Предисловие

Непрекращающийся поток публикаций, посвященных все еще загадочному витамину С, снова и снова возвращает мою память к волнующим дням шестидесятилетней давности. Это было время глубоких перемен. Изучение структуры органических молекул перестало быть только „химией в пробирке", которой так блистательно владели сэр Роберт Робинсон и его ученики. Начиналась эпоха инструментальных методов анализа: УФ-спектроскопии, дисперсии оптического вращения и рентгеноструктурного анализа. Биохимия как отдельная наука только находилась в стадии становления благодаря усилиям таких исследователей, как профессора Г. Хопкинс, А. Харден и Г. Рейстрик.

Не всегда по достоинству оценивают тот факт, что значительной частью своих успехов в химии углеводов профессор Хеуорс обязан микроаналитическому методу анализа, разработанному Преглем. В 1925 г. из Бирмингема в Прагу был направлен X. Дру для освоения этой методики; вернувшись обратно, он привез знаменитые кульмановские весы и другие приборы. С тех пор 5 мг метилированного углевода было вполне достаточно для анализа. Это обстоятельство имело большое значение, учитывая ограниченную доступность витамина С. Другим нововведением Хеуорса стало создание коллектива, названного им „синдикат", который был способен выполнить поставленную задачу. Каждый исследователь разрабатывал свою узкую тему, концентрируясь на отдельной стадии синтеза или деградации. Лаборатория работала с большим напряжением, так как было известно, что конкуренты в Европе — профессора Каррер, Рейхштейн и Мичел — имеют достаточное количество материала и очень близко подошли к установлению структуры. Хеуорс, предвидя потенциальные возможности рентгеноструктурного анализа, в 1928 г. уговорил К. Г. Кокса (сейчас сэр Гордон) начать работу по выяснению структуры углеводов. Очень быстро Коксу удалось продемонстрировать, что в молекуле витамина С атомы углерода и кислорода лежат в одной плоскости, и подтвердить, что это действительно углевод.

Летом 1933 г. я провел шесть недель в лаборатории BDH на Грэхем-стрит в Лондоне, изучая возможности наработки витамина С в промышленном масштабе. С тех пор полученные тогда 0,5 кг витамина хранятся в нашем музее. Вскоре, однако, был разработан замечательный пятистадийный синтез Рейхштейна и Грюссне- ра, ключевой стадией которого является биологическое окисление D-сорбита в L-сорбозу. Этот процесс и стал основой промышленного производства витамина С, осуществляемого и сегодня, за что следует отдать должное блестящим химикам и технологам Roche Company. Несколько лет назад я видел впечатляющее хранилище, вмещавшее 30 т глюкозы и горы стокиллограмовых полиэтиленовых пакетов с прекрасным кристаллическим витамином С, ждущих отправки на экспорт. Производство продолжает расти.

При написании этой книги авторы скрупулезно обобщили достижения последних лет в области изучения витамина С. Необыкновенно увлекательна глава, содержащая исторические сведения о цинге. Удивительно, что победа над этим заболеванием заняла так много времени, когда ответ буквально лежал на поверхности. Все разделы хорошо проработаны и ясно изложены. Весьма важны и интересны медицинские аспекты использования витамина С.

Если все утверждения о биологической значимости и целебных свойствах этой простой, но загадочной молекулы верны, то мы имеем в руках нечто такое, что напоминает жизненный эликсир, который так долго искали алхимики древности! Однако авторы предостерегают нас от чрезмерного увлечения большими дозами витамина С. Человеческий организм настолько индивидуален, что порой ожидаемая польза может обернуться непоправимым злом.

Я с большим удовольствием прочитал рукопись и горячо рекомендую ее самому широкому кругу читателей, и особенно молодым ученым, ищущим источники творческого вдохновения.

Проф. М. Стейси Бирмингем, 1991

Предисловие авторов

Еще ни одна книга не была написана без объединения усилий многих людей. Мы благодарны членам наших семей за проявленную к нам терпимость во время написания этой книги. Мы весьма признательны М. Хо, которая оказала неоценимую помощь в оформлении рукописи, терпеливо разбирала наши практически нечитаемые каракули и не жаловалась даже тогда, когда в самый последний момент мы продолжали вносить изменения в текст. Мы благодарны Р. Мортимеру, Й. Фиддесу и П. Лоуингу, взявшим на себя труд по прочтению рукописи и сделавшим ряд ценных критических замечаний, а также нашим коллегам по работе, особенно Дж. Хадсону, за плодотворное обсуждение исторических аспектов. Мы также признательны Э. Констеблю за ценные рекомендации при подготовке рисунков.

Считаем своим приятным долгом выразить особую благодарность проф. М. Стейси, чьи впечатления непосредственного участника событий, развивавшихся вокруг витамина С в тридцатые годы, украсили книгу увлекательными подробностями.

Весьма полезны были советы и помощь П. Картера (Schering Ltd.), К. Кондита и Д. Годфри (Roche Products Ltd.), П. Скелтона (University Chemical Laboratories, Cambridge) и Б. и К. Робинсонов (Media Production, Anglia Polytechnic).

И, наконец, следует отдать должное всем, кто на протяжении последнего столетия занимался исследованиями витамина С, всем авторам сотен статей и книг, которыми мы пользовались при написании этой работы.

Мы приносим свои извинения тем, кого забыли упомянуть. Все неточности в этой книге лежат целиком на совести ее авторов, хотя мы постарались свести их число к минимуму.

О витамине С слышал каждый. Лишь немногие из простых органических молекул возбуждают такой всеобщий интерес. Частично это объясняется тем благотворным влиянием на человеческий организм, которое оказывают все витамины и ряд других веществ в малых дозах. Их значимость особенно проявилась в последние годы в связи с негативным действием на здоровье человека целого ряда соединений, особенно пищевых добавок. Общеизвестно, что витамины необходимы для поддержания хорошего самочувствия. Вследствие этого многим из них приписываются целебные свойства, что не всегда соответствует действительности. О витамине С зачастую говорят как о почти магическом средстве, именно поэтому полезно привести полную картину химии и биохимии этого загадочного соединения.

Витамин С отличается от всех других витаминов, и, как мы убедимся по ходу изложения, химия и биохимия этого соединения делают его во многих аспектах просто уникальным. Витамин С вездесущ: он найден и в животном, и в растительном мире, причем его роль часто не вполне ясна. Синтетический витамин широко используется в качестве пищевых добавок и, следовательно, имеет Е number (Е300). Однако присутствие витамина С в пище ни у кого не вызывает возражений,чего нельзя сказать о многих других пищевых добавках. Несомненно, что его антиокислительные свойства способствуют сохранности продуктов питания.

Витамин С стал предметом дискуссий еще задолго до того, как была установлена его природа. Его роль (в качестве компонента овощей и фруктов) в лечении и профилактике цинги широко дебатировалась на протяжении столетий. И даже само его существование подвергалось сомнению вплоть до начала XX в. Спорным является и вопрос о том, кому принадлежат лавры первооткрывателя. Даже сегодня не прекращается полемика о значении витамина С для здоровья человека, а также об оптимальных дозах витамина, которые следует принимать: рекомендации различных авторов колеблются от 30 мг до 10 г в день. Его роль в лечении

простудных заболеваний, в улучшении состояния раковых больных и другие медицинские аспекты являются темами оживленных дискуссий. Биохимия витамина С у млекопитающих настолько далека от понимания, что даже до сих пор его биохимическая роль в таких системах остается неясной. Химическая структура L-аскорбиновой кислоты однозначно определена методом рентгеноструктурного анализа монокристаллического образца, однако структура продукта ее двухэлектронного окисления — дегидро- аскорбиновой кислоты — окончательно не установлена, так как до сих пор не удалось получить это соединение в чистом виде в кристаллическом или хотя бы в твердом состоянии.

В химическом отношении витамин С является простейшим среди витаминов, поэтому он был одним из первых соединений этого класса, которое удалось выделить в индивидуальном состоянии, очистить и всесторонне охарактеризовать, в том числе и структурно. Витамин С производится в больших количествах, чем какой- либо другой из витаминов или все остальные витамины, вместе взятые. Это одно из немногих чистых химических веществ, которое потребляется человеком в граммовых количествах (возможным конкурентом является сахар). Витамин С не оказывает никаких вредных воздействий даже в таких больших дозах, и, наконец, это лекарство просто приятно принимать, особенно в виде фруктов и овощей.

Можно подумать, что после всесторонних исследований на протяжении многих лет эта простая молекула уже ничем не может удивить. Тем не менее конференции, посвященные химии витамина С, собирают большое число участников, и каждый раз всплывают все новые и новые аспекты. Причина незатухающего интереса к химии витамина С объясняется тем фактом, что, несмотря на простоту молекулы, наличие в ней ендиольной группировки создает основу для сложных окислительно-восстановительных процессов с участием стабильных промежуточных радикалов, на которые сильно влияют свойства кислотных групп самой молекулы. Давно было известно, что L-аскорбиновая кислота легко окисляется кислородом воздуха. Первый продукт этой реакции, дегидроаскорбиновая кислота, еще сохраняет антискорбутное действие, но дальнейшее окисление приводит к необратимому распаду витамина. Механизм всех стадий этого процесса остается до конца невыясненным, несмотря на пристальное изучение. Недавно появилось много работ, посвященных взаимодействию витамина С с ионами металлов, особенно с ионами переходных металлов. Это открыло новые возможности в работе с ь-аскорбиновой кислотой, теперь не только в качестве сильного восстановителя,

но и в качестве комплексообразующего агента. Действительно, окисление L-аскорбиновой кислоты кислородом или другими окислителями катализируется ионами переходных металлов, особенно Си(П), поэтому растворы витамина С иногда стабилизируют добавлением ЭДТА, которая образует комплексы с ионами металлов и таким образом ингибирует катализ. Иногда витамин С участвует в биохимических процессах не в одиночку, а совместно с другими веществами, например с витамином Е. Исследования в области витамина С достигли, по-видимому, некоего стабильного уровня. В 1969, 1979 и 1989 гг. ежегодно публиковалось примерно одинаковое количество работ, посвященных различным аспектам химии L-аскорбиновой кислоты. Таким образом, в течение последних двадцати лет интенсивность исследований сохраняется на постоянном уровне, и пока нет ни малейшего признака снижения интереса к этому соединению. '

Развитие аналитических методов обнаружения и количественного определения имело решающее значение для выявления витамина С в природе И изучения его стабильности. Применявшиеся первоначально биологические методы постепенно были вытеснены химическими вследствие простоты, большей чувствительности, селективности и воспроизводимости последних. Многие успешно используемые сегодня методы анализа основаны на применении высокоэффективной жидкостной хроматографии. Однако возможности этих методов применения ограничены относительно низкой чувствительностью обнаружения дегидроаскорбиновой кислоты в присутствии ь-аскорбиновой кислоты, что значительно затрудняет количественное определение дегидроаскорбиновой кислоты в животных и растительных тканях. Ситуация аналогична и в случае продуктов дальнейшего окисления. Поэтому существует настоятельная необходимость в совершенствовании методов обнаружения этих соединений, что позволило бы изучать механизм и кинетику окисления L-аскорбиновой кислоты в овощах и фруктах, определяя количество всех продуктов окисления.

Как известно, аскорбиновая кислота применяется в качестве компонента фармацевтических препаратов. Обычно она используется не в чистом виде, а в смесях с другими веществами, которые часто добавляются просто для улучшения вкуса. Однако большие количества аскорбиновой кислоты используются в целях, которые не так широко известны. Во многих работах было продемонстрировано ее воздействие на рост растений, в частности на прорастание семян и рост корней. Опрыскивание раствором аскорбиновой кислоты эффективно защищает растения от вредного влияния озона, образующегося в процессе фотолиза некоторых компонентов

загрязненной атмосферы, особенно в больших городах. Витамин С находит применение и в качестве добавки к кормам для домашних животных, хотя большинство из них способны его биосинтезировать. У рыб, неспособных к биосинтезу аскорбиновой кислоты, недостаток этого витамина проявляется в виде „синдрома сломанного хребта11: наблюдаются его искривление, нарушения в синтезе коллагена, задержка роста и другие симптомы. Таким образом, развитие прудового рыбоводства требует все больших количеств аскорбиновой кислоты.

Говоря об использовании L-аскорбиновой кислоты в пищевой промышленности, можно условно выделить два направления:

В качестве пищевой добавки с целью повышения питательности. Добавление L-аскорбиновой кислоты компенсирует потери витамина в процессе приготовления пищи либо просто повышает природное содержание витамина. Так, добавление L-аскорбиновой кислоты во фруктовый сок усиливает то, что заложено природой, а добавление в искусственные фруктовые напитки улучшает вкус и повышает питательность.

Добавление L-аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта повышает кислотность продуктов и увеличивает срок их хранения.

Свежее мясо обязано своим характерным красным цветом присутствию таких комплексов железа, как миоглобин. Технологический процесс приготовления мясных продуктов включает добавление нитритов, что позволяет сохранить цвет мяса вследствие реакции оксида азота с миоглобином. Добавление аскорбиновой кислоты также улучшает цвет, вкус и запах мясных продуктов, а также снижает количество используемых нитритов. Кроме того, практически случайно было обнаружено, что аскорбиновая кислота в одиночку или в комплексе с токоферолом ингибирует образование канцерогенных нитрозосоединений, не препятствуя в то же время подавлению нитритом опасного микроорганизма Clostridium botulinum.

L-Аскорбиновая кислота широко применяется в хлебопечении в качестве разрыхлителя теста. Практически это приводит к улучшению качества и увеличению объема выпекаемого хлеба, повышению эластичности и рыхлости теста. При хранении хлеб не засыхает, так как улучшается поглощение влаги. Более того, срок хранения хлеба увеличивается, поскольку мука с добавкой L-аскорбиновой кислоты по своим пекарским характеристикам приближается к муке высшего сорта. Утешительно сознавать, что продуктами разложения L-аскорбиновой кислоты в процессе хлебопечения являются углекислый газ, L-треониновая кислота

и 2,3-дикетогулоновая кислота, но ни в коем случае не щавелевая кислота. Во многих странах это единственный разрыхлитель, использование которого разрешено. Все другие используемые разрыхлители теста являются окислителями, как, например, бромат калия; ь-аскорбиновая кислота — единственный восстановитель, используемый для этой цели. Механизм действия витамина С все еще остается тайной. Ясно, что в процессе приготовления теста ь-аскорбиновая кислота превращается в стабильную деги- дроаскорбиновую кислоту.

В некоторых странах установлены максимально допустимые количества ь-аскорбиновой кислоты, добавляемые в качестве разрыхлителя. Величины колеблются от 200 мг/кг в Канаде до 20 мг/кг в Уругвае.

Другими областями промышленного применения ь-аскорбино- вой кислоты являются реакции полимеризации, фотография, технология обработки металлов и даже внутривагинальная контрацепция. В большинстве этих применений использование ь-аскор- биновой кислоты в той или иной мере основано на ее восстановительных свойствах.

L-Аскорбиновая кислота обнаружена у всех представителей растительного мира, во всех частях растений, и часто в достаточно больших количествах. Биохимия витамина С у растений до конца не выяснена. Существует точка зрения, что L-аскорбиновая кислота — просто вторичный продукт клеточного метаболизма растений. Невероятно, чтобы такое вездесущее в растительном мире соединение оказалось там почти случайно в качестве побочного продукта каких-то процессов! Ну а если это действительно так — эта случайность обернулась удачей.

Существует экспериментальное доказательство того, что ь-аскорбиновая кислота является основным предшественником винной кислоты, содержащейся в винограде. Так, если незрелый виноград подкармливать ь-аскорбиновой кислотой, меченной 14С в положении С-1, 72% введенной метки локализуется на атоме углерода карбонильной группы винной кислоты. Показано, что атомы углерода с С-1 по С-4 ь-аскорбиновой кислоты участвуют в построении молекулы винной кислоты; если же пометить положение С-6, можно зафиксировать отсутствие радиоактивной метки в винной кислоте. Однако процесс вызревания винограда отнюдь не прост. Он зависит от множества факторов, включая и развитие лозы, причем протекает по-разному в разных частях растения. Аналогичным образом было показано, что, например, у герани, конечным продуктом биосинтетического цикла является оксалат. Многие растения способны аккумулировать относитель-

но большие количества щавелевой кислоты, иногда даже в виде кристаллов оксалата кальция. Самым известным аккумулятором оксалата является ревень. Очевидно, у этих растений щавелевая кислота также имеет своим предшественником L-аскорбиновую кислоту. Биосинтез самой L-аскорбиновой кислоты из D-глюкозы у растений осуществляется посредством биохимических процессов, отличных от тех, которые имеют место у животных, способных к ее биосинтезу. У растений цикл биохимических превращений включает окисление глюкозы по С-1, эпимеризацию по С-5 и сохранение гидроксиметильной группы при С-6.

Как теперь известно, процесс фотосинтеза, жизненно важный для всего живого на Земле, представляет собой сложную цепь биохимических превращений, но до сих пор содержит ряд неясностей. Установлено, что молекулярный кислород необходим для развития жизни, но в больших концентрациях оказывает неблагоприятное воздействие на целый ряд важных биохимических процессов, в том числе на процесс фотосинтеза, ингибируя работу хлоропластов. При освещении хлоропластов может происходить распад таких кислородсодержащих соединений, как пероксид водорода, с образованием атомарного кислорода. Полагают, что присутствие L-аскорбиновой кислоты в растениях препятствует этому процессу, так как подавляет действие сильных окислителей.

Продолжаются споры на тему о биохимической роли L-ac- корбиновой кислоты у животных, о причинах ее высокой концентрации в растениях, а также о том, кто первый открыл и выделил витамин С. Интерес к химии этого соединения не ослабевает, и, несомненно, будет сделано еще немало открытий. Однако для большинства людей наиболее интересными и спорными остаются вопросы использования витамина С в медицине. В каких количествах следует его принимать? Помогает ли он при простуде? Оказывает ли он положительный эффект в терапии рака? В подобных спорах лучше всего утверждать только то, что известно наверняка. Ясно, что витамин С жизненно важен для образования полноценного коллагена и потому способствует заживлению ран. Только по одной этой причине полезно принимать витамин в количествах, гораздо больших, чем это рекомендуется при цинге. С другой стороны, значительное увеличение дозы не способствует усилению положительного эффекта. Даже витамины не стоит глотать десятками грамм! Нас часто спрашивают: какова же оптимальная ежедневная доза? Все вышеизложенное и есть ответ на этот вопрос.

Глава 2. Исторический очерк.

Роль витамина С в профилактике и лечении цинги

Ничто другое так убедительно не свидетельствует о важности витамина С для человеческого организма, как последствия его отсутствия в течение даже относительно короткого периода времени. Уже через несколько месяцев проявляются первые симптомы чрезвычайно неприятной и в конечном итоге смертельной болезни — цинги. Сегодня нам трудно понять тот ужас, который испытывали перед загадочным недугом мореплаватели в средние века. Это было только одно из множества заболеваний, от которых страдали моряки. Но в длительных морских экспедициях, становившихся все более частыми начиная с XIV в., болезнь, казалось, возникала ниоткуда, без всякой видимой причины. Когда в 1497— 1499 гг. Васко де Гама впервые обогнул Мыс Доброй Надежды, он потерял половину экипажа; с тех пор еще в течение четырех столетий цинга продолжала собирать свою смертельную дань с морских путешественников.

Что же это за болезнь? Определение из учебников было бы примерно таким: болезнь, вызывающая кровотечение в тканях, кровоточивость десен, потерю зубов, анемию и общую слабость. Однако свидетельства очевидцев доносят до нас более отталкивающую картину. Так, Томас Стивенс в 1579 г. писал с корабля, идущего из Лиссабона в Гоа:'

„... Десны распухают до огромных размеров... ноги отекают, все тело болит и настолько цепенеет, что невозможно шевельнуть ни рукой, ни ногой, и смерть наступает от слабости; или их слабит и лихорадит, и они умирают от этого... “

Отец Антонио де ля Асенсьон записал в своем дневнике во время экспедиции вдоль побережья Калифорнии в 1602 г.:

„... Первый отмечаемый симптом — боль во всем теле при малейшем прикосновении... все тело, особенно ниже талии, покрывается красными пятнами... Чувствительность тела больных настолько велика, что ... лучшая помощь, которая может быть им оказана, — это не касаться даже их постельного белья... верхние и нижние десны распухают с обеих сторон до таких размеров, что зубы невозможно сомкнуть. Зубы, лишившиеся опоры, настолько расшатываются, что движутся при пово-

роте головы... силы покидают их, и они умирают совершенно внезапно, замолкнув на полуслове".

Сегодня известно, что цинга — болезнь, вызванная недостатком витаминов, и, очевидно, она сопутствовала человечеству на протяжении всей его истории. Однако только длительные морские путешествия раннего средневековья привлекли к ней особое внимание, хотя любые бедствия, сказывающиеся на снабжении продовольствием (например, осада), должны были бы также приводить к росту заболеваемости цингой. Очевидно, можно выделить по крайней мере три основные причины, препятствовавшие выявлению лекарственного средства против цинги:

Недостаток информации в древней медицине

Тот факт, что потребление цитрусовых излечивает цингу, скорее всего был известен еще задолго до описываемых событий. Винслоу и Дюран-Рейнолс ссылались на испанский медицинский трактат XIII в., в котором апельсиновый и лимонный соки рекомендовались в качестве целебного средства для больных, страдающих цингой. Подобные рекомендации встречались на протяжении и последующих четырех столетий, но так и не получили должного распространения, так как нигде в мире широкие слои населения не читали ученых трактатов. Потребовалось невероятно долгое время для того, чтобы то, что сегодня настолько очевидно, было признано официальной медициной.

Нестабильности витамина С

В последующих главах мы рассмотрим химизм окисления витамина С. Давно было известно, что антискорбутное действие овощей и фруктов снижается при их хранении вледствие потери витамина С из-за множества окислительно-восстановительных процессов под действием кислорода воздуха. Этот факт препятствовал использованию овощей, фруктов и фруктовых соков для профилактики и лечения цинги вплоть до начала XX в.

Статистика заболеваемости

Цинга воспринималась как болезнь относительно узкого слоя населения. Считалось, что она не поражает богатых и известных людей. Но позже мы увидим, что в зимние месяцы случаи заболевания отмечались и среди аристократов. Более того, заболевали даже члены королевских семей, хотя цингу тогда еще и не умели распознавать. Цингой редко болели горожане. Все это в совокупности с отсутствием понимания патологии означало, что цинга не была „модной" болезнью, владевшей умами медицинских светил.

Один из первых отчетов о лечении цинги можно найти в работе Хаклита „Принципы навигации”, опубликованной в 1600 г. Автор описывает события, происходившие в экспедиции Жака Кортье на остров Ньюфаундленд в 1535 г.

„Некоторые совсем обессилили... у других вся кожа от лодыжек до шеи была покрыта бордовыми кровоподтеками. Изо рта несло зловонием, а десны сгнили вплоть до корней зубов, да и зубы почти все выпали. Однажды капитан, обдумывая наше печальное положение, вышел прогуляться за ворота форта. Вдруг он увидел отряд аборигенов из Ста- даконы, и среди них был Домагая. Десять-двенадцать дней назад он тоже был очень болен: у него были распухшие колени, усохшие мускулы, испорченные зубы, гниющие и зловонные десны. Увидев его живым и здоровым, капитан необычайно обрадовался, надеясь узнать, как тому удалось излечиться, и тем самым помочь своим людям. Когда отряд приблизился, капитан спросил Домагаю об этом, и тот ответил, что пил сок и отвар из листьев какого-то дерева. Тогда наш капитан спросил, не растет ли оно поблизости... Домагая послал двух женщин, они принесли десять-двенадцать веток и показали, как приготовить отвар, который следует пить каждый день. На их языке дерево называется Ammeda или Hannedew, очевидно, это был сассафрас. Капитан приказал приготовить напиток для своих людей, но никто не мог отважиться попробовать его, за исключением одного-двух человек. Глядя на них, и другие сделали то же самое. Вскоре их здоровье улучшилось, а затем наступило и полное исцеление. Как только открылась целебная сила этого лекарства, оно стало предметом непрерывной борьбы: люди готовы были поубивать друг друга, ссорясь из-за того, кто первым выпьет напиток. Дерево размером с огромный дуб за пять-шесть дней было ободрано догола. Если бы все лекари Монпелье и Ловы оказались здесь со всеми своими снадобьями, они и за год не принесли бы столько пользы, сколько одно это дерево за шесть дней. Все, кто пользовался им, милостью Божьей выздоровели".

В случае описываемых событий диагноз не вызывает сомнений. Однако основной проблемой для судовых медиков оставалось то, что моряки страдали множеством различных заболеваний, вызываемых разнообразными причинами. Они были плохо описаны, и зачастую было трудно, а то и просто невозможно поставить точный диагноз. В результате многие случаи цинги оставались нераспознанными, что затрудняло лечение.

Одно из первых описаний цинги на английском языке можно найти в первом издании (1589 г.) тех же „Принципов навигации" Хаклита, где говорится о том, что в 1582 г. на судне, возвращающемся из Магелланова пролива, два человека умерли почти у родных берегов.

Пионерами дальних морских экспедиций были испанцы и португальцы. Начало освоения Мирового океана англичанами было

положено кругосветным плаванием Дрейка в 1577-1579 гг. Так же как испанцы и португальцы, английские моряки страдали от цинги. И снова мы встречаемся со ссылками на эффективное лечение этой болезни с помощью различных фруктов и растений. Так, судовой журнал кругосветной экспедиции Томаса Кавендиша (1586 г.) пестрит упоминаниями о необходимости свежих фруктов, и в этом плавании было относительно мало случаев заболевания. Из отчета сэра Ричарда Хокинза об экспедиции 1593 г. мы можем почерпнуть сведения о том, насколько быстро настигала цинга морских путешественников. Плавание началось в апреле, а в августе, когда мореплаватели достигли экватора, часть команды уже слегла от цинги. К октябрю на судне осталось только четыре здоровых человека. Ситуацию удалось спасти в Бразилии, в то время португальской колонии, где в изобилии были апельсины и лимоны. В качестве профилактического средства наряду с цитрусовыми Хокинз рекомендовал и сильно разбавленную серную кислоту, а наибольшую пользу приписывал „воздуху земли“, ибо море есть природная среда обитания для рыб, но никак не для человека!

Несомненно, что факты исцеления цинги с помощью фруктовых соков получали все большую известность. Отчет об экспедиции сэра Джеймса Ланкастера на остров Суматра в 1601 г. недвусмысленно свидетельствует о пользе апельсинов и лимонов:

„... Причина хорошего самочувствия людей генерала кроется в том, что он приказал взять на борт бутыли с лимонным соком. Каждое утро на протяжении всего путешествия он давал каждому по три полных ложки... С помощью этого средства генерал спас многих... “

Ост-Индская компания настоятельно рекомендовала всем экспедициям, которые она финансировала, иметь среди запасов продовольствия лимонную воду. Даже в 1626 г. все еще шли споры о том, что полезнее при заболевании цингой: тамаринд или другие фрукты, но суда Ост-Индской компании неизменно снабжались фруктовыми соками.

Предполагаемые причины возникновения цинги

В этом месте стоит сделать паузу в обсуждении эволюции представлений о противоцинготных средствах и рассмотреть предполагаемые причины заболевания. Не претендуя на исчерпывающее изложение этой темы, осветим некоторые ранние теории.

Одним из самых первых предположений было то, что цинга является болезнью селезенки. Представления позднего средневековья о функционировании человеческого организма и причинах недомоганий абсолютно отличались от сегодняшних, хотя, как и теперь, полагались абсолютно верными. В медицине средних веков мало что изменилось со времен древних греков, чьи медицинские познания пользовались самым большим уважением. Гиппократ жил в 460-377 гг. до н. э. и был современником Сократа. Преподавание в медицинской школе Гиппократа основывалось на так называемом сборнике Гиппократа, который состоял из 60 текстов. Авторство большинства из них приписывают самому Гиппократу, но туда вошли произведения и других древнегреческих врачей, например зятя Гиппократа Полибия. Древнегреческие медики имели весьма туманные представления о строении и функционировании различных частей человеческого тела. Особенно непонятной для них оставалась природа и функция жизненно важных органов, и, конечно, они ничего не знали о кровообращении. Им был известен тот факт, что человеческий организм секретирует жидкости. Было очевидно, что они как-то связаны с болезнями: потеря крови вызывает болезнь и в конечном итоге смерть, выделения из носа — признак общего переохлаждения и других заболеваний, у больных часто наблюдается рвота, и так далее. Согласно теории, сформулированной древнегреческими врачами, организм подвержен влиянию четырех содержащихся в нем жидких сред или гу- моров: кровь, черная желчь, желтая желчь и слизь. Соотношение между жидкостями определяет состояние здоровья человека. Каждый гумор соотносится с определенным типом темперамента:

кровь — сангвинический, или оптимистический, черная желчь — меланхолический, или мрачный, желтая желчь — холерический, или раздражительный, слизь — флегматичный, или умеренный.

Полагали, что эти жидкости вырабатываются различными органами: сердце продуцирует кровь, селезенка — черную желчь, печень — желтую желчь, мозг — слизь. Исходя из учения о четырех стихиях (воздух, вода, земля, огонь) и их первичных качествах (тепло, холод, влажность, сухость), каждому гумору приписывались определенные физические свойства: кровь — горячая и влажная, черная желчь — холодная и сухая, желтая желчь — горячая и сухая, слизь — холодная и влажная (рис. 2.1).

Терминология гуморальной патологии используется и сегодня, когда мы говорим о человеке, что он меланхолик, флегматик, холерик, сангвиник, или называем больного печеночником. Счита-

Рис. 2.1. Теория четырех гуморов.

лось, что цинга вызывается нарушениями функции селезенки, которая у цинготных больных набухает и затвердевает. Вследствие этого черная желчь якобы не может очиститься в процессе рециркуляции, что и проявляется в виде симптомов болезни. Недостатком этой теории, не говоря о ее полной несостоятельности, является то, что она не указывала пути к исцелению. Нарушение баланса черной желчи связывалось с приступами меланхолии, поэтому цингу пытались лечить, улучшая настроение пациентов. А этого можно было добиться, обеспечив больному приятное окружение, свежий воздух и все то, чего человек лишен в тесноте ограниченного пространства корабля.

Значение химических процессов в лечении и понимании причин возникновения патологических состояний сегодня ни у кого не вызывает сомнений. Вряд ли можно говорить о существовании химии как науки в XVI-XVII вв., но некоторые идеи о взаимодействии между субстанциями, приемлемые и сегодня, постепенно дошли до нас именно благодаря алхимикам. Одна из них заключается в том, что вещества можно классифицировать как кислоты и щелочи. Конечно, тогда не существовало определения кислот и щелочей,

которое мы имеем сегодня, но было известно, что поодиночке они могут оказывать разрушительное действие на человеческий организм. Полагали, что процесс пищеварения есть не что иное, как реакция между кислотами и щелочами. Нарушение пищеварения приводит к избытку в организме, скажем, кислоты: возникшее патологическое состояние следует лечить щелочным препаратом. Другой тип расстройства может привести к нарушению равновесия щелочных условий, в этом случае прописывалась кислота. Цинга рассматривалась как смешанный тип патологии, так как характерные для болезни язвы считались атрибутом повышенной кислотности, а зловонное дыхание приписывалось нарушению щелочного баланса. Таким образом, рекомендовалось принимать как кислотные, так и щелочные снадобья, причем лечение сопровождалось обильным кровопусканием, которое традиционно считалось благотворным при различных недугах и с большим энтузиазмом использовалось веками. Что касается кровопускания, его польза признавалась и в середине XIX в.

В известном смысле цинга была болезнью империй. Страны с территориальными амбициями, такие, как Испания, Португалия, Британия, должны были содержать мощный флот для разведки дальних территорий, расширения пределов своих империй и защиты отдаленных колоний. Британский флот начал выступать в такой роли с конца XVII в. Ис этого времени основной проблемой флота становится цинга. Война с Испанией, начавшаяся в 1740 г., потребовала от британского флота присутствия на огромных территориях для захвата испанских кораблей, везущих сокровища из южноамериканских и иных колоний. И у английских моряков, и у их испанских и португальских коллег опыт был одинаково печален: спустя несколько месяцев, проведенных на море, проявлялись первые признаки цинги. Наряду с пониманием пользы свежих овощей и фруктов широко бытовало заблуждение об эффективном лечении заболевания посредством всего „хорошего": свежего воздуха, хорошего питания, умеренного климата. Стандартным лекарством, которое часто прописывалось при лечении, был так называемый купоросный эликсир — сильно разбавленная серная кислота, содержащая спирт, сахар и ароматические добавки для улучшения вкуса. Нам сегодня абсолютно ясно, что для преодоления этих заблуждений, которые не исключали и верных представлений о способах лечения цинги, необходимо было четко продемонстрировать преимущества использования в качестве лекарственного средства свежих овощей и фруктов. То есть необходимы были, как мы сказали бы сегодня, клинические испытания. Нечто очень близкое к этому и проделал Джеймс Линд.

Джеймс Линд

Джеймс Линд родился в 1716 г. в Эдинбурге. Его предки были родом из Далрая в графстве Эршир. По удивительному совпадению именно в Далрае сегодня работает предприятие фирмы Roche Products, производящее ежегодно тысячи тонн L-аскорбиновой кислоты. В возрасте пятнадцати лет Линд был отдан в учение к местному хирургу. Он осваивал свою профессию таким же образом, как, скажем, подмастерье плотника: много наблюдал и слушал, прежде чем его постепенно стали допускать к самостоятельной работе. В 1739 г., когда ему было двадцать три года, он поступил на службу в британский флот в качестве помощника судового хирурга. В возрасте тридцати лет Линд становится хирургом на судне „Salisbury11 и вскоре дважды подряд, в 1746 и 1747 гг., сталкивается со вспышками цинги. Во время второй вспышки он и осуществил эксперимент по проверке эффективности существующих в то время способов лечения цинги, т. е. заложил основы того, что сегодня мы называем клиническими испытаниями.

Джеймс Линд (1716-1794)(библиотека Веллкомовского института, Лондон)

Таблица 2.1. Испытания Джеймса Линда различных способов лечения цинги

Группа

1

2

3

4

5

6

Лечение

кварта сидра

25 капель купоросного эликсира трижды в день Две полные ложки уксуса перед приемами пищи 1/2 пинты морской воды

апельсина и 1 лимон

Паста, содержащая чеснок, семена горчицы и др.

Линд взял двенадцать человек, больных цингой, и велел кормить их одинаковой пищей. Пациенты были разбиты на шесть групп по два человека в каждой, и с каждой группой проводился определенный курс лечения (табл. 2.1). Апельсинов и лимонов хватило только на шестидневный курс, но пациенты, получавшие их, вскоре оправились настолько, что смогли вернуться к своим повседневным обязанностям. У пациентов, получавших сидр, к концу второй недели гниение десен несколько уменьшилось и уже не наблюдалось такой утомляемости и слабости. Другие курсы лечения дали весьма незначительный эффект или такового вообще не имели. Результаты этого эксперимента позволили Д. Линду прийти к заключению, что „апельсины и лимоны являются наиболее эффективным лекарственным средством от этой болезни на море“. В 1748 г. Линд оставил службу и вернулся в Эдинбург, где в 1750 г. был избран членом Королевского медицинского колледжа. В 1758 г. он начинает практиковать в новом военно-морском госпитале в Госпорте недалеко от Портсмута, который и сегодня является действующим лечебным учреждением. Строительство этого госпиталя было следствием возросшей заболеваемости в Королевском флоте в то время.

В 1753 г. Линд опубликовал свой знаменитый труд, озаглавленный „Трактат о цинге в трех частях, содержащий исследование природы, причин возникновения и лечения этого заболевания, а также критический и хронологический обзор публикаций". Второе издание вышло в свет в 1757 г.

В книге представлен прекрасный обзор практических знаний о цинге, но теоретические обоснования причин возникновения болезни не выдерживают никакой критики. Даже в 1953 г. на симпозиуме, посвященном двухсотлетнему юбилею трактата, не было сделано ни малейшей попытки интерпретировать эти теоретические представления, в основе которых лежит идея о „засорении11

Роль витамина С в профилактике и лечении цинги 23 кожных пор, служащих якобы для избавления организма от нежелательных „жидкостей и испарений".

Линд рекомендовал иметь на кораблях обширные запасы свежих овощей, апельсинов и лимонов, но даже он не пришел к убеждению, что овощи и фрукты могут служить для профилактики цинги.

Однако никто из авторитетных людей не прислушивался к советам доктора Линда. Очевидно, он не обладал достаточным влиянием в официальных медицинских кругах. Прошло много времени, прежде чем появился человек, пользующийся таким влиянием, — сэр Гилберт Блейн.

Сэр Гилберт Блейн

Влияние британского флота на развитие методов лечения и профилактики цинги повысилось с назначением в 1781 г. Гилберта Блейна главным медиком флотилии под командыванием адмирала Родни. Блейн родился в 1749 г. и получил медицинское образование в Эдинбурге и Глазго. После присуждения степени магистра он практиковал как лечащий врач и заслужил прекрасную репутацию, которой был обязан своей дружбой с адмиралом Родни. Проведя десять месяцев во флотилии, Блейн подготовил и отправил в адмиралтейство записку о росте числа несчастных случаев. За год флотилия потеряла 1600 человек, причем только 60 из них погибли в результате военных действий. И это при том, что во флотилии было всего 12 000 человек! Среди заболевших было много случаев со смертельным исходом, и несомненно, многих унесла в могилу цинга. Блейн констатировал:

„... Цингу, одну из основных болезней, которыми страдают моряки, можно надежно предотвращать и излечивать овощами и фруктами, в частности, апельсинами и лимонами".

В записке рекомендовалось организовать снабжение кораблей свежими фруктами, так как „.. .каждые пятьдесят апельсинов сохранят для флотилии лишнюю пару рук".

Возвратившись в 1782 г. вместе с адмиралом Родни в Лондон, Блейн отправился затем в Вест-Индию, где провел последующие два года и уже никогда больше не возвращался на море.

И все-таки неразбериха продолжалась. Несмотря на недвусмысленные утверждения Блейна об эффективности свежих фруктов, вопреки весомым практическим доказательствам его правоты совет больных и раненых моряков отверг все предложения медиков раз и навсегда решить проблему цинги. В качестве оружия в борь-

Сэр Гилберт Блейн, член Королевского общества (1749-1834)(Королевский медицинский колледж, Лондон)

бе с цингой преимущество отдавалось другим продуктам питания. Пиво, черная патока, свежий хлеб — все находило своих сторонников. Интересно, что иногда и эти средства оказывали явный эффект. Даже Гилберт Блейн, уже вернувшись к гражданской жизни, отмечал в своей работе „Наблюдения за болезнями моряков “ антискорбутное действие некоторых других продуктов, в том числе и черной патоки.

И тут, к счастью, Гилберт Блейн становится придворным медиком принца Уэльского. Это дало ему положение в обществе и связи, позволявшие высказывать свою точку зрения на способы лечения цинги, к которой прислушивались. Теперь он мог благодаря дружбе с адмиралом Гарденером получить одобрение советом своего предложения о снабжении лимонным соком корабля флотилии, идущего в Ост-Индию. В этом плавании ни один человек не умер от цинги, а те, кто все-таки заболел, очень быстро вылечились с помощью апельсинового сока. С 1795 г., когда Блейн стал членом

совета, британский флот уже регулярно снабжался лимонным соком. Была установлена ежедневная доза — три четверти унции на человека, и с 1796 г. заболеваемость резко упала. Цинга перестала быть основной проблемой флота. Это случилось через два года после смерти Джеймса Линда и только через пятьдесят лет после его знаменитых клинических испытаний. В 1812 г. Блейн был возведен в дворянство, а в 1834 г. незадолго до своей смерти был избран действительным членом Королевского общества.

По-разному сложились судьбы этих двух людей. Линд умер в 1795 г., за одинадцать лет до этого удалившись от дел и так и не дождавшись признания своих работ. Однако Блейн по достоинству оценил наиболее выдающиеся результаты деятельности Линда. Благодаря своему высокому общественному положению он смог претворить идеи Линда в жизнь и добиться изменений в продовольственной политике адмиралтейства. Тысячи людей оказались обязанными своими жизнями этим медикам, и имена обоих по праву занимают почетное место в истории медицинской науки.

Е. Л. Мосс, акварель.

Ежедневная раздача лимонного сокаво время арктической экспедиции 1875 г.

Благодаря главным образом Блейну и Линду цинга на море была побеждена. Это можно было бы считать счастливым концом печальной истории, но в XIX в. разразились трагические события, переместившие центр внимания к этой болезни с моря на сушу.

Цинга на суше

В Северной Европе овощи и фрукты всегда были в недостатке в зимние месяцы. Должно быть, на протяжении всей истории население Британских островов в холодное время года находилось на грани заболевания цингой. Ситуация усугублялась в христианских странах, где строго соблюдался шестинедельный пост перед Пасхой. Когда Пасха была ранней, она по времени совпадала только с появлением первых свежих овощей. Но аристократы считали овощи пищей, пригодной только для низших классов, так как они растут в „грязной" земле. Поэтому с приходом зимы аристократы чаще заболевали цингой. Иными словами, цинга на суше была в значительной степени сезонной болезнью, появляющейся зимой и исчезающей с приходом весны. Эти факты были приведены Сюзанной Мак-Лин Кибетт в доказательство того, что загадочная болезнь, которой в последние десять лет жизни страдал Генрих VIII, была на самом деле цингой. Очевидно, она была вызвана потреблением в зимние месяцы пищи, не содержавшей витаминов, и строгим постом весной. В своем рационе питания англичане делали упор на мясо птиц и животных, а фрукты есть опасались, так как считалось, что они вызывают сыпь на коже и лихорадку. В последние десять лет жизни Генрих невероятно располнел. Он тяжело страдал от язв на ногах, пятен на теле и лихорадки, был подвержен резкой смене настроений, — все эти симптомы с большой долей вероятности указывают на цингу. Любопытной особенностью цинги является то, что человек может хорошо питаться с точки зрения количества потребляемой пищи и даже иметь избыточный вес и все-таки быть безнадежно больным.

Генрих умер 28 января 1547 г. Время года, когда это произошло, наводит на мысль о том, что именно цинга была основной причиной его смерти. И это далеко не единственный случай, когда характерные симптомы наблюдались у представителей аристократии. Очень вероятно, что Яков I и его жена также страдали этим заболеванием, которое так и осталось ^диагностированным среди бесчисленных недугов, веками мучивших население Северного Хэмпшира. Однако вплоть до XIX в. не подозревали о существовании болезни на суше, так как все внимание было приковано к случаям цинги на море.

Картофель был завезен в Западную Европу по историческим меркам относительно недавно, но его питательная ценность уже неоднократно оспаривалась. Многие считают, что картофель из- за высокого содержания углеводов следует исключать из рациона питания людей, следящих за своим весом. Карпентер и другие авторы неоднократно подчеркивали важность этого скромного овоща в профилактике и лечении цинги. В XIX в. тюрьмы наряду с больницами были местом, отнюдь не способствовавшим сохранению здоровья. В то время (а, возможно, и до сих пор) частью философии пентенциарной системы было убеждение в том, что преступник должен страдать не столько от потери свободы, сколько от лишения комфорта и хорошего питания. Прямым результатом этого были периодические вспышки цинги во всех английских тюрьмах. Начальство любой тюрьмы вставало перед дилеммой: как обеспечить заключенным такое питание, которое, с одной стороны, было бы достаточным для предотвращения болезни, а с другой — не могло рассматриваться общественностью как слишком роскошное. Снижение правительственных субсидий отнюдь не является феноменом конца XX в.: начальники тюрем периодически получали приказы урезать и без того скудный рацион своих подопечных. Когда это случалось, в первую очередь урезалось потребление картофеля. Ясно, что такая политика не могла не способствовать возникновению цинги. Анализ продовольственного снабжения тюрем того времени, приведенный в отчетах инспекторов тюрем, показал, что там, где заключенные получали картофель, цинги не было. В результате картофель был рекомендован в качестве составной части тюремного меню. Это было вполне приемлемо, так как картофель давал хорошие урожаи и обходился дешевле, чем свежие овощи. По этой же причине он составлял основу питания беднейших слоев населения Ирландии.

Лето 1845 г. выдалось особенно холодным и дождливым даже для Британских островов. В тот год дожди заливали всю северную Европу. На посадки картофеля обрушилась болезнь: листья свернулись и почернели, а клубни деформировались и обесцветились. При хранении такой картофель быстро сгнивал. Под влиянием дождливой погоды болезнь картофеля распространилась на всю северную Европу, и половина урожая в тот год погибла. Положение осложнилось тем, что урожай погиб и в следующем, 1846 г. Разразился страшный голод, который особенно сильно ударил по Ирландии, где картофель был основным продуктом питания. Люди слабели, начался тиф, унесший множество жизней. Вскоре появилась и цинга. Это было полной неожиданностью для официальной медицины, несмотря на очевидные доказательства роста

заболеваемости при отсутствии в рационе питания картофеля, уже полученные в английских тюрьмах.

Когда неверные теории получают официальную поддержку, они, к сожалению, становятся основой практики. Согласно одной из теорий того времени, цинга возникала вследствие недостатка в организме белка. Поводом для этого послужили ошибочные представления о том, что же есть общего у продуктов, обладающих антискорбутным действием. Результатом применения этой теории на практике была, конечно, снова цинга. И все же, несмотря на еще одну неверную интерпретацию причин заболевания, наконец стало ясно, что в некоторых продуктах питания содержится некое вещество, отсутствие которого в рационе и приводит к его возникновению. Иными словами, сегодня мы говорим, что цинга — болезнь, обусловленная неполноценностью питания. Аналогичные умозаключения вызвали к жизни еще одну теорию того времени, утверждавшую, что цинга является следствием недостатка калия в пище.

Тем временем в 1848 г. был получен нормальный урожай картофеля, и цинга практически исчезла. Социальные последствия голода тех лет ощущаются, особенно в Ирландии, еще и сегодня, спустя почти 150 лет.

Снабжение продовольствием всегда ухудшается во время военных действий, и все войны, которые периодически вспыхивали на протяжении XIX в., собирали свой урожай жертв цинги. Во время гражданской войны в Америке 25% пленных, умерших в Андерсонвильской тюрьме, унесла в могилу цинга. Цинга, убила многих при осаде Парижа в 1870 г., сильная вспышка заболевания наблюдалась в Крымскую войну (1854-1856). Среди больных и раненых солдат, за которыми ухаживала Флоренс Найтингейл, многие страдали от цинги, так как обычным эпизодом любой войны был сбой с доставкой продовольствия.

Цинга представляла большую проблему и в XX в. до тех пор, пока не было обнаружено и выделено вещество, составляющее ан- тискорбутное начало пищи.

Исследование Арктики и Антарктики

В конце XIX — начале XX вв. последними неисследованными областями на Земле оставались Арктика и Антарктика. На протяжении всего XIX в. было много попыток освоения Арктики. Типичный маршрут таких экспедиций проходил вокруг мыса Горн,

вдоль побережья Америки и затем вдоль северных берегов Аляски. Такое плавание, подробно описанное Карпентером, было предпринято судном „Investigator". Корабль, как и многие другие, оказался затертым льдами. В таких ситуациях, продолжавшихся часто по нескольку лет, путешественников настигала цинга даже при наличии продуктов, которые, как считалось, обладали антискор- бутным действием. Ко времени первой экспедиции Скотта в Антарктику широкое распространение получила идея о том, что цинга вызывается первичными продуктами разложения мяса, так называемыми птомаинами. Продовольственные запасы экспедиции Скотта были тщательно подобраны таким образом, чтобы свести количество птомаинов к минимому. И это в 1901 г, в начале XX в.! В сентябре 1902 г. появился первый заболевший. Среди запасов провианта еще были соки и свежие овощи, и больной выздоровел. В этом же году при попытке проникнуть как можно дальше на юг симптомы цинги обнаружились у Скотта и Шеклтона. По возвращении они оправились, а их выздоровление было приписано употреблению в пищу сырого тюленьего мяса.

В 1910 г. Скотт предпринял свою знаменитую и ставшую последней в его жизни экспедицию к Южному полюсу. Среди запасов продовольствия был и фруктовый сок, но людям не сказали, что его необходимо регулярно пить. Свежее мясо сначала имелось в изобилии. Нет сомнений, что в этой экспедиции лейтенант Эдвард Эванс (позже адмирал лорд Эванс) перенес цингу. У нас нет доказательств того, что именно цинга свела в могилу Скотта, Эванса, Оатса и Вильсона, хотя обстоятельства смерти Эванса таковы, что это действительно могло быть так. Но это предположение в то время расценили бы как скандальное.

Детская цинга

Во второй половине XIX в. усилилась тенденция как можно раньше отнимать младенцев от материнской груди. Молоко матери заменялось сухарями и „концентрированным молоком". Многие такие младенцы были детьми состоятельных родителей, которые были бы потрясены, узнав, что их отпрыски заболели цингой в результате плохого питания.Больные дети испытывали сильные боли при малейшем прикосновении к телу. Маленькая пациентка доктора Барлоу скончалась в марте 1874 г., не дожив и до двух лет. Вскрытие показало, что надкостница полностью отделилась от костей, а образовавшееся пространство заполнено сгустками крови. Был поставлен диагноз — цинга, и с тех пор детскую цингу стали называть болезнью Барлоу. Много аналогичных случаев было

зафиксировано в Англии, Америке и Германии. Цинга часто накладывалась на рахит и иногда принималась за врожденный сифилис. Интересно, что один из наиболее характерных симптомов цинги, кровоточивость десен, у многих детей не наблюдался просто из-за отсутствия у них зубов. Барлоу лечил детей сырой рубленой говядиной, парным молоком и апельсиновым соком; улучшение обычно наступало очень быстро.

Неудачи в борьбе с цингой даже в начале этого столетия объяснялись стойким нежеланием признать цингу болезнью неполноценности питания. Споры о причинах заболевания и необходимой диете не утихали до тех пор, пока не удалось идентифицировать антискорбутный фактор и выделить его из натуральных природных продуктов питания, а также продемонстрировать его эффективность в лечении болезни. Но прежде чем это случилось, прошло более четверти столетия. Все эти двадцать пять лет ученые постепенно приближались к разгадке тайны неуловимого ан- тискорбутного вещества.

События, приведшие к открытию витамина С

Почти минуло первое десятилетие XX столетия, когда, наконец, было признано, что свежие овощи и фрукты содержат некое вещество или вещества, необходимые для нормальной жизнедеятельности человека. При исследованиях цинги сложность заключалась в том, что многие лабораторные животные, например крысы, ею не заболевали. Сегодня известно, что причина этого кроется в способности многих животных биосинтезировать собственный витамин С. В 1907 г. Аксель Хольст (1860-1931) и Теодор Фрелих опубликовали свою знаменитую работу, посвященную исследованию причин возникновения цинги, которая была выполнена на морских свинках. Хольст занимал должность профессора гигиены и бактериологии в университете Христиании (Осло). Выбор морских свинок для проведения этих работ может показаться сегодня странным, поскольку вездесущая крыса заполонила все современные биологические лаборатории. Но в конце XIX в. крыса считалась неприятным грязным животным, тогда как морская свинка была любимицей детей, удобной и дешевой в содержании. Последнее обстоятельство было особенно важным, так как тогда исследовательские работы не финансировались так щедро, как (по крайней мере теоретически) сегодня. Выбор оказался исключительно удачным, поскольку морская свинка — одно из немногих млекопитающих, утративших способность (или никогда на обла-

давших ею) биосинтезировать витамин С. Хольст и Фрелих содержали своих свинок на рационе, который вызывал полиневрит у голубей. Однако появившиеся симптомы заболевания у морских свинок — кровоизлияния в мышечных тканях, ломкость костей и кровоточивость десен — абсолютно не были похожи на признаки полиневрита. Фрелих сталкивался прежде со случаями детской цинги и сразу обратил внимание на сходство патологических изменений у морских свинок и у больных детей. Это дало возможность исследовать различные продукты питания, с тем чтобы выяснить их антискорбутную активность. Прежде всего окончательно была продемонстрирована эффективность свежих овощей и фруктов. Было показано, что свежий картофель служит надежной защитой от цинги, тогда как сушеный картофель такой способностью не обладает; и вообще, тепловая обработка овощей и фруктов сильно снижает их антискорбутную активность. Единственным результатом этой работы стал вывод о том, что цинга является следствием неполноценного питания.

Аксель Хольст (1860-1931)(фотография предоставлена доктором Р. Форбзом,Иллинойсский университет)

Фредерик Гоуленд Хопкинс был первым профессором биохимии в Кембриджском университете. Он пристально изучал влияние сбалансированного питания на рост крыс. Хотя их рацион включал очищенные белки, жиры, углеводы и минеральные соли, эффект был катастрофическим. Однако добавление только небольших количеств коровьего молока приводило к полному выздоровлению. Стало ясно, что при здоровом питании в организм с пищей поступает целый ряд каких-то веществ. В 1912 г. Казимир Функ из Листеровского института в Лондоне пришел к выводу, что бери- бери, полиневрит у птиц, водянка, цинга и пеллагра развиваются вследствие недостатка в пище азотсодержащих веществ. Он полагал, что все эти вещества являются аминами, и назвал их „vital amines" (жизненно важные амины), или сокращенно „vitamines". Со временем, как это часто случается с терминами, буква „е“ была утрачена, и сегодня мы называем эти вещества „vitamins" — витаминами.

И все-таки даже после этого открытия список ложных теорий о причинах заболевания цингой продолжал пополняться. В 1917 г. Макколлум отверг идею о том, что цинга является болезнью неполноценности питания и выдвинул свою теорию, гласившую, что цингу вызывают запоры, обусловленные составом пищи, которые якобы приводят к бактериальному заражению организма через стенки слепой кишки.

Первая мировая война ускорила решение вопроса о причинах заболевания цингой по крайней мере на два года. Это было обусловлено тем, что, во-первых, многие исследователи получили возможность своими собственными глазами наблюдать разрушительные последствия цинги на фронте. Во-вторых, в отсутствие мужчин женщины стали выполнять многие мужские обязанности. Так, в Листеровском институте в Лондоне оставшиеся женщины под руководством Генриетты Чик выполняли обширную научную программу по исследованию влияния факторов питания на профилактику цинги и бери-бери. Самым важным при выполнении этих экспериментов было обеспечить морским свинкам тщательно сбалансированное питание, но при этом исключить продукты с антискорбутным действием. Только при этом условии животные не подвергались никаким другим заболеваниям, кроме цинги. Удалось установить различную степень эффективности разных продуктов: наиболее мощным антискорбутным действием обладал лимонный сок, далее следовал свежий картофель, а молоко оказывало весьма слабое действие. Раз и навсегда было разрешено недоразумение, которое возникало во многих экспедициях на рубеже XIX-XX вв., использовавших для профилактики цинги сок разновидности лимонов из Вест-Индии. Оказалось, что сок плодов именно этой культуры обладает относительно низкой антискор-

Генриетта Чик (1875-1977)

(д-р Н. Тодхантер, Вандербильтский университет)

бутной активностью, да и та практически исчезает при хранении. Таким образом, теперь был доступен надежный биологический анализ. Его результаты немедленно учитывались при снабжении войск продовольствием, и без преувеличения можно сказать, что это спасло многие жизни.

Наличие надежного биологического метода анализа сыграло, хотя и не сразу, решающую роль в последующем успешном выделении витамина. В 1919 г. Макколлум присвоил названия А и В двум веществам, поступающим с пищей и необходимым для выживания крыс. В том же году Дрюммонд предложил назвать анти- скорбутный фактор „водорастворимый С“. Но для таких важных веществ уже начал приживаться термин „витамин", и антискор- бутный фактор стал известен под именем витамина С.

В 1920—1930 гг. проводятся активные исследования витамина С. Было сделано много попыток его выделения. На переднем крае снова оказался Листеровский институт, где Цильве с сотрудниками удалось изучить некоторые аспекты химии витамина С, не

Бутилирование лимонного сокаво времена правления королевы Виктории(библиотека Кембриджского университета)

выделяя его. Он установил, что витамин С является сильным восстановителем, и использовал это свойство для анализа, что позволило отказаться от очень длительного биологического анализа.

Выделение витамина С оказалось трудной задачей. Некоторые исследователи потерпели на этом пути неудачу, находясь почти у цели. Возможно, наиболее печальная участь постигла Линка из Висконсинского университета. Он получил неочищенный аскорбат кальция, но ему не удалось продемонстрировать его антискор- бутное действие, так как университет отказался финансировать продолжение работ. Другим неудачником был Веддер, который в 1927 г. выделил сырой препарат витамина С. Но, так как он был военным медиком, его перевели на другую должность прежде, чем он получил результаты необходимого биологического анализа.

Мы подходим к концу десятилетия, которое так и не оправдало надежд на быструю победу. Последующие несколько лет были заполнены драматическими событиями, связанными с выделением, определением структуры и синтезом витамина С, а также спорами, кто же все-таки первым его выделил.

Глава 3. Открытие витамина С и установление его структуры

Выделение

Годы после окончания первой мировой войны были ознаменованы бурным развитием работ, направленных на выделение неуловимого витамина. И в США, и в Европе развернулась настоящая гонка, в финале которой победителя ожидали огромный научный престиж и солидная финансовая поддержка. Как мы уже видели, Соломон Цильва и его группа в Листеровском институте лихорадочно пытались выделить витамин С из концентрированных цитрусовых соков. И хотя полученный ими препарат обладал сильнейшим ан- тискорбутным действием, все попытки получить чистое кристаллическое вещество оставались тщетными. Крушение надежд испытала также и ведущая американская группа под руководством Чарльза Кинга из Питсбургского университета. Основным камнем преткновения было то, что витамин С, будучи углеводоподобным веществом, очень трудно поддавался очистке от других углеводов, присутствующих в концентрированных фруктовых соках. И тут, несмотря на кропотливую и самоотверженную работу названных групп, по иронии судьбы на сцене появился никому не известный венгерский ученый Альберт Сент-Дьёрдьи.

Альберт Имре Сент-Дьёрдьи фон Нагираполт родился в 1893 г. в обедневшей аристократической семье. Он получил далеко не блестящее образование в родном Будапеште и защитил диссертацию на соискание докторской степени. В годы первой мировой войны его обучение было прервано службой в разгромленной австровенгерской армии. Но Сент-Дьёрдьи обладал редким и так необходимым каждому выдающемуся исследователю даром — способностью, по его собственному выражению, „видеть то, что видят все, но при этом думать то, что никому другому не придет в голову".

После войны он со своей семьей исколесил всю Европу, работая в различных лабораториях бок о бок со многими известными учеными. Именно в этот период возник его непреходящий интерес к только что зарождающейся науке — биохимии. В частности, его интересовали внутриклеточные окислительно-восстановительные реакции на молекулярном уровне в процессе дыхания живых ор-

ганизмов. Абсолютно без денег, но обогащенный ценным опытом, в 1922 г. Сент-Дьёрдьи очутился в датском университетском городе Гронинген, где получил должность ассистента профессора физиологии X. Дж. Хамбергера. Благодаря своему острому чутью он буквально почувствовал казавшуюся невероятной связь между пигментацией кожи пациентов, страдающих болезнью Аддисона (вызванной нарушением функции надпочечников), и потемнением свежего среза картофеля, яблока и груши. Было известно, что такое потемнение вызвано нарушением окислительно- восстановительного процесса. Апельсины и лимоны не темнеют на срезе, и в их соке, а позже в соке капусты Сент-Дьёрдьи обнаружил сильный восстановитель. Присутствие аналогичного вещества было обнаружено им и в экстракте коры надпочечников коровы. Далее Сент-Дьёрдьи решил выделить это соединение, которое, как он полагал, могло оказаться новым гормоном надпочечников.

После непродолжительной и безуспешной попытки выделения, предпринятой в Лондонской лаборатории сэра Генри Дейла в начале 1925 г., он вернулся в Гронинген. Не найдя общего языка с новым руководством, Сент-Дьёрдьи отослал семью обратно в Будапешт, а сам отказался от должности и прошел через период глубокой депрессии. Вскоре, однако, ему улыбнулась удача. На конференции в Стокгольме он встретился с ныне всемирно известным биохимиком профессором Фредериком Хопкинсом, которому понравилась одна из его статей. Результатом этой встречи стало приглашение работать в Кембридже. Сент-Дьёрдьи выписал семью и целиком погрузился в работу, сделавшую впоследствии ему имя.

После многих разочарований наконец удалось накопить менее грамма беловатого кристаллического вещества из коры надпочечников крупного рогатого скота, где оно содержалось в весьма незначительных количествах (около 300 мг/кг исходного материала), а позже из апельсинового и капустного соков. Процесс выделения „восстанавливающего фактора" заключался в следующем:

Замороженные надпочечники измельчали и экстрагировали метанолом, пропуская углекислый газ для предотвращения контакта с кислородом воздуха.

Восстанавливающий фактор высаживали из профильтрованного экстракта добавлением раствора ацетата свинца.

Осадок суспендировали в воде и добавляли серную кислоту.. При этом выпадал осадок сульфата свинца, а восстанавливающий фактор оставался в растворе.

Фильтрат упаривали под вакуумом.

Сухой остаток снова экстрагировали метанолом и повторяли стадии 2, 3 и 4.

Сухой остаток растворяли в ацетоне, и при добавлении избытка петролейного эфира постепенно выпадали кристаллы восстанавливающего фактора.

Как типичный восстановитель, полученное вещество обесцвечивало иод, и исходя из суммарной массы продуктов реакции, был сделан вывод, что относительная молекулярная масса соединения равна 88,2 или кратна этому значению. Молекулярная масса, найденная методом понижения давления паров воды, составила около 180, что соответствовало точному значению 176,4. И, наконец, элементный анализ дал 40,7% углерода, 4,7% водорода и 54,6% кислорода, что позволило окончательно вывести формулу СеНзОб-

Хопкинс настаивал на публикации этой работы, полагая,что Сент-Дьёрдьи выделил и охарактеризовал новый гормон углеводной природы с кислотными свойствами. Однако при сдаче статьи в печать возникли осложнения. Дело в том, что Сент-Дьёрдьи из озорства назвал новое соединение ,,ignose“ (nose — нос), что, по его замыслу, должно было означать вещество углеводной природы с неизвестной структурой. Это название было отвергнуто редакцией, тогда Сент-Дьёрдьи представил новый вариант ,,Godnose“ (в буквальном переводе Божий нос). И только когда рассерженный редактор пригрозил, что статья не будет опубликована до тех пор, пока не будет выбрано подходящее название, Сент-Дьёрдьи сдался и принял предложение редакции присвоить новому соединению название „гексуроновая кислота". Итак, в 1928 г. в Biochemical Journal эта основополагающая работа увидела свет. Несомненно, что этот забавный анекдот неоднократно всплывал в послеобеденных беседах. Интересно отметить, что в статье Сент-Дьёрдьи высказывал предположение о том, что восстанавливающие свойства фруктовых соков могут быть также обусловлены присутствием гексуроновой кислоты. Еще немного — и истина была бы установлена, тем не менее идея о том, что во всех случаях мы имеем дело с одним и тем же вездесущим веществом, уже носилась в воздухе.

В следующем году Сент-Дьёрдьи посетил США, где провел некоторое время в клинике Мэйо в Рочестере, шт. Миннесота. Многочисленные скотобойни в окрестностях Рочестера поставляли в изобилии свежие надпочечники, и ему удалось наработать 25 г гексуроновой кислоты, что составляло несметное богатство. Половина этого количества была немедленно отправлена в Англию в Бирмингем профессору Норману Хеуорсу для структурных исследований. К сожалению, этого количества оказалось недостаточно для установления структуры, которая так и осталась в тот раз тайной.

Альберт Сент-Дьёрдьи (1893-1986)(библиотека Веллкомовского института, Лондон)

Казалось, что на протяжении всей жизни Сент-Дьёрдьи сопутствовала удача быть в нужном месте в нужное время. Так оказалось и на этот раз. Последовавшее приглашение министра образования Венгрии дало ему возможность с триумфом вернуться на родину, и летом 1930 г. Сент-Дьёрдьи вступил в должность профессора медицинской химии в Сегеде, расположенном в ста милях южнее Будапешта. Он быстро приобрел репутацию неортодоксального и доступного руководителя, одинаково любимого и коллегами, и студентами. Годом позже ведущий сотрудник группы профессора Кинга из Питсбурга Джо Свирбли вернулся на родину и тоже начал работать в Сегеде. Мысль о том, что его беловатые кристаллы могут оказаться витамином С, все больше и больше овладевала Сент-Дьёрдьи, но витамины не входили в круг его научных интересов, и, кроме того, он ненавидел клинические испытания. Приезд Свирбли позволил всесторонне проверить эту идею, и к весне 1932 г. была установлена полная идентичность гексуроновой кислоты и витамина С.

Сэр Норман Хеуорс (1883-1950)(библиотека Веллкомовского института, Лондон)

Вопреки научной этике Свирбли счел своим долгом сообщить эту волнующую новость Кингу. Каковы же были ужас и уныние в Сегеде, когда Кинг незамедлительно опубликовал письмо в Science, приписав себе честь открытия! А ведь совсем незадолго до получения последних подтверждающих результатов он писал Свирбли о своих сомнениях относительно идентичности двух соединений. Этот инцидент привел в бешенство Сент-Дьёрдь и и на длительное время подорвал его веру в честность и порядочность коллег по науке. Однако присуждение ему Нобелевской премии в области медицины за 1937 г. „в знак признания его открытий в области биоокислительных процессов, особенно с участием витамина С“ продемонстрировало, кому научная общественность отдала предпочтение в этом споре.

Запас кристаллов был исчерпан. И тут новое, почти сверхъестественное озарение помогло Сент-Дьёрдьи определиться в ближайших планах на будущее. Он обнаружил, что сладкий перец, в изобилии произрастающий в Венгрии, чрезвычайно богат Битами-

ном С, причем благодаря отсутствию других углеводов его выделение не представляет большого труда. В течение недели он наработал больше килограмма кристаллов, фактически став монополистом на владение чистым витамином С. Сент-Дьёрдьи и Хеуорс переименовали соединение в „аскорбиновую кислоту“, отразив в названии антискорбутное действие этого вещества. И снова группа Хеуорса приступила к решению задачи по установлению структуры, которое на этот раз увенчалось успехом.

Установление структуры

На этот раз бирмингемская группа имела в своем распоряжении достаточное количество кристаллов. Были известны молекулярная формула соединения (СеНаОе), точка плавления (191°С) и угол оптического вращения (+23° в воде). Тем не менее расшифровка структуры потребовала увлекательной, почти детективной работы, так характерной для органической химии в те легендарные годы. Ответственность за работу была возложена на Эдмунда Херста, который работал под руководством Хеуорса еще в Дареме.

Сэр Эдмунд Херст (1898-1975)(из личного архива Мориса Стейси)

Лауреаты Нобелевской премии за 1937 г.;

сидят слева направо: Роже Мартин дю Гар (литература),Альберт Сент-Дьёрдьи (физиология и медицина),Пауль Каррер и Норман Хеуорс (химия),

Клинтон Дж. Дэвиссон (физика)(Национальная медицинская библиотека)

При кипячении в соляной кислоте кристаллы давали фурфурол с количественным выходом, что свидетельствовало о том, что по крайней мере пять из шести атомов углерода образуют нераз- ветвленную цепь. Дальнейшие опыты показали, что аскорбиновая кислота является слабой одноосновной кислотой и сильным восстановителем. Первая стадия окисления, которая легко обратима, может быть проведена с помощью водного раствора иода, подкисленного бензохиноном, или молекулярного кислорода в присутствии солей меди при pH 5. Продукт окисления, которое приводило к отщеплению двух атомов водорода, был назван дегидроас- корбиновой кислотой (СеНбОб). Обратимое окисление иодом протекало аналогично известной реакции с 2,3-дигидроксималеиновой кислотой:

НООСС(ОН) = С(ОН)СООН + 12—>

НООССО - СОСООН + 2HI (1) что позволяло предположить наличие ендиольной группировки С(ОН) = С(ОН). Сходство в спектрах поглощения аскорбиновой

ch2n2

—С—СI IOCHOCH3

Рис. 3.1. Реакции ендиольной группировки.

и дегидроксималеиновой кислот с единственной интенсивной полосой при 245 нм подтвердило это предположение. В дальнейшем присутствие ендиольной группировки было доказано следующим образом: 1) при обработке диазометаном получалась диметиласкорбиновая кислота; 2) взаимодействие с фенилгидразином после первоначального окисления приводило к образованию озазона (рис. 3.1).

Первоначально кислотные свойства аскорбиновой кислоты приписывались наличию карбоксильной группы. Однако было показано, что дегидроаскорбиновая кислота — это нейтральный лактон, который медленно гидролизуется, высвобождая карбоксильную группу. Легкость взаимных превращений дегидроаскорбино- вой и аскорбиновой кислот указывала на то, что последняя также является лактоном. Эта точка зрения подкреплялась и тем фактом, что диметиласкорбиновая кислота, будучи нейтральным соединением, при обработке гидроксидом натрия дает натриевую соль без отщепления метильной группы, т. е. происходит раскрытие лактонного кольца (рис. 3.2).

соон

О = Сгидролиз

О=С

О=С

I о=с

окисление

восстановление

дегидроаскорбиновая кислота(нейтральное соединение)

НО —С

НО —С

ch2n2

аскорбиновая кислота(кислотные свойства)

уCOO-Na

ii

Н3СО — СNaOHН3СО —С

И - II

H3CO-CH3CO-C

II

ди-О-метиласкорбиновая кислота(нейтральное соединение)

Рис. 3.2. Раскрытие лактонного кольца аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот.

САОб

гидролиз лактона

дегидроаскорбиноваякислота

соон । с=о I с=о

он но

СНгОН

Н1*0Г

СООН I соон

щавелеваякислота

CONH2

осн3 1)метилирование

Н3СО2) амидирование conh2

l- (+) -диметокси - сукцинамид

соон

он но

соон

L-виннаякислота

соон

окислениеон "но

сн2он L-треониновая -^ кислота

метилирован»

амидирование

СОМН2осн3н3сосн2осн3

2,3,4-три-О-метил-1.-треонамид

Рис. 3.3. Расщепление дегидроаскорбиновой кислоты и установление конфигурации аскорбиновой кислоты.

Кроме того, было известно, что в молекуле присутствуют еще две спиртовые ОН-группы, которые при обработке ацетоном образуют производное изопропилидена, также содержащее два енольных гидроксила.

Дальнейшее окисление дегидроаскорбиновой кислоты гипоио- дитом натрия в щелочной среде приводит к образованию щавелевой и L-треониновой кислот, причем последняя была идентифицирована по ее последовательным превращениям в известные соединения — L-диметоксисукцинамид и три-О-метил-ь-треонамид. Описанные превращения помогли установить стереохимическое родство природной L-аскорбиновой кислоты и углеводов L-ряда, а также выяснить, что карбонильная группа лактона соседствует непосредственно с ендиольной группировкой (рис. 3.3).

Теперь необходимо было выяснить размер лактонного кольца, и это удалось сделать в результате еще одного простого экспе-

ch2n2ch2n2CHjl/A^OCHjl/A^Oносн2онносн2онНОСН2ОННОСН2ОНН3СОСН2ОСН3Н3СОСН2ОСН3L-аскорбиноваякислотаL-аскорбиноваякислота2,3-ди-О-метил-с- аскорбиновая кислота2,3-ди-О-метил-с- аскорбиновая кислота2,3,5,6-тетра-О-метил-1_-аскорбиновая кислота2,3,5,6-тетра-О-метил-1_-аскорбиновая кислотаН3СОН3СООНООНОдеградацияпо Веерманудеградацияпо ВеермануСН2ОСН3СН2ОСН3NaOC/NaOHNaOC/NaOHCONH,I *conh2амид щавелевойкислотыNHj/CHjOH conh2 -онН3СОСН2ОСН3CONH,I *conh2амид щавелевойкислотыNHj/CHjOH conh2 -онН3СОСН2ОСН3Н3СО—С=ОН3СО—С=ОН3СОН3СОСН2ОСН;СН2ОСН;

ch2n2

ch2n2

CHjl/A^O

CHjl/A^O

но

сн2он

но

сн2он

НО

СН2ОН

НО

СН2ОН

Н3СО

СН2ОСН3

Н3СО

СН2ОСН3

L-аскорбиноваякислота

L-аскорбиноваякислота

2,3-ди-О-метил-с- аскорбиновая кислота

2,3-ди-О-метил-с- аскорбиновая кислота

2,3,5,6-тетра-О-метил-1_-аскорбиновая кислота

2,3,5,6-тетра-О-метил-1_-аскорбиновая кислота

Н3СО

Н3СО

ОНО

ОНО

деградацияпо Веерману

деградацияпо Веерману

СН2ОСН3

СН2ОСН3

NaOC/NaOH

NaOC/NaOH

CONH,I *conh2амид щавелевойкислоты

NHj/CHjOH conh2 -

он

Н3СО

СН2ОСН3

CONH,I *conh2амид щавелевойкислоты

NHj/CHjOH conh2 -

он

Н3СО

СН2ОСН3

Н3СО—С=О

Н3СО—С=О

Н3СО

Н3СО

СН2ОСН;

СН2ОСН;

+ Na+NCO"+ Na+NCO"3,4-Ди-О-метил-1_-треонамид

+ Na+NCO"

+ Na+NCO"

Рис. 3.4. Установление размера лактонного кольца аскорбиновой кислоты.

римента. Было известно, что при обработке диазометаном L-аскорбиновая кислота превращается в ди-О-метильное производное. Дальнейшее метилирование иодметаном в присутствии оксида серебра приводит к образованию тетра-О-метилированного соединения, озонолиз которого дает единственный продукт — нейтральный эфир. Под действием аммиака в метаноле эфир деградирует с образованием амида щавелевой кислоты и 3,4-ди-О-метил-Ь-трео- намида; последний был идентифицирован по характерной для 2-гидроксиамидов реакции Веермана. Так было показано, что лактонное кольцо замыкается по положению С-2 треонамида, эквивалентного положению С-4 тетра-О-метиласкорбиновой кислоты (рис. 3.4).

Таким образом было установлено, что аскорбиновая кислота является 7-лактоном, который изображен на рис. 3.5. Надо отме-

1

2

3

4

5

6

^:нгон

НО

СН2ОН

но он

Рис. 3.5. Структура L-аскорбиновой кислоты.

Рис. 3.6. Первичная ионизация L-аскорбиновой кислоты.Рис. 3.6. Первичная ионизация L-аскорбиновой кислоты.

Рис. 3.6. Первичная ионизация L-аскорбиновой кислоты.

Рис. 3.6. Первичная ионизация L-аскорбиновой кислоты.

тить, что в растворе в небольших количествах могут присутствовать и другие таутомерные формы. Асимметрический центр при С-5 имеет L-конфигурацию (или S-конфигурацию согласно системе Кана — Ингольда — Прелога). Кислотные свойства раствора аскорбиновой кислоты обусловлены ионизацией ендиольного гидроксила при С-3 (рА'а 4,25), что приводит к делокализации отрицательного заряда в образующемся анионе (рис. 3.6). Физические свойства аскорбиновой кислоты суммированы в табл. 3.1.

Бирмингемская группа быстро подтвердила предложенную структуру, разработав синтетический путь получения L-аскорбиновой кислоты. Эта работа, завершившая огромный кропотливый труд, была опубликована в 1933 г., а Норман Хеуорс разделил триумф с Сент-Дьёрдьи в Стокгольме в 1937 г., где ему также была вручена Нобелевская премия за исследования в области структуры углеводов и витамина С. Альберту Сент-Дьёрдьи было суждено совершить еще несколько важных научных открытий. Он проделал большую часть подготовительной работы, приведшей к открытию цикла Кребса, инициировал изучение биохимических процессов в мышечной ткани и провел множество новаторских основополагающих исследований по установлению причин и возможных способов лечения рака.

Открытие витамина С и установление его структуры47

Таблица 3.1. Физические свойства L-аскорбиновой кислоты

Номенклатура

Гексуроновая кислота, аскорбиновая кислота, редуксон; L-аскорбиновая кислота, L-ксило-аскорбиновая кислота, L- трео- 2,3,4,5,6- пентагид- роксигексен-2-овая кислота-4-лактон, Ь-трео-гексоно-1,4-лактоно-2-ен

Т. пл., °C

190-192 (с разложением)

Отн. мол. масса

176,14

рКа

1-я (С-3=ОН) 4,25

2-я (С-2=ОН) 11,79

Оптическое вращение, град.

[a]D° = +23 в воде;

[o-]d8 = +49 в метаноле

Растворимость,

33 (вода), 3 (этанол), 1 (глицерин)

(г на 100 см3 при 20° С)

нерастворим в хлороформе, бензоле, эфире, петролейном эфире,

жирах и маслах

Плотность, г ■ см-3

1,65

После второй мировой войны Сент-Дьёрдьи обосновался в США и принял американское гражданство. Этот выдающийся ученый, поистине один из гигантов науки двадцатого столетия, с уникальным природным даром научного предвидения, не прекращал работать вплоть до самой своей смерти, последовавшей в 1986 г. на девяносто третьем году жизни.

Уточнение структуры с помощью инструментальных методов

Развитие и совершенствование спектроскопических методов, последовавшее в годы после успешного установления структуры L-аскорбиновой кислоты, позволило более глубоко проникнуть в структуру молекулы.

Дифракция рентгеновского излучения

Впервые рентгеноструктурный анализ L-аскорбиновой кислоты был выполнен еще в начале 30-х гг. с целью помочь структурным

Таблица 3.2. Длины связей в молекулах L-аскорбиновой кислоты и аскорбата натрия

0,12330,14160,13730,12870,12330,14160,13730,1287С,=О С, — С2 с2 = с3 С,-ОС,=О С, — С2 с2 = с3 С,-О0,1216 0,1452 0,1338 0,13260,1216 0,1452 0,1338 0,1326

0,1233

0,1416

0,1373

0,1287

0,1233

0,1416

0,1373

0,1287

С,=О С, — С2 с2 = с3 С,-О

С,=О С, — С2 с2 = с3 С,-О

0,1216 0,1452 0,1338 0,1326

0,1216 0,1452 0,1338 0,1326

исследованиям, проводимым в Бирмингеме, и фактически подтвердил выводы бирмингемской группы. В 60-е гг. в работе Хвослефа из Осло, выполненной с помощью методов рентгеновской и нейтронной дифракции, было обнаружено, что кристаллы аскорбиновой кислоты относятся к моноклинной пространственной группе с четырьмя молекулами в элементарной ячейке. В кристалле существует два типа молекул (А и В) с восемью межмолекулярными водородными связями (рис. 3.7). Конформации молекул А и В фактически идентичны в том смысле, что в обоих случаях С-5—ОН расположена антиперипланарно относительно С-4—Н и С-6-ОН (рис. 3.8).

Соли L-аскорбиновой кислоты содержат резонансно-стабилизированный аскорбатный анион, образующийся при депротонировании С-3—ОН. Рентгеноструктурные данные подтверждают ожидаемое изменение длины связей в конъюгированной системе аниона О—С-3=С-2—С-1=О по сравнению с нейтральной молекулой (табл. 3.2).

Во многих солях аскорбиновой кислоты суммарный эффект координированного иона металла и водородного связывания приводит к тому, что С-6—ОН находится в синклинальной (или гош) ориентации относительно С-5—ОН.

Ультрафиолетовая спектроскопия

УФ-спектр L-аскорбиновой кислоты при pH 2 имеет максимум поглощения при 243 нм (е = 10 000 моль-1дм3см-1), кото-

Рис. 3.7. Водородные связи в молекулах А и В аскорбиновой кислоты в кристалле (,Falk, Wojcik, Spectrochim.Acta, 35А, Pergamon Press Inc.).

Рис. 3.8. Предпочтительная конформация молекулы L-аскорбиновой кислоты.

рый при pH 7,0 сдвигается в красную область к 265 нм (г = 16 500моль-1дм3см-1) за счет депротонирования С-3—ОН группы.

Эти изменения соответствуют тг —+ тг* электронному переходу в сопряженной двойной углерод-углеродной связи пятичленного лактонного кольца.

Инфракрасная спектроскопия

В ИК-спектре L-аскорбиновоЙ кислоты имеется ряд интересных максимумов поглощения (рис. 39).

Особенный интерес представляет область валентных колебаний О—Н от 4000 до 2000 см-1, которая в укрупненном масштабе приведена на рис. 3.10.

Так как длины водородных связей (и соответственно прочность) в кристалле известны, можно провести корреляцию этих максимумов поглощения и характеристических валентных колебаний ОН-групп, участвующих в образовании водородных связей. Очевидно, что четыре отчетливых пика в высокочастотном крыле спектра соответствуют спиртовым ОН-группам при С-5 и С-6 боковой цепи (табл. 3.3).

Енольные гидроксилы при С-2 и С-3 участвуют в образовании более прочных водородных связей с укороченным расстоянием 0-0 (0,261-0,267 нм), что выражается в виде сложной серии уширенных полос в области 3 1 00 -2200 см-1, соответствующих молекулам А и В. Несомненно, пик с максимумом поглощения 2915 см""1 вблизи высокочастотного крыла спектра является следствием наложения сигналов валентных колебаний С-Н.

Что касается низкочастотных сигналов, сильное поглощение при 1754 см""1 было отнесено за счет валентных колебаний группы С=О пятичленного лактонного кольца, а интенсивный дублет при 1675 и 1660 см""1 — за счет валентных колебаний группы С=С (на которые накладываются колебания вдоль всей сопряженной системы). Сигнал при 1460 см'1 приписан ножничным колебаниям группы СНг-

3525,4 1754,2 1141,6

3314,6 1674,3 1026,6

3024,8 1321,9 989,9

Рис. 3.9. Инфракрасный спектр L-аскорбиновой кислоты (в виде эмульсии в нуйоле) (публикуется с разрешения Aldrich Chemical Company Inc.).

Рис. 3.10. Инфракрасный спектр L-аскорбиновой кислоты (в таблетках NaCl) (публикуется с разрешения, с некоторыми изменениями, по работе Lehmann, Pagel, Репка, Eur. J. Biochem, 1984, 138, 480).

Табл. 3.3. Высокочастотные полосы валентных колебаний ОН-групп молекулы L-аскорбиновой кислоты, участвующих в образовании водородных связей

Связь

Волновое число, см 1

Расстояние О-О, нм

О-6-Н О

3525

0,294

0-5—Н О

3410

0,279

0-6“-Н О

3315

0,277

0-5“-Н О

3220

0,271

“ Молекула В на рис. 3.7.

Рис. 3.11. Спектр 13С ЯМР аскорбиновой кислоты в водном растворе при pH 2 (при полном подавлении спин-спинового взаимодействия с протонами).

Несмотря на сложность области характеристических колебаний, были сделаны попытки провести их корреляции, например: полоса при 1320 см-1 приписана деформации С-2—ОН, полоса при 1275 см-1 — колебаниям С-2—О, полоса при 1140 см-1 — колебаниям С-5—О и полосы при 1025/990 см-1 — деформации лактонного кольца.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса

В спектре 13С ЯМР L-аскорбиновой кислоты при полном подавлении спин-спинового взаимодействия с протонами, как и ожидалось, появились шесть сигналов, которые были соотнесены с конкретными атомами молекулы (рис. 3.11).

Неполное подавление спин-спинового взаимодействия с протонами приводит к ожидаемому расщеплению сигналов, т. е. С-1, С-2 и С-3 (синглеты), С-4 и С-5 (дуплеты) и С-6 (триплет). Сигналы С-4 и С-5 удалось дифференцировать после того, как был получен спектр при полном подавлении спин-спинового взаимодействия с протонами производного, дейтерированного по положению 4, где сигнал при 776 м. д. стал триплетом вследствие спин-спинового взаимодействия с дейтерием. Сигнал С-3 был идентифицирован благодаря его большому (196 м. д.) слабопольному сдвигу при изменении pH от 2 до 7, что приводит к депротонированию С-3—ОН.

Особенно интересен спектр ТН ЯМР L-аскорбиновой кислоты, так как его тщательный анализ позволяет определить конформа-

Рис. 3.12. Спектр 1Н ЯМР аскорбата, натрия (D2O) (публикуется с разрешения по работе Reid, J. Chern. Ed., 1989, 66, 345).

цию молекулы в водном растворе. При снятии спектра в D2O четыре протона ОН-групп замещаются на дейтерий и не проявляются в виде сигналов. Остальные четыре протона (Н-6, Н-6', Н-5 и Н-4) образуют систему АВМХ, причем протоны при С-6 неэквивалентны из-за хиральности атома С-5.

Тонкая структура этих сигналов не проявляется в низких магнитных полях (60 или 100 МГц), но выше 300 МГц обнаруживается спин-спиновое взаимодействие, не являющееся взаимодействием первого порядка. Это расщепление особенно заметно в спектре 1Н ЯМР аскорбата натрия (рис. 3.12).

Значения констант спин-спинового взаимодействия J, полученные из таких спектров, позволяют определить преимущественную конформацию L-аскорбиновой кислоты в водном растворе. Например, найдено, что Jh4,H5 составляет 1,8 Гц. Это соответствует предсказанному значению для конформации, изображенной на рис. 3.13. Таким образом, преимущественная конформация вокруг связи С-4—С-5 в водном растворе такая же, как и в кристалле (рис. 3.8).

В равной степени информативна корреляция констант спин- спинового взаимодействия с конформацией вокруг связи С-5—С-6.

Рис. 3.13. Преимущественные С-4—С-5 конформации L-аскорбиновой кислоты в водном растворе.

Таблица 3.4. Корреляция констант спин-спинового взаимодействия с С-5—С-6 конформацией

Конформер

^HS.He, Гд

•Тйб.Нб , Гд

Населенность конформера, %

I(теоретический)

5,0

10,8

58

II (теоретический)

10,8

3,0

25

III (теоретический)

0,8

5,7

2,9

7,5

17

Наблюдаемые величины (ХН ЯМР)

Возможные стабильные конформеры представлены на рис. 3.14. Предположив, что наблюдаемые константы спин-спинового взаимодействия являются весовым усреднением теоретических величин для трех конформеров, можно вычислить их населенность (табл. 3.4). И снова предпочтительная конформация вокруг связи С-5—С-6 в растворе идентична обнаруженной в кристалле.

Сходство преимущественных конформаций боковых цепей в кристаллической решетке и в растворе объясняется, возможно, отсутствием в обоих случаях внутримолекулярных водородных связей. Но, конечно, прочные межмолекулярные водородные связи образуются между соседними молекулами аскорбиновой кислоты в кристалле и с молекулами воды в водном окружении.

Масс-спектрометрия

В масс-спектре L-аскорбиновой кислоты, зафиксированном при ионизации молекулы под действием электронного удара, имеется интенсивный пик с т/е 116 наряду с пиком молекулярного иона (т/е 176) (рис. 3.15). Было высказано предположение, что фрагментация происходит за счет отщепления боковой цепи с последующим разрушением кольца, что соответствует наличию наиболее интенсивных сигналов (рис. 3.16).

II

III

Рис. 3.14. Возможные С-5—С-6 конформации L-аскорбиновой кислоты в водном растворе.

Масса и интенсивность

11 441147119226

3d 517397176109

51 1567671

42 1028322

43 2948434

44 6985290

45 758?80

54 448839

55 1009166

57 3310057

59 85101145

60 4610270

61 192116999

71 18511757

Рис. 3.15. Масс-спектр L-аскорбиновой кислоты (публикуется с разрешения согласно NIST/EPA/MSDC Mass Spectral Database (1990), National Standard Reference Data System Database 1, Национальный институт стандартов и технологии, Gaithersburg, Мэриленд, США).

с3но3+

m/e85

Рис. 3.16. Возможный характер фрагментации молекулы L-аскорбиновой кислоты.

Глава 4. Синтез, производство и химические свойства витамина С

Синтетические методы получения L-аскорбиновой кислоты

В 1933 г. швейцарская группа под руководством Т. Рейхштей- на синтезировала из D-ксилозы вещество, идентичное природной аскорбиновой кислоте. Единственное отличие между ними составляла величина угла оптического вращения. Структура аскорбиновой кислоты в то время еще не была известна (на самом деле авторы приписали своему продукту неверную структуру), и вскоре стало ясно, что в действительности они получили D-изомер витамина. В том же году внушительный научный дуэт, Н. Хеуорс и Э. Херст, вооруженные знанием правильной структуры и при поддержке большой группы опытных химиков-синтетиков Фрэнк- лендской лаборатории (Бирмингем) завершили синтез природного вещества, о чем сообщили в журнале Chemistry and Industry. В качестве исходного соединения они взяли L-ксилозон, кропотливо полученный из D-галактозы сложным восьмистадийным синтезом (рис. 4.1), а затем использовали ту же трехстадийную реакцию, что и швейцарские химики (рис. 4.2).

Лидерство в этой группе синтетиков принадлежало М. Стейси, молодому химику с докторской степенью, начавшему свою научную карьеру в Бирмингеме еще студентом. День и ночь Хеуорс безжалостно подгонял своих сотрудников, а те терпеливо сносили все: и усталость от работы, и страшные язвы, и нарывы на руках от бесконечной возни с фенилгидразином. Несмотря на имеющийся опыт работы с D-изомером, получение страстно желаемого L-продукта, пригодного для кристаллизации, вызвало значительные затруднения. Наконец, после многих разочарований Стейси сообщил Хеуорсу о получении небольшого количества неуловимых кристаллов, идентичных во всех отношениях природной L-аскорбиновой кислоте. Работа спешно была опубликована, так как бирмингемская группа знала, что конкуренты в Швейцарии и Германии буквально дышат им в затылок. В статье Хеуорс отметил самоотверженную работу Стейси и еще семи химиков: Олта, Бэрда, Каррингтона, Херберта, Херста, Персиваля и Смита.

Хеуорс и Херст были возведены в дворянство, а многие из их сотрудников в последующие годы возглавляли университетские ка-

сно

СНгОН

ацетон

(СНзЪС .СНгОН

Ко ■

(СН^С соон

окисление

о.

D-(+)-галактоза

СНО

он

деградацияпо Весрману

НО

•ОН

СН2ОН

L-ликсоза

о

O-QCHjh

■Г?

О-ЦСНзк

1,2:3.4-ди-О-изопропилиден-D-галактопираноза

1,2:3,4-ди-О-изопропилиден-о-галактуроновая кислота

гидролиз

conh2 но

ОН

ОН

НО

СН2ОН

СНгОН

СНО

■ОН 1) восстановление

НО

НО

ОН

CONH-

L-галактоиамид

2) амидирование н0

ОН

НО

ОН

СООН

D-галактуроновая кислота

PhNHNH,

СНО I с=оОНно сн2онL-ксилозонСНО I с=оОНно сн2онL-ксилозонCH=NNHPh

СНО I с=о

ОН

но сн2он

L-ксилозон

СНО I с=о

ОН

но сн2он

L-ксилозон

C=NNHPh гидролиз

ОН

НО

сн2он

L-ликсозазон (L-ксилозаэон)

Рис. 4.1. Получение L-ксилозона из D-галактозы.

федры, включая и самого Стейси, который руководил кафедрой химии в Бирмингемском университете с 1956 по 1974 г. Выдающиеся достижения школы химии углеводов Хеуорса отмечены и мемориальной доской на стенах здания, где в те годы работала лаборатория. Доска была торжественно открыта в 1981 г. не кем иным, как профессором М. Стейси, через семь лет после его ухода на пенсию.

Синтез аскорбиновой кислоты из пентоз сегодня подробно изучен, а в качестве исходного продукта использовались ксилоза, ликсоза и в последние годы (1980 г.) арабиноза.

Примерно через год после успеха группы Хеуорса и Херста Рейхштейн и Грюсснер опубликовали новый синтез ь-аскорбиновой кислоты из п-(+)-глюкозы (рис. 4.3). Этот цикл превращений остается наиболее важным синтетическим методом, предложен-

CHO I c=o

CH2OH

KCN

(CaCI;,)

Г CN

I CHOH

I c=o

OH

HN

c

1

HO—c

перегруппировка Ц

HO —c

L-КСИЛОЗОН

HO

CH2OHJ

HO

CH2OH

имино-ь-аскорбиновая кислота

разбавл. НО(10 мин)

L-аскорбиновая кислота

Рис. 4.2. Получение L-аскорбиновой кислоты из L-ксилозона.

Тадеуш Рейхштейн(Urs Schachenmann,F. Hoffmann-La Roche AG,Basle)

Морис Стейси,член Королевского общества(из личного архиваМориса Стейси)

ным для получения витамина С, который, претерпев некоторые модификации, и сегодня составляет основу его промышленного производства. Рейхштейн совместно с фармацевтическим гигантом, фирмой Hoffmann-La Roche, впоследствии получил ряд патентов на производство витамина С, оказавшееся в конечном итоге очень доходными. Процесс включал восстановление D-глюкозы до D-глюцита (D-сорбита) с последующим ферментативным окислением до L-сорбозы бактериями Acetobacter suboxydans (или Acetobacter xylmum\ После введения ди-0-изопропилиденовой защиты гидроксильных групп при С-2, С-3 и С-4, С-6 проводили мягкое окисление первичной спиртовой группы при С-1 перманганатом калия. Далее следовали снятие защиты, этерификация, енолизация (с помощью метилата натрия) и подкисление, что в конечном итоге давало аскорбиновую кислоту с выходом 15-18% (рис. 4.3).

В современном промышленном производстве восстановление D- сорбита достигается либо электролитическим, либо каталитическим (Щ/СиСгОг) гидрированием. Кроме того, было обнаружено, что ацетонирование сорбозы в кислой среде при низких температурах (—5°С) дает гораздо больший выход ди-0-изопро-

снон

но

о

он

он

о-(+ ) -глюкопираноза

но

СН2ОН восстановлениеОН

но

он

он

сн2ону

соосн

—о

сн,онлГ

но

он

но

СН2ОН

СН2ОН

фермент.

окисление

СН2ОН он

CHjOH=о

VAcetobactersuboxydans)

.о-(+)-глюцит (о-(+)-сорбит)

соон

—о

он

но

но■ но

он

он

—о

СН2ОН

но

СН2ОН l-(-)-сорбоза

Н2О/нагре-вание

О окисление

сн

О. ,о

соон <щелочной

КМпО4)

сн2

о, ,о

•сн2он

(СН3)2

(СН,),

О?»ОН

HOH^l—|сн2онон '

L- (-) -сорбофураноза

(СЩ^О/Н1

(защита ОН-групп)

(СН3)2

|СН2ОН

CHjOUa’/aijOH 2-кетб-с-гулоновая

(енолизация) кислота

2,3:4,6-ди-О-изопропилиден-2-кето -L-гулоновая кислота

2,3"-4,6-ди-О-изопропилиден -ь-сорбофураноза

СООСН, НО—С

Na^O"—С ОН

но

*СН2ОН

*СН2ОН

суммарный выход 15-18%

(2,3-моно-О-изопропилиденовыепроизводные можно удалить)

L-аскорбиновая кислота

Рис. 4.3. Получение L-аскорбиновой кислоты из D-глюкозы с инверсией углеводной цепи.

Roche, ДалраЙ.

(здания, изображенные в верхней части фотографии слева направо,используются для промышленного получения витамина С.(Urs Schachenmann, F.Hoffmann-La Roche AG, Basle)

лиденового производного по сравнению с 2,3-моно-О-изопропили- деновым. Окисление защищенной сорбозы (2,3:4,6-ди-О-изопро- пилиден-ь-сорбофуранозы или диацетонсорбозы) в соответствующую 2,3:4,6-ди-О-изопропилиден-2-кето-ь-гулоновую (диацетонке- тогулоновую) кислоту обычно выполняется с помощью отбеливателя (гипохлорита натрия) в присутствии в качестве катализатора сульфата никеля. В настоящее время продемонстрировано, что такая защищенная кислота может с хорошим выходом превращаться непосредственно в аскорбиновую кислоту в безводной среде (система хлороформ— этанол— концентрированная соляная кислота, 65°С, 50ч). Сырой продукт выделяют, очищают над активированным углем и перекристаллизовывают из воды. В результате описанных модификаций на каждой стадии промышленного производства сегодня выход достигает более 90%, а выход конечного продукта составляет более 50% в расчете на исходную глюкозу (рис. 4.4).

Подсчитано, что в настоящее время ежегодно производится около 40 000 т витамина (без учета производства в Китае и в странах бывшего восточного блока), причем основным производителем закономерно остается Roche Company. Принадлежащий компании завод по производству витамина С расположен в Далрае, в Шотландии, в живописной местности Северного Эршира. Завод был введен в строй в 1983 г. как третья очередь основного производства, которое к тому времени уже выпускало витамины A, Bi и Bg; сегодня это крупнейший и единственный производитель витамина С в компании. Свыше 90% продукции завода экспортируется за пределы Великобритании для нужд пищевой промышленности и животноводства, а также для изготовления различных поливитаминных препаратов.

Интересно отметить, что в синтезе Рейхштейна наблюдается инверсия цепи углеродных атомов: атом С-1 в молекуле D-глюкозы занимает положение атома С-6 в молекуле L-аскорбиновой кислоты, что можно проследить по звездочке на рис. 4.3.

В последние годы был предложен целый ряд новых синтезов на основе D-глюкозы с С-1/С-6 инверсией. Кроме того, были разработаны способы получения витамина и без инверсии углеродной цепи. Такая цепь превращений, когда атом С-1 в молекуле глюкозы остается в том же положении, что и в молекуле аскорбиновой кислоты, включает окисление глюкозы по С-1 и С-2 и обращение конфигурации при С-5 с последующим стереоселективным восстановлением (рис. 4.5). Хотя подобные синтезы и не имеют коммерческой ценности, они нашли применение при получении дейтерированных по С-5 производных ь-аскорбиновой кислоты.

восстановление

ГЛЮКОЗА-

(гидрирование)

окислениеСОРБИТ * СОРБОЗА

(бактериальное)

защита

(ацетон)

ДИАЦЕТОН- СОРБОЗА

окисление (отбеливание

и катализ)

снятие защиты и

АСКОРБИНОВАЯ очисткаАСКОРБИНОВАЯперегруппировкаДИАЦЕТОН-

КИСЛОТА КИСЛОТА - КЕТОГУЛОНОВАЯ

(чистая)(обесцвечивание и (СЫРЕЦ)(безводная среда)КИСЛОТА

перекристаллизация)

Рис. 4.4. Схема современного промышленного производства витамина С.

*сно

он но

см

см

CHjOH

ферментативноеокисление

(Acetobacterfragrum)

выход >90%

СООН

I с=о

стереоселективноевосстановление

НО

D-глюкоза

СМ

с=о

I

СН^Н2,5-дикето-о-

NaBH, (выход 89%)

Me2NHBH3

(выход 95%)

глюконовая кислота

CH2OH

qH .1) енолизация

/ '0=02) подкисление

но^он(см- рис 43)

L-аскорбиновая кислота

COOCH

(удаление остатков борной кислоты)

CHjOH

СООН

С=О

он

но

СН2ОН

86

6)92

2-кето-ь-гулоноваякислота

chjOH/h'

НО

СООН

I

с=о

но

он

он

СН2ОН

14 (в виде Na-соли)

2-кето-о-гулоноваякислота

ферментативное разрушение о-изомера

(Pseudomonas fluorescens)

СООН

ОН

НО

СН2ОН

2-кето-ь-гулоновая кислота

Рис. 4.5. Получение L-аскорбиновой кислоты из D-глюкозы без инверсии углеводной цепи.

COOEt t ^ CH=O этиловый эфир глиоксалевой кислоты

COOEt I "О-СН

CN

COOEt I но-с -

I

CN

СН=О ОН +

НО

СН2ОНь-треоза

COOEt I но-с-

ICN

(

:ooEt

(

:ooEt

NC—С-ОН

удаление

с-он

-(

НО—

<

'—OH

—он

:н2он

CN-

(

но—

(

1 :-он

—он

:н2он

СН2ОН

ОН

НО он

L-аскорбиноваякислота

Рис. 4.6. Получение L-аскорбиновой кислоты из С<- и С2-предшественников.

.L-ксилозаС5 + С1| L-ликсоза1 L-арабиноза.L-ксилозаС5 + С1| L-ликсоза1 L-арабинозав виде С§в виде С§

.L-ксилоза

С5 + С1| L-ликсоза

1 L-арабиноза

.L-ксилоза

С5 + С1| L-ликсоза

1 L-арабиноза

в виде С§

в виде С§

D-глюкоза (с инверсией углеродной цепи и без нее)

D-галактуроновая кислота

СН2ОН

НО ОН

С4 + С2 L-треоза в виде С4

Рис. 4.7. Синтетические способыРис. 4.7. Синтетические способыполучения L-аскорбиновой кислоты.получения L-аскорбиновой кислоты.

Рис. 4.7. Синтетические способы

Рис. 4.7. Синтетические способы

получения L-аскорбиновой кислоты.

получения L-аскорбиновой кислоты.

Кроме глюкозы для синтеза витамина С было предложено еще только одно из производных гексоз — D-галактуроновая кислота [СНО(СНОН)4СООН], полученная ферментативным гидролизом пектина. Однако выход конечного продукта оказался слишком мал.

Третий основной способ синтеза L-аскорбиновой кислоты заключается в комбинации С4- и Сг-содержащих звеньев. Примером такого подхода является бензоиновая конденсация ь-треозы и этилового эфира глиоксалевой кислоты в присутствии цианида натрия (рис. 4.6).

С тех пор, как пятьдесят лет назад Хеуорс и Херст впервые добились успеха, было опубликовано большое число работ по синтезу L-аскорбиновой кислоты. Интересно отметить, что все предложенные способы можно разбить на три группы в зависимости от того, какие соединения использовались в качестве исходных продуктов: 1) производные гексоз (Сб), 2) пентозы (Сд) с дополнительным Ci-содержащим звеном, 3) тетрозы (С4) с дополнительным Сг-содержащим звеном (рис. 4.7).

Химические свойства ь-аскорбиновой кислоты

Некоторые превращения ь-аскорбиновой кислоты уже упоминались в разделе, посвященном установлению структуры молекулы. Эти и другие реакции будут подробно рассмотрены в последующих разделах.

Алкилирование и ацилирование

Как и у многих углеводов, первичный гидроксил при С-6 L-аскорбиновой кислоты легко подвергается трифенилметилированию (тритилированию) под действием трифенилхлорметана в пиридине (рис. 4.8).

Метилирование L-аскорбиновой кислоты диазометаном проливает свет на таутомерную природу витамина. Повышенная кислотность гидроксила при С-3 позволяет оттитровать его диазометаном в эфире; при этом образуется З-О-метиласкорбиновая кислота. Реакция сопровождается образованием небольших количеств 1- метил-^>-ь-аскорбиновой кислоты вследствие присутствия минорных количеств таутомера. Оба соединения подвергаются дальнейшему метилированию диазометаном, давая 2,3-ди-О-метил-ь- аскорбиновую и 1,2-ди-О-метил-^>-ь-аскорбиновую кислоту соответственно (рис. 4.9).

рь,са пиридинрь,са пиридинCHzOCPh3CHzOCPh3Под действием щелочи с последующим подкислением 2,3-ди-О- метильное производное претерпевает интересную цепь превращений. Образуется не простой моноциклический лактон, а бициклическое производное с единственным свободным гидроксилом — 2,3- изодиметил-ь-аскорбиновая кислота. Кислотный гидролиз этого продукта приводит к З-О-метил-ь-аскорбиновой кислоте, которая также получается при стоянии на холоду водного раствора 1,2-ди-

рь,са пиридин

рь,са пиридин

CHzOCPh3

CHzOCPh3

СН2ОН

но он

Рис. 4.8. Тритилирование L-аскорбиновой кислоты.

СН2ОНСН2ОНСН2ОНОНононСН2ОНСН2ОНСН2ОНОНононно ОНМеО ОНМеО ОМено ОНМеО ОНМеО ОМеЗ-О-метил-ь- аскорбиповая кислотаЗ-О-метил-ь- аскорбиповая кислота2,3-ди-О-метил-с- аскорбиновая кислота2,3-ди-О-метил-с- аскорбиновая кислотаСН2ОНСН2ОНV1 -L-аскорбиновая кислотаV1 -L-аскорбиновая кислотаСН2ОНСН2ОНОНонСН2ОНСН2ОНОНон1-О-метил-^-ь-1,2-ди-О-метил-^-с-аскорбиновая кислотааскорбиновая кислота1-О-метил-^-ь-1,2-ди-О-метил-^-с-аскорбиновая кислотааскорбиновая кислотаРис. 4.9. Продукты метилирования L-аскорбиновой кислоты диазометаном.Рис. 4.9. Продукты метилирования L-аскорбиновой кислоты диазометаном.

СН2ОНСН2ОНСН2ОН

ОНонон

СН2ОНСН2ОНСН2ОН

ОНонон

но ОНМеО ОНМеО ОМе

но ОНМеО ОНМеО ОМе

З-О-метил-ь- аскорбиповая кислота

З-О-метил-ь- аскорбиповая кислота

2,3-ди-О-метил-с- аскорбиновая кислота

2,3-ди-О-метил-с- аскорбиновая кислота

СН2ОН

СН2ОН

V1 -L-аскорбиновая кислота

V1 -L-аскорбиновая кислота

СН2ОНСН2ОН

ОНон

СН2ОНСН2ОН

ОНон

1-О-метил-^-ь-1,2-ди-О-метил-^-с-

аскорбиновая кислотааскорбиновая кислота

1-О-метил-^-ь-1,2-ди-О-метил-^-с-

аскорбиновая кислотааскорбиновая кислота

Рис. 4.9. Продукты метилирования L-аскорбиновой кислоты диазометаном.

Рис. 4.9. Продукты метилирования L-аскорбиновой кислоты диазометаном.

О-метил-^>-ь-аскорбиновой кислоты, что сопровождается потерей лабильного метильного остатка при С-1. Как и следовало ожидать, З-О-метил-ь-аскорбиновая кислота легко метилируется под действием диазометана в эфире, образуя 2,3-ди-О-метилированное производное. Описанные превращения суммированы на рис. 4.10.

2,3-Ди-О-метил-ь-аскорбиновая кислота может быть подвергнута дальнейшему метилированию иодметаном в присутствии оксида серебра с образованием 2,3,5,6-тетра-О-метилированного продукта, а также тритилированию первичной спиртовой группы при С-6. Метилирование с последующим снятием тритильной защитной группировки в кислой среде приводит к 2,3,5-три- О-метильному производному (рис. 4.11), которое, как было показано, участвует в цепи превращений, идентичных приведенным на рис. 4.10, и превращается в бициклическое 2,3,5-изотриметильное производное.

Катализируемая кислотами этерификация аскорбиновой кислоты, например ацетилирование, первоначально приводит к образованию О-6-ацильного производного, а в более жестких условиях — к 5,6-диэфиру. Кристаллический 5,6-диацетат хорошо известен; получение 2,3,4,6-тетраацетата требует еще более жестких условий.

СН2ОН ОНСН2ОН ОНМеО ОМеМеО ОМеСН2ОНСН2ОНН+/охлаж- дениеН+/охлаж- дениеСНОНСНОН2,3-изодиметил-ь- аскорбиновая кислота2,3-изодиметил-ь- аскорбиновая кислотаН+/нагре~ ваниеН+/нагре~ ваниеСН2ОН ОНСН2ОН ОНОМе н2О/охлаждеиие

СН2ОН ОН

СН2ОН ОН

МеО ОМе

МеО ОМе

СН2ОН

СН2ОН

Н+/охлаж- дение

Н+/охлаж- дение

СНОН

СНОН

2,3-изодиметил-ь- аскорбиновая кислота

2,3-изодиметил-ь- аскорбиновая кислота

Н+/нагре~ вание

Н+/нагре~ вание

СН2ОН ОН

СН2ОН ОН

при стоянии

СН2ОНСН2ОННО ОМеНО ОМеОМеОМе2-О-метил-ь-аскорбиновая кислота

СН2ОН

СН2ОН

НО ОМе

НО ОМе

ОМе

ОМе

ch,n2

СН2ОН

МеО ОМе

Рис. 4.10. Реакции ди-О-метил-Ь-аскорбиновой кислоты.

В щелочных условиях электрофильная атака алкилирующих и ацилирующих агентов зависит от кислотности и стерической доступности гидроксильных групп при С-2, С-3, С-5 и С-6. Наиболее кислым является атом водорода гидроксила при С-3 (рАд = 4,25), но делокализация отрицательного заряда в соответствующем анионе снижает его реакционную способность и приводит к возникновению двойственной природы, которая выражается в том, что алкилироваться может не только положение 0-3, но и положение С-2. В результате селективная модификация положения 0-3 затруднена, и добиться ее можно только с помощью таких сильных

СН2ОНСН2ОМе-—ОН0МсСН2ОНСН2ОМе-—ОН0Мс2,3,5,6-тетра-О-метил-ь- аскорбиновая кислота2,3,5,6-тетра-О-метил-ь- аскорбиновая кислотаPh3CCl/пиридинPh3CCl/пиридин

СН2ОНСН2ОМе

-—ОН0Мс

СН2ОНСН2ОМе

-—ОН0Мс

2,3,5,6-тетра-О-метил-ь- аскорбиновая кислота

2,3,5,6-тетра-О-метил-ь- аскорбиновая кислота

Ph3CCl/

пиридин

Ph3CCl/

пиридин

СН2ОНСН2ОНОМеОМе2,3,5-три-О-метил-ь-2,3,5-три-О-метил-ь-аскорбиновая кислотааскорбиновая кислотаCH2OCPh3

СН2ОН

СН2ОН

ОМе

ОМе

2,3,5-три-О-метил-ь-

2,3,5-три-О-метил-ь-

аскорбиновая кислота

аскорбиновая кислота

ОН

Ro 1) Mel/Ag2O

МеО ОМе

Рис. 4.11. Синтез три- и тетра-О-метилированных производных.

алкилирующих и ацилирующих агентов, как диазометан и хлоран- гидриды.

Потеря второго протона гидроксилом при С-2 (р/<0 = 11,79) приводит к образованию дианиона, который селективно алкилируется и ацилируется по этому положению (рис. 4.12). Подобный подход можно использовать при синтезе 2-О-неорганических эфиров, например 2-О-сульфата. Если защищены оба гидроксила при С-2 и С-3, то в присутствии основания модифицируется более доступная стерически первичная спиртовая группа при С-6 и в последнюю очередь — при С-5 (рис. 4.13).

Образование ацеталей и кеталей

Катализируемое кислотами образование ацеталей и кеталей аскорбиновой кислоты применяется для специфической защиты одновременно двух гидроксильных групп в процессе структурной модификации. Такие 5,6-0-производные, как изопропилиденкеталь и бензилиденацеталь, хорошо известны, а недавно появилась возможность селективно защищать гидроксильные группы при С-2 и С-3 с помощью реакционноспособных альдегидов (рис. 4.14).

Рис. 4.12. Селективное алкилирование и ацилирование аскорбат-анионов.

СН2ОН

RC0C1/ пиридин

СН2ОСОК

МеО ОМе

RCOC1/пиридин

CH2OCOR OCOR

МеО ОМе

Рис. 4.13. Ацилирование положений С-5 и С-6.

НО ОН

сн2=снснош*

СН2ОН

Рис. 4.14. Образование ацеталей и кеталей.

Эти новые реакции открыли путь к селективному модифицироват нию как первичных, так и вторичных спиртовых групп молекулы аскорбиновой кислоты.

Окисление

L-Аскорбиновая кислота является сильным восстановителем в водном растворе, однако в безводной среде это не так очевидно. Первая стадия окисления легко обратима и приводит к образованию дегидроаскорбиновой кислоты, структура и свойства которой будут рассмотрены в следующем разделе. Дегидроаскорбиновая кислота также способна быть восстановителем особенно в щелочных условиях и при окислении гипоиодит-ионом или молекулярным кислородом распадается на L-треонин и щавелевую кислоту. Эта реакция фрагментации оказалась очень полезной при установлении структуры витамина С. Аналогичная фрагментация происходит также при обработке пероксидом водорода в щелочной среде или перманганатом калия в кислой или щелочной среде, причем кроме вышеназванных продуктов детектируется еще и ряд других.

Скорость аэробного окисления аскорбиновой кислоты зависит от pH раствора, достигая максимума при pH 5 и 11,5. Однако наиболее быстро и полно фрагментация протекает в щелочной среде. Окислительное расщепление происходит и в анаэробных условиях, хотя и медленнее. .

Ультрафиолетовое, рентгеновское и гамма-излучение инициируют фотохимическое окисление аскорбиновой кислоты в водных растворах по свободнорадикальному механизму как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

Окисление первичной и вторичной спиртовых групп аскорбиновой кислоты при С-5 и С-6 может теоретически приводить к образованию ряда побочных продуктов. Получение таких производных непосредственно из L-аскорбиновой кислоты требует селективной защиты гидроксилов при С-2 и С-3. На рис. 4.15 приведены примеры соединений такого типа, которые удалось выделить.

Дезоксисоединения

Производные L-аскорбиновой кислоты, у которых один или более гидроксилов при С-2, С-3, С-5 или С-6 замещены на атом водорода, известны как дезоксисоединения. Нестабильность витамина С подогревает интерес к его более стабильным аналогам

СООНСООНб-карбокси-L- аскорбиновая кислота (сахароаскорбиновая кислота )б-карбокси-L- аскорбиновая кислота (сахароаскорбиновая кислота )

СООН

СООН

б-карбокси-L- аскорбиновая кислота (сахароаскорбиновая кислота )

б-карбокси-L- аскорбиновая кислота (сахароаскорбиновая кислота )

СН2ОН

НООН

НО ОН5-кето-ь-аскорбиновая кислота(выделенагидратированная форма)

6-карбокси-5-кето-ь-аскорбиновая кислота(5-кетосахароаскорбиновая кислота)(стабильна в виде енольного таутомера)

Рис. 4.15. Побочные продукты окисления L-аскорбиновой кислоты.

СН3СН3НО он6-дезокси-ь-аскорбиновая кислотаНО он6-дезокси-ь-аскорбиновая кислотаСН3

СН3

СН3

НО он

6-дезокси-ь-аскорбиновая кислота

НО он

6-дезокси-ь-аскорбиновая кислота

ОН

но он

L-рамноаскорбиновая кислота(7-дезоксисоединение)

Рис. 4.16. Некоторые дезоксисоединения с антискорбутным действием.

при условии сохранения ими антискорбутного действия. Известно, что б-дезокси-ь-аскорбиновая и L-рамноаскорбиновая кислоты (рис. 4.16) сохраняют соответственно 30 и 20% антискорбутной активности витамина С. В последние годы были синтезированы еще некоторые соединения такого типа (рис. 4.17). Обнадеживает, что 6-хлор-6-дезо'ксипроизводное обладает повышенной термической стабильностью по сравнению с витамином С и в то же время обладает заметной антицинготной активностью.

СН2ОН

СН2Х

нх/сн3соон

(х=а,Вг)

СН,Х

НО ОН 6-галоген-6-

дезоксипроизводное

L-аскорбиновая кислота

Zn/CHjCOOH

каталитическое гидрирование

5,6-дидезоксипроизводное

Рис. 4.17, Новый синтез дезоксисоединений с антискорбутным действием.

Дегидроаскорби новая кислота и ее производные

Получение

Еще работая в Листеровском институте в середине двадцатых годов, Соломон Цильва заметил, что прокисшие растворы витамина С сохраняют антискорбутную активность. Примерно в то же время Сент-Дьёрдьи отмечал, что его „гексуроновая кислота" при окислении иодом теряет два атома водорода, а продукт окисления можно количественно превратить обратно в исходное соединение восстановлением сероводородом. Как только была установлена идентичность витамина С и гексуроновой кислоты и определена структура молекулы, стала ясна природа этого окислительно-восстановительного равновесия, а продукт окисления был идентифицирован как L-дегидроаскорбиновая кислота (ДГА). Было показано, что ДГА является лактоном, который при стоянии в водном растворе медленно гидролизуется с образованием кислоты ациклической структуры. Ранние представления об

НО—СНО—С-2[Н]2(Н]-2[Н]2(Н]НОНОСН2ОН L-дегидроаскорбиновая кислотаСН2ОН L-дегидроаскорбиновая кислота

НО—С

НО—С

-2[Н]

2(Н]

-2[Н]

2(Н]

НО

НО

СН2ОН L-дегидроаскорбиновая кислота

СН2ОН L-дегидроаскорбиновая кислота

НО

СН2ОНL-аскорбиновая кислота

Рис. 4.18. Предварительная схема взаимных превращений L-аскорби- новой и L-дегидроаскорбиновой кислот.

окислительно-восстановительном процессе приведены в виде схемы на рис. 4.18. Аскорбиновая кислота окисляется до дегидропроизводного под действием различных окислителей — иода, брома, хлора, хинонов в кислой среде, йодатов, фенолиндофенола и других красителей, молекулярного кислорода в присутствии солей меди(И) при pH 5 или активированного угля в водном этаноле. Обратное восстановление до аскорбиновой кислоты можно осуществить действием сероводорода, иодноватистой кислоты, цистеина, других тиолов и дитионата натрия. Недавно были обнаружены и охарактеризованы ферменты, катализирующие этот окислительно-восстановительный процесс. Окисление аскорбиновой кислоты молекулярным кислородом катализируется медьсодержащим ферментом аскорбатоксидазой, а восстановление деги- дроаскорбиновой кислоты в большинстве случаев глутатионом — ДГА-редуктазой.

Развитие синтетических методов получения ДГА осложняется переокислением, а также недостаточной стабильностью ДГА в водных растворах. На сегодняшний день ДГА получена только в виде вязкого сиропа или аморфного вещества. Наиболее удобным препаративным методом ее получения является окисление аскорбиновой кислоты молекулярным кислородом с использованием в качестве катализатора активированного угля в водном этаноле. Продукт реакции довольно стабилен при низкой температуре (— 10°С). Известна димерная форма ДГА — бисдегидроаскорбиновая кислота (БДГА). Это вещество в кристаллической форме можно получить растворением ДГА в нитрометане, кипячением полученного раствора и отфильтровыванием образовавшегося белого кристал-

лического осадка димера, который хранят при низкой температуре.

Структура

Еще в пионерской работе по установлению структуры L-аскорбиновой кислоты в начале тридцатых годов было сделано предположение, что первым продуктом ее окисления является нейтральный лактон, который в водном растворе медленно гидролизуется с образованием кислоты ациклической структуры. Процесс сопровождался падением pH и постепенным изменением угла оптического вращения. Лактон не давал полосы в спектре поглощения в области выше 225 нм, что указывало на отсутствие двойной углерод-углеродной связи, характерной для аскорбиновой кислоты, зато появлялся слабый сигнал карбонильной группы при 290 нм. Эти наблюдения согласуются с реакцией, приведенной на рис. 4.19. Более поздние работы уточнили эти первоначальные выводы, а к концу семидесятых годов структура ДГА и БДГА стала известна более детально. Было показано, что мономер существует преимущественно в виде бициклической полукетальной формы. Полукеталь образуется за счет гидроксила при С-6, а димер — за счет отщепления двух молекул воды от гидроксильных групп при С-2 и С-3 соседних молекул мономера (рис. 4.20). Структура ДГА была окончательно установлена спектроскопическими методами, главным образом методами 1Н- и 13С ЯМР. ТН ЯМР спектр ДГА (в ВгО) ясно демонстрирует, что протоны Н-6 и Н-6' (4,26 м. д.; интегральная интенсивность 2), Н-5 (4,66 м. д.; интегральная интенсивность 1) и Н-4 (4,756 м. д.; интегральная интенсивность 1) образуют систему АВМХ. Правильное отнесение этих сигналов является однозначным, поскольку облучение дополнительным радиочастотным полем при 4, 66 м. д. (т. е. Н-5) приводит к превращению мультиплета при 4, 26 м. д. в очень наглядную пару дублетов, характерных для системы АВ, образуемой протонами Н-6 и Н-6'.

В спектре 13С ЯМР, полученном при полном подавлении спин- спинового взаимодействия с протонами, имеются шесть сигналов (рис. 4.21). При неполном подавлении спин-спинового взаимодействия в спектре появляются три синглета (173, 106 и 916 м. д.), два дублета (86 и 736 м. д.) и один триплет (766 м. д.). Селективное облучение протонов на известных частотах Н-4 и Н-5 позволяет различить дублеты атомов С-4 и С-5. Низкопольный син-

но—с

2НзО(быстро)

IНО—С-ОН

I О

НО—С-ОН I

медленный гидролиз

о» он с I с=о

I с=о он

но

сн2он

L-аскорбиноваякислота

НО

_ СН2ОН _

нейтральное соединение;легко гидратируется

НО

сн2он

нейтральное соединение;

не поглощает в УФ-области

L-дегидроаскорбиновая кислота

Рис. 4.19. Уточненная схема окисления и раскрытия лактонного кольца.

но

сн2он

ь-2,3-дикетогулоноваякислота

БДГА

Рис. 4.20. Дегидроаскорбиновая кислота: мономер (ДГА) и димер (БДГ).

Рис. 4.21. Спектр 13С ЯМР ДГА при полном подавлении спин-спино- вого взаимодействия с протонами (в ВгО).

Рис. 4.22. Преобладающая и минорные формы ДГА в водном растворе.

глет при 1735 м. д. несомненно соответствует карбонильной группе лактона. Однако интересно, что сигналы атомов С-2 и С-3 (91 и 1065 м. д. соответственно) испытывают гораздо меньшее дезэкранирование, на основе чего можно полагать, что ни один из них не входит в состав свободной карбонильной группы. В то же время атом С-6 дезэкранирован в гораздо большей степени по сравнению с соответствующим атомом в молекуле L-аскорбиновой кислоты, что указывает на участие гидроксила при С-6 в образовании полукеталя. Таким образом, приведенные данные подтверждают как

ХЮН

соон

соон

но—

—он

=о

_ ноон

но—

—он

ноон

=о

—ин

он

он

но—

но

но

СН2ОН

СН2ОН

СН2ОН

Рис. 4.23. Структура гидролизованной ДГА в водном растворе.

наличие двух гидроксильных групп при С-2, так и участие атома С-3 в образовании структуры полукеталя.

В водном растворе ДГА существует в основном (> 99%) в виде бициклического полукеталя (рис. 4.20) с незначительными примесями других форм (рис. 4.22), чему, однако, нет твердых доказательств.

Свойства

При низких температурах ДГА в виде сиропа или аморфного твер-. дого вещества стабильна в течение нескольких месяцев. ДГА легко растворяется в воде, гидролизуясь до 2,3-дикето гулоновой кислоты. На скорость гидролиза существенно влияет pH раствора: гидролиз протекает относительно медленно на холоду при pH 2-4,, но существенно ускоряется при значениях pH выше и ниже этих пределов.

Интересно отметить, что после гидролиза в УФ-спектре поглощения появляется слабый сигнал карбонильной группы. Однако результаты исследования методом 13С ЯМР дают основания полагать, что в молекуле 2,3-дикетогул оновой кислоты карбонильные группы при С-2 и С-3 существуют главным образом в виде геминальной диольной формы (рис. 4.23).

Стабильный димер БДГА трудно растворим в воде, тем не менее в растворе он диссоциирует с образованием мономера.

ДГА вступает в реакцию с о-фенилендиамином, причем образование того или иного продукта зависит от стехиометрического соотношения реагентов (рис. 4.24).

С фенилгидразином ДГА (или аскорбиновая кислота, сначала окисленная до ДГА) дает красные кристаллы 2,3-дифенилгидра- зона (озазона), т. пл. 197°С, структура которого стабилизирована за счет образования внутримолекулярных водородных связей (рис. 4.25). Эти дигидразоновые производные интересны своими превращениями: в результате перегруппировки образуется соеди-

ДГА

Рус. 4.24. Реакция ДГА с о-фенилендиамином.

ДГАДГАPhNHNH2 2 МОЛЯPhNHNH2 2 МОЛЯСН2ОНСН2ОНPhNHNPhNHN

ДГА

ДГА

PhNHNH2 2 МОЛЯ

PhNHNH2 2 МОЛЯ

СН2ОН

СН2ОН

PhNHN

PhNHN

Рис. 4.25. Дигидразон L-аскорбиновой кислоты.

СН2ОН

перегруппировка

Ph

восстановление

ЛгСНО

Рис. 4.26. Модификация 2,3-дигидразона.

(СНОН)2СН2ОН

О

пиразольноекольцо

нение с пиразольным циклом, а восстановление приводит к 2,3- диамино-2,3-дидезоксипроизводному L-аскорбиновой кислоты, которое в свою очередь под действием альдегидов дает имидазолины (рис. 4.26). При перекристаллизации дигидразона иногда может происходить перегруппировка с образованием желтого кристаллического пиразолидона (т. пл. 210°С), что разрешает сомнения относительно природы продукта фенилгидразиновой конденсации.

Еще одна интересная реакция ДГА — образование окрашенного в красный цвет соединения с «-аминокислотами, трис(2-дезокси- 2-ь-аскорбил)амина (рис. 4.27). Эта реакция нашла применение для обнаружения «-аминокислот после хроматографического разделения.

Разумно предположить, что все читатели этой книги осведомлены об антискорбутной природе витамина С. Те, кто хоть немного изучал биологию, легко смогут понять, что эффективность витамина в заживлении ран и способность ускорять рост связаны с его участием в синтезе волокнистых соединительных тканей, особенно в ускорении посттрансляционного гидроксилирования остатков пролина и лизина коллагена — наиболее распространенного белка животного мира. Этот процесс, все еще далекий от того, чтобы быть полностью понятным, в ходе которого, как это ни парадоксально, восстановительные свойства аскорбиновой кислоты необходимы для окисления пролина и лизина, будет главной темой настоящей главы. Хотя, конечно, этим роль аскорбиновой кислоты отнюдь не ограничивается. Начиная с первых лет становления биохимии витамина С, ознаменовавшихся спорами вокруг его открытия, а также вокруг роли в метаболизме аминокислот, сфера влияния этого соединения все более расширялась, охватывая различные аспекты иммунологии, онкологии, процессов пищеварения и всасывания, эндокринологии, нейрологии, детоксикации и профилактики катаракты.

Среди высших организмов лишь очень немногие не способны к биосинтезу витамина С. К ним относится и Homo sapiens, поэтому неудивительно, что большая часть из того, что известно о биохимии L-аскорбиновой кислоты, имеет отношение к млекопитающим. Большинство научных статей, посвященных метаболизму аскорбиновой кислоты, опубликовано по результатам работ, выполненных на лабораторных крысах и морских свинках, но термин „витамин11 строго применим только к последним. Как и человек, морская свинка практически не способна синтезировать аскорбиновую кислоту, тогда как крыса им полностью себя обеспечивает. Начиная с рождения (человеческое молоко содержит до 5мг% аскорбиновой кислоты в зависимости от питания матери) и до самой смерти мы зависим от поступления витамина С в основном с овощами и фруктами, если не принимать синтетических препаратов. Несмо-

тря на распространенность витамина в растительном мире, о его роли в жизни растений из учебников по ботанике и биохимии можно почерпнуть очень мало.

В этой главе будет рассмотрен метаболизм аскорбиновой кислоты у млекопитающих, начиная с биосинтеза и заканчивая катаболизмом и выделением. В очерченных рамках возникает целый ряд вопросов относительно участия витамина С в многочисленных биологических явлениях, упомянутых выше. Вопросы можно некоторым образом упорядочить, если все известные биохимические реакции с участием витамина С разбить на три группы: окислительные (гидроксилирование), восстановительные (например, защита сульфгидрильной группы легко окисляемого трипептида глутатиона и устранение потенциально опасных окислительных свободных радикалов) и окислительно-восстановительные (имеющие отношение к переносу электронов и мембранному потенциалу через установление протонного градиента). Сама аскорбиновая кислота является восстановителем и, следовательно, не может непосредственно способствовать окислению. Но внутри живой клетки витамин может существовать в различных формах, которые образуют окислительно-восстановительные пары. Эти пары способны осуществлять как окисление, так и восстановление компонентов других окислительно-восстановительных пар в зависимости от их относительного окислительно-восстановительного потенциала.

Различные физиологически активные формы витамина С представлены на рис. 5.1, но отнюдь не все приведенные взаимопревращения происходят in tiivo. Наше бессилие установить конкретную роль этого наиболее жизненно важного вещества фактически является источником непрерывного крушения надежд.

Биосинтез

Большинство живых организмов могут превращать D-глюкозу в L-аскорбиновую кислоту. Важно ясно понимать, что это превращение происходит не через эпимеризацию, а через формальный поворот в плоскости на 180° соединения D-ряда, в результате чего образуется соединение, относящееся к L-ряду. С явлением инверсии углеродной цепи мы уже сталкивались в гл. 3. Следует помнить, что представленное на рис. 5.2 изображение ациклической формы D-глюкозы, данное Хеуорсом, относится к D-ряду, так как гидроксильная группа у предпоследнего атома углерода (в данном случае С-5) расположена справа от него.

L-аскорбат-аннон

Рис. 5.1. Взаимные превращения различных форм витамина С.

СНО

Н——ОН

НО— — Н

Н—— ОН

СНО

Н-

НО—

Н—

ОН

Н

ОН

6СН2ОН6СН2ОНН——ОН

6СН2ОН

6СН2ОН

Рис. 5.2. D-Глюкоза.Рис. 5.2. D-Глюкоза.^СООН

Рис. 5.2. D-Глюкоза.

Рис. 5.2. D-Глюкоза.

Рис. 5.3, D-Глюкуроновая кислота.

Н

сн2он

-—он

НОН

‘соон но——н но——н

Н

ОН

Н

ОН

н——он но——н

соон

Рис. 5.4. Продукт реакции глюкуроновой кислоты по положению С-1.

6СН2ОН

Рис. 5.5. L-Гулоновая кислота (рис. 5.4 перевернут).

Защитив предварительно реакционноспособную альдегидную группу по С-1, можно окислить D-глюкозу поположениюС-б, получив D-глюкуроновую кислоту (рис. 5.3). '

Если теперь С-1 альдегидную группу восстановить до первичного гидроксила, мы получим соединение, структура которого приведена на рис. 5.4. Наиболее важная функциональная группировка (в данном случае карбоксильная при С-6) обычно располагается в верхней части изображения, а соответствующему атому углерода присваивается номер С-1. Следовательно, если повернуть лист бумаги на 180° или перевернуть изображение в плоскости, мы получим соединение ь-ряда — производное альдогексозы ь-гулозы, называемое L-гулоновой кислотой (рис. 5.5). Последующие циклизация и окисление приводят к образованию L-аскорбиновой кислоты (рис. 5.6), более привычное изображение которой представлено на рис. 5.7.

Считается, что все хлорофиллсодержащие растения и прорастающие семена могут синтезировать аскорбиновую кислоту согласно схеме, приведенной на рис. 5.8.

Согласно некоторым авторитетным источникам, у растений бо-

ООdCH2OHdCH2OHно онно он

О

О

dCH2OH

dCH2OH

но он

но он

но5-—н

6СН2ОН

Рис. 5.6. Ь-Аскор- биновая кислота.

О

НО 1(1

Рис. 5.7. Различные способы изображения L-ac- корбиновой кислоты.Рис. 5.7. Различные способы изображения L-ac- корбиновой кислоты.1>?нно^^Г :| №онн

Рис. 5.7. Различные способы изображения L-ac- корбиновой кислоты.

Рис. 5.7. Различные способы изображения L-ac- корбиновой кислоты.

'сно

’сно

СООН

н—

—он

н—

—он

но—

—н

но—

—н

но—

—н

но—

—н

н—

—он

н—

—он

н—

-он

н—

—он

н—

—он

но-

—н

•сн2он•сн2онь-аскорбиноваякислотаь-аскорбиноваякислота_НОН IH1но-—н*СН2ОН2-кето-г_-гулонолактои_НОН IH1но-—н*СН2ОН2-кето-г_-гулонолактоиНОННОНННОННОНННО-—Н•сн2онь-гулонолактонНО-—Н•сн2онь-гулонолактонСН2ОНСООН*СН2ОН

•сн2он

•сн2он

ь-аскорбиноваякислота

ь-аскорбиноваякислота

_НОН I

H1

но-—н

*СН2ОН

2-кето-г_-гулонолактои

_НОН I

H1

но-—н

*СН2ОН

2-кето-г_-гулонолактои

НОН

НОН

Н

НОН

НОН

Н

НО-—Н

•сн2он

ь-гулонолактон

НО-—Н

•сн2он

ь-гулонолактон

о-глюкоза D-глюкуроновая кислота L-гулоновая кислота

Рис. 5.8. Биосинтез L-аскорбиновой кислоты.

лее важна цепь превращений с участием D-галактуроновой кислоты, в результате которой после восстановления и замыкания лактонного кольца вместо L-гулонолактона образуется L-галакту- ронолактон, также превращающийся в L-аскорбиновую кислоту. Предшественником D-галактуроновой кислоты является, очевидно, п-галактоза — углевод, обнаруженный у млекопитающих и не найденный по крайней мере в значительных количествах у растений. Поэтому трудно предполагать, что этот процесс может быть важным. Тем не менее независимо от того, является ли исходным соединением D-глюкоза или D-галактоза, биосинтез L-аскорбиновой кислоты происходит через инверсию. Однако этому противоречат экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что у некоторых растений, например у созревающей клубники, превращение D-глюкозы в L-аскорбиновую кислоту осуществляется не через инверсию. Если использовать D-глюкозу, меченную тритием (3Н) по положению С-6, в образующейся L-аскорбиновой кислоте меченым

СНО

СООНСООН

НОН

НОН

НОН

НОН

НОН

НОН

СН2ОН

НОН

НОН

СН2ОН

о-глюкоза

о-глюконоваякислота

=О

, НОН

НОН

=О

СН2ОН

2,5-дикетоглюконовая кислота

НО—;

ИО

Н

_ НОн

н

о

НОН

СН2ОНь-аскорбиноваякислота

нон

СН2ОН

2-кето-г_-гулонолактон

СООН

=О

.НОн

нон

нон

СН2ОН2-кето-ь-гулоноваякислота

Рис. 5.9. Альтернативная схема биосинтеза L-аскорбиновой кислоты.

оказывается также положение С-6. Результаты генноинженерной работы, в которой была получена экспрессия гена фермента редуктазы Corynebacterium в бактериях Erwinia herbicola, демонстрируют наличие в цепи превращений еще двух промежуточных соединений — D-глюконовой и 2,5-дикетоглюконовой кислот (рис. 5.9). В этом случае нет необходимости в инверсии, чтобы объяснить, каким образом D-глюкоза трансформируется в L-аскорбиновую кислоту. Очевидно, следует предположить, что одни растения продуцируют L-гулоновую кислоту через D-глюкуроновую или D-ra- лактуроновую кислоты, тогда как у других процесс протекает через образование D-глюконовой и 2,5-дикетоглюконовой кислот и не требует инверсии.

Большая часть исследований по синтезу аскорбиновой кислоты у животных была выполнена на лабораторных крысах, и результаты подтвердили идею о полной С-1/С-6 инверсии между D-глю- куронатом и L-гулонатом. Большинство представителей земной фауны способны биосинтезировать L-аскорбиновую кислоту из

НОН

НОН

Н

катализируетсяq

НОН I

L-гулонолактон-I

оксидазой Н

самопроизвольная

енолизация

НО—jИО-

Н

НОН

НОН

НОН

СН2ОН L-гулонолактонСН2ОН L-гулонолактонСН2ОНь-аскорбиноваякислотаСН2ОНь-аскорбиноваякислотаСН2ОН

СН2ОН L-гулонолактон

СН2ОН L-гулонолактон

СН2ОНь-аскорбиноваякислота

СН2ОНь-аскорбиноваякислота

2- кето-ь-гулонолак! он

Рис. 5.10. Завершающая стадия биосинтеза L-аскорбиновой кислоты.

d-глюкозы через промежуточные соединения — D-глюкуроно- вую кислоту, L-гулоновую кислоту, L-гулонолактон и 2-кето-ь-гу- лонолактон. Исключение составляют приматы (включая и Ното sapiens) и некоторые другие млекопитающие, а также рыбы, насекомые и некоторые виды птиц. Остается лишь гадать, почему эти представители животного мира утратили способность к биосинтезу аскорбиновой кислоты. По-видимому, их далекие предки лишились генетического материала, необходимого для синтеза фермента L-гулонолактоноксидазы, что и заблокировало завершающую стадию в цепи превращений (рис. 5.10). Полагают, что эта досадная ошибка произошла 25 миллионов лет назад и именно она привела к тому, что человек делит несомненные трудности своего положения с другими приматами, морскими свинками, индийскими крыланами, некоторыми видами птиц, включая дрозда с экзотическим голосом; рыбами и некоторыми видами насекомых, включая обитающую в пустыне саранчу, тутового шелкопряда и жуков Anthonomus. Возможно, что у всех травоядных насекомых (поедающих зеленые растения) существует потребность в поступлении витамина С с пищей. Выведение его из рациона, например, саранчи приводит к абортивной линьке и смерти. У тех представителей животного мира, которые способны самообеспечивать себя аскорбиновой кислотой, ее биосинтез осуществляется в печени (млекопитающие) или почках (птицы, рептилии, амфибии).

Витамин С в продуктах питания

Homo sapiens целиком зависит от поступления витамина С с пищей. Единственным животным продуктом, содержащим значительные количества витамина С, является молоко (1-5 мг/100г); содержится он также и в печени. Самые богатые источники аскорбиновой кислоты — это свежие овощи и фрукты (особенно цитру-

Таблица 5.1. Содержание витамина С в распространенных фруктах и овощах

Овощи/фрукты

Содержание0 аскорбиновой кислоты, мт на 100 г

Плоды шиповника

1000

Черная смородина

200

Капуста кочанная

186

Зеленый перец

128

Хрен

120

Капуста брокколи

113

Брюссельская капуста

109

Кресс-салат

79

Цветная капуста

78

Клубника

59

Шпинат

51

Апельсины/лимоны

50

Капуста листьевая

47

Молодой картофель

30

Горох

25

Старый картофель

8

Морковь

6

Яблоки

6

Сливы

3

° Данные колеблются в зависимости от множества параметров: места произрастания, характеристики почвы, погодных условия и т. д.

совые, томаты и зеленый перец), печеный картофель (17 мг/100 г) и листовые овощи. Очень богаты витамином С гуава (300 мг/100 г) и черная смородина (200 мг/100 г), но они не слишком распространены в западных странах. В табл. 5.1 приведены исчерпывающие данные о содержании витамина С в наиболее употребимых овощах и фруктах.

Известно, что кулинарная обработка овощей и фруктов часто влечет за собой потери аскорбиновой кислоты. Так, при измельчении продуктов значительно возрастает ферментативная активность аскорбатоксидазы, содержащейся в растениях, богатых витамином С. Этот фермент присутствует во всех растительных тканях и обычно либо неактивен, либо содержится внутри визикул.

Другой фермент, обусловливающий потерю аскорбиновой кислоты, фенолаза, катализирует окисление полифенольных соеди-

нений кислородом воздуха, за счет чего происходит потемнение таких фруктов, как яблоки. При наличии аскорбиновой кислоты фермент восстанавливает о-хиноны снова до о-дифенолов. Процесс сопровождается образованием дегидроаскорбиновой кислоты, которая быстро превращается в 2,3-дикетогулоновую кислоту, и катализируется ионами Сп(П) и других переходных металлов. Именно поэтому не рекомендуется готовить овощи и фрукты в медной и железной посуде. И, конечно, основным фактором, влияющим на потерю витамина С в процессе приготовления пищи, является просто его растворение в воде.

Исследования скорости разрушения витамина С при кулинарной обработке, выполненные на модельных системах, привели к предположению, что это процесс первого порядка. Влияние температуры на скорость распада витамина С адекватно описывается уравнением Аррениуса (2), где к — константа скорости первого порядка, А — предэкспоненциальный множитель, Еа — энергия активации, R — газовая постоянная и Г — абсолютная температура:

к = Ae-EalRT (2)

Как показали результаты экспериментов, график зависимости Ink от 1/Т представляет собой прямую линию, что позволяет вычислить энергию активации. Стандартные величины лежат в пределах 80-120 кДж ■ моль-1. Однако растения — очень сложные системы, на скорость распада витамина С в которых влияют и другие факторы, например микроорганизмы и (или) природные ферменты. Поэтому энергия активации служит только для приблизительной оценки влияния температуры на этот процесс. Более того, дополнительным параметром является отсутствие воздушной среды. Ситуация еще больше усложняется, если реакция не подчинаяется первому порядку. Так, например, имеются данные, что при хранении соков распад аскорбиновой кислоты является процессом нулевого порядка. Трудно понять, почему наблюдается такое различие в кинетике, однако несомненно, что решающее влияние на разрушение витамина С оказывает природа системы. Следует отметить, что овощи, приготовленные в микроволновой печи, сохраняют гораздо больше витамина С, чем приготовленные обычными способами. Это может происходить главным образом благодаря использованию меньших объемов воды, хотя должно сказываться и сокращение времени кулинарной обработки. Таким образом, потери витамина С можно предотвратить, не только избегая длительного кипячения овощей в медной посуде, но и если готовить их целиком.

Окисление и гидроксилирование

Установлено, что аскорбиновая кислота является существенным фактором многих реакций типа RH + О —* ROH. Роль восстановителя в таких процессах кажется на первый взгляд парадоксальной. Но это отнюдь не так, если принять во внимание, что витамин С может образовывать окислительно-восстановительную пару аскорбиновая кислота/дегидроаскорбиновая кислота (Н2А/А) аналогично цитохромам. Цитохром с, например, функционирует в митохондриях в виде пары цитохром с (Ееп)/цитохром с (Fe111). Осуществляя перенос электронов между метаболитами и кислородом, молекула цитохрома постоянно претерпевает циклические изменения, переходя из восстановленной формы (Fe11) в окисленную (Fe111) и обратно. Гидроксилирование катализируется монооксигеназами, при этом образуется реакционноспособный атомарный кислород. Процесс можно представить следующим образом:

ХН2 + О2 -> X + Н2О + 0(3)

О + RH -> ROH(4)

В качестве ХН2 скорее выступает не аскорбиновая кислота, а другие восстановители, например НАДН2, НАДФН2, а-кетоглутарат и т. д., а аскорбиновая кислота и цитохром участвуют в процессе в виде циркулирующих окислительно-восстановительных пар (рис. 5.11). В принципе, и аскорбиновая кислота может выполнять роль ХН2, а реакцию можно свести к простой форме:

Н2А + 02 + RH А + Н20 + ROH(5)

Известно, что аскорбиновая кислота участвует в метаболизме некоторых аминокислот, способствуя образованию гидроксипролина, гидроксилизина, норадреналина (норэпинефрина), серотонина, го- могентизиновой кислоты и карнитина.

Гидроксипролин и гидроксилизин содержатся в животных тканях практически только в составе коллагена, на долю которого

Рис. 5,11. Окислительно-восстановительный цикл аскорбиновой кислоты, обеспечивающий окисление и гидроксилирование.

сукцинатсукцинат-Нур--Нур-Рис. 5.12. Возможный механизм посттрансляционного гидроксилирования пролина.Рис. 5.12. Возможный механизм посттрансляционного гидроксилирования пролина.

сукцинат

сукцинат

-Нур-

-Нур-

Рис. 5.12. Возможный механизм посттрансляционного гидроксилирования пролина.

Рис. 5.12. Возможный механизм посттрансляционного гидроксилирования пролина.

приходится около одной трети всех белков организма млекопитающих. Волокна коллагена входят в состав сухожилий, кожи, костей, зубов, хрящей, сердечных клапанов, кровеносных сосудов, межпозвоночных дисков, роговой оболочки и хрусталика глаза, не говоря о том, что коллаген обеспечивает внеклеточный каркас у всех многоклеточных. Гидроксипролин (Нур) и гидроксилизин (Hyl) не имеют соответствующих кодонов, поэтому гидроксилирование остатков пролина (Pro) и лизина (Lys) в процессе биосинтеза коллагена осуществляется посттрансляционно. Около половины всех остатков пролина гидроксилируется в основном до 4-гидроксипролина, но встречается также и 3-гидроксипролин. На суммарный пролин (Pro и Нур) в коллагене приходится 27% всех аминокислотных остатков, далее следует глицин (Gly) — 26% и суммарный лизин (Lys и Hyl) — 4%. Гидроксилирование Pro и Lys катализируется пролилгидроксилазой и лизилгидроксила- зой — ферментами, которые функционируют при участии аскорбиновой кислоты, ионов Ге11 и а-кетоглутарата (аКГ). Реакция предположительно протекает через образование промежуточного пероксиглутарата, который далее взаимодействует с Pro и Lys, как изображено на рис. 5.12 для Pro. Фермент специфично действует на остатки пролина, занимающие третье положение в триплете Gly-X-Pro, перед последующим остатком глицина (Gly). Очевидно, роль аскорбиновой кислоты заключается в сохранении восстановленного состояния кофактора гидроксилазы — атома Ре11. Формирование четвертичной трехспиральной структуры физио л о-

гически активного коллагена может быть достигнуто только при условии наличия гидроксилированных остатков пролина и лизина. Коллаген, синтезированный при недостатке или отсутствии витамина С, не способен к образованию полноценных волокон, что является причиной поражений кожи, ломкости сосудов и других признаков, характерных для1 цинги. Другой содержащий гидроксипролин белок, биосинтез которого находится в зависимости от витамина С, — плазматический белок системы комплемента (C-lqu), определяющий способность организма морской свинки подавлять патогенные микроорганизмы.

Катаболизм аминокислоты фенилаланина и ее гидроксилированного производного тирозина протекает в печени животных с образованием фумаровой и ацетоуксусной кислот через промежуточную гомогентизиновую кислоту. Окисление 4-гидро- ксифенилпировиноградной кислоты катализируется медьсодержащим ферментом 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназой, для проявления активности которого необходимо присутствие витамина С (рис. 5.13). Диоксигеназа получила свое название вследствие того, что оба атома кислорода включаются в молекулу субстрата. Следует отметить, что одновременно протекает и декарбоксилирование, но это не нашло отражения в названии фермента. Нарушения метаболизма гомогентизина, связанные с недостаточностью гомо- гентизатоксидазы, приводят к возникновению наследственной болезни алкаптонурии. Это заболевание представляет в значительной степени исторический интерес, поскольку именно на основе его изучения была выдвинута идея о наследственных метаболических нарушениях. Гидроксилирование фенилаланина (Phe) до тирозина (Туг) сопровождается окислением производного фолиевой кислоты тетрагидробиоптерина (ТГБ) до дигидробиоптерина (ДГБ),

Phe + О2 + ТГБ — ДГБ + Туг + Н2О (6) обратное превращение ДГБ в тетрагидроформу зависит, очевидно, от присутствия витамина С. Блокирование превращения фенилаланина в тирозин — причина наследственного заболевания фенилкетонурии, встречающегося с частотой 1 на 20000 новорожденных.

Тирозин — предшественник гормона и нейромедиатора норадреналина, который образуется из дофамина (3,4-дигидроксифе- нилэтаноламина) под действием витамин С-зависимого фермента дофамин-/?-монооксигеназы (доф амин-^-гидроксил аз а) в хромаффинных клетках мозгового слоя надпочечников (рис. 5.14).

Все процессы гидроксилирования, о которых шла речь выше, осуществляются при участии тетрагидробиоптерина, подвергающегося циклическим превращениям в присутствии аскорбиновой

он

1।4-гидроксифеиил-

||jфенилаланин-4

11 Jмонооксигеназа

пиРУватДиоксигеназа_х^.ОН

тирозинтрансаминазаJО2/витамин СИ Т

сн2 chnh2 соон фенилаланин

J* Тно' Y

^Н2сн2сн2

CHNH2сосоон

СООН^оонгом°гск™°юя

тирозин4-гидроксифенилпировино-(2,5-дигидрокси-

градная кислотафенилуксусная кислота)

Рис. 5.13. Метаболизм фенилаланина и тирозина.

норадреналиннорадреналинтирозин3,4-дигидрокси- дофаминфенилаланин (дофа)тирозин3,4-дигидрокси- дофаминфенилаланин (дофа)

норадреналин

норадреналин

тирозин3,4-дигидрокси- дофамин

фенилаланин (дофа)

тирозин3,4-дигидрокси- дофамин

фенилаланин (дофа)

ОН

Ф

гидро^ ксилирование

chnh2

соон

Рис. 5.14. Образование норадреналина.

Рис. 5.15. Циркуляция аскорбата в биосинтезе норадреналина (САР — свободный аскорбатный радикал; А — аскорбат).

кислоты. Недавно было высказано предположение, что дофамин- /?-гидроксилаза (ДБГ) функционирует в тандеме с семидегидро- аскорбатредуктазой (СДР), что обеспечивает циклические превращения витамина С и окисление НАДНг (рис. 5.15).

Что происходит дальше с высвобождающимся реакционноспособным и, следовательно, опасным атомарным кислородом, остается неясным. Гидроксилирование и декарбоксилирование тирозина с образованием дофамина протекает в шишковидной ясе- лезе параллельно с аналогичными превращениями другой ароматической аминокислоты триптофана. Продуктами метаболизма триптофана являются сосудосуживающий агент и нейромедиатор 5-гидрокситриптамин, более известный под названием серотонина. Начальная стадия гидроксилирования катализируется триптофан-5-монооксигеназой (или триптбфангидроксилазой), которая, как полагают, также является витамин С-зависимым ферментом (рис. 5.16).

Еще одним субстратом, подвергающимся действию монооксигеназы, является тетрагидробиоптерин (ТГБ), и здесь снова необхо-

(5-гидрокситриптамин)

Рис. 5.16. Образование серотонина.

Рис. 5.17, Циркуляция аскорбата и гидробиоптерина в биосинтезе серотонина.

димО присутствие аскорбиновой кислоты, чтобы предотвратить его необратимое окисление в дигидробиоптерин (ДГБ). (рис. 5.17).

В цепи метаболических превращений, ведущих к образованию из лизина карнитина, дважды встречаются реакции, катализируемые витамин С-зависимыми диоксигеназами (или гидроксилазами), субстратами для которых являются 7-бутиробетаин и триме- тиллизин. Карнитин необходим для обеспечения транспорта энергетически богатых жирных аминокислот из цитоплазмы в митохондрии, где они подвергаются /5-окислению с образованием ацетата.

Другими оксигеназными витамин С-зависимыми системами, ответственными за биосинтез нейромедиаторов и гормонов, являются медьсодержащие пептидилглицин-а-амидирующие монооксигеназы (ПАМ), недавно обнаруженные в гипофизе и в коре надпочечников. C-Концевой глицинсодержащий пептид, часто встречающийся в белках эндокринной системы и нервных тканей (ААП- Gly-COOH), под действием ПАМ превращается в AAn-CONH2

по реакции, аналогичной реакции, катализируемой дофамин-/?- монооксигеназой. В такой форме белки более устойчивы к действию различных ферментов и приобретают повышенную способность связываться со своими рецепторами. В качестве примеров можно привести меланоцитстимулирующий гормон и тиреотропин- рилизинг-гормон.

Существенной функцией печени млекопитающих является биотрансформация ксенобиотиков: лекарственных препаратов, ядов и аномальных метаболитов. Важная роль принадлежит оксидазам микросомальной фракции, в частности, цитохрому Р450 — оксидазе со смешанной функцией (ОСФ). При участии этого фермента протекает метаболизм четырех пользующихся дурной славой токсинов: этанола, бензола, тетрахлорметана и полихлорированных бифенилов (ПХБ). Ферментативная активность цитохрома Р450 также зависит от присутствия витамина С, так как при его недостаточности уровень фермента в организме морских свинок значительно снижается. Более того, введение этих ядов в организм животных ускоряет метаболизм и повышает потребность в витамине С, поступающем с пищей.

Еще один пример участия аскорбиновой кислоты в процессах гидроксилирования, осуществляемых в микросомальной фракции, — ступенчатое превращение холестерина в желчную и холевую кислоты через промежуточные 7а-гидроксихолестерин, За, 7а-дигидроксикопростан и За, 7а, 12а-тригидроксикопростан. В процессе метаболизма липидов жирные кислоты с нечетным числом атомов углерода подвергаются а-окислению монооксигеназой и последующему декарбоксилированию, давая производные с четным числом атомов углерода. Обе реакции требуют присутствия витамина С. Так как а-окисление катализируется монооксигеназой, возможно, что все ОСФ нуждаются в присутствии аскорбиновой кислоты для проявления своей ферментативной активности.

Восстановительные свойства

Известно, что жизнь на Земле полностью зависит от снабжения кислородом. Но, будучи в избытке, в неподходящей форме или в ненадлежащем месте, кислород — потенциальный яд. Особенно вредны его реакционноспособные формы и окислительные радикалы, например, супероксид-анион и гидроксильный радикал. Это общеизвестные активные оксиданты, которые могут вызвать серьезные повреждения липидных компонентов клеточных мембран вследствие окисления пероксидами. Установлена защитная

антиоксидантная роль витамина Е и необходимых жирных кислот. Однако они являются жирорастворимыми соединениями, и, очевидно, что функция, выполняемая ими внутри мембраны, на ее поверхности переходит к аскорбиновой кислоте. Здесь, в водном окружении, витамин С способствует улавливанию потенциально опасных окислителей еще одним водорастворимым антиоксидантом, трипептидом глутатионом.

Глутатион — трипептид с первичной структурой 7-Glu-CySH- Gly (GSH), который может существовать также и в виде окисленного димера (GSSG). В форме GSH его роль заключается в поддержании различных ключевых белков организма в восстановленном состоянии, что необходимо, например, для структурной целостности эритроцитов и прозрачности хрусталика глаза. Способность GSH окисляться до функционально неактивной формы GSSG определяется его природой, и, как полагают, аскорбиновая кислота либо предотвращает, либо делает обратимым этот нежелательный процесс. Эффект витамина С не является непосредственным, так как известно, что окисленная форма глутатиона GSSG восстанавливается за счет НАДФНг, образующегося в пентозофос- фатном цикле при деградации глюкозо-6-фосфата до рибулозо-5- фосфата. Этот цикл осуществляется во многих растениях и микроорганизмах, а также в хрусталике глаза, эритроцитах, надпочечниках, жировых тканях (включая молочные железы) и печени животных и, как показано недавно, стимулируется аскорбиновой кислотой. Как это ни парадоксально, но существует предположение, что одна из функций глутатиона — поддерживать аскорбиновую кислоту в восстановленном состоянии!

Говорить о том, что витамины Е и С выполняют идентичные антиокислительные функции в липидном матриксе и в водном клеточном окружении соответственно, — это значит чрезмерно упрощать положение дел. Показано, что эти витамины действуют совместно, и, возможно, на границе раздела липиды/водная фаза аскорбиновая кислота обеспечивает защиту витамина Е или восстанавливает его окисленную форму после атаки свободных радикалов.

Восстановительная способность аскорбиновой кислоты „ис- пользуется“ еще одним витамином — фолиевой кислотой (рис. 5.18). Фолиевая кислота является незаменимым кофактором при переносе одноуглеродных звеньев: например, метильные группы, поставляемые незаменимой аминокислотой метионином, необходимы для синтеза различных соединений — пуринов, пиримидина тимина, аминокислоты серина, холина, карнитина, креатина, адреналина и многих других. Для выполнения своей функ-

H2NH2NРис. 5.18. Фолиевая кислота.Рис. 5.18. Фолиевая кислота.

H2N

H2N

Рис. 5.18. Фолиевая кислота.

Рис. 5.18. Фолиевая кислота.

ции фолиевая кислота должна находиться в восстановленной те- трагидрофолатной форме, и это состояние обеспечивается и(или) поддерживается в присутствии аскорбиновой кислоты.

Большой проблемой является склонность агрессивного перок- сидного свободного радикала окислять в эритроцитах атом железа гема Ее11 до Ее111, что приводит к образованию функционально неактивного метгемоглобина (metHb). Этот процесс обращается ферментом metHb-редуктазой, который функционирует в присутствии цитохрома bs и аскорбиновой кислоты. Супероксидный свободный радикал обычно разрушается витамин С-зависимой супероксид- дисмутазой (СОД), таким образом СОД предотвращает образование очень агрессивного гидроксильного радикала. Однако в противоположность этому в настоящее время утверждают, что аскорбиновая кислота может обходить эту защиту, восстанавливая Ее111 до Ее11, который и высвобождает гидроксильный радикал из супероксида по реакции Фентона. Полагают, что в растениях СОД и аскорбат совместно с глутатионом и НАДФН2 образуют целостную систему защиты от супероксидных радикалов.

Хорошо известно, что аскорбиновая кислота способствует всасыванию железа сквозь стенки кишечника. Возможно, это происходит благодаря тому, что она поддерживает элемент в восстановленной форме, Ее11, в которой он легче поглощается слизистой оболочкой.

Электронный транспорт

Окислительно-восстановительные свойства аскорбиновой кислоты давно используются в изучении in vitro электронного транспорта в митохондриальных мембранах. . Электронный транспорт и окислительное фосфорилирование обычно объясняют не очень хорошо согласующимися между собой моделями. Разница окислительно-восстановительных потенциалов приписывается изменению свободной энергии, а экзергонический электронный

АДФ—► АТФАДФ—► АТФАПф , АТФАПф , АТФРис. 5.19. Цепь электронного транспорта и участки окислительного фосфорилирования в митохондриях. (Обозначения. ФМН — флавинмононуклеотид, ФМНЩ — его восстановленная форма; ФАД — флавинадениндинуклеотид, ФАДЩ — его восстановленная форма; остальные обозначения см. в тексте.)Рис. 5.19. Цепь электронного транспорта и участки окислительного фосфорилирования в митохондриях. (Обозначения. ФМН — флавинмононуклеотид, ФМНЩ — его восстановленная форма; ФАД — флавинадениндинуклеотид, ФАДЩ — его восстановленная форма; остальные обозначения см. в тексте.)

АДФ—► АТФ

АДФ—► АТФ

АПф , АТФ

АПф , АТФ

Рис. 5.19. Цепь электронного транспорта и участки окислительного фосфорилирования в митохондриях. (Обозначения. ФМН — флавинмононуклеотид, ФМНЩ — его восстановленная форма; ФАД — флавинадениндинуклеотид, ФАДЩ — его восстановленная форма; остальные обозначения см. в тексте.)

Рис. 5.19. Цепь электронного транспорта и участки окислительного фосфорилирования в митохондриях. (Обозначения. ФМН — флавинмононуклеотид, ФМНЩ — его восстановленная форма; ФАД — флавинадениндинуклеотид, ФАДЩ — его восстановленная форма; остальные обозначения см. в тексте.)

транспорт связывают с установлением протонного градиента. Последовательность событий в цепи электронного транспорта в митохондриях можно представить в виде схемы на рис. 5.19. Такие субстраты, как изоцитрат, а-кетоглутарат и малат, участвующие в цикле лимонной кислоты, имеют отношение Р : О = 3, т. е. на каждую молекулу окисленного субстрата (удаляются два атома водорода с помощью НАД в качестве кофактора) образуются три молекулы АТФ. Это объясняется тем, что высвобождающиеся электроны (вместе со своими протонами) движутся по всей цепи электронного транспорта, встречая на своем пути три участка фосфорилирования, т. е. осуществляются три окислительно-восстановительные реакции, в которых участвующие окислительно-восстановительные пары создают довольно большую разность окислительно-восстановительных потенциалов (около 0,21 В) для высвобождения такого количества свободной энергии (40 кдж/моль), которой достаточно для фосфорилирования одного моля АДФ.

Окисление сукцината, также участника цикла лимонной кислоты, или ацил-СоА, образующегося при /5-окислении жирных кислот, катализируется флавопротеиновыми дегидрогеназами; при этом один участок фосфорилирования выпадает и отношение Р : О становится равным 2.

Аскорбиновая кислота участвует в восстановлении цитохрома с через краситель тетраметил-n-фенилендиамин (ТМФД); в этом случае выпадают два участка фосфорилирования и Р : О равно 1.

В шестидесятых годах Митчелл сформулировал хемиосмоти- ческую теорию, объясняющую, каким образом энергия, высвобождающаяся при электронном транспорте, используется для транслокации протонов из матрикса к наружной стороне внутренней митохондриальной мембраны. При прохождении протонов через „ворота11, расположенные в выступах внутренней мембраны, происходит активация АТФ-синтетазы. Недавно было показано, что в этом процессе участвует аскорбиновая кислота, способствуя установлению протонного градиента на плазматических мембранах везикул, полученных из соевых бобов (Glycine таху

Современные представления об электронном транспорте в таких органеллах, как митохондрии и хлоропласты, включают понятие носителей. Некоторые из них статично зафиксированы в мембране, другие более свободно связаны с мембранной поверхностью, третьи свободно перемещаются внутри мембранного матрикса. Соблазнительно предположить, что витамин С не только выступает в качестве искусственного донора электронов для восстановления цитохрома с в экспериментах in vitro, но и осуществляет еще од-

ну связь в цепи электронного транспорта в интактных живых митохондриях и хлоропластах. То, что витамин С способен проникать сквозь мембрану, доказывает факт его присутствия в тканях, характеризующихся высоким скоплением клеток, например, в надпочечниках и мозге. Известно, что мембраны проницаемы только для дегидроаскорбиновой кислоты (А), хотя внутри клеток этих тканей преобладает аскорбиновая кислота (НгА). Очевидно, НгА аккумулируется клетками надпочечников после того, как она подверглась окислению вне клетки, проникла сквозь мембрану в виде А и здесь посредством внутриклеточного восстановления вернулась в исходное состояние. В этом случае разумно предположить, что в транслокации электронов между компонентами липидного матрикса и водного окружения участвуют аскорбат- ные окислительно-восстановительные пары НгА/А или НгА/САР (САР — свободный аскорбатный радикал). Полагают, что в растениях аскорбиновая кислота причастна к возникновению протонного градиента, используемого для транспорта материала через клеточную мембрану, и таким образом участвует в регуляции роста.

Распределение в тканях

Витамин С участвует в реакциях гидроксилирования в биосинтезе коллагена, серотонина и норадреналина в организме животных. И все же очень важна его роль там, где он главным образом и синтезируется, а именно в хлорофиллсодержащих растениях. В некоторых из них аскорбиновая кислота содержится в довольно больших количествах, а скорость ее синтеза в прорастающих семенах очень высока. Несмотря на это, о роли витамина С в процессе метаболизма известно очень мало, за исключением того, что он необходим для синтеза ксантофилла, некоторых ненасыщенных жирных кислот (окисление жирных кислот), а также, возможно, участвует в транслокации, упомянутой выше. Ключ к решению вопроса о роли аскорбиновой кислоты в процессе метаболизма у животных может быть найден, исходя из результатов анализа ее тканевого распределения. Проанализированные животные ткани содержат следующие количества витамина С (в убывающем порядке): надпочечники (55 мг%), гипофиз и лейкоциты (белые кровяные клетки), мозг, хрусталики глаз и поджелудочная железа, почки, селезенка и печень, сердечная мышца, молоко (женское 3 мг%, коровье 1 мг%), плазма (1 мг%). В большинстве этих тканей функция витамина С заключается в поддержании структурной целостности посредством участия в биосинтезе коллагена. Бо-

лее высокий уровень содержания в некоторых жизненно важных органах обусловлен необходимостью их защиты при недостаточном поступлении витамина С с пищей, так как, хотя страдает весь организм, ущерб, причиненный цингой мозгу, гораздо серьезнее, чем, скажем, скелету. Однако более вероятно, что такой повышенный уровень содержания аскорбиновой кислоты отражает более специализированные функции, например, участие в синтезе гормонов и нейромедиаторов надпочечников и мозга, а также в формировании иммунного ответа в селезенке и лейкоцитах, стимулирование пен- тозофосфатного цикла в печени, поддержание прозрачности хрусталика и роговой оболочки глаза.

Потребление, экскреция и метаболизм

Для профилактики цинги человеческому организму необходимо 10 мг витамина С в день, ежедневная рекомендуемая доза в Великобритании составляет 30 мг, а лабораторная крыса способна синтезировать в день количество, эквивалентное 2000 мг (2 г)! Ясно, что крыса и другие животные, включая и человека, а также растения, не содержащие коллаген, используют аскорбиновую кислоту и для иных целей, отличных от профилактики цинги. В медицине существует направление (гл. 6), не пользующееся сегодня популярностью, рекомендующее прием мегадоз (1-10 г в день). Возможно, это и имеет смысл. Но аргументом против этого служит то, что организм взрослого человека способен аккумулировать только ограниченное количество витамина, обычно 2-3 г, возможно 4 г. При этом уровень в плазме достигает 1,4 мг%. Избыточные количества, которые не успевают метаболизировать (скорость метаболизма 5-20 мг в день), усваиваются организмом, но сразу выводятся почками в неизмененном состоянии. Недавнее утверждение о том, что усваиваться может не более 500-600 мг в день, значительно ослабляет аргументацию против потребления витамина С в больших дозах. Аскорбиновая кислота метаболизирует в печени и почках, подвергаясь серии последовательных превращений, конечным результатом которых является образование щавелевой кислоты, выводимой с мочой. Катаболизм аскорбиновой кислоты у животных можно представить в виде схемы, приведенной на рис. 5.20. Так как аскорбатоксидаза находится в „спящих“ семенах в активном состоянии, полагают, что ее инактивация или, вернее, повышение уровня содержания аскорбиновой кислоты может служить тем спусковым механизмом, который запускает цепь метаболических реакций.

L-аскорбиновая кислота

ь-аскорбат-анион

свободный аскорбатныйсвободный аскорбатныйдегидроаскорбиноваядегидроаскорбиноваяРис. 5.20. Катаболизм аскорбиновой кислоты.Рис. 5.20. Катаболизм аскорбиновой кислоты.

свободный аскорбатный

свободный аскорбатный

дегидроаскорбиновая

дегидроаскорбиновая

Рис. 5.20. Катаболизм аскорбиновой кислоты.

Рис. 5.20. Катаболизм аскорбиновой кислоты.

В то время, как о биосинтезе и деградации витамина С кое-что все-таки известно, его роль в качестве специфического кофермента остается неясной. Хорошо известно, что его восстановительные свойства делают его прекрасным косубстратом в монооксигеназных реакциях гидроксилирования, приводящих к образованию аминокислот и катехоламинов. Благодаря этим же свойствам витамин С обеспечивает защиту не только клеток, устраняя свободные радикалы, но и других антиоксидантов типа витамина Е. Его хелатирующие и(или) восстановительные свойства способствуют усвоению соединений железа в кишечнике. Высказано предположение, что он может функционировать в виде циркулирующей окислительно-восстановительной пары в электронном транспорте и при создании мембранного потенциала, а его статус соответствует статусу цитохрома с. В настоящее время можно предположить, что основная роль витамина С в метаболизме заключается в том, что он является оптимальным, но не единственным фактором, необходимым для поддержания многочисленных железо- и медьсодержащих ферментов в восстановительном состоянии, в котором они наиболее функционально активны. Витамину С были полностью посвящены три симпозиума. Последний из них состоялся в 1986 г. и охватил следующие направления: нейрохимия, здоровье и эпидемиология, здоровье и болезнь, биохимия и иммунология, ксенобиотики, анализ, метаболизм и безопасный уровень потре-

бления. На этот симпозиум съехались в основном ученые-медики, что и неудивительно; основная область биосинтеза и использования витамина С — растительный мир — упоминался лишь вскользь. Наш понятный интерес к различным аспектам химии и биохимии витамина С, подогреваемый весьма ощутимыми доходами от его производства, — не лучший стимул к разрешению загадки о существовании одной основной биологической функции у этой простой молекулы или ее отсутствии. Наш энтузиазм обусловлен просто отсутствием у всех нас L-гулонолактоноксидазы. И виноват в этом один-единственный ген, которого наши далекие предки лишились 25 миллионов лет назад, что и обрекло человека вместе с другими приматами, а также некоторыми видами птиц, летучих мышей, жуков и, конечно, морскими свинками быть отчасти „вегетарианцами поневоле".

Глава 6. Витамин С в медицине

Можно спорить, действительно ли применение витамина С, пусть еще и не распознанного под маской цитрусовых, для профилактики цинги испанскими мореплавателями, осмелившимися пересекать Атлантику и Тихий океан в XVI-XVII вв., положило начало диетологии как области современной медицины. Начиная с XVII в., лимонный сок входил в запасы провианта судов голландской Ост-Индской компании, и что более удивительно, соками цитрусовых снабжались некоторые английские корабли в начале XVIII в. Правда, вскоре упоминания об этом исчезли из архивов и возобновились только после знаменитых клинических испытаний Джеймса Линда, описанных в гл. 2, результатом которых в 1753 г. стали рекомендации ежедневно выдавать всем морякам лимонный сок. Почти наверняка можно сказать, что моряков умышленно лишали продуктов с антискорбутным действием, чтобы ослабить их и полностью держать под контролем Ост-Индской компаний. Не менее грязные побуждения, в основе которых была зависть к профессиональным успехам доктора Линда, заставили британский флот задержать выполнение его рекомендаций на 42 года. Эту скандальную в истории медицины задержку прервал только мятеж, одним из требований которого было обеспечить „достаточное количество овощей11. Последующие двести лет завершились успешной идентификацией активного ингредиента овощей и фруктов, так необходимого для здоровья человека. Предписываемые ежедневные дозы витамина С для профилактики и лечения практически всех основных патологических состояний человека и лабораторных млекопитающих колеблются от нескольких миллиграммов до многих граммов (правда, в некоторых случаях прием мегадоз может оказаться и причиной заболевания). Широкое использование витамина С создает основу для большого международного бизнеса, начиная с химического синтеза и заканчивая формированием таблеток. И все же, как мы видели, это простое углеводоподобное вещество горько-сладкого вкуса все еще це раскрыло своих секретов. Его физиологическая роль в организме так и не ясна до

конца, несмотря на успешное использование витамина С в лечении различных патологических состояний, зачастую, казалось бы, с ним никак не связанных. Сотни лет его использовали для лечения цинги, а в последние два года было показано, что витамин С вызывает состояние ремиссии у некоторых больных с аутоиммунной тромбоцитопенией. Вера в него пациентов при отсутствии понимания механизма действия препарата оказывает неоценимую помощь медикам. Для таких, терапевтических целей назначают перорально ежедневный прием сотен или даже тысяч миллиграммов, что значительно превышает относительно малые количества витамина С, необходимые для профилактики цинги. Существенно превышают эти количества и поступления витамина С с пищей у здорового человека, который следует рекомендуемой диетической норме (РДН) или превышает ее. Правда, выражается некоторое беспокойство по поводу того, что такие большие поступления могут вызывать нежелательные побочные эффекты. При некоторых патологических состояниях, очевидно, следует максимально снизить потребление витамина С, хотя в общем случае его действие на организм, безусловно, благотворно.

Недостаточность витамина С

В гл. 2, целиком посвященной цинге, акцент был сделан на историческом аспекте. Но этот классический авитаминоз не следует игнорировать и сегодня. Для цинги характерен длинный список симптомов: кровоточивые десны, состояние депрессии, легкость образования кровоподтеков, незаживающие раны и несра- стающиеся переломы, раздражительность, боли в суставах, гниение и выпадение зубов, общее недомогание и утомляемость. Диагноз можно поставить на основании и более ограниченных наблюдений, в частности, по изменению окраски небольших участков кожи зследствие разрыва кровеносных сосудов (петехиальные кровоизлияния) и легкости образования гематом (экхимоз и пурпура), по образованию красных сосудов с точечными и линейными кровоизлияниями на нижней поверхности языка (подъязычные кровоизлияния) и по гиперкератозу волосяных фолликул, сопровождающемуся закручиванием волос и образованием на коже вокруг них розовых ободков. Только одного последнего признака достаточно для точного диагноза. У добровольцев из студентов- медиков, находившихся на специальной диете, все симптомы проявлялись через один-два месяца. Уже через месяц можно было поставить диагноз на основании низкого уровня аскорбиновой ки-

слоты в плазме, составляющем 0,2 мг% и ниже при средней норме около 1,2 мг% (допустимые пределы 0,6-2,5 мг%), а также низкого содержания аскорбата в лейкоцитах (15-18 мкг на 108 клеток при норме по крайней мере 25 мкг на 108 клеток). Клинический диагноз можно подтвердить результатами теста Хесса: давление в 100 мг ртути, обеспечиваемое манжетой прибора для измерения кровяного давления, через пять минут вызывает характерные петехиальные явления. Еще одной гематологической аномалией является анемия, вызываемая предположительно нарушениями в поглощении железа и в метаболизме фолиевой кислоты, а также нарушениями в образовании эритроцитов в костном мозге (эритропоэз). Полагают, что все перечисленные процессы являются витамин С-зависимыми. Уже через две недели, когда уровень аскорбиновой кислоты в плазме еще соответствовал норме, у некоторых добровольцев наблюдались психические расстройства в виде ипохондрии и депрессии. При лечении витамином С кожные дефекты у пациентов полностью исчезают; обычно назначают 200 мг витамина в день в течение недели с последующим снижением его дозы. Но с сосудистыми нарушениями приходится смиряться: расширение сосудов под языком оставляет незаживающие трещины. Наиболее заметны те симптомы цинги, которые объясняются нарушениями в образовании коллагена в соединительной ткани, окружающей все животные клетки и составляющей основу скелета и дентина. Недавно в работе американских ученых было показано, что пища, не содержащая витамина С, вызывает у молодых людей воспаление и кровоточивость десен. Согласно рекомендуемой диетической норме, прием 60 мг аскорбиновой кислоты в день помогает избежать подобных явлений.

Для клинициста очень важно сразу распознать симптомы цинги, так как отсутствие надлежащего лечения ведет к смерти пациента. Существует точка зрения, что в западных странах авитаминозы больше не встречаются. Но это отнюдь не так, особенно в среде городской бедноты. Признано, что авитаминозом, связанным с недостаточностью витамина С, страдают хронические больные, престарелые и одинокие люди. Ему подвержены также те, кто избегает употребления кислых продуктов из-за расстройств пищеварения типа грыжи отверстия пищевода; хронические алкоголики (которые, кроме этого, гораздо серьезнее страдают от недостаточности витамина В); пациенты, подвергающиеся перитонеальному диализу и гемодиализу, а также младенцы, получающие невита- минизированное коровье молоко. Согласно результатам исследования, проведенного в 70-х гг. в Великобритании, 80% живущих дома пожилых людей, в течение долгого времени страдали недо-

статочностью витамина С, а среди госпитализированных ситуация была еще хуже. В противоположность этому пожилые вегетарианцы обладали крепким здоровьем (с точки зрения цинги), уровень аскорбиновой кислоты в плазме у них обычно составлял 1,02 мг%, а концентрация в лейкоцитах — 36 мкг на 108 клеток. Питание в большинстве английских государственных школ явно обеднено витамином С, а медицинское обследование молодежи, занятой в строительной промышленности, а также служащих английского военно-морского флота, показало, что около трети из них имеют кожные и подъязычные признаки цинги. Представители низших социальных слоев, имеющие склонность к алкоголизму и табакокурению и игнорирующие в рационе питания свежие овощи, удовлетворяют свои потребности в витамине С в основном за счет картофеля; но его кулинарная обработка зачастую сводит на нет поступления витамина из этого источника. Говорят, что к другим факторам, снижающим уровень аскорбиновой кислоты в тканях, относится пероральный прием контрацептивов, а также множество заболеваний и расстройств. Здоровому человеку вполне достаточно ежедневно получать 10 мг витамина С для профилактики цинги, симптомы которой могут проявиться при падении суммарного уровня аскорбиновой кислоты в организме ниже 300 мг.

Сохранение здоровья

Рекомендуемые диетические нормы (РДН) на протяжении последних десятилетий испытывали большие колебания в зависимости от личных, национальных и прочих пристрастий, изменяясь от 10 мг витамина С в день до количеств, в тысячи раз больших. Рекомендуемая норма в США относительно высока по сравнению с английской, которая находится в большем соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения. Недавно РДН для взрослых в Великобритании, США и СССР составляли 30, 60 и 90 мг в день соответственно. Однако надо учитывать, что потребление витамина С следует корректировать в зависимости от возраста, стрессового и физиологического состояния и, возможно, пола. Мода и представления быстро меняются, и в настоящее время вполне разумными выглядят цифры, приведенные в табл. 6.1. В США установлены такие РДН, которые „обеспечивают хорошее питание практически всему здоровому населению Америки". Цель вполне ясна, но на практике порой бывает трудно следовать рекомендациям: в них указано суммарное количество витамина, и отдельному человеку довольно сложно оценить его содержание во всех компонентах рациона.

Таблица 6.1. Рекомендуемые диетические нормы (РДН) ежедневного потребления витамина С

РДН/мг в день

Младенцы

35

Дети

45

Подростки

50

Взрослые

60

Беременные женщины

80

Кормящие матери

100

Старики

150

На практике некоторые люди просто включают в свой рацион разумные количества овощей и фруктов, полагая, что при этом организм обеспечивается всем необходимым. Другие не придают большого значения диете, но принимают витамины в таблетках. Третьи, и их большинство, вообще находятся в блаженном неведении. Лица, относящиеся к третьей категории, из-за своей лени или незнания, более свойственных одиноким пожилым людям, игнорируют сбалансированное питание, отдавая предпочтение таким удобным блюдам, как макароны, чай и бутерброды. Рано или поздно это неминуемо ведет к проблемам со здоровьем. Поклонники витаминов в таблетках сталкиваются со сложностями прямо противоположного рода, так как большинство таблеток содержит более 60 мг аскорбиновой кислоты. Путаница может возникнуть и из-за неточности информации на этикетке препарата. Например, на этикетке указано: „Витамин С, таблетки В.Р. 100 мг“. А так как таблетки содержат ряд ингредиентов, остается неясным, то ли масса каждой равна 100 мг, то ли каждая содержит 100 мг аскорбиновой кислоты. Как правило, верно последнее. Препараты витамина С, как и некоторые другие, иногда снабжаются аннотацией, где указано, что они могут вызывать местные повреждения пищевода, если их глотать целиком. Это выражается в виде жгучей боли в груди и приводит к образованию язв на слизистой оболочке, которые, однако, бесследно исчезают через несколько дней. Принимая таблетку, следует подстраховаться и запить ее несколькими глотками воды или еще лучше предварительно разжевать. Довольно неприятный вкус аскорбиновой кислоты делает последний способ похожим на упражнение по мазохизму; но, с другой стороны, подтверждается расхожее мнение, что лекарство только тогда полезно, когда оно горькое.

Превышение РДН вряд ли может принести какой-либо вред, хотя некоторые утверждают, что высокие нормы потребления витамина С приносят пользу только фармацевтической промышленности. Мегадозовый режим приема (1-40 г в день) имеет много сторонников, первый среди которых дважды лауреат Нобелевской премии Лайнус Полинг. На самом деле трудно понять, каким образом очень большие дозы витамина С могут оказывать благотворное действие, так как его усвояемость организмом ограниченна. Повышение уровня аскорбиновой кислоты в плазме происходит только при поступлении до 150 мг в день. Превышение этого количества снижает усвояемость, и уровень витамина С в плазме остается практически неизменным (усваивается 95% из 100 мг в день, но только 20% из 5 г в день). Низкий уровень аскорбиновой кислоты в почках доказывает, что произошла стимуляция ферментов печени, участвующих в катаболизме витамина С, и его избыток экскретировался. Уровень аскорбиновой кислоты в плазме порядка 1,4- 2,0 мг% отражает насыщение всех тканей организма витамином С (1500-3000 мг), а избыток удаляется почками в виде аскорбата, дегидроаскорбата, аскорбат-2-сульфата и щавелевой кислоты.

Показателем уровня витамина С в организме служит уровень аскорбиновой кислоты в плазме. На состояние недостаточности указывает его падение ниже 0,5 мг%. Обнаружено, что уровень в плазме снижается при многих патологических состояниях, таких, как инфекционные болезни, застойная сердечная недостаточность, болезни печени и почек, гастроэнтерологические и эндокринные расстройства, пурпура (гемморагическая сыпь), злокачественные образования. Пациенты в лихорадочном состоянии, перенесшие хирургическое вмешательство или травму, нуждаются в больших поступлениях витамина С с пищей. Это также относится к курильщикам, к больным, получающим питание парентерально (для компенсации потерь с мочой), и к тем, кто подвергся переохлаждению или перегреву. Оказалось, что шахтерам в Южной Африке необходимо 300 мг витамина в день для поддержания его содержания в плазме на уровне порядка 0,7 мг%. Правда, подозревают, что до начала обследования они уже страдали маргинальной цингой. Для установления концентрации витамина С в плазме проводится стандартный тест „на насыщение". Пациент перорально принимает большую дозу аскорбиновой кислоты. Если ткани организма насыщены витамином, большая часть дозы выводится в течение последующих 24 ч, в состоянии недостаточности большая часть дозы удерживается. Интерпретация результатов этого теста может оказаться затруднительной, так как по оценкам многих химиков-клиницистов норма содержания аскорбиновой кислоты в

плазме колеблется в широких пределах — от 0,6 до 2,5 мг%. Альтернативным методом исследования служит анализ лейкоцитов, содержание витамина С в которых составляет в норме по крайней мере 25 мкг на 108 клеток, что более точно отражает уровень витамина в организме.

В западных странах большинство населения полагается на натуральные источники витамина С в пище. В процессе кулинарной обработки продуктов следует соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму потери аскорбиновой кислоты. Как уже упоминалось в гл. 5, при мелкой резке овощей высвобождается аскорбат- оксидаза, разрушающая витамин, а при использовании для варки больших объемов воды он вымывается. Повторный разогрев блюд и добавление бикарбоната натрия, теперь уже, к счастью, редко используемого, также ведет к потерям витамина вследствие его окисления, которое особенно быстро протекает в медной посуде. Для младенцев, как и для детенышей всех млекопитающих, материнское молоко является ценным продуктом, содержащим 3,0- 5,5 мг% витамина С. Коровье молоко не так им богато, и в случае его использования для вскармливания требует обогащения питательными добавками.

В настоящее время нет уверенности, что в РДН предусмотрены оптимальные количества потребления аскорбиновой кислоты, так как не установлено четких границ между ее недостаточностью и избыточностью, которая может оказывать токсическое действие. Для выяснения оптимальной скорости поступления витамина С в организм человека использовали интересный подход. Сравнивали скорость биосинтеза аскорбиновой кислоты у различных млекопитающих и ее суммарное количество в организме витамин С- зависимых близкородственных приматов. Оказалось, что среди подопытных животных жвачных и грызунов биосинтез витамина С в микросомальной фракции печени с минимальной скоростью осуществляется у собак и кошек — 5 мг/кг живого веса в день, а максимального значения скорость биосинтеза достигает у мышей — 275 мг/кг живого веса в день. Значение РДН для человека, равное 60 мг в день, соответствует скорости биосинтеза всего лишь 0,9 мг/кг живого веса! Результаты опытов с другими приматами также свидетельствуют в пользу увеличения существующей нормы. Так, у южноафриканских и резус-мартышек малые дозы витамина С, эквивалентные скорости биосинтеза 0,6 мг/кг веса в день, предотвращали возникновение цинги. Но для сохранения здоровья и поддержания поголовья здоровых животных в популяции южноафриканских и резус-мартышек, белок, макак и бабуинов необходимы были дозы, соответствующие 3-35 мг/кг веса

в день. Кроме того, и морские свинки нуждаются в десятикратном увеличении противоцинготной дозы для сохранения здоровья, быстрого заживления ран и выхода из наркоза. Все вышеизложенные наблюдения дают возможность полагать, что при установлении РДН нельзя исходить только из антискорбутного действия витамина С, такой подход может привести к большой недооценке.

Терапевтическое применение

Кроме цинги, теперь уже редко встречающейся в основной массе населения, существует много других патологических состояний, для лечения которых используют витамин С. Далеко не во всех случаях это логически оправданно. Витамин С назначают либо перорально, либо внутривенно, обычно в ежедневной дозе 3 х 100 мг. Это лечение традиционно назначается в случае хирургического вмешательства, травм и язвы двенадцатиперстной кишки. Витамин С не только способствует заживлению ран, но также укрепляет иммунную систему организма, что препятствует проникновению опасных инфекций. Именно поэтому аскорбиновая кислота назначается при инфекционных заболеваниях, лихорадочных состояниях и поносе, а также в тех случаях, когда высока степень риска проникновения инфекции и возникновения воспаления, например при гемодиализе. Витамин С используют в геронтологической психиатрии, в домах престарелых, рекомендуют беременным женщинам, новорожденным и их матерям. Для подкисления мочи при хронических инфекциях мочевыводящих путей назначаются 0,5-0,3 г в день. Витамин С известен как иммуномодулятор, действующий на различные точки иммунной системы. Например, он ингибирует гистидиндекарбоксилазу, подавляя таким образом образование иммуносупрессора гистамина; способствует активности нейтрофильных лейкоцитов; нейтрализует избыточный уровень реактивных оксидантов, продуцируемых фагоцитами при хронической инфекции.

Витамином С лечат некоторые болезни крови и кровеносной системы. Анемия, сопровождающая цингу, уже упоминалась. Но витамин С показан и при обычной анемии, вызванной недостатком в организме железа. Правда, одновременно необходимо лечение препаратами железа. Аскорбиновая кислота способствует усвояемости железа организмом за счет образования с ним растворимых комплексов и восстановления Ееш до Ее11, препятствуя таким образом связыванию железа в кишечнике фитатами и таннинами, поступающими с пищей. Уровень восстановленного железа в крови

можно поддерживать, подобрав подходящую железосодержащую диету с добавлением в каждый прием пищи 25-50 мг аскорбиновой кислоты. Предполагают, что рацион первобытного человека был богат мясом (обеспечивающим 35% энергии) и аскорбиновой кислотой (до 40 мг в день), а потому он и не страдал анемией, несмотря на всю грязь и грубость своей очень непродолжительной жизни!

Для того чтобы гемоглобин мог участвовать в транспорте кислорода, атом железа в молекуле гема должен находиться в восстановленном состоянии Fe11. Как правило, свыше 98% гемоглобина присутствует в организме в этой форме и менее 2%— в виде функционально неактивного метгемоглобина с окисленным Реш. Обычно эти небольшие количества метгемоглобина восстанавливаются до гемоглобина под действием фермента НАДН/метге- моглобинредуктазы (также называемого цитохром-65-редуктазой эритроцитов). Известно несколько типов врожденной метгемоглобинемии, обусловленных недостаточностью цитохром-65-редуктаз- ной системы. При этом назначается пероральный ежедневный прием 500 мг аскорбиновой кислоты или 100-300 мг метиленового синего. Очевидно, аскорбиновая кислота непосредственно, хотя и медленно, восстанавливает метгемоглобин, тогда как метиленовый синий активирует находящуюся обычно в латентном состоянии НАДФН-дегидрогеназу, обеспечивая таким образом непрерывность цепи превращений в НАДН-системе. Этот тип метгемоглобинемии является легкой формой заболевания, а лечение просто устраняет проявления цианоза. Другой тип наследственной метгемоглобинемии обусловлен дефектами в молекуле самого гемоглобина, и хотя здесь аскорбат и метиленовый синий бессильны, состояние пациентов также не вызывает особой тревоги. Существует некоторое расхождение во мнениях относительно эффективности лечения аскорбиновой кислотой благоприобретенной метгемоглобинемии вследствие воздействия некоторых химических реагентов (тринитротолуол, нитробензол, анилин, нафтохинон, нафталин, рескорцинол, фенил гидр азин) или приема лекарственных препаратов (фенацетин, примахин, бензокаин, п-аминосалициловая кислота). Нитриты также вызывают метгемоглобинемию. Некоторые пациенты вместо аскорбиновой кислоты предпочитают принимать метиленовый синий, который оказывает гораздо более быстрый эффект. В острых случаях вопрос скорости является весьма существенным, так как вслед за тяжелым цианозом могут последовать коллапс, кома и в конечном итоге смерть.

Метгемоглобинемия обусловлена в-конечном итоге'наличием в организме больного пероксидных радикалов О2 , которые в норме

находятся под контролем фермента супероксидцисмутазы (СОД), требующего присутствия витамина С в качестве кофермента. Полагают, что прием аскорбиновой кислоты может снимать острое состояние у пациентов с серповидно-клеточной анемией, когда эритроциты обеднены витамином и подвержены разрушительному действию оксидантов.

Доказано, что в более высоких дозах витамин способствует улучшению липидного обмена в организме. Вследствие этого предотвращается отложение холестерина на стенках артерий и снижается риск коронарной недостаточности. При коронарной недостаточности уровень аскорбиновой кислоты в плазме и лейкоцитах снижается, и что здесь является причиной, а что следствием, пока не ясно. Тем не менее полагают, что витамин С способствует профилактике атеросклероза, так как поддерживает целостность стенок артерий (за счет надлежащего уровня гидроксипролина, необходимого для биосинтеза коллагена), снижает уровень в крови холестерина (способствуя биосинтезу желчной кислоты) и триглицеридов (активируя липазу плазмы). Витамин С полезен для здорового обмена еще и тем, что уменьшает агрегацию тромбоцитов и повышает фибринолитическую активность в крови. У некоторых цинготных больных, добровольно участвовавших в медицинских экспериментах, были обнаружены сердечно-сосудистые расстройства. Явления атеросклероза наблюдались также у грызунов и поросят, находившихся на искусственном рационе, лишенном витамина С. Однажды его окрестили даже „сердечным витамином“. Хотя и можно проследить взаимосвязь между случаями ишемической болезни сердца (ИБС) и низким уровнем аскорбиновой кислоты в плазме, скорее последнее является следствием первого, а не наоборот. Тем не менее фактором риска при ИБС по мнению некоторых специалистов является наличие различных агрессивных форм кислорода, например, супероксидного радикала, существование которого находится под контролем витамин С-зависимой супероксиддисмутазы .

Прй довольно распространенном заболевании, идиопатической тромбоцитопенической пурпуре, иногда возникают аутоиммунные состояния, вызванные применением лекарственных препаратов, когда антитела действуют на тромбоциты, которые затем разрушаются в селезенке. Это выражается в обильном кровотечении и образовании кровоподтеков и обычно лечится адренокортикостероидами, некоторыми алкалоидами, иммуносупрессорами, да- назолом, внутривенно гаммаглобулином или, что более эффективно, операционным путем (удалением селезенки). Однако все виды лечения сопровождаются сильными побочными эффектами и ни

одно из них не является на 100% эффективным. В 1988 г. одна упорная пациентка принимала витамин С, и у нее повысилось количество тромбоцитов. Это заставило врачей провести клинические испытания, в результате которых у семерых из одиннадцати пациентов, принимавших по 2 г витамина С ежедневно, возросло количество'тромбоцитов и время их жизни, а образование кровоподтеков и петехия уменьшились. Этот нетоксический способ лечения был с успехом опробован и в других больницах, но, как сказал мне один специалист из Белфаста: „Мы не знаем, как это получается!"

Гораздо более редко встречающееся заболевание обусловлено врожденным нарушением в образовании лизосом. Оно приводит к дисфункции меланоцитов, тромбоцитов и фагоцитов и выражается соответственно в виде альбинизма, слабых кровотечений и пониженной сопротивляемости к бактериальной инфекции. Это заболевание известно под названием болезни Чедика — Хигаши, в случае проникновения неконтролируемой инфекции оно обычно приводит к летальному исходу за десять-двадцать дней. Однако некоторым пациентам удавалось исправить свой микроцидный дефект с помощью больших доз аскорбиновой кислоты (20 мг на кг веса в день).

Различные наследственные дефекты в синтезе а- и /3-цепей гемоглобина приводят к целой группе нарушений, известных как талассемия (средиземноморская анемия). В наиболее тяжелых случаях, таких, как большая /3-талассемия, единственное лечение, которое может поддержать жизнь, заключается в регулярном переливании крови. Однако это чревато неизбежным побочным эффектом в виде огромного переизбытка железа. Ситуацию можно до некоторой степени исправить с помощью препарата десферри- оксамина (дефероксамин, десфереал), который способствует выведению из организма железа с мочой. Эффект можно усилить, если одновременно с этим принимать перорально аскорбиновую кислоту в дозах от 150 мг до 2 г в день. Использование витамина С в лечении талассемии является спорным вопросом и будет обсуждаться позже в разделе „Токсические эффекты".

Витамин С обычно прописывают в случае угрозы выкидыша, при тиреотоксикозе, ахлоргидрии, поносе, тропическом лишае, ревматических воспалениях, артрите, а также при травмах позвоночника для снижения кислотности мочи. Физиологические основы терапии витамина С не всегда полностью ясны, за исключением случаев ахлоргидрии и поноса, когда существует угроза возникновения анемии из-за пониженного всасывания через кишечник негемового железа, что и выправляется с помощью витамина С.

Выполненные недавно эпидемиологические исследования дают основания полагать, что низкий статус витамина С сопутствует катаракте и повышенному внутриглазному давлению, диабету, табакокурению и злоупотреблению алкоголем. Катаракта обычно встречается у лиц пожилого возраста, когда статус витамина С особенно низок, и в основном у мужчин. Одной из причин возникновения катаракты у пожилых людей являются кислород и его радикалы, особенно супероксид-ион О^, который, как мы уже видели, в норме разрушается аскорбатзависимым ферментом супер- оксиддисмутазой. Было обнаружено, что в присутствии аскорбата экспериментально полученное in nitro фотохимическое повреждение хрусталика глаза животных восстанавливается, а человеческий хрусталик поражается катарактой в значительно меньшей степени. Клинические испытания, к которым привлекали 450 пациентов с катарактой в начальной стадии, продемонстрировали, что ежедневный прием 1 г витамина С приостанавливает ее развитие. Измерения внутриглазного давления показали, что для пожилых людей благотворны ежедневные дозы, начиная со 150 мг, хотя для пациентов, страдающих глаукомой, лечебный эффект был в каком-то роде смешанным. Оказалось, что для части больных глаукомой полезно местное употребление 10%-ного водного раствора три раза в день.

Недавно австралийские ученые обнаружили, что уровень витамина С в организме больных диабетом на 70-80% ниже, чем у здоровых людей. Эти данные подтверждают результаты работы, выполненной ранее в Индии, и дают основания полагать, что именно в этом кроется корень таких осложнений, как сердечная и почечная недостаточность, слепота и гангрена. Согласно одной из гипотез, хроническая гипергликемия может быть связана с внутриклеточным дефицитом аскорбиновой кислоты в лейкоцитах вследствие того, что глюкоза и аскорбиновая кислота достаточно схожи между собой и могут транспортироваться внутрь клетки с помощью одной и той же мембранной системы. Это приводит к тому, что у больных диабетом, не получающих лечения, ослаблена ответная реакция организма в случае острого воспаления, повышена восприимчивость к инфекции и наблюдается патология в заживлении ран. Пока не ясно, то ли у этих больных организм способен поглощать меньше витамина, чем у здоровых людей, то ли экскретировать его в больших количествах. Есть предположение, что на их состояние должны положительно влиять дозы витамина, повышающие толерантность к глюкозе. Однако очень больших доз тоже следует избегать, так как это ведет к повышению уровня де-

гидроаскорбиновой кислоты в крови, что в свою очередь вызывает сахарный диабет у крыс!

Хорошо известный токсический эффект алкоголя можно снизить, если принимать витамин С, который в данном случае подключается к процессу детоксикации в печени, участвуя в окислении системы цитохрома Р450. Возможно, любителям джина с тоником следует посоветовать вернуться к старомодной смеси джина с апельсиновым соком, чтобы более безболезненно преодолевать последствия выпивки. Витамин С также использовался для лечения в случаях отравления свинцом, но тщательно проведенные клинические испытания не выявили никакого положительного эффекта аскорбата в снижении концентрации тяжелых металлов в волосах.

Высказывалось предположение, что участие витамина С в превращении незаменимой жирной арахидоновой кислоты в просто- гландины способствует поддержанию тонуса и реактивности дыхательной системы. Следовательно, витамин может быть полезен для облегчения состояния больных, страдающих бронхиальной астмой и энфиземой легких. Ежедневная доза в количестве 1 г предотвращала у некоторых пациентов приступы астмы, у других одноразовый прием 4-8 г приносил облегчение во время приступа. Возможно, энфизема и рак легких обязаны своим возникновением повышенному уровню в организме полиморфноядерных лейкоцитов и макрофагов (например, вследствие воздействия сигаретного дыма), что влечет за собой увеличение количества реактивных оксидантов. А как уже упоминалось, витамин С наряду с другими соединениями выполняет важную роль по их нейтрализации. В результате курения уровень витамина в плазме падает до 0,2 мг%, и курильщикам необходимо добавочно получать 60-70 мг в день, чтобы компенсировать это снижение. Не ясно, является ли причиной низкого уровня аскорбата в плазме курильщиков повышенная скорость метаболизма, пониженное поглощение или просто недостаток поступления витамина С с пищей в силу их привычки исключать из рациона фрукты.

Витамин С также рекомендуется для лечения и профилактики простуд, психических заболеваний, бесплодия, рака и СПИДа. Его использование в этих случаях является спорным и не всегда находит поддержку официальной медицины.

Результаты клинических испытаний не выявили ничего конкретного относительно эффективности витамина С в лечении простудных заболеваний. Тем не менее многие уверены, что регулярный прием от одного апельсина до нескольких граммов аскорбиновой кислоты в день помогает избежать этой распространенной

инфекции или облегчает протекание болезни. Результаты экспериментов свидетельствуют, что в лучшем случае удается добиться значительного уменьшения числа дней нетрудоспособности. Доказано, что витамин С стимулирует деятельность щитовидной железы и, следовательно, может приводить к ускорению метаболических реакций. В совокупности с несомненной антигистаминной и иммунологической ролью это еще раз подтверждает его значимость в поддержании здорового образа жизни. Эти же доводы свидетельствуют и о его необходимости для продления жизни. „Пока вы чувствуете себя хорошо, вы здоровы,11 — этой точки зрения придерживаются многие. Тем не менее представляется, что лозунг „Витамин С — это молодость в бутылке11 заводит слишком далеко. Абсолютно ясно только то, что уровень аскорбиновой кислоты в плазме и лейкоцитах сильно понижается при простуде и других инфекциях. Возможно, это объясняется окислением аскорбата вследствие повышенной активности нейтрофильных лейкоцитов, но нет конкретных доказательств того, что такие инфекции можно предотвращать с помощью факторов питания.

Клинические испытания не продемонстрировали эффективности аскорбиновой кислоты в лечении мужского бесплодия. Тем не менее, когда в качестве его причины предполагается агглютинация спермы, прописывают витамин С в количестве 1 г в день в течение десяти дней с последующим ежедневным приемом 500 мг на протяжении двух менструальных циклов партнерши. Возможно, агглютинация объясняется нежелательным окислением белка семенной жидкости. В присутствии витамина С происходит его восстановление, и сперматозоиды, как говорят, „плавают поодиночке11. Обычно семенная жидкость человека содержит около 12 мг% аскорбиновой кислоты, что значительно превышает ее содержание в сыворотке (1,2 мг%).

В одной из работ высказано весьма сомнительное предположение, что большие дозы витамина оказывают лечебное действие в случае болезни Паркинсона, шизофрении, депрессии, болезни Альцгеймера и задержки умственного развития. Тем не менее имеются надежные свидетельства в пользу того, что некоторые пациенты с психическими расстройствами находятся на грани заболевания цингой и в таких случаях лечение витамином С может оказаться благотворным. Существуют данные, свидетельствующие о том, что при некоторых депрессивных состояних, вызываемых соединениями пятивалентного ванадия, витамин С может оказывать защитное действие, восстанавливая его до безвредной четырехвалентной формы. Много говорилось об успешном использовании витамина С перорально в умеренных дозах для лечения маниа-

кального синдрома, повторяющихся длительных депрессивных периодов и раздражительности у детей с пониженной способностью к обучению. Но это скорее эпизодические случаи, чем результаты двойных (слепых) клинических испытаний в строго контролируемых условиях. Причина популярности витамина С в терапии умственных заболеваний кроется в его общепризнанной биохимической роли в синтезе различных нейромедиаторов, о чем говорилось в гл. 5. В настоящее время наблюдается возрождение интереса к поиску возможной взаимосвязи между недостаточностью в организме витамина С и такими расстройствами, как болезнь Альцгеймера и старческое слабоумие.

И все-таки самые яркие дискуссии в области терапевтического применения витамина С разгорелись из-за лечения и профилактики рака. Лауреат Нобелевской премии Лайнус Полинг, один из наиболее активных сторонников мегадозового режима приема витамина С, в 1973 г. совместно с шотландским хирургом Эваном Камероном опубликовал результаты, демонстрирующие, что у раковых больных наступает состояние длительной ремиссии при ежедневном приеме 10 г витамина. Достаточно сказать, что вообще медики с большим сочувствием относятся к тем исследователям, которые усомнились в надежности данных, полученных Полингом и Камероном, а также в правильности постановки эксперимента, и в результате не смогли воспроизвести полученный ими эффект в крупных клинических испытаниях в США. Тем не менее есть ощущение, что витамин С может способствовать проявлению цитотоксичности некоторыми хемотерапевтическими средствами. Результаты недавних широкомасштабных клинических испытаний, проведенных в Европе, дают основания полагать, что витамин С может служить надежной защитой против рака желудка за счет своей способности (продемонстрированной in vitro) ингибировать образование нитрозаминов. Нитрозамины могут образовываться при взаимодействии нитритов с аминами, поступающими с пищей, и считаются важнейшей причиной возникновения рака желудка и пищевода. С пищей обычно поступает небольшое количество нитритов, но они могут образовываться в результате восстановления нитратов кишечными бактериями, именно поэтому такое беспокойство вызывает повышение уровня нитратов в питьевой воде. Анализ статистики заболеваемости раком желудка наглядно свидетельствует о том, что риск заболевания велик там, где в связи с географическим положением или низким уровнем культуры ощущается недостаток свежих овощей и фруктов, содержащих витамин С. Заболеваемость раком желудка в США, как нигде, высокая, значительно пошла на убыль с тех пор, как население

регулярно принимает витамин С. На основании медицинских экспериментов сделан вывод об эффективности аскорбиновой кислоты в профилактике рака матки. Недавно был продемонстрирован положительный эффект платинового производного аскорбиновой кислоты в лечении некоторых видов опухолей у мышей. Однако терапия мегадозами витамина С группы раковых больных с последующим хемотерапевтическим и радиационным лечением не дала заметных результатов, и было решительно опровергнуто мнение, что витамин С может заменить хирургическое вмешательство или хемотерапевтический и радиационный методы. Несмотря на противоположные точки зрения, некоторые авторитетные ученые полагают, что, учитывая угрозу раковых заболеваний, всем полезно принимать ежедневно 1-2 г витамина С. В ответ можно сказать только одно: вреда от этого, очевидно, не будет, и есть шанс получить некоторую пользу!

Лайнус Полинг недавно снова начал кампанию в поддержку исследований, направленных на использование витамина С в лечении больных СПИДом. Как известно, гомосексуальная община Калифорнии верит, что прием массивных доз витамина порядка 50-200 г в день — эффективный способ и профилактики заболевания, и улучшения состояния (если не для лечения) уже заболевших. Полинг заявил, что положительный эффект может оказаться только желаемым, но в любом случае проведение исследований необходимо хотя бы для того, чтобы похоронить ложные надежды.

Недавно в одной публикации, посвященной исследованию факторов питания на состояние здоровья, говорилось о том, что витамин С эффективен для профилактики и лечения не менее сорока патологических состояний. Кроме уже упоминавшихся заболеваний, этот список включает бурсит и ломкость сосудов (часто встречающиеся последствия спортивных травм), болезнь Крона, желчнокаменную болезнь, подагру, гепатит, простой герпес, гиперменорею, рассеянный склероз, ожирение, остеоартрит, ревматоидный артрит, утомляемость, язву желудка и двенадцатиперстной кишки, пролежни, хроническую крапивницу и патологию в заживлении ран. Впечатляют результаты клинических испытаний, в которых участвовали пациенты, перенесшие хирургическое вмешательство. Крайне нежелательным послеоперационным последствием является сывороточный гепатит. Из 1095 пациентов, принимавших ежедневно по 2 г витамина, ни один не умер, тогда как около 10% из 150 пациентов, получавших менее 1,5 г в день, погибли. Дозы свыше 10 г ускоряют выздоровление пациентов, страдающих вирусным гепатитом. Витамин С в комбинации с био- флаваноидами уменьшает образование пузырьков и вдвое сокра-

щает продолжительность заболевания простым герпесом, если начать лечение в начальной стадии. Смесь 250 г витамина С со 100 г сульфата цинка, используемая дважды в день лицами, страдающими повторяющимся герпесом, полностью подавляет вспышку, а симптомы часто ограничиваются легким покалыванием. Еще одно давно упрочившееся применение витамина С и цинка, практикуемое во многих больницах, — это лечение пролежней как пероральное, так и местное. В большинстве случаев витамин С назначается перорально: внутривенные инъекции 2 г трижды в неделю на протяжении шести-семи недель ускоряли выздоровление пациентов с язвой желудка и двенадцатиперстной кишки. В экспериментах на мышах аскорбиновая кислота способствовала снижению тяжести ожогов и обморожений, хотя подобный эффект у человека неизвестен.

Токсические воздействия

В пылу дискуссии, вызванной рекомендациями Лайнуса Полинга по профилактике различных заболеваний с помощью мегадоз витамина С, возникло представление о том, что большие дозы витамина могут быть причиной возникновения рака. В 1985 г. в журнале „New Scientist" появилась статья, озаглавленная „Витамин С: означает ли „С" „cancer"? Доказательства этой точки зрения основаны главным образом на результатах экспериментов на животных, которые трудно экстраполировать на человеческий организм. Тем не менее в статье выражались опасения по поводу того, что у пациентов, внезапно прекращавших прием больших доз аскорбиновой кислоты, ее уровень в организме резко падал значительно ниже нормы. Этот эффект, хотя и временный, может повышать восприимчивость организма к различного рода заболеваниям, в том числе и опухолевым. Резкий отказ от приема препарата даже в средних дозах может иногда вызывать цингу. Поэтому, если нужно прекратить прием витамина С, рекомендуется делать это постепенно, медленно снижая дозу и сводя ее на нет в течение нескольких дней, а то и недель.

Опасения вызывает также и то, что витамин С в больших дозах может способствовать образованию камней в почках, так как промежуточным продуктом его метаболизма является этанодио- тик (щавелевая кислота). И хотя эти опасения не подкреплены конкретными доказательствами, здравый смысл подсказывает не увлекаться чрезмерными количествами аскорбиновой кислоты тем, кто склонен к образованию камней или страдает почечными

расстройствами. Это поможет также избежать обострения ацидоза при хронических почечных заболеваниях и почечного тубулярного ацидоза. Сопутствующая гипероксалурия встречается относительно редко при приеме больших количеств витамина С.

В некоторых случаях дозы порядка 1-2 г в день могут вызывать незначительные болезненные ощущения в желудочно-кишечном тракте в виде ощущения дискомфорта и болей. Единственным существенным побочным эффектом действия больших доз является осмотический понос.

Было обнаружено, что поступление с пищей свыше 600 мг витамина С в день снижает оксидазную активность церулоплазмина в сыворотке человека. Полагают, что это может быть обусловлено отделением от молекулы фермента кофактора, в качестве которого выступает атом меди. Однако не было высказано никаких предположений относительно того, является ли диссоциация церулоплазмина причиной возникновения патологического состояния типа болезни Вильсона, когда уровень активности фермента снижен, а избыток меди откладывается в тканях. Недавно было обнаружено повышенное содержание меди за счет диссоциации церулоплазмина в клетках человека, обработанных как L-аскорбатом, так и его о-изомером.

Уже упоминалось, что витамин С широко используется на практике для усиления действия препаратов, способствующих выведению из организма с мочой переизбытка железа, особенно при талассемии и врожденной сидеробластической анемии. Высказывались опасения, что в этих случаях витамин повышает токсичность железа. Существуют данные, свидетельствующие о том, что у некоторых пациентов ухудшается функционирование левого желудочка и наступает общее ухудшение состояния миокарда. В настоящее время считается, что применять витамин С"для повышения эффективности дефероксаминовой терапии если вообще и стоит, то с максимальной осторожностью, особенно при лечении людей пожилого возраста. Из результатов экспериментов на животных явствует, что на клеточном уровне происходит разрушение мембранных липидов вследствие пероксидирования, что приводит к повреждению сердечной мышцы и снижению фагоцитозной активности, а это в свою очередь повышает вероятность проникновения инфекции. Нежелательное действие аскорбата может проявляться в том, что он восстанавливает Ее^1П\ высвобождаемый под действием дефероксамина, до Ее*-П\ который вступает в так называемую реакцию Фентона с эндогенным пероксидом водорода, образуя высокореакционноспособный и потому очень опасный гидроксильный радикал ОН . Гидроксильный радикал и являет-

ся причиной повреждения мембраны, так как вызывает пероксидирование липидов. Этот процесс сопровождается образованием малонилдиальдегида, который служит показателем степени разрушения мембраны. Обнаружено, что при приеме дефероксамина количество малонилдиальдегида снижается и увеличивается при поступлении в организм аскорбата. Интересно, что в племени банту в Южной Африке традиционно выхаживают пиво в "железной посуде, следствием чего является высокое содержание в организме железа. Тем не менее интоксикации не наблюдается, очевидно, по причине низкого статуса витамина С.

Некоторые причины для беспокойства есть у тех, кто страдает недостаточностью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы: прием мегадоз может вызывать гемолитические явления. У новорожденных, матери которых принимали большие количества витамина С, есть риск заболеть цингой вследствие поступления высоких доз в организм ребенка в период внутриутробного развития.

Кроме непосредственных токсических эффектов присутствие больших количеств витамина С может помешать правильной интерпретации результатов клинических анализов крови и мочи на наличие различных метаболитов. Отрицательные или положительные результаты различных тестов на содержание глюкозы в моче могут оказаться ложными, причем ложный отрицательный результат в этом случае препятствует выявлению скрытого кровотечения. Результаты автоматического метода анализа жидких сред организма на содержание аланинаминотрансферазы или глутаматпируват-трансаминазы, лактатдегидрогеназы и мочевой кислоты также могут оказаться ненадежными, если пациент принимает в день более 3 г витамина С.

Применение в ветеринарии

Интенсивные методы содержания домашнего скота вызывают у животных состояние стресса, что сказывается, например, на росте молодняка, яйценоскости кур и прочности скорлупы куриных яиц. Как показывает опыт, подобных проблем можно избежать, если добавлять в рацион домашних животных витамин С, хотя большинство из них и способны к его биосинтезу. У новорожденных телят эта способность, однако, очень ограничена, и они зависят от поступлений аскорбиновой кислоты с молоком. Согласно современной практике ведения интенсивного животноводства, телят рано отучают от материнского молока, и они особенно нуждаются в поступлениях витамина С с пищей. Обнаружено, что иногда соба-

ки страдают заболеванием, напоминающим цингу. Неспособность собак биосинтезировать аскорбиновую кислоту является, очевидно, врожденной, и на таких животных подкормка витамином С действует благотворно. Много работ с аскорбиновой кислотой проводилось в рыбоводстве. Установлено, что авитаминоз у рыб приводит к деформации спинного хребта, проникновению инфекции, плохому заживлению ран. Статус аскорбиновой кислоты у рыб определяется по концентрации ее в печени, отношению гидроксипролин : пролин в коже и содержанию коллагена в позвоночнике.

Биологическая значимость витамина С не исчерпывается его участием в биосинтезе гидроксилированных аминокислот, необходимых для формирования соединительных тканей. Окончательное установление роли витамина для живых организмов еще впереди. Однако уже сегодня представляется несомненным то, что кроме цинги многие другие недуги попадают в сферу влияния этого простого вещества горько-сладкого вкуса. Нет единого мнения относительно того, какое его количество составляет идеальную ежедневную дозу: очевидно, оно составляет 50-500 мг в зависимости от 'состояния здоровья, возраста и социальных привычек. Хотя сбалансированное питание, содержащее овощи и фрукты, и должно обеспечивать достаточное поступление аскорбиновой кислоты, все же подавляющая часть населения нуждается в дополнительных ее количествах в виде таблеток, которые обычно производятся с добавлением лактозы, глюкозы, винной кислоты, кукурузного крахмала, стеариновой кислоты и стеарата магния. Большинство из этих веществ необходимо для связывания ингредиентов в прочную таблетку, обычно содержащую 100-500 мг аскорбиновой кислоты. Более приятны на вкус, но и более дороги таблетки-жвачки или шипучие таблетки с добавлением фруктовых отдушек и сахара, а в случае шипучки еще лимонной кислоты и карбонатов, содержание аскорбиновой кислоты в которых составляет 0,5-1 г.

Согласно авторитетным утверждениям, много миллионов лет назад произошла делеция в гене, что и предопределило неспособность современного человека к биосинтезу витамина С в отличие от большинства млекопитающих. Зависимость от поступлений витамина С с пищей выглядит досадным неудобством. Тем не менее приводились доводы в пользу того, что этот генетический дефект в виде серповидно-клеточной анемии может приносить некоторую выгоду, хотя подобные аргументы могли возникнуть только под давлением обстоятельств.

и аналитические аспекты химии витамина С

Сегодня ь-аскорбиновая кислота производится ежегодно тысячами тонн. Она широко используется в пищевой промышленности и имеет свой Е number (Е300). Во многие продукты питания, например во фруктовые соки, аскорбиновая кислота добавляется просто для дополнительной витаминизации. Она используется в хлебопечении, а также присутствует во многих продуктах в качестве антиоксиданта. В аптеках без рецепта можно приобрести как аскорбиновую кислоту в виде таблеток, так и различные поливитаминные препараты, одним из компонентов которых она является. В Калифорнии, например, при желании можно купить порошкообразный витамин С в упаковках по 1 кг. Ясно, что при таком распространении и общедоступности совершенно необходимы надежные и точные аналитические методы контроля и гарантии качества. Кроме того, еще многое предстоит узнать о роли витамина С в живых организмах, а такие исследования невозможны без владения методиками определения его микроколичеств в животных и растительных тканях.

На первый взгляд может показаться странным говорить о неорганической химии такой органической молекулы, как L- аскорбиновая кислота. Однако сложность окислительно-восстановительных процессов с ее участием определяет интерес к аскорбиновой кислоте как восстановителю и в неорганических системах. Именно поэтому столько усилий было потрачено на исследование реакций ь-аскорбиновой кислоты с ионами металлов и их комплексами, которые часто встречаются в биохимии витамина С. Так, например, в состав молекулы аскорбатоксидазы входит атом меди, что, несомненно, играет существенную роль в функционировании этого фермента.

Аналитическая химия

Анализ ь-аскорбиновой кислоты и ее различных форм представляет собой определенную трудность, и даже сегодня нет универсального рутинного метода, который был бы свободен от недостатков. Любой метод анализа должен давать возможность одновременно

определять как саму L-аскорбиновую кислоту, так и продукты ее окисления и находить четкие различия между этими соединениями. Кроме того, аналитический метод должен позволять работать с минимальными количествами препаратов. Это, так сказать, требования высшего порядка. Но ситуация осложняется тем, что в животных и растительных тканях витамин С присутствует в окружении множества других органических молекул. Аскорбиновую кислоту следует либо отделять от них, либо использовать для анализа некое уникальное свойство этой кислоты. Очевидно, что таким уникальным свойством является ее способность участвовать в окислительно-восстановительных реакциях, что и составляет основу многих аналитических методик. Другие методы базируются на определении суммарного количества витамина С как в окисленной, так и в восстановленной формах. Иногда такое определение более предпочтительно, поскольку многие полезные свойства этого соединения, используемые в медицине, присущи как самой аскорбиновой кислоте, так и продуктам ее окисления.

Биологические методы анализа

Сегодня биологические методы представляют главным образом исторический интерес. Но на самом деле их преимущество заключается в том, что они основаны на определении конкретного профилактического и лечебного свойства, а именно антискорбутной активности, присущей и дегидроаскорбиновой кислоте. Биологические методы требуют больших затрат времени и средств и дают широкий разброс результатов, которые не всегда надежны. Для проведения биоанализа используют морских свинок, так как крысы синтезируют собственный витамин С. Животных выдерживают на искусственном рационе с добавлением различных количеств витамина, затем забивают, а их зубы подвергают гистологическому анализу. В результате устанавливают степень защиты от цинги в зависимости от количеств аскорбиновой кислоты, поступающей с пищей. Антискорбутная активность 0,05 мг аскорбиновой кислоты принята в качестве международной единицы для измерения содержания витамина С.

Титриметрические и колориметрические методы анализа

Титриметрические методы основаны на использовании восстановительных свойств ь-аскорбиновой кислоты. Обычно она окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты. В методике, предложенной

С1

С1

Рис. 7.1. Структура 2,6-дихлорфенолиндофенола.

еще в 1927 г., используется 2,6-дихлорфенол индофено л или 2,6-ди- хлор-4[(4-гидроксифенил)имино]циклогексадиен-3,5-он-1, который при нейтральных pH дает синюю окраску, при кислых — розовую, а при взаимодействии с L-аскорбиновой кислотой образует бесцветный продукт. Структура этого соединения приведена на рис. 7.1.

Эта реакция лежит в основе наиболее популярного титриметрического метода анализа витамина С. Она проста в исполнении благодаря легкости определения конечной точки титрования и без труда может быть использована для анализа растворов, содержащих довольно высокие концентрации витамина С. К сожалению, данный метод очень чувствителен к присутствию других восстановителей, с которыми витамин С часто соседствует в растворах (диоксид серы, таннины, ионы металлов, восстанавливающие сахара и т. п.). В каждом конкретном случае есть способы уменьшить влияние примеси, но устранить эффект всех примесных восстановителей в анализируемом растворе одновременно невозможно. И, конечно, если раствор первоначально окрашен, это маскирует изменение цвета вследствие реакции; в таких случаях для определения конечной точки использовали разнообразные инструментальные методы, например, полярографию.

Было предложено много других титрующих реагентов, например, соединения железа(Ш). В этом случае конечную точку определяют при добавлении в качестве индикаторов феррозина, а, а'- дипиридина или 2,4,6-трипиридил-сил<л<-триазина (рис. 7.2).

Полагают, что единственным продуктом многих изученных окислительно-восстановительных реакций L-аскорбиновой кислоты является дегидроаскорбиновая кислота. Но часто это не так, и окисление идет дальше. Поэтому разработка точного и чувствительного метода определения концентрации в растворе L-аскорбиновой кислоты, дегидроаскорбиновой кислоты и отдельных или всех продуктов дальнейшего окисления все еще остается актуальной.

Na*-Q3SNa*-Q3S

Na*-Q3S

Na*-Q3S

а а'-дипиридина а'-дипиридин

а а'-дипиридин

а а'-дипиридин

Na+X)3S

феррозин: динатриевая соль 3-(2-пиридил)-5,6-бис- (4-фенилсульфоновая кислота)-1,2,4-триазина

Рис. 7.2. Индикаторы титрования L-аскорбиновой кислоты соединениями желеэа(Ш).

Спектрофотометрический анализ

Водные растворы L-аскорбиновой кислоты бесцветны и не поглощают в видимой области спектра, но при нейтральных значениях pH в спектре поглощения наблюдается сильный сигнал при 265 нм. Это обстоятельство было бы очень удобно использовать для непосредственного спектрофотометрического анализа, но в большинстве случаев растворы витамина С содержат вещества, также поглощающие в УФ-области, что в некоторой степени ограничивает использование этого метода. В течение ряда лет были сомнения относительно точного значения молярного коэффициента экстинкции при 265 нм; в разных работах давались значения от 7500 до 16650. Причина таких различий объясняется быстрым окислением ь-аскорбиновой кислоты в нейтральных и слабокислых растворах атмосферным кислородом. До тех пор, пока спектры поглощения снимаются в строго анаэробных условиях, неизбежны низкие величины, так как поглощение продуктов окисления, при 265 нм

незначительно. Сложности появляются при наличии в растворе ионов Си2"*" и других переходных металлов, являющихся потенциальными катализаторами окисления молекулярным кислородом. Их следует удалять или связывать в комплекс путем добавления хелатирующего агента этилендиаминтетрауксусной кислоты. Положение максимума поглощения зависит от pH и в кислых растворах смещается в область 245 нм. На основании величины поглощения при этой длине волны в растворе соляной кислоты и хлорида калия определяли содержание витамина С в безалкогольных напитках и некоторых лекарственных препаратах, где незначительны примеси других веществ.

Часто бывает желательно определить в одном и том же растворе содержание дегидроаскорбиновой и L-аскорбиновой кислот. Де- гидроаскорбиновая кислота поглощает в УФ-области при 220 нм, но величина молярного коэффициента экстинкции значительно ниже и составляет 720. Таким образом, в этом случае чувствительность спектрофотометрического анализа почти в 20 раз меньше, чем в случае L-аскорбиновой кислоты. Позже мы увидим, что этот факт имеет далеко идущие последствия при хроматографическом разделении L-аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот.

Для того чтобы преодолеть проблемы, связанные с присутствием в животных и растительных тканях веществ, поглощающих в УФ-области, проводился поиск реагентов, дающих специфические цветные реакции с L-аскорбиновой кислотой и(или) продуктами ее окисления. Титриметрический метод с использованием дихлорфе- нолиндофенола, описанный выше, был адаптирован для колориметрии. Для спектрофотометрического определения можно использовать и окрашенное 2,4-динитрофенилгидразиновое производное витамина. Обнаружено, что это же самое соединение образуется с дегидроаскорбиновой и 2,3-дикетогулоновой кислотами, являющимися продуктами окисления L-аскорбиновой кислоты (рис. 7.3). Эта реакция имеет широкое практическое применение для определения содержания дегидроаскорбиновой кислоты и известна под названием метода Роу. Он заключается во взаимодействии раствора дегидроаскорбиновой кислоты с 2,4-динитрофенилгидразином в специфических условиях при 37°С в течение 4 ч, в результате чего образуется озазон — производное 2,3-дикетогулоновой кислоты. Эту же реакцию можно использовать и для определения содержания L-аскорбиновой кислоты, предварительно окислив ее до дегидроаскорбиновой кислоты над активированным углем (норит) раствором брома и т. п. При добавлении к озазону сильной кислоты образуется раствор красного цвета, поглощающий при 530 нм. Основу для колориметрического и спектрофотометрического ме-

Рис. 7.3. 2,4-Динитрофенилгидразиновое производное 2,3-дикетогуло- новой кислоты.

NO,ОН О

L-аскорбиновой кислотой диазониевогоL-аскорбиновой кислотой диазониевого

L-аскорбиновой кислотой диазониевого

L-аскорбиновой кислотой диазониевого

Рис. 7.4. Реакция образования производного голубого цвета.

тодов анализа создает также ярко-синий цвет продукта реакции L-аскорбиновой кислоты с соединениями диазония (рис. 7.4).

Альтернативный подход заключается в использовании флуоресценции продукта конденсации дегидроаскорбиновой кислоты с о-фенилендиамином. Облучение образующегося хиноксалина на длине волны 350 нм приводит к его флуоресценции при 427 нм. Обычно методика включает окисление L-аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой, и затем суммарное количество определяется спектрофлуорометрически.

Электрохимические методы

Электрохимические методы предоставляют возможность высокоселективного анализа с высокой точностью и воспроизводимостью; к тому же они очень просты в исполнении. Было предложено множество методик. Например, в таблетках поливитаминов, содержащих соединения Fe^n\ витамин С был проанализирован методом дифференциальной пульсирующей вольтамперометрии на стеклянном углеродном электроде. Однако эти методики не нашли широкого применения, так как необходима большая работа по их совершенствованию.

Хроматографические методы

Хроматографические методы дают самую большую надежду на преодоление основной проблемы, связанной с присутствием в смесях, содержащих витамин С, множества мешающих анализу веществ. Как мы уже видели, пока не существует методов, позволяющих четко и непосредственно определять небольшие количества L-аскорбиновой кислоты и(или) продуктов ее окисления в присутствии любых других соединений. Единственный удовлетворительный способ достижения специфичности заключается в хроматографическом отделении анализируемых соединений друг от друга, а также от остальных веществ.

Вплоть до относительно недавнего времени наиболее часто из хроматографических методов использовали обычно газожидкостную хроматографию (ГЖХ). Определить ь-аскорбиновую кислоту непосредственно этим методом невозможно из-за ее нелетучести. Для того чтобы иметь такую возможность, была разработана длительная процедура превращения L-аскорбиновой кислоты в летучий триметилсилиловый эфир (рис. 7.5). Такой метод позволяет получать точные и воспроизводимые результаты, но из-за длительности предварительной подготовки образца он не так удобен, как разработанный недавно метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В настоящее время ВЭЖХ стала альтернативным способом быстрого определения самых разнообразных органических и неорганических соединений. Она часто находит применение в фармацевтической промышленности для анализа болеутоляющих и других препаратов. ВЭЖХ давно используется и для анализа витаминов. Однако это не решает всех проблем в случае определения витамина С. Остается еще много сложностей, и метод не всегда удается использовать с одинаковой легкостью как для анализа всего раз-

CH2OSi(CH3)3

но он

Рис. 7.5. Летучее триметилсилильное производное L-аскорбиновой кислоты.

Рис. 7.6. Типичная хроматограмма анализа на L-аскорбиновую кислоту методом ВЭЖХ.

нообразия образцов, так и для определения малых концентраций. Однако, когда применение метода ВЭЖХ возможно, он обычно дает надежные, точные и воспроизводимые результаты.

Вопрос количественного определения разделенных веществ в ВЭЖХ требует наличия специфического физического свойства у витамина С (как у L-аскорбиновой кислоты, так и у продуктов ее окисления). Ко времени написания этой книги наиболее широкое распространение получили детекторы, измерявшие поглощение в УФ- или видимой области спектра. Они позволяют определять на- нограммовые количества L-аскорбиновой кислоты, но при определении дегидроаскорбиновой кислоты их чувствительность гораздо ниже из-за значительно более низкого молярного коэффициента экстинкции (см. выше). Остается проверить, нельзя ли повысить эффективность анализа, используя детекторы другого типа, чувствительные к массе.

Для ВЭЖХ обычно используют колонку с мелкопористым полимерным обратнофазовым сорбентом с развитой поверхностью, таким, как, например, PLRS-s 100А, при низких значениях pH водной подвижной фазы. Для этого подходит 0,2 М раствор ХаНгРО4, который создает pH около 2,1, а также подавляет действие ионов металлов и дает хорошо забуференную подвижную фазу. Такой метод был использован для определения содержания ь-аскорби- новой кислоты и продуктов ее окисления во фруктовых соках. В данной среде УФ-спектрофотометрический детектор, регистрирующий поглощение при 220 нм (при этой длине волны оба соединения имеют близкие молярные коэффициенты экстинкции), имеет удовлетворительную чувствительность. Типичная хроматограмма приведена на рис. 7.6. Из нее явствует, что этим методом разделяются не только L-аскорбиновая и дегидроаскорбиновая кислоты, но и продукты их дальнейшего окисления, соответствующие которым пики также присутствуют на хроматограмме. Это одна из многих методик с использованием ВЭЖХ, пригодных для проведения подобного анализа.

Неорганическая химия

Этот раздел будет посвящен главным образом реакциям ь-аскор- биновой кислоты с ионами металлов и их комплексами. Однако было бы неуместно обсуждать эту тему без рассмотрения свойств соединения, которое в буквальном смысле „покушается“ на всю неорганическую химию. Следовательно, сюда важно включить рассмотрение довольно сложного химизма окислительно-

восстановительных реакций витамина С, а также информацию о количественном и качественном определении и свойствах соединений, которые часто фигурируют как промежуточные продукты таких реакций, а именно аскорбат-радикалов.

Свободные радикалы аскорбиновой кислоты

Так как L-аскорбиновая кислота является потенциальным двухэлектронным восстановителем, разумно предположить, что в ходе любой окислительно-восстановительной реакции потеря электронов ее молекулой осуществляется в две дискретные стадии. Если это так, то промежуточное соединение, образующееся в результате потери одного электрона, является радикалом аскорбиновой кислоты. Существование свободных радикалов впервые было продемонстрировано более тридцати лет назад. Ямазаки с сотрудниками, используя спектроскопию электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), доказал их присутствие in vitro. ЭПР позволяет измерить взаимодействие случайного магнитного поля со спином неспаренного электрона в молекуле. С помощью этого же метода был зафиксирован in vitro аскорбат-радикал, имеющий единственный неспаренный электрон.

Аскорбат-радикал был получен методом импульсного радиолиза в водном растворе, чтобы исследовать его УФ-спектр. Разбавленный (5 мМ) раствор L-аскорбиновой кислоты бомбардируют электронными импульсами по 1,8 МэВ, каждый из которых длится около 25 мкс. Этот режим обычно задается генератором Вандер-Граафа. Раствор насыщают закисью азота (N2O), что приводит к превращению образующихся сольватированных электронов в ОН-радикалы. В этих условиях L-аскорбиновая кислота очень быстро окисляется ОН-радикалами в радикалы аскорбиновой кислоты. Эксперимент многократно повторяют, и после пропускания каждого импульса измеряют поглощение раствора в интервале 320-420 нм. Затем можно построить спектр радикала с максимумом поглощения при 360 нм и молярным коэффициентом экстинкции 3700. При проведении этих экспериментов можно также замерить скорость распада радикала. УФ-спектр радикала аскорбиновой кислоты при pH 3,3 приведен на рис. 7.7. При изменениях pH от 0,3 до 11 заметного сдвига в положении максимума поглощения не наблюдается, что доказывает присутствие в этом интервале кислотности единственного соединения, почти наверняка А .

Интерпретация спектра ЭПР на рис. 7.8 позволяет получить структурную информацию о радикале. Спектр, как можно видеть,

Длина волны, нм

Рис. 7,7. УФ-спектр радикала аскорбиновой кислоты при pH 3,3.

Рис. 7.8. Спектр-ЭПР радикала аскорбиновой кислоты.

состоит из двух триплетов, в которых каждая полоса расщеплена еще на две. Эта картина полностью соответствует структуре, приведенной на рис. 7.9.

Наличие только трех резонансных частот в спектре означает, что электронная плотность неспаренного электрона распределена между тремя карбонильными группами.

СН2ОН

СНОН

О' о

Рис. 7.9. Структура аскорбат-радикала.

Распад А - сложен. Предложенная схема включает взаимодействие двух ионов аскорбат-радикала с образованием промежуточного соединения, которое далее разлагается до конечных продуктов. Именно такой механизм необходимо предположить, чтобы объяснить зависимость скорости реакции от ионной силы и pH раствора. Предложенный механизм представлен в виде уравнений (7)-(9):

2А- ^ (А")2(7)

(А-)2 + Н+ НА" + А(8)

(А-)2 + Н20 -+ НА- + А + ОН-(9)

Свободные аскорбат-радикалы представляют собой важные промежуточные соединения в многочисленных реакциях in vitro, включающих окисление и восстановление, и есть доказательства того, что они также играют существенную роль и в живых системах. Известно, что витамин С взаимодействует с токоферокси- радикалом, регенерируя токоферол (витамин Е, рис. 7.10). Витамин Е является важным антиоксидантом липидов биомембран. Полагают, что в этой роли образующийся свободный радикал (витамин Е) реагирует с аскорбатом, вновь образуя витамин Е, который далее снова пригоден для выполнения антиокислительной функции. Радикал А -, который также образуется в ходе этой реакции, затем претерпевает обратное диспропорционирование, превращаясь в аскорбат и дегидроаскорбиновую кислоту. И действительно, у морских свинок, выдерживаемых на рационе, богатом витамином С, наблюдается более высокая концентрация витамина Е в тканях, чем у животных, получающих обедненный витамином рацион.

Полагают, что свободные аскорбат-радикалы выполняют важную биологическую функцию, реагируя с деструктивными свобод-

СН3

Рис. 7.10. а-Токоферол, витамин Е.

ными радикалами. Особенно это касается радикалов кислорода, которые часто вызывают осложнения в живых клетках. Как было показано, аскорбат-радикалы подавляют гидроксильные радикалы и атомарный кислород, что особенно важно для глаз, где обычно имеются относительно большие количества витамина С.

Окислительно-восстановительное равновесие ь-аскорбиновой кислоты

Окисление ь-аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой в водном растворе является примером двухэлектронного окислительновосстановительного процесса. Действительно, во многих учебниках эта реакция дается в том виде, в котором она приведена на рис. 7.11, со стандартным восстановительным потенциалом —0,058 В. Однако данная система является гораздо более сложной, чем это кажется на первый взгляд. Наиболее очевидное осложнение связано с тем, что на любой окислительновосстановительный процесс с участием L-аскорбиновой кислоты влияет перенос протонов, так как сама ь-аскорбиновая кислота, ее свободный радикал, образующийся в результате потери одного электрона, и дегидроаскорбиновая кислота — все обладают кислотно-основными свойствами, которые можно суммировать в виде уравнений (10)—(13):

н2а

—^

Н+ + НА"

рКа

= 4,25

(Ю)

НА

—i

Н+ + А2"

рКа

= 11,79

(И)

НА'

—^

Н+ + А"

рКа

= -0,45

(12)

А

—ь

Н+ + А'-

PKQ

= 8,0

(13)

Кроме того, в водном растворе дегидроаскорбиновая кислота быстро образует полуацетальную структуру.

Как видно из приведенных реакций, ь-аскорбиновая кислота является слабой кислотой при потере первого атома водорода и

Рис. 7.11. Реакция окисления L-аскорбиновой кислоты, приводимая во многих учебниках.

очень слабой кислотой при потере второго. Для дегидроаскорби- новой кислоты рКа имеет только приблизительное значение. Радикал НА', однако, — это сильная кислота, сравнимая по силе с минеральными кислотами. Конечно, каждое из этих соединений ведет себя в окислительно-восстановительных реакциях по-своему; величины восстановительных потенциалов, которые были определены или приблизительно подсчитаны, приведены в уравнениях (14)-(19).

Реакция

Е°, В

А + 2Н+ + 2е Н2А

А + Н+ + 2е ^ НА"

А + 2е ^ А2"

А + е ^ А-

А" + е А2-

НА" + е НА-

0,40(14)

0,28(15)

-0,05(16)

0,16(17)

+0,05(18)

+0,70(19)

Исследование протекания любой реакции в водном растворе обычно включает этап изучения влияния pH на природу реагирующих веществ и, следовательно, на скорость реакции, что обеспечивает ценную возможность проникнуть в суть реакции и ее механизм.

Как мы увидим позже, было выполнено множество работ по изучению реакции L-аскорбиновой кислоты с комплексами переходных металлов и фактически во всех случаях было выведено сложное выражение, связывающее скорость реакции с концентрацией водородных ионов.

Окислительно-восстановительные реакции витамина С

Сложность окислительно-восстановительных процессов с участием витамина С не препятствовала проведению многочисленных исследований механизма окисления ь-аскорбиновой кислоты, а также окисления и восстановления дегидроаскорбиновой кислоты и других продуктов окисления. Одной из причин огромного интереса к этой теме является то, что роль витамина С в живых системах несомненно связана с его поведением в окислительно- восстановительных реакциях, которое в конечном итоге может дать ключ к пониманию биологического механизма действия витамина С. В этом разделе мы рассмотрим окисление и восстановление витамина С под действием различных реагентов, уделив особое внимание поведению L-аскорбиновой кислоты, в этом отношении являющейся наиболее изученным соединением.

Окисление L-аскорбиновой кислоты кислородом

Еще прежде, чем выяснилась природа „антискорбутного фактора11, было известно, что стоящее за ним соединение чувствительно к окислению кислородом воздуха, ь-Аскорбиновая кислота окисляется молекулярным кислородом до дегидроаскорбиновой кислоты, но оба соединения обладают антискорбутным действием витамина С. Превращение L-аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую кислоту in vivo можно фактически рассматривать как обратимое. Однако ясно, что для изучения свойств ь-аскорбиновой кислоты in vitro всегда важно использовать свежие растворы, приготовленные на дегазированной воде. Очевидно, что кислород приводит к распаду витамина С, окисляя дегидроаскорбиновую кислоту до. физиологически неактивных продуктов. Этот процесс протекает в водном растворе на воздухе, а в овощах и фруктах ускоряется посредством катализаторов. Полагают, что своим распадом на воздухе витамин С обязан главным образом ферментативной активности. Ионы многих переходных металлов катализируют как окисление ь-аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой, так и распад дегидроаскорбиновой кислоты на воздухе до 2,3-дикетогулоновой кислоты и других продуктов окисления. Особенно активны в этом отношении ионы Сп2+. Полагают, что катализ этими ионами был причиной потерь витамина при сгущении цитрусовых соков в медных сосудах во второй половине XIX в. Это привело к утрате веры в эффективность свежих фруктов для лечения и профилак-

тики цинги и, возможно, на некоторое время отложило открытие присутствующего в них активного фактора.

Окисление L-аскорбиновой кислоты молекулярным кислородом, растворенным в воде, было предметом обсуждения в большом числе работ. Некоторые исследователи сосредоточивали внимание на механизме реакции в растворах, из которых были тщательно удалены переходные металлы, другие, наоборот, пытались выяснить их роль в катализе. В частности, эти исследования и выявили действие ионов Си2+.

Окисление в отсутствие катализаторов

Когда говорят об окислении L-аскорбиновой кислоты молекулярным кислородом в водном растворе в отсутствие каких-либо катализаторов, часто пользуются термином „автоокисление". Несмотря на пристальное изучение этого вопроса, все еще не разработан механизм реакции, удовлетворительно объясняющий перенос электронов с молекулы аскорбата на молекулу кислорода. Исследования методом ЭПР продемонстрировали, что при взаимодействии аскорбата с кислородом в водном растворе при pH 6,6-9,6 образуются аскорбат-радикалы в устойчивой концентрации. Существует, однако, мало прямых доказательств образования Н2О2 в этой реакции. Результаты по ингибированию данной реакции некоторыми ферментами, особенно супероксиддисмутазой, дают основание полагать, что в ней действительно образуется Н2О2.

В отсутствие катализаторов реакция L-аскорбиновой кислоты с кислородом протекает медленно, хотя ее скорость сильно зависит от изменений pH раствора. Медленнее всего процесс протекает в кислых растворах; при pH 4 константа скорости обычно равна 10-5 л моль-1-с-1. При pH 10 скорость гораздо выше, но константа составляет только около 5 л ■ моль-1 • с-1. Этот факт был выдвинут в качестве возможного объяснения отсутствия каких-либо прямых доказательств наличия О2, — при таком медленном процессе он, очевидно, присутствует в минимальных концентрациях.

Окисление в присутствии ионов металлов

Окисление L-аскорбиновой кислоты, дегидроаскорбиновой кислоты и продуктов дальнейшего окисления, по-видимому, катализируется ионами металлов, из которых наиболее сильным является ион

Си2"1". Было выполнено много исследований реакций ь-аскорбино- вой кислоты в этих условиях, но каталитическому окислению других соединений внимания уделялось мало. Авторы многих работ пытались ответить на вопрос, какова роль иона металла, особенно иона Си2"1", в механизме реакции. Хотя картина сегодня несколько и прояснилась, расхождения по этому поводу все же остались.

Результаты важной в этой области работы А.Е.Мартеля продемонстрировали, что в соответствующих условиях реакция является процессом первого порядка по концентрации иона металла, аскорбиновой кислоты и молекулярного кислорода. Предложенный им механизм реакции предполагал образование тройного комплекса между ь-аскорбиновой кислотой, атомом меди(П) и кислородом (рис. 7.12). Однако это не окончательное заключение. Известно, что порядок реакции по концентрации кислорода снижается, так как снижается сама концентрация 02. В противоположность этой предпосылке недавно было показано, что порядок реакции по концентрации кислорода при ее низких значениях составляет 1/2, а скорость расходования кислорода определяется выражением

= ^Cu^JfHA-JfO^1/2 (20) di

Для того чтобы объяснить такую зависимость от концентрации молекулярного кислорода, пришлось предположить образование довольно экзотического комплекса между Си2"1" и ь-аскорбиновой кислотой:

2[CuHA]+ ^ [СиНА]2"1" (21)

структура которого приведена на рис. 7.13. Этот комплекс взаимодействует с кислородом, давая следующее промежуточное соединение:

[CuHA]^+ + О2 [CuHAO2CuHA]2+ (22)

Структура, предложенная для этого кислородного комплекса, приведена на рис. 7.14. Его последующий распад является стадией, определяющей скорость всего процесса:

[Си НА О2СиНА]2 — АСиО2Н' +

Си2"1" + А -+ конечный продукт (23)

Однако предложенное объяснение кинетики процесса не было единственным. Другие исследователи интерпретировали аналогичные данные в рамках цепного механизма с участием Си+ в качестве ключевого элемента всего процесса:

Рис. 7.12. Предполагаемый механизм катализируемого ионами меди(П) взаимодействия L-аскорбиновоЙ кислоты с кислородом.

Рис. 7.13. Предполагаемое промежуточное соединение, объясняющее 1/2 порядок зависимости скорости окисления L-аскорбиновой кислоты от концентрации кислорода в присутствии ионов меди(П).

Рис. 7.14. Промежуточный кислородный комплекс, образующийся при окислении L-аскорбиновой кислоты, катализируемом ионами меди(П).

Инициирование

2Си2+ + НА" 2Си+ + А + Н+

(24)

Развитие

Н+ + Си+ + О2 Си2+ + НО2

(25)

НО2 + НА- -> А- + Н2О2

(26)

А-Си2+ ^Си+ + А

(27)

Обрыв

Си+ + Н02 — Си2+ + НО2

(28)

Несомненно, истина лежит где-то посередине между этими двумя довольно различными механизмами, но все вышеизложенное демонстрирует, каким образом одни и те же или сходные данные могут интерпретироваться совершенно по-разному. Ясно, что в водном растворе L-аскорбиновой кислоты в присутствии ионов Си2+ быстро устанавливается равновесие, приводящее к образованию комплекса Си[НА]+, значительные количества которого присутствуют в растворах, содержащих большой избыток аскорбиновой кислоты по отношению к ионам Си2+. Система становится еще более сложной в присутствии хелатирующих агентов типа ЭДТА или других комплексонов, таких, как хлорид- или бромид-ионы. Й последнем случае наблюдается значительное ускорение реакции

при низких концентрациях (< 0,05 М). Этот факт интерпретировался по-разному, но он представляет характерную особенность другого типа реакций L-аскорбиновой кислоты, катализируемых ионами меди Сп2+.

Реакции с ионами металлов

Витамин С образует комплексы даже с теми ионами металлов, которые могут восстанавливаться, например с Ее3+ и Сп2+. Это потенциально бидентатный лиганд. Методом рентгеноструктурного анализа была определена структура только одного комплекса, о чем речь пойдет ниже. В общем случае полагают, что большинство комплексов образуется за счет координации атомов кислорода гидроксильных групп при С-2 и С-3. В этом случае, как отмечал Мартель, образовавшиеся комплексы менее устойчивы, чем ожидалось, если сравнивать их с комплексами сходных хелатных лигандов. .В табл. 7.1 приведены константы равновесия комплексов с различными ионами металлов. Наибольшее значение равно 3,66, что существенно ниже 5 — значения, ожидаемого на основании сравнения со сходными лигандами. В образовании всех комплексов, приведенных в табл. 7.1, участвует НА-. Если вообще и зарегистрированы комплексы с полностью депротониро- ванным лигандом, то таких очень мало. Тому может быть много причин, но вероятнее всего то, что, поскольку такие комплексы образуются в щелочных растворах, многие ионы металлов в этих условиях дают гидроксосоединения.

При добавлении аскорбиновой кислоты к слабощелочному рас-- твору хлорида железа(Ш) сразу появляется насыщенная синяя окраска, и из рекционной среды легко можно выделить темносиний, почти черный осадок. Если эту реакцию проводить в кислых условиях, окраска появляется в виде мерцающих „вспышек11 синего цвета и не устанавливается до тех пор, пока железо(Ш) не восстановится до железа(П) под действием L-аскорбиновой кислоты. Структура темно-синего комплекса окончательно не установлена, но ясно, что это комплекс аскорбиновой кислоты с железом. Его предполагаемая структура приведена на рис. 7.15.

Структура подобных комплексов в водном растворе в основном неизвестна. Для решения этого вопроса попытались использовать метод ЯМР; на рис. 7.16 приведена структура комплекса никеля(Ш), предложенная на основании результатов таких исследований.

Недавно Джабсу и Гобу удалось получить кристаллы некого-

Таблица 7.1. Константы равновесия (А") комплексов аскорбиновой кислоты с некоторыми ионами металлов

Ион металла

Равновесие

1g К (ионная сила) (при 25°С, 1,0 М)

Мп2+

MHL/MHL

1,1 (0)

Fe2+

MHL/MHL

0,21 (1,0)

ML/M-L

1,99 (1,0)

Со2+

MHL/MHL

1,4 (0)

Ni2"1"

MHL/MHL

1,1 (0)

Cu2+

MHL/MHL

1,57 (0,1)

vo+

MH2L/M ■ H2L

2,69

Ag+

ML/M-L

3,66 (0,1)

Zn2+

MHL/MHL

1,0 (0)

Pb2+

MHL/MHL

1,77 (0,1)

Au3+

MHL/MHL

1,89 (0,1)

M(HL)2/M • (HL)2

3,55 (0,1)

СН2ОН

Рис. 7.15. Предполагаемая структура комплекса L-аскорбата желе- за(Ш).

Рис. 7.16. Структура комплекса L-аскорбиновой кислоты с ионом ни- келя(П), предложенная на основе исследований методом ЯМР.

Рис. 7.17. цис-Изомер комплекса L-аскорбиновой кислоты с ионом пла- тины(П).

рых комплексов аскорбиновой кислоты по реакции типа:

NiSO4-7H2O + Ba(OH)2 + 2HA“ —

№(НА)2 ■ 4Н2О + BaSO4 + ЗН2О (29)

Ключ к успешному проведению этой реакции заключается в том, чтобы она проходила в строго анаэробных условиях. Таким методом были получены следующие комплексы: TiO(HA)2 ■ 2Н2О, TiO(OH)(HA), Gr(HA)3 • 6Н2О, Мп(НА)2 ■ 4Н2О, Со(НА)2 ■ 4Н2О, Ni(HA)2 • 4Н2О, Zn(HA)2 • 4Н2О. Ко времени написания этой книги еще не был проведен рентгеноструктурный анализ их структуры.

Единственный из комплексов переходных металлов с аскорбиновой кислотой, структура которого на сегодня определена методом рентгеноструктурного анализа, — это цис-1,2-диаминоцикло- гексан(аскорбато)платина(П). Совершенно неожиданно было обнаружено, что в этом соединении комплексообразование происходит не за счет 2-ОН и 3-ОН в молекуле аскорбиновой кислоты, а за счет атома С-2 и депротонированного гидроксила при С-5 (рис. 7.17)!

На первый взгляд может показаться, что приведенная структура только добавляет неясности относительно строения комплексов аскорбиновой кислоты с другими переходными металлами, но следует отметить, что платина(П) иногда предпочтительнее образовывает связи Pt-C там, где можно ожидать образования связей Pt-О [например, в комплексах платины(П) с пентандионом-2,4 (ацетилацетоном)]. Подобная структура была предложена и для бисаскорбатного комплекса на основе анализа спектра ЯМР. цис-Изомер комплекса и подобные ему комплексы подают некоторые надежды в качестве противоопухолевых препаратов.

Окисление аскорбиновой кислоты комплексами переходных металлов

Окислительно-восстановительные реакции ионов переходных металлов изучались в'течение многих лет. В общих чертах все существующие реакции можно разбить на два типа:

Внутрисферный электронный перенос. Полагают, что перенос электрона осуществляется посредством образования „моста11 между восстановителем и окислителем. Это обеспечивает путь для перемещения электрона от одного к другому, а образовавшееся мостиковое соединение соответствует переходному состоянию реакции.

Внешнесферный электронный перенос. Перенос электрона осуществляется без образования какой-либо связи между восстановителем и окислителем.

Обнаружено, что восстановление ионов переходных металлов и их комплексов с L-аскорбиновой кислотой происходит согласно внутри- или внешнесферному механизму в зависимости от природы комплекса или металла. Изучена масса примеров обоих механизмов.

Роль переходных металлов в катализе окислительно-восстановительных реакций ь-аскорбиновой кислоты часто влечет за собой восстановление самого иона металла.

Мы живем и занимаемся химией в мире, в котором вода вездесуща, поэтому нам свойственно забывать, что ионы переходных металлов в водных растворах присутствуют в виде акво-комплексов и их не следует рассматривать как „свободные ионы11. В водном растворе ионы многих переходных металлов восстанавливаются L-аскорбиновой кислотой. Типичным примером с изученным механизмом реакции служит восстановление ионов кобальта(Ш). В воде эти ионы существуют относительно недолго, но вполне достаточно для того, чтобы изучить кинетику их реакции с аскорбиновой кислотой. Большой положительный заряд кобальта приводит к тому, что молекулы воды, участвующие в образовании акво-комплекса, создают кислую среду, поэтому гидроксосоедине- ния образуются при более высоких значениях pH. Влияние последнего эффекта на реакцию восстановления отражено в механизме, представленном в виде уравнений (30)—(34):

Co3+(aq) ^ [CoOH]2+(aq) + Н+ (30)

Со3+ + Н2А — Со2+ + Н2А+(31)

[Co(OH)]2+(aq) + Н2А Co2+(aq) + НА' + Н2О (32)

Co3+(aq) + HA' -> Co2+(aq) + А + Н+ (33) (CoOH]2+(aq) + НА' Co2+(aq) + А (34)

Аналогичный механизм был продемонстрирован и для других гидратированных ионов, таких, как ионы аквомарганца(Ш), но в этом случае можно расширить интервал pH для того, чтобы включить в реакционную среду и НА-.

Приведенные реакции иллюстрируют то общее, что связывает большинство случаев окисления аскорбиновой кислоты ионами и комплексами переходных металлов, а именно то, что первая стадия окисления неизменно приводит к образованию аскорбат- радикала. Обычно предполагается взаимодействие аскорбат- радикала еще с одним ионом металла, и это дает необходимую стехиометрию.

Кроме акво-комплексов было изучено и много других комплексов. Одна из типичных реакций, в которые они вступают, — это восстановление в широком интервале pH аниона трис(1,2- этандиоато)кобальтата(Ш), [Со(С2О4)]3~. Предложенный механизм представлен в виде уравнений (35)-(39):

Н2А ^ НА" + Н+ (35)

[Со(С2О4)з]3" + Н2А ^ Н2А+ + Со2+ + 3[С2О4]2“ (36) [Со(С2О4)3]3" + НА" ^ НА' + Со2+ + 3[С2О4]2” (37) [Со(С2О4)3]3” + Н2А+ DHA + Со2+ + 3[С2О4]2" + 2Н+ (38)

[Со(С2О4)з]3“ + НА' DHA + Со2+ + 3[С2О4]2~ + Н+ (39) Это дает константу скорости:

^набл = ^1 + (^2 — ^1) (p+j + j< ) (^0)

Аналогичные константы скорости получены и для многих других реакций. Был изучен механизм окисления комплексов практически всех ионов металлов, способных окисляться под действием аскорбиновой кислоты. Иногда используются довольно экзотические соединения, такие, как, например, комплекс иона нике- ля(1У) с диацетилоксимтриэтилентетрамином (основание Шиффа, рис. 7.18), изображенный на рис. 7.19.

В этом случае реакция представляет собой двухэлектронный окислительно-восстановительный процесс, так как ее конечным продуктом является никель(П). Исследование механизма реакции методом ЭПР подтверждает, что она осуществляется в две одноэлектронные стадии. Поведение комплекса в зависимости от

Рис. 7.18. Диацетилоксимтриэтилентетрамин (основание Шиффа).

Рис. 7.19. Скелетная структура комплекса иона никеля(1У) с 2,4-ди- метил-4,7,10,13-тетраазагексадекандион-3,13-диоксимом.

pH на этот раз осложнено протонированием, что влияет на его окислительно-восстановительные свойства.

Обнаружено, что аналогично окислению молекулярным кислородом эти реакции катализируются ионами Си , хотя широко они и не исследовались. Так, восстановление трис(1,2- этандиоато)кобальтата(Ш) катализируется ионами Си2+ в значительной степени; кинетику реакции интерпретировали, предположив наличие пути, на котором эти ионы выполняют роль посредников в перемещении электрона от молекулы L-аскорбиновой кислоты к кобальту(Ш) через постулированное промежуточное соединение, изображенное на рис. 7.20. Показано, что, как и при окислении кислородом, такие реакции ускоряются в присутствии галогенид-ионов в низких концентрациях.

Реакции по принципу маятника весьма наглядны и часто демонстрируются на лекциях.. Они известны уже в течение многих лет и обычно основаны на взаимодействии бромата с иодидом в присутствии восстановителя, в качестве которого использовалась и ь-аскорбиновая кислота. Обнаружено, что ионы металлов также катализируют эту реакцию. Молибден(У1) ускоряет взаимодействие бромата с иодидом, тогда как ванадий(У) катализирует не-

Рис. 7.20. Возможная структура промежуточного соединения, образующегося при окислении L-аскорбиновой кислоты ионом трис(оксала- то)кобальтата(Ш), катализируемом ионами меди(П).

посредственную реакцию бромата с L-аскорбиновой кислотой, что сокращает индукционный период реакции.

Взаимодействие витамина С с витамином В12

Витамин В12 представляет собой комплекс кобальта. Он абсолютно необходим для нормальной жизнедеятельности человека, а его недостаточность в конечном итоге приводит к летальному исходу вследствие злокачественной анемии. Витамин В12 не синтезируется в человеческом организме и должен поступать с пищей, главным образом с мясными и молочными продуктами, или за счет жизнедеятельности микроорганизмов. В12 — единственный из витаминов, содержащий ион металла, более того, in vivo в нем часто встречается кобальт-углеродная связь, т. е. это одно из редких в природе металлоорганических соединений. В лабораторной практике витамин В12 используется в виде красивых красных кристаллов, являющихся цианокомплексом. Структура витамина В12, приведенная на рис. 7.21, была первоначально определена именно при помощи этого соединения — цианокобаламина. Указанная форма витамина является единственной обнаруженной в организме курильщиков! В других формах цианидный лиганд замещен на другие лиганды: именно аксиальная связь, расположенная над плоскостью корринового кольца, часто задействована в выполнении витамином его биохимической функции. Структура, приведенная на рис. 7.21, была определена методом дифракции рентгеновского излучения и подтверждена химическими методами. Возможно, наиболее существенной особенностью такой структуры является планарное корриновое кольцо, в центре которого расположен ион кобальта. Это кольцо (рис. 7.22) сильно напоминает по своему строению порфириновый цикл, в котором пропущен атом С-20.

Рис. 7.21. Циано кобаламин (витамин В12).

Рис. 7.22. Структура корринового кольца.

Шестое положение занято 5,6-диметилбензимидазольной группировкой (рис. 7.23), расположенной ниже плоскости кольца. Всасывание витамина организмом зависит от присутствия мукопротеина, получившего название „внутренний фактор". Он связан с витамином В12 в стехиометрическом соотношении. В организме содержится довольно мало витамина В12 — порядка 3-5 мг, и большая его часть хранится в печени в дезоксиаденозильной форме. Ежедневная потребность человека составляет только около

Рис. 7.23. 5,6-Диметилбензимидазольная часть витамина В12.

Рис. 7.24. 5'-Дезоксиаденозильная группа.

3-7 мкг. Это количество содержится в нормальном рационе питания, но может не обеспечиваться строгой вегетарианской диетой, так как витамин В12 обнаружен только у некоторых растительных одноклеточных, например, у Euglena.

Цианидный лиганд может замещаться водой с образованием так называемого аквокобаламина, или витамина В12, в котором кобальт присутствует в окисленном состоянии +3. В двух биологически активных формах кофермента аксиальное положение занято или метильной (метилкобаламин), или, как в коферменте В12, 5'-дезоксиаденозильной (рис. 7.24) группами. Обе формы витамина В12 чрезвычайно чувствительны к свету.

В мягких условиях кобальт(Ш) в циано- и аквокобаламине восстанавливается до кобальта(П) (обычно желто-оранжевого цвета), а под действием более мощных восстановителей происходит образование соединений кобальта(1) (обычно зеленого или серого цвета). Процесс может сопровождаться различными изменениями в природе координации вокруг иона кобальта, но структура корри- нового цикла при этом не нарушается (рис. 7.25).

Высказывались опасения, что витамин С будет разрушать витамин В12 и лицам, принимающим „мегадозы" витамина С (около 5-10 г в день), грозит опасность лишиться запасов витамина В12

координационное число

Рис. 7.25. Схематичное изображение различных форм витамина Вп-

в организме и, следовательно, заболеть злокачественной анемией. Однако на практике было показано, что добавление в пищу больших количеств витамина С и инкубация при 37°С не оказывают никакого влияния на содержание витамина В12- Эксперименты на крысах также продемонстрировали, что подкормка витамином С не истощает содержание витамина В12 в плазме и печени. Все обстояло благополучно с витамином В12 и у пациентов-мужчин со спинномозговыми повреждениями, которые получали ежедневно по 4 г витамина С в течение одинадцати месяцев.

Однако не вызывает сомнений факт, что витамины С и В12 взаимодействуют in vitro. Более того, известно, что, если реакция не осуществляется в отсутствие ионов Си2+ (как в случае цианокобаламина), она все-таки происходит в их присутствии. Кроме этого, ионы Си2+ значительно ускоряют взаимодействие двух витаминов.

Экспериментально показано, что при взаимодействии ь-аскор- биновой кислоты с цианокобаламином в присутствии ионов Си2+ в водном растворе красный цвет соединения цианокобальта(Ш) изменяется на оранжевый, присущий соединению аквокобальта(П). Пропускание воздуха через раствор или разбавление аэрированной водой быстро восстанавливает первоначальный красный цвет. При стоянии раствора его цвет снова меняется на оранжевый. Это может повторяться до тех пор, пока в растворе остается L- аскорбиновая кислота. Аквокобаламин (витамин В12а) быстро реагирует с ь-аскорбиновой кислотой и в отсутствие меди(П). Реакция очень чувствительна к присутствию кислорода, который следует полностью удалять. И снова в результате реакции образуется соединение кобальта(П). Скорость реакции зависит от pH раствора. При повышении значения pH от 2,0 она возрастает, достигая максимума около pH 5,6. Выше этого значения скорость снижается, достигая постоянной величины около pH 8,5. Выше pH 2,0 ион НА- образуется с обычным ускорением. Скорость реакции достигает постоянного уровня, когда фактически вся аскорбиновая кислота присутствует в виде моноаниона, и затем снова начинает снижаться при более высоких значениях pH, так как вода в молекуле акво- кобаламина депротонируется. Образующийся гидроксокобаламин восстанавливается более медленно, чем аквокобаламин.

Восстановление по внутрисферному механизму

Такой механизм подразумевает образование химической связи между двумя реагирующими частицами, которая действует как „мост“ для перехода электрона. Это менее распространенный

способ перемещения электрона в окислительно-восстановительных реакциях с участием L-аскорбиновой кислоты. Мы уже видели, что взаимодействие с соединением железа(Ш) приводит к образованию промежуточного продукта синего цвета, и, вероятно, оно протекает по типу внутрисферного электронного перехода.

При исследовании кинетики реакции ванадия(У) с ь-аскорби- новой кислотой было отмечено быстрое образование промежуточного соединения коричневого цвета с максимумом поглощения в видимой области при 425 нм. На основе полученных результатов предложен механизм, представленный в виде уравнений (41)-(43):

Vv + Н2А ^ 6[VvH2A](41)

[VvH2A] -+ Vv + радикал(42)

радикал + Vv —+ Viv + А(43)

Это взаимодействие является необычным, так как образование комплекса происходит даже при относительно высоких концентрациях кислоты, когда в реакционной смеси преобладает Н2А.

Аскорбатоксидаза

Обсуждение неорганических аспектов химии витамина С не было бы полным без упоминания об аскорбатоксидазе. Этот фермент, катализирующий окисление L-аскорбиновой кислоты в де- гидроаскорбиновую первоначально был обнаружен в листьях капусты Сент-Дьёрдьи, который первым выделил витамин С. Полученный из раздавленной массы плодов тыквы-горлянки фермент имеет сине-зеленый цвет и молекулярную массу порядка 150 000. Этот фермент содержит около 0,26% меди. В спектре поглощения, представленном на рис. 7.26, характерный пик при 610 нм обусловлен наличием меди(П). Кроме того, наблюдается плечо при 412 нм. При добавлении L-аскорбиновой кислоты при pH 6 фермент быстро выцветает, приобретая желтый цвет. Этот процесс объясняется превращением меди(П) в медь(1); под действием кислорода синий цвет восстанавливается.

Много было написано о функционировании оксидаз, и, в частности, аскорбатоксидазы, но структура последней оставалась неизвестной вплоть до 1989 г., когда Альбрехту Мессершмидту с сотрудниками удалось получить кристаллы синего цвета двух различных форм оксидазы и определить структуру аскорбатоксидазы из кабачков цуккини методом рентгеноструктурного анализа. Исследование обеих форм завершилось определением их кристал-

ф = атом меди

Рис. 7.27. Димер аскорбатоксидазы.

лической структуры. Одна из них представляла собой димер с относительной молекулярной массой 140 000, а другая — тетрамер с относительной молекулярной массой 280 000. Природа ионов меди в ферментах такого типа часто бывала предметом спора до тех пор, пока не удавалось установить структуру кристалла. Так было и в случае аскорбатоксидазы. Результаты рентгеноструктурного анализа продемонстрировали, что каждая субъединица содержит четыре атома меди, которые организованы таким образом, что три из них образуют „кластер11, с которым связаны восемь гистидиновых лигандов. Четвертый атом меди связан с цистеиновым, метиониновым и двумя гистидиновыми лигандами. Имеются также данные, свидетельствующие о том, что в трехъядерном кластере два атома меди выполняют сходную функцию, тогда как третий отличается от них. Схематическое изображение димера аскорбатоксидазы приведено на рис. 7.27. Нет сомнений, что определение кристаллической структуры этого фермента будет важным шагом в понимании механизма действия оксидаз.

Литература

Ниже перечислены издания, которые могут оказаться полезными для дополнительного чтения. Перечень не претендует и не может претендовать на полный список публикаций на тему витамина С. Существует очень много оригинальной литературы по всем аспектам химии и биохимии витамина С, а также множество обзоров. Некоторые из перечисленных ниже книг снабдят читателей более подробными ссылками, которые при необходимости помогут подобрать нужную литературу.

Basu Т. К., Schorah С. J., „Vitamin С in Health and Disease11, Croom Helm, London and Canberra, 1982.

Burns J. J., Rivers J. M., Machlin L. J., „Third World Conference on Vitamin C“, New York Academy of Sciences, 1987.

Carpenter K. J., „The History of Vitamin C and Scurvy11, Cambridge University Press, Cambridge, 1986.

Cheraskin E., Ringsdorf N. M., Jr., Sisley E. L., „The Vitamin C Connection11 Thorsons Publishers, Wellingborough, 1983.

Chinoy J. J., „The Role of Ascorbic Acid in Growth, Differentiation and Metabolism of Plants11, Kluer Boston, The Hague, 1987.

Coultate T. P., „Food: The Chemistry of its Components11, 2nd Edn., Royal Society of Chemistry, London, 1989.

Counsell J. N., Hornig-D. H., „Vitamin C, Ascorbic Acid11, Applied Science, London, 1981.

Hay R. W., „Bio-Inorganic Chemistry11, Ellis Horwood, Chichester, 1984.

Kybett S. M., „Henry VIII - A Malnourished King11, History Today, 1989, 39, 19-25.

Levine M., „New Concepts in the Biology and Biochemistry of Vitamin C“, New Engl. J. Med., 1986, 314, 892-902.

Lewin S., „Vitamin C, its Molecular Biology and Medical Potential11, Academic Press, 1976.

Moss R. W., „Free Radical: Albert Szent-Gyorgyi and the Battle over Vitamin C“, Paragon House, New York, 1988.

Newsholme Е. A., Leech A. R., „Biochemistry for the Medical Sciences11, Wiley, Chichester, 1983.

Nobile S., Woodhill J. M., „Vitamin C. The Mysterious Redox System, A Trigger of Life11, MTP Press, Lancaster, 1981.

Pauling L.,„Vitamin C and the Common Cold11, Ballantine Books, London, 1970.

Sebrell W. H., Harris R. S., „The Vitamins11, Academic Press, New York and London, 1967.

Seib P. A., Tolbert В. M., „Ascorbic Acid: Chemistry, Metabolism, and Uses11, Advaces in Chemistry Series, American Chemical Society, Washington DC, 1982.

Werbach M. R., „Nutritional Influences on Illness11, Thorsen Publishing Co. Wellingborough, 1989.

Wyngaarden J. B., Smith L. H., „Cecil Textbook of Medicine11, 18th Edn., Saunders Co., 1988.

Ключевые работы по выделению, определению структуры и синтезу витамина С:

Isolation: Szent-Gyorgyi A., Biochem. J., 1928, 22, 1387.

Structure determination: Herbert R. W., Hirst E. L., Percival E. G. V., Reynolds R. J. W., Smith F., J. Chem. Soc., 1933, 1270.

Synthesis (from L-xylosome): Haworth W. N., Hirst E. L., Chem. Ind. (London), 1933, 645.

Ault R. G., Baird D. K., Carrington H. C., Haworth W. N., Herbert R. W., Hirst E. L., Percival E. G. V, Smith F., Stacey M., J. Chem. Soc., 1933, 1419.

Synthesis (from D-glucose): Reichstein T., Griissner A., Helv. Chim. Acta, 1934, 17, 311.

Предметный указатель

Аддисона болезнь 36

АДФ 107, 108

Аквокобаламин (витамин В12а), реакция с аскорбиновой кислотой 143

Аланинаминотрансфераза 131

Алкаптонурия 99

Алкилирование 70 и сл.

Альбинизм 123

Альцгеймера болезнь 126, 127

Анемия 120

врожденная сидеробластическая 130

серповидно-клеточная 122

средиземноморская (талассемия) 123

Анилин 121

Антиоксидант 8, 133, 144

Апельсиновый сок 15, 24, 30, 36, 147

Апельсины 17, 22, 23, 81

Арабиноза как исходный продукт 60

Арахидоновая кислота 125

Аррениуса уравнение 96

Артеросклероз 122

Артрит ревматический 123, 128

Аскорбат-анион, резонансно-стабилизированный 48

Аскорбатоксидаза 79, 133, 163

Аскорбат-радикал, спектр ЭПР 142, 143

- УФ-спектр 142, 143

Астма бронхиальная 125

АТФ 107, 108

АТФ-синтетаза 108

Аутоиммунная тромбоцитопения 114

Ацеталей образование 73, 75

Ацетоуксусная кислота 99

Ацидоз 130

Ацилирование 70 и сл.

Бактерия

Acetobacter fragrum 67

- suboxydans 62, 63

- xylinum 62

corynebacterium 93

Erwinia herbicola 93

Барлоу болезнь 29

Белок 28, 32

Бензокаин 104

Бери-бери, болезнь 32

Биологические методы анализа 10, 134

Бисдегидроаскорбиновая кислота 79, 80, 82, 84

Блейн Гилберт 23-26

Бобы соевые (Glycine max) 108

Бромат калия как разрыхлитель теста 12

Бурсит 128

7-Бутиробетаин 103

Ванадий 126, 163

Ванадий(У) как катализатор “маятниковых” реакций 157

Веермана деградация 60

Ветеринария, применение витамина С 131, 132

Вильсона болезнь 130

Винная кислота 12

Винслоу 15

Витамин В12 (цианокобаламин) 158 и сл.

Витамин Bi2a (аквокобаламин) 143

Витамин Е (токоферол) 10, 11, 95, 105, 111, 144, 145

Внутривагинальная контрацепция, использование аскорбиновой кислоты 12

Водородные связи в молекуле аскорбиновой кислоты 48-50, 55

Водянка 32

Высокоэффективная жидкостная хроматография 139-141

Г азо-жидкостная хроматография 139

Галактоза 59, 60, 92

Галактонамид 60

D-Галактуроновая кислота 60, 69,

92

L-Галактуронолактон 92

6-Галоген-6-дезоксипроизводное 78

Гангрена 124

Гексуроновая кислота 37, 38, 78

Гемоглобин 121

Гемодиализ 115

Гепатиты 128

Гесса тест 115

Герпес простой 128, 129

Гидроксилизин 97, 98

Гидроксилирование 89, 97 и сл.

Гидроксильный радикал 104, 106,

131

Гидроксипролин 97, 98

5-Гидрокситриптамин см. Серотонин

5-Гидрокситриптофан 102, 103

4-Гидроксифенилпировиноградная кислота 99, 100

Гиперкератоз волосяных фолликул 114

Гиперменорея 128

Гипофиз 103, 109

Гистидиндекарбоксилаза 120

Глаукома 111, 124

Глиоксалевой кислоты этиловый эфир 68, 69

Глицин 98

Глутаматпируват-трансаминаза 131

Глутатион 89, 105, 106

D-Глюкоза 60, 63, 66, 67, 69, 89-93,

131

Глюкозо-6-фосфат 105, 131

D-Глюконовая кислота 92, 93

D-Глюкуроновая кислота 90-94

О-(+)-Глюцит см. О-(+)-Сорбит Гомогентизатоксидаза 99 Гомогентизиновая кислота 97-99 L-Гулоза 91

L-Гулоновая кислота 91-94

L-Гулонолактон 92, 94

L-Гулонолактоноксидаза 94, 96

Дегидроаскорбиновая кислота, структура, свойства, спектр ЯМР 66 и сл.

6-Дезокси-Ь-аскорбиновая кислота 77

Дезоксисоединения, получение из L-аскорбиновой кислоты 76 и сл.

Дейл Генри 36

Дейтерированные производные L- аскорбиновой кислоты, получение 65, 67

Десферриоксамин (дефероксамин, десфереал) 123, 130, 131

Детоксикация 88

Дефероксамин см. Десферриоксамин

Диабет 124

Диазометан 42-44, 70, 71, 74

2,3-Диамино- 2,3-дезоксипроизводное аскорбиновой кислоты 86, 87

цис-1,2-Диаминоциклогексан(аскор- бато)платина(П) 154

Диацетонкетогулоновая кислота 63, 65, 66

Диацетонсорбоза 63, 65, 66

Дигидразон L-аскорбиновой кислоты 85

Дигидробиоптерин 99, 103

2,3-Дигидроксималеиновая кислота 41

3,4-Дигидроксифенилаланин (дофа) 101

3,4-Дигидроксифенилэтаноламин см. Дофамин

5,6-Дидезоксисоединение 78

1,2:3,4-Д и- О-изопропилиден- D-ra- лактопираноза 60

1,2:3,4-Ди-О-изопропилиден-С-га- лактуроновая кислота 60

2,3:4,6-Ди-О-изопропилиден-2-кето- L-гулоновая кислота см. Ди- ацетонкетогулоновая кислота

Ди-О-изопропилиденовая защита гидроксильных групп молекулы аскорбиновой кислоты 60, 62, 63, 65

2,3:4,6-Ди- О-изопропилиден-Ь-сор- бофураноза см. Диацетонсор- боза

2,3-Дикетогулоновая кислота 11, 81, 84, 111, 137, 138, 147

2,5-Дикето-С-гулоновая кислота 67, 92, 93

2,3-Ди-О-метил-Ь-аскорбиновая кислота 42, 43, 45, 70-72

3,4-Ди-О-метил-Ь-треонамид 44,45

L-Диметоксисукцинамид 44

2,4-Динитрофенилгидразин 137,

138

а, а'-Дипирин в качестве индикатора титрования L-аскорбино- вой кислоты 135, 136

Дифракция рентгеновского излучения 47, 48

Дифференциальная пульсирующая вольтамперометрия 139

2,6-Дихлорфенолиндофенол 135

Диэтическая доза, рекомендуемая

8, 114, 116-120

Длина связей в молекуле L-аскор- биновой кислоты 48

Добавка пищевая 8, 11

Дофа см. 3,4-Дигидроксифенилаланин

Дофамин (3,4-дигидроксифенил- этаноламин) 99, 101

Дофамин-/?-гидроксилаза 99

Дофамин-/?-монооксигеназа, витамин С-зависимый фермент 99

Дрейк 17

Дюран-Рейнолс 15

Ендиольная группировка 9, 41, 42

E-number 8, 133

Железо 11, 111, 115, 121, 123, 130

Железо(П) 98, 106, 107, 130, 133, 139

Железо(Ш) 106, 107, 130, 135, 136, 152, 153

Желчная кислота 104

Желчнокаменная болезнь 128

Желчь 18

Заживление ран 128

Зубы 14, 98, 134

Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура 122

2,3-Изодиметил-Ь-аскорбиновая кислота 59

Изоцитрат 108

Имидазолин 86, 87

Иммунология 88, 111

Иммуномодулятор 120

Импульсный радиолиз, метод по

лучения аскорбат-радикала 142

Инверсия углеродной цепи 65, 89

Инфракрасные спектры 50-53

Ишемическая болезнь сердца 122

Кавендиш Томас 17

Камерон 127

Кана-Ингольда-Прелога система 46

Капустный сок 36

6-Карбокси-Ь-аскорбиновая кислота 77

6-Карбокси-5-кето-ь-аскорбиновая кислота 77

Карнитин 97, 103, 105

Карпентер 22, 27, 29

Каррингтон 59

Картофель 27, 28, 31, 32, 95

Катаболизм аскорбиновой кислоты 110, 111

Катаракта 88, 124

Катехоламины 111

Кеталей образование 73, 75

а-Кетоглутарат 98, 108

2-Кето-В-гулоновая кислота 67 2-Кето-Ь-гулоновая кислота 63, 67, 93

2-Кето-Ь-гулонолактон 92, 93

Кинг Чарльз 35, 38

Клинические испытания 20, 21

Клубника 92, 95

Кобальта(Ш) комплексы, восстановление L-аскорбиновой кислотой 155-158

Кожа 98, 99

Коллаген 11, 97, 99, 109, ПО, 115

Колориметрические методы анализа 134

Константы спин-спинового взаимодействия 54, 55

Конформация вокруг С — С-связей 54, 55

Кора надпочечников 36, 103, 105, 108, 109

Коронарная недостаточность 104

Кортье Жак 16

Кости 98

Кошки, биосинтез витамина С 119

Крапивница хроническая 128

Креатин 105

Кребса цикл 46

Кристаллическая структура аскорбиновой кислоты 48, 49

Кровоточивость десен 115

Крона болезнь 128

Крысы 30, 88, ПО, 134

Ксантофилла синтез 109

Ксенобиотики 104, 111

L-Ксилоза 69, 111

D-Ксилозон 59

L-Ксилозон 59-61

Кулинарная обработка продуктов, потери аскорбиновой кислоты 96, 119

Купоросный эликсир 20, 22

Лактатдегидрогеназа 131

Ланкастер Дмсеймс 17

Лейкоциты ПО, 115

Лизилгидроксилаза 98

Лизин 88, 98, 99, 103

Лизосомы 123

L-Ликсоза 60, 69

L-Ликсозазон (L-ксилозазон) 60

L-Ликсоновая кислота 111

Лимонной кислоты цикл 108

Лимонный сок 15, 24, 32, 113, 147

Линд Джеймс 21-23, 25, 26, 113

Липазы плазмы 122

Липопротеины 122

Малат, в цикле лимонной кислоты 108

Марганца(Ш) аквоионы, восстановление L-аскорбиновой кислотой 156

Мартель А. Е. 149, 152

Масс-спектрометрия 55, 57, 58

“Маятниковые” реакции с участием аскорбиновой кислоты 157, 158

Меди(П) ионы в качестве катализатора 10, 137, 147-152

Медицинское применение витамина С 113 и сл.

Медьсодержащие ферменты 96, 99, 103, 111, 130, 133

Меланоцитстимулирующий гормон 104

Металлов ионы 9, 133, 135, 141 и сл.

Метгемоглобин 106, 121

Метгемоглобинемия 121

Метгемоглобинредуктаза 121

З-О-Метил-Ь-аскорбиновая кислота 70, 71

Метиленовый синий 121

Метилирование L-аскорбиновой кислоты 70, 71

Микроволновые печи, приготовление пищи 96

Миоглобин 11

Митохондрии, электронный транспорт 97, 103, 106-109

Митчелл 108'

Молибден(1У), участие в “маятниковых” реакциях с аскорбиновой кислотой 157

Молибден(У1) как катализатор “маятниковых” реакций аскорбиновой кислоты 158

Молоко 88, 109, 118

Монооксигеназа 111

Морские свинки 30-32, 88, 94, 99,

112, 120, 134

Мужское бесплодие 126

Мясные продукты, использование L-аскорбиновой кислоты 11, 26

Надпочечники 109, ПО, 125, 126

НАДН/метгемоглобинредуктаза 121

НАДН2 97, 101, 103, 107

НАДФН-дегидрогеназа 104, 121

НАДФН2 97, 105, 106

Нафталин 121

Нафтохинон 121

Недостаточность витамина С 28, 114 и сл.

Нейромедиатор 101, ПО

Никеля(1У) комплексы 156, 157

Нитриты 11, 121

Нитробензол 121

Нитрозамины 127

Нитрозосоединения 11

Норадреналин (норэпинефрин) 97,

99, 101

Обморожение 129

Овощи 15, 23-27, 29-36, 95, 96, 117

Ожирение 128

Ожоги 129

Окисление 76, 97 и сл., 130 и сл.

Окислительно-восстановительное равновесие L-аскорбиновой кислоты 145 и сл.

Окислительно-восстановительный цикл аскорбиновой кислоты 97

Окислительное фосфорилирование 106-108

Оксамид 45

Остеоартрит 128

Ост-Индская компания 17, 113

Паркинсона болезнь 126

Пеллагра 32

Пентозофосфатный цикл 105, 106

Пептидилглицин-а-амидирующие монооксигеназы 103

Перец сладкий 39

Перитонеальный диализ 115

Пероксиглутарат 98

Печень 99, 104, 105, 109, ПО

детоксикация 125

Пиразольные производные деги- дроаскорбиновой кислоты 86, 87

Пищевая промышленность 11

Плазматический белок системы комплемента 99

Плазма, уровень витамина С 109, ПО, 118, 119, 122

Подагра 128

Поджелудочная железа 109

Поливитамины, содержащие аскорбиновую кислоту 133, 139

Полимеризация, применение аскорбиновой кислоты 12

Полинг Лайнус 118, 127-129

Полиневрит 31

у птиц 32

Полярография 135

Понос 123, 130

Почки 109, ПО

Примахин 121

Пролилгидроксилаза 98

Пролин 88, 98

Промышленное использование аскорбиновой кислоты 12

Промышленное получение аскорбиновой кислоты 59-66

Простуды профилактика 13, 125

Разрыхлитель теста в хлебопечении 11, 12

Рак 9, 13, 46

желудка 127

легких 125

матки, профилактика 128

L-Рамноаскорбиновая кислота 77

Рассеянный склероз 128

Ревень 13

Редуксон 47

Резорцин 121

Рейхштейна синтез 59, 62, 63, 65

Рибулозо-5-фосфат 105

Роговая оболочка глаза 98, ПО

Роу метод 137

Саранча 94

Сассафрас 16

Сахар 9, 20

Сахароаскорбиновая кислота 77

Свинцом отравление 125

Свободные радикалы 89, 144-146

Селезенка 18, 19, 122

Семена прорастающие 91, 109

Семидегидроаскорбатредуктаза 101

Сент-Дъердъи Альберт 35-40, 46, 47, 78

Серная кислота 17, 20

Серотонин 97, 101, 102, 109

Синдром сломанного хребта у рыб 11

Скорость распада витамина С 96

Скотта путешествие в Антарктику 29

Слепая кишка 32

Слепота 124

Смородина черная 95

Собаки, биосинтез витамина С 119, 132

О-(+)-Сорбит (С-(+)-глюцит) 62, 63, 66

L-Сорбоза 62, 63-65

Сосудов ломкость 128

Спектрофотометрический анализ L-аскорбиновой кислоты 136 и сл.

Спектр ЭПР аскорбат-радикала 142, 143

СПИД 125, 128

Старческое слабоумие 127

Стейси М. 59, 60, 62

Сукцинат 98, 108

Сульфгидрильной группы защита 89

Супероксид 106, 122, 124

Супероксиддисмутаза 105,106,

122-124

Сухожилия 98

Табакокурение 116, 124, 125

Талассемия см. Анемия средиземноморская

Тетрагидробиоптерин 99, 101, 103

2,3,5,6-Тетра-О-метил-Ь-аскорбино- вая кислота 45, 71

Тетраметил-п-фенилендиамин 108

Тиреотоксикоз 123

Тиреотропин-рилизинг гормон 104

Тирозин 99, 100

Титриметрический метод анализа 134 и сл.

L-Токоферол см. Витамин Е

Томаты 95

L-Треоза 68, 69

L-Треониновая кислота 11, 44, 76, 111

Триглицериды 122

2,3,5-Три-О-метил-Ь-аскорбиновая кислота 71, 73

Триметиллизин 103

Триметилсилильное производное L-аскорбиновой кислоты 139, 140

Три-О-метил-Ь-треонамид 44

Тринитротолуол 121

2,4,6-Трипиридил-сиз<л<-триазин в качестве индикатора титрования L-аскорбиновой кислоты 135, 136

Триптофан 101, 102

Триптофангидроксилаза 101, 102

Триптофан-5-монооксигеназа (триптофангидроксилаза) 101, 102

Трис(2- дезокси- 2-L-аскорбил) амин 86, 87

Т рис( 1,2-этандиоато)кобальтат(Ш) 156, 157

Трифенилметилирование 70, 71, 73

Трифенилхлорметан, реакция с L- аскорбиновой кислотой 70

Тромбоцитов агрегация 122

Тутовый шелкопряд 94

Уксус 22

УФ-спектр аскорбат-радикала 142, 143 аскорбиновой кислоты 48-50, 136, 137

Фенацетин 121

Фенилаланин 99, 100

Фенилгидразин 42, 59, 84, 85, 121

о-Фенилендиамин 84, 85

Фенилкетонурия 99

Фенолаза 95

Фенолиндофенол 79

Фентона реакция 130

Феррозин в качестве индикатора титрования L-аскорбиновой кислоты 135, 136

Фибринолитическая активность 122

Фолиевая кислота 105, 106, 115

Фотография, использование аскорбиновой кислоты 12

Фрелих Теодор 30, 31

Фруктовые соки 11, 15, 29, 133, 141

Фумаровая кислота 99

Функ Казимир 32

Фурфурол 41

Хаклит 16

Хамбергер X. Дмс. 36

Херст Эдмунд 40, 59, 60, 69

Хеуорс Норман 37, 39, 40, 46, 59, 60, 69

Хлебопечение 11, 12, 133

6-Хлор-6-дезоксипроизводное аскорбиновой кислоты 77

Хлоропласты 13, 108

Хлорофиллсодержащие растения, синтез аскорбиновой кислоты 91

Хокинз Ричард 17

Холевая кислота 104

Холестерин 104, 122, 123

Холъст Аксель 30, 31

Хопкинс Фредерик Роуленд 32, 36, 37

Хроматографические методы 139- 141

Хрусталик глаза 98, 105, 110

Хрящи 98

Церулоплазмин 130

Цианоз 121

Цианокобаламин см. Витамин В12

Цильва Соломон 35, 78

Цинга 14-34, 105, ПО, 114, 116, 119, 122

Цинка сульфат, лечение герпеса 129

Цитохром Ьь 97, 107

Цитохром с 97, 107, 108, 111

Цитохром Р450 104, 125

Цитохром-65 редуктаза эритроцитов 121

Цитохромы 97, 107

Цитрусовые как источник витамина С 94, 95

Чедика-Хигаши болезнь 123

Чик Генриетта 32

Шеклтон, путешествие в Антарктику 29

Шиповника плоды 95

Шишковидная железа 101

Щавелевая кислота 11-13, 44, 76, 110, 111, 118, 129

Щитовидная железа 126

Эванс Эдвард 29

Электронный транспорт 106-109, 111

Эмфизема легких 125

Эндокринная система 103

Эндокринология 88

Энергия активации при распаде

витамина С 96

Эпидемиология 111, 124

Эритропоэз 115

Язва двенадцатиперстной кишки 120, 128

- желудка 129

ЯМР-спектры L-аскорбиновой кислоты 53, 54

Оглавление

Предисловие5

Предисловие авторов7

Введение8

Исторический очерк. Роль витамина С в профилактике и лечении цинги14

Предполагаемые причины возникновения цинги 17

Джеймс Линд 21

Сэр Гилберт Блейн 23

Цинга на суше 26

Исследование Арктики и Антарктики 28

Детская цинга 29

События, приведшие к открытию витамина С 30

Открытие витамина С и установление его структуры 35

Выделение 35

Установление структуры 40

Уточнение структуры с помощью инструментальных методов .47

Дифракция рентгеновского излучения 47

Ультрафиолетовая спектроскопия 48

Инфракрасная спектроскопия 50

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса:...53

Масс-спектрометрия 55

Синтез, производство и химические свойства витамина С59

Синтетические методы получения ь-аскорбиновой кислоты ...59

Химические свойства ь-аскорбиновой кислоты 70

Алкилирование и ацилирование 70

Образование ацеталей и кеталей 73

Окисление 76

Дезоксисоединения 76

Дегидроаскорбиновая кислота и ее производные 78

Получение 78

Структура 80

Свойства 84

Биохимия витамина С88

Биосинтез 89

Витамин С в продуктах питания 94

Окисление и гидроксилирование 97

Восстановительные свойства 104

Электронный транспорт 106

Распределение в тканях 109

Потребление, экскреция и метаболизм ПО

Витамин С в медицине113

Недостаточность витамина С 114

Сохранение здоровья 116

Терапевтическое применение 120

Токсические воздействия 129

Применение в ветеринарии 131

Неорганические и аналитические аспекты химии витамина С133

Аналитическая химия 133

Биологические методы анализа 134

Титриметрические и колориметрические методы анализа 134

Спектрофотометрический анализ 136

Электрохимические методы 139

Хроматографические методы 139

Неорганическая химия 141

Свободные радикалы аскорбиновой кислоты 142

Окислительно-восстановительное равновесие ь-аскорбино- вой кислоты 145

Окислительно-восстановительные реакции витамина С 147

Окисление L-аскорбиновой кислоты кислородом 147

Окисление в отсутствие катализаторов 148

Окисление в присутствии ионов металлов 148

Реакции с ионами металлов 152

Окисление аскорбиновой кислоты комплексами переходных металлов 155

Взаимодействие витамина С с витамином В12 158

Восстановление по внутрисферному механизму 162

Аскорбатоксидаза 163

Литература166

Предметный указатель168

В книге скрупулезно обобщены достижения последних лет в области изучения витамина С. Необыкновенно увлекательно изложены истори

ческие сведения о цинге. Удивительно, что победа над этим заболеванием заняла так много времени, когда ответ лежал буквально на поверхности. Если все утверждения о биологической значимости и целебных свойствах

этой простой, но загадочной молекулы верны,

то мы имеем в руках нечто, очень похожее на

жизненный эликсир, который так долго искали

алхимики!

Издательство/Мир

ВИТАМИН С

Химия и биохимия

Royal Society of Chemistry Paperbacks

Vitamin C

Its Chemistry and Biochemistry

Michael B.Davies, John Austin, David A.Partridge

Department of Applied Science Anglia Polytechnic, Cambridge

М. Девис, Дж. Остин, Д. Патридж

ВИТАМИН С

ХИМИЯ И БИОХИМИЯ

Перевод с английского канд. хим. наук М.Б.Костиной

Москва «Мир» 1999

УДК 577.16

ББК 24.239 ДИ

Девис М., Остин Дж., Патридж Д.

Д11 Витамин С: Химия и биохимия: Пер. с англ. — М., Mi 1999. — 176 с., ил.

ISBN 5-03-002968-0

Книга английских авторов охватывает широкий спектр вопросов, начиная с истории открытия аскорбиновой кислоты и кончая современными методами ее получения в промышленных масштабах. Особый интерес представляет обобщение большого опыта использования витамина С при лечении различных заболеваний.

Для специалистов в области химии, биологии, медицины, а также для широкого круга читателей, включая учителей, студентов и людей, интересующихся здоровьем.

ББК 24.239

Научно-популярное издание

Майкл Девис, Джон Остии, Дэвцд Патридж

Витамин СХимия и биохимия

Заведующий редакцией академик | О. А. Реутов |Зам. зав. редакцией канд. хим. наук Т. И. ПочкаеваВедущий редактор Б. М. КомароваХудожник И. Б. КравцовХудожественный редактор Н. В. ДубоваТехнический редактор Е В. ДенюковаКорректор В. И. Киселева

Оригинал-макет подготовлен И. В. Терешкиной в пакете ОТрХ с использованиемкириллических шрифтов, разработанных в редакции АИП издательства «Мир»Лицензия ЛР № 010174 от 20.05.97 г.

Подписано в печать 23.02.99. Формат 60x88/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.Объем 5,50 бум. л. Усл. печ. л. 10,76. Уч-изд. л. 11,18. Изд. № 3/9214.

Тираж 3000 экз. Зак. 868 С009.

Издательство «Мир»Государственного комитета Российской Федерации по печати.129820, Москва, 1-й Рижский пер., 2.

Отпечатано в Производственно-издательском комбинате ВИНИТИ,140010, г. Люберцы, Московской обл., Октябрьский пр-т, 403.

Тел. 554-21-86

Редакция литературы по химии

© The Royal Society of Chemistry, 1991

ISBN 5-03-002968-0 (рус.)© перевод на русский язык,

ISBN 0-85186-333-7 (англ.)оформление «Мир», 1999