЛ и их участие в непрямом механизме действия ионизирующих излучений. Использование новых методов анализа ядерной ДНК показало, что многие эндогенные оксидазные модификации этой макромолекулы в облученной клетке и в клетках организма являются результатом действия на ДНК АКСС. При помощи этих методов исследования расшифрована химическая структура оксирадикалов и продуктов их взаимодействия с ДНК, а также с другими биомакромолекулами.
Таким образом, активные кислород-содержащие соединения — АКСС — принимают непосредственное участие в зарождении и развитии нарушений системы окислительно-восстановительного равновесия в облученной клетке.
Остановимся подробнее на этой проблеме, учитывая при этом проявление в ней качественно нового, системного клеточного ответа на облучение. Изменению регуляции окислительно-восстановительного гомеостаза при действии ионизирующей радиации посвящен следующий раздел этой главы.
Система окислительно-восстановительного гомеостазаклетки и ее изменения после облучения
Известно, что система окислительно-восстановительных процессов составляет основу жизнедеятельности клетки и организма, а кислород играет ключевую роль в энергетике дыхания нормальных аэробных клеток, являясь единственным акцептором электронов.
Основное количество молекулярного кислорода в клетке — 9098% расходуется в реакциях тканевого дыхания и микросомального окисления, катализируемых соответственно митохондриальной цито- хромоксидазой, а также и другими оксидазами, в результате чего в дыхательных цепях происходит запасение энергии и осуществляется четырехэлектронное восстановление О2 с образованием двух молекул воды:
О2 + 4е" + 4Н 2Н2О. (VI.7)
Значительно реже под действием ферментов — оксигеназ — происходит включение одного из атомов кислорода в биоорганические молекулы:
О2 + М + 2Н МО + Н2О. (VI.8)
Так, важную роль в окислении ненасыщенных липидов играют ферментные реакции, катализируемые липоксигеназами и циклооксигеназами — первыми ферментами на путях образования специфических регуляторов метаболизма — эйкозаноидов.
Около 2% поглощаемого кислорода восстанавливается самопроизвольным, неферментативным путем. Эти реакции всегда начинаются с присоединения к молекуле О2 одного электрона и образования ани- она-радикала (содержащего неспаренный электрон) — супероксида О2 (см. также (V.29)):
О2 + е" OJ. (VI.9)
Донорами электронов в клетке служат Ре2+, Сп+, семихинон и другие промежуточные участники процессов тканевого дыхания, а под воздействием ионизирующей радиации, как известно, электроны генерируются вследствие ионизации воды и биоорганических молекул.
В основном состоянии молекулярный кислород парамагнитен — представляет собой триплет — «бирадикал», т. е. имеет два неспаренных электрона (с параллельными спинами) на различных орбиталях. По этой причине прямые, неферментативные реакции с кислородом могут осуществляться по свободнорадикальным механизмам. Большинство органических молекул синглетны (электроны с анти- параллельными спинами), поэтому, вследствие различий с триплетным кислородом в направлении спинов, их реакции с молекулярным кислородом из-за спиновых запретов затруднены и протекают очень медленно. Кинетические барьеры одноэлектронного восстановления кислорода в клетке достаточно высоки, поэтому образование супероксида процесс медленный, однако он очень важен для формирования системы окислительно-восстановительного гомеостаза в клетке, так как О2 участвует в генерации многих окислителей — активных кислород-содержащих соединений — АКСС (табл. VI.2).
Активные кислород-содержащие соединения — образование и биологическое действие в клетке в норме и после облучения
Как видно из табл. VI.2, к АКСС отнесены активные формы кислорода (АФК), активные соединения азота (АСА) и продукты перекисного окисления липидов. Выступая в качестве сигнально-пусковых молекул, OJ, а также Н2О2, ОН' и NO' запускают каскад реакций поддержания окислительно-восстановительного гомеостаза в клетке.
В отличие от многих других биологически активных соединений, АКСС неспецифичны, так как вступают в реакции не со специально «предназначенными» к ферментативному окислению субстратами дыхания, а непосредственно с любыми восстановленными веществами R—Н (липидами, ДНК, белками), образуя гидропероксиды RiOOH.
Название
Символ
Содержание в клетке (в норме), моль/л
Полупериод жизни в секундах при 37 °C
Свойства
Относительная активность *)
Молекулярный кислород
кислород в основном, триплетном состоянии
X 02
[Ю-6]
> ю2
способен к диффузии через биомембраны
слабый окислитель
Активные формы кислорода (АФК)
супероксидный анион — радикал кислорода
01
[10-11]
ю-6
сигнально-пусковые функции в цитоплазме; через биомембраны не проникает
0
гидроперокси-радикал (пергидроксид)
НОз
[Ю"11]
10"8
способен к диффузии и оксидазной модификации
1
синглетный кислород
^2
[Ю"11]
10"6
способен к диффузии и выраженной оксидазной модификации
10
пероксид водорода
Н2О2
[10-8]
10 102
сигнально-пусковые функции; диффундирует на большие расстояния
> 1
гидроксид- р адикал
ОН'
< [пг11]
10"9
диффундирует на короткие расстояния; очень высокая оксидазная модификация
ю7
Таблица VI.2. Содержание и некоторые характеристики кислорода и АКСС в интактной клетке
222 Гл. VI. Реакции клетки на действие ионизирующих излучений
Название
Символ
Содержание в клетке (в норме), моль/л
Полупериод жизни в секундах при 37 °C
Свойства
Относительная активность
Активные соединения азота (АСА)
моноксид азота- радикал
NO'
[Ю-6]
0,1-6,4
Сигнально-пусковые функции; диффундирует на большие расстояния
не измерен
пероксинитрит
ONO^
< [Ю-6]
1-2
диффундирует на большие расстояния; высокая оксидазная модификации
ю2
Продукты перекисного окисления липидов (ППОЛ)
алкокси л- р адикал
LO'
[10-6]
10"6
инициирование цепной реакции ПОЛ
104
перокси л- р адикал
lo2
[Ю-6]
кг2
инициирование цепной реакции ПОЛ
1
молекулярные продукты ПОЛ
LOOH, lo2, R-LO
[10-6]
10-2 1
высокая способность к диффузии и оксидазной модификации
ю2
Продолжение таблицы VI.2
*)По А. А. Болдыреву (2001) и данным автора.
. Система окислительно-восстановительного гомеостаза клетки 223
Схематично это можно представить в виде
АКСС + R—Н RiOOH. (VI.10)
Принято процесс образования гидропероксидов называть пероксидацией ^перекисным окислением), а действие АКСС на молекулы в клетке — «оксидазной модификацией».
Взаимодействуя с липидами (L), АФК и АСА способствуют ал- коксил- и пероксил-радикалообразованию и активации тем самым самоускоряющихся цепных реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Главными субстратами ПОЛ в клетке являются полине- насыщенные жирные кислоты, а конечными продуктами — эпоксиды, кетоны, альдегиды.
Под влиянием АКСС-продуктов ПОЛ (ППОЛ) в интактной клетке образуются аддукты ОРТ с ДНК, обладающие цитотоксическим, цитогенетическим и канцерогенным эффектами. Эти эффекты проявляются в зависимости от уровня накапливающихся АФК, находящихся под многоплановым контролем антиокислительной системы в клетке. Оказывая оксидазное действие, они способны вызывать клеточную гибель путем апоптоза и радиационно-индуцируемую нестабильность генома.
Из табл. VI.2 видно, что большинство АКСС обладают относительно короткой продолжительностью жизни и находятся в низких, стационарных концентрациях. Однако это не препятствует активным продуктам выполнять важные для нормальной клеточной жизнедеятельности физиологические функции.
Рассмотренные представления, а также вывод о повреждающих эффектах избытка свободнорадикальных или радикалообразующих продуктов одноэлектронного восстановления кислорода в биологических системах доминируют в литературе на протяжении последних двух-трех десятилетий. Это относится прежде всего к АФК, АСА, а также ППОЛ, образующихся в цепных процессах липопероксидации в биологических мембранах и накапливающихся, в частности, в жидкой фазе клетки при распаде гидроперекисей липидов — LOOH.
Значительный вклад в исследования механизмов образования и биологического действия ППОЛ был сделан специалистами в области радиационной биофизики и молекулярной биологии, показавшими, что окислительно-деструктивные процессы, вызываемые повышенным уровнем АКСС в конденсированной водной фазе и в биологических мембранах, лежат в основе клеточной патологии при многих заболеваниях (см. раздел «Радиотоксины»).
Центральным звеном в поддержании в клетке окислительно-восстановительного равновесия является образование АФК.
5. Система окислительно-восстановительного гомеостаза клетки
АФК обнаруживаются в клеточных органеллах. Главными местами их образования являются митохондриальная, ядерная, плазматическая и микросомальная мембраны у животных, хлоропласты и хро- матофоры у растений.
В клетке существуют ферментный и неферментный пути образования АФК. Метаболические, ферментные пути образования АФК, участвующие в нормальной жизнедеятельности клетки, представлены в схеме Бурлаковой-Михайлова-Мазурика (рис. VI.1).
В ферментной генерации АФК участвуют: дыхательная цепь митохондрий и система микросомального окисления, системы оксидаз (ксантин-, флавин-, НАДФ.Н*-оксидазы) и цитохромов, глутатионпероксидаза и супероксиддисмутаза (СОД).
Неферментативное образование основных АФК и их превращения происходят по схеме, изображенной на рис. VI.2, в следующих реакциях.
Рис. VI.2. Схема последовательности образования АФК в клетке в цепи неферментного одноэлектронного восстановления кислорода до воды (названия продуктов см. в табл. VI.1)
Образование «надперекисного» анион-радикала кислорода — супероксида Оз представлено реакцией (VI.9).
При слабокислых значениях pH супероксид образует протонированную форму — гидропероксирадикал-Н-О"^-
Оз + Н+Щно^.(VI.11)
При недостатке супероксиддисмутазы в присутствии металлов переменной валентности может произойти спонтанная дисмутация супероксидов и образование синглетного кислорода ХО2:
(Ц + СЦ + 2Н+ + Ге3+ —> Н2О2 + Ге2+ + Щ. (VI.12)
Синглетный кислород, содержащийся в хлоропластах растений и в зрительных рецепторах животных, занимает особое место среди АФК. Образование его здесь связано не только с реакцией (VI. 12), а преимущественно с фотохимическими процессами. Поглощая квант света, пигмент-фотосенсибилизатор переходит в синглетное, а затем в триплетное возбужденные состояния. В обоих возбужденных состояниях молекулы пигмента взаимодействуют с молекулярным кислородом, передают ему свою энергию и превращают его в активный окислитель.
Супероксид при взаимодействии с органическими биомолекулами обладает слабой реакционной способностью, так как имеет невысокий окислительно-восстановительный потенциал. Однако он выполняет важную роль, продолжая дальнейшую цепь одноэлектронного восстановления кислорода путем образования молекулы пероксида (перекиси) водорода Н2О2.
Пероксид водорода — сильный окислитель и образуется при реакции супероксида с электроном и двумя протонами:
Оз ++ 2Н+Н2О2.(VI.13)
В другой реакции (рис. VI. 1) пероксид водорода появляется вследствие рекомбинации (дисмутации) двух супероксидов, уже под влиянием фермента супероксиддисмутазы (СОД):
Оз + Оз + 2Н+ Н2О2 + О2.(VI.14)
Цепь одноэлектронного восстановления продолжается образованием из перекиси водорода еще более сильного окислителя — гидроксид- радикала ОН':
Н2О2 + е" + Н+ ОН*.(VI.15)
В клетке ОН' может появиться также за счет других реакций — реакции Фентона из пероксида водорода при участии ионов Ре2+ (или Сп2+):
Н2О2 + Ее2+ОН' + ОН+ + Fe3+,(VI.16)
а также реакции Хабера-Вейса:
Н2О2 + OJОН' + ОН- + о2.(VI.17)
Гидроксид-радикал завершает неферментный одноэлектронный процесс восстановления кислорода:
ОН' + с” + Н+ Н2О.(VI.18)
Экспериментально показано, что гидроксид-радикал относится к наиболее эффективным окислителям АКСС (и, соответственно, АФК) (табл. VI. 1).
Биологическая роль АФК может осуществляться в жизненно необходимых реакциях иммунитета и воспаления: АФК способствуют образованию цитокинов и иммунных рецепторов, миграции лейкоцитов в «аварийные ткани», выполняют бактерицидную функцию в фагоцитозе. Так, в макрофагах и нейтрофилах АФК реализуют процесс повреждения и разрушения макромолекул, вредных микроорганизмов, попавших в организм, а также старых, поврежденных и ставших генетически чужеродными клеток. Поглощая повышенное количество кислорода, защитные клетки с помощью встроенного в плазматическую мембрану фермента НАД(Ф)Н-оксидазы (рис. VI. 1) производят реакцию «кислородного взрыва» («дыхательного всплеска»)быстро образуя необходимые ударные концентрации супероксида:
О2 + НАД(Ф)Н 20^ + НАДФ+ + Н+.(VI.19)
Вслед за этим также резко накапливаются перекись водорода, гидроксильный радикал и другие АКСС, «сжигающие макромолекулы на своем пути».
Известно, что возрастающий уровень ХО2 может быть причиной обновления «отработанных» субклеточных компонентов фоторецепторов, а также фотодинамического действия пигментов в клетках, не имеющих фоторецепторных систем.
В конце XX в. получены данные о способности АФК выполнять сигнальную функцию в клеточной регуляции. Показано, что АФК стимулируют накопление цАМФ и цГМФ, ионов Са2+ в цитозоле, активацию протеинкиназ, протеинтирозинкиназ и подавление активности протеинфосфатаз. Помимо стимуляции процессов фосфорилирования белков, АФК активируют и белок Ras, участвующий в передаче сигналов в ядро клетки.
Вопрос о биологической роли АФК находится также в связи с инициированием ими значимых процессов в клетке — перекисного окисления липидов.
Так, в 1983 г. К. Фонг и соавт. предположили возможность непрямого участия О2 в пероксидации липидов посредством образования радикалов ОН ,L иLO:
ОТ + АДФ-Ее3+ —> О2 + АДФ-Ее2+,
АДФ-Ге2+ + Н2О2 —> АДФ-Ее3+ + 2ОН",
(VI.20)
ОН' +LH —> L' +Н2О,
или ОН" + LOOH —У LO + Н2О.
Через несколько лет была показана возможность прямого взаимодействия О2 с гидроперекисями липидов LOOH и образования радикалов LO :
GJ + LOOH —> LO + ОН' + О2.(VI.21)
Однако вопрос о прямом участии супероксида в процессе перекисного окисления липидов все еще оставался дискуссионным. Причиной этому — игнорирование аскорбатзависимого пути пероксидации липидов, не требующего участия 0^. Аскорбиновая кислота, так же, как и супероксидный анион-радикал, поддерживает (регенерирует) хелатированные ионы двухвалентных металлов Ге2+, Си2+ в стационарных концентрациях и обеспечивает многократное участие их в актах инициирования и разложения гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот — исходных продуктов перекисного окисления липидов. Естественно, что аскорбатзависимый процесс не тормозится СОД, так как супероксид в этом процессе не участвует. Супероксидзависимый процесс липопероксидации — это самостоятельная реакция, которая подавляется СОД или неферментным путем, например, катехоламинами, комплексами меди с аминокислотами, перехватчиками гидроксильных радикалов (Томас, Сазерленд и др.).
В настоящее время окончательно установлено, что АФК способны инициировать цепные реакции липопероксидации в норме, а их избыток — усиливать цепные процессы при лучевом поражении и других физических и химических воздействиях.
Непрямой эффект радиации при радиолизе воды в облученной клетке был изучен давно. Однако биологическое действие ОН' и других АКСС в норме и в механизме усиления радиационных повреждений более полно стало раскрываться только в последние 10-20 лет.
Гидроксид-радикал — чрезвычайно активный окислитель и способен разрушать фактически любую находящуюся рядом с ним молекулу в клетке. При взаимодействии с нуклеиновыми кислотами он вступает в реакции с азотистыми основаниями, образуя продукты их повреждения, а также разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и вызывает разрывы цепей ДНК и РНК. Благодаря этому ОН' способен вызывать мутации и гибель клеток. Взаимодействуя с другой мишенью — биологическими мембранами (БМ), гидроксид-радикал внедряется в липидный слой, инициирует цепные реакции липопероксидации, приводит тем самым к нарушениям структуры и функции мембран, инициируя процессы гибели клеток. При облучении клетки в больших дозах, действуя на тиольные белковые молекулы, ОН' денатурирует их и инактивирует ферменты.
Все же следует оговориться, что время жизни ОН' небольшое (табл. VI.2) и гидроксид-радикал успевает диффундировать лишь на один-два молекулярных диаметра, взаимодействуя лишь с молекулами близлежащих компонентов клетки. Поэтому вероятность прямого взаимодействия его с ядерной ДНК малая. Диффундирующей «скрытой» формой гидроксид-радикала является пероксид водорода — более длительно живущая АФК, содержащаяся в клетке в относительно больших количествах (табл. VI.2). Молекула Н2О2 (вступая в реакцию с ионом металла) «доставляет» ОН" в мембранные структуры и ядро клетки.
Важнейшую роль в протекании окислительно-восстановительных реакций, к продуктам которых относятся АФК-прооксиданты, играет и недавно открытая система NO, выполняющая функции регулятора многих ключевых физиологических и биохимических процессов.
Активные формы кислорода
К активным формам кислорода относятся свободные радикалы — супероксидный анион-радикал (супероксид), гидроксид- и гидропероксид (пергидроксид)-радикалы и нейтральные молекулы — пероксид водорода и синглетный кислород (табл. VI.2, рис. VI. 1, VI.2).
Ю. Б. Кудряшов
Рис. VI. 1. Метаболическая генерация активных форм кислорода в клетке. В заштрихованных овалах — сенсорные молекулы, всветлых кругах — молекулы прооксидантов
Активные соединения азота
В последние два десятилетия проведены фундаментальные исследования, открывшие новую страницу в молекулярной биологии: установлено, что, казалось бы, простое химическое соединение — моноксид азота NO, образующееся в организме из L-аргинина ферментативным путем (рис. VI.3), — выполняет функции одного из наиболее универсальных регуляторов метаболизма.
Суммарное уравнение ферментной реакции образования NO, включающее пятиэлектронное окисление атома азота (N^- —^N^-) аргинина (L-аргинин — Apr — превращается в L-цитруллин — Цит),
L-аргининL-цитруллин
Рис. VI.3. Образование NO в ходе NO-синтазной реакции. Один из гуанидиновых атомов азота L-аргинина окисляется молекулярным кислородом в NO при участии фермента NO-синтазы. Пунктиром отмечены химические группировки, участвующие в модификации при образовании NO и L-цитруллина
сопряженное с окислением НАДФ.Н, имеет вид:
2 Арг+3 НАДФ.Н+4 О2+3 Н+ = 2 Цит+2 NO+3 НАДФ++4 Н20.
(VI.22)
Ферментная реакция генерации моноксида азота обеспечивается изоформами эндотелиальной и нейрональной NO-синтаз. В 1998 г. В. П. Реутов и Е. Г. Сорокина сформулировали концепцию цикла оксида азота, согласно которой электронодонорные системы, содержащие НАДН, НАДФ.Н, флавопротеиды и восстановленные гемсо- держащие белки, находящиеся в дезоксиформе, обладают нитрит- редуктазной активностью и способны замкнуть цепочку в цикл. Авторы предложили следующую схему метаболических превращений: L—аргинин —> ’NO —> NO^/NO^ (рис. VI.4).
Обнаружено, что активные соединения NO выполняют многообразные физиологические регуляторные функции в организме, выступая в качестве антагониста адренергической нервной системы, регулирующего по эфферентным нервам деятельность дыхательной, мочеполовой, мышечной, секреторной, сосудистой и других систем. Установлено активирующее действие NO на растворимую форму важнейшего внутриклеточного регуляторного белка — гуанилатци- клазы — фермента, ответственного за синтез одного из вторичных мессенджеров — цГМФ.
Малые размеры двухатомной газообразной молекулы NO и отсутствие заряда позволяют ей легко проникать через плазматические и внутриклеточные мембраны. Молекулы моноксида азота легко диффундируют в биологических средах и являются относительно долгоживущими.
Так, среднее время жизни NO в клетке составляет 5,6 с (табл. VI. 1). (Д/2 ег° существования в почечной ткани крыс 6,41 с, в миокарде — 0,1 с,
Рис. VI.4. Схема образования NO и цикла оксида азота. NO-синтазная (NO—S) и нитроредуктазная (NO-—R) компоненты цикла оксида азота в клетках млекопитающих: 1 — образование NO в результате NO-синтазной реакции; 2 — окисление NO в ионы NO^~ и NO^"; 3 — восстановление NO^~ в NO при участии нитроредуктазных систем
в физиологическом растворе — от 6 до 30 с. В воде, из которой удален кислород, NO сохраняется несколько суток).
Наряду с нормальными регуляторными функциями, NO, образуясь в фагоцитах в больших концентрациях, проявляет цитотоксическую активность, обнаруживая эффекторные свойства системы клеточного иммунитета.
Установлено также, что длительная генерация NO способна вызывать патологию различного генеза. Так, наряду с другими АКСС, оксид азота и его производные являются ключевыми факторами воспаления, инфекции, канцерогенеза, а также развития радиационных, стрессорных и адаптивных ответов клеток и организма на соответствующие воздействия.
Показано, что цитотоксические и цитогенетические эффекты обусловлены образованием чрезвычайно активного окислителя — пероксинитрита (табл. VI.2), возникающего в реакции взаимодействия оксида азота с супероксидным анион-радикалом:
или протонированной формой пероксинитрита:
*N=0 + *0-0" + Н+ 0=N—О—ОН. (VI.24)
Как видно, пероксинитрит представляет собой связующее звено двух высокоактивных низкомолекулярных кислород- и азотсодержащих систем: АФК и АСА (активные соединения азота). Пероксинитрит может разлагаться с образованием гидроксид-радикала:
0=N—О—ОН 0=N-0* + ОН*. (VI.25)
Протонированный пероксинитрит так же, как и пероксид водорода, выполняет функции диффундирующей «скрытой» формы гидроксид-радикала.
Установлено, что пероксинитрит и его протонированная форма, диффундируя в клетке и проникая через мембраны с помощью переносчиков анионов, имеют уникальный спектр химической реактивности: разрывы цепочек и окисление оснований ДНК, нитрование гуанина и белков, окисление липидов биологических мембран и т. д. Результатом многих таких реакций могут быть цитогенетические эффекты и мутагенез.
NO является источником не только пероксинитрита и гидроксид- радикала, но и синглетного кислорода, который образуется при реакции моноксида азота с пероксидом водорода.
Сильные окислители 'NO и 0N0^~, обладая высокой реакционной способностью, могут влиять на цепные свободнорадикальные реакции. Их оксидазная активность во многом связана со способностью АСА модифицировать уровень продуктов перекисного окисления липидов.
Продукты цепных реакций перекисного окисления липидов
Перекисное окисление липидов исследовано не только в модельных системах (см. гл. V), но и на всех уровнях организации живого и имеет свои особенности в норме и патологии клетки.
Известно, что биологические мембраны способны подвергаться интенсивной окислительной деградации, так как ненасыщенные участки жирных кислот (линоленовой, арахидоновой и др.) фосфолипидов чрезвычайно чувствительны к окислению.
Многочисленные данные молекулярной биологии показали, что при различных патологиях, в том числе и при лучевом поражении, одной из первых клеточных структур повреждается мембрана митохондрий.
Митохондрия — «главная дышащая органелла клетки» (В. П. Скулачев, 2001), содержащая большое количество ферментов и коферментов (переносчиков электронов в дыхательной цепи) — главных участников клеточной регуляции системы окислительно-восстановительного гомеостаза.
Известно, что БМ формируют элементы цитоскелета и ультраструктуру клетки. Они выполняют разнообразные барьерно-матричные функции, нарушение любой из которых может привести к нарушениям жизнедеятельности и в конечном итоге — к гибели клетки. Особенно уязвим липидный слой БМ.
Лучевые оксидативные изменения структуры и функций БМ (повреждения фосфолипидного барьера) приводят к дальнейшему нарушению регуляции окислительно-восстановительного равновесия, возрастанию мембранной проницаемости, дезинтеграции внутриклеточных процессов, выравниванию градиентов с фатальным для клетки исходом.
Большое содержание полиненасыщенных жирных кислот в фосфолипидах определяет высокую способность БМ к неферментным цепным реакциям окисления и образованию инициаторов и продуктов окисления, обладающих оксидазной активностью. В результате цепных реакций липопероксидации образуются свободные радикалы (БО’-алкоксил-радикалы, БО^-пероксил-радикалы), гидропероксиды — LOOH и другие молекулярные ППОЛ.
Из табл. VI.2 видно, что содержание таких продуктов в клетке относительно высокое, время существования — довольно значительно, и это создает условия для окисления ими практически любых макромолекул в клетке (ДНК, белков, ферментов и др.).
Первичная роль в зарождении неферментивных цепных процессов ПОЛ в клетке, как и in vitro, принадлежит свободным электронам, донорами которых могут служить Ре2+, Сп2+, семихиноны; сигнальнопусковыми продуктами являются, как известно, OJ, Н2О2, ОН' и NO’. В инициировании цепных реакций могут принимать участие и другие продукты АКСС, проникающие в липиды БМ.
Биологическая значимость цепного процесса, инициированного в клетке, заключается в том, что он способствует накоплению токсических продуктов окисления в связи с их многократным циклическим воспроизведением.
Цепной процесс липопероксидации в клетке протекает в такой последовательности:
Молекулы ненасыщенных жирных кислот липидов LH окисляются преимущественно радикалом ОН’ (или другими АКСС):
LH + ОН’ Б’ + Н2О.(VI.26)
Образовавшиеся радикалы липида Б’ претерпевают в клетке дальнейшее окисление с помощью молекулярного кислорода или с большей вероятностью — АКСС (АФК, NO-системами). Появляются пероксил-БО^- и алкоксил-БО’-радикалы:
Б’ + О2 ^БО',
Б +Н2О2 ^БО‘+Н2О.
Реакции (VI.26) и (VI.27) имеют низкие энергии активации и высокие константы скорости, величины которых зависят от окисляющегося соединения БН (например, степени ненасыщенности липида) и типа окислителя — АКСС.
В «топку сгорания» подбрасываются новые порции восстановленных молекул липидов LH, которые, окисляясь алкоксил-ра- дикалом, образуют замкнутую цепь образования радикалов L’:
LH + 2LO’ 2L' + LOOH.(VI.28)
То же может происходить и с помощью образующихся пероки- сил-радикалов LO2:
LH + LO2 L' + LOOH.(VL29)
В процесс вовлекаются все новые и новые молекулы липидов LH и активных форм кислорода. В результате накапливаются гидропероксиды LOOH. Число радикалов L’, LO' (или LO2) не изменяется (принцип неуничтожимости свободной валентности, «бессмертия свободных радикалов»), хотя структурно радикалы могут отличаться друг от друга.
Образующиеся липидные гидропероксиды вступают в реакцию с радикалами ОН' (которые могут мигрировать в клетке на большие расстояния с помощью пероксида водорода или пероксинитрита) :
2LOOH + 2ОН’ L' + 2Н2О2 + LO2
(VI.30) или LOOH + ОН' LO’ + Н2О2
или с радикалом LO':
2LOOH + 2LO' —> 2L* + Н2О2 + 2LO2(VLSI)
и осуществляют вторичное инициирование цепи реакции и протекание разветвленных свободнорадикальных цепных процессов.
При окислительном распаде липидных гидропероксидов образуются высоко лабильные ППОЛ, представляющие собой жирнокислотные фрагменты, содержащие пероксидные, эпоксидные, альдегидные и кетонные группы. Лишь в последние годы, благодаря применению высокочувствительных аналитических методов, удалось идентифицировать некоторые из ППОЛ (см., в дальнейшем, рис. VI.8-VI.10) и показать исключительно важную их роль в биологии клетки.
Таким образом, цепной процесс липопероксидации в клетке может быть представлен в виде схемы, изображенной на рис. VI.5.
Гидропероксид L — LOOH — и образованные им конечные продукты ППОЛ содержатся в клетке в норме на стационарном уровне, не превышающем 1 мкмоль/л (табл. VI.2). При действии ионизирующих излучений этот уровень возрастает, и вследствие усиления цепного процесса многократного накопления конечных ППОЛ образуется их избыток (ЛРТ, рис. VI.5), оказывающий токсическое действие на клетку.
Рис. VI.5. Схема цепных свободнорадикальных процессов перекисного окислениялипидов (липопероксидации) в клетке. Объяснения в тексте. Обозначения: LH —восстановленные молекулы липида, L' — радикал липида, LO' — алкоксил-ради-кал, LOg — пероксил-радикал, ДН — донор водорода
Таблица VI.3. Регуляторные и модифицирующие влияния продуктов перекис-ного окисления липидов на биологические мембраны
ругуляция пассивного иактивностьустановление и сохранение в нормеразборка и обновлениеактивногосистемыфункционированиябиомембран;транспортаклеточной«мембранныхуниверсальионов ирегуляциимашин» и энергетикиная модифивеществ(цАМФ,клетки: ферментов,кация еечерез мембрануцГМФ)рецепторов, каналообразователейструктуры и свойствругуляция пассивного иактивностьустановление и сохранение в нормеразборка и обновлениеактивногосистемыфункционированиябиомембран;транспортаклеточной«мембранныхуниверсальионов ирегуляциимашин» и энергетикиная модифивеществ(цАМФ,клетки: ферментов,кация еечерез мембрануцГМФ)рецепторов, каналообразователейструктуры и свойствСтационарный уровень ППОЛСтационарный уровень ППОЛ
ругуляция пассивного и
активность
установление и сохранение в норме
разборка и обновление
активного
системы
функционирования
биомембран;
транспорта
клеточной
«мембранных
универсаль
ионов и
регуляции
машин» и энергетики
ная модифи
веществ
(цАМФ,
клетки: ферментов,
кация ее
через мембрану
цГМФ)
рецепторов, каналообразователей
структуры и свойств
ругуляция пассивного и
активность
установление и сохранение в норме
разборка и обновление
активного
системы
функционирования
биомембран;
транспорта
клеточной
«мембранных
универсаль
ионов и
регуляции
машин» и энергетики
ная модифи
веществ
(цАМФ,
клетки: ферментов,
кация ее
через мембрану
цГМФ)
рецепторов, каналообразователей
структуры и свойств
Стационарный уровень ППОЛ
Стационарный уровень ППОЛ
Радиационно-биофизические исследования цепных свободнорадикальных механизмов вызвали резкий приток работ, посвященных роли липопероксидации в патогенезе очень многих, самых разнообразных клеточных патологий и заболеваний организма. Однако не менее важными являются и другие работы, на основе которых сформировались представления и о биологической роли ППОЛ в условиях физиологической нормы.
Процессы ПОЛ широко распространены в нормальной жизнедеятельности клетки. Биологическая роль ППОЛ и их связь с активными формами кислорода и NO подтверждается работами, в которых показано, что синтез тканевых гормонов — простагландинов, лейкотриенов и др. — нуждается в образовании перекисей ненасыщенных жирных кислот. Простагландины и лейкотриены способны активно участвовать в процессах воспаления, влиять на цитотоксичность, дегрануляцию, хемотаксис, агрегацию, адгезию лейкоцитов, синтез цитокинов и др. медиаторов гуморальных клеточных взаимодействий. Образующиеся эйкозаноиды выполняют роль специфических эндогенных липидных биорегуляторов. Продукты цепных процессов окисления липидов принимают активное участие в нормальной жизнедеятельности клетки — в динамике структурообразования и функций БМ и в эндогенной модификации ДНК.
В настоящее время хорошо известна важная биологическая роль взаимного влияния активности ППОЛ и физико-химических свойств липидного бислоя БМ. Так, ППОЛ оказывают значительное влияние на функционирование плазматических и внутриклеточных БМ, обладая способностью включаться в механизмы формирования, разборки и обновления их структуры, являясь физиологическими регуляторами важнейших функций и универсальными модификаторами структуры БМ (Е. Б. Бурлакова, табл. VI.3).
Установлена зависимость интенсивности реакций липопероксидации от степени ненасыщенности жирных кислот и состояния структурной организации биологических мембран: молекулярной подвижности липидов, прочности липид-липидных и белок-липидных взаимодействий.
Рис. VI.6. Схема модификации клеточного метаболизма
Интенсивность свободнорадикальных процессов перекисного окисления липидов, находящихся под контролем АКСС, эндогенных антиокислителей и активности ферментов, взаимосвязана с составом и физическим состоянием фосфолипидов биологических мембран (текучестью, окисляемостью и др.), с чувствительностью их рецепторов к сигналам лигандов. Активация ПОЛ ведет к ускорению выхода легко окисляемых липидов из БМ и обогащению их липидов резистентными к окислению фракциями. Это в свою очередь замедляет скорость ЛПО и возвращает этот процесс к норме.
Изменения скорости ПОЛ, состава и свойств липидов, т. е. структурных характеристик БМ, влияют на активность интегральных белков — ферментов, каналообразующих белков, рецепторов и др.
На рис. VI.6 приведена схема Е. Б. Бурлаковой, иллюстрирующая способность окисленных БМ влиять на клеточный метаболизм.
Окислительные процессы в облученной клетке
Радиационные изменения окислительно-восстановительного равновесия в живых системах начинаются уже сразу, с момента передачи энергии ионизирующих излучений биоорганическим молекулам. Как уже отмечалось в гл. V, в процессе ионизации происходит образование электронов, которые представляют особый интерес с биологической точки зрения, так как вызывают поляризацию и окисление молекул. Электроны в водной среде стабилизируются до гидратированного состояния, превращаясь в e^p, способные диффундировать на значительные молекулярные расстояния и эффективно взаимодействовать с молекулярным кислородом, повышая уровень содержания супероксида О2 (и других окислительных радикалов и продуктов) не только в водных растворах, но и в облученной клетке. Другая часть электронов окисляет биоорганические молекулы, первоначально превращая их в катионы и радикалы. Кроме того, как уже отмечалось, количество сильного радикала-окислителя ОН' возрастает в результате непосредственного радиолиза молекул воды. В облученной клетке так же, как и в водных растворах (гл. V) образуются оксирадикалы и оксипродукты, способные окислять практически любые органические молекулы.
Известно, что ионизирующие излучения могут индуцировать в клетке образование пероксинитрита. Уже первые работы (В. Д. Микоян и др., 1994) показали, что его содержание в облученной клетке возрастает за счет усиления активности NO-синтазы. Накапливающиеся в облученной клетке оксипродукты ОН', Н2О2 и ONO^" высоко эффективны и могут быть отнесены к радиотоксинам ) (АКСС-ра- диотоксины — АКССрт). Важным свойством АКССрт является их «пусковая» способность — инициировать и усиливать цепной процесс перекисного окисления и инициировать образование сильных и относительно долгоживущих окислителей — НПО Л. В облученной клетке избыточно накопленные НПО Л известны под названием «липидных радиотоксинов» (ЛРТ). Они образуются, в основном, при окислении полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов БМ.
Обе группы радиотоксинов АКССрт и ЛРТ объединяются под общим названием оксирадиотоксины (ОРТ). Они вызывают в клетках и тканях облученного организма повреждения, приводящие к так называемому лучевому токсическому эффекту.
В начальный период после облучения в клетке происходит нарушение баланса между образованием ОРТ и антиокислителями. Эти изменения неспецифичны для ионизирующих излучений и известны под названием оксидативного стресса. Вначале при этом защитные
антиокислительные ресурсы клетки активируются и сдерживают выход окислителей из стационарного режима. Затем, по мере развития лучевого поражения, содержание антиокислителей (антиокислитель- ный буфер) постепенно исчерпывается, и накопление радиотоксинов приобретает бесконтрольный характер.
Известно, что содержание АКССрт и ЛРТ может увеличиваться не только в липидах, но и в водной фазе клетки. Поэтому эти продукты способны взаимодействовать с обоими радиационными клеточными мишенями — БМ и ДНК. Результат этих взаимодействий — дальнейшее изменение системы окислительно-восстановительного гомеостаза, перестройка физико-химической регуляции метаболизма в клетке, нарушение барьерно-матричных свойств БМ, образование аддуктов [ОРТ ДНК]. Участвуя в непрямом действии излучений, ОРТ, и в частности ЛРТ, вызывают хромосомные аберрации, мутации, вовлекаются в формирование радиационно-индуцируемой нестабильности генома.
В экстремальной стадии оксидативных повреждений происходят многоэтапные и значительные цитогенетические повреждения мишеней, завершающиеся гибелью облученной клетки.
В связи с изложенным предлагается следующая краткая схема образования и действия оксирадиотоксинов (табл. VI.4).
Радиотоксины
Понятие о радиотоксинах возникло еще в начале прошлого столетия. Ряд немецких радиобиологов-биохимиков вели поиски эндогенных «клеточных ядов», образующихся под действием излучений. Предполагалось, что эти «яды» могли быть гистамином, холином, какими-то иными низкомолекулярными продуктами распада белков. Строились гипотезы о роли этих и других веществ в зарождении и формировании лучевой болезни.
Однако достаточно глубоко рассматривать возникающие гипотезы не представлялось возможным ввиду отсутствия в то время знаний о механизмах действия ионизирующих излучений и данных о химической идентификации веществ, выделяемых из облученных организмов. Позднее делались попытки найти сходство в эффектах облучения и действия бактериальных экзотоксинов или синтезированных препаратов — иприта, эмбихина, мильерана и их аналогов, имитирующих действие ионизирующей радиации (радиомиметиков), а также эндогенных хиноноподобных веществ и липидов.
Радиобиологи ряда лабораторий мира часто обращались к мысли, что многие проявления лучевого поражения можно объяснить образующимися при облучении токсическими веществами. На роль радиотоксинов в развитии лучевого поражения указывали многочисленные исследования по введению экстрактов, выделенных из облученных организмов, интактным биологическим объектам; по дистанционному действию излучений; эксперименты с парабионтами (один партнер —
Стартовые изменения при облучении
Постлучевые изменения
накопление оксирадиотоксинов (ОРТ)
лучевой токсический эффект
ионизация органических молекул (МН) и воды
образование свободных е-
возрастание уровня АКСС-радиотоксинов (АКССрт) ОН', н2о2, ono2 инициирование цепных процессов ПОЛ
усиление цепных процессов ПОЛ О
накопление липидных радиотоксинов (ЛРТ)
влияние ОРТ на структуру и функции БМ**); нарушение барьерноматричных свойств БМ
оксидативный стресс, апоптоз, некроз
влияние ОРТ на структуру и функции ДНК***); образование генотоксических оксиаддуктов [ОРТ^ДНК]
участие в формировании нестабильности генома; хромосомные аберрации, мутации, апоптоз
МН =4 е" д еГИДр =4
оД н2о2 4
=4 е“+О2 ОН'
н2о2+лн о | лрт|
ОРТ => (БМ)
[ОРТ^ДНК]
Н2О = е"+Н2О+ -4
4-
ОН'+ЛН о I ЛРТ I -4
МН =4 е У егидр =4
ОН' t no+o2^ ono2 -д
=4 е“+О2
Н2О2+ЛН о | лрт|
Таблица VI.4. Схема последовательности образования и токсического действия ОРТ*) в облученной клетке
^Характеристику некоторых свойств ОРТ см. в табл. VI.2.
**) Подробнее см. в табл. VI.3 и на рис. VI.6.
***)Химическую структуру отдельных ЛРТ и оксиаддуктов см. на рис. VI.8—VI. 10.
Гл. VI. Реакции клетки на действие ионизирующих излучений
облученный, другой — реципиент); по оценке роли токсемии в патогенезе лучевой болезни; в опытах по повышению радиочувствительности клеток при их пострадиационной инкубации в тканевых культурах, наконец, в исследованиях по влиянию облученной цитоплазмы на необлученные ядра клеток.
Все больше укреплялось предположение, что токсичность является результатом появления в облученных клетках избыточных концентраций продуктов обычного метаболизма, но в условиях выхода его из нормального режима, а не появления новых, чуждых для организма веществ.
Подводя итог этим исследованиям, Б.Н.Тарусов еще в 1954 г. отмечал, что анализ развития лучевого поражения во времени позволяет говорить о механизмах усиления незначительных первичных радиационных повреждений — образования активных «первичных токсинов» (тогда еще не идентифицированных), действие которых является пусковым для автокаталитической цепной реакции.
Основываясь на данных радиационной биофизики и химической кинетики, Б. Н. Тарусов (публикации 1957-1962 гг.) выдвинул и развил теорию свободнорадикальных цепных процессов лучевого поражения клетки и организма, сводящуюся в основном к следующим трем положениям.
Ионизирующая радиация не вызывает несвойственные для организма какие-то новые процессы, а активирует свободнорадикальные цепные реакции окисления, находящиеся в интактных клетках в стационарном режиме и обычно протекающие с малой скоростью.
Основным субстратом первичных лучевых цепных процессов перекисного окисления в клетке являются легко окисляемые биолипиды (т. е. фосфолипиды, содержащие полиненасыщенные жирные кислоты).
Процессы перекисного окисления развиваются по кинетике цепных разветвленных реакций в присутствии ингибиторов, поэтому в этих реакциях большое значение приобретает и характер природных ингибиторов окислительных реакций — антиоксидантов, с количеством и качеством которых связана в значительной мере радиочувствительность организма.
Эта теория выдержала проверку временем и явилась основой для многих радиационно-биофизических исследований механизмов лучевого поражения биологических объектов и систем.
Развивая идеи о роли радиотоксинов в облученном организме, А. М. Кузин отмечал, что особое значение для понимания начальных, пусковых лучевых реакций имеет эффект воздействия токсических веществ на структуру и функции БМ и уникальных молекул ДНК.
16 Ю. Б. Кудряшов
Оксиаддукты ДНК
Еще два десятилетия назад основное внимание биологов уделялось экзогенным влияниям излучений, или ксенобиотиков, на ДНК, а возможность повреждения уникальной макромолекулы в процессе нормального метаболизма многими категорически отвергалась. Однако все же стали появляться данные о случаях модификации ДНК при действии избытка НПО Л, накапливающихся в мембранах облученных клеток. Затем стало ясно, что и образующиеся в интактной клетке оксирадикалы способны изменять структуру ДНК. Накапливаясь после облучения, ОРТ в виде идентифицированных продуктов ЛРТ, а именно альдегидов и эпоксидов, взаимодействуют с основаниями ДНК, образуя высокотоксичные оксиаддукты.
В настоящее время с помощью высокочувствительных аналитических методов исследования лабильных структур (см. в этой главе раздел «Свободные радикалы в облученной клетке и методы их определения») показано, что в интактной клетке происходят оксидативные изменения макромолекул геномной ДНК и эти изменения возрастают количественно при канцерогенезе и лучевом поражении. Большим достижением этих работ оказались выводы об образовании в хроматине в процессе клеточного метаболизма ДНК-оксиаддуктов, вызывающих генотоксические эффекты, мутации и клеточную гибель (табл. VI.4).
Наиболее хорошо изучены аддукты с окисленными основанием гуанозина — (8-оксо-дезоксигуанозин, 8-оксо-дГ), а также тимина (ти- мингликоль), цитозина (6-гидрокси-5,6-дигидроцитозин) и урацила (5- гидроксиметилурацил; 5-гидроксиурацил; урацилгликоль) (рис. VI.7).
тимин гликольтимин гликоль8-oxo-dG5-гидроксиметилурацил8-oxo-dG5-гидроксиметилурацилурацил гликольурацил гликоль6гидрокси-5,6-дигидроцитозин5-гидроксиурацил6гидрокси-5,6-дигидроцитозин5-гидроксиурацил
тимин гликоль
тимин гликоль
8-oxo-dG5-гидроксиметилурацил
8-oxo-dG5-гидроксиметилурацил
урацил гликоль
урацил гликоль
6гидрокси-5,6-дигидроцитозин5-гидроксиурацил
6гидрокси-5,6-дигидроцитозин5-гидроксиурацил
Рис. VI.7. Окисленные основания ДНК
Многие из идентифицированных оксиаддуктов приводят к значительным изменениям структуры хроматина, цитотоксичны, канцерогенны и являются структурной основой мутаций, наблюдаемых в мутантных генах организма (рис. VI.8-VI.10). Показано, что гуаниновые, адениновые и цитозиновые оксиаддукты МДА («МПА») с ДНК (MiG, Mi A, Mi С) обладают мутагенным, канцерогенным и цитотоксическим действием на клетки различных органов и тканей млекопитающих.
Эпоксид ЭГН («EHN»), взаимодействуя с основаниями ДНК, образует этено-аддукты. Они обладают слабым мутагенным и сильным цито-генотоксическим эффектами.
Среди ППОЛ выраженным токсическим действием обладают акролеин и кротоновый альдегид. С основаниями ДНК в клетках они образуют пропано-аддукты — гидроксипропанодезоксигуанозины — ГПДГ, (OH-PdGs), вызывающие мутагенные эффекты.
5.2. Антиокислительные механизмы защиты облученной клетки
Современные фундаментальные исследования по биоэнергетике оказались весьма плодотворными при радиобиологическом изучении механизмов системного ответа клетки на облучение, например, в регуляции окислительно-восстановительного равновесия в клетке. На разных этапах развития лучевого поражения — начиная от момента облучения вплоть до терминальной стадии процесса — подключаются разнообразные средства внутриклеточной антиоксидантной защиты облученной клетки. Облучение вызывает не только повреждение радиобиологических мишеней — БМ и ДНК, но и изменение (мобилизацию и последующее подавление) нормального функционирования системы защиты этих критических для жизнедеятельности клеточных структур.
Проследим последовательность проявления сложнейших и многоплановых механизмов защиты облученной клетки от избыточного образования ОРТ — с момента поступления молекулярного кислорода в клетку до образования при его участии оксирадиотоксинов — ППОЛ (ЛРТ). Схематично это представлено на рис. VI.11.
Снижение содержания молекулярного кислорода и АФК
Гипоксия
Естественно, что наиболее эффективный путь защиты от накопления начальных (соответственно — и последующих) продуктов восстановления кислорода — это снижение в клетке концентрации молекулярного кислорода (рис. VI.11, I).
Интересно, что наиболее эффективным клиническим методом защиты организма от лучевого поражения являются физические и фармако-химические способы создания гипоксии к моменту облучения — профилактическое снижение содержания кислорода в окружающей атмосфере, инъекции препаратов, вызывающих клеточную и тканевую гипоксию и др.
о5 К К ЕС к
О Л
К
Рис. VI.9. Реакция эпоксида ЭРН (2,3-эпокси-4гидроксиноненала) с основаниями ДНК и образование этено-аддуктов
Рис. VI. 10. Пропано-аддукты (ГПДГ)
Нетрудно видеть, что в таких условиях в облучаемой системе вследствие уменьшения содержания кислорода наблюдается пониженный уровень потенциально опасных продуктов окисления (свободных радикалов, оксирадиотоксинов), в чем и проявляется известный в радиобиологии универсальный эффект защиты от облучения.
Однако клетка имеет также и свои разнообразные механизмы защиты от любой (в том числе и радиационной) угрозы образования избытка молекулярного кислорода и компонентов ОРТ (рис. VI.2). К таким механизмам относится, прежде всего, активность митохондриальной цитохромоксидазы, способной поглощать О2, включая его в молекулу воды, и тем самым вносить вклад в защиту клетки путем создания «эндогенной гипоксии».
Рис. VI.11. Схема механизмов защиты клетки от образования и токсического действия ОРТ. Обозначения: LH — восстановленные молекулы липида, L' — радикал липида, LO' — алкоксил-радикал, LOg — пероксил-радикал, ДН — донор водорода, Шн — восстановленный ингибитор, FSHF — восстановленный глутатион, FSSF — окисленный глутатион, R ' — молекула в свободнорадикальном состоянии
Ферментний контроль уровня АФК
Известно, что молекулярный кислород способен легко проникать через биологические мембраны, так как он не имеет заряда и его гидрофобные свойства выражены сильнее, чем гидрофильные (коэффициент распределения кислорода в системе липид/вода = 10). Поэтому нейтральная молекула кислорода легко проникает через мембрану внутрь клетки, образуя в ней супероксид (уравнение (VI.9)).
Если, несмотря на активность цитохромоксидазы, содержание молекулярного кислорода продолжает возрастать, а концентрация супероксида увеличиваться, О2 реокисляется с помощью фермента цитохрома с или (и) удаляется из клетки с помощью дальнейших превращений.
В отличие от молекулярного кислорода, супероксид имеет заряд и, следовательно, гидратируется. Такое «громоздкое» образование с
гидрофильным окружением не растворяется в липидах БМ и не может покинуть клетку, которая становится «ловушкой супероксида» (В. П. Скулачев).
Удаление избытка супероксида из клетки происходит в результате дисмутации О2 ферментом митохондриального матрикса суперок- сиддисмутазой (СОД) с превращением в Н2О2 — незаряженную молекулу, легко проникающую через мембрану (уравнение (VI. 14)).
В свою очередь, пероксид водорода в митохондиях и пероксисомах инактивируется активным ферментом каталазой):
2Н2О2 -^2Н2О + О2. (VI.32)
Ферментная система пероксидаз, например, глутатионпероксидаза, локализованная в мембранах, отводит избыток Н2О2 на специальные субстраты, например, глутатион (GSH):
2GSH + Н2О2 G-S-S-G + 2Н2О. (VI.33)
Если активность ферментов контроля за стационарным уровнем АФК оказывается недостаточной, тогда может включаться еще один механизм защиты — способность мембраны митохондрий регулировать открытие пор.
Регуляция открытия пор митохондриальной мембраны
Уже первые сигналы аномального возрастания содержания кислорода в клетке ведут к накоплению О2, Н2О2 и ОН' в таких концентрациях, которые вызывают открытие пор мембран митохондрий, что приводит к быстрому «изгнанию» из клетки излишков кислорода и АКСС. При нормализации уровня молекулярного кислорода концентрации АКСС достигают исходных величин, а это вызывает регуляторное закрытие пор.
Д. Утечка протонов
Известно, что в стадии, предшествующей некрозу клетки, происходит «неомическая» утечка протонов в мембранах митохондрий. Она позволяет поддерживать низкую концентрацию кислорода, осуществляя защиту клетки от токсического действия кислорода и появления избыточных концентраций CoQ (кофермента Q, образуемого дыхательными ферментами) и, следовательно, супероксид-анион радикалов и других АФК.
Снижение уровня и активности радиотоксинов
При усилении цепных процессов липопероксидации в облученной клетке включаются антирадикальные и антиокислительные механизмы, сдерживающие образование избытка ППОЛ, т. е. ЛРТ (рис. VI.7, II, III).
Ферментные реакции
С помощью глутатионпероксидаз происходит ферментативное восстановление молекул липидных гидропероксидов:
2GSH + LOOH G-S-S-G + Н20 + LOH. (VI.34)
Фосфолипидгидропероксид-глутатионпероксидаза также производит восстановление гидропероксидов, но уже не свободных, а находящихся в составе негидролизованных фосфолипидов:
2GSH + ROOH G-S-S-G + Н20 + ROH. (VI.35)
В отличие от глутатионпероксидаз, глутатионтрансферазы восстанавливают только органические гидропероксиды, в том числе и ядерный гидропероксид ДНК, локализованный в хроматине. Глута- тионредуктаза катализирует регенерацию GSH из G—S—S—G:
G-S-S-G + НАДФН + Н+ 2GSH + НАДФ, (VI.36) предоставляя возможность глутатиону вновь и вновь защищать ДНК и другие жизненно важные компоненты клетки путем предотвращения образования ROOH и (или) их непосредственного разрушения. Важную роль в антирадикальной и антиокислительной защите от оксидативного токсического действия ОРТ играют в клетке также оксигеназные системы, в том числе и цитохром Р450, физиологическая роль которых сводится к увеличению водорастворимо- сти, полярности окисляемой молекулы в биологических мембранах. Считается, что это, по существу, единственный механизм передачи высоконеполярных, гидрофобных молекул из липидной фазы клетки (мембраны) в водную фазу и последующей их инактивации, например, путем превращения окисленного продукта в GSH-зависимых и трансферазных реакциях и последующего удаления водорастворимых окисленных веществ (А. И. Арчаков, 1983).
Низкомолекулярные антиокислители
Глутатион участвует не только в процессах антиокислительного механизма защиты, взаимодействуя с пероксидом водорода и гидропероксидами, но он способен обезвреживать ЛРТ — эпоксиды, альдегиды и др. продукты цепных процессов липопероксидации. Его концентрация в клетке (1-10 ммоль/л) намного превышает уровень АФК и продуктов ПОЛ (табл. VI.2). Глутатион включается в анти- окислительные защитные реакции буквально во всех частях клетки, включая митохондрии, ядро, эндоплазматический ретикулум; его иногда называют «главным восстановителем в клетке» (В. И. Кулинский).
Защитные системы клеток имеют, наряду с глутатионом, в своем арсенале большой «набор» низкомолекулярных веществ «антиокис- лительного буфера», способных перехватывать или инактивировать радикалы, восстанавливать АПК, в том числе и продукты ПОЛ на разных этапах их образования.
Приведем перечень наиболее активных из них в табл. VI.5.
Таблица VI.5. Перечень наиболее активных низкомолекулярных компонентов «антиокислительного буфера»
Эндогенные антиоксиданты
Растворимость
Тиолы:
- восстановленный глутатион, цистеин
растворимы в воде
Биогенные амины:
- серотонин, гистамин, катехоламины
растворимы в воде
Пептиды:
- карнозин, ансерин
растворимы в воде
Витамины:
аскорбиновая кислота
токоферол, /3-каротин и другие каротиноиды
растворима в воде растворимы в липидах
Стероиды:
- кортикостероиды
растворимы в липидах
Другие антиоксиданты:
микроэлементы, ионы металлов переменной валентности
таурин, убихинон, ураты, билирубин, фенолы, фосфолипиды
растворимы в воде и (или) липидах
Приведенные компоненты «антиокислительного буфера» обладают способностью снижать уровень и токсическое действие АКСС (ОРТ) в водной и липидной фазах клетки.
Заметим, что многие из этих биологически активных веществ применяются в радиобиологии в качестве препаратов — радиопротекторов, введение которых в клетки и организмы оказывает защитное профилактическое действие от острого облучения (Е. Н. Гончаренко, Ю. Б. Кудряшов, 1985).
При защите от острого облучения уже полвека используются наиболее эффективные радиопротекторы — аминотиолы и биогенные амины, их многочисленные синтезированные в лабораториях аналоги, а также низкомолекулярные пептиды и, конечно, вещества и приемы создания гипоксии. При длительном хроническом низкоинтенсивном лучевом воздействии, когда применять радиопротекторы не представляется возможным (например, в связи с их кратковременным действием, а также с вынужденной токсичностью препаратов, эффективных только в высоких концентрациях), используются пищевые добавки, включающие витамины, микроэлементы, адаптогены, содержащие комплексы антиокислителей (Ю. Б. Кудряшов, 2000).
Факт эффективности, результативности применения антиокислителей в качестве препаратов для противолучевой защиты биологических объектов подтверждает общий вывод о ключевой роли нарушения системы окислительно-восстановительного гомеостаза в формировании радиационного эффекта.
Необходимо особо отметить, что радиационные нарушения окислительно-восстановительного гомеостаза в биологических мембранах и цитозоле тесно связаны с повреждениями структуры и функции ядерного аппарата клетки, ДНК — центральной субклеточной структуры в жизнедеятельности всех эукариотических клеток. Вопросу об изменениях ДНК и ее репарации в облученных клетках посвящен следующий раздел этой главы.
Повреждения и процессы восстановления ДНК воблученной клетке
Согласно центральному постулату генетики, развитие и свойства организма определяются генами — дискретными единицами наследственности в виде участков ДНК. В совокупности они составляют геном, который в точности воспроизводится в поколениях клеток и организмов благодаря механизмам наследственности. Основным из этих механизмов, обеспечивающим поддержание постоянства (стабильности) генома, является репликация ДНК, корректируемая репарацией, благодаря чему лишь изредка возникают случайные изменения в геноме — мутации, являющиеся одним из проявлений другой характеристики генома — его непостоянства.
Материальную основу мутаций составляют нарушения исходной структуры ДНК, вызванные весьма редкими ошибками механизма репликации или действием генотоксических факторов. В результате закрепления в потомстве (наследования) определенного типа структурных изменений (мутаций) образовался ряд наследственных заболеваний, таких как атаксия-телеангиэктазия, анемия Фанкони, синдром Блюма, пигментная ксеродерма и др.
Феномен мутационных изменений был открыт в радиобиологических опытах. Развитие представлений о его биологической значимости также происходило во многом на основании данных радиобиологии. Стало аксиомой, что такие последствия действия радиации на организм, как клеточная гибель, хромосомные аберрации и опухолевая трансформация, возникают в ходе мутационного процесса или служат его проявлениями как результат необратимых повреждений первичной структуры клеточной ДНК во время самого облучения. Таким образом, одним из следствий возникновения мутационных изменений в геноме является увеличение вероятности развития патологии.
Не менее значима другая, лишь отчасти связанная с возможностью развития патологии функция непостоянства, изменчивости генома — адаптационно-эволюционная. При ее осуществлении также возникают мутационные явления, сходные по внешним признакам с генетически
наследуемыми, но они имеют иную частоту и механизмы, сопровождают процессы клеточной дифференцировки, регуляции активности генов. Они передаются в потомстве клеток эпигенетически, направлены на адаптацию к изменяющимся условиям среды и обеспечивают эволюционный процесс.
Повреждения ДНК
Поглощенная мишенью — макромолекулой ДНК — энергия ионизирующих излучений обусловливает, как уже говорилось, ионизацию и возбуждение в молекулах, локализованных в чувствительном объеме. Ионизации, в отличие от возбуждений, с определенной вероятностью приводят к разрыву химических связей в молекулах. Количество ионизаций, индуцируемых в треке частицей, пересекающей чувствительный объем (с учетом S-электронов), зависит от качества излучений. Так, при рентгеновском или у-излучениях в ядре диаметром 8 мкм индуцируется несколько десятков ионизаций, что эквивалентно дозе, приблизительно, в 1 мГр. При пролете а-частицы (4 МэВ) в ядре с теми же параметрами происходит 23000 ионизаций, эквивалентных дозе 370 мГр. Однако следует отметить, что плотность ионизации неоднородна даже в треках частиц с малыми величинами лпэ.
Известно также, что число разорванных химических связей зависит не только от ионизации и возбуждения молекул, но и от их локальных концентраций в треке пролетающей частицы. Эти концентрации в свою очередь зависят от способа пространственной упаковки молекулы-мишени. При равной концентрации молекул-мишеней в некотором объеме проход соответствующей частицы может реализовать различные типы повреждений. Например, если отдельные участки молекулы пространственно сближены и находятся в области пролетающей частицы, увеличивается вероятность одновременных разрывов в этих участках.
В зависимости от ЛПЭ пролетающей частицы при прочих равных условиях облучения количество и типы разрывов в анализируемом участке молекулы-мишени варьируют. Множественные повреждения макромолекул в локальной области называют комплексными. Таким образом, спектры повреждений в молекулах-мишенях зависят от способа пространственной организации их отдельных фрагментов и качества излучения.
Все типы повреждений ДНК в облученной клетке можно условно разбить на следующие три группы.
К первой группе принадлежат изменения в каждой из цепей двухспиральной молекулы ДНК, не нарушающие ее пространственную непрерывность как целого. Среди таких повреждений выделяют од- нонитевые разрывы (ОР), модификации и повреждения оснований, образование щелочелабильных участков и др. Большинство повреждений этого типа образуется вследствие атаки соответствующих участков ДНК радикалами, генерируемыми в среде, т. е. в результате непрямого действия излучений.
Вторую группу образуют повреждения, приводящие к нарушению пространственной и, следовательно, информационной непрерывности двухспиральной молекулы ДНК как целого. К повреждениям этого типа относят двунитевые (двойные) разрывы (ДР), являющиеся следствием образования ОР на противоположных цепях ДНК. При этом расстояние между ОР на противоположных цепях может варьировать от единиц до превышающих десяток нуклеотидных пар.
К третьей группе повреждений ДНК в облученной клетке можно отнести нарушение ее вторичной структуры и надмолекулярной организации, вклад которых в общую картину лучевых повреждений пока еще недостаточно изучен.
Повреждения ДНК при внешнем облучении клетки
При плотной упаковке ДНК (например, в составе конденсированного хроматина) и при внешнем действии излучений с высокими значениями Л ПЭ в ограниченном участке ДНК, кроме указанных выше повреждений, в каждой из цепей ДНК могут возникнуть отдельные или несколько ДР с множественными локальными повреждениями макромолекулы. Например, компьютерные наблюдения показывают, что при проходе а-частицы (140 кэВ/мкм) через структуру декон- денсированного хроматина появляются фрагменты ДНК размером в 100 нуклеотидных пар, а для конденсированного хроматина (соленоид) — 1200-1400 нуклеотидных пар.
Эти и ряд других данных свидетельствуют об образовании кластеров комплексных повреждений ДНК в пределах отдельных сложно упакованных фрагментов хромосом. При этом ДР составляют только некоторую часть комплексных повреждений в кластере, зависящую от ЛПЭ излучений. Радиационно-химический выход ДР, особенно для излучений с высокими ЛПЭ, зависит линейно от величины дозы внешнего облучения. Это указывает на возможность возникновения ДР в результате поглощения энергии трека даже одиночной ионизирующей частицы на локальном участке ДНК.
В ДНК облученной клетки могут возникать также ковалентные сшивки ДНК-белок. Их количество возрастает с увеличением степени конденсации хроматина с выходом, сравнимым с выходом ОР. Сшивки наблюдаются между определенными основаниями ДНК и аминокислотами белков, например, между цитозином и тирозином, тимином и тирозином и др. Количество сшивок зависит также от качества излучения: с возрастанием ЛПЭ радиационно-химический выход их увеличивается.
Повреждения ДНК при внутреннем облучении
Остановимся кратко на повреждениях ДНК, вызываемых излучениями инкорпорированных в эту макромолекулу радионуклидов, наиболее часто применяемых в биологических экспериментах: 3Н, 14С, 32Р. Оценка радиобиологического эффекта этих ^-излучающих радионуклидов затрудняется тем, что в результате радиоактивного
Таблица VI.6. Повреждения ДНК в клетках млекопитающих, индуцированные действием излучений с низкими ЛПЭ
Тип повреждений
Количество повреждений в клетке на 1 Гр
однонитевые разрывы (ОР)
1000
повреждение оснований
500
сшивки ДНК-белок
150
двунитевые разрывы (ДР)
40
распада названные изотопы превращаются в стабильные элементы — гелий (Не), азот (N) и серу (S) соответственно. Такое превращение радионуклидов называется трансмутацией. Таким образом, повреждения, возникающие в исходных органических молекулах, могут быть обусловлены, с одной стороны, воздействием ^-излучения, с другой — изменением элементного состава вследствие трансмутации одного из типов атомов, что приводит к внезапному нарушению распределения орбитальных электронов в молекуле с последующей перегруппировкой их и образованием стабильной, но другой молекулярной конфигурации.
Для вычленения вклада радиационной компоненты в суммарное повреждающее действие радиоактивного распада приведенных радионуклидов используется методика суицидальных экспериментов, предложенная Херши с соавт. в 1951 г. Суть ее состоит в том, что, например, в азотистое основание ДНК или какую-либо аминокислоту клеток вводится радиоактивный изотоп, меченые клетки затем подвергаются охлаждению до такого состояния, когда метаболические процессы в ней прекращаются, и единственным событием остается распад радиоактивных атомов. После выдерживания клеток в таком состоянии для достижения измеряемого количества трансмутаций клетки инкубируют при температуре, физиологической для их жизнедеятельности, и оценивают радиобиологический эффект (по выживаемости), произведенный ^-излучением.
3Н
При включении 3Н в пуриновые основания ДНК главными продуктами трансмутационного компонента радиоактивного распада радионуклида в 8-м положении пуринового остатка являются 8-оксо-7- дигидроаденин (8-оксоА) и 8-оксо7,8-дигидрогуанин (8-оксоГ) — те же соединения, которые возникают при повреждении пуриновых оснований оксирадикалами. В опытах на фаге А образование 8-оксоА и 8-оксоГ в определенных количествах оказывается для бактериофага летальным. Эффективность инактивации фага (число летальных повреждений на 1 3Н-распад в фаговом геноме) за счет 3Н-распада в позиции 8 пуринов та же самая, что измеряется при повреждении в положениях 5 и 6 колец пиримидиновых оснований ДНК.
Образование 8-оксоГ ответственно за главную часть мутагенного эффекта, вызываемого 3Н. При этом эффективность мутагенного действия 3Н-пуринов (частота мутаций на 1 3Н-распад в фаговом геноме) возрастает от 2,4-кратной при отсутствии в бактериальной клетке одного из ферментов репарации нарушенного спаривания А:Г — ДНК-гликозилазы — до 55-кратной, когда отсутствует и другой аналогичный фермент — формамидопиримидин-ДНК- гликозилаза. Последняя устраняет до 40% от общего количества 8-оксоГ, образующегося при ^-распаде 3Н, но не предохраняет от мутаций, возникающих в ДНК в результате ошибок репаративной репликации по местам апуриновых-апиримидиновых участков, образуемых гликозилазами в нитях ДНК.
14С
Энергия возбуждения его составляет «45 эВ. Этого достаточно для разрыва любой химической связи в молекуле ДНК. Поэтому при ^-распаде 14 С в составе колец азотистых оснований ДНК будет происходить раскрытие колец, либо (и) будут возникать аналоги с заменой углерода на азот. Таким образом, радиоактивность 14С может вызывать трансмутации и ОР. Появление ДР в данном случае маловероятно.
32р
Распад 32Р в составе ДНК с вероятностью = 0,1 приводит к образованию ДР и с вероятностью = 1 — ОР. Разрыв связей происходит по чисто химическим причинам, т. к. в результате распада 32Р образуются серноэфирные связи, которые не устойчивы в водных растворах и легко гидролизуются. Образовавшиеся при распаде одной цепи ДНК радикалы взаимодействуют с окружающими молекулами, в том числе и со второй цепью макромолекулы, а это в конечном счете приводит к ДР ДНК. По-видимому, основной вклад в летальный эффект клеток при распаде 32Р, включенного в ДНК, вносит трансмутационная составляющая.
В целом радиационно-химические выходы продуктов повреждения ДНК, образующихся в результате ^-распада инкопорированных радионуклидов, примерно соответствуют тем, которые наблюдаются при внешнем воздействии ^-излучения в равных экспозиционных дозах.
Следует отметить, что только крайне незначительная часть радиационных повреждений, возникающих в ДНК при воздействии излучений, сохраняется надолго в облученных клетках. Подавляюще большая часть их устраняется в ходе репарации ДНК.
Репарация ДНК от повреждений
Из происходящих в облученных клетках изменений наиболее значимыми являются повреждения — мутации и хромосомные аберрации, поскольку они передаются в ряду клеточных поколений и определяют типы генетических дефектов. Известно, что многие из них служат
отражением нестабильности генома, являются причиной наследственных заболеваний, приводят к трансформации клеток (одна из стадий злокачественного перерождения клеток) или к их гибели.
Естественно, что в процессе эволюции были выработаны системные реакции, предохраняющие геном от вредных воздействий, репарирующие его от возникших повреждений и поддерживающие его постоянство.
Первичные изменения ДНК — это начальный, узловой этап многостадийного мутационного процесса. Важнейшая стадия, контролирующая мутагенез, — репарация ДНК.
Ранние исследования
На существование репарации ДНК впервые обратили внимание при анализе летального действия ультрафиолетового (УФ) излучения на бактерии. Еще в 1928 г. было показано, что наибольшей эффективностью в летальном эффекте обладают кванты этого излучения с длиной волны 260 нм, которые избирательно поглощаются азотистыми основаниями ДНК. Возникло предположение, что мишенью для летального действия УФ радиации служит бактериальная ДНК. Обосновать это предположение удалось лишь после открытия роли ДНК в наследственности. Стало очевидным, что для клеток фотохимическое повреждение генетических структур является губительным.
В 1960 г. были выявлены фотохимические повреждения ДНК, ответственные за летальное действие ультрафиолетового излучения. Ими оказались димеры тимина, возникающие в результате связывания двух соседних оснований одной полинуклеотидной цепи. Появление димеров приводит к локальному нарушению вторичной структуры ДНК и подавлению активности того гена, в котором произошла димеризация.
Было показано, что вероятность летального действия данной дозы УФ излучения зависит от условий, в которых выдерживают облученные клетки (освещение, состав питательной среды и т. д.). Так как эти факторы не влияли на первичные фотохимические повреждения, заключили, что бактерии способны репарировать свою ДНК, освобождаясь от некоторых из фотохимических повреждений, а легальны те повреждения, от которых репарация невозможна.
Значительный прогресс в этой области исследований был достигнут благодаря открытию мутантов, дефектных по репарации ДНК. Было обнаружено, что мутации в любом из трех генов — uvr A, uvr В и uvr С в клетках Е. coli значительно повышают чувствительность бактерий к действию УФ излучения. Эти гены расположены в трех далеко отстоящих друг от друга участках генетической карты. Вероятно, нормальный продукт, кодируемый ими, участвует в процессе репарации.
Природу одного из молекулярных процессов репарации ДНК открыл в 1964 г. Сетлоу с соавторами. Опыты проводились с нормальными и мутантными бактериями, ДНК которых предварительно метили
3Н-тимидином. Оба типа клеток получали равную дозу УФ излучения, после чего изучали количество 3Н-тиминовых димеров в клеточных экстрактах.
Полученные результаты показали, что в обоих экстрактах содержится одинаковое количество тиминовых димеров в расчете на клетку. Однако в чувствительном к УФ излучению штамме все тиминовые димеры оказались в составе высокомолекулярной фракции, т. е. структурно целостной ДНК. Напротив, в нормальном штамме тиминовые димеры обнаруживались в составе коротких фрагментов, состоящих не более чем из шести нуклеотидов.
Отсюда авторы заключили, что в ДНК как нормальных, так и мутантных штаммов образовалось одинаковое число начальных фотохимических повреждений. Однако нормальные клетки Е. colt обладают ферментативной системой, которая вырезает тиминовые димеры из облученных полинуклеотидных тяжей, заменяя их нормальными тимидиловыми нуклеотидами. Пониженная выживаемость мутантных клеток, по-видимому, связана с отсутствием активного фермента, необходимого для вырезания (эксцизии) димеров тимина.
В дальнейшем было показано, что в рассматриваемом процессе участвует эндонуклеаза, вызывающая однонитевые разрывы в ДНК с УФ повреждениями. Эта эндонуклеаза имеется в нормальных штаммах Е. colt и в мутантах по гену uvr С, но отсутствует в мутантах по генам uvr А и uvr В. Из этого можно заключить, что гены uvr А и uvr В кодируют разные субъединицы эндонуклеазы, репарирующей ДНК от УФ повреждений.
Вслед за вырезанием тиминовых димеров и окружающих их нуклеотидов начинается репарационная репликация. Ее существование было доказано в экспериментах с бактериями, которые после облучения УФ светом инкубировали в присутствии радиоактивного бромурацила. Накопление радиоактивной метки свидетельствовало о включении в облученные клетки бромурацила, который используется при репликации ДНК вместо тимина.
Однако в облученных бактериях происходила не обычная репликация, протекающая только в репликационных вилках с образованием меченых бромурацилом протяженных участков полинуклеотидов, а репарационная, сопровождающаяся включением бромурацила во многих рассеянных по разным участкам ДНК точках. Об этом говорило измерение плотности ДНК при равновесном центрифугировании в растворе CsCl. Бромурацил плотнее тимина, поэтому при обычной репликации возникала бы «тяжелая» нить ДНК. Однако ее образования опыты не показали. Весь бромурацил содержался в «легких» цепях ДНК.
Следовательно, его включение происходило в короткие полину- клеотидные участки, окруженные длинными нереплицировавшимися полинуклеотидными последовательностями, так что плотность ДНК заметно не изменилась.
В дальнейшем были изучены ферментные механизмы рассматриваемого типа репарации ДНК. Согласно схеме, предложенной Говард- Фландерсом, одна или несколько молекул фермента, кодируемого генами uvr А и uvr В, постоянно «обегает» кольцевой бактериальный геном, «выискивая» в двойной спирали ДНК структурные нарушения. Когда такой фермент сталкивается с повреждениями ДНК, обусловленными появлением тиминовых димеров, он вызывает два разрыва в полинуклеотидной цепи по обе стороны от фотохимического повреждения. В результате происходит эксцизия тиминового димера вместе с несколькими соседними нуклеотидами.
Другой вариант состоит в том, что фермент вызывает лишь один разрыв с б'-стороны повреждения, что позволяет ДНК-полимеразе I вырезать поврежденный участок под действием своей 5\ З'-экзонукле- азной активности. Образующаяся брешь заполняется под действием репарирующей активности той же ДНК-полимеразы I, прибавляющей нуклеотиды к З'-ОН-концу старой полинуклеотидной цепи, используя в качестве матрицы неповрежденную комплементарную цепь ДНК, в которой нет УФ повреждений.
Завершается процесс восстановления двойной спирали образованием с помощью ДНК-лигазы фосфодиэфирной связи между З'-ОН- концом последнего нуклеотида, включенного при репарационной репликации, и б'-концом старой полинуклеотидной цепи.
Помимо рассмотренного механизма репарации ДНК, названного «выщепление-замещение», у бактерий обнаружен и принципиально иной путь репарации ДНК от УФ повреждений. В 1950 г. Дулбекко наблюдал резкое возрастание способности клеток Е. coli репариро- вать Т-четные фаги от повреждения, если зараженные этим фагом бактерии после УФ облучения осветить сильной вспышкой видимого света. Оказалось, что у Е. colt имеется фотореактивирующий фермент, детерминируемый геном phr. Этот фермент при воздействии светом с длиной волны 300-500 нм осуществляет прямое превращение тиминовых димеров в нормальные основания без эксцизии.
Еще один механизм репарации ДНК от УФ повреждений был расшифрован с помощью Rec--мутантов Е. coli, открытых Кларком в 1965 г. Эти мутанты обладали способностью к эксцизионной репарации тиминовых димеров и тем не менее оказались необыкновенно чувствительными к УФ облучению. Помимо высокой чувствительности к УФ радиации, Rec--мутанты неспособны к генетической рекомбинации ни при конъюгации, ни при трансдукции.
Связь между репарацией поврежденной ДНК и генетической рекомбинацией была установлена в работах Говард-Фландерса, доказавшего, что, кроме механизма «выщепления-замещения», в бактериальной клетке существуют возможности исправления дефектов в дочерней ДНК, образующейся при репликации нерепарированной облученной родительской ДНК. Первая после облучения копия ДНК образуется в форме полинуклеотидной цепи с разрывами. Брешь возникает в дочерней цепи напротив тиминового димера матричной родительской цепи в результате препятствия для продвижения ДНК-полимеразы.
Однако всего через 1 час после синтеза таких разорванных цепей в клетке обнаруживаются непрерывные цепи ДНК нормальной длины. Бреши заполняются в результате пострепликативной репарации, осуществляемой за счет генетической рекомбинации между комплементарными сестринскими нитями, несущими разрывы. Из этого следует, что как отсутствие способности к генетической рекомбинации, так и высокая чувствительность к УФ излучению у мутантов Rec- обусловлены дефектом системы, отвечающей за рекомбинационные события.
По-видимому, все возможные пути репарации бактериальной ДНК от УФ повреждений исчерпываются процессами, контролируемыми генами uvr, rec и фотореактивацией. В отсутствие видимого света двойные мутанты по генам uvr и гес погибают в результате возникновения в их геноме всего одного тиминового димера.
Расшифровка молекулярных механизмов репарации бактериальной ДНК от УФ повреждений существенно расширила представления о функционировании генома и показала, что в клетке существуют генетически детерминированные системы ферментов, поддерживающие целостность генетической информации и исправляющие ее в случае нарушений.
В дальнейшем было доказано, что в общих чертах сходная система существует в клетках млекопитающих. Благодаря активности репаративной системы, клетки способны поддерживать целостность генома в случае повреждений, наносимых не только УФ излучением, но и ионизирующей радиацией, канцерогенами и мутагенами. В последнюю четверть века были проведены интенсивные исследования механизмов репарации ДНК от повреждений, вызванных ионизирующей радиацией. Эти работы вызвали большой интерес не только среди радиобиологов, но и среди генетиков, молекулярных биологов, биохимиков. Накоплен обширный экспериментальный материал, зачастую противоречивый и нуждающийся в дальнейшем уточнении.
В настоящее время не вызывает сомнения наличие в клетках млекопитающих эффективных систем дорепликативной репарации, участвующих в воссоединении однонитевых и двунитевых разрывов. В зависимости от природы концевых участков в месте разрыва в процесс вовлекаются различные ферментные системы: ДНК-лигазы, ДНК-полимеразы, эндо- и экзонуклеазы. Пробелы, возникающие в по- линуклеотидной цепи вследствие освобождения нуклеозидов из ДНК, восстанавливаются за счет системы эксцизионной репарации, подобной (хотя и менее эффективной) темновой репарации УФ повреждений у бактерий.
В 1975 г. была описана пострепликативная репарация в клетках китайского хомячка, подвергнутых воздействию ионизирующей радиации. Как и в случае УФ повреждения клеток, новообразованная ДНК синтезируется в виде коротких фрагментов между местами сохраняющихся повреждений, а заделывание брешей происходит в пострепликативный период либо за счет вырезания дефектных участков нитей ДНК и ресинтеза de novo, либо путем рекомбинационных обменов между сестринскими дуплексами. Как отмечают В. Е. Комар
и К. П. Хансон (1980), пострепликативную репарацию следует скорее рассматривать не как истинное восстановление, а как преодоление повреждений, обеспечивающее клетке сохранение жизнеспособности, несмотря на наличие дефектов в ДНК. Сохранение измененной структуры ДНК в поколениях клеток может лежать в основе отдаленных последствий облучения — канцерогенеза и мутагенеза.
Механизмам репарации принадлежит важнейшая роль в поддержании постоянства первичной структуры ДНК как в ходе нормальной жизнедеятельности, так и при действии различных повреждающих агентов, в том числе ионизирующего излучения. От эффективности репаративных систем во многом зависит восстановление, наблюдаемое на клеточном уровне, однако точный вклад исправления дефектов структуры ДНК в общую картину радиационного поражения и в судьбу облученной клетки пока еще не установлен. Расшифровка молекулярных механизмов репарации ДНК в клетках млекопитающих позволила бы активно вмешиваться в этот процесс, селективно изменять радиочувствительность клеток и, возможно, многоклеточных организмов. При этом не исключено, что различная природная радиочувствительность клеток и организмов связана не только с эффективностью репаративных систем, но и с их уязвимостью для радиационного воздействия.
Репарация ДНК от повреждений в облученной клетке
(Д. М. Спитковский)
Известно, что весь спектр ДНК-репарационных реакций в облученной клетке можно разделить на два типа.
Первый реализуется, когда повреждения носят локальный характер реализации в одной из двух цепей ДНК. Тогда антипараллельная ей цепь ДНК является ей матрицей для восстановления физической и информационной непрерывности поврежденной цепи, т. е. для репарации. Типичным примером таких повреждений являются ОР ДНК.
Второй тип относится к репарации ДНК от ДР, когда повреждены обе цепи ДНК, т. е. отсутствует матрица, необходимая для воссоздания исходной структуры информации макромолекулы.
Повреждения, которые устраняются по первому типу, возникают при облучении клетки в любых дозах, особенно когда речь идет об излучениях с низкими значениями ЛПЭ. Количество повреждений, разумеется, зависит от величины дозы облучения. Однако в клеточной ДНК возникает и множество спонтанных изменений. Некоторая часть из них обусловлена тепловыми шумами. Большая же часть является следствием атаки ДНК окислительными радикалами, образующимися в процессе нормальной жизнедеятельности клетки и «ускользнувшими» от систем инактивации.
Было рассчитано, что в результате окислительного метаболизма в одной клетке млекопитающих продуцируется в течение суток около 109 радикалов. Они принимают участие в среднем в 105 модификациях ДНК в клетке за тот же период. Однако только незначительная 17*
Таблица VI.7. Количество повреждений ДНК, приходящихся на одну «усредненную» клетку млекопитающих
Тип повреждений
Спонтанные повреждения
Число повреждений ДНК
в
сек
в
мин
за
сутки
В
ГОД
на
1 сГр
однонитевые разрывы (ОР)
14
84
8-Ю6
4,4-Ю7
10
двунитевые разрывы (ДР)
—
—
—
—
0,4
повреждения оснований и (или) депуринизация
0,8
48
0, 9-10®
0, 75-Ю5
1,9-10® и 1,1107
9,5
общее число повреждений
2,2
132
4, 85-Ю5
и 7-107
20
часть из всех повреждений ДНК в клетке сохраняется. Умеренное воздействие внешних факторов среды незначительно увеличивает эту цифру. В качестве иллюстрации в табл. VI.7 представлены данные из последних работ Д. М. Спитковского о числе спонтанных повреждений ДНК в клетке.
Кроме указанных в таблице, существует значительно меньшее количество «повреждений» ДНК, которые являются, скорее всего, изменениями макромолекулы в процессе нормального метаболизма клетки (разрывы ДНК при дифференцировке клеток, V(D)J-npeo6pa3OBaHH- ях иммуноглобулиновых генов и др.).
Как следует из табл. VI.7, в клетке ежеминутно возникает достаточно большое количество спонтанных повреждений ДНК (более ста тридцати), которые в основном успешно устраняются. Дополнительно к спонтанным повреждениям макромолекулы также должны быть устранены и повреждения, вызванные действием генотоксических агентов (например, от облучения в дозе 1-10 сГр в течение минуты и за большее время). При этом имеется в виду, что повреждения ДНК, индуцируемые как прямым, так и косвенным действием излучений, имеют ту же природу, что и спонтанные повреждения.
Вместе с тем возможны изменения распределения разных типов повреждений.
В ДНК-репарационных процессах первого типа, в зависимости от характера повреждения, участвуют различные ферменты: гликозидазы, фосфодиэстеразы, ДНК-полимеразы, лигазы и др. Количество таких ферментов достаточно велико. Так, в дрожжевых клетках известно более 50 генов, продукты которых участвуют в процессах репарации ДНК. Некоторые из них выполняют и другие функции,
например, участвуют также и в процессах регуляции клеточного деления. Полагают, что из 60000-70000 генов в клетке человека несколько сотен может принимать участие в поддержании стабильности генома.
Следует отметить, что некоторые процессы репарации первого типа реализуются с разными скоростями в разных участках генома. Например, активно экспрессируемые гены восстанавливаются от повреждений значительно быстрее, чем остальные участки генома. Известно также, что только одна цепь в ДНК-дуплексе транскрибируется. Повреждения именно в этой цепи устраняются наиболее быстро. Этим, по-видимому, объясняется накопление мутаций в нетранскри- бируемой цепи ДНК.
Как следует из изложенного, при действии ионизирующих излучений в малых дозах (и при низких значениях ЛПЭ) повреждения ДНК, индуцируемые в одной из ее цепей, должны в основном устраняться благодаря емкости ДНК-репарационной системы, принимающей участие в восстановлении спонтанных повреждений макромолекулы.
Совершенно иная ситуация складывается в случае двунитевых разрывов ДНК. Такие разрывы, как уже отмечалось, хотя и с достаточно малой вероятностью образуются даже при фоновых дозах облучения. Образование ДР приводит к потере физической непрерывности ДНК и, как следствие, к отсутствию антипараллельной цепи, которая является матрицей для репарации ДНК по первому типу.
В настоящее время известны два пути репарации ДНК от двунитевых разрывов. Механизм первого из них — сшивание негомологичных концов (non homologous end joining — NHEJ) связан с первоначальной стабилизацией разорванных концов ДНК Ku-белками и с последующим образованием комплекса между этой структурой и ДНК-зависимой протеинкиназой. Существенно, что при реализации NHEJ-стратегии не происходит движения разорванных концов ДНК в пространстве ядра клетки. При этом координаты ДР относительно фиксированы, а комплексы белков, необходимых для репарации, вероятнее всего мигрируют к месту ДР.
Следует, однако, отметить, что при репарации ДНК по этому механизму возникают нарушения в ее первичной структуре (делеции и др.). Эти нарушения обусловлены тем, что при установлении микрогомологии в районе разрыва остаются свободные концы ДНК, которые затем «отрезаются» при помощи ряда ферментативных реакций.
Второй механизм репарации ДНК от ДР реализуется с помощью гомологичной рекомбинации.
Последовательности ДНК, от которых информация передается на поврежденную копию, должны быть идентичны на достаточно большой длине (более 200 пар нуклеотидов). Такие рекомбинационные процессы могут реализоваться, например, между материнскими и отцовскими копиями одного и того же гена. Известно, что рекомбинации могут осуществляться также между соответствующими последовательностями ДНК в пределах одной хромосомы.
Соотношения между обоими типами репарации ДНК от ДР зависят от ряда условий, в том числе — от стадии клеточного цикла.
Репарация с участием механизма гомологичной рекомбинации подразумевает сближение гомологичных последовательностей в пространстве ядра клетки. Известно также, что часто соответствующие локусы гомологичных хромосом пространственно разобщены. Радиация индуцирует процессы, приводящие к перемещению этих локусов в пространстве ядра клетки, необходимые для их сближения. Естественно, что репарация ДНК от ДР как более сложный процесс (по сравнению с репарацией от ОР) требует более длительного времени и не всегда возможна. Нерепарируемые ДР ДНК часто оказываются летальными для клетки. С еще меньшей вероятностью следует ожидать восстановления комплексных повреждений ДНК, локализованных в кластерах.
Таким образом, при облучении в малых дозах повреждения ДНК, репарируемые по первому типу, должны полностью восстанавливаться (естественно, возможно с некоторой, хотя и малой вероятностью ошибки).
Схема структурных изменений ДНК при ее репарации приведена на рис. VI. 12. В целом представленные на ней механизмы репарации ДНК условно представляют собой:
эксцизионную репарацию оснований (в англоязычной литературе ее сокращенно обозначают ВЕН — base excision repair), осуществляемую в одну стадию без разрыва полинуклеотидной цепи путем замены поврежденного пиримидинового или пуринового основания на нормальное, комплементарное неповрежденному, в другой нити ДНК уже упоминавшимися репарационными ферментами: соответственно формамидопиримидин-ДНК-гликози- лазой и ДНК-гликозилазой нарушенного спаривания оснований А:Г;
эксцизионную репарацию нуклеотидов (NER — nucleotide excision repair), осуществляемую в несколько стадий при участии ферментов эндонуклеаз распознавания повреждения и инци- зии — разрезания, разрыва нити ДНК — по обе стороны на несколько нуклеотидов вблизи от повреждения либо с одной стороны от повреждения с последующей эксцизией (вырезанием) поврежденного и нескольких интактных нуклеотидов при участии экзонуклеазы; репаративной репликации, обеспечивающей «застройку» образовавшейся бреши при помощи ряда ДНК-полимераз (у человека, прежде всего, ^-, а также у- (для митохондриальной ДНК), 5- и в-); наконец, завершающей стадии «сшивания» концов восстановленного и предсуществующего участков нитей ДНК, осуществляемой ДНК-лигазами.
Наконец, в правой части на рис. VI. 12 представлена схема репарации ДР, осуществляемой путем сшивания негомологичных концов либо посредством рекомбинационного механизма.
Повреждения основанийПовреждения основанийДвунитевые разрывы (ДР) ДНК
Повреждения оснований
Повреждения оснований
111О11ШН1ПЖ1ИМ1111Г111О11ШН1ПЖ1ИМ1111ГПППППШЕ лшшшгшПППППШЕ лшшшгшустранение основания(гликозилаза)устранение основания(гликозилаза)процессинг концов ДНК в районеДР ДНКпроцессинг концов ДНК в районеДР ДНК11 III 11П11111111 III 11П111111I лтп“^тгг1т№.ТшддшшшПI лтп“^тгг1т№.ТшддшшшПразрезаниеразрезание(эндонуклеаза)(эндонуклеаза)IlflfllHlIllliIlflfllHlIllliразрезание(эндонуклеаза)разрезание(эндонуклеаза)соединение(лигаза)соединение(лигаза). взаимодействие с неповрежденным гомологомПШЦЩПШ. взаимодействие с неповрежденным гомологомПШЦЩПШзаполнение(полимераза)заполнение(полимераза)11111а1,1шшД11111а1,1шшДII III НГ III III III НГ III I**Hill I iHl ■ III гHill I iHl ■ III гзаполнение(полимераза)заполнение(полимераза)соединение(лигаза)соединение(лигаза)I Hill 11 III 111I Hill 11 III 111соединение(лигаза)соединение(лигаза)Кп-белкиДНК-зависи- мая протеин- киназаКп-белкиДНК-зависи- мая протеин- киназазаполнение(полимераза)WTTFзаполнение(полимераза)WTTFlllllllillllMlllllllillllMI соединение▼ (лигаза)(рекомбинация)ТПГП111Г11МГ шшшшшI соединение▼ (лигаза)(рекомбинация)ТПГП111Г11МГ шшшшш
111О11ШН1ПЖ1ИМ1111Г
111О11ШН1ПЖ1ИМ1111Г
ПППППШЕ лшшшгш
ПППППШЕ лшшшгш
устранение основания(гликозилаза)
устранение основания(гликозилаза)
процессинг концов ДНК в районеДР ДНК
процессинг концов ДНК в районеДР ДНК
11 III 11П111111
11 III 11П111111
I лтп“^тгг1т№.
ТшддшшшП
I лтп“^тгг1т№.
ТшддшшшП
разрезание
разрезание
(эндонуклеаза)
(эндонуклеаза)
IlflfllHlIllli
IlflfllHlIllli
разрезание(эндонуклеаза)
разрезание(эндонуклеаза)
соединение(лигаза)
соединение(лигаза)
. взаимодействие с неповрежденным гомологом
ПШЦЩПШ
. взаимодействие с неповрежденным гомологом
ПШЦЩПШ
заполнение
(полимераза)
заполнение
(полимераза)
11111а1,1шшД
11111а1,1шшД
II III НГ III I
II III НГ III I
*
*
Hill I iHl ■ III г
Hill I iHl ■ III г
заполнение
(полимераза)
заполнение
(полимераза)
соединение(лигаза)
соединение(лигаза)
I Hill 11 III 111
I Hill 11 III 111
соединение(лигаза)
соединение(лигаза)
Кп-белки
ДНК-зависи- мая протеин- киназа
Кп-белки
ДНК-зависи- мая протеин- киназа
заполнение
(полимераза)
WTTF
заполнение
(полимераза)
WTTF
lllllllillllM
lllllllillllM
I соединение
▼ (лигаза)
(рекомбинация)
ТПГП111Г11МГ шшшшш
I соединение
▼ (лигаза)
(рекомбинация)
ТПГП111Г11МГ шшшшш
эксцизионная репарацияэксцизионная репарациярепарация с участием гомологичной рекомбинациирепарация с участием гомологичной рекомбинации
эксцизионная репарация
эксцизионная репарация
репарация с участием гомологичной рекомбинации
репарация с участием гомологичной рекомбинации
Рис. VI. 12. Схематическое изображение некоторых механизмов репарации ДНК: а) поврежденные основания выщепляются специфическими глюкозил азами: нить ДНК разрезается, и брешь заполняется при помощи полимераз; б) удаляется нуклеотидный фрагмент, включающий поврежденные основания (примерно 30 оснований в клетках человека. Ресинтез происходит с использованием поврежденной цепи-матрицы; в) двойные разрывы соединяются конец в конец; г) двойные разрывы репарируют с использованием гомологической неповрежденной молекулы
При репарации ДНК от ДР происходит сложная перестройка пространственной организации генома, а следовательно, изменение активности ряда генов, необходимых для реализации этой программы. При описании кривых выживаемости клеток, независимо от концепции, лежащей в основе такого описания, необходимо учитывать возможность восстановления ДНК от ряда первичных ее повреждений. Как мы уже отмечали, существуют разные математические способы этого описания (гл. III).
Напомним, что наиболее простое выражение — для одноударных «одномишенных» кривых:
N/No = e-^D-b^^ (VI.37) где N/Nq — относительное число выживших объектов, VD — число попаданий в чувствительный объем V, b(D) — среднее число первичных повреждений, от которых клетка восстанавливается.
В более сложных зависимостях учитывается возможность того, что число первичных повреждений пропорционально дозе, а число устраненных при репарации повреждений с ростом дозы увеличивается, но стремится к некоторому пределу.
Некоторые представления о надежности генома
Стабильность генома, в том числе и по отношению к действию ионизирующих излучений, обусловлена рядом факторов: размерами чувствительного объема, способностью различных клеток репариро- вать ДНК от повреждений, активностью систем их детоксикации и т. д. Было предложено мерой надежности генома считать величину, обратную частоте возникновения элементарных генетических повреждений на один геном и на единицу дозы облучения (В. И. Корогодин, 1983).
Если исходить из вероятностной концепции описания кривых выживаемости, можно ввести два параметра: а и а.
Параметр а — это вероятность инактивации облученной клетки или ее потомков от одного повреждения, которая в общем случае может зависеть от числа клеточных повреждений в клетке. Другими словами, параметр а — это реакция клетки на уже возникшее повреждение.
Другой параметр а — это вероятность возникновения одного повреждения на единицу дозы облучения, что отражает чувствительность генома к возможному возникновению повреждения.
Показано, что Dq ^ а-1. С другой стороны, а « кС, где к — константа, а С — количество ДНК в геноме. Таким образом, можно прийти к следующему равенству:
К = D0C, (VI.38)
где К — удельная надежность генома, выраженная в эВ и равная количеству энергии излучения, поглощение которой в ДНК клетки необходимо и достаточно для инициации одного элементарного повреждения, т. е. К = 1/к. Из анализа соотношений радиоустойчивости объектов и надежности генома можно сделать два вывода.
Если отложить в плоскости координат Dq как функцию количества ДНК в геноме С, то все ДНК-содержащие объекты можно разбить на несколько радиотаксонов, отличающихся по удельной надежности генома. В первый из них входят биологические объекты, содержащие однонитевую ДНК; во второй — вирусы с двунитевой ДНК; в третий — бактерии и гаплоидные эукариоты, и, наконец, в
четвертую — диплоидные клетки эукариот. Поскольку распределение биологических объектов по радиотаксонам коррелирует с организацией в них генома, их можно отнести к кариотаксонам.
Учитывая радиационно-химические выходы ОР и ДР для излучений с низкими значениями Л ПЭ и удельную надежность генома К. можно определить выходы биологически значимых ОР и ДР (их сумму) на одно элементарное повреждение для разных радиотаксонов. Расчеты показывают, что если для первого и второго радиотаксона необходимо около одного повреждения, для третьего радиотаксона — около двух, то для четвертого радиотаксона число повреждений приближается к тридцати.
Другими словами, по-видимому, благодаря развитой системе ДНК- репарационных процессов, надежность генома диплоидных эукариот чрезвычайно высока.
В связи с этим возникает другая проблема: чрезвычайно малая генетическая изменчивость клеток диплоидных эукариот может привести их к эволюционному тупику. Для того, чтобы обойти указанную трудность, были предложены две гипотезы. Одна из них связана с повышенным уровнем геномной изменчивости за счет ошибок в работе некоторых репарационных систем клеток. Вторая — с наличием субпопуляции клеток онтогенетического или эволюционного резерва, если эта субпопуляция относится к соматическим или половым клеткам соответственно.
Суть второй гипотезы состоит в существовании среди гетерогенной по составу популяции клеток данного типа программируемой субпопуляции, которая отвечает на разнообразные генотоксические стимулы в малых дозах детерминированной реакцией — аутоиндукцией в ее клетках аномалий кариотипа и (или) других наследуемых структурных перестроек генома. Появляющиеся при этом новые генетические варианты после отбора обусловливают выживание новой популяции клеток. Некоторые из этих генетических вариантов могут быть родоначальниками трансформированных клонов.
Повреждения и процессы восстановления ДНК-мембранного комплекса в облученной клетке (Н. Ю. Кудряшова)
Несколько особняком в радиобиологической литературе стоит проблема лучевых изменений ДНК-мембранного комплекса (ДНК-МК). Еще в 1968 г. Т. Альпер впервые высказала гипотезу о существовании двух основных сайтов лучевого воздействия. Один сайт, названный ею N-сайтом, слабо реагирует на присутствие кислорода в момент облучения и представляет собой ДНК. Другой — О-сайт, относящийся к БМ, значительно в большей степени поражается ионизирующей радиацией в присутствии кислорода по сравнению с анаэробными условиями.
Хорошо известно, что хромосома в клетках как эукариотов, так и прокариотов представляет собой сложный структурный комплекс ДНК с белками, липидами, РНК и многими низкомолекулярными соединениями клеточных элементов. Известно также, что большую роль
в организации и функционировании генетического аппарата играют мембранные структуры. В клетках прокариотов мембраны участвуют в образовании суперскрученной ДНК, так называемого нуклеоида бактерий, прототипа ядра высших организмов. Поэтому реальные события, происходящие в облученной клетке, значительно сложнее, чем повреждение и репарация облученной ДНК вне ее комплексных структур.
Повреждения ДНК-МК
Одним из эффектов, наблюдаемых при облучении клеток млекопитающих или бактериальных клеток, является разрушение связей ДНК с клеточными элементами, в результате чего происходит переход ДНК во фракцию свободных молекул. В процессе пострадиационной инкубации клеток в условиях их роста возможно восстановление комплексов ДНК.
Для объяснения механизма высвобождения ДНК из комплекса ДНК-МК под воздействием облучения высказывались различные гипотезы. Так, одни авторы связывали этот процесс с повреждением молекулы ДНК, входящей в комплекс. Согласно их представлению, после облучения во фракции свободной ДНК оказываются ее фрагменты, расположенные между соседними точками прикрепления к мембране и не связанные с мембранными структурами. Другие наоборот предположили, что в лучевых нарушениях связи ДНК с мембранами определяющую роль играют изменения самих мембран.
Доказательства этого предположения были получены, например, в многолетних работах В. А. Стручкова и Н. Б. Стражевской по изучению структуры ДНК-МК и ее лучевых повреждений. Авторы выделили из клеток печени и тимуса млекопитающих надмолекулярную структуру ДНК-липидной природы, состоящей из одинаковых по размеру субъединиц (молекулярной массой ЗЛО9 дальтон), соединенными липидными «линкерами». Воздействие ионизирующего излучения даже в дозе 1 Гр вызывает распад комплекса на субъединицы, причем радиационный выход этой реакции в сотни тысяч (!) раз превышает выход ОР и ДР в ДНК. Было показано, что липидные линкеры являются наиболее радиочувствительным местом в ДНК-МК. В 1993 г. авторы пришли к выводу, что ДНК-мембранный комплекс может представлять собой единую радиобиологическую мишень — ДНК-БМ. лучевое повреждение которой способно привести к инактивации и гибели клетки (Стручков В.А., Стражевская Н.Б., 1993).
Лучевым нарушениям структурно-функциональных свойств ДНК- МК посвящен ряд работ, начатых в семидесятых-восьмидесятых годах. В работах В. Е. Комара и др. изучали действие рентгеновского облучения в дозе 15 Гр на репликацию ДНК в ядрах асцитной гепатомы крыс. Для регистрации новосинтезированной ДНК использовали импульсную метку 3Н тимидина на фоне длительной метки 14 С тимидина. Было показано, что облучение, нарушая связь ДНК с мембраной, блокирует инициацию репликации ДНК в составе комплекса,
но не влияет на продолжающуюся репликацию, индуцированную до лучевого воздействия.
В работах Крампа и др. (Cramp et al, 1972) изучено подавление процессов синтеза ДНК, входящей в состав ДНК-МК в облученных клетках Е. Coli В/r (дикого типа) и его радиочувствительного мутанта BS-I. Оказалось, что способность ДНК к репликации у обоих штаммов зависит от присутствия кислорода в момент облучения и от вида облучения. Показано, что в отличие от электронного облучения, действие нейтронов на процессы синтеза ДНК в большей степени обусловлено повреждением N-сайта (нечувствительного к кислороду), и что эффект облучения нейтронами в условиях гипоксии был более выражен у Е. Coll В/т по сравнению с Е. Coll BS-I. Эти результаты позволили заключить, что чувствительность к облучению мутанта BS-I связана с N-сайтом, и что поражение мембранного компонента ДНК-МК у обоих штаммов одинаково.
При облучении изолированных ДНК-МК обнаруживается высокая устойчивость ДНК синтезирующей активности комплекса к ионизирующим излучениям. Синтезирующая активность не подавляется даже при облучении в дозах, существенно снижающих выживаемость клеток, хотя кислородный эффект наблюдался.
Таким образом, вследствие облучения происходит взаимодействие повреждений О- и N-сайтов, т. е. обоих компонентов ДНК-МК, приводящих к гибели клеток.
Процессы восстановления ДНК-МК
Впервые процесс восстановления ДНК-МК от лучевых повреждении описали Баррелл с соавторами (Burrell et al, 1971) в опытах на одной из наиболее радиорезистентных бактерий — М. radiodurans. Авторы наблюдали, что вслед за диссоциацией ДНК-МК, возникающей от сублетальных доз облучения, в процессе инкубации клеток отмечалось появление промежуточного (по плотности в градиенте сахарозы) ДНК-МК, который в дальнейшем приобретал свойства ДНК- МК из интактных клеток. Было высказано предположение о том, что мембранные структуры ДНК-МК участвуют в репарации ДНК, обеспечивая правильное восстановление фрагментов хромосом.
В последующие годы эффект образования промежуточного ДНК- МК и восстановления исходного комплекса был подтвержден многими авторами. Уточнялась роль репарации ДНК и участие мембран в этом процессе и биологическое значение процессов восстановления ДНК- МК. Были сделаны выводы о том, что ассоциация ДНК с мембраной в пострадиационный период способствует защите ДНК от неспецифического нуклеазного расщепления и деградации макромолекулы и одновременно создает благоприятные структурные условия для репарации ДНК. К таким выводам при- шел С. В. Шестаков в исследованиях пострадиационных изменений ДНК-МК в клетках Anacystis nidulans и его радиочувствительного мутанта XR.
Участие мембран в процессе репарации ДНК от лучевых повреждений было подтверждено рядом авторов на бактериальных клетках
и подробно изучено на М. radiodurans. Экспериментально показано, что действие ряда мембраноповреждающих агентов (гипертермии, аминазина, новокаина) полностью блокирует способность к репарации ДНК-МК в клетках М. radiodurans дикого типа и его радиочувствительного мутанта UVS-17, дефектного по ДНК-полимеразе (Н. Ю. Кудряшова, 1987). Восстановление ДНК-МК у М. radiodurans зависит от нормального функционирования гена гес-30^ ответственного за генетическую рекомбинацию. Высказывалось предположение о том, что для восстановления генетического аппарата в клетках М. radiodurans необходимы рекомбинационные события, приводящие к устранению ДР ДНК.
Представленные данные по восстановлению ДНК-МК от лучевых повреждений относятся к исследованиям, проведенным на прокариотических клетках. Вопрос о постлучевой репарации ДНК-МК в клетках эукариотов остается еще мало изученным. В клетках млекопитающих, как in vivo, так и in vitro показано существование двух механизмов репарации: один воссоединяет разрывы субъединиц, другой восстанавливает связь между субъединицами, из которых состоит высокомолекулярная ДНК (Cole А., 1975; Lange С., 1975). Результаты были получены на активно делящихся клетках яичников китайского хомячка и клетках лимфомы мыши.
Сходные результаты были получены в неделящихся клетках головного мозга собаки (Wheller К., Lett J., 1972). Таким образом, репликативный синтез не требуется для восстановления связи между субъединицами. Характерной чертой репаративных процессов в неделящихся клетках млекопитающих является существование критического диапазона доз рентгеновского или у-облучения. При низких дозах репаративные процессы напоминают таковые в культуре делящихся клеток. При дозах, превышающих критический диапазон, происходит лишь восстановление самих субъединиц, в то время как связывание субъединиц между собой не наблюдается. Считается, что при высоких дозах радиации процессы восстановления линкеров либо непосредственно подавляются под действием облучения, либо это связано с накоплением нерепарируемых повреждений ДНК.
Приведенный в этой главе фактический материал свидетельствует о том, что лучевые повреждения и восстановления как биологической мембраны, так и макромолекулы ДНК, а также ДНК-МК представляют собой сложную взаимосвязанную и взаимозависимую единую систему ответа клетки на действие ионизирующих излучений. От соотношения характера и интенсивности проявлений повреждений и восстановления радиобиологических мишеней зависит дальнейшая судьба облученной клетки и ее гибель. Механизмам клеточной гибели и их восстановлению посвящен завершающий раздел этой главы.
Механизмы гибели и процессы восстановления клеток отрадиационного поражения
Два типа гибели облученных клеток — различия в зависимости от стадии клеточного цикла
Еще в начале века были описаны различные реакции клеток на облучение — от временной задержки роста и размножения до полной деградации и лизиса. Выраженность эффекта зависела от дозы облучения и особенностей объекта. В 1906 г. Бергонье и Трибондо, обобщив накопленный к тому времени экспериментальный материал, сформулировали общее правило о том, что рентгеновские лучи тем сильнее действуют на клетки, чем интенсивнее они делятся и чем менее дифференцированы. Это эмпирическое правило указывало, что ответная реакция клеток на лучевое воздействие зависит от физиологического состояния объекта и его генетической конституции.
С появлением методов культивирования клеток вне организма удалось детально описать характер гибели быстроделящихся малодифференцированных клеток и неделящихся или медленно делящихся высокодифференцированных клеток. Выявление принципиальных различий в реакции на облучение активно пролиферирующих и неделящихся клеточных популяций позволило раздельно исследовать механизмы их лучевого поражения, проявляющиеся феноменом гибели клеток. В зависимости от пролиферативного статуса клеток, а точнее от стадии клеточного цикла, в которой происходит реализация процесса клеточной гибели, различают соответственно репродуктивную и интерфазную гибель.
Репродуктивная и интерфазная гибель облученных клеток
Быстроделящиеся клетки, или клетки, стимулированные к делению). С помощью замедленной киносъемки можно проследить судьбу потомков одной облученной клетки. На рис. VI. 13 показаны клетка линии L, облученная в дозе 2 Гр, и ее потомство.
Первая видимая реакция клеток на облучение — задержка их вступления в митоз, т. е. клетка, облученная в интерфазе, не делится в ожидаемый момент. Опыты с синхронизированными культурами показали, что выраженность задержки деления зависит от стадии клеточного цикла: наибольший эффект наблюдается при облучении клеток в стадиях S и G). Чем больше доза облучения, тем продолжительнее задержка деления.
Через определенный промежуток времени, зависящий от величины дозы, клетки вступают в митоз. Их дальнейшая судьба складывается по-разному. Часть клеток облученной популяции, вступив в митоз, не в состоянии разделиться. Образуются гигантские клетки. Их размеры
mmРис. VI. 13. Результаты наблюдения за потомками клетки линии L, облученной в дозе 0,2 Гр во время поздней S-фазы: 1 — погибшие клетки;2 — гигантская клеткаРис. VI. 13. Результаты наблюдения за потомками клетки линии L, облученной в дозе 0,2 Гр во время поздней S-фазы: 1 — погибшие клетки;2 — гигантская клеткамогут в сотни раз превосходить размеры необлученных клеток. По- видимому, гигантские клетки возникают не за счет набухания, а в результате общего увеличения синтезированных клеточных компонентов (содержание ДНК, РНК и белка увеличивается пропорционально размерам клетки). В конечном итоге, гигантские клетки погибают, вероятно, из-за нарушения механической прочности мембран и изменения оптимального для питания соотношения поверхности клетки и ее объема.
m
m
Рис. VI. 13. Результаты наблюдения за потомками клетки линии L, облученной в дозе 0,2 Гр во время поздней S-фазы: 1 — погибшие клетки;
2 — гигантская клетка
Рис. VI. 13. Результаты наблюдения за потомками клетки линии L, облученной в дозе 0,2 Гр во время поздней S-фазы: 1 — погибшие клетки;
2 — гигантская клетка
Большая часть облученных клеток проходит митоз и делится. Однако сразу же после первого деления появляются погибшие клетки. Еще больше клеток гибнет после второго, третьего и т. д. митозов (рис. VI.13).
Описанный тип гибели неразрывно связан с процессом митоза. Его существенная особенность состоит в том, что облученные клетки в течение определенного промежутка времени сохраняют метаболическую активность, но не в состоянии разделиться с образованием жизнеспособных дочерних клеток, способных делиться далее. До первого постлучевого митоза погибшие клетки не появляются — процессы митоза как бы выявляют летальные повреждения, вызванные облучением. Особенности гибели быстроделящихся клеток подчеркивают термины, которые в разное время были приняты для ее обозначения: «митотическая гибель» («гибель в митозе»), «отсроченная гибель», «гибель при делении», «репродуктивная гибель».
Последний термин получил наибольшее распространение, так как подчеркивает связь этого типа клеточной гибели с процессом репродукции, воспроизводства клеток, для обнаружения которого характерно использование методов количественной оценки репродуктивной способности клеток (способность к образованию колоний in vitro, селезеночных колоний и другие методы оценки клоногенной активности).
Неделящиеся или медленно делящиеся клетки. Примером неделящихся клеток служат дифференцированные нервные или мышечные клетки; к медленно делящимся относятся клетки печени; у малых лимфоцитов и юных ооцитов способность к делению ограничена. Гибель после облучения клеток этого типа, являющихся «постмитотическими», крайне редко делящимися, почти не зависит от деления: облученные клетки гибнут в интерфазе. Для обозначения рассматриваемого типа гибели приняты термины: «немитотическая гибель», «немедленная гибель», «гибель в отсутствие деления», «гибель в интерфазе» — «интерфазная гибель». Каждый из терминов по-своему
подчеркивает особенности рассматриваемого типа гибели клеток, но наиболее распространен последний — «интерфазная гибель».
Отмечены две условных категории вариантов, в которых установлена радиационная гибель по интерфазному механизму: 1) гибель неделящихся или ограниченно делящихся клеток типа лимфоцитов при общем облучении организма или при облучении in vitro в дозах от нескольких десятков сГр и выше; 2) гибель в аналогичных условиях таких неделящихся или редко делящихся клеток, как нервные, мышечные и печеночные при облучении в дозах от нескольких десятков до сотен Гр.
В радиобиологии наибольшее количество исследований посвящено интерфазной гибели лимфоцитов: тимоцитов, лимфоцитов селезенки, лимфоузлов, костного мозга, отличающихся высокой радиочувствительностью.
Основными доказательствами гибели клеток лимфоидной ткани в интерфазе считают следующие.
Совпадение временной динамики гибели лимфоцитов после облучения in vitro и in vivo: первые гибнущие клетки в обоих случаях появляются через 2 часа после радиационного воздействия, а максимальное число их обнаруживается в период 4-8 часов после облучения. Поскольку при инкубации in vitro эта гибель не может быть связана с делением (в отсутствие фитогемагглютинина лимфоциты не делятся), это означает, что клетки погибают в интерфазе.
Другое доказательство строится на цитокинетических расчетах. Известно, что в вилочковой железе (тимусе) животных имеется две субпопуляции тимоцитов: делящиеся, составляющие около 15% общего числа клеток, и неделящиеся — ~ 85 %. Время полуобновления первого контингента 7-8 часов, второго — 40 часов с временем жизни таких клеток 5 суток. При полном нарушении клеточной репродукции 50% клеток убывало бы в органе на 50% за 40 часов, т. е. со скоростью 1,25% в час и 12,5% за 10 часов. Фактически же после облучения в дозе 2 Гр количество клеток в тимусе уменьшалось за это время на 50%, т. е. было в 4 раза выше ожидаемого. Это означает, что нарушение репродукции может быть ответственным не более чем за 1/4 часть пострадиационного опустошения тимуса, основная же причина — гибель клеток в интерфазе.
Наконец, еще одно доказательство радиационной гибели клеток лимфоидной ткани по интерфазному механизму состоит в совпадении цитоморфологических признаков и биохимических проявлений гибели их в интерфазе.
Гибели клетки в интерфазе предшествует ряд закономерных физиологических и морфологических ее изменений. Нарушается ядерное
фосфорилирование, угнетается клеточное дыхание, изменяется проницаемость ядерной, митохондриальной и цитоплазматической мембран — клетки теряют способность препятствовать проникновению в цитоплазму красителей, например эритрозина Б, и становятся окрашенными ими, происходит деградация дезоксирибонуклеопротеид- ного комплекса в ядре, активируются протеолитические ферменты. Среди морфологических изменений наиболее отчетливо выражены набухание и пикноз ядер, вакуолизация и распад ядрышек.
Гибель клеток, как уже отмечалось, происходит через несколько часов (малые лимфоциты, юные ооциты) или в первые сутки (нервные, мышечные, печеночные клетки) после облучения. При действии радиации в очень высоких дозах интерфазная гибель наступает сразу же, «под лучом». В принципе, можно добиться того, чтобы клетки, для которых характерна репродуктивная форма гибели, также погибали в интерфазе до первого митоза. Для этого их необходимо облучать в большой дозе.
Так, известны данные о непосредственной гибели делящихся клеток в культуре при облучении в дозах 5, 10 и более Гр. Наблюдалась гибель делящихся клеток через несколько часов после облучения в дозе несколько Гр перед вступлением в митоз или в интерфазе следующих генераций, что также рассматривается как вариант репродуктивной гибели, поскольку она возникает в связи с клеточным делением.
Модификация лучевого поражения клеток
Чувствительность клеток к летальному (то есть вызывающему гибель) действию ионизирующей радиации можно повысить или понизить при помощи физических, химических и других модифицирующих факторов, изменяющих биологические характеристики клеток (плоидность, уровень метаболитов, интенсивность дыхания и другие процессы обмена веществ).
Модифицирующие факторы пытаются использовать в лучевой терапии, например, для избирательного повышения радиочувствительности опухолевых клеток и защиты от повреждения нормальных клеток и организма в целом от радиации.
Применение воздействий, изменяющих радиочувствительность, способствует выяснению механизмов лучевого поражения клеток. Если какой-либо из внутриклеточных процессов подвергается модификации и при этом меняется устойчивость клеток к облучению, логично предполагать связь этого процесса с механизмом лучевого поражения.
Модификация репродуктивной гибели
Радиочувствительность быстроделящихся клеток к летальному действию радиации удается модифицировать за счет воздействий, изменяющих продолжительность отдельных стадий жизненного цикла, плоидность генома, характер внутриклеточного метаболизма. На
репродуктивную гибель оказывают влияние физические параметры среды — температура, состав атмосферы, присутствие в облучаемой системе ряда химических агентов, степень замещения нуклеотидов ДНК на бромированные аналоги.
Несмотря на многолетние исследования, до сих пор окончательно не ясно, на какие внутриклеточные системы и процессы направлено действие многих модифицирующих факторов. И все же для некоторых из них можно указать предположительные механизмы оказываемого ими влияния (Окада, 1970).
Факторы, способные изменять степень начального радиационного поражения клетки. Установлено, что при облучении в присутствии кислорода увеличивается выход однонитевых разрывов ДНК и эффективность летального поражения клеток. При использовании другого модифицирующего агента — бромдезоксиуридина — происходит включение его в состав ДНК вместо тимидина. В результате при облучении увеличивается число однонитевых разрывов и снижается радиочувствительность.
Цистеамин и цистеин увеличивают устойчивость клеток к действию радиации при одновременном снижении выхода одно- и дву- нитевых разрывов в клеточной ДНК.
Таким образом, модифицируя начальное радиационное повреждение ДНК, можно изменить радиочувствительность быстроделящихся клеток, понизить неизбежность репродуктивной гибели значительной части их.
Факторы, модифицирующие процессы восстановления. При увеличении плоидности клетки повышаются ее устойчивость к действию излучения и способность восстанавливать генетический аппарат от повреждений. Напротив, с ростом ЛПЭ излучения эффективность лучевого поражения клеток увеличивается в 23 раза, и снижается их способность к восстановлению, вероятно, за счет появления трудноустранимых повреждений.
Ряд химических агентов, влияющих на восстановление клеток от радиационных повреждений, модифицирует радиочувствительность (актиномицин Д, циклогексимид, стрептовитацин А и др.).
Известно, что на разных стадиях цикла деления клетки обладают неодинаковой по критерию гибели радиочувствительностью. Для большинства клеток наиболее радиочувствительными являются стадии «поздняя Gi», «поздняя G2» и «М». На стадиях «ранняя Gi» и «поздняя S» клетки наиболее устойчивы к облучению. Некоторые воздействия, изменяя продолжительность отдельных стадий клеточного цикла, делают иным распределение клеток в популяции «по возрасту» и, таким образом, модифицируют радиочувствительность популяции клеток.
Так, понижение концентрации сыворотки в культуральной среде пролонгировало стадию Gi клеток китайского хомячка, при этом радиочувствительность популяции также становилась ниже, чем при 18 Ю. Б. Кудряшов
культивировании клеток в сыворотке нормальной концентрации, где клеток в стадии Gi значительно меньше.
Агенты, блокирующие синтез ДНК, вызывают накопление клеток на поздней стадии Gi и (или) ранней S. При этом клетки оказываются наиболее радиочувствительными.
По данным Синклера (1968), защитный агент цистеамин отменяет «возрастную» зависимость радиочувствительности клеток китайского хомячка — на всех стадиях цикла клетки становятся одинаково чувствительными к облучению. Это означает, что радиационное повреждение состоит из двух компонент — зависящей от возраста и чувствительной к защите цистеамином и не зависящей от возраста, на которую цистеамин не оказывает защитного действия. Механизм различия повреждения в этих компонентах и действия цистеамина на одну из них неизвестен.
Модификация интерфазной гибели
Неделящиеся или медленно делящиеся клетки погибают в интерфазе до первого деления. Как уже отмечалось, гибели клеток предшествует изменение внутриклеточного метаболизма и проницаемости мембран, появление морфологических признаков деградации ядерно- го материала. Можно было ожидать, что воздействия, изменяющие характер метаболизма или защищающие ядерный материал от деградации, модифицируют интерфазную гибель. В целом это предположение подтвердилось.
Физические агенты — температура, газовый состав атмосферы и pH среды — изменяют радиочувствительность клеток по критерию интерфазной гибели. Так как снижение температуры и уменьшение pH способны модифицировать выраженность, частоту проявления интерфазной гибели после облучения, было высказано предположение, что эти факторы влияют на химические реакции, зависящие от температуры и pH и, возможно, имеющие ферментный характер.
Частота интерфазной гибели возрастает при облучении клеток в атмосфере чистого кислорода. Замена кислорода на азот приводит к снижению радиочувствительности. Возможно, эти агенты модифицируют начальное радиационное поражение клеток, тогда степень или особенности начального повреждения могут определять развитие интерфазной гибели.
Химические факторы, модифицирующие интерфазную гибель, делят на три группы.
В первую входят «конденсирующие агенты» — агматин, спермидин, хлористый натрий в высоких концентрациях. Считается, что эти вещества защищают клетки от интерфазной гибели за счет влияния на степень диспергированности хроматина.
Действительно, в их присутствии понижается число клеток с пик- нозом ядер. Однако они не снижают доли погибших клеток, если интерфазную гибель оценивать по выходу К+, уменьшению скорости
дыхания и окрашиванию красителями. Это означает, что пикноз может зависеть от диспергированности хроматина, но другие проявления интерфазной гибели связаны с иными процессами.
Вторая группа веществ включает различные дыхательные яды (цианиды, арсенат натрия, динитрофенол, йодацетат), которые уменьшают число клеток с пикнозом ядер и с пониженным количеством ДНК на клетку. Выход К+ и окрашиваемость эритрозином Б у клеток, облученных в присутствии дыхательных ядов и без них, мало различается. По-видимому, поражение мембран не модифицируется ни первой, ни второй группой веществ.
Третья группа — различные метаболиты. Подробно изучено модифицирующее действие никотинамида и неорганического фосфата. Никотинамид, предшественник НАД, уменьшал вызываемое облучением число пикнозов ядер, но не влиял на выход К+ и окрашиваемость клеток. Эффект неорганического фосфата обнаружить не удалось.
Очевидно, состояние хроматина, интенсивность дыхания и уровень содержания метаболитов играют роль в развитии интерфазной гибели клеток, однако мы не располагаем модифицирующими агентами, способными в равной мере влиять на все эти параметры.
Информация, полученная с помощью модифицирующих агентов, имеет большое значение для выяснения механизмов соответствующих типов клеточной гибели.
О механизмах радиационной гибели клеток
Рассмотренная в разделе 7.1 классификация радиационной гибели клеток на основе зависимости ее проявления от стадии клеточного цикла не может оценить конкретных радиационно-химических изменений после облучения, т. е. ответить на вопрос — какие молекулы, какие субклеточные структуры (органеллы) являются критическими для инициации этой гибели, какие процессы возникают в результате действия излучений и приводят клетку сначала к утрате жизнеспособности, а затем к разрушению. Знание этих механизмов особенно важно для понимания последствий клеточной гибели на уровне целостного организма.
Оказалось, что как репродуктивная, так и интерфазная гибель клеток могут проявляться в двух формах — апоптоза) или некроза).
Если вопрос о некротической гибели издавна связывался биологами с решением проблем неспецифической реакции клетки на различные воздействия, то исследование апоптоза непосредственно
возникло в радиобиологических лабораториях. Исследования механизмов апоптоза начались с изучения радиобиологической проблемы радиационной гибели клеток млекопитающих. Большая часть работ начального периода изучения этой проблемы была выполнена в нашей стране, хотя первую статью на эту тему опубликовали в США.
В 1957 г. Л. Коулом и М. Эллис в радиочувствительной лимфоидной ткани животных было обнаружено значительное повышение после облучения содержания солерастворимой ДНК, оказавшейся на самом деле фрагментами хроматина, получившими название полидезоксинуклеотидов (ПДН). Эти данные вскоре подтвердили Т. Н. Рысина и Р. Е. Либинзон (1960). В дальнейших исследованиях Н. В. Ермолаевой (1961, 1966, 1977, 1978), И. В. Филипповича и Е. Ф. Романцева (1968-84), С. Р. Уманского (19791985), К. П. Хансона и Б. Д. Животовского (1979-1985), Н.И. Рябченко с сотрудниками (1975-1982) и многих других было установлено, что ПДН — это продукты деградации хроматина погибающей части лимфоидной ткани — малых (неделящихся) лимфоцитов, представляющие собой нуклеосомы и их олигомеры с нормальным содержанием гистонов и интактной структурой ДНК-белкового комплекса. Они образуются не в результате образования радиационных разрывов ДНК, а под действием неких ферментов типа эндонуклеаз (но не ДНКазы II), активность которых может быть понижена введением ингибиторов белкового синтеза, что указывает на их индуцируемую природу.
Было установлено далее, что деградация генетического материала в клетках лимфоидной ткани начинается сразу после прекращения пострадиационной репарации ДНК (которая в этом случае, вероятно, остается незавершенной, неполной) и является необратимым этапом радиационной гибели клеток. Вне зависимости от дозы облучения этот процесс начинается после двухчасового лаг-периода и достигает максимальных значений через 6-8 часов после облучения. Деградация хроматина происходит в жизнеспособных по многим показателям клетках, зависит от синтеза белка и функционирования биоэнергетических систем. Ингибиторы этих процессов задерживают деградацию ДНК и проявления гибели клеток.
Распад хроматина происходит по механизму энзиматической межну- клеосомной фрагментации. В гибнущих клетках деградации подвергается большая часть генетического материала, в то время как в клетках, еще не вступивших на путь гибели, она остается интактной. Образующиеся продукты, как уже отмечалось, представляют собой нуклеосомы и их олигомеры.
Деградация хроматина не определяется активацией протеолитических ферментов, ДНКазы I и ДНКазы II и не является, таким образом, следствием автолиза хроматина лизосомными гидролазами. Н. В. Ермолаевой и С. Р. Уманским была установлена природа эндонуклеазы — фермента, осуществляющего межнуклеосомную фрагментацию ДНК, изучены его свойства и причины активации в облученных клетках. Выявлена общность энзиматического механизма деградации хроматина при облучении и действии глюкокортикоидов, алкилирующих соединений и химических индукторов дифференцировки (Н. И. Сорокина, 1984).
Совокупность полученных результатов впервые позволила К. П. Хансону рассматривать механизмы, приводящие клетки к гибели, как адаптивный ответ на внешние воздействия различной природы и еще в 1979 г. сформулировать концепцию о существовании внутриклеточной генетической
Рис. VI. 14. Изменение структуры клеток животных при некрозе и апоптозе. 1 — нормальная клетка. 2, 3 — некротические изменения: 2 — набухание клетки, 3 — некротическая дезинтеграция. 4, 5 — апоптозные изменения: 4 — сморщивание клетки с образованием пузырчатых выростов, 5 — фрагментация клетки с образованием апоптозных везикул
программы, включение которой приводит к деградации генома и гибели клеток. Назначение этой программы в здоровом организме заключается в реализации клеточной гибели в ходе морфо- и эмбриогенеза, в поддержании клеточного гомеостаза тканей и в осуществлении функций цитотоксических лимфоцитов (Т-киллеров).
Описанные здесь результаты изысканий отечественных исследователей послужили стимулом и дали «научную канву» для развертывания аналогичных работ за рубежом. Как это будет очевидно из дальнейшего изложения, основные факты и гипотезы, описанные и сформулированные нашими соотечественниками в отношении механизмов радиационной гибели клеток, получили полное подтверждение и способствовали блестящему развитию в мировой науке научных представлений о молекулярных механизмах апоптоза и о его значимости как общебиологического явления.
На рис. VI. 14 представлена картина морфологических изменений клеток при некрозе и апоптозе (В. Д. Самуилов, 2001). Из приведенного рисунка видна отчетливая разница в изменениях ультраструктуры клетки при ее некрозе и апоптозе.
Непрограммируемая, патологическая форма гибели клетки (некроз) характеризуется увеличением ее объема (набуханием), деградацией и разрывом клеточных мембран. Вследствие этого происходит разрушение органелл, высвобождение ферментов лизосом, выравнивание клеточных градиентов и выход внутриклеточного содержимого наружу, в межклеточные пространства. В организме некроз является результатом внешнего повреждения клетки, приводящего к остановке в ней метаболизма с полной
278 Гл. VI. Реакции клетки на действие ионизирующих излучений утратой способности поддерживать ионный гомеостаз, и обычно сопровождается воспалительной реакцией тканей).
Изменение морфологической структуры клетки при апоптозе происходит в результате сморщивания цитоплазматической мембраны, конденсации ядра, фрагментации нитей ДНК и всего ядерного хроматина с последующим распадом клеточного ядра на части.
Один из ранних морфологических признаков апоптоза — конденсация хроматина со смещением (маргинацией) к внутренней поверхности ядерной мембраны.
Затем происходит фрагментация клетки на мембранные везикулы, включающие в себя фрагменты хроматина, образуются «апоптозные тельца». Клетка внешне «спокойно» (без электрического пробоя и воспаления тканей) распадается на части.
Конечным результатом распада ДНК в клетке при апоптозе является ее расчленение в составе хроматина на двунитевые фрагменты — полинуклеотиды — размером от 50 тысяч пар нуклеотидов до более коротких, олигонуклеотидов, содержащих фрагменты, кратные 180-200 парам нуклеотидов (нуклеосомам). При электрофорезе ДНК хроматина апоптотической клетки представляется в виде «нуклеосомной лесенки». Малые, сформированные из мембран и ДНК пузырьки, называемые апоптотическими тельцами, быстро фагоцитируются макрофагами и близкорасположенными эпителиальными клетками без воспалительного (иммунного) ответа, в противоположность воспалительной реакции, наблюдаемой при выбросе внутриклеточного содержимого некротическими клетками. Еще одно различие апоптоза и некроза: первый затрагивает отдельные, расположенные диспергированно клетки, второй охватывает группы клеток, имеющих взаимные контакты.
При учете гибели клеток по пикнозу ядер появление нежизнеспособных клеток в тимусе крыс наблюдается уже через 2 часа после облучения с максимумом через 6 часов после него. При световой и электронной микроскопии цитофотометрические изменения и нарушения ультраструктуры ядер клеток селезенки крыс, облученных в дозе 6 Гр, обнаруживались в единичных клетках уже к 75 мин. после воздействия. Через 2 часа в ядрах большого числа лимфоцитов селезенки хроматин наблюдался смещенным к периферии, а через 4-6 часов после облучения выявлялся в цитоплазме и вскоре исчезал вообще.
Наконец, в отличие от некроза («убийства ради убийства» любой клетки), апоптоз направлен на поддержание «общего блага» ткани и
организма — сохранения нормального клеточного гомеостаза за счет «самоубийства» клеток, ставших лишними или переставших выполнять свои функции.
Механизм некротической гибели клеток (некроза)
Некротическая, беспрограммная форма гибели наиболее характерна для сильных воздействий, например, для облучения клеток и организма в высоких, летальных дозах. В основе ее — нарушение окислительно-восстановительного равновесия, достигающее уровня патологии. Так, накапливающиеся в облученной клетке ОРТ выступают в роли образователен пор в мембранах. Оксирадиотоксины способны окислять тиоловые группы белков, инициировать гидролиз и окисление ненасыщенных фосфолипидов мембран. В результате этого происходит инактивация в мембранах ион-транспортных ферментов-насосов, содержащих сульфгидрильные группы, например, Са2+-АТФазы. Ферментный выход ионов Са2+ из клетки через мембраны тормозится, и они накапливаются в цитозоле.
Ионы Са2+, как известно, являются активаторами фосфолипазы А2, вызывающей гидролиз фосфолипидов внутренней мембраны митохондрий. Образуются фрагменты фосфолипида — свободные жирные кислоты, которые подвергаются дальнейшему окислению с образованием новых ЛРТ. Кроме того возникает и лизоформа фосфолипидов, обладающая также разрушающими, лизирующими свойствами. Развиваются неспецифические процессы дезинтеграции и нарушения структуры БМ. ОРТ, образуясь в высоких концентрациях, воздействуют на фосфолипиды БМ и образуют в них поры. Появившиеся поры увеличивают ионную проницаемость благодаря образованию ионных каналов. В итоге в митохондрии входят ионы калия, а в клетки — ионы натрия.
Одновременно через мембранные поры происходит усиленное проникновение Н+ в клетку, возрастает градиент протонного потенциала АцН+. Все эти изменения дают начало дальнейшим серьезным повреждениям мембран митохондрий.
Описанные изменения структуры и проницаемости БМ вызывают увеличение осмотического давления внутри клеток и их набухание (рис. VI. 14, 2). Прогрессирующее увеличение градиента Д//Н+ может достичь такого уровня, при котором митохондрии теряют важнейшую для энергетики клетки способность — синтезировать АТФ; происходит разобщение сопряжения процессов дыхания и фосфорилирования (В. П. Скулачев, 2000).
Уже одно это может служить причиной последующей гибели митохондрий и клеток. Рост протонного градиента может достичь пороговых значений электрохимического потенциала (называемого
^ ^ ^КЛЕТКАобразованиеизбыткаОРТ^ ^ ^КЛЕТКАобразованиеизбыткаОРТИОНИЗИРУЮЩИЕИЗЛУЧЕНИЯ
^ ^ ^
КЛЕТКА
образованиеизбытка
ОРТ
^ ^ ^
КЛЕТКА
образованиеизбытка
ОРТ
Образование пор в БМ,нарушение ионнойпроницаемости —набухание клеток.Окислительнаядезинтеграция иэлектрическийсамопробой БМ,некроз.
Рис. VI. 15. Схема модели некротической гибели облученных клеток «потенциалом пробоя» )), когда изменения силы тока от возрастания электрохимического потенциала мембраны уже перестают подчиняться линейной зависимости (по закону Ома). С этого момента ток самопроизвольно возрастает во времени и происходит резкий электрический пробой БМ (так называемой самопробой мембраны).
Происходящее снижение электрической прочности мембраны сопровождается глубокими повреждениями и некротической дезинтеграцией клетки до полного ее разрушения, (рис. VI.14, 3; рис. VI.15).
Описанный механизм оксидативного повреждения и самопробоя БМ электрическим полем с последующим некрозом клетки в терминальной стадии оксидативного стресса не является специфичным только для ионизирующей радиации. В основе патобиологического эффекта разных физических и химических экстремальных воздействий лежит одно и то же последствие: снижение электрической прочности мембраны, создаваемое разностью электрических потенциалов. Предполагается, что самопробой БМ электрическим полем — универсальный механизм нарушения барьерных свойств мембран в патологии и одна из главных причин смерти клеток в экстремальных неблагоприятных условиях (Ю. А. Владимиров, 2000).
Механизмы апоптоза
Развитие и функционирование многоклеточных организмов подразумевает равновесие между синтезом и распадом молекул, их окислением и восстановлением, пролиферацией и гибелью клеток (Д. М. Спитковский, 2002). Этот баланс может устанавливаться на различном уровне в зависимости от стадии развития организма, времени года и т. д. Поэтому апоптоз является частью природного механизма, обеспечивающего этот баланс, физиологическим процессом. Однако в том случае, когда этот процесс активируется под действием
повреждающих факторов, апоптоз становится частью патологического процесса.
Индукция апоптоза характерна не только для действия ионизирующих излучений, но и для многих других патологических явлений в организме, включая канцерогенез. Как полагают, при этом происходит значительное нарушение баланса между скоростью деления и гибели клеток. В организме или культуре клеток стратегия апоптоза используется для элиминации клеток, несущих нерепарируруемые повреждения биологических мембран (например, путем супероксид-зависимого апоптоза), ДНК и, возможно, других макромолекул клетки.
С активацией процессов апоптоза связывают элиминацию апо- птоз-чувствительных субпопуляций клеток в феномене повышения радиорезистентности клеточных популяций к действию ионизирующих излучений в высоких дозах. Так, у ракообразных, облученных в широком диапазоне доз, уровень апоптотической гибели клеток в популяции резко возрастал лишь в интервале от 0 до 0,5 Гр. При этом частота обнаружения клеток, гибнущих по этому механизму, после облучения в дозах от 0,5 до 5 Гр претерпевала лишь незначительные изменения. Такая гиперчувствительность части клеток при действии излучения в малых дозах рассматривается как защитная реакция для популяции клеток в целом, поскольку по механизму апоптоза элиминируются клетки, имеющие генетические повреждения. Хотя эти повреждения не всегда легальны для клетки, однако при делении последних мутации и другие геномные аномалии могут передаваться потомкам, нарушая постоянство генома, и поэтому «нежелательны».
Следует отметить интригующее воззрение о так называемом незавершенном апоптозе, т. е. о том, что начальные стадии в ряде случаев обратимы, а образующиеся при этом клетки с дефектами в геноме могут быть родоначальниками новых клонов, в том числе трансформированных.
Генетически запрограммированный механизм апоптоза, удивительным образом сходный по большинству реакций у животных разных видов, реализуется в 3 стадии: индукции — инициирования (сигнальная), активации механизмов осуществления (контроля и исполнения) и деградации (структурных изменений).
Генетически обусловленный характер апоптоза проявляется не только в определенной последовательности его реакций, но в первую очередь в обязательности активации в клетке тех генов, которые контролируют синтез белков, необходимых для реализации апоптотической гибели. Впервые это было установлено в опытах на нематоде Caenorhabditis elegans американцем Хартвеллом с соавт., удостоенным в 2002 г. Нобелевской премии по физиологии и медицине за выдающийся вклад в изучение механизмов апоптоза. У данного червя программа включает активацию генов клеточной смерти (cell death) ced-3^ ced-4 и ced-9, играющих центральную роль в механизме явления, что приводит к образованию белков CED-3 и CED-4, необходимых для реализации эффекта, а также CED-9, защищающего клетки от гибели путем ингибирования CED-4, активирующего
исполнительную функцию белка CED-3. У млекопитающих гомологом CED-3 является каспаза-1 — белок из семейства 11 цистеиновых протеиназ с аспартатной специфичностью. Термин каспаза (caspase) составлен из букв названия протеаз — Cysteine with Aspartate Specificity ProteASEs, ранее называвшегося семейством ICE (interleukin- 1^-converting enzyme). Кандидатом на гомологию CED-4 у млекопитающих является белок семейства Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1) — активирующего фактора-1 апоптотических протеаз. Белок bcl-2 (и члены образуемого им семейства антиапоптотических белков) является аналогом белка CED-9 в качестве негативного регулятора (ингибитора) каспазы-1.
Каспазы находятся в цитоплазме клетки в неактивном состоянии. После каскада активирующих модификаций под влиянием генных продуктов они переходят в ядро и атакуют в общей сложности около двух десятков структурных и функциональных белков, включая белки проведения сигналов и цитоскелетные. При этом в каждом белке расщепляется та химическая связь, которая находится сразу за аспартатом в специфичной для каждой каспазы аспартатсодержащей последовательности аминокислот. Большинство субстратов расщепляется каспазами-3 и -7, ламин избирательно каспазой-6. Чтобы произошла характерная для апоптоза межнуклеосомная фрагментация ДНК, необходима активация апоптоз-специфической эндонуклеазы. Она происходит путем расщепления каспазой цитоплазматического ингибитора этой эндонуклеазы (ингибитора каспазо-активируемой ДНКазы, фактора фрагментации ДНК).
Только после этого ДНКаза переходит в клеточное ядро и производит деградацию геномной ДНК.
Активация каспаз осуществляется путем восприятия соответствующих сигналов, приходящих из внешней среды или из самой клетки. В результате, как уже отмечалось, возникает экспрессия определенных генов с образованием белковых продуктов с сигнальной функцией. Команды на апоптоз реализуются двумя путями — внешним и внутренним: через так называемые поверхностные рецепторы смерти в клеточной мембране (death receptors, DR) или через митохондрии внутри клетки.
Первый путь начинается с рецепторов смерти, которых в настоящее время насчитывают пять: DR1 (Fas, или Apol), DR2 (TNFR1 — tumor necrosis factor receptor-1, или p55, или CD120a), DR3 (АроЗ, или WSL-1, или TRAMP, или LARD), DR4 и DR5 (Аро2, или TRAIL-R2, или TRICK 2, или KILLER). Среди них главными считаются Fas и TNFR1.
Рецептор ) клеточных мембран — это встроенная в мембраны белковая молекула, обычно состоящая из трех частей. Наружная, неклеточная часть молекулы способна узнавать (подобно узнаванию замком своего
ключа) сигнальные молекулы, которые могут либо свободно плавать во внеклеточной жидкости, либо быть фиксированными на поверхности других клеток (например, лейкоцитов). При взаимодействии сигнальных молекул с наружной частью белка-рецептора происходит изменение конформации рецептора — структурные изменения расположения одних атомов относительно других в макромолекуле рецептора, причем как в наружной его части, так и в средней (погруженной в мембрану) и внутриклеточной его частях. Внутриклеточная часть рецептора передает сигналы клеточным ферментам.
Таким образом, взаимодействуя с соответствующим генным продуктом — своим специфическим лигандом, рецептор формирует последующий сигнал, активирующий каспазы. В итоге индуцируется каскад реакций апоптоза.
Митохондриальный путь активации этого процесса осуществляется каспазой-3. Для своей реализации он требует, помимо АТФ или дАТФ, участия трех белков: зрелой гемсодержащей формы цитохрома с, Apaf-1 (аналога CED3) и каспазы-9 (аналога CED4).
В норме цитохром с содержится в митохондриальном межмембранном пространстве. Выход его в цитоплазму происходит вследствие повреждения митохондрий, приводит к активации каспазы-3 и запуску апоптоза.
Существует и иной вариант митохондриального пути, когда в результате открытия пор проницаемости и утраты протонного и электрического градиента на внутренней митохондриальной мембране из митохондрий выходит белок, получивший название апоптоз-индуци- рующего фактора (apoptosis-inducing factor, AIF), прямо активирующий каспазу-3.
В отличие от некроза, уже незначительные нарушения окислительно-восстановительного равновесия в клетке могут послужить начальной стадией реализации многоплановой программы апоптоза. При этом к ее «запуску» в данной клетке могут быть причастны другие клетки.
На рис. VI. 16 представлена ориентировочная схема реализации апоптоза, вызванного образованием ОРТ в облученной клетке.
Сигналы о неблагополучии клетки.
Даже небольшой избыток оксирадиотоксинов может способствовать появлению на поверхности клетки первичного сигнала — послания во внеклеточную среду информации о неблагополучном состоянии клетки. Таким сигналом часто служит молекула окисленного фосфатидилсерина (ФСОК), появляющаяся на внешней поверхности мембраны.
В структуре БМ в норме существует асимметрия в распределении фосфолипидов. За счет транспортной АТФазы фосфатидилсерин (ФС) удерживается только во внутреннем липидном слое БМ. Образующиеся в клетке ОРТ окисляют фосфатидилсерин, превращая его в ФСОК.
ИОНИЗИРУЮЩИЕИЗЛУЧЕНИЯ^ ^ ^| КЛЕТКА~|
ОБРАЗОВАНИЕ ИЗБЫТКА ОРТсигналы на внешней поверхности БМ неблагополучной клетки
ЛЕЙКОЦИТСИГНАЛЫ >(«ЧЕРНЫЕМЕТКИ»)ЛЕЙКОЦИТСИГНАЛЫ >(«ЧЕРНЫЕМЕТКИ»)>>Г < (ФСОк) V
ЛЕЙКОЦИТСИГНАЛЫ >(«ЧЕРНЫЕМЕТКИ»)
ЛЕЙКОЦИТСИГНАЛЫ >(«ЧЕРНЫЕМЕТКИ»)
>
>
> РЕЦЕПТОР БМ(КОНФОРМАЦИЯ)
IT
сигналы на внутренней поверхности БМ и в -цитозоле неблагополучнойклетки (в том числе -цитохром с и др. свободные белки при митоптозе)
ИЗМЕНЕНИЕ ИОННОГО СОСТАВА ЦИТОПЛАЗМЫ,
АКТИВАЦИЯ ФОСФОРИЛИРУЮЩИХ
И ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ,
БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ
В БЕЛКАХ, ЛИПИДАХ, НУКЛЕОТИДАХ
активация белковых регуляторов,образование белков и РНК
АКТИВАЦИЯ ПРОТЕАЗ И НУКЛЕАЗ
РАЗРУШЕНИЕ ЖИЗНЕННО ВАЖНЫХ БЕЛКОВ,ФРАГМЕНТАЦИЯ ДНК С УЧАСТИЕМАКТИВИРОВАННОЙ ДНКазы
УПЛОТНЕНИЕ И ФРАГМЕНТАЦИЯ ХРОМАТИНА,РАСПАД КЛЕТКИ НА АПОПТОЗНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ,ПОГЛОЩАЕМЫЕ МАКРОФАГАМИ
Рис. VI. 16. Схема модели апоптоза облученной клетки
ФСОК либо инактивирует АТФазу, либо фермент не способен удерживать (транспортировать) окисленный фосфолипид. Это приводит к проникновению ФСОК из внутреннего липидного слоя плазматической БМ во внешний. Так на клеточной поверхности появляется апоптоз- ный сигнал избытка ОРТ — сигнал о неблагополучии клетки.
Химический сигнал о неблагополучии узнается окружающими клетками (например, лейкоцитами), которые могут передать неблагополучной клетке решение о необходимости самоубийства с помощью своего сигнала, условно обозначим его «черной меткой».
« Чернив метки».
Во многих случаях атакующие лейкоциты выделяют на «приговоренную к самоубийству» клетку собственные АКСС (например, супероксид-анионы), увеличивающие на ее поверхности концентрацию ФСОК, т. е. усиливают этот сигнал, который затем посылается внутрь клетки для реализации программы апоптоза (рис. VI. 16).
В других случаях лейкоциты под влиянием ФСОК выделяют вблизи меченой клетки белки — перфорин и гранзимы. Перфорин проделывает поры в плазматической мембране, а гранзимы проникают через них в клетку и запускают программу апоптозного механизма.
Еще один пример принудительного апоптоза и передачи различных «черных меток» — это секреция лейкоцитами индукторов апоптоза, например, фактора некроза опухоли — TNF (tumor necrosis factor), а также цитокина, которые связываются с соответствующими рецепторами на поверхности апоптической клетки. TNF и кинины способны инициировать сразу несколько различных механизмов апоптоза.
Сигналы, появляющееся в цитозоле в результате апоптоза митохондрии.
В последнее время термин «апоптоз» распространен на явление лизиса митохондрий в клетке. Апоптоз клеточной органеллы — митохондрии (митоптоз) — начинается с открытия пор во внутренней мембране митохондрии.
Внутренние мембраны митохондрии содержат фосфолипазу А2, вызывающую в присутствии ионов Са2+ гидролиз фосфолипидов с образованием свободных жирных кислот и лизофосфолипидов.
В интактной митохондрии фосфолипаза А2 неактивна, поскольку ионы кальция находятся только на внешней мембране органеллы. При облучении под влиянием образующихся ОРТ в мембранах появляются поры, через которые ионы Са2+ проникают внутрь и активируют фосфолипазу А2. Продукты гидролиза и окисления — лизофосфолипиды и окисленные жирные кислоты (ЛРТ) — приводят к значительным повреждениям мембраны митохондрий.
Происходит набухание матрикса, разрыв внешней митохондриальной мембраны и освобождение в цитозоль межмембранных белков и
цитохрома с. Освобождение цитохрома с и других митохондриальных белков происходит значительно раньше, чем истощение внутриклеточного АТФ. К освобождаемым белкам относятся, помимо цитохрома с, AIF ), Smac ) и прокаспаза ) (прокаспаза-9). Все они могут включаться в реализацию сигнала от поврежденной митохондрии к клетке.
В интенсивно делящихся клетках обычно вырабатываются различные белковые вещества, называемые факторами роста^ стимулирующие клеточное деление. Они взаимодействуют с внутриклеточной частью рецептора, часто — с несколькими рецепторами. Отсутствие сигналов от факторов роста может говорить о неблагополучии и необходимости также включения программы реализации апоптоза.
Имеются сведения о том, что апоптотические сигналы, идущие от внутренней части рецептора, могут миновать генетический аппарат и напрямую активировать протеазы, гидролизующие белковые структуры клетки. Важную роль для сигналов такого типа могут играть продукты распада митохондрий.
Недавно появились новые данные о еще одной возможности инициирования генетической программы апоптоза. Открытие в последние годы способности ОРТ непосредственно вступать в реакцию с ДНК и образовывать МДА-, этено-, пропано- и другие оксиаддукты ([ОРТ^ДНК]), обладающие генотоксическим (мутагенным) и цитотоксическим (инициирующим апоптоз) действием, позволяет предположить важную роль аддуктов ОРТ с ДНК в запуске и реализации наследуемой программы радиационного апоптоза. Однако это предположение требует экспериментальных подтверждений.
Большое разнообразие и многостадийность проведения сигналов, вынуждающих неблагополучные клетки гибнуть, становится понятной в связи с важностью самой проблемы равновесного состояния живой системы. Все неблагополучие клетки может происходить подчас от неспособности ее защитных ресурсов справиться с избытком ОРТ. Поэтому информация о степени собственного неблагополучия, принятие и выполнение решения о самоубийстве — задача очень сложная и ответственная, и она решается в клетке в рамках строгой последовательности событий проявления уже упоминавшейся предсуществующей программы апоптоза [192]. Хотя многие детали ее остаются пока еще не выясненными, в целом эта последовательность проиллюстрирована на представленной выше схеме (рис. VI. 16).
Возникновение апоптоза под влиянием сигналов повреждения не является фатальным. В зависимости от интенсивности того или иного альтернативного процесса регуляции (действующего по принципу: «усилить сигнал» данного повреждения или «ослабить его» имеющимися защитными ресурсами) решается вопрос о продолжении или
приостановке развития апоптоза. Апоптотическим сигналам противодействуют целые семейства белков с антиапоптотическими функциями, в частности, образуемое белком bcl-2. Недавно идентифицирован еще и белок BAR (bifunctional apoptosis regulator), способный подавлять передачу апоптотических сигналов как по внешнему, так и по внутреннему путям.
Итак, апоптоз завершается потерей целостности, фрагментацией клетки. Хроматин — главный ядерный компонент, состоящий из ДНК и белков, уплотняется, а ядро и клетка распадаются на апоптозные тельца — везикулы (рис. VI. 14, 5). Однако в некоторых программах апоптоз возможен и без фрагментации ДНК. Появляющиеся везикулы уничтожаются макрофагами.
Морфологическая и биохимическая картина апоптоза, имеющая общие черты сходства для самых разных клеток эукариот, имеет также и важное биологическое значение для жизнедеятельности организма. Это поддержание клеточного гомеостаза, реализация программы индивидуального развития, дифференцировка некоторых специализированных клеток организма, это механизм защиты организма (наряду с иммунной системой) от действия ксенобиотиков и возбудителей инфекционных заболеваний, направленного на изменение наследственных свойств и жизнеспособности клеток.
В завершение данного раздела приведем общую схему механизмов радиационной гибели клеток, любезно предоставленную нам в 2002 г. проф. В. К. Мазуриком (рис. VI.17).
В результате воздействия ионизирующей радиации в тканях многократно возрастает содержание оксирадикалов (по отношению к естественному фону их метаболической продукции) — супероксидного OJ. гидроксильного ОН’, NO — субстрата для образования вещества с радикальными функциями — пероксинитрита. Оксирадикалы вызывают структурные изменения в ряде биологически важных макромолекул, имеющие характер необратимых повреждений. Часть этих повреждений реализуется в виде продукции клетками сигнальных молекул общеклеточного повреждения.
В качестве таких молекул, выделяемых во внеклеточное пространство, выступают фактор некроза опухоли (TNF) или Fas-(CD95)-nH- ганд, являющиеся прямыми инициаторами апоптоза, либо митогены, необходимые для прохождения клеткой клеточного цикла, возникновение дефицита которых приводит к необратимому блокированию ее на какой-то из стадий цикла, что инициирует апоптоз.
Внутриклеточными сигналами апоптоза становятся неустранимые повреждения ДНК (в особенности двунитевые разрывы), высвобождение церамида из мембран под действием оксирадикалов (в результате активации сфингомиелиназ или активация его синтеза церамидсинта- зой), высвобождение цитохрома с из митохондрий в результате изменения мембранной проницаемости.
Однако после облучения в сверхлетальных дозах эти каскады, так же как и продукция макроэргов в окислительно-восстановительных
Ионизирующая радиация^ ^ ^Многократное возрастание в тканях содержания оксирадикалов
Генерация оксирадикалами сигналов необратимого повреждения —
внеклеточных, таких как:внеклеточных, таких как:- высвобождение фактора некроза опухоли (TNF) и CD95-лиганда (Fas-лиганда) — дефицит митогенов- высвобождение фактора некроза опухоли (TNF) и CD95-лиганда (Fas-лиганда) — дефицит митогеноввнутриклеточных, таких как:
внеклеточных, таких как:
внеклеточных, таких как:
- высвобождение фактора некроза опухоли (TNF) и CD95-лиганда (Fas-лиганда) — дефицит митогенов
- высвобождение фактора некроза опухоли (TNF) и CD95-лиганда (Fas-лиганда) — дефицит митогенов
неустранимые повреждения ДНК
высвобождение церамида из мембран под действием оксирадикалов в результате активации сфингомиелиназ или активация его синтеза церамидсинтазой
высвобождение цитохрома с из митохондрий в результате изменения мембранной проницаемости
^1^
Действие сигнальных молекул на сенсорные структурыпрограммы апоптоза (программируемой клеточной гибели)
в клетках
V,После облучения в сублетальных и летальных дозах —рецепция сигналов повреждения и активация программ апоптозаV,После облучения в сублетальных и летальных дозах —рецепция сигналов повреждения и активация программ апоптоза^1
V,
После облучения в сублетальных и летальных дозах —
рецепция сигналов повреждения и активация программ апоптоза
V,
После облучения в сублетальных и летальных дозах —
рецепция сигналов повреждения и активация программ апоптоза
После облучения в очень высоких летальных дозах — инактивация компонентов сигнальных каскадов, невозможность реализации программируемой клеточной гибели —
НЕКРОЗ
^1
Активация рецепторов смерти на плазматической мембране:
DR1 (Fas, или Apol), DR2 (TNFR1, или р55, или CD120a), DR3 (АроЗ, WSL-1,TRAMP, или LARD), DR4 и DR5 (Аро2, TRAIL-R2, TRICK 2, или KILLER)
Ф
Активация каспазного каскада (диссоциация комплекса каспаз-9, -3 и-4, связывание каспазы-4 с каспазой-3 с активацией последней),приводящего к деструкции клеточных компонентов до низкомолекулярныхпродуктов, включая хроматин ДНК с образованием продуктов егодеградации, формирующих при электрофорезе характерную «лесенку»
Ф
АПОПТОЗ
Рис. VI. 17. Схема, иллюстрирующая современные представления о механизмахрадиационной гибели клеток
реакциях, оказываются инактивированными под действием радиационных радикалов. В результате этого реализация программируемой клеточной гибели становится невозможной. Возникает процесс некротических изменений клетки. Утрата ионных градиентов приводит к набуханию субклеточных структур и клеток до таких размеров, а натяжение ограничивающих их мембран до таких величин, при которых мембраны становятся неспособными сохранить свою механическую целостность и разрываются, выбрасывая содержимое в межклеточные пространства. Радиационная гибель клеток реализуется как некроз.
После облучения в сублетальных и летальных дозах происходит рецепция сигналов повреждения и активация программ апоптоза: сначала уже упоминавшихся рецепторов смерти на плазматической мембране — DR1 (Fas, или Apol), DR2 (TNFR1, или р55, или CD120a), DR3 (АроЗ, WSL-1, TRAMP, или LARD), DR4 и DR5 (Аро2, TRAIL- R2, TRICK 2, или KILLER), затем киназных каскадов Erk (extracellular signal regulated kinase — киназа, регулируемая внеклеточными сигналами) и JNK (с-Jun N-terminal kinase — с-Jun-терминальная киназа), обеспечивающих транскрипционную активацию генома и синтез белков для реализации программируемой клеточной гибели и активации необходимых для нее зимогенов. В конечном итоге наступает исполнительская стадия апоптоза — активация каспазного каскада: происходит диссоциация комплекса каспаз-9, -3 и -4, связывание каспазы-4 с каспазой-3 с активацией последней и под действием их деструкция клеточных компонентов до низкомолекулярных продуктов, в первую очередь, хроматина ДНК с образованием продуктов его деградации, формирующих при электрофорезе характерную «лесенку».
Общий биологический закон самоликвидации — биологический смысл апоптоза
Гибель «во имя высшей цели»
Рассмотренные процессы защиты облучаемой клетки от возникающих повреждений, вызывающих нарушения структуры ДНК и окислительно-восстановительного равновесия, свидетельствуют о глубоко эшелонированном и последовательном развитии этих процессов. Мы видели, что в клетке существует тщательно отрегулированный, многокомпонентный и разнообразный по способам действия аппарат предупреждения и защиты от оксидативных повреждений клеточных структур, вызываемых ОРТ.
Однако этим эндогенный механизм противолучевой защиты не исчерпывается, если оценивать способность клеток ликвидировать себя в целях защиты всего организма. В этом случае, например, апоптоз клеток можно рассматривать не как самоубийство, а скорее как самопожертвование для организма.
В последнее время установлено, что механизмы апоптоза свойственны не только клеткам, но они также присущи субклеточным и надклеточным структурам [321]. В.П.Скулачев сформулировал общий биологический закон самоликвидации: «любая достаточно сложная биологическая система (от органеллы и выше) всегда готова к самоликвидации. Она кончает с собой, если становится опасной для самого существования живой системы, занимающей более высокую ступень в иерархии организации жизни». Самоликвидация митохондрий была названа митоптозом, а органов и тканей (например, в норме, в эмбриональном развитии) — органоптозом. Как мы видели, важный сигнальный механизм в норме, а также цито- и генотоксические эффекты самопожертвования инициируются образованием АПК и возрастанием активности ОРТ.
Митоптоз, апоптоз и некроз клеток в облученном организме
Если радиационное воздействие на организм еще в нелегальных дозах способно увеличить содержание АКСС в митохондриях, то в популяции митохондрий клетки может оказаться уже такое количество митоптозов, свободных цитохрома с и проапоптических белков, что уровень их окажется способным активировать механизм следующего этапа защиты — самоликвидации клетки. Наступает апоптоз клеток, содержащих поврежденные митохондрии. Эта часть клеток с повышенным содержанием продуктов распада выбраковывается и удаляется из ткани облученного организма. Все это может происходить раньше, чем наступает некроз митохондрий и клетки.
При облучении организма в более высоких, летальных дозах, когда защитные механизмы оказываются уже неспособными противостоять повреждениям, количество некротизированных митохондрий быстро возрастает, и клетки «без разбора» погибают раньше от некротического убийства, чем произошла бы самоликвидация некоторых из них путем апоптоза. Таким образом, вслед за снижением эффективности химической защиты организм может терять и биологический механизм восстановления, начиная с субклеточного уровня.
Степень поражения организма, лучевые синдромы зависят от изменений во времени соотношения эффектов повреждения и восстановления элементов систем на разных уровнях организации их структуры и функций. Хорошо известно, например, что в зависимости от диапазонов доз острого облучения организма наблюдаются различные лучевые синдромы, являющиеся следствием массовой гибели популяций клеток и клеточного опустошения тех или иных «критических» органов и тканей (см. гл. VII).
Другим важным многоплановым механизмом системного ответа на облучение являются процессы пострадиационного восстановления клеток.
Процессы восстановления облученных клеток
Среди радиобиологов давно утвердилось представление о том, что организмы способны избавляться по крайней мере от части нанесенных им радиационных повреждений. На это указывали следующие эксперименты.
Частота гибели организмов, длительность задержки деления, выраженность различных морфологических и биохимических эффектов облучения уменьшаются в том случае, когда доза радиации сообщается в виде отдельных фракций с достаточным промежутком времени между ними. Было предположено, что перерыв между отдельными фракциями облучения используется для ликвидации ряда повреждений.
В начале пятидесятых годов Н. В. Лучник подробно изучил частоту структурных мутаций в клетках, делящихся через разные интервалы времени после облучения, и показал, что чем больше этот интервал, тем меньше выражен биологический эффект. Автор предположил, что наблюдаемая закономерность объясняется восстановлением клеток от
первичных повреждений. Были получены данные о корреляции между радиорезистентностью хромосом и наклоном кривых «доза-эффект». Аналогичное уменьшение лучевого поражения наблюдалось и в том случае, когда облучение в данной дозе радиации происходило в течение длительного времени, т. е. при малой мощности дозы.
Этот эффект можно объяснить тем, что решающей оказывается скорость нанесения повреждений. Если она соизмерима со скоростью и эффективностью работы восстановительных систем, то организм окажется в состоянии исправлять возникающие повреждения, не допуская их реализации.
Группа фактов получена при различных воздействиях на уже облученные биологические объекты. Варьируя состав питательной среды, освещенность, температуру во время инкубации, газовый состав атмосферы и другие факторы, удается значительно снизить поражающее действие радиации. Ни один из этих факторов не в состоянии повлиять на степень начального радиационного повреждения, поэтому естественным выглядит предположение о том, что в данном случае создаются оптимальные условия для протекания восстановительных процессов.
Так, в 1957 году, проводя эксперименты на дрожжевых клетках, В. И. Корогодин открыл реальное существование эффекта пострадиационного восстановления. Он показал, что способность клеток к образованию макроколоний частично восстанавливается, если облученные дрожжи высевать на питательную среду не сразу после облучения, а после выдерживания их в воде.
Принципиальной новизной эффекта восстановления явилась неизвестная ранее способность клеток спонтанно избавляться от лучевых и иных ДНК-зависимых повреждений, вызывающих летальные и генетические эффекты. Сама идея восстановления противоречила распространенному тогда представлению о необратимости лучевых повреждений мишени.
Открыв явление пострадиационного восстановления, В. И. Корогодин выдвинул концепцию «потенциальных повреждений» в облученной клетке, концепцию, не противоречащую, а развивающую трактовку принципов количественной радиобиологии с позиций зависимости «время-эффект». Согласно этой концепции, в результате поглощения энергии ионизирующих излучений, отдельных попаданий, могут формироваться потенциальные повреждения структур клеток. Эти повреждения, развиваясь во времени, «способны приводить к проявлению единиц реакции, только пройдя фазу реализации». В интервал времени между потенциальным повреждением и его реализацией возможно протекание восстановительных процессов, которые подчиняются статистическим закономерностям.
Вскоре была обнаружена способность клетки репарировать ДНК от разрывов, возникающих под воздействием ионизирующих излучений, и показана связь восстановления ДНК с радиорезистентностью клетки.
Основные характеристики процесса восстановления клеток от летального радиационного повреждения были изучены в 60-х годах благодаря использованию метода культивирования одиночных клеток млекопитающих. Этот метод позволил проводить количественные радиобиологические эксперименты на клетках млекопитающих с такими же точными результатами, какие ранее получали только на бактериях, вирусах и фагах.
Одно из наиболее подробных исследований в этом направлении было проведено Элкиндом и Саттон на клетках китайского хомячка. Когда популяцию клеток облучали однократно в дозах 9,92, 5,05 или 4,87 Гр, выживало соответственно 0,186%, 8,2% и 9,5% клеток.
Рассмотрим результат облучения в дозе 5,05 Гр. Летально поврежденными оказались 91,8% клеток, и только 8,2% были либо не повреждены, либо несли су б л стальные повреждения, которые могли проявиться при последующем облучении. Если эту же популяцию клеток после облучения в дозе 5,05 Гр повторно облучить в дозе 4,87 Гр, то возможна одна из трех ситуаций: 1) репарация летального и сублетального повреждений завершится к моменту повторного облучения; предполагаемая выживаемость будет равняться 9,5%; 2) су б л стальные повреждения будут полностью восстановлены, а летальные сохранятся; предполагаемая выживаемость составит 0, 082 х 0, 095 = 0, 0078 (0,78%); 3) ни одно из повреждений не будет репарировано, и выживаемость двукратно облученной популяции не будет отличаться от выживаемости в случае однократного облучения в дозе 9,92 Гр, т. е. составит 0,186%.
В конкретных условиях эксперимента наблюдаемая в действительности выживаемость изменялась от 0,186 до 0,78%, находясь при этом в зависимости от интервала времени между двумя облучениями. Наибольшая выживаемость наблюдалась в том случае, когда интервал между облучениями превышал 10 часов.
Это означает, что клетки, имеющие сублетальные повреждения (о них свидетельствует «плечо» на кривой «доза-эффект»), успевают к моменту повторного радиационного воздействия полностью завершить восстановление и, следовательно, не погибают от добавочного сублетального повреждения, нанесенного второй дозой радиации.
Таким образом, полученные данные позволили их авторам заключить, что клетки млекопитающих способны ликвидировать сублетальные, подпороговые повреждения, нанесенные ионизирующим излучением.
Для выяснения природы восстановления от сублетальных повреждений изучали влияние различных модифицирующих факторов на этот процесс. Увеличение ЛПЭ излучения, облучение в условиях аноксии или использование клеток малой плоидности приводило к снижению до минимума начального восстановления. По-видимому, в этих случаях образуется крайне мало сублетальных повреждений (сужается «плечо» на кривой «доза-эффект») и большое число летальных.
Использование различных ингибиторов и активаторов не позволило выявить роль синтеза ДНК или белков, окислительного фосфорилирования или дыхания в этом процессе.
Анализ температурной зависимости указывает на участие ферментов в восстановлении от сублетальных повреждений. Способность актиномицина D в низких концентрациях подавлять восстановление позволило Элкинду и соавторам высказать гипотезу, согласно которой связывание антибиотика молекулой ДНК препятствует процессу восстановления либо за счет перевода репарированной ДНК в функционально неактивное состояние, либо за счет ингибирования образования комплекса ДНК—РНК—белок. Ни природа сублетальных повреждений, ни молекулярный механизм их восстановления до настоящего времени все еще не выяснены.
Другая разновидность процесса восстановления была обнаружена в экспериментах с клетками млекопитающих, которые после облучения подвергали воздействию различных химических и физических агентов. Еще одна — восстановление от потенциально летальных повреждений — обнаружено при облучении клеток в неоптимальных условиях — пониженной температуры, при помещении клеток в дефицитную питательную среду, в условиях торможения синтеза ДНК и т. д.
Филипс и Толмач в 1966 г. провели наблюдения над облученными клетками HeLa, к которым через различные сроки после однократного облучения прибавляли оксимочевину. Оказалось, что этот препарат увеличивает летальное поражение клеток, если его прибавить сразу же после облучения. Удлинение интервала времени между радиационным воздействием и прибавлением оксимочевины до 6 часов полностью предотвращало гибель облученных клеток, вызванную оксимочевиной.
Следовательно, за этот период потенциально летальные повреждения, чувствительные к оксимочевине, перешли в состояние, нечувствительное к этому химическому агенту. Так как используемые концентрации оксимочевины вообще не влияли на необлученные клетки, то наблюдаемый эффект можно объяснить тем, что в результате облучения в клетках индуцировались сублетальные повреждения, для перехода которых в летальные требуется дополнительное воздействие оксимочевиной. За счет функционирования репаративных систем эти повреждения могут быть восстановлены, однако для этого требуется определенный интервал времени для активного синтеза ДНК и белков.
Аналогичные результаты на клетках китайского хомячка были получены с использованием актиномицина D. который увеличивает гибель облученных клеток, переводя су б л стальные повреждения в летальные (уменьшает «плечо» на кривой выживаемости). Если между облучением и прибавлением актиномицина D проходит 2-8 часов, то способность антибиотика увеличивать летальное поражение резко падает. Это означает, что восстановительные системы клетки переводят сублетальные повреждения, чувствительные к актиномицину D.
в нечувствительное состояние. По ряду признаков последний эффект имеет много общего с восстановлением, описанным Элкиндом и Саттон, но отличается от репарации потенциально летальных повреждений, реализуемых оксимочевиной.
Одним из наиболее вероятных механизмов, определяющих способность клетки избавляться от сублетальных повреждений, может быть процесс репарации радиационных нарушений структуры ДНК. Во- первых, уникальность текста, записанного в ДНК, и его значение для клетки совершенно исключают замещение пораженных облучением молекул вновь синтезированными. Во-вторых, сама структура ДНК позволяет проводить работы по исправлению генетического «текста», так как он присутствует в двух комплементарных копиях.
Согласно принятому определению, восстановление — это процесс ликвидации явных или (и) скрытых повреждений. При явном повреждении восстановление заключается в возврате исходных свойств объекта после периода, в течение которого они вследствие облучения были изменены. При скрытом повреждении (потенциально летальном) восстановление состоит в утрате способности к реализации повреждения.
Наконец, наблюдаются восстановление от повреждений в клетках, не гибнущих от облучения. Обнаруживается это при так называемом адаптивном ответе, когда эффект восстановления регистрируется по возрастанию выживаемости клеток при облучении в дозе, разделенной интервалом времени на две фракции по сравнению с облучением в одной суммарной дозе (см. гл. VII, «адаптивный ответ»).
Ведущую роль в изучении процессов пострадиационного восстановления клеток вновь сыграли успехи молекулярной биологии по исследованию ферментных систем, репарирующих повреждения ДНК.
Изучены различные репаративные ферменты, одни из которых как бы усиливают первичные лучевые повреждения ДНК (в том числе — экзо- и эндонуклеазы), другие — ликвидируют их (полимеразы, лигазы, фосфатазы). К процессам пострадиационного восстановления клеток оказались причастными также некоторые гормоны и факторы роста, влияющие на отдельные хромосомы и их фрагменты. Оценка соотношений между активностью первой и второй групп ферментов дала важную информацию о механизмах усиления повреждений и восстановления главной мишени радиационного воздействия мишени — ДНК.
Таким образом, по мере развития радиобиологических исследований становилось совершенно очевидным, что существует множество путей репарации лучевых повреждений на всех уровнях организации живого: молекулярном, клеточном и уровне целостного организма.
Параллельно с вопросами, изученными в упомянутых работах, в ряде лабораторий исследованы «физические» и молекулярно-биологические механизмы пострадиационного восстановления и доказано, что клетки мутантных бактерий, простейших, млекопитающих и растений восстанавливаются от летальных, сублетальных и мутационных
изменений. В многоклеточном организме восстановление клеток от повреждений в разных органах и тканях также имеет свои особенности.
Так, наибольшей скоростью восстановления клеточного состава обладают активно пролиферирующие ткани за счет репарации стволовых клеток, еще сохранивших свою жизнеспособность. Показана количественная зависимость ОБЭ от Л ПЭ разных видов ионизирующих излучений, ОБЭ по зависимости между восстановлением хромосом и понижением летального эффекта излучений, восстановлением генов и выходом мутаций отдельных генов.
Весьма плодотворным в изучении механизмов радиационного повреждения и пострадиационного восстановления оказались представления о важной роли кислорода в этих процессах, а также о модифицирующем действии ряда радиопротекторов и радиосенсибилизаторов.
Наконец, все более актуальной становится необходимость учитывать новые подходы к пониманию биофизических механизмов формирования радиационных эффектов — принимать в расчет принципи системного ответа клетки на облучение: наряду с ролью деструктивных процессов исследовать вклад в формирование радиационных эффектов реакции систем репарации, контроля и регуляции, заложенных в клетке.
Глава VII
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ МАЛЫХ ДОЗИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ.
ОТДАЛЕННЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ОБЛУЧЕНИЙ
В предыдущих главах учебника основное внимание уделялось облучению в таких дозах, которые приводили к инактивации молекул, значительным проявлениям эффектов лучевого поражения и гибели клеток. Однако не менее важной оказывается проблема биологических эффектов воздействия ионизирующих излучения низкой интенсивности в малых дозах, которая в последние годы стала особенно актуальной и заняла доминирующее место в радиационной биофизике, особенно в связи с интересом к радиоэкологическим проблемам.
Казалось бы простая, линейная экстраполяция от больших доз к малым, вплоть до величины естественного радиационного фона (рис. VII.2, пунктирная линия) могла бы легко решить вопрос о последствиях слабых воздействий, механизм которых мог бы свестись к одному лишь количественному понижению выраженности радиобиологических эффектов. Действительно, среди многих радиобиологов существовала долгое время известная парадигма: «большие дозы облучения вызывают большие повреждения, малые дозы — меньшие». То, что это не так, следует из результатов ознакомления с эффектами облучения организмов в малых, нелегальных дозах: открывается картина качественно иных радиобиологических явлений, не свойственных лучевым поражениям, инициируемым облучением в больших дозах.
Для характеристики эффектов облучения биологических объектов в малых дозах приведем данные, позволяющие сравнить эти эффекты с характером поражающего действия больших доз при внешнем общем однократном воздействии ионизирующих излучений.
Лучевые реакции многоклеточных организмов
От больших (летальных) доз облучения к малым (нелетальным) дозам
Известно, что у многоклеточных организмов при остром облучении в больших дозах гибель вызывается клеточным опустошением «критических» органов и тканей. Опустошение происходит в
результате повреждения и гибели клеток тех «критических» органов и тканей, которые первыми выходят из строя в исследуемом диапазоне доз облучения, приводящих к лучевым синдромам. При внешнем однократном общем облучении в очень больших дозах гибель организмов происходит под лучом, при меньших дозах — через различные интервалы времени.
В современной радиобиологической литературе достаточно подробно изучено лучевое поражение критических органов у млекопитающих, облученных в больших дозах. Поэтому остановимся лишь на отдельных интересующих нас вопросах.
В зависимости от степени тяжести лучевой патологии причиной гибели организма может стать «отказ» различных органов. Описаны следующие основные лучевые синдромы, базирующиеся на органной патологии: костномозговой (кроветворный), кишечный и церебральный (ЦНС). При этих лучевых синдромах обнаружена прямая зависимость морфологических и функциональных изменений критических систем от величины поглощенных доз ионизирующей радиации, свидетельствующая о закономерной связи клеточного опустошения с клеточной кинетикой или радиационной гибелью соответствующих критических органов и тканей многоклеточных организмов.
На рис. VII. 1 представлены данные интегрального радиационного показателя — изменения средней продолжительности жизни облученных животных, полученные разными авторами в опытах на некоторых видах млекопитающих.
Органы кроветворения относятся к наиболее радиочувствительным критическим органам: поражение костного мозга, тимуса, лимфатических
узлов, селезенки представляет собой ведущее звено в развитии костно-
Рис. VII. 1. Зависимость средней продолжительности жизни животных от внешнего общего однократного рентгеновского облучения в больших дозах (лучевые синдромы). Сплошная линия — мыши, точечная (о) — крысы, пунктирная (+) — морские свинки, штрих-пунктирная (•) — обезьяны
однократным равномерным воздействием рентгеновского или д-излучений в дозах, близких к среднелетальним (2,5-3 Гр для человека, собаки и свиньи, 4,5 Гр для морских свинок, 6-6,5 Гр для мышей и хомячков, 7,5 Гр для кроликов). Наиболее важным результатом поражения этих органов, приводящим к изменениям морфологического состава периферической крови, является клеточное опустошение перечисленных органов. Пострадиационные изменения числа клеток разного типа в периферической крови у млекопитающих и человека являются зависимыми от дозы облучения, многофазными во времени после радиационного воздействия и сходными по форме характеризующих их кривых.
Выделяют 3 фазы изменений в клеточном составе крови: 1) ранняя дегенеративная; 2) максимальное понижение числа клеток; 3) регенерация. При более детальном анализе выявляется большее число фаз: 1) лаг-фаза, характеризующаяся сохранением (или первоначальным повышением, как в случае нейтрофилов) количества клеток по сравнению с исходным уровнем; 2) 1-го опустошения; 3) абортивного подъема; 4) повторного опустошения; 5) восстановления, или регенерации.
Выраженность и время проявления описанных фаз после облучения зависят от поглощенной дозы ионизирующего излучения. После облучения в низких и среднелетальных дозах глубина опустошения менее значительна, а восстановление устойчиво. При смертельных дозах падение числа клеток резкое, раннее, глубокое, восстановление хотя и может начаться, но не завершается, так как наступает гибель.
В основе этих изменений лежат радиобиологические механизмы апоптоза в процессе интерфазной (с максимумом через 6-8 часов после облучения) и репродуктивной гибели клеток, а также связанное с задержкой прохождения клетками по циклу нарушение кинетики клеточных популяций в органах кроветворения (костном мозге, тимусе, селезенке), поддерживающих клеточный гомеостаз в периферической крови.
В настоящее время общепринято предложенное В. Бондом, Т. Флидне- ром и Д. Аршамбо распределение всех клеток системы крови и кроветворения в зависимости от степени зрелости относить к следующим четырем пулам: а) в костном мозгу это 1) стволовые клетки; 2) делящиеся-созреваю- щие; 3) уже неделящиеся, но еще созревающие клетки; б) в периферической крови — зрелые клетки.
Время пребывания клеток в каждом пуле до перехода в другой для всех ростков кроветворения (направлений дифференцировки) определяется цитокинетическими параметрами этих клеток и у животных разных видов различно.
Наиболее радиочувствительными клетками являются стволовые: Do для плюрипотентных стволовых клеток костного мозга мышей составляет около 1 Гр, для предшественников гранулоцитарно-макрофагального ростка — около 1,6 Гр. После облучения мышей в дозе 1,5 Гр выживает 10-20%, в летальных дозах — 0,1-1% стволовых кроветворных клеток костного мозга.
По мере созревания радиочувствительность клеток понижается. Так, клетки предшественники В-лимфоцитов мышей имеют Do, равную 0,89 Гр, дифференцирующиеся клетки — 1,25 Гр, зрелые В-лимфоциты — 2,23 Гр. Т-клетки в стадии дифференцировки имеют Do, равную 4,41 Гр, зрелые — 10,95 Гр.
Таким образом, после облучения больше всего гибнет стволовых клеток, меньше — клеток следующих пулов, и вообще не погибают до отведенного им природой обычного срока зрелые клетки периферической крови. Убыль
их в кровяном русле после облучения оказывается проявлением естественного отмирания, она целиком зависит от равновесия между естественной продолжительностью жизни клеток разного типа и темпом их восполнения из кроветворных органов. Когда в результате облучения в органах кроветворения возникают Qi-, S-, G2- и М-блоки клеточного цикла и гибель клеток- предшественников элементов крови, естественный «поток» клеточных элементов из центров кроветворения в кровяное русло «усыхает», равновесие нарушается, смещается в сторону естественной клеточной убыли, и наступает клеточное опустошение.
В фазе восстановления длительность стадий клеточного цикла и пребывания клеток-предшественников в каждом пуле сокращается, благодаря повышенному темпу деления новообразование клеток возрастает, восполнение начинает превышать естественную клеточную убыль и происходит резкое увеличение содержания, восстановление числа клеток в крови, быстро приближающееся к исходным (до облучения) значениям.
В целом большой вклад в изучение закономерностей клеточного опустошения органов кроветворения и иммунитета при лучевом поражении внесли исследования П. Д. Горизонтова и его учеников (Г. П. Груздев, О. И. Белоусова, М. И. Федотова) в 60-70-е годы прошлого столетия. Ими было установлено, что процесс клеточного опустошения указанных органов начинается уже в ближайшие часы после облучения. Он обусловлен при дозах около 1 Гр миграцией, а при больших дозах — апоптозом клеток, линейно зависит от дозы облучения и в костном мозге, тимусе, селезенке может приводить к 50-90%-му понижению числа клеток.
Установлен значительный вклад в клеточное опустошение глюкокорти- коид-зависимого апоптоза.
Гибель клеток лимфоидной ткани приводит к тому, что это освобождает кроветворные стволовые клетки от существующего в норме ингибирующего действия на их репродукцию со стороны отдельных фракций лимфоцитов. Устранение ингибирующего влияния со стороны лимфоцитов становится сигналом и условием постепенного восстановления численности клеток (репопуляции, регенерации) сначала в кроветворной и лимфоидной системе, а затем в системе крови (А. М. Поверенный).
Исследование закономерностей и механизмов клеточного опустошения кроветворных и лимфоидных органов, их связи, в частности, с феноменом апоптоза, при параллельном изучении биохимическими методами позволило установить дозовые и временные закономерности метаболических превращений (катаболизма) продуктов деградации хроматина (ДНК) при лучевом поражении. Оказалось, что эти превращения являются радиобиологической основой радиационного феномена дезоксинуклеозидурии — повышенной экскреции дезоксинуклеозидов с мочой из облученного организма. Закономерности проявления этого феномена в пострадиационный период (зависимости «доза-эффект» и «время-эффект») являются адекватным отражением выраженности апоптоза среди облученных контингентов клеток и закономерностей клеточного опустошения радиочувствительных органов на уровне организма (В. К. Мазурик). При определенных условиях этот феномен и присущие ему закономерности проявления рассматривались как реальная биохимическая основа для разработки методов ранней диагностики и дозиметрии острых лучевых поражений человека (Т. А. Федорова, О. Я. Терещенко, В. К. Мазурик).
Большой интерес в оценке костномозговой формы гибели животных представляют работы Е. И. Щербовой (1984) по сопоставлению двух критических тканей — кроветворной и сосудистой — у различных по радиочувствительности видов млекопитающих. Обнаружено, что видовые различия степени тяжести лучевого поражения зависят как от глубины поражения гемопоэза — исходной численности пула стволовых клеток кроветворения, выраженности гибели костномозговых клеток делящегося- созревающего пула, высоты и продолжительности абортивного подъема нейтрофилов периферической крови и т. д., так и от времени наступления процесса восстановления. Характерно, что у радиочувствительных видов млекопитающих геморрагия, развивающаяся вследствие гибели клеток- предшественников тромбоцитов, зависит не только от тромбоцитопении, но в значительно большей степени (по сравнению с радиорезистентными видами) от непосредственного поражения эндотелиальных клеток кровеносных сосудов (Воробьев, Степанов, 1985).
При кишечном синдроме, развивающемся после облучения в дозах от 8-10 до 10-15 Гр, подавление обновления клеток в криптах и ворсинках кишечника наблюдается в более ранний период, чем полное подавление обновления клеток в кроветворных органах. Через трое суток после облучения происходит почти полное исчезновение эпителиоцитов и бокаловидных клеток (Расина и др., 1977).
Высокая радиочувствительность стволових клеток кишечного эпителия и связанные с нею уровень содержания и морфофункциональное состояние эпителиоцитов являются определяющими в формировании кишечного синдрома. Отмечается возрастание уровня содержания в ткани перекисных соединений, активности ферментов протеолиза и автолиза, оказывающее общетоксическое действие на организм (Нестеренко, Паршков, 1982).
После общего облучения мышей в дозах, вызывающих кишечный лучевой синдром, создаются условия, при которых эпителиального покрытия кишечника и желудка уже недостаточно для поддержания жизни организма, в результате этого все животные погибают на 3-5-ые сутки. Так называемая «кишечная гибель» животных наступает при резком снижении в слизистой оболочке кишечника содержания крипт, ворсинок (более чем вдвое), а также в особенности стволовых клеток. В результате оголения эпителиального покрытия фатальными оказываются быстро развивающаяся инфекция кишечной микрофлоры, поражение сосудов и др. (Федоровский, 1976; Яр- моненко, 1984). В конечном счете тяжесть лучевого поражения эпителия тонкого кишечника, смертность от кишечной формы лучевой болезни (как и в случае кроветворного синдрома в результате поражения гемопоэтической системы) во многом определяется уровнем выживаемости соответствующих стволовых клеток (Коноплянникова, Коноплянников, 1984).
Центральная нервная система — морфологически наиболее радиоре- зистентная критическая система. Зрелая нервная ткань состоит из непролиферирующих высокодифференцированных клеток, не способных замещаться в организме.
Церебральный синдром наиболее четко начинает проявляться у млекопитающих при возрастании дозы общего облучения от 10-15 Гр до 200 и более Гр. После некоторого латентного периода у животных возникают двигательные нарушения, появляются судороги, и они погибают в коме. После облучения в сверхвысоких дозах (более 100-150 Гр) сразу после облучения у животных возникают двигательное возбуждение, нарушения
координации движений, клонические судороги. Затем наступает общая заторможенность (вялость, пониженная реакция на болевые раздражители), длящаяся около одних суток. За несколько часов до гибели развивается повторное возбуждение, но в более резкой форме, более глубокие нарушения координации движения и судороги типа тонических.
Время наступления симпотомов обратно пропорционально дозе облучения, а величины доз, вызывающих церебральный синдром, у разных видов животных имеют значительные различия. Подобно кроветворному и кишечному синдромам, формирующимся вследствие функциональной и морфологической инактивации клеточных элементов соответствующих органов, церебральный синдром формируется на основе радиационного поражения клеточных элементов центральной нервной системы и неспособности нейронов обеспечивать синаптическую нейропередачу из-за нарушения функций нейронов головного мозга, обусловленной дезинтеграцией синаптических и других клеточных мембран (Лаврова и др., 1983). При сопоставлении эффектов локального облучения головы и общего облучения обнаружено, что гибель крыс от церебрального синдрома является в основном системным ответом всего организма, а не только следствием непосредственного действия излучения на ткань головного мозга. У более крупных животных таких видов, как собаки и обезьяны, церебральный синдром может быть вызван облучением только области головы при экранировании остальной части тела. На облучение организма в массированных дозах мозг реагирует как единый многотканевой орган: прямые поражения нейронных структур и расстройства циркуляции, связанные с поражением стенок кровеносных сосудов, обычно сопутствуют друг другу (Воробьев, Степанов, 1985).
При гистологическом исследовании головного мозга животных с проявлениями церебрального синдрома в ткани этого органа наблюдаются многочисленные пикнотические нервные клетки, периваскулярные инфильтрации, явления воспаления мозговых оболочек и отек. Гибель нейронов обнаруживается обычно после облучения в сверхвысоких дозах (свыше 100 Гр), относится к интерфазному типу и обусловлена как радиационным повреждением этих клеток, так и компрессией их вследствие повышения внутричерепного давления.
Тщательные исследования позволили установить у крыс и мышей так называемую переходную (от кишечного к церебральному синдрому) форму острой лучевой болезни (характерную и для других видов млекопитающих) в диапазоне доз общего облучения от 15 до 20 Гр у-квантов. Эта переходная форма подобна токсемической, которую объясняют интоксикацией организма продуктами распада облученных тканей в клинике острой лучевой болезни человека (Гуськова, Байсоголов, 1971).
При этой форме поражения, помимо явлений поражения кишечника, наблюдаются застойное полнокровие печени, селезенки, головного мозга, а также множественные кровоизлияния в легкие и почки.
К числу причин нарушения функции нервной системы и гибели облученных животных от шокоподобного состояния относят нарушение гемодинамики центрального происхождения, а также отек мозга.
Таким образом, характер лучевых синдромов, возникающих у животных, определяется дозовыми характеристиками облучения и динамикой процессов поражения и восстановления. Развитие костномозгового и кишечного синдромов определяется кинетикой клеточного опустошения критических органов: соответственно кроветворной системы и кишечника.
Церебральный синдром является следствием функциональной инактивации и гибели нервных клеток. При этом неделящиеся или медленно делящиеся дифференцированные радиорезистентные клетки других критических органов взрослого организма погибают в интерфазе путем апоптоза, а по мере увеличения доз облучения в диапазоне сверхвысоких — во все большем количестве по некротическому механизму гибели (Окада, 1974; Хансон, Комар, 1985).
В последнее время подчеркивается взаимосвязь между мерой дифференцированности клеток и их чувствительностью к действию излучений (Филиппович и др., 1985; Эйдус, 2001). Так, апоптоз и некротическая гибель клеток в облученном организме рассматриваются в связи с развитием процессов клеточной дифференцировки. В первом случае излучение оказывает влияние на скорость клеточного деления, во втором — на процесс самой дифференцировки. Известны примеры изменения после облучения скорости и направления клеточной дифференцировки (в стволовых кроветворных клетках), упорядоченности расположения клеток (нейронам головного мозга) и др.
Пострадиационное клеточное опустошение различных критических органов, обусловленное нарушением кинетики клеточных популяций, гибелью и элиминацией погибших клеток, происходит не только в результате непосредственного поглощения энергии излучений критическим органом или тканью, но зависит от функционального состояния этих образований в момент поражения, от эндогенного фона резистентности, нервно-гуморальных, клеточно-регуляторных и других процессов, связывающих критические и «менее критические» структуры между собой (Акоев и др., 1972; Кудряшов, 1966, 1987, 2001; Гончаренко, Кудряшов, 1980, 1998; Бурлакова, Мазурик, Михайлов, 2001). Важную роль в поражении критических структур играют «дистанционные эффекты», «лучевой токсический эффект», нарушения окислительно-восстановительного гомеостаза. Однако эти механизмы еще недостаточно изучены для оценки их количественного вклада в тот или иной конкретный лучевой синдром. Это связано не столько с недостаточностью знаний о лучевых нарушениях регуляторных механизмов или о развитии токсических процессов в организме, сколько с тем, что прямой перенос известных молекулярных нарушений на события, происходящие в более сложных системах — в организме, пока еще методологически затруднен. Кроме того, все еице нет достаточной ясности в вопросе о количественном соотношении прямого или опосредованного (косвенного) действия излучений на исследуемые структуры.
Для млекопитающих и человека смертельными дозами считаются такие, при которых после острого или пролонгированного облучения часть популяции организмов погибает в течение 30 (животные) или 45 суток (человек).
При переходе к облучению в малых дозах последовательное снижение дозы уже не приводит к преждевременной гибели организмов, однако повреждение (или изменение) тех или иных органов и тканей или проявления лучевой патологии могут быть обнаружены по различным биологическим и медицинским показателям.
Рис. VII.2. Биологические эффекты облучения организмов в сублетальных дозах. ЕРФ — «ультрамалые дозы» естественного (природного) радиационного фона; I — эффекты облучения в «сверхмалых» дозах, феномен гиперрадиочувствительности; II — эффекты облучения в малых дозах, вызывающих стимуляцию биологических процессов — гормезис; III — развитие структурно-функциональных повреждений при облучении в «средних сублетальных» дозах; IV — условная граница между «большими» и «средними» дозами для млекопитающих составляет ~ 1-2,5 Гр. Пунктиром обозначена линейная экстраполяция из области больших доз
Оценивая биологические последствия (эффекты) облучения организмов, удобно делить их на летальные, возникающие в результате действия излучений в больших дозах, и нелетальные (сублетальные), инициируемые воздействием ионизирующих излучений в малых и средних дозах. В отличие от эффектов острого облучения в летальных дозах, биологический ответ на облучение в нелетальных дозах, оцениваемый по субклиническим показателям, имеет немонотонный характер, при графическом описании — S-образный вид. В определенном диапазоне доз наблюдаются эффекты стимуляции, а не повреждения или угнетения таких процессов как, например, клеточное деление, рост и развитие организмов. На рис. VII.2 представлена схема последовательной смены эффектов, вызываемых внешним общим однократным облучением организмов в сублетальных дозах.
Следует отметить, что экспериментальные факты о фазовой, немонотонной зависимости биологических эффектов от дозы облучения в диапазоне малых доз противоречат линейной концепции, официально принятой еще в 1978 г. Международной комиссией МКРЗ и НКДАР
ООН). На рис. VII.2 пунктиром обозначена экстраполяция из области больших доз, осуществленная исходя из упомянутой гипотетической линейной концепции. Видно явное расхождение теоретической зависимости «малые дозы—гипотетический линейный ответ» с реальными фактами синусоидальной зависимости ответа биологических объектов и систем на облучение в малых дозах.
Понятно, что отмеченные в схеме и таблице эффекты облучения в малых дозах не могут служить для точного количественного определения величины «дозы», а являются только иллюстрацией ответной реакции биологических объектов на облучение.
Численные физические величины диапазона малых доз для разных организмов при таком определении могут сильно различаться. Для млекопитающих, например, условная граница между летальными и сублетальными дозами лежит в области 1-2,5 Гр при внешнем общем однократном облучении (ср. рис. VII. 1 и VII.2). Для других таксономических групп организмов, в зависимости от различий их радиочувствительности, эта граница может значительно отличаться (даже на несколько порядков) от упомянутой. Однако нелинейная зависимость радиобиологических изменений от величины дозы облучения и времени после облучения — характерный признак динамики эффектов облучения в малых дозах. К такому выводу пришли многие радиобиологи, особенно в последнее десятилетие, используя физиологические, биохимические и цитогенетические методы.
Обобщение большого экспериментального материала показало, что многочисленные и самые разнообразные биологические параметры клеток и тканей животных, хронически облученных в малых дозах, обнаруживают нелинейный, немонотонный характер зависимостей «время-эффект» и «доза-эффект» и что фазовые изменения метаболизма как функции времени и дозы — это общебиологическое явление, отражающее включение различных путей поддержания гомеостаза. Так, по мнению И. К. Коломийцевой (1999-2003) немонотонность кривых «доза-эффект» является результатом нелинейной зависимости «время-эффект». В фиксированной временной точке зависимость «доза-эффект» может принимать немонотонный характер. При этом наблюдаются обратные отношения проявлений эффекта от дозы. При изменении дозы радиации меняются как амплитуда, так и период колебаний.
Как видно из схемы, для наиболее высоких значений сублетальных доз (рис. VII.2, III) еще существует прямая зависимость ответа (размера повреждения) от величины дозы облучения. Можно выделить этот участок кривой в область «средних сублетальных» доз (или иначе — «промежуточных» — между большими и малыми дозами облучения)
(рис. VII.2, III). Остальная, немонотонная часть кривой, относится к малым дозам. Она имеет два противоположно направленных максимума: собственно малые дозы (рис. VII.2, II), вызывающие «гормезис» — стимуляцию жизненных процессов (табл. VII.1), и «сверхмалые» дозы — всплеск повреждений, соответствующий эффекту гиперрадиочувствительности (рис. VII.2, I).
Естественный радиационный фон (ЕРФ) изображен на схеме в качестве начальной точки отсчета радиобиологических изменений. Его биологическая роль источника излучения с ультрамалыми мощностями доз ранее вообще не принималась во внимание, так как оказалась сложной корректная постановка биологического эксперимента со значительным снижением уровня фона природной радиации.
Характеристика биологических эффектов облучения в малых дозах
Значение ультрамалых мощностей доз естественного радиационного фона
Вопрос о том, какое значение для жизни на нашей планете имеет постоянное действие излучений с ультрамалыми мощностями доз (10-15 мкР/час) или облучения (~ 1 мЗв/год) за счет естественного (природного) радиационного фона, долгое время оставался не изученным. На основе экстраполяции от больших, летальных доз к фоновым строились лишь предположения (рис. VII. 1, пунктирная линия), что ЕРФ представляет собой низший уровень наносимого ионизирующими излучениями организму вреда, такого как спонтанная заболеваемость раком, наследственные и другие болезни, встречающиеся обычно без дополнительного облучения.
Первые эксперименты по выяснению биологического значения ЕРФ были поставлены только в 1965 г. Изучая скорость размножения парамеций при экранировании их от ЕРФ свинцом), X. Планель обнаружил, что снижение фона природной радиации приводит не к улучшению, а наоборот к ухудшению развития клеточных культур и замедлению скорости деления клеток. На следующий год X. Планель доложил о своих экспериментах на III Международном конгрессе по радиационным исследованиям в Кортина д’Ампеццо и опубликовал данные, выводы из которых с трудом воспринимались научной общественностью.
Затем, в 60-70 годах появились новые работы X. Планеля, а также А. М. Кузина, А. А. Козлова, Т. Д. Люкки и др., показавших, что снижение внешнего ЕРФ (космического и Земного) замедляет скорость деления одиночных клеток (простейших, водорослей, культуры клеток), эмбриональное развитие насекомых, рост и развитие растений
и животных. В дальнейшем стали применяться подземные термостатируемые железобетонные камеры — бункеры. Радиобиологические исследования в таких бункерах подтвердили выводы о положительной роли ЕРФ в жизнедеятельности организмов.
Внесение в камеры солей урана, излучение которого восстанавливало ЕРФ, при сохранении всех других условий полностью снимало эффект угнетения развития организмов.
Однако при одном только экранировании организмов от действия внешнего ЕРФ наблюдалось все же незначительное снижение жизнеспособности организмов (в 1,2-1,5 раз), поскольку при такой постановке экспериментов оставалось еще внутреннее облучение, главным образом, за счет эндогенного радионуклида) 40К. Только в 80-90 годах начали проводить эксперименты на высших растениях и животных с использованием их экранирования в сочетании с удалением радона из воздуха и заменой в организме при поступлении с пищей радиоактивного калия на стабильный. При такой защите организмов от внешнего и внутреннего ЕРФ мощность природного облучения резко падала и происходило значительное, более чем вдвое, угнетение жизненных процессов.
С 1977 по 2002 г. опубликовано 5 монографий А. М. Кузина, в которых обобщен большой фактический материал собственных исследований автора и мировой литературы, дан его последовательный анализ и сформулирована идея о роли ЕРФ для жизнедеятельности живых организмов. Автор пришел к выводу, что ЕРФ не только не вреден для биоты, а необходим для ее существования на нашей планете.
Открытие жизненно важной необходимости непрерывного облучения организмов от источников природной ионизирующей радиации в ультрамалых дозах поставило перед радиобиологами задачу выяснения биофизического механизма этой зависимости.
Незадолго до своей кончины А. М. Кузин выдвинул концепцию о роли ЕРФ в формировании «вторичного биогенного излучения», представляющего собой когерентное, очень слабое по интенсивности ультрафиолетовое излучение, характерной особенностью которого является стимуляция митозов, клеточного деления, образования «внутреннего радиационного поля». При обосновании этой концепции он опирался на периодически утверждавшиеся в биофизической литературе теории: биологического поля и митогенетических лучей А.Г. Гурвича (1932, 1934); внутри- и внеклеточных эффектов сверхслабого когерентного электромагнитного излучения В. П. Казначеева и Л. П. Михайловой (1981); клеточного биофотонного излучения Ф. Попа (1989).
Особый интерес представляют исследования в этом направлении Б.Н.Тарусова и его школы, посвященные «сверхслабому свечению», испускаемому любыми живыми клетками (Ю. А. Владимиров, Ф.Ф. Литвин, 1959; В. А. Веселовский, 1965; Б.Н.Тарусов, И. И. Иванов, Ю. М. Петрусевич, 1967 и др.). Ими обнаружено, что измерение сверхслабого свечения — биоэлектрохемилюминесценции — открывает широкие возможности оценки физиологического и физико-химического статуса клетки в норме и на различных стадиях стрессовых состояний организма и является важнейшим способом получения информации об изменениях окислительно-восстановительного равновесия в биологических системах.
Концепции биологической значимости поглощения энергии ЕРФ и вторичного спонтанного испускания излучений живыми системами являются важным шагом в расширении радиационно-биофизических представлений и нуждаются в дальнейшем развитии на основе экспериментальных исследований.
Эффект воздействия излучений в сверхмалых дозах.
Гиперрадиочувствительность
В конце прошлого столетия появились сообщения о том, что однократное облучение клеток млекопитающих в сверхмалых дозах — от исходной «нулевой» отметки ЕРФ до ~ 5-20 сГр, вызывает у них так называемый эффект гиперрадиочувствительности (рис. VII.2,1), оцениваемой по биохимическим (нарушение окислительно-восстановительного гомеостаза) и цитогенетическим показателям (аберрации хромосом, выход клеток с микроядрами, злокачественная трансформация и др. прецизионные показатели), имеющим при больших дозах облучения связь с выживаемостью клеток.
В настоящее время этот феномен показан более чем на трех десятках линий клеток млекопитающих, а также в опытах на многоклеточных организмах.
В качестве одного из примеров гиперрадиочувствительности, проявляющейся в тканях облученных организмов, можно привести данные из работ Е. Б. Бурлаковой. Автором этих исследований обнаружено, что уже при незначительном (на 1-3 порядка) превышении ЕРФ при общем однократном облучении в диапазоне сверхмалых доз наблюдается характерный «колоколобразный» по форме кривой всплеск оксидативных изменений в липидах.
Обнаруженное изменение получило название эффекта сверхмалых доз или «эффекта колокола». Показано, что в основе его лежат нарушения конкурентных отношений между про- и антиоксидантами в окислительно-восстановительном гомеостазе, возникающие при облучении в сверхмалых дозах в клетках и тканях животных и растений, одиночных клетках и биологических мембранах. Эти изменения наблюдаются как при кратковременном, так и пролонгированном облучении в сверхмалых дозах.
Так, у мышей после общего хронического внешнего воздействия 7- излучения (мощность дозы 0,6 мГр/сут) установлены статистически достоверные изменения уровня содержания в надпочечниках адреналина и кортикостероидов: возрастание на 1/3 при дозе 0,6 мГр, возвращение к норме после облучения в дозе 1,2 мГр и начало падения ниже нормы уже при воздействии в дозах 2,4-5,4 мГр (Е. Н. Гончаренко и соавт., 2000).
В последние годы появились работы, позволяющие более полно характеризовать природу «эффекта колокола» в организмах, облученных в сверхмалых дозах: наблюдаемые изменения уровней содержания АФК, ППОЛ и АО у животных, облученных в сверхмалых дозах, характерны для неспецифических реакций живых систем на слабые воздействия.
Таким образом, изменения внутриклеточных структур, а также содержания биологически активных веществ, участвующих в механизмах реализации первичных реакций оксидативного стресса, наблюдаются после облучения в очень незначительных по величине дозах и отражают асинхронность конкурентных процессов повреждения и репарации, окисления и восстановления.
Радиационный гормезис
Еще в конце XIX века было известно, что ряд химических соединений оказывает стимулирующий эффект на рост и развитие микроорганизмов, грибов, водорослей, растений. Впоследствии это явление было обнаружено на самых разнообразных биологических объектах. Термин «гормезис» впервые появился в научных публикациях в 1942 г. при описании стимуляции клеточного деления и роста грибка под влиянием антибиотика в малых концентрациях, тогда как в больших концентрациях антибиотик оказывал угнетающее действие. Таким образом, гормезис — это неспецифический эффект воздействий на живые организмы в малых дозах (концентрациях), вызывающих изменения, диаметрально противоположные повреждающим эффектам при воздействии в больших дозах.
Анализ характеристических показателей гормезиса для разнообразных химических веществ показал, что вызываемый последними эффект имеет пределы выраженности: высота стимуляции в максимуме обычно не превосходит 130-160% от контроля, а верхний предел дозы или концентрации, при которой еще наблюдается гормезис, обычно не превышает более, чем в 1020 раз минимальные значения дозы (концентрации), при которых эффект стимуляции возникает (Кейлабрезе и Болдуин, 1999).
Вскоре после открытия ионизирующего излучения Рентгеном стали появляться отдельные сообщения, в которых наряду с поражающим действием больших доз радиации иногда обнаруживались и стимулирующие эффекты при облучении биологических объектов в малых дозах. Однако эти сообщения были немногочисленны, и основное внимание радиобиологических работ было приковано к поражающему действию ионизирующих излучений. Беспороговая линейная концепция, предполагающая опасность любого, даже самого малого превышения естественного радиационного фона, была положена в
основу рекомендаций МКРЗ. Мы уже отмечали, что эта парадигма не выдержала проверки временем. В 1980 г. вышла монография Т. Д. Л юкки, в которой автор обобщил данные литературы и привел собственные эксперименты о биологическом эффекте ионизирующих излучений в малых дозах, которые в отличие от воздействия в больших, повреждающих дозах оказывают диаметрально противоположное, «благоприятное», стимулирующее действие на рост, развитие и жизнедеятельность клеток и многоклеточных организмов. Такие ответные реакции на облучение в малых дозах были объединены автором под названием «радиационной гормезис».
Стало очевидным, что гормезисные эффекты, производимые радиацией в малых дозах, характеризуются теми же свойствами и теми же характеристическими параметрами описывающих их графиков, что и при химическом гормезисе. Это является еще одним доказательством проявления неспецифической защитной реакции организмов и клеток на лучевые воздействия. Реальность радиационного гормезиса нашла подтверждение в многочисленных исследованиях, результаты которых показали, что облучение в малых дозах вызывает неспецифический ответ, а одно из проявлений его — гормезис — аналогичен стадии адаптации стрессовой реакции.
В качестве иллюстрации проявлений гормезиса приведем табл. VII.1, составленную А. М. Кузиным (1989), с нашими дополне-
Таблица VII. 1. Примеры сравнения биологических эффектов действия ионизирующих излучений в больших и малых дозах
Объект исследования
Критерий действия радиации
Результат действия радиации в дозах
больших
малых, вызывающих гормезис
парамеции, фито- и зоопланктон, дрожжи, клетки в культуре
скорости деления клеток, роста популяции, синтеза ДНК
понижение, вплоть до полного прекращения процесса
возрастание
семена, растения
всхожесть семян, рост, развитие растений
задержка, прекращение
стимуляция
эмбрионы насекомых и птиц
рост и развитие
задержка, прекращение
стимуляция
насекомые, птицы, рыбы, млекопитающие
плодовитость
падение
возрастание
животные, человек
иммунитет
угнетение
активация
ниями. Как видно из таблицы, эффект гормезиса обнаруживается на разных уровнях организации живых систем и проявляется событиями, противоположными наблюдаемым при больших дозах.
В связи с резким различием видовой радиочувствительности абсолютные величины диапазона малых доз для разных биологических объектов, как уже отмечалось, сильно отличаются. По расчетам А. М. Кузина, область малых доз, вызывающих гормезис, лежит, как правило, ниже полулегальных доз LD^ на о дин-два порядка при внешнем общем однократном облучении. Например, для человека и ряда млекопитающих LD^q составляют 4-5 Гр. Поэтому дозы для них от 0,4-0,5 Гр и ниже могут быть отнесены к малым. Полулегальная доза для многих семян растений существенно выше и находится в диапазоне 200-500 Гр. Следовательно область малых доз для них имеет верхнюю границу, характеризуемую уже более высокими величинами, т. е. 2-5 Гр.
Некоторые особенности действия радиации в нелетальных дозах
В отличие от действия ионизирующих излучений в больших дозах, облучение в малых, нелегальных дозах в определенных диапазонах обладает способностью вызывать «индуцированную резистентность» — повышение устойчивости биологических объектов к экстремальным радиационным воздействиям, в результате чего обнаруживается обратная зависимость биологических изменений от моицности доз облучения (табл. VII.2).
Таблица VII.2. Особенности действия ионизирующей радиации в нелетальных (малых и средних) дозах в сравнении с действием в больших, летальных дозах на одиночные клетки, растения и животных
Критерий действия радиации
Результат действия радиации
больших дозах
в малых и средних дозах
устойчивость к повторному облучению в большой дозе (D2)
понижается
возрастает (радиоадаптивный ответ)
эффективность мощности дозы облучения
прямая зависимость радиобиологического ответа от мощности дозы облучения
более эффективно пролонгированное или хроническое облучение с малой мощностью дозы по сравнению с большой мощностью (непрямая зависимость радиобиологического ответа от мощности доз)
Радиационно-индуцированный адаптивный ответ
Радиационно-индуцированный адаптивный ответ («радиоадаптив- ный ответ») — это реакция биологических объектов, которая заключается в том, что после действия излучения в малых, адаптирующих дозах Dy при повторном облучении через определенный интервал времени в больших, проявляющих дозах D^ радиобиологический эффект от дозы D2 понижается, иными словами, облучение в малой дозе в определенном интервале доз способно вызывать состояние повышенной радиоустойчивости (табл. VII.2).
Особенностью радиоадаптивного ответа обычно являются многократные различия в величинах адаптирующей Dy и проявляющей D2 доз облучения, а также фиксированные интервалы времени между двумя экспозициями (например, для мышей и крыс — две недели, а для клеток млекопитающих — 4-6 часов).
Эти параметры подвержены колебаниям в зависимости от объекта исследований, условий облучения и выбранного радиобиологического теста.
Обязательное соблюдение интервала времени между облучениями в дозах Di и D2 указывает на то, что программа переключения клеток на адаптивный ответ требует сравнительно продолжительной перестройки радиорезистентности, которая может сохраняться в течение многих клеточных циклов. Так, если экспозиция адаптивного ответа на клеточном уровне обычно требует 4-6 часов, то сохраняться ответ может несколько часов, суток, месяцев.
Последний феномен позволяет говорить о двух возможных способах реализации адаптирующих воздействий:
включение новой генетической программы,
индуцированные радиацией синтез белков и мобилизация антиокислителей, т. е. эндогенных защитных ресурсов клетки, в количествах, способных поддерживать состояние готовности к адаптивному ответу в течение нескольких клеточных поколений.
Так, было обнаружено, что через 4-6 часов после воздействия д-излучения в адаптирующих дозах в лимфоцитах человека появляются вновь синтезированные белки, которые могут быть кандидатами на роль адаптивных белков. Известно также, что уже вскоре после действия ионизирующих излучений в адаптирующих дозах в клетке происходит накопление антиокислителей-адаптогенов, выполняющих функцию противолучевых средств.
Радиоадаптивный ответ обнаружен при облучении растительных и животных организмов, а также в опытах на лимфоцитах человека, мыши и кролика, фибробластах китайского хомячка, клетках костного мозга и сперматоцитах мышей. При адаптивном ответе можно достичь 50-60% снижения количества генных, хромосомных мутаций или других нарушений генома, а также иных проявлений повреждения биологических объектов. Наиболее общим, интегральным критерием адаптивного ответа в опытах на животных является изменение их выживаемости после повторного, проявляющего воздействия рентгеновского или д-излучения.
Рис. VII.3. Влияние предварительного облучения в адаптирующей дозе ГЦ на выживаемость мышей после повторного (через 14 суток) облучения в проявляющей дозе 6 ГрРис. VII.3. Влияние предварительного облучения в адаптирующей дозе ГЦ на выживаемость мышей после повторного (через 14 суток) облучения в проявляющей дозе 6 Гр
Рис. VII.3. Влияние предварительного облучения в адаптирующей дозе ГЦ на выживаемость мышей после повторного (через 14 суток) облучения в проявляющей дозе 6 Гр
Рис. VII.3. Влияние предварительного облучения в адаптирующей дозе ГЦ на выживаемость мышей после повторного (через 14 суток) облучения в проявляющей дозе 6 Гр
На рис. VII.3 представлен один из примеров радиоадаптивного ответа лабораторных животных на действие облучения в однократных малых и средних дозах Dy (по М. Д. Померанцевой и Л.Х.Рамайя, 1962). Из рисунка видно, что облучение мышей в нелетальных для них дозах от 0,5 до 2,5 Гр способно увеличивать выживаемость животных до 25- 30% после воздействия в повторной дозе D2 = 6 Гр (эта доза — абсолютно летальная при однократном облучении, т. е. выживаемость при ней равна 0). Двухнедельный интервал между двумя облучениями (Di и D2) оказывается оптимальным для выявления данного радиоадаптивного ответа.
В опытах на клетках критериями для выявления радиоадаптивной реакции обычно служат разрывы ДНК, аберрации хромосом, мута
ции, выход микроядер, нарушения окислительно-восстановительного гомеостаза и проницаемости биологических мембран, а также выжива
емость клеток. Радиоадаптивный ответ наблюдается при воздействии на клетки рентгеновского и у-излучения , а также ^-частиц различных энергий от инкорпорированных изотопов 3Н, 14С и 32Р.
Способность ионизирующих излучений к формированию адаптивного ответа зависит не только от величины дозы облучения,но и от ее мощностп. При сравнительно больших дозах необходима невысокая ее мощность, и наоборот. Так, для многих типов клеток установлена связь между адаптирующей дозой Di и ее мощностью ^^ при индукции клеточной реакции адаптивного ответа:
DDdDi1 dtdDi1 dt= const.= const.(VII.l)(VII.l)
D
D
dDi
1 dt
dDi
1 dt
= const.
= const.
(VII.l)
(VII.l)
Следует отметить, что способность к реакции адаптивного ответа обнаружена не у всех клеток. Доля случаев, когда не удается обнаружить этот ответ, возрастает для популяций, находящихся в условиях с повышенным радиационным фоном, а также при патологиях, в том числе наследственных
(И. И. Пелевина и др., 2000). Имеются также сведения о пониженной частоте адаптивного ответа у детей. Вместе с тем, не совсем ясно, является ли отсутствие реакции адаптивного ответа в этих случаях абсолютным, или этот феномен обусловлен тем, что в данных клетках адаптирующее воздействие по тем или иным причинам уже было реализовано.
В последнее время показано (А. Н. Котеров, И. В. Филиппович, 2002), что повышение радиорезистентности происходит не только после однократных Di, но и после хронических, а также дробных лучевых воздействий, которые по суммарной величине адаптирующей дозы могут приближаться к соответствующим параметрам однократного облучения D). При этом интервалы времени между Dy и D^ могут значительно варьировать в зависимости от условий эксперимента.
Обнаружено также, что не только ионизирующие излучения в малых дозах, но и другие физические или химические воздействия низкой интенсивности способны отсроченно вызывать повышение устойчивости биологических объектов к последующему, более сильному, экстремальному действию, т. е. можно говорить о существовании более общего феномена адаптивного ответа.
Все это еще раз подтверждает вывод о неспецифическом, стрессовом характере эффектов действия малых доз ионизирующих излучений.
Зависимость наблюдаемых изменений от мощности дозы излучения. Эффект Петко
Известно, что характер и интенсивность радиобиологических ответов организмов на действие ионизирующих излучений зависят не только от величины, но и от мощности дозы облучения. Для больших доз излучения характерна прямая зависимость лучевого поражения от мощности дозы. Так, например, из приведенной табл. VII.3 видно, что увеличение мощности («скорости получения») дозы излучения на два-три порядка вызывает возрастание поражающего эффекта более, чем в три раза. Поэтому для осуществления одного и того же биологического ответа (50%-го выживания) при остром облучении
Таблица VII.3. Влияние мощности дозы д-излучения при однократном внешнем общем воздействии на величину дозы 50%-ой выживаемости ЛД50/30 белых лабораторных крыс
Мощность дозы, Гр/мин
ЛДбо/зо, Гр
Мощность дозы, Гр/мин
ЛДбо/зо, Гр
0,001
16, 4 ±1,4
0,7
5, 2 ±0,6
0,002
13,1 ± 1, 3
0,8
5,1 ±0,6
0,003
10, 0 ± 1, 2
0,9
5, 2 ±0,5
0,02
6, 4 ±0,6
1,5
4, 8 ±0,4
0,15
5, 4 ±0,5
3,0
3,9 ±0,6
0,6
5,3 ±0,5
3,5
3,5 ±0,7
требуется соответствующее снижение дозы радиации. Обнаружено, что при высокой мощности дозы острого облучения репарирующая активность биологических систем не успевает проявляться в полной мере.
Иная картина зависимости радиобиологических эффектов от мощности дозы наблюдается при облучении в не летальных, малых дозах, когда растянутая во времени доза хронического облучения может оказывать более сильный эффект по сравнению с той же дозой, полученной при кратковременной лучевой экспозиции большей мощности.
Впервые такой эффект на уровне клеточной мембраны обнаружил в 1972 г. канадский ученый А. Петко, который показал, что длительное облучение клеток вызывает значительно большее изменение проницаемости БМ, чем кратковременное в той же дозе. Так, при кратковременном действии рентгеновского излучения большой мощности (26 рад/мин) на клетку проницаемость БМ изменялась при высокой дозе облучения — 3,5 крад. Но при длительном облучении клетки (22Na в физиологическом растворе) в дозе малой мощности (10-3 рад/мин) для изменения проницаемости мембраны для Na было достаточно поглощенной дозы 0,7 рад. Таким образом, для проявления радиобиологического эффекта при длительном действии маломощного излучения оказалась достаточной доза, в 5 тысяч раз меньшая, чем при облучении с высокой мощностью дозы. Этот феномен обратной зависимости от мощности дозы при облучении клеток в незначительной по величине дозе и их гиперрадиочувствительности по некоторым критериям при облучении в сверхмалых дозах получил впоследствии название «эффект Петко» (Р. Грейб, 1996).
Для математического описания этого явления А. Петко (1984) использовал два уравнения, связывающие эффекты дозы и мощности дозы при облучении в широком диапазоне доз и мощностей дозы, включая низкие их уровни. Одно уравнение (VII.2) предложено самим Петко, другое (VII.3) взято им из работы М. Лайона и соавт. (1972):
R = птГп (VII.2)
и
R = D^a^blnl + 7z(InZ)2], (VILS) где R — величина эффекта, ответа (response): в первом уравнении — это количество связанных липидных гидропероксидов, образующихся в мембранах при облучении, во втором — число радиационно-инду- цируемых мутаций на локус, возникающих в сперматогониях мышей; D — доза облучения: в первом уравнении в диапазоне от близкой к 0 до 3000 сГр, во втором — от 37,5 до 861 сГр; I — мощность дозы облучения: в уравнении (VII.2) — от 1 до 0,16 сГр/мин, в уравнении (VII.3) — от 0,00034 до 895 рад/мин; т, п, а, b и h — константы, имеющие величину: т = 1,44 ± 0, 30, п = 1,18 ± 0,15, а = (8, 66 ± 1,44) • 10 8. b = (1, 70 ± 0, 20) • IO”8 и h = (2,46 ± 0,65) • 10"9.
Мощность дозы, Гр/минМощность дозы, Гр/минМощность дозы, Гр/минМощность дозы, Гр/мин
Мощность дозы, Гр/мин
Мощность дозы, Гр/мин
Мощность дозы, Гр/мин
Мощность дозы, Гр/мин
Рис. VII.4. Зависимость адаптивного ответа клеток китайского хомячка от величины мощности адаптирующей дозы Di (по Дж. Виенкке и др., 1986). а — Di = 0,01 Гр — обратный эффект мощности; б — ГД = 0,5 Гр — прямой эффект мощности. Заштрихованные полосы — диапазон средних значений эффекта только однократного облучения в дозе D2 с ошибкой средней
Зависимость радиобиологических эффектов от мощности дозы удобно оценивать по показателям проявления адаптивного ответа. Обнаружено, что зависимость радиобиологического ответа от мощности адаптирующей дозы Dy может иметь противоположную направленность при облучении в малых и больших дозах Dy. Это особенно отчетливо видно в опытах на одиночных клетках. В этом случае при малых значениях дозы Dy обнаруживается обратная зависимость выраженности радиационных изменений от мощности дозы.
Как видно из рис. VII.4, при малой величине адаптирующей дозы (Di = 0,01 Гр) наблюдается «обратний эффект мощности»: с увеличением мощности дозы от 0,01 до 0,2 Гр/мин повреждающее действие повторной, проявляющей дозы D^ снижается. В том случае, когда адаптирующая доза более высока (Di = 0, 5 Гр), в противоположность первому случаю, эффект повреждения по мере возрастания мощности дозы облучения увеличивается, проявляется обычная для облучения в больших дозах прямая зависимость радиобиологических изменений от мощности дозы.
Прямая или обратная зависимости радиобиологического эффекта от мощности дозы облучения в малых дозах обнаружены при использовании в качестве показателей реакции и других физиологических, биохимических, цитогенетических характеристик клеток и целостных организмов.
Таким образом, биологические ответы на изменение мощности дозы радиации могут служить еще одной иллюстрацией принципиальных различий в механизмах биологического действия ионизирующих излучений в больших и малых дозах.
Общая неспецифическая реакция организмов на облучение
В ходе рассмотрения приведенных выше радиобиологических эффектов неоднократно возникал общий вывод о неспецифическом, стрессовом характере действия ионизирующих излучений во всем интервале малых доз.
Стресс
Понятие «стресс» (англ, stress — напряжение) широко вошло в повседневную жизнь. Как известно, его ввел еще в 1936 г. канадский ученый Ганс Селье для обозначения способности любого организма стандартно реагировать на действие факторов внешней среды в виде так называемой общей неспецифической реакции. Различные внешние воздействия — холод, тепло, боль, физические, химические или эмоциональные нагрузки — вызывают не только свойственные им специфические проявления ответных реакций организма, но и активацию общего для всех раздражителей, заложенного в любом организме механизма ответа на воздействие стрессора — состояния напряжения. Такие термины как холодовой, тепловой, эмоциональный стрессы и т. п. указывают только на конкретную природу того или иного воздействия и на непосредственный специальный ответ на них отдельных тканевых систем: спазм или расширение сосудов кровеносной системы соответственно на холод или тепло, изменение эмоционального состояния со стороны центральной нервной системы.
Стресс-реакция характерна не только для экстремальных воздействий. Она — необходимое звено в защитно-приспособительной реакции организма и клетки в процессе их нормальной жизнедеятельности, при которой для поддержания стабильного, «равновесного» состояния (т. е. гомеостаза или стационарного состояния) в ответ на меняющиеся условия среды обитания необходима мобилизация защитных резервов.
Степень и выраженность проявления реакций стресса зависят от силы и продолжительности действия стрессора (раздражителя). Г. Селье показал, что при действии стрессоров различного происхождения в организме происходят однотипные изменения, активирующие ось гипоталамус-гипофиз- кора надпочечников с вовлечением также тимуса и желудочно-кишечного тракта. Позднее было установлено, что в результате стресса в организме из синапсов нейронов секретируются 5 нейромедиаторов АО: катехоламины (адреналин, норадреналин, дофамин), а также серотонин и ацетилхолин.
Изменение устойчивости организма к стрессорным воздействиям происходит по универсальной схеме. Начинается стресс стадией тревоги: вследствие активации нейро-гормональных механизмов в ответ на действие раздражителя мобилизуются защитные силы организма; повышается функциональная активность клеток, органов и тканей, реализующих ответ за счет усиления продукции энергетических ресурсов и активации систем защиты; изменяется нормальный ритм клеточного деления и т. и. На стадии тревоги резистентность (т. е. устойчивость к действующим факторам — стрессорам) незначительно возрастает.
При продолжающемся воздействии стрессора в организме развивается вторая стадия — адаптации (резистентности). Процессы, характерные для первой стадии, сменяются реакциями, приводящими к прогрессивному повышению резистентности. Для этой стадии характерно устойчивое, сбалансированное производство и расходование адаптационных резервов в
условиях изменившейся окружающей среды. Организм приобретает устойчивость не только к воздействующему, но и к другим раздражителям.
Однако защитные резервы имеют предел, и при продолжающемся воздействии усиленное восполнение их становится недостаточным, а поддержание работоспособности биологических систем происходит все в большей степени за счет возникновения разрушения собственных жизненно важных структур и постепенного понижения общей устойчивости. В итоге наступает третья стадия стресса — состояние истощения. Начинается прогрессирующее падение массы тела, некоторые типичные изменения в крови, снижение функции нейрогормональной системы, другие патологические проявления, а в результате — падение общей устойчивости организма ниже исходного уровня.
Периодическое воздействие на организм привычных для него факторов среды обитания умеренной силы и длительности активирует и тренирует соответствующие функциональные системы, повышая их защитные возможности. Такая адаптация по мере снижения потребности в ней может постепенно исчезать.
Стресс-реакция, вызывающая благоприятное влияние на реактивные приспособительные способности организма, получила название эустресс.
Раздражители необычной природы, силы и продолжительности, затрудняющие адаптацию, характеризуются как экстремальные. Их действие вызывает так называемый дистресс — мобилизацию и истощение защитных ресурсов организма, нарастание повреждения биологических структур и различные формы патологии. Крайнее напряжение регуляторно-приспособительных механизмов может не обеспечить сохранение и поддержание стабильного, устойчивого состояния — гомеостаза, и тогда может наступить смертельный исход.
Таким образом, в одних случаях стрессорное воздействие оказывает тренирующий, полезный эффект, в других — истощает защитные резервы организма и приводит к развитию патологии.
Исследования Г. Селье послужили толчком к всестороннему изучению стресса как явления. Возник вопрос — является ли сам принцип формирования стресс-реакции универсальным, общебиологическим механизмом ответа для разных уровней организации живых систем на любое внешнее воздействие, или он относится только к организмам человека и животных?
Оказалось, что для растительных организмов такая ответная реакция также существует. Она получила название «фитостресс» и тоже протекает в три стадии последовательных структурно-метаболических изменений. Первые две стадии обратимы (стадия «первичной реакции» и стадия «реституции», т. е. восстановления) и могут привести растение в состояние повышенной устойчивости к раздражителям; третья стадия охарактеризована как стадия «необратимых изменений и гибели».
Одиночные клетки также оказываются способными к триадному стандартному ответу на физические и химические воздействия. Так, «пред- паранекротическое состояние» (обратимое состояние, предшествующее повреждению) сменяется «паранекротическими изменениями» (процессами восстановления клеток) и завершается стадией «необратимой альтерации» (необратимого повреждения). Эта концепция паранекроза, выдвинутая Д. Н. Насоновым и В. Н. Александровым (1934, 1940), получила впоследствии новое название «неспецифического адаптационного синдрома клетки» в связи с признанием универсального, общебиологического характера неспецифической стресс-реакции.
В дальнейшем резко возрос интерес к механизмам инициирования и развития неспецифической реакции. Было показано, что в основе их лежат изменения окислительно-восстановительного гомеостаза, активизация продукции АФК и окислительных процессов в ненасыщенных липидах биологических мембран (так называемый оксидативный стресс).
Синдром липопероксидации
С начала шестидесятых годов прошлого столетия, т. е. в первый период исследований оксидативного стресса, главное внимание было обращено на традиционные липидные оксирадикалы и токсические продукты, образующиеся при лучевом поражении биологических объектов и систем. В дальнейшем радиобиологическими работами заинтересовались в медицине, и проблеме биохимического «синдрома липопероксидации» и «свободнорадикальной патологии» стало уделяться самое пристальное внимание. Количество работ в этом направлении прогрессивно возрастает вплоть до последнего времени. Уже неполный перечень состояний организма и заболеваний, при которых проявляется синдром липопероксидации (ЛПО), говорит об исключительно широком круге ситуаций, для которых он характерен (табл. VII.4).
Удивительно, до чего разнообразны и далеки друг от друга по характеру этиологии и патогенеза заболевания, при которых проявляется синдром ЛПО! Приведенные данные свидетельствуют о неспецифическом характере этого синдрома.
В настоящее время инициирование очень многих заболеваний стали оценивать с позиции свободнорадикальной патологии и накопления в организме не только липидных перекисных продуктов, но и промоторов цепных реакций — АФК и др. оксипродуктов.
Однако трудно согласиться с оценкой роли этих продуктов как факторов этиологии (причинных факторов) столь разных патологий. Развитие синдрома ЛПО совсем не значит, что образование радикалов — окситоксинов — является причиной каждого из перечисленных заболеваний. Совершенно очевидно, что образование ППОЛ является событием, сопутствующим развитию многих заболеваний, патогенетическим звеном в системе его механизмов.
Следует отметить также, что если процесс собственно липопероксидации протекает по «единому сценарию», то регуляция его чрезвычайно разнообразна и осуществляется многоэшелонированной системой контроля, к которой относятся в клетке и действие антиокислительного буфера (низкомолекулярные и ферментные антиокислители), и механизм регуляции открытия пор БМ.
Напомним, что при действии ионизирующих излучений токсическое действие ОРТ является важнейшим инициирующим механизмом повреждения клеточных структур, осуществляющим непрямой эффект радиации, механизм запуска и усиления первичных изменений. Липопероксидация является элементарной неспецифической реакцией, особенно ярко проявляющей свою активность в этих условиях.
Таблица VII.4. Перечень физиологических состояний организма и заболеваний, при которых проявляется биохимический синдром липопероксидации
Лучевое поражение (лучевой токсический эффект).
Фотодинамическое действие ультрафиолетовых излучений.
Действие электрических и магнитных полей.
Механические травмы.
Гипер- и гиподинамия.
Гипер- и гипоксия.
Атеросклероз и сердечно-сосудистая патология.
Гипер- и гипотермия.
Ожоги, воспаления, обморожения.
Гипер- и гипоосмотические нарушения обмена веществ.
Гипервитаминоз А и Д и гиповитаминоз (авитаминоз) Е.
Аутоиммунные и хронические воспалительные заболевания: артрит, колит, цистит, гастрит и язва.
Острые и хронические заболевания печени, легких и др. органов.
Токсикозы. Сахарный диабет.
Дегенеративные заболевания нервной системы: болезнь Альцгеймера, паркинсонизм.
Злокачественный рост:
химический, гормональный и вирусный канцерогенез.
Синдром приобретенного иммунодефицита — СПИД.
Старческая катаракта.
Старение.
Отдаленные последствия облучения организмов
Важной особенностью биологического действия ионизирующих излучений в нелегальных дозах является то, что через значительный промежуток времени после этого события на фоне, казалось бы, полного восстановления организма от первоначальных нарушений появляется ряд характерных изменений — отдаленные последствия облучения.
Естественно, что время от облучения до проявления этого радио- билогического эффекта для разных организмов может сильно отличаться. Для человека оно может составлять 10-20 лет и более, для лабораторных мышей и крыс — несколько месяцев и т. п. Наконец, теоретически отдаленные последствия могут появляться не только в пределах жизни облученного организма, но и у его потомства, как непосредственного, так и через несколько поколений.
Отдаленные последствия облучения не являются какими-то новыми, свойственными только для действия ионизирующих излучений заболевания. Скорее это провокация развития таких известных
болезней, как лейкозы (лейкемии), раковые опухоли всех видов, пониженная плодовитость, физические и умственные пороки развития, ослабление сопротивляемости к инфекциям, катаракта хрусталика глаза, сокращение продолжительности жизни, возможно, большая подверженность развитию заболеваний сердечно-сосудистой системы и органов кровообращения и др. на фоне хромосомных изменений в клетках крови и других тканей.
Отдаленные последствия облучения иногда связывают с изменениями в организме, происходящими при естественном старении, повышающими вероятность появления раковых опухолей, развития катаракт, наступления поседения, ослабления эластических свойств кожи, сосудистых склеротических изменений и др. Эти явления наступают в облученном организме в более раннем возрасте, чем в норме, а поскольку уменьшается и средняя продолжительность жизни, то многие радиобиологи приходят к выводу о том, что действие излучений, в том числе, возможно, и в малых дозах, способно вызывать радиационное старение организма — ускоренное под влиянием облучения наступление старости.
В литературе широко дискутируется вопрос о влиянии облучения в малых дозах на возникновение отдаленных последствий действия излучений, возникающих в природных условиях в результате загрязнения окружающей среды радионуклидами. Наибольшее число работ, посвященных таким отдаленным последствиям, касается появления раковых заболеваний.
Однако общепризнанного мнения о причинной связи тех или иных заболеваний людей с действием на них ионизирующих излучений все еще не выработано. Трудность представляет установление такой связи на основе статистически достоверных данных, само получение которых требует большого экспериментального, клинического и эпидемиологического материала на большом количестве исследуемых объектов с учетом исходного физиологического их состояния, и достоверного вычленения радиационной компоненты из множества эффектов, обусловленных воздействием других патогенных факторов среды на организм. Проявление же радиационного эффекта в свою очередь зависит от вида излучения и характера облучения (величины дозы и мощности дозы излучения, внешнего или от инкорпорированных радионуклидов, однократного или многократного, острого или хронического, локального или общего и т. д.).
Так, после аварии на Чернобыльской АЭС среди многих радиобиологов укоренилось мнение, что классическая радиобиология на основе данных по облучению в больших дозах может и должна описать и количественно оценить эффекты действия на здоровье людей низкоинтенсивного облучения, обусловленного загрязнением природной среды радионуклидами. Предлагались различные модели экстраполяции данных от высоких доз облучения. Несмотря на их разнообразие, они основывались на априорном логическом постулате: большие дозы вызывают большие повреждения, малые дозы — такие же, но меньшие.
Под давлением современных данных ряд радиобиологов хотя и вынужден признать вывод о немонотонной зависимости биологических эффектов (например, цитогенетических изменений и частоты злокачественных заболеваний) от доз низкоинтенсивного облучения, все же считает, что если и существует такая зависимость, то возникшие изменения настолько малы, что не имеют реальной значимости для популяции.
Однако такой подход подвергся критике, по крайней мере, по следующим позициям (Е. Б. Бурлакова и др., 1994).
К вопросу о влиянии Чернобыльской аварии на здоровье человека нельзя подходить только с позиции действия одних ионизирующих излучений на население, необходимы знания о сочетанном действии радиации и разнообразных химических загрязнений среды. Эффекты синергизма и антагонизма этих факторов приводят к изменению соотношения их значимости для здоровья человека. Для одних и тех же условий облучения эффекты будут разными в экологически чистых и химически загрязненных районах. Могут возникнуть даже качественно новые эффекты факторов окружающей среды. При этом роль радиационного фактора может быть провоцирующей.
Анализ клинических данных немонотонной зависимости «доза-эффект» привел ряд радиобиологов к заключению, что эффект от облучения в малых дозах может быть «недооценен» из расчета эффектов при больших дозах и последующих экстраполяций к малым.
Не обсуждая медицинские проблемы возникновения отдаленных изменений в организме, приведем лишь один из многих примеров результатов наблюдения частоты заболеваемости у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС (по В. К. Иванову и А. Ф. Цыбу, 1996) в табл. VII.5. Понятно, что «привязать» обнаруженную частоту проявления патологий к точной величине вызывающих их доз и мощности доз облучения в условиях проводимых обследований оказалось невозможным. Поэтому представленные данные могут служить лишь ориентиром к оценке того или иного возможного факта отдаленного последствия сочетанного действия ионизирующих излучений и других повреждающих факторов (химических аэрозолей, эмоционально-психологического стресса, физических перегрузок).
О количественной оценке биологического действияизлучений в малых дозах
В настоящее время нет единого определения понятия «малости» доз. Широко используются биологические оценки количественных границ диапазона доз, называемых малыми, хотя и здесь нет единства мнений.
21 Ю. Б. Кудряшов
Таблица VII.5. Показатели заболеваемости по основным классам болезней у ликвидаторов и населения России в целом, случаев на 105 человек
Основные классы болезней
Ликвидаторы
Население России
новообразования
747
788
злокачественные новообразования
233
140
болезни крови и кроветворных органов
339
94
болезни органов пищеварения
9739
2635
болезни органов кровообращения
6306
1472
психические расстройства
5743
599
болезни эндокринной системы
6036
327
все классы болезней
75606
50783
По данным НКДАР ООН (UNSCEAR) 1999 г. [72] к малым дозам облучения клетки можно отнести дозы до 0,2 Гр (200 мЗв), хотя в принципе даже при дозе в 0,1 сГр можно ожидать прохождения одного трека через ядро диаметром 8 мкм, возникновения изменений в клетке и соответствующих радиобиологических эффектов. Для млекопитающих малыми наиболее часто считают дозы ниже 1,0 Гр; иногда границу между большими и малыми дозами понижают до 0,25-0,20 Гр, приближая ее к величинам, рассматриваемым в качестве малых для клеток (Дж. Гофман, 1994). В соответствии с другим подходом это все те дозы, которые в 100 раз меньше ЛД5О/зо и в 100 раз больше уровня ЕРФ (Р. Грейб, 1996). Ранее мы приводили данные А. М. Кузина (1989) о большом разбросе значений диапазона малых доз, в котором проявляется, например, гормезис у разных биологических объектов.
Таким образом, термин «малые дозы» — условное понятие. Величина малых доз различна для разных уровней организации живых систем, и определяется она характерными проявлениями биологических эффектов, вызываемых слабым однократным и (или) хроническим радиационным воздействием.
Так, при определении малых доз для многоклеточных организмов имеют в виду нелетальные дозы облучения. Для клеток и других биологических объектов малые дозы характеризуются не свойстен- ными большим дозам эффектами, например, гормезисом. Часто говорят о том, что малые дозы вызывают эффекты, «противоположные» большим дозам облучения.
Однако термин «доза» — это прежде всего физическое понятие, и поэтому хотелось бы дать строгое определение диапазона малых доз, исходящее из оценки поглощенной энергии излучения. Поскольку в
О количественной оценке биологического действия излучений 323 физической дозиметрии нет деления доз на большие и малые, радиобиологи вынуждены производить такое деление в связи с различиями в биологических эффектах.
Существует более строгий — биофизический — подход в классификации дозы на клеточных моделях — по характеру прохождения ионизированной частицы через гетерогенную структуру клетки, на основании чего возможно количественное определение диапазона малых доз. Однако и при таком способе его оценки нельзя не учитывать «биологический фактор», так как наряду с прямым осуществляется и непрямое действие радиации, а в популяции клеток или в тканях, помимо ионизации на облученную или необлученную клетку, действуют секретируемые (в их составе, возможно, и токсические) вещества облучаемых «клеток-соседей», называемых в литературе «свидетелями» облучения.
О биологических критериях (показателях), используемых для оценки эффектов малых доз
Проблема изучения индивидуальных биологических реакций организма при низкодозовых радиационных воздействиях, поиск наиболее характерных для этих воздействий биологических изменений занимает одно из ключевых мест в современной радиобиологии. Характером и точностью дозиметрической информации определяется решение о необходимости, сроках и объеме оказания медицинской помощи пострадавшим, оценка вероятности и характера отдаленных последствий действия облучения, установление социальных прав на возмещение ущерба здоровью людей. Все это стимулировало поиск критериев установления поглощенной дозы на основе величины вызываемых ею радиобиологических эффектов. На такую возможность указывали факты количественной зависимости их от величины дозы облучений по некоторым показателям и длительное сохранение пострадиационных изменений. Так, еще в середине прошлого столетия возникло особое направление в радиобиологии - биодозиметрия. Были сформулированы требования к биоиндикаторам, их классификация, дана попытка определить те из них, которые уже сейчас можно рассматривать в качестве реальных биодозиметров. Наибольшее развитие это направление получило, как известно, после аварии на Чернобыльской АЭС в связи с необходимостью ретроспективной дозиметрии малых доз излучений.
Существует пять групп ретроспективного выявления последствий дозовых нагрузок на организм при внешнем и внутреннем облучении: цитогенетические, гематологические, иммунобактериологиче- ские, биохимические и биофизические. При оценке эффектов биологического действия радиации в малых дозах возможна регистрация цитогенетических и гематологических повреждений: частоты хромосомных перестроек (например, при помощи анафазного и метафазного анализа аберраций хромосом), числа лимфоцитов с микроядрами, а 21*
также частоты клеток-носителей соматических мутаций в периферической крови.
Метод хромосомных аберраций принят в качестве официального метода биологической дозиметрии). Основой радиационной биодозиметрии по аберрациям хромосом является количественная зависимость образования аберраций в лимфоцитах периферической крови и костного мозга от дозы излучений. Поскольку лимфоциты периферической крови обладают высокой радиочувствительностью, то содержание их в крови у человека, облученного в высоких дозах, вскоре резко снижается, и их количество может оказаться слишком малым для культивирования. В то же время в отделах костного мозга, особенно при неравномерном облучении, уровень лимфоцитов может оставаться достаточным для подсчета аберраций хромосом, и таким образом трудности в выборе клеток могут быть преодолены. In vitro использование прецизионных методов позволяет оценивать выживаемость клеток млекопитающих в диапазоне невысоких доз облучения — от уровня природного фона до 1-2 Гр.
Количественная ретроспективная дозовая оценка по хромосомным аберрациям у хронически облученных людей и в отдаленные сроки после воздействия излучений встречает известные трудности. Так, даже при раннем цитогенетическом анализе, исключающем элиминацию аберраций хромосом вследствие гибели клеток, на дозовой кривой в диапазоне малых доз от 0,1-0,2 Гр и выше (до 0,5 Гр) разброс индивидуальных значений настолько велик, что установление дозы облучения становится крайне сложной проблемой. Явление гормезиса существенно модифицирует зависимость «доза-эффект». Вместе с тем имеются данные о длительном сохранении хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у профессионалов, работающих с источниками ионизирующих излучений. Однако ретроспективную оценку индивидуальных доз провести не удается.
Также встречают затруднения попытки осуществить дозиметрическую оценку по численности клеточного состава периферической крови. Вместе с тем в литературе известны данные о том, что на основе динамики количества нейтрофилов и тромбоцитов и использования соответствующей компьютерной обработки данных дозы облучения человека могут быть установлены ретроспективно.
Перспективной является оценка выхода микроядер в облученных популяциях клеток и их потомков, например, при исследовании адаптивного ответа клеток. Появление микроядер — это следствие повреждений генетического аппарата клеток. Микроядра возникают в процессе разделения хромосомного материала лимфоцитов между двумя дочерними клетками из-за препятствия, создаваемого аберрациями переходу разорванных или слипшихся хромосом в одно или два дочерних ядра, и оказываются в отдельных микроядерных структурах, наблюдаемых в клетках, не сумевших разделиться из-за повреждения
веретена или центромеры. Процесс этот может быть усилен прибавлением цитохалазина В в культуральную среду для лимфоцитов, который препятствует разделению цитоплазмы клетки и образованию дочерних клеток. Образующиеся при этом двуядерные клетки учесть намного проще, чем подсчитать аберрации хромосом.
Микроядерный тест обладает высокой разрешающей способностью, удобен и более быстр по сравнению с хромосомным анализом, что делает его незаменимым для оценки мутагенного действия разных агентов. Он позволяет наблюдать повреждения хромосом в асинхронной популяции клеток в следующем после воздействия повреждающего агента клеточном цикле (И. И. Пелевина и др., 2001). Анализ цитогенетических эффектов облучения в малых дозах изложен в ряде других современных работ (например, Н. Л. Шмаковой и др., 2002).
По перечисленным критериям показана сложная нелинейная зависимость «доза-эффект» после воздействия радиации в диапазоне малых доз. Общий вид ее представлен схематически на рис. VII.2.
Исследование радиационных изменений на разных уровнях организации живых систем (от молекулярного до организменного) привело к накоплению большого фактического материала по количественной оценке биологического действия излучений в малых дозах. Однако попытки простого переноса используемых приемов и данных с одного уровня на другой (например, от животных на человека) без учета иного качества системы более высокого уровня, встречая значительные трудности, в принципе не могут быть успешными.
В радиобиологии встречаются отдельные работы, в которых термин «биодозиметрия» иногда употребляют применительно к количественной оценке уровня содержания радионуклидов в клетках, органах и тканях облучаемого организма. При этом забывают, что термин «биодозиметрия» подразумевает не физическую дозиметрию в биологическом объекте, а оценку дозы излучения, поглощенной биологическим объектом, по вызванному этим событием биологическому эффекту. Именно такой смысл имеет, например, биофизический метод индивидуальной биологической оценки доз облучения по ЭПР-сигналу эмали зубов облученных млекопитающих, отражающему накопление радиационных радикалов в химической структуре гидроксиапатита, входящего в состав биологической ткани — зубной эмали.
Еще в 1968 г. при ЭПР-спектроскопии образцов бедренной кости и резцов млекопитающих, облученных в дозах от 1 до 250 Гр была обнаружена строгая линейная зависимость величины ЭПР-сигнала от дозы облучения. Последующие исследования позволили выяснить механизмы ЭПР-эффекта, установить длительность его проявления и разработать методы практического применения в лучевой биодозиметрии.
Было установлено, что радиационно-индуцируемые резонансные центры в эмали зубов дают многократно более интенсивные сигналы, чем в любых
других тканях. В основе этих сигналов лежит образование в дефектах кристаллической решетки зубной эмали (включающей кристаллы гидроксиапатита) свободных радикалов СО23 в результате захвата комплексом СО22 свободных электронов, появляющихся в облученной эмали. Таким образом, зубы представляют собой своеобразные «накопительные биодозиметры», накапливающие дозы облучения организма за всю его жизнь, т. к. в связи с высокой минерализованностью эмали (96%) и замедленного обмена веществ в ней при 25° С ЭПР-центры могут сохраняться 109 лет!
Известны и другие попытки изыскания методов, с помощью которых можно было бы на основании биологических и медицинских показателей ретроспективно оценивать величину дозы облучения организма и предсказать степень риска возникновения патологии от лучевого воздействия.
Однако задача оценки величины малых доз радиации с помощью «биологических маркеров» затруднена в связи с нелинейным характером ответа организма на низкоинтенсивные воздействия и разбросом данных, связанным с большими колебаниями видовой и индивидуальной чувствительности организмов к облучению. На этом же основании также понятно, что сейчас, без достаточного понимания сущности радиационного эффекта в диапазоне малых доз, еще рано делать окончательные выводы о возможных отдаленных последствиях облучения ликвидаторов радиационных аварий и населения.
Тем не менее такой прогноз необходим в первую очередь для решения важных медицинских и социальных проблем.
Рассмотрим один из примеров прогноза возмоснсной индукции онкологических заболеваний среди ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС и снсителей загрязненных радионуклидами территорий (А. Цыб, В. Иванов, 2002). НКДАР ООН на 49-ой сессии (Вена, май 2000 г.) пришел к заключению, что средняя доза внешнего облучения ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС составляет 0,1 Гр. Сформированный к 2000 г. Российский Национальный радиационно-эпидемиологический регистр со- дерснсит индивидуальную медико-дозиметрическую информацию о 180 тыс. ликвидаторах этой аварии. Если для прогноза отдаленных канцерогенных рисков воспользоваться линейной беспороговой моделью «доза-эффект» (рис. VII.2, пунктирная линия), т. е. предположить, что сколь угодно малая доза облучения может вызвать с крайне малой вероятностью онкологическое заболевание, то можно было бы предсказать, что среди 180 тыс. ликвидаторов за всю предстоящую жизнь будет выявлено около 1 тыс. онкологических заболеваний, обусловленных полученной дозой облучения. Авторы прогноза заболеваемости сравнили данные упомянутого регистра с результатами японско-американских радиационно-эпидемиологических исследований (1950-1990 гг.) на когорте в 86,5 тыс. чел. (Хиросима-Нагасаки) и пришли к выводу о том, что к группе действительно радиационного риска следует относить только ликвидаторов, получивших дозы внешнего облучения более 0,2 Гр (т. е. по сути только ликвидаторов 1986 года). Вместе с тем реальные накопленные к настоящему времени данные Национального
регистра свидетельствуют о повышении частоты онкологических заболеваний среди ликвидаторов, получивших меньшие дозы внешнего облучения — более 0,1 Гр, а не более 0,2 Гр. Тем не менее упомянутые авторы считают, что имеющиеся в настоящее время эпидемиологические данные не позволяют сделать заключение о доказанной реальности радиационного канцерогенеза, вызванного облучением в малых дозах. Понятно, что работы по количественной оценке биологических эффектов действия излучений в малых дозах должны продолжаться и совершенствоваться с целью получения объективных данных и выработки на этой основе оптимальных нормативов радиационной безопасности.
В последнее время М. Ф. Киселев (1999-2002) предложил комплекс методов экспресс-диагностики индивидуальных доклинических изменений в основных саногенетических ) системах организма (в системах обмена веществ и гуморального иммунитета, сердечно-сосудистой, дыхательной, психомоторной) при низко дозовых радиационных воздействиях в сочетании с действием других антропогенных факторов внешней среды.
Автор отошел от традиционной схемы изучения пострадиационных реакций организма при облучении в малых дозах, когда вначале определяется вероятный уровень действующих доз, а затем определяется вызванный ими эффект (заболеваемости, сокращения продолжительности жизни, изменения смертности). В основу оценки биологических реакций организма, возникающих при низкодозных радиационных воздействиях в сочетании с другими антропогенными факторами, положен учет интегральных эффектов воздействий стрессов: радиационного, химического, психо-эмоционального, а также влияния климато-географических условий и экологической ситуации.
Автор пришел к выводу, что при оценке биологического действия радиации в малых дозах необходимо проводить комплексное тестирование, а не ограничиваться только изучением отдельных, хотя и принципиально важных функциональных систем. Для такого комплексного тестирования предложен биофизический метод лазерной «корреляционной спектроскопии» (ЛКС). Этот метод (Киселева- Носкиных) позволяет оценивать «функциональные напряжения» в системе обмена веществ и гуморального иммунитета, возникающие при низко дозовых лучевых воздействиях.
Экспериментально установлено, что по характеру изменения метаболических сдвигов, регистрируемых методом ЛКС, представляется возможным прогнозировать исход лучевого воздействия (в том числе и процессов канцерогенеза) в сроки, заметно предшествующие проявлению достоверных морфологических признаков. Характер и степень выраженности сдвигов в ЛК-спектрах позволяют в динамике
проводить скрининговые ) оценки «патологической отягощенности» организма, облученного в малых дозах.
Так, методом Л КС установлено, что хроническое облучение людей, проживающих в пойме реки Теча (в диапазоне доз до 75 сЗв, а также и в более высоких дозах), вызывает функциональные изменения в системе иммунитета, проявляющиеся изменением субфракционного состава плазмы крови в направлении нарастания частоты встречаемости анаболически направленных сдвигов (увеличение в плазме крови кластера частиц с гидродинамическим радиусом в основном 70-150 нм). М.Ф. Киселев обнаружил также, что при радиационно-индуцированном канцерогенезе в субфракции плазмы крови происходит увеличение числа частиц с радиусом до 10 нм. Прогноз развития процессов канцерогенеза по указанным сдвигам ЛК- спектров осуществляется на 1-2 месяца раньше, чем принятыми методами детекции опухолевых процессов.
Проанализировав большой фактический материал современной литературы по отдаленным последствиям облучения, Е. Б. Бурлакова (2001, 2002) пришла к выводу о необходимости рассматривать заболеваемость облученных людей с учетом индивидуального их распределения по «уровням здоровья», «группам инвалидности» и др. в зависимости от узкого диапазона доз облучения. При таком квали- метрическом) анализе данных оказалось, что в каждом из выбранных узких диапазонов доз хронического облучения имеется своя для определенного контингента людей зависимость «доза-эффект». Так, при облучении в малых дозах (менее 0,1 Гр) имеется область снижения эффекта вероятности возникновения лейкозных заболеваний с увеличением дозы облучения; в другой области доз происходит смена знака эффекта на противоположный и т. д.
Квалиметрический подход к оценке последствий облучения позволил прийти к важному выводу о статистической достоверности и характерной зависимости радиобиологических эффектов от дозы облучения для каждой группы обследованных людей. Показав, что устойчивость организма к воздействиям экзо- и эндогенной природы определяется, в основном, состоянием систем антиоксидантной и иммунологической защиты, Е. Б. Бурлакова (2002) предположила, что
дефицит потенциала этих систем является важным показателем при оценке возможных последствий и в прогнозе возникновения заболеваний у лиц, облученных в малой дозе.
Конечно, как уже отмечалось, едва ли возможно найти простые соотношения, поставить знак равенства между физической и биологической оценками ожидаемого эффекта дозы облучения. В полной мере это никак не удается в связи с большими колебаниями биологической ответной реакции на одну и ту же дозу воздействия. Биологический ответ организма на облучение зависит от большого множества причин, например таких как рацион питания, психо-физиологическое состояние организма, время года и суток в момент облучения, от адаптивного ответа, который может быть вызван предшествующими воздействиями любых физических, химических и даже биологических факторов, например таких как вирусная инфекция, стресс и др.
Сами понятия «радиорезистентность» или «радиочувствительность» — это меняющиеся от многих причин количественные признаки, такие же как вес, рост, плодовитость и т. д. Известно, что такие количественные признаки детерминированы полигенно и на их проявление оказывает влияние физиологическое состояние облучаемого биологического объекта. Кроме того, известно, что особи в популяции распределены по признаку радиочувствительности биномиально, при этом в 5% крайних отклонений от средней величины 2,5% особей являются «суперрезистентными» и еще 2,5% — «суперчувствительными» (И. Б. Моссе, 2002).
При количественной оценке биологического действия ионизирующих излучений необходимо четко разграничивать цели исследований: изучение существа возникающего эффекта или установление дозы облучения. При решении задачи оценки характера и меры изменений, возникающих в облученных биологических объектах, первостепенную роль играют биологические методы.
Однако совершенно очевидно, что биологическая оценка ответа на радиационное воздействие не может и не должна подменять собой физические или биофизические способы определения поглощенных доз излучения, характера и количественной меры поглощения энергии облучаемой клеткой. Приведем один из известных в биофизической литературе подходов в оценке диапазонов доз облучения, помятуя, что для модельных систем количественная оценка диапазона доз может отличаться от значений, получаемых с помощью радиобиологических показателей организменного уровня.
Биофизический подход в оценке диапазона малых доз по характеру поглощения энергии излучений (Д. М. Спитковский)
В связи с актуальностью исследований биологического действия низкоинтенсивных излучений на клетку с неизбежностью возникают вопросы о понятии малых и больших доз: что считать малой дозой облучения, где граница между «малой» и большой дозой и в чем
особенности радиобиологического эффекта при действии на клетку излучений в разных диапазонах доз? Последний вопрос в радиационной биофизике естественно должен решаться комплексно, т. е. с учетом не только физической величины дозы, ее мощности и условий облучения, но и в сопоставлении с оценкой биологического ответа различных по радиочувствительности клеток.
Анализ прохождения частицы через гетерогенную структуру клетки
Известно, что в силу гетерогенности структурной организации и состава клетки различная пространственная локализация ионизирующих событий в ее объеме должна приводить к различным биологическим последствиям. Например, прохождение трека через
Рис. VII.5. Сечение сферического объема клетки (схема, выделена только мембрана). Затемненное кольцо — плазматическая мембрана; А, В — треки ионизирующих частиц (обозначены стрелками); С и D — области мембраны (затемнены), в которых возможна ионизация и локализация продуктов радиолиза воды и липидов в случае прохождения соответственно треков А и ВРис. VII.5. Сечение сферического объема клетки (схема, выделена только мембрана). Затемненное кольцо — плазматическая мембрана; А, В — треки ионизирующих частиц (обозначены стрелками); С и D — области мембраны (затемнены), в которых возможна ионизация и локализация продуктов радиолиза воды и липидов в случае прохождения соответственно треков А и Вцитоплазму, если при этом радиационному воздействию подвергается достаточное количество ее элементов, может привести к функциональным изменениям, которые в зависимости от степени их выраженности и необратимости способны индуцировать механизмы, приводящие к гибели клетки.
Рис. VII.5. Сечение сферического объема клетки (схема, выделена только мембрана). Затемненное кольцо — плазматическая мембрана; А, В — треки ионизирующих частиц (обозначены стрелками); С и D — области мембраны (затемнены), в которых возможна ионизация и локализация продуктов радиолиза воды и липидов в случае прохождения соответственно треков А и В
Рис. VII.5. Сечение сферического объема клетки (схема, выделена только мембрана). Затемненное кольцо — плазматическая мембрана; А, В — треки ионизирующих частиц (обозначены стрелками); С и D — области мембраны (затемнены), в которых возможна ионизация и локализация продуктов радиолиза воды и липидов в случае прохождения соответственно треков А и В
При действии ионизирующих излучений областью инициации последующих реакций клетки может явиться не только ее ядро, но и мембрана. Рассмотрим вопрос о потенциальных различиях в чис-
ле «воспринимающих» энергию радиации объемов биологической мембраны при пересечении ее треком частицы с низкими значениями ЛПЭ. Для этой цели представим клеточную поверхность в виде сферы (рис. VII.5).
Как видно из схемы, можно ожидать два крайних типа пересечения мембраны, отличающихся по своим последствиям. Первый из них: трек проходит перпендикулярно к поверхности клетки (рис. VII.5, трек А). При этом инициируемые события
(с учетом диффундирующих продуктов радиолиза) будут «воздей(с учетом диффундирующих продуктов радиолиза) будут «воздействовать» на области в относительно небольших участках мембраны,ствовать» на области в относительно небольших участках мембраны,на ее «полюсах».
(с учетом диффундирующих продуктов радиолиза) будут «воздей
(с учетом диффундирующих продуктов радиолиза) будут «воздей
ствовать» на области в относительно небольших участках мембраны,
ствовать» на области в относительно небольших участках мембраны,
Совершенно иная ситуация будет иметь место во втором случае, т. е. если трек проходит как бы по касательной в районе экватора мембраны (рис. VII.5, трек В). В этом случае воздействию будет подвергнута существенно большая часть мембраны.
Указанные различия в рассмотренных двух крайних вариантах пересечения мембраны клетки треком частицы могут быть причиной
разных ответных реакций клетки. Естественно, такая ситуация может быть реализована только при облучении в малых дозах, когда клетки пересекаются единичными треками ионизирующих частиц. При облучении анизотропно облучаемых систем в больших дозах указанные различия нивелируются, и последствия могут оказаться иными.
Локализация трека в пределах генетического субстрата клетки также может быть причиной различных последующих событий при облучении в малых дозах.
Известно, что геном эукариот имеет сложную структурную организацию. Его ионизация в транскрибируемой области может инициировать мутации, т. е. появление мутантных белков или пептидов. Те же события в достаточно протяженных участках генома, представленных повторяющимися последовательностями ДНК (а такие последовательности в геноме человека представлены достаточно часто) могут инициировать как генетические последствия, связанные с разнообразными структурными нарушениями в кариотипе, так и функциональные.
Функциональные нарушения могут быть связаны с изменениями структуры хроматина, в организации которой принимают участие также повторяющиеся последовательности ДНК, поскольку способы организации хроматина существенны для реализации процессов транскрипции.
Таким образом, результатом действия ионизирующих излучений могут быть как функциональные, так и генетически значимые события в клетке. В зависимости от степени выраженности или значимости для функционирования клетки, события, происходящие как в БМ, так и в ДНК, могут оказаться несовместимыми с ее жизнедеятельностью.
Однако такое схематическое рассмотрение является все же упрощенным, поскольку клетка представляет собой единую динамическую систему, элементы которой функционально взаимосвязаны. Так, радиационно-индуцированное подавление ДНК-репарационных систем клетки может оказаться причиной последующего генетического неблагополучия, связанного, например, с риском возникновения процессов злокачественной трансформации клеток и наследственных заболеваний. Поэтому приведенная выше упрощенная оценка радиационных событий не снимает многих других вопросов. По крайней мере два из них являются весьма принципиальными.
Во-первых, является ли «генетической мишенью» излучений собственно молекула ДНК или же некий «событийный комплекс» молекул, ионизации в пределах которого вызывают образование повреждений ДНК.
И во-вторых, обязательно ли прохождение треков ионизирующих частиц только через клетку (или ее ядро) для инициации генетических нарушений в этих клетках или же источник этих нарушений может быть индуцирован радиацией в межклеточной среде, представляя из себя, возможно, продукты, секретируемые другими облученными клетками.
Для ответа на первый вопрос следует уточнить определение понятия «попадание». Как известно, оно сформулировано так: событием попадания является поглощение дискретной порции энергии, оставляемой быстрой частицей в форме ионизаций и возбуждений атомов в пределах некоего эффективного объема. Из любой точки такого объема эта энергия, не диссипировав ниже порога работы, с помощью какого-либо физического механизма миграции достигает места действия (Н. В. Тимофеев-Ресовский, В. И. Иванов, В. И. Корогодин, 1968).
Как уже отмечалось ранее, основными факторами радиационно- индуцированных повреждений молекул, в том числе и ДНК, являются непосредственное поглощение энергии в молекуле (прямое действие) и воздействие продуктов радиолиза растворителя (непрямое, косвенное действие). Среди последних наиболее активным по отношению к ДНК является радикал ОН’. Его средний диффузионный пробег в клетках равен приблизительно 30 А).
Таким образом, можно аппроксимировать мишень в виде цилиндра диаметром 20 А (диаметр В-формы ДНК), содержащего различным образом упакованную ДНК, окруженного цилиндрическим слоем воды толщиной в 30 А. По разным данным, содержание ДНК в диплоидной клетке человека (и некоторых других организмов) составляет (6, 3-8, 3)40-12 г. Тогда объем цилиндра ДНК, окруженного упомянутым слоем воды, составит 1,240-10 см3. Существенно, что в таком объеме собственно ДНК занимает только малую часть, и поэтому можно пренебречь различиями в плотности воды и ДНК. Если мишень представляет собой сферу, то объему мишени 1,240-10 см3 соответствует радиус сферы приблизительно в 3 мкм. Этот радиус близок к таковому для ядер лимфоцитов периферической крови человека. Многие радиобиологи для расчетов размеров мишени клеток человека используют в качестве последней сферический объем с радиусом 4 мкм. Эту величину мы будем приводить и в дальнейшем.
Опираясь на выводы из многочисленных экспериментальных данных, можно заключить, что мишенью в клетках эукариот, в которой оцениваются генетически значимые повреждения генома, является ядро клетки диаметром в несколько микрометров.
Вместе с тем известно, что при воздействии радиации в малых дозах часть клеток в облучаемой популяции (через которые прошли треки соответствующих частиц) может передавать путем контактов сигналы или секретировать фактор или факторы, влияющие на функционирование и выживаемость «соседей» или другой части
клеток этой же популлции, через которые соответствующие частицы не проходили. Феномен приобретения клетками свойств облученных наблюдали и после внесения необлученных клеток в среду, в которой предварительно культивировали облученные клетки («эффект свидетеля», см. с. 346 в этой главе).
Учитывая феномен «свидетеля», следует заметить, что определение понятия малых доз относительно и нуждается в поправках и на «эффект свидетеля», и на другие, внутриклеточные непрямые эффекты ионизирующей радиации, обнаруженные при облучении клеток в малых дозах.
Диапазоны доз, отличающихся по событиям поглощения энергии (малые, низкие и средние дозы)
Как уже отмечалось, понятие «малая доза» для клеточной модели можно связать с представлением о минимальном количестве действующего начала, например, таким, как прохождение ионизирующей частицы через критическую область, при котором в этой области возможно минимальное поглощение энергии. При этом предполагается, что возбуждения и ионизации молекул происходят в основном вдоль траекторий первичных заряженных частиц как отдельные статистически независимые события. Предложено) малой считать ту дозу, при которой в «критической мишени» будет инициировано не более, чем одно «радиационное событие».
Пусть г — среднее значение удельной энергии в микрообъемах, распределенных в облучаемой среде. Вопрос, почему вместо дозы вводится это новое понятие, уже рассматривался в гл. II в связи с так называемым энергетическим парадоксом. Как правило, биологический эффект не пропорционален дозе. Как мы видели, величина ОБЭ излучения, выражающая различие между дозой и производимым ею эффектом, может возрастать во много раз при переходе от больших доз к малым, но не наоборот, как может показаться. Микродозиметрия, а конкретно теория дуального действия, позволила разобраться в этой парадоксальной ситуации, рассматривая спектры одиночных и кратных событий пересечения треками чувствительных микрообъемов. При малых дозах можно ограничиться только одиночными событиями, так как остальные относительно редки. Но в этом случае каждое попадание является эффективным, избыточных попаданий нет, и именно поэтому ОБЭ при малых дозах возрастает.
При уменьшении массы или микрообъема (при неизменной плотности среды) среднее значение удельной энергии г приближается к теоретическому значению поглощенной дозы D. Поскольку микрообъемы критических областей в клетке достаточно малы, можно считать, что D =
Обозначим среднюю дозу, поглощенную в результате одного события поглощения энергии, символом Doc. Величина Doc зависит как от качества излучения, подобно Л ПЭ, так и от длины пробега и траектории частицы в исследуемом микрообъеме. Doc может быть получена путем усреднения удельной энергии зд (см. гл. II), выделенной в одиночном событии, которая является стохастической величиной, флуктуация которой определяется геометрическими и физическими факторами облучаемого объекта. Таким образом, мы приходим к следующему выражению для Doc:
Doc = kL = z1, (VII.4)
Если Doc выражена в сГр, чувствительный объем V — в мкм3, а ЛПЭ L — в кэВ/мкм, то к = 16L/V).
Пусть I мкм — средняя длина пробега частицы в объеме с площадью поверхности S мкм2. Тогда для выпуклого объема I = 4V/S и к = 64/S, а для сферы I = 2/Зф где d — диаметр сферы в мкм,
Doc = ШЬУ^ = 20,41дГ2 сГр. (VII.5)
При воздействии у-излучения 60Со (ЛПЭ = 0,3 кэВ/мкм) на клеточное ядро диаметром 8 мкм получим Doc = 0,1 сГр = 1 мГр.
Полагая, что число событий поглощения при данной дозе D распределяется по закону Пуассона, определим вероятность появления п событий Рп;
Рп = (D/Docy exp(-D/Doc)/n!, (VII.6) где D/Doc — ожидаемое число событий.
В случае, когда каждый чувствительный объем пересекает в среднем один трек, точная оценка событий соответствует следующей ситуации: около 37% объектов не пересекается треком (отсутствуют попадания), 37% пересекает один трек, 26% — два трека и более.
При таком подходе следует, что уменьшение дозы от 1 мГр до фоновых значений будет соответствовать только уменьшению числа ядер клеток, через которые проходят треки ионизирующих частиц. Характерно, что в этом случае существенно изменяется соотношение между числом ядер клеток, которые пересекают соответственно один, два и более треков. Например, при уменьшении D в пять раз по сравнению с Doc, т. е. до 0,2 мГр, ядра около 82% клеток вообще не будут пересекаться треками и только менее 2% будут пересечены двумя и более треками.
Интересно, что за 5 часов (условное время устранения сложно репарируемых повреждений ДНК) при фоновой дозе 1 мГр/год клетки будут подвергнуты облучению в дозе 0,57 мкГр. В этом случае попаданиям не будут подвержены более чем 99,9% облученных клеток, один трек пересечет около 5, 740-2% их, а два и более треков — всего лишь 1,740-5% ядер клеток.
Таким образом ясно, что происходит во всем диапазоне малых доз, вплоть до фоновых величин, когда изменяется количество ядер клеток, которые будут пересечены одним, двумя и более треками ионизирующих частиц. Соотношение между числом ядер клеток приведено в табл. VII.6. Как следует из таблицы, верхнему пределу диапазона доз соответствует доза в 0,2 мГр (= 0, 2Z)OC) при у-облучении. Для а- частиц, для которых Вос = 350 мГр, верхний предел малых доз будет соответствовать 350-0,2 = 70 мГр и т. д.
Однако принятое выше определение верхней границы интервала малых доз не совсем удачно. Действительно, при D /Doc <С 1 мы как будто бы приближаемся к ситуации, соответствующей определению малой дозы. При анализе биологических последствий облучений в таких «малых дозах» этот подход правомочен только в ситуации, когда абсолютное количество клеток в облучаемой системе относительно невелико. Проанализируем сказанное на примере гемопоэтических клеток человека. Их количество примерно 1,5-109. В этом случае при воздействии фоновой дозы в течение 5 часов 8, 9-105 клеток будут пересечены одним и около 240 ядер клеток — двумя треками. Известно, что организм взрослого человека (to 70 кг) содержит примерно 7-1013 клеток, соответствующих чувствительным объемам с массой каждого 1 нг. Продолжая предыдущий анализ, легко показать, что в этом случае за 5 часов воздействия фоновой дозой 1 треком будет пересечено 4-1010, а двумя треками — 1-107 ядер клеток человека. Естественно, что и в этом случае возможными радиационными последствиями в 1-107 ядер клеток пренебречь нельзя, хотя выполняется условие D/Doc <( 1.
Определим, насколько D/Doc должно быть меньше 1, чтобы в облучаемой популяции не содержались клетки, пересекаемые двумя и более треками ионизирующих частиц. Для реализации такой ситуации должно выполняться условие:
S = FN < 1, (VII.7) 1 2
где F = — (Z?/Z?oc) exp (—Z)/Z)oc) — доля клеток, каждая из которых пересекается двумя треками ионизирующих частиц при дозе D; N — абсолютное число клеток облученной популяции. Учитывая, что exp (—D/Doc) to 1 при D/Dgc 1, можно записать (D*/В^)2 N/2 < 1 или окончательно
lg£<_°’51gT’ (VIL8)
где В* — доза, при которой в облучаемой популяции S клеток количество клеток, пересекаемых двумя треками, менее 1. На рис. VII.6 область А находится в диапазоне доз, где в зависимости от числа клеток облучаемой популяции реализуется такая ситуация. Значения В* прямо пропорциональны величине Вос.
Доза D. мГр
Среднее число треков, пересекающих ядро клетки
Количество клеток в % в облученной популяции, пересекаемое треками
% ядер клеток, пересекаемых только 1 треком (среди всех ядер, получивших попадания)
0 треков (нет попаданий)
1 трек
2 трека
3 трека
4 трека
5 и более треков
1 мГр/год, 5,7-Ю"4 мГр за 5 час
5, 710-4
99,94
5, 710-2
1,6-10"5
3,1-Ю"9
4,4-10“13
5-Ю"17
99,97
од
од
90,5
9
0,5
0,015
0,0004
8-10-6
95,1
0,2
0,2
81,9
16,4
1,6
од
0,005
2-Ю"4
90,3
0,5
0,5
60,7
30,3
7,6
1,3
0,2
0,03
77,1
1 = Д1
1
36,8
36,8
18,4
6,1
1,5
0,4
58,2
2
2
13,5
27,1
27,1
18
9
5,3
31,3
5
5
0,7
3,4
8,4
14
17,5
56
3,4
10
9,2
0,005
0,05
0,2
0,8
1,9
97,1
0,05
Таблица VII.6. Доля клеток, пересекаемая треками при различных дозах д-излучения 60Со при Doc = 1 мГр
336Гл. VII. Биологические эффекты малых доз излучений
Тогда для случая гемопоэтических клеток (N = 1,5-109) неравенство (VII.7) начинает выполняться (DOc = 1 мГр) при дозе 3.6Т0 5 мГр. Эту дозу клетки получают при фоновом облучении
Рис. VII.6. Доза D*, ограничивающая верхний предел диапазона малых доз, как функция числа облучаемых клеток V. А — область малых дозРис. VII.6. Доза D*, ограничивающая верхний предел диапазона малых доз, как функция числа облучаемых клеток V. А — область малых дозпримерно за 20 минут. В этом случае в 99,996% клеток вообще не реализуются попадания, один трек пройдет лишь через 3,6ТО-3% клеток (5,4-104 гемопоэтических клеток) , а число клеток с двумя попаданиями — меньше единицы. С рассматриваемых позиций верхний предел диапазона малых доз при облучении 7Т013 клеток человека будет иной. В этом случае параметр S = FN = F-7T013 < 1, т. е. F < 0,141Q-13 и D* = 1,7-Ю"7 мГр (при Doc = 1 мГр). Такую дозу клетки получают при воздействии фонового облучения (1 мГр/год) примерно за 5,2 секунды. Из сказанного следует,
Рис. VII.6. Доза D*, ограничивающая верхний предел диапазона малых доз, как функция числа облучаемых клеток V. А — область малых доз
Рис. VII.6. Доза D*, ограничивающая верхний предел диапазона малых доз, как функция числа облучаемых клеток V. А — область малых доз
что чем больше количество клеток в их облучаемой популяции, тем
меньше доза D* которая ограничивает сверху диапазон малых доз.
Зная значения Doc и абсолютную численность облучаемой клеточной популяции, легко найти верхний предел малых доз, т. е. ту дозу, при которой в пораженной радиацией части клеток абсолютное количество последних, через которые проходят 2 трека ионизирующих частиц, будет меньше единицы. Следует отметить, что верхний предел диапазона малых доз подвижен и зависит от числа облучаемых чувствительных объемов. Именно в диапазоне доз, ограниченном сверху D* ^ нет зависимости эффектов в пораженных клетках ни от дозы,
ни от ее мощности.
Таким образом, становится ясным, что при облучении достаточно большого количества чувствительных объемов диапазон малых доз находится в интервале фоновых облучений, причем за короткое время. Только доза, накапливаемая при фоновом облучении в течение года и даже суток, выходит за пределы этого диапазона. Вместе с тем следует полагать, что к воздействию фоновых доз в течение длительного периода клетки адаптированы. Следовательно, нам необходимо определить диапазон, в интервале которого в клетках в среднем происходят качественно те же события, что и при фоновых облучениях. Как видно из табл. VII.6, и мы это обсуждали ранее, начиная от фонового облучения в течение 5 часов и до значения Doc, хотя и в разных пропорциях, через клетки проходят 1, 2, 3 и т. д. треков ионизирующих частиц. При этом количество однотрековых событий достигает максимума, а затем спадает, однако при этом увеличивается количество многотрековых событий.
22 Ю. Б. Кудряшов
Следовательно, во всем диапазоне, ограниченном сверху Doc, качественно события в пораженных клетках в среднем те же, что и при длительном воздействии фоновых доз. Мы еще раз акцентируем это утверждение, поскольку оно представляется довольно важным. Вместе с тем поглощенная доза, равная Doc, соответствует ситуации, когда в среднем через каждую клетку в облучаемой популяции проходит один трек ионизирующей частицы. Таким образом, Doc ограничивает сверху диапазон доз, в котором качественно в пораженных клетках происходят события те же, что и при фоновых воздействиях.
Тем самым моснсно выделить еще один критерий определения малых доз, которому соответствует дозовый диапазон, отличающийся по ответным реакциям клеток (адаптивным) на воздействие радиации.
Ничего удивительного нет в том, что изменив критерий, по которому определяется диапазон малых доз, мы пришли к определению более расширенного диапазона доз (меньший диапазон отвечал чисто формальному определению, которое было основано на представлении о якобы линейности всех эффектов, и как мы видели, оно уже устарело).
Прикинем, насколько это важно. Ведь при расчете величины Doc существует немалая неопределенность. В основном она связана с определением величины чувствительного объема (ранее эта величина уже рассчитывалась). Учет пробега свободных радикалов и моделирование в связи с этим чувствительного объема позволили заключить, что если он представлен сферой, то радиус последней приближается к 3 мкм. Однако возможен и другой подход. Удельный парциальный объем ДНК человека равен приблизительно 0,63 см3/г. Масса ДНК в клетках человека примерно 7.2-1012 г. Тогда объем молекулы ДНК равен 4.5Т012 см3. Если этот объем представить в виде сферы, то ее диаметр будет равен примерно 2 мкм. Тогда Doc для у-излучения 60Со согласно уравнению (VII.5) равна примерно 2,1 сГр, а для 160 кВ рентгеновского излучения (ЛПЭ = 2 кэВ/мкм) — 10,2 сГр. Значит, при разных определениях чувствительного объема рассчитанные величины Doc различаются почти на порядок.
Таким образом, верхний предел диапазона доз, в котором каждая из клеток облучаемой популяции получает в среднем одно попадание, может достигать нескольких сГр (для фотонов). Уменьшение дозы от этого предела будет приводить не только к уменьшению количества клеток, получивших попадания, но и к изменению распределения одного, двух, трех и т. д. попаданий по клеткам. В этом дозовом диапазоне должна наблюдаться зависимость этих параметров и от мощности дозы. Во всем этом диапазоне, поскольку качественно пораженные клетки не отличаются от таковых при фоновых дозах, все клетки должны быть адаптированы к действию ионизирующих излучений.
Важно отметить, что величина Doc не зависит не только от дозы, но и от ее мощности. В зависимости от мощности дозы D/t различается время tx между двумя последовательными событиями пересечения чувствительного объема 0,2 треками в среднем, чем определяется граница диапазона малых доз. Несколько расширим эту границу, пусть в среднем это не 0,2, а 1 трек; это не так существенно, поскольку эта величина условна, а расчеты упростятся. Например, мощность дозы у-излучения в 1 мГр/сутки означает, что за сутки ядра клеток были пересечены в среднем одним треком. Однако если мощность дозы равна 3 мГр/сутки, то пересечение чувствительного объема в среднем одним треком произойдет за 8 часов (1/3 суток), после чего такие события будут повторяться в среднем через 16, 24 часов и т. д. За эти интервалы времени накапливается доза в 3 мГр. Можно рассчитать, что при облучении в дозе 1 Гр/сутки будут происходить через каждые 1,4 мин. пересечения ядра клетки в среднем одним треком. Таким образом, мощность дозы и Doc можно связать соотношением:
у = (VIL9)
Таким образом, в диапазоне малых доз поглощенная доза пропорциональна доле пораженных мишеней, а средняя энергия, поглощенная в объеме мишени, является дозовонезависимой величиной. Учитывая, что в реальности распределение попаданий реализуется по закону Пуассона, при облучении биологического объекта диапазон малых доз ограничен значением попаданий, которые характерны для фоновых весьма кратковременных облучений. При увеличении поглощенных доз от этих значений до величин, при которых в среднем в каждой мишени реализуется одно событие попаданий (верхняя граница низких доз), будет увеличиваться количество мишеней, в которых реализованы попадания. При этом изменяются соотношения одного, двух и т. д. попаданий в поражаемых мишенях. Поскольку эти события характерны и для фоновых облучений в течение длительных воздействий радиации, следует ожидать, что во всем диапазоне рассматриваемых доз должны сохраняться эволюционно выработанные механизмы ответных (адаптивных) реакций клеток на облучение.
Механизмы действия ионизирующих излучений в малыхдозах на клетки
Описание биологических эффектов облучения в малых дозах и при низких интенсивностях позволяет прийти к выводу, что область знаний о них представляет собой самостоятельный, быстро развивающийся раздел в современной радиобиологии. Несмотря на то, что проблеме облучения в малых дозах посвящено уже большое количество публикаций и фундаментальных исследований, все же вопрос о механизмах формирования и проявления вызываемых ими эффектов часто остается еще на уровне гипотез и предположений.
Наиболее важным достижением в данной проблеме является понимание того, что эффект воздействия излучений в малых дозах нельзя оценивать путем простой экстраполяции экспериментальных данных, полученных при использовании больших повреждающих доз облучения. Синусоидальная зависимость эффектов при изменениях дозы облучения: гиперрадиочувствительность при облучении в сверхмалых дозах и индуцированная радиорезистентность (адаптивный ответ) при возрастании дозы; проявление стимуляции биологически важных процессов роста, развития, клеточного деления и других физиологических функций в период гормезиса, обратный эффект моицности доз — уже одни только эти, наиболее изученные проявления биологического действия ионизирующих излучений в малых дозах свидетельствуют об их принципиальном отличии от эффектов, наблюдаемых после облучения в более высоких дозах. Попытки объяснить пусковые механизмы эффектов облучения в малых дозах с привычных, традиционных позиций одного только первичного повреждения ДНК наталкивались на все новые и новые факты принципиального различия. В развиваемой концепции «мембранного механизма биологического действия малых доз» Л. X. Эйдус (2001) пришел к выводу, что первичной мишенью действия радиации в малых дозах является не ДНК, а клеточные мембраны, и в этом состоит принципиальное отличие эффектов, вызываемых облучением в малых дозах по сравнению с большими.
Крупнейшим событием в раскрытии мембранных механизмов формирования биологического эффекта малых доз радиации стало появление новых данных о способности облученной клетки секретировать в микросреду токсические и сигнальные факторы и передавать через них, а также путем непосредственных межклеточных контактов необ- лученным клеткам-соседям сигналы радиационного повреждения, вызывая у последних квазилучевые изменения.
Одно из проявлений этого эффекта, как мы отмечали ранее, было давно известно под названием лучевого токсического эффекта, вызываемого радиотоксинами («эндогенными радиомиметиками»). Однако в последние годы роль радиотоксинов в вызываемом эффекте, получившем название «bystander effect», была существенным образом уточнена, а сама проблема значительно развита в связи с исследованиями ряда особенностей биологического действия радиации в малых дозах.
Плодотворным оказалось направление исследований отечественных лабораторий в изучении процессов перекисного окисления липидов БМ, что позволило оценить вклад изменений окислительно-восстановительного гомеостаза и оксидативного стресса в развитие пусковых реакций эффектов, вызываемых облучением в малых дозах (Е. Б. Бурлакова, 2001, 2002; Ю. Б. Кудряшов, 2001 и др.).
В связи с этим вызывает особый интерес гипотеза о механизме индукции адаптивного ответа, высказанная в недавней публикации И. А. Боднарчука (2002). Автор пришел к выводу о том, что ключом в понимании радиоадаптивного ответа клетки на действие радиации
в малых дозах является первичное усиление процессов перекисного окисления липидов в плазматической мембране с последующей активацией находящихся на БМ рецепторов факторов роста клеток. В результате этого происходит запуск каскадов реакций эксцизионной репарации ДНК и апоптоза. Происходящая под влиянием адаптирующих доз радиации программированная выбраковка наиболее радиочувствительной клеточной субпопуляции способствует проявлению в оставшейся устойчивой части популяции клеток способности к адап- тивому ответу.
В предлагаемой И. А. Боднарчуком схеме выстроена последовательность включения цепи присущих клетке метаболических каскадов, начинающаяся с инициируемых радиацией первичных реакций пероксидации липидов в БМ, играющих роль пусковых в активации клеточных рецепторов, запускающих упомянутые каскады через экспрессию генов, отвечающих за конечные эффекты облучения в малых дозах.
Мембраны в механизме действия радиации в малых дозах
Наряду с традиционной генетической мишенью — ДНК — в радиобиологических исследованиях прочное место заняли и другие критические структуры — БМ. Внимание радиобиологов к ним еще более возросло с тех пор как стали выясняться механизмы эффектов малых доз радиации.
Мы уже отмечали, что ионизирующие излучения «не выбирают» субстрат, их энергия поглощается всеми молекулами и структурами клетки, а дальнейшее развитие событий связано с первичным повреждением критических структур — радиобиологических мишеней, инициирующих в конечном счете нарушение клеточных функций вплоть до гибели клеток, клеточного опустошения, нарушения функций критических органов и тканей при облучении организма в конкретных диапазонах доз.
В отличие от воздействия в больших дозах, радиация в малых дозах не приводит к клеточному опустошению тканей. При облучении в малых дозах может происходить гибель только некоторой части популяции клеток. В подавляющем большинстве клеток развиваются упомянутые эффекты, инициаторами которых являются изменения структуры и функций БМ.
Биологические мембраны — особый принцип организации структур в живых системах
Оценивая роль БМ в появлении и развитии лучевых эффектов, следует кратко упомянуть о наиболее важных особенностях их роли в интактной клетке.
Напомним, что БМ — это универсальный компонент биологических систем. В их строении заложен особый принцип организации такой системы: мозаичность самообновления, динамичность структуры цитоскелета и выполнение барьерно-матричных функций. Разнообразные
изменения в окружающей среде, возрастные изменения метаболизма, инфекционные, онкологические и многие другие заболевания, ионизирующие и неионизирующие радиационные воздействия приводят к структурным перестройкам БМ, которые, в свою очередь, вызывают изменения нормального функционирования клеток.
Первичными неспецифическими изменениями в мембранах являются нарушения тонко отрегулированного уровня окислительно-восстановительных процессов (редокс-гомеостаза) и нарушение физикохимических свойств липидов.
БМ обладают свойством текучести). Изменяясь под действием ионизирующих излучений и других различных физических, а также химических факторов, это свойство обеспечивает адаптивные перестройки в мембране и изменение активности мембраносвязанных белков, воспринимающих и передающих внешние сигналы.
К числу таких молекул относятся рецепторные протеинкиназы и другие сенсоры, ионные каналы, белки-переносчики различных молекул. Изменение функционального состояния сенсорных белков влияет на экспрессию генов, отвечающих за адаптацию клеток к стрессовым условиям.
К числу важнейших барьерно-матричных свойств БМ относятся:
регуляция окислительно-восстановительного гомеостаза;
рецепторно-сигнальная, транспортная, биоэнергетическая функции;
создание многочисленных ионных, молекулярных и др. градиентов в клетке, регуляция метаболических процессов;
межклеточные взаимодействия.
Можно предположить, что при высокой радиочувствительности изменение любого из перечисленных свойств БМ окажется решающим в проявлениях эффектов ионизирующих излучений в малых дозах.
Данные о высокой радиочувствительности БМ и их ранней реакции на облучение начали появляться уже вскоре после получения первых электронно-микроскопических снимков клетки.
Радиочувствительность мембран. Гиперрадиочувствительность
В 1955 г. в первом издании монографии 3. Бака, П. Александера «Fundamentals of radiobiology» ее авторы предположили, что первичный пусковой механизм, ведущий к лучевому поражению клетки, сводится к нарушению структурно-функциональных свойств БМ,
главным из которых является возрастание проницаемости и последующее окислительное повреждение структуры мембран, приводящее к ферментативному распаду клетки. На основании этих представлений авторы выдвинули гипотезу «высвобождения ферментов». Приведем краткое изложение этой гипотезы, опубликованной в русском издании монографии в 1963 г. [3].
Ионизирующие излучения вызывают повреждение липидной структуры БМ (например, лизосом) и нарушение их барьерных функций, обеспечивающих компартментализацию в клетке. Это приводит к нарушению пространственной изоляции ферментов от их субстратов, высвобождению ферментов и к последующему разрушению макромолекул и внутриклеточных структур клетки. Первичное лучевое повреждение структуры БМ представлялось авторами гипотезы как локальный распад фосфолипидов вследствие развития цепных процессов окисления. К сожалению, не делая ссылок на работы Б.Н.Тарусова (1954, 1957, 1960), авторы гипотезы отмечают: «известно, что ионизирующее излучение инициирует окисление липидов, идущее по типу цепной реакции, в результате которой каждый акт ионизации вызывает окисление многих молекул липидов. Изолированный акт ионизации может не повредить внутриклеточную мембрану если его эффект не будет усилен в результате цепного процесса^ происходящего с участием кислорода» [3, с. 267].
Многие радиобиологи обращали внимание также и на то, что транспортные функции БМ относятся не только к уязвимым, но и к таким, нарушения которых возникают быстро. Показано, что изменения клеточной проницаемости для К+, Са2+, Na+, протонов, фосфатных и других ионов могут наступать уже в первые секунды и минуты после облучения и даже в процессе непосредственного действия ионизирующих излучений. По мнению многих радиобиологов, это время слишком мало для того, чтобы успели развиться какие- то биохимические процессы повреждения. Это позволило отнести изменение проницаемости БМ к пусковым физико-химическим эффектам облучения.
Далее было показано, что нарушение ионной проницаемости БМ зависит от возрастания в них окисленности и текучести липидов, приводящих к изменениям величины биоэлектрических мембранных потенциалов, состояния клеточной пролиферации. Была высказана идея о неспецифическом механизме действия излучений на мембраны и что нарушения проницаемости БМ обладают высокой чувствительностью к действию самых различных физических и химических агентов.
Выводы о высокой функциональной чувствительности БМ подтверждались в ранних радиобиологических исследованиях различных лабораторий мира. Однако с 70-80-х годов прошлого столетия начали появляться другие, достаточно многочисленные работы, свидетельствующие об устойчивости БМ к повреждениям от облучения в высоких дозах in vivo и in vitro (Ятвин и др., 1976, 1982). Естественно, что
для сопоставления этих двух кажущихся противоположными выводов о радиочувствительности БМ требовалось проведение в одинаковых условиях экспериментов, использования сравнимых объектов и методов исследований, поскольку при невыполнении этих правил было трудно подчас объяснять причины несовпадения получаемых результатов. Кроме того, как мы уже отмечали, с получением новых данных молекулярной радиобиологии стали понятными ошибочные представления о линейной зависимости радиобиологических эффектов от дозы и мощности дозы облучения. Такие представления, как известно, значительно затрудняли объективность оценки чувствительности и других биологических объектов и систем к излучениям.
Для характеристики реакции БМ на облучение большой интерес представляют исследования радиочувствительности упрощенных мембранных структур — липидных моделей БМ.
Так, открытый в 1972 г. «эффект Петко» (обратный эффект мощности дозы и гиперрадиочувствительность) на облученных клетках был продемонстрирован также и на уровне искусственных клеточных мембран А. Петко и В. Челак (1976, 1980). Авторы показали, что помещение липосом в физиологический раствор, содержащий радиоактивные 22Na или 3Н (мощность дозы IO 3 10 5 рад/час), вызывает при ничтожных дозах облучения (единицы и даже сотые доли мрад) образование гидроперекисей фосфатидилхолина (лецитина) и активирование свободнорадикальных цепных процессов перекисного окисления липидов мембран. Было обнаружено понижение «квантового выхода» гидроперекисей от возрастания мощности дозы при постоянной абсолютной величине поглощенной дозы. Упомянутые изменения нормализуются при действии СОД (одного из ферментов антирадикальной защиты) и различных низкомолекулярных антиоксидантов — радиопротекторов.
Обсуждая механизм обратного эффекта мощности дозы, авторы отмечают, что «чем меньше свободных радикалов создает ионизирующее излучение в данном объеме в единицу времени (а доза меньшей мощности формирует меньшие их концентрации), тем чаще они могут достигать молекул внешней микросреды, не подвергшись до этого рекомбинации». Напротив, при повышении доз (и мощности доз) в диапазоне низко дозового облучения, т. е. при кратковременном облучении, в единицу времени образуются большие концентрации свободных радикалов, успевающие прореагировать между собой и нейтрализовать друг друга, прежде чем они окажутся способными повредить мембрану. Поэтому и радиобиологический эффект при возрастании мощности дозы снижается (Р. Грейб, 1996).
В диапазоне больших доз кратковременного облучения свободных радикалов образуется достаточно много и для рекомбинации, и для реакции с молекулами микросреды. При этом с увеличением мощности дозы доля реагирующих радикалов с молекулами внешней микросреды растет, радиобиологический эффект возрастает в прямой зависимости от мощности дозы. Впоследствии данные о гиперрадиочувствительности искусственных БМ и клеток при облучении их в
сверхмалых и малых дозах были многократно подтверждены работами многих японских, американских, западноевропейских и отечественных лабораторий. Упрощенный химический состав структуры липосом, везикул и других искусственных БМ позволил изучать весьма чувствительные к радиации процессы пероксидации в липидных слоях мембран, лишенных антиокислителей, белков и других систем биогенной защиты, какими обладают природные БМ, клетки и ткани живых организмов.
Можно предположить, что обнаруженная гиперрадиочувствительность (рис. VII.2, I) клеток и моделей БМ при сверхмалых дозах облучения имеет сходство в ответной реакции на облучение по показателям ПОЛ. По-видимому, при облучении в сверхмалых дозах защитная система клеток, оказавшаяся более устойчивой к радиации, еще не реагирует на облучение, не мобилизуется в клетке, позволяя свободно развиваться оксидативным реакциям в липидах так же, как это происходит в «чистых» липидных структурах искусственных БМ. По мере дальнейшего возрастания дозы облучения клеток все более активируется защитная система ингибирования процессов липоперок- сидации.
Известно, что образование оксирадикалов, активация лучевых процессов липопероксидации в плазматических мембранах и проницаемости БМ может быть рассмотрена в качестве пускового, ведущего механизма в проявлении цитогенетических изменений при действии облучений в малых дозах (Е. Б. Бурлакова, 2001; Л.Х. Эйдус, 2001; И. А. Боднарчук, 2002 и др.).
На основании полученного фактического материала можно предположить такую последовательность в развитии эффекта облучения в сверхмалых дозах:
радиационное образование оксирадикалов и накопление ППОЛ в плазматических мембранах инициируют каскад стереотипных биохимических реакций в субпопуляции наиболее радиочувствительных клеток на повреждающие воздействия, в том числе тех механизмов, которые приводят к их апоптозу; в связи с этими событиями наблюдаются прогрессирующие изменения липопероксидации, вызываемые облучением клеток в сверхмалых дозах (левая, восходящая ветвь кривой на рис. VII.2, I);
при дальнейшем возрастании величины сверхмалых доз облучения и достижении определенного дозового порога, происходит, как отмечалось, снижение уровня ППОЛ (вследствие мобилизации антиокислительного механизма защиты); наблюдается активация упомянутого каскадного механизма реакций на повреждение, задержка клеточного цикла и усиление работы системы репарации ДНК в выжившей субпопуляции клеток; поэтому после прохождения пика дозовой кривой возникшие изменения липопероксидации постепенно утрачиваются (правая, нисходящая ветвь кривой на рис. VII.2, I).
Следует отметить, что снижение уровня содержания ППОЛ в облученной клетке, приводящее к исчезновению эффекта сверхмалых доз, может зависеть не только от мобилизации антиокислителей, но и от «утечки» (с помощью открытия пор мембран) из клетки части токсических липидов.
«Эффект свидетеля» («bystander effect»)
В последние годы ушедшего столетия начали появляться сообщения о способности клеток, подвергнутых воздействию ионизирующих излучений в малых дозах, секретировать в окружающую среду токсические вещества и передавать ими необлученным клеткам различные повреждения, в частности, признаки нестабильности генома). Этот эффект воздействия облученных клеток на необлученные получил в зарубежной литературе название «bystander effect» (С. В. Seymour, С. Mothersill, 1997; В. Е. Lehnert, Е. Н. Goodvin, 1997). Он реализуется путем межклеточных контактов и секреции в межклеточные пространства активных веществ.
По-видимому, механизм секреции облученной клеткой активных веществ является одним из способов ее защиты от избытка эндогенных АФК и токсических липидных оксипродуктов, избавления от них при помощи регуляторного открытия пор БМ. Поры во внутренней митохондриальной мембране проницаемы в норме для веществ с молекулярной массой не более 1,5 кДа. Способность их открываться в ответ на накопление АФК предохраняет клетку от накопления ППОЛ и других токсических продуктов. Благодаря большому диаметру открывшихся пор происходит «немедленное выравнивание всех градиентов низкомолекулярных веществ», включая протоны и субстраты окисления (В. П. Скулачев, 1996).
Как показали исследования последних лет, в состав секретируемых веществ могут входить не только АФК, но и другие биологически активные соединения (цитокины или иные факторы, способные повышать в необлученных клетках уровень АФК), белок р53 и др.
Выделившиеся в межклеточную среду экзорадиотоксины (или активные продукты, способные индуцировать эндотоксические вещества после проникновения в другую клетку), проникают в необлученные клетки-соседи и, накапливаясь в достаточных концентрациях, вызывают квазилучевые ответные реакции, т. е. цитогенетические и морфологические изменения, сходные с наблюдаемыми в самих облученных клетках на разных постлучевых стадиях.
Эта способность передавать активные продукты и цито- и генотоксические вещества свойственна как непосредственно облученным
клеткам, так и части их потомков в последующих поколениях. Важно отметить, что повышение содержания секретируемых веществ наблюдалась при облучении клеток даже в сверхмалых дозах а- и 7- излучения.
Удобным объектом для исследования подобных эффектов излучений в сверхмалых и малых дозах могут служить высоко радиочувствительные лимфоидные клетки — лимфоциты, дифференцирующиеся ооциты, сперматогонии В, кортикальные тимоциты и др. Еще в середине прошлого столетия было обнаружено, что LD^ лимфоидных клеток может составлять всего лишь несколько десятков рад, и их гибель обнаруживает прямую зависимость от времени инкубации. Исследование в то время гибели ) этих клеток показывало зависимость поражения клеток от их химического микроокружения: модифицирующее действие оказывали различные биологически активные вещества, в том числе ппол, антиоксиданты и уровень кислорода в среде.
Для лимфоидных, так же как и других клеток, обнаруживался характерный для облучения в сверхмалых и малых дозах обратный эффект мощности.
В экспериментах на тимоцитах Л. X. Эйду с еще в 1989 г. обнаружил, что не только химический состав микроокружения среды оказывает на клетку модифицирующий эффект, но и концентрация облученных клеток в среде: «чем больше концентрация клеток в облученной среде (до известного предела), тем сильнее лучевое поражение клеток».
Анализ феномена «межклеточного взаимодействия облученных клеток» позволил прийти к выводу о способности облученных клеток выделять медиаторы в окружающую среду, изменяя тем самым химическое микроокружение клетки, влияющее на ход развития лучевого поражения. Используя метод ингибиторного анализа, удалось показать, что медиаторная роль в феномене межклеточного взаимодействия принадлежит окисленной полиненасышенной жирной кислоте — арахидоновой, образующейся под действием фосфолипазы А2 из фосфолипидов БМ и подвергающейся в последующем окислению липоксигеназой.
К выводу о «дистанционном действии облученных клеток» пришли также и другие авторы при оценке важной роли процессов липопероксидации в этом эффекте (Poli et al, 1985; Gutteridge et al, 1990).
Как видно, «эффект свидетеля» и примеры «межклеточного или дистанционного взаимодействия» говорят об одном и том же феномене, только в первом утверждении речь идет о влиянии выделяемых облученной клеткой токсических медиаторов на облученную клетку, а во втором — и на необлученную. Итак, при воздействии радиации в малых дозах часть клеток в облучаемой популяции, через которые
прошли треки соответствующих частиц, может секретировать фактор или факторы (радиотоксины), влияющие на функционирование и выживаемость другой части клеток этой же популяции, через которые соответствующие частицы не проходили. Более того, аналогичный феномен наблюдали и после внесения необлученных клеток в среду, в которой предварительно культивировали облученные клетки. Обнаруживается этот эффект вскоре после воздействия радиации на стадии накопления радиотоксинов. Одним из главных биофизических механизмов передачи радиотоксинов от облученных клеток необлученным является механизм открытия пор митохондриальных мембран. Известно, что уже первые сигналы аномального возрастания содержания молекулярного О2, Н2О2, ОН' в клетке ведут к накоплению в клетках таких концентраций и уровня содержания НПО Л, которые вызывают открытие пор мембран, что приводит к быстрому удалению из клетки излишков кислорода и радиотоксинов. При нормализации уровня содержания молекулярного кислорода концентрации АФК достигают исходных величин, а это вызывает регуляторное закрытие пор.
На многоклеточных организмах одно из проявлений «эффекта свидетеля», связанное с образованием и медиаторным действием липидных и хиноидных радиотоксинов, — лучевой токсический эффект последних — давно хорошо изучено. В опытах с локальным облучением животных и растений, а также в экспериментах на парабионтах способность радиотоксинов к миграции в пределах организма или у парабиотически сращенных животных через кровь — от облученного донора к необлученному реципиенту — продемонстрирована также давно (Ю. Б. Кудряшов, 1956, 1966; А. М. Кузин, 1966).
ППОЛ, образующиеся при облучении организмов, а также при облучении и при окислении высших ненасыщенных жирных кислот, вошли в литературу под названием «естественных (т. е. природных) радиомиметиков» за их способность имитировать действие излучений при введении в необлученный организм, вызывая в нем квазилучевое поражение по многим гистологическим, физиологическим и биохимическим проявлениям (Ю. Б. Кудряшов и др., 1964).
Таким образом, уже в шестидесятых годах было известно о существовании некоторых из молекулярных продуктов, участвующих в реализации «эффекта свидетеля» (радиотоксинов — ППОЛ), и об их медиаторном радиомиметическом действии.
Мембранный механизм индукции радиоадаптивного ответа
Несмотря на то, что проблеме радиоадаптивного ответа клеток млекопитающих посвящено большое количество публикаций, понимание его механизма все еще остается на уровне отдельных гипотез.
До недавнего времени существовало в основном два объяснения причин повышения радиорезистентности клеток, облученных в малой, адаптирующей дозе Dy:
происходит гибель наиболее радиочувствительной части клеточной популяции, и в результате оставшаяся часть демонстрирует большую устойчивость к повторному облучению (гипотеза клеточной селекции в популяции);
в диапазоне адаптирующих доз облучения включаются репарационные процессы, делающие всю популяцию менее чувствительной к последующему облучению (гипотеза поклеточной индукции репарации ДНК).
Обе гипотезы имеют право на существование, поскольку опираются на достоверные факты, однако оставалось неясным, являются ли гипотезы альтернативными или могут дополнить одна другую.
Известно, что радиоадаптивный ответ клеток зависит от многих факторов, к числу которых можно отнести гетерогенность клеток в популяции относительно стадий клеточного цикла, пролиферации или дифференцировки, а также от их физиологического состояния: возраста и эндогенного фона радиорезистентности клеток, состояния липидов БМ (например, интенсивности пероксидации и текучести липидов).
Предполагалось в самом общем виде, без детального рассмотрения конкретных молекулярных и биохимических процессов, что пусковая реакция, инициирующая радиоадаптивный ответ, представляет собой обилий неспецифический заи^итний механизм ответа на внешние воздействия. Этот механизм обусловлен нарушением окислительновосстановительного равновесия в клетке и сопровождается синтезом защитных белков, мобилизацией антирадикальных и антиокисли- тельных систем, активацией процессов репарации повреждений ДНК и т. д.
В 2002 г. И. А. Боднарчук, суммировав данные литературы, выдвинул гипотезу о механизме индукции адаптивного ответа клеток при облучении в малых дозах. Автор проследил весь путь индукции радиорезистентности от возникновения повреждений БМ до активации репарации ДНК и клеточной селекции. Кратко детали этой гипотезы состоят в следующем.
Известно, что для реализации адаптивного ответа необходим кислороду т. к. облучение клеток млекопитающих в дозе Dy в условиях гипоксии эффекта защиты от повторной дозы D^ не проявляет. Показано также, что ппол и Н2О2 вызывают изменение микровязкости БМ, снижая их текучесть, а в малых концентрациях стимулируют деление клеток и оказывают защитный эффект на клетки при повторном облучении их в дозе D). Автор рассматриваемой гипотезы привел данные о ведущей роли БМ в инициации адаптивного ответа и схему «каскада событий, запускаемого при облучении клеток млекопитающих в малой дозе, приводящего к индукции реакции адаптивного ответа», фрагменты которой представлены в табл. VII.7, рис. VII.7 и VIL8.
Таблица VII.7. Пусковой механизм ответа клеток млекопитающих на облучение их в малой, адаптирующей дозе Di (начало схемы)
Облучение в малой дозе DiФактивация перекисного окисления липидов плазматической мембраныФувеличение микровязкости липидного матриксаФдимеризация субъединиц рецепторов фактора ростаФактивация рецепторовФприкрепление лигандов к рецепторам и активациярегуляторных белковф ф ф
Из табл. VII.7, где изображена начальная часть предложенной схемы, следует, что при облучении клетки в малой, адаптирующей дозе Di происходит первичное оксидативное повреждение плазматической мембраны за счет активных форм кислорода, инициации образования и накопления ППОЛ.
В результате накопления повреждений и отсутствия репарации БМ возрастает микровязкость липидов мембраны и происходит модификация рецепторов на поверхности клеток. Модификация заключается в димеризации гомологичных субъединиц рецептора — такой же, какая обычно сопровождает активацию рецепторов соответствующим лигандом, различными физическими и химическими воздействиями.
По мнению И. А. Боднарчука, ключом к пониманию природы адаптивного ответа может послужить аналогия происходящих процессов с наблюдаемыми при стимуляции пролиферативной активности клеток под действием фактора роста. Поэтому к пусковым механизмам адаптивного ответа относится активация рецепторов факторов роста, вызывающих включение последующих процессов, в которых участвуют компоненты передачи митогенного сигнала.
Передача митогенного сигнала начинается с прикрепления митогенов к активированным рецепторам и проявляется последующей каскадной активацией различных белков.
Сразу после активации рецептора в клетке возрастает активность фосфолипазы С (ФЛ С), фосфатидилинозитол-3-киназы (ФИ-З-К), Ras. Продукты реакций, катализируемых этими ферментами, возникающие уже через несколько секунд после активации рецептора, — фосфатидилинозитолтрифосфат и диацилглицерин активируют про- теинкиназу С (ПК С). Белок Ras, связываясь с рецептором, вызывает активацию последовательности протеинкиназ, включая митоген-активируемую протеинкиназу (МАПК) и c-Jun-N-концевую киназу (JNK).
Цитоплазматические протеинкиназы ПК С, МАПК и JNK служат основными посредниками, участвующими в передаче сигнала от активированных рецепторов к активаторам транскрипции.
Активаторы транскрипции с-Jun/АР-1 и белок р53 относят к ключевым факторам реализации радиоадаптивного ответа, так как они непосредственно или посредством активации генов-мишеней принимают участие в инициации процессов апоптоза и эксцизионной репарации ДНК.
Активация генов-мишеней транскрипционного фактора с-Jun/АР-1 приводит к образованию комплекса с-Jun/АР-1 с белком c-Fos, который предварительно модифицируется ПК С (рис. VII.7).
Мишенями транскрипционного фактора с-Jun/АР-1 являются гены, участвующие в клеточной пролиферации, дифференцировке, злокачественной трансформации и апоптозе.
Сайт связывания транскрипционного фактора с-Jun/АР-1 присутствует в гене, кодирующем МТ. МТ (металлотионин) — фермент, участвующий в перехвате свободных радикалов. Предполагается, что индукция синтеза МТ — один из механизмов обеспечения радиоадаптивного ответа.
Транскрипционный фактор с-Jun/АР-1 способен не только активировать транскрипцию генов индукции радиоадаптивного ответа, но и сам непосредственно участвует в повышении радиорезистентности клеток, обеспечивая инициацию эксцизионной репарации, благодаря узнаванию поврежденной ДНК и (или) ингибирующему действию на транскрипцию в репарируемых участках ДНК. Таким образом транскрипционный фактор с-Jun/АР-1 может выполнять роль как активатора, так и ингибитора транскрипции. Стимуляция экспрессии генов c-JUN обусловливает усиление и длительное сохранение в клетках радиорезистентного фенотипа.
Период полураспада транскрипционного фактора с-Jun/AP-l в клетках млекопитающих составляет около 6 часов. Это определяет сохранение радиорезистентного состояния клеток на протяжении нескольких часов или клеточных циклов. В то же время изменения, сопровождающие адаптивное состояние, способны сохраняться длительное время, например в течение многих месяцев (А. С. Саенко, 1997).
Активация гена c-FOS, регулируемого собственным продуктом — белком c-FOS — по принципу отрицательной обратной связи, прекращается вскоре после возрастания уровня содержания этого белка в облученной клетке; ингибирование транскрипции гена c-FOS приводит к последующему понижению и выключению адаптивного ответа.
Предполагают, что сайт связывания транскрипционного фактора с-Jun/АР-1 имеется в гене, кодирующем ДНК-полимеразу 3- (DNA Pol ЗУ Этот фермент синтезирует короткие фрагменты ДНК во время функционирования доминирующего механизма эксцизионной репарации оснований в клетках млекопитающих.
АРЕ-1|
c-JUN/APl
c-FOS
образование комплекса
репарация
свободных
длительное
адаптивного
радикалов
сохранение
ответа
адаптивного
ответа
задержка
клеточного
352Гл. VII. Биологические эффекты малых доз излучений
апоптоз радиочувствительных клеток /—
цикла
репарация ДНК
Рис. VII.7. Активация генов-мишеней транскрипционного фактора с-Jun/АР-1 и механизм формирования радиоадаптивного ответа (продолжение схемы). Регуляторные белки обозначены в светлых прямоугольниках, гены — в затемненных прямоугольниках.
Сайт связывания транскрипционного фактора с-Jun/AP-l содержится также и в других генах, продукты которых участвуют в эксцизионной репарации оснований, поскольку экспрессия этих генов активируется ПК С (рис. VII.7 и VII.8).
Активированная протеинкиназа С транслоцируется из цитоплазмы в клеточное ядро и, связываясь с ядерным матриксом, осуществляет посттрансляционную модификацию ДНК-полимеразы а (DNA Pol а), топизомеразы I (TOP I), гистона (Н 1), ДНК и белков, регулирующих транскрипцию, в частности белков р53 и c-Fos, а также апуриновой (апиримидиновой) эндонуклеазы (АРЕ-1) (рис. VII.8).
Как видно из рис. VII.8, белок р53 («страж генома») под действием протеинкиназы ПК С переходит в клетке в стабильное состояние, количество его возрастает и активирует транскрипцию р53-зависимых генов CDKNIA и GADD45. Продукты этих генов активируют репарационную систему, вызывают остановку клеточного цикла, создавая условия для репарации повреждений ДНК или инициируют апоптоз, что обеспечивает удаление из популяции неспособных к восстановлению поврежденных радиочувствительных клеток. Кроме того, белок р53 может принимать непосредственное участие в эксцизионной репарации нуклеотидов, возможно, способствуя узнаванию повреждений ДНК.
Топоизомераза I (TOP I) в результате посттрансляционной модификации под влиянием ПК С переходит в активное состояние и обеспечивает деконденсацию хроматина. Это облегчает работу ферментов репарации ДНК и тем самым увеличивает радиорезистентность клеток, облученных в адаптирующей дозе Dy.
Фосфорилирование ПК С гистона Н I ослабляет компактизацию хроматина и также способствует репарации ДНК и повышению устойчивости клеток к облучению. Активация ДНК полимеразы а под влиянием ПК С содействует протеканию эксцизионной репарации оснований ДНК, осуществляемой при участии ДНК полимеразы ^ и полиАДФ-рибозополимеразы (ПАРП).
Апуриновая (апиримидиновая) эндонуклеаза 1 (АРЕ-1) — еще один субстрат фосфорилирования протеинкиназой ПК С — является ключевым, лимитирующим ферментом эксцизионной репарации оснований ДНК. Активация ее существенным образом усиливает репарацию ДНК, обеспечивая повышение радиорезистентности клеток в радиоадаптивном ответе. Наряду с этим АРЕ-1 регулирует ДНК- связывающую транскрипционную активность не только c-Jun/AP-1, но и белка р53.
Описанная И. А. Боднарчуком схема каскадного механизма инициации радиоадаптивного ответа впервые дает приемлемое согласование высказанных до него гипотез формирования, селекции и элиминации радиочувствительной субпопуляции клеток и активации механизмов репарации ДНК в клетках, выживающих после облучения в адаптирующей дозе Dy.
23 Ю. Б. Кудряшов
Рис. VII.8. Роль белка р53 в формировании радиоадаптивного ответа клеток млекопитающих (окончание схемы). Регуляторныебелки обозначены в светлых прямоугольниках, гены — в затемненных прямоугольниках.
Селекционная гипотеза механизма радиоадаптивного ответа была сформулирована Д. М. Спитковским еще в 1992 г. Гибель от облучения в малых дозах радиочувствительной субпопуляции клеток скорее всего происходит вследствие активации механизмов апоптоза, способных включаться уже при низких уровнях нерепарируемых повреждений. Действительно, как это было показано в лаборатории Л. А. Носкина (1999), количество апоптотически гибнущих клеток возрастает после облучения культуры в адаптирующих дозах. Из схемы видно, что лучевая активация рецепторов фактора роста способна содействовать инициации апоптоза, осуществляемого под контролем и при участии белка р53, выполняющего функцию «стража генома» и обеспечивающего поддержание постоянства генома.
О зависимости адаптивного ответа от репарации ДР ДНК )
Реакция адаптивного ответа уже в первой стадии воздействия адаптирующих доз Di переводит клетку в состояние готовности к последующей репарации ДНК от ДР, которые индуцируются через 4-6 часов после воздействия повреждающей дозы. Однако для репарации ДНК от ДР необходимо включение новой программы и осуществление процесса сближения гомологичных последовательностей ДНК в пространстве ядра клетки.
Было обнаружено, что при воздействии на лимфоциты человека рентгеновских лучей в адаптирующих дозах (3-10 сГр, 160 кВ) в этих клетках действительно происходит перемещение центромерных локусов хромосом в направлении от периферии к центру ядра. Вместе с тем известно, что в лимфоидных клетках с этими локусами связаны белковые Jkaros-комплексы, являющиеся неспецифическими репрессорами многих генов. Таким образом, индуцируемое облучением в адаптирующих дозах перемещение локусов хромосом может являться фундаментальным механизмом как для изменения спектра экспрессируемых белков (в результате переключения активности генов, необходимого для реализации программы репарации ДНК от ДР), так и для пространственного сближения соответствующих гомологичных последовательностей ДНК в ядре клетки, что необходимо для репарации ДР с участием механизмов гомологичной рекомбинации. В клетках с нарушенной репарацией ДР ДНК (например, при раке молочной железы — мутации в генах BRCA 1 и BRCA 2) упомянутого движения локусов не происходит.
Важно отметить, что перемещение центромерных локусов при адаптирующих дозах наблюдается в лимфоцитах человека, находящихся в Go стадии клеточного цикла. Вместе с тем аналогичное движение имеет место в отсутствии внешнего воздействия в лимфоцитах, находящихся в S-, G2- стадиях клеточного цикла. Однако в последнем случае клетки теряют свою функцию, характерную для покоящихся дифференцированных клеток.
В связи с этим было высказано предположение (Д. М. Спитковский), что и при хронических воздействиях, если они осуществляются длительно, дифференцированные клетки могут частично терять свою функцию. В тех случаях, когда репарация ДНК не может быть полностью реализована, появляются клетки с соответствующими нарушениями в геноме или же
клетки гибнут. В последнем случае реализуется специфическая программа гибели клеток — апоптоз.
Итак, в инициации различных механизмов радиоадаптивного ответа клеток при облучении в малых дозах низкой интенсивности важную роль играют мембранные механизмы, в то время как в реализации этого ответа центральное место занимают каскады регуляторных реакций, активирующих транскрипционные факторы с-Jun/AP-l и р53, благодаря которым при помощи механизмов апоптоза обеспечивается элиминация неспособной к восстановлению от повреждений высокорадиочувствительной субпопуляции клеток и активация механизмов репарации ДНК в оставшейся части клеток, делающая их относительно резистентными к воздействию излучения в «разрешающей» дозе.
Неспецифическая реакция биомембран и клеток на действие ионизирующих излучений
Рассматривая различные аспекты воздействия ионизирующих излучений в малых дозах, нельзя оставить без ответа вопрос о том, в какой мере радиобиологические эффекты, наблюдаемые в биомембранах после облучения в этом диапазоне доз, являются специфичными. Другими словами, могут ли аналогичные эффекты быть вызваны действием иных, нерадиационных повреждающих факторов? Если да, то как они проявляются в самой мембране и в целой клетке?
Неспецифическая реакция биологических мембран
Известно, что подобно ионизирующим излучениям, разнообразные химические и физические воздействия, вызывая стрессовые изменения в организме, индуцируют стандартные изменения в структуре мембран, проявляющиеся развитием общей неспецифической оксида- тивной реакции в клетках. Многочисленные данные радиационной биофизики позволяют говорить о том, что эффекты ионизирующих излучений принципиально не отличаются от действия других стрессоров, а клетки и клеточные мембраны отвечают на облучение обычными, неспецифическими изменениями.
БМ в норме находится в жидкокристаллическом состоянии и имеет определенную вязкость, величина которой находится в обратной зависимости от текучести липидов («норма» на рис. VII. 10 и VII. 11).
Вязкость («микровязкость») — это основная характеристика степени неупорядоченности и подвижности липидного бислоя мембран. Она играет важную роль в восприятии мембраной сигналов различных воздействий, в том числе и ионизирующих излучений. Изменение вязкости мембраны связано с изменениями расположения и окисленности ненасыщенных жирных кислот в бислое. Вследствие структурных изменений БМ происходят адаптивные перестройки и изменения функционального состояния мембраносвязанных белков, воспринимающих и передающих внешние сигналы. К таким белкам относятся протеинкиназы и другие сенсоры, а также ионные каналы и
переносчики различных ионов и молекул. Изменения активности сенсорных белков влияют на экспрессию генов, обеспечивающую преодоление клеткой возникших изменений, направленную на нормализацию ее состояния.
При действии ионизирующих излучений, также как и любого дру
гого стрессора, происходят характерные изменения вязкости липидов БМ. В качестве иллюстрации таких изменений вязкости БМ от воздействия облучения в малых дозах приведем данные Е. Б. Бурлаковой 1994 г. (рис. VII.9). Эти изменения после облучения в среднем диапазоне малых доз наступают практически сразу после облучения и обнаруживают немонотонную, колоколобразную зависимость от дозы. Возрастание вязкости по мере увеличения дозы облучения проходит через максимум, сменяясь затем при росте дозы спадом кривой (рис. VII.9) вплоть до значений, меньших нормальной величины.
Интересно, что при других, нерадиационных стрессовых воздействиях на клетку также наблюдаются зависимые от их интенсивности (дозы УФ- излучения, температуры, концентрации вещества во внешней среде) как повышение, так и понижение вязкости липидов БМ. Например, при холодовом или гиперосмотическом стрессе (повышение концентрации растворенных веществ во внешней среде клетки) происходит увеличение вязкости БМ,
Рис. VII.9. Относительное изменение вязкости липидов ядерной мембраны после облучения клеток в малых дозах. На ординате изображена вязкость в относительных к норме (= 1,0) величинахРис. VII.9. Относительное изменение вязкости липидов ядерной мембраны после облучения клеток в малых дозах. На ординате изображена вязкость в относительных к норме (= 1,0) величинаха при гипертермии или
Рис. VII.9. Относительное изменение вязкости липидов ядерной мембраны после облучения клеток в малых дозах. На ординате изображена вязкость в относительных к норме (= 1,0) величинах
Рис. VII.9. Относительное изменение вязкости липидов ядерной мембраны после облучения клеток в малых дозах. На ординате изображена вязкость в относительных к норме (= 1,0) величинах
гипоосмотическом давлении — ее понижение. При этом наблюдается прямая зависимость текучести мембраны от степени ненасыщенности фосфолипидов в ней, а увеличение числа двойных связей в жирных кислотах способствует интенсификации их окисления.
Проиллюстрируем изменения структуры и свойств БМ на примерах гипо- и гипертермического стресса (рис. VII. 10, VII.11; Л. А. Лось, 2001).
Адаптивние изменения БМ при холодовом (гипотермическом) стрессе
При понижении температуры происходит сближение «хвостов» (молекул жирных кислот) и заряженных головок фосфолипидов в горизонтальной плоскости липидного слоя мембраны. Это вызывает
Рис. VII. 10. Схематическое изображение молекулярной геометрии фосфолипидов мембран в норме (N), при гипотермии (I) и гипертермии (II). При понижении температуры молекулы жирных кислот сближаются, их подвижность и радиус свободного вращения уменьшаются (I). В результате повышения температуры происходит противоположное — молекулы раздвигаются, их подвижность и радиус вращения возрастают (II)
нормаI а
ж® - етж
жидкокристаллическая зона фазовогофазаперехода
I
I б
ХОЛОДОВОЙ
стресс
IIIIгипертермический стрессгипертермический стрессдезинтеграция и нарушение структуры мембраныдезинтеграция и нарушение структуры мембраныфаза геля
II
II
гипертермический стресс
гипертермический стресс
дезинтеграция и нарушение структуры мембраны
дезинтеграция и нарушение структуры мембраны
Рис. VII.11. Изменения структуры и свойств мембраны при стрессорных воздей-ствиях на клетку.
Норма: В норме мембрана находится в жидкокристаллической фазе.
I а-I Ь: При снижении температуры окружающей среды в мембране возникают зоны разделения фаз (I а), и затем мембрана может перейти в фазу геля (I б). При этом происходит сближение полярных головок фосфолипидов, уменьшение объема клеток и сжатие мембран.
При повышении температуры может произойти частичная или полная дезинтеграция мембраны с хаотичным слиянием липидов и образованием внутримем- бранных инвертированных фаз. Ненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов в разрыхленной мембране легко подвергаются окислительным реакциям, образуя токсические продукты.
При более глубоких стрессовых повреждениях возможен пробой липидного слоя с выщеплением окисленных фрагментов жирных кислот и образованием пор в мембране. Это наблюдается, например, при некротической форме гибели клеток после воздействия ионизирующих излучений в высоких дозах
увеличение вязкости липидов и сжатие БМ. По мере усиления гипотермии текучесть липидов понижается настолько, что мембрана приобретает гелеобразное состояние (рис. VII.11, 16). В этом состоянии резко снижается подвижность и конформационная мобильность мембраносвязанных белков, и в завершение подавляются биологические функции БМ и клетки.
Однако в клетке имеются механизмы, защищающие ее от такого состояния. Начало увеличения вязкости липидов (снижения текучести) мембраны в клетке служит сигналом неблагополучия, «тревоги». Вследствие этого мобилизуются процессы десатурации — образования двойных связей в хвостах жирных кислот фосфолипидов. Это приводит к увеличению уровня содержания ненасыщенных жирных кислот в мембране и восстановлению текучести.
Предполагается следующий механизм регуляции биофизического состояния мембран с помощью десатурации жирных кислот: 1) сигнал повышения вязкости фосфолипидов БМ передается через мембраносвязанные сенсорные переносчики ) к промоторам генов десатураз в клетке; 2) возрастает синтез полиненасыщенных жирных кислот, нормализуется текучесть мембран и физиологическое состояние клетки (Д. А. Лось, 2001). Следует отметить, что индукция генов десатурации зависит не от абсолютной температуры, а от разницы температур преадаптации и индукции.
В случае образования избытка ненасыщенных связей при десатурации появляется опасность накопления ППОЛ, а это приводит к мобилизации другой системы защиты клетки и мембран от повреждений — активации антиоксидантной системы, регулирующей окислительно-восстановительный гомеостаз.
Адаптивные изменения БМ при гипертермическом стрессе
При повышении температуры вязкость БМ понижается, текучесть и подвижность липидов возрастает, происходит разрыхление мембраны. При этом усиливаются процессы липопероксидации и накопления токсических ППОЛ, приводящих к молекулярной дезинтеграции фосфолипидов. При высокой интенсивности воздействий происходит нарушение структурно-функциональных свойств БМ и клетки (рис. VII.11, II).
Так же, как и при холодовом стрессе, в ответ на сигнал неблагополучия включаются стандартные системы, регулирующие десатурацию и окисление ненасыщенных жирных кислот. Повышение температуры, увеличивая текучесть мембраны, понижает активность десатураз и мобилизует антиоксидантные системы. Характерной для регуляции
реакции на гипертермию является активация экспрессии генов теплового шока, в частности Hsp 90 (heat shock protein 90), кодирующего один из белков теплового шока. Этот белок способен связываться с фосфолипидами и предохранять тем самым БМ от окислительной дезинтеграции.
Концепция влияния текучести липидов мембраны на регуляцию экспрессии генов подтверждена многими исследованиями.
В зависимости от природы и интенсивности фактора, воздействующего на мембрану, клетка мобилизует те или иные механизмы сохранения гомеостаза. При осмотических стрессах клетка активирует синтез биологически активных веществ, регулирующих ее объем (глицерина, пролина, глицин-бетаина), или пытается избавиться от избытка воды в цитоплазме.
Помимо описанных механизмов регуляции, через мембраны могут активироваться иные способы восприятия и передачи сигналов в клетке. Это может происходить при участии ассоциированных с рецептором ферментов — фосфолипазы С, протеинкиназы С, механизмов регуляции проницаемости, мобилизации ионов Са2+, изменения уровней содержания циклических нуклеотидов и др.
Рассмотренные изменения текучести мембран связаны не только с уровнем ненасыщенности жирных кислот, но и зависят от степени их окисленности. Они являются частью общей неспецифической реакции регуляции гомеостаза, происходящей в клетке в ответ на физические и химические воздействия.
Здесь вспоминаются слова основателя теории стресса Ганса Селье о том, что стресс — это состояние живой системы, характеризующееся выработкой адаптационных реакций в ответ на неблагоприятные факторы среды.
Стадии неспецифической оксидативной реакции клетки
Любой стрессор вызывает в клетке ответную стресс-реакцию — «оксидативный стресс», проявления которого зависят от интенсивности и длительности воздействия.
Эта реакция состоит из двух основных взаимосвязанных процессов: оксидативного, развивающегося в результате накопления ОРТ, приводящего к патологическому эффекту, и сдерживания этого процесса с помощью мобилизации запасов защитных ресурсов клетки — системы ферментных и низкомолекулярных антиоксидантов, т. е. емкости антиокислительного буфера) (АОБ) (рис. VII.12).
При действии ионизирующего излучения в малых дозах на клетки и организмы проявляются первые две стадии неспецифической стресс
Рис. VII. 12. Схема соотношения интенсивности перекисного окисления липидов (I) и емкости антиокислительного буфера (II) на разных стадиях оксидатив- ного стресса клетки и организма
В ответ на стресс-воздействие возникает первая реакция — всплеск ПОЛ и образование ППОЛ (I а). Это «стадия тревоги», которая служит сигналом для мобилизации антиокислительных ресурсов клетки — возрастания емкости антиокислительного буфера, сдерживающего процессы перекисного окисления липидов (II а) в «стадии адаптации».
Процесс возрастания устойчивости организма на стадии адаптации связывают с активизацией антиокислителей, открытием пор БМ для секреции во внешнюю среду токсических веществ и с восстановлением «критических» органов клеток от возникших повреждений.
Защитные ресурсы клетки небезграничны, и наступает момент, когда емкость антиокислительного буфера уменьшается и достигает в «стадии истощения» уровня ниже стационарного состояния нормы (II б), предоставляя возможность резко развиваться процессам липопероксидации (I б)
реакции. Стадии тревоги оксидативного стресса соответствует эффект гиперрадиочувствительности, а адаптации — радиоадаптивный ответ (РАО) и эффект гормезиса.
Облучение в высоких дозах приводит к состоянию, характерному для стадии истощения. В этой стадии происходит значительное расходование антиокислительного буфера. Параллельно этому «вырывается» из-под контроля и развертывается по цепному механизму процесс липопероксидации. Наблюдается резкое возрастание ОРТ, в том числе прогрессирующее накопление ЛРТ. В этой стадии в наибольшей степени развивается дисбаланс регуляторных (защитных) и оксидативных механизмов. При этом в клетках и тканях происходит изменение соотношения между уровнями емкости антиокислительного буфера (АОБ) и содержания оксирадиотоксинов (ОРТ) в направлении понижения этого соотношения, когда АОБ/ОРТ становится меньше 1
(естественно, что в норме, в состоянии гомеостаза, этот коэффициент равен единице и он может превышать ее при мобилизации и увеличении содержания защитных ресурсов в клетке). В радиобиологии это соотношение получило название эндогенного фона радиорезистентности (ЭФР) (Е. Н. Гончаренко, Ю. Б. Кудряшов, 1980).
Специфика нарушений окислительно-восстановительного гомеостаза при различных заболеваниях заключается в характере и величине изменений АОБ и ОРТ. Длительная или интенсивная активация перекисного окисления липидов при снижении емкости антиокисли- тельного буфера вызывает значительные биохимические изменения облученных клеток и внутриклеточных структур. Характер этих изменений требует дальнейшего изучения в свете концепции включения биохимических модулей ответа в реакции клеток на повреждения.
При крайней интенсивности острого лучевого поражения возникают деструктивные процессы, приводящие к такой форме клеточной гибели, как непрограммированное «убийство» — некроз. Менее интенсивные воздействия вызывают, как известно, стимуляцию программированной гибели клеток, «самоубийства» — апоптоз.
Радиационно-индуцированная нестабильность генома(В. К. Мазурик, В. Ф. Михайлов)
До сих пор в данной книге уделялось главное внимание рассмотрению радиационного поражения и восстановления на разных уровнях биологической организации — от молекулярного и клеточного до уровня организма — эффектов, проявляющихся с одной стороны инактивацией молекул, разными формами клеточной гибели, гибелью организма и с другой — процессами структурного восстановления объектов названных уровней и выживаемостью. Меньше рассматривались функциональные характеристики клеток и организмов, выживших после облучения. Между тем это весьма важный аспект последствий действия ионизирующей радиации как на клеточном, так и на организменном уровне, поскольку имеет отношение к механизмам радиационного канцерогенеза и преждевременного старения, основу которых составляют клеточные изменения. В опытах in vitro уже давно было обнаружено особое состояние потомства облученных клеток, делающее их существенно отличными от нормальных, необлу- ченных (A. R. Kennedy, J. В. Little, 1980; С. В. Seymour, С. Mothersill, 1986; И. И. Пелевина с сотр., 1992, 1995; W. F. Morgan et al, 1996). Оно проявлялось рядом феноменов: спонтанным возникновением так называемой отсроченной репродуктивной гибели в потомстве облученных клеток в отсутствие воздействия излучения, снижением жизнеспособности потомков клеток, облученных в дозе 50 сГр, при дополнительном воздействии химических соединений, влияющих на клеточный метаболизм, появлением гигантских клеток как при остром, так и
при хроническом воздействии излучений. Восстановление от потенциально летальных повреждений сопровождалось почти в 20 поколениях потомства облученных клеток усилением элиминации клеток с микроядрами. Более чем в 30 поколениях потомства облученных клеток наблюдали спонтанную индукцию сестринских хроматидных обменов, увеличение числа клеток с такими обменами и с микроядрами, повышение радиочувствительности и отсутствие адаптивного ответа (И. И. Пелевина с сотр.). Сходные описанным здесь функциональным изменениям в клеточном потомстве облученных клеток наблюдали еще раньше и продолжают исследовать в настоящее время И. Б. Бычковская, Г. К. Очинская и др. (1973-2002).
В последнее десятилетие это состояние получило название радиационно-индуцированной нестабильности генома и стало одной из самых активно разрабатываемых проблем современной радиобиологии.
Термином «радиационно-индуцируемая нестабильность генома» обозначают радиобиологический феномен, проявляющийся в том, что часть клеток, выживших после облучения, может давать функционально измененное потомство, в котором с высокой частотой на протяжении многих поколений возникают de novo аберрации хромосом и генные мутации, в ряде случаев приводящие к повышенной клеточной смертности путем апоптоза. Эти отсроченные проявления радиационного эффекта не имеют клонального характера, обнаруживаются с высокой частотой, сильно зависят от вида воздействующего излучения, типа облучаемых клеток.
Таким образом, в отличие от перманентной геномной нестабильности, свойственной таким наследственным болезням, как анемия Фанкони, синдром Блюма, атаксия-телеангиэктазия и др., радиационно-индуцированная нестабильность генома не определяется возникновением стойких нарушений в первичной структуре ДНК, копированием в клеточном потомстве радиационных повреждений ДНК родительских клеток, не имеет клонального характера и может возникать в клетках, не подвергавшихся облучению, но получивших сигналы повреждения от облученных «соседей» («эффект свидетеля»). Очевидно, она обусловлена длительно сохраняющимся приобретенным изменением функционирования клетки как целого, передаваемым потомству посредством эпигенетических механизмов.
Варианты проявления нестабильности генома
В табл. VII.8 представлены характеристики клеток по существенным показателям (мутации, состояние систем контроля и обеспечения постоянства генома) в норме и при геномной нестабильности различной природы.
Соматические клетки и спонтанные мутации
В норме ДНК клеток организма человека и животных подвергается постоянному воздействию АКСС, образующихся в ходе окислительновосстановительного метаболизма (О2, Н2О2, ОН*, NO’, пероксинитрит
Показатель
В норме
При нестабильности генома
в соматических
клетках (кроме В-клеток иммунной системы)
в В-лимфоцитах — представителях клеток с функциональной нестабильностью генома
при перманентной, генетически наследуемой (анемия Фанкони, синдром Блюма, атаксия-
телеангиэктазия и т.д.)
при радиационно- индуцируемой (РИНСГ)
1. Мутации:
А. Частота
Б. Механизм возникновения
В. Механизм наследования
Г. Распространенность в популяции клеток
10"6
спонтанный + индукция мутагенами
генетический, клональный
единичные клетки
усиление амплификаций, рекомбинаций
в ответ на антиген
генетический, клональный
клон
> 10"5-
не известен
генетический, клональный
клон
> 10“5
не известен
эпигенетический, не клональный
>10% популяции
Таблица VII.8. Некоторые клеточные характеристики в норме и при радиационно-индуцированной нестабильности генома (РИНСГ)
Продолжение таблицы — на следующей странице.
364Гл. VII. Биологические эффекты малых доз излучений
2. Состояние систем контроля стабильности генома:
дефектна
дефектна
эффективность понижена
повышена экспрессия генов, связанных с клеточным циклом (р53, р21, р34 и т.д.)
А. Система репарации ДНК
Б. Система контроля стадий
эффективна
эффективна
активирована эффективна
В. Система окислительно- восстановительного гомеостаза
норма
норма
нарушена при анемии Фанкони
усилена продукция АФК, АСОА; ее модификация воздействует на проявления РИНСГ
Г. Частота апоптоза
норма
норма
повышена
как правило повышена
3. Радиочувствительность
норма
норма
повышена
повышена
4. Последствия
нормальные для данного типа клеток старение и гибель
нормальные для данного типа клеток старение и гибель
высокая чувствительность к генотоксическим агентам, склонность к онкотрансформации
возможны
два исхода: а) восстановление б) длительное сохранение в популяции клеток сРИНСГ с возможностью их онкотрансформации
Продолжение таблицы VII.8
4. Радиационно-индуцированная нестабильность генома365
и др.). В результате возникает значительное количество повреждений, большинство из которых эффективно устраняется механизмами репарации ДНК. Тем не менее часть таких повреждений сохраняется в геноме и служит структурной основой спонтанных мутаций, проявляющихся в норме с частотой ^ 10 6. Если клетки с такими мутациями преодолевают барьеры сверочных точек клеточного цикла и не устраняются путем апоптоза, то эти мутации наследуются потомством клеток при помощи клонального механизма. Фенотипически такие мутации практически никак себя не проявляют, и клетки тканей, в которых они обнаруживаются, характеризуются нормальным темпом старения и гибели.
В-лимфоциты — представители клеток с функциональной нестабильностью генома
Непостоянство генома не является патологией, скорее оно имеет эволюционно-приспособительную функцию. В клетках различных организмов она осуществляется путем амплификации генов с последующим адаптивным изменением части их в ответ на изменение среды. Наиболее демонстративным примером описанного явления служит ответ В-лимфоцитов на воздействие антигена, завершающийся выработкой специфических антител.
Гены, кодирующие различные части цепей иммуноглобулинов, в недифференцированных В-клетках разобщены и при дифференцировке, вызванной антигенным стимулом, соединяются между собой. До начала этого процесса существуют много сотен генов вариабельных (variable, V) частей легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. Отдельно от них на расстоянии тысяч пар нуклеотидов перед началом генов константных (constant, С) частей иммуноглобулинов расположено несколько коротких сшивающих (joining, J) последовательностей. Еще левее их находятся также очень короткие участки разнообразия (diversity, D).
Для синтеза антител в результате внутрихромосомных рекомбинаций возникает колоссальное количество вариантов соединения V-, D-, J- и С-генов. При соединении V- и J-генов рекомбинация происходит не в точно фиксированных местах, а с отклонением на несколько нуклеотидов. Поэтому в некоторых участках уже собранных генов усиливается соматический мутагенез. В результате многообразие вариаций существенно увеличивается, обеспечивая соответствующее многообразие клонов лимфоцитов как материала для отбора тех из них, которые синтезируют антитела, специфические к антигену.
Состояние систем контроля стадий клеточного цикла и окислительно-восстановительного гомеостаза, частота апоптоза и радиочувствительность на фоне активированной системы У(П)Л-рекомбинации ) не отличаются от нормальных для данного типа клеток значений.
Перманентная (генетически наследуемая) нестабильность генома
Синдромы наследуемой хромосомной нестабильности лежат в основе группы аутосомных рецессивных заболеваний человека, в которую входят атаксия-телангиэктазия, анемия Фанкони, синдромы Блюма, Вернера и Ниджмегена и атаксия-панцитопения. Для них характерны повышенная частота спонтанных мутаций (> 10-5), обусловленная передачей молекулярных дефектов в установленных локусах ДНК, специфичных для каждого из синдромов.
В системе контроля за стабильностью генома при таких заболеваниях обнаружены существенные дефекты.
При атаксии-телангиэктазии это мутация в гене АТМ\ ответственном за распознавание разрывов ДНК и включение системы сверенных точек клеточного цикла, активации репарации ДНК и апоптоза путем стабилизации белка р53, контролирующего эти процессы.
Для анемии Фанкони характерны мутации в генах FACC\ контролирующих белки, образующие при этом заболевании 5 групп комплементации. Предполагается, что в результате страдают процессы узнавания дефекта — поперечных сшивок ДНК, развития и завершения репарации. Кроме того, клетки высокочувствительны к действию активных форм кислорода, что свидетельствует об инактивации в них генов, участвующих в антиоксидантной защите.
При синдроме Блюма это мутации в гене BLM\ локализованном в участке 15q26.1 хромосомы 15. Белок, кодируемый этим геном, принадлежит к семейству геликаз, необходимых для раскручивания нитей ДНК в репликативных вилках при репликации и для обеспечения доступа репарационного комплекса к месту повреждения ДНК. Поэтому при синдроме Блюма мутация BLM приводит к возникновению высоко рекомбиногенных разрывов ДНК, нарушению разделения гомологичных нитей ДНК во время клеточного деления с увеличением количества анеуплоидий и разрывов хромосом. Неспособность репарационного комплекса взаимодействовать с участками повреждения ДНК сопровождается увеличением протяженности областей нерепарированной ДНК, что объясняет возрастание генетической нестабильности, чувствительности к мутагенам и частоты возникновения аберраций хромосом при этой патологии.
Для всех рассмотренных заболеваний, характеризующихся генетически передающейся нестабильностью генома, типична высокая чувствительность к генотоксическим агентам и склонность к онкотрансформации.
Характеристика некоторых проявлений радиационно- индуцируемой нестабильности генома
Существенные отличия от рассмотренных вариантов геномной нестабильности обнаруживаются при радиационно-индуцируемой нестабильности генома.
Мутации при радиационно-индуцируемой нестабильности генома. Как и генетически наследуемая геномная нестабильность, радиационно-индуцируемая нестабильность генома характеризуется высокой частотой мутаций, достигающей значений > 105.
Установлено, что после радиационного воздействия в десятках поколений клеток число их значительно превосходит спонтанный уровень. Так, частота мутаций в локусе гуанин-гипоксантинфосфори- бозил-трансферазы (hprt)) у потомства облученных клеток после 95-100 делений была на 2 порядка выше спонтанного уровня, достигая 10'\ Если при непосредственном радиационном воздействии более 70% мутаций относится к делециям, то при радиационно-индуцируемой нестабильности генома они имеют характер точковых, затрагивая многие гены: hprt, резистентности к уабаину, тимидинки- назы (tk)), опухолевого супрессора р53 и, возможно, др. При этом в мутационный процесс вовлекаются не только кодирующие участки генов, но и интронные, не экспрессируемые, а также минисателлитные области всего генома.
При радиационно-индуцируемой нестабильности генома в популяциях клеток длительно наблюдается повышенный уровень аберраций хромосом. При этом обнаруживаются множественные перестройки их структуры, и это коррелирует с пониженной клоногенной активностью клеток (повышением частоты проявлений их отсроченной репродуктивной гибели).
В силу разных причин общее число клеток с аберрациями хромосом с каждым митозом убывает. При этом клоны с хромосомной нестабильностью в следующей клеточной популяции могут восстанавливать стабильность, сохранять тот же уровень нестабильности либо становиться еще более нестабильными. В клетках, претерпевших опухолевую трансформацию, нестабильность хромосом становится устойчивым признаком.
Получены прямые доказательства существования феномена радиационно-индуцированной нестабильности генома in vivo.
Так, если мышиные клетки СЗН/10Т1/2 подвергали воздействию рентгеновского излучения in vitro, а затем выращивали потомство их in vivo (в организме сингенных мышей СЗН) в течение около 6 мес., то оказалось, что частота геномных перестроек в условиях in vivo существенно выше, чем при смене того же числа поколений при
культивировании in vitro. Причем перестройки хромосом затрагивают 50-100% клеточных субклонов.
При пересадке клеток костного мозга мышей-самцов СВА/Н, подвергнутых воздействию нейтронов с энергией 2,2 МэВ в дозе 0,5 Гр (252Cf, мощность дозы 0,04 Гр/мин), самкам-реципиентам, которые были облучены на рентгеновской установке в дозе 10 Гр, обнаружены четкие проявления радиациационно-индуцируемой нестабильности генома на протяжении всего срока исследования (13 мес.). Пересадка сингенных облученных (40XY) и необлученных (40XYT6T6) клеток костного мозга, отличавшихся от первых стабильной Тб-реципрок- ной транслокацией между хромосомами 14 и 15, показала наличие в потомстве 40XYT6T6 необлученных клеток хроматидных и хромосомных разрывов, типичных для индуцированной нестабильности генома, количество которых, правда, было несколько ниже, чем в условиях культивирования in vitro.
Схематически характер проявления мутационного процесса при радиационно-индуцированной нестабильности генома представлен в табл. VII.9.
При действии ионизирующей радиации в малых дозах в нормальных клетках с эффективно функционирующими механизмами контроля клеточного цикла и репарации ДНК происходит устранение спонтанно возникающих и радиационных повреждений ДНК (путем репарации или апоптоза), восстановление возмущенного окислительно-восстановительного гомеостаза. В результате после деления облученной клетки возникает клон ее потомства с нормальным фенотипом. Отдельные клетки с повреждением ДНК крайне редко преодолевают барьеры сверочных точек клеточного цикла и апоптоза и дают жизнеспособное мутантное потомство, формирующее путем генетического механизма наследования повреждений мутантный клон. Практически такие клетки в большинстве случаев функционально не отличимы от нормальных, и мутации в них выявляются только специальными методами.
Эпигенетическое наследование при радиационно- индуцированной нестабильности генома
Экспериментальные данные, полученные в опытах in vitro и in vivo, свидетельствуют о том, что после облучения выживает еще одна часть клеток — те, в которых адаптационные механизмы были активированы, но не пришли в норму к моменту деления. В таких клетках нет повреждений ДНК, препятствующих преодолению барьера сверочных точек клеточного цикла, однако генерация активных форм кислорода в них усилена, а их ДНК чувствительна к действию оксирадикалов, липидных радиотоксинов и других генотоксических агентов.
В таких клетках и обнаруживается радиационно-индуцированная нестабильность генома со всеми ее фенотипическими проявлениями. При этом она возникает как в потомстве клеток, непосредственно подвергавшихся облучению (табл. VII.9, А), так и в потомстве клеток, 24 Ю. Б. Кудряшов
Таблица VII.9. Схема вариантов последствий облучения клеточной популяции, включая проявления радиационно-индуци-рованной нестабильности генома
№поколенияпотомства
Клон, образуемыйполностьювосстановившейсяоблученной клеткой
Клон, образуемыйклеткой, ставшеймутантной в результатеоблучения
Неклональный характер эпигенетической передачи впотомстве облученной клеточной популяциипроявлений радиационно-индуцируемойнестабильности генома
АБ
Материн-скиеклетки
1-е
поколение
2-е
поколение
3-е
поколение
4-е
поколение
▼ттттттт
Примечание: Светлыми ромбами показаны клетки с нормальным фенотипом, темными — мутантные клетки. Вариант А — потомство клетки, через которую прошел трек ионизации; вариант Б — потомство клетки-«свидетеля» из облученной ткани, через нее не проходил трек ионизации, но она имела контакт с облученной клеткой или получила от нее гуморальный сигнал. «Отсроченная» гибель клеток и утраченное в результате нее клеточное потомство показаны штриховыми значками.
370Гл. VII. Биологические эффекты малых доз излучений
через которые при низких дозах излучения не прошли треки ионизации, либо они не затронули клеточное ядро, оказав воздействие только на цитоплазму (клетки-«свидетели») (табл. VII.9, Б).
Если генетическое наследование подразумевает передачу от родителей потомству записанной в ДНК информации, необходимой для воспроизведения определенных биологических структур, то под эпигенетическим наследованием подразумевают передачу информации о функциональном состоянии генетических программ для названных структур, т. е. о наследуемых изменениях активности какого-либо гена или совокупности генов после воздействия на родительские клетки внутренних или внешних модифицирующих факторов. Именно это может иметь существенное значение в механизмах радиационно-индуцированной нестабильности генома: изменение свойственной необлучен- ной клетке модели генной экспрессии, передача измененной модели, в которой хроматин дочерних клеток более чувствителен к повреждающему действию оксирадикалов и оксирадиотоксинов, воспроизведение этой модели в фенотипе последующих поколений.
Возможная роль «эффекта свидетеля»
Объяснение механизма возникновения радиационно-индуцированной нестабильности генома в последнее время пытаются найти путем выяснения причин так называемого «эффекта свидетеля».
Как уже отмечалось, этот феномен обнаружен в опытах, когда в культуральную среду от облученных клеток высеивали интактные клетки, которые не подвергались действию ионизирующей радиации. Вскоре такие клетки, а затем и часть их потомства начинали проявлять все или многие из признаков, характерных для радиационно- индуцированной нестабильности генома, как если бы были потомками облученной клетки.
«Эффект свидетеля», проявляющийся индукцией генетических изменений в необлученных ядрах клеток, может быть следствием двух различных механизмов.
Первый механизм предполагает приобретение клетками свойств нестабильности генома путем контактов с клетками-носителями нестабильности. Этот механизм реализуется через р53-опосредуемий путь проведения сигнала повреждения.
Известно, что содержание белка р53 в клетке, играющего роль стража генома, ответственного за поддержание его постоянства путем активации механизмов сверочных точек клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза, при повреждении ДНК повышается. Такое повышение служит индикатором поврежденности ДНК и после облучения обнаруживается в большей доле клеток легочного эпителия, чем можно было ожидать на основании данных о числе клеток, которые были повреждены а-частицами непосредственно. Важно отметить, что повышение содержания белка р53 наблюдалось даже после облучения ci-частицами в таких низких дозах, как 0,6 сГр, а при действии редкоионизирующего рентгеновского излучения — в дозе 10 сГр.
Отмечается участие в реализации «эффекта свидетеля» экспрессии генов, связанных с клеточным циклом, — р53), p21/Wafl), p34cdc2 ), циклина В1) и rad51. Так, при исследовании реакции культуры первичных диплоидных фибробластов человека на низкоэнергетическое «-излучение в малых дозах было отмечено, что, хотя треки частиц проходили только через 5% ядер, наблюдалось 3-4-кратное увеличение уровней содержания белков р53 и p21/Wafl. Повышенная экспрессия этих белков в культуре клеток отменялась прединкубацией с линданом — ингибитором межклеточных контактных взаимодействий, что указывает на важную роль передачи сигналов от непосредственно поврежденных радиацией клеток через межклеточные контакты.
При облучении культуры клеток низкоэнергетическими «-частицами, когда они пересекали только ~ 2% ядер, наблюдали повышенную экспрессию генов в ограниченных участках культуры. При этом в некоторых группах клеток, не подвергавшихся облучению, наблюдали повышенный уровень содержания соответствующих белков, в то время как в других клетках тех же самых культур их содержание оставалось на исходном уровне. «Эффект свидетеля» существенно подавлялся линданом, а также при понижении плотности клеточной популяции.
Согласно другому механизму, облученные клетки секретируют цитокины или другие факторы, которые в необлученных клетках повышают внутриклеточный уровень содержания АФК. Действительно, если клетки, облученные потоком низкоэнергетических «-частиц, после отмывания от среды, в которой их облучали, высеивали на жидкую среду, то при использовании этой среды в последующем для инкубации необлученных тест-клеток наблюдали повышение в них частоты сестринских хроматидных обменов. Поскольку использованная среда непосредственному облучению не подвергалась, то наблюдавшийся эффект мог быть только результатом накопления в ней неких факторов, выделявшихся облученными клетками. Эффект свидетеля не развивался, если среду подвергали тепловой обработке или облученные клетки до их удаления из среды обрабатывали ингибиторами белкового синтеза. Это доказывает, что данные секретируемые факторы имеют белковую природу. Они способны индуцировать повышение
внутриклеточного содержания АФК, включая супероксидный анион- радикал О2 и пероксид водорода, оксирадиотоксинов — критических интермедиатов в распространении повреждения.
Для реализации «эффекта свидетеля» по этому механизму чрезвычайно важно состояние внутриклеточных систем, контролирующих окислительный гомеостаз. Так, способность культуральной среды после выращивания на ней кератиноцитов человека или мутантных клеток китайского хомячка СНО-К1, подвергнутых воздействию у-из- лучения, вызывать «эффект свидетеля» в необлученных клетках зависела от наличия или отсутствия в таких клетках ферментов лактатдегидрогеназы или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, играющих важную роль в окислительно-восстановительных превращениях углеводов. Среда выращивания облученных клеток с мутантным фенотипом по названным ферментам, т. е. (LDH-/-))- или (G6PD-/-) )-клеток, обладала пониженной способностью или вообще оказывалась неспособной вызывать «эффект свидетеля» в нормальных клетках, культивируемых в ней, что проявлялось отсутствием апоптоза. Трансфекция клеток геном G6PD приводила к восстановлению «эффекта свидетеля». Обработка клеток антиоксидантными веществами — L- лактатом и L-депренилом — также предотвращала действие фактора «свидетеля», проявлявшегося клеточной гибелью, что указывает на участие энергетического/окислительно-восстановительного метаболизма в экспрессии клетками радиационно-индуцированного «эффекта свидетеля».
«Эффект свидетеля» зависит от дозы облучения нелинейно. Он максимален при облучении в малых дозах.
Таким образом, очевидно, что в инициировании радиационно-индуцированной нестабильности генома могут играть роль оба механизма «эффекта свидетеля»: как сигналы о повреждении, передаваемые через клеточные контакты от потомков облученных клеток к интактным, так и сигналы через культуральную среду. Пока не установлена длительность существования «эффекта свидетеля» в поколениях клеток; однако есть доказательство, что этот эффект наблюдается до тех пор, пока облученные клетки не вернутся к исходным уровням реакции на повреждение ДНК. Таким образом, первоначальный профиль повреждения усиливается «эффектом свидетеля», и клетки, которые затронуты этим механизмом, в течение ряда поколений могут оставаться в области повышенного риска генетического изменения.
Механизмы реализации нестабильности генома
Механизмы проявления радиационно-индуцированной нестабильности генома окончательно не изучены. Предполагают, что в качестве необходимых условий нестабильности выступают повреждение ДНК и усиленная продукция АФК.
Известно, что стабильность генома обеспечивается на клеточном уровне тремя взаимосвязанными системами.
Первая из них — система контроля клеточного цикла в све- рочных точках (checkpoints). Она создает условия для удаления клеток с измененной структурой ДНК. Вызывая остановку продвижения клеток по циклу, эта контрольная система обеспечивает время, необходимое для репарации, а при ее неэффективности индуцирует процессы апоптоза. Центральным компонентом этой системы является опухолевый супрессор — белок р53. В целом система контроля клеточного цикла в сверочных точках при действии ионизирующей радиации эффективна. Однако ген р53 относится к числу высоко мутабельных. Мутантный белок р53 может утрачивать способность к полноценному взаимодействию с хромосомой и, как следствие, терять эффективный контроль над другими генами, в частности, над генами р21, bcl-2), Ьах), непосредственно участвующими в реализации надзора за прохождением клеток по циклу и за элиминацией дефектной части клеточного контингента посредством апоптоза. В итоге в 5-20 раз возрастает частота спонтанной гомологичной рекомбинации между хромосомными прямыми последовательностями, что свидетельствует о возрастании геномной нестабильности.
Показано, что при действии ионизирующей радиации в дозах 0,5 и 5 Гр в культуре нормальных эпителиоцитов человека через 5-10 циклов клеточного деления возникает спонтанное развитие множественных «фокусов» морфологически нормальных делящихся клеток с повышенной экспрессией гена р53, который, однако, был мутантным. Клетки с такими мутациями оказывались не способными эффективно устранять метаболические повреждения ДНК, что приводило к накоплению последних и служило одной из причин поддержания геномной нестабильности в поколениях.
Вторая система — механизмы репарации ДНК, направленные на устранение повреждений, возникающих в ее молекулах в процессе клеточного метаболизма, тепловых флуктуаций атомов полимера и действия генотоксических агентов, включая ионизирующую радиацию. К числу таких механизмов относятся эксцизионная репарация оснований, эксцизионная репарация нуклеотидов, репарация нарушений спаривания оснований и рекомбинационная репарация
разрывов ДНК, осуществляемая путем гомологичного механизма и негомологичного соединения концов ДНК. Эффективность репарации определяется характером повреждений, реальными условиями для ее осуществления, активностью ферментов репарационной системы, состоянием укладки ДНК хроматиновых нитей, функциональной полноценностью белка р53, участвующего в контроле репарации, в частности, путем активации гена GADD45 ) и др. Изменение каждого из перечисленных факторов существенным образом сказывается на поддержании стабильности генома и может приводить к возникновению его нестабильности.
Например, дефекты компонентов системы негомологичного соединения концов ДНК приводят к преждевременному старению, повышению чувствительности клеточной ДНК к воздействию ДНК-по- вреждающих агентов, индуцирующих двойные разрывы, в конечном счете, к геномной нестабильности. У мышей, нокаутных по гену GADD45 (GADD45a-/-) ), отмечены повышенная частота возникновения радиационного рака и геномной нестабильности. Последняя проявлялась анеуплоидией, аберрацией хромосом, амплификацией генов и центросомы и сопровождалась аномалиями в процессах митоза, цитокинеза и контроля роста.
Приведенные факты делают понятным, почему участие систем репарации ДНК в развитии радиационно-индуцируемой нестабильности генома является предметом интенсивного изучения.
Третья система, оказывающая существенное влияние на поддержание стабильности генома — система окислительно-восстановительного гомеостаза).
Как уже отмечалось, АФК (супероксидный анион-радикал О2, синглетный кислород О2, пероксид водорода Н2О2, гидроксильный радикал ОН ) и антиоксиданты образуют единую прооксидантно-антиоксидантную систему. С этой системой до недавнего времени связывали только защитные функции: некоторых типов клеток — против чужеродных антигенов (прооксидантная активность), а при действии ионизирующей радиации, эффекты которой в значительной мере обусловлены образованием кислородных радикалов, — с инактивацией последних (антиоксидантная активность). Существенное влияние на антиоксидантную активность клеток оказывает онкобелок bcl-2, локализованный в тех же микроструктурах клетки, где происходит генерация О^. Активация гена bcl-2 предотвращает окислительное повреждение клеточных компонентов, препятствует развитию апоптоза.
Помимо непосредственно защитных функций, для некоторых из АФК в настоящее время установлена функция молекул, участвующих в передаче сигналов в клетках, направленных на формирование адекватного ответа при действии факторов внешней среды.
Экспрессия в потомстве облученных клеток системы образования повышенных количеств АФК предполагается в качестве главного источника радиационно-индуцированной нестабильности генома: АФК ) перманентно повреждают клеточные компоненты, прежде всего ДНК, увеличивая частоту клеточной гибели, мутаций и аберраций хромосом.
Это предположение подтверждается, хотя и не прямо, экспериментальными данными о способности антиоксидантов изменять характер проявлений нестабильности генома. Так, выращивание потомства кератиноцитов человека линии НаСаТ в присутствии низкомолекулярных антиоксидантов, понижающих содержание АФК, уменьшало выраженность радиационно-индуцированной нестабильности генома после воздействия у-излучения в дозе 5 Гр, приводя к понижению соответствующего этой дозе количества апоптотических клеток, восстановлению клоногенной активности.
Другой пример — снижение содержания антиапоптотического белка bcl-2, способного увеличивать в клетках содержание глутатиона, было характерно для потомства облученных клеток с проявлениями радиационно-индуцированной нестабильности генома. Выращивание клеток в среде с антиоксидантами восстанавливало процент bcl-2 позитивных клеток до нормального уровня.
С другой стороны, показано, что при увеличении в клетках содержания АФК стабильность генома резко падает. Так, в опытах на культурах клеток костного мозга, различающихся двукратно по способности к эндогенной продукции супероксидного анион-радикала 0J. инициирование «респираторного взрыва» приводило к возникновению значительного числа хроматидных разрывов в клетках линии, характеризующейся более высоким образованием Оу
Наконец, при исследовании радиационно-индуцированной нестабильности генома и радиочувствительности в клетках с различным генотипом в опытах на мышах обнаружена доминантность наследования как предрасположенности к повышенному образованию аберраций хромосом, так и сопровождающей ее способности тканей к генерации повышенных количеств супероксидного анион-радикала О2.
Биологическое значение радиационно-индуцированной нестабильности генома
Как уже отмечалось, судьба клеток, выживающих после облучения, и особенно их потомства не одинакова.
Активация механизмов репарации ДНК в клетках с высоким уровнем эффективности антиоксидантных механизмов приводит к устранению структурных повреждений в геноме и нормализации метаболических процессов.
Часть клеток, сохранивших повреждения, нарушающих постоянство генома или жизнеспособность, элиминируется механизмами апоптоза. Однако остаются клетки, которые, несмотря на имеющиеся повреждения, преодолели барьеры репарации ДНК и апоптоза и стали мутантными.
Наконец, после облучения выживает еще одна часть клеток — те, в которых адаптационные механизмы были активированы, но не пришли в норму к моменту деления. В таких клетках нет повреждений ДНК, препятствующих преодолению барьера сверочных точек клеточного цикла, однако генерация АФК в них усилена, а их ДНК чувствительна к действию метаболических оксирадикалов и генотоксических агентов. Они-то и становятся носителями радиационно- индуцированной нестабильности генома со всеми ее проявлениями.
Фенотипически радиационно-индуцированная нестабильность генома — это особое состояние части потомства облученных клеток, при котором они существенно отличаются от нормальных клеток, не подвергавшихся никаким повреждающим воздействиям. Это состояние характеризуется в настоящее время цитогенетическими, молекулярно-биологическими, цитологическими и биохимическими проявлениями, не свойственными нормальным клеткам.
На цитогенетическом уровне — это передача части потомства склонности к спонтанному образованию аберраций хромосом de novo. Это относится и к образованию точковых мутаций, особенно затрагивающих регуляторные гены, что делает неэффективным их функционирование, в частности по контролю за поддержанием постоянства генома, темпа клеточного обновления и элиминации чужеродных клеток, и облегчает опухолевую трансформацию.
На молекулярно-биологическом уровне — это существование и эпигенетическая передача части потомства облученных клеток конформационных изменений в структуре хроматина, свойственного материнской клетке состояния его активности, включая экспрессию и продукцию белков, участвующих в осуществлении функции сверочных точек в клеточном цикле, прежде всего белка р53. Оно поддерживает измененный биохимический фенотип клетки, способствует мутагенезу. Изменение в локализации мини- и микросателлитных последовательностей ДНК, амплификация генов также облегчают фенотипические проявления мутагенеза.
На клеточном уровне это проявляется снижением жизнеспособности в обычных для нормальных клеток условиях, понижением, по крайней мере in vitro, их клоногенной способности.
Биохимические особенности такого состояния и механизмы, приводящие к проявлению отсроченных летальных мутаций/репродуктивной гибели, пока еще недостаточно изучены.
Радиобиологическая характеристика радиационно-индуцированной нестабильности генома показывает, что этот феномен возникает после облучения в широком диапазоне доз, включая малые (< 20 сГр), особенно при воздействии плотноионизирующих излучений. Он зависит от дозы излучения, вероятно, в ограниченном диапазоне и может наблюдаться в некоторых случаях в потомстве облученных клеток длительное время, на протяжении многих десятков клеточных циклов.
Феноменология радиационно-индуцированной нестабильности генома находит объяснение с позиций концепции непостоянства генома, развивавшейся Р. Б.Хесиным. Многообразные механизмы перестройки хроматина могут рассматриваться как направленные на обеспечение адаптивно-эволюционного процесса приспособления вида к изменяющимся условиям внешней среды, как переход потомства облученных клеток в состояние готовности к адаптационным изменениям.
Такое состояние может иметь два исхода: приспособление к возникшим условиям с постепенной нормализацией клеточных функций и фенотипа путем репарации и элиминации дефектных клеток, переход в нормальное стабильное состояние, либо переход клеток в трансформированное состояние с сохраняющейся нестабильностью генома и приобретением свойств опухолевого роста.
Заключение
Радиационная биофизика, как мы видели, — сложная, многоплановая наука. Ее задача заключается в том, чтобы выяснить каждую стадию в развитии лучевых изменений, начиная от поглощения энергии излучения отдельными молекулами до конечного радиобиологического эффекта — лучевого поражения и гибели клетки и организма.
Радиационная биофизика также и комплексная наука — в ней работают специалисты самых разных научных дисциплин.
Это и физики, изучающие атомное ядро, свойства излучений, способы их регистрации, физические аспекты взаимодействия излучений с веществом, включая биоматерию.
Это и биологи самого широкого профиля, в задачи которых входит оценка существа и механизмов ответной реакции биологических объектов на разных уровнях их организации на воздействия ионизирующих излучений.
Это и врачи, интересы и обязанности которых сосредоточиваются на изучении механизмов развития, распознавания лучевой болезни и лучевых поражений, их лечении и профилактике.
На разных этапах своего развития радиационная биофизика находила возможности для объяснения с единых позиций, казалось бы, непримиримых концепций и подходов ученых в оценке механизмов ответных реакций биологических систем и объектов на лучевые воздействия.
Методологической основой для биофизического анализа механизмов инициируемых излучениями процессов является изучение биологических явлений в динамике на принципе «от простого — к сложному».
Так, биофизические исследования процессов, протекающих на разных уровнях организации живого, позволили оценить наиболее простые и фундаментальные механизмы реакций элементов биологических систем на внешние физические воздействия. Как отмечал профессор-эколог Массачусетского технологического института Роберт Вайнберг, «прелесть и загадочность красоты Природы нигде не проявляется так ярко, как в молекулярной организации живой системы». Однако к этим словам следует добавить, что по мере усложнения организации исследуемой живой системы загадочность ее все более возрастает, поскольку появляются новые, качественно иные, не свойственные другим уровням и потому не сопоставимые свойства.
В настоящем учебнике для описания динамической картины лучевого поражения использован в основном наиболее «устоявшийся» и вместе с тем не потерявший новизну фактический материал по эффектам внешнего однократного воздействия ионизирующих излучений на молекулярные системы, клетку и организм. Наряду с ним приводятся материалы новейших исследований радиационной биофизики, которые можно отнести к дискуссионным, но необходимым для современной оценки бурно развивающейся науки.
Описание экспозиционных и поглощенных доз излучений, характера поглощения и передачи их энергии биомолекулам позволило изложить последовательную схему событий, развивающихся во времени и пространстве, начиная с момента эмиссии ионизирующих излучений и поглощения их энергии, радиолиза и инактивации молекул, усиления первичных повреждений, вплоть до поражения и гибели клетки и организма.
Однако, как стало очевидно, одного только формального описания общей логической схемы последовательности радиационных событий оказывается явно недостаточно для анализа ответной реакции сложной системы на облучение.
Уже на раннем этапе развития радиобиологии выяснилось, что ионизирующие излучения, в отличии от неионизирующих, обладают необычайно высокой биологической эффективностью, способностью не только повреждать молекулы, но и приводить к гибели клеток и организма. С привычных позиций тепловой энергетики вызывала недоумение ничтожность величины дозы ионизирующей радиации, способной оказывать биологический эффект.
Так, напомним, что минимальная доза общего однократного облучения, вызывающая гибель человека («минимальная абсолютно летальная доза»), составляет 7 Гр. Эта доза в пересчете на массу тела человека в 70 кг составляет 490 Дж или 117,6 калорий тепловой энергии. Такая ничтожно малая, но фатальная для жизни, тепловая энергия, равномерно распределившись в теле человека, «согреет» его всего лишь менее чем на две тысячные доли градуса. Аналогичные расчеты можно привести и для облучаемой клетки.
Уже этот хорошо известный в радиобиологии «энергетический парадокс» позволяет видеть, что рамки необратимой, неравновесной, нелинейной термодинамики («тепловой») оказываются тесными для объяснения столь значимого эффекта биологического действия ионизирующих излучений). Необходимы новые представления энергодинамики открытых систем, учитывающие особенности природы ионизирующих излучений и характер ответа живой системы на облучение.
Вековой опыт радиобиологических исследований и недавние фундаментальные научные открытия молекулярной биологии легли в основу современной радиационной биофизики, развитие которой позволяет объединить в систему основные принципы радиобиологии, касающиеся особенностей природы излучений и характера ответа живой системы на облучение. Напомним исходные положения этих основополагающих принципов.
Речь пойдет прежде всего о принципе попаданий и принципе гетерогенности, постулированных на основе исследования количественной
зависимости биологических эффектов от дозы облучения, успешно развивавшихся в работах Д. Е. Ли, Н. В. Тимофеева-Ресовского и др. и ставших большим вкладом в теоретическую радиобиологию.
Первый принцип, как известно, исходит из физических свойств ионизирующих излучений — их дискретности, квантованности взаимодействия излучений с веществом, вероятностного процесса распределения энергии в пространстве.
Принцип попаданий (дискретности ионизирующих излучений)
Ионизирующие излучения обладают очень малой объемной плотностью по сравнению, например, с тепловым излучением, т. е. переносят энергию в дискретном виде, попадая в некий объект «концентрированными порциями».
Фотоны рентгеновского или д-излучения, ускоренные электроны или тяжелые заряженные частицы обладают огромной энергией, величина которой значительно превосходит энергию любой химической связи.
За время первой, или физической, стадии действия ионизирующего излучения на биологические системы (1016 1013 с) происходят процессы поглощения, перераспределения и диссипиро- вания энергии.
Энергия поглощенных живой системой фотонов или заряженных частиц полностью (прямо или косвенно) растрачивается на возбуждение и ионизацию атомов и молекул.
Вероятность переноса энергии к молекуле не зависит от химической структуры последней, она определяется суммарной электронной плотностью, имеющей примерно равные значения для различных элементов клетки.
В основе другого принципа — принципа мишени — заложено понимание особенности живой системы — того, что структура ее элементов, а также и функции гетерогенны, неравноценны и проявляют различия в ответах на одно и то же попадание. Образно говоря, если радиация «одинаково безразлична» к облучаемым субстратам («не выбирает» их), то повреждения отдельных элементов биологических систем имеют неодинаковую значимость для судьбы клетки.
Принцип мишени (структурной и функциональной гетерогенности клетки)
Высокая энергия, дискретно поглощаемая в клетке, и отсутствие избирательного действия позволяют ионизирующим излучениям вызвать изменения любой молекулы, любой биологической системы. В биологических объектах не существует структур,
испытывающих преимущественное поглощение энергии радиации; возбужденными и ионизированными оказываются белки и нуклеиновые кислоты, липиды и углеводы, молекулы воды и различные низкомолекулярные органические соединения.
Однако неоднородные элементы клетки, поглотившие одну и ту же энергию излучения, по истечении времени (различного для каждого элемента живой системы) претерпевают изменения, приводящие к различным по степени и биологической значимости повреждениям.
Характерные зависимости «доза-эффект» являются отражением квантованного характера взаимодействия излучения с веществом и наличия в клетках высокочувствительных критических объемов — мишеней.
Наблюдается дальнейшая последовательность физико-химического, химического и биологического этапов лучевых изменений молекул и разнообразие их ответов на одно и то же попадание.
Исходя из упомянутых принципов попадания (дискретности) и мишеней (гетерогенности), заложивших фундамент радиобиологии, была сформулирована теория мишени, согласно которой в зависимости от интерпретации понятия радиочувствительности и биологической значимости радиобиологических эффектов в качестве клеточных мишеней рассматриваются высокочувствительные объемы — критические структуры, такие как ДНК и биологическая мембрана, лучевые повреждения которых могут быть ответственными за летальные исходы.
Если не было сомнений в том, что ДНК является критической радиобиологической мишенью, повреждение которой приводит к «генетической» гибели клеток, то в отношении признания в качестве мишени БМ ранее возникали серьезные возражения.
Фундаментальные открытия радиационной биофизики 30-50-х годов ознаменовали новый этап в теоретической радиобиологии, посвященной первичным механизмам взаимодействия ионизирующих излучений с биологическими системами. Открытие кислородного эффекта, непрямого действия излучений, возможности химической модификации лучевого поражения — все это позволило начать исследования биофизической природы «событий попадания», характера поражения элементов гетерогенной живой системы и оценки значимости повреждений критических структур облученной клетки.
Важным достижением этого периода является установление роли активированной воды (активированной вследствие ее радиолиза), роли окислительных радикалов в развитии радиобиологических эффектов. Появились многочисленные исследования, показавшие, что ионизация и возбуждение вызывают не только повреждение органических молекул, но и сами эти повреждения способны передавать
энергию излучения, т. е. проявляют новую повреждающую активность в отношении различных клеточных элементов. Так начала зарождаться идея усиления лучевых повреждений в последовательности радиобиологических эффектов от времени, проходящего после облучения.
Однако упомянутые открытия радиационной биофизики были ошибочно восприняты рядом радиобиологов так, «что понятие мишени расплывается и теряет реальный смысл», и не дали в то время возможности рассматривать «негенетические структуры» в качестве реальной радиобиологической мишени.
Еще в 1970 году Дертингер и Юнг отмечали, что БМ так же, как и ДНК может оказаться структурой, претерпевающей резкие изменения при одном или нескольких событиях поглощения энергии. Однако поскольку после облучения удавалось наблюдать деградацию ДНК, а не мембран или других клеточных компонентов, то, по мнению авторов, это позволяло утверждать, что «на данном этапе нельзя привести экспериментальных доказательств в пользу того, что в клетке существуют другие мишени, которые можно было бы сравнить по значимости с ДНК».
В связи с имевшейся неопределенностью в оценке фатальности для клетки повреждений БМ долгое время ей отводили скромную роль лишь «кандидата на мишень».
Новые экспериментальные доказательства в отношении радиобиологической значимости БМ, ее лучевой деградации и деградации ДНК стали появляться в результате впечатляющих достижений молекулярной биологии о роли оксирадикалов в повреждениях ДНК и БМ. Эти данные экспериментально подтвердили, а также существенно развили и дополнили представления Б.Н.Тарусова о цепном механизме лучевого поражения и о радиобиологической роли оксирадикалов и токсических продуктов перекисного окисления липидов.
Среди главных новых данных, подтверждающих идею усиления радиационных эффектов, было открытие цитогенетического действия ЛРТ и генотоксических оксидативных повреждений ДНК вследствие непрямого действия ионизирующей радиации.
В 1966 г. в совместном исследовании лабораторий Ю. Б. Кудряшова и Н. В. Лучника впервые обнаружено, что радиационно-индуцированные продукты окисления липидов вызывают цитогенетический эффект. Через три года была показана их способность повреждать структуру нуклеиновых кислот.
В лаборатории Е. Б. Бурлаковой с середины семидесятых годов проводились радиобиологические исследования роли липидов и продуктов их перекисного окисления в биосинтезе и функциональной активности ДНК. Однако только на современном уровне молекулярной биологии удалось провести фундаментальное изучение структуры и свойств высоколабильных оксирадикалов и оксипродуктов и их влияния на макромолекулу ДНК и БМ (Л. Дж. Мернетт, 2000). Стало
известно, что накопление ОН' и Н2О2 является не только результатом радиолиза воды, но и усиления радиационно-индуцированного четырехэлектронного неферментативного восстановления кислорода в клетке.
Непрямой эффект радиации через радикалы воды был изучен давно, однако цито- и генотоксическое действие ОН', Н2О2 и других активных окислителей в механизме усиления лучевых повреждений более полно стало раскрываться только в последнее время. Гидрок- сид-радикал — чрезвычайно активный окислитель с весьма малым пробегом — способен разрушать фактически любую находящуюся вблизи него молекулу в клетке. При этом он взаимодействует не только с мембранными структурами. На большие клеточные расстояния его доставляет пероксид водорода, являющийся диффундирующей, «скрытой» формой гидроксид-радикала.
Перемещаясь на большие клеточные расстояния и диссоциируя, молекула Н2О2 способна оказать токсическое действие гидроксид- радикалом не только на ядерный хроматин, но и на любые другие элементы клетки. Действие радикалов на клеточные мишени может быть облегчено в ДНК-липидном комплексе, подробно изученном в 60-70 годах. Вполне вероятно, что ДНК-мембранный комплекс (мол. масса 3-109 Да) может представлять собой единую радиобиологическую мишень — ДНК-МК, лучевое повреждение которой может привести к инактивации и гибели клеток как эукариотов, так и прокариотов.
Радиационное окисление ДНК было известно давно и является важнейшим и твердо установленным фактом, как и механизмы окислительной деградации БМ и лучевого токсического эффекта продуктов ПОЛ, исследование которых проводилось, начиная с пятидесятых-шестидесятых годов прошлого столетия. Однако эти исследования происходили изолированно друг от друга, а возможная связь процессов в липидах и ДНК практически не рассматривалась.
Известно, что БМ наиболее подвержены окислительной деградации, и большое содержание полиненасыщенных жирных кислот в фосфолипидах определяет высокую способность БМ к цепным реакциям окисления и образованию новых инициаторов окисления, обладающих оксидазной активностью.
Показано, что оксирадикалы и образованные ими оксирадиотоксины содержатся в клетке в норме на стационарном уровне, не превышающем 1 мкмоль/л. При действии ионизирующих излучений этот уровень возрастает и вследствие многократного накопления ППОЛ образуется их избыток, который нарушает окислительно-восстановительное равновесие и оказывает токсическое действие на клетку, например вызывая денатурацию мембрано-связанных макромолекул и инактивацию встроенных в мембрану ферментов.
Реакция цепного окисления липидов, инициируемая ионизирующими излучениями, играет исключительно важную роль в клеточной патологии и гибели клетки. Важность такой реакции заключается в
том, что это процесс, способствующий наиболее массивному накоплению избытка токсических продуктов окисления (ППОЛ) в связи с многократным их воспроизведением. Таким образом, имеются убедительные данные о непрямом эффекте излучений не только за счет продуктов радиолиза воды, но и в результате образования свободнорадикальных продуктов окисления липидов.
В последние годы ведутся интенсивные работы по исследованию механизмов непрямого повреждения ДНК эндогенными оксирадикалами. Принципиально новые методические усовершенствования (газовая, тонкослойная хроматография, селективная нон-масс спектрометрия, ЭПР, хемилюминесценция, использование радиоактивных меток, радикальных ингибиторов и др.) создали в конце прошлого столетия основу для высокочувствительной и специфической идентификации токсических оксипродуктов и оксидативных повреждений ДНК, а также для оценки биологических последствий их образования.
Обнаружено, что в нуклеиновых кислотах оксирадиотоксины вступают в реакции с основаниями, образуя оксиаддукты, составляющие основу повреждений генома. Они также разрушают углеводные мостики между нуклеотидами и вызывают разрывы связей в ДНК и РНК. В итоге оксидативные повреждения ДНК в клетке оказываются цито- генотоксичными — вызывают задержку клеточного деления, а при репликации нанесенные ими повреждения вызывают появление на всех стадиях клеточного цикла мутаций в виде аберраций хромосом.
Показано, что оксидативные повреждения в клетке являются важным звеном в патогенезе не только лучевых, но и многих других заболеваний, что свидетельствует о неспецифическом характере этого важнейшего общебиологического процесса. Использование новых методов анализа ядерной ДНК показало также, что непрямой механизм повреждения этой макромолекулы в клетках организма является результатом действия на нее АФК, ППОЛ и системы моноксида азота NO.
В последнее время особенно большой интерес у исследователей вызвало простое химическое соединение — моноксид азота (структурная формула *N=O), обладающее высокой реакционной активностью (в том числе способного активировать и ингибировать цепные свободнорадикальные реакции). Диффундирующий молекулярный мес- седжер — моноксид азота — и продукт его окисления — протонированный пероксинитрит O=N-O-OH — накапливаются в клетках и тканях облученных организмов и вызывают весьма сильное цито- и генотоксическое действие. Пероксинитрит так же, как и перекись водорода, выполняет функции диффундирующей «скрытой» формы гидроксида-радикала.
Благодаря использованию современных методов молекулярной биологии, появляются все новые и новые данные о регуляторной роли NO и пероксинитрита в оксидазных процессах и механизмах влияния на экспрессию генов и биосинтез белков. Установлено, например, что длительная генерация их инициирует апоптоз.
Наряду с оксирадикалами моноксид азота и его производные являются ключевыми факторами воспаления, механизмов инфекции, канцерогенеза, а также развития стрессорного и адаптивного ответов организма.
Установлено, что пероксинитрит и его протонированная форма, диффундируя в клетке и проникая через мембраны с помощью пе- реносчиков-анионов, имеют уникальный спектр химической реактивности: вызывают разрывы цепочек и окисление оснований ДНК, нитрование гуанина и белков, окисление липидов биологических мембран и т. д. Результатом многих таких реакций могут быть цитотогенетиче- ские эффекты и мутагенез.
Все полученные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что ДНК, а также и БМ представляют собой мишени не только для непосредственного попадания в них квантов энергии ионизирующих излучений, но и непрямого оксидантного действия радиации, т. к. мишени повреждаются вследствие действия в облученной клетке мультитоксичных и мутагенных прооксидантов-оксирадиотоксинов'. ОН', Н2О2, ONO^", NO и НПО Л-липидных радиотоксинов.
Оценивая характерный для ионизирующих излучений эффект последействия с прогрессирующей деградацией критических структур клетки, следует остановиться еще на одном принципе радиобиологии — «принципе усиления первичных повреждений».
Принцип усиления первичных радиационных повреждений в критических структурах-мишенях
Радиационно-индуцированные первичные повреждения ДНК (одно- и двунитевые разрывы, повреждение и/или освобождение оснований) и БМ (начальные стадии окисления полиненасыщен- ных липидов) потенциально опасны для судьбы клеток.
Реальная опасность этих нарушений связана с накоплением лучевых повреждений критических структур. Показаны количественная зависимость ОБЭ по отношению к хромосомам (летальный эффект) и генам (мутации отдельных генов), а также зависимость ОБЭ от Л ПЭ разных видов ионизирующих излучений.
Если непосредственные первичные радиационные повреждения локализованы в структурной части гена и проявятся как мутации, то в результате экспрессии гена синтезируются сотни и тысячи молекул мутантных белков, нарушающих функционирование клетки или вызывающих изменения, несовместимые с ее жизнью. Последующий этап усиления первичных повреждений ДНК в отсутствие контроля со стороны механизмов надзора на молекулярном (мутантный белок р53) или клеточном (иммунные механизмы элиминации чужеродных клеток) уровне может сопровождаться их передачей (наследованием) потомкам материнских клеток, т. е. приводить к увеличению численности клеточного потомства, несущего повреждения.
Процесс ионизации, образование избыточных концентраций АФК, NO, пероксинитрита и первичных ППОЛ, образование токсических окислительных аддуктов ДНК и БМ на физикохимическом и химическом этапах передачи энергии излучений, а также фактическая универсальность проявления кислородного эффекта — все это говорит об исключительно важной роли кислорода в трансформации энергии излучения в лучевое поражение клетки.
Развитие оксидативного процесса, цепных реакций окисления в БМ представляет собой механизм усиления первичных повреждений, завершающегося необратимой окислительной деградацией мембранных структур клетки.
Необратимая деградация структур как ДНК, так и БМ может привести к фатальным для клетки последствиям.
Следует еще раз подчеркнуть, что важнейшая биологическая роль клеточных мембран в энергетике, их барьерно-матричные, регуляторные функции в клетке, высокая способность к радиационно-индуцированному окислению и образованию избытка мультитоксических и мутагенных оксирадикалов и ППОЛ — все это в настоящее время позволяет говорить о БМ как о критической структуре — радиобиологической мишени (наряду с критической структурой ДНК), повреждение которой может оказаться губительной для клетки.
В интактной клетке оксидативные процессы находятся в состоянии гомеостаза — под строгим и чрезвычайно разнообразным контролем ферментативных и неферментативных систем, скорость этих процессов невелика, а содержание природных прооксидантов находится на низком стационарном уровне.
Важная роль оксидативных процессов для нормальной жизнедеятельности клетки экспериментально установлена и в настоящее время продолжает исследоваться. Получены убедительные данные, что ок- сидативная деградация, возникающая вследствие накопления избытка продуктов окисления, способная вызывать ряд патологических состояний организма (они получили разные названия: «лучевой токсический эффект», «лучевой стресс», «синдром липопероксидации», «оксида- тивный стресс» и др.), есть результат системной, общей неспецифической реакции клеток и организма на внешние воздействия. При этом происходит изменение эндогенного фона радиорезистентности, т. е. соотношения в клетках или тканях между количествами прооксидантов — ПО и антиоксидантов — АО, т. е. ПО/АО, которое становится заметно > 1.
Специфика нарушений окислительно-восстановительного равновесия при различных заболеваниях заключается в характере и степени изменений конкретных компонентов АО и ПО. Для лучевого поражения, как уже отмечалось, характерно лучевое последействие развивающихся во времени механизмов усиления процессов деградации 25*
критических структур. В настоящее время ферментная и неферментная внутриклеточная защита и восстановление от избыточного накопления ППОЛ носит сложный и многоэтапный характер и подробно изучена.
Обращая внимание на процессы липопероксидации в БМ, следует отметить, что хотя этот процесс развивается в липидной фазе клетки, многие стадии этой сложной системы реакций окисления протекают также и в водной среде. Поэтому часть эндогенных защитных систем в клетке локализована в липидах БМ, часть — в водной клеточной фазе.
Другим важным многоплановым механизмом системного ответа на облучение являются процессы репарации ДНК и пострадиационного восстановления клетки и ее генетического аппарата, связь восстановления ДНК с радиорезистентностью клетки. Стало совершенно очевидным, что существует чрезвычайно великое множество путей восстановления от лучевых повреждений на всех уровнях организации живого: молекулярном, клеточном и уровне целостного организма. Множество путей предохранения и защиты критических структур-мишеней обеспечивает клетке и организму высокую степень надежности их защиты от развития патологического процесса.
В ряде лабораторий исследованы «физические» и молекулярнобиологические механизмы пострадиационного восстановления и доказано, что клетки мутантных бактерий, простейших, млекопитающих и растений восстанавливаются от летальных, сублетальных и мутационных изменений. В многоклеточном организме клеточное восстановление в разных органах и тканях имеет свои особенности. Так, наибольшей скоростью восстановления обладают активно пролиферирующие ткани за счет репопуляции от стволовых клеток, еще сохранивших свою жизнеспособность.
Плодотворными в изучении механизмов радиационного повреждения и пострадиационного восстановления оказались выводы о ключевой роли кислорода в этих процессах, а также о модифицирующем действии ряда радиопротекторов и радиосенсибилизаторов.
Все убедительнее становилась необходимость учитывать новые подходы в оценке биофизических механизмов радиационных эффектов — принципы системного ответа клетки на облучение: наряду с усиливающим первоначальное повреждение эффектом деструктивных процессов принять в расчет работу контролирующих и репарационных систем, «заложенных» в клетке.
Ведущую роль в исследовании процессов пострадиационного восстановления сыграли успехи молекулярной биологии по изучению ферментных систем, обеспечивающих репарацию ДНК от повреждений. Изучены различные репаративные ферменты, одни из которых как бы усиливают первичные лучевые повреждения ДНК (экзо- и эндонуклеазы), другие — отчетливо направлены на их ликвидацию (полимеразы, лигазы, фосфатазы) и др. В реакциях восстановления участвуют некоторые гормоны и факторы роста, влияющие на отдельные хромосомы и их фрагменты.
Слаженность и многоплановость процессов репарации ДНК, процессов, протекающих с разной скоростью и наблюдаемых в клетках (облученных даже в очень высоких, абсолютно летальных дозах), работа систем, контролирующих пострадиационную деградацию Полину клеотидных цепей, открыли возможность детально исследовать механизмы репродуктивной и интерфазной гибели клеток, апоптоза, некротической гибели клеток, формирования радиационно-индуциру- емой нестабильности генома, т. е. главных явлений системного ответа клетки на действие ионизирующих излучений.
Появление идей о необходимости учета фактора времени привели к существенной трансформации представлений о характере действия ионизирующей радиации на клетку. Если на заре развития радиобиологии предпочтение отдавалось статичным моделям, которые рассматривали гибель клетки как результат простого повреждения субклеточной мишени, то для современного периода характерен динамический и системный подход, который в целом соответствует представлениям динамической биохимии и биофизики. На основе количественной оценки эффектов восстановления клеток были предложены «стохастические модели», внесшие существенные коррективы в концепцию принципов попаданий и гетерогенности, а также в теорию мишени. Они базируются на представлениях о том, что случайные и диффузно расположенные акты ионизации и возбуждения только в редких и маловероятных случаях однозначно приводят клетку к гибели. На эту «стохастику первого порядка» должна накладываться «стохастика более высоких порядков», которая определяется динамической нестабильностью жизненных процессов, способных усиливать или элиминировать начальное радиационное повреждение.
Разработанный математический аппарат позволил формально оценить вероятность перехода повреждений с одного уровня на следующий, перехода, связанного с принципами усиления и восстановления радиационних повреждений. Предложенные математические модели позволили, например, Хугу и Келлереру (1969) получить семейство дозовых кривых, удовлетворительно согласующихся с получаемыми в реальных экспериментах на клетках. Это послужило важным критерием приложимости динамических моделей для объяснения феноменов радиационной биофизики. Стохастическая теория, например, ввела понятие «дисперсного начального повреждения» не только генетического аппарата, но и элементов других клеточных структур, в том числе и БМ. Репаративные механизмы, определяющие конечный радиобиологический процесс, формируются за счет неспецифической «компенсационной способности объекта».
Таким образом, математическое моделирование стало эффективным средством оценки влияния ионизирующих излучений на живые объекты. Однако методы моделирования применяются все еще недостаточно активно.
Так, до сих пор основная роль моделирования в радиационной биофизике — это формализованная трактовка механизмов воздействия ионизирующих излучений с помощью аналитических моделей.
Остаются практически невостребованными имитационные математические модели, которые позволяют изучать и прогнозировать поведение объекта в сложной временной и пространственной динамике при постоянно меняющихся условиях (например, уровня излучения, концентрации веществ, модифицирующих действие излучения и т. д.).
Тем не менее важным достижением стохастических представлений в радиобиологии явилось объяснение роли системного ответа клетки на повреждение клеточных структур.
К оригинальному в этом плане выводу пришел недавно Л. X. Эй- дус [355, с. 676]: «... репарация ДНК позволяет понять назначение неспецифической реакции клеток на внешние влияния. По-видимому, главная цель этой приспособительной реакции, выработанной в ходе эволюции, — поддержание целостности основного достояния клетки — ее генома, а способ достижения этой цели природа изобрела наипростейший: воздействие на плазматическую мембрану — наиболее уязвимую структуру клетки, миновать которую не может ни один химический или физический повреждающий агент.»
В дополнение ко всему сказанному можно привести следующую краткую трактовку принципа «системного ответа клетки».
Принцип системного ответа клетки на повреждение радиационных мишеней (регуляция клеточного гомеостаза)
- Облучение клетки (как и вообще любых «сложных» биологических систем) активирует функции механизмов авторегуляции гомеостаза. Значение их заключается в мобилизации компенсаторных механизмов, предназначенных для предотвращения повреждений или активации восстановления поврежденных структур и нарушенного динамического равновесия облученной системы.
Особенно важны такие компенсаторные процессы для сохранения структуры и функций критических структур — мишеней.
- Контроль за избыточным, токсическим накоплением ОН’, Н2О2 и др. активных форм кислорода, NO, ONO^" и продуктов ПОЛ в БМ выполняет сложная многоэтапная система защитных ресурсов клетки (водо- и жирорастворимые биологически активные соединения), включающая ферментативные и неферментативные «антирадикальные», «гипоксические» и «антиоксидантные» механизмы, активность которых зависит от величины дозы и времени, прошедшего после облучения. Сдвиги окислительно-восстановительного гомеостаза, т. е. соотношения содержания в клетке анти- и прооксидантов, характеризуют уровень эндогенного фона радиорезистентности.
Для восстановления ДНК от повреждений в клетке функционируют многочисленные (зависящие от типа повреждения) ДНК- репарационные системы. Активность некоторых из них индуцируется самими повреждениями ДНК и, следовательно, зависит от величины поглощенной дозы. Процесс восстановления повреждений структуры ДНК с участием ферментов репарации предваряется сложными преобразованиями хроматина или перемещениями локусов хромосом в ядре клетки.
Чернобыльские события и наступивший на нашей планете радиоэкологический кризис поставили перед радиобиологами и биофизиками новую задачу — исследование биологического действия ионизирующих излучений в малых дозах и с малой мощностью, соответственно условиям реально загрязненной среды.
Исследования нелегального действия радиации на организм, клетку и молекулярные системы открыли новый мир радиобиологических эффектов. Это и гиперрадиочувствительность при сверхмалых мощностях и дозах облучения, это и стимулирующее действие и адаптивный ответ при облучении в более высоком диапазоне малых доз, это и «эффект свидетеля» — передача необлученной клетке сигналов повреждения токсическими и регуляторными «выделениями» от соседней облученной, это и «непривычное» возрастание устойчивости клетки к действию излучения с ростом мощности дозы при одной и той же дозе радиации («обратный эффект мощности доз»)...
В природных условиях характер и выраженность эффектов облучения в малых дозах искажается на фоне химического загрязнения среды обитания; в экологически чистых условиях ультрамалые дозы ЕРФ оказываются необходимыми для нормальной жизнедеятельности организмов.
Как видно, принцип системного ответа клетки и организма проявляется во всем многообразии при разных диапазонах доз ионизирующих излучений.
Появилась принципиально новая трактовка динамики радиобиологических эффектов радиационного воздействия в малых дозах, имеющей синусоидальный, т. е. нелинейный, немонотонный характер при возрастании дозы облучения.
Приведем основные выводы по данной проблеме.
Системный ответ клетки на действие излучений в малых дозах.
Биологический эффект излучений малых величин и мощностей проявляется в узких интервалах доз и мощностей доз и отличается от действия больших доз не только количественно, но и качественно.
Системы индуцибельной репарации, восстановления, нормализации функций, измененных после облучения клетки в малых дозах и при малых мощностях дозы, в определенном диапазоне
интенсивностей воздействия работают с низкой эффективностью или могут вообще «не включаться». Чем ниже интенсивность облучения, тем позже могут включаться системы индуцибельного восстановления.
Дозы облучения малой величины и мощности в этих условиях могут оказаться более значимыми в сочетании с действием разнообразных факторов окружающей среды, и это может быть следствием синергетических эффектов при радиоэкологических загрязнениях.
Одним из важных механизмов системного ответа является общая неспецифическая реакция на облучение. Инициирующая роль в этой реакции принадлежит окислительным процессам в плазматических БМ.
Анализ совокупности непосредственных эффектов облучения в малых дозах позволил прийти к выводу о том, что в их проявлениях БМ выполняет роль чувствительной радиобиологической мишени.
Облучение биологических объектов в указанном режиме способно вызывать формирование радиационно-индуцируемой нестабильности генома. Это состояние может передаваться в потомстве облученных клеток посредством эпигенетических механизмов и будет существовать до тех пор, пока клетки не вернутся к исходным уровням системного ответа на повреждение ДНК.
Как видно, эти выводы являются важным дополнением к проблеме системного ответа живых объектов на действие ионизирующих излучений.
Таким образом, рассмотрение основных принципов радиобиологии с современных позиций радиационной биофизики и молекулярной биологии показывает, что достигнутый уровень научного знания в этой области может служить основой для построения общей теории механизмов действия ионизирующих излучений на живую клетку. Такая теория окончательно еще не построена, так как ряд проблем, касающихся, например, особенностей, характера и роли изменений критических структур и систем в эффектах действия излучений в больших и малых дозах нуждаются в дальнейшем изучении.
Однако ясно, что общая теория должна учитывать как физические особенности действия ионизирующих излучений на радиобиологические мишени, так и принимать в расчет особенности биологического ответа на облучение. Это, с одной стороны, инициирующее звено («запальный» и каскадный механизмы усиления эффекта на определенных уровнях организации живого), с другой — особенности системного ответа, механизмы компенсации в биосистемах более сложного уровня. Последние развертываются при формировании последовательности
биофизических, биохимических и физиологических процессов в клетке и их проявлений на уровне клетки и организма облученных как в больших, так и малых дозах, в виде функциональных изменений или патологического процесса.
Другими словами, анализ динамики лучевых эффектов должен обязательно основываться на принципах учета усиления немногочисленных начальных молекулярных изменений до видимых, регистрируемых биологических эффектов на фоне способности клетки и организма к системному ответу — мобилизации свойственных им защитных и восстановительных ресурсов и механизмов до уровня полной компенсации возникшего отклонения от нормы. При этом следует иметь в виду, что компенсаторные возможности каждого уровня имеют свой предел, за которым возникает патология.
Логика современного исследования требует планомерного поэтапного анализа механизмов действия излучений и создания динамических радиобиологических моделей с применением новейших достижений электроники и математического аппарата. Для этого необходимо использовать всю совокупность данных, полученных на биологических системах различной сложности структурной организации, с учетом динамики их «поведения» в зависимости от величины и мощности дозы, а также характера облучения.
РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
Основная литература
Монографии, учебники, учебные пособия
Амирагова М.И., Дуженкова Н.А.^ Савич А.ЕД Шальное М.И. и др. Первичные радиобиологические процессы. 2-е изд. /Под ред. Н. В. Тимофеева-Ресовского. М.: Атомиздат, 1973. 336 с.
Бак 3. Химическая защита от ионизирующей радиации. М.: Атомиздат, 1968. 264 с.
Бак 3.. Александер И. Основы радиобиологии. М.: И. Л., 1963. 500 с.
Барабой В.А.^ Брехман И.И.^ Голотин В. Г, Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. СПб.: Наука, 1992. 149 с.
Бонд В.^ Флиднер Д Аршамбо Д. Радиационная гибель млекопитающих. Нарушение кинетики клеточных популяций. /Пер. с англ. М.: Атомиздат, 1971. 320 с.
Гончаренко Е.Н., Кудряшов Ю.Б. Гипотеза эндогенного фона радиорезистентности. М.: Изд-во МГУ, 1980. 176 с.
Гончаренко Е.ЕД Кудряшов Ю.Б. Химическая защита от лучевого поражения. Учебное пособие. М.: Изд-во Моск, ун-та, 1985. 249 с.
Граевский Э.Я. Сульфгидрильные группы и радиочувствительность. М.: Атомиздат, 1969. 243 с.
Гродзинский Д.М. Радиобиология растений. Киев: Наукова думка, 1989. 402 с.
Груздев Г.П. Проблема поражения кроветворной ткани при острой лучевой патологии. М.: Медицина, 1968. 124 с.
Гудков И. И. Клеточные механизмы пострадиационного восстановления растений. Киев.: Наукова думка, 1985. 224 с.
Гуськова А.К.^ Байсоголов Г.Д. Лучевая болезнь человека. М.: Медицина, 1970. 333 с.
Даренская И.Г, Кознова Я.Б., Акаев И.Г.^ Невская Г.Ф. Относительная биологическая эффективность излучений. Фактор времени облучения. М.: Атомиздат, 1968. 302 с.
Дейл В. Действие ионизирующих излучений на ферменты in vitro //Ионизирующие излучения и клеточный метаболизм. М.: Изд-во ИЛ, 1958. С. 43-57.
Дертингер Г.. Юнг X. Молекулярная радиобиология. М.: Атомиздат, 1973. 248 с.
Жестяников В.Д. Восстановление и радиорезистентность клетки. Л.: Наука, 1968. 351 с.
Иванов В. И. Курс дозиметрии. М.: Энергоатомиздат, 1988.
Иванов В.И., Лысцов В.И., Губин А.Т. Основы микродозиметрии. М.: Атомиздат, 1979. 192 с.
Итоги науки и техники. Общая генетика. Т. 4. Биологические системы репарации ДНК у эукариотов. /Под ред. В. К. Мазурика и Г. Г. Порошенко. М.: ВИНИТИ, 1978. 246 с.
Капулъцевич Ю.Г. Количественные закономерности лучевого поражения клеток. М.: Атомиздат, 1978, 232 с.
Кеирим-Маркус И.Б. Эквидозиметрия. М.: 1980. 222 с.
Киселев М.Ф. Медико-биологические исследования низкодозовых радиационных воздействий в сочетании с другими антропогенными факторами. /Дисс. докт. биол. наук. М.: МГУ, 2002. 248 с.
Киселев М.Ф.^ Довгуша В.В., Носкин Л.А. Ланда, С.Б. Детекция антропогенных факторов окружающей среды на основе анализа сдвигов в системе гомеостаза, устанавливаемых с помощью лазерной корреляционной спектроскопии плазмы крови. (Биологическая дозиметрия радиационных нагрузок). //Методические рекомендации № 32-00358/57-Р4. М.: Минздрав России (Федеральное управление «Медбиоэкстрем»). 2000. 27 с.
Коггл Дэю. Биологические эффекты радиации. /Пер с англ. М.: Энер- гоатомиздат, 1986. 184 с.
Коломийцева И.К. Радиационная биохимия мембранных липидов. М.: Наука, 1989. 181 с.
Комар В.Е., Хансон К.П. Информационные молекулы при лучевом поражении клеток. М.: Атомиздат. 1980, 175 с.
Корогодин В.И. Проблемы пострадиационного восстановления. М.: Атомиздат. 1966, 392 с.
Красавин Е.А. Проблема ОБЭ и репарация ДНК. М.: Энергоатомиз- дат. 193 с.
Кудряшов Ю.Б. Практикум по общей биофизике. Вып. 7. Радиобиология. М.: Высшая школа, 1962. 275 с.
Кудряшов Ю.Б., Беренфелъд Б. С. Радиационная биофизика. Курс лекций по биологическому действию ионизирующих излучений. М.: Изд- во Моск, ун-та, 1979. 241 с.
Кудряшов Ю.Б.^ Беренфелъд Б. С. Основы радиационной биофизики. Учебник. М.: Изд-во Моск, ун-та, 1982. 302 с.
Кузин А.М. Стимулирующее действие ионизирующего излучения на биологические процессы: к проблеме биологического действия малых доз. М.: Атомиздат, 1977. 284 с.
Кузин А.М. Структурно-метаболическая теория в радиобиологии. М.: Наука, 1986. 284 с.
Кузин А.М. Идеи радиационного гормезиса в атомном веке. М.: Наука. 1995. 158 с.
Кузин А.М. Роль природного радиоактивного фона и вторичного биогенного излучения в явлении жизни. М.: Наука, 2002. 80 с.
Ли Д.Э. Действие радиации на живые клетки./Пер. с англ. М.: Госа- томиздат, 1963. 288 с.
Моссе И.Б. Радиация и наследственность: генетические аспекты противорадиационной защиты. Минск: Университетское, 1990. 208 с.
Нормы радиационной безопасности — НРБ-99. //Государственные санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. СПб.: Минздрав России, 1999. 115 с.
Обатуров Г.М. Биофизические модели радиобиологических процессов. М.: Энергоатомиздат, 1987. 152 с.
Окада Ш. Радиационная биохимия клетки. /Пер с англ. М.: Мир, 1974. 408 с.
Осанов Д.ЕД Лихарев И.А. Дозиметрия излучения инкорпорированных радиоактивных веществ. М.: 1977. 198 с.
Основные санитарные правила обеспечения радиационной безопасности (ОСПОРБ-99), М.: Минздрав России, 2000.
Особенности механизмов действия плотноионизирующих излучений. /Под ред. А. В. Савича и В. К. Мазурика. М.: Медицина, 1985. 232 с.
Панин М.П., Скотникова О.Г. Действие ионизирующей радиации на человека и окружающую среду. М.: МИФИ. 143 с.
Пелевина И. И., Саенко А. С., Готлиб В. Я., Синзинис Б.И. Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК. М.: Энергоатомиздат, 1985. 120 с.
Петин В. Г., Комаров В.П. Количественное описание модификации радиочувствительности. М.: Энергоатомиздат, 1989. 192 с.
Петров Р.В. Иммунология острого лучевого поражения. М.: Госатом- издат, 1962. 268 с.
Поливода Б. И., Конев В. В., Попов ГА. Биофизические аспекты радиационного поражения биомембран. М.: Энергоатомиздат, 1990. 160 с.
Радиотоксины, их природа и роль в биологическом действии радиации высокой энергии. //Сб. тр. М.: Атомиздат, 1966. 296 с.
Ретроспективная дозиметрия участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС. /Под ред. В. П. Крючкова и А. В. Носовского. Киев: Седа-Стиль, 1996. 256 с.
Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Охотин В.Е., Косицин П.С. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих. М.: Наука, 1997. 160 с.
Ризниченко Г.Ю. Лекции по математическим моделям в биологии. М., Ижевск: Dynamics. 2002. 232 с.
Рубин А.Б. Биофизика. (Теоретическая биофизика). М.: Книжный дом «Университет», 1999. Том I. 443 с.
Рубин А.Б. Биофизика. (Биофизика клеточных процессов) . М.: Книжный дом «Университет», 2000. Т. II. 468 с.
Рябченко Н.П. ДНК и радиация. М.: Атомиздат, 1979. 154 с.
Савицский А.К. Взаимодействие электронов с тканеэквивалентными средами, М.: Энергоатомиздат, 1984. 111 с.
Сборник задач малого практикума по биофизике. М.: Изд-во Моск, ун-та, 1999. 98 с.
Современные методы биофизических исследований. Практикум по биофизике. /Под ред. А. Б. Рубина М.: Высшая школа, 1988. 358 с.
Гарусов Б.П. //Роль перекисей и кислорода в начальных стадиях радиобиологического эффекта. М.: Госатомиздат, 1960. С. 60-65.
Гарусов Б.П. Первичные процессы лучевого поражения. М.: Госатомиздат, 1962. 96 с.
Тимофеев-Ресовский Н.В., Иванов В.И., Корогодин В.П. Применение принципа попадания в радиобиологии. М.: Атомиздат, 1968. 228 с.
Тимофеев-Ресовский Н.В., Савич А.В., Шальное М.И. Введение в молекулярную радиобиологию. М.: Медицина, 1980. 320 с.
Федорова. ТА., Терещенко О.Я., Мазурик В.К. Нуклеиновые кислоты и белки в организме при лучевом поражении. /Под ред. Т. А. Федоровой. М.: Медицина, 1972. 407 с.
Хуг О., Келлер А. Стохастическая радиобиология. /Пер. с нем. М.: Атомиздат, 1969. 183 с.
Циммер К.Г. Проблемы количественной радиобиологии. /Пер. с нем. М.: Госатомиздат, 1962. 101 с.
Штреффер К. Радиационная биохимия. /Пер. с нем. М.: Атомиздат, 1972. 200 с.
Эйдус Л.Х. Физико-химические основы радиобиологических процессов и защиты от излучений. М.: Атомиздат, 1979. 216 с.
Эйдус Л.Х. Мембранный механизм биологического действия малых доз. Новый взгляд на проблему. М.: ООО «Типография ФНПР», 2001. 81 с.
Эйдус Л.Х., Корнетов Ю.Н. Кислород в радиобиологии. М.: Энерго- атомиздат, 1984. 176 с.
Эмануэль Н.М., Зайков Г.Е., Крицман В.А. Цепные реакции (исторический аспект). М.: Наука, 1989. 336 с.
Ярмоненко С.П. Радиобиология человека и животных. Учебник. Изд. 2-е. М.: Высшая школа, 1988. 424 с.
Biological Effects of Low Radiation Doses — Models, Mechanisms and Uncertainties. Report to the General Assambley, 48 Session of UNSCEAR. Vienna, April 12-16, 1999.
Gerber G.B., Altman K.I. Radiation Biochemistry. Vol. II. Tissue and body fluids. New York, London: Acad. Press, 1970. 396 p.
Статьи, тезисы докладов
Бонд В.П. Основы радиобиологии, необходимые для понимания влияния ионизирующих излучений на кроветворение. //Руководство по радиационной гематологии. (Совм. изд. МАГАТЭ и ВОЗ). /Пер. с англ. М.: Медицина, 1974. С. 68-70.
Бурлакова Е.Б. Действие сверхмалых доз. //Вестник РАН. 1994. Т. 64. С. 425-431.
Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты: новые горизонты. //Биоантиоксидант. VI Междунар, конф.. Тез. докл. М.: РАН, 2002. С. 69-70.
Burlakova E.B.//Low doses of radiation: are they dangerous? Hungtington, New York: Nova Science Pubis., Inc., 2000. Ch. 11. P. 141-154.
Бурлакова Е.Б., Михайлов В.Ф., Мазурик В.К. Система окислительновосстановительного гомеостаза при радиационно-индуцируемой нестабильности генома. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 489-499.
Ванин А.Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований. //Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 7. С. 867-869.
Вилков Л.В. Физические методы исследования в химии. //ISSEP. Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 1. Физическая химия. М.: Наука-Флинта, 1999. С. 225-230.
Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и незапрограммированная гибель клетки. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 9 (58). С. 2-9.
Газиев А.И. Ферменты в пострадиационном метаболизме ДНК. //Современные проблемы радиобиологии. /Под общей ред. А. М. Кузина. Т. 4. Радиационная биохимия. /Под ред. Е. Ф. Романцева. М.: Атомиздат, 1975. С. 41-82.
Гераськин С.А. Концепция биологического действия малых доз ионизирующего излучения на клетки. //Радиационная биология. Радиоэкология. 1995. Т. 35, № 5. С. 571-508.
Грейб Г. Действие малых доз ионизирующего излучения. Эффект Петко. //Ядерная энциклопедия. М.: Благотв. фонд Ярошинской, 1996.
С. 387-394.
Зеленцов Б.П. Математические модели на основе процесса размножения и гибели объектов. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 6 (67). С. 92-97.
Коломийцева И. К. Немонотонность зависимости доза-эффект в области малых доз ионизирующей радиации. //Радиоэкология. 2003. Т. 43, № 2. С. 179-181.
Кудряшов Ю.Б. Роль липидных радиотоксинов в лучевом токсическом эффекте. //Радиотоксины, их природа и роль в биологическом действии радиации высокой энергии. М.: Атомиздат, 1966. С. 119-125.
Кудряшов Ю.Б. Основные принципы в радиобиологии. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 531-548.
Кудряшов Ю.Б.^ Гончаренко Е.Н. Лучевой стресс. //Москва — Чернобылю. Книга II, М.: Воениздат, 1998. С. 197-204.
Кудряшов Ю.Б., Пархоменко И.М. Молекулярно-клеточные механизмы биологического действия малых доз рентгеновского излучения на изолированные клетки млекопитающих. //Радиобиология. 1987. Т. 27, вып. 3. С. 297-302.
Кузин А.М. Радиотоксины. Их возможная природа и роль в развитии радиационного поражения. //Радиотоксины, их природа ироль в биологическом действии радиации высокой энергии. М.: Атомиздат, 1966. С. 5-17.
Лучник Н.В., Куликова В.Г. Влияние предварительного облучения мышей на их последующую радиорезистентность. //Доклады АН СССР. 1956. Т. ПО. С. 109-113.
Luchnic N.V., Sevankaev А. И Radiation-induced chromosomal aberrations in human lymphocytes. 1. Dependence on the dose of gamma-rays and anomaly of low doses. //Mutat. Res. 1976. V. 36. P. 363-378.
Мазурик В.К., Михайлов В. Ф. О некоторых молекулярных механизмах основных радиобиологических последствий действия ионизирующих излучений на организм млекопитающих. //Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39, № 1. С. 91-98.
Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. Радиационно-индуцируемая нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 3. С. 272-289.
Мазурик В. К., Мороз Б.Б. Проблемы радиобиологии и белок р53. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 548-572.
Милъничук В.К. Радиационная химия. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 4 (53). С. 24-29.
Михайлов В.Ф., Мазурик В.К., Бурлакова Е.Б. Сигнальная функция активных форм кислорода в регуляторных сетях ответа клеток на повреждающие воздействия: участие в реализации радиочувствительности и нестабильности генома. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43, № 1. С. 5-18.
Неймарк Ю.И. Простые математические модели и их роль в постижении мира. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т.З. Математика. Механика. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 141-144.
Pelemna LL, Afanasiev G.G. et al. //Low doses of radiation: are they dangerous? /Ed. E. B. Burlakova. Hungtington, New York: Nova Science Publishers, Inc., 2000. Ch. 11. P. 141-153.
Рождественский Л.М. Pro и contra пороговости/беспороговости мутагенного (канцерогенного) действия ионизирующего излучения низкого уровня. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 580-588.
Рубин А.Б. Кинетика биологических процессов. //Соросовский образовательный журнал. 1998. № 10 (35). С. 84-91.
Ряшко Л.Б. Модели динамики популяции: от порядка к хаосу. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 10 (71). С. 122127.
Савич А.В. Радиационно-химические превращения и радиочувствительность биологических макромолекул. //Лучевое поражение. /Под ред. Ю. Б. Кудряшова. М.: Изд-во Моск, ун-та, 1987. С 73-83.
Самуилов В.Д. Биохимия программированной клеточной смерти (апоптоза) у животных. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 10 (71). С. 18-25.
Саенко А.С.^ Семенеу Т.Н.. Семина О.В. Повышение радиорезистентности (адаптивный ответ) in vivo колониеобразующих единиц (КОЕс) после воздействия на мышей у-лучей 60 Со в малых дозах. //Радиобиология. 1991. Т. 31. С. 716-717.
Скулачев В.П. О биохимических механизмах эволюции и роли кислорода. //Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 11. С. 1570-1579.
Скулачев В.П. Альтернативные функции клеточного дыхания //Соросовский образовательный журнал. 1998. Т. 7, № 8 (33). С. 2-7.
Скулачев В.П. Активные формы кислорода и явления запрограммированной смерти: от органеллы до организма. //Биоантиоксидант. VI Международная конференция. Тез. докл. М.: Изд-во Ун-та Дружбы народов. 2002. С. 523-524.
Спирин А.С. Принципы структуры рибосом. //Соросовский образовательный журнал. 1998. № 11 (36). С. 65-70.
Спитковский Д.М. Концепция действия малых доз ионизирующих излучений на клетки и ее возможные последствия к трактовке медикобиологических последствий. //Радиационная биология. Радиоэкология. 1992. Т. 32, вып. 3. С. 382-400.
Спитковский Д.М. Новые биофизические и биохимические аспекты механизмов действия малых доз ионизирующей радиации. //Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39, № 1. С. 145-155.
Spitkovsky D.M. //Low doses of radiation: are they dangerous? /Ed. E. B. Burlakova. Hungtington, New York: Nova Science Publishers, Inc., 2000. Ch. 14. P. 212-230.
Спитковский Д.М., Кузьмина И.В. Теоретические и экспериментальные подходы к проблеме индуцируемых адаптирующими дозами ионизирующей радиации изменений функциональных возможностей клеток. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 599605.
Тарусов В.П. Особенности действия радиоактивных веществ на организм. //Биологическое действие излучений и клиника лучевой болезни. М.: 1954. С. 63-75.
Тарусов В.П. Первичные процессы при действии ионизирующих излучений. //Первичные процессы лучевого поражения. /Под ред. Б. Н. Тарусова. М.: Медгиз, 1957. С. 3-28.
Хансон К.П. Молекулярный механизм гибели лимфоидных клеток. //Радиобиология. 1979. Т. 19, вып. 15. С. 814-820.
Хансон К.П. Апоптоз: современное состояние проблемы. //Известия РАН, сер. биол. 1998. № 2. С. 134-141.
Цыб А., Иванов В. Канцерогенные риски малых доз облучения. //Ядерное общество. 2002. № 3. С. 13-15.
Чернавский Д.С., Паламарчук Е.К.^ Календо Г.С., Календо Ю.И. Математическая модель одного из способов модификации радиочувствительности клеток. //Радиобиология. 1975. Т. 15, вып. 5. С. 662-670.
Шарпатый В.А. Радиационная модификация сахарного фрагмента ДНК: образование разрывов, изменение конформации полимера, передача повреждения на основание. //Радиационная биология. Радиоэкология. 1992. Т. 32, вып. 2. С. 183-193.
Шевченко В.А. Эволюция представлений о генетической опасности ионизирующих излучений для человека. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 615-626.
Шестаков С.В., Карбышева Е.А.^ Еланская И.В. //Генетика. 1982. Т. 18, № 8. С. 1271-1281.
Шмакова Н.Л., Фадеева Т.А.^ Насонова Е.А., Красавин Е.А.^ Рзянина А.В. Цитогенетические эффекты малых доз облучения в клетках млекопитающих: анализ феномена гиперрадиочувствительности и инду- цировнной резистентности. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42, № 3. С. 245-250.
Эману эль Н.М. Роль свободных радикалов в радиобиологических процессах и некоторые новые возможности в разработке средств против лучевого поражения. //Первичные механизмы биологического действия ионизирующих излучений. М.: Изд-во АН СССР, 1963. С. 73-84.
Alper Т. Low oxygen enhancement ratios for radiosensitive bacterial strains and two types of primer lesion. //Nature. 1968. V. 217, № 5131. P. 862-863.
Alper T. Cell death and its modification: the role of primary lesion in membranes and DNA. //Biophysical aspects of radiation qualities. Vienna: JAEA, 1971. P. 171-194.
Burrell A.D^ Feldschreiber P., Dean C.J. DNA-membrane association and the repair of double-strand breaks in X-irradiated micrococcus radiodurans. //Biochimica et Biophysica Acta. 1971. V. 247, № 1. P. 38-53.
Calabrese E.J. Hormesis: changing view of the dose-response, a personal account of the history and current status. //Mutat. Res. 2002. V. 511. P. 181-189.
Calabrese Е.Д Baldwin L.A. Radiation hormesis: its historical foundation as a biological hypothesis. //BELLE Newsletter. 1999. V. a8. P. 2-37.
Ikushima T. Chromosomal responses to ionizing radiation reminiscent of an adaptive response in culture Chinese humster cells. //Mutat. Res. 1987. V. 180. P. 215-221.
Marnett L.J. Oxyradicals and DNA damage. //Carcinogenesis. 2000. V. 21, № 3. P. 361-370.
Oberbaum M.^ Kambar J. Hormesis: Dose-Dependent Reverse Effect of Low and Very Low Doses. //Ultra High Dilution. Physiology and Physics. /Ed. P. S. Endler, J. Shulte. Boston, Dordrecht, London: Kluwer Academic, 1994. 321 p.
Selye H. Syndrome produced by diverse nocuous agents. //Nature. 1936. V. 138, № 3479.
Дополнительная литература
Монографии, учебники, пособия, справочники
Акаев И.Г. Проблемы постлучевого восстановления. М.: Атомиздат, 1970. 281 с.
Алексахин Р.М.^ Васильев А.В.^ Дикарев В.Г. и др. Сельскохозяйственная радиоэкология. /Под ред. Р. М. Алексахина и Н. А. Корнеева. М.: Экология. 1992. 400 с.
Аспекты клинической дозиметрии. /Под ред. Р. В. Ставицкого. М.: Изд-во МНПИ, 2000. 388 с.
Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны. Структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами. Учебное пособие. Воронеж: Воронежский ун-т, 2000. 296 с.
Артюхов В.Г., Наквасина М.А.^ Резван С.Г., Башарино О.В., Батанов Г.А. Практикум по биофизике. Воронеж: Воронежский ун-т, 2001. 224 с.
Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Наука, 1975. 328 с.
Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. /Пер. с англ. М: Мир, 1978. 463 с.
Ахманов С.А., Никитин С.Б. Физическая оптика. М.: Изд-во Моск, ун-та. 1998. 656 с.
Балантер Б.И.^ Ханин М.А., Чернавский Д.С. Введение в математическое моделирование патологических процессов. М.: Медицина, 1980. 264 с.
Бесядовский Р.А.. Иванов К.В.^ Козюра А.К. Справочное руководство для радиобиологов. М.: Атомиздат, 1978. 125 с.
Биоантиокислители. Труды МОИП. Секция биофизики и радиобиологии. Т. LIL /Под ред. И. И. Иванова М.: Наука, 1975. 268 с.
Болдырев А.А., Карнозин. М.: Изд-во Моск, ун-та, 1998. 320 с.
Браун А.Д., Моженок Т.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. М.: Наука, 1987. 231 с.
Бударков В. А, Зенкин А.С., Киршин В.А. Краткий радиоэкологический словарь. Саранск: 1998. 256 с.
Бурлакова Е.Б., Алесенко А. В., Молочкина Е.М., Пальмина Н.Л., Храпова Н.Г. Биоантиоксиданты в лучевом поражении и злокачественном росте. М.: Наука, 1975. 214 с.
Василенко О.И. Радиоэкология. М.: УНЦ ДО, 2003. 350 с.; Курс лекций. М.: Изд-во Моск, ун-та, 1979. 241 с.
Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. Стресс у растений. М.: Изд-во Моск, ун-та, 1993. 145 с.
Вилков Л.В., Пентин Ю.А. Физические методы исследования в химии. М.: Высшая школа, 1989.
Владимиров Ю.А.^ Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 252 с.
Владимиров В. Г., Красильников И.И.^ Арапов О.В. Радиопротекторы: структура и функции. Киев: Наукова думка, 1989. 220 с.
Беннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. /Пер. с англ. М.: Мир. 1997. 624 с.
Гурвич А.Г. Митогенетическое излучение. М.: Гослитиздат, 1932. 270 с.
Гурвич А.Г. Теория биологического поля. М.: Сов. наука, 1944. 155 с.
Дубур Г.Я., Белена А.Х. Биомембраны: структура, функции, медицинские аспекты. Рига: 1981. 257 с.
Жербин Е.А.^ Комар В.Е., Хансон К.П.^ Чухловин А.А. Радиация. Молекулы и клетки. М.: Знание, 1984. 160 с.
Иванов В.И.^ Лысцов В.Н.^ Губин А.Т. Справочное руководство по микродозиметрии. М.: Энергоатомиздат, 1986. 184 с.
Иванов В. И., Машкович В. И., Центнер Э.М. Международная система единиц (СИ) в атомной науке и технике. М.: Атомиздат, 1981. 55 с.
Иванов В. К., Петровский А.М. Пошаговые и многошаговые процессы управления в задачах оптимизации лучевой терапии опухолей. Математические модели в иммунологии и медицине. М.: Мир, 1986. 310 с.
Ингрем Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии. /Пер. с англ. М.: Мир, 1972. 296 с.
Каган В.Е., Орлов О.Н.^ Прилепко Л.И. Проблемы анализа эндогенных продуктов ПОЛ. //Итоги науки и техники. Биофизика. Т. 18. М.: ВИНИТИ, 1986. 135 с.
Казначеев В. И., Михайлова Л.И. Сверхслабые свечения в межклеточных взаимодействиях. Новосибирск: Наука, 1981. 144 с.
Клеппер Л. Я. Формирование дозовых полей радиоактивными источниками излучения. М.: Энергоатомиздат, 1993. 272 с.
Корогодин В.И. Каскадный мутагенез. //Сообщение ОИЯИ. Дубна: 1992. Препринт 19-22-81. 15 с.
Кудряшов Ю.Б. Радиобиология. //Бурлакова Е.В., Владимиров Ю.А.^ Колье О.Р. и др. Малый практикум по биофизике. М.: Высшая школа, 1964. С. 279-342.
Кузин А.М., Копылов В.А. Радиотоксины. М.: Наука, 1983. 76 с.
Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука,1981. 278 с.
Милинчук В. К., Клиншпонт Э.Р.^ Тупиков В.И. Основы радиационной стойкости органических материалов. М.: Энергоатомиздат, 1994. 256 с.
Мороз Б. Б., Кендыш И.И. Радиобиологический эффект и эндокринные факторы. М.: Атомиздат, 1975. 232 с.
Насонов Д.Н., Александров В.Я. Реакция живого вещества на внешние воздействия. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1940. 321 с.
Романовский Ю.М.^ Степанова Н.В.^ Чернавский Д.С. Математическая биофизика. М.: Наука, 1984. 304 с.
Розенберг Г.С. Модели в фитоценологии. М.: Наука, 1984. 264 с.
Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М.: Медгиз, 1960. 123 с.
Семенов И.И. Цепные реакции. Химическая кинетика. М.: Госхимте- хиздат, 1966.
Скулачев В.И. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989. 564 с.
Смирнова О.А. Математическое моделирование динамики основных систем организма облученных млекопитающих. //Автореф. дисс. д-ра физ.-мат.наук. М.: 1992. 48 с.
Соболев А.С. Биохимия циклических нуклеотидов. М.: Энергоатомиздат, 1987. 111 с.
Суворов И.И. Шашков В.С. Химия и фармакология средств профилактики радиационных поражений. М.: Атомиздат, 1975. 223 с.
Тарусов Б.И. Сверхслабое свечение живых организмов. М.: Знание, 1972. 275 с.
Тарусов Б.И., Иванов И.И.^ Петрусевич Ю.М. Сверхслабое свечение биологических систем. М.: Изд-во Моск, ун-та, 1967. 71 с.
Томилин Н.В. Генетическая стабильность клетки. Л.: Наука, 1983. 387 с.
Хансон К. ГЦ Комар В.Е. Молекулярные механизмы радиационной гибели клеток. М.: Энергоатомиздат, 1985. 380 с.
Шевченко В.А.^ Абрамов В.И.^ Печкуренков В.Л. Генетические исследования на Восточноуральском радиоактивном следе. //Экологические последствия радиоактивного загрязнения на Южном Урале. М.: Наука, 1993. С. 258-302.
Шевченко В.А.^ Померанцева М.Д. Генетические последствия действия ионизирующих излучений. М.: Наука, 1985. 279 с.
Шеннон С. Питание в атомном веке. Как уберечь себя от малых доз радиации. Минск: 1991. 304 с.
Эмануэль Н.М., Кнорре Д.Г. Курс химической кинетики. М.: Высшая школа, 1984. 463 с.
Luckey T.D. Hormesis with ionizing radiation. Boca Raton: CRC Press, 1980. 198 p.
Pospisil ХЦ Vacha Y. Individual radiosensitivity mechanisms and their manifestations. Praha: Academia. 210 p.
Статьи, тезисы докладов
Агол В.И. Генетически запрограммированная смерть клетки. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 2. Общая биология. М.: Наука-Ф линта, 1999. С. 185-188.
Алесенко А.В. Роль липидов и продуктов перекисного окисления в биосинтезе и функциональной активности ДНК. //Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М.: Наука, 1981. С. 3-16.
Алесенко А.В. Роль липидов в передаче информационных сигналов клеточной пролиферации и экспрессии онкогенов. //Биоантиоксиданты: теоретические и прикладные аспекты. /Под ред. У. К. Ибрагимова и Е. Б. Бурлаковой. Ташкент: ФАН, 1995. С. 83-112.
Альфредович А. А., Готлиб В.Я., Конрадов А. А., Конопля Е.Ф., Пелевина И. И. Действие малых доз гамма-излучения на клетки млекопитающих. //Изв. Акад, наук СССР, сер. биол. 1992. № 1. С. 127-130.
Andreev S,G, Khvosdunov J. K.^ Spitkovsky D.M, et al. //Microdosimetry. An Interdisciplinary Approach. /Eds. D. T. Goodhead, P. O’Neill, H. G. Vinzel. Cambridge: Roy. Soc. Chemistry, 1997. P. 133-136.
Анигценко B.C. Динамические системы. //Соросовский образовательный журнал. 1997. № 11 (24). С. 77-84.
Антонов В.Ф. Биофизика мембран. //Соросовский образовательный журнал. 1996. № 6 (7). С. 4-12.
Антонов В.Ф. Липидные поры: стабильность и проницаемость мембран. //Соросовский образовательный журнал. 1998. № 10 (35). С. 1017.
Арчаков А. И., Карузина И.И. Микросомальное окисление. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 8. Молекулярные основы биологических процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 261-268.
Безлепкин В.Г., Газиев А.И. Индуцированная нестабильность генома половых клеток по мини- и микросателлитным последовательностям. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 475-488.
Бердоносов С. С. Радиоактивные индикаторы в химических исследованиях. //Соросовский образовательный журнал. 1999. № 4 (41). С. 51-57.
Бердоносов С.С.^ Сапожников Ю.А. Ионизирующее излучение и окружающая среда. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 2 (63). С. 40-46.
Бирштейн Т.М., Хохлов А.Р. Конформация молекул. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 6. Общая химия. М.: МАГИСТР- ПРЕСС, 2000. С. 117-120.
Благой Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами). //Соросовский образовательный журнал. 1998. № 10 (35). С. 18-24.
Блюменфельд Л.А.^ Тихонов А.Н. Электронный парамагнитный резонанс. //Соросовский образовательный журнал. 1997. № 9 (22). С. 91-99.
Богданов А.А. Теломеры и теломераза. //Соросовский образовательный журнал. 1998. № 12 (37). С. 12-18.
Богданов А. А. Биосинтез белка на рибосоме — заключительный этап трансляции. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 8. Молекулярные основы биологических процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 94-103.
Болдырев А. А. Окислительный стресс и мозг. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 4 (65). С. 21-28.
Боднарчук Н.А. Гипотеза о механизме индукции адаптивного ответа при облучении клеток млекопитающих в малых дозах. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42, № 1. С. 36-43.
Брюне Б.^ Сандау К.. фон Кнетон А. Апоптическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути. //Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 7. С. 966-974.
Бумагин Н.А. Радикалы и их реакции. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 6. Общая химия. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 24-29.
Бурлакова Е.Б. Особенности действия сверхмалых доз биологически активных веществ и физических факторов низкой интенсивности. //Росс. хим. журнал. 1999. Т. 43, № 5. С. 3-11.
Burlakova Е.В., Goloschapov et al. New aspects of regularities in the action of low doses of low-level irradiation //Low doses of radiation: are they dangerous? /Ed. E. B. Burlakova. Hungtington, New York: Nova Science Publishers, Inc., 2000. Ch. I. P. 1-14.
Бурлакова Е.Б., Дзантиев Б.Г., Сергеев Г.Б., Эммануэль Н.М. Радиолитическое расщепление жиров. //Известия вузов. Химия и хим. технология. 1959. № 2. С. 533-540.
Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов и природа антиоксидантов. //Успехи химии. 1985. Т. 54, вып. 9. С. 1540-1558.
Бурлакова Е.Б., Эмануэль Н.М. //Физико-химические основы авторегуляции в клетках. М.: 1965. С. 44.
Вартанян Л.С., Гуревич С.Н., Козаченко А.И.^ Наглер Л.Г., Лозовская Е.Л., Бурлакова Е.Б. Изменения скорости образования супероксидных радикалов и активности супероксиддисмутазы и глютатион- пероксидазы в субклеточных органеллах печени мышей при низкоинтенсивном облучении в малых дозах. //Биохимия. 2000. Т. 65, вып. 4. С. 522-527.
Варфоломеев С.Д. Простагландины — новый тип биологических регуляторов. //Соросовский образовательный журнал. 1996. № 1 (2). С. 1723
Васильев Ю.М. I. Сигнальные молекулы, вызывающие размножение
и гибель клеток. //Соросовский образовательный журнал. 1997. № 4 (17). С. 17-22.
Васильев Ю.М. II. Клетки строят ткань. //Соросовский образовательный журнал. 1997. № 5 (18). С. 20-25.
Васьковский В.Е. Липиды. //Соросовский образовательный журнал. 1997. № 2 (15). С. 32-37.
Веселовский В.А. Сверхслабая биолюминесценция проростков злаковых. //Тр. МОИП. Т. 21. Биолюминесценция. М.: Наука, 1965.
Виноградов А.Д. Синтез АТФ в митохрондриях. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 8. Молекулярные основы биологических процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 236-245.
Виноградов А.Д. Преобразование энергии в митохрондриях. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 8. Молекулярные основы биологических процессов. М.: МАГИСТР- ПРЕСС, 2000. С. 246-255.
Владимиров Ю.А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции. //Соросовский образовательный журнал. 1999. Т. 5, № 6 (43). С. 25-32.
Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 8. Молекулярные основы биологических процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 271-279.
Владимиров Ю.А. Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 1 (62). С. 16-23.
Владимиров Ю.А^ Литвин Ф.Ф. Исследование сверхслабых свечений в биологических системах. //Биофизика. 1959. Т. 4, № 5. С. 601-605.
Власов П.А., Квачева Ю.Е. и др. APUD- и RAA-системы регуляции при остром лучевом поражении. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 1. С. 16-19.
Вовна В.И. Фотоэлектронная спектроскопия молекул. //Соросовский образовательный журнал. 1999. № 1 (38). С. 86-91.
Voebodskaya^ N. Г, Vanin АД. Gamma irradiation potenciation L-arginin dependent NO formation in mice. //Biochem. biophys. res. commun. 1992. V. 186, № 3. P. 1423-1428.
Воронов В.К. Ядерный магнитный резонанс. //Соросовский образовательный журнал. 1996. № 10 (11). С. 70-75.
Гераськин С. А., Срапульцев Б.И. Стохастическая модель индуцированной нестабильности генома. //Радиационная биология. Радиоэкология. 1995. Т. 35, вып. 4. С. 451-462.
Гильяно Н.Я., Бондарев Г.Н.. Бикинеева Е.Г.. Красоцкая Г. И.. Нос- кин Л.А. Исследование радиопротекторного эффекта ингибитора NO- синтазы L-NAME в культуре клеток китайского хомячка. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 6. С. 653-658.
Гольдштейн Н.И. Аэроионы: возможная роль активных форм кислорода в механизмах биологического действия. //Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине. Рига: 1988. С. 80-108.
Гольдштейн Н.И. Биофизические аспекты физиологического действия экзогенного О2 на животных. //Автореф. дисс. докт. биол. наук. М.: 2000. 57 с.
Гончаренко Е.Н., Антонова С.В., Ахалая М.Я., Кудряшов Ю.Б. Влияние малых доз ионизирующей радиации на уровень катехоламинов и кортикостероидов в надпочечниках мышей. //Радиационная биология.
Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 2. С. 160-161.
Гончаренко Е.Н., Балтбарздыс З.Я. Граевская Е.Э., Ковалева Т.А.. Кудряшов Ю.Б. О химической природе липидного радиотоксина. //Радиобиология. 1968. Т. 8, вып. 4. 497-506.
Делоне Н.Б. Нелинейная оптика. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 7. Физика волновых процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 181-187.
Дмитриев Л.Ф. Малоновый диальдегид может контролировать клеточное деление на стадии репликации ДНК (гипотеза). //Ж. эвол. биохимии и физиологии. 1992. Т. 28, № 6. С. 720-730.
Евгеньева И.И. Планарная хроматография и анализ органических веществ. //Соросовский образовательный журнал. 1999. № 11 (48). С. 5055.
Евстигнеева Р.П. Химия биологически актитвных гетероциклов. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 6. Общая химия. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 50-55.
Еловников С. С. Оже-электронная спектроскопия. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 2 (63). С. 82-88.
Ермолаева Н.В. Ферментативный распад дезоксирибонуклеопротеидов. //Биохимия. 1961. Т. 26, вып. 5. С. 897-908.
Ермолаева Н.В.^ Водолазская Н.А. Физико-химические свойства хроматина и его фрагментов, образующихся в тимусе крыс в процессе постлучевого автолиза и под действием кислой ДНК-азы и протеазы на препараты ДНК. //Радиобиология. 1978. Т. 18, вып. 4. С. 492-497.
Жестяников В.Д. Ингибирование пострадиационного восстановления как один из путей усиление действия ионизирующих излучений. //Мед. радиология. 1975. Т. 20, № 1, С. 32-38.
Животовский Б.Д., Звонарева Н.Б., Воскобойников Г.В., Хансон К.П. Молекулярные механизмы интерфазной гибели лимфоидных клеток. Сообщ. 2. Сравнительная характеристика продуктов пострадиационной деградации и нуклеазного переваривания хроматина тимуса крыс. //Радиобиология. 1980. Т. 20, вып. 4. С. 502-507.
Животовский Б.Д., Звонарева Н.Б., Степанов Р.П., Хансон К.П. Молекулярные механизмы интерфазной гибели лимфоидных клеток. Сообщ. 3. Исследование плавучей плотности и электронно-микроскопическая характеристика продуктов пострадиационной деградации хроматина тимуса крыс. //Радиобиология. 1980. Т. 20, вып. 5. С. 643-647.
Zasukhina G.D. )До^ doses of radiation: are they dangerous? /Ed. E. B. Burlakova. Hungtington, New York: Nova Science Publishers, Inc., 2000. Ch. 6. P. 77-86.
Зеленин K.H. Газовая хроматография в медицине. //Соросовский образовательный журнал. 1996. № 10 (11). С. 20-25.
Зеленин К.П. Оксид азота (II): новые возможности давно известной молекулы. //Соросовский образовательный журнал. 1997. № 10 (23). С. 105-110.
Иванов В.К., Цыб А.Ф. Последствия Чернобыльской катострофы. //Здоровье человека. /Под ред. Е. Б. Бурлаковой. М.: Центр экологической политики Е. Б. Бурлаковой — Центр экологической политики России, 1996. С. 10-23.
Календо Г. С. Различные уровни радиозащиты в популяции опухолевых клеток. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 519-427.
Карцева А. А. Жидкостная хроматография в медицине. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 11 (60). С. 35-40.
Киселев М.Ф. Российско-американская программа изучения влияния радиации на здоровье населения на Южном Урале. //Мед. радиол, и рад. безопасность. 2001. № 6. С. 5-8.
Кнорре Д.Г. Что изучает молекулярная биология? //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 8. Молекулярные основы биологических процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 7-12.
Kolomiytseva I.K., Slozhenikina L.V. et al. Nonmontonous changes in metabolic parameters of tissues and cells under action of ionizing radiation in animals. //J. Biol. Physics. 1999. V. 25. P. 325-338.
Корогодин В.И. Радиотаксоны и надежность генома. //Радиобиология. 1982. Т. 22, вып. 2. С. 147-154.
Корогодин В.И. Кариотаксоны, надежность генома и прогрессивная биологическая эволюция. //Природа. 1985. № 2. С. 3-14.
Корочкин Л.И. Генетический контроль развития клеток. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 2. Общая биология М.: Паука- Флинта, 1999. С. 93-98.
Корыстное Ю.Н. Прямое и косвенное действие ионизирующего излучение в клетке. //Радиобиология. 1986. Т. 26, вып. 1. С. 137.
Котнеров А.Н., Филиппович И.Н. Радиоадаптивный ответ in vitro нестимулированных лимфоцитов крыс по металлотионеиновому тесту. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42, № 2. С. 130-135.
Красавин Е.А. Радиобиологические исследования в ОИЯИ. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 528-530.
Кудряшов Ю.Б. О природе и характере накопления гемолитического фактора, появляющегося в печени крыс, облученных рентгеновскими лучами. //Доклады АН СССР. 1956. Т. 109, № 3. С. 515-521.
Кудряшов Ю.Б. Лучевое поражение критических систем. //Лучевое поражение. /Под ред. Ю. Б. Кудряшова. М.: Изд-во Моск, ун-та, 1987. С. 5-72.
Кудряшов Ю.Б. Химическая защита от лучевого поражения. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 6 (55). С. 21-26.
Кудряшов Ю.Б., Балтпбарздыс З.Я., Ле Дак Лъеу. О возможности непрямого эффекта ионизирующей радиации в липидных растворах. //Доклады АН СССР. 1964. Т. 156. № 1. С. 191-193.
Кудряшов Ю.Б., Гасанов Г.И., Гончаренко Е.Н., Дороснсинский В.Б., Дряновский П.Г., Какушкина М.Л., Коноплянников А. Г, Лабзина Н.Г., Сюэ Юй-хуа. Естественный радиомиметик и его действие на различные биологические объекты и системы. //Журнал общей биологии. 1964. Т. XXV, № 1. С. 3-21.
Кудряшов Ю.Б, Гончаренко Е.Н. Лучевая болезнь. //Ядерная энциклопедия. М.: Благотв. фонд Ярошинской, 1996. С. 322-326.
Кудряшов Ю.Б, Гончаренко Е.Н. Современные проблемы противолучевой химической защиты организмов. //Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39, № 2-3. С. 197-211.
Кудряшов Ю.Б., Гончаренко Е.Н., Антонова С.В., Ахалая М.Я., Бай- снсуманов А. А. Исследование действия сублетальных доз ионизирующих излучений на эндогенный фон радиорезистентности. //Радиационная биология. Радиоэкология. 1997. Т. 37, вып. 3. С. 372-376.
Кудряшова Н.Ю. Влияние ионизирующей радиации на ДНК-мембран- ные комплексы. //Лучевое поражение. М.: Изд-во Моск, ун-та, 1987.
С. 93-97.
Кузин А.М. Молекулярная радиобиология клеточного ядра. М.: Атом- издат, 1973. 208 с.
Кузнецов В.В. Проточный инжекционный анализ. //Соросовский образовательный журнал. 1999. № 11 (48). С. 56-60.
Кузьмин Р.Н. Рентгеновская оптика. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 7. Физика волновых процессов. М.: МАГИСТР- ПРЕСС, 2000. С. 23-30.
Кулинский В.И^ Колесниченко Л.С. //Успехи совр. биологии. 1993. Т. 113, вып. 1. С. 107-122.
Кулинский В. И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация. //Соросовский образовательный журнал. 1999. Т. 5, № 1 (38). С. 2-7.
Лабзина Н.1\ Кудряшов Ю.Б., Лучник Н.В. Цитогенетическое действие липидных радиотоксинов. //Радиотоксины, их природа и роль в биологическом действии радиации высокой энергии. М.: Атомиздат, 1966. С. 176-181.
Легеза В.И.^ Владимиров В.Г. Новая классификация профилактических противолучевых средств. //Радиационная биология. Радиоэкология. 1998. Т. 38, вып. 3. С. 416-425.
Лось Л.А. Восприятие сигналов биологическими мембранами: сенсорные белки и экспрессия генов. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 9 (70) С. 14-22.
Лучник Н.В.^ Морозов К.Н. и др. Влияние стадии клеточного цикла и времени фиксации на частоту хромосомных аберраций, вызванных облучением. //Доклады АН СССР. 1973. Т. 212, № 5. С. 1220-1223.
Мазалов М.Л. Рентгеновские спектры и электронная структура молекул. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 7. Физика волновых процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 73-78.
Мазалов М.Н. Рентгеноэлектронная спектроскопия и ее применение в химии. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 4 (53). С. 37-44.
Мазо Г.Н. Методы атомного спектрального анализа. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 7 (56) С. 31-34.
Мазурик В.К., Михайлов В.Ф., Ушенкова Л.Н. Динамический компонент поддержания стабильности генома в клетках костного мозга у мышей после хронического облучения низкой интенсивности длительностью один год. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42, № 6. С. 669-674.
Малышев И.Ю.^ Манухина Е.Б. Стресс, адаптация и оксид азота. //Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 7. С. 992-1006.
Меньшикова Н.Б.^ Зенков Н.К.^ Реутов В.П. Оксид азота и NO- синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях. //Биохимия. 2000. Т. 63, вып. 4. С. 485-503.
Мерзляк М. Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки. //Итоги науки 1989. Т. 113, вып. 1. С. 107-122.
Мерзляк М.Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений. //Соросовский образовательный журнал. 1997. Т. 5, № 9 (46). С. 20-26.
Микоян В.Д., Воеводская Н.В., Кудрина Л.Н., Маленкова И.В.^ Ванин А.Ф. Экзогенное железо и д-облучение индуцируют синтез NO-
синтетазы в печени мышей. //Биохимия. 1994. Т. 59, вып. 5. С. 732738.
Москалев А. А., Зайнуллин В.Г. Изучение роли апоптотической гибели клетки в радиоиндуцированном старении. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 6. С. 650-652.
Моссэ И.Б. Современные проблемы биодозиметрии. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42, № 6. С. 654-660.
Недоспасов А. А. Биогенный NO в конкурентных отношениях. //Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 7. С. 881-1006.
Осадъко И. С. Молекулярная спектроскопия. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 7. Физика волновых процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 93-98.
Осипов А.И. Термодинамика вчера, сегодня, завтра. Часть I. Равновесная термодинамика. //Соросовский образовательный журнал. 1999. № 4 (41). С. 79-85.
Осипов А.И. Термодинамика вчера, сегодня, завтра. Часть II. Неравновесная термодинамика. //Соросовский образовательный журнал. 1999. № 5 (42). С. 91-97.
Пархоменко И.М.^ Перишвили Г.В.^ Туровецкий В.Б., Кудряшов Ю.Б.^ Рубин А.Б.^ Бровко Л.Ю. Влияние малых доз ионизирующей радиации на внутриклеточный pH, содержание АТФ и синтетическую активность активность культивируемых фибробластов китайского хомячка. //Радиобиология. 1993. Т. 33, вып. 1. С. 104-109.
Пелевина И.И.^ Алексенко А.В. и др. Уровень спонтанных и индуцированных облучением цитогенетических повреждений в лимфоцитах крови детей в зависимости от возраста и условий жизни. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 489-499.
Пескин А.П. О регуляторной роли активных форм кислорода. //Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 9. С. 1307-1308.
Платцман Р.Л. Энергетический спектр возбуждения при действии ионизирующей радиации. //Современные проблемы радиационных исследований (материалы III Международного конгресса по радиационным исследованиям. Италия, 1966 г.). М.: 1972.
Померанцева М.Д.^ Рамайя Л.Х. Предварительное облучение как фактор, изменяющий эффективность лучевого воздействия на организм. //М.: Изд-во АН СССР, 1962. С. 91-106.
Поливода Б.И.^ Конев В.В. Корреляция мембранных и генетических эффектов перекисного окисления липидов. //Радиобиология. 1986. Т. 26, вып. 6. С. 803-805.
Пурмаль А.П. Цепные реакции. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 1. Физическая химия. М.: Наука-Флинта, 1999. С. 116— 122.
Пшенникова М.Г. Стресс и адаптация. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 2. Общая биология. М.: Наука-Флинта, 1999. С. 244251.
Радиация и риск. Бюлл. Национ. радиац.-эпидемиол. регистра, а) 1995. вып. 5, 6; б) 1998.
Раева Н.Ф. Роль малондиальдегида и сходных с ним соединений в образовании сшивок при у-облучении ДНК. //Радиобиология. 1980. Т. 20, вып. 5. С. 664-670.
Реутов В.П., Сорокина Е.Г. NO-синтазная и нитроредуктазная компоненты цикла оксида азота. //Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 7.
С. 1029-1038.
Рождественский Л.М. Концепция биологического действия ионизирующей радиации низкого уровня (анализ проблемы в аспектах по- роговости эффектов и радиочувствительности—радиоактивности биоструктур различного уровня организации). //Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39, вып. 1. С. 127-149.
Росцина Т.М. Хроматография в физической химии. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 8 (57) С. 39-46.
Рисина Т.Н.. Либинзон Р.Е. Связанные и солерастворимые дезоксиполинуклеотиды в тканях кролика поссле облучения. //Биохимия. 1960. Т. 25, вып. 5. С. 825-830.
Саенко А.С., Замулаева И.А. Результаты и перспективы использования методов определения частоты мутантных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточного рецептора для оценки генотоксического действия ионизирующих излучений в отдаленные сроки после воздействия. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 5. С. 549-553.
Самуилов В.Д. Программированная клеточная смерть у растений. //Соросовский образовательный журнал. 2001. № 10 (71). Т. 7. С. 1217.
Свободнорадикальные процессы в биологических системах. //Труды МОИП. Секция биофизики и радиобиологии /Под ред. А. И. Журавлева. М.: Наука, 1966. Т. XVI. 295 с.
Севанъкаев А.В. Некоторые итоги цитогенетических исследований в связи с оценкой последствий Чернобыльской аварии. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 5. С. 590-597.
Сидоров Л.Н. Масс-спектрометрия и определение массы больших молекул. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 11 (60). С. 41-45.
Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло. //Соросовский образовательный журнал. 1996. Т. 2, № 3 (4). С. 4-10.
Скулачев В.П. О биохимических механизмах эволюции и роли кислорода. //Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 11. С. 1570-1579.
Скулачев В.П. Эволюция, митохондрии и кислород. //Соросовский образовательный журнал. 1998. № 9 (33). С. 1-7.
Скулачев В.П. Законы биоэнергетики. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 8. Молекулярные основы биологических процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 223-227.
Скулачев В.П. Явления запрогрммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 6 (67). С. 4-10.
Славатинский С.А. Фундаментальные частицы. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 2 (63). С. 62-68.
Сойфер В.П. Репарация генетических повреждений. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 8. Молекулярные основы биологических процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 32-42.
Солдатов А.В. От спектроскопии HEXAFS к спектроскопии XANES: новые возможности исследования материи. //Соросовский образовательный журнал. 1998. № 12 (37). С. 101-104.
Спитковский Д.АД Ермаков А.В.^ Горин Ф.И. Особенности внепланового синтеза ДНК и изменений структурных параметров ядер лимфоцитов человека после действия рентгеновского излучения в малых
дозах и в сочетании с УФ-облучением. //Радиационная биология. Радиоэкология. 1994. Т. 34, № 1 С. 23-31.
Сторожок Н.М. Биоантиоксиданты и фосфолипиды. Механизм сочетанного действия. //Биоантиоксидант. VI Международная конференция. Тез. докл. М.: Изд-во ун-та Дружбы народов, 2002. С. 555-556.
Стручков В.А.^ Стражевская Н.Б. ДНК-связанные липиды: состав и возможные функции. //Биохимия. 1993. Т. 58. С. 1154-1176.
Тарханов И.Р. //Известия СПб биол. лаборатории АН 1896. Т. 1. № 3. С. 47.
Тимофеев-Ресовский Н.В. //Первичные механизмы биологического действия ионизирующих излучений. М.: Изд-во АН СССР, 1963. С. 162.
Тимофеев-Ресовский Н.В. Биофизическая интерпретация явления радиостимуляции растений. //Биофизика. 1956. Т. 1, вып. 7. С. 616-627.
Тихонов А.Н. Молекулярные преобразователи энергии в живой клетке. //Соросовский образовательный журнал. 1997. № 7 (20). С. 10-17.
Тихонов А.Н. Электронный парамагнитный резонанс в биологии. //Соросовский образовательный журнал. 1997. № 11 (24). С. 8-15.
Тихонов А.Н. Спиновые метки. //Соросовский образовательный журнал. 1998. № 1 (26). С. 8-15.
Ткачук Б.А. Молекулярные механизмы нейроэндокринной регуляции. //Соросовский образовательный журнал. 1998. № 6 (31). С. 16-20.
Ткачук В.А. Мембранные рецепторы и внутриклеточный кальций. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 1 (62). С. 10-15.
Тонков М.В. Фурье-спектросопия — максимум информации за минимум времени. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т 7, № 1 (62). С. 83-88.
Тюрин В.А. и др. Репарация липидного бислоя мембран при окислительном стрессе: реацелирование фосфатидилэтаноламина в мембранах синаптосом фоторецепторов и эритроцитов. //Ж. эволюц. биохимии и физиологии. 1996. Т. 32, № 3. С. 248-255.
У гай Я. А. Валентность, химическая связь и степень окисления — важнейшие понятия химии. //Соросовский образовательный журнал. 1997. № 2 (15). С. 53-57.
Уманский С.Р. Генетическая программа клеточной гибели: гипотеза и некоторые приложения. //Успехи совр. биол. 1982. Т. 93, вып. 1. С. 139— 148.
Уманский С.Р. Критерии клеточной гибели. Радиобиология. //Инф. Бюлл. Научного совета по радиобиологии АН СССР. 1985. № 31. С. 7879.
Филиппович И.В.^ Романцев Е.Ф. Влияние ионизирующей радиации, сульфгидрильных соединений и гипоксии на фософрилирование тимидина в зобной железе и селезеке крыс. //Радиобиология. 1968. Т. 8, вып. 6. С. 800-805.
Филиппович И.В.^ Солдатенков В. А., Сорокина Н.И.^ Романцев Е.Ф. Исследование молекулярных механизмов радиационной гибели лимфоидных клеток. Сообщ. 3. Репарация суперспиральной ДНК субпопуляций тимоцитов, различающихся по радиочувствительности. //Радиобиология. 1982. Т. 22, вып. 2. С. 165-170.
Хансон К.П. Молекулярные механизмы интерфазной гибели лимфоидных клеток. //Радиобиология. 1979. Т. 19, вып. 6. С. 814-820.
Черепанов В.И. Резонансные методы исследования вещества. //Энциклопедия. Современное естествознание. Т. 7. Физика волновых
процессов. М.: МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. С. 115-120.
Чернавский Д.С., Паламарчук Е.К., Календо Г.С., Календо Ю.И. Математическая модель одного из способов модификации радиочувствительности клеток. //Радиобиология. 1975. Т. 15, вып. 5. С. 662-670.
Чизмаджев Ю.А. Мембранная биология: от липидных бислоев до молекулярных машин. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 8 (57). С. 12-17.
Чизмаджев Ю.А. Как сливаются биологические мембраны. //Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 5 (66). С. 4-9.
Чизмаджев Ю.А. Мембранная биология: от липидных бислоев до молекулярных машин. //Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6, № 8 (57) С. 12-17.
Шарпатий В. А. Проблемы радиационной химии белковых молекул. //Химия высоких энергий. 1995. Т. 29, № 2. С. 85-100.
Шишкина Л. ЕД Кушнирева Е.В. и др. Роль антиоксидантного статуса в формировании последствий биологического действия излучения в малой дозе. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 2. С. 162-167.
Шмакова ВЕЛ., Абу Зейд О., Фадеева Т.А.. Красавин Е.А.^ Куца- ло П.В. Дозовая зависимость цитогенетических повреждений и адаптивный ответ клеток млекопитающих при действии ионизирующих излучений в малых дозах. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 4. С. 405-409.
Эберт М. Образование перекиси водорода при различных условиях облучения. //Вопросы радиобиологии. М.: И. Л., 1956. С. 56-68.
Эйдус Л.Х. Роль межклеточного взаимодействия в инициации радиационной гибели тимоцитов и проблема апоптоза. //Известия РАН, сер. биол. 1998. № 2. С. 204-212.
Эйдус Л.Х. О механизме индукции репарации повреждений ДНК при действии ионизирующего излучения на клетки. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 6. С. 674-677.
Эйдус Л.Х. Интерфазная гибель облученных тимоцитов — результат эффекта свидетеля? //Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42, № 3. С. 284-286.
Эйдус Л.Х., Эйдус В. Л. Проблемы механизма радиационного и химического гормезиса. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 627-630.
Eidus L.Kh., Korystov Yu.N., Dobrovinskaya O.R., Shaposhnikova V.V. The mechanism of radiation-induced interphase death of lymphoid cells: a new hypothesis. //Radiat. Res. 1990. V. 123. P. 17-21.
Cramp W.A.. Watkins D.K., Collins J. Synthesis of DNA by membrane- DNA complexes from E.coli B/r and BS-I after exposure to fast electrons and neutrons. //Int. J. Rad. Biol. 1972. V. 22, № 4. P. 379-387.
Desai J., Sawant P., Tappel A., Miller G.G. Lipid peroxidation as a cause of damage in irradiated biological membranes. //Biochem. Biophys. Acta. 1964. Vol. 2, № 86. P. 277-289.
Frankel E.N. Lipid oxidation. //Progr. Lipid Res. 1980. V. 19, № 1-2. P. 122.
Frankel E.N. Secondary product of lipid peroxidation. //Chern. Phys, of Lipids. 1987. V. 44, № 2-4. P. 73-83.
Gille J. J., Joenji H. Biological signification of oxygen toxicity: an introduction. //Membrane Lipid oxidation V. 3. /Ed. C. Vigo-Perfley. Boca Raton, Ann Arbor, Boston: 1991. P. 1-32.
Gutteridge J.M.C., Hallivell A. The measurement and mechanism of lipid peroxidation in biological systems. //TIBS. 1990. Vol. 15. P. 129-135.
Kagan V.E.. Fabisiak J.P.^ Shvedova A.A. et al. Oxidative signaling pathway for externalization of plasma membrane phosphatidilserine during apoptosis. //FEBS Letters. 2000. V. 477. P. 1-7.
Kellerer A.M.^ Rossi E.N. //Proc. Second Symposium in microdosimetry /Ed. H. G. Ebert Brussels: Commission of the Eur. Communities, 1970.
Lange C.S. Size and structure of a mammalian DNA determined by viscoelastometry. //Biophysical J. 1975. V. 15, № 2, Pt. 2. P. 205.
Lehnert B.E., Goodvin E.H. Extracellular factor(s) following exposure to alpha particle can cause sister chromatid exchanges in normal human cells. //Cancer Res. 1997. V. 57. P. 2164-2171.
Leonarduzzi G.^ Arcan M.C. et al. Lipid oxidation products in cell signaling. //Free Radical Biology and Medicine. 2000. V. 28, № 9. P. 1370-1378.
Luckey T.D. Ionizing radiation promotes protozoan reproduction. //Radiat. Res. 1986. V. 108. P. 215-221.
Marathe W.K.. Harrison K.A. et al. Bioactive phospholipid oxidation products. //Free Radical Biol. Med. 2000. V. 28, № 28. P. 1762-1770.
Mothersill C.. O’Malley K.. Seymour C.B. Relevance of radiation-induced bystander effects for environmental risk assessment. //Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. T. 42, № 6. С. 585-587.
Myers D.M^ De Wolfe D.E., Araki K. Effects of X-irradiation and of metabolic inhibitors on rat thymocytes in vitro. //Can. J. Biochem. Physiol. 1962. V. 40. P. 1532-1552.
Petkau A. Radiation affection of model phospholipid membranes. //Acta Physiol. Scand. 1980. V. 492. P. 81-90.
Petkau A, Chelak W.S. Radioprotective effect of SOD on model phospholipid membranes. //Biochem.. Biophys. Acta. 1976. V. 433, № 3. P. Ill— 127.
Poli G., Dianzani M.V., Cheesman K.H. et al. Separation and characterization of the aldehidic products of lipid peroxidation stimulated by carbon tetrachloride or ADP — iron in isolated rat hepatocytes fnd rat liver microsomal suspensions. //Biochem. J. 1985. V. 227. P. 629-638.
Porter N.A. Mechanisms for the autoxidation of polyunsaturated lipids. //Acc. Chem. Res. 1986. V. 19. P. 262-268.
Reinhart E. Hormesis und die Bewertung kleinster Dosen von Wirkstoffen. //Biol. Med. 1998. V. 27, № 2. P. 51-54.
Seymour C.B., Mothersill C. Delayed expression of lethal mutations and genomic instability in the progeny of human epithelial cells that survived in a bystander-killing environment. //Radiat. Oncol. Investig. 1997. V. 5, № 3. P. 106-110.
Wheeller K.T., Lett J.T. Formation and rejoining of DNA strand breaks in irradiated neutrons in vivo. //Radiat. Res. 1972. V. 52, № 1. P. 59-67.
Wiencke J.K., Afzal V.. Olivieri G., Wolffe S. Evidence that the H-tymi- dine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-Rays involves the induction of the chromosomal repair mechanism. //Mutagenesis. 1986. P. 375-380.
Материалы международных конгрессов, съездов,конференций по радиобиологии )
Материалы Международной конференции по мирному использованию атомной энергии. Женева, 8-20 августа 1955. М.: Гос. изд-во Междун. литры, 1958. Т. 11. 487 с.
Симпозиум МОИП. Секция биофизики и радиобиологии. Первичные механизмы биологического действия ионизирующих излучений. Секция биофизики. М., 30 мая — 1 июня 1960. М.: Изд-во № 1 Госплана СССР. 52 с.
Second International Congress of Radiation Research. Congress Proceedings Radiation Research. London-Harrogate, August 1962. President Gray L. H. Harrogate. England (UK). 254 p.
Международный симпозиум по первичным и начальным процессам, происходящим в живых клетках при действии на них ионизирующей радиации. 18-22 октября 1963 М.: АН СССР, ЮНЕСКО, МАГАТЭ.
Первичные механизмы биологического действия ионизирующих излучений. //Сборник трудов МОИП. Т. VII. М.: АН СССР, 1963. 230 с.
Первое всесоюзное совещание по вопросам природы и роли радиотоксинов в биологическом действии ионизирующей радиации. М., 10 июня — 12 июня 1965. //Радиотоксины, их природа и роль в биологическом действии радиации высокой энергии. М.: Атомиздат, 1966. 296 с.
Third International Congress of Radiation Research. Congress Proceedings Radiation Research. Cortina d’Ampezzo, June 26 — July 2 1966. President Hollaender A. Italy. 263 p.
II Международный Симпозиум по первичным и начальным механизмам биологического действия ионизирующего излучения на клетку. Материалы Симпозиума. Ереван, 28 октября — 4 ноября 1968. Ереван: Изд-во АН Арм. ССР, 1989. 92 с.
IV International Congress of Radiation Research. Congress Proceedings Radiation Research. Evian, June 29 — July 4 1970. President Latarjet R. France. 264 p.
V International Congress of Radiation Research. 1975.
Всесоюзная конференция, посвященная 130-летию со дня рождения И. Р. Тархан-Моурави (Тарханова) и 80-летию издания его основополагающих работ по радиобиологии. Материалы конференции. Тбилиси, 1015 ноября 1976. Тбилиси: Мецниереба, 107 с.
IV International Congress. International Radiation Protection Association. Proceedings. Paris, April 24-30 1977. France. General Secretary Bresson G. V. I. 232 p.; V. II. 690 p.; V. IV. 1439 p.
The Sixth International Congress of Radiation Research. Congress Proceedings Radiation Research. Tokyo, May 13-19 1979. Japan. President Okada S. 1025 p.
Seventh International Congress of Radiation Research. Congress Proceedings. Radiation research under the auspices of the international association for radiation research. Program. Amsterdam, July 3-8 1983. The Netherlands. President Hollaender A. 144 p.
The Eight International Congress of Radiation Research. Congress Proceedings. Radiation Research. Edinburgh, July 19-24 1987. President Adams G.E. UK. Tailor & Francis. V. I. 441 p.; V. II. 985 p.
Radiation Biological Effects. Modifiers and Nreatment. Proceedings of the international conference on biological effects of large dose ionizing and non ionizing radiation. Hangzhou, March 29 — April 1 1988. Chinese Med. Assoc. President Wu C.T. Beijing, China. 372 p.
Первый Всесоюзный радиобиологический съезд. 21-27 августа 1989. М.: АН СССР. Т. I. 254 с.; Т. II. 562 с.; Т. III. 809 с.; Т. IV. 1017 с.; Т. V. 1031 с.
The Ninth International Congress of Radiation Research. Congress Proceedings. Radiation Research. Toronto, July 7-12 1991. President Whitmore G.E. Canada. Academic press, Inc. V. II. 1057 p.
International Conference on Low dose Irradiation and Biological Defense Mechanisms. Proceedings. Radiation Research. Kyoto, July 12-16 1992. President Sugahara Ts. Japan. Excerpta Medica. 510 p.
Второй съезд по радиобиологии. Киев, 20-25 сентября 1993. Пущино: Изд-во ОНТИ ПНЦ. Т. I. с. 443; Т. II. 777 с.; Т. III. 1179 с.
United Nations General Assambley. Adaptive responses to radiation in cells and organisms. 43 session of UNSCEAR. Vienna, Austria, 7-11 March 1994. 105 p.
Tenth International Congress of Radiation Research. Congress Proceedings. Radiation Research 1895-1995. Wurzburg, August 27 — September 1 1995. ISBN. President Hagen. Canada. V. II. 1057 p.
Третий съезд по радиационным исследованиям. Радиобиология. Радиоэкология. Радиационная безопасность. М., 14-17 октября 1997. Пущино: Изд-во ОНТИ ПНЦ. Т. I. 454 с.; Т. II. 495 с.; Т. III. 269 с.
United Nations General Assambley. Biological effects at low radiation doses — models, mechanisms and uncertainties. 49 session of UNSCEAR. Vienna, Austria, 12-16 April 1999. 130 p.
Международный симпозиум. Хроническое радиационное воздействие. Возможности биологической индикации. 14-16 марта 2000. //Сборник УНЦ РФ. Радиционная медицина. 308 с.
Modern problems of Radiobiology, radioecology and evolution dedicated to centenary of N. W. Timofeeff-Resovsky. Russia, Dubna, Joint Institute for Nuclear Research, September 6-9 2000. Abstracts. 231 p.
Современные проблемы радиобиологии, радиоэкологии и эволюции. Труды Международной конференции (6-9 сентября 2000), посвященной 100- летию со дня рождения Н. В. Тимофеева-Ресовского. ОИЯИ. /Под общей ред. В. И. Корогодина. 2001. 494 с.
European Radiation Research. 31 Annual Meeting of the European Society for Radiation Biology (ESRB) and 5 Jahrestagung der Gesselschaft fur Biolo- gische Strahlenforschung (GBS). 01-05 09 2001. Dresden, Germany.
International Congress on Radioecology-ecotoxicology of Continental and Estuarine Environments. 3-7 September, 2001. Nuclear protection and Safety Institute. France.. Aix-en-Provence. Congress Centre.
Четвертый съезд по радиационным исследованиям. Радиобиология. Радиоэкология. Радиационная безопасность. 20-24 ноября 2001. М.: Изд-во Рос. Ун-та Дружбы народов.
Международная конференция «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций». 10-13 июня 2002. М.: Изд-во Рос. Ун-та Дружбы народов.
Ill International Symposium “Mechanisms of Action of Ultra-Low Doses”. Moscow, December 3-5, 2002.
Список сокращений, символов и некоторыхусловных терминов
△//Н“*" — градиент протонного потенциала.
BER — (base excision repair) эксцизионная репарация оснований.
-Оз 7 — облучение в данной дозе приводит к выживаемости 37% биологических объектов или молекул.
Оос — доза «одного события».
DR — (death receptors) «рецепторы смерти» на поверхности клеточной мембраны.
е7иДР — гидратированный электрон.
G — радиационно-химический выход.
HED - (Haut Eritem Doses, нем.) кожная эритемная доза.
НО2 — гидроперокси-радикал (пергидроксид)
Н2О2 — пероксид (перекись) водорода.
LO — алкокси л-радикал.
LO2 — пероксил-радикал.
LOOH — гидропероксил.
NER — (nucleotide excision repair) эксцизионная репарация нуклеотидов.
NO — моноксид азота.
NOS — моноксида азота синтетаза (то же: NO-синтаза).
О2 — анион-радикал кислорода; супероксид.
ТО2 — синглетный кислород.
^2д О2 — кислород в основном, триплетном состоянии.
ONOO- — пероксинитрит.
ОН' — гидроксид-радикал.
ROOH — гидропероксид (гидроперекись).
TNF — (tumor necrosis factor) фактор некроза опухоли.
z — средняя доза, поглощенная в результате одного события поглощения энергии.
ААТ — аминоалкилтиолы.
АКСС — активные кислородосодержащие соединения, к которым относятся активные формы кислорода, активные соединения азота и продукты перекисного окисления липидов.
АКССрт — АКСС-радиотоксины.
Ю. Б. Кудряшов
АО — антиокислители.
АОА — антиокислительная активность.
АОБ — антиокислительный буфер.
АСА — активные соединения азота.
АТ — аминотиолы.
АТФ — аденозинтрифосфорная кислота.
АТ Фаза — аденозинтрифосфатаза.
АФК — активные формы кислорода.
АЭТ — аминоэтилизотиуроний.
БМ — биологическая мембрана.
ВОЗ (WHO) — всемирная организация здравоохранения (образована в 1946 г. в Нью-Йорке).
гпдг — гидроксипропанодезоксигуанозины.
Да — дальтон (кДа — килодальтон).
др — двунитевые (двойные, двутяжевые) разрывы молекулы ДНК.
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота.
ДНКаза — дезоксирибонуклеаза.
ДНК—МК — ДНК-мембранный комплекс.
ЕОРБ (ESRB) — европейское общество радиобиологии (основано в 1959 г. в Брюсселе).
ИАА — индолилалкиламины.
КЭ — кислородный эффект.
ЛД®/?/ (LD®/?/) — летальная доза для х% объектов в течение у суток.
ЛД50 (С£>бо) — «полулегальная» доза (смертельная доза для 50% облученных объектов).
ЛДюо (С£>юо) — «минимально летальная» доза (минимально доза, смертельная для всех облученных объектов).
Л КС — лазерная «корреляционная спектроскопия».
ЛПИ — линейная плотность ионизации.
ЛПО — липопероксидация (синдром ЛПО — синдром липопероксидации).
ЛПЭ (LET) — линейная передача (потеря) энергии.
ЛРТ — липидные радиотоксины.
МАГАТЭ (IAEA) — международное агентство по атомной энергии (автономная межправительская организации, учрежденная в 1957 г. в Вене в соответствии с решением Генеральной Ассамблеи ООН).
МАРЗ (IRPA) - международная ассоциация радиационной защиты (основана в 1966 г. в Риме).
МАРИ (IARP) — международная ассоциация радиационных исследований (основана в 1962 г. в Харрогейте).
МДА — малоновый диальдегид.
МКРЕИ (ICRU) — международная комиссия по радиационным единицам и измерениям (основана в 1925 г. в Лондоне).
МКРЗ (ICRP) — международная комиссия по радиационной защите (основана в 1928 г. в Стокгольме).
МСР (IUR) — международный союз радиоэкологов (основан в 1978 г. в Бельгии).
НКДАР ООН (UNSCEAR) — научный комитет Организации Объединенных Наций по изучению действия атомной радиации (учрежден на 10-й сессии Генеральной Ассамблеи ООН в 1955 г. в Вене).
НРБ — нормы радиационной безопасности.
ОБЭ — относительная биологическая эффективность излучений.
ОНРО — общая неспецифическая реакция организма (= объекта биологического).
ОР — однонитевые разрывы молекулы ДНК.
ОРТ — оксирадиотоксины (к ним относятся АКССрт и ЛРТ).
[ОРТ ДНК] — аддукты (оксиаддукты) ОРТ с ДНК.
ОСПОРБ — Основные санитарные правила обеспечения радиационной безопасности.
ПД — предел дозы.
пдд — предельно допустимые дозы облучения.
пдн — полидезоксинуклеотиды.
ПО — прооксиданты.
ПОЛ — перекисное окисление липидов.
ППОЛ — продукты перекисного окисления липидов.
РНК — рибонуклеиновая кислота.
СИ (SI) — Международная система единиц измерения.
СОД (SOD) — супероксиддисмутаза.
СПЖ — средняя продолжительность жизни.
УФ — ультрафиолет.
Ф — флюенс, то есть среднее число частиц, пролетающих через единичную площадку.
ФИД (ФУД) — фактор изменения (уменьшения) дозы.
ФС — фосфатидилсерин.
ФС — фосфатидилсерин.
ФСок — фосфатидилсерин окисленный.
ХЛ — хемилюминесценция.
ЦНС — центральная нервная система.
ЧАЭС — чернобыльская атомная электростанция.
ШО — Шифовые основания.
эВ — электронвольт.
27*
ЭГН - 2,3-эпокси-4гидроксиноненал.
ЭПР — электронный парамагнитный резонанс.
ЭФР — эндогенный фон радиорезистентности.
ЭХ Л — электрохемилюминесценция.
МКР — ядерный квадрупольный резонанс.
ЯМР — ядерный магнитный резонанс.
Предметный указатель )
/3-каротин
— радиолиз 201, 202, 203
Е. coli 134, 255, 256, 257
— гены репарации ДНК 258
гес 257, 258
uvr А 257
uvr В 257
Е. coli В/r и BS-I 122, 123, 135, 267
Адаптивный ответ (индуцированная радиорезистентность) 33, 276, 294, 311, 312, 313, 324, 340, 341, 348, 349, 350, 351, 352, 354, 355, 356, 361, 363
— адаптирующие дозы 311, 312, 315, 341, 348, 349, 350, 353, 355 выраженность при дроблении и длительности облучения 313
— влияние мощности дозы 312, 313, 315
— гипотеза о механизме 349
— интервал между облучениями 312, 313
как условие проявления неспецифического механизма защиты 313, 349
— мембранный механизм индукции 348
— механизмы развития 340, 350, 353
клеточной селекции 349, 353, 355
мембранной индукции репарации ДНК 349, 353
— проявляющие дозы 311, 312, 315, 356
— схема последовательности реакций формирования 349, 350, 355
Адреналин 308
Активность радионуклида 38, 39, 40, 41
Активные кислородсодержащие соединения (АКСС) 28, 220, 221, 222, 224, 227, 228, 231, 233, 237, 238, 239, 247, 249, 285, 290, 363
Активные соединения азота (АСА) 221, 224, 229, 232
Активные формы кислорода (АФК) 27, 199, 221, 224, 226, 227, 228, 229, 232, 233, 243, 246, 247, 248, 308, 318, 346, 348, 350, 372, 373, 374, 375, 376, 385, 387, 390
— биологическая роль 227, 228
— виды 224
— места образования 226
— метаболическая генерация 225, 226
Алкогольдегидрогеназа
— радиационная инактивация
причина 187, 212
Аминотиолы 164, 204
Антиокислители (антиоксиданты) 200, 238, 249, 250, 344, 345, 346, 347, 373, 375, 376, 387
— эндогенные 249, 360
Антиокислительная (антиоксидантная) защита 224, 243, 328, 345, 349, 359, 361, 390
Антиокислительный буфер 209, 239, 248, 249, 360, 361, 362, 390
— низкомолекулярные компоненты 248, 249
Апоптоз 224, 275, 278, 280, 281, 282, 283, 285, 287, 289, 290, 299, 302, 341, 345, 351, 353, 355, 356, 362, 363, 366, 367, 369, 377, 389 — биологический смысл 278, 287, 289 — два пути реализации 282 митохондриальный 283
— каспазы 282, 283, 286, 289
— механизмы 30, 277, 278, 280, 281, 285, 298, 356
— морфологические признаки 277, 278, 287
— нематода Caenorhabditis elegans 281
— программа апоптоза 283, 285, 287, 289
— сигналы неблагополучия клетки («черные метки») 283, 285, 287
— стадии 281, 289
— схема реализации 283, 284
Арахидоновая кислота 347
АТФаза (аденозинтрифосфатаза)
— радиационная инактивация 20, 187, 279, 285
Атомная радиация 24
Атомные бомбардировки Хиросимы и Нагасаки 24
Беккерель (единица активности радионуклида) 39
Белок р53 346, 351, 353, 354, 355, 356, 367, 371, 374, 375, 377
Биогенные амины 249
Биодозиметрия 323, 324, 325, 326, 327
Биологический закон самоликвидации 30, 289, 290
Биомембраны (БМ) 27, 28, 30, 33, 205, 206, 220, 226, 229, 232, 233, 236, 237, 238, 240, 246, 247, 265, 279, 330, 331, 341, 345, 346, 348, 349, 356, 358, 382, 383, 384, 386, 387, 392
барьерно-матричные свойства 239, 240, 341, 342
ведущая роль в инициации адаптивного ответа 341
вязкость (микровязкость) 349, 350, 356, 357, 359
изменение структуры и функций при холодовом и гипертермическом стрессе 357, 359
как радиобиологическая мишень 10, 33, 210, 341, 382, 383, 387, 392
неспецифический характер изменений при облучении 279, 308, 343, 356
особый принцип организации 341
проницаемость для 22Na после облучения в разных дозах 279, 314, 343
проницаемость для К+, Са2+, Na+, протонов, фосфатных и др. ионов 279, 343
«самопробой» при некрозе 280
— радиочувствительность (гиперррадиочувствительность) 342, 343, 344, 345
— рецепторы, включая рецепторы смерти 282, 283, 289, 341
— текучесть 342, 356, 357, 359, 360
— цепные реакции пероксидации 233, 343, 388
Биохемилюминесценция 220
Блау и Альтенбургера формула расчета числа попаданий в мишень 91, 92, 110, 113
Больцмана закон 215
Бора константа магнетона 215
Брэгга пик 71, 72
Брэгга—Грэя принцип 43, 84
Бэр 46, 47
Взвешивающий коэффициент для отдельных видов ионизирующих излучений см. Доза облучения (поглощенная доза)
Вирус табачной мозаики
— инактивация у-излучением 88, 96
Вода 207, 226
оптический спектр поглощения при облучении 172
первичные продукты радиолиза 175, 176, 181, 212, 330, 384
роль в инактивации биомолекул 177
радиационно-химический выход (G) 175, 195
— радиационно-химические превращения 212, 238, 382
возбуждение 381, 382
ионизация 381, 382
образование радикалов 172, 175, 197
сверхвозбуждение 172
расстояние диффузии радикалов 214
схема реакций радиолиза 175
Возбуждение молекул 67, 68, 73, 74, 75, 76, 140, 141, 142, 144, 146, 147, 148, 160, 173, 175
сверхвозбужденное состояние 142, 144, 145, 146, 148, 149, 172
спектр 142, 143, 144, 171
Выживаемость 99
ЛД50/30 для белых крыс 313
— уравнение кривой 100
Гейзенберга принцип неопределенности 144 Гемопоэз
— модель нарушений при лучевом поражении 115, 118, 119
Геном 250, 261, 264, 265, 272, 281, 289, 331, 332, 355, 363, 366, 367, 374, 375, 376, 377, 378
— надежность 250, 264, 265
— перестройка пространственной организации при репарации 263 Гены (см. таксисе Е. coli, гены репарации ДНК; Репарация ДНК, гены) 250, 255, 260, 261, 263, 311, 341, 351, 352, 353, 359, 360, 366, 368, 377, 386
- ATM 367
— bax 374
- bcl-2 374, 375, 376
- BLM 367
- c-FOS 351
— c-JUN 351
- DNA Pol 3 351
- FACC 367
- G6PD 373
- ^DD45 353, 375
p21/Waf (CDKN1A) 353, 372, 374
p34cdc2 (CDC2) 372
p53 (TP53) 372, 374
phr 257
rad51 (CCNB1) 372
uvr A 255, 256
uvr В 255, 256
uvr C 255, 256
иммуноглобулиновые — С, V, D, J 366
клеточной смерти (cell death) 281
ced-3 281
ced-4 281
ced-9 281
Гидроксид-радикал 222, 224, 227, 229, 232, 248, 332, 384, 385
Гидроксильный радикал (ОН ) 176, 184, 185, 188, 193, 217, 221, 227,
228, 229, 234, 238, 287, 332, 375, 384
Гидропероксиды 233, 234
Гидропероксирадикал 199, 200, 222, 224, 226
Гиперрадиочувствительность 305, 307, 344, 361
- и ЕРФ 303, 305, 307
и сверхмалые дозы 303, 305, 306, 307, 314, 340, 345, 346, 347, 391
Глутаматдегидрогеназа
радиационная инактивация
причина 187
Глутатион 164, 165, 183, 184, 246, 247, 248, 249, 376
Глутатионпероксидаза 226, 247, 248
Глутатионредуктаза 248
Глутатионтрансфераза 248
Головной мозг (см. таксисе Облучение организма, церебральный синдром) 48
Гомеостаз 221, 317, 360
окислительно-восстановительный
система 205, 220, 221, 224, 233, 238, 239, 243, 250, 302, 307, 312,
40, 342, 349, 359, 362, 366, 369, 373, 375, 387, 390
Гонады 48
Гормезис (радиационный) 33, 89, 303, 308, 309, 310, 324, 340, 361
— диапазон доз 305, 308, 310
Государственная премия 28, 29, 30
Гранулоцит 115, 118
— гранулоцитопоэз 115, 116, 117, 118, 307
Гроттгуса принцип 54, 55
Грэй (единица поглощенной дозы) 42, 138
Дезоксинуклеозидурия 299
зависимости «доза-ффект» и «время-эффект» 299
закономерности после облучения 299
связь с апоптозом 299
связь с клеточным опустошением 299
Дессауэра теория нагрева 21, 22
Джоуль (см. таксисе Энергия излучения, единица Джоуль) 35, 42
Димер тиминовый 255, 256, 257, 258
ДНК 22, 74, 123, 127, 128, 132, 150, 151, 152, 153, 183, 188, 191, 194, 205, 206, 219, 220, 229, 254, 255, 331, 383, 385
— восстановление от повреждений 28, 31, 250, 263, 291, 391
— денатурация 150, 188
как критическая структура (мишень) 23, 29, 210, 251, 331, 341, 382
комплексные повреждения 252
модификация оснований 188, 251
повреждения 152, 187, 205, 250, 251, 252, 331, 363, 374, 386
аддукты 239, 240, 387
двунитевые разрывы 74, 81, 122, 150, 151, 152, 188, 189, 194, 195, 252, 261, 287, 355
число на клетку спонтанных и на 1 Гр 253, 260
количество в клетке млекопитющих 260
МДА 193, 194, 195, 243, 244
однонитевые разрывы 81, 122, 123, 150, 151, 152, 188, 189, 194, 195, 251, 252, 259
число на клетку спонтанных и на 1 Гр 253, 260
оснований
число на клетку спонтанных и на 1 Гр 253, 260
при внутреннем облучении 253
сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок 151, 152, 188, 195, 252, 253
фотохимические (УФ) 255, 256, 257, 258, 306
— репарация от повреждений 250, 254, 255, 259, 260, 261, 262, 263, 267, 291, 294, 331, 349, 351, 353, 355, 356, 374, 388, 389, 391
путем некомплементарного (негомологичного) сшивания концов ДНК 29, 261, 262
рекомбинационная 29, 261, 262, 263, 355, 375
схема механизмов 262, 263
эксцизионная нуклеотидов 262, 353, 374
эксцизионная оснований 262, 353, 374
ДНК Diplococcus pneumonia 133
— инактивация 183, 189
— трансформирующая активность 133
ДНК тимуса теленка
— радиационные повреждения 151, 188
ДНК-лигаза 257, 258, 260, 262, 294
ДНК-мембранный комплекс 265, 266, 267, 268
— восстановление 265, 267, 268
— единая радиобиологическая мишень 266
— радиационное повреждение 265, 266, 267
ДНК-полимераза I
— экзонуклеазная активность 257, 258, 260, 262, 263, 294
ДНКаза (дезоксирибонуклеаза) I 186, 209, 282
— радиационная инактивация 181, 186, 187
Доза излучения (экспозиционная доза) 37, 40, 322
единица измерения 40
мощность дозы 40
Доза облучения (поглощенная доза) 17, 38, 41, 42, 68, 71, 72, 73, 74, 87, 131, 132
Do ЮО, 101
D37 94, 95, 96, 100, 137, 138, 150, 153, 154, 157, 158, 161, 162, 164, 186, 202, 210, 212
Dq. квазипороговая 100, 101
единицы и их соотношение 42
зависимость «доза-эффект» 94
— интегральная 42
— кожная эритемная 18, 278
— летальная для клетки 210, 255
— малая 32
— мощность 42, 49, 339
— эквивалентная 45, 47, 51, 91
взвешивающий коэффициент для отдельных видов излучений 45, 46, 48
единица Зиверт 46, 47
мощность 47
Дозиметр Фрике 44
Дозиметрия 18, 43, 73, 80
— методы 43
ионизационной камеры 43
калориметрический 43
сцинтилляционный 44
химические 44
«Дыхательный всплеск» 227
Единицы измерения
система СИ 37, 39, 40
Естественный радиационный фон (ЕРФ) 296, 305, 306, 307, 308, 322, 337 — ультрамалые мощности доз 305, 306
Желудок 48
Живая система 22, 31, 206, 289, 341, 360, 379, 381
гетерогенность 22, 381, 382
неспецифическая реакция 31, 317, 318
поглощение излучения 22
Зависимость «доза—эффект» 87, 96, 126, 129, 130, 170, 186, 324, 328, 382 - кривые 88, 89, 90, 91, 92, 96, 97, 99, 100, 101, 102, 111, 123, 124, 127, 132, 134, 136, 137, 157 — критерии одноударности 97, 264 — сигмоидальная 100, 101, 189 — экспоненциальная зависимость 96, 97, 100, 130, 131, 134, 137, 170, 186
Излучение ионизирующее 13, 14, 15, 72, 91, 205, 238, 241, 318, 381 - у-кванты 14, 17, 35, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 68, 73, 91, 96, 130, 133, 137 — качество 45 — корпускулярное 15, 35
о-частицы (ядра гелия) 15, 17, 35, 36, 46, 62, 65, 68, 73, 74, 75, 76, 93, 137
/3-частицы (электроны и позитроны) 15, 17, 68, 73, 77
тг-мезоны 15
нейтроны 15, 35, 46, 65, 67, 68
протоны 15, 35, 46, 65
механизмы биологического действия 84, 321
непрямое действие 25, 127
прямое действие 126, 132
стадии 128, 136
физико-химическая 128, 136, 144, 147, 157, 165, 207, 382
физическая 128, 136, 137, 144, 207
химическая 128, 136, 149, 208, 382
«теория дуального действия» 81, 83
плотноионизирующее 75, 97
редкоионизирующее 75, 97
рентгеновское (Х-лучи) 14, 17, 35, 56, 58, 59, 60, 62, 63, 66, 67, 68, 73, 83, 91, 96
фотонное (электромагнитное) 35, 46, 91
Излучение электромагнитное 15
виды 35
оптическое 14
видимое 14
инфракрасное 14, 129
ультрафиолетовое 14, 59
радиочастотное 14
высокочастотное 14
деци- и миллиметровое 14
низкочастотное 14
спектр 14
среднечастотное 14
Инвертаза 130, 164
— радиационная инактивация 130
Ингибиторы
— метод 219, 241, 385
Индолилалкиламины 164
Ионизация 63, 65, 66, 67, 68, 74, 75, 76, 77, 84, 92, 95, 96, 97, 122, 137, 140, 142, 144, 146, 148, 169, 172, 173, 175, 331
— молекул 68, 73, 146, 148, 149
— потенциал 15, 142, 144, 146, 172
— тяжелые заряженные частицы 75, 76, 77, 91
Ионы 56, 66, 67, 75, 76, 77, 78, 93, 137, 138, 146, 147, 148, 149, 151, 172, 173
— блобы 77, 208
пространственное распределение 73
шпоры (рои ионов, шпуры) 76, 77, 175, 208
Камера Вильсона 77, 78, 85
Карбонильные соединения 122
реагирующие с тиобирбитуровой кислотой 195
Каталаза
радиационная инактивация
причина 187, 247
Кейлон 115, 117
Кислород 161, 162, 163, 176, 183, 184, 185, 192, 198, 199, 203, 220, 221, 222, 224, 226, 227, 230, 243, 246, 349, 384, 387
— оксирадикалы 183, 238, 383, 387
— синглетный 222, 224, 226, 228, 375
Кислородное последействие 162, 386
Кислородный эффект 183, 184, 185, 382, 387
Клейна—Нишины формула 61
Клетка 27, 29, 31, 76, 89, 100, 205, 206, 207, 250, 290, 324, 330, 363
антиокислительная защита 27
— восстановление от повреждений 28, 269, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 298, 363, 388, 389
восстановление от сублетальных повреждений 29, 292, 293
интерфазная (немитотическая) гибель 29, 269, 270, 271, 274, 275, 389
биохимические и морофологические изменения 271
клеточный цикл 299
блоки G1-, S-, G2- И М 273, 299
фазы S и G2 274
— лучевое поражение 270, 379
выживаемость 94, 95, 99
модификация 26, 27, 120, 219, 272, 274
факторы 272, 273, 274, 275
механизмы гибели 275
неспецифическая оксидативная реакция 269, 356, 360
стадии 361
неспецифическая реакция на повреждение 31, 387, 392
окислительно-восстановительный гомеостаз 29, 30
окислительные процессы в облученной клетке 30
оксидативный стресс 280, 318, 340, 360, 361, 387
принцип системного ответа на облучение 31, 295, 388, 390, 391, 392
принцип структурной и функциональной гетерогенности 389
радиационное поражение 238
радиочувствительность 117, 119, 273, 330, 363, 366, 376
репродуктивная (митотическая) гибель 195, 269, 270, 272, 273, 275, 298, 362, 368, 389
ядро 324, 330, 331, 332, 334, 335, 336, 339, 353, 355, 371, 372
Клеточная популяция (популяция клеток) 290, 298, 302, 323, 332,
335, 337, 341, 345, 347, 349, 368
Кожа 18, 48
лучевое поражение 82
радиогенный дерматит 18
рак 18
Коллаген
радиационные превращения 192
Комптона эффект 60, 61, 62, 63, 67
Комптоновские электроны
энергия 60, 62
Комптоновское поглощение
коэффициенты 61, 67
Константа Михаэлиса—Ментен 131
Кортикостероиды 308
Косвенно ионизирующие частицы 65, 66
Кости 48
Костный мозг 48, 118
Кровь
клеточный состав после облучения 298
Кулон 40
Кюри (единица активности радионуклида) 39, 41
Лактатдегидрогеназа
радиационная инактивация
причина 187
Лактопероксидаза
радиационная инактивация
причина 187
Легкие 48
Лизоцим
— инактивирующие радикалы 185
Лимфоцит 276, 347
— В-лимфоцит 298, 366
— гибель 271
— ингибирование стволовых клеток 299
— лимфопоэз 115, 116, 117, 118
Линейная передача энергии (ЛПЭ) 36, 37, 57, 71, 74, 75, 80, 83, 84, 94, 95, 97, 123, 136, 137, 139, 151, 173, 193, 195, 252, 330, 334, 386 — временная шкала превращений 144, 145 — соударение лобовое 139 — соударение скользящее 139, 140
Линейная плотность ионизации (ЛПИ) 37, 74, 75
Липидные радиотоксины (ЛРТ) 10, 228, 239, 247, 248, 279, 285, 361, 369, 386
Липиды 27, 197, 198, 199, 202, 203, 207, 224, 232, 234, 238, 239, 240, 242, 247, 248, 361
— перекисное свобонорадикальное окисление (пероксидация) 27, 28, 197, 198, 201, 224, 228, 229, 232, 233, 234, 235, 236, 318, 341, 345, 350, 359, 361, 384
коррекция цепных реакций 200
продукты (ППОЛ) 221, 223, 224, 232, 233, 234, 236, 238, 242, 243, 248, 308, 318, 330, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 359, 361, 376, 383, 384, 385, 386, 387, 388
синдром 318, 319
стадия инициирования (зарождения цепи) 197, 198, 234
стадия обрыва цепи 198, 199
стадия развития цепной реакции 198, 199
— радикалы 235
Лучевое поражение 18, 19, 20, 29, 189, 229, 241, 300, 379
— биологическая стадия 208, 209, 210, 211, 382
— гемопоэз 300
структурно-метаболическая теория 29
теория свободнорадикальных цепных процессов 27, 241
эмбриогенеза 19
Макромолекулы 127, 169, 170, 210
— радиационная инактивация 127, 128, 180, 210
непрямая 184
прямая 180, 184
радиочувствительность функций 127, 160, 170, 180
этапы биофизического анализа 127, 128, 130, 135, 166, 167, 171 Малые дозы (см. таксисе Облучение, малые дозы) 82, 89, 94, 95, 181, 261, 262, 281, 304, 312, 321, 322, 323, 325, 326, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 339, 340, 341, 342, 345, 347, 356, 357, 360, 369, 373, 391 — диапазон (интервал) 314, 321, 322, 323, 326, 329, 333, 335, 337, 338, 339, 357
зависимость «доза-эффект»
неправомерность экстраполяции от больших доз к малым 296, 303, 320, 340
сложный (немонотонный) характер 303, 304, 321, 325, 326, 340, 391
— зависимость эффекта от мощности дозы 310, 314, 340, 344, 347, 391
механизмы биологического действия 339
первичная мишень не ДНК, а мембраны 340
Маркова цепь 24, 114
Марковские случайные процессы 113, 114
Математические модели 103, 104, 106, 107, 108, 109, 110, 119, 124 — подтипы 106
детерминированные и стохастические 106, 108
статичные и динамичные 106
точечные и распределенные 106
феноменологические (базовые) 106
— системные (разноуровневые) 109, 112, 122
Мансона 109, 122
— типы 104, 115
аналитические 104, 105, 106, 108, 109, 112, 124, 389
имитационные модели 104, 105, 106, 108, 109, 112, 124, 390
стохастические 110, 113, 389
Математическое моделирование 102, 103, 104, 107, 108, 109, 111, 112, 115, 124, 125, 389
— методы 108, 115, 389
Матка 48
Металлотионеины
роль в адаптивном ответе 351
Метионин 192
Микродозиметрия 78, 79, 80, 82, 83, 84, 333
и бесстеночный газоразрядный пропорциональный счетчик 84
и моделирование 84
ионизационно-импульсный метод 84
сайтовая модель 82
— трековая модель 83
Митохондрия
— митоптоз 30, 232, 285, 289, 290
Мишень 92, 93, 94, 95, 96, 99, 100, 101, 103, 137, 138, 214, 332, 333, 339, 341, 383, 390
- ДНК 205, 239
— концепция 87, 92, 99, 102, 103
— мембраны 33, 239
— параметры мишени 92, 136, 137, 138, 332
— принцип 380, 381, 382, 389
— расчет молекулярной массы 138
— теория 111, 382, 389
формула расчета числа попаданий 93, 94
эффективный объем 96, 101
МКРЗ (Международная комиссия по радиационной защите)
304, 309
Молекула 146, 201, 206
возбужденное состояние 140, 144, 146, 147, 148, 149, 169
синглетное 148, 221
триплетное 148, 221
— диссоциация 142, 146
радиолиз 149
Молекулярная радиобиология 127, 392
Молочная (грудная) железа 48
Мочевой пузырь 48
Мутагенез (мутагенные изменения) 250, 255, 294, 369
Мутации 239, 250, 254, 261, 281, 311, 312, 331, 363, 366, 367, 368, 369, 375, 376, 377, 378, 385, 386 — соматические 324 — спонтанные 363, 366, 367
Мышечная ткань 48
Надпочечники 48
НАД(Ф)Н-оксидаза 226, 227
Нанодозиметры 85
Научный комитет по действию атомной радиации ООН
(НКДАР) 24, 303, 304, 322, 326, 333
Нейтроны 57, 64, 81
— неупругое рассеяние 64
- ОБЭ 82
— поглощение веществом 64, 65
радиационный захват ядром 65
упругое рассеяние 64
Некроз (некротическая гибель клеток) 275, 277, 278, 279, 280, 283, 285, 287, 290, 302, 358, 362, 389
Непрямое действие радиации 169, 176, 180, 181, 182, 197, 201, 202, 203, 204, 212, 213, 214, 229, 323, 332, 333, 382, 384, 385
в клетках 211, 213, 251
зависимости «доза-эффект» 181
критерий 181
последовательность процесса 182
соотношение прямого и непрямого эффекта 213, 302
эффект Дейла 180
Нормы радиационной безопасности (НРБ-99) 39, 49, 50, 51, 52
Нуклеиновые кислоты
радиационная инактивация 128, 132, 135, 137, 189, 191, 207
акцепторная активность тРНК 134, 135
гибридизация с мРНК 133, 134
затравочная активность ДНК 133
инфекционность ДНК и РНК 128, 132, 133, 187, 189
трансформирующая активность бактериальной ДНК 128, 132, 133, 138, 183
ОБЭ (относительная биологическая эффективность) излучения 56, 57, 81, 82, 83, 84, 333, 386
коэффициент 56, 57, 84
Облучение 23
клетка 23, 32
системный ответ 389
— малые дозы 33, 296, 305
сравнение эффектов больших и малых доз 309, 310, 315
организма 296
внешнее 49
внутреннее (инкорпорированное) 49
длительное (хроническое) 49, 51
кратковременное (острое) 49, 50
критические органы 290, 296, 297, 301
клеточное опустошение 290, 296, 297, 298, 299, 301, 302, 341
местное (локальное) 49
многкратное (фракционированное) 49
нелегальные (сублетальные) дозы 303, 304, 310
общее 49
однократное 49
отдаленные последствия 296, 319, 321, 362
протяженное 50
радиационные синдромы 290, 297, 301, 302
кишечный 297, 300, 301
костномозговой (кроветворный) 297, 300, 301
средняя продолжительность жизни при них 297
церебральный (ЦНС) 297, 300, 301
смертельные (летальные) дозы 296
стволовые клетки 295, 298, 300, 302, 388
Ожидаемая индивидуальная доза 47, 48
Оксиаддукты ДНК 28, 242, 243
МДА 191, 286
— пропаноаддукты 243, 245, 286
— этеноаддукты 243, 245, 286
Оксид азота 221, 223, 229, 230, 231, 232, 233, 238, 287, 385, 386, 387
продукты превращения 223
цикл 231
Оксимочевина 293, 294
Оксирадиотоксины (ОРТ) 238, 239, 240, 242, 243, 245, 246, 279, 283, 285, 286, 289, 318, 360, 361, 362, 371, 373, 376, 385, 386
аддукты с ДНК 242
Оптическое приближение 141, 144
Острая лучевая болезнь 20, 300
Осциллятор молекулы
- сила 140, 141, 142, 143, 144, 171, 172
Перекисное свобонорадикальное окисление 27, 208, 209, 210, 224, 228
— продукты
алкокси л-радикал 224, 233, 234, 246
пероксил-радикал 223, 224, 233, 246
Пероксиды 184, 199
- водорода 175, 176, 221, 222, 224, 227, 228, 229, 232, 238, 247, 332, 349, 373, 375, 384
— гидропероксиды 221, 224, 228
— липипероксиды 228
Пероксинитрит 231, 232, 238, 287, 332, 385, 386, 387
Печень 48
Пищевод 48
Планка постоянная 61
Поглощенная доза (излучения) (см. таксисе Доза облучения) 41, 333, 334, 339
Поджелудочная железа 48
Попадание 93, 95, 99, 101, 138, 332, 338, 339
— множественные (многоударные) 92, 100, 101
— одиночное 92, 100, 101
— одноударная модель 93, 95, 96, 99, ПО, 116, 137
- принцип 22, 87, 92, 99, 102, 111, 139, 382
Почка 73
— зависимость «доза-эффект» при облучении 100
Предел дозы 51, 52
Привитой сополимеризации метод 217, 218
Принцип Франка—Кондона 146
Протеинкиназа С (ПК С) 228, 350, 351, 353, 356, 360
Протон 247
— отдачи 68
Прямое действие радиации 126, 163, 166, 180, 181, 201, 211, 212, 213, 323, 332
— модификация (защита) низкомолекулярными веществами 165, 166
— на нуклеиновые кислоты 135
— способы оценки соотношения прямого и непрямого эффектов с применением температурных воздействий, высушивания, замораживания 211
Рад (единица дозы) 42
Радиационная биофизика 9, 12, 13, 15, 16, 21, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 33, 103, 108, 109, 115, 124, 125, 126, 127, 128, 154, 206, 209, 224, 296, 330, 379, 380, 382, 383, 389, 392
— математические модели 23
— радиационной биофизики лаборатория 9, 201
Радиационная гибель клеток 269, 276, 288
— механизмы 276, 277, 287, 288
— некроз 288
Радиационно-индуцируемая нестабильность генома 224, 239, 362, 363, 368, 369, 371, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 389, 392
— биологическое значение 377
— варианты проявления 363
— контроль клеточного цикла 366, 367, 369, 374
— механизмы 371
межклеточных контактов 371, 373
обмена гуморальными сигналами 372, 373
— определение понятия 363
— отличия от перманентной нестабильности 363
— схема вариантов проявления 370
— характеристика 364, 365, 368
— эпигенетическое наследование 363, 369, 377
Радиационно-химический выход (G) 171, 180, 190, 191, 196, 203, 252
Радиационное старение 19, 320, 362
Радиационный (лучевой) канцерогенез (онкотрансформация)
19, 362, 368
Радиационный мутагенез 21, 386
Радиационный риск 44, 48, 326
Радиационный эффект 379
— механизм усиления 241, 343, 386
Радиация
— гипотеза точечного нагрева 90, 91
принцип и механизмы усиления начального радиационного повреждения 27, 211, 294, 383, 386, 387, 389
теория физико-химического механизма 27
Радикалы метаболические 259, 377
число повреждений ДНК за счет их ежесуточной продукции 259, 260, 261
Радикалы радиационные 149, 152, 173, 175
аденина в ДНК 194
органических молекул
реакции 159, 176, 177, 190, 238
с образованием стабильных продуктов 178
гидролиз 179
димеризация и присоединение 177, 178
диспропорционирование 178
перенос водорода 179
присоединение кислорода 179
— перехватчики 185, 187, 188, 189
тимина в ДНК 152
цитозина в ДНК 194
Радиоактивное загрязнение 39
плотность 39
Радиоактивность 17
естественная (природная) 17
искусственная 17
Радиобиологический эффект 29, 73, 137, 212, 311, 344, 382
«вероятностная» модель Капульцевича 103, 109, 110, 111
детерминированный 50
зависимость от дозы облучения 20, 87, 88
— сравнение при больших, малых и средних дозах 303
— стохастический 50, 103, 123, 389
Радиобиология 13, 16, 24, 27, 32, 33, 102, 123, 124, 125
— основные принципы 34, 380, 392
— периоды развития
второй 20
первый (начальный) 18
третий 24, 32
— принцип попадания 380, 381
— «энергетический парадокс» 55, 78, 380
Радиолиз биоорганических молекул 185, 190
— влияние ЛПЭ 182
— импульсный 177
— модификация в водных растворах 182
— фосфолипидов 189, 195, 201
с образованием гидроперекисей 195, 196
с образованием карбонильных соединений 196
с образованием Шиффовых оснований 191, 195, 196
эффект защиты 182
Радионуклиды 32, 320, 325
222На (радон) 39
60Со 56, 57, 59, 67, 133
гелий 36
радий 18, 19
трансмутация 253
14С (радиоуглерод) 252, 254
32р (радиофосфор) 252, 254
3Н (тритий) 252, 253, 254
Радиопротекторы 25, 164, 204, 344
Радиорезистентность 310, 329, 348, 351, 353
Радиоспектроскопия
методы 214
Радиотаксон 265
Радиотерапия
клеточные модели 119
модель глобальной (многошаговой) оптимизации временного режима 119
Радиотоксины 34, 218, 224, 238, 239, 240, 241, 242, 247, 248, 346, 348
Радиочувствительность 96, 123, 134, 164, 189, 190, 191, 196, 202, 241, 329, 382
аминокислот 191, 192, 196, 212
ОТНОСИТеЛЬНЫЙ ВЫХОД раЗЛОЖеНИЯ (Gqth) 192
белков 191
ДНК 196
биомолекул 161, 163, 164, 185, 189, 190
закон Бергонье-Трибондо 19
клеток 89
сравнительная 25
нуклеиновых кислот 184, 185, 193
нуклеотидов 191, 196
углеводов 191, 193, 196, 207
ферментов 185
фосфолипидов 185, 195
Радиоэкология 32, 33, 296, 391
Реакция Хабер—Вайса 227
Рентген (единица экспозиционной дозы) 21, 40, 341
Рентгеновская трубка 58
Репарационная репликация 256, 262
Репарация ДНК 257, 341, 366, 367, 369, 377
два типа («выщепление-замещение» и фотореактивация) 257
пострепликативная 258
схема Говард-Фландерса 257
Рецепторы клеточных мембран 350, 351
Рибонуклеаза (РНКаза) 129, 130, 155, 158, 160, 161, 164, 171, 184, 187, 209
— радиационная инактивация 88, 90, 163, 170, 186
D37 130, 169, 170, 171
зависимость «доза-эффект» 161
причина 186, 187
— радиочувствительность 169
Рибосомы
радиационная инактивация функциональной активности 134, 135
Ридберга константа 142
Свободнорадикальное перекисное окисление 211, 218, 219
Свободные радикалы 25, 26, 147, 148, 149, 152, 160, 162, 163, 166, 172, 176, 178, 182, 197, 198, 200, 203, 214, 218, 219, 224, 233, 242, 338, 344, 351
анион-радикалы 149
в облученной клетке 214, 220
методы определения 214, 216, 217
— катион-радикалы 149
— липидов 198, 201
— модель инактивации ферментов 156, 157
Селезенка 48
Серотонин 249
Система СИ см. Единицы измерения
Спиновая ловушка
— метод 217, 219
Стресс 316, 317, 327, 358, 360
— дистресс 317
— оксидативный 238
— понятие 316
— стадии 309, 316, 317
фитостресс 317
эустресс 317
Структурные повреждения радиационные 149, 150, 153, 154, 162, 163
в нуклеиновых кислотах 150
в ферментах 153
в лизоциме 153, 156
D37 156
в рибонуклеазе 153
в химотрипсине 154, 156
модификация 160, 163
кислородом 161, 183
молекулами примесей 164, 165, 166
температурой 163
Сукцинатоксидаза
радиационная инактивация
причина 187
Супероксиддисмутаза 226, 227, 228, 247
Супероксидный анион-радикал (супероксид) 221, 222, 224, 226, 227, 228, 231, 238, 246, 247, 281, 285, 287, 344, 373, 375, 376
Счетчики
Буза 85
«капле-пузырьковый детектор» Эппла 85
Росси 84
Теория мишени 22, 23, 137, 138
Тимус (вилочковая железа) 48
Тонкая кишка 48
Трек ионизации 36, 75, 85, 208, 330, 331, 334, 335, 336, 337, 339, 348, 371
о-частицы 75
дейтрона 75
электрона 75, 76, 77, 78
Трипсин 131, 137, 161, 183
— радиационная инактивация 137, 183, 185, 186
зависимость «доза-эффект» 183
радикалы 159
Тромбоциты 116, 324
динамика концентрации после облучения у крыс 118
тромбоцитопоэз после облучения 115, 116, 117, 118, 300
Уравнение Бете—Блоха 70, 71, 139
Уреаза 187
Ускоренные заряженные частицы 68, 71
модель Дертингера и Юнга 69
УФ-излучение 91, 255, 256, 257, 258
Ферменты 128, 129, 130, 131, 191, 209, 212, 343
радиационная инактивация 129
радиочувствительность 130, 131, 132
глутаматдегидрогеназа 131
протеаза 131
рибонуклеаза 131
химотрипсин 131
Ферми уравнение 65
Флюэнс 41, 93, 94
Фосфатидилсерин 283
окисленный 283, 285
Фосфоглюкомутаза
радиационная инактивация
причина 187
Фосфолипиды 191, 196, 199, 201, 232, 233, 238, 241, 279, 283, 285, 343, 357, 358, 359, 360
молекулярная геометрия при стрессах 358
Фотонное излучение см. Излучения ионизирующие
Фотоэлектроны 61, 62, 66, 187
Фотоэффект (фотоэлектрический эффект) 60, 62, 63, 66
ФУД (фактор уменьшения дозы) 164
Хемилюминесценции метод 217, 218, 219, 220, 385
Херши
методика суицидальных экспериментов 253
Химическая защита от излучений 25, 34, 290, 382
гипотеза «биохимического шока» 26
гипотеза «комплексного биохимического механизма действия ра- диозащитных средств» 26
гипотеза «эндогенного фона радиорезистентности» 26, 349, 362
радиозащитные препараты 25, 32
— «сульфгидрильная гипотеза» 26
Хромосомные аберрации (аберрации хромосом) 82, 239, 254, 307, 312, 323, 324, 325, 363, 367, 368, 376, 377, 385
Цепные свободнорадикальные реакции 197, 198
— и лучевое поражение клетки 241, 383
Цистамин 164
Цистеамин 165
Цитохром с 226, 246, 283, 286, 290
Цитохромоксидаза 245, 246
Чернобыльская авария 32, 320, 321, 323, 326, 391
Щитовидная железа 48
Эквидозиметрия 44, 45
Экзонуклеазная активность (экзонуклеаза) 258, 262, 294
Экспозиционная доза (доза излучения) см. Доза излучения (экспозиционная доза)
Экстраполяционное число п 100, 101
Электрон 15, 35, 46, 58, 67, 68, 74, 76, 77, 146, 147, 148, 149, 160, 173, 220, 221, 227
— активация 141
— вторичный (5-электрон) 63, 76
— Оже 77
— отдачи 66
— потеря энергии 78, 143
— пробег в веществе 77, 78
— свободный 148, 173, 174, 233, 240
сольватированные (гидратированные) 148, 173, 174, 175, 176, 177, 184, 185, 188, 189, 203, 238
характеристики 147
судьба после испускания молекулой 147
ускоренный 58, 77
энергия 58, 67, 78
Электрон-вольт 35
Электронно-позитронные пары 62, 63
кинетическая энергия пары 62
Электрохемилюминесценции метод 218, 219, 307
Эндогенный фонд радиорезистентности (ЭФР) 30, 387, 390
Эндонуклеаза 256, 258, 262, 282, 294
Энергия излучения 54, 55, 58, 67, 76, 81, 90, 144, 381
линейная потеря (ЛПЭ) (см. таксисе Линейная передача энергии) 37, 76, 79, 157, 158
— миграция в биоструктурах изменение сигнала ЭПР 158 реакция присоединения 158
термолюминесценция 158, 160
— пакет 143
— перенос на молекулу 158, 160, 161, 381
— поглощение веществом 54, 55, 58, 59, 60, 67, 73, 78, 79, 80, 81, 207, 329, 333, 334, 339, 381, 382
— удельная потеря 37, 71, 79, 80, 143
ЭПР-спектроскопия 152, 154, 155, 158, 159, 160, 163, 214, 215, 216, 217, 219, 220, 325, 326
- метод 136, 154, 217, 385
— спектры ЭПР облученных животных 152, 155, 158, 217
Эритропоэз 115, 116, 117, 118
Эффект Петко 313, 314, 344
Эффект свидетеля (bystander effect) 34, 333, 340, 346, 347, 348, 363,
371, 372, 373, 391
Эффективная доза 47, 48, 51
Ядерная реакция 17, 65
Ядро отдачи 64, 65, 67
ЯКР (ядерный квадрупольный резонанс) 215, 216
ЯМР (ядерный магнитный резонанс)
— ЯМР-спектроскопия 215, 216
Указатель имен
Акоев И.Г. 302
Александер П. 26, 31, 342
Александров В.Н. 317
Альтенбургер К. 91, 92, 110, 113
Арчаков А.И. 28, 199, 248
Аршамбо Д. 298
Ауэрбах III. 212
Байсоголов Г.Д. 301
Бак 3. 25, 26, 31, 204, 342
Беккерель А. 17
Бергонье И. 19, 269
Беренфельд Б.С. 9
Бесядовский Р.А. 113
Блау М. 91, 92, 110, 113
Блох Ф. 216
Блюменфельд Л.А. 44
Боденштейн М. 197
Боднарчук И.А. 340, 341, 345, 349, 350, 353
Бонд В. 298
Бурлакова Е.Б. 12, 27, 28, 219, 226, 236, 237, 302, 307, 321, 328, 340, 345, 357
Бычковская И.Б. 363
Вайнберг Р. 379
Василенко О.И. 12
Вейс Дж. 173
Веселовский В.А. 307
Виенкке Дж. 315
Владимиров Ю.А. 28, 199, 217, 280, 307
Говард-Фландерс П. 257
Гольдберг С.В. 18
Гончаренко Е.Н 12, 26, 201, 218, 249, 302, 308, 362
Горизонтов П.Д. 30, 299
Гофман Дж. 322
Граевский Э.Я. 26
Грей Л. 25, 42
Грейб Р. 314, 322, 344
Груздев Г.П. 299
Гурвич А.Г. 306
Гуськова А.К. 301
Деев Л.И. 12
Дейл В. 25, 180, 204
Дертингер Г. 69, 162, 183
Дессау эр Ф. 21
Дубинин Н.П. 24
Ермолаева Н.В. 276
Жолио-Кюри Ирен 17
Жолио-Кюри Фредерик 17
Жербин Е.А. 30
Жеребченко П.Г. 25
Животовский Б.Д. 30, 276
Зиверт Р.М. 46
Иванов В.И. 40, 332
Иванов В.К. 119, 321, 326
Иванов И.И. 28, 307
Каган В.Е. 28
Казначеев В.И. 306
Капульцевич Ю.Г. 103, 109, 111
Касьяненко А.А. 12
Кеирим-Маркус И.Б. 45
Кейтер Д. 25
Келлерер 103, 109, 110, 389
Киселев М.Ф. 327, 328
Кларк Л. 257
Козлов Ю.П. 28, 218
Козлов А.А. 305
Коломийцева И.К. 304
Колье О.Р. 12
Комар В.Е. 258, 302
Коноплянников А.Г. 300
Коноплянникова О.А. 300
Корогодин В.И. 22, 291, 332
Корыстов Ю. И. 212
Котеров А.И. 313
Коул К. 214
Коул Л. 276
Кроутер Дж. 22, 92
Кудряшов Ю.Б 26, 28, 201, 203, 218, 249, 302, 340, 348, 362, 383
Кудряшова Н.Ю. 265, 268
Кузин А.М. 24, 30, 241, 305, 306, 309,
310, 322, 348
Кулинский В.И. 248
Кюри Мария 17, 35
Кюри Пьер 17
Лангендорф X. 25
Ли Д.Е. 22, 75, 78, 92, 173, 381
Либинзон Р.Е. 276
Литвин Ф.Ф. 217, 307
Ломанов М.Ф. 11, 44, 78
Лондон Е.С. 17, 18, 19
Лось Л.А. 357, 359
Лучник Н.В. 290, 383
Люкки Т.Д. 305, 309
Мазурик В.К. 11, 30, 226, 287, 299,
302, 362
Мамихин С.В. 11, 102
Мернетт Л. Дж. 220, 383
Мёллер Г. 21
Микоян В.Д. 238
Михайлов В.Ф. 11, 302, 362
Михайлова Л.П. 306
Моссэ И.Б. 329
Надсон Г.А. 21
Насонов Д.Н. 317
Нейфах Е.А. 28
Неменов М.И. 19
Нернст В. 197
Носкин Л.А. 355
Обатуров Г.Н. 109, 112, 122,
Окада Ш. 176, 187, 212, 273, 302
Острецов И.Н. 12
Очинская Г.К. 363
Пальмина Н.П. 28
Парибок В.П. 31
Патт X. 25
Пелевина И.И. 12, 313, 325, 362
Перов С.Ю. 12
Петко А. 313, 314, 344
Петровский А.М. 119
Петрусевич Ю.М. 307
Платцман Р.Л. 84, 136, 140, 147, 171
Планель X. 305
Платонов А.Г. 12
Поверенный А.М. 30, 299
Померанцева М.Д. 312
Попа Ф. 306
Пурселл Э. 216
Рентген В.К. 17, 17, 35
Реутов В.П. 230
Ризниченко Г.Ю. 12, 104
Ромайя Л.Х. 312
Романовский Ю.М. 104
Романцев Е.Ф. 30, 276
Рощупкин Д.И. 28
Рубин А.Б. 12, 104
Рысина Т.Н. 276
Рябченко Н.И. 30, 276
Савич А.В. 190, 191, 196
Саган Л. 24
Саенко А.С. 351
Самуилов В.Д. 277
Саттон Е. 292, 294
Селье Г. 316, 317, 360
Семенов Н.Н. 27, 198
Сетлоу Р.Б. 255
Синклер У.К. 274
Скулачев В.П. 30, 232, 247, 279, 289
Смирнова О.А. 115
Сорокина Е.Г. 230
Сорокина Н.И. 276
Спитковский Д.М. 11, 259, 260, 280,
329, 355, 355
Степанова Н.В. 104
Суворов Н.Н. 25
Тарусов Б.Н. 10, 27, 28, 198, 218,
219, 241, 307, 343
Тарханов (Тарханишвили) И.Р. 17
Терещенко О.Я. 299
Тимофеев К.Н. 12
Тимофеев-Ресовский Н.В. 22, 91, 92,
332, 381
Тихонов А.Н. 44
Тобайес К.А. 101
Толмач Л.Дж. 293
Трибондо Л. 19, 269
Уманский С.Р. 30, 276
Федорова Т.А. 299
Федоровский Л.Л. 300
Федотова М.И. 299
Филиппов Г.С. 21
Филиппович И.В. 30, 276, 302, 313
Филипс P.O. 293
Флиднер Т.: 298
Фонг К.: 228
Хартвелл Л. 281
Хансон К.П. 30, 258, 276, 302
Хейнеке Г. 18
Хесин Р.Б. 378
Хуг О. 103, 110, 389
Циммер К.Г. 22, 92, 95, 217
Циркль Р. 101
Цыб А.Ф. 326
Челак В. 344
Чернавский Д.С. 12, 104, 119, 121
Шарпатый В.А. 12
Шило А. 12
Щербова Е.И. 300
Эйдус Л.Х. 31, 162, 302, 340, 345,
347, 390
Элкинд М.М. 292
Эмануэль Н.М. 27, 198, 219
Эрв А. 25
Юнг X. 69, 183
Ярмоненко С.П. 9, 25, 99, 300
Ятвин М. 343
Учебное издание
КУДРЯШОВ Юрий Борисович
РАДИАЦИОННАЯ БИОФИЗИКА(ИОНИЗИРУЮЩИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ)
Редакторы Е.Н. Гончаренко, Р.А. Бунатян
Оригинал-макет: А.М. ШироковОформление переплета: А.А. Логунов
ЛР №071930 от 06.07.99. Подписано в печать 17.11.03.
Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 28. Уч.-изд. л. 30,8. Заказ №
Издательская фирма «Физико-математическая литература»МАИК «Наука/Интерпериодика»
117997, Москва, ул. Профсоюзная, 90
E-mail: fizmat@maik.ru, fmlsale@maik.ru
http://www.fml.ru
Отпечатано с готовых диапозитивов в ПФ «Полиграфист»160001, г. Вологда, ул. Челюскинцев, 3Тел.: (8172) 72-55-31, 72-61-75, факс: (8172) 72-60-72E-mail: form.pfp@votel.ru http://www.vologda/~pfpv
ISBN 5-9221-0388-1
3. Международная система единиц СИ
В 1960 г. на Генеральной конференции по мерам и весам в Париже принята Международная система единиц измерения (Systeme International, сокращенно SI, или Система Интернациональная — СИ). В СССР она введена в 1963 г. в качестве государственного стандарта (ГОСТ). В научно-технической литературе системные и внесистемные единицы измерения встречаются и сейчас, поэтому мы приводим и те и другие, а также будем приводить соотношения между ними. Кроме обычных единиц удобно употреблять кратные или дольные их значения (табл. 1.1).
Для оценки эффективности действия ионизирующих излучений на физический или биологический объект принято учитывать:
- активность нуклида в радиоактивном источнике,
*) Следует отметить, что жесткие физические воздействия на клетки, например, замораживание, могут привести клетки к гибели и без облучения. В связи с этим в таких экстремальных опытах по оценке радиочувствительности эксперименты проводили, по возможности, в щадящих клетки условиях физических воздействий (например, содержание клеток в глицерине при замораживании и т. д.).
14*
****) Один из циклинов семейства белков-инициаторов продвижения клеток по циклу; новое название — CCNB1).
УДК 539.16
ББК 22.383
К 88
Кудряшов Ю. Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения) / Под ред. В.К. Мазурика, М.Ф. Ломанова. — М.: ФИЗМАТЛИТ, 2004. - 448 с. - ISBN 5-9221-0388-1.
В учебнике последовательно описываются этапы развития лучевого поражения биологических систем от первичной стадии поглощения энергии ионизирующих излучений биомолекулами до гибели клетки и организма. Специальная глава посвящена вопросу единиц измерения доз и мощностей доз облучения биологических объектов и систем. Значительное внимание уделено современным представлениям о механизмах действия ионизирующих излучений на клетку и организм в больших и малых дозах. Проблема радиационной биофизики в настоящее время особенно актуальна в связи с последствиями чернобыльских событий и других радиационных аварий, а также острой необходимостью освоения читателем биологических и медицинских аспектов действия ионизирующих излучений на живые организмы и человека.
Для студентов биологов, медиков, физиков, химиков, специализирующихся по радиационной биологии и медицине, а также тех, кто работает на АЭС, на предприятиях и в учреждениях, использующих источники ионизирующих излучений и людей, проживающих в условиях повышенного фона радиоактивности.
ISBN 5-9221-0388-1ISBN 5-9221-0388-1© ФИЗМАТЛИТ, 2004
ISBN 5-9221-0388-1
ISBN 5-9221-0388-1
Предисловие автора 9
Введение 13
Глава I
Ионизирующие излучения, их характеристика,дозиметрия и дозовые величины
Виды ионизирующих излучений, их энергия 35
Линейная передача энергии излучения 36
Международная система единиц СИ 37
Единицы активности радионуклидов и доз радиации 38
Активность радионуклида 38
Доза излучения (экспозиционная доза) 40
Доза облучения (поглощенная доза) 41
Методы дозиметрии 43
Метод ионизационной камеры 43
Калориметрический метод 43
Сцинтилляционный метод 44
Химические методы дозиметрии 44
Эквидозиметрия и концепция риска 44
Качество излучения 45
Эффективная доза облучения 47
Ожидаемые индивидуальные дозы 47
Концепция риска облучения 48
Глава II
Поглощение энергии ионизирующих излучений
Общий принцип Гроттгуса. Дискретный характер поглощения энергии ионизирующих излучений 54
«Энергетический парадокс» в радиобиологии 55
Относительная биологическая эффективность (ОБЭ) разных видов ионизирующих излучений 56
Механизмы процессов поглощения энергии излучений 58
Поглощение рентгеновского и у-излучений 58
Поглощение нейтронного излучения 64
Ионизация в тканях косвенно ионизирующими частицами . . .66
Поглощение ускоренных заряженных частиц 68
Пространственное распределение ионов 73
Ионизация в тканях при действии тяжелых заряженных частиц 75
Ионизация в тканях при действии ускоренных электронов . .77
Локальные характеристики поглощения энергии веществом. Проблемы микродозиметрии (М. Ф. Ломанов) 78
Зависимость ОБЭ от локального распределения энергии излучения 81
Моделирование в микродозиметрии 84
Глава III
Зависимость биологического эффекта от поглощеннойдозы излучения
Принцип попадания и концепция мишеней 87
Зависимость «доза-эффект». Количественные закономерности 87
Кривые «доза-эффект» 88
Гипотеза «точечного нагрева» 90
Принцип попадания и концепция мишеней 92
Одиночные и множественные попадания в мишень 92
Попадания в мишени и гибель облученных клеток 99
Математическое моделирование радиобиологических эффектов (С. В. Мамихин) 102
Краткое описание метода математического моделирования и его применение в биологии 103
Типы моделей 104
Подтипы моделей 106
Специфика моделирования в радиационных исследованиях . . 108
Эволюция математических моделей, описывающих инактивацию облученных клеток 110
Некоторые нетрадиционные подходы к построению радиобиологических моделей 112
Имитационное моделирование в радиобиологии 112
Стохастические модели, основанные на теории марковских случайных процессов 113
Примеры построения радиобиологических математических моделей 115
Моделирование нарушений системы гемопоэза при лучевом поражении 115
Клеточные модели, применяемые врадиотерапии 119
Разноуровневые(«системные») модели 122
Глава IV
Прямое действие ионизирующих излучений
О прямой и непрямой радиационной инактивации макромолекул .126
О структурных повреждениях и радиационной инактивации макромолекул 127
Феноменологический анализ радиационного повреждения макромолекул 128
ЗЛ. Прямое действие излучения на ферменты 129
Прямое действие излучения на нуклеиновые кислоты 132
Инфекционность нуклеиновых кислот 132
Трансформирующая активность 132
Затравочная активность ДНК 133
Способность ДНК к образованию гибридов с мРНК 133
Способность транспортных РНК связывать соответствующие аминокислоты 134
Функциональная активность рибосом 134
Последовательность стадий прямого действия радиации 136
Первичные физические процессы 137
Первичные продукты радиационного превращения молекул 139
Физико-химическая стадия действия излучения 144
Сверхвозбужденные молекулы 146
Ионизированные молекулы 146
Судьба электронов, испущенных молекулой 147
Последовательность образования промежуточных активных частиц 148
Химическая стадия 149
Структурные повреждения, возникающие в облученных макромолекулах 149
Миграция энергии излучения в биологических структурах . 157
Модификация лучевого повреждения макромолекул 160
Модифицирующее действие кислорода 161
Кислородное последействие 162
Влияние температуры во время прямого действия радиации . 163
Температурное последействие 163
Роль молекул-примесей 164
Глава V
Непрямое действие ионизирующего излучения
Общая характеристика непрямого действия ионизирующих излучений на макромолекулы в водных растворах 169
Биофизический анализ радиационной инактивации молекул в растворах 171
Радиационно-химические превращения молекул воды 171
Роль продуктов радиолиза воды в инактивации биоорганиче- ских молекул 176
Реакции радикалов органических молекул, ведущие к образованию стабильных продуктов 178
Количественные характеристики непрямого действия радиации в водных растворах. Эффект Дейла 180
Модификация радиолиза молекул в водных растворах 182
Радиационно-обусловленные изменения и радиочувствительность биоорганических молекул в растворах 185
Радиационно-обусловленные изменения молекул 185
Изменения белковых молекул (ферментов) 185
Радиационно-химические изменения нуклеиновых кислот . . 187
О радиационно-химических изменениях фосфолипидов . . . 189
Радиочувствительность биомолекул 190
Радиочувствительность белков 191
Радиочувствительность нуклеиновых кислот 193
Радиочувствительность фосфолипидов 195
Сравнительная оценка радиочувствительности 196
Непрямое действие радиации в липидных растворах 197
Цепные свободнорадикальные реакции перекисного окисления в облучаемых липидах 197
Стадия инициирования цепи 198
Стадия развития цепной реакции (продолжение цепи) . . . . 199
Стадия обрыва цепи 199
Коррекция цепных реакций 200
Роль свободных радикалов липидов в непрямом эффекте инактивации биоорганических молекул 201
Глава VI
Реакции клетки на действие ионизирующих излучений
От изолированных молекул к клетке 206
Об усилении первичных молекулярных повреждений 210
Прямое и непрямое действие излучений в клетках 211
Свободные радикалы в облученной клетке и методы их определения 214
Система окислительно-восстановительного гомеостаза клетки и ее изменения после облучения 220
Активные кислород-содержащие соединения — образование и
биологическое действие в клетке в норме и после облучения . 221
Активные формы кислорода 224
Активные соединения азота 229
Продукты цепных реакций перекисногоокисления липидов 232
Окислительные процессы в облученнойклетке 238
Радиотоксины 239
Оксиаддукты ДНК 242
Антиокислительные механизмы защиты облученной клетки . 243
Снижение содержания молекулярного кислорода и АФК . . 243
Снижение уровня и активности радиотоксинов 247
Повреждения и процессы восстановления ДНК в облученной клетке 250
Повреждения ДНК 251
Повреждения ДНК при внешнем облучении клетки 252
Повреждения ДНК при внутреннем облучении 252
Репарация ДНК от повреждений 254
Л. Ранние исследования 255
.2. Репарация ДНК от повреждений в облученной клетке (Д. М. Спитковский) 259
Некоторые представления о надежности генома 264
Повреждения и процессы восстановления ДНК-мембранного комплекса в облученной клетке (Н. Ю. Кудряшова) 265
Повреждения ДНК-МК 266
Процессы восстановления ДНК-МК 267
Механизмы гибели и процессы восстановления клеток от радиационного поражения 269
Два типа гибели облученных клеток — различия в зависимости от стадии клеточного цикла 269
Репродуктивная и интерфазная гибель облученных клеток . 269
Модификация лучевого поражения клеток 272
О механизмах радиационной гибели клеток 275
Механизм некротической гибели клеток (некроза) 279
Механизмы апоптоза 280
Общий биологический закон самоликвидации — биологический смысл апоптоза 289
Процессы восстановления облученных клеток 290
Глава VII
Биологические эффекты малых доз ионизирующихизлучений. Отдаленные последствия облучений
Лучевые реакции многоклеточных организмов 296
От больших (летальных) доз облучения к малым (нелегальным) дозам 296
Характеристика биологических эффектов облучения в малых дозах 305
Значение ультрамалых мощностей доз естественного радиационного фона 305
Эффект воздействия излучений в сверхмалых дозах. Гиперрадиочувствительность 307
Радиационный гормезис 308
Некоторые особенности действия радиации в нелегальных дозах 310
Радиационно-индуцированный адаптивный ответ 311
Зависимость наблюдаемых изменений от мощности дозы излучения. Эффект Петко 313
Общая неспецифическая реакция организмов на облучение . . 316
Стресс 316
Синдром липопероксидации 318
Отдаленные последствия облучения организмов 319
О количественной оценке биологического действия излучений в малых дозах 321
О биологических критериях (показателях), используемых для оценки эффектов малых доз 323
Биофизический подход в оценке диапазона малых доз по характеру поглощения энергии излучений (Д. М. Спитков- ский) 329
Анализ прохождения частицы через гетерогенную структуру клетки 330
Диапазоны доз, отличающихся по событиям поглощения энергии (малые, низкие и средние дозы) 333
Механизмы действия ионизирующих излучений в малых дозах на клетки 339
Мембраны в механизме действия радиации в малых дозах . . 341
Биологические мембраны — особый принцип организации структур в живых системах 341
Радиочувствительность мембран. Гиперрадиочувствительность 342
«Эффект свидетеля» («bystander effect») 346
Мембранный механизм индукции радиоадаптивного ответа . 348
Неспецифическая реакция биомембран и клеток на действие ионизирующих излучений 356
Неспецифическая реакция биологических мембран 356
Стадии неспецифической оксидативной реакции клетки . . . 360
Радиационно-индуцированная нестабильность генома (В. К. Мазурик, В. Ф. Михайлов) 362
Варианты проявления нестабильности генома 363
Соматические клетки и спонтанные мутации 363
В-лимфоциты — представители клеток с функциональной нестабильностью генома 366
Перманентная (генетически наследуемая) нестабильность генома 367
Характеристика некоторых проявлений радиационно-индуцируемой нестабильности генома 368
Эпигенетическое наследование при радиационно-индуцированной нестабильности генома 369
Возможная роль «эффекта свидетеля» 371
Механизмы реализации нестабильности генома 374
Биологическое значение радиационно-индуцированной нестабильности генома 377
Заключение 379
Рекомендованная литература 394
Материалы международных конгрессов, съездов, конференций по радиобиологии 414
Список сокращений, символов и некоторых условных терминов . . . . 417
Предметный указатель 421
Указатель имен 440